UNIVERSITÉ DE NANTES UFR Sciences Pharmaceutiques et Biologiques ______

ANNÉE 2014 N° 057

THÈSE

pour le

DIPLÔME D’ÉTAT

DE DOCTEUR EN PHARMACIE

par

(Alba, Noël)

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Présentée et soutenue publiquement le 28/11/2014

Cardénolides : passé et futur. Isolement et étude de l’activité biologique de cardénolides isolés de fruits d’une plante endémique des Mascareignes : Cassine orientalis

Président : Pr. Yves-François POUCHUS, Professeur de Botanique et Mycologie

Membres du jury : Dr. Catherine ROULLIER, Maître de Conférences de Pharmacognosie Dr. Marc LITAUDON, Pharmacien, Chercheur au CNRS Mes remerciements s’adressent en premier lieu au Dr Catherine Roullier, qui m’a aiguillée et soutenue non seulement pour cette thèse, mais également pour mon orientation dans le domaine de la recherche en chimie des produits naturels.

Je tiens également à remercier le Professeur François Pouchus qui m’a fait l’honneur d’accepter de diriger ce jury de thèse.

Ensuite je souhaite remercier le Dr Fanny Roussi pour m’avoir accueillie chaleureusement au sein de son équipe pour effectuer mon stage de Master 2 et ces travaux de recherche. Merci également pour sa disponibilité et son écoute.

Je tiens également à exprimer ma gratitude envers le Dr Marc Litaudon, responsable de mon stage de Master 2 et membre de ce jury, pour son aide avisée et ses conseils précieux.

Je remercie fortement Nina Corlay qui a été présente tout le long de mon stage pour répondre à mes perpétuelles questions et qui m’a aiguillée tout au long de ce projet.

Je remercie Jérôme Bignon pour son aide précieuse pour la réalisation des études biologiques, ainsi que Xavier Cachet pour son soutien et ses conseils en chimie.

Je remercie toute l’équipe du Pôle Substances Naturelles de l’ICSN pour leur accueil, leurs conseils et leur bonne humeur qui ont fait de ce projet une excellente expérience personnelle.

II

Je tiens également à adresser un grand merci à Marine, ma binôme de toutes ces années de fac et grande amie, ainsi qu’à Fanny, Elia, Sandrine, Flora, Camille avec qui j’ai partagé ces longues études et bien d’autres choses passées et à venir…

Merci à Mélisande, mon pilier depuis tant d’années, pour son amitié, son écoute et son humour.

Je remercie aussi ma famille pour sa présence et son soutien pendant cette longue aventure, ce qui n’a pas été aisé tous les jours.

Enfin je remercie François, pour son aide, sa présence et tout ce qu’il m’apporte chaque jour.

III

TABLE DES FIGURES VI

TABLE DES TABLEAUX VIII

LISTE DES ABREVIATIONS IX

INTRODUCTION 1

PARTIE I 3

LES CARDENOLIDES 3

I – HISTORIQUE 4 II – DESCRIPTION CHIMIQUE ET BIOSYNTHESE 11 III – ACTIVITES BIOLOGIQUES 14 IV – UTILISATION EN THERAPEUTIQUE 17 V – INTOXICATIONS 19 VI – EN RECHERCHE 21

PARTIE II 28

CASSINE ORIENTALIS 28

I – DESCRIPTION BOTANIQUE 29 II – UTILISATION TRADITIONNELLE 32 1 - FAMILLE DES CELASTRACEAE 32 2 - GENRE CASSINE 32 3 - ESPECE CASSINE ORIENTALIS (JACQ.) KUNTZE 34 III – PHYTOCHIMIE 35 1 - FAMILLE DES CELASTRACEAE 35 2 - GENRE CASSINE 36 3 - ESPECE CASSINE ORIENTALIS 37

PARTIE III 38

TRAVAUX DE RECHERCHE PORTANT SUR L’ISOLEMENT ET ETUDE DE L’ACTIVITE BIOLOGIQUE DE CARDENOLIDES ISOLES DE FRUITS DE CASSINE ORIENTALIS 38

I – TRAVAUX ANTERIEURS 39 1 – EXTRACTION 39 2 – FRACTIONNEMENT 39 II – TRAVAUX PERSONNELS 40 1 - ANALYSE DES FRACTIONS 40 2 - PURIFICATIONS 42 3 – RECAPITULATIF DES COMPOSES ISOLES 51 4 - ANALYSE STRUCTURALE 52 5 – RESULTATS DES TESTS BIOLOGIQUES ET ETUDES DE RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITE 64 III – DISCUSSION SUR LES RESULTATS 70 IV

IV – CONCLUSION SUR LES RESULTATS ET PERSPECTIVES 73

PARTIE IV 75

MATERIELS ET METHODES 75

I – MATERIEL VEGETAL 76 II – EXTRACTION (LA REUNION) 77 III – FRACTIONNEMENT PAR MPLC (LA REUNION) 77 IV – CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE 78 V – ISOLEMENT ET PURIFICATION 79 VI – IDENTIFICATION ET ELUCIDATION STRUCTURALE 80 VII – ETUDE DEREPLICATIVE 80 VIII – TESTS BIOLOGIQUES 81 IX – ACETYLATION DES COMPOSES 1, 4 ET AFFINOSIDE R 83

CONCLUSION 85

ANNEXES 94

V

Table des figures

FIGURE 1 : TABLEAUX CHOISIS DE VINCENT VAN GOGH ILLUSTRANT SON INTOXICATION AUX DIGITALIQUES : A) PORTRAIT DU DR GACHET AVEC LA BRANCHE DE DIGITALE B) LES TOURNESOLS C) MAISON JAUNE ...... 4 FIGURE 2 : PAGES DE "DE HISTORIA STIRPIUM COMMENTARII" REPRESENTANT LA DIGITALE ...... 5 FIGURE 3 : DIGITALIS LANATA ...... 6 FIGURE 4 : DIGITALIS PURPUREA ...... 6 FIGURE 5 : STRUCTURE DES CARDENOLIDES AYANT ETE UTILISES EN THERAPEUTIQUE ...... 6 FIGURE 6 : DESLANOSIDE ...... 6 FIGURE 7 : SQUELETTE DES CARDENOLIDES ET DES BUFADIENOLIDES ...... 11 FIGURE 8 : CONFIGURATION DES CYCLES DANS L’ESPACE ...... 11 FIGURE 9 : SCHEMA DE LA SYNTHESE DES PRECURSEURS STEROÏDIQUES ...... 12 FIGURE 10 : SCHEMA REACTIONNEL DU REACTIF DE KEDDE ...... 13 + + + 2+ FIGURE 11 : SCHEMA D'UNE CELLULE ET DU FONCTIONNEMENT DES POMPES NA /K ET NA /CA ...... 14 FIGURE 12 : ELECTROCARDIOGRAMME : A) PATIENT SAIN, B) PATIENT SOUS DIGITALIQUES ...... 15 FIGURE 13 : BOITE DE COMPRIMES DE DIGOXINE NATIVELLE ...... 17 FIGURE 14 : CUPULE DIGITALIQUE : A : IMPREGNATION THERAPEUTIQUE, B : INTOXICATION ...... 19 FIGURE 15 : BOITE D'ANTIDOTE AUX INTOXICATIONS DIGITALIQUES "DIGIFAB" ...... 20 FIGURE 16 : COMPOSE UNBS1450 ...... 21 FIGURE 17 : CALOTROPIS PROCERA ...... 21 FIGURE 18 : CASSINE ORIENTALIS (ARBRE) ...... 29 FIGURE 19 : FEUILLES DE CASSINE ORIENTALIS ...... 30 FIGURE 20 : INFLORESCENCE DE CASSINE ORIENTALIS ...... 30 FIGURE 21 : FLEURS DE CASSINE ORIENTALIS ...... 30 FIGURE 22 : FRUITS DE CASSINE ORIENTALIS ...... 31 FIGURE 23 : LOCALISATION DES MASCAREIGNES ...... 31 FIGURE 24 : EXEMPLES DE CARDENOLIDES ISOLES DE PLANTES DE LA FAMILLE DES CELASTRACEAE ...... 35 FIGURE 25 : CCM RECAPITULATIVE DE L'EXTRAIT FRACTIONNE (DCM/MEOH 90:10) ...... 40 FIGURE 26 : ELAEODENDROSIDE B ...... 40 FIGURE 27 : ANALYSE DES COMPOSES PRESENTS DANS L'EXTRAIT CHLOROFORMIQUE DE CASSINE ORIENTALIS ...... 41 FIGURE 28 : CCM RECAPITULATIVE DU FRACTIONNEMENT DE LA FRACTION 8 ...... 42 FIGURE 29 : COMPOSE 1 MM=592, C29 H36 O13 ...... 42 FIGURE 30 : COMPOSE 2, ...... 43 FIGURE 31 : SCHEMA DE LA PURIFICATION DE LA FRACTION 8 (EN ROUGE LES FRACTIONS CONTENANT DES CARDENOLIDES) ...... 44 FIGURE 32 : ELAEODENDROSIDE P ...... 45 FIGURE 33 : ELAEODENDROSIDE R ...... 45 FIGURE 34 : SCHEMA DE PURIFICATION DE LA FRACTION 10 (EN ROUGE FRACTIONS CONTENANT DES CARDENOLIDES) ...... 45 FIGURE 35 : AFFINOSIDE S ...... 46 FIGURE 36 : SCHEMA DE PURIFICATION DE LA FRACTION 11 (EN ROUGE, FRACTIONS CONTENANT DES CARDENOLIDES) ...... 47 FIGURE 37 : COMPOSE 3, MM=576, ...... 48 FIGURE 38 : COMPOSE 4, MM = 606, ...... 48 FIGURE 39 : AFFINOSIDE R ...... 49 FIGURE 40 : SCHEMA DE PURIFICATION DE LA FRACTION 12 (EN ROUGE FRACTIONS CONTENANT DES CARDENOLIDES) ...... 49 FIGURE 41 : COMPOSE 5, MM = 530, ...... 50 FIGURE 42 : COMPOSES CONNUS ISOLES ...... 51 FIGURE 43 : COMPOSES NOUVEAUX ISOLES ...... 51 FIGURE 44 : SPECTRE LC-MS HAUTE RESOLUTION DU COMPOSE 4 ...... 52 FIGURE 45 : SPECTRE D'ABSORPTION DANS L'INFRAROUGE DU COMPOSE ...... 53 FIGURE 46 : STRUCTURE GENERALE DES CARDENOLIDES ...... 55 FIGURE 47 : CONSTRUCTION DU CYCLE D ...... 55 FIGURE 48 : CONSTRUCTION DU CYCLE D, SPECTRES HMBC DU COMPOSE 4 : A) CORRELATIONS H-17, B) CORRELATIONS H-18; SPECTRES COSY : C) CORRELATIONS H-17, D) CORRELATIONS H-16 ...... 55 FIGURE 49 : CONSTRUCTION DU CYCLE C ...... 56 FIGURE 50 : CONSTRUCTION DU CYCLE C, SPECTRES HMBC DU COMPOSE 4 : A) CORRELATION H-18, B) CORRELATIONS H-11, D) CORRELATIONS OH-8; SPECTRE COSY : C) CORRELATIONS H-11 ...... 56 FIGURE 51 : CONSTRUCTION DU CYCLE B ...... 57 FIGURE 52 : CONSTRUCTION DU CYCLE B, SPECTRES HMBC DU COMPOSE 4 : A) CORRELATIONS H-19, B) CORRELATION OH-8; SPECTRES COSY : C) CORRELATIONS H-7A ET B ...... 57 FIGURE 53 : CONSTRUCTION DU CYCLE A ...... 58 VI

FIGURE 54 : CONSTRUCTION DU CYCLE A, SPECTRES HMBC DU COMPOSE 4 : A) CORRELATION H-19, D) CORRELATION OH-4 ; SPECTRES COSY : B) CORRELATIONS H-2, C) CORRELATIONS H-4 ...... 58 FIGURE 55 : CONSTRUCTION DE LA PARTIE OSIDIQUE ...... 59 FIGURE 56 : LIEN GENINE ET PARTIE OSIDIQUE ...... 59 FIGURE 57 : CONSTRUCTION DE LA PARTIE OSIDIQUE, SPECTRE COSY DU COMPOSE 4 : A) CORRELATIONS H-5' ; SPECTRES HMBC : B) CORRELATIONS H-1' C) CORRELATIONS DU METHYLENE ...... 59 FIGURE 58 : STRUCTURE DU COMPOSE 4 ...... 60 FIGURE 59 : CORRELATIONS ROESY DU COMPOSE 4...... 60 FIGURE 60 : REPRESENTATION SPATIALE DU COMPOSE 4 DANS LES CRISTAUX ...... 60 FIGURE 61 : COMPOSE 1 ...... 61 FIGURE 62 : COMPOSE 2 ...... 62 FIGURE 63 : COMPOSE 3 ...... 62 FIGURE 64 : COMPOSE 5 ...... 63 FIGURE 65 : CYCLE CELLULAIRE ...... 65 FIGURE 66 : NOMBRE DE CELLULES K562 ENGAGEES DANS LES DIFFERENTES PHASES DU CYCLE CELLULAIRE APRES ACTION DES COMPOSES ...... 66 FIGURE 67 : NOMBRE DE CELLULES U87 ENGAGEES DANS LES DIFFERENTES PHASES DU CYCLE CELLULAIRE APRES ACTION DES COMPOSES ...... 66 FIGURE 68 : COMPARAISON AFFINOSIDE R ET AFFINOSIDE S ...... 67 FIGURE 69 : COMPARAISON AFFINOSIDE R ET ELAEODENDROSIDE P...... 67 FIGURE 70 : COMPARAISON ELAEODENDROSIDE B ET ELAEODENDROSIDE R ...... 68 FIGURE 71 : DERIVES ACETYLES ...... 69 FIGURE 72 : LOCALISATION DU PITON ST LEU ...... 76 FIGURE 73 : SCHEMA REACTIONNEL DU REACTIF DE KEDDE ...... 78 FIGURE 74 : MECANISME DU REACTIF CELLTITER BLUE ...... 81 FIGURE 75 : MECANISME DE LA REACTION D'ACETYLATION ...... 83

VII

Table des tableaux

TABLEAU 1: PLANTES A HETEROSIDES CARDIOTONIQUES ...... 8 TABLEAU 2 : ETAT DE LA RECHERCHE SUR LES CARDENOLIDES DANS LE DOMAINE DE LA CANCEROLOGIE ...... 22 TABLEAU 3 : ASPECT DES FEUILLES SUIVANT LE DEVELOPPEMENT DE CASSINE ORIENTALIS ...... 30 TABLEAU 4 : PLANTES DE LA FAMILLE DES CELASTRACEAE ET LEUR UTILISATION TRADITIONNELLE ...... 32 TABLEAU 5 : UTILISATIONS TRADITIONNELLES DES PLANTES DU GENRE CASSINE (ET ELAEODENDRON) ...... 33 TABLEAU 6 : MOLECULES ISOLEES DE PLANTES DU GENRE CASSINE ...... 36 TABLEAU 7 : MASSE DES FRACTIONS DE CASSINE ORIENTALIS (EN MG) ...... 39 TABLEAU 8 : ACTIVITE CYTOTOXIQUE DES FRACTIONS TESTEES SUR HCT 116 ...... 41 TABLEAU 9 : MASSE DES FRACTIONS OBTENUES ...... 42 TABLEAU 10 : MASSE DES FRACTIONS OBTENUES APRES PURIFICATION DE LA FRACTION 10 ...... 44 TABLEAU 11 : MASSES DES FRACTIONS OBTENUES APRES LA DEUXIEME PURIFICATION ...... 45 TABLEAU 12 : MASSES DES FRACTIONS OBTENUES APRES PURIFICATION DE LA FRACTION 11 ...... 46 TABLEAU 13 : MASSES DES FRACTIONS OBTENUES APRES PURIFICATION DE LA FRACTION 12 ...... 48 1 TABLEAU 14 : TABLEAU DES DEPLACEMENTS CHIMIQUES EN RMN DU COMPOSE 4 DANS L’ACETONE 500 MHZ ( H) ET 125 MHZ (13C) ...... 54 TABLEAU 15 : CYTOTOXICITE DES PRODUITS PURS SUR 4 LIGNEES CELLULAIRES (IC50 EN M) ...... 64 TABLEAU 16 : POURCENTAGE DE CELLULES BLOQUEES DANS CHAQUE PHASE; A) CELLULES K562 ; B) CELLULES U87 ...... 66 TABLEAU 17 : IC50 (EN µM) DES DIFFERENTS COMPOSES EN FONCTION DES LIGNEES CELLULAIRES ...... 68 TABLEAU 18 : ACTIVITE CYTOTOXIQUE DES DERIVES ACETYLES...... 69 TABLEAU 19 : GRADIENT D'ELUTION MPLC ...... 77 TABLEAU 20 : GRADIENT 80/20 HPLC ANALYTIQUE ...... 79

VIII

Liste des abréviations

ACN/CH3CN : Acétonitrile AcOEt : Acétate d’éthyle AF : Acide Formique ARN : Acide ribonucléique CCM : Chromatographie sur Couche Mince CHCl3 : Chloroforme CH2Cl2/DCM : Dichlorométhane COSY : COrrelated SpectroscopY CPL/SM : Chromatographie en Phase Liquide couplée à un Spectromètre de Masse DAD : Diode Array Detector (détecteur à barrette de diode) DEDL : Détecteur Évaporatif à Diffusion de Lumière DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium ECG : Electrocardiogramme HIV : Virus de l’immunodéficience humaine HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC : High Pressure Liquid Chromatography HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence IC50 : Concentration à laquelle 50 % des cellules sont vivantes LC-MS HR : Chromatographie Liquide associée à un spectromètre de masse haute résolution MeOH : Méthanol MPLC : Medium Pression Liquid Chromatography PBS : Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate) PFP : PentaFluoroPhényl RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire ROESY : Rotating-frame Overhauser SpectroscopY RPMI 1640: Milieu de culture cellulaire développé au « Roswell Park Memorial Institute » UPLC/SM : Ultra-high Pressure Liquid Chromatography couplé à un spectromètre de masse UV : Ultra-Violet

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Introduction

Les cardénolides sont des composés chimiques appartenant au groupe des hétérosides cardiotoniques. Cette famille chimique est connue depuis de nombreuses années, notamment grâce aux digitaliques. En effet, digitaline, digoxine et ouabaïne ont longtemps fait partie de l’arsenal thérapeutique des médecins. L’utilisation de ces composés a débuté par la découverte des vertus thérapeutiques des plantes à hétérosides comme la Digitale. Puis l’étude chimique de ces plantes a permis l’identification des cardénolides comme composés actifs. Les digitaliques ont alors ensuite été considérés comme le traitement de référence pour certaines pathologies cardiaques telle que l’insuffisance cardiaque pendant de nombreuses années. Plus récemment, de nouvelles molécules avec de meilleurs rapports bénéfices/risques sont arrivées sur le marché, rendant l’utilisation des digitaliques plus désuète. Cependant de nouvelles propriétés ont été découvertes dans cette famille de composés. De nombreuses recherches sur la cytotoxicité des cardénolides ont été réalisées avec des résultats très encourageants en thérapeutique anti-cancéreuse. Il est à noter que la distribution de ces composés dans le règne végétal est assez restreinte, puisqu’on les retrouve dans une soixantaine de genres regroupés dans une douzaine de familles différentes. Les analyses phytochimiques de plusieurs plantes de la famille des Celastraceae ont démontré la présence de cardénolides au sein de cette branche, et plus particulièrement dans le genre Cassine. Cassine orientalis, espèce endémique des Mascareignes, est une plante sur laquelle aucune étude chimique n’a été réalisée auparavant. Plusieurs cas d’intoxication consécutifs à l’ingestion de ses fruits ont été décrits dans les années 2000 sur l’île de La Réunion, témoignant ainsi de la présence de composés actifs dans cette plante. De plus, un criblage réalisé dans le cadre d’un stage de Master 2 au Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et des Sciences des Aliments, à la Réunion, par Pierre-Marie Allard a mis en évidence la présence de cardénolides dans cette plante. C’est donc tout naturellement, que Cassine orientalis a été sélectionnée pour cette étude. Ainsi l’étude phytochimique de ses fruits verts a été réalisée dans le but d’en isoler des cardénolides et de les caractériser. L’étude de l’activité cytotoxique des composés identifiés a ensuite été réalisée pour compléter l’étude.

1

2

Partie I Les cardénolides

3

I – Historique

Les cardénolides les plus connus et les premiers identifiés sont les digitaliques, isolés des plantes du genre Digitalis et Strophantus.

La digitale pourpre, Digitalis purpurea, est connue depuis plusieurs siècles en médecine autant pour ses utilisations en thérapeutique que pour sa toxicité. En effet de nombreux incidents d'intoxication par les digitaliques ont été décrits au fil des ans. On retrouve parmi ceux-ci le cas de Vincent Van Gogh, qui aurait été traité par la digitale pourpre durant ses derniers jours, suite aux prescriptions du Dr Gachet. Cette hypothèse s'appuie sur la peinture de Van Gogh illustrant le Dr Gachet avec une branche de digitale pourpre réalisée dans les derniers mois de la vie du peintre (Figure 1 a)). Un second argument en faveur de cette hypothèse est la modification de perception des couleurs induite par la consommation de digitaliques et la « haute note jaune » présente dans de nombreuses peintures de l'artiste (Figures 1b) et c)).

a) b)

c)

Figure 1 : Tableaux choisis de Vincent Van Gogh illustrant son intoxication aux digitaliques : a) Portrait du Dr Gachet avec la branche de digitale b) Les tournesols c) Maison jaune

4

On retrouve également des cas d'intoxications par les digitaliques dans la fiction comme par exemple dans le livre « Rendez-vous avec la mort » d'Agatha Christie. (Burchell, 1983)

Elle a été utilisée pour traiter diverses pathologies durant de nombreuses années avant même que ses effets ne soient étudiés. On retrouve notamment une description de cette plante réalisée par le botaniste Leonhart Fuchs en 1542 dans son œuvre « De historia stirpium commentarii ». Celui-ci la décrit alors comme purgative et émétique (Figure 2).

Figure 2 : Pages de "De historia stirpium commentarii" représentant la digitale

Ses effets sur l'activité cardiaque n'ont vraiment été étudiés que par William Withering en 1785. Dès 1775 il prend connaissance d'un traitement utilisé par une vieille femme pour traiter les hydropisies non soulagées par les méthodes conventionnelles. Ce médicament était composé d'une vingtaine d'extraits de plantes et il identifia la digitale comme seule plante active de ce mélange. Ainsi, il débuta une longue étude des effets de cette plante sur divers patients atteints d’œdèmes d'origine cardiaque, qu'il relata dans son livre « An Account of the Foxglove and some of its Medical Uses With Practical Remarks on Dropsy and Other Diseases ».

La digitoxine (Figure 5) ne fut isolée que 100 ans plus tard par un pharmacien français, Claude-Adolphe Nativelle, à partir de feuilles de Digitalis purpurea (SHP, s. d.). Puis d'autres

5 digitaliques ont été identifiés de Digitalis purpurea et Digitalis lanata (Figures 3 et 4) tel que la digoxine. La découverte de ces molécules a également permis d'améliorer la

Figure 4 : Digitalis purpurea Figure 3 : Digitalis lanata compréhension de la fonction cardiaque.

Les digitaliques ont par la suite été utilisés pendant de nombreuses années dans le traitement de certaines pathologies cardiaques. Pour exemple, on peut citer le lanatoside C (Figure 5), le deslanoside commercialisé sous le nom Cédilanide® (Figure 6) ou la digoxine (Figure 5). Aujourd'hui, seule la digoxine est encore commercialisée dans le cadre du traitement de l'insuffisance cardiaque ou des troubles du rythme supraventriculaire.

Figure 5 : Structure des cardénolides ayant été utilisés en thérapeutique

Figure 6 : Deslanoside 6

Par ailleurs, d'autres cardénolides ont été identifiés dans les plantes du genre Strophantus. Ces plantes étaient notamment utilisées chez certains peuples africains comme poison pour enduire le bout de leurs flèches pour chasser ou se défendre. L'étude de ces plantes a permis d'identifier la ouabaïne et la strophantine, composés également reconnus pour leur activité cardiaque.

Les hétérosides cardiotoniques sont présents dans 12 familles différentes et dans plus de 60 genres. Certaines de ces plantes comme les Digitales, la Scille maritime et les Strophantus sont depuis longtemps utilisées pour leurs propriétés cardiotoniques. D'autres comme le Muguet ou le Laurier-Rose, sont des plantes toxiques riches en hétérosides cardiotoniques. (Tableau 1) (Bruneton, 2009)

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Tableau 1: Plantes à hétérosides cardiotoniques

Strophantus sp Cardénolides Ouabaïne

K-Strophantine

Nerium oleander Cardénolides Oléandrine Laurier-Rose

Convallaria majalis Cardénolides K-Strophantidine Muguet

Convallatoxine

8

Convalloside

Convallatoxol

Lokundjoside

Urginea maritima Bufadiènolides Scillarénine

Scille maritime

9

Helleborus niger Bufadiénolide Hellebrigenin

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II – Description chimique et biosynthèse

Les cardénolides sont des hétérosides cardiotoniques dont la génine est caractérisée par un squelette stéroïdique tétracyclique portant un cycle lactonique α,β-insaturé en C-17 orienté en β. La taille de ce cycle lactonique permet de différencier les cardénolides (4 carbones) et les bufadiènolides (5 carbones) (Figure 7). Les cycles A, B, C et D sont généralement fusionnés en cis-trans-cis et plus rarement en trans-trans-cis (Figure 8). On retrouve également comme point commun la présence systématique d’un hydroxyle tertiaire en C-14 et d’un hydroxyle secondaire en 3β. Ce dernier hydroxyle sert de point d’ancrage à diverses sous-unités osidiques responsables de la grande diversité de cette famille de composés. Les quelques variations structurales relevées sur la génine consistent en la formation d’une double liaison en C4-C5 ou d’un époxyde en C5-C6. Ces génines sont substituées par une partie osidique en C-3, ou plus rarement sur les carbones C-2 et C-3.

Figure 7 : Squelette des cardénolides et des bufadiènolides

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Figure 8 : Configuration des cycles dans l’espace

La partie osidique peut être constituée de 1 à 4 sucres. Dans le cas des digitaliques on retrouve 3 digitoxoses reliés par des fonctions hydroxyles. Ce sont principalement des 2,6- didesoxyhexoses et des 2,6-didésoxy-3-méthylhexoses. (Bruneton, 2009)

Le cycle stéroïdique des cardénolides est issu de la voie des terpènes. Il y a tout d’abord formation du squalène par condensation queue à queue de deux sous-unités farnésyl diphosphate avec l’aide d’une enzyme, la squalène synthase. Puis, ce squalène est oxydé en 2,3-oxidosqualène qui subit ensuite une cyclisation aboutissant à la formation d’un précurseur des stéroïdes. (Figure 9) (Xu, Fazio et Matsuda, 2004).

Figure 9 : Schéma de la synthèse des précurseurs stéroïdiques

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Le précurseur stéroïdique emprunte ensuite soit la voie des pregnanes, soit celle des acides norcholaniques. Dans ces deux voies on retrouve l'intervention d'une enzyme, la 5β-réductase, qui permet de réduire la double liaison en C-4-C-5, son action permet d'obtenir des cycles A et B fusionnés en cis. Ce précurseur réduit est ensuite condensé avec une unité malonyl pour aboutir à la synthèse d'un cardénolide. Il peut également se condenser avec une unité oxaloacétyl et donner un bufadiénolide. Les voies empruntées peuvent être nombreuses ce qui amène à une grande variabilité dans les produits synthétisés et explique la grande diversité structurale de cette famille de composés (Agrawal, Petschenka, Bingham, Weber, et al., 2012 ; Kreis, Hensel et Stuhlemmer, 1998).

La détection des cardénolides peut être réalisée à l'aide de deux réactifs. Le réactif de Kedde est une préparation constituée d'une solution éthanolique d'acide 3,5-dinitrobenzoïque à 3% et d'une solution de soude à 2 M, le mécanisme d'action est présenté dans la figure 10.

Figure 10 : Schéma réactionnel du réactif de Kedde

Le réactif de Baljet peut également être utilisé, il contient de l'acide picrique qui réagit avec la lactone en milieu alcalin de la même manière que l’acide 3,5-dinitrobenzoïque. Le complexe coloré obtenu est de couleur orangé.

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III – Activités biologiques

Les cardénolides font partie d'une classe de composés appelés hétérosides cardiotoniques. Ces composés agissent sur la cellule cardiaque par une interaction avec la pompe Na+/K+. Celle-ci est une protéine transmembranaire permettant la sortie de sodium de la cellule ainsi que l’entrée de potassium, dans le but de maintenir le gradient de concentration intra et extracellulaire (Figure 15). Cette pompe est constituée d'une sous-unité alpha catalytique et d'une sous-unité bêta régulatrice. Il existe quatre types de sous-unités alpha et trois types de sous unités bêta. Les cardénolides bloquent la pompe Na+/K+ en interagissant avec la sous unité alpha, ce qui entraîne une augmentation du sodium intracellulaire. Pour compenser ce phénomène, l'échangeur Na+/Ca2+ fonctionne en sens inverse et fait ainsi sortir les ions sodium et entrer les ions calcium. Cela provoque une accumulation du calcium intracellulaire ce qui entraîne une augmentation de la force de contraction du muscle cardiaque (effet inotrope +) (Figure 11).

Figure 11 : Schéma d'une cellule et du fonctionnement des pompes Na+/K+ et Na+/Ca2+ a) Fonctionnement normal, b) Fonctionnement en présence de cardénolides

Les digitaliques provoquent également une augmentation du tonus vagal et une diminution du tonus adrénergique, ce qui induit une diminution de l'automaticité (effet chronotrope -) et un ralentissement de la conduction auriculo-ventriculaire entraînant une diminution du rythme ventriculaire (effet dromotrope -).

Ils ont également une action sur la réponse baroréflexe carotidienne aux variations de pression, en augmentant leur sensibilité ce qui provoque une inhibition du tonus sympathique, renforçant ainsi l'action bradycardisante. L'activité cardiaque des digitaliques est identifiable à l'électro-cardiogramme par la présence d'une cupule digitalique. Ce signe est caractéristique de l'imprégnation digitalique (Figure 12).

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Figure 12 : Electrocardiogramme : a) Patient sain, b) Patient sous digitaliques

La diminution du tonus adrénergique au niveau des fibres musculaires lisses entraîne une vasodilatation avec diminution des résistances périphériques. Au niveau rénal, cet effet, associé au blocage de la pompe sodium/potassium située sur le tube distal, a comme conséquence une diminution de la résorption du sodium et implique donc un effet diurétique.

Ces composés sont également responsables d'une stimulation du centre bulbaire du vomissement, ce qui a pour effet de provoquer des nausées et des vomissements. Ils peuvent également être responsables d'une modification de la perception des couleurs en agissant sur le cortex visuel.

La principale activité biologique est l'activité cardiaque, celle-ci est décrite par la règle des « 3 R » : Ralentir, Régulariser et Renforcer le cœur malade.

L'activité anti-cancéreuse des cardénolides est supposée depuis déjà quelques temps, en effet, en 1979, Dr Stenkvist et al observent que les patientes sous digitaliques souffrant de cancer du sein présentent des tumeurs bénignes, contrairement aux autres patientes présentant plus de tumeurs malignes. Ils attribuent cette propriété à la structure de la génine, qui est proche de celle des oestrogènes et qui pourrait interférer avec les récepteurs aux oestrogènes (Stenkvist, 1979). A contrario, de récentes études montrent une augmentation du risque de cancer du sein chez les patients en cours de traitement par des digitaliques. Cet effet est accru par des longs traitements par des digitaliques, mais il n’est pas constaté sur les patients anciennement traités par ces molécules (Ahern et al., 2014). Récemment, un criblage réalisé sur plus de 3000 composés a révélé que la digoxine présentait également une bonne activité cytotoxique, notamment sur des cellules de cancer de la prostate (Platz et al., 2011). On retrouve plusieurs articles décrivant l'activité cytotoxique de cardénolides, (Rashan et al., 2011 ; Roy, Chang, Huang, Chiang, et al., 2005 ; You et al., 2013). Selon certaines études, ces

15 propriétés auraient un lien avec l’interaction des molécules avec la pompe Na+/K+, l'augmentation de calcium intracellulaire induite provoquerait l'apoptose des cellules cancéreuses. Suite à la découverte de la présence d'hétérosides cardiotoniques endogènes à des concentrations de l'ordre du nanomolaire, le rôle de la pompe Na+/K+ a été étudié plus en profondeur (Schoner et Scheiner-Bobis, 2007). La faible concentration de ces molécules dans l'organisme ne suffit pas à créer un blocage de la pompe induisant un afflux de calcium, l'idée d'un second mode de fonctionnement du récepteur aux digitaliques a donc été envisagée. De cette manière il a été mis en évidence que cette pompe est également au départ de nombreuses voies de signalisations intracellulaire (Xie et Cai, 2003). Ainsi ces différentes voies de signalisations sont étudiées par de nombreuses équipes pour identifier le mécanisme d'action responsable de l'activité anti-cancéreuse des cardénolides (Cerella, Dicato et Diederich, 2013). Cependant ce mécanisme reste encore non réellement élucidé.

Relation structure-activité (Bruneton, 2009) L'activité cardiotonique des cardénolides est liée à la génine. La composition de la partie osidique intervient dans la distribution des molécules en modifiant leur polarité. En effet suivant le nombre de sucres liés et la présence de groupements hydroxyles libres, la polarité de la molécule sera affectée. Certains éléments structuraux de la génine sont importants pour l'activité : – La présence de la lactone insaturée en C-17, même si certains dérivés non insaturés ne sont pas totalement inactifs, la présence de cette lactone améliore l'activité. – L'enchaînement des cycles A, B et C en cis-trans-cis est plus favorable à l'activité qu'un enchaînement trans-trans-cis. – L'orientation des substituants a également un rôle important sur l'activité. Les configurations des carbones C-3 et C-14 portant tous deux des hydroxyles sont notamment liées à l'activité.

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IV – Utilisation en thérapeutique

Le seul cardénolide commercialisé aujourd'hui est la digoxine, Digoxine Nativelle ou Hemigoxine Nativelle, sous forme de comprimés, de solutions buvables ou de solutions injectables.

Figure 13 : Boîte de comprimés de Digoxine Nativelle

Indications : L'utilisation de ces médicaments est indiquée dans la prise en charge de l'insuffisance cardiaque, du flutter auriculaire et de la fibrillation auriculaire.

Posologie : La posologie habituelle de ce traitement par voie orale est de 0,25 mg par jour.

Contre-indications : La digoxine est contre-indiquée de façon absolue en cas de bloc auriculo-ventriculaire, d'hyperexcitabilité ventriculaire, d'extrasystole ventriculaire, de syndrome de Wolf Parkinson White, de tachycardie auriculaire ou ventriculaire, de flutter auriculaire, de fibrillation auriculaire ou ventriculaire, d'hypokaliémie, de traitement par sultopride ou calcium injectable ou millepertuis, d'apport alimentaire de millepertuis ou d'hypersensibilité à la digoxine ou à l'un des excipients. Ce traitement est également déconseillé en cas de traitement par la midodrine.

Effets indésirables :  Hyperexcitabilité ventriculaire. L'arrêt des digitaliques est indispensable en cas d'hypersensibilité ou de surdosage.

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 Les troubles digestifs (nausées, vomissements, diarrhées), sont les premiers symptômes fréquents et précoces de la toxicité digitalique. Ils cessent rapidement à l'arrêt du traitement.

 Troubles de la vision en particulier chez le sujet âgé, devant faire suspecter un surdosage.

 Troubles psychiatriques (convulsion, délire, hallucinations, psychose) en particulier chez le sujet très âgé, devant faire suspecter un surdosage.

 Gynécomastie exceptionnelle.

 Manifestations allergiques exceptionnelles (réactions cutanées).

 Thrombopénie, exceptionnelles en dehors d'un surdosage.

 A l'ECG, l'aspect en cupule du segment ST est habituel et traduit une imprégnation

digitalique et nullement un surdosage.

Auparavant, la digitaline (ou digitoxine) était également utilisée en thérapeutique dans le traitement de l'insuffisance cardiaque, la fibrillation auriculaire et le flutter auriculaire. Cette dernière a été retirée de la vente en 2003 du fait de son implication dans de nombreux cas d'intoxication aux digitaliques et du meilleur rapport bénéfice/risque apporté par la digoxine.

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V – Intoxications

Les hétérosides cardiotoniques sont responsables d'intoxications pouvant être dues à des surdosages suite aux traitements par les digitaliques ou à l'ingestion de fruits ou plantes riches en composés toxiques. L’ingestion de plantes cardiotoxiques peut être due à une confusion avec une autre espèce botanique ou à une tentative de suicide. Ces cas d’intoxication sont plutôt rares mais ils peuvent être graves.

Cette intoxication se révèle souvent de prime abord par des manifestations digestives, notamment avec des nausées, vomissements et douleurs abdominales pouvant aller jusqu'à l'infarctus mésentérique. Ces effets sont dus à la stimulation de l'area postrema. On retrouve également les troubles de la vision de type dyschromatopsie et flou visuel. Une confusion, des céphalées ou une agitation peuvent aussi être observées. Les signes caractéristiques de ce type d'intoxication sont les symptômes cardiovasculaires avec notamment des anomalies de l'ECG. En effet la cupule digitalique est alors plus prononcée (figure 14). Cette modification est due à des troubles de la conduction qui entraînent une bradycardie externe, ainsi qu'à des troubles de la repolarisation et des troubles de l'automatisme. Ces effets cardiaques font toute la gravité de l'intoxication.

Figure 14 : Cupule digitalique : A : imprégnation thérapeutique, B : intoxication

Au vu de la gravité des effets cardiaques des hétérosides cardiotoniques à forte dose, cette intoxication nécessite un traitement rapide et spécifique. Un traitement à base de fragments d'immunoglobulines (Fab) antidigitaliques (d'origine ovine) DigiFab® a donc été mis en place réduisant considérablement le nombre de décès liés à ces intoxications. Ces fragments lient la digoxine libre avec une affinité plus forte que celle existant entre les digitaliques et la pompe Na+/K+. Ainsi toutes les molécules de digoxine sont rapidement fixées et éliminées. 19

Les autres prises en charge face aux intoxications par les digitaliques sont l'administration de charbon, le lavage gastrique et éventuellement l'injection d'atropine en cas de bradycardie très importante.

Figure 15 : Boîte d'antidote aux intoxications digitaliques "DigiFab"

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VI – En recherche

Les principales recherches sur les cardénolides sont orientées sur leur potentielle activité anti- cancéreuse. Ces recherches s'avèrent être très prometteuses puisque aujourd'hui, un essai clinique de phase II est en cours pour découvrir les effets de la digoxine seule sur les tissus humains de cancer du sein. Il existe également deux autres essais en phase I et II en cours pour l'utilisation de la digoxine en association pour le traitement du cancer du sein et du mélanome (Cragg, Grothaus et Newman, 2014). Ces résultats encourageants sont tout de même à modérer et à confronter avec les résultats d’une étude récente portant sur une cohorte de 90202 femmes post-ménopause menée entre 1994 et 2010, qui a montré que l’utilisation de digoxine peut promouvoir la formation de cancer du sein (Ahern et al, 2014).

Un second composé se démarque en recherche sur les cardénolides, appelé UNBS 1450 (Figure 16), c'est un produit obtenu par modifications structurales d’un produit naturel, le 2’’- oxovoruscharin isolé du latex de Calotropis procera (Figure 17). Son activité a été démontrée sur les glioblastomes ce qui a conduit au dépôt d'un brevet et au lancement d'essais cliniques (Mijatovic et al, 2006).

Figure 16 : Composé UNBS1450 Figure 17 : Calotropis procera

Le tableau 2, ci-dessous, présente un aperçu de l'état de la recherche sur la cytotoxicité des cardénolides. L'activité des molécules est donnée par pathologie, et est quantifiée par la concentration de composé inhibant 50% de la population cellulaire (IC50).

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Tableau 2 : Etat de la recherche sur les cardénolides dans le domaine de la cancérologie

Pathologies / Molécules Activité Références Lignée cellulaire testé Glioblastome UNBS 1450 (U373) Proceraside A 0,05μg/mL (S R M Ibrahim, 2014) Frugoside 0,03μg/mL Calotropine 0,005μg/mL 6'-hydroxycalactin 0,4μM (Hamed et al., 2006) 6'-hydroxy-16α- 3,4μM acetoxycalactin 16α-hydroxycalactin 2,6μM 3'-O-α-D-glucopyra- 0,4μM nosylcalactin 12-dehydroxyghala- 0,1μM kinoside 6-dehydroxyghalaki- 0,4μM noside Ghalakinoside 0,4μM Calactin 0,2μM Cancer du sein 2′-O-acetylcerleaside 4,62μg/mL (Laphookhieo et al., 2004) (BC) A Cerleaside A 9,12μg/mL 17α-neriifolin 0,049μg/mL 17β-neriifolin 0,048μg/mL Cerberine 1,63μg/mL 7,8-dehydrocerberin 0,0006μg/mL (Cheenpracha, Karalai, Rat- Deacetyltanghinin 1,48μg/mL a-pa, Ponglimanont, et al., Tanghinin 0,77μg/mL 2004)

MCF-7 Glucogitoroside 10μM (Perrone et al., 2012) Digitaline 50μM Toxicarioside D 0,0485μM (Jiang et al., 2008) Malayoside 0,0282μM Strophanthojavoside 0,0341μM Deglucocheirotoxine 0,0234μM Strophalloside 0,041μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,037μM rhamnoside Strophanolloside 0,0152μM Antiarigenin-3-O-β-D- 0,437μM 6-deoxyalloside Antiarojavoside 0,123μM 6'-hydroxycalactin 0,5μM (Hamed et al., 2006) 6'-hydroxy-16α- 4,1μM acetoxycalactin 16α-hydroxycalactin 3,8μM 3'-O-α-D-glucopyra- 0,3μM nosylcalactin 12-dehydroxyghala- 0,4μM kinoside 22

6-dehydroxyghalaki- 0,3μM noside Ghalakinoside 0,3μM Calactin 0,04μM Reevesioside A 0,063μM (Chang et al., 2013) Reevesioside B 3,524μM Reevesioside C 2,040μM Reevesioside D 36,400μM Reevesioside E 11,800μM Reevesioside F 0,072μM Epi-Reevesioside F 0,034μM Reevesioside G 2,627μM Epi-Reevesioside G 2,415μM Tupichinolide 0,06μM (Pan et al., 2012) Adynerin 6,0μM (Siddiqui et al., 2012) Odoroside A 0,002μM Odoroside B 0,700μM Oleandrine 0,190μM

MDA-MB-435 Elaeodendroside T 0,37μM (Cao et al., 2007) Elaeodendroside B 0,15μM Cancer du côlon Glucogitoroside 8,3μM (Perrone et al., 2012) HT29 Digitaline 18μM Elaeodendroside T 0,18μM (Cao et al., 2007) Elaeodendroside B 0,08μM

SW480 Toxicarioside D 0,103μM (Jiang et al., 2008) Malayoside 0,0616μM Strophanthojavoside 0,0763μM Deglucocheirotoxine 0,064μM Strophalloside 0,0776μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,0658μM rhamnoside Strophanolloside 0,0436μM Antiarigenin-3-O-β-D- 0,9905μM 6-deoxyalloside Antiarojavoside 0,2395μM Tupichinolide 0,12μM (Pan et al., 2012) Cancer du Glucogitoroside 12μM (Perrone et al., 2012) poumon non à Gitoxigenin 3-Oβ-D- 60μM petites cellules digitaloside (A549) Digitaline 10μM Proceraside A 0,3μg/mL (S R M Ibrahim, 2014) Frugoside 0,2μg/mL Calotropine 0,005μg/mL UNBS 1450 0,01μM (Mijatovic et al., 2006) Toxicarioside D 0,0671μM (Jiang et al., 2008) Malayoside 0,0248μM Strophanthojavoside 0,0483μM Deglucocheirotoxine 0,0258μM Strophalloside 0,0322μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,0176μM rhamnoside 23

Strophanolloside 0,0083μM Antiarigenin-3-O-β-D- 0,4507μM 6-deoxyalloside Antiarojavoside 0,238μM 6'-hydroxycalactin 0,08μM (Hamed et al., 2006) 6'-hydroxy-16α- 0,8μM acetoxycalactin 16α-hydroxycalactin 0,4μM 3'-O-α-D-glucopyra- 0,2μM nosylcalactin 12-dehydroxyghala- 0,04μM kinoside 6-dehydroxyghalaki- 0,05μM noside Ghalakinoside 0,08μM Calactin 0,02μM Tupichinolide 0,06μM (Pan et al., 2012)

NCI-H187 2′-O-acetylcerleaside 7,56μg/mL (Laphookhieo et al., 2004) A 17α-neriifolin 0,032μg/mL 17β-neriifolin 0,076μg/mL Cerberin 1,24μg/mL 7,8-dehydrocerberin 16,7μg/mL (Cheenpracha, Karalai, Rat- Deacetyltanghinin 0,1μg/mL a-pa, Ponglimanont et Tanghinin 2,3μg/mL Chantrapromma, 2004)

NIH-H460 Toxicarioside D 0,0303μM (Jiang et al., 2008) Malayoside 0,0146μM Strophanthojavoside 0,0215μM Deglucocheirotoxine 0,015μM Strophalloside 0,0196μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,0108μM rhamnoside Strophanolloside 0,0058μM Antiarigenin-3-O-β-D- 0,215μM 6-deoxyalloside Antiarojavoside 0,0816μM Madagascarensilide A 0,16μM (Pan et al., 2011) Madagascarensilide B 0,68μM Madagascarensilide C 0,37μM Madagascarensilide D 0,48μM Reevesioside A 0,019μM (Chang et al., 2013) Reevesioside B 0,431μM Reevesioside C 0,208μM Reevesioside D 3,900μM Reevesioside E 1,770μM Reevesioside F 0,020μM Epi-Reevesioside F 0,010μM Reevesioside G 0,749μM epi-Reevesioside G 0,680μM Reevesioside H 8,066μM Epi-Reevesioside H 4,638μM

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Calu-6 Toxicarioside D 0,619μM (Jiang et al., 2008) Malayoside 0,3455μM Strophanthojavoside 0,331μM Deglucocheirotoxine 0,207μM Strophalloside 0,2213μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,1633μM rhamnoside Strophanolloside 0,0675μM Antiarigenin-3-O-β-D- 2,893μM 6-deoxyalloside

H522-T1 Elaeodendroside T 0,18μM (Cao et al., 2007) Elaeodendroside B 0,08μM Cancer de la Proceraside A 0,06μg/mL (S R M Ibrahim, 2014) prostate (PC3) Frugoside 0,05μg/mL Calotropine 0,005μg/mL 6'-hydroxycalactin 0,3μM (Hamed et al., 2006) 6'-hydroxy-16α- 1,2μM acetoxycalactin 16α-hydroxycalactin 1,0μM 3'-O-α-D-glucopyra- 0,2μM nosylcalactin 12-dehydroxyghala- 0,04μM kinoside 6-dehydroxyghalaki- 0,05μM noside Ghalakinoside 0,08μM Calactin 0,02μM

LNCaP Toxicarioside D 0,115μM (Jiang et al., 2008) Malayoside 0,0524μM Strophanthojavoside 0,089μM Deglucocheirotoxine 0,0476μM Strophalloside 0,0697μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,0428μM rhamnoside Strophanolloside 0,0219μM Antiarigenin-3-O-β-D- 0,6885μM 6-deoxyalloside Antiarojavoside 0,4785μM Cellules KB 2′-O-acetylcerleaside 7,56μg/mL (Laphookhieo et al., 2004) A 17α-neriifolin 0,078μg/mL 17β-neriifolin 0,017μg/mL Cerberine 1,92μg/mL 7,8-dehydrocerberin 1,75μg/mL (Cheenpracha, Karalai, Rat- Deacetyltanghinin 0,05μg/mL a-pa, Ponglimanont et Tanghinin 1,29μg/mL Chantrapromma, 2004) Cancer ovarien Toxicarioside D 0,997μM (Jiang et al., 2008) HeLa Malayoside 0,037μM Strophanthojavoside 0,0679μM Deglucocheirotoxine 0,0449μM 25

Strophalloside 0,0591μM Cannogenol-3-O-α-L- 0,0277μM rhamnoside Strophanolloside 0,0115μM Antiarigenin-3-O-β-D- 0,493μM 6-deoxyalloside Antiarojavoside 0,2597μM

A2780 Madagascarensilide A 0,18μM (Pan et al., 2011) Madagascarensilide B 0,12μM Madagascarensilide C 0,17μM Madagascarensilide D 0,29μM Elaeodendroside V 0,12μM (Hou et al., 2009) Elaeodendroside W 0,07μM Bovinides A 0,17μM (Karkare et al., 2007) Bovinides B 0,66μM Bovinides C 2,9μM Bovinides D 0,29μM Bovinides E 0,28μM Bovinides F 0,54μM Elaeodendroside T 0,085μM (Cao et al., 2007) Elaeodendroside U 30μM Elaeodendroside B 0,019μM Elaeodendroside F 0,19μM Elaeodendroside G 0,10μM Lymphome Elaeodendroside V 0,15μM (Hou et al., 2009) U937 Elaeodendroside W 0,08μM Elaeodendroside T 0,15μM (Cao et al., 2007) Elaeodendroside B 0,05μM

Les cardénolides sont également étudiés pour leurs propriétés anti-inflammatoires. En effet, la ouabaïne à faible concentration a démontrée provoquer l'activation du facteur de transcription NF-κB, par l'intermédiaire de faible oscillations de la concentration de calcium intracellulaire (Aizman, Uhlén, Lal, Brismar, et al., 2001). La ouabaïne provoque également une rapide augmentation du taux intracellulaire d’espèces réactives de l'oxygène (ROS) ce qui serait impliqué dans l'activation du NF-κB (Xie et al., 1999). Au contraire, l'oléandrine et la digitoxine bloquent l'activation du facteur de transcription NF- κB induite par la protéine inhibitrice IκB. Cette propriété a pour conséquence des effets anti- inflammatoires importants. Cette activité peut également être intéressante pour inhiber l'initiation, la promotion et les métastases cancéreuses (Manna, Sah, Newman, Cisneros, et al., 2000 ; Yang et al., 2005). Ainsi, de nombreuses études ont été réalisées sur les propriétés anti-inflammatoires des cardénolides et leur mécanisme d'action. Les effets de ces molécules ont été étudiés sur différentes voies de signalisation, mettant ainsi en évidence le blocage de divers médiateurs de l'inflammation tels que les interleukines 1 ou 8 (IL-1, IL-8) (Manna, Sreenivasan et Sarkar, 26

2006 ; Kataoka, 2009). La suppression de l'IL-8 induite par les cardénolides est également l'objet de recherche dans le traitement de la fibrose kystique (Srivastava et al., 2004).

De récentes recherches étudient également l'effet de ces molécules sur certaines neuropathies (Paul et al., 2014) et sur la diminution des accidents ischémiques (Kanegan et al., 2014). Il a également été démontré qu'une courte exposition des tissus cardiaques à une faible concentration de ouabaïne, protège le cœur contre les accidents vasculaires (Pierre et al., 2007).

Ces recherches sur les cardénolides montrent l’intérêt encore bien présent de ces molécules en thérapeutique. L’étude présentée dans le reste du manuscrit s’est plus particulièrement orientée sur les hétérosides cardiotoniques contenus dans une plante de la famille des Célastraceae, Cassine orientalis.

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Partie II

Cassine orientalis

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I – Description botanique

Classification phylogénétique : Classification classique : Clade : Angiospermes Règne : Plantae Clade : Dycotylédones vraies Division : Magnoliophyta Clade : Rosidées Classe : Magnoliopsida Clade : Fabidées Ordre : Celastrales Ordre : Celastrales Famille : Celastraceae Famille : Celastraceae

Cassine orientalis, autrement appelé bois d'olive ou bois rouge est un grand arbre atteignant 15 m de hauteur, à cime régulière et arrondie (Figure 18). Son tronc mesure de 30 à 90 cm de diamètre à la base, il est tordu et irrégulièrement cannelé. Son écorce est orange vif à l'intérieur.

Figure 18 : Cassine orientalis (arbre)

Les feuilles de cet arbre sont opposées, parfois sub-opposées et rarement disposées par trois. Cette espèce présente une hétérophyllie de développement décrite dans le tableau 3 ci-dessous (Figure 19).

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Tableau 3 : Aspect des feuilles suivant le développement de Cassine orientalis

Feuilles juvéniles Sessiles, longues, linéaires, étroites, souvent plus ou moins falciformes, à marges révolutées, entières ou ayant quelques dents distantes Feuilles de transition Pétiole et nervure principale rouges, à limbe progressivement plus large et plus nettement crénelé par des échancrures glanduleuses Feuilles adultes Pétiole long de 5-20 mm, canaliculé ou plan sur la face supérieure; limbe vernissé dessus, vert plus clair dessous, plus ou moins épais, elliptique ou elliptique-oblong à obovale (2,5-10 x 1,5-8 cm), le plus souvent obtus au sommet et plus ou moins apiculé par une pointe creuse ou épaissie, devenant noire en séchant, à marges épaisses, révolutées, glanduleuses-crénelées; nervation réticulée, saillante sur les deux faces; nervure médiane épaisse, saillante sur la face inférieure

Figure 19 : Feuilles de Cassine orientalis

Les inflorescences sont des cymes bipares sur des pousses nouvelles, axillaires ou aux nœuds défeuillés, au-dessous des feuilles (figure 20). Les fleurs sont très petites, hermaphrodites à 5 pétales vert-jaune safran (Figure 21).

Figure 20 : Inflorescence de Cassine orientalis Figure 21 : Fleurs de Cassine orientalis

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Le fruit est une drupe contenant une ou deux graines dans un noyau osseux et ressemblant à une olive (d’où son nom mauricien, Bois d'olive), verte pendant la maturation, brune en séchant après la chute (Figure 22).

Figure 22 : Fruits de Cassine orientalis

Cette espèce est endémique des Mascareignes, archipel regroupant les îles de La Réunion, Maurice et Rodrigues.

Figure 23 : Localisation des Mascareignes

Elle est présente jusqu'à 1000 m d'altitude sur le pourtour de l'île et dans les cirques.

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II – Utilisation traditionnelle

1 - Famille des Celastraceae

La famille des Celastraceae regroupe principalement des arbres et arbustes, sa distribution est largement répandue mais concentrée dans les régions tropicales et subtropicales. Les principaux genres retrouvés sont Maytenus, Salacia, Euonymus, Hippocratea, Cassine, Celastrus, Elaeodendron, Pachystima et Gyminda (Heywood, 1993).

Quelques plantes appartenant à la famille des Celastraceae et leur utilisation traditionnelle sont décrites dans le tableau 4 suivant.

Tableau 4 : Plantes de la famille des Celastraceae et leur utilisation traditionnelle

Plantes Utilisation Références Maytenus ilicifolia Maux d'estomac (Raintree, Tropical Plant Contraception Database) Salacia oblonga, S. reticulata Diabète (Williams et al, 2007) Euonymus europaeus Anti-poux (UVED) Toxique Euonymus atropurpureus Plante purgative (PFAF) Toxique contenant des cardénolides Hippocratea excelsa, H. Insecticide (Reyes-Chilpa et al, 2003) celastroide Celastrus scandens Émétique (Wikipedia) Maladies vénériennes Antituberculeux

2 - Genre Cassine

Le genre Cassine regroupe environ 80 espèces, il est présent en zone tropicale et est particulièrement bien représenté en Afrique. Le genre Elaeodendron a longtemps été considéré comme distinct de Cassine mais aucun caractère important ne les sépare. Le seul critère est la variation de l’endocarpe de la drupe qui varie de coriace à osseuse, ce qui n’est plus considéré comme suffisant pour individualiser les deux genres. De plus, des études palynologiques conduisent à conclure à l’identité des deux genres. Ce sont des arbres ou arbrisseaux présents aux Mascareignes, glabre, inermes et sans latex. Les fruits sont des drupes indéhiscentes. 32

On retrouve diverses propriétés attribuées à des plantes du genre Cassine. Celles-ci sont répertoriées dans le tableau 5 suivant.

Tableau 5 : Utilisations traditionnelles des plantes du genre Cassine (et Elaeodendron)

Plante Partie utilisée Préparation Activité Référence Cassine transvaa- Ecorce Infusion Laxatif, (Arnold et lensis maux d'estomac, Gulumian, 1984) syn : Elaeodendron dysménorrhée transvaalense Macération Calculs rénaux, maladies vénériennes

Ecorce et Décoction Laxatif racines Racines Macération Maux d'estomac Infusion Toux, Diarrhées Ecorce Extrait Antibactérien (McGaw, Jäger et éthanolique vs Bacillus subtilis; Van Staden, 2000) Staphylococcus aureus Extrait Antifongique (vs Can- (Samie et al., 2010) méthanolique dida albicans) Racines Extrait aqueux Antibactérien (Tshikalange, Meyer et Hussein, 2005) Elaeodendron bu- Ecorce Pneumonie (Hamza et al., chananii 2006) Fruits Extrait Insecticide (Tsanuo, méthanolique Hassanali, Jondiko et Torto, 1993) Elaeodendron Racines Décoction Anémie, (Maregesi et al., schlechteranum dysménorrhée, 2010) infertilité et impuis- sance, problèmes cardiovascu- laires Ecorce et Extrait Antibactérien (Gram +) racines méthanolique Antiparasitaire Anti-HIV

Cassine xylocarpa Anti-HIV Cassine orientalis Plante entière Extrait aqueux Anti-oxydant (Soobrattee, Bahorun, Neergheen, Googoolye, et al., 2008) Extrait Antidiabétique (Picot, Subratty et méthanolique Mahomoodally, 2014)

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3 - Espèce Cassine orientalis (Jacq.) Kuntze

Synonymes : Aralia chabrieri A.van Geert, Cassine orientale (Jacq.) Kuntze, Elaeodendron indicum Gaertn., Elaeodendron orientale Jacq., Elaeodendron pyramidale Salisb., Rubentia olivina J.F. Gmel., Rubentia orientalis (Jacq.) Dum.Cours.

Noms communs : Bois rouge, Bois rouge à feuilles de laurier, Bois rouge de Bourbon, Bois d’olive.

Son bois est considéré comme étant de bonne qualité il est ainsi utilisé en menuiserie, ébénisterie et construction. Il est également utilisé comme bois d'ornement et d'alignement du bord des routes. A La Réunion, cette plante est considérée comme étant toxique, son écorce aurait des propriétés stupéfiantes et les feuilles sont émétiques. Cassine orientalis y est également utilisée pour son activité anti-hypertensive et elle est connue à l'île Maurice pour ses effets antidiabétiques. Une espèce proche de Cassine orientalis à Madagascar produit des fruits toxiques pour les lémuriens (Cao et al., 2007).

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III – Phytochimie

1 - Famille des Celastraceae Les principales molécules d'intérêt identifiées dans les plantes de la famille des Celastraceae sont des composés terpéniques, notamment des triterpènes ainsi que des sesquiterpènes. D'autres types de molécules sont retrouvés dans ces plantes :

 diterpènes  alcaloïdes  naphtoquinones  lactones macrocycliques

Divers cardénolides ont préalablement été isolés à partir de plantes appartenant à la famille des Celastraceae, la plupart de ceux-ci présentent une génine substituée sur les positions C-2 et C-3, autorisant la formation d'une structure cyclique comme c'est le cas pour les elaeodendrosides B, C, F, G, K, L, M, N, O, P, Q, R et S isolés par Shimada K. et al à partir de Elaeodendron glaucum (Shimada, Kyuno, Nambara et Uchida, 1985) (Shimada, Masuda, Ohtaki, Kobayashi, et al., 1990) (ex elaeodendrosides B et R, figures 24 a) et b)). Cette particularité est également retrouvée avec le buchaninoside (Figure 24 c)), isolé de Elaeodendron buchananii par Tsujino Y. et al (Tsujino, Ogoche, Tazaki, Fujimori, et al., 1995).

Figure 24 : Exemples de cardénolides isolés de plantes de la famille des Celastraceae

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On retrouve également des composés dont la partie osidique n'est rattachée à la génine que par le carbone C-3, aboutissant ainsi à des structures chimiques plus proches de celle des digitaliques. L'euonymuside et l'euonymusoside isolés de Euonymus alata par Kitanaka et al présentent ce type de structure (Kitanaka, Takido, Mizoue et Nakaike, 1996). (Euonymuside A, figure 24 d))

2 - Genre Cassine

Plusieurs types de molécules ont été isolés de plantes appartenant au genre Cassine ou Elaeodendron et sont résumés dans le tableau 6 suivant. On trouve un genre riche en composés triterpéniques tels que les cardénolides.

Tableau 6 : Molécules isolées de plantes du genre Cassine

Plante Famille de molécule Molécules Références Elaeodendron Hétéroside Elaeodendroside A (Kupchan et al., 1977) glaucum cardiotonique Elaeodendrosides (Shimada, Kyuno, A, D, E, H, I, J Nambara et Uchida, Elaeodendrogenin 1982)

Elaeodendrosides (Shimada, Kyuno, B, C, F, G, K, L Nambara et Uchida, 1985) Elaeodendrosides (Shimada, Masuda, M, N, O, P, Q, R, S Ohtaki, Kobayashi et Nambara, 1990) Nor-triterpène Elaeodendrol, (Anjaneyulu et Rao, Elaeodendradiol 1980) Dérivés de friedelan Friedelin Canophyllal Friedelan-3-on-25- al Friedelan-3β-ol Canophyllol Friedelan-3-on-25- ol Sitosterol Elaeodendron Flavonoïdes Ourateacatechin (Weeratunga, Bohlin, balae Ouratea- Verpoorte et Kumar, proanthocyanidin A 1985) Elaeocyanidin

Friedooleanane D:B-friedoolean-5- (Weeratunga et Kumar, (triterpène) en-3β,29-diol 1985) Cassine balae Ene-quinone-méthide Balaenol (Chandrasiri Fernando, 36

triterpènoïde Balaenonol Leslie Gunatilaka, Isobalaendiol Tezuka et Kikuchi, 1989) Pristimerin Tingenone 22β- hydroxytingenone 20- hydroxytingenone Celastranhydride Cassine Triterpenes Canophyllol (Drewes, Mashimbye, transvaalensis pentacycliques Canophyllal Field et Ramesar, 1991) 6β-hydroxy-lup- 20(30)-en-3-one

Peltogynoide 11,11-diméthyl- 1,3,8,10- tetrahydroxy-9- methoxypeltoginan Elaeodendron Hétérosides Mutangin (Tsanuo, Hassanali, buchananii cardiotoniques Jondiko et Torto, 1993) Elabunin (Kubo et Fukuhara, 1990) Buchaninoside (Tsujino, Ogoche, Tazaki, Fujimori et Mori, 1995) Elaeodendron Hétérosides Elaeodendrosides T (Cao et al., 2007) sp cardiotoniques et U Elaeodendron Hétérosides Elaeodendrosides (Hou et al., 2009) alluaudianum cardiotoniques V et W

3 - Espèce Cassine orientalis

La seule étude sur le contenu chimique de Cassine orientalis répertoriée dans la littérature a démontré la présence de nombreux composés polyphénoliques dont des flavonoïdes et des proanthocyanidines (Soobrattee, Bahorun, Neergheen, Googoolye et Aruoma, 2008). La plante a récemment fait l’objet de travaux préliminaires dans le cadre d’un master au Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et des Sciences des Aliments (LCSNSA) de l’Université de La Réunion. Ces travaux ont permis de déceler la présence de cardénolides en grand nombre dans ses fruits. Cette plante n'ayant été que très peu étudiée, son analyse phytochimique se révèle intéressante pour isoler de nouveaux cardénolides. De plus, des intoxications suite à l'ingestion de ces fruits ont été décrites, laissant y présumer la présence de composés actifs. Les nombreuses études réalisées sur les hétérosides cardiotoniques dans le domaine de la cancérologie et de l'immunologie montrent l'intérêt d'étudier de nouveaux cardénolides.

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Partie III

Travaux de recherche portant sur l’isolement et étude de l’activité biologique de cardénolides isolés de fruits de Cassine orientalis

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I – Travaux antérieurs

1 – Extraction

Les échantillons de Cassine orientalis ont été recueillis au Piton Saint-Leu sur l'île de La Réunion. Une extraction à partir de diverses parties de la plante et à l'aide de divers solvants, a été réalisée au Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et des Sciences des Aliments de l'Université de La Réunion. Des extraits de différentes polarités ont été analysés par chromatographie sur couche mince (CCM) et révélés à l'aide de plusieurs réactifs de manière à réaliser un criblage chimique. L'utilisation du réactif de Kedde a mis en évidence la présence de nombreux cardénolides principalement dans les extraits apolaires (chloroformiques) des fruits verts de la plante. Les données bibliographiques montrant l'intérêt des cardénolides en recherche, l'étude a été poursuivie sur les fruits.

2 – Fractionnement

L'extrait chloroformique de fruits verts de Cassine orientalis a été fractionné en Avril 2011, au LCSNSA, par flash chromatographie (phase inverse), dans le but d'isoler les cardénolides qu'il contient. Ce fractionnement a abouti à l'obtention de 26 fractions. Parmi ces fractions, deux ont donné des cristaux : F12 et F14, lors de la MPLC. La recristallisation a été réalisée par solubilisation complète dans du chloroforme puis évaporation lente permettant ainsi d’obtenir les fractions 14a, 14b, 14c et 14d. Les fractions 3 à 26 ont ensuite été transmises à l'Institut de Chimie des Substances Naturelles dans le but de poursuivre leur étude.

Tableau 7 : Masse des fractions de Cassine orientalis (en mg)

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II – Travaux personnels

1 - Analyse des fractions Les fractions reçues ont toutes été analysées en HPLC analytique avec le gradient de 80/20 ACN/eau à 100% ACN (tableau 20) (fractions 3 à 26). Les fractions ont également été analysées sur CCM avec un éluant DCM/MeOH 90 :10 puis révélées à l’aide du réactif de Kedde. Les fractions 6 à 19 ont révélé contenir des cardénolides (Figure 25).

Figure 25 : CCM récapitulative de l'extrait fractionné (DCM/MeOH 90:10) Toutes ces informations ont permis de sélectionner seulement quelques fractions à partir desquelles le travail d'isolement et de purification des cardénolides de la plante a été effectué. Cette analyse a permis de révéler une fraction quasiment pure, la fraction 14d. Elle a donc été analysée en LC-MS HR et un spectre de RMN 1H a été réalisé dans le but de procéder aux travaux de déréplication. Ces recherches ont abouti à l’identification d’une molécule préalablement décrite, l’Elaeodendroside B (Shimada, Kyuno, Nambara et Uchida, 1985)

Figure 26 : Elaeodendroside B (Figure 26).

Après analyse par HPLC, les différents composés constituant les fractions ont été listés en fonction de leur temps de rétention (Figure 27). Cette étude a permis de repérer les fractions contenant les composés majoritaires en fonction de l’intensité des pics au DEDL. Ainsi, les fractions 8, 10, 11, 12 et 14b ont été sélectionnées dans le but d’en isoler ces composés majoritaires.

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Figure 27 : Analyse des composés présents dans l'extrait chloroformique de Cassine orientalis

Parallèlement, les fractions contenant des cardénolides (6 à 19) ont été testées sur des lignées cellulaires cancéreuses HCT-116 (cancer du côlon) dans le but d’observer une activité cytotoxique. Ce test a montré que les fractions les plus actives étaient les fractions 12, 14 et 16. (Résultats tableau 8)

Tableau 8 : Activité cytotoxique des fractions testées sur HCT 116

HCT116 (μg/mL)

F6 0,1

F7 0,1< IC50<1

F8 0,1< IC50<1

F9 0,1< IC50<1

F10 0,1< IC50<0,5

F11 0,1< IC50<0,5

F12 0,01< IC50<0,1

F14 0,01< IC50<0,1

F16 0,01< IC50<0,1

F18 0,1< IC50<0,5

F19 0,1< IC50<0,5

F22 IC50>1

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La fraction 16 a donc été également sélectionnée pour être purifiée par HPLC semi- préparative.

2 - Purifications

1 – Fraction 8 La fraction 8 a été séparée à l’aide de la Flash Chromatographie, par un mélange de dichlorométhane et de méthanol, conduisant ainsi à l’obtention de 16 sous-fractions (tableau 9). La CCM a indiqué la présence de cardénolides dans les sous-fractions 6 à 15 (Figure 28).

Tableau 9 : Masse des fractions obtenues après purification de la fraction 8 (en rouge fractions contenant des cardénolides) Fraction Masse fraction F1 0,6 F2 2,8 F3 0,4 F4 0,1 F5 3,3 F6 12,7 F7 41,8 F8 26,1 F9 14,3 F10 36,1 F11 36,7 F12 9,1 F13 3,9 Figure 28 : CCM récapitulative du fractionnement de F14 3,7 la fraction 8 F15 3,5 F16 13,5

Les profils chromatographiques des sous-fractions 6, 7 et 8 ont montré un composé majoritaire avec le même temps de rétention dans des conditions identiques. La RMN 1H et les données obtenues par LC-MS HR ([M+H]+=593,2208) ont confirmé que cette molécule était la même dans les 3 sous-fractions. Une étude déréplicative a été réalisée. Aucun composé correspondant n’a pu être retrouvé, une analyse complète de la sous-fraction 7 (la plus pure) en RMN a donc été réalisée. L’identification structurale a mené à la découverte d’un nouveau

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Figure 29 : Composé 1 MM=592, C29 H36 O13 composé, appelé ici Composé 1 (Figure 29).

La sous-fraction 9 s’est révélée trop impure pour identifier le composé majoritaire, cependant la LC-MS HR a montré la présence d’une molécule de masse molaire différente de celle du composé 1 ([M+H]+=547,2552). L’étude déréplicative n’a pas permis d’identifier ce second composé. La sous-fraction 9 a donc été purifiée par chromatographie semi-préparative. Cette purification a permis l’obtention de 2 produits en petite quantité. Le seul produit isolé en quantité suffisante pour être identifié est celui obtenu dans la première fraction. La déréplication avec les données obtenues n’a pas permis d’identifier le composé. Une étude complète en RMN a donc également été réalisée dans le but d’effectuer l’identification structurale. Le produit identifié a été appelé ici Composé 2 (Figure 30).

Figure 30 : Composé 2, MM=546, C29 H38 O10

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Figure 31 : Schéma de la purification de la fraction 8 (en rouge les fractions contenant des cardénolides)

2 – Fraction 10 La fraction 10 a été purifiée à l’aide d’une colonne Kromasil C18 préparative avec une élution isocratique à 25% ACN 0,1% AF – 75% eau 0,1% AF. Deux sous-fractions ont été obtenues, elles ont toutes les deux été soumises à l’étude déréplicative.

Tableau 10 : Masse des fractions obtenues après purification de la fraction 10

Fraction Masse fraction (mg) F1 5,2 F2 2,9 Total 8,2

La première sous-fraction a révélé être principalement constituée du Composé 1 déjà décrit. La seconde sous-fraction obtenue a présenté un mélange de deux cardénolides.

Cette 2ème sous-fraction a donc été purifiée à l’aide d’une colonne PFP semi-préparative avec une élution isocratique à 22% ACN 0,1% AF – 78% eau 0,1% AF. Deux composés purs ont alors été obtenus.

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Tableau 11 : Masses des fractions obtenues après la deuxième purification

Fractions Masse fraction (mg) F1 88,1 F2 20,7 Total 108,8

Après déréplication, les composés ont été identifiés comme étant l’Elaeodendroside P avec [M+H]+=547,2496 et l’Elaeodendroside R avec [M+H]+=531,2592 (Shimada, Masuda,

Figure 32 : Elaeodendroside P Figure 33 : Elaeodendroside R Ohtaki, Kobayashi et Nambara, 1990) (Figures 32 et 33).

Figure 34 : Schéma de purification de la fraction 10 (en rouge fractions contenant des cardénolides)

3 – Fraction 11

La fraction 11 a également été séparée par HPLC préparative sur une colonne Kromasil C18 préparative, avec une élution isocratique 30% ACN 0,1% AF – 70% eau 0,1% AF. Cette séparation a conduit à l’obtention de 5 sous-fractions.

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Tableau 12 : Masses des fractions obtenues après purification de la fraction 11

Fraction Masse fraction (mg) F1 5,1 F2 4,8 F3 1,7 F4 2,6 F5 44,9 Total 59,1

Chacun des produits repérés dans ces sous-fractions a été dérépliqué. La sous-fraction 1 a révélé être constituée du Composé 1. La sous-fraction 2 est constituée du même mélange trouvé dans la sous-fraction 2 provenant de la fraction 10, c’est à dire un mélange d’elaeodendroside P et elaeodendroside R. + La sous-fraction 3 est constituée d’un composé avec [M+H] =561,2710 soit C30 H40 O10. Après déréplication, le composé a été identifié comme étant l’Affinoside S (Hanada, Abe, Mori et Yamauchi, 1992) (Figure 35).

Figure 35 : Affinoside S

La sous-fraction 4 est majoritairement constituée d’un composé inconnu avec [M+H]+=577,2318 et de pureté et de quantité non suffisante pour réaliser une élucidation structurale. Ce composé a cependant été retrouvé ensuite lors de la purification de la fraction 12 et a pu être identifié, il correspond au composé 3. La sous-fraction 5 contient également un composé inconnu avec [M+H]+=607,2384. Ce composé a aussi été retrouvé ensuite lors de la purification de la fraction 12 et a pu être identifié, il correspond au composé 4.

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Figure 36 : Schéma de purification de la fraction 11 (en rouge, fractions contenant des cardénolides)

4 – Fraction 12

La fraction 12 a été purifiée par chromatographie préparative sur une colonne Kromasil C18 préparative avec une élution isocratique 30% ACN 0,1% AF – 70% eau 0,1% AF. Sept sous- fractions ont été obtenues. Seules les sous-fractions 3 à 7 ont été analysées en LC-MS HR et RMN du proton, les deux premières étant obtenues en trop faibles quantités.

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Tableau 13 : Masses des fractions obtenues après purification de la fraction 12

Fractions Masse fraction (mg) F1 0,3 F2 0,2 F3 4,2 F4 10,9 F5 62,6 F6 38,2 F7 2,1 Total 118,6

La sous-fraction 3 n’est pas de pureté suffisante pour réaliser une étude structurale des composés présents. La sous-fraction 4 est constituée d’un composé de masse molaire [M+H]+=577,2318 non retrouvé dans les bases de données. Une analyse complète par RMN a donc été réalisée. Le composé 3 a été caractérisé. (Figure 37) La sous-fraction 5 a également révélé contenir un composé pur, de masse molaire [M+H]+=607,2384 et non retrouvé dans les bases de données. L’élucidation structurale de celui-ci a donc été réalisée. Le composé 4 a été identifié. (Figure 38) Ce composé a également été isolé sous forme de cristaux et analysé par cristallographie.

Figure 37 : Composé 3, MM=576, Figure 38 : Composé 4, MM = 606, C29 H36 O12 C30 H38 O13

La sous-fraction 6 s’est également montrée constituée d’un produit pur avec [M+H]+=561,2737. Après déréplication, le composé a été identifié comme étant l’Affinoside R (Hanada, Abe, Mori et Yamauchi, 1992). (Figure 39)

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Figure 39 : Affinoside R

Enfin le produit obtenu dans la sous-fraction 7 a été identifié comme étant l’elaeodendroside

Figure 40 : Schéma de purification de la fraction 12 (en rouge fractions contenant des cardénolides) B.

5 – Fraction 14b

La fraction 14b a également été purifiée par HPLC préparative sur une colonne Kromasil C18 préparative avec une élution isocratique 30% ACN 0,1% AF – 70% eau 0,1% AF. Un seul composé a été isolé avec cette technique. Après une analyse LC-MS HR et RMN du proton, le composé a été identifié comme étant le composé 4.

6 – Fraction 16

La fraction 16 a été séparée par une HPLC semi-préparative sur une colonne Kromasil C18 semi-préparative avec une élution isocratique 35% ACN 0,1% AF – 65% eau 0,1% AF. Trois sous-fractions ont été obtenues de cette manière mais en très petite quantité. Ainsi seule la sous-fraction 3 a pu être analysée pour la déréplication, pour un composé avec

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[M+H]+=531,2940 ne donnant aucun résultat dans les bases de données. L’analyse complète du produit a donc été réalisée par RMN, permettant l’identification du composé 5 (Figure 41).

Figure 41 : Composé 5, MM = 530, C30 H42 O8

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3 – Récapitulatif des composés isolés

1 – Composés connus isolés

Figure 42 : Composés connus isolés

Tous les composés isolés ont une partie osidique doublement liée à la génine, formant ainsi des structures à six cycles. Ces molécules connues possèdent toutes un méthoxy en position 3’ et une double liaison entre C-4 et C-5.

2 – Composés nouveaux

Figure 43 : Composés nouveaux isolés

Les composés nouveaux ont également une partie osidique doublement liée à la génine. Cependant, certaines de ces molécules présentent un dioxométhylène en C-2’-C-3’ ainsi qu’un époxyde en C-5-C-6.

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4 - Analyse structurale La démarche d’analyse structurale utilisée durant l’étude débute par l’obtention de la masse moléculaire haute résolution par l’analyse LC-MS HR fournissant ainsi des informations sur la formule brute des composés. Seule l’analyse exhaustive du composé 4 sera effectuée, pour les autres les différences les plus marquantes seront discutées par rapport à cette première analyse.

1 – Composé 4

La masse de l’ion pseudo-moléculaire obtenue pour ce composé est de [M+H]+ = 607,2396 calculée pour C30 H39 O13 m/z = 607,2391 (Figure 44). Soit un composé avec M= 606 Da et une formule brute C30 H38 O13, dont on peut déduire le nombre d’insaturations de 12.

Figure 44 : Spectre LC-MS haute résolution du composé 4

Le spectre IR du composé montre des bandes d’absorption à 1736 et à 3445 cm-1 suggérant la présence d’un carbonyle ,-insaturé et des groupements hydroxyles (Figure 45).

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Figure 45 : Spectre d'absorption dans l'infrarouge du composé

L’élucidation structurale complète du composé 4 a été déterminée par l'analyse des spectres IR et de RMN 1D et 2D: 1H, 13C, HSQC, COSY, HMBC et ROESY. Le tableau des déplacements chimiques (tableau 14) a été établi à l’aide des spectres 1H, 13C et de l’HSQC montrant les corrélations entre les carbones et les protons qu’ils portent.

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Tableau 14 : Tableau des déplacements chimiques en RMN du Composé 4 dans l’acétone 500 MHz (1H) et 125 MHz (13C)

Position δC (ppm) δH (ppm) Nb H Multiplicité : J (Hz) 1 43,7 1,46 1 t (13,2 ; 12,4 Hz) 2,69 1 dd (13,2 ; 3,9 Hz) 2 65,7 4,27 1 ddd (12,4 ; 10,1; 3,9 Hz) 3 71,8 3,70 1 dd (10,1 ; 2,7 Hz) 4 75,1 3,32 1 m 5 65,8 6 63,6 3,62 1 d (2,1 Hz) 7 30,4 2,03 1 d (15,3 Hz) 2,37 1 dd (15,3 ; 2,6 Hz) 8 75,4 9 52,2 1,59 1 m 10 38,9 11 70,5 4,66 1 dd (11,4 ; 5,2 Hz) 12 212,0 13 63,1 14 84,8 15 34,3 1,26 1 m 1,56 1 16 25,9 1,74 2 m 17 41,7 4,09 1 dd (8,5 ; 7,0 Hz) 18 18,4 1,09 3 s 19 18,5 1,57 3 s 20 174,0 21 117,8 5,98 1 s large 22 173,3 23 73,3 4,89 1 dd (18,6 ; 1,5 Hz) 5,03 1 dd (18,6 ; 1,5 Hz) 1’ 95,8 4,59 1 s 2’ 95,4 3’ 78,8 3,76 1 m 4’ 33,6 1,56 1 m 2,03 1 d (15,2 Hz) 5’ 67,9 3,79 1 m CH2 93,9 5,02 1 s 5,19 1 s CH3 20,9 1,16 3 d (6,2 Hz)

Les carbones sp2 de la lactone apparaissent sur les spectres à 117,8 et 174,0 ppm, et le carbone à 211,8 ppm est caractéristique d’une cétone. L’examen du spectre du proton permet de déterminer les protons caractéristiques : (Annexe I)  de la lactone : les deux doublets dédoublés formant un système ab à 4,89 et 5,03 ppm, correspondent au méthylène en position 23. Le singulet à 5,98 ppm correspond au proton vinylique en position 21, fortement déblindé par le carbonyle voisin.  de la génine : les singulets intégrant pour 3 protons à 1,09 et 1,57 ppm sont caractéristiques des méthyles 18 et 19 d’un squelette stéroïdique.

Les spectres HMBC et COSY permettent ensuite de construire le squelette stéroïdique.

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Cycle D : (Figures 47 et 48) Tout d’abord le proton 17 à 4,09 ppm est placé grâce à ses corrélations en HMBC avec les carbones de la lactone à 117,8 et 174,0 ppm. Le spectre COSY permet de placer les protons voisins du méthylène en 16 puis de celui en 15. Enfin le méthyle en 18 à 1,09 ppm est situé sur le cycle D grâce à ses corrélations en HMBC avec C-17, C-13 et C-14 permettant ainsi de compléter le cycle.

Figure 46 : Structure générale des Figure 47 : Construction cardénolides du cycle D

Figure 48 : Construction du cycle D, Spectres HMBC du composé 4 : a) Corrélations H-17, b) Corrélations H-18; Spectres COSY : c) Corrélations H-17, d) Corrélations H-16

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Cycle C : (Figures 49 et 50) La corrélation HMBC du méthyle en 18 avec la cétone à 211,8 ppm, permet de la placer en 12. Les autres corrélations HMBC avec le carbonyle permettent d’identifier le proton en 11 et un hydroxyle sur ce même carbone 11 (proton non corrélé à un carbone selon le spectre HSQC). L’hydroxyle est également corrélé sur le spectre COSY avec le proton H-11, confirmant ainsi sa position. La seconde corrélation COSY du proton H-11 permet d’identifier le proton H-9. L’hydroxyle en position 8 est placé grâce aux corrélations en HMBC de son proton avec C-14 et C-8.

Figure 49 : Construction du cycle C

Figure 50 : Construction du cycle C, Spectres HMBC du composé 4 : a) Corrélation H- 18, b) Corrélations H-11, d) Corrélations OH-8; Spectre COSY : c) Corrélations H-11

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Cycle B : (Figures 51 et 52) Le méthyle 19 est placé tout d’abord grâce à sa corrélation HMBC avec C-9, puis ses autres corrélations avec C-5 et C-10 complètent le cycle. Une corrélation HMBC de l’hydroxyle en 8 permet de placer C-7. Les corrélations sur le spectre COSY des protons du méthylène en 7 permettent d’identifier le méthine en 6.

a H19/C10 H19/C9 H19/C10 H19/C9 H19/C5 H19/C5

Figure 51 : Construction du cycle B

OH8/C7 OH8/C7

H7a/H6 H7b/H6 H7a/H6

Figure 52 : Construction du cycle B, Spectres HMBC du composé 4 : a) Corrélations H-19, b) Corrélation OH-8; Spectres COSY : c) Corrélations H-7a et b

Cycle A : (Figures 53 et 54) La corrélation des protons du méthyle 19 avec C-1 permet d’identifier ce dernier. Puis les corrélations COSY des protons (H-1) de ce méthylène permettent de placer le proton H-2 et de la même manière le proton H-3 (corrélation COSY avec H-2). L’hydroxyle en C-4 est placé grâce à la corrélation HMBC de son proton avec C-5. Le proton H-4 est identifié grâce à sa corrélation sur le spectre COSY avec l’hydroxyle en C-4 et une autre corrélation COSY avec H-3 confirme la construction du cycle A.

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Figure 53 : Construction du cycle A

Figure 54 : Construction du cycle A, Spectres HMBC du composé 4 : a) Corrélation H- 19, d) Corrélation OH-4 ; Spectres COSY : b) Corrélations H-2, c) Corrélations H-4

Construction de la partie osidique : (Figures 55, 56 et 57) Grace aux informations combinées obtenues par  le spectre COSY montrant les corrélations du méthyle avec H-5’, puis de H-5’ avec le méthylène 4’ et enfin de ce méthylène avec le H-3’,  les valeurs de déplacement chimique des C-1’, C-2’, C-3’ et C-5’ montrant des liaisons avec des hétéroatomes  les corrélations HMBC reliant les groupements une structure osidique a été établie, confirmée par les données bibliographiques (Shimada, Kyuno, Nambara et Uchida, 1985). 58

Cette structure a pu être reliée au cycle stéroïdique grâce à la corrélation HMBC du proton H- 1’ avec C-3. Il reste ensuite un méthylène non attribué avec une valeur de déplacement chimique de 93,9 ppm ce qui est très déblindé et correspond à une valeur d’un carbone lié à des oxygènes. La position est ensuite déterminée grâce à la corrélation des protons de ce méthylène avec C-2’ et

Figure 55 : Construction de la partie osidique Figure 56 : Lien génine et partie osidique

H5’/HCH3-5’ H1'/C3

H5’/H4’ H1'/C2'

C-3’ en HMBC.

HCH2/C3’

HCH2/C2’

H1'/C5' a H5'/HCH3-5' b

H5'/H4' 59

Figure 57 : Construction de la partie osidique, spectre COSY du composé 4 : a) Corrélations H-5' ; Spectres HMBC : b) Corrélations H-1' c) Corrélations du méthylène Enfin il ne reste qu’un oxygène à attribuer selon la formule brute ainsi qu’une insaturation. Cela nous suggère de positionner un groupement époxyde en 5-6. (Figure 58)

Figure 58 : Structure du composé 4

La structure tridimensionnelle du composé 4 a pu être déterminée grâce aux corrélations observées sur le spectre ROESY (figure 59). Sachant que selon la biogenèse des stéroïdes les méthyles 18 et 19 ont toujours la même configuration spatiale, la détermination de la structure tridimensionnelle s’est appuyée sur leurs corrélations ROESY.

Figure 59 : Corrélations ROESY du composé 4

Ce composé a également été obtenu sous forme de cristaux et analysé par diffraction des rayons X ce qui a permis de confirmer la structure du produit. (Figure 60)

Paramètres de maille : Type de maille : Orthorhombique

Distance Angle Groupe d’espace : P 21 21 21 (19) Volume de maille conventionnelle : 2 894,63778 Å3 A = 12,948 Å3 α = 90° B = 13,166 Å3 β = 90° C = 16,980 Å3 γ = 90°

Figure 60 : Représentation spatiale du composé 4 dans les cristaux 60

2 – Autres composés

Composé 1 (AN1-6-7): (Figure 61) + Les valeurs de masse obtenues pour ce composé sont [M+H] =593,2208, calculée pour C29

H37 O13 à 593,2234. Ce qui correspond à un nombre de 12 insaturations. Le spectre IR du composé montre des bandes d’absorption à 1740 et à 3448 cm-1 suggérant la présence d’un carbonyle ,-insaturé et des groupements hydroxyles. Le spectre RMN 1H de ce composé présente beaucoup d’analogies avec celui du composé 4. En effet une des différences notables est l’absence du doublet vers 1,15 ppm intégrant pour 3 protons qui correspond au méthyle en 5’. Ce qui permet d’affirmer l’absence de ce méthyle

Figure 61 : Composé 1 dans le composé 1.

Composé 2 (AN1-9-1): (Figure 62) + Les valeurs de masse obtenues pour ce composé sont [M+H] =547,2552, calculée pour C29 1 H39 O10 à 547,2543. Ce qui correspond à un nombre de 11 insaturations. Le spectre RMN H de ce composé présente beaucoup d’analogies avec celui du composé 4. Diverses variations peuvent cependant être identifiées, notamment la présence d’un singulet à 3,27 ppm intégrant pour 3 protons, correspondant à un méthoxy. Celui-ci est placé à la place du dioxométhylène grâce à sa corrélation HMBC avec C-3’. L’absence du doublet aux alentours de 1,15 ppm permet d’affirmer l’absence du méthyle en 5’. Un singulet supplémentaire à 5,12 ppm intégrant pour un seul proton associé à la présence de deux carbones fortement déblindés (120,6 et 146,4 ppm) sur le spectre RMN 13C indiquent la présence d’une double liaison. Celle-ci est placée en C4-C5 grâce aux corrélations HMBC que le proton H-4 présente sur le spectre HMBC avec C-2, C-6 et C-10. Enfin, la présence d’une méthine supplémentaire corrélant en COSY avec le méthylène H-7 indique que l’hydroxyle en C-8 est ici remplacé par un hydrogène. 61

Figure 62 : Composé 2

Composé 3 (AN1-10-4): (Figure 63) + Les valeurs de masse obtenues pour ce composé sont [M+H] =577,2318, calculée pour C29

H37 O12 à 577,2285. Ce qui correspond à un nombre de 12 insaturations. Le spectre IR du composé montre des bandes d’absorption à 1735 et à 3675 cm-1 suggérant la présence d’un carbonyle ,-insaturé et des groupements hydroxyles. Le spectre RMN 1H de ce composé présente beaucoup d’analogies avec celui du composé 4. Cependant, deux différences sont repérées. Tout d’abord l’absence du doublet vers 1,15 ppm correspondant au méthyle en 5’, et la présence d’un singulet supplémentaire à 5,44 ppm intégrant pour un proton. Ce proton est porté par un carbone fortement déblindé (122,4 ppm) et on peut constater sur le spectre 13C la présence d’un carbone à 146,7 ppm. Ces valeurs montrent la présence d’une double liaison, celle-ci est placée grâce aux corrélations HMBC du proton avec C-3, C-6 et C-10, en C4-C5.

Figure 63 : Composé 3

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Composé 5 (AN1-30-3): (Figure 64) + Les valeurs de masse obtenues pour ce composé sont [M+H] =531,2940, calculée pour C30

H43 O8 à 531,2958. Ce qui correspond à un nombre de 10 insaturations. Le spectre RMN 1H de ce composé est différent de celui du composé 4 par plusieurs points :  la présence d’un singulet à 3,45 ppm intégrant pour 3 protons, correspondant à un méthoxy et placé à la place du dioxométhylène grâce à sa corrélation HMBC avec C- 3’  le singulet à 5,12 ppm avec le déplacement chimique de C-4 et C-5 à 118,9 et 147,1 ppm montrant la présence de la double liaison positionnée grâce aux corrélations HMBC avec C-2, C-6 et C-10  la perte du carbonyle en C-12 démontré par l’absence de signal vers 200 ppm sur le spectre 13C  l’absence des hydroxyles en C-8 et C-11, démontrée par la formule brute et les corrélations COSY des protons H-7 avec H-8 et H-9 avec H-11

Figure 64 : Composé 5

63

5 – Résultats des tests biologiques et études de relations structure- activité 1 – Cytotoxicité

Les molécules isolées de Cassine orientalis ont été testées sur quatre cultures de lignées cellulaires cancéreuses humaines dans le but d’évaluer leur cytotoxicité. Seuls les composés 2 et 5 n’ont pas pu être testés du fait de la trop faible quantité isolée. (tableau 15)

Cellules HCT116 : cellules issues d’un cancer du côlon Cellules A549 : cellules issues d’un cancer du poumon non à petites cellules Cellules K562 : cellules issues d’une leucémie Cellules U87 : cellules issues d’un glioblastome

Tableau 15 : Cytotoxicité des produits purs sur 4 lignées cellulaires (IC50 en M)

Produits HCT116 A549 K562 U87 Composé 1 2,000 1,500 4,000 1,000 Elaeodendroside P 0,070 0,350 0,100 0,100 Elaeodendroside R 0,200 1,500 0,500 0,250 Affinoside S 0,300 0,250 0,450 0,600 Composé 3 0,650 0,200 0,400 0,080 Composé 4 1,000 0,800 1,000 0,600 Affinoside R 0,045 0,040 0,060 0,050 Elaeodendroside B 0,065 0,080 0,150 0,060

Les produits ont tous été testés en triplicats, puis la moyenne des valeurs a été calculée et comparée aux valeurs des témoins négatifs.

Le composé le plus actif s’est révélé être l’affinoside R avec des valeurs d’IC50 autour de 50 nM sur les 4 lignées. L’elaeodendroside B, l’elaeodendroside P, l’affinoside S et le composé 3 ont quant à eux montré des IC50 inférieures au micromolaire. Les autres composés, l’elaeodendroside R, le composé 4 et le composé 1 ont montré une IC50 équivalente ou supérieure au micromolaire. Dans le cadre d’une rapide étude de relation structure-activité on peut observer que les composés avec le méthoxy sont plus actifs que ceux avec le dioxométhylène.

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2 – Cycle cellulaire

Une étude du cycle cellulaire a été réalisée pour 3 des composés les plus actifs, le composé 3, le composé 4 et l’affinoside R.

Le cycle cellulaire est divisé en 4 phases G0/G1-S-G2-M. Durant la phase G0 la cellule est dite quiescente, lors de la phase G1 la cellule produit les éléments nécessaires à la duplication de l’ADN, le nombre de chromosome est alors égal à 2N. La phase S est la phase de réplication de l’ADN, les chromosomes passent alors de une à 2 chromatines et donc la quantité d’ADN passe de 2N à 4N. La phase qui suit est la phase G2, phase durant laquelle la cellule se prépare à la mitose. Enfin le cycle se termine par la phase M, la mitose correspondant à la division de la cellule mère en deux cellules filles (Figure 65).

Figure 65 : Cycle cellulaire

Chaque cellule est marquée et va être analysée individuellement par cytométrie en flux et on pourra ainsi calculer pour un nombre déterminé de cellules, leur répartition dans chacune des phases du cycle cellulaire.

Ces tests ont été effectués sur deux lignées cellulaires cancéreuses, les K562 (résultats figure 66 et tableau 14-a)) et les U87 (résultats figure 67 et tableau 14-b)). 65

Figure 66 : Nombre de cellules K562 engagées dans les différentes phases du cycle cellulaire après action des composés

Figure 67 : Nombre de cellules U87 engagées dans les différentes phases du cycle cellulaire après action des composés

Tableau 16 : Pourcentage de cellules bloquées dans chaque phase; a) Cellules K562 ; b) Cellules U87

AFFINOSIDE R AN1-10-4 AN1-10-5 G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M a) NT 27 57 16 NT 27 57 16 NT 27 58 15 1.10-8 30 53 17 1.10-7 26 58 16 5.10-7 23 61 16 5.10-8 20 64 17 5.10-7 12 59 29 1.10-6 12 61 27 1.10-7 8 58 33 1.10-6 6 66 28 5.10-6 9 72 19 5.10-7 13 77 10 5.10-6 10 77 13

b) AFFINOSIDE R AN1-10-4 AN1-10-5 G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M NT 76 14 10 NT 75 15 10 NT 73 18 9 1.10-8 74 17 9 1.10-7 72 19 9 5.10-7 69 20 11 5.10-8 76 16 8 5.10-7 76 11 13 1.10-6 77 14 9 1.10-7 55 33 12 1.10-6 55 32 13 5.10-6 42 52 6 5.10-7 46 47 7 5.10-6 49 45 6 1.10-5 46 48 6

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Les résultats ont montré une augmentation du nombre de cellules bloquées en phase G2-M aux concentrations avoisinant l’IC50 pour les 3 composés, puis une augmentation du nombre de cellules bloquées en phase S pour les concentrations plus élevées.

3 – Comparaison structurale

Les données de cytotoxicité obtenues expérimentalement permettent de réaliser une étude comparative. Elle consiste à observer l’effet d’une modification structurale sur la valeur de l’IC50, en comparant les molécules deux à deux.

Les premières molécules comparées sont l’affinoside S et l’affinoside R. La seule différence structurale entre ces deux composés est l’orientation du méthoxy en 3’, orienté en α dans l’affinoside R et en β dans l’affinoside S (Figure 68).

Figure 68 : Comparaison Affinoside R et Affinoside S

On observe une différence d’activité d’environ 1 log, sur les quatre lignées cellulaires, entre ces deux molécules (voir valeurs tableau 17). L’affinoside R étant plus actif que l’affinoside S, on peut déduire que l’orientation du méthoxy en α est favorable à l’activité. De la même manière l’affinoside R et l’elaeodendroside P ont été comparés. L’unique différence entre ces deux molécules est la présence ou l’absence du méthyle en 5’ (Figure 69).

Figure 69 : Comparaison Affinoside R et Elaeodendroside P 67

On observe une différence d’activité d’environ un demi log, sur les quatre lignées cellulaires, entre ces deux molécules (voir valeurs tableau 17). L’affinoside R étant plus actif que l’elaeodendroside P, on peut déduire que la présence du méthyle en 5’ est favorable à l’activité.

Enfin, l’elaeodendroside B et l’elaeodendroside R ont été comparés et la seule différence structurale constatée est la présence ou l’absence de la cétone en C-12 (Figure 70).

Figure 70 : Comparaison Elaeodendroside B et Elaeodendroside R

La différence d’activité entre ces deux molécules est également d’un demi log, en faveur de l’elaeodendroside B (voir valeurs tableau 17). On peut donc conclure que la présence de la cétone est délétère à l’activité cytotoxique.

Tableau 17 : IC50 (en µM) des différents composés en fonction des lignées cellulaires

Produits HCT116 A549 K562 U87 Composé 1 2 1,50 4 1 Elaeodendroside P 0,07 0,35 0,10 0,10 Elaeodendroside R 0,20 1,50 0,50 0,25 Affinoside S 0,30 0,25 0,45 0,60 Composé 3 0,65 0,20 0,40 0,08 Composé 4 1 0,80 1 0,60 Affinoside R 0,05 0,04 0,06 0,05 Elaeodendroside B 0,07 0,08 0,15 0,06

68

4 – Acétylation

Pour compléter les études de relations structure-activité, les composés 1, 4 et l’affinoside R ont été soumis à une réaction d’acétylation. L’activité cytotoxique des produits acétylés obtenus a ensuite été déterminée. Les composés 1 et 4 possédant 2 hydroxyles secondaires (plus réactifs que les tertiaires) ont été tous deux totalement di-acétylés. L’affinoside R quant à lui ne possède qu’un seul hydroxyle secondaire, il a été mono-acétylé et la réaction n’a pas été totale (Figure 71).

Figure 71 : Dérivés acétylés

Les acétates ont ensuite été testés sur une lignée cellulaire cancéreuse, HCT116, dans le but d’évaluer leur activité cytotoxique. (Résultats tableau 18)

Tableau 18 : Activité cytotoxique des dérivés acétylés

Composés IC50 (µM) du produit de IC50 (µM) du dérivé départ acétylé Composé 1 2 >10 Composé 4 1 10 Affinoside R 0.045 3.5

L’activité du composé 4, monoacétylé diminue d’un log et celle de l’affinoside R, diacétylé, diminue d’environ 2 log. Les résultats obtenus montrent donc une perte importante de l’activité avec l’acétylation des hydroxyles. Cette perte d’activité augmente avec le nombre d’hydroxyles acétylés.

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III – Discussion sur les résultats

 Choix de la plante et de la partie de plante à étudier: C'est en raison de cas d'intoxications sévères, faisant suite à l’ingestion de fruits de Cassine orientalis, rapportés sur l'île de La Réunion dans les années 2000 (Rivière, 2012) , que nous avons souhaité entreprendre l'étude chimique et biologique des fruits de cette espèce, en portant notre attention sur les hétérosides cardiotoniques. On peut d'ailleurs également mentionner des cas d'intoxications de lémuriens de Madagascar par ingestion des fruits d'une espèce malgache très proche de l'espèce de notre étude (Cao et al, 2007). D’autre part, les résultats de criblages biologiques (tests de cytotoxicité sur macrophage THP-1 et cellules microgliales CHME, et tests anti-inflammatoire, ref M2 Allard) et chimique sur les extraits des feuilles, tiges et fruits de cette espèce, réalisés au LCSNSA, ont mis en évidence la présence d'hétérosides cardiotoniques faiblement cytotoxiques sur les lignées considérées, principalement présents dans les fruits. Les cardénolides présentent de plus un intérêt particulier si l'on considère la très forte activité cytotoxique (du submicromolaire au nanomolaire) sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses de certains dérivés (Cao et al, 2007; Hou et al, 2009). Par exemple, récemment, un dérivé hémisynthétique, l’UNBS 1450, préparé à partir de la 2-oxovoruscharin (isolé de Calotropis procera) par R. Kiss et collaborateurs, a montré une puissante activité anti- tumorale in vivo chez la souris (cancer du poumon non à petites cellules et glioblastome) (Juncker et al, 2009). Des brevets ont été déposés sur ce composé et d'autres dérivés (Wang & O'Doherty, 2012) pour leurs propriétés anti-tumorales (WO2004033465 A1 22 avril 2003, US 20060166952 A1 27 juillet 2006). Le mécanisme d'action de ce dérivé serait lié à l'interaction avec certaines sous-unités de la pompe à sodium (Lefranc et al, 2008). Cette dernière pourrait constituer une nouvelle cible pour la recherche d'anticancéreux (Cragg et al, 2014). L'investigation chimique des fruits a conduit à l'isolement et à la caractérisation de 10 cardénolides dont 5 sont des composés nouveaux.

 Choix des fractions : Les fractions étudiées sont celles contenant les cardénolides majoritaires de la plante (analyse en HPLC analytique et CCM). Cependant de nombreuses fractions contenant des cardénolides restent encore non exploitées et pourraient permettre l’isolement d’autres composés potentiellement responsables des intoxications décrites. En deuxième intention, nous nous sommes intéressés aux fractions présentant les activités cytotoxiques les plus intéressantes (fraction 16 par exemple), y compris celles n'ayant qu'une faible masse. Certains composés, comme les composés 2 et 5, ont été obtenus en trop faible quantité pour être testés sur les 70 lignées cancéreuses. La purification d'autres fractions (comme la fraction 7 pour le composé 2 et la fraction 18 pour le composé 5) pourrait permettre d’en isoler davantage et ainsi de déterminer leur potentialité cytotoxique.

 Choix des méthodes : Deux méthodes de purifications, différentes, ont été mises en œuvre pour l’isolement des composés, - (1) une séparation chromatographique utilisant un support de silice en phase normale (chromatographie flash) pour la fraction 8 et, - (2) une séparation sur phase inverse avec des colonnes greffées en C18 (HPLC préparative) pour les autres fractions. L'emploi des deux méthodes s'est révélé judicieux pour la purification de ces molécules qui présentent une polarité intermédiaire.

 Identification structurale : Une démarche de déréplication a été mise en œuvre tout au long de l’étude : - (1) recherche des formules brutes qui peuvent être déduites de l'ion pseudomoléculaire obtenu après analyse en LC-HRESI-MS puis, - (2) consultation des bases de données de produits naturels comme le Dictionnaire des Produits Naturels, Reaxys ou SciFinder fournissant ainsi des informations sur les composés correspondant déjà décrits, puis - (3) filtration des résultats obtenus par les informations retirées des spectres RMN 1H - (4) confirmation par comparaison des données spectrales 1H et 13C Nous avons ainsi pu identifier rapidement 5 des cardénolides isolés: l’elaeodendroside B, l’affinoside R, l’affinoside S, l’elaeodendroside P et l’elaeodendroside R. Pour les composés nouveaux (composés 1, 2, 3, 4 et 5), l'élucidation structurale a reposé sur une analyse spectroscopique (IR et RMN 1 et 2D) exhaustive.

 Activité des composés :

Les 8 composés testés ont montré une activité cytotoxique avec une IC50 de l’ordre du micromolaire et submicromolaire. L'Affinoside R et l'Elaeodendroside B sont les composés les plus actifs avec des IC50 comprises entre 40 et 150 nM selon les lignées. Les cardénolides sont des hétérosides cardiotoniques et possèdent probablement une activité au niveau des cellules cardiaques par l’intermédiaire des pompes Na+/K+, ce qui peut naturellement limiter leur emploi en chimiothérapie anticancéreuse. Des évaluations plus poussées sur leur éventuelle cardiotoxicité, sur la nature des récepteurs et sous-types de 71 récepteurs impliqués dans la toxicité mais aussi dans l’activité anticancéreuse doivent être réalisées avant de procéder au développement de ce type de composé. L'idée serait de découvrir une molécule sélective des récepteurs ou sous-récepteurs impliqués exclusivement dans le cancer, comme c'est le cas pour l’UNBS 1450. De plus, nous n’avons aucune information sur la biodisponibilité de ces molécules même si les cas d'intoxications rapportés dans la littérature nous donnent quelques indices. Ces données pourront être obtenues par des tests in vivo.

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IV – Conclusion sur les résultats et perspectives

L’étude phytochimique de Cassine orientalis a permis d’isoler 10 cardénolides dont 5 nouveaux. Les tests de cytotoxicité réalisés ont montré que ces composés possèdent une forte activité sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses et sont des molécules prometteuses dans le domaine du cancer. Les différentes valeurs obtenues ont permis une comparaison structurale des composés et une rapide étude de relation structure-activité. Des dérivés acétylés ont été synthétisés dans le but d’obtenir plus d’informations sur les relations structure-activité des composés. Les tests de cytotoxicité de ces produits acétylés ont montré une importante diminution de l’activité, témoignant de l’importance des groupements hydroxylés dans la structure des cardénolides actifs. L'isolement et la caractérisation des composés minoritaires issus de fractions cytotoxiques, en particulier l'obtention des composés 2 et 5 en plus grandes quantités, seraient importants pour permettre la réalisation des tests de cytotoxicité et d'approfondir les relations structure/activité dans cette série. Enfin, une étude biologique plus complète des cardénolides les plus actifs pourrait être envisagée afin de mieux évaluer leur potentialité comme agent anticancéreux.

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Partie IV Matériels et Méthodes

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I – Matériel végétal

L’étude a été réalisée sur un lot de fruits de Cassine orientalis récolté à La Réunion, au Piton St Leu (Figure 72), sur le Chemin Quat’Sous, en Mars 2011, par l’université de La Réunion. La plante a été identifiée par Marc Rivière, pharmacien, association de naturalistes amateurs (APN). La référence de l’herbier est RM175.

Figure 72 : Localisation du Piton St Leu

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II – Extraction (La Réunion)

Les fruits entiers (10 kg) ont été mis à macérer dans différents solvants (CHCl3, AcOEt, MeOH) à température ambiante pendant plusieurs jours sur agitateur orbital avec renouvellement de solvant. L’extrait chloroformique (13 g) a été utilisé pour la suite des travaux, un lavage de cet extrait au cyclohexane a ensuite été réalisé.

III – Fractionnement par MPLC (La Réunion)

L’extrait CHCl3 lavé a ensuite été fractionné par Chromatographie Liquide Moyenne Pression sur un système MPLC de Büchi Sepacore constitué de :  2 pompes C-605 Büchi  Programmateur de pompes C-615 Büchi  Collecteur de fractions C-660 Büchi  Colonne de verre borosilicaté C-690 Büchi 26x460 mm

La phase inverse utilisée est constituée de 140g de silice Kieselgel 100 C-18, de granulométrie 40-63 μm, Fluka.

Un gradient H2O/CH3CN a été utilisé pour l’élution, celui-ci est présenté dans le tableau 19.

Tableau 19 : Gradient d'élution MPLC

Temps (min) % CH3CN 0 10 40 80 45 100 50 10

26 fractions ont été obtenues grâce à cette méthode. Ces fractions ont été transmises à l’ICSN dans le but de poursuivre leur étude (fractions 3 à 26).

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IV – Chromatographie sur Couche Mince

Les CCM ont été réalisées dans le but de mettre en évidence la présence de cardénolides. Les dépôts ont été réalisés sur une plaque de silice et la migration des composés s’est faite par un mélange éluant Dichlorométhane/Méthanol (9 :1). Dans le but de détecter la présence de cardénolides dans les fractions, les plaques ont été révélées à l’aide du réactif de Kedde. Celui-ci est composé d’un mélange fraichement préparé, à volumes égaux, d’une solution éthanolique d’acide 3,5-dinitrobenzoïque à 3% et d’une solution de soude à 2 M. Les cardénolides apparaissent alors sous forme de tâches roses à bleue violettes. Le principe de la réaction colorée est présenté figure 73.

Figure 73 : Schéma réactionnel du réactif de Kedde

Un second réactif a été utilisé, la vanilline sulfurique dans l’optique d’observer la présence d’autres composés non lactoniques dans les fractions.

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V – Isolement et purification

Les différentes fractions ont été analysées par chromatographie liquide haute performance sur un appareil Alliance Waters 2695. La séparation a été effectuée à l’aide d’une colonne Kromasil C18 Thermohypersil 5 μm, 250 x 4,6 mm par un gradient de solvant Acétonitrile 0.1% d’acide formique/Eau 0.1% d’acide formique décrit tableau 20. La détection se fait à l’aide d’un détecteur UV à barrette de diodes (Waters 2696) associé à un DEDL (Polymer Laboratories, PL-ELS 1000).

Tableau 20 : Gradient 80/20 HPLC analytique

Temps H2O 0,1% AF ACN 0,1% AF Débit 0,0 80,0 20,0 0,1 0,5 80,0 20,0 1,0 3,0 80,0 20,0 1,0 25,0 0,0 100,0 1,0 35,0 0,0 100,0 1,0 37,0 80,0 20,0 1,0 50,0 80,0 20,0 1,0

L’isolement des composés a été réalisé par un mélange isocratique de solvant acétonitrile 0.1% AF/ eau 0.1% AF adapté à la polarité des différents composés. La purification de ces composés a été faite sur une chaîne HPLC préparative ou semi-préparative Dionex avec une colonne préparative Thermohypersil Kromasil C18 5 μm, 250 x 21 mm, une colonne semi- préparative Thermohypersil Kromasil C18 5 μm, 250 x 10 mm ou une colonne Nucleodur PFP semi-préparative 5 μm, 250 x 10 mm. La chaine HPLC est reliée à un détecteur UV. La collecte des fractions a été réalisée de façon automatique en fonction de l’absorbance UV détectée.

La fraction 8 a été purifiée par Flash chromatographie sur un appareil CombiFlash® Companion à l’aide d’une colonne de silice de 40 g.

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VI – Identification et élucidation structurale

Les composés purifiés ont ensuite été analysés par UPLC-SM. Les formules brutes des composés ont pu être déduites des masses hautes résolutions obtenues. Ils ont également été étudiés par RMN 500 Hz ou 600 Hz sur des spectromètres Avance Bruker Ultrashield dans le but de déterminer leur structure. Des spectres 1H, 13C, HSQC, HMBC, COSY et ROESY ont

été réalisés pour chaque composé nouveau. Les solvants deutérés utilisés sont le DMSO-d6, l’acétone-d6, le CDCl3 et la pyridine-d6. Les spectres ont été traités et analysés avec le logiciel NMRnotebook, ils sont référencés sur les pics de solvant. Les déplacements chimiques, δ, sont exprimés en ppm et les constantes de couplage, J, en Hertz (Hz). Les signaux sont désignés par s (singulet), d (doublet), t (triplet) et m (multiplet).

Un produit a été obtenu sous forme de cristaux et a donc été analysé au service de cristallographie de l’ICSN. Les expériences sont réalisées à  (Ka Mo) = 0,7107 Å sur un diffractomètre KappaCCD à température ambiante et à partir de monocristaux. Les données ont été retraitées sur le logiciel Avogadro ®.

Les spectres d’absorption dans l’infra-rouge ont été enregistrés sur un spectromètre à transformée de Fourier Perkin-Elmer Spectrum-BX, FT-IR. Les bandes d’absorption sont exprimées en cm-1. Les mesures de pouvoir rotatoire ont été effectuées à l’aide d’un polarimètre MCP 300 Anton Paar à 24°C, la source lumineuse monochromatique est la raie D du sodium (589 nm). Le solvant utilisé est le méthanol pour la plupart des échantillons ou le dichlorométhane.

VII – Etude déréplicative

La déréplication des composés isolés a été réalisée à partir de la formule brute déduite des données obtenues par la LC-MS HR. Cette formule a été entrée dans des bases de données telles que le Dictionnaire des Produits Naturels, Reaxys ou SciFinder. Puis les données RMN 1H des composés fournis par les bases de données ont ensuite été comparées aux données obtenues expérimentalement pour identifier les composés.

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VIII – Tests biologiques

Tests de cytotoxicité : Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur quatre lignées cellulaires cancéreuses : HCT116, A549, K562 et U87. Ces cellules ont été cultivées respectivement dans des milieux McCoy, RPMI 1640, DMEM et RPMI 1640 complémentés à 10% de sérum de veau fœtal. Elles sont cultivées à 37°C dans un incubateur à 95% air – 5% CO2 en atmosphère humide. Les repiquages se font 2 fois par semaine, afin d’entretenir le stock et de préparer les plaques de criblage. Les cellules adhérentes sont isolées par utilisation de trypsine (enzyme permettant de décoller et de dissocier les cellules). Après élimination du milieu de culture et rinçage du tapis cellulaire au PBS (tampon phosphate isotonique pH = 7), 4 mL de trypsine sont déposés sur les cellules. Après quelques minutes d’action 4 mL de milieu sont ajoutés pour inactiver la trypsine. Le nombre de cellules vivantes est ensuite évalué en utilisant le compteur Vi-Cell XR (Beckman Coulter). La suspension cellulaire est ensuite centrifugée et le culot est repris dans du milieu de culture complémenté puis les cellules sont ensemencées sur des plaques 96 puits, à raison de 2500 cellules/puits. Après 24h d’incubation à 37°C les produits purs ont été ajoutés dans les puits en concentration croissante : 1.10-9, 5.10-9, 1.10-8, 5.10-8, 1.10-7, 5.10-7, 1.10-6, 5.10-6 et 1.10-5 M. Après 72h d’incubation à 37°C, 20 µL du réactif CellTiter Blue® sont ajoutés dans chaque puits et la fluorescence produite est mesurée après 1h d’incubation à 37°C (mécanisme figure 74).

Figure 74 : Mécanisme du réactif CellTiter Blue

Les valeurs obtenues sont comparées à celles obtenues avec les cellules non traitées, fournissant ainsi un pourcentage de viabilité cellulaire permettant de déterminer la concentration du produit pour laquelle il reste 50% de cellules vivantes (IC50). 81

Cycle cellulaire : L’étude du cycle cellulaire a été réalisée pour 3 des composés les plus actifs, sur des cultures de cellules K562 et U87. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits (3.105 cellules/puits). Après 24h d’incubation à 37°C, elles ont été traitées par les produits à 4 concentrations différentes. Après 24h d’incubation, elles ont été récoltées, lavées par 1 mL de PBS puis fixées dans de l’éthanol à 70% à 4°C pendant 10 min et enfin, centrifugées. Après un lavage au PBS, les cellules ont été perméabilisées avec du Triton X100 à 1% pendant 30 min. Les cellules perméabilisées ont finalement été incubées pendant 30 min dans 500 L d’une solution contenant de l’iodure de propidium (50 µg/mL) et de la RNAse-DNAse free (1 mg/mL). Les cellules en suspension ont ensuite été analysées par cytométrie de flux. Le cytomètre de flux mesure la fluorescence émise par l’iodure de propidium intercalé de façon stochiométrique dans l’ADN des cellules.

82

IX – Acétylation des composés 1, 4 et Affinoside R

A 10 mg de produit pur sont ajoutés 25 µL d’anhydride acétique, soit quatre équivalents de réactifs par hydroxyle, dans 1 mL de pyridine. Après 8h de réaction, aucun produit final n’est observé, un excès d’anhydride acétique, soit 50 µL, est ajouté au mélange réactionnel ainsi que de la diméthylaminopyridine (DMAP) en quantité catalytique. A la fin de la réaction, les produits sont séchés à sec puis repris dans 3 mL d’acétate d’éthyle. Le mélange réactionnel est lavé par une extraction liquide/liquide avec 2 x 3 mL d’une solution d’acide chlorhydrique 1N. La phase organique est ensuite rincée par 3 mL d’eau et 3 mL de saumure. La phase organique est récupérée et séchée par du sulfate de magnésium (MgSO4). Le mélange est ensuite filtré puis séché. L’avancée de la réaction a été surveillée par des CCM régulières comparant les produits de départ au milieu réactionnel. Un spectre RMN 1H 500 Hz a été réalisé à la fin de la réaction pour identifier les groupements acétylés.

Figure 75 : Mécanisme de la réaction d'acétylation

83

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Conclusion

L’étude phytochimique réalisée sur Cassine orientalis a démontré la présence de nombreux cardénolides dans ses fruits verts, confirmant ainsi les hypothèses émises suite à l’étude préliminaire réalisée au LCSNSA. La structure chimique des composés isolés, avec leur partie osidique doublement liée à la génine, correspond à celles précédemment identifiées dans les plantes de la famille des Celastraceae. On retrouve notamment des molécules déjà décrites lors de l’analyse phytochimique de plantes du genre Cassine, tels que l’elaeodendroside B (Shimada, Kyuno, Nambara et Uchida, 1985), l’elaeodendroside P et l’elaeodendroside R (Shimada, Masuda, Ohtaki, Kobayashi et Nambara, 1990) isolés de Elaeodendron glaucum. Les composés 1 à 4, qui sont des composés nouveaux, étoffent la diversité structurale de cette famille chimique. Les données obtenues dans cette analyse viennent ainsi s’ajouter aux autres résultats témoignant de la synthèse de cardénolides par les plantes de la famille des Celastraceae et plus particulièrement par des espèces appartenant au genre Cassine.

Les tests de cytotoxicité ici réalisés donnent de bons résultats de l’ordre du micromolaire à la dizaine de nanomolaire, témoignant de l’activité biologique des cardénolides sur les lignées cellulaires cancéreuses. Les IC50 obtenues expérimentalement sont du même ordre de grandeur que celle préalablement obtenue pour la digoxine (163 nM) (Cragg, Grothaus et Newman, 2014) voire même plus intéressante pour les composés les plus actifs de l’étude (affinoside R – 5 nM) et ces valeurs montrent une plus grande activité que la digitaline (50 µM sur MCF7, 18 µM sur HT29 et 10 µM sur A549) (Perrone, 2012). Les cardénolides testés restent cependant moins actifs que l’UNBS 1450, composé ayant atteint la phase I des essais cliniques, et présentant une IC50 à 2.7 nM (Juncker et al, 2009). Les résultats obtenus sont néanmoins très encourageants pour poursuivre la recherche de cardénolides cytotoxiques. D’éventuelles pharmacomodulations peuvent notamment être envisagées sur ces molécules en s’appuyant sur l’étude de relation structure-activité réalisée. Enfin, les propriétés anti-inflammatoires des composés n’ont pas été testées ici mais au vu des précédentes études attribuant un potentiel anti-inflammatoire aux cardénolides, ces tests pourraient être envisagés.

85 Les cardénolides sont des molécules avec une bonne activité cytotoxique, les 10 composés isolés de Cassine orientalis ont montré une bonne activité et ont permis de réaliser une brève étude de relation structure-activité. De nombreux autres composés de cette famille restent à découvrir, mais le point essentiel de ce domaine de recherche reste l’élucidation du mécanisme d’action sur les cellules cancéreuses pour cibler l’activité cytotoxique et ainsi éviter la cardiotoxicité.

Connus et utilisés depuis longtemps en thérapeutique, les cardénolides aujourd’hui ne sont plus représentés que par une seule spécialité pharmaceutique d’emploi assez restreint. Cependant, des articles récents ainsi que les travaux de recherche exposés dans cette thèse démontrent d’un regain d’intérêt pour ces molécules, notamment dans le domaine du cancer. Tout en restant vigilant sur le potentiel toxique et les effets indésirables générés par cette classe médicamenteuse, ces résultats préliminaires sont très encourageants pour le renouveau de cette famille de produits naturels.

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ANNEXES

I- RMN 1H (500 MHz, DMSO) du composé 4

II- Fiche produit composé 1

III- Fiche produit composé 2

IV- Fiche produit composé 3

V- Fiche produit composé 4

VI- Fiche produit composé 5

VII- Schéma récapitulatif

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I- Spectre RMN 1H (500 MHz, DMSO) du composé 4

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II- Fiche produit du composé 1 (AN1-6-7)

Aspect : poudre blanche amorphe Formule chimique : C29 H36 O13 M = 592 g.mol-1 Masse isolée : 134,7 mg

IR, ν max (cm-1) : 3448, 1740, 1055, 957 [α]D = +68,3° (c = 0,1 g/100mL, méthanol, T=25°C)

+ SM-ESIHR : m/z [M+H] 593,2208 calculée pour C29 H37 O13 m/z 593,2234

RMN (Acétone) 500 MHz (1H) et 125 MHz (13C)

Position δC (en ppm) δH (en ppm) Nb H Multiplicité : J (Hz) 1 45,3 1,46 1 t (13,3 ; 12,5 Hz) 2,86 1 dd (13,3 ; 4,3 Hz) 2 66,4 4,46 1 ddd (12,5 ; 10,0 ; 4,3 Hz) 3 72,8 3,77 1 dd (10,0 ; 3,2 Hz) 4 77,0 3,50 1 t (3,2 Hz) 5 66,7 6 64,6 3,66 1 d (2,7 Hz) 7 31,5 2,20 1 d (15,4 Hz) 2,58 1 dd (15,4 ; 2,7 Hz) 8 76,9 9 54,1 1,70 1 d (11,9 Hz) 10 40,2 11 71,7 4,85 1 dd (11,9 ; 4,1 Hz) 12 213,4 13 63,8 14 86,6 15 35,1 1,47 1 t (13,1 Hz) 1,78 1 m 16 27,3 1,90 2 m 17 42,6 4,20 1 dd (8,6 ; 7,2 Hz) 18 18,9 1,25 3 s 19 19,2 1,75 3 s 20 174,0 21 119,2 5,95 1 s 22 174,0 23 73,9 4,87 1 dd (18,4 ; 1,5 Hz) 5,05 1 dd (18,4 ; 1,5 Hz) 1’ 97,2 4,58 1 s 2’ 97,3 3’ 79,7 3,77 1 m 4’ 27,2 1,98 2 m 5’ 62,3 3,70 1 td (11,6 ; 3,7 Hz) 3,84 1 ddd (11,6 ; 4,9 ; 3,0 Hz) CH2 95,1 5,05 1 s 5,17 1 s

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III- Fiche produit du composé 2 (AN1-9-1)

Aspect : poudre blanche amorphe Formule chimique : C29 H38 O10 M = 546 g.mol-1 Masse isolée : 0,8 mg

+ SM-ESIHR : m/z [M+H] 547,2552 calculée pour C29 H39 O10 m/z 547,2543

RMN (Acétone) 600 MHz (1H) et 150 MHz (13C)

Position δC (en ppm) δH (en ppm) Nb H Multiplicité : J (Hz) 1 43,8 1,56 1 t (13,5 ; 13,0 Hz) 2,29 1 dd (13,5 ; 3,3 Hz) 2 67,3 4,06 1 ddd (9,5 ; 13,0 ; 3,3 Hz) 3 70,9 4,33 1 m 4 120,6 5,12 1 s 5 146,4 6 32,6 2,11 2 m 7 29,8 1,04 1 m 2,22 1 m 8 40,6 2,13 1 m 9 54,5 1,28 1 m 10 42,7 11 74,4 4,51 1 dd (11,2 ; 3,6 Hz) 12 213,5 13 63,6 14 85,7 15 33,3 1,29 1 m 1,67 1 ddd (13,8 ; 6,7 ; 2,5 Hz) 16 27,4 1,74 2 m 17 41,6 4,12 1 t (8,1 Hz) 18 17,3 1,09 3 s 19 20,8 1,28 3 s 20 174,1 21 118,9 5,88 1 s 22 174,5 23 73,9 4,79 1 dd (17,9 ; 1,6 Hz) 4,87 1 dd (17,9 ; 1,6 Hz) 1’ 97,9 4,34 1 s 2’ 93,3 3’ 83,3 3,17 1 dd (12,0 ; 4,6 Hz) 4’ 27,8 1,62 1 m 1,75 1 m 5’ 62,6 3,41 1 td (12,0 ; 1,8 Hz) 3,86 1 ddd (12,0 ; 4,3 et 1,5 Hz) OMe 57,8 3,27 3 s

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IV- Fiche produit du composé 3 (AN1-10-4)

Aspect : poudre blanche amorphe Formule chimique : C29 H36 O12 M = 576 g.mol-1 Masse isolée : 10,9 mg

IR, ν max (cm-1) : 3675, 2987, 2902, 1394, 1056 [α]D = + 17° (c = 0,1 g/100mL, dichlorométhane, T = 25°C)

+ SM-ESIHR : m/z [M+H] 577,2318 calculée pour C29 H37 O12 m/z 577,2285

RMN (DMSO) 500 MHz (1H) et 125 MHz (13C)

Position δC (en ppm) δH (en ppm) Nb H Multiplicité : J (Hz) 1 44,1 1,55 1 t (13,0 ; 12,5 Hz) 2,46 1 dd (13,0 ; 3,2 Hz) 2 69,3 4,01 1 ddd (12,5 ; 9,1 ; 3,2 Hz) 3 70,0 4,26 1 d (9,1 Hz) 4 122,4 5,44 1 d (1,2 Hz) 5 146,7 6 72,8 4,42 1 s large 7 37,6 1,41 1 m 2,34 1 dd (14,9 ; 2,7 Hz) 8 77,3 9 52,6 1,71 1 d (10,1 Hz) 10 40,5 11 71,7 4,91 1 m 12 212,3 13 62,3 14 85,7 15 34,5 1,42 1 m 1,57 1 m 16 26,7 1,78 2 m 17 42,5 3,94 1 t (7,9 Hz) 18 17,9 1,06 3 s 19 23,6 1,58 3 s 20 173,5 21 117,1 5,97 1 s 22 173,6 23 73,1 4,83 1 dd (18,3 ; 1,3 Hz) 4,95 1 dd (18,3 ; 1,2 Hz) 1’ 96,7 4,59 1 s 2’ 97,0 3’ 78,3 3,80 1 m 4’ 25,9 1,94 2 m 5’ 61,2 3,61 1 td (11,2 ; 3,1 Hz) 3,82 1 m CH2 93,9 5,01 1 s 5,20 1 s

98

V- Fiche produit du composé 4 (AN1-10-5)

Aspect : poudre blanche amorphe et cristaux Formule chimique : C30 H38 O13 M = 606 g.mol-1 Masse isolée : 62,6 mg

IR, ν max (cm-1) : 3445, 2878, 1736, 1368, 1066, 1046 [α]D = + 64,3° (c = 0,1 g/100mL, dichlorométhane, T = 25°C)

+ SM-ESIHR : m/z [M+H] 607,2384 calculée pour C30 H39 O13 m/z 607,2391

RMN (DMSO) 500 MHz (1H) et 125 MHz (13C)

Position δC (en ppm) δH (en ppm) Nb H Multiplicité : J (Hz) 1 43,7 1,46 1 t (13,2 ; 12,4 Hz) 2,69 1 dd (13,2 ; 3,9 Hz) 2 65,7 4,27 1 ddd (12,4 ; 10,1; 3,9 Hz) 3 71,8 3,70 1 dd (10,1 ; 2,7 Hz) 4 75,1 3,32 1 m 5 65,8 6 63,6 3,62 1 d (2,3 Hz) 7 30,4 2,03 1 d (15,3 Hz) 2,37 1 dd (15,3 ; 2,3 Hz) 8 75,4 9 52,2 1,59 1 m 10 38,9 11 70,5 4,66 1 dd (11,4 ; 5,2 Hz) 12 212,0 13 63,1 14 84,8 15 34,3 1,26 1 m 1,56 1 16 25,9 1,74 2 m 17 41,7 4,09 1 dd (8,5 ; 7,0 Hz) 18 18,4 1,09 3 s 19 18,5 1,57 3 s 20 174,0 21 117,8 5,98 1 s large 22 173,3 23 73,3 4,89 1 dd (18,6 ; 1,5 Hz) 5,03 1 dd (18,6 ; 1,5 Hz) 1’ 95,8 4,59 1 s 2’ 95,4 3’ 78,8 3,76 1 m 4’ 33,6 1,56 1 m 2,03 1 d (15,2 Hz) 5’ 67,9 3,79 1 m CH2 93,9 5,02 1 s 5,19 1 s CH3 20,9 1,16 3 d (6,2 Hz)

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VI- Fiche produit du composé 5 (AN1-30-3)

Aspect : poudre blanche amorphe Formule chimique : C30 H42 O8 M = 530 g.mol-1 Masse isolée : 0,5 mg

+ SM-ESIHR : m/z [M+H] 531,2940 calculée pour C30 H43 O8 m/z 531,2958

RMN (Acétone) 600 MHz (1H) et 150 MHz (13C)

Position δC (en ppm) δH (en ppm) Nb H Multiplicité : J (Hz) 1 41,8 1,34 1 t (12,8 Hz) 1,68 1 m 2 67,7 4,12 1 ddd (12,8 ; 9,0 ; 3,4 Hz) 3 71,0 4,44 1 d (9,0 Hz) 4 118,9 5,12 1 s 5 147,1 6 32,3 2,05 1 m 2,17 1 m 7 29,6 1,02 1 m 2,16 1 m 8 42,2 1,68 1 m 9 51,1 1,19 1 m 10 41,3 11 21,9 1,35 1 m 1,46 1 m 12 40,0 1,49 2 m 13 50,3 14 85,1 15 33,3 1,66 1 m 2,08 1 m 16 27,4 1,88 1 m 2,09 1 m 17 51,4 2,87 1 m 18 16,1 0,93 3 s 19 20,4 1,10 3 s 20 176,3 21 117,8 5,88 1 s 22 174,4 23 73,9 4,86 2 dd (18,2 ; 1,7 Hz) 5,01 dd (18,2 ; 1,2 Hz) 1’ 97,2 4,47 1 s 2’ 92,7 3’ 82,7 3,28 1 dd (12,0 ; 4,5 Hz) 4’ 34,8 1,40 1 m 1,91 1 m 5’ 68,6 3,65 1 m OMe 57,8 3,35 3 s CH3 21,5 1,21 3 d (6,0 Hz)

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VII- Schéma récapitulatif

Extraction CHCl3

Lavage cyclohexane MPLC gradient ACN/H2O 15 à 60% ACN en 36 min puis 60 à 100% ACN en 12 min

Kromasil C18 semi-prep Iso 35 % ACN + 0,1%AF pendant 30 min Composé 5 C30 H42 O8

Recristallisation Elaeodendroside B

Kromasil C18 prep 30% ACN + 0,1% AF Kromasil C18 prep 30% ACN + 0,1% AF pendant 35 min

Composé 3 C29 H36 O12

Kromasil C18 prep 30% ACN + 0,1% AF pendant 30 min

Composé 4

C30 H38 O13

Composé 1 Séparation par Flash chromatographie Affinoside S Solvant : DCM/MeOH gradient 100% DCM à 80/20% Kromasil C18 prep 25% ACN + 0,1% AF pendant 35 min Affinoside R

PFP semi-prep Composé 1 22% ACN + 0,1%AF pendant 35 min

Kromasil C18 Semi-prep Iso 30% ACN + 0,1% AF pendant 15 min Composé 1 C29 H36 O13 Composé 2 C H O 29 38 10 Elaeodendroside P Elaeodendroside R

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Vu, le Président du jury,

Signature 

Yves-François POUCHUS

Vu, le Directeur de thèse,

Signature 

Catherine ROULLIER

Vu, le Directeur de l'UFR,

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UNIVERSITÉ DE NANTES Année de la soutenance 2014

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Nom - Prénoms : NOËL Alba

Titre de la thèse : Cardénolides : passé et futur. Isolement et étude de l’activité biologique de cardénolides isolés de fruits d’une plante endémique des Mascareignes : Cassine orientalis ______

Résumé de la thèse : Les cardénolides ou hétérosides cardiotoniques sont des composés naturels constitués d’une génine stéroïdique présentant un cycle lactonique et une partie osidique. Ces composés possèdent d’intéressantes propriétés cardiotoniques utilisées depuis longtemps en thérapeutique (digitaline, ouabaïne) mais peuvent également être toxiques. C’est précisément suite à des cas d’intoxication de jeunes enfants par l’ingestion des fruits d’une plante de la famille des Celastraceae endémique de La Réunion, Cassine orientalis que nous avons entrepris son étude phytochimique. Cette étude a permis l’identification de dix cardénolides dont cinq nouveaux. Ces composés ont montré une forte activité cytotoxique sur quatre lignées cellulaires cancéreuses, avec des IC50 de l’ordre du micromolaire au submicromolaire. Ils pourraient agir au niveau de la pompe Na+/K+, comme cela a été démontré pour un dérivé hémisynthétique, l’UNBS 1450. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans l’utilisation des cardénolides pour lutter contre certains cancers qui surexpriment ces pompes. ______

MOTS CLÉS

Cardénolides – Cassine orientalis – Celastraceae – Hétérosides cardiotoniques - Cytotoxicité

______

JURY : PRÉSIDENT : Pr. Yves-François POUCHUS, Professeur de Botanique et Mycologie Faculté de Pharmacie de Nantes ASSESSEURS : Dr. Catherine ROULLIER, Maître de Conférences de Pharmacognosie Faculté de Pharmacie de Nantes Dr. Marc LITAUDON, Pharmacien – Chercheur au CNRS Institut de Chimie des Substances Naturelles, Gif-sur-Yvette ______

Adresse de l'auteur :

Mlle NOËL Alba 13 rue des rouleaux 44115 Basse-Goulaine

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