Informe Final De EPS

Indice

I. Introducción………………………………………………………..……………...01

II. Antecedentes…………………………………………………………...…..……..02

III. Actividades Desarrolladas…………………………….……..….…..…..………10

A. Actividades de Docencia……………………..…………..…………..10

B. Actividades de Servicio………………………………………..……..19

C. Actividades de Investigación…………………………..…….………22

IV. Anexos……………………………………………………………………………..56

Informe Final de EPS

Introducción

Las prácticas de Ejercicio Profesional Supervisado (EPS) se realizaron en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT), el cual se encuentra ubicado en el edificio T-10 de la Ciudad Universitaria, en él se llevan a cabo proyectos de investigación en la rama de la Química que comprende lo relacionado al área de los Productos Naturales. Las actividades de Servicio consistieron en contribuir con los proyectos y las actividades de investigación programadas por el LIPRONAT durante el periodo correspondiente a las prácticas de Ejercicio Profesional Supervisado, además de contribuir cuando fue posible, al mejoramiento de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el LIPRONAT para el desarrollo de sus investigaciones. Así también se pudo impartir y recibir conferencias, charlas informativas, además de asistir a seminarios, cursos, cursillos, talleres y demás actividades que permitieron un intercambio de información y de conocimiento entre la Epeesista y profesionales del área de la Química. Gracias a todo ello se pudo elevar el nivel de conocimiento de la Epeesista en cuanto a lo relacionado con el área de la Química, en especial la rama referente a la Química de Productos Naturales. En cuanto a lo relacionado a la investigación de EPS, se logró el estudio de una planta nativa de Guatemala, la Euonymus enanthiopylla, perteneciente a la familia de las Celastraceaes. Fue estudiada la composición fitoquímica de dicha planta conociéndose así las familias de metabolitos secundarios que forman parte de su composición química, así también fue llevada a cabo la evaluación de su actividad antifúngica, antibacteriana y citotóxica para conocer si dicha planta puede tener potencial como planta medicinal.

Antecedentes del LIPRONAT

Los proyectos de investigación para la caracterización y validación de los productos naturales, particularmente las plantas medicinales han sido una actividad importante en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, aunque en los primeros años las actividades fueron dispersas y sin una coordinación. Durante 1985-93 la Dra. Amarillis Saravia recibió un apoyo inicial de la Fundación Internacional para las Ciencias (FIS) de Suecia para establecer un laboratorio de farmacología de plantas de uso medicinal en Guatemala (1), para lo que requería también una capacidad y equipo para preparar extractos vegetales y hacer análisis fitoquímico. En 1992 bajo la coordinación del Lic. Armando Cáceres se inicia un proyecto sobre la actividad antiinflamatoria con financiamiento de la Dirección General de Investigación (DIGI) (2), que luego es coordinado por la Dra. Saravia durante 1993-95.

Durante 1995-98 se realizan trabajos conjuntos de investigación de plantas con actividad antiprotozoarica con el apoyo financiero de la Agencia Japonesa de Cooperación Internacional (JICA) y de la Academia Austriaca de Ciencias (AAC), que a través de la Dra. Ingeborg Berger de la Universidad de Viena apoya técnica y financieramente las actividades de investigación fitoquímica de plantas con actividad biocida en coordinación con el Departamento de Citohistología de la Facultad (3,4). Para perfeccionar las técnicas de tamizaje fitoquímico y fraccionamiento bioguiado de las plantas con bioactividad, se contó con la colaboración del Dr. Luca Rastrelli de la Universidad de Salerno, quien capacitó personal nacional, estableció metodologías analíticas y permitió elucidar las estructuras químicas

1 Proyecto “Contribución al estudio farmacológico y fitoquímico de plantas medicinales de uso popular en Guatemala”, FIS, 1985-93. 2 Proyecto “Actividad antiinflamatoria de plantas de uso popular en Guatemala”, DIGI, 1992-95. 3 Cáceres A et al. Plants used in Guatemala for the treatment of protozoal infections. 1. Screening of activity to bacteria, fungi and American trypanosomes of 13 native plants. J. Ethnopharmacol. 1998; 62:195. 4 Berger I et al. Plants used in Guatemala for the treatment of protozoal infections. II. Activity of extracts and fractions of five Guatemalan plants against Trypanosoma cruzi. J. Ethnopharmacol. 1998; 62:107. 2 responsables de la actividad biocida (5,6), antiinflamatoria (7) y anti-Artemia salina (8,9) en varias plantas nativas.

Actividades Realizadas por el LIPRONAT

Investigación En 1997 se construye el Bioterio de la Facultad, por lo que en 1998 se trasladan a ese local los laboratorios de Farmacología y el salón 11-105 se convierte poco a poco en un laboratorio de Análisis Fitoquímico donde se realizan análisis para investigadores de la Universidad dentro de diferentes proyectos. En primer lugar podemos mencionar varios trabajos de tesis desarrollados por estudiantes de diversas carreras de la Universidad a lo largo del tiempo. Estos trabajos de tesis han complementado algunos proyectos como los coordinados por los Ings. César García y Telma Cano del Centro de Investigaciones de Ingeniería (CII) de la Facultad de Ingeniería con financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYT) en la línea FODECYT (10,11) para caracterizar algunos productos naturales. Los autores, escuelas y especie vegetal investigada se presentan en el cuadro siguiente.

5 Rastrelli L et al. Glycolipids from Byrsonima crassifolia. Phytochem. 1997; 45:647. 6 Rastrelli L et al. Iridoids from Lippia graveolens. Phytochem. 1998; 49:1829. 7 Rastrelli L et al. Antiinflammatory activity-guided fraction of Gnaphalium stramineum. Pharmaceut. Biol. 1998; 36:315. 8 Rastrelli L et al. New 12a-hydroxyrotenoids from Gliricidia sepium bark. J. Nat. Prod. 1999; 62:188. 9 Rastrelli L et al. Studies on the constituents of Gliricidia sepium (Leguminosae) leaves and roots: Isolation and structure elucidation of new triterpenoid saponins and aromatic compounds. J. Agric. Food Chem., 1999; 47:1537. 10 Proyecto “Obtención y caracterización de aceite esencial de ajo y jengibre cultivados en Guatemala” FODECYT, 1997. 11 Proyecto “Obtención y caracterización de capsaicina, ingrediente activo y productos fitofarmacéuticos y agroindustriales de tres especies de capsicum cultivadas en Guatemala”, FODECYT, 1999. 3

Trabajos de tesis realizados en LIPRONAT durante 1997-2001

Año Estudiante de Escuela Especie vegetal investigada Tesis 1997 Benjamín Ing. Química Aceite esencial de Rosmarinus Piedrasanta officinalis 1998 Nelson Chanquín Ing. Química Aceite esencial de Lippia alba 1998 Irma Tay Ing. Química Aceite esencial de Pimenta dioica 1998 Virna Rivas Q. Farmacéutica Bioctividad de Tridax procumbens 1998 Telma L. Barillas Nutrición Raíz de Dioscorea convolvulacea 1998 Lisbeth Agustín Nutrición Flor de Spathiphyllum phyniifolium 1998 Bequer Velásquez Nutrición Hojas de Galinsoga urticaefolia 1999 Miguel A. Química Comparación de Lippia graveolens Velásquez 1999 Carmina Diaz Ing. Química Aceite esencial de Protium copal 2000 Rina Barrios Q. Farmacéutica Extracto de Vaccinium poasanum 2000 Sully Cruz Q. Farmacéutica Caracterización de Ocimum micranthum 2000 Sandra Ordóñez Q. Farmacéutica Equiparación de Rauwolfia tetraphylla 2001 Manuel Mendoza Ing. Química Aceite esencial de Cymbopogon citratus 2001 Edgar de León Ing. Química Caracterización de Litsea guatemalensis 2001 Diana Hernández Ing. Química Comparación de Matricaria recutita Yela 2001 Manola Anleu Química Cuantificación de antioxidantes 2001 Rodrigo Cifuentes Ing. Química Aceite esencial de Thymus vulgaris 2001 Melissa Ventura Q. Farmacéutica Equiparación de especies de Passiflora 2001 Marielos Pernillo Ing. Química Comparación de Ocimum basilicum

Ante la necesidad de realizar acciones más permanentes, dar una utilización óptima a los equipos instalados que quedaron de los proyectos anteriores y participar directamente en investigaciones de productos naturales, durante el 2000-2001 se ejecutan dos proyectos para contribuir al análisis fitoquímico de productos naturales de interés agroindustrial bajo la coordinación del Lic. Cáceres con financiamiento de la DIGI (12,13).

Estos proyectos permitieron establecer un equipo de trabajo especializado en fitoquímica que ha servido de contraparte para cooperar con proyectos de otras instancias, tales como los proyectos sobre actividad biocida de especies vegetales obtenidas por Etnobotánica y bioprospección de la Reserva de la Biosfera Sierra de las Minas (RBSM) realizado por el Departamento de Citohistología con cofinanciamiento de la Organización de Estados Americanos (OEA) (14) y el Instituto de Investigaciones Químicas y Biológicas (IIQB) (15); los proyectos de desarrollo agroindustrial con fondos de la DIGI o de la línea FODECYT realizados por el Centro de Investigaciones de Ingeniería sobre pimienta negra (16), plantas aromáticas (17) y arrayán (18); y, un proyecto para determinar la actividad antiofídica de extractos usados para combatir la mordedura de serpiente con apoyo del Instituto de Investigación y Desarrollo (IRD) y la Asociación Médicos Descalzos de Francia y fondos de la

12 Proyecto “Caracterización de metabolitos secundarios de extractos de plantas nativas de uso medicinal en Guatemala y de un invertebrado marino del caribe Mesoamericano”, DIGI, 2000. 13 Proyecto “Caracterización de extractos naturales y aceites esenciales como nuevos recursos para el desarrollo agroindustrial”, DIGI, 2001. 14 Proyecto “Inventario y evaluación de la biodiversidad tropical centroamericana como fuente de sustancias antimicrobianas, antimicóticas, anticancer, antiprotozoarias e insecticidas”, OEA 1998-2000 15 Proyecto “Actividad antimicrobiana de tres plantas de uso etnomédico en la Reserva de la Biosfera Sierra de las Minas”, IIQB 1999-2001. 16 Proyecto “Extracción y caracterización de aceite esencial y oleorresina de pimienta negra (Piper nigrum L.), alternativa de agroindustrialización para el agricultor guatemalteco” DIGI, 2001. 17 Proyecto “Obtención y caracterización de aceite esencial de 4 plantas medicinales cultivadas a diferentes niveles altitudinales de Guatemala”, FODECYT No. 77-00 18 Proyecto “Caracterización de las fracciones extractables contenidas en el fruto del palo de cera, de arrayán o cera San Pascual (Myrica cerifera), FODECYT No. 50-00 5 línea FODECYT, en colaboración con el Centro Mesoamericano de Estudios sobre Tecnología apropiada (CEMAT) y Laboratorio FARMAYA, lo que permitió tener el apoyo técnico y financiero del M.Sc. Yann-Olivier Hay (19).

Los apoyos financieros de diversas instancias que participaron a lo largo del tiempo han hecho posible la adquisición de equipo y mobiliario, cristalería, disolventes y reactivos y estándares que sumados a las principales necesidades actuales permiten tener los procedimientos fitoquímicos necesa- rios para apoyar a otros proyectos de la Facultad, a otras unidades académicas de la Universidad y a otras instancias. De esa forma actualmente se tienen establecidos compromisos de coOperaciones para ejecución de proyectos con otras instancias, como los proyectos para aprovechamiento de la flora regional con financiamiento de OEA (20) y caracterización de especies de Smilax con financiamiento CATIE-FONTAGRO (21) ejecutados por profesores del Depto. de Citohistología, un proyecto de desarrollo agrotecnológico con la Asociación Gremial de Exportadores de Productos No Tradicionales (AGEXPRONT) con fondos de Inversiones para la Paz (IPP)/Agencia para el Desarrollo Internacional (AID) (22), y, los proyectos de caracterización agronómica de cultivos interesantes para el desarrollo agroindustrial de especies nativas como Polypodium aureum (23) y Smilax spp. (24), coordinados por el Ing. Vicente Martínez de la Facultad de Agronomía de la USAC con financiamientos de DIGI y FODECYT respectivamente.

Durante los años del 2002 a 2005 se ejecutó un proyecto regional para desarrollo de tecnología de cultivo de plantas medicinales y productos

19 Proyecto 20 Proyecto “Aprovechamiento de la flora regional como fuente de moléculas antifúngicas, antiparasitarias y anticancer”, OEA 2001-2003. 21 Proyecto “Desarrollo del manejo sostenible de Smilax spp. En ecosistemas naturales y agroforestales de América Central”, CATIE-FONTAGRO 2001- 2002. 22 Proyecto “Desarrollo agrotecnológico de plantas medicinales con potencial en el mercado interno y de exportación” IPP-AGEXPRONT/AID, 2001-2002. 23 Proyecto “Caracterización in situ y manejo de poblaciones de Polypodium spp.”, DIGI, 2001. 24 Proyecto “Caracterización in situ y manejo de poblaciones de Smilax spp”, FONACYT, 2001-2002. 6 fitoterápicos, que coordinó el Lic. Armando Cáceres con financiamiento de OEA. Además se han sometido propuestas a DIGI, FODECYT y AGROCYT apoyando a otras unidades académicas e instituciones para fortalecer las actividades que se realizan y avanzar en el desarrollo de los productos naturales como opción para el desarrollo agroindustrial del país. Así mismo, se ha continuado con los proyectos de colaboración con universidades europeas, lo que han permitido la publicación reciente de artículos científicos sobre plantas nativas validadas con potencial de desarrollo comercial (25,26).

Servicio Si bien LIPRONAT no está formalmente constituido como un Laboratorio de la Facultad, en los últimos ocho años ha logrado prestar servicios de análisis fitoquímico a algunos proyectos institucionales y empresas en el campo de los productos naturales.

Cabe resaltar el importante trabajo de investigación y prestación de servicios analíticos ofrecidos a un proyecto de desarrollo agrotecnológico conjuntamente con la AGEXPRONT con fondos de IPP-AID a través de Laboratorio FARMAYA, para dar acompañamiento analítico al proyecto en sus dos etapas. En el primer año los análisis fueron compartidos con FARMAYA y se obtuvo una remuneración en especie consistente en un equipo Neocleavenger para aumentar la capacidad analítica del Laboratorio. Durante el segundo año se realizaron algunos análisis que son remunerados directamente a la Facultad a través de la Unidad de Análisis Instrumental (UAI) de la Escuela de Química, como análisis de aceite esencial con AGEXPRONT/IPP y algunos análisis fitoquímicos para laboratorios farmacéuticos, como análisis de valepotriatos para Laboratorios LANCASCO.

25 Cáceres A et al. Furanocoumarins from the aerial parts of Dorstenia contrajerva. Fitoterapia 2001; 72:376. 26 Berger I et al. Antiprotozoal activity of Neurolaena lobata. Phytother. Res. 2001; 15:327. 7

Docencia

LIPRONAT ha desarrollado algunas actividades de docencia, inicialmente entrenando personal nacional en técnicas de análisis fitoquímico con profesionales extranjeros durante 1995-99 y posteriormente colaborando en diferentes actividades docentes como las siguientes:

En abril de 1999 se realizó el Seminario-Taller Mesoamericano “Metabolitos de interés nutricional en plantas comestibles de la región” bajo la coordinación del Dr. Rubén Velásquez en el marco de la red MENUPLAN y financiamiento del CONCYT.

En el 2000 se realizó la capacitación de estudiantes de la Escuela de Ingeniería Química sobre extracción y cálculo del rendimiento de aceites esenciales, para complementar sus investigaciones en la planta piloto de extracción que funciona en el CII.

En julio del 2001 se realizó el Curso Centroamericano de Control de Calidad de Plantas Medicinales con el apoyo del Centro de Desarrollo Educativo (CEDE), la Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del CYTED y la Comisión Nacional para el Aprovechamiento de las Plantas Medicinales (CONAPLAMED) en el que se contó con la participación de 30 profesionales académicos y de empresas de fitomedicamentos nacionales y de la región.

Posteriormente se ha realizado la capacitación y extracción de aceite de semilla de Coriandrum sativum por los estudiantes de la Escuela de Química, Walter Bran y Juan P. Barreda, la capacitación de estudiantes del curso de Química de Productos Naturales de la Escuela de Química, así como el préstamo del equipo y las instalaciones para llevar a cabo la parte experimental de diferentes trabajos de investigación de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia.

Durante los años 2002 al 2007 el LIPRONAT ha participado en por lo menos 30 proyectos de investigación con varios profesores y estudiantes

8 tanto de la facultad como de otras unidades académicas e instituciones y se han presentado proyectos a diversas fuentes financieras.

III. Actividades Desarrolladas

A. Actividades de Docencia

1. Objetivos

 Elevar el nivel de conocimiento de la Epeesista en cuanto a lo relacionado con el área de la Química.

 Elevar el nivel de conocimiento de la Epeesista en cuanto a lo relacionado con el área de Química de Productos Naturales.

 Intercambiar criterios científicos entre la Epeesista y Profesionales de la Química o ciencias relacionadas.

 Intercambiar criterios técnicos entre la Epeesista y las personas que laboran tanto en el LIPRONAT como las que laboran en el Departamento de Citohistologia.

 Propiciar el intercambio de información entre los investigadores de Química de Productos Naturales de las Universidades de El Salvador y de la Universidad de La Laguna (Tenerife, España) con investigadores de la Universidad de San Carlos de Guatemala.

 Propiciar el intercambio de información entre la Epeesista y los alumnos de Química Orgánica III, los cuales contribuyen con su ayuda para proyectos de investigación del LIPRONAT.

2. Actividades Programadas y Realizadas de acuerdo al Plan de Trabajo de EPS Actividad Desarrollada Actividad Específica Desarrollada Conceptos fundamentales Revisión Bibliográfica Métodos de extracción sobre temas Tamizaje Fitoquímico Química de Productos Métodos de Identificación de compuestos químicos Naturales Tamizaje de Actividad Biológica Investigaciones en el área Proyectos de Investigación del LIPRONAT

Cursos Relacionados Métodos de Identificación de compuestos químicos con Química de Química de Productos Naturales: determinación estructural Productos Naturales mediante técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (1 D y 2D) (Universidad de El Salvador) Asistente a conferencias sobre temas de interés Asistente en paneles sobre temas de interés Converciencia 2006 Asistente a foros sobre temas de interés Participante en mesas redondas sobre temas de interés Entrevistas a Conferencistas sobre temas de interés Impartida a estudiantes de Química Orgánica III quienes Conferencia contribuyeron con investigaciones que se desarrollaron en el LIPRONAT durante el año de 2006 A los estudiantes de Química Orgánica III en el desarrollo de Asesoría la parte experimental de su contribución con Proyecto de Investigación del LIPRONAT. Capacitaciones y adiestramientos Laboratorio de Productos Naturales – LIPRONAT- teórico-prácticos Departamento de Citohistologia recibidos

3. Resultados y Discusión Los resultados de las actividades de docencia desarrolladas pueden ser separar en tres distintos grupos dependiendo de la finalidad y los resultados obtenidos con dichas actividades. A continuación se muestran estos tres grupos con sus resultados principales colocados en tablas y con su respectiva discusión de resultados. En el primero y el segundo grupo se encuentran las actividades de docencia indirecta que cumplieron con el fin de aportar a la Epeesista nuevos conocimientos en el área de la Química y a sus distintas ramas. En el primer grupo esto fue gracias al desarrollo de diversas investigaciones y revisiones bibliográficas sobre diversos temas y también debido a participaciones en conferencias, congresos, seminarios, cursos, talleres, foros, mesas redondas entre otros. Los resultados de estas actividades se resumen en el siguiente cuadro:

Tema General o Tema Específico cubierto o actividad específica Actividad Investigación Conceptos fundamentales de temas Métodos de extracción relacionados Tamizaje Fitoquímico con la Métodos de Identificación de compuestos químicos Química de Tamizaje de Actividad Biológica Productos Investigaciones en el área Naturales Proyectos de Investigación del LIPRONAT

Se asistió a conferencias, paneles, foros donde fueron tratados temas Asistencia relacionados con distintas ramas de la Química y ciencias afines Converciencia Se participó en mesas redondas donde fueron tratados temas 2006 relacionados con distintas ramas de la Química y ciencias afines Entrevistas a Conferencistas sobre temas de interés

 Como manejar el estrés  Anticonvulsivantes Asistencia a II  Diabetes: nuevos medicamentos inhalados Minicongreso  Colon irritable de  Aporte de la Biología Celular y Molecular en el Diagnóstico de Farmacología y Enfermedades Genéticas Terapeútica  Bioética: El Uso de Medicamentos Genéricos 2006  Antiofídicos  Antidepresivos  Resistencia asociada al uso de antimicrobianos  Alzheimer  Drogas de Diseño  La ética de la píldora del día siguiente  Seminario Validación Farmacológica de plantas medicinales  Curso de Homeopatía

Al concluir dichas actividades la Epeesista logró elevar su nivel de conocimiento en cuanto a lo relacionado al área de la Química y en especial en el área de Química de Productos Naturales, además logró el intercambio de criterios científicos con profesionales de la Química y de ciencias relacionadas. Así también propició el intercambio de información entre los investigadores de Química de Productos Naturales de las Universidades de El Salvador y de la Universidad de La Laguna con investigadores de la Universidad de San Carlos de Guatemala.

En el segundo grupo de resultados de las actividades de docencia indirecta, se encuentran aquellas actividades en las que la Epeesista recibió capacitaciones y adiestramientos tanto teóricos como prácticas para poder desempeñar distintos ensayos y pruebas de interés, las cuales se describen a continuación:

Capacitaciones y adiestramientos Laboratorio de Productos Naturales – LIPRONAT- teórico-prácticos Departamento de Citohistologia recibidos

Con lo cual se obtuvo el intercambio de criterios técnicos y científicos entre la Epeesista y las personas que laboran tanto en el LIPRONAT como las que laboran en el Departamento de Citohistología, con lo que pudo elevar su nivel de conocimiento en cuanto a lo relacionado al área de la Química y en especial en el área de Química de Productos Naturales.

Y por último en el tercer grupo se encuentran las actividades de docencia directa en las cuales la Epeesista impartió conocimientos adquiridos a estudiantes de la carrera de Licenciatura en Química y a otros estudiantes de la Universidad, mediante la conferencia del proyecto DIGI-IIQB 2006 “Síntesis de Análogos del Medicamento Anti-Alzheimer AMPAKINA CX 516 a partir de los Productos Naturales Eugenol y Piperonal” y mediante asesorías, los detalles se resumen a continuación en la siguiente tabla

Actividad Descripción Proyecto DIGI-IIQB 2006 “Síntesis de Análogos del Medicamento Anti-Alzheimer AMPAKINA CX 516 a partir de los Productos Conferencia Naturales Eugenol y Piperonal”, impartida a estudiantes del curso de Química Orgánica III de la carrera de Licenciatura en Química quienes contribuyeron con investigaciones que se desarrollaron en el LIPRONAT durante el año de 2006 A los estudiantes de Química Orgánica III en el desarrollo de la parte experimental de su contribución con Proyecto de Investigación Asesoría del LIPRONAT. A estudiantes de la universidad que desarrollaron su trabajo de investigación de tesis en el LIPRONAT durante el período correspondiente a las prácticas de EPS.

Gracias a estas actividades de docencia directa la Epeesista pudo compartir su conocimiento con estudiantes tanto de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia como de otras facultades de la Universidad de San Carlos de Guatemala, contribuyendo con la asesoría de tesistas que necesitaban de una persona que les guiará para llevar a cabo la parte experimental de su trabajo de tesis, la cual desarrollaron en el LIPRONAT durante el período de EPS. Además de ello la Epeesista impartió la conferencia “Síntesis de Análogos del Medicamento Anti-Alzheimer AMPAKINA CX 516 a partir de los Productos Naturales Eugenol y Piperonal” a estudiantes del curso de Química Orgánica III de la carrera de Licenciatura en Química quienes contribuyeron con investigaciones del Proyecto DIGI-IIQB 2006 que se desarrollaron en el LIPRONAT durante el año de 2006. Además de la conferencia se les asesoró posteriormente con temas relacionados con lo cual la Epeesista logró el intercambio de información con los alumnos de Química Orgánica III.

4. Conclusiones Los resultados de las actividades de docencia desarrolladas se dividieron en tres distintos grupos dependiendo de la finalidad y los resultados obtenidos con dichas actividades. Los dos primeros grupos se refieren a docencia indirecta y la el tercer grupo se refiere a docencia directa.

En las actividades de docencia indirecta están las actividades que aportaron a la Epeesista nuevos conocimientos en el área de la Química y a sus distintas ramas. Esto gracias al desarrollo de diversas investigaciones y revisiones bibliográficas sobre diversos temas y también debido a participaciones en conferencias, congresos, seminarios, cursos, talleres, foros, mesas redondas y capacitaciones y adiestramientos teórico-prácticos.

Como consecuencia de las actividades de docencia indirecta se logró elevar el nivel de conocimiento en cuanto a lo relacionado al área de la Química y en especial en el área de Química de Productos Naturales, además de lograrse el intercambio de criterios científicos con profesionales de la Química y de ciencias relacionadas tanto de la Universidad de San Carlos de

Guatemala como de la Universidad de El Salvador y de la Universidad de La laguna. En las actividades de docencia directa están aquellas en las que la Epeesista impartió conocimientos a estudiantes tanto de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia como de otras facultades de la Universidad de San Carlos de Guatemala, impartiendo una conferencia y brindando asesorías.

5. Recomendaciones Se recomienda la implementación y adaptación de los conocimientos adquiridos para modificar los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT).

6. Referencias i. Proyecto “Contribución al estudio farmacológico y fitoquímico de plantas medicinales de uso popular en Guatemala”, FIS, 1985-93. ii. Proyecto “Actividad antiinflamatoria de plantas de uso popular en Guatemala”, DIGI, 1992-95. iii. Cáceres A et al. Plants used in Guatemala for the treatment of protozoal infections. 1. Screening of activity to bacteria, fungi and American trypanosomes of 13 native plants. J. Ethnopharmacol. 1998; 62:195. iv. Berger I et al. Plants used in Guatemala for the treatment of protozoal infections. II. Activity of extracts and fractions of five Guatemalan plants against Trypanosoma cruzi. J. Ethnopharmacol. 1998; 62:107. v. Rastrelli L et al. Glycolipids from Byrsonima crassifolia. Phytochem. 1997; 45:647. vi. Rastrelli L et al. Iridoids from Lippia graveolens. Phytochem. 1998; 49:1829. vii. Rastrelli L et al. Antiinflammatory activity-guided fraction of Gnaphalium stramineum. Pharmaceut. Biol. 1998; 36:315. viii. Rastrelli L et al. New 12a-hydroxyrotenoids from Gliricidia sepium bark. J. Nat. Prod. 1999; 62:188. ix. Rastrelli L et al. Studies on the constituents of Gliricidia sepium (Leguminosae) leaves and roots: Isolation and structure elucidation of 16

new triterpenoid saponins and aromatic compounds. J. Agric. Food Chem., 1999; 47:1537. x. Proyecto “Obtención y caracterización de aceite esencial de ajo y jengibre cultivados en Guatemala” FODECYT, 1997. xi. Proyecto “Obtención y caracterización de capsaicina, ingrediente activo y productos fitofarmacéuticos y agroindustriales de tres especies de capsicum cultivadas en Guatemala”, FODECYT, 1999. xii. Proyecto “Caracterización de metabolitos secundarios de extractos de plantas nativas de uso medicinal en Guatemala y de un invertebrado marino del caribe Mesoamericano”, DIGI, 2000. xiii. Proyecto “Caracterización de extractos naturales y aceites esenciales como nuevos recursos para el desarrollo agroindustrial”, DIGI, 2001. xiv. Proyecto “Inventario y evaluación de la biodiversidad tropical centroamericana como fuente de sustancias antimicrobianas, antimicóticas, anticancer, antiprotozoarias e insecticidas”, OEA 1998- 2000 xv. Proyecto “Actividad antimicrobiana de tres plantas de uso etnomédico en la Reserva de la Biosfera Sierra de las Minas”, IIQB 1999-2001. xvi. Proyecto “Extracción y caracterización de aceite esencial y oleorresina de pimienta negra (Piper nigrum L.), alternativa de agroindustrialización para el agricultor guatemalteco” DIGI, 2001. xvii. Proyecto “Obtención y caracterización de aceite esencial de 4 plantas medicinales cultivadas a diferentes niveles altitudinales de Guatemala”, FODECYT No. 77-00 xviii. Proyecto “Caracterización de las fracciones extractables contenidas en el fruto del palo de cera, de arrayán o cera San Pascual (Myrica cerifera), FODECYT No. 50-00 xix. Proyecto xx. Proyecto “Aprovechamiento de la flora regional como fuente de moléculas antifúngicas, antiparasitarias y anticancer”, OEA 2001-2003. xxi. Proyecto “Desarrollo del manejo sostenible de Smilax spp. En ecosistemas naturales y agroforestales de América Central”, CATIE- FONTAGRO 2001-2002.

xxii. Proyecto “Desarrollo agrotecnológico de plantas medicinales con potencial en el mercado interno y de exportación” IPP- AGEXPRONT/AID, 2001-2002. xxiii. Proyecto “Caracterización in situ y manejo de poblaciones de Polypodium spp.”, DIGI, 2001. xxiv. Proyecto “Caracterización in situ y manejo de poblaciones de Smilax spp”, FONACYT, 2001-2002. xxv. Cáceres A et al. Furanocoumarins from the aerial parts of Dorstenia contrajerva. Fitoterapia 2001; 72:376. xxvi. Berger I et al. Antiprotozoal activity of Neurolaena lobata. Phytother. Res. 2001; 15:327.

B. Actividades de Servicio

1. Objetivos

 Contribuir con los proyectos y las actividades de investigación del LIPRONAT.

 Contribuir, cuando sea posible, al mejoramiento de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el LIPRONAT para el desarrollo de sus investigaciones.

2. Actividades Programadas y realizadas de acuerdo al Plan de Trabajo del EPS

Actividades Frecuencia Contribución con Proyectos de Investigación Actividad diaria programados por el LIPRONAT durante el período de tiempo comprendido dentro de la práctica de EPS.

Contribución al mejoramiento de los Procedimientos Actividad única Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el LIPRONAT.

3. Resultados y Discusión de Resultados Los resultados de las actividades de servicio desarrolladas pueden ser separados en dos partes: la primera es la contribución con Proyectos de Investigación del LIPRONAT y la segunda es la contribución al mejoramiento e implementación de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO). A continuación se muestran estas tres actividades en la siguiente tabla de resultados.

Actividades Realizadas Contribución con Proyectos de Investigación programados por el LIPRONAT durante el período de tiempo comprendido dentro de la práctica de EPS.

Contribución al mejoramiento de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el LIPRONAT.

Elaboración de nuevos Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el LIPRONAT.

Fue posible contribuir con distintos proyectos y actividades de investigación que se desarrollaron durante el período de EPS, además luego de una exhaustiva investigación y revisión bibliográfica y el intercambio cultural con investigadores en Productos Naturales de Universidades del exterior (Dr. Marvin Núñez, Universidad de El Salvador, y Dra. Isabel López Bazzocchi, Universidad de La Laguna) se mejoraron en lo posible los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el LIPRONAT para el desarrollo de sus investigaciones.

4. Conclusiones  Se logró contribuir con los distintos proyectos y actividades de investigación desarrollados en el LIPRONAT.  Se logró el mejoramiento de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT).

5. Recomendaciones  La modificación de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT).

 La actualización de los Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) empleados en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT).

 La implementación de nuevos Procedimientos Estándar de Operaciones (PEO) para ser empleados en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT).

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Informe Final de Investigación

Tamizaje Fitoquímico del extracto etanólico de las hojas de la especie Euonymus enantiophylla (“Alís, Rou´j Xiwáan”) y la evaluación de su actividad antifúngica, antibacteriana y citotóxica

Presentado por

Carmen Teresa Garnica Marroquín

Estudiante de la Carrera de

Química

Guatemala, septiembre 2007 Indice 1. Resumen………………………………………………………………………….22

2. Introducción…………………..………………………………………………….22

3. Antecedentes……………………..………………………………………………23

4. Objetivos………………………………………………………….………………43

5. Justificaciones……………………………………………………………………43

6. Aspectos metodológicos…………………………………………….…..………44

6.2 Universo del Trabajo…………………………………..…….………………44

6.3 Recursos Humanos……………………………………….…………………44

6.4 Recursos Físicos……………………………………………….……………45

6.5 Recursos Materiales…………………………………………………………45

6.5.1 Material es………………………………………….…………………45

6.5.2 Equipo de Laboratorio……………………………….………………46

6.5.3 Reactivos………………………………………..……….……………46

6.5.4 Cristalería………………………………………………………..……47

6.6 Procedimiento…………………………………………………….…….……48

7. Resultados y Discusión………………………….……………..……….………51

8. Conclusiones……………………………………………………………..………52

9. Recomendaciones…………………………………….……………....…………53

10. Referencias……………………………….………………………………………53

11. Anexos……………………………………………………………………….……56

C. Actividades de Investigación

1. Resumen Esta investigación ofreció un estudio exploratorio de la familia Celastraceae de Guatemala, ya que fueron obtenidos datos sobre la composición fitoquímica y la actividad biocida de la especie Euonymus enantiophylla, la cual es una especie de Celastraceae perteneciente a la flora de Guatemala. La importancia de los resultados obtenidos radica en que en Guatemala no existían estudios previos sobre la composición fitoquímica y la actividad biocida de plantas representativas de la familia Celastraceaea, de cuya familia existen reportadas diversidad de actividades biocidas. Al concluir la investigación fue confirmada para la especie de estudio la presencia de alcaloides, flavonoides, antocianinas, antraquinonas, cumarinas, cardenólicos y bufadienólicos; pero a pesar de su composición fitoquímica el extracto no presentó actividad ante ninguno de los organismos evaluados. Aunque los resultados obtenidos no fueron los esperados, el conocimiento que se obtuvo sobre la composición química y la actividad biológica de la especie Euonymus enantiophylla servirá como fundamento para estudios posteriores y para estimular el estudio de otras especies de la familia Celastraceae cuyos resultados podrían ser más productivos.

1. Introducción Existen varias medidas terapéuticas tradicionales para diversas enfermedades, sin embargo existen reacciones secundarias a estos tratamientos así como daños graves por su uso prolongado, el cual es inevitable ya que para la mayoría de tratamientos se requieren de varias sesiones de administración. Por ello en la actualidad existe la búsqueda continua de nuevas alternativas de tratamiento para las distintas enfermedades, para así lograr un medicamento eficaz que reduzca o elimine todo efecto secundario a su uso prolongado.

En la actualidad existen estudios previos en África, Asia, El Salvador y España, sobre la composición fitoquímica y la actividad de las plantas pertenecientes a la Familia Celastraceae. Se han estudiado varios de sus 22 géneros, donde se ha encontrado que algunos poseen propiedades antisépticas, antiinflamatorias, antimaláricas, antitumorales, insecticidas y anticancerígenas, y otras especies representantes de esta familia han sido usadas también para el tratamiento del reumatismo y como antitumorales para cáncer de piel. En el presente trabajo de investigación se pretende lograr el estudio de una planta nativa de Guatemala, la Euonymus enanthiopylla perteneciente a la familia de las Celastraceaes la cual no ha sido estudiada antes y promete resultados muy esperanzadores por pertenecer a un género de Celastraceae que ya ha brindado muy buenos resultados en otros países.

2. Antecedentes

A. La Familia Celastraceae

1. Consideraciones Taxonómicas

La familia Celastraceae se conoce como “familia agridulce” (bittersweet family). Las especies de esta familia son árboles y arbustos, a veces trepadores, con hojas opuestas o alternas, simples, coriáceas con frecuencia, con o sin estípulas. En general, poseen flores pequeñas poco llamativas, por lo común verdosas o blancas, regulares, bisexuales o unisexuales, normalmente dispuestas en inflorescencias cimosas. Los sépalos y pétalos se encuentran insertos en un disco carnoso. Las flores poseen de 3 a 5 sépalos, libres o unidos en la base y de 3 a 5 pétalos. Los estambres se encuentran en igual número que los pétalos, rara vez alternando con éstos. El fruto es una cápsula dehiscente o indehiscente, sámara, baya o drupa. Las semillas suelen estar cubiertas, total o parcialmente en la base, de un arilo vivamente coloreado. Esta familia está constituida por 106 géneros y 1300 especies27 con distribución pantrópica, aunque existe un gran número de especies distribuidas en climas cálidos y cálido-templados (Anexo No. 1 de la Distribución geográfica de las Celastráceas). Los géneros más interesantes y representativos28,29 son,

27 Royal Botanic Garden, Kew.: Vascular Plant Families and Genera http:/www.rbgkew.org.uk/cgi- bin/web.dbs/genlist.pl?Celastraceae. (consulta 21.07.2005).

28 Heywood, V. H.: Flowering Plants of the World; Oxford University Press, New York, 1993.

Maytenus con 388 especies, Celastrus con 330 especies, Cassine con 121 especies y Euonymus con 414 especies.

La clasificación botánica de esta familia ha experimentado cambios debido a las hibridaciones.30 Así, el género Maytenus incluye, actualmente, las especies antiguamente incluidas en Gymnosporia y algunas especies de Rhacoma hoy día están incluidas en el género Crossopetalum, lo que ha dado lugar a que muchas especies tengan varios sinónimos.31 En el Cuadro No.1 puede observarse la clasificación taxonómica de la familia Celastraceae de Guatemala.

Cuadro No. 1. División taxonómica de las Celastráceas pertenecientes a la Flora de Guatemala

Familia Género Especie Celastrus chiapensis vulcanicolus Elaeodendron trichotomum Euonymus acuminata enantiophylla belizensis Maytenus guatemalensis matudai schippii guatemalensis Microtropis ilicina occidentalis Perrottetia HBK longistylis eucymosa gaumeri gentlei Crossopetalum lanceifolia Celastraceae puberula riparia standleyi tonduzii Wimmeria bartlettii cyclocarpa pubescens Zinowiewia pallida rubra

tacanesis

29 Woodland, D. W.: Contemporary Plant Systematics; Prentice-Hall, New Jersey, 1991.

30 Brüning, R.; Wagner, H. Phytochemistry. 1978, 17, 1821.

31 Chou, T. Q.; Mei, P. F. J. Physiol., 1936, 10, 529.

En color se muestran los géneros y las especies más abundantes en Guatemala. Elaborado por Carmen Garnica con datos obtenidos de Standley, P.; Séller, J.; Flora de Guatemala, Vol.24, Parte VI. Chicago Natural History Museum. E.U.A. Págs. 201-218. 1949.

2. Usos Etnobotánicos de las Celastráceas Numerosas especies de la Familia Celastraceae son mundialmente conocidas por su uso en la medicina tradicional o en la agricultura, especialmente en Ásia y América Latina.

Se puede citar el uso en Asia de Tripterygium wilfordii (Foto No.1), conocida comúnmente en China como “lei gong teng”, ésta es la especie más estudiada y de la que se han aislado mayor número de principios activos. Las raíces molidas de esta especie se han usado en China durante siglos por sus propiedades insecticidas, estudios llevados a cabo para identificar los principios activos de esta y otras especies con propiedades insecticidas32 condujeron al aislamiento del alcaloide wilfordina y el triterpeno celastrol33 En 1972, Kupchan y col. aislaron de las raíces de esta especie los nuevos diterpenos triepoxídicos, triptolida, tripdiolida y triptonida con una potente actividad antileucémica.34

Tripterygium wilfordii Foto No. 1 Flores y Hojas de Tripterygium wilfordii. Extraída de Beroza, M. J. Am. Chem. Soc., 1953, 75, 2136.

Recientemente, extractos crudos y extractos refinados de T. wilfordii se están usando en clínica para el tratamiento de la artritis reumatoide, espondolitis anquilosante, enfermedades autoinmunes y diversas afecciones dérmicas. Existen diversas patentes sobre el uso de la raíz seca

32 Chou, T. Q.; Mei, P. F. J. Physiol., 1936, 10, 529.

33 Beroza, M. J. Am. Chem. Soc., 1953, 75, 2136.

34 Kupchan, S. M.; Court, W. A.; Dailey, J. R.; Gilmore, C. J.; Bryan, R. F. J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 7194.

de esta especie como antitumoral y de la actividad del extracto clorofórmico como inmunosupresor y antiinflamatorio.35

Celastrus paniculatus (Foto No.2) es una especie ampliamente distribuida en la India, China, Malasia e incluso Australia. Esta planta ha sido usada en la medicina Ayurvédica durante siglos para mejorar la habilidad mental.36 Además, se ha descrito la aplicación de extractos de C. paniculatus para combatir espasmos intestinales, 37 aislándose de esta especie los únicos ejemplos de sesquiterpenos con actividad relajante intestinal.38

Celastrus paniculatus Foto No. 2. Fruto y Hojas de Celastrus paniculatus. Extraída de Gattu, M.; Boss, K. L.; Terry, A. V. Jr.; Buccafusco, J..J. Pharmacology, 1997, 57, 793.

En África, como ejemplos más significativos podemos citar las especies Catha edulis (Foto No.3) y Maytenus senegalensis. Así, Catha edulis, “khat”, es un arbusto de hoja perenne que crece a lo largo de la Costa de África y de la península Arábica. Las hojas y brotes del “khat” son masticadas por sus efectos estimulantes; sin embargo, su consumo produce una sensación de bienestar y excitación, presentando numerosos efectos secundarios, como insomnio y falta de concentración, por lo que su uso abusivo crea grandes problemas de naturaleza social, sanitarios y económicos.39

35 Zheng, J. R.; Gu, K.; Xu, L.; Gau, J.; Yu, Y.; Tang, M. Acta Acad. Med. Sin., 1991, 13, 391.

36 Gattu, M.; Boss, K. L.; Terry, A. V. Jr.; Buccafusco, J..J. Pharmacology, 1997, 57, 793.

37 Kapoor, L. D.: Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants. CRC Press, Boca Raton, pg. 111, 2000.

38 Borrelli, F.; Borbone, N.; Capasso, R.; Montesano, D.; Izzo, A. A.; De Marino, S.; Capasso, F.; Ferrara, L.; Longo, R.; Zollo, F. Planta Med., 2004, 70, 652.

39 Der Krikorian, A. J. Etnopharmacol., 1984, 12, 115. 26

Catha edulis

Foto No. 3. Flores y Hojas de Catha edulis. Extraída de Der Krikorian, A. J. Etnopharmacol., 1984, 12, 115.

Por otra parte, Maytenus senegalensis (Foto No.4), conocida comúnmente como “bademi”, posee numerosos usos en la medicina tradicional. Así, las hojas pulverizadas y bebidas en jugo de leche son usadas como vermífugo; la corteza machada y mezclada con agua posee propiedades anticancerígenas, antimaláricas y antisépticas.40

Maytenus senegalensis

Foto No. 4. Árbol de Maytenus senegalensis. Extraída de González, A. G.; Bazzocchi, I. L.; Moujir, L.; Jiménez, I. A. Studies in Natural Products Chemistry, Bioactive Natural Products; Vol. 23. Ed. Atta-ur-Rahman, Elsevier, Amsterdam, pg. 649, 2000.

En diversas áreas de la Amazonía (Perú, Ecuador y Colombia) el polvo rojo de la corteza de una planta conocida como “chuchuhuasca” es utilizada por los indígenas para el tratamiento del reumatismo y como afrodisíaco (Foto

40 González, A. G.; Bazzocchi, I. L.; Moujir, L.; Jiménez, I. A. Studies in Natural Products Chemistry, Bioactive Natural Products; Vol. 23. Ed. Atta-ur-Rahman, Elsevier, Amsterdam, pg. 649, 2000.

No.5). De forma tópica, es empleado como antitumoral en el cáncer de piel y para combatir la soriasis.41 En los últimos años se ha ampliado de forma apreciable la bibliografía sobre la “chuchuhuasca” y diversas especies del género Maytenus han recibido este nombre (M. chuchuhuasca, M. krukovii, M. colassi y M. laevis).42

Maytenus chuchuhuasca

Foto No. 5. Fruto de Maytenus chuchuhuasca. Extraída de González, J. G.; Delle Monache, G.; Delle Monache, F.; Marini-Bettolo, G. B. J. Ethnopharmacol., 1982, 5, 73.

El representante europeo mejor conocido de la familia Celastraceae, Euonymus europaeus (Foto No.6), es de las pocas especies tóxicas de esta familia. Se cultiva como planta ornamental y para obtener carboncillo de su madera. Antiguamente, los tegumentos se usaban por su color para teñir cuero y sus frutos como purgantes y eméticos, aunque son venenosos.43 Estudios fitoquímicos realizados en esta especie condujeron al aislamiento de poliésteres de tipo β-agarofuránico, algunos de ellos alcaloídicos, con propiedades antialimentaria e insecticida.44

41 González, J. G.; Delle Monache, G.; Delle Monache, F.; Marini-Bettolo, G. B. J. Ethnopharmacol., 1982, 5, 73.

42 Colas, R.: Les plantes amazoniennes designées sous le nom de “Chuchuhuasha”. These Imprimerie André Lesot, Paris, 1937. 43 Perrot, E. : Les Plantes Medicinales, Part 1., Paris, R. R., Press Universitaires de France, Paris, 1971.

44 Descoins, C. Tesis Doctoral, Universidad de La Laguna, 1999.

Euonymus europaeus Foto No. 6. Fruto y hojas de Euonymus europaeus. Extraída de Perrot, E.: Les Plantes Medicinales, Part 1, Paris, R. R., Press Universitaires de France, Paris, 1971.

Como representante de la familia en las Islas Canarias se encuentra Maytenus canariensis (Foto No.7), arbusto de ambiente termófilo, que recibe el nombre local de “peralillo”. Los agricultores y pastores lo usan como estimulante suave, mascando sus hojas para aliviar la fatiga, lo que recuerda al uso del “khat” en África. Sus frutos machacados se utilizan externamente para rebajar tumoraciones en la piel y abscesos cutáneos y la infusión de sus hojas contra el reuma.45 Estudios fitoquímicos de Maytenus canariensis han dado lugar al aislamiento e identificación de numerosos metabolitos secundarios, destacando los sesquiterpenos46 con actividad antialimentaria e insecticida y los nor-triterpenosfenoles con actividad antibiótica y citotóxica.47

Maytenus canariensis

Foto No. 7. Flores de Maytenus canariensis. Extraída de Otero, J.: Nuestras hierbas medicinales. Caja Insular de Ahorros. Santa Cruz de Tenerife, 1984.

45 Otero, J.: Nuestras hierbas medicinales. Caja Insular de Ahorros. Santa Cruz de Tenerife, 1984.

46 González, A. G.; Jiménez, I. A.; Ravelo, A. G.; Bazzocchi, I. L. Tetrahedron. 1993, 49, 6637.

47 González, A. G.; Alvarenga, N. L.; Ravelo, A. G.; Jiménez, I. A.; Bazzocchi, I. L.; Canela, N. J.; Moujir, L. M. Phytochemistry, 1996, 43, 129.

3. Metabolitos Secundarios Aislados de la Familia Celastraceae

De celastráceas se han aislado un gran número de metabolitos secundarios, destacando las fenilalquilaminas, maytensinoides, terpenoides y glicósidos cardiotónicos, los cuales presentan una amplia gama de actividades biológicas, que se describen a continuación.48

a) α-aminopropiofenona [(-)-catinona],

Una fenilalquilamina aislada del “khat” (Catha edulis Forsk), es la principal responsable de los efectos estimulantes que posee dicha planta. La estructura y configuración absoluta de la (-)-catinona es parecida a la (+)- anfetamina y (-)-norseudoefedrina (Figura No. 1), siendo todos ellos estimulantes del sistema nervioso central y de las cuales la (-)-catinona es la más potente.49

O NH2 (-)-norseudoefedrina NH2

(-)-catinona

NH2 (+)-anfetamina Figura No.1. Estructuras de la (-)-catinona, la (+)-anfetamina y (-)- norseudoefedrina. Extraída de Pullen, C.; Schmitz, P; Hoffmann, D.; Meurer, K.; Boettcher, T.; Bamberg, D.; Pereira, A.; Castro, F.; Hauser, M.; Geertsema, H.; Van Wyk, A.; Mahmud, T.; Floss, H.; Leistner, E. Phytochemistry, 2003, 62, 377.

b) Maytensinoides Son compuestos que presentan marcadas similitudes en cuanto a su estructura con los antibióticos del tipo de la rifampicina, por ser ambos ansamacrólidos con diversos enlaces peptídicos (Figura No.2), pero no tienen la misma biogénesis ni la misma actividad biológica. Este tipo de metabolitos estimuló el estudio de la Familia Celastraceae como posible fuente de

48 González, A.G.; Bazzochi, I. L.; Jiménez, I. A. Studies in Natural Products Chemistry, Bioactive Natural Products; Vol. 23. Ed. Atta-ur-Rahman, Elsevier, Amsterdam, pág. 649.2000.

49 Ahmed, M. B.; El Qirbi, A. B. J. Etnopharmacol., 1993, 39, 213. 30 sustancias bioactivas, pero recientemente se ha sugerido que las maytensinas no son metabolitos secundarios de la Familia Celastraceae sino de un hongo/bacteria asociado a ella.50 Maytensina es un agente antitumoral excepcionalmente interesante, que presenta actividad a dosis de microgramos por kilogramo de individuo. Sin embargo, debido a sus efectos secundarios (hepatotóxicos) se abandonó su aplicación clínica. Recientes investigaciones han dado una nueva posibilidad para su uso terapéutico, al combinarla con anticuerpos específicos.51

N H O HO

O OHOHO O Cl O O H O MeO NH MeO N N O N O OH N O N O O OH MeO H

Rifampicina MaytansinaMaytensina

Figura No.2. Estructura de Maytensina en comparación con la Rifampicina. Extraído de Liu, C.; Chari, V. J. Expert. Opin. Invest. Drugs, 1997, 6, 169.

c) Terpenoides Es sin duda el grupo más numeroso de compuestos biactivos de la familia Celastraceae. Los terpenoides son un grupo de metabolitos secundarios con gran diversidad estructural, que están formados por la repetición de una unidad de isopreno, que se unen entre sí, mediante una reacción “cabeza- cola”. Entre los terpénoides se puede mencionar a los monoterpenos constituidos por dos unidades de isopreno (C10), los sesquiterpenos constituidos por tres unidades (C15), los diterpenos por cuatro unidades (C20) y los triterpenos por seis unidades de isopreno (C30).

50 Pullen, C.; Schmitz, P; Hoffmann, D.; Meurer, K.; Boettcher, T.; Bamberg, D.; Pereira, A.; Castro, F.; Hauser, M.; Geertsema, H.; Van Wyk, A.; Mahmud, T.; Floss, H.; Leistner, E. Phytochemistry, 2003, 62, 377.

51 Liu, C.; Chari, V. J. Expert. Opin. Invest. Drugs, 1997, 6, 169. 31

i. Monoterpenos Son compuestos volátiles que forman parte de los aceites esenciales. La β-thujona, es el monoterpeno responsable del olor característico de las hojas frescas del “khat” (Figura No.3).52

β-Thujona Figura No.3. Estructura del Monoterpeno β-thujona. Extraído de Yang, D.; Ye, M. X.; Pang, K. W.; Zou, N.; Letcher, R. M. J. Org. Chem., 1998, 63, 6446.

ii. Sesquiterpenos y alcaloides sesquiterpénicos Con esqueleto básico de dihidro-β-agarofurano (Figura No. 4), se consideran indicadores quimiotaxonómicos de la Familia Celastraceae. Se han descrito una amplia gama de propiedades biológicas para estos metabolitos, como antialimentaria e insecticida y recientemente, inmunosupresora, antitumoral, inhibidora de la multirresistencia a fármacos y de la activación del virus Epstein-Barr, así como actividad anti-VIH.53

OAc OAc OAc

AcO O OAc OAc OBz AcO OAc O O HO O OAc O HO O OH N O Celangulin Orthosphenina Figura No. 4. Ejemplos de sesquiterpenos con esqueleto básico de dihidro-β- agarofurano. Extraído de Setzer, W. N.; Setzer, M. C.; Hopper, A.; Moriaty, D.; Lehrman, G. K.; Niekman, A.; Morcomb, S.; Bates, R. B.; Mc. Clure, K.; Stessman, C.; Haber, W. Planta Med., 1998, 64, 583.

52 Saleh. Q. Planta Med., 1972, 21, 410.

53 Spivey, A. C.; Weston, M.; Woodhead, S. Chem. Soc. Rev., 2002, 31, 43.

iii. Diterpenos Son poco frecuentes en esta familia. Se han aislado algunos metabolitos con esqueletos de isopimarano, abietano y abietatrieno. Estos últimos, poseen estructuras muy oxidadas como la triptolida (Figura No. 5), un triepóxido aislado de las raíces de T. wilfordii y uno de los responsables de la actividad antileucémica e inmunosupresora de esta planta,54 que se comercializa en China, además para el control de la fertilidad.55

O O OH O O

O Triptolida

Figura No. 5. Estructura de triptolida. Extraído de Zhang, Z.; Ding, L.; Qian, S.; An, D. J. Chin. Pharm. Sci., 1993, 2, 144.

iv. Triterpenos Se presentan con diferentes esqueletos, tanto tetracíclicos como pentacíclicos, con la singularidad de que algunos de ellos presentan sistemas metilenquinónicos sobre un esqueleto de friedelano, denominándose a estos compuestos nortriterpenometilenquinonas. Este tipo de compuestos sólo se han aislado de la familia Celastraceae, considerándose un indicador quimiotaxonómico. Sobre estos metabolitos se han descrito una gran diversidad de actividades biológicas. Así, por ejemplo la tingenona (Figura No.6) presenta actividad citotóxica frente a las líneas celulares Hep-G2, H-4-II y 56 SK-Mel-28 con CI50 de 1.9, 2.7 y 1.7 μM, respectivamente y actividad antimicrobiana frente a diferentes bacterias.57 Otro triterpeno interesante es el ácido salaspérmico (la estructura de este triterpeno puede observarse en la

54 Yang, D.; Ye, M. X.; Pang, K. W.; Zou, N.; Letcher, R. M. J. Org. Chem., 1998, 63, 6446.

55 Zhang, Z.; Ding, L.; Qian, S.; An, D. J. Chin. Pharm. Sci., 1993, 2, 144.

56 Setzer, W. N.; Setzer, M. C.; Hopper, A.; Moriaty, D.; Lehrman, G. K.; Niekman, A.; Morcomb, S.; Bates, R. B.; Mc. Clure, K.; Stessman, C.; Haber, W. Planta Med., 1998, 64, 583.

57 Sotanaphun, U.; Lipipum, V.; Suttisri, R.; Bavovada, R. Planta Med., 1999, 65, 450.

Figura No.6), que muestra actividad anti-VIH, al ser un inhibidor de la transcriptasa inversa del virus.58

COOH O

HO HO O Ácido Salaspérmico Tingenona

Figura No.6. Estructura del ácido salaspérmico y de la tingenona. Extraído de Chen, K.; Shi, Q.; Kashiwada, Y.; Zhang, D.; Hu, C.; Jin, J.; Nozaki, H.; Kilkuskie, R.; Tramontano, E. J. Nat. Prod., 1992, 55, 340.

d) Glicósidos cardiotónicos Son muy abundantes en las semillas y raíces del género Elaeodendrom. Los metabolitos más interesantes de este grupo son los elaeodendrósidos (Figura No.7), esteroides aislados de Elaeodendrom glaucum Pers con una marcada actividad cardiotónica.59

O O O HO O O O OH O O Elaeodendrósido A

Figura No. 7. Estructura del Elaeodendrósido. Extraído de Shimada, K.; Kyuno, T.; Nambara, T.; Uchida, I. Chem. Pharm. Bull., 1982, 30, 4075.

58 Chen, K.; Shi, Q.; Kashiwada, Y.; Zhang, D.; Hu, C.; Jin, J.; Nozaki, H.; Kilkuskie, R.; Tramontano, E. J. Nat. Prod., 1992, 55, 340.

59 Shimada, K.; Kyuno, T.; Nambara, T.; Uchida, I. Chem. Pharm. Bull., 1982, 30, 4075.

e) Ciclopéptidos Macrocíclicos En la familia Celastraceae sólo dos especies han presentado ciclopéptidos macrocíclicos; una serie de estos fueron aislados de Euonymus europeaus60 y recientemente, se aisló de la corteza de raíz de Tripterygium wilfordii, el ciclopéptido denominado triptotin L (Figura No.8).61

O H N N H O O O NH O O O HN NH HN HN NH O O O O NMe 2

Frangulanina Triptotin L Euonymus europeaus Tripterygium wilfordii

Figura No.8. Estructura de los ciclopéptidos frangulina y triptotin. Extraído de Yang, G.-Z.; Li, Y.- C. Helv. Chim. Acta, 2002, 85, 168.

4. Géneros más representativos de las celastráceas 4.1. Género Maytenus Se caracterizan por ser arbustos o arbolillos a veces espinosos, con hojas fasciculadas o alternas, a menudo dísticas, enteras o dentadas. Flores en cimas, tirsos, racimos o fascículos. Son bisexuales y en ocasiones unisexuales, monoicas o dioicas. Cáliz con 4-5 dientes. Corola con 4-5 pétalos extendidos. Androceo con 4-5 estambres libres o unidos, reducidos a estaminodios en las flores unisexuales femeninas. Fruto en cápsula dehiscente de 2-5 valvas con semillas de arilo carnoso coloreado. Comprende unas 255 especies nativas de los trópicos y subtrópicos. Algunos ejemplos representativos de este género son la Maytenus senegalensis (Lam.) Exell, la Maytenus boaria Mol, y la Maytenus canariensis (Loes.) G.Kunkel & Sund (Foto No.8). 43

60 Bishay, D. W.; Kowalewski, Z. Phytochemistry, 1973, 12, 693.

61 Yang, G.-Z.; Li, Y.- C. Helv. Chim. Acta, 2002, 85, 168

Foto No. 8. Frutos de Maytenus canariensis. Extraído de Familia Celastraceae: www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm.

4.2. Género Celastrus Son arbustos o arbolillos erectos o la mayoría de veces escandentes, con hojas alternadas, membranosas, pecioladas. Flores algunas veces unisexuales, en racimos o fascículos terminales o axilares. Cáliz con 5 dientes. Corola con 5 pétalos insertados alrededor del anillo. Androceo con 5 estambres insertados en el disco. Fruto en cápsula dehiscente de 2-4 valvas con semillas de arilo carnoso coloreado. Algunos ejemplos representativos de este género son Celastrus scandens (Foto No.9), Celastrus paniculatum, y Celastrus orbiculatus (Foto No.10)43

Foto No. 9. Frutos de Celastrus scandens, llamada a veces “dulcamara americana”. Extraído de Familia Celastraceae: http:/ www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm.

Foto No. 10. Frutos y hojas de Celastrus orbiculatus. Extraído de Familia Celastraceae: http:/ www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm.

4.3. Género Cassine Son arbustos o árboles siempreverdes con ramillas tetrágonas y hojas alternas u opuestas, enteras o aserradas, coriáceas. Flores pequeñas dispuestas en cimas axilares. Perianto con 3-5 segmentos, con los sépalos a veces carnosos y los pétalos mayores que los sépalos. Androceo con 3-5 estambres más cortos que los pétalos. Fruto indehiscente, drupáceo, oblongo- globoso, ligeramente carnoso. Comprende unas 80 especies nativas de los trópicos y subtrópicos. Algunos ejemplos representativos de este género son Cassine australis (Vent.) Kuntze, Cassine papillosa (Hochst.) Kuntze, y Cassine orientalis (Jacq.) Kuntze (Foto No.11).43

Foto No. 11. Frutos de Cassine orientalis. Extraído de Familia Celastraceae: http:/ www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm.

4.4. Género Euonymus Las plantas pertenecientes a este género se caracterizan por ser árboles y arbustos erectos (especies guatemaltecas) o raramente escandentes, usualmente glabros, las ramas tetrágonas, hojas opuestas, pecioladas, coriáceas a membranosas, enteras o aserradas, estípula caduca; flores 37 pequeñas, verdes o purpurinas, cimosas, las cimas pedunculadas, axilares, generalmente con pocas flores; cáliz tetra o pentámera, los segmentos extendidos o recurvados; pétalos 4 o 5, insertos en la parte baja del disco, extendidos, enteros, dentados o fimbrillados, estambres 4 o 5, insertos sobre o en el margen del disco, filamentos tubulados, usualmente son muy cortos, las anteras anchas, didímos; disco carnoso, grande, explanado, de 4 a 5 lóbulos; ovarios inmersos en un disco y confluente con el; estilo corto, el estigma con 4 o 5 lóbulos; óvulos comúnmente 2 en cada carpelo, ascendentes o resupinados en el ángulo interior, cápsula con 4 o 5 cárpelos en ocasiones angulados, coriáceos, frecuentemente tuberculados o equinados, carpelos con 1 o 2 semillas, loculicidos con 3 a 5 valvas; semillas encenagas en un arilo, las testa cartácea; endospermo carnoso; embrión ostótropos, los cotiledones anchos, foliáceos, la radícula inferior.44

Existen reportadas en la actualidad 414 especies, comúnmente en regiones templadas, y en los trópicos encontrados en regiones montañosas, la mayoría de las especies son asiáticas, también existen reportadas Europa y América. Algunos ejemplos representativos de este género son Euonymus europaeus L (Foto No.12), Euonymus hamiltonianus Wall, Euonymus japonicus Thunb (Foto No.13), y Euonymus oxyphyllus Miq. 62

Foto No. 12. Frutos de Euonymus europaeus. Extraído de Familia Celastraceae: disponible en www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm.

62 Familia Celastraceae: disponible en www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm. Fecha de Consulta: (20/ 10/2005).

Foto No. 13. Flores de Euonymus japonicus. Extraído de Familia Celastraceae: disponible en www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm.

4.4.1. Especie de Estudio Euonymus enantiophylla (“Alís, Rou’j Xiwáan”) Esta especie es común en bosques mixtos de 1,899 a 3,000 metros; endémico; en la República de Guatemala se encuentra en Baja Verapaz; El Progreso; Chimaltenango; Sololá; Sacatepequez; Suchitepequez; Quiché (donde fue por primera vez recolectado, tipo como el “Chiúl”,). 44

Las plantas pertenecientes a esta especie se caracterizan por ser un árbol o arbusto glabro, en ocasiones posee 7 m de altura. Sus ramas cuando jóvenes son delgadas, verdes y anguladas. Posee hojas delgadas y membranosas, en pecíolos de 3 a 7 mm de largo, ovado-lanceolado u oblongo-elíptico de 8 a 11 cm de diámetro y de 2.5 a 3.5 cm de ancho, acuminada o largamente- acuminada, redondeada u obtusa en la base, crenado-serrulado, con puntos debajo de la hoja. Tiene cimas largamente pedunculadas, simples o doblemente tricotómicas, ramas muy delgadas, pedúnculos de 2 a 3.5 cm de largo. Sus sépalos son semiorbliculares, de 1 mm de largo, pétalos redondeado-obovado de 4 mm de largo, estilos muy cortos cápsulas subglobosas, verdosas de 1 cm de diámetro, suave de 2 a 3 carpelos y arilo rojo (Foto No.14 y 15). La madera de este género posee un color blanco- amarillento, es de textura fina y fácil para trabajar. Las especies europeas son usadas para tornear, limas para manicure, y otros artículos pequeños. 63

63 Standley, P.;Séller, J.; Flora de Guatemala, Vol.24, Parte VI. Chicago Natural History Museum. Págs. 201-218. E.U.A. 1949.

Foto No. 14. Parte Aérea de Euonymus enantiophylla (hojas, rama y fruto). Tomada por Carmen Garnica de las muestras de referencia del Herbario BIGU, Facultad de Ciencias Química y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala. Enero 2007.

B. Extractos Vegetales 1. Definición Los extractos son preparaciones de consistencia líquida (extractos fluidos y tinturas), semisólida (extractos blandos) o sólida (extractos duros y secos), obtenidos a partir de drogas vegetales.

2. Producción Los extractos se preparan utilizando etanol anhidro, soluciones hidro- alcohólicas u otros disolventes apropiados. Para extractos blandos y secos en los que el disolvente orgánico se elimina por evaporación, puede utilizarse un disolvente recuperado o reciclado, a condición de que los procesos de recuperación sean controlados y vigilados para garantizar que los disolventes satisfacen las especificaciones apropiadas antes de su reutilización o mezcla con otros materiales aprobados. Cuando proceda, la concentración hasta obtener la consistencia deseada se realiza utilizando rotavapor, generalmente a presión reducida y a una temperatura a la cual sea mínima la degradación de los constituyentes.

3. Extractos Secos i. Definición Los extractos secos son preparaciones sólidas, obtenidas por evaporación del disolvente utilizado para su producción. En general, los extractos secos tienen una pérdida por desecación o un contenido de agua no superior al 5 por ciento m/m.

4. Concentración usando Rotavapor La concentración representa la etapa siguiente al proceso de extracción. El proceso de concentración busca aumentar el contenido de sólidos totales en el extracto con la finalidad de alcanzar un determinado contenido del residuo seco, producir extractos blandos, como etapa preliminar en la producción de extractos duros, los extractos también pueden ser concentrados para la extracción en contracorriente con disolventes no miscibles, con miras a la fabricación de extractos purificados o el aislamiento de sustancias puras.

C. Análisis de Actividades 1. Tamizaje de la Actividad Antimicótica in vitro El tamizaje de la actividad antimicótica consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento de un hongo determinado en condiciones estándar con una concentración previamente determinada como punto de corte (entre 500-1000 mg/mL) de un extracto, fracción o compuesto obtenidos de una droga vegetal.

a) Tamizaje de la Actividad Antilevadura in vitro El tamizaje de la actividad antilevadura consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento de una levadura en condiciones estándar con una concentración previamente determinada como punto de corte (entre 500-1000 mg/mL) de un extracto, fracción o compuesto obtenidos de una droga vegetal.

2. Tamizaje de la Actividad Antibacteriana in vitro El tamizaje de la actividad antibacteriana consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento de una bacteria determinada en condiciones estándar con una concentración previamente determinada como punto de corte 41

(500-1000 mg/mL) de un extracto, fracción o compuesto obtenidos de una droga vegetal.

3. Tamizaje de la Actividad Citotóxica contra Artemia Salina Artemia salina o camarón salino es un crustáceo cuyas larvas (nauplios) son sensibles a una gran variedad de sustancias. Los nauplios de A. salina son utilizados como organismos blanco para detectar la bioactividad de compuestos extraídos de plantas y la toxicidad a estos crustáceos presenta una buena correlación con actividad antitumoral. El tamizaje de la actividad citotóxica consiste en poner de manifiesto la tolerancia de los nauplios a una determinada concentración (1000 mg/mL) del extracto, fracción o compuesto en condiciones estándar previamente determinadas.

4. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) Consiste en cuantificar la concentración mínima de un extracto, fracción o compuesto obtenidos de una droga vegetal que ha demostrado actividad en una prueba de tamizaje previo. Se emplean diluciones seriadas del extracto y concentraciones constantes del microorganismo y se evalúa el crecimiento del microorganismo en un ensayo estandarizado similar al que sirvió de tamizaje.64

D. Tamizaje Fitoquímico El tamizaje fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. Consiste en la extracción de la planta con disolventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración y análisis por

64 Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia., Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

42 cromatografía en capa fina. Permite la evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo.65

3. Objetivos Principales

 Identificar botánicamente la especie Euonymus enantiophylla y recolectar la parte aérea de la misma en regiones boscosas del Volcán San Pedro en el Departamento de Sololá en la República de Guatemala.

 Obtener el extracto etanólico de las hojas de la especie Euonymus enantiophylla.

 Identificar las familias de metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico obtenido de las hojas de la especie de estudio.

 Evaluar la actividad antifúngica, antibacteriana y citotóxica, del extracto obtenido de la especie Euonymus enantiophylla.

 Aprobar o rechazar la siguiente hipótesis: “Por lo menos uno de los componentes del extracto etanólico de las hojas de Euonymus enantiophylla (“Alís, Rou’j Xiwáan”), posee como mínimo un tipo de actividad biocida: antifúngica, antibacteriana o citotóxica.

4. Justificación A pesar de que en Guatemala existen más de 25 especies pertenecientes a la familia Celastraceae no existen estudios sobre la composición fitoquímica y la actividad biocida de las mismas. Es aquí donde radica la importancia de esta investigación ya que el mismo podría ofrecer un estudio exploratorio para Guatemala, gracias al cual se obtendrían datos de la composición fitoquímica

65 Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

43 de una especie perteneciente a la familia Celastraceae, la Euonymus enantiophylla, así como datos sobre su actividad biocida.

Es por ello que se pretende que la presente investigación sirva como fundamento para estudios posteriores, en donde el conocimiento obtenido sobre la composición química y la actividad biológica de la especie Euonymus enantiophylla, nativa de Guatemala, sirvan de precursores para el desarrollo de una opción terapéutica adecuada. Además se espera que la presente investigación estimule el estudio de otras especies de la familia Celastraceae cuyos resultados podrían ser muy prometedores.

5. Aspectos Metodológicos 6.1 Universo de Trabajo Planta nativa guatemalteca pertenecientes a la Familia Celastraceae, especie Euonymus enantiophylla

Muestra Extractos etanólico de hojas secas de Euonymus enantiophylla, la misma ha sido seleccionada con base en cuatro criterios: - Que la planta Euonymus enantiophylla es nativa de Guatemala. - Que no existen estudios previos acerca de la actividad biológica de dicha planta. - Que no existen estudios previos acerca de la composición fitoquímica de la planta. - Que existen reportes de estudios del uso medicinal de plantas pertenecientes a la familia Celastraceae nativas de otras partes del Mundo.

6.2 Recursos Humanos

- Carmen Teresa Garnica Marroquín (Química Epeesista) - Doctor Óscar Manuel Cóbar Pinto (Jefe inmediato -LIPRONAT- y asesor trabajo de investigación de EPS) 44

- Licenciada Isabel Gaitán (investigadora del Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistologia de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia) - Personal que labora en el LIPRONAT - Personal que labora en el Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistologia de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia - Ingeniero Mario Veliz (Director del Herbario BIGU de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia) - Asesores Externos de trabajo de investigación Doctor Marvin Núñez (Universidad de El Salvador) y Doctora Isabel López Bazzocchi (Universidad de La Laguna, España)

6.3 Recursos Físicos

- Instalaciones del cuarto de Investigaciones ubicado en el Laboratorio No. 4 del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. - Instalaciones del Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistologia de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia). - Instalaciones del LIPRONAT - Instalaciones del Herbario BIGU de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

6.4 Recursos Materiales

6.4.1 Materiales y Equipo de Laboratorio

Materiales - asa de nicromo - fósforos - Puntas amarillas de 200 L - Puntas azules de 1000 L

- Papel parafilm - Viales - Huevos de Artemia salina - Microplaca - Pipeteadores - Baño maría - Agitador magnético - Placas y cámaras cromatográficas

Equipo - autoclave - balanza analítica - campana bacteriológica - incubadora - mechero - microscopio - refrigeradora - vortex (agitador) - rotavapor - Aparato para secado artificial - Estereoscopio - Estufa - Bomba de oxígeno para pecera - Lámpara de luz blanca - Lámpara de luz UV

Reactivos - agar-agar - agar saboraud - agar Muller Hinton - Caldo tripticasa soya - agua desmineralizada - dextrosa - Solución salina 46

- etanol 50% - etanol 70% - fenol 5% - metanol

- fosfato diácido de potasio (KH2PO4) - peptona - sangre de carnero

- sulfato de sodio (Na2SO4). - Sal de mar - Reactivos específicos para cada grupo de metabolitos - Ácidos, bases, disolventes orgánicos y estándares según el caso

Cristaleria - beakers de 250 y 500 mL - equipo sohxlet - Probetas - cajas de petri - Cajas de petri cuadriplate - cámara de Neubauer - campanillas de Durham - erlenmeyer de 500 mL y con tapón de rosca de 250 mL - frascos con tapón de rosca - pipetas automáticas de 10 a 1000 µl - tubos de vidrio con tapadera de rosca de 15 mL - Balones aforados - Embudo - Termómetro - Tubos de ensayo - Micropipetas

Otros - Cuchillo de monte - Tijeras de podar

- Tijeras - Prensa - Cuerda para apretar las rejillas - Papel periódico - Cartones corrugados - Papel mayordomo - Algodón - Regla graduada en mm - Marcador indeleble - Pecera para cultivo - Programa de computadora Finney (DOS). - Asperjador de vidrio

6.5 Procedimiento Las etapas principales del desarrollo del tema fueron:

Etapa Descripción Recolección de parte aérea de especie Euonymus Recolección enantiophylla en la región boscosa del Volcán San Pedro en el Departamento de Sololá en la República de Guatemala.

Identificación Botánica de la planta de estudio en género y especie (Ingeniero Mario Véliz Director del Herbario de la Identificación de Escuela de Biología (BIGU) de la Facultad de Ciencias la Planta Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala).

Obtención de alrededor de 500 gramos de hojas secas de Secado y especie Euonymus enantiophylla, empleando equipo para Molienda secado con fuente de calor artificial. Molienda con tamiz adecuado.

Obtención del extracto etanólico de la planta recolectada Extracción y empleando alcohol etílico al 95 %, método Soxhelt y Concentración Rotavapor.

Tamizaje de las principales familias de metabolitos secundarios del extracto etanólico. Éstos se llevaron a cabo Tamizaje según método empleado en el Laboratorio de Investigación Fitoquímico de Productos Naturales (LIPRONAT) de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala como Procedimiento Estándar de Operaciones (PEO) Tamizaje de actividades del extracto etanólico de la planta, Tamizaje de según método empleado en el Laboratorio de Bioensayos Actividad del Departamento de Citohistología de la Facultad de Antibacteriana, Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Antifúngica, Carlos de Guatemala como Procedimiento Estándar de Citotóxica Operaciones (PEO)

6.6 Diseño de la Investigación a. Composición Fitoquímica Evaluación: se evalúa en forma descriptiva de acuerdo a los resultados del tamizaje fitoquímico. Análisis: Cambio de coloración de la muestra vegetal en reacciones y en cromatografía de capa fina, comparada con coloración de estándares específicos para cada prueba.

b. Tamizaje de Actividades antifúngicas y antibacterianas Evaluación: La determinación y detección de la concentración de los extractos de la planta de estudio tiene de base una concentración de 1mg/ml; para antifúngica, 10 mg/ml; para antibacteriana y haciendo diluciones seriadas en los casos positivos se determina la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). Diseño totalmente al azar con 4 replicas por cada microorganismo a probar (Anexo No.3), para un nivel de significancia α=0.10 Para el experimento, se 49 realizan cuatro repeticiones para cada actividad correspondiente a cada extracto. Análisis: Se espera que en las cuatro repeticiones se observe 100% de mortandad de los microorganismos (Anexo No. 3), si es así se procede a realizar las diluciones para medir la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). Prueba de hipótesis binomial de la respuesta crecimiento (actividad negativa) o inhibición de crecimiento (actividad positiva), se espera que las cuatro replicas den actividad positiva para rechazar Ho y concluir que los metabolitos del extracto tienen actividad. Ho: p=q= 0.5 (No tiene actividad) Ha: p>q

c. Actividad Citotóxica Evaluación: Se realiza un ensayo de citotoxicidad con Artemia salina donde como primer paso se prueba una solución del extracto en agua de mar por triplicado a una concentración 0.01 g/ ml, en caso positivo se determina la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) haciendo diluciones seriadas a partir de la concentración inicial probada. Análisis: Se espera que en las tres repeticiones iniciales observar 100% de mortandad de los nauplios de A. salina, si es así se procede a realizar las diluciones. Prueba de hipótesis binomial de la respuesta crecimiento (actividad negativa) o inhibición de crecimiento (actividad positiva), se espera que las cuatro replicas den actividad positiva para rechazar Ho y concluir que los metabolitos del extracto tienen actividad. Ho: p=q= 0.5 (No tiene actividad) Ha: p>q

Muestreo Recolección de hojas de especie Euonymus enantiophylla en la región boscosa del Volcán San Pedro en el Departamento de Sololá en la República de Guatemala.

Variables de Interés  Metabolitos secundarios contenidos en el extracto etanólico de la especie Euonymus enantiophylla.  Respuesta de los organismos de estudio frente a las distintas pruebas de tamizaje de actividad biológica.

Análisis Resultados  Reconocimiento metabolitos secundarios en el extracto etanólico.  Evaluación de respuesta de los organismos de estudio frente a las pruebas de actividad biológica.

7. Resultados y Discusión Los resultados de la investigación desarrollada se encuentran separadas en dos grupos: resultados del tamizaje fitoquímico y resultado del tamizaje de actividades biológicas, a continuación se muestran los resultados principales colocados en tablas y con su respectiva discusión de resultados.

Tamizaje Fitoquímico Familia de Resultado Observaciones Metabolitos alcaloides + Fluorescencia flavonoides y + fluorescencia antocianinas antraquinonas + Fluorescencia amarilla y rojo-café cumarinas + Fluorescencia verde cardenólicos y + Formación de anillo púrpura bufadienólicos saponinas - No se observó la formación de espuma principios amargos - No se observó fluorescencia del color respectivo Esteroles - No se observó la formación de anillo insaturados púrpura

Tamizaje de Actividades biológicas

Organismo de estudio Especie Estudiada Resultado Observaciones Gram + Staphylococcus aureus - Bacillus subtilis - Bacteria Escherichia coli - En todas las pruebas se Gram - Pseudomonas aeruginosa - observó actividad Salmonella typhi - negativa (-) del extracto Miceliares Micobacterium - etanólico de Euonymus Hongo tuberculosis enantiphylla Micobacterium smegmates - Levadurifor Candida alvicans - mes Cryptococcus neoformans - Artemia Salina -

Interpretación de Resultados

Actividad + Inhibición crecimiento - crecimiento

Como puede observarse en la tabla de resultados de Tamizaje Fitoquímico se confirmó la presencia de alcaloides, flavonoides y antocianinas, antraquinonas, cumarinas, y cardenólicos y bufadienólicos gracias a fluorescencia o cambios de color específica para cada una de las pruebas. Pero a pesar de su composición fitoquímica el extracto de la planta Euonymus enantiophylla no presentó actividad ante ninguno de los organismos evaluados como puede observarse en la tabla de Tamizaje de Actividades, esto pudo deberse a la baja concentración que pudieran presentar dichos metabolitos en el extracto, lo cual produciría una cantidad muy baja de metabolitos en la solución empleada para llevar a cabo las pruebas de actividades lo cual no lograría ser suficiente para inhibir el crecimiento de los organismos evaluados.

8. Conclusiones  Se confirmó la presencia de alcaloides, flavonoides y antocianinas, antraquinonas, cumarinas, y cardenólicos y bufadienólicos en el extracto etanólico de la especie de estudio.  A pesar de su composición fitoquímica el extracto de la planta Euonymus enantiophylla no presentó actividad ante ninguno de los organismos evaluados. 52

9. Recomendaciones  Realizar el tamizaje fitpquímico y de actividades biocidas a particiones del extracto etanólico de la planta de estudio.  Realizar estudios a otras especies de Celastraceae de Guatemala.

10. Referencias de Investigación

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37. Bishay, D. W.; Kowalewski, Z. Phytochemistry, 1973, 12, 693.

38. Yang, G.-Z.; Li, Y.- C. Helv. Chim. Acta, 2002, 85, 168.

39. Familia Celastraceae: disponible en www.arbolesornamentales.com/Celastraceae.htm. (Fecha de Consulta: 20.10.2005).

40. Standley, P.;Séller, J.; Flora de Guatemala, Vol.24, Parte VI. Chicago Natural History Museum. Págs. 201-218. E.U.A. 1949.

41. Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia., Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

42. Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

43. Dr. P. Font Quer, Diccionario de Botánica; Labor, S.A. España, 1953, 1236 pags

44. Gran Sopena, Diccionario Enciclopédico, XX Volúmenes; Ramón Sopena S.A. Barcelona, España.

IV. Anexos

Anexo No. 1. Mapa distribución geográfica de las Celastráceas

Se observa en anaranjado las regiones en donde se encuentran plantas pertenecientes a la familia de las Celastráceas. Heywood, V. H.: Flowering Plants of the World; Oxford University Press, New York, 1993.

Anexo No. 2. Clasificación Taxonómica de la Familia Celastraceae

División Spermathophyta Subdivisión Magnoliophyta (Angiospermas) Clase Magnoliatae Subclase Rosidae Suborden Celastranae Orden Celastrales Familia Celastraceae

Brüning, R.; Wagner, H. Phytochemistry. 1978, 17, 1821.

Anexo No. 3. Cuadros de Microorganismos a emplear y de Interpretación de Resultados para Tamizaje de Actividades Biológicas

Microorganismos a emplear

Organismo de estudio Especie Representante Observaciones Gram + Staphylococcus aureus Empeora cuadro IG Bacillus subtilis Empeora cuadro IG Bacterias Escherichia coli Gastrointestinal Gram - Pseudomonas aeruginosa Nosocomial Salmonella typhi Gastrointestinal Miceliares Micobacterium tuberculosis ---- Hongos Micobacterium smegmates ---- Levaduriformes Candida alvicans ---- Cryptococcus neoformans ---- Artemia Salina ---- Elaborado por Carmen Garnica, datos tomados de Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Interpretación de Resultados

Actividad + Inhibición crecimiento - crecimiento Elaborado por Carmen Garnica, datos tomados Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia., Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Anexo No. 4. Glosario

1. Arilo: (del bajo latin arillus, pepita de la uva). M. Excrecencia que se forma en la superficie del rudimento seminal (o en el extremo del funículo) localizada en muy diversos puntos del tegumento externo y también muy variable por su desarrollo. Aplícase al fruto cuyo pericarpio se abre naturalmente al llegar la época de la madurez, para dar salida a la semilla.66

2. Baya: (del frances baie, y éste del latín, baca). Fruto de algunas plantas, carnoso y jugoso. Contiene semillas rodeadas de pulpa, como la uva y la grosella.

3. Coriáceas: (del latín coreacêus, de corîum, cuero). Dícese de los órganos que, como a veces las hojas y las brácteas, y también los pericarpios secos y delgados de algunos frutos, con sus alas, sus espermodermos, etc. , son firmes duros y presentan una consistencia bastante parecida a la del cuero.

4. Dehiscente: (del latín dehicens, -entis, p.a. de dehiscere, abrirse), adj que se abre, hablando de un fruto o de esporangio, de una antera etc.

5. Dídimos: (del griego dídumos, gemelo, mellizo), adj. Aplicase a los órganos o partes orgánicas que forman pareja, hermanados o gemelos como los tubérculos de diversas orquídeas.67

6. Distribución Pantrópica: (del griego pân, todo y de trópico). Dícese de todas los animales y las plantas distribuidos por todas las regiones tropicales de la Tierra.

66 Dr. P. Font Quer, Diccionario de Botánica; Labor, S.A. España, 1953, 1236 pags

67 Gran Sopena, Diccionario Enciclopédico, XX Volúmenes; Ramón Sopena S.A. Barcelona, España.

7. Drupa: (del latín drupa, aceituna que empieza a madurar), f. termino introducido por Lineé. En general se llama así toda suerte de fruto carnoso con un hueso en su interior.

8. Especie: Grupo de individuos dotados de caracteres esenciales comunes. Es división del género, y a veces se subdivide en variedades o especias. Conjunto de especias.

9. Estaminodio: (del latín staminodium, der de stamen , -inis, estambre). Aplicase al estambre que, habiendo perdido su función , permanece completamente esteril al final de su desarrollo.

10. Estípulas: (del latín stîpula, diminutivo de stipa). Apéndice foliáceo situado en los lados del pecíolo o en la unión de este con el tallo.

11. Excrecencia: (del latín, excrecentia). Carnosidad superflua que altera la superficie del cuerpo vegetal.

12. Género: Conjunto de especies que tienen ciertos caracteres comunes.

13. Hibridación: Producción de seres híbridos.

14. Híbridos: (del latín hybrîda). Ser viviente procreado por dos individuos de distinta especie.

15. Indehiscente: Que no es dehiscente.

16. Oblongo-elíptico: Que es más largo que ancho - Que tiene forma de elipse, es decir, de una curva plana y cerrada, resultante de cortar un cono por un plano que encuentra todas las generatrices a un mismo lado del vértice.

17. Ovado-lanceolado: De figura de huevo, ovalado – Dícese de las hojas y de los lóbulos de ellas cuya figura es semejante al hierro de la lanza.

18. Sámara: (del latín samâra, simiente del olmo). Fruto seco, indehiscente, con pocas semillas y pericarpio extendido a modo de ala, como el del fresno, el del olmo, etc. 19. Sépalo: (del latín separ, _ârem, separado, apartado). Cualquiera de las divisiones del cáliz de la flor.

20. Vermífugo: (del latín vermis, gusano, y fugâre, ahuyentar). Que tiene virtud o eficacia para matear las lombrices intestinales.

21. Zimosa: (de zimo, fermento fermento, y la terminación osa, propia de nombres de carbohidratos y derivados hidrolíticos de las proteínas.). Bioquímica; invertida.

Anexo No.5. Figuras y Fotos de Materiales y Métodos

Figura No. 1. Equipo Soxhlet. Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

1. Alzador rápido. 2. Accionamiento 3. Cabezal electrónico. 4. Matraz de evaporación. 5. Módulo de vidrio. 6. Matraz receptor. 7. Sistema de hermetización. 8. Baño calefactor. 9. Módulo indicador de velocidad de rotación y temperatura del vapor. 10. Control de Vapor. 11. Conjunto de válvulas.

Foto No. 1. Rotavapor con sus partes señaladas. Extraído de Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Foto No.2. Extractos etanólicos de una planta estudiada en el Lipronat. Extraído de Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Foto No. 3. Resultados de una Prueba de Actividad Antimicótica in vitro. Extraído de A la izquierda se muestra una actividad negativa y a la derecha un control.

Foto No. 4. Resultados de una Prueba de Actividad Antibacteriana in vitro. Abajo se muestra una actividad positiva con agar-planta y arriba una actividad positiva para el control negativo (agar Muller Hinton con etanol al 50%). Extraído de Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Foto No. 5. Huevos y nauplios de Artemia Salina. Extraído de Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia., Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Foto No.6. Equipo y material necesario para llevar a cabo ensayo de Citotoxicicdad con Artemia Salina. Extraído de Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia., Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Foto No. 7 Foto que muestra inóculos hechos a varias concentraciones del extracto, cada Caja de Petri posee 4 concentraciones distintas. Manual de Operaciones, Laboratorio de Bioensayos del Departamento de Citohistología. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia., Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.

Foto No. 8. Se observa una cámara cromatográfica al fondo y distintas cromatoplacas de cromatografías hechas a extractos de plantas. Extraído de Manual de Operaciones, Laboratorio de Investigación de Productos Naturales LIPRONAT. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. 2005.