UNIVERSITÉ DE NANTES UFR Sciences Pharmaceutiques et Biologiques __________________________________________________________________________________________ ANNÉE 2014 N° 057 THÈSE pour le DIPLÔME D’ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE par (Alba, Noël) ----------------------------------------- Présentée et soutenue publiquement le 28/11/2014 Cardénolides : passé et futur. Isolement et étude de l’activité biologique de cardénolides isolés de fruits d’une plante endémique des Mascareignes : Cassine orientalis Président : Pr. Yves-François POUCHUS, Professeur de Botanique et Mycologie Membres du jury : Dr. Catherine ROULLIER, Maître de Conférences de Pharmacognosie Dr. Marc LITAUDON, Pharmacien, Chercheur au CNRS Mes remerciements s’adressent en premier lieu au Dr Catherine Roullier, qui m’a aiguillée et soutenue non seulement pour cette thèse, mais également pour mon orientation dans le domaine de la recherche en chimie des produits naturels. Je tiens également à remercier le Professeur François Pouchus qui m’a fait l’honneur d’accepter de diriger ce jury de thèse. Ensuite je souhaite remercier le Dr Fanny Roussi pour m’avoir accueillie chaleureusement au sein de son équipe pour effectuer mon stage de Master 2 et ces travaux de recherche. Merci également pour sa disponibilité et son écoute. Je tiens également à exprimer ma gratitude envers le Dr Marc Litaudon, responsable de mon stage de Master 2 et membre de ce jury, pour son aide avisée et ses conseils précieux. Je remercie fortement Nina Corlay qui a été présente tout le long de mon stage pour répondre à mes perpétuelles questions et qui m’a aiguillée tout au long de ce projet. Je remercie Jérôme Bignon pour son aide précieuse pour la réalisation des études biologiques, ainsi que Xavier Cachet pour son soutien et ses conseils en chimie. Je remercie toute l’équipe du Pôle Substances Naturelles de l’ICSN pour leur accueil, leurs conseils et leur bonne humeur qui ont fait de ce projet une excellente expérience personnelle. II Je tiens également à adresser un grand merci à Marine, ma binôme de toutes ces années de fac et grande amie, ainsi qu’à Fanny, Elia, Sandrine, Flora, Camille avec qui j’ai partagé ces longues études et bien d’autres choses passées et à venir… Merci à Mélisande, mon pilier depuis tant d’années, pour son amitié, son écoute et son humour. Je remercie aussi ma famille pour sa présence et son soutien pendant cette longue aventure, ce qui n’a pas été aisé tous les jours. Enfin je remercie François, pour son aide, sa présence et tout ce qu’il m’apporte chaque jour. III TABLE DES FIGURES VI TABLE DES TABLEAUX VIII LISTE DES ABREVIATIONS IX INTRODUCTION 1 PARTIE I 3 LES CARDENOLIDES 3 I – HISTORIQUE 4 II – DESCRIPTION CHIMIQUE ET BIOSYNTHESE 11 III – ACTIVITES BIOLOGIQUES 14 IV – UTILISATION EN THERAPEUTIQUE 17 V – INTOXICATIONS 19 VI – EN RECHERCHE 21 PARTIE II 28 CASSINE ORIENTALIS 28 I – DESCRIPTION BOTANIQUE 29 II – UTILISATION TRADITIONNELLE 32 1 - FAMILLE DES CELASTRACEAE 32 2 - GENRE CASSINE 32 3 - ESPECE CASSINE ORIENTALIS (JACQ.) KUNTZE 34 III – PHYTOCHIMIE 35 1 - FAMILLE DES CELASTRACEAE 35 2 - GENRE CASSINE 36 3 - ESPECE CASSINE ORIENTALIS 37 PARTIE III 38 TRAVAUX DE RECHERCHE PORTANT SUR L’ISOLEMENT ET ETUDE DE L’ACTIVITE BIOLOGIQUE DE CARDENOLIDES ISOLES DE FRUITS DE CASSINE ORIENTALIS 38 I – TRAVAUX ANTERIEURS 39 1 – EXTRACTION 39 2 – FRACTIONNEMENT 39 II – TRAVAUX PERSONNELS 40 1 - ANALYSE DES FRACTIONS 40 2 - PURIFICATIONS 42 3 – RECAPITULATIF DES COMPOSES ISOLES 51 4 - ANALYSE STRUCTURALE 52 5 – RESULTATS DES TESTS BIOLOGIQUES ET ETUDES DE RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITE 64 III – DISCUSSION SUR LES RESULTATS 70 IV IV – CONCLUSION SUR LES RESULTATS ET PERSPECTIVES 73 PARTIE IV 75 MATERIELS ET METHODES 75 I – MATERIEL VEGETAL 76 II – EXTRACTION (LA REUNION) 77 III – FRACTIONNEMENT PAR MPLC (LA REUNION) 77 IV – CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE 78 V – ISOLEMENT ET PURIFICATION 79 VI – IDENTIFICATION ET ELUCIDATION STRUCTURALE 80 VII – ETUDE DEREPLICATIVE 80 VIII – TESTS BIOLOGIQUES 81 IX – ACETYLATION DES COMPOSES 1, 4 ET AFFINOSIDE R 83 CONCLUSION 85 ANNEXES 94 V Table des figures FIGURE 1 : TABLEAUX CHOISIS DE VINCENT VAN GOGH ILLUSTRANT SON INTOXICATION AUX DIGITALIQUES : A) PORTRAIT DU DR GACHET AVEC LA BRANCHE DE DIGITALE B) LES TOURNESOLS C) MAISON JAUNE .......................................................... 4 FIGURE 2 : PAGES DE "DE HISTORIA STIRPIUM COMMENTARII" REPRESENTANT LA DIGITALE ......................................................... 5 FIGURE 3 : DIGITALIS LANATA .......................................................................................................................................... 6 FIGURE 4 : DIGITALIS PURPUREA ...................................................................................................................................... 6 FIGURE 5 : STRUCTURE DES CARDENOLIDES AYANT ETE UTILISES EN THERAPEUTIQUE .................................................................. 6 FIGURE 6 : DESLANOSIDE ............................................................................................................................................... 6 FIGURE 7 : SQUELETTE DES CARDENOLIDES ET DES BUFADIENOLIDES ..................................................................................... 11 FIGURE 8 : CONFIGURATION DES CYCLES DANS L’ESPACE ..................................................................................................... 11 FIGURE 9 : SCHEMA DE LA SYNTHESE DES PRECURSEURS STEROÏDIQUES ................................................................................. 12 FIGURE 10 : SCHEMA REACTIONNEL DU REACTIF DE KEDDE ................................................................................................. 13 + + + 2+ FIGURE 11 : SCHEMA D'UNE CELLULE ET DU FONCTIONNEMENT DES POMPES NA /K ET NA /CA ........................................... 14 FIGURE 12 : ELECTROCARDIOGRAMME : A) PATIENT SAIN, B) PATIENT SOUS DIGITALIQUES ........................................................ 15 FIGURE 13 : BOITE DE COMPRIMES DE DIGOXINE NATIVELLE ............................................................................................... 17 FIGURE 14 : CUPULE DIGITALIQUE : A : IMPREGNATION THERAPEUTIQUE, B : INTOXICATION ...................................................... 19 FIGURE 15 : BOITE D'ANTIDOTE AUX INTOXICATIONS DIGITALIQUES "DIGIFAB" ....................................................................... 20 FIGURE 16 : COMPOSE UNBS1450 .............................................................................................................................. 21 FIGURE 17 : CALOTROPIS PROCERA ................................................................................................................................ 21 FIGURE 18 : CASSINE ORIENTALIS (ARBRE) ....................................................................................................................... 29 FIGURE 19 : FEUILLES DE CASSINE ORIENTALIS .................................................................................................................. 30 FIGURE 20 : INFLORESCENCE DE CASSINE ORIENTALIS ........................................................................................................ 30 FIGURE 21 : FLEURS DE CASSINE ORIENTALIS .................................................................................................................... 30 FIGURE 22 : FRUITS DE CASSINE ORIENTALIS .................................................................................................................... 31 FIGURE 23 : LOCALISATION DES MASCAREIGNES ............................................................................................................... 31 FIGURE 24 : EXEMPLES DE CARDENOLIDES ISOLES DE PLANTES DE LA FAMILLE DES CELASTRACEAE ............................................... 35 FIGURE 25 : CCM RECAPITULATIVE DE L'EXTRAIT FRACTIONNE (DCM/MEOH 90:10) ............................................................ 40 FIGURE 26 : ELAEODENDROSIDE B ................................................................................................................................. 40 FIGURE 27 : ANALYSE DES COMPOSES PRESENTS DANS L'EXTRAIT CHLOROFORMIQUE DE CASSINE ORIENTALIS ............................... 41 FIGURE 28 : CCM RECAPITULATIVE DU FRACTIONNEMENT DE LA FRACTION 8 ......................................................................... 42 FIGURE 29 : COMPOSE 1 MM=592, C29 H36 O13 ........................................................................................................... 42 FIGURE 30 : COMPOSE 2, ............................................................................................................................................ 43 FIGURE 31 : SCHEMA DE LA PURIFICATION DE LA FRACTION 8 (EN ROUGE LES FRACTIONS CONTENANT DES CARDENOLIDES) ............. 44 FIGURE 32 : ELAEODENDROSIDE P ................................................................................................................................. 45 FIGURE 33 : ELAEODENDROSIDE R ................................................................................................................................. 45 FIGURE 34 : SCHEMA DE PURIFICATION DE LA FRACTION 10 (EN ROUGE FRACTIONS CONTENANT DES CARDENOLIDES) .................... 45 FIGURE 35 : AFFINOSIDE S ........................................................................................................................................... 46 FIGURE 36 : SCHEMA DE PURIFICATION DE LA FRACTION 11 (EN ROUGE, FRACTIONS CONTENANT