Faculté de Pharmacie Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques

Contribution à l'étude des réponses cellulaires secondaires à l'activation de récepteurs purinergiques ionotropes dans les glandes salivaires et les macrophages de souris

Michèle SEIL

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur :

Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie pharmaceutique)

Composition du jury :

Pierre DUEZ (Président) Carine DE VRIESE (Secrétaire) Jean-Michel KAUFFMANN Hassan JIJAKLI

Astrid VANDEN ABBEELE (Faculté de Médecine, Université libre de Bruxelles) Bernard ROBAYE (Faculté des Sciences, Université libre de Bruxelles)

2011

REMERCIEMENTS

Je voudrais tout d’abord remercier mon promoteur, le Professeur Jean-Paul Dehaye pour m’avoir accueillie dans son laboratoire. Sa motivation, sa disponibilité, son expérience, ses connaissances scientifiques et ses nombreux conseils m’ont permis de mener à bien cette thèse.

Je tiens à exprimer ma sincère gratitude au Professeur Stéphanie Pochet pour m’avoir formé aux différentes techniques de laboratoire, pour ses nombreux conseils, sa disponibilité et sa gentillesse.

Je remercie le Dr. Michel Vandenbranden pour avoir réalisé les analyses infrarouge et pour ses conseils scientifiques.

Je voudrais également exprimer mes remerciements au Professeur Nathalie Verbruggen pour m’avoir donnée accès au spectrophotomètre NanoDrop 2000c.

Mes remerciements vont à tous les membres, anciens et actuels, du Département de Biopharmacie dont le Service de Chimie Biologique et Médicale et de Microbiologie Pharmaceutique. Je remercie en particulier Sara, Manuela et Robert pour leur aide lors des manipulations effectuées et pour les moments passés ensemble aux travaux pratiques de Biochimie et de Biologie moléculaire. Merci également aux autres doctorants du service, dont Malika et Carole, pour leur soutien et les bons moments partagés, ainsi qu’à Anar avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir à donner les travaux pratiques de Biochimie médicale.

Un grand merci aux doctorants étrangers, aux étudiants Erasmus et aux stagiaires avec lesquels j’ai eu l’occasion de travailler lors de leur séjour dans notre laboratoire : Unai, Irantzu, Giulia, Asma, Vivien, Christian et Souleymane.

Je remercie sincèrement mes parents, ma grand-mère et ma sœur, Diane, qui ont toujours été présents pour moi et qui m’ont soutenu au cours de ces années de doctorat. Merci également à la famille d’Olivier pour leurs marques de sympathie et leurs encouragements.

Enfin, merci à Olivier, pour sa présence, sa patience et ses encouragements tout au long de ces années de doctorat.

TABLE DES MATIERES

RESUME

LISTE DES ABREVIATIONS

CHAPITRE I : INTRODUCTION I.1. LES RECEPTEURS PURINERGIQUES...... 1 I.1.1. Historique ...... 1 I.1.2. Les nucléotides et les nucléosides...... 3 I.1.2.1. Stockage et libération d’ATP dans l’espace extracellulaire...... 3 I.1.2.2. Métabolisme de l’ATP dans l’espace extracellulaire...... 4 I.1.3. Les récepteurs purinergiques...... 6 I.1.3.1. Les récepteurs P1 ...... 6 I.1.3.2. Les récepteurs P2 ...... 7 I.1.3.2.1. Les récepteurs P2Y ...... 7 Structure ...... 7 Pharmacologie...... 9 Sous-types des récepteurs P2Y ...... 9 I.1.3.2.2. Les récepteurs P2X ...... 11 Structure ...... 12 Pharmacologie...... 13 Sous-types des récepteurs P2X ...... 16 I.1.3.3. Les récepteurs P2X 7 ...... 18 Structure ...... 18 Pharmacologie...... 19 Réponses secondaires à l’activation du récepteur P2X 7...... 21 I.1.4. Le potentiel thérapeutique de la signalisation purinergique...... 23 I.2. LES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE (ROS) ...... 26 I.2.1. Les ROS et leurs effets ...... 26 I.2.2. Les systèmes antioxydants...... 28 I.2.3. Les sources des ROS ...... 30 I.3. LA CYTOKINE INTERLEUKINE-1β (IL-1β) ...... 34 I.3.1. L’IL-1β et ses effets...... 34 I.3.2. La synthèse de la pro-IL-1β...... 36 I.3.3. Le clivage de la pro-IL-1β et la libération d’IL-1β mature...... 39 I.4. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DE LA FAMILLE DES CATHELICIDINES. 42 I.4.1. Les peptides antimicrobiens...... 42 I.4.2. Les cathélicidines...... 43 I.4.2.1. La régulation de l’expression des cathélicidines...... 45 I.4.2.2. La structure des cathélicidines ...... 46 I.4.2.3. Les propriétés antimicrobiennes des cathélicidines...... 47 I.4.2.4. Les effets des cathélicidines sur les cellules eucaryotes...... 49 I.5. LES MACROPHAGES ...... 50 I.5.1. Historique ...... 50

I.5.2. Origine et différenciation...... 50 I.5.3. Morphologie...... 52 I.5.4. Rôles dans l’immunité...... 52 I.5.5. Les récepteurs purinergiques dans les macrophages ...... 53 I.6. LES GLANDES SALIVAIRES ET LA SALIVE ...... 54 I.6.1. Anatomie et histologie des glandes salivaires ...... 54 I.6.2. Physiologie de la sécrétion salivaire ...... 56 I.6.3. Composition et rôles de la salive ...... 59 I.6.4. Les récepteurs purinergiques dans les glandes salivaires...... 62 I.7. OBJECTIFS DU TRAVAIL...... 62

CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES II.1. MATERIEL ...... 65 II.1.1. Les animaux...... 65 II.1.2. Les réactifs et substances ...... 66 II.2. METHODES...... 68 II.2.1. Préparation des milieux...... 68 II.2.2. Prélèvement des macrophages péritonéaux ...... 70 II.2.3. Préparation de la suspension brute de cellules à partir des glandes sous- maxillaires de souris ...... 71 II.2.4. Séparation des cellules ductales et acineuses ...... 71 II.2.5. Prélèvement de la salive...... 72 II.2.6. Dosage des protéines...... 72 II.2.7. Mesure de l’activité de l’amylase...... 73 2+ II.2.8. Mesure de la concentration intracellulaire en ([Ca ]i) ...... 73 II.2.9. Mesure du potassium intracellulaire...... 77 II.2.10. Mesure des espèces réactives de l’oxygène (ROS)...... 79 II.2.11. Mesure de la perméabilité membranaire...... 80 II.2.12. Mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) ...... 81 II.2.13. Test de cytotoxicité (test MTT) ...... 82 II.2.14. Mesure de l’activité de la phospholipase A2 (PLA 2) ...... 84 II.2.15. Dosage de l’interleukine-1β ( IL-1β) par ELISA ...... 85 II.2.15.1. Préparation des échantillons ...... 85 II.2.15.2. Dosage de l’IL-1β...... 86 II.2.16. Mise en évidence de l’expression des récepteurs purinergiques, de l’expression et de la sécrétion de pro-IL-1β et d’IL-1β et de la phosphorylation d’I κB par Western blot...... 87 II.2.16.1. Préparation des échantillons ...... 87 II.2.16.2. Electrophorèse ...... 89 II.2.16.3. Transfert...... 90 II.2.16.4. Incubation en présence des anticorps ...... 90 II.2.16.5. Révélation...... 91 II.2.17. Mise en évidence des transcrits de la pro-IL-1β, du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88 par RT-PCR ...... 91 II.2.17.1. Extraction des ARN totaux...... 91 II.2.17.2. Transcription inverse des ARN en ADN complémentaires (ADNc) ...... 92 II.2.17.3. Polymérisation en chaîne (PCR) des ADNc...... 92 II.2.17.3. Electrophorèse sur gel d’agarose...... 93 II.2.18. Séquençage de l’ADNc du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88...... 94

II.2.19. Détermination de la structure secondaire des peptides antimicrobiens à l’aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée (ATR- FTIR) ...... 94 II.2.20. Analyse statistique des résultats...... 95

CHAPITRE III : EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X DANS LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES

III.1. L’EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X 7...... 96 III.2. L’EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X 4...... 101

CHAPITRE IV : PRODUCTION DE ROS EN REPONSE A L’ATP DANS LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES IV.1. INTRODUCTION ...... 104 IV.2. RESULTATS ...... 105 IV.2.1 Production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages péritonéaux ..... 105 IV.2.2. Production de ROS suite à l’activation de récepteurs purinergiques dans les glandes sous-maxillaires...... 112 IV.2.3. Caractérisation des récepteurs purinergiques impliqués dans la production de ROS dans les glandes sous-maxillaires...... 116 IV.2.4. Mécanismes couplant l’activation des récepteurs P2X 7 à la production de ROS dans les glandes sous-maxillaires...... 119 IV.2.5. Identification de la source de ROS produits suite à l’activation des récepteurs P2X 7 dans les glandes sous-maxillaires ...... 123 IV.3. DISCUSSION ...... 126

CHAPITRE V : ETUDE DE L’EXPRESSION ET DE LA SECRETION D’IL-1βββ PAR LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES V.1. INTRODUCTION...... 131 V.2. RESULTATS ...... 132 V.2.1. Concentration salivaire d’IL-1β...... 132 V.2.2. Expression d’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires ...... 135 V.2.3. Etude de la phosphorylation d’I κB...... 139 V.2.4. Expression du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88...... 140 V.2.5. Régulation de la sécrétion d’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous- maxillaires...... 141 V.3. DISCUSSION ...... 146

CHAPITRE VI : REGULATION DES REPONSES DES MACROPHAGES PERITONEAUX A L’ATP PAR LE PEPTIDE ANTIMICROBIEN CRAMP VI.1. INTRODUCTION ...... 151 VI.2. RESULTATS ...... 152 2+ VI.2.1. Effet du CRAMP sur la variation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP...... 152 VI.2.2. Interaction entre le CRAMP et le canal cationique activé par l’ATP...... 155 VI.2.3. Effet des agonistes des récepteurs des peptides formylés (FPR) sur 2+ l’augmentation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP...... 160

VI.2.4. Effet du CRAMP sur la formation d’un pore en réponse à l’ATP...... 162 VI.2.5. Effet du CRAMP sur la libération d’acide oléique en réponse à l’ATP ...... 165 VI.2.6. Effet du CRAMP sur la production de ROS en réponse à l’ATP ...... 166 VI.2.7. Effet du CRAMP sur la libération d’IL-1β en réponse à l’ATP...... 168 VI.2.8. Etude de la structure secondaire du CRAMP...... 169 VI.3. DISCUSSION ...... 172

CHAPITRE VII : CONCLUSION ET PERSPECTIVES...... 177

BIBLIOGRAPHIE ...... 180

ANNEXES...... 217

Résumé

RESUME

Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à étudier certaines réponses cellulaires secondaires à l’activation des récepteurs purinergiques P2X dans deux modèles différents, les macrophages péritonéaux et les cellules des glandes sous-maxillaires. Ces cellules contribuent à notre immunité innée, soit tournée vers l’intérieur (macrophages), soit vers l’extérieur (glandes sous-maxillaires).

Nous avons dans un premier temps confirmé par Western blot et par des dosages de la 2+ concentration intracellulaire de calcium ([Ca ]i) que les deux types de cellules étudiés expriment des récepteurs P2X 4 et P2X 7 fonctionnels.

Nous nous sommes alors concentrés sur deux réponses impliquées dans la protection de l’hôte contre les agressions et l’élimination de pathogènes : la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1β (IL-1β). Nos résultats montrent que la production de ROS en réponse à l’ATP extracellulaire est secondaire à l’activation d’une NADPH oxydase dans les deux types de cellules. Cette réponse est médiée par les récepteurs P2X 7 ainsi que, dans les macrophages, par d’autres récepteurs purinergiques comme par exemple les récepteurs P2X 4 et des récepteurs P2Y. Dans les glandes exocrines, contrairement aux macrophages, la protéine kinase C ainsi que ERK1/2 interviennent dans l’activation de la NADPH oxydase.

Par la suite nous avons comparé la régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL- 1β par les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Nous avons observé que l’IL-1β est présente dans la salive collectée chez des souris injectées par de la pilocarpine. Des analyses par ELISA, RT-PCR et Western blot montrent que la cytokine est exprimée de manière constitutive par les cellules acineuses et ductales des glandes sous-maxillaires, à un niveau plus élevé que dans les macrophages. Contrairement aux cellules phagocytaires, l’expression de la cytokine dans les cellules des glandes salivaires n’est pas augmentée suite à la stimulation par des lipopolysaccharides. De même, dans ces cellules l’ATP n’a pas provoqué + la sécrétion d’IL-1β malgré l’efflux de K secondaire à l’activation des récepteurs P2X 7.

Résumé

Dans une dernière série d’expériences nous avons évalué les effets du peptide antimicrobien CRAMP sur les macrophages murins. Le CRAMP a inhibé toutes les réponses secondaires à l’activation des récepteurs P2X 7 (ouverture du canal cationique, formation de pore, production de ROS, libération d’IL-1β, d’acide oléique et de lactate déshydrogénase). 2+ L’inhibition par le CRAMP de l’augmentation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP n’était pas médiée par les récepteurs aux peptides formylés car les agonistes de ces récepteurs n’ont pas 2+ bloqué cette augmentation. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’augmentation de la [Ca ]i secondaire à l’activation des récepteurs P2X 4 par une combinaison d’ATP et d’ivermectine.

Nos expériences ont révélé que les récepteurs P2X 7 sont couplés à diverses voies de signalisation dans les macrophages et dans les glandes exocrines. Les voies activées diffèrent en fonction du type de cellules. Nous avons également conclu que les peptides antimicrobiens de la famille de cathélicidines ne sont pas des agonistes universels des récepteurs P2X 7.

Abréviations

LISTE DES ABREVIATIONS

2+ [Ca ]i : concentration intracellulaire de calcium + [K ]i : concentration intracellulaire de potassium α,β -meATP : α,β -méthylène adénosine 5’-triphosphate β,γ -meATP : β,γ -méthylène adénosine 5’-triphosphate 2MeSADP : 2-(méthylthio)adénosine 5’-diphosphate 2MeSATP : 2-(méthylthio)adénosine 5’-triphosphate ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire ADP : adénosine 5’-diphosphate AEBSF : 4-(2-aminoéthyl) benzènesulfonyle fluorure AMP : adénosine 5’-monophosphate AMPA : acide (2-amino-3-(5-méthyl-3-oxo-1,2- oxazol-4-yl) propionique AMPc : adénosine 5’-monophosphate cyclique ARN : acide ribonucléique ARNm : acide ribonucléique messager ATP : adénosine 5’-triphosphate ATP γS : adénosine 5’-(γ-thio) triphosphate BAPTA : acide 1,2-bis(2-aminophénoxy)-éthane-N,N,N’,N’-tétraacétique BCA : acide bicinchoninique BEL : bromoénol lactone BIM : bisindolylmaléimide BSA : albumine de sérum bovin BzATP : 2’,3’-O-(4-benzoylbenzoyl)adénosine 5’-triphosphate Carbachol : carbamylcholine CD : cluster of differentiation CFTR : régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) CRAMP : cathelin-related antimicrobial peptide CTP : 5 ′-triphosphate Da : Dalton

Abréviations

DAG : diacylglycérol DAMP : motifs structuraux associés aux signaux de danger ou de dommage ( damage/danger associated molecular pattern) DCF : dichlorofluorescéine DCFH : dichlorodihydrofluorescéine DCFH/DA : dichlorodihydrofluorescéine diacétate DMSO : diméthylsulfoxyde dNTP : désoxyribonucléotides triphosphates DPI : diphénylène iodonium

EC 50 : concentration efficace à 50 % EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique EGF : facteur de croissance épidermique EGTA : acide éthylène glycol-bis( β-aminoéthyléther)-N,N,N ′,N ′-tétraacétique ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ENaC : canal épithélial du E-NTPDases : ectonucléosides triphosphates diphosphohydrolases E-NPPs : ectonucléotides pyrophosphatases/phosphodiestérases Eq : équation ERK1/2 : kinase régulée par les signaux extracellulaires ( extracellular signal- regulated kinase )

FADH 2/FAD : flavine adénine dinucléotide réduit/oxydé FBS : sérum fœtal bovin FCCP : carbonyl cyanide p -(trifluorométhoxy) phénylhydrazone fMLF : N-formyl-méthionyl-leucyl-phénylalanine FPR : récepteurs aux peptides formylés fura-2 : acide 1-[2-(5-carboxylazol-2-yl)-6-aminobenzo-furan-5-oxy]-2- (2’amino-5’-méthylphénoxy)-éthane-N,N,N’,N’-tétraacétique fura-2/AM : ester acétoxyméthyl du fura-2

GABA : acide γ-aminobutyrique G-CSF : facteur stimulant les granulocytes (granulocyte colony stimulating factor) GM-CSF : facteur stimulant les granulocytes et les macrophages (granulocyte macrophage colony stimulating factor) GTP : 5’-triphosphate

Abréviations hCAP18 : human cationic antimicrobial peptide HBSS : Hank’s balanced salt solution HEPES : acide N-[2-hydroxyéthyl] pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique] HRP : peroxydase de raifort IDP : 5’-diphosphate Ig : immunoglobuline IκB : protéine inhibitrice de NF-κB IKK : kinase d’IκB IL : interleukine IL-1R1 : récepteur 1 de l’interleukine-1 IL-1Ra : antagoniste du récepteur 1 de l’interleukine-1 IL-1R-AcP : protéine accessoire du récepteur 1 de l’interleukine-1

IP 3 : 1,4,5 trisphosphate ITP : inosine 5’-triphosphate

Kd : constante de dissociation KN-62 : 1-[N,O-bis-(5-isoquinolinesulfonyl)-N-méthyl-L-tyrosyl]-4- phénylpipérazine LBP : protéine liant les lipopolysaccharides LDH : lactate déshydrogénase L-NAME : N-nitro-L-arginine méthyl ester LPS : lipopolysaccharides LRR : motifs répétitifs riches en leucine (leucine-rich repeat) LY294002 : 2-(4-morpholinyl)-8-phényl-4H-1-benzopyran-4-one MAPK : protéine kinase activée par un mitogène ( mitogen-activated protein kinase) M-CSF : facteur stimulant les macrophages ( macrophage colony stimulating factor) MEK : MAPK/ERK kinase MES : acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique MOPS : acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique MyD88 : myeloid differentiation primary response gene MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium NADPH/NADP + : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit/oxydé

Abréviations

NF-κB : facteur nucléaire κB NGF : facteur de croissance des nerfs NMDA : acide N-méthyl-D-aspartique NMDG : N-méthyl-D-glucosamine oATP : ATP oxydé (adénosine 5’-triphosphate 2’,3’-dialdéhyde) PAMP : motifs structuraux associés aux pathogènes ( pathogen-associated molecular pattern) pb : paires de bases PBFI : potassium -binding benzofuran isophtalate PBFI/AM : ester acétoxyméthyl du PBFI PBS : phosphate-buffered saline PD98059 : 2’-amino-3’-méthoxyflavone PI3K : phosphatidylinositol 3 kinase PI4K : phosphatidylinositol 4 kinase PK : protéine kinase

PLA 2 : phospholipase A 2 cPLA 2 : phospholipase A 2 cytosolique dépendante du calcium iPLA 2 : phospholipase A 2 indépendante du calcium PLC : phospholipase C PLD : phospholipase D PMA : phorbol myristate acétate (12-o-tétradécanoylphorbol-13-acétate) PNP : nucléoside phosphorylase PPADS : acide pyridoxalphosphate-6-azophényl-2’-4’-disulfonique PPI-PLC : phospholipase C spécifique des polyphosphoinositides PVDF : polyfluorure de vinylidène RMN : résonance magnétique nucléaire ROS : espèces réactives de l’oxygène RT-PCR : polymérisation en chaîne après transcription inverse RXR : récepteur aux rétinoïdes SDS : sodium dodécylsulfate SEM : écart étalon de la moyenne (standard error of the mean) SOD : superoxyde dismutase

Souris P2X 7-WT : souris de type sauvage

Souris P2X 7-KO : souris knockout, invalidées pour le gène codant pour le récepteur P2X 7

Abréviations

Spectroscopie ATR- : spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, à réflexion totale FTIR atténuée TBE : tampon TRIS-borate-EDTA TEEI : tampon TRIS-EDTA-EGTA-inhibiteurs protéases TIR : Toll-IL-1 domain TLR : Toll like receptor TNFR1 : récepteur 1 du facteur de nécrose tumorale TRIS : tris(hydroxyméthyl)-aminométhane u.a.f. : unités arbitraires de fluorescence U73122 : 1-[6-[((17 β)-3-méthoxyestra-1,3,5[10]-trien-17-yl)amino]hexyl]-1H- pyrrole-2,5-dione U73343 : 1-[6-[((17 β)-3-méthoxyestra-1,3,5[10]-trien-17-yl)amino]hexyl]-2,5- pyrrolidinedione UDP : 5’-diphosphate UDP βS : uridine 5’-(β-thio) diphosphate UTP : uridine 5’-triphosphate UTP γS : uridine 5’-(γ-thio) triphosphate VDR : récepteur de la vitamine D VDRE : élément de réponse à la vitamine D VIP : peptide intestinal vasoactif VNUT : transporteur vésiculaire des nucléotides (vesicular transporter )

Introduction

CHAPITRE I

INTRODUCTION

I.1. LES RECEPTEURS PURINERGIQUES

Pendant de longues années l’adénosine 5’-triphosphate (ATP) a été considéré uniquement comme réserve d’énergie des cellules, l’hydrolyse du lien anhydride entre les trois phosphates libérant de l’énergie utilisée pour le métabolisme cellulaire. C’est donc au niveau intracellulaire que sa concentration est la plus élevée, tandis que sa concentration extracellulaire est beaucoup plus faible (Bours et al., 2006). Aujourd’hui, les nucléotides et les nucléosides sont aussi considérés comme molécules de la signalisation extracellulaire (Burnstock, 2006 a). En effet, l’ATP et ses dérivés sont libérés localement par des cellules, ils activent des récepteurs purinergiques situés au niveau de la membrane de diverses cellules et ils sont hydrolysés par de multiples ectoenzymes, ce qui régule leur concentration extracellulaire.

I.1.1. Historique

En 1929, un premier article décrivant les activités physiologiques des a été publié par Drury et Szent-Györgyi. Ces travaux montraient que les dérivés de l’adénine avaient des effets sur le cœur et les vaisseaux sanguins (Drury et Szent-Györgyi, 1929). D’autres études menées quelques années plus tard ont confirmé les actions des nucléosides et nucléotides au niveau des vaisseaux. Un premier indice suggérant que l’ATP pourrait éventuellement être un neurotransmetteur est apparu en 1959, quand Holton montra que pendant des stimulations antidromiques il y a une libération d’ATP par des branches collatérales des fibres sensitives afférentes, en quantité suffisante pour entraîner une vasodilatation des artères de l’oreille de lapin. Le concept de neurotransmission purinergique a été proposé pour la première fois en 1972 par Burnstock. Selon lui, l’ATP était le neurotransmetteur responsable de la transmission non-cholinergique, non-adrénergique au

1 Introduction niveau de la musculature lisse du tractus gastro-intestinal et de la vessie. Ce nouveau concept a, au début, suscité une forte opposition, beaucoup considérant l’ATP uniquement comme source d’énergie. En 1976, Burnstock a évoqué la possibilité de la co-transmission, le fait donc que certaines terminaisons nerveuses stockent et libèrent plusieurs neurotransmetteurs. C’est également lui qui, en 1978, a proposé de classer les récepteurs purinergiques en deux groupes, les récepteurs purinergiques P1, sélectifs de l’adénosine et inhibés par de faibles concentrations de méthylxanthines, et les récepteurs purinergiques P2 qui reconnaissent principalement l’ATP et l’ADP. A peu près au même moment deux sous-types des récepteurs

P1 ont été découverts, appelés A1 et A2 (Van Calker et al., 1979). En 1985, une première sous-division des récepteurs P2 en P2X et P2Y a été proposée par Burnstock et Kennedy. Cette classification était basée sur le profil pharmacologique et la distribution tissulaire des récepteurs, les récepteurs P2X ayant comme agonistes les plus puissants l’ α,β -meATP et le β,γ -meATP, et les récepteurs P2Y activés surtout par la 2MeSATP. D’autres sous-types de récepteurs P2 ont été découverts au cours des années suivantes, parmi lesquels les récepteurs P2T, sélectifs de l’ADP et impliqués dans l’agrégation plaquettaire, les récepteurs P2Z, activés par l’ATP 4- (Gordon, 1986), les récepteurs P2U ayant comme agoniste l’ATP et l’UTP de manière équivalente (O’Connor et al., 1991), et les récepteurs P2D, proposés être responsables des effets biologiques des polyphosphates de diadénosine (Pintor et al., 1993). La nomenclature des récepteurs P2 a été révisée suite à la mise en évidence de deux mécanismes de transduction différents, à savoir des canaux ioniques intrinsèques et le couplage à des protéines G (Benham et Tsien, 1987 ; Dubyak, 1991), ainsi que suite au clonage des deux premiers récepteurs P2, le P2Y 1 (Webb et al., 1993) et le P2Y 2 (Lustig et al., 1993). En 1994, Abbracchio et Burnstock ont ainsi proposé une nomenclature adoptée par la plupart des scientifiques, basée sur la structure et les mécanismes de transduction, à savoir une classification des récepteurs purinergiques P2 en deux familles majeures, les récepteurs P2X, ionotropes, et les récepteurs P2Y, métabotropes.

2 Introduction

I.1.2. Les nucléotides et les nucléosides

I.1.2.1. Stockage et libération d’ATP dans l’espace extracellulaire

La concentration intracellulaire d’ATP est proche de 1 à 5 mM. Cet ATP cytosolique constitue la source de nucléotide extracellulaire (Miller et Horowitz, 1986). La concentration extracellulaire d’ATP est beaucoup plus faible, avec des concentrations plasmatiques physiologiques de l’ordre du micro- ou nanomolaire (Bours et al., 2006). Des concentrations plus élevées d’ATP sont stockées dans les vésicules sécrétoires des neurones et sont co- libérées avec des neurotransmetteurs comme l’acétylcholine, la noradrénaline ou le peptide intestinal vasoactif (VIP) (Burnstock, 2009). Il a été montré que le transporteur vésiculaire des nucléotides (vesicular nucleotide transporter , VNUT) dépend du chlorure et appartient à la famille SLC17 des transporteurs anioniques. Ce transporteur intervient dans l’accumulation d’ATP dans les vésicules (Sawada et al., 2008). L’ATP et probablement d’autres nucléotides sont également stockés à des concentrations élevées dans les granules denses des plaquettes, dans les granules chromaffines des médullo-surrénales (Abbracchio et al., 2006) et dans les granules contenant de l’insuline des cellules β pancréatiques (Novak, 2003 ; Obermuller et al., 2005). La stimulation de ces cellules par des impulsions nerveuses ou par des agonistes provoque l’exocytose de l’ATP de ces vésicules. Les cellules non-excitables, comme les cellules épithéliales ou endothéliales, les fibroblastes, les astrocytes et les hépatocytes peuvent également libérer des nucléotides (Lazarowski et al., 2003). Différents stimuli sont susceptibles de provoquer cette libération, parmi lesquels des contraintes de cisaillement (shear stress ), l’hypoxie, le gonflement osmotique (Burnstock, 2007 a), ainsi que la stimulation par des agonistes cholinergiques (Sorensen et Novak, 2001 ; Novak et al., 2010). La libération spontanée ou constitutive de nucléotides a été suggérée pour beaucoup de cellules, comme les cellules épithéliales bronchiques, les cellules de gliome de rat C6, les cellules d’astrocytome humain 1321N1 (Lazarowski et al., 2000 ; Lazarowski et al., 2003), les cellules de la lignée de macrophages BAC1.2F5 (Beigi et Dubyak, 2000) et les cellules d’hépatome de rat (Roman et al., 1999). Finalement la lyse cellulaire peut également entraîner la libération des nucléotides intracellulaires.

3 Introduction

Des mécanismes de transport spécifiques sont nécessaires pour la libération de l’ATP car le nucléotide ne diffuse pas à travers la membrane plasmique à cause de ses charges nettes négatives (voir Praetorius et Leipziger, 2009, pour revue). Certains de ces mécanismes restent controversés, comme le mécanisme de conductance d’anions activé par le gonflement cellulaire ( cell-swelling activated anion conductance ) ou l’implication du régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose ( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator , CFTR). L’hémicanal de connexine a également été proposé comme mécanisme de transport de l’ATP (Cotrina et al., 1998 ; Kang et al., 2008 ; Li et al., 2010), et certaines études ont montré que les pannexines seraient des pores pour la libération d’ATP (Bao et al., 2004 ; Ransford et al., 2009 ; Li et al., 2010). La libération vésiculaire de l’ATP pourrait également être un phénomène ubiquitaire de la plupart des cellules (Maroto et al., 2001).

I.1.2.2. Métabolisme de l’ATP dans l’espace extracellulaire

La concentration d’ATP mesurée au niveau des surfaces épithéliales ou dans des sécrétions dépend de l’activité d’enzymes qui métabolisent les nucléotides et les nucléosides. En effet, après la libération d’ATP dans l’espace extracellulaire, sa demi-vie est très courte suite à sa dégradation rapide en ADP, AMP et adénosine. Les ecto-enzymes sont localisées à la surface des cellules ou peuvent être retrouvées sous forme soluble dans le milieu interstitiel ou dans les liquides corporels. Ces enzymes incluent les ectonucléosides triphosphates diphosphohydrolases (E-NTPDases), les ectonucléotides pyrophosphatases/ phosphodiestérases (E-NPPs), l’ecto-5’-nucléotidase et les phosphatases alcalines (Yegutkin, 2008). Les E-NTPDases hydrolysent les nucléosides triphosphates et diphosphates mais pas les monophosphates. Huit gènes différents codent pour les membres de cette famille, le prototype étant la protéine CD39. La famille des E-NPPs comprend sept membres qui hydrolysent les liens phosphodiester et pyrophosphate. Ces enzymes possèdent un large spectre de substrats (Stefan et al., 2005), et seuls les trois premiers membres de cette famille peuvent hydrolyser les nucléotides (Goding et al., 2003). Les 5’-nucléotidases hydrolysent l’AMP en adénosine. Un seul des sept membres de la famille des 5’-nucléotidases, le CD73, est associé aux surfaces. Les phosphatases alcalines déphosphorylent divers substrats, y compris les nucléotides. L’ATP extracellulaire est ainsi dégradé en ADP, AMP et finalement en adénosine. Celle-ci active des récepteurs purinergiques P1. Le nucléoside peut également

4 Introduction

être recapturé par les cellules grâce à des transporteurs spécifiques des nucléosides, ou il peut être inactivé via l’inosine en suite à l’action séquentielle de l’adénosine désaminase et de la purine nucléoside phosphorylase (PNP) (Fig. 1.1) (Yegutkin, 2008).

A part ces enzymes intervenant dans la dégradation des nucléotides d’autres enzymes ont été décrites, qui catalysent la synthèse de différents nucléotides. L’ATP peut ainsi être synthétisé via des réactions de transfert de groupement phosphate, par l’adénylate kinase et la nucléoside diphosphate kinase. Ces enzymes, d’abord décrits comme enzymes intracellulaires peuvent aussi être exprimés à la surface de différents types cellulaires (Yegutkin, 2008).

Figure 1.1 : Mécanismes d’inactivation des purines au niveau de la surface cellulaire. Les nucléotides sont hydrolysés par plusieurs ectoenzymes (E-NPPs, E-NTPDases, ecto-5’- nucléotidases). L’adénosine résultant est à son tour désaminée en inosine (Ino) puis libère de l’hypoxanthine (Hyp) par action séquentielle de l’adénosine désaminase et de la PNP (Yegutkin, 2008).

5 Introduction

I.1.3. Les récepteurs purinergiques

I.1.3.1. Les récepteurs P1

Les récepteurs P1 sont activés principalement par l’adénosine. Jusqu’à ce jour quatre sous-types ont été clonés, les récepteurs A 1, A 2A , A 2B et A 3. Ces récepteurs font partie de la famille des récepteurs métabotropes et ils sont distribués de façon hétérogène dans différents tissus. Comme tous les récepteurs couplés à des protéines G, ils possèdent sept segments transmembranaires, formés chacun d’une hélice α d’approximativement 21 à 28 acides aminés hydrophobes (Fig. 1.2). L’extrémité N-terminale de la protéine se trouve du côté extracellulaire, tandis que l’extrémité C-terminale se trouve du côté cytoplasmique (Ralevic et Burnstock, 1998).

Figure 1.2 : Structure schématique du récepteur A 1. Le récepteur A 1 possède sept domaines transmembranaires (I-VII) d’acides aminés hydrophobes, connectés entre eux par trois boucles extracellulaires et trois boucles intracellulaires. La localisation des résidus histidine (H) dans les régions transmembranaires VI et VII, qui joueraient un rôle dans la fixation de ligand, est indiquée. S-S indique la présence possible de ponts disulfures (Fields et Burnstock, 2006).

6 Introduction

Les récepteurs A 1 sont couplés à différentes protéines G. Une stimulation de ces récepteurs par des agonistes a pour effet une inhibition de l’adénylate cyclase, entraînant une diminution de la concentration intracellulaire du second messager AMPc. Leur stimulation peut également activer la phospholipase C (PLC), menant à la production d’inositol 1,4,5- trisphosphate (IP 3) et de diacylglycérol (DAG), et elle permet l’activation de différents types de canaux potassiques. Les récepteurs A 2 sont divisés en deux sous-types, les récepteurs A 2A et A2B , qui activent l’adénylate cyclase via une protéine G s essentiellement. Le récepteur A 2B humain peut également être couplé à une protéine G q/11 . L’activation des récepteurs A 3 2+ entraîne une inhibition de l’adénylate cyclase et une augmentation des taux d’IP 3 et de Ca intracellulaires (Ralevic et Burnstock, 1998).

I.1.3.2. Les récepteurs P2

Les récepteurs P2 sont les récepteurs sensibles à l’ATP. En 1994, Abbracchio et Burnstock ont proposé de classer les récepteurs P2 en deux grandes familles, les récepteurs ionotropes P2X, formant un canal cationique non spécifique, et les récepteurs métabotropes P2Y, couplés aux protéines G. A ce jour, sept sous-types de récepteurs P2X et huit sous-types de récepteurs P2Y ont été clonés et caractérisés chez les mammifères (Ralevic et Burnstock, 1998).

I.1.3.2.1. Les récepteurs P2Y

Après le clonage en 1993 des récepteurs P2Y 1 et P2Y 2, d’autres sous-types de récepteurs P2Y ont été clonés : P2Y 4, P2Y 6, P2Y 11, P2Y 12, P2Y 13 et P2Y 14 . Les nombres manquants représentent des récepteurs clonés chez des espèces autres que les mammifères ou des récepteurs possédant une séquence proche de celle des récepteurs P2Y mais pour lesquels aucune réponse fonctionnelle aux nucléotides n’est connue (Abbracchio et al., 2006).

Structure Contrairement aux récepteurs P2X, les gènes codant pour les récepteurs P2Y ne contiennent pas d’introns dans leur séquence codante, à l’exception du récepteur P2Y 11 (Burnstock, 2007 b). Les récepteurs P2Y sont des protéines constituées de 328 à 377 acides aminés. Ils présentent la structure typique des récepteurs couplés aux protéines G, comprenant

7 Introduction une extrémité N-terminale extracellulaire, qui contient des sites potentiels de N-glycosylation, une extrémité C-terminale intracellulaire, qui contient des sites consensus de phosphorylation par des protéines kinases, et sept segments transmembranaires (Fig. 1.3).

D’un point de vue structural deux sous-groupes de récepteurs P2Y peuvent être identifiés. Le premier sous-groupe comprend les récepteurs P2Y 1, P2Y 2, P2Y 4, P2Y 6, et P2Y 11 , et le deuxième sous-groupe comprend les récepteurs P2Y 12 , P2Y 13 et P2Y 14 possédant des séquences assez proches (Abbracchio et al., 2003).

Figure 1.3 : Structure schématique du récepteur P2Y. Le récepteur P2Y possède sept domaines transmembranaires (I-VII) d’acides aminés hydrophobes, connectés entre eux par trois boucles extracellulaires (e2-e4) et trois boucles intracellulaires (i1-i3). L’extrémité N-terminale est extracellulaire (e1) tandis que l’extrémité C-terminale se situe au niveau intracellulaire (i4). S-S indique la présence possible de ponts disulfures. Les cercles verts représentent des acides aminés qui sont conservés entre les récepteurs P2Y1, P2Y 2 et P2Y 6, les cercles jaunes indiquent les résidus non conservés, et les cercles rouges représentent des résidus importants pour la fonction d’autres récepteurs couplés aux protéines G (Fields et Burnstock, 2006).

8 Introduction

Pharmacologie Les récepteurs P2Y sont couplés aux différentes protéines G. Un récepteur P2Y particulier peut être couplé à différentes protéines G et activer différentes voies de signalisation intracellulaire. En fonction du ligand, l’une ou l’autre de ces voies de signalisation peut être activée. Les récepteurs P2Y1, P2Y 2, P2Y 4 et P2Y 6 sont couplés à l’activation d’une PLC via G q/11 . Leur activation entraîne la formation d’IP 3 et la mobilisation du calcium intracellulaire. Le récepteur P2Y 4 est également couplé à G i/0 . L’activation du récepteur P2Y 11 par l’ATP conduit à une augmentation d’AMPc et d’IP3, alors que l’activation par l’UTP entraîne une mobilisation du calcium intracellulaire sans augmentation d’IP 3 et d’AMPc. Les récepteurs P2Y 12 , P2Y 13 et P2Y 14 sont surtout couplés à G i (Abbracchio et al., 2006 ; Burnstock, 2007 b).

D’un point de vue pharmacologique les récepteurs P2Y peuvent être subdivisés en quatre groupes (Abbracchio et al., 2006) : • les récepteurs ayant plus d’affinité pour les purines (activés préférentiellement par l’ADP

et l’ATP), parmi lesquels les récepteurs P2Y 1, P2Y 11, P2Y 12, P2Y 13 ; • les récepteurs ayant plus d’affinité pour les (répondant à l’UDP et à l’UTP),

parmi lesquels le récepteur P2Y 4 humain et le récepteur P2Y 6 ;

• les récepteurs à sélectivité mixte, parmi lesquels le récepteur P2Y 2 et le récepteur P2Y 4 de rongeur ;

• le récepteur P2Y 14 répondant à l’UDP-glucose et à l’UDP-galactose.

Sous-types des récepteurs P2Y

Récepteurs P2Y 1 : Le récepteur P2Y 1 a d’abord été cloné à partir du cerveau de poussin (Webb et al., 1993). Dans la plupart des espèces, l’ADP est un agoniste plus puissant que l’ATP, et leurs dérivés 2-méthylthio sont plus puissants. L’UTP, l’UDP, le CTP et le GTP sont inactifs (Waldo et Harden, 2004). L’agoniste le plus puissant et le plus sélectif connu à ce jour est un analogue du 2MeSADP, le MRS2365 (Chhatriwala et al., 2004). Plusieurs antagonistes très sélectifs et puissants existent, le MRS2179, le MRS2279 et le MRS2500 (Jacobson et al., 2009). Ces récepteurs sont largement distribués au niveau des tissus, notamment au niveau des plaquettes et des cellules endothéliales (Abbracchio et al., 2006).

Récepteurs P2Y 2 : Le récepteur P2Y 2, anciennement appelé P2U, a d’abord été cloné à partir de cellules du neuroblastome de souris (Lustig et al., 1993). Ce récepteur est activé par des

9 Introduction concentrations équivalentes d’ATP et d’UTP (Lustig et al., 1993), sauf le récepteur de porc, insensible à l’ATP (Shen et al., 2004), tandis que leurs dérivés diphosphates sont moins puissants. L’UTP γS est également un agoniste du récepteur P2Y 2 (Lazarowski et al., 1995), de même que l’INS365 et l’INS37217 (Jacobson et al., 2009). La suramine est un antagoniste des récepteurs P2Y 2 du rat et de l’homme. D’autres antagonistes du P2Y2 sont l’AR-C126313 et l’AR-C118925 (Burnstock, 2007 b). Ce récepteur est exprimé dans différents tissus, dont le cœur et le cerveau (Abbracchio et al., 2006). Le récepteur P2Y 2 est couplé à la PLC via une protéine G q/11 . Son activation augmente la synthèse et/ou la libération d’acide arachidonique, de prostaglandines et d’oxyde nitrique (Xu et al., 2003).

Récepteurs P2Y 4 : Les récepteurs P2Y 4 ont d’abord été clonés chez l’homme (Communi et al., 1995). L’UTP est l’agoniste le plus puissant du récepteur recombinant humain P2Y 4 (Nicholas et al., 1996). Le GTP et l’ITP sont 10 fois moins puissants que l’UTP (Communi et al., 1996 a). L’ATP agit en tant qu’antagoniste compétitif (Kennedy et al., 2000). En revanche, les récepteurs recombinants de rat et de souris sont activés de façon égale par l’ATP et l’UTP (Bogdanov et al., 1998 ; Webb et al., 1998). Chez l’homme, le transcrit et la protéine sont les plus abondants dans l’intestin mais sont également présents dans d’autres tissus (Moore et al., 2001).

Récepteurs P2Y 6 : Ces récepteurs, d’abord clonés chez le rat (Chang et al., 1995) et l’homme (Communi et al., 1996 b), sont sélectifs de l’UDP. Les nucléotides les plus puissants sont : UDP > UTP > ADP > 2MeSATP >> ATP (Communi et al., 1996 b). Des agonistes plus résistants à la dégradation sont l’UDP βS, le MRS2633, le MRS2693 et l’INS48823 (Jacobson et al., 2009). Parmi les propriétés de ce récepteur on peut citer sa désensibilisation et son internalisation lentes (Robaye et al., 1997 ; Brinson et Harden, 2001). Le récepteur P2Y 6 est exprimé au niveau de différents tissus.

Récepteurs P2Y 11 : Le récepteur P2Y 11 a d’abord été cloné chez l’Homme, à partir de placenta (Communi et al., 1997). Il est unique parmi tous les récepteurs P2Y. C’est le seul récepteur P2Y dont le gène contient un intron. L’intron de 1,9 kpb sépare l’exon codant pour les six premiers acides aminés du second exon (Communi et al., 2001 a). L’ATP a une affinité assez faible pour ce récepteur qui est couplé à la fois à la PLC et à l’adénylate cyclase.

10 Introduction

L’ATP γS est plus puissant que l’ATP. Un autre agoniste puissant est l’AR-C67085 qui est

également un antagoniste du récepteur P2Y 12 (Jacobson et al., 2009).

Récepteurs P2Y 12 : Ce récepteur, cloné en 2001 chez l’homme (Hollopeter et al., 2001 ; Savi et al., 2001 ; Zhang et al., 2001), le rat (Hollopeter et al., 2001) et la souris (Foster et al., 2001), possède comme agoniste naturel l’ADP. Il est fortement exprimé dans les mégacaryocytes et les plaquettes où il est la cible de plusieurs médicaments (voir partie I.1.4.).

Récepteurs P2Y 13 : Les récepteurs P2Y 13 ont d’abord été clonés chez l’homme (Communi et al., 2001 b ; Zhang et al., 2002). Leurs agonistes naturels sont l’ADP et le 2MeSADP

(Jacobson et al., 2009). L’IDP est un agoniste puissant du récepteur P2Y13 murin (Zhang et al., 2002). Le (AR-C69931MX), antagoniste du récepteur P2Y 12 , est également un antagoniste du récepteur P2Y 13 humain et de rat (Marteau et al., 2003 ; Fumagalli et al.,

2004). Le récepteur P2Y 13 est exprimé dans différents organes humains, surtout dans la rate et le cerveau (Communi et al., 2001 b).

Récepteurs P2Y 14 : Le récepteur P2Y 14 , anciennement appelé récepteur à l’UDP-glucose, est identique à 47 % aux récepteurs P2Y 12 et P2Y 13 . Il est activé par l’UDP-glucose, l’UDP- galactose, l’acide UDP-glucuronique et l’UDP-N-acétylglucosamine (Chambers et al., 2000). A ce jour aucun antagoniste sélectif n’est disponible. L’ARNm de ce récepteur est largement distribué dans le corps humain.

I.1.3.2.2. Les récepteurs P2X

Les récepteurs P2X sont des récepteurs ionotropes. Ils font partie de la famille des canaux ioniques dépendants de ligands qui comprend, en plus des récepteurs P2X trimériques, les récepteurs pentamériques Cys-loop (récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, récepteurs de la sérotonine 5-HT 3, récepteurs du GABA A, récepteurs de la glycine et récepteurs activés par le ) et les récepteurs tétramériques au glutamate (NMDA, AMPA, kainate) (Fig. 1.4). Les premiers récepteurs P2X ont été clonés en 1994 (Valera et al., 1994 ; Brake et al., 1994).

Actuellement sept sous-unités de récepteurs P2X (P2X 1-7) sont reconnues.

11 Introduction

Figure 1.4 : Représentation schématique des trois familles de canaux ioniques dépendants de ligands. La famille des récepteurs pentamériques Cys-loop comprend les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (ACh), les récepteurs de la sérotonine (5-HT 3), les récepteurs du GABA A, les récepteurs de la glycine et les récepteurs activés par le zinc ( zinc-activated channels , ZAC). Les récepteurs tétramériques au glutamate sont sous-divisés en récepteurs NMDA, AMPA et kainate. Les récepteurs purinergiques P2X sont des récepteurs trimériques. Les cercles jaunes indiquent les résidus cystéine participant dans la formation de ponts disulfures. Les cylindres rouges indiquent des régions qui participent dans la conduction ionique/sélectivité (Collingridge et al., 2009).

Structure Les sous-unités des récepteurs P2X comprennent des extrémités N- et C-terminales intracellulaires, deux segments transmembranaires et une large boucle extracellulaire. Le domaine extracellulaire contient dix résidus cystéine conservés formant plusieurs ponts disulfures, deux à six sites potentiels de N-glycosylation, une région hydrophobe pouvant jouer un rôle dans la régulation du canal par le magnésium, le zinc, le cuivre et d’autres cations, et un site de liaison pour l’ATP. Au niveau des extrémités intracellulaires on retrouve

12 Introduction des sites de liaison pour des protéines kinases (Burnstock, 2007 b). Les sous-unités des récepteurs P2X humains sont constituées de 379 (P2X6) à 595 (P2X 7) acides aminés (Jarvis et Khakh, 2009). Les séquences de ces sous-unités possèdent une homologie inférieure à 50 %.

La sous-unité P2X 7 diffère des autres par son extrémité C-terminale intracellulaire longue, contenant plusieurs domaines permettant son interaction avec des protéines intracellulaires (Denlinger et al., 2001 ; Kim et al., 2001).

Plusieurs sous-unités doivent s’associer pour constituer des récepteurs fonctionnels. Des canaux cationiques homo- ou hétéro-multimériques sont ainsi formés (Torres et al., 1999), impliquant trois sous-unités (Nicke et al., 1998 ; Stoop et al., 1999 ; Jiang et al., 2003).

L’existence de plusieurs hétéromultimères a été décrite (P2X 1/2 , P2X 1/4 , P2X 1/5 , P2X 2/3 , P2X 2/6 et P2X 4/6 ). Le récepteur P2X 6 est le seul qui ne forme pas d’homomultimères (Burnstock,

2007 b). La sous-unité P2X 7 était pendant longtemps considérée comme la seule sous-unité ne formant pas d’hétéromères (Torres et al., 1999). En 2007, Guo et ses collaborateurs ont suggéré la formation d’hétéromères entre les récepteurs P2X 4 et P2X 7 (Guo et al., 2007). Cependant, des études ultérieures ont conclu que ces récepteurs s’assemblent de manière prédominante sous forme d’homotrimères (Nicke et al., 2008 ; Boumechache et al., 2009 ; Antonio et al., 2011). La composition des récepteurs P2X détermine leurs propriétés fonctionnelles et pharmacologiques. Ces propriétés dépendent également de la présence de diverses variantes d’épissage ou de polymorphismes liés à un seul nucléotide.

Pharmacologie L’activation des récepteurs P2X entraîne l’ouverture d’un canal cationique permettant le passage de cations tels que le Na +, le K + et le Ca 2+ . Ceci est suivi d’une dépolarisation de la membrane entraînant l’activation de canaux calciques dépendant du potentiel de membrane (Erb et al., 2006). Il en résulte une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium 2+ ([Ca ]i). Certains récepteurs, notamment les récepteurs P2X 2, P2X 4 et P2X 7, subissent des changements de conformation lors d’une stimulation prolongée. Ces changements sont accompagnés d’une augmentation de la perméabilité à des ions de taille plus grande tels le NMDG + ou le YOPRO-1 (Steinberg et al., 1987 ; Khakh et al., 1999 a ; Virginio et al., 1999). L’activation des récepteurs P2X est généralement suivie par la désensibilisation plus ou moins rapide de ceux-ci. Les récepteurs P2X 1 et P2X 3 sont rapidement désensibilisés (< 1 seconde), tandis que les récepteurs P2X 2, P2X 4, P2X 5 et P2X 6 sont désensibilisés plus lentement. Le récepteur P2X 7 est peu ou pas désensibilisé (North, 2002).

13 Introduction

L’agoniste naturel des récepteurs P2X est essentiellement l’ATP. Au moins trois molécules du nucléotide se lient à la partie extracellulaire des récepteurs P2X (Bean, 1990 ; Ding et Sachs, 1999). Les récepteurs P2X diffèrent par rapport à leur sensibilité à l’ATP et à d’autres agonistes. Ainsi le récepteur P2X 7 est activé par des concentrations d’ATP de l’ordre du millimolaire, tandis que les autres sous-types ont des EC 50 de 0,1 à 10 µM pour l’ATP. L’ α,β -meATP est un analogue de l’ATP permettant la discrimination entre plusieurs sous- types de récepteurs P2X : seuls les récepteurs P2X 1 et P2X 3 sont activés par des faibles concentrations de cet agoniste. Le 2MeSATP et le BzATP sont d’autres agonistes des récepteurs P2X. L’activité des récepteurs P2X peut être régulée par certains ions, notamment 2+ par le Zn , par le pH, ou encore par l’ivermectine (P2X 4). Différents antagonistes des récepteurs P2X ont été décrits, avec des spécificités variables par rapport aux sept sous-types. Parmi ces antagonistes on trouve entre autres la suramine, le PPADS, le bleu de Coomassie, le KN-62 et l’ATP oxydé (Fig. 1.5) (Jarvis et Khakh, 2009). Des différences entre espèces ont été rapportées en ce qui concerne la sensibilité des récepteurs P2X aux différents agonistes et antagonistes (Young et al., 2007 ; Donnelly-Roberts et al., 2009).

14 Introduction

Figure 1.5 : Structure chimique de certains agonistes, antagonistes et modulateurs des récepteurs P2X. L’ATP, l’ α,β -meATP, le 2MeSATP et le BzATP sont des agonistes des récepteurs P2X, tandis que l’ATP oxydé (oATP), le KN-62 et le PPADS sont des antagonistes. L’ivermectine est un modulateur des récepteurs P2X 4.

15 Introduction

Sous-types des récepteurs P2X

Récepteurs P2X 1 : Le récepteur P2X 1 a d’abord été cloné à partir de la musculature lisse du canal déférent de rat (Valera et al., 1994). Cette protéine de 399 acides aminés intervient dans la contraction des muscles lisses du canal déférent, de la vessie, d’artères et de veines (Di

Virgilio et al., 2005). Le récepteur P2X 1 est également retrouvé au niveau des plaquettes (MacKenzie et al., 1996) où son activation entraîne un changement de forme de ces cellules (Rolf et al., 2001) et leur agrégation (Erhardt et al., 2003). Parmi les caractéristiques de ce récepteur on peut citer sa désensibilisation rapide et son activation par l’ α,β -meATP (Evans et al., 1995 ; Valera et al., 1994). D’autres agonistes sont le BzATP, le 2MeSATP et l’ATP (Valera et al., 1994).

Récepteurs P2X 2 : D’abord cloné à partir de cellules PC12 du phéochromocytome du rat (Brake et al., 1994), ce récepteur n’est pas activé par l’α,β -meATP et ne montre pas ou très peu de désensibilisation. Il est activé par l’ATP, l’ATP γS et le 2MeSATP (Evans et al., 1995), et il est potentialisé par les protons (King et al., 1996 ; Stoop et al., 1997) et par des faibles concentrations de Zn 2+ (Brake et al., 1994). Il est exprimé dans le système nerveux central et périphérique ainsi que dans d’autres tissus (Gever et al., 2006).

Récepteurs P2X 3 : Les récepteurs P2X 3 ont été clonés à partir de la racine postérieure ganglionnaire de rat (Chen et al., 1995 ; Lewis et al., 1995). Ils sont activés par le 2MeSATP, l’ATP et l’ α,β -meATP. On constate une désensibilisation rapide, comme c’est le cas avec le récepteur P2X 1. Le récepteur P2X 3 est localisé de façon prédominante au niveau des neurones sensitifs et il est impliqué dans certains types de douleur (Wirkner et al., 2007).

Récepteurs P2X 4 : D’abord clonés à partir de l’hippocampe (Bo et al., 1995), du cerveau (Seguela et al., 1996), du ganglion cervical supérieur (Buell et al., 1996) et des îlots pancréatiques (Wang et al., 1996) de rat, ces récepteurs sont largement distribués. Les récepteurs P2X 4 de la microglie interviennent dans l’inflammation chronique et dans la douleur neuropathique (Guo et al., 2005 ; Inoue et al., 2004 ; Schwab et al., 2005 ; Tsuda et al., 2003). Le gène codant pour la sous-unité P2X 4 est localisé sur le même chromosome que celui de la sous-unité P2X 7. La sous-unité P2X 4 est composée de 388 acides aminés. Parmi toutes les sous-unités de récepteurs P2X, c’est celle qui a la séquence en acides aminés la plus proche de la sous-unité P2X 7 (environ 49 % d’identité) (North, 2002). Les récepteurs P2X 4

16 Introduction sont localisés de manière prédominante au niveau intracellulaire car ils sont internalisés par endocytose via des vésicules recouvertes de clathrine (Bobanovic et al., 2002 ; Royle et al., 2002 ; Royle et al., 2005). Dans la cellule ils sont principalement localisés dans les lysosomes (Qureshi et al., 2007 ; Stokes et Surprenant, 2009). Ces récepteurs sont activés par des concentrations intermédiaires d’ATP (3-300 µM), qui est l’agoniste le plus puissant. Le 2MeSATP active également ces récepteurs, tandis que l’ α,β -meATP est un agoniste faible des récepteurs P2X 4 murins et humains. Ces récepteurs sont relativement insensibles aux antagonistes classiques des récepteurs P2X, comme la suramine et le PPADS (Buell et al.,

1996). Aucun antagoniste sélectif du récepteur P2X 4 humain, de rat ou de souris n’a été identifié jusqu’à maintenant. Son activité est fonction du pH : en milieu acide (pH 6,3 - 6,5) elle est diminuée, alors qu’en milieu basique (pH 8,0 - 8,3) il n’y a que très peu ou pas de changement (Stoop et al., 1997). Les récepteurs P2X4 sont modulés de façon positive par le Zn 2+ (Garcia-Guzman et al., 1997) et par l’ivermectine, une lactone macrocyclique semi- synthétique dérivée des produits de fermentation de Streptomyces avermitilis et utilisée comme antiparasitaire. L’ivermectine exerce son effet antiparasitaire par l’activation des canaux chlorure activés par le glutamate des nerfs et muscles des invertébrés (Cully et al., 1994). Ceci entraîne une hyperpolarisation, puis la paralysie et la mort des parasites. Cette molécule a également une action au niveau d’autres canaux ioniques : les récepteurs GABA A (Sigel et Baur, 1987), les récepteurs de la glycine (Shan et al., 2001) et les récepteurs α7- nicotiniques des mammifères (Krause et al., 1998). En 1999, Khakh et ses collaborateurs ont observé une modulation allostérique du récepteur P2X 4 par l’ivermectine, mais aucun effet au niveau des autres récepteurs P2X (Khakh et al., 1999 b). Cet antiparasitaire semble interagir avec un site allostérique du récepteur P2X 4 plutôt que d’avoir un effet sur son internalisation (Priel et Silberberg, 2004 ; Silberberg et al., 2007 ; Asatryan et al., 2010). Deux groupes indépendants ont mis en évidence certains résidus au niveau des hélices α des deux segments transmembranaires intervenant dans la liaison à l’ivermectine (Silberberg et al., 2007 ; Jelinkova et al., 2008).

Récepteurs P2X 5 : Le récepteur P2X 5 a d’abord été cloné à partir des ganglions cœliaques (Collo et al., 1996) et du cœur (Garcia-Guzman et al., 1996) de rat. Il est activé par l’ATP, le

2MeSATP et l’ADP. Le PPADS et la suramine sont des antagonistes du récepteur P2X 5 (Bo et al., 2000 ; Garcia-Guzman et al., 1996 ; Collo et al., 1996).

17 Introduction

Récepteurs P2X 6 : Ce clone a été isolé du ganglion cervical supérieur (Collo et al., 1996) et du cerveau (Soto et al., 1996) de rat. Des agonistes de ce récepteur sont l’ATP, le 2MeSATP et l’ADP. Aucun courant n’est induit par l’ATP quand les récepteurs P2X 6 sont exprimés sous forme d’homomultimères dans des oocytes ou des cellules HEK293 (Collo et al., 1996 ; Khakh et al., 1999 b). Ils peuvent former des récepteurs hétéromultimériques fonctionnels

P2X 2/6 (King et al., 2000) ou P2X 4/6 (Le et al., 1998).

Récepteurs P2X 7 : Ce récepteur a été cloné à partir du cerveau de rat (Surprenant et al., 1996) et correspond au récepteur P2Z. Il est surtout exprimé au niveau des cellules du système hématopoïétique, tels que les mastocytes, les macrophages et les monocytes, mais également au niveau d’autres cellules, par exemple des fibroblastes, des cellules gliales, neuronales ou épithéliales (Gever et al., 2006). Le récepteur P2X 7 est structurellement et fonctionnellement différent des autres récepteurs P2X. La partie I.1.3.3. est consacrée spécialement à ce récepteur.

I.1.3.3. Les récepteurs P2X 7

Structure

Le gène codant pour la sous-unité P2X 7 contient 13 exons et chez l’homme il est localisé au niveau du chromosome 12, le chromosome sur lequel est également situé le gène codant pour le récepteur P2X 4. Le récepteur P2X 7 humain, formé de 595 acides aminés, est glycosylé au niveau de cinq résidus de la boucle extracellulaire (Lenertz et al., 2010). Cette modification post-traductionnelle est importante pour la fonction du récepteur. Lenertz et ses collaborateurs (2010) ont montré qu’une mutation au niveau de ces sites de N-glycosylation a comme conséquence une diminution de la phosphorylation d’ERK1/2 en réponse au BzATP.

L’extrémité C-terminale du récepteur P2X 7 est beaucoup plus longue que celle des autres récepteurs P2X. Elle contient plusieurs sites d’interactions protéines-protéines ou protéines- lipides, dont un site potentiel pour la liaison des lipopolysaccharides (LPS) (Denlinger et al., 2001) et un site de liaison à la calmoduline (Roger et al., 2008). Elle intervient dans la régulation de la translocation du récepteur P2X 7 vers la membrane plasmique (Smart et al., 2003 ; Denlinger et al., 2003) et dans la modulation du fonctionnement du canal (Becker et al., 2008). Kim et ses collaborateurs (2001) ont montré que les récepteurs P2X 7 peuvent former un complexe de signalisation avec de multiples protéines, comme des protéines du

18 Introduction cytosquelette, des protéines de choc thermique ou encore la phosphatidylinositol-4-kinase (PI4K) ou le récepteur à activité tyrosine phosphatase. Le même groupe a démontré que le ème récepteur P2X 7 est phosphorylé au niveau de la tyrosine en position 343 (2 segment transmembranaire) en condition basale. Suite à l’activation du récepteur cette tyrosine est déphosphorylée (Kim et al., 2001).

De nombreux polymorphismes d’un seul nucléotide ont été mis en évidence chez les récepteurs P2X 7 (Fuller et al., 2009). Parmi ces derniers, certains semblent causer une perte ou une augmentation de fonction et ont été associés à diverses affections, comme la leucémie lymphocytaire chronique, le risque de fracture osseuse, ainsi que des fonctions immunitaires diminuées (Cabrini et al., 2005 ; Ohlendorff et al., 2007 ; Shemon et al., 2006). Jusqu’à ce jour dix isoformes du récepteur P2X 7 humain ont été identifiées (Cheewatrakoolpong et al.,

2005 ; Feng et al., 2006 ; Nicke et al., 2009). L’ADNc du récepteur P2X 7 complet, formé de

13 exons, est la variante P2X 7(a) (GenBank NM_011027).

Pharmacologie

Le récepteur P2X 7 possède une affinité plus faible pour l’ATP (EC 50 = 100 µM) que les autres récepteurs P2X. Le BzATP est l’agoniste le plus puissant (Gargett et al., 1997 ;

Gever et al., 2006). Cependant cet analogue n’est pas spécifique du récepteur P2X 7, il active également d’autres récepteurs P2X. Après une stimulation préalable par l’ATP ou le BzATP, le récepteur P2X 7 devient plus sensible à l’ADP et l’AMP. Chafke et ses collaborateurs (2002) ont montré que l’ADP et l’AMP entraînent une libération de la cytokine interleukine- 1β (IL-1β ) par les cellules de la microglie humaine suite à une stimulation initiale par l’ATP.

Le NAD n’active pas directement le récepteur P2X 7, mais il a été montré que le transfert, via l’ADP-ribosyltransférase ART2.2, du groupement ADP- du NAD sur certains résidus du récepteur P2X 7 entraîne l’activation de celui-ci (Seman et al., 2003 ; Adriouch et al., 2008).

Plusieurs modulateurs des récepteurs P2X 7 ont été décrits. Le tenidap, un produit anti- inflammatoire, potentialise les effets cytotoxiques et perméabilisants du récepteur P2X 7 dans les macrophages (Sanz et al., 1998). Une potentialisation de l’effet perméabilisant a également été observée dans les glandes salivaires (Alzola et al., 2001). Le groupe de Di Virgilio a montré que la polymyxine B, un antibiotique cationique qui se lie au lipide A des

19 Introduction

LPS et les neutralise, potentialise les réponses couplées à l’activation du récepteur P2X 7 dans plusieurs modèles cellulaires (Ferrari et al., 2004 ; Ferrari et al., 2007). Récemment, suite au criblage d’une bibliothèque d’un millier de composés, la clémastine a été décrite comme modulateur allostérique du récepteur P2X 7. Cet antihistaminique H 1 sensibilise à l’ATP les récepteurs P2X 7 humains natifs ou exprimés de manière recombinante, probablement en se liant au domaine extracellulaire de ces récepteurs (Nörenberg et al., 2011). La concentration en ions du milieu extracellulaire influence également l’activité des récepteurs P2X 7. Les réponses à l’ATP sont potentialisées dans un milieu contenant une faible concentration en ions bivalents, comme le Ca 2+ ou le Mg 2+ (Surprenant et al., 1996). L’ATP 4- semble donc être la forme active d’ATP sur le récepteur P2X 7. Une autre explication pourrait être que les ions bivalents se lient au récepteur P2X 7 et exercent une inhibition allostérique (Virginio et al., + 1997). Le Na possède également un effet inhibiteur sur le récepteur P2X 7 (Wiley et al., 1992 ; Michel et al., 1999).

Plusieurs antagonistes du récepteur P2X 7 ont été décrits. La suramine et le PPADS bloquent ce récepteur mais ne sont pas sélectifs (Jacobson et al., 2002). Le bleu de Coomassie est plus actif sur le récepteur P2X 7 de rat que sur le récepteur humain (Jiang et al., 2000).

L’ATP oxydé bloque le récepteur P2X 7 irréversiblement (Di Virgilio, 2003), mais à la concentration utilisée (100 µM) ce produit inhibe également d’autres récepteurs P2X. Le KN-

62, un inhibiteur de la kinase calcium/calmoduline dépendante II, inhibe le récepteur P2X 7 humain. Il est moins actif sur le récepteur P2X 7 de rat et de souris (Humphreys et al., 1998 ; North, 2002). Le décavanadate a été décrit comme antagoniste réversible et compétitif du récepteur P2X 7. Cependant cette molécule inhibe également les récepteurs P2X 2 et P2X 4 et interagit avec d’autres molécules (Michel et al., 2006). Au cours des dernières années, la recherche d’antagonistes sélectifs a beaucoup progressée. Un certain nombre de ces antagonistes ont montré une activité anti-nociceptive et anti-inflammatoire (Donnelly-Roberts et Jarvis, 2007). Cependant, une partie des antagonistes a été développée par des firmes pharmaceutiques et n’est pas encore disponible pour la communauté scientifique. Parmi les antagonistes du récepteur P2X 7 décrits on trouve l’A-438079, une tétrazole disubstituée, qui bloque le récepteur P2X 7 humain et de rat de manière réversible et ne semble pas active sur les autres récepteurs P2X (Nelson et al., 2006), et l’A-740003, une cyanoguanidine, qui est un antagoniste sélectif et puissant du récepteur P2X 7 humain et de rat (Honore et al., 2006). L’AZ11645373, l’AZ10606120, le GSK314181A et l’A-804598 sont d’autres antagonistes du récepteur P2X 7 étudiés récemment (Skaper et al., 2010 ; Jarvis et Khakh, 2009).

20 Introduction

Réponses secondaires à l’activation du récepteur P2X 7

L’activation du récepteur P2X 7 entraîne l’ouverture d’un canal cationique perméable 2+ + + au Ca , au Na et au K . La perméabilité du récepteur P2X 7 augmente après une exposition prolongée à l’ATP, permettant le passage d’ions organiques de taille élevée. La stimulation par l’ATP extracellulaire permet ainsi le passage dans les macrophages de molécules ayant un poids moléculaire jusqu’à 800-900 Da (Steinberg et al., 1987) et en dessous de 400 Da dans les lymphocytes (Wiley et al., 1993). La formation de pores en réponse à une stimulation prolongée du récepteur P2X 7 a été observée dans différents types cellulaires, notamment dans les glandes salivaires (Chaïb et al., 2000 ; Gibbons et al., 2001). Au niveau de ces glandes l’effet perméabilisant de l’ATP est plus faible qu’au niveau des cellules du système immunitaire, comme les macrophages ou les cellules gliales (Chaïb et al., 2000). Différents mécanismes ont été proposés pour cette perméabilisation membranaire, mais le processus précis n’a pas encore été établi avec certitude. Selon l’hypothèse de la dilatation de pore, le diamètre du canal augmenterait progressivement pour laisser passer des molécules plus larges (Virginio et al., 1999). La longue extrémité C-terminale pourrait jouer un rôle dans la formation de pore (Smart et al., 2003). Cependant, Tomasinsig et ses collègues (2008) ont montré qu’en présence du peptide antimicrobien LL-37, des récepteurs P2X 7 tronqués au niveau de leur extrémité C-terminale sont capables de former des pores. Leurs résultats supportent l’idée que le domaine C-terminal ne serait pas nécessaire à la formation de pore. Certaines études suggèrent l’intervention d’autres protéines dans la formation de pore, dont la pannexine-1, une protéine transmembranaire pouvant former des jonctions communicantes (gap junctions ) (Pelegrin et Surprenant, 2006 ; Locovei et al., 2007). Les molécules anioniques et cationiques possèderaient des mécanismes de perméabilisation différents (Schachter et al., 2008 ; Cankurtaran-Sayar et al., 2009).

Le récepteur P2X 7 n’est pas seulement impliqué dans le transport d’ions, mais il active également diverses voies de signalisation intracellulaires et régule des fonctions importantes comme la mort cellulaire. Ces récepteurs régulent ainsi les voies de signalisation des phospholipides (Garcia-Marcos et al., 2006 a). Même si leur stimulation n’est pas couplée à l’activation de la phospholipase C spécifique des polyphospoinositides (PPI-PLC), les agonistes des récepteurs P2X 7 peuvent moduler l’activation de cette enzyme par d’autres neurotransmetteurs comme l’acétylcholine ou l’adrénaline (Hurley et al., 1993 ; Jorgensen et al., 1995). La stimulation d’une activité phospholipase A 2 (PLA 2) et d’une activité phospholipase D (PLD) secondaire à l’activation des récepteurs P2X 7 a été démontrée dans

21 Introduction plusieurs types de cellules (el-Moatassim et Dubyak, 1992 ; Alzola et al., 1998 ; Humphreys et Dubyak, 1996 ; Perez-Andrés et al., 2002 ; Hung et Sun, 2002 ; Pochet et al., 2003). L’ATP peut activer deux isoformes de la PLA 2 : la PLA 2 dépendante du calcium (cPLA 2), spécifique des phospholipides contenant de l’acide arachidonique en position 2, et la PLA 2 calcium- indépendante (iPLA 2), moins spécifique pour l’acide gras en position 2 (Alzola et al., 1998).

Il a été montré que les récepteurs P2X 7 augmentent le taux de céramides, suite à l’activation de la sphingomyélinase neutre (Garcia-Marcos et al., 2006 b). Ceci suggère certaines analogies entre le récepteur P2X 7 et le récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR1), car l’activation du récepteur TNFR1 entraîne une augmentation du taux de céramides et régule des voies d’apoptose (Gulbins et Kolesnick, 2003 ; Reynolds et al., 2004). Le récepteur P2X 7 contient au niveau de son extrémité C-terminale une région possédant des similitudes avec la séquence responsable de la mort cellulaire ( death domain ) du récepteur TNFR1 (Denlinger et al., 2001). Ce death domain est essentiel pour la localisation du récepteur TNFR1 au niveau de domaines membranaires rigides, riches en cholestérol, appelés rafts lipidiques (Cottin et al., 2002). Il a été démontré que les récepteurs P2X 7 sont également localisés, en partie, au niveau des rafts (Garcia-Marcos et al., 2006 b ; Barth et al., 2007 ; Gonnord et al., 2009).

D’après Gonnord et ses collègues (2009), l’association des récepteurs P2X 7 avec les rafts nécessite la palmitoylation de résidus cystéine du récepteur, ce qui augmente l’hydrophobicité du récepteur. Le couplage des récepteurs P2X 7 à différentes voies de signalisation dépend de la distribution du récepteur au niveau de la membrane (Garcia-Marcos et al., 2006 b). Les rafts contiennent également des récepteurs métabotropes comme des récepteurs P2Y ou P1, et plusieurs enzymes telles que la sphingomyélinase neutre ou l’E-NTPDase CD39 (Kittel et al., 1999 ; Koziak et al., 2000 ; Lasley et al., 2000 ; Kaiser et al., 2002 ; Kittel et al., 2004 ; Savi et al., 2006).

L’activation des récepteurs P2X 7 entraîne une multitude de réponses au niveau intracellulaire. Sa stimulation mène ainsi à l’activation de plusieurs kinases, comme les protéine kinases (PK) C et D, la phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et ERK1/2 (Aga et al., 2002 ; Bradford et Soltoff, 2002 ; Amstrup et Novak, 2003 ; Jacques-Silva et al., 2004). Plusieurs groupes ont démontré l’activation de facteurs de transcription tels que AP-1, CREB et NF-κB en réponse à la stimulation des récepteurs P2X 7 (Ferrari et al., 1997 ; Ferrari et al., 1999 a ; Aga et al., 2002 ; Lenertz et al., 2009). Ces récepteurs sont également impliqués dans la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Parvathenani et al., 2003 ; Cruz et al., 2007). Des études menées sur des souris n’exprimant pas le gène codant pour le récepteur

22 Introduction

P2X 7 (souris P2X 7-KO) confirment le rôle de ce récepteur dans la libération de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β (Solle et al., 2001). En effet, les macrophages péritonéaux de souris contrôles, mais pas de souris P2X 7-KO, stimulés préalablement par des LPS, libèrent de l’IL- 1β après stimulation par des concentrations élevées d’ATP (Solle et al., 2001). Ceci est secondaire à l’activation de la caspase-1 provoquée par l’efflux de potassium suite à l’activation des récepteurs P2X 7 (Kahlenberg et Dubyak, 2004). Ces récepteurs jouent donc un rôle important dans les phénomènes inflammatoires. Ils induisent également des phénomènes liés à la mort cellulaire, comme l’apparition d’un bourgeonnement membranaire (membrane blebbing) (Mackenzie et al., 2001 ; Wilson et al., 2002), le collapsus du potentiel de membrane mitochondrial (Garcia-Marcos et al., 2005), la fragmentation d’ADN (Ferrari et al., 1999 b), l’activation de caspases (Ferrari et al., 1999 b) et le transfert de la phosphatidylsérine de la partie interne vers la partie externe de la membrane plasmique

(Elliott et al., 2005). L’activation du récepteur P2X 7 peut provoquer la mort cellulaire, par nécrose ou par apoptose, en fonction du temps d’incubation en présence de l’agoniste, de la concentration d’ATP et du type de cellule (Di Virgilio et al., 1998). Cependant, les réponses induites par ce récepteur sont assez complexes et son activation a parfois été corrélée à la prolifération cellulaire (Di Virgilio et al., 2009).

I.1.4. Le potentiel thérapeutique de la signalisation purinergique

Depuis ces dernières années les récepteurs purinergiques sont devenus une cible potentielle de médicaments. Plusieurs firmes pharmaceutiques se sont intéressées aux agonistes et antagonistes de ces récepteurs. Les dernières avancées au sujet du potentiel thérapeutique de la signalisation purinergique ont été publiées dans plusieurs revues (Burnstock, 2006 b ; Burnstock, 2008 ; Takenouchi et al., 2010 ; Burnstock, 2011). Aujourd’hui, plusieurs molécules agissant sur les récepteurs purinergiques sont approuvées comme médicaments ou sont en phase d’essai clinique. L’utilisation des produits agissant sur la signalisation purinergique est envisagée dans le traitement de plusieurs pathologies, dont :

Les pathologies cardiovasculaires Arythmie : L’adénosine, un agoniste des récepteurs P1, est commercialisé en Belgique (Adénocor ®) et est utilisé par voie intraveineuse dans le traitement de certaines tachycardies

23 Introduction supraventriculaires ainsi que pour le diagnostic différentiel de certains troubles du rythme. Des essais cliniques sont actuellement réalisés avec le capadénoson et le tecadénoson, des agonistes des récepteurs P1A 1, pour le traitement de la fibrillation et de la tachycardie supraventriculaire respectivement.

Imagerie cardiaque : Le reganédoson est un agoniste sélectif des récepteurs P1A2A agissant comme vasodilatateur coronarien. Ce produit, autorisé aux Etats-Unis (Lexiscan ®) mais pas encore en Europe, est utilisé dans l’imagerie cardiaque. D’autres agonistes de ce récepteur sont actuellement (mars 2011) en phase d’essai clinique (apadénoson et binodénoson).

Thrombose : Les plaquettes expriment les récepteurs P2Y 1, P2Y 12 et P2X 1 impliqués dans l’agrégation plaquettaire (Hollopeter et al., 2001). Il existe des variations au niveau du gène des récepteurs PY 1 et P2Y 12 qui expliquent les variations de la réponse des plaquettes à l’ADP. Ceci peut être le reflet d’une variation individuelle du risque de thrombose (Fontana et al., 2003 ; Hetherington et al., 2005). Plusieurs antagonistes des récepteurs P2Y 12 sont actuellement commercialisés ou en phase d’essai comme thrombolytiques : les thiénopyridines (Plavix ®), (Efient ®) et (Ticlid ®), et les antagonistes directs du récepteur P2Y 12 cangrelor (AR-C69931MX), (AZD6140) et (PRT060128) (Cattaneo, 2010). Le MRS2500, un antagoniste sélectif du récepteur

P2Y 1, a également montré des effets antiagrégants. Les thiénopyridines sont utilisées comme antiagrégants plaquettaires pour la prévention des thrombo-embolies. Après leur conversion en métabolite actif, elles se lient de façon covalente aux résidus cystéine de la partie extracellulaire du récepteur P2Y 12 des plaquettes et empêchent ainsi la fixation d’ADP. Or, l’activation du récepteur P2Y 12 favorise la fixation du fibrinogène sur le récepteur glycoprotéine IIb/IIIa. Les antagonistes directs entraînent une inhibition réversible des récepteurs P2Y 12 .

Les pathologies neurologiques Certains récepteurs purinergiques voient leur expression augmenter ou diminuer lors de pathologies neurologiques comme les maladies de Parkinson, d’Alzheimer ou de Huntington, et des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs ont été développés à des fins thérapeutiques

(voir la revue de Burnstock, 2008). Citons les récepteurs P1A 2A , dont l’expression est augmentée dans le cerveau de patients ayant la maladie de Parkinson et présentant de la

24 Introduction

dyskinésie (Calon et al., 2004). L’antagoniste des récepteurs P1A 2A preladénant est actuellement (mars 2011) en phase 3 d’essai clinique pour le traitement de cette maladie.

La douleur et l’inflammation

Les récepteurs purinergiques P2X 3, P2X 2/3 , P2X 4, P2X 7, P2Y 1 et P2Y 12 sont impliqués dans la transmission de la douleur. Plusieurs antagonistes de ces récepteurs ont été développés et

étudiés (Jarvis, 2010). Parmi ces molécules, les antagonistes des récepteurs P2X 7 suscitent le plus grand intérêt. L’activation de ces récepteurs entraîne notamment la libération de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β. Des souris invalidées pour le gène du récepteur P2X 7 montrent une diminution de la sévérité de l’arthrose (Labasi et al., 2002) et une diminution de la sensibilité à la douleur (Chessell et al., 2005). Ces études, conjointement avec des études utilisant des antagonistes des récepteurs P2X 7, montrent le rôle joué par ce récepteur dans la douleur. De nombreux brevets concernant des antagonistes de ces récepteurs ont été déposés (Friedle et al., 2010).

Les pathologies ophtalmiques La signalisation purinergique est bien développée au niveau de l’œil et différentes stratégies sont mises au point pour le traitement du glaucome, de la sécheresse oculaire et du décollement de la rétine (Crooke et al., 2008). L‘activation du récepteur P2Y 2 augmente la sortie de sels et d’eau et la sécrétion de mucus. Un agoniste de ce récepteur, le sel tétrasodique du diquafosol (Diquas TM ), a reçu une autorisation de mise sur le marché au Japon en décembre 2010 pour le traitement de la sécheresse oculaire .

Les pathologies respiratoires

L’ATP et l’UTP stimulent le récepteur P2Y 2 et entraînent la sécrétion du surfactant pulmonaire ainsi que la sortie de Cl - dans les cellules alvéolaires de type II. Or, dans la mucoviscidose, des anomalies de ces mécanismes sont présents (Yerxa, 2001). Les nucléotides augmentent également la fréquence des battements ciliaires des cellules épithéliales pulmonaires (Kemp et Kim, 2004).

Les pathologies urogénitales L’ATP est impliqué comme co-transmetteur, avec l’acétylcholine, dans le contrôle parasympathique de la contraction de la vessie. Les récepteurs purinergiques des nerfs sous- urothéliaux sont impliqués à la fois dans le réflexe de la vidange de la vessie et dans la

25 Introduction douleur en réponse à l’ATP, libéré par les cellules épithéliales lors de la distension de la vessie et de l’uretère. Les récepteurs purinergiques constituent ainsi une cible potentielle dans le traitement de l’incontinence, de la douleur au niveau urogénital et du cancer de la vessie et de la prostate (Burnstock, 2011).

L’oncologie Les agents actifs sur les récepteurs purinergiques peuvent réguler la prolifération, la différenciation et l’apoptose de cellules cancéreuses et pourraient donc jouer un rôle dans le traitement du cancer (White et Burnstock, 2006 ; Deli et Csernoch, 2008 ; Di Virgilio et al., 2009). Une étude a notamment suggéré le rôle de l’ATP dans le traitement de la cachexie chez des patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules, au stade IIIB (Agteresch et al., 2003). Il faudrait cependant attendre les résultats d’un plus grand nombre d’études, réalisées avec plus de participants, afin de pouvoir tirer des conclusions.

I.2. LES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE (ROS)

I.2.1. Les ROS et leurs effets

Les ROS sont des molécules très réactives, dérivées de l’oxygène moléculaire, et dont certaines possèdent des électrons non appariés. Divers ROS sont produits par les cellules, •- principalement l’anion superoxyde (O 2 ), généré suite à la réduction de l’oxygène moléculaire (Eq. 1) :

- • - O2 + e  O2 (Eq. 1)

L’anion superoxyde est considéré comme ROS « primaire », pouvant par la suite donner naissance à des ROS « secondaires ». Le peroxyde d’hydrogène (H 2O2) est produit • - suite à la dismutation d’O 2 (Eq. 2). Cette dismutation peut se produire spontanément, surtout à pH acide, ou elle peut être catalysée par la superoxyde dismutase (SOD).

• - + 2 O 2 + 2 H  H2O2 + O 2 (Eq. 2)

26 Introduction

L’H 2O2 engendre à son tour la production de ROS secondaires. Il y a ainsi formation • du radical hydroxyle (OH ), surtout en présence d’ions métalliques via la réaction de Fenton • (Eq. 3). Ce radical OH , extrêmement réactif et ayant un temps de vie très court, réagit rapidement avec des molécules appartenant à différentes classes, comme les acides nucléiques, les lipides, les protéines ou les hydrates de carbone.

2+ 3+ • - H2O2 + Fe  Fe + OH + OH (Eq. 3)

L’H 2O2 est également le substrat de peroxydases. Les myéloperoxydases sont des protéines localisées dans les granules azurophiles des neutrophiles. Elles catalysent une - réaction utilisant le chlorure et l’H 2O2 pour former de l’hypochlorite (OCl ) (Eq. 4), un agent antimicrobien puissant. Les lactoperoxydases ont été identifiées dans la salive, le lait et les larmes. Parmi leurs substrats on trouve l’iodure, le bromure ou encore le thiocyanate (Eq. 5- 7). Les produits formés grâce à l’action de cette enzyme ont des propriétés antimicrobiennes.

- - Cl + H2O2  OCl + H2O (Eq. 4)

- - I + H 2O2  OI + H 2O (Eq. 5)

- - Br + H 2O2  OBr + H 2O (Eq. 6)

- - SCN + H 2O2  OSCN + H 2O (Eq. 7)

• L’oxyde nitrique (NO ) est un radical généré par les NO synthases. Ce radical peut • - - réagir avec O 2 pour former le peroxynitrite (ONOO ) (Eq. 8), un oxydant très puissant.

• - • - O2 + NO  ONOO (Eq. 8)

Les ROS ont pendant longtemps été connus comme produits secondaires du transport des électrons par la chaîne des cytochromes. Dans les cellules phagocytaires les NADPH oxydases sont à l’origine de divers ROS intervenant dans l’élimination de pathogènes.

L’anion superoxyde produit par la NADPH oxydase est converti en H 2O2 par la SOD. En présence de la myéloperoxydase, l’H 2O2 réagit avec des ions chlorure pour former de

27 Introduction l’hypochlorite, toxique pour les bactéries. Les patients atteints de la maladie chronique granulomateuse, qui est due à une déficience en NADPH oxydase, souffrent notamment d’infections sévères et récurrentes (Assari, 2006). Depuis quelques années, il est clair que les • - ROS, surtout H 2O2 et O 2 , sont également impliqués dans la signalisation cellulaire (Martinon, 2010 ; Bartosz, 2009 ; Rhee, 2006 ; Forman et Torres, 2002). Les ROS semblent exercer leur effet via l’oxydation de la fonction thiol de résidus cystéine de protéines comme les phosphatases (surtout les tyrosine phosphatases), les protéines G, ainsi que certains canaux ioniques et facteurs de transcription. Cette oxydation des cystéines peut inactiver les protéines (par exemple les tyrosine phosphatases), elle peut parfois les activer (récepteurs de la ryanodine) ou elle peut entraîner un changement de leur conformation afin d’induire une dimérisation (protéines chaperones) (Bartosz, 2009). La production de ROS régule ainsi plusieurs réponses physiologiques comme l’angiogenèse, le tonus vasculaire, la croissance, la différenciation et la migration cellulaire (Martinon, 2010). Les ROS pourraient également jouer un rôle dans la libération de la cytokine IL-1β. Cruz et ses collaborateurs (2007) ont montré que dans les macrophages alvéolaires l’activation de la caspase-1, qui clive la pro-IL- 1β en IL-1β mature, en réponse à l’ATP est bloquée en présence d’un inhibiteur de la NADPH oxydase, le DPI . Cet inhibiteur bloque également la libération d'IL-1β en réponse à l’ATP ou à la nigéricine, un ionophore K +/H +, dans les monocytes humains (Hewinson et al., 2008). Le rôle des ROS dans l’inflammation est cependant controversé. En effet, des patients atteints de la maladie chronique ganulomateuse, caractérisée par une déficience en NADPH oxydase, présentent un phénotype inflammatoire et leurs monocytes ne montrent pas de diminution de l’activité de la caspase-1 ou de la sécrétion d’IL-1β (van de Veerdonk et al., 2010 ; Meissner et al., 2010).

I.2.2. Les systèmes antioxydants

La production excessive de ROS peut causer des dommages au niveau cellulaire, comme des mutations de l’ADN, l’inactivation de protéines et la mort cellulaire. Afin de contrer ce stress, divers systèmes enzymatiques antioxydants existent pour neutraliser les • - ROS en excès : la SOD produit du H 2O2 à partir d’O2 (Eq. 2), la glutathion peroxydase (Eq.

9) et la catalase (Eq. 10) éliminent l’H2O2.

28 Introduction

H2O2 + 2 GSH  2 H 2O + GS-SG (Eq. 9)

2 H 2O2  2 H 2O + O 2 (Eq. 10)

Un déséquilibre entre la formation des ROS et leur neutralisation entraîne un stress oxydatif, pouvant jouer un rôle dans des processus pathologiques tels que le vieillissement, l’hypertension, l’athérosclérose, le cancer, l’ischémie, les désordres neurodégénératifs et le diabète (Dröge et al., 2002). La figure 1.6 montre un aperçu des divers ROS produits et des principaux mécanismes d’élimination.

ONOO - OH + OH - OCl -

Fe 3+ PO M 2+ O Fe H 2 - NO Cl SOD LPO - - O2 O2 H2O2 OSCN - SCN H2O

C G

a S

t H a l G p a S e s H ro e x .

G S S G H2O + O 2 H2O

Figure 1.6 : Production et élimination des principaux ROS. •- L’anion superoxyde (O 2 ) est généré suite à la réduction de l’oxygène moléculaire (O 2). • •- - L’oxyde nitrique (NO ) réagit avec O 2 pour former le peroxynitrite (ONOO ). La • - dismutation d’O2 donne du peroxyde d’hydrogène (H 2O2) dans une réaction catalysée par la superoxyde dismutase (SOD). L’H 2O2 est le substrat de plusieurs réactions. En présence • d’ions métalliques il y a production d’OH à partir d’H2O2. Les myéloperoxydases (MPO) - utilisent le chlorure et l’H2O2 pour former de l’hypochlorite (OCl ), tandis que les - lactoperoxydases (LPO) utilisent comme substrats le thiocyanate (SCN ) et l’H 2O2. La glutathion peroxydase (GSH perox.) et la catalase peuvent éliminer l’H2O2 et former de l’eau.

29 Introduction

I.2.3. Les sources des ROS

• - La mitochondrie est considérée comme source principale d’O2 . Cet anion est formé au cours de la chaîne de transport d’électrons, lorsque certains électrons passent directement à l’oxygène moléculaire par une réduction mono-électronique. Ces électrons proviennent des complexes I et III de la chaîne respiratoire.

Plusieurs systèmes enzymatiques peuvent également intervenir dans la production de ROS, comme la NO synthase, la oxydase, ainsi que la NADPH oxydase, qui, contrairement aux précédentes, génère des ROS comme produit principal.

• Les NO synthases sont une famille d’enzymes capables d’oxyder un des azotes de • l’arginine pour former du NO et de la L-citrulline (Eq. 11).

+ • L-arginine + 2 NADPH + 2 O 2  L-citrulline + 2 NADP + 2 H 2O + NO (Eq. 11)

• La xanthine oxydase catalyse l’oxydation de l’hypoxanthine en xanthine (Eq. 12) et

ensuite en acide urique (Eq. 13), avec production concomitante d’H2O2.

Hypoxanthine + O 2 + H 2O  xanthine + H 2O2 (Eq. 12)

Xanthine + O 2 + H 2O  acide urique + H 2O2 (Eq. 13)

• La famille des NADPH oxydases est probablement la source enzymatique la plus importante de production de ROS. Ces enzymes ont d’abord été décrites dans les phagocytes (Babior, 1999), mais ont depuis été identifiées dans d’autres types de cellules ou de tissus • - (Yang et al., 2011). Les NADPH oxydases catalysent la réaction de production d’O2 par transfert d’un électron du NADPH sur l’oxygène (Eq. 14) :

• - + + 2 O 2 + NADPH  2 O 2 + NADP + H (Eq. 14)

Le complexe actif de la NADPH oxydase phagocytaire comprend plusieurs protéines : phox phox le cytochrome b 559 membranaire, composé des deux sous-unités gp91 /NOX2 et p22 , ainsi que diverses composantes cytosoliques. Suite à une stimulation, ces composantes

30 Introduction

cytosoliques se dirigent vers le cytochrome b 559 membranaire, où elles vont s’assembler en NADPH oxydase fonctionnelle. La sous-unité gp91 phox /NOX2 est la composante catalytique de la NADPH oxydase. Elle comprend six domaines transmembranaires et possède des motifs pour la liaison du NADPH et du FAD au niveau de l’extrémité C-terminale, ainsi que quatre histidines conservées au niveau des domaines transmembranaires, pouvant se lier à des groupements hémiques (Fig. 1.7) (Yang et al., 2011).

Figure 1.7 : La structure de la sous-unité gp91 phox /NOX 2. La sous-unité gp91 phox /NOX2 comprend six domaines transmembranaires, les domaines III et V possédant chacun deux histidines liant l’hème. Au niveau de l’extrémité C-terminale on retrouve des domaines de liaison pour le FAD et le NADPH. Les cercles plus larges représentent les acides aminés conservés chez les NOX1, NOX2, NOX3 et NOX4 humains (Bedard et Krause, 2007).

Associé à p22 phox au niveau de la membrane plasmique ou au niveau de la membrane de compartiments intracellulaires (vésicules sécrétoires, granules spécifiques), gp91 phox /NOX2 joue le rôle de transférase d’électrons, ces derniers passant du NADPH à l’oxygène, probablement via le FAD et les groupements hémiques. En absence de stimulation, deux complexes protéiques faisant partie des NADPH oxydases sont localisés au niveau du cytosol. Un des complexes est composé par p47 phox , désignée sous-unité organisatrice, par p67 phox , la sous-unité activatrice, et par p40 phox . Le deuxième complexe contient la GTPase

31 Introduction

Rac2 couplée à son inhibiteur Rho-GDI. Suite à une stimulation, Rac2 se dissocie de Rho- GDI, le GDP est échangé pour du GTP et Rac devient actif. La sous-unité p47 phox est phosphorylée, ce qui provoque un changement de conformation permettant son interaction avec p22 phox , entraînant avec elle p40 phox et p67 phox , et générant ainsi le complexe actif de la NADPH oxydase. Rac2 est également dirigé vers la membrane (Fig. 1.8) (Bedard et Krause, 2007).

Figure 1.8 : L’assemblage de la NADPH oxydase NOX2. A. Dans les granulocytes neutrophiles, gp91 phox /NOX2 et p22 phox sont localisés principalement au niveau de la membrane de vésicules intracellulaires, où ils sont associés. B. Suite à une stimulation, il y a échange entre le GDP et le GTP de Rac, menant à son activation. La sous-unité p47 phox est phosphorylée et peut ensuite interagir avec p22 phox au niveau de la membrane. Après activation les vésicules fusionnent avec la membrane plasmique ou la membrane du phagosome. Le complexe enzymatique actif transporte les •- électrons du NADPH cytosolique sur l’oxygène pour générer l’anion superoxyde O 2 (Bedard et Krause, 2007).

En plus de l’oxydase des phagocytes gp91 phox /NOX2, six autres isoformes ont été identifiées jusqu’à aujourd’hui : NOX1, 3, 4, 5 et Duox1 et 2 (Fig. 1.9). Les sous-unités NOX1-5 possèdent six domaines transmembranaires, des sites de liaison pour le NADPH et le FAD, ainsi que des histidines conservées. NOX1 est exprimé principalement au niveau du côlon. NOX3 et NOX4 sont surtout localisés au niveau de l’oreille interne et du rein, respectivement. NOX5, exprimé principalement au niveau des testicules et des nodules lymphatiques, comprend au niveau de son extrémité N-terminale un domaine avec quatre

32 Introduction motifs EF-hand permettant la fixation de calcium. Duox1 et Duox2 sont deux protéines initialement décrites dans les glandes thyroïdes, où elles interviennent dans la maturation des hormones thyroïdes (Dupuy et al., 1999 ; De Deken et al., 2000), mais dont l’expression a par la suite été mise en évidence dans d’autres tissus, parmi lesquels l’épithélium bronchique et les glandes salivaires (Geiszt et al., 2003). Les Duox possèdent un domaine transmembranaire supplémentaire et une longue extrémité N-terminale extracellulaire avec un domaine homologue aux peroxydases telle que la myéloperoxydase. Ce domaine permet à ces oxydases de produire de l’H 2O2. Au niveau des glandes salivaires et des muqueuses des voies aériennes les Duox participent au système lactoperoxydase/thiocyanate. En présence d’H 2O2 , la lactoperoxydase transforme SCN - en OSCN - qui participe à la défense antimicrobienne (Geiszt et al., 2003 ; Forteza et al., 2005). Au niveau de la première boucle intracellulaire les Duox comportent deux motifs EF-hand . La présence de ces motifs EF-hand chez NOX5 et 2+ chez les Duox1 et Duox2 suggère que ces enzymes sont régulées par les ions Ca (Bedard et Krause, 2007).

Figure 1.9 : Les différents membres de la famille des NOX/Duox. Les membres de la famille des NOX/Duox possèdent une extrémité C-terminale intracellulaire avec des sites de liaison au NADPH et au FAD. Les NOX1-5 comportent six domaines transmembranaires. NOX5 possède quatre domaines EF-hand pour la fixation du calcium au niveau de son extrémité N-terminale. Les Duox1/2 possèdent un segment transmembranaire supplémentaire avec une extrémité N-terminale extracellulaire contenant une séquence homologue à celle de la peroxydase. Ils possèdent également deux domaines EF-hand au niveau de la première boucle intracellulaire (Bedard et Krause, 2007).

33 Introduction

I.3. LA CYTOKINE INTERLEUKINE-1βββ (IL-1βββ)

I.3.1. L’IL-1βββ et ses effets

Les cytokines sont des substances peptidiques solubles, synthétisées par un grand nombre de cellules, qui se lient à des récepteurs spécifiques et entraînent divers effets. Parmi les différentes cytokines on retrouve la famille des interleukines (IL), divisée elle-même en sous-familles, sur base structurelle et fonctionnelle. L’IL-1β fait ainsi partie de la sous-famille de l’IL-1 comprenant onze membres parmi lesquels les plus étudiés sont les agonistes IL-18, IL-1α et IL-1β, et l’antagoniste du récepteur IL-1 ( IL-1 receptor antagonist , IL-1Ra). L’IL- 1α et l’IL-1β, les deux agonistes du récepteur de l’IL-1 ( IL-1 receptor 1 , IL-1R1), sont synthétisées sous forme de précurseurs de 31 kDa et sont ensuite clivées pour libérer la forme mature. La pro-IL-1α est clivée principalement par la calpaïne. Le précurseur et la forme mature sont tous les deux biologiquement actifs. L’IL-1α est localisée surtout au niveau intracellulaire où elle joue le rôle de messager autocrine. L’IL-1β est la forme prédominante au niveau de la circulation. Suite au clivage de la pro-IL-1β en IL-1β par la caspase-1, la cytokine devient active et est libérée par les cellules. L’IL-1β se lie au récepteur IL-1R1, qui recrute une protéine accessoire (IL-1R-AcP) formant ainsi un complexe qui va initier une cascade de signalisation. Un deuxième récepteur de l’IL-1β a été identifié, le récepteur IL- 1R2. La liaison de l’IL-1β à ce récepteur n’active pas de voie de signalisation intracellulaire (Dinarello et al., 2009 ; Dinarello et al., 2010).

L’IL-1R1 est une glycoprotéine transmembranaire possédant trois domaines extracellulaires semblables aux immunoglobulines (Ig). L’activation de ce récepteur est suivie de l’induction de l’expression de la cyclooxygénase 2, de la PLA 2 et de la NO synthase inductible, entraînant la production de la prostaglandine E2, du facteur activant les plaquettes et d’oxyde nitrique. Il en résulte l’apparition de fièvre, une diminution du seuil de la douleur, une vasodilatation et de l’hypotension. D’autres conséquences d’une stimulation d’IL-1R1 sont l’augmentation de l’expression de molécules d’adhésion, de protéines de la phase aiguë de l’inflammation et de cytokines, comme l’IL-6. L’IL-1β intervient également dans la différenciation des cellules T helper 17 (Dinarello et al., 2009 ; Dinarello et al., 2010).

34 Introduction

Plusieurs pathologies sont associées à une augmentation de la libération d’IL-1β. Elles sont dues soit à une mutation au niveau du gène codant pour un des composants de l’inflammasome NLRP3 provoquant une dysrégulation de ce complexe protéique impliqué dans le clivage de la pro-IL-1β en IL-1β mature, soit à l’activation de l’inflammasome NLRP3 par des signaux de danger, comme les cristaux d’urate monosodique, l’amyloïde β ou l’amiante (Hoffman et al., 2011 ; Mitroulis et al., 2010). Les mutations au niveau des gènes liés à l’inflammasome NLRP3 sont associées à différentes maladies autosomiques dominantes parmi lesquelles le syndrome de Muckle-Wells (Hoffman et al., 2001), caractérisé par de la fièvre et de l’arthralgie, le syndrome chronique, infantile, neurologique, cutané et articulaire (chronic, infantil, neurologic, cutaneous, articular syndrome ) (Aksentijevich et al., 2002), caractérisé par des méningites chroniques, de l’arthrite et de la fièvre, et le syndrome familial auto-inflammatoire au froid (familial cold autoinflammatory syndrome ) (Hoffman et al., 2001) ayant comme symptômes cliniques principaux de l’arthralgie et de la fièvre. Le rôle de l’IL-1β dans d’autres pathologies inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde est également bien établi (Kahle et al., 1992). La cytokine semble également être impliquée dans la pathogenèse du diabète de type 2 (Dinarello, 2011). Depuis plusieurs années, les recherches se sont ainsi tournées vers des substances bloquant les effets de l’IL-1β, soit en bloquant la cytokine elle-même, soit en empêchant sa fixation au niveau de son récepteur IL-1R1.

L’anakinra (Kineret ®) est une forme recombinante non-glycosylée de l’IL-1Ra. Autorisé en Europe depuis 2002, ce produit est utilisé par voie sous-cutanée dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, en association avec le méthotrexate. Le rilonacept (Arcalyst ®), également appelé piège à IL-1 ( IL-1 trap ), est une protéine de fusion recombinante dimérique qui contient les domaines extracellulaires d’IL-1R1 et IL-1R-AcP fusionnés avec la partie Fc de l’IgG1 humaine (Hoffmann et al., 2008). Le rilonacept fixe l’IL-1β et prévient ainsi sa liaison au récepteur IL-1R1. Ce produit a reçu une autorisation de mise sur le marché en Europe en 2009 pour le traitement d’un groupe de maladies auto-inflammatoires rares, les syndromes périodiques associés à la cryopyrine, un des composants de l’inflammasome NLRP3. Ceux-ci comprennent le syndrome familial auto-inflammatoire au froid, le syndrome chronique, infantile, neurologique, cutané et articulaire et le syndrome de Muckle-Wells. Le canakimumab (Ilaris ®), un anticorps monoclonal humain dirigé contre l’IL-1β, a une autorisation de mise sur le marché en Europe depuis 2009. Ses indications sont les syndromes périodiques associés à la cryopyrine. Les inhibiteurs de la caspase-1, qui est activée par

35 Introduction l’inflammasome NLRP3 et qui clive ensuite la pro-IL-1β en IL-1β mature, parmi lesquels le pralnacasan (VX-740) et VX-765, ont également un potentiel thérapeutique.

I.3.2. La synthèse de la pro-IL-1βββ

Différents facteurs d’inflammation et produits bactériens stimulent la transcription de l’IL-1β en activant des facteurs de transcription. L’IL-1β peut induire elle-même sa propre synthèse (Dinarello et al., 1987). Les LPS activent des récepteurs Toll like (Toll like receptors , TLR) qui sont homologues aux produits du gène Toll de la drosophile. La famille des récepteurs TLR humains comprend 10 membres, tandis que chez la souris 12 membres ont été mis en évidence. Les récepteurs TLR1-9 sont exprimés chez l’homme et chez la souris, le récepteur TLR10 est exprimé uniquement chez l’homme et les récepteurs TLR11-13 sont exprimés uniquement chez la souris. Les caractéristiques des récepteurs TLR10, TLR12 et TLR13 ne sont pas encore bien définies et leur fonction reste inconnue. Les récepteurs TLR sont des récepteurs membranaires caractérisés par un domaine extracellulaire comprenant des motifs répétitifs riches en leucine ( leucine rich repeat , LRR), responsable de la reconnaissance des pathogènes, et un domaine cytosolique homologue à celui des récepteurs IL-1R1, appelé domaine homologue Toll/IL-1R (TIR) et responsable de la transduction du signal. Les récepteurs TLR sont situés au niveau de la membrane plasmique (TLR1,-2,-4,-5,- 6,-11) ou au niveau de la membrane des endosomes (TLR3,-7,-8,-9). Ces récepteurs sont activés par différents motifs structuraux associés aux pathogènes ou aux signaux de danger (pathogen associated molecular pattern , PAMP ou damage/danger associated molecular pattern , DAMP) (Fig. 1.10) (Kumar et al., 2011).

36 Introduction

Figure 1.10 : La famille des récepteurs TLR avec leurs principaux ligands. Les récepteurs TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 et TLR11 sont situés au niveau de la membrane plasmique. Le récepteur TLR2, en combinaison avec le récepteur TLR1 ou TLR6, est essentiel pour la reconnaissance des lipopeptides microbiens. Le récepteur TLR5 est activé par la flagelline et le récepteur TLR4 est le récepteur des LPS. Le récepteur TLR11, exprimé chez la souris, reconnaît des molécules ressemblant à la profiline de Toxoplasma gondii et des composants de bactéries uropathogènes. Les récepteurs TLR endosomiaux sont les récepteurs TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9. Le récepteur TLR3 reconnaît l’ARN viral double brin (dsRNA), les récepteurs TLR7 et 8 ont comme ligand l’ARN simple brin (ssRNA) et le récepteur TLR9 est activé par l’ADN riche en motifs -phosphate- (CpG). Modifié d’après Takeda et Akira (2005).

Les LPS stimulent la synthèse de pro-IL-1β via l’activation des récepteurs TLR4. Ils se lient à une protéine soluble liant les LPS, la LBP ( LPS binding protein ). Ce complexe se lie alors au CD14, situé au niveau de la membrane plasmique, avant d’activer le récepteur TLR4. La protéine MD-2 intervient également dans l’activation du récepteur TLR4 par les LPS (Lu et al., 2008). La stimulation du récepteur TLR4 active plusieurs voies de signalisation intracellulaires menant à l’activation de différents facteurs de transcription (NF-κB, AP-1, IRF3) et à la synthèse subséquente de cytokines et chimiokines. La voie dépendant de MyD88 implique les protéines IRAK et TRAF. Cette voie, par l’intermédiaire du complexe TAK1/TAB1/TAB2/TAB3, mène soit à l’activation d’AP-1, via des protéines kinases

37 Introduction activées par des mitogènes (MAPK), soit à l’activation de NF-κB, via des kinases d’I κB ( IκB kinases , IKK). En condition basale, NF-κB interagit avec une protéine inhibitrice appelée IκB et est localisé dans le cytosol. Après activation du récepteur TLR4 les IKK phosphorylent IκB qui est ubiquitinylé et ensuite dégradé par le protéasome. Ceci libère NF-κB qui migre vers le noyau et induit la transcription de ses gènes cibles dont le gène de l’IL-1β (Fig. 1.11) (Kawai et Akira, 2006).

LPS

TLR4/MD-2 CD14

Figure 1.11 : L’activation du facteur de transcription NF-kB par les LPS. Après activation par les LPS, le récepteur TLR4 active des voies de signalisation dépendant de MyD88 et de TRIF. Les protéines TIRAP/Mal sont nécessaires pour l’activation des voies dépendant de MyD88. Cette protéine adaptatrice recrute IRAK4 et TRAF6 suite à une stimulation. TRAF6 active le complexe TAK1/TAB1/TAB2/TAB3 par ubiquitinylation. Il y a ensuite activation du complexe IKK qui va phosphoryler I κB, menant à sa dégradation subséquente. Ceci permet la translocation de NF-κB vers le noyau et la synthèse de cytokines pro-inflammatoires dont l’IL-1β. Modifié d’après Kawai et Akira (2006).

38 Introduction

I.3.3. Le clivage de la pro-IL-1βββ et la libération d’IL-1βββ mature

Avant sa libération dans le milieu extracellulaire, la pro-IL-1β est clivée par l’enzyme de conversion d’IL-1, appelée également caspase-1, au niveau de l’aspartate en position 116 en sa forme active de 17 kDa. Cette cystéine protéase fait partie de la famille des caspases. La caspase-1 possède plusieurs substrats de la famille des interleukines, parmi lesquels la pro-IL- 1β, la pro-IL-18 (Ghayur et al., 1997), la pro-IL-33 (Schmitz et al., 2005) et l’IL-1F7b (Kumar et al., 2002). Elle est synthétisée sous forme de précurseur inactif de 45 kDa. Suite à un stimulus il y a clivage de l’extrémité C-terminale de la pro-caspase-1 avec la libération de sous-unités de 10 et 20 kDa. Les sous-unités vont s’assembler en tétramère, composé de deux sous-unités de 20 kDa et de deux sous-unités de 10 kDa, capable de cliver la pro-IL-1β en IL- 1β.

En 2002, le groupe de Tschopp a utilisé le terme « inflammasome » pour décrire un large complexe multiprotéique d’environ 700 kDa, formé sous certaines conditions et qui intervient dans l’activation de la caspase-1 (Martinon et al., 2002). Plusieurs types d’inflammasomes ont été identifiés, possédant des composants différents et activés par différents signaux. L’inflammasome NLRP3, le plus étudié, est activé par des substances endogènes, telles que l’ATP, l’amyloïde β, les cristaux d’urate de sodium ou de pyrophosphate de calcium dihydraté, ou par des substances exogènes parmi lesquelles l’aluminium, l’amiante, la silice, l’irradiation UV, les produits dérivés de bactéries ou de virus et les produits fongiques (Davis et al., 2011). Différentes toxines bactériennes activent cet inflammasome (Gurcel et al., 2006 ; Craven et al., 2009) et récemment il a été montré que plusieurs antibiotiques (néomycine, polymyxine B, gramicidine et tyrothricine) entraînent une sécrétion d’IL-1β via l’activation de l’inflammasome NLRP3 (Allam et al., 2011). Les mécanismes exacts de la formation de l’inflammasome, de l’activation de la caspase-1 et de la sécrétion d’IL-1β ne sont pas encore entièrement élucidés. Une interaction directe entre les stimuli et l’inflammasome semble peu probable étant donné les divergences entre leurs structures et leurs propriétés. Un événement cytosolique commun pourrait plutôt être à l’origine de l’activation de l’inflammasome. Trois modèles ont été proposés pour expliquer les mécanismes d’activation de ce complexe protéique (Fig. 1.12) (Jin et Flavell, 2010 ; Bauernfeind et al., 2011 ; Schroder et Tschopp, 2010 ; Davis et al., 2011). La production de ROS semble jouer un rôle dans cette activation. En effet, plusieurs activateurs de

39 Introduction l’inflammasome entraînent la production de ces espèces réactives, et l’inhibition de la production de ROS ou leur neutralisation par des antioxydants supprime l’activation de l’inflammasome. Ce modèle reste cependant controversé (voir partie I.2.1). Le deuxième + modèle suggère que l’efflux de K , suite à l’activation du récepteur P2X 7 ou suite à l’action de toxines formant des pores, intervient dans l’activation de l’inflammasome. L’efflux de K+ est responsable de l’activation de l’inflammasome en réponse à plusieurs antibiotiques (Allam et al., 2011). Il a été montré que cette activation est inhibée dans un milieu extracellulaire riche en K +. La nigéricine, un échangeur H +/K + entraînant la sortie du K + intracellulaire, provoque également l’activation de la caspase-1 et la libération d’IL-1β. Enfin, un troisième modèle propose que l’inflammasome est activé en réponse à des dommages des lysosomes dus à la capture et l’ingestion de cristaux ou de particules (par exemple l’urate de sodium, la silice, l’amiante). Le contenu des lysosomes est ainsi libéré, dont la protéase cathepsine B qui pourrait activer l’inflammasome. L’inhibition de la cathepsine B par le CA-074 diminue l’activation de la caspase-1. Cependant, dans des macrophages déficients en cathepsine B, une activation de l’inflammasome est observée en réponse à des stimuli. La spécificité du CA-074 a donc été mise en doute, et d’autres protéases pourraient être la cible de cet inhibiteur et engendrer l’activation de l’inflammasome.

Une stimulation des récepteurs P2X 7 entraîne l’activation de la caspase-1 et la sécrétion subséquente d’IL-1β, suite à l’efflux de K+ (Kahlenberg et Dubyak, 2004). Ces récepteurs sont également impliqués dans la production de ROS, suite à la stimulation de la NADPH oxydase (Parvathenani et al., 2003). L’inhibition de la production de ROS bloque l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β mature en réponse à l’ATP (Cruz et al., 2007 ; Hewinson et al., 2008). La pannexine-1 semble également jouer un rôle dans l’activation de l’inflammasome en réponse aux récepteurs P2X 7 car l’inhibition de cette protéine bloque l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β mature en réponse à l’ATP ainsi qu’à la maitotoxine et la nigéricine (Pelegrin et Surprenant, 2006 ; Pelegrin et

Surprenant, 2007 ; Pelegrin et al., 2008). Les récepteurs P2X 7 sont couplés à l’activation de différentes phospholipases et plusieurs études ont suggéré l’implication de la iPLA 2 dans l’activation de la caspase-1 (Walev et al., 2000 ; Andrei et al., 2004 ; Kahlenberg et

Dubyak, 2004). Ces études sont basées sur l’utilisation du BEL, un inhibiteur de la iPLA 2 en présence duquel l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β sont bloquées. Cependant, en 2009, Franchi et ses collègues ont montré que l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β en réponse à l’ATP ou à des stimuli bactériens n’étaient pas affectées dans des

40 Introduction

macrophages déficients en iPLA 2. Dans ces macrophages, la sécrétion d’IL-1β était inhibée en présence de BEL ainsi que de trois inhibiteurs de sérine protéases. Les auteurs proposent que le BEL exerce son effet inhibiteur via des sérine protéases plutôt que via la iPLA 2 (Franchi et al., 2009).

Figure 1.12 : L’activation de l’inflammasome NLRP3 entraîne le clivage de la pro-IL-1βββ en IL-1βββ mature et sa sécrétion subséquente. Après un premier stimulus l’activation de facteurs de transcription entraîne l’expression de la pro-IL-1β et de NLRP3 ( priming step ). Trois modèles ont été proposés afin d’expliquer les mécanismes d’activation de l’inflammasome NLRP3 ( activation step ) menant au clivage de la pro-IL-1β par la caspase-1 et à la libération subséquente de la cytokine. L’efflux de potassium, en réponse à l’activation du récepteur P2X 7 ou à des toxines formant des pores active l’inflammasome. D’autre part la production de ROS suite à de nombreux stimuli mène à l’activation de NLRP3. Enfin, la désintégration des lysosomes suite à l’ingestion de divers cristaux ou particules entraîne la libération de plusieurs enzymes lysosomiales et l’activation subséquente de l’inflammasome (Bauernfeind et al., 2011).

41 Introduction

Suite au clivage de la pro-IL-1β en IL-1β mature, la cytokine est libérée par les cellules dans le milieu extracellulaire. Les mécanismes exacts de la sécrétion d’IL-1β ne sont pas encore élucidés. La plupart des protéines sécrétées suivent la voie classique de sécrétion, via le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi (Halban et Irminger, 1994). Cependant, certaines protéines, telle l’IL-1β, ne possèdent pas de séquence signal et sont donc sécrétées via un mécanisme non-classique, indépendant du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi. Différents modèles ont ainsi été proposés afin d’expliquer les mécanismes de libération de l’IL-1β : l’exocytose de lysosomes sécrétoires, la libération de microvésicules de la membrane plasmique, l’exocytose d’exosomes, l’exportation via des transporteurs membranaires spécialisés ou encore la libération suite à la lyse cellulaire (Eder, 2009).

I.4. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DE LA FAMILLE DES CATHELICIDINES

I.4.1. Les peptides antimicrobiens

Nos épithélia sont constamment exposés à des pathogènes potentiels. La réponse de l’immunité adaptative à ces agressions est généralement très efficace. Cependant, cette adaptation est lente et nécessite un certain délai. Afin d’éviter la multiplication excessive des pathogènes, l’immunité innée intervient afin de bloquer, ou au moins de ralentir, la progression de l’infection. Cette réponse rapide est due à la reconnaissance de motifs structuraux associés aux pathogènes par des cellules spécialisées, comme les cellules présentatrices d’antigènes. Les peptides antimicrobiens font également partie de l’immunité innée. Ce sont des peptides endogènes, synthétisés par différents types de cellules, et qui possèdent une activité bactériostatique ou bactéricide. Ils sont également actifs contre des champignons et certains virus enveloppés. Leur rôle a été élargi ces dernières années, on a notamment établi que ces peptides sont également des modulateurs de la réponse immunitaire.

Chez les mammifères on peut identifier deux principales familles de peptides antimicrobiens, les cathélicidines (Bals et Wilson, 2003) et les défensines (Ganz, 2003). D’autres peptides à propriétés antimicrobiennes ont également été décrits chez l’homme, comme par exemple les histatines, peptides salivaires riches en résidus histidine (Kavanagh et

42 Introduction

Dowd, 2004), ou encore la lactoferricine, peptide cationique présent dans le lait, la salive et les larmes (Gifford et al., 2005).

I.4.2. Les cathélicidines

La famille des peptides antimicrobiens qui nous intéresse le plus est celle des cathélicidines, peptides comprenant dans leur structure un domaine hautement conservé, le domaine cathéline (Zanetti et al., 1995). La cathéline a d’abord été identifiée dans les leucocytes du cochon (Ritonja et al., 1989) et possède une activité inhibitrice de la cystéine protéase cathepsine L, d’où elle tient son nom ( cathe psin L in hibitor ). Ce domaine cathéline, long d’environ 100 acides aminés, est entouré par une séquence signal d’une trentaine d’acides aminés du côté N-terminal, et par une région C-terminale variable, ayant des propriétés antimicrobiennes. Le domaine cathéline a été bien conservé au cours de l’évolution et montre une homologie inter-espèces de 75 à 100 %. Au niveau de ce domaine, quatre résidus cystéine forment deux ponts disulfures intramoléculaires. Selon Zaiou et ses collègues (2003), le domaine cathéline possèderait également une activité antimicrobienne.

La structure des cathélicidines varie d’une espèce à l’autre. Chez l’homme, une seule cathélicidine a été découverte : hCAP18. Le nom hCAP18 provient de la masse du pré- propeptide, contenant la séquence signal, le domaine cathéline et l’extrémité C-terminale à propriétés antimicrobiennes, d’environ 18 kDa, ainsi que de son caractère cationique ( human cationic antimicrobial peptide). Le gène codant pour hCAP18, CAMP, est situé au niveau du chromosome 3, au locus p21, et est composé de 4 exons (Fig. 1.13). Les exons 1 à 3 codent pour la séquence signal ainsi que pour le domaine cathéline, tandis que l’exon 4 code pour le peptide antimicrobien. Le clivage du propeptide hCAP18 par la protéinase-3 ou par l’élastase libère le LL-37 (Sorensen et al., 2001 ; Gudmundsson et al., 1996). Ce peptide a une taille de 37 acides aminés et sa séquence commence avec deux leucines (Fig. 1.13). hCAP18 est exprimé principalement dans les granulocytes neutrophiles, où il est stocké dans des granules spécifiques, à une concentration de 40 µM (Sorensen et al., 1997). Suite à la libération dans le milieu extracellulaire le peptide est clivé par la protéinase-3, elle-même stockée dans les granules azurophiles des neutrophiles avant sa libération (Sorensen et al., 2001). La cathélicidine humaine est exprimée également dans d’autres cellules du système immunitaire

43 Introduction tels que les macrophages, dans des cellules épithéliales de différents tissus (poumons, tractus gastro-intestinal, peau, tractus génital) et dans des liquides corporels comme la sueur, le lait maternel et la salive (Zanetti et al., 2004). Dans le vagin, la gastricsine libère un peptide de 38 acides aminés, ALL-38 (Sorensen et al., 2003). Il a été montré que dans la sueur humaine le LL-37 peut être dégradé par différentes kallikréines en peptides plus petits, comme le RK-31, le KS-30 et le KR-20 (Murakami et al., 2004 ; Yamasaki et al., 2006).

Figure 1.13 : Structure du gène et du pré-propeptide, et séquence des peptides antimicrobiens de l’homme et de la souris. De haut en bas : structure globale du gène, formé de quatre exons, et du pré-propeptide, contenant une séquence signal, un domaine cathéline et la partie C-terminale à propriétés antimicrobiennes (AMP) ; séquence du peptide antimicrobien humain (hCAP18/LL-37) et de souris (CRAMP).

Le peptide antimicrobien de souris est appelé CRAMP ( cathelin-related antimicrobial peptide ). Son gène a été cloné à partir de la moelle osseuse par Gallo et ses collaborateurs en 1997. Le gène codant pour CRAMP se situe au niveau du chromosome 9 et il est formé de 4 exons comme son homologue humain. Le pré-propeptide est formé de 173 acides aminés (~19 kDa). Deux sites de clivage potentiels ont été mis en évidence, en position 134 et en position 139 (Gallo et al., 1997). En 2001, le groupe de Gallo a purifié le peptide mature de 34 acides aminés (Fig. 1.13) (Pestonjamasp et al., 2001). Comme son homologue humain, le CRAMP n’est pas seulement exprimé dans les cellules du système immunitaire, tels les granulocytes

44 Introduction neutrophiles ou les macrophages, mais également dans les glandes salivaires et les glandes mammaires ainsi que dans d’autres organes comme l’intestin, la rate, les testicules et l’estomac (Gallo et al., 1997 ; Murakami et al., 2002 ; Rosenberger et al., 2004 ; Murakami et al., 2005).

I.4.2.1. La régulation de l’expression des cathélicidines

Les cathélicidines sont exprimées constitutivement, surtout au niveau des granulocytes neutrophiles, ou elles peuvent voir leur expression induite dans certaines cellules ou tissus suite à divers stimuli (Zanetti, 2005). L’expression de ces peptides peut être influencée par l’âge et la maturation sexuelle. Par exemple, le peptide CRAMP est exprimé fortement au niveau de l’épithélium de l’intestin grêle de jeunes souriceaux. La présence du peptide est limitée aux deux premières semaines après la naissance et diminue ensuite graduellement (Ménard et al., 2008). Chez l’adulte, l’expression de plusieurs peptides est augmentée suite à des blessures ou infections. Dorschner et ses collègues (2001) ont montré que l’expression des cathélicidines au niveau des kératinocytes est induite en réponse à l’incision de la peau ou à une infection par Staphylococcus aureus. L’infection par Helicobacter pylori induit également l’expression du gène CAMP dans les cellules épithéliales gastriques (Hase et al., 2003). L’expression de la cathélicidine humaine repose sur l’acétylation des histones et l’action de la vitamine D 3. Le butyrate et la trichostine A, deux inhibiteurs de l’histone désacétylase, augmentent l’expression de la cathélicidine dans les cellules gastro-intestinales et dans les cellules épithéliales de poumon (Kida et al., 2006 ; Schauber et al., 2004). La vitamine D 3, synthétisée au niveau de la peau sous l’action des rayons UV-B à partir de 7- déhydrocholestérol, subit deux hydroxylations successives pour produire la forme active de la vitamine D 3, le calcitriol (1,25-dihydroxyvitamine D 3). La première réaction est catalysée par des enzymes hépatiques microsomales et mitochondriales (Holick, 2007), parmi lesquelles le

CYP27A1 est l’enzyme majeure. Le calcidiol (25-hydroxyvitamine D 3) est ensuite métabolisé par le CYP27B1 en calcitriol. Ce dernier se lie au récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR), qui va former un hétérodimère avec le récepteur aux rétinoïdes (RXR). Le dimère VDR-RXR se lie ensuite à l’élément de réponse à la vitamine D (VDRE) au niveau de l’ADN, ce qui conduit à la dissociation de répresseurs et au recrutement de coactivateurs de la transcription (Margolis et Christakos, 2010). Wang et ses collaborateurs (2004) ont montré que l’exposition de monocytes, neutrophiles et kératinocytes au calcitriol augmente la

45 Introduction transcription du gène de la cathélicidine. Ils ont également décrit la présence d’un VDRE en amont du gène de la cathélicidine. Ces résultats ont été confirmés dans plusieurs types de cellules (Gombart et al., 2005 ; Liu et al., 2006 ; Dai et al., 2010). Au niveau des kératinocytes, l’acétylation des histones amplifie la régulation de l’expression de la cathélicidine LL-37 par la vitamine D 3 (Schauber et al., 2008).

I.4.2.2. La structure des cathélicidines

Le LL-37 et le CRAMP possèdent des structures assez proches. Ils sont composés d’un grand nombre d’acides aminés basiques (lysine et arginine). La charge nette des deux peptides à pH physiologique est de + 6. Le CRAMP possède 29 % de résidus hydrophobes tandis que pour le LL-37 cette valeur est égale à 35 %. Les peptides antimicrobiens forment des structures secondaires amphipathiques avec un côté cationique et un côté hydrophobe. En présence de bicouches phospholipidiques ou de micelles de phospholipides, le LL-37 adopte préférentiellement une hélice α (Fig. 1.14) , comme démontré par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, par dichroïsme circulaire et par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) (Seil et al., 2010). La structure du peptide murin CRAMP a été analysée par spectroscopie RMN et par dichroïsme circulaire par Yu et ses collaborateurs (2002). Selon ces analyses, le CRAMP formerait une hélice α amphipathique en solution trifluoroéthanol/eau, dans des micelles et liposomes, mais possèderait une structure aléatoire en solution aqueuse.

Figure 1.14 : Structure secondaire du LL-37. Modèle représentant la structure secondaire en hélice α de LL-37. En bleu : acides aminés chargés positivement, en rouge : acides aminés chargés négativement, en brun : acides aminés hydrophobes, en vert : acides aminés neutres hydrophiles (Nagaoka et al., 2005).

46 Introduction

I.4.2.3. Les propriétés antimicrobiennes des cathélicidines

Les cathélicidines sont exprimées au niveau de sites constituant une barrière contre l’environnement extérieur, comme les épithélia respiratoires et intestinaux, la salive et la peau. Ils y forment un mécanisme de défense de première ligne de l’immunité innée contre les agressions (Zanetti, 2005). Ces peptides sont actifs contre les bactéries à Gram négatif et à Gram positif (Gennaro et Zanetti, 2000 ; Travis et al., 2000), les champignons (Shin et al., 2000), certains parasites (Giacometti et al., 1999) et virus enveloppés (Gordon et al., 2005). L’importance de ces peptides comme substances antimicrobiennes a été renforcée par des expériences réalisées sur des animaux transgéniques. Salmonella typhimurium survit ainsi mieux dans les macrophages de souris déficientes en CRAMP que dans les macrophages de souris de type sauvage (Rosenberger et al., 2004). Ces souris déficientes en CRAMP sont également plus susceptibles à des infections de la peau causées par Staphylococcus aureus (Braff et al., 2005), à des infections par méningocoques du système nerveux central (Bergman et al., 2006) et à des infections du tractus urinaire (Chromek et al., 2006). Des peptides de familles différentes peuvent agir en synergie (Yan et Hancock, 2001). Par exemple, le LL-37 agit en synergie avec les β-défensines pour éliminer les streptocoques du groupe B (Dorschner et al., 2003). L’activité des peptides antimicrobiens dépend de la composition ionique du milieu (Dürr et al., 2006).

L’activité antimicrobienne est exercée via l’interaction du peptide, possédant des acides aminés chargés positivement, avec la paroi des bactéries, présentant des charges négatives. Les résidus hydrophobes des peptides affectent la structure et l’intégrité de la membrane des bactéries ce qui peut finalement mener à la lyse de la bactérie. Le mécanisme exact de cette interaction entre les peptides antimicrobiens et les membranes microbiennes n’est pas totalement élucidé mais plusieurs théories existent : le modèle « en douve de tonneaux » ( barrel stave ), le modèle « des pores torroïdaux » ( toroidal-pore ) et le modèle « tapis » ( carpet-like ) (Fig. 1.15) (Brogden, 2005). Dans le modèle toroidal-pore les hélices peptidiques s’intègrent dans la membrane et induisent les phospholipides à se plier de manière à constituer un pore dont les parois sont formées par les parties polaires des peptides et les groupements polaires des phospholipides. Dans le modèle carpet-like, les peptides couvrent la membrane cellulaire formant une sorte de tapis. L’intégrité de la membrane est alors détruite suite à la déstabilisation de la bicouche phospholipidique, ce qui mène éventuellement à la

47 Introduction formation de micelles. Le modèle barrel stave implique la formation de canaux transmembranaires, avec les domaines hydrophobes des peptides antimicrobiens se situant en face de la partie lipidique des membranes. Un pore, avec les parties hydrophiles des peptides tournées vers l’intérieur du pore, est ainsi formé à travers la membrane. Le LL-37 se lie à la membrane des bactéries et forme une hélice α avec un côté cationique et un côté hydrophobe. Il a été suggéré que le peptide perméabilise la membrane bactérienne par le modèle carpet- like ou par le modèle toroidal-por e (Oren et al., 1999 ; Henzler-Wildman et al., 2003 ; Henzler Wildman et al., 2004). Le LL-37 se lie également aux LPS des bactéries à Gram négatif et neutralise ainsi certains de leurs effets (Larrick et al., 1995).

Figure 1.15 : Les différents modèles d’action des peptides antimicrobiens. A. Dans le modèle toroidal-pore les peptides s’agrègent et induisent les phospholipides membranaires à se plier jusqu’à la formation d’un pore, dont les parois internes sont formées à la fois par les parties hydrophiles des peptides et par les groupements polaires des phospholipides. B. Dans le modèle carpet-like les peptides sont orientés parallèlement à la membrane de manière à former une sorte de tapis. L’intégrité de la membrane est alors détruite et des micelles se forment. C. Dans le modèle barrel stave les peptides s’insèrent dans la membrane de manière à ce que les parties hydrophobes du peptide s’alignent à la partie lipidique des membranes tandis que la partie hydrophile est tournée vers l’intérieur du pore formé. Les parties hydrophiles et hydrophobes des peptides sont colorées respectivement en rouge et en bleu. Modifié d’après Brogden (2005).

48 Introduction

I.4.2.4. Les effets des cathélicidines sur les cellules eucaryotes

Outre leurs propriétés antimicrobiennes, les peptides antimicrobiens agissent comme immunomodulateurs. Le LL-37 exerce un effet chimiotactique pour les neutrophiles, les monocytes et les lymphocytes T. Il a été suggéré que cet effet est secondaire à la liaison du LL-37 au récepteur des peptides formylés FPR2/ALX2, appelé anciennement FPRL1, couplé aux protéines G (Yang et al., 2000). Comme le LL-37, le peptide murin CRAMP est chimiotactique pour les granulocytes neutrophiles, les monocytes et les macrophages, suite à l’activation du récepteur FPR2/ALX2 et de son homologue murin, le récepteur FPR-2, (Kurosaka et al., 2005). Ces peptides antimicrobiens contribuent ainsi à la réponse immunitaire en recrutant des cellules inflammatoires qui expriment un récepteur FPR2/ALX2 fonctionnel. L’activation de FPR2/ALX2 par le LL-37 est également responsable des effets anti-apoptiques du peptide sur les neutrophiles (Nagaoka et al., 2006). Le peptide augmente l’angiogenèse en interagissant avec les récepteurs FPR2/ALX2 des cellules endothéliales (Koczulla et al., 2003). Deux autres récepteurs couplés aux protéines G ont été liés au LL-37. Le peptide diminue de manière sélective l’expression en surface du récepteur des chimiokines CXCR2 des neutrophiles humains, et reproduit toutes les réponses couplées à ce récepteur, suggérant qu’il s’agit d’un agoniste (Zhang et al., 2009). Brandenburg et ses collaborateurs

(2010) ont observé que le LL-37 active le récepteur purinergique P2Y 11 des cellules gliales. Cette interaction provoque l’expression de diverses cytokines et l’activation de voies de phosphorylation (Brandenburg et al., 2010). Selon Elssner et ses collègues (2004), le LL-37 interagit avec un autre sous-type des récepteurs purinergiques, les récepteurs P2X 7. Ce groupe a décrit que le peptide provoque une libération d’IL-1β dans les monocytes humains stimulés par des LPS, via l’activation du récepteur P2X 7 (Elssner et al., 2004). Récemment,

Montreekachon et ses collaborateurs (2011) ont montré l’implication du récepteur P2X 7 dans l’augmentation de l’expression de l’IL-8 en réponse au LL-37 dans des fibroblastes gingivaux humains. La capacité des cathélicidines à activer les récepteurs P2X 7 semble être corrélée à leur capacité à former une hélice α et à agréger (Tomasinsig et al., 2008). Le LL-37 augmente également la prolifération cellulaire, la cicatrisation (Heilborn et al., 2003 ; Shaykhiev et al., 2005), et entraîne la prolifération tumorale (Coffelt et al., 2008 ; Coffelt et al., 2009 ; von Haussen et al., 2008 ; Weber et al., 2009). Le mécanisme impliqué dans cette réponse pourrait être secondaire à l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G pas encore caractérisé, responsable de l’activation d’une métalloprotéase transmembranaire faisant partie de la

49 Introduction famille ADAM (Ohtsu et al., 2006). L’activation de cette protéase contribuerait au clivage de ligands pouvant par la suite activer le récepteur du facteur de croissance épidermique et ainsi promouvoir la prolifération cellulaire (Tjabringa et al., 2003).

I.5. LES MACROPHAGES

Le premier modèle cellulaire utilisé dans le cadre de ces travaux est un modèle de macrophages péritonéaux. A part leur rôle dans la phagocytose, ces cellules du système immunitaire sont responsables de la sécrétion de divers produits dont les cytokines. Les macrophages péritonéaux sont souvent utilisés en recherche car ils peuvent être assez facilement isolés en grande quantité par lavage péritonéal, surtout après stimulation par un agent inflammatoire tel le thioglycollate.

I.5.1. Historique

Le terme macrophage a été employé pour la première fois au 19 ème siècle par Élie Metchnikoff afin de décrire des grosses cellules capables d’ingérer des microorganismes. Pour sa découverte il a obtenu en 1908 le prix Nobel de physiologie et de médecine, avec Paul Ehrlich (Tan et Dee, 2009). Plus tard, en 1924, Aschoff a inclus les macrophages dans le système réticulo-endothélial appelé également système réticulohistiocytaire (Auger et Ross, 1992). Actuellement, le terme de système réticulo-endothélial est remplacé par celui de système des phagocytes mononucléés (Van Furth et al., 1972). Ce terme regroupe les monoblastes, les pro-monocytes, les monocytes périphériques sanguins et les macrophages tissulaires.

I.5.2. Origine et différenciation

Les cellules du système des phagocytes mononucléés proviennent de cellules souches pluripotentes de la moelle osseuse qui se différencient ensuite. Cette prolifération et différenciation nécessitent la présence de différents facteurs de croissance, tels que l’IL-6,

50 Introduction l’IL-3 et les facteurs GM-CSF ( granulocyte macrophage colony stimulating factor ) et M-CSF (macrophage colony stimulating factor, appelé aussi CSF-1). Sous l’influence de ces facteurs de croissance, les cellules souches pluripotentes prolifèrent et vont évoluer successivement en monoblastes, pro-monocytes, puis en monocytes. Les monocytes quittent la moelle osseuse et entrent dans le sang périphérique, où ils restent environ 24 heures avant de se diriger vers les tissus. Quand ils quittent les vaisseaux sanguins les monocytes adhèrent d’abord à l’endothélium vasculaire via des molécules d’adhésion exprimées à leur surface qui se lient aux molécules de surface des cellules endothéliales. Suite à leur attachement à l’endothélium, les monocytes peuvent traverser celui-ci et atteindre les tissus. Ils s’y différencient en macrophages résidents, et peuvent y demeurer plusieurs mois (Fig. 1.16) (Mosser et Edwards, 2008). On peut distinguer plusieurs populations de macrophages, notamment les macrophages péritonéaux, les cellules de Kupffer dans le foie, les cellules de Langerhans au niveau de la peau, les macrophages alvéolaires et les cellules de la microglie.

Figure 1.16 : Origine et différenciation des macrophages. Les monocytes sont originaires d’une cellule souche hématopoïétique commune (HSC) de la moelle osseuse. En réponse à des facteurs de croissance ces précurseurs se divisent et se différencient en monoblastes, pro-monocytes avant de devenir des monocytes. Ces derniers quittent la moelle osseuse et entrent dans le sang périphérique. Ils migrent ensuite vers différents tissus ou ils deviennent des macrophages spécifiques. Modifié d’après Mosser et Edwards (2008).

51 Introduction

I.5.3. Morphologie

Les macrophages sont de grandes cellules de diamètre de 25 à 50 µm. Ce sont des cellules mononucléés avec un noyau excentrique de forme ronde ou réniforme. Ils possèdent un cytoplasme abondant dans lequel on trouve de nombreuses mitochondries et des lysosomes. Le cytosquelette du macrophage, formé de microtubules et de microfilaments d’actine, permet sa locomotion de même que la formation de pseudopodes lors de la phagocytose (Auger et Ross, 1992).

A la surface des macrophages on retrouve différentes molécules, telles que des récepteurs et des molécules d’adhésion. Des récepteurs de la partie Fc des Ig, surtout des IgG et des IgE, y sont localisés. Ils sont responsables de l’adhésion et de la phagocytose subséquente de particules recouvertes d’anticorps. Un autre groupe de récepteurs impliqués dans la phagocytose par le macrophage sont les récepteurs des molécules du complément (May et Machesky, 2001). A la surface des macrophages on peut également distinguer des récepteurs pour de nombreux facteurs de croissance et cytokines. Les lipoprotéines de faible densité sont reconnues par les récepteurs des lipoprotéines et par les récepteurs Scavenger , qui sont notamment impliqués dans la reconnaissance de pathogènes (Greaves et Gordon, 2009). Les macrophages expriment plusieurs membres de la famille des récepteurs TLR, dont le récepteur TLR4, ainsi que le CD14. Pour permettre leur adhésion aux cellules environnantes et à la matrice extracellulaire les macrophages possèdent des sélectines et des intégrines. Des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité I et II sont exprimées par les macrophages, afin de permettre la présentation des antigènes aux lymphocytes T.

I.5.4. Rôles dans l’immunité

Les macrophages sont des cellules immunitaires distribuées au niveau de différents organes, tissus et fluides. Ils font partie de la première ligne de défense contre les agents pathogènes, l’immunité innée. Ils interviennent dans le phénomène de phagocytose, caractérisé par l’adhésion, l’ingestion et éventuellement la digestion de particules. La particule phagocytée est entourée par les pseudopodes de la cellule. Entre ces pseudopodes se forme une nouvelle vacuole intracellulaire, le phagosome, qui va ensuite fusionner avec un

52 Introduction lysosome et former un phagolysosome. Les pathogènes et débris cellulaires sont dégradés et les antigènes peuvent être présentés aux différentes cellules du système immunitaire, via le complexe majeur d’histocompatibilité II. Les macrophages sécrètent divers médiateurs tels que les cytokines IL-1β, TNF-α et IL-6, des chimiokines et d’autres médiateurs de l’inflammation comme les prostaglandines et leucotriènes.

I.5.5. Les récepteurs purinergiques dans les macrophages

Steinberg et Silverstein sont les premiers à avoir démontré, en 1987, l’expression d’un récepteur membranaire activé sélectivement par l’ATP et certains de ses analogues, dans la lignée cellulaire J774 de macrophages murins et dans les macrophages péritonéaux (Steinberg et Silverstein, 1987 ; Steinberg et al., 1987). L’activation de ce récepteur, appelé récepteur

P2X 7 ou anciennement récepteur P2Z, résulte en la formation d’un pore perméable à des colorants fluorescents de taille inférieure à 900 Da (Steinberg et al., 1987). En 1988, Greenberg et ses collaborateurs ont démontré que dans les macrophages J774, les nucléotides 2+ extracellulaires entraînent une augmentation de la [Ca ]i par deux mécanismes distincts, la mobilisation du calcium intracellulaire ainsi que l’entrée de calcium extracellulaire. Outre les récepteurs P2X, ces cellules expriment donc des récepteurs P2Y couplés aux protéines G. La présence de récepteurs purinergiques fonctionnels est aujourd’hui établie dans différents types de macrophages et dans des lignées cellulaires. Au niveau des macrophages de la lignée J774 les récepteurs P2X 4 et P2X 7 sont principalement exprimés, comme le montrent des analyses par RT-PCR, immunofluorescence et Western blot. L’expression de divers récepteurs P2Y

(P2Y 1, P2Y 2, P2Y 4, P2Y 6) a également été reportée (Coutinho-Silva et al., 2005 ; Ito et al.,

2008). L’ARNm de plusieurs récepteurs purinergiques, dont les récepteurs P2X 4 et P2X 7, a été mis en évidence au niveau des macrophages alvéolaires humains (Myrtek et al., 2008). Del Rey et ses collègues (2006) ont décrit la présence d’ARNm correspondant aux récepteurs

P2X 1, P2X 4, P2X 7, P2Y 1, P2Y 2 et P2Y 6 dans les macrophages péritonéaux résidents. Les récepteurs P2X 4 et P2X 7 sont également co-exprimés dans les cellules microgliales BV-2 (Raouf et al., 2007).

53 Introduction

I.6. LES GLANDES SALIVAIRES ET LA SALIVE

Le deuxième modèle cellulaire utilisé dans le cadre de ces travaux est constitué par les glandes sous-maxillaires. Ces glandes exocrines sécrètent divers produits directement dans l’environnement extérieur et permettent donc l’étude des sécrétions exocrines. Les glandes sous-maxillaires présentent plusieurs avantages : elles sont facilement accessibles, bien individualisées et visibles à l’œil nu. Ces glandes sont innervées par les systèmes nerveux ortho- et parasympathique et sont riches en récepteurs de divers types.

I.6.1. Anatomie et histologie des glandes salivaires

Il existe trois paires de glandes salivaires principales, qui produisent la plus grande partie de la salive, et une multitude de glandes salivaires accessoires qui sont distribuées un peu partout dans la muqueuse buccale et qui contribuent en faible proportion à la sécrétion salivaire. Les glandes salivaires principales sont les glandes parotides situées en dessous et en avant des oreilles, les glandes sous-maxillaires ou submandibulaires situées sous la base de la langue et les glandes sublinguales situées au dessus des sous-maxillaires (Fig. 1.17).

Figure 1.17 : Localisation anatomique des glandes salivaires majeures. Cette figure montre la localisation des trois glandes salivaires majeures : les glandes sublinguales, les glandes parotides et les glandes sous-maxillaires. On y distingue également le canal de Wharton, canal excréteur principal des glandes sous-maxillaires, et le canal de Sténon, canal excréteur principal des glandes parotides.

54 Introduction

Les glandes salivaires sont des glandes tubulo-acineuses ramifiées et lobulées. Elles sont entourées d’une capsule conjonctive fibreuse dont se détachent des cloisons qui délimitent les lobules. Les vaisseaux sanguins et les nerfs pénètrent dans la glande par le hile pour se disperser dans les lobules. L’unité sécrétrice des glandes salivaires est l’adénomère, constitué de cellules sécrétrices formant des agglomérats dénommés acini. Au niveau de ces cellules polarisées, caractérisées par une membrane apicale et une membrane basolatérale, a lieu la totalité de la libération d’eau ainsi que la majorité de la sécrétion de protéines et de la sortie d’ions. La salive primaire est ainsi formée et elle est acheminée dans la cavité buccale via les canaux. Les acini contiennent entre les cellules glandulaires et la membrane basale des cellules myoépithéliales. Ces cellules possèdent des myofilaments, de type actine ou myosine, dont la contraction pousse le produit de sécrétion vers la lumière de l'acinus. Des petits tubes collecteurs appelés canaux intercalaires et formés d’un épithélium monostratifié recueillent la salive des acini. Les canaux intercalaires confluent pour former des canaux intralobulaires striés, bordés d’un épithélium pseudostratifié. Les canaux striés sont drainés par les canaux collecteurs qui aboutissent au canal excréteur principal de la glande, canal de Wharton pour les glandes sous-maxillaires, canal de Sténon pour les glandes parotides. Lors du passage de la salive primaire dans les canaux des modifications de sa composition ionique ont lieu. Certaines protéines comme la kallikréine y sont également sécrétées. Le produit final est la salive secondaire, hypotonique, qui est finalement déversée dans la cavité buccale.

On peut distinguer plusieurs types d’acini (Fig. 1.18). Les acini séreux sont constitués de cellules séreuses avec un noyau arrondi et contiennent des grains de sécrétion ou grains de zymogène renfermant des protéines. Les acini muqueux sont formés de cellules muqueuses claires avec un noyau aplati au pôle basal, et ils élaborent des glycoprotéines appelées mucines qui constituent le mucus. Les acini mixtes contiennent à la fois des cellules séreuses et muqueuses ; les cellules muqueuses bordent la lumière glandulaire tandis que les cellules séreuses forment un croissant, le croissant de Gianuzzi, accolé à l’extérieur de l’acinus. Les glandes parotides sont des glandes séreuses pures. Elles produisent une salive aqueuse riche en enzymes. Les glandes sous-maxillaires sont des glandes salivaires mixtes, à prédominance séreuse. Les glandes sublinguales sont également des glandes mixtes, mais à prédominance muqueuse, qui excrètent une salive plus visqueuse, riche en polysaccharides.

55 Introduction

Figure 1.18 : Les différents types d’acini. Différents types d’acini peuvent être distingués : les acini séreux contenant des grains de zymogènes renfermant des protéines, les acini muqueux qui élaborent les mucines et les acini mixtes qui contiennent à la fois des cellules séreuses et muqueuses.

I.6.2. Physiologie de la sécrétion salivaire

Production de salive La production de la salive se fait en deux phases (Thaysen et al., 1954). La phase primaire ou phase acineuse produit la salive primaire ; la phase définitive ou phase ductale produit la salive définitive. A la sortie des acini la salive est isotonique. Elle subit des modifications lors de son passage dans les canaux au niveau desquels le Na + et le Cl - sont + - réabsorbés tandis que le K et l’HCO 3 sont libérés dans la lumière du canal. Comme les cellules ductales sont peu perméables à l’eau, la réabsorption d’ions n’est pas accompagnée par une réabsorption d’eau. La salive sera finalement hypotonique. La composition ionique de la salive varie en fonction des espèces. Différents mécanismes de transport d’ions sont responsables de ces différences (Roussa, 2011).

Phase acinaire La totalité de la libération d’eau a lieu au niveau des acini. Divers canaux, pompes, échangeurs et transporteurs d’ions sont exprimés au niveau de leurs membranes basolatérales et apicales. Leur activité coordonnée entraîne la sortie de Cl - des cellules acineuses. Il s’ensuit un gradient osmotique entraînant un mouvement d’eau vers la lumière des acini (Fig. 1.19) (Nakamoto et al., 2007 ; Catalan et al., 2009 ; Roussa, 2011).

56 Introduction

La pompe Na +/K + ATPase au niveau basolatéral maintient la concentration intracellulaire de Na + faible et celle de K + élevée, et crée donc un gradient électrochimique de Na + dirigé vers l’intérieur des cellules. Le cotransporteur Na +/K +/2Cl -, situé également au niveau basolatéral, permet l’entrée de Cl - et le maintien d’une concentration intracellulaire en Cl - élevée. Evans et ses collègues (2000) ont montré que le volume de salive collecté suite à la stimulation par la pilocarpine est diminué dans les glandes salivaires de souris déficientes en ce cotransporteur. Une salivation résiduelle est cependant observée, suggérant un mécanisme - + + - - alternatif pour l’entré de Cl . Celui-ci dépendrait d’échangeurs Na /H et Cl /HCO 3 au niveau 2+ + - 2+ basolatéral. En condition basale, la [Ca ]i est faible et les canaux K et Cl activés par le Ca 2+ sont inactifs. La stimulation par des sécrétagogues provoque l’augmentation de la [Ca ]i et l’ouverture de canaux Ca 2+ -dépendants : les canaux K+ situés sur la membrane basolatérale et les canaux Cl - situés au niveau de la membrane apicale. On observe un efflux de K + vers le compartiment plasmatique et une sortie de Cl - vers la lumière de la glande. L’accumulation de charges négatives au niveau de la lumière acineuse entraîne un afflux d’ions Na + qui passent à travers des jonctions serrées entre les cellules, et ce afin de préserver l’électroneutralité. L’augmentation de la pression osmotique due au NaCl entraîne un mouvement d’eau jusque la lumière de la glande via des voies paracellulaires et/ou transcellulaires. Des aquaporines ont été mis en évidence au niveau des glandes cellulaires (Delporte et al., 2006). Parmi celles-ci l’aquaporine 5 est exprimée au niveau de la membrane apicale des acini et serait impliquée dans le passage d’eau vers la lumière de la glande. L’importance de l’aquaporine 5 a été confirmée par des études menées sur des souris invalidées pour le gène de l’aquaporine 5, chez lesquelles le volume de salive recueilli après stimulation par un agoniste muscarinique est diminué par rapport aux souris de type sauvage (Krane et al., 2001 ; Ma et al., 1999).

Phase ductale Au cours de la phase ductale le Na + et le Cl - sont réabsorbés. Cette réabsorption a lieu au niveau des canaux intercalaires, striés et excrétoires (Catalan et al., 2009). Le canal épithélial du sodium (ENaC) est le principal intervenant dans la réabsorption du Na + au niveau des membranes apicales des cellules ductales. L’inhibition de ce canal par l’amiloride bloque la réabsorption de Na + (Schneyer, 1970). La sortie de Na + et l’entrée de K + au niveau de la membrane basolatérale seraient assurées par une pompe Na +/ K+/ATPase. Celle-ci maintiendrait la concentration intracellulaire en Na + faible et celle de K + élevée. Le Cl - est également réabsorbé au niveau de la membrane apicale des cellules ductales. Il a été suggéré - - - que des canaux Cl ou des échangeurs Cl /HCO 3 interviennent dans cette réabsorption. Le

57 Introduction canal CFTR semble également jouer un rôle dans la réabsorption de Cl -. Le contenu en NaCl de la salive est significativement plus élevé chez les souris déficientes en CFTR que chez les souris normales (Catalan et al., 2010). Le K + est libéré dans la salive au niveau des cellules ductales. Cette sortie de K + nécessite la présence de canaux Maxi K+ (Nakamoto et al., 2008 ; Romanenko et al., 2007).

Figure 1.19 : Modèle de la sécrétion salivaire. Phase acinaire (stage 1) : la sécrétion de salive par les cellules acineuses dépend du Cl -. L’activité coordonnée de canaux, transporteurs, pompes et échangeurs résulte en la libération de Cl- dans la lumière acineuse. Ceci est suivi par un afflux de Na +, par des voies paracellulaires, et d’eau, via l’aquaporine 5 ainsi que via des voies paracellulaires. Une salive isotonique est ainsi produite. Phase ductale (stage 2) : les cellules ductales réabsorbent le Na + et le Cl - et libèrent le K+ et - l’HCO 3 dans la salive. Les cellules ductales étant peu perméables à l’eau, ceci n’est pas compensé par une réabsorption d’eau. La salive finale est hypotonique. Modifié d’après Catalan et ses collègues (2009).

Contrôle de la sécrétion salivaire Le volume quotidien moyen de salive produit est de 1 à 1,5 litres. La sécrétion salivaire est très limitée en période interdigestive et s’accroît lors de l’alimentation. En condition basale, la salive est produite principalement (69 %) par les glandes sous-maxillaires. Lors d’une stimulation la répartition change, les glandes parotides sont alors responsables de la majorité de la production de la salive. La sécrétion salivaire est sous le contrôle du système

58 Introduction nerveux parasympathique et orthosympathique. La stimulation parasympathique provoque la production d’une salive abondante et aqueuse, tandis que la stimulation sympathique augmente faiblement la salivation et résulte en une salive plus visqueuse. En plus des agonistes adrénergiques et cholinergiques, d’autres hormones et neurotransmetteurs sont localisés au niveau des nerfs des glandes salivaires (Proctor et al., 2007).

Les glandes salivaires présentent un grand nombre de récepteurs. En fonction du type de récepteur mis en jeu différentes voies d’activation de la sécrétion salivaire peuvent être distinguées (Turner et Sugiya, 2002 ; Proctor et Carpenter, 2007) : - Les agonistes muscariniques (acétylcholine), agissant principalement via les récepteurs M3, les agonistes α-adrénergiques (adrénaline), la substance P et les agonistes des récepteurs P2Y activent des récepteurs couplés aux protéines G. Il s’ensuit une activation de la PLC et une 2+ 2+ augmentation de la [Ca ]i. Cette augmentation de la [Ca ]i joue un rôle majeur dans la sortie d’eau et d’électrolytes. Les récepteurs purinergiques P2X 7, exprimés au niveau des glandes salivaires (voir partie I.6.4.), semblent participer dans la régulation de la sécrétion salivaire. 2+ Leur stimulation augmente la [Ca ]i et la sécrétion de protéines telles que la kallikréine (Amsallem et al., 1996 ; Pochet et al., 2007 ; Nakamoto et al., 2009). Plusieurs groupes ont étudié l’implication de ces récepteurs dans la sécrétion salivaire, en utilisant des souris invalidées pour le gène du récepteur P2X 7, générées par Pfizer. Leurs résultats suggèrent que les récepteurs P2X 7 régulent la sécrétion par les glandes salivaires (Pochet et al., 2007 ; Nakamoto et al., 2009 ; Novak et al., 2010). - Les agonistes β-adrénergiques (isoprotérénol) stimulent l’adénylate cyclase et entraînent une production d’AMPc. La PKA est activée et phosphoryle des protéines intracellulaires causant l’exocytose de granules sécrétoires et donc la sécrétion de protéines salivaires.

I.6.3. Composition et rôles de la salive

La salive est constituée majoritairement d’eau ainsi que de protéines, glycoprotéines et d’électrolytes. Le pH de ce fluide physiologique, propre à la bouche, est de 6,7 à 7,4. Elle contient plusieurs enzymes, dont principalement l’ α-amylase. Cette enzyme est sécrétée par les cellules séreuses dans des grains zymogènes et coupe les liaisons α(1-4) de l’amidon à pH neutre. En plus faible quantité on trouve dans la salive le lysozyme, la lactoferrine, la lipase

59 Introduction linguale, la kallikréine, des peroxydases, des RNases et des DNases, ainsi que des protéines riches en proline, les histatines et les cystatines. La salive contient également des anticorps parmi lesquels des IgA sécrétoires. Les cellules muqueuses sécrètent dans la salive des mucines, un mélange de glycoprotéines, dont la principale est la sialoglycoprotéine, et de glycosaminoglycanes. Ce sont des grosses molécules qui donnent à la salive sa viscosité. Les ions contenus dans la salive sont le potassium, le bicarbonate, le calcium, le phosphate, le chlorure et le sodium. On y retrouve également des substances organiques tels que l’urée et le thiocyanate, et des facteurs de croissance capables d’accélérer des phénomènes de cicatrisation.

L’utilité de la salive comme sécrétion exocrine est bien connue. L’absence de sécrétions salivaires provoque la xérostomie ou sécheresse de la bouche. Une des pathologies associées à un dysfonctionnement salivaire est le syndrome de Sjögren, une maladie auto- immune touchant les glandes exocrines, en particulier les glandes lacrimales et salivaires. D’autres causes de xérostomie sont la radiothérapie de patients atteints de cancer du cou et de la tête, ou la prise de certains médicaments ayant comme effet secondaire une sécheresse de la bouche. Les patients qui souffrent de xérostomie témoignent de nombreuses plaintes, telles que des infections buccales et caries dentaires, des difficultés pour parler et avaler.

Les différents rôles de la salive sont repris ci-dessous (Fig. 1.20) (Kaplan, 1993 ; Nieuw Amerongen, 2002 ; Walker, 2004 ; Dodds et al., 2005) :

- rôle gustatif : La salive dissout des molécules qui peuvent ensuite stimuler les papilles gustatives.

- rôle mécanique : La salive lubrifie le bol alimentaire et facilite la mastication, la déglutition et le passage de ce bol dans l’œsophage. L’eau et les glycoprotéines comme les mucines et les protéines riches en proline jouent un rôle dans cette action lubrifiante. Une lubrification suffisante est également importante pour articuler correctement.

- rôle digestif : L’α-amylase, qui agit idéalement au pH de la salive, hydrolyse l’amidon des aliments en maltose ; la lipase linguale hydrolyse les triglycérides.

60 Introduction

- rôle de protection : La cavité buccale est protégée grâce au simple flux physique de la salive ainsi que grâce à diverses substances à propriétés antimicrobiennes contenues dans la salive. Parmi celles-ci on trouve les IgA, le lysozyme, la peroxydase, la lactoferrine, les histatines et les cystatines. On peut également noter la présence de LL-37 dans la salive (Murakami et al., 2002). Les peptides antimicrobiens pourraient être utilisés pour le traitement de maladies parodontales (Gorr et Abdolhosseini, 2011). La salive a un rôle de protection des dents contre les caries, grâce à la formation d’une pellicule protectrice, à l’élimination de bactéries et à son pouvoir tampon (dû essentiellement à la présence de bicarbonate, et aussi de phosphate). Il y a neutralisation des acides produits par les micro-organismes présents sur les dents. La déminéralisation de l’émail dentaire est limitée et il y a minéralisation de nouvelles dents. La présence de facteurs de croissance permet une meilleure cicatrisation.

Figure 1.20 : Les principaux rôles de la salive. Ce diagramme reprend les principales fonctions de la salive, par rapport à la nourriture (formation du bol alimentaire, goût, digestion), à la protection contre les micro-organismes (bactéries, champignons, virus) et à la protection des dents. On y trouve également les composants de la salive impliqués dans ces fonctions (Nieuw Amerongen, 2002).

61 Introduction

I.6.4. Les récepteurs purinergiques dans les glandes salivaires

En 1982, Gallacher a décrit l’expression de récepteurs spécifiques de l’ATP dans les cellules acineuses des glandes parotides, responsables de l’augmentation de la conductance membranaire et de la sécrétion d’amylase. Des publications subséquentes ont montré que certaines des réponses des glandes parotides à l’ATP étaient dues à un canal cationique, formé probablement par le récepteur P2Z/P2X 7 (Soltoff et al., 1990 ; Soltoff et al., 1992). Des résultats similaires ont été obtenus dans les glandes sous-maxillaires de rats, où il a été montré 2+ 2+ que l’ATP augmente la [Ca ]i et l’entrée basale de Zn via un canal cationique régulé par un récepteur avec une affinité faible pour le nucléotide (Dehaye, 1993). D’autres études ont par la suite été effectuées sur les récepteurs purinergiques dans les glandes exocrines. De nombreux travaux confirment aujourd’hui la présence de récepteurs P2X 7 et P2X 4 dans les glandes salivaires, et notamment les acini et les canaux des glandes sous-maxillaires. Ces résultats sont basés sur l’utilisation des différents agonistes et antagonistes, ainsi que sur des techniques comme le Western blot et la RT-PCR (Lee et al., 1997 ; Tenneti et al., 1998 ; Alzola et al., 1998 ; Peréz-Andrés et al., 2002 ; Pochet et al., 2003 ; Pochet et al., 2007). La présence de récepteurs P2Y 1 et P2Y 2 a également été mise en évidence dans les glandes salivaires (Turner et al., 1999). La distribution et l’activité de certains récepteurs P2 changent en fonction de l’innervation, du développement et de la durée de la culture cellulaire (Tenneti et al., 1998 ; Turner et al., 1997 ; Turner et al., 1998).

I.7. OBJECTIFS DU TRAVAIL

Les études concernant les récepteurs purinergiques se sont multipliées durant ces dernières années. Différents sous-types de ces récepteurs ont été clonés et caractérisés. Ils sont largement distribués au niveau du corps humain, notamment dans les cellules du système immunitaire et les cellules épithéliales, et ils interviennent dans de nombreuses réponses physiologiques et pathologiques. Ceci les rend particulièrement intéressants pour l’industrie pharmaceutique pour qui ces récepteurs, ainsi que les enzymes intervenant dans leur dégradation et leur synthèse, constituent de nouvelles cibles thérapeutiques. Divers agonistes et antagonistes ont ainsi été développés et étudiés au cours des dernières années. Le développement et l’utilisation de molécules agissant sur les récepteurs purinergiques requièrent cependant des connaissances préalables des réponses cellulaires secondaires à

62 Introduction

l’activation de ces récepteurs. Les récepteurs P2X 7 notamment sont impliqués dans de multiples voies de signalisation et interviennent par exemple dans la stimulation de phospholipases, de diverses kinases, de la sécrétion de cytokines et la production de ROS.

Le but de ce travail est d’étudier certaines réponses intracellulaires secondaires à l’activation des récepteurs P2X 7 dans des modèles cellulaires différents. Nous allons centrer notre travail sur deux types de cellules exprimant des récepteurs P2X 7 et capables de sécréter diverses enzymes ou protéines leur conférant un rôle de protection contre les agressions. Les macrophages sont des cellules du système immunitaire impliquées dans la protection contre les pathogènes. Suite à la phagocytose, ces derniers seront éliminés et les antigènes peuvent être présentés aux différentes cellules du système immunitaire. Parmi les différents types de macrophages qui existent, notre choix s’est porté sur les macrophages péritonéaux qui peuvent être prélevés facilement. Le deuxième modèle cellulaire est constitué par des glandes exocrines, plus précisément par les glandes salivaires. Ces glandes sont situées à l’entrée du tractus digestif et sécrètent diverses substances à propriétés antimicrobiennes, comme les IgA, ce qui permet de prévenir la colonisation de la lumière de ces glandes par des bactéries. Trois paires de glandes salivaires principales existent, dont les glandes sous-maxillaires qui sont abondamment innervées et facilement accessibles. Il est également possible de séparer les deux populations majeures de cellules qui forment cette glande. Le choix de cellules originaires de souris nous permet d’utiliser des animaux invalidés pour le gène du récepteur

P2X 7 et donc de mieux cerner le rôle de ce récepteur dans les réponses étudiées.

Nous étudierons d’abord deux réponses impliquées dans la protection de l’hôte contre les agressions et l’élimination de pathogènes : la production de ROS ainsi que la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β. Nous commencerons par étudier l’effet de l’ATP extracellulaire sur la production de ROS dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires, afin de déterminer si cette production y est régulée de la même manière. Ensuite nous allons comparer l’expression et la sécrétion d’IL-1β par les deux types de cellules. Nous allons déterminer si les LPS régulent l’expression d’IL-1β et si les récepteurs P2X 7 sont couplés à la sécrétion de la cytokine aussi bien dans les cellules du système immunitaire que dans les glandes salivaires. Les récepteurs P2X 7, contrairement aux autres récepteurs P2X, sont activés par des concentrations d’ATP élevées, atteintes suite à la libération du nucléotide par les cellules elles-mêmes. Divers agonistes potentiels ont été étudiés, dont le peptide

63 Introduction antimicrobien LL-37. Ce peptide entraîne une sécrétion d’IL-1β des monocytes humains, via l’activation de récepteurs P2X 7 (Elssner et al., 2004), mais n’est pas un agoniste des récepteurs P2X 7 des glandes salivaires murines (Pochet et al., 2006). Dans la dernière partie de ce travail nous déterminerons les effets du peptide antimicrobien murin CRAMP sur les macrophages de souris.

64 Matériel et Méthodes

CHAPITRE II

MATERIEL ET METHODES

II.1. MATERIEL

II.1.1. Les animaux

Les expériences ont été menées sur des souris mâles, âgées de 12 à 16 semaines, pesant entre 20 et 30 g, nourries ad libitum et ayant accès libre à l’eau. Ces souris ont été soumises à un rythme de 12 heures de lumière, puis 12 heures d’obscurité. Il s’agissait soit de +/+ -/- souris contrôles C57Bl/6J P2X 7R (souris P2X 7-WT), soit de souris knock-out P2X 7R

(souris P2X 7-KO), qui ont été fournies par Pfizer (Groton, CT, Etats-Unis). Les souris P2X 7- KO ont été initialement produites selon le schéma repris dans la figure 2.1. L’élevage des souris contrôles P2X 7-WT et des souris P2X 7-KO a été effectué par le Service de Chimie Biologique et Médicale et de Microbiologie Pharmaceutique de la Faculté de Pharmacie. L’élevage et l’utilisation de ces souris ont été réalisés selon les procédures du Ministère Belge de l’Agriculture sous la supervision d’un comité éthique institutionnel (protocole n° 221N).

Figure 2.1 : Stratégies utilisées pour la génération des souris P2X 7-KO. La stratégie de GlaxoSmithKline consiste à insérer le gène LacZ deux paires de bases après l’ATG initial du côté 5’ de l’exon 1. Chez Pfizer le gène de résistance à la néomycine a été inséré au niveau de l’exon 13 et les nucléotides 1527 à 1607 ont été éliminés (Taylor et al., 2009).

65 Matériel et Méthodes

II.1.2. Les réactifs et substances

Le 2-(4-morpholinyl)-8-phényl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002), la 2’-amino-3’- méthoxyflavone (PD98059) et le bisindolylmaléimide (BIM I) ont été obtenus chez Calbiochem (VWR, Leuven, Belgique). Le mélange d’acides aminés exempt de glutamine, le sérum fœtal bovin (FBS), la L- glutamine, la solution saline équilibrée de Hank ( Hank’s Balanced Salt Solution , HBSS), le tampon phosphate salin ( Phosphate-Buffered Saline , PBS), le RPMI 1640 et le mélange streptomycine-pénicilline provenaient de chez GIBCO (Invitrogen, Paisley, Ecosse). Le bromure d’éthidium, le DCFH/DA, le PBFI/AM, le fura-2/AM, l’acide pluronique F-127, les membranes de nitrocellulose et de PVDF, le tampon de charge NuPAGE ® LDS Sample Buffer, les tampons d’électrophorèse NuPAGE ® MOPS SDS et NuPAGE ® MES SDS, les gels NuPAGE ® Novex 4-12 % ou 12 % Bis-TRIS, le tampon de transfert NuPAGE ® Transfer Buffer et l’indicateur de taille des protéines SeeBlue Plus2 ont été achetés chez Invitrogen (Paisley, Ecosse). Le film BioMax MR, le fixateur AL4 et le révélateur LX24 ont été fournis par Kodak (Sigma, St. Louis, MO, Etats-Unis). Les anticorps secondaires anti-lapin couplés à la peroxydase et l’ECL Plus ont été achetés chez GE Healthcare (Buckinghamshire, Angleterre). L’acide 9,10-[3H] oléique a été acheté chez American Radiolabeled Chemicals Inc (St. Louis, MO, Etats-Unis). Le CRAMP (GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ), le WKYMVm (Try-

Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH 2), le MMK-1 (LESIFRSLLFRVM) et le KR-20 (KRIVQRIKDFLRNLVPRTES) ont été synthétisés par GL Biochem (Shanghai, Chine). Le thioglycollate a été obtenu chez Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, Etats-Unis). L’héparine a été fournie par Braun (Diegem, Belgique). Le mercaptoéthanol a été acheté chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Le kit BCA pour le dosage des protéines, le substrat de la peroxydase 1 Step Ultra TMB- ELISA et la streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) ont été fournis par Pierce (Perbio, Erembodegem, Belgique).

Les anticorps polyclonaux anti-récepteurs P2X 7 et anti-récepteurs P2X 4 ont été achetés chez

Alomone (Jérusalem, Israël). Les anticorps anti-récepteurs P2X 7 sont dirigés contre les 20 acides aminés C-terminaux du récepteur P2X 7 de rat. Chez la souris, 18 de ces acides aminés

66 Matériel et Méthodes sont conservés ce qui permet une réactivité croisée avec les anticorps de rat. Les anticorps anti-récepteurs P2X 4 sont dirigés contre les 19 acides aminés C-terminaux du récepteur P2X 4 de rat, qui sont identiques aux acides aminés de souris. L’anticorps primaire anti-IL-1β de souris provenait de chez R&D Systems (Abingdon, Angleterre). C’est un anticorps polyclonal produit chez la chèvre. L’anticorps secondaire monoclonal anti-IL-1β de souris, couplé à la biotine, ainsi que l’IL-1β utilisée pour la préparation de la courbe étalon, provenaient de chez Endogen (Perbio, Erembodegem, Belgique). Les anticorps anti-phospho-IκB-α et anti-IκB-α de souris ont été fournis par Cell Signaling (Danvers, MA, Etats-Unis). Ces anticorps ont été produits chez le lapin. L’anticorps anti-IgG de chèvre, lié à la peroxydase a été acheté chez Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Etats-Unis). Le liquide de scintillation Ecoscint A provenait de chez National Diagnostics (Atlanta, GA, Etats-Unis). Le trishydroxyméthylaminométhane (TRIS) et le GelRed ont été achetés chez VWR (Leuven, Belgique). La N-acétylcystéine, l’acide glutamique, le 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle fluorure chlorhydrate (AEBSF), l’, l’apocynine, l’adénosine 5’-triphosphate (ATP), l’adénosine 5’-triphosphate 2’,3’-dialdéhyde (oATP), le β-nicotinamide adénine dinucléotide (β-NADH), le 2’,3’-O-(4-benzoylbenzoyl)adénosine 5’-triphosphate (BzATP), la carbamylcholine (carbachol), la chélérythrine, le cocktail d’inhibiteurs de protéases, la digitonine, le chlorure de diphenylène iodonium (DPI), l’acide éthylène glycol-bis-(β- aminoéthyléther)-N,N,N’,N’-tétraacétique (EGTA), la carbonyl cyanide 4- (trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP), le N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF), la forskoline, l’acide N-[2-hydroxyéthyl] pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique] (HEPES), l’ionomycine, l’oligomycine, le (+) et (-) isoprotérénol, l’ivermectine, le 1-(N, O-bis[5- isoquinolinesulfonyl]-N-méthyl-L-tyrosyl)-4-phénylpipérazine (KN-62), le kit d’extraction d’ARN « GenElute Mammalian Total RNA Miniprep », les lipopolysaccharides (LPS) de E.coli sérotype O55:B5 (référence L2880), le bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5- diphényl tétrazolium (MTT), la N-méthyl-L-arginine (L-NAME), la nigéricine, le pyruvate de sodium, la thapsigargine, le Tween 20, le Triton X-100, le 12-o-tétradécanoylphorbol-13- acétate (PMA), le 1-[6-[((17 β)-3-méthoxyestra-1,3,5[10]-trien-17-yl)amino]hexyl]-1H- pyrrole-2,5-dione (U73122) et le 1-[6-[((17 β)-3-méthoxyestra-1,3,5[10]-trien-17-

67 Matériel et Méthodes yl)amino]hexyl]-2,5-pyrrolidinedione (U73343) ont été obtenus chez Sigma (St. Louis, MO, Etats-Unis). L’albumine de sérum bovin (fraction V) et la collagénase P ont été achetés chez Roche Diagnostics (Mannheim, Allemagne). La xylazine, la kétamine et la pilocarpine provenaient respectivement de Bayer AG (Leverkusen, Allemagne), de Pfizer S.A . (Bruxelles, Belgique) et d’ Alcon (Forth Worth, TX, Etats-Unis). Le kit « DNA Clean & Concentrator TM -5 » provenait de Zymo Research (Orange, CA, Etats- Unis). Les amorces pour la RT-PCR ont été synthétisées par Eurogentec (Seraing, Belgique). L’agarose provenait également de chez Eurogentec. Le MasterMix, le marqueur de taille d’ADN GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus et le kit de transcription inverse « RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis » ont été obtenus chez Fermentas (Burlington, ON, Canada). Le Percoll (densité 1,130 ± 0,005 g/ml) a été acheté chez Amersham Biosciences (Uppsala, Suède). Tous les autres produits étaient de qualité pour analyse.

II.2. METHODES

II.2.1. Préparation des milieux

Les milieux utilisés pour la digestion des glandes sous-maxillaires (milieu D), pour l’incubation des cellules en présence des indicateurs (milieu I) et pour le dosage des cellules (milieu If) sont préparés le jour de l’expérience. Ces milieux sont préparés à partir de plusieurs solutions stock qui sont soit préparées à l’avance, soit achetées prêtes à l’emploi, et qui sont conservées à 4°C.

68 Matériel et Méthodes

 Solutions stock :

- Solution d’HEPES 10X concentrée, pH 7,4 : • 245 mM HEPES

- Solution de « fumarate » 10X concentrée, pH 7,4 : • 50 mM fumarate de sodium • 50 mM pyruvate de sodium • 50 mM glutamate de sodium • 115 mM glucose

- Solution d’ions 2X concentrée : • 192 mM NaCl

• 5 mM NaH 2PO 4 • 12 mM KCl

- Solution de MgCl 2 :

• 1 M MgCl 2

- Solution de CaCl 2 :

• 1 M CaCl 2

- Mélange d’acides aminés, sans L-glutamine

69 Matériel et Méthodes

 Milieux pour les expériences :

Milieu D Milieu I Milieu If HEPES (pH 7,4) 24,5 mM 24,5 mM 24,5 mM Fumarate de sodium 5 mM 5 mM 5 mM Pyruvate de sodium 5 mM 5 mM 5 mM Glutamate de sodium 5 mM 5 mM 5 mM Glucose 11,5 mM 11,5 mM 11,5 mM NaCl 96 mM 96 mM 96 mM

NaH 2PO 4 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM KCl 6 mM 6 mM 6 mM

MgCl 2 1 mM 1 mM - Mélange d’acides aminés 1 % (v/v) 1 % (v/v) - Albumine de sérum bovin (BSA) 0,125 % (m/v) 1 % (m/v) -

CaCl 2 - 0,5 mM -

Tableau 2.1 : Composition des milieux utilisés pour les expériences.

II.2.2. Prélèvement des macrophages péritonéaux

Les macrophages péritonéaux sont prélevés selon la méthode décrite par McCarron et ses collaborateurs (1984). Trois à cinq jours avant le prélèvement des macrophages, 2 ml d’une solution de thioglycollate (4 % dans de l’eau stérile) sont injectés dans la cavité péritonéale des souris. Le thioglycollate provoque une inflammation, ce qui attire les monocytes circulants qui se différencient alors en macrophages. Le jour du prélèvement, les souris, qui ont été mises à jeûne la veille, sont sacrifiées par asphyxie avec du CO 2. Leur cavité péritonéale est lavée au moyen de 10 ml de milieu PBS glacé contenant 10 U/ml d’héparine. Le milieu récupéré à l’aide de deux seringues de 5 ml est centrifugé pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. Le culot de cellules est resuspendu dans du milieu RPMI 1640 contenant 2 mM de glutamine, 10 % de FBS, 20 mM d’HEPES (pH 7,4), 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine (milieu RPMI). Les cellules sont placées dans des boîtes de culture (en général 2 boîtes contenant environ 1 x 10 7 cellules pour une souris) puis

70 Matériel et Méthodes

elles sont incubées pendant 3 heures à 37°C et sous une atmosphère de 5 % CO 2. A la fin de ces 3 heures, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu frais. Les macrophages péritonéaux sont ainsi séparés des autres cellules par leur capacité d’adhérer à certains matériaux, notamment la paroi des boîtes de culture. Les boîtes sont ensuite placées à 37°C et sous une atmosphère de 5 % CO 2 pendant la nuit. Les macrophages sont incubés en présence de LPS 250 ng/ml pendant la nuit sauf indication contraire.

II.2.3. Préparation de la suspension brute de cellules à partir des glandes sous-maxillaires de souris

Les souris sont sacrifiées par asphyxie avec du CO 2. Les glandes sous-maxillaires de trois souris sont immédiatement prélevées et finement coupées à l’aide de ciseaux. Le tissu est ensuite digéré pendant 20 minutes à 37°C, sous agitation constante, dans 10 ml de milieu D en présence de 1 mg de collagénase P (activité 2,8 U/mg). Dix minutes après le début de la digestion et à la fin de la digestion, la suspension cellulaire est dispersée mécaniquement par plusieurs aspirations avec des pipettes en verre de 10-, 5-, et 2-ml. Cette dispersion mécanique complète la digestion enzymatique. La suspension est filtrée sur un filtre nylon et centrifugée à 1000 x g pendant 1 minute. Le culot est resuspendu dans 10 ml de solution isotonique de NaCl, avant d’être recentrifugé. Ce lavage est réalisé trois fois. Après le dernier lavage la suspension est filtrée sur quatre couches de filtre nylon et est recentrifugée. Le culot final est mis en suspension dans un milieu adéquat au type de mesure effectuée ensuite, et il est gardé à 4°C jusqu’à utilisation. A la fin de cette digestion on obtient une suspension brute de cellules de glandes sous-maxillaires, c’est-à-dire qu’on y retrouve un mélange de canaux et d’acini.

II.2.4. Séparation des cellules ductales et acineuses

Les canaux et acini sont séparés selon la méthode de Dehaye et Turner (1991). Après lavage de la suspension brute avec une solution isotonique de NaCl, le culot est resuspendu dans 8 ml de milieu D et il est déposé délicatement dans quatre tubes contenant 3 ml d’une solution de Percoll (40 %) rendue isotonique avec du NaCl. Les quatre tubes sont centrifugés

71 Matériel et Méthodes pendant 10 minutes à 4000 x g, à 4°C. A la fin de la centrifugation, les cellules acineuses, plus rondes et plus denses, ont sédimenté au fond des tubes alors que les cellules ductales, plus longues et moins denses, sont restées à l’interface de la solution de Percoll et du milieu D. Les cellules acineuses et ductales sont prélevées, transférées dans deux tubes et puis lavées avec une solution isotonique de NaCl. Les culots finaux sont resuspendus dans un milieu adéquat au type de mesure.

II.2.5. Prélèvement de la salive

Le prélèvement de la salive se fait en accord avec les instructions du National Institute for Dental Research (Bethesda, MD, Etats-Unis). Une solution saline de LPS 100 µg/ml est préparée afin d’étudier l’effet des LPS sur la composition de la salive. Après filtration, la solution est injectée dans la cavité péritonéale des souris, à une concentration de 400 µg/kg, selon le protocole de Yao et ses collaborateurs (2005). La salive est collectée 6 heures après l’injection de LPS ou d’une solution saline isotonique (contrôle). Les souris sont anesthésiées par injection d’un mélange de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans la cavité péritonéale. Pour une souris de 30 g, un millilitre d’une solution physiologique contenant 48 µl de Ketalar (spécialité de Pfizer contenant 50 mg/ml de kétamine) et 15 µl de Rompun (spécialité de Bayer contenant 20 mg/ml de xylazine) est injecté. Les souris sont placées sous une lampe afin d’éviter l’hypothermie. De la pilocarpine (1 mg/kg) est injectée en sous-cutané dans la région dorso-lombaire pour stimuler la salivation. Trente microlitres d’une solution physiologique contenant 3 µl d’Isopto-Carpine (spécialité d’Alcon-Couvreur contenant 10 mg/ml de pilocarpine HCl) ont ainsi été injectés aux souris. La salive est ensuite collectée pendant 20 minutes à l’aide d’un capillaire et est recueillie dans un tube Eppendorff préalablement pesé. La quantité de salive collectée est estimée en pesant le tube contenant la salive. A la fin du prélèvement les souris sont sacrifiées par augmentation de la concentration en CO 2.

II.2.6. Dosage des protéines

72 Matériel et Méthodes

La concentration en protéines des échantillons préparés est déterminée par la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA) en utilisant le kit BCA TM de Pierce. Cette méthode combine la réduction du Cu 2+ en Cu + par les protéines en milieu alcalin, connue sous le nom de réaction de biuret, avec une réaction colorimétrique entre le Cu + et le BCA. En effet, deux molécules de BCA vont chélater le Cu + avec formation d’un complexe de couleur pourpre, soluble dans l’eau et qui absorbe à 562 nm. La réaction est linéaire pour des concentrations en protéines de 20 à 2000 µg/ml. Le réactif au BCA est préparé en mélangeant 50 parties de réactif A (carbonate de sodium, bicarbonate de sodium, acide bicinchoninique et tartrate de sodium 0,1 M dans du NaOH) et 1 partie de réactif B (sulfate de cuivre 4 %). Vingt-cinq microlitres d’échantillon ou de solution standard (BSA, 0 à 2000 µg/ml) sont placés dans les puits d’une plaque 96 puits. Après ajout de 200 µl de réactif, la plaque est incubée pendant 30 minutes à 37°C. A la fin de l’incubation l’absorbance est mesurée à 562 nm à l’aide d’un lecteur pour plaques multipuits (BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis).

II.2.7. Mesure de l’activité de l’amylase

Les échantillons de salive sont dilués 5 fois et 10 µl des dilutions sont transférés dans des tubes en verre. Ensuite 240 µl d’une solution contenant 40 mM de NaCl, 80 mM de

Na 2HPO 4, 80 mM de KH 2PO 4 (pH 6,9) et 0,35 % d’amidon sont ajoutés aux tubes. Après 5 minutes d’incubation à 37°C, la réaction est arrêtée par ajout de 250 µl d’une solution d’acide dinitrosalicylique 43,8 mM, de NaOH 0,4 M et de tartrate de sodium et de potassium 1,06 M. Les tubes sont placés à 100°C pendant 10 minutes. Les échantillons sont ensuite dilués par ajout de 2 ml d’eau et 200 µl des échantillons dilués sont transférés dans les puits d’une plaque 96 puits. L’absorbance est mesurée à 540 nm (BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis). Une courbe d’étalonnage est également préparée avec des solutions contenant de 0,1 à 10 µmoles de maltose.

2+ II.2.8. Mesure de la concentration intracellulaire en calcium ([Ca ]i)

Principe

73 Matériel et Méthodes

2+ La mesure de la [Ca ]i est réalisée à l’aide d’un indicateur fluorescent sensible à la concentration en Ca 2+ libre, le fura-2. Le fura-2 est un indicateur dérivé de l’EGTA et du BAPTA, deux chélateurs de Ca 2+ . Il ne peut traverser la membrane plasmique tel quel, voilà pourquoi il est souvent utilisé sous forme d’ester, plus lipophile. Lors de ces expériences l’acétoxyméthylester du fura-2, appelé fura-2/AM, est utilisé. Cet ester du fura-2 est insensible au Ca 2+ et diffuse passivement à travers la membrane plasmique. Une fois à l’intérieur des cellules, le fura-2/AM est hydrolysé par des estérases intracellulaires. Il y a formation de formaldéhyde et d’acide acétique, avec libération du fura-2, qui se trouve ainsi sous forme acide, polyanionique (Fig. 2.2). Le fura-2 n’étant pas lipophile, il est piégé à l’intérieur des cellules et ne sort généralement plus. Cependant, l’indicateur peut s’accumuler dans des organites intracellulaires via un transport actif. Cette accumulation est plus prononcée chez les plantes et les champignons, ainsi qu’à des températures élevées. De plus, le fura-2 peut sortir des cellules via des transporteurs d’ions organiques, par exemple la glycoprotéine-P (Homolya et al., 1993). Ce transport actif peut être bloqué en utilisant des inhibiteurs de transporteurs tel que le probénécide ou la sulfinpyrazone (Di Virgilio et al., 1990).

74 Matériel et Méthodes

Figure 2.2 : Déestérification du fura-2/AM, insensible au calcium, en fura-2, sensible au calcium (Source : Molecular Probes) . 2+ 2+ Le fura-2 se lie au Ca avec une constante de dissociation (K d) proche de la [Ca ]i basale dans les cellules des mammifères (~100 nM). La K d dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels le pH, la température, la force ionique. L’indicateur est très sélectif du Ca 2+ 2+ 2+ vis-à-vis d’autres ions comme le Mg et permet de mesurer des [Ca ]i allant approximativement de 20 nM à 1 µM.

Le fura-2 est fluorescent grâce à son groupement stilbène. L’excitation est maximale à 362 nm et l’émission à 512 nm. Dans le cytoplasme, le fura-2 est présent soit sous forme libre, soit sous forme d’un complexe avec le Ca 2+ . Lorsque le fura-2 passe de la forme libre à la forme complexée, son spectre d’excitation se modifie et se déplace vers les longueurs d’onde plus petites (maximum déplacé de 362 nm à 335 nm). Les deux formes émettent à la même longueur d’onde (Fig. 2.3).

Figure 2.3 : Spectre d’excitation du fura-2 dans des solutions contenant entre 0 et 39,8 µM de Ca 2+ libre (Source : Molecular Probes).

Le rapport des intensités de fluorescence obtenues en excitant les cellules de façon alternée à 340 et à 380 nm et en mesurant l’émission de lumière à 510 nm, permet de calculer 2+ la [Ca ]i. Ainsi on peut éliminer certaines variables telles que l’épaisseur des cellules et la 2+ concentration intracellulaire de fura-2. La [Ca ]i peut être calculée grâce à la formule suivante :

75 Matériel et Méthodes

2+ [Ca ]i = K d Q (R - R min )/(R max - R) (Eq. 15)

2+ dans laquelle K d représente la constante de dissociation du Ca pour le fura-2, Q équivaut au rapport des coefficients de proportionnalité correspondant au fura-2 libre à 380 nm et au fura-

2 lié à 380 nm, R est égal au rapport des fluorescences à 340 et à 380 nm, R min correspond à la 2+ valeur minimale de R lorsque [Ca ]i est égale à zéro, et R max correspond à la valeur maximale de R lorsque l’indicateur est saturé en Ca 2+ .

Le K d a été mesuré par Grynkiewicz (1985) et est de 224 nM en présence de 115 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 mM K-Mops, 1 mM Mg 2+ libre, à pH 7,05 et à 37°C. Il est de 135 nM en présence de 100 mM KCl, à pH 7,1-7,2 et à 20°C. Afin de déterminer R max et R min , plusieurs solutions sont ajoutées à la fin des tracés. La digitonine lyse les cellules et permet ainsi la sortie du fura-2 dans le milieu extracellulaire contenant une concentration saturante en 2+ Ca . Un signal maximal est observé, ce qui permet la détermination de R max . L’EGTA est un chélateur qui va fixer tous les ions Ca 2+ , un signal minimal est observé permettant de déterminer R min . L’autofluorescence des cellules est estimée par ajout de MnCl 2 qui a une grande affinité pour le fura-2 et qui va déplacer les cations qui y sont fixés. Le complexe fura- 2/Mn 2+ n’étant pas fluorescent, la fluorescence propre des cellules, due à des molécules fluorescentes intracellulaires, peut alors être mesurée. Cette valeur est soustraite des valeurs de fluorescence à 340 nm et à 380 nm avant de calculer le rapport.

Protocole expérimental Après une nuit d’incubation, les macrophages sont lavés deux fois avec du milieu PBS, décrochés à l’aide d’un grattoir et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. Les macrophages ou les cellules de la suspension brute des glandes sous-maxillaires sont resuspendus dans du milieu d’incubation I et 500 µl de cette suspension cellulaire sont prélevés et transférés dans un tube. Les cellules sont incubées en présence de 3 µM fura- 2/AM pendant au moins 45 minutes, à 25°C, à l’abri de la lumière. A la fin de l’incubation les cellules sont lavées avec du PBS (macrophages) ou avec une solution de NaCl isotonique (glandes sous-maxillaires) et finalement elles sont resuspendues dans 2 ml de milieu If en présence de CaCl 2 1 mM. La fluorescence est mesurée à 25°C, sous agitation, à l’aide d’un fluorimètre (SLM Aminco Bowman, Urbana, IL, Etats-Unis ou Photon Technology International, Birmingham, NJ, Etats-Unis). Les échantillons sont excités alternativement à 340 et 380 nm et la lumière émise est mesurée à 510 nm. A la fin des mesures les tracés sont

76 Matériel et Méthodes

calibrés par ajout successif de digitonine 100 µM, d’EGTA 40 mM (pH 8,5) et de MnCl 2 100 mM. La valeur d’autofluorescence est soustraite des valeurs de fluorescence à 340 nm et à 2+ 380 nm avant de calculer le rapport F340/F380, utilisé pour estimer la variation de la [Ca ]i.

II.2.9. Mesure du potassium intracellulaire

Principe Le K+ intracellulaire est dosé grâce à un indicateur fluorescent, le PBFI ( potassium- binding benzofuran isophthalate ). Cet indicateur est formé de deux fluorophores benzofuranes isophthalates liés à l’azote d’une diaza-éther-couronne (Fig. 2.4). La taille de la cavité confère la sélectivité pour le K +. En absence de K + et à pH 7 le coefficient d’extinction est de 42.000 cm -1 M -1 à 345 nm. La fixation de K + entraîne une augmentation de l’intensité de la fluorescence. La fluorescence n’est pas affectée par des variations de pH entre 6,5 et 7,5. + + L’affinité du PBFI pour le K dépend de la concentration de Na . Le K d est d’environ 100 mM en présence de Na + et de 10 mM en absence de Na +. Le PBFI est seulement 1,5 fois plus + + + sélectif pour le K que pour le Na , mais étant donné que la [K ]i est dix fois plus importante que celle du Na +, cet indicateur peut être utilisé pour des dosages du K + intracellulaire.

77 Matériel et Méthodes

Figure 2.4 : Structure chimique du PBFI/AM (Source : Molecular Probes). Les cellules sont incubées en présence de l’acétoxyméthylester du PBFI (PBFI/AM). Cet ester, plus lipophile, passe plus facilement à travers la membrane plasmique. Une fois à l’intérieur des cellules, il est clivé par des estérases en la forme acide du PBFI. Afin d’obtenir un meilleur rendement du chargement des cellules en indicateur, de l’acide pluronique F-127 est ajouté. Ce détergent non-ionique facilite le chargement des cellules en PBFI/AM, peu soluble en solution aqueuse. Les mesures sont généralement faites en excitant les cellules à deux longueurs d’onde, à 340 nm (excitation maximale) et à 380 nm (point isobestique), et en mesurant l’émission à 500 nm. Ce rapport des fluorescences peut être utilisé pour déterminer la concentration en K +. Ce paramètre n’est pas affecté par la quantité de cellules ni par le chargement en indicateur. Cependant, nous avons observé que le signal obtenu en excitant les macrophages à 380 nm était très faible, empêchant l’utilisation du rapport afin de calculer la concentration intracellulaire de potassium. Les résultats sont donc exprimés sous forme d’unités arbitraires de fluorescence ou de pourcentage de la fluorescence initiale.

Protocole expérimental Les macrophages incubés pendant une nuit à 37°C dans une atmosphère contenant 5 %

CO 2, sont lavés deux fois avec du milieu PBS, décrochés à l’aide d’un grattoir et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. Les macrophages ou les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires sont ensuite resuspendus dans du milieu d’incubation I. La solution de PBFI/AM est préparée comme décrit ci-après. Une solution d’acide pluronique F- 127 à 20 % est préparée en ajoutant 500 µl de DMSO à 100 mg d’acide pluronique. Vingt- cinq microlitres de cette solution ainsi que 25 µl de DMSO sont ensuite ajoutés dans un tube contenant 50 µg de PBFI/AM. On a ainsi une solution à 1 µg/µl ce qui correspond à une concentration de 1 mM en PBFI/AM. Des cellules sont chargées en présence de 3 µM de PBFI/AM pendant au moins 90 minutes, à 25°C, à l’obscurité. Les suspensions de cellules sont mélangées régulièrement et à la fin de l’incubation les cellules sont lavées. Les culots sont ensuite mis en suspension dans 2 ml de milieu If normal ou dans du milieu If riche en K + contenant 100 mM de KCl, en présence de CaCl 2 1 mM. Les dosages sont effectués à 25°C, sous agitation, à l’aide d’un fluorimètre (SLM Aminco Bowman, Urbana, IL, Etats-Unis ou Photon Technology International, Birmingham, NJ, Etats-Unis). Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont 345 et 485 nm. Les produits à tester sont ajoutés aux temps souhaités.

78 Matériel et Méthodes

II.2.10. Mesure des espèces réactives de l’oxygène (ROS)

Principe Afin de mesurer la production intracellulaire de ROS, les cellules sont incubées en présence de 2’,7’-dichlorodihydrofluorescéine diacétate (DCFH/DA). Ce produit passe facilement à travers la membrane plasmique à l’intérieur des cellules où il est clivé par des estérases en 2’,7’-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH), non fluorescent. Le DCFH reste dans le cytoplasme des cellules où il peut être oxydé en 2’,7’-dichlorofluorescéine (DCF) fluorescent (Fig. 2.5).

Figure 2.5 : Mécanisme de la déestérification du DCFH/DA en DCFH et oxydation consécutive en DCF par des ROS (Gomes et al., 2005).

Le DCFH est oxydé par le peroxyde d’hydrogène ainsi que par des peroxydes organiques en présence d’un catalyseur, tel que la peroxydase. Il est également oxydé par des peroxynitrites, par contre ni l’oxyde nitrique ni l’anion superoxyde n’oxydent le DCFH (Gomes et al., 2005 ; Bartosz et al., 2006).

79 Matériel et Méthodes

Protocole expérimental Après une nuit d’incubation, les macrophages sont lavés deux fois avec du milieu PBS, décrochés à l’aide d’un grattoir et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. Les macrophages ou les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires sont resuspendus dans du milieu d’incubation I. Des aliquotes des suspensions cellulaires sont incubés en présence de 6 µM DCFH/DA pendant 45 minutes à 25°C, à l’abri de la lumière. Après incubation les cellules sont lavées et resuspendues dans 2 ml de milieu If contenant du

CaCl 2 1 mM. La fluorescence est mesurée à 25°C à l’aide d’un fluorimètre (SLM Aminco Bowman, Urbana, IL, Etats-Unis ou Photon Technology International, Birmingham, NJ, Etats-Unis). Les échantillons, sous agitation, sont excités à 485 nm et la lumière émise est mesurée à 525 nm. Les produits à tester sont ajoutés aux temps souhaités.

II.2.11. Mesure de la perméabilité membranaire

Principe La perméabilisation membranaire est mesurée à l’aide du colorant fluorescent bromure d’éthidium (Di Virgilio et al., 1989). C’est une molécule chargée qui ne pénètre généralement que très lentement à travers la membrane plasmique. L’ion éthidium a un poids moléculaire de 314 Da. Lorsque la perméabilité de la membrane plasmique est altérée le colorant pénètre à l’intérieur des cellules et il peut s’y intercaler entre deux brins d’acide nucléique. Ainsi sa fluorescence augmente.

Protocole expérimental Après avoir été incubés pendant une nuit, les macrophages sont lavés deux fois avec du milieu PBS. Ils sont ensuite décrochés à l’aide d’un grattoir et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. Les macrophages sont resuspendus dans du milieu d’incubation I. Avant chaque mesure 0,5 ml sont prélevés et lavés, puis les cellules sont resuspendues dans 2 ml de milieu If dépourvu de calcium. Le bromure d’éthidium est ajouté à une concentration finale de 20 µM. Après 5 minutes d’incubation, on débute la mesure de la fluorescence, qui se fait à 37°C et sous agitation constante (SLM Aminco Bowman, Urbana, IL, Etats-Unis). Les échantillons sont excités à 360 nm et la lumière émise à 580 nm est mesurée chaque seconde.

80 Matériel et Méthodes

A la fin de la mesure les cellules sont perméabilisées avec 100 µM de digitonine afin d’estimer la captation d’indicateur lors de la perméabilisation totale des cellules. La fluorescence mesurée en présence de digitonine est prise comme valeur maximale de référence.

II.2.12. Mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH)

Principe La lactate déshydrogénase (LDH) est l'enzyme qui catalyse l'oxydation du L-lactate en pyruvate, en présence d’un accepteur d’électrons, le NAD + (Fig. 2.6). Le pH optimal de la réaction d’oxydation du L-lactate en pyruvate est de 8,8 à 9,8 ; celui de la réaction inverse est de 7,4 à 7,8. La température optimale est de 30 à 37°C.

Figure 2.6 : Oxydation du L-lactate en pyruvate en présence de la LDH.

La LDH est une enzyme intracellulaire d’environ 135 kDa, présente dans le cytoplasme de pratiquement toutes les cellules. La présence de la LDH dans le milieu extracellulaire témoigne de la destruction des membranes plasmiques et donc d’une souffrance cellulaire. La méthode de dosage de la LDH libérée est adaptée de la méthode développée par la Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology (1974). A pH 7,4 et à 30°C la LDH va réduire le pyruvate en lactate et oxyder le NADH en NAD +. Le NADH absorbe la lumière à 340 nm, contrairement au NAD + n’absorbant pas à cette longueur d’onde. En fournissant du pyruvate et du NADH, on peut donc suivre la diminution de l’absorbance due à la consommation du NADH par la LDH.

81 Matériel et Méthodes

Protocole expérimental Les macrophages péritonéaux sont prélevés et incubés comme décrit précédemment. Après une nuit d’incubation les cellules sont lavées deux fois avec du PBS puis elles sont décrochées. Après centrifugation pendant 10 minutes à 1500 x g, les cellules sont resuspendues dans du milieu If contenant 0,1 % de BSA et 1 % de mélange d’acides aminés.

Les macrophages sont ensuite incubés dans ce même milieu, en présence de CaCl 2 1 mM ainsi que des substances à tester. Chaque condition est testée en triple. L’incubation se fait à 37°C, sous agitation constante. A la fin de l’incubation les échantillons sont centrifugés pendant 5 minutes à 10.000 x g et 10 µl de surnageant sont placés dans les puits d’une plaque 96 puits. Une procédure similaire est appliquée à des cellules non incubées pour estimer la quantité de LDH présente dans le milieu au début de l’incubation (blancs). Une partie de la suspension cellulaire non incubée est sonifiée pour lyser les cellules et permettre la sortie de toute la LDH (estimation de la LDH totale). Dix microlitres de cette suspension sont déposés dans les puits correspondant aux totaux. Ensuite 190 µl d’un milieu contenant du TRIS 56 mM (pH 7,4), de l’EGTA 5,6 mM et du NADH 170 µM, et 20 µl d’une solution de pyruvate 14 mM sont successivement ajoutés dans chaque puits. L’absorbance est alors mesurée à 340 nm, toutes les 30 secondes pendant 20 minutes, à 30°C à l’aide d’un lecteur de microplaques Synergy TM HT (BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis). La variation de l’absorbance par minute est calculée et les valeurs des blancs sont soustraites des résultats obtenus avec les cellules incubées. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’activité de la LDH totale.

II.2.13. Test de cytotoxicité (test MTT)

Principe Le test colorimétrique MTT permet de quantifier l’activité mitochondriale de cellules en culture, et donc de mesurer la viabilité cellulaire. Les cellules sont incubées en présence d’un sel de tétrazolium soluble et de couleur jaune, le MTT. Le MTT est ensuite réduit en cristaux insolubles de formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes (Fig. 2.7). Les cristaux de formazan sont solubilisés par du DMSO et une solution pourpre est obtenue. L’absorbance mesurée à 540 nm est proportionnelle au nombre de cellules métaboliquement actives.

82 Matériel et Méthodes

Figure 2.7 : Réduction du MTT en formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale.

Protocole expérimental Après leur prélèvement les macrophages péritonéaux sont resuspendus dans du milieu RPMI et ils sont comptés à l’aide d’une cellule de Neubauer. Les cellules sont placées dans les puits d’une plaque 96 puits, à l’exception des puits du bord, à raison de 100.000 cellules par puits. La plaque est incubée pendant 3 heures à 37°C et sous une atmosphère de 5 % de

CO 2. A la fin de ces 3 heures, la plaque est retournée au-dessus de papier absorbant pour éliminer le milieu. Deux cents µl de milieu RPMI frais contenant 250 ng/ml de LPS sont placés dans les puits. Après une nuit d’incubation à 37°C et sous une atmosphère de 5 % CO 2, le milieu de culture est éliminé et les macrophages sont lavés avec du milieu PBS. Les cellules sont ensuite incubées pendant 1 heure à 37°C dans du milieu If contenant du BSA

(0,1 %), le mélange d’acides aminés (1 %) et du CaCl 2 (1 mM), en présence des substances à tester. A la fin de l’incubation le milieu est enlevé et les macrophages sont mis en contact avec du milieu contenant 1 mg/ml de MTT pendant 3 heures et demie à 37°C. Ensuite la plaque est centrifugée pendant 10 minutes à 200 x g, à 25°C. Le milieu est enlevé et les cristaux de formazan formés sont solubilisés par ajout de 100 µl de DMSO. Après 1 minute d’agitation, l’absorbance est mesurée à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (Synergy TM HT, BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis).

83 Matériel et Méthodes

II.2.14. Mesure de l’activité de la phospholipase A2 (PLA 2)

Principe

Afin de déterminer l’activité de la PLA 2 les cellules sont incubées en présence d’acide 3 oléique marqué par du tritium, l’acide 9,10-[ H] oléique : CH 3-(CH 2)7-CH*=CH*-(CH 2)7- COOH. Cet acide gras insaturé est alors incorporé en position 2 dans les glycérophospholipides, qui sont constamment dégradés et renouvelés au sein des cellules. Une stimulation de l’activité de la PLA 2 a pour conséquence la libération dans le milieu extracellulaire des acides gras en position 2 des glycérophospholipides, et donc une augmentation de la radioactivité dans ce milieu extracellulaire (Fig. 2.8).

Figure 2.8 : Structure de la phosphatidylcholine et site d’hydrolyse par la PLA 2.

Protocole expérimental Les macrophages sont incubés pendant une nuit à 37°C et sous une atmosphère de 5 % 3 de CO 2, dans du milieu RPMI contenant 250 ng/ml de LPS et 1,67 µCi/ml d’acide 9,10-[ H] oléique. Le lendemain, le milieu de culture est éliminé et les macrophages sont lavés avec du milieu PBS. Après lavage, 10 ml de milieu RPMI sans LPS et sans acide 9,10-[3H] oléique sont ajoutés dans la boîte qui est placée à 37°C et sous une atmosphère de 5 % CO 2 pendant 1

84 Matériel et Méthodes heure, afin d’éliminer l’acide 9,10-[3H] oléique qui n’a pas été incorporé dans des glycérophospholipides. Le milieu de culture est ensuite éliminé et les macrophages sont lavés avec du milieu PBS. Ils sont décrochés à l’aide d’un grattoir et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g. Le culot est resuspendu dans du milieu If contenant 0,1 % de BSA et 1 % de mélange d’acides aminés. Cent microlitres de cellules sont alors transférés dans des tubes contenant 400 µl de ce même milieu, du CaCl 2 1 mM et les substances à tester. Les cellules sont incubées à 37°C, sous agitation. Chaque condition est testée en triple. A la fin de l’incubation les tubes sont centrifugés pendant 5 minutes à 10.000 x g et 400 µl de surnageant sont transférés dans des flacons de scintillation. Afin d’estimer la quantité d’acide 9,10-[3H] oléique présent dans le milieu au début de l’incubation, trois échantillons sont centrifugés immédiatement sans incubation (blancs). Des échantillons de cellules sont également prélevés et transférés sans centrifugation préalable dans des flacons de scintillation, permettant d’estimer la quantité d’acide 9,10-[3H] oléique incorporé dans les glycérophospholipides des cellules (totaux). Cinq millilitres de liquide de scintillation Ecoscint A sont ajoutés dans les flacons de scintillation et la radioactivité est mesurée pendant deux fois cinq minutes dans un compteur à scintillation liquide Tri-Carb ® 2900 TR (PerkinElmer, Waltham, MA, Etats-Unis). Grâce à une standardisation interne le compteur évalue le rendement de chaque comptage et convertit les coups par minute en désintégration par minute. La valeur des blancs est soustraite des autres valeurs. Les résultats sont exprimés en pourcentage de radioactivité par rapport à la radioactivité totale incorporée dans les cellules.

II.2.15. Dosage de l’interleukine-1β (β ( IL-1β) par ELISA

II.2.15.1. Préparation des échantillons

L’IL-1β est dosée soit dans les cellules, soit dans le surnageant afin de mesurer la sécrétion de cette cytokine. L’IL-1β sécrétée est dosée dans le surnageant de macrophages ou de cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires incubés dans différentes conditions. Les macrophages sont prélevés et 500.000 cellules sont placées dans les puits d’une plaque contenant 12 puits. Après 3 heures d’incubation à 37°C dans une atmosphère de

5 % de CO 2, du milieu RPMI frais est ajouté aux cellules qui sont incubées pendant une nuit. Les macrophages sont incubés en présence de LPS 250 ng/ml pendant 4 heures ou pendant

85 Matériel et Méthodes une nuit. Les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires sont préparées comme décrit précédemment (II.2.3.), puis elles sont resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Suite à l’incubation des cellules dans différentes conditions (voir partie Résultats), le milieu d’incubation est prélevé et centrifugé pendant 5 minutes à 10.000 x g à 4°C. Les surnageant est sonifié et après centrifugation pendant 5 minutes à 10.000 x g à 4°C, le liquide surnageant contenant l’IL-1β est récupéré et gardé à -80°C jusqu’au dosage.

Afin de mesurer le contenu en IL-1β dans les cellules, les macrophages ou les cellules des glandes sous-maxillaires (suspension brute ou canaux et acini séparés) sont incubés pendant 2 heures à 37°C, en condition contrôle ou en présence de 250 ng/ml de LPS. Les macrophages sont incubés dans des boîtes de culture dans du milieu RPMI. A la fin de l’incubation ils sont lavés deux fois avec du PBS, puis décrochés et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. L’incubation des cellules de la suspension brute de glandes sous- maxillaires se fait dans du milieu I. Après incubation, les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 10.000 x g. Un millilitre de tampon de lyse froid (HEPES 25 mM, NaCl 300 mM,

MgCl 2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, Triton X-100 0,1 %, inhibiteurs de protéases 2,5 µl) est ajouté au culot de cellules. Après 10 minutes sur glace, les échantillons sont sonifiés puis centrifugés pendant 5 minutes à 10.000 x g à 4°C. Le surnageant est gardé à -80°C jusqu’au dosage.

II.2.15.2. Dosage de l’IL-1βββ

La plaque 96 puits pour le dosage ELISA est préparée la veille du dosage. Cent microlitres d’une solution d’anticorps primaire polyclonal anti-IL-1β à 1 µg/ml dans du PBS sont placés dans les puits de la plaque. La plaque est couverte et incubée à 4°C pendant la nuit. Le lendemain les puits de la plaque sont lavés deux fois à l’aide de 300 µl de solution de lavage contenant 50 mM de TRIS HCl (pH 7,5) et 0,2 % de Tween 20. Elle est ensuite incubée pendant 1 heure à température ambiante en présence de 300 µl d’une solution de blocage (4 % de BSA dans du PBS), puis de nouveau lavée quatre fois avec la solution de lavage.

Afin de réaliser une courbe étalon, différentes dilutions d’IL-1β (0-1000 pg/ml) sont préparées à partir d’une solution stock à 40 µg/ml d’IL-1β. Avant de réaliser les mélanges

86 Matériel et Méthodes entre échantillons et anticorps secondaire, des dilutions de ces échantillons sont réalisées. Les extraits cellulaires sont dilués 3 fois avec du tampon de lyse, la salive est diluée 3 fois avec de l’eau et les milieux surnageants sont dilués avec le milieu d’incubation correspondant. Ensuite 150 µl d’anticorps secondaire biotinylé anti-IL-1β (0,4 µg/ml dans du PBS contenant 1 % de BSA) sont ajoutés à 150 µl d’échantillon dilué ou de standard d’IL-1β. De ces mélanges 100 µl sont placés dans les puits de la plaque de dosage et la plaque est incubée pendant 2 heures à 37°C. Après plusieurs lavages, 100 µl de streptavidine-HRP à 0,2 µg/ml dans du PBS sont ajoutés dans tous les puits et la plaque est incubée pendant 30 minutes à température ambiante. Après plusieurs lavages, un substrat de la peroxydase, le 1 Step Ultra TMB-ELISA, est ajouté. Après 10 à 20 minutes une coloration bleue se développe suite à l’oxydation du substrat, la 3,3´,5,5´-tétraméthylbenzidine, par le peroxyde d’hydrogène (Josephy et al.,

1982). L’ajout de 100 µl de H 2SO 4 1,8 M arrête la réaction et un produit de coloration jaune apparaît. L’absorbance de ce produit peut être mesurée à 450 nm (BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis). Les deux anticorps reconnaissent la pro-IL-1β et l’IL-1β mature.

II.2.16. Mise en évidence de l’expression des récepteurs purinergiques, de l’expression et de la sécrétion de pro-IL-1βββ et d’IL- 1βββ et de la phosphorylation d’IκκκB par Western blot

II.2.16.1. Préparation des échantillons

A) Préparation des membranes pour la mise en évidence des récepteurs purinergiques Après une nuit d’incubation, les macrophages sont lavés deux fois avec du milieu PBS, décrochés à l’aide d’un grattoir et centrifugés pendant 10 minutes à 1500 x g, à 4°C. Les macrophages ou cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de quatre souris sont resuspendus dans 1 ml de tampon TEEI glacé, contenant 20 mM de TRIS (pH 8), 1 mM d’EGTA et 1 mM d’EDTA, ainsi qu’un mélange d’inhibiteurs de protéases (1:400). Afin de détruire les membranes, la suspension cellulaire est passée dix fois à travers une aiguille de gauge 19 (diamètre interne de 686 µm), puis dix fois à travers une aiguille de gauge 29 (diamètre interne inférieur à 184 µm). Après centrifugation pendant 10 minutes à 4°C, à 1000 x g, le surnageant contenant les fragments de membrane est transféré dans un tube pour

87 Matériel et Méthodes ultracentrifugation, et placé sur glace. Le culot est resuspendu dans 1 ml de tampon TEEI glacé et passé à travers les aiguilles. Cette opération est réalisée quatre fois au total. Tous les surnageants sont ensuite réunis et centrifugés à 100.000 x g, à 4°C, pendant 30 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot contenant les fragments de membrane est resuspendu dans 200 µl de tampon TEEI glacé contenant 0,3 % de Triton X-100, puis placé sur glace. Après 30 minutes, la suspension est passée à travers des aiguilles de gauge 19 et 29, puis elle est centrifugée pendant 10 minutes à 10.000 x g, à 4°C. Le surnageant contenant les protéines membranaires extraites est utilisé pour l’électrophorèse. A 60 µl d’échantillon sont ajoutés 4 µl de mercaptoéthanol, permettant de réduire les protéines, et 20 µl de tampon de charge NuPAGE ® LDS Sample Buffer 4X. Ce dernier contient notamment du glycérol, des colorants et du lithium dodécylsulfate, un détergent qui va linéariser les protéines et qui va leur conférer une charge négative.

B) Préparation des échantillons pour l’analyse de l’IL-1βββ Un Western blot est réalisé soit pour détecter l’IL-1β sécrétée (macrophages), soit pour sa mise en évidence dans les cellules (macrophages et glandes sous-maxillaires). Afin de détecter l’IL-1β sécrétée par les macrophages lors d’une incubation en présence de différentes substances, les macrophages sont incubés pendant une nuit dans une plaque de 12 puits (1,5 x 10 6 cellules/puits) dans 1 ml de milieu RPMI. Le lendemain les macrophages sont incubés pendant 4 heures en présence de 250 ng/ml de LPS. Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et elles sont ensuite incubées en présence des substances à tester, comme décrit dans la partie Résultats. A la fin de l’incubation le milieu surnageant est collecté et centrifugé pendant 5 minutes à 10.000 x g, à 4°C. Le surnageant est transféré dans un autre tube et il est sonifié pendant 10 secondes. Après centrifugation pendant 5 minutes à 10.000 x g, à 4°C, le surnageant est concentré à l’aide d’un filtre cut-off 3-kDa selon les instructions du fabricant (Pall Life Sciences, Port Washington, NY, Etats-Unis).

Pour la mise en évidence de l’IL-1β intracellulaire, les macrophages sont incubés pendant 4 heures en présence de 250 ng/ml LPS. Les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires sont préparées comme décrit précédemment (II.2.3.). Les cellules sont lysées dans 1 ml de tampon de lyse froid (Hepes 25 mM, NaCl 300 mM, MgCl 2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, Triton X-100 0,1 %, inhibiteurs de protéases 1:400). Après 10 minutes sur glace, les échantillons sont sonifiés pendant 10 secondes, puis centrifugés pendant 5 minutes à

88 Matériel et Méthodes

10.000 x g, à 4°C. Le surnageant des échantillons de glandes sous-maxillaires est concentré à l’aide d’un filtre cut-off 3-kDa. A 30 µl d’échantillon sont ajoutés 2 µl de mercaptoéthanol et 10 µl de tampon de charge NuPAGE ® LDS Sample Buffer 4X. Les échantillons sont gardés à -80°C jusqu’à l’électrophorèse.

C) Préparation des échantillons pour la mise en évidence de la phosphorylation d’IκκκB Les macrophages et les cellules de la suspension brute des glandes sous-maxillaires sont incubés pendant différents temps en présence de LPS 250 ng/ml, à 37°C, dans du milieu RPMI (macrophages) ou dans du milieu I (glandes sous-maxillaires). A la fin de l’incubation les cellules sont centrifugées et le culot est resupendu dans du tampon de lyse froid dont la composition est la suivante (mM) : NaCl 137, TRIS 20, EGTA 1, EDTA 1, orthovanadate de sodium 1, NaF 47,6, pyrophosphate de sodium 4,5, β-glycerophosphate de sodium 9,26, DTT 0,5 ; contenant 1 % de Triton X-100, 10 % de glycérol et des inhibiteurs de protéases (1:400). Les échantillons sont gardés 10 minutes sur glace, ils sont sonifiés pendant 10 secondes et ensuite ils sont centrifugés pendant 5 minutes à 10.000 x g à 4°C. Le surnageant est prélevé et le tampon de charge NuPAGE ® LDS Sample Buffer 4X ainsi que le mercaptoéthanol sont ajoutés.

II.2.16.2. Electrophorèse

Les échantillons sont chauffés pendant 10 minutes à 80°C (récepteurs P2X), pendant 10 minutes à 70°C (I κB) ou pendant 1 heure à 40°C (IL-1β), puis centrifugés à 10.000 x g pendant 10 minutes pour enlever les agrégats. Le surnageant est prélevé et l’équivalent de 10 µg de protéines membranaires est déposé sur un gel NuPAGE ®. Les protéines sont séparées par électrophorèse selon les conditions indiquées (Tableau 2.2) (Xcell II TM Mini-Cell, Novex, Invitrogen, Paisley, Ecosse).

89 Matériel et Méthodes

Gel Novex Tampon Electrophorèse

P2X 7 Bis-TRIS 4-12% NuPAGE MOPS SDS 50 minutes à 200V

P2X 4 Bis-TRIS 4-12% NuPAGE MOPS SDS 50 minutes à 200V (phospho)I κB Bis-TRIS 4-12% NuPAGE MES SDS 35 minutes à 200V IL-1β Bis-TRIS 12% NuPAGE MOPS SDS 50 minutes à 200V

Tableau 2.2 : Conditions d’électrophorèse.

II.2.16.3. Transfert

A la fin de cette séparation les protéines sont transférées par électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose de 0,2 µm (récepteurs P2X) ou une membrane PVDF de 0,45 µm (I κB, IL-1β) pendant 60 minutes à 30 volts.

II.2.16.4. Incubation en présence des anticorps

Après le transfert la membrane est lavée deux fois deux minutes avec une solution de

PBS-T (80 mM Na 2HPO 4, 20 mM NaH 2PO 4, 100 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) et ensuite elle est bloquée pendant 2 heures à 25°C avec du PBS-T contenant 5 % de lait en poudre. Après deux lavages au PBS-T, la membrane est incubée pendant une nuit à 4°C en présence de l’anticorps primaire (Tableau 2.3).

Anticorps Dilution Milieu d’incubation primaire (concentration finale) P2X PBS-T + 2,5% de lait en poudre 7 anti-récepteur P2X 7 1:200 (1,5 µg/ml)

P2X 4 anti-récepteur P2X 4 1:400 (1,5 µg/ml) PBS-T + 2,5% de lait en poudre

(phospho) anti-(phospho) 1:250 PBS-T + 1% de BSA IκB IκB IL-1β anti-IL-1β 1:250 (0,4 µg/ml) PBS-T + 2,5% de lait en poudre

Tableau 2.3 : Conditions d’incubation en présence des anticorps primaires.

Le lendemain, après plusieurs lavages avec du PBS-T, la membrane est exposée pendant 1 heure à 25°C à l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Tableau 2.4).

90 Matériel et Méthodes

Anticorps Dilution Milieu d’incubation secondaire (concentration finale) P2X 7 anti-lapin 1:6666 PBS-T + 2,5% de lait en poudre

P2X 4 anti-lapin 1:6666 PBS-T + 2,5% de lait en poudre

(phospho) I κB anti-lapin 1:6666 PBS-T + 1% de BSA IL-1β anti-chèvre 1:5000 (0,04 µg/ml) PBS-T + 2,5% de lait en poudre

Tableau 2.4 : Conditions d’incubation en présence des anticorps secondaires.

II.2.16.5. Révélation

La membrane est lavée plusieurs fois avec du PBS-T avant de procéder à la visualisation des protéines sur des films photographiques, grâce à un substrat chemiluminescent de la peroxydase (ECL Plus). L’oxydation du substrat Lumigen PS-3 en présence de peroxydase de raifort et de peroxyde produit des esters d’acridinium. Ces produits intermédiaires réagissent avec du peroxyde en milieu légèrement alcalin et forment un produit chemiluminescent avec une émission maximale à 430 nm. La lumière émise est détectée grâce à un film photographique BioMax MR. Le film est ensuite placé successivement dans le révélateur (2 minutes), dans de l’eau distillée (30 secondes) et dans le fixateur (5 minutes).

II.2.17. Mise en évidence des transcrits de la pro-IL-1βββ, du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88 par RT-PCR

II.2.17.1. Extraction des ARN totaux

Les ARN totaux de macrophages ou de cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires (de l’ordre de 1 x 10 7 cellules) sont extraits au moyen du kit « GenElute Mammalian Total RNA Miniprep » de Sigma, qui ne requiert pas l’utilisation de phénol ou de chloroforme. Après la lyse des cellules dans 500 µl de tampon de lyse contenant du thiocyanate de guanidium afin d’inactiver les RNases, les débris cellulaires sont enlevés lors du passage sur une colonne GenElute Filtration . Le filtrat est recueilli et un volume égal d’éthanol 70 % est ajouté à ce dernier. Les ARN sont ensuite isolés sur une colonne GenElute Binding et ils sont élués après plusieurs lavages à l’aide de 50 µl de solution d’élution.

91 Matériel et Méthodes

II.2.17.2. Transcription inverse des ARN en ADN complémentaires (ADNc)

La transcription inverse des ARN est réalisée à l’aide du kit « RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis » de Fermentas. Les ADNc sont synthétisés à partir des ARNm par la transcriptase inverse RevertAid H Minus M-MuLV, qui est une version génétiquement produite de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine Moloney. Les amorces utilisées sont des oligo(dT) reconnaissant la queue poly(A) en position 3’ des ARNm. Ce sont donc uniquement les ARNm qui sont utilisés pour la synthèse des ADNc. Les ARN totaux extraits sont mélangés avec 0,5 µg d’amorce oligo(dT). Après 5 minutes d’incubation à 70°C, différents réactifs sont ajoutés dans un ordre précis : le tampon de réaction, les inhibiteurs de ribonucléases RiboLock TM (20 U) ainsi que 1 mM de mélange de désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP). Les échantillons sont incubés pendant 5 minutes à 37°C. La transcriptase inverse est ajoutée (200 U) et les échantillons sont incubés pendant 60 minutes à 42°C. La réaction est arrêtée en chauffant pendant 10 minutes à 70°C et les échantillons sont conservés à -80°C.

II.2.17.3. Polymérisation en chaîne (PCR) des ADNc

Le mélange pour la PCR contient : 25 µl de Master Mix (0,05 U/µl Taq ADN polymérase, 4 mM MgCl 2, 0,4 mM de chaque dNTP), 0,25 µM de chacune des amorces (sens et antisens), 20 µl d’eau dépourvue de nucléases et 2,5 µl d’ADNc. Les amorces utilisées sont décrites dans le tableau 2.5. Les amorces pour le récepteur TLR4 et l’IL-1β ont été décrites par Yao et ses collaborateurs (2005 et 2006), et celles pour la mise en évidence de CD14 et de MyD88 par Applequist et ses collègues (2002). Une PCR avec les amorces de la β-actine est également réalisée et sert de contrôle positif. Un contrôle négatif est réalisé dans lequel l’ADNc a été remplacé par de l’eau. Les amplifications sont réalisées dans un thermocycleur ICycler (Bio-Rad, Hercules, CA, Etats-Unis) (Tableau 2.6).

92 Matériel et Méthodes

Nom du gène et Séquence amorces (5’ – 3’) Position Fragment n° GenBank amorces amplifié IL-1βββ Sens : AGCAGCTATGGCAACTGTTC 62-81 706 pb NM_008361 Antisens : CTCTGCAGACTCAAACTCCAC 747-767 TLR4 Sens : AGCAGAGGAGAAAGCATCTATGATGC 2017-2042 540 pb NM_021297 Antisens : GGTTTAGGCCCCAGAGTTTTGTT CTCC 2530-2556 CD14 Sens : CTAGTCGGATTCTATTCGGAGC 456-477 302 pb NM_009841 Antisens : AGACAGGTCTAAGGTGGAGAGG 736-757 MyD88 Sens : ATCCGAGAGCTGGAAACG 262-279 660 pb NM_010851 Anti sens : GCAAGGGTTGGTATAGTC 904-921 β -actine Sens : ACCCACACTGTGCCCATCTA 557 – 575 290 bp NM_007393 Antisens : CGGAACCGCTCGTTGCC 830 – 846

Tableau 2.5 : Amorces utilisées pour les RT-PCR.

Les conditions de la PCR pour la mise en évidence des ADNc de l’IL-1β, du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88 sont les suivantes :

Dénaturation Hybridation des Elongation par la Elongation Nom ADNc amorces avec l’ADNc Taq polymérase finale 30 cycles 1 cycle βββ IL-1 94°C 30 sec 60°C 45 sec 72°C 60 sec 72°C 5 min 35 cycles 1 cycle TLR4 94°C 30 sec 55°C 45 sec 72°C 60 sec 72°C 5 min 30 cycles 1 cycle CD14 96°C 60 sec 66°C 60 sec 72°C 90 sec 72°C 5 min 30 cycles 1 cycle MyD88 96°C 60 sec 54°C 60 sec 72°C 90 sec 72°C 5 min

Tableau 2.6 : Conditions des PCR réalisées.

II.2.17.3. Electrophorèse sur gel d’agarose

Les fragments amplifiés sont analysés sur gel d’agarose 2 % dans du tampon TBE (TRIS 100 mM, acide borique 50 mM, EDTA 2,5 mM). Vingt microlitres d’échantillon sont

93 Matériel et Méthodes mélangés avec 5 µl de tampon de charge contenant du xylène cyanol, du bleu de bromophénol et du glycérol. 15 µl du mélange sont déposés dans les puits, ainsi que 5 µl d’un marqueur de taille, le GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus. L’électrophorèse se déroule pendant au moins 90 minutes à 60 V. A la fin de l’électrophorèse, le tampon TBE est enlevé de la cuve et 50 ml d’une solution NaCl 0,1 M contenant 15 µl de colorant GelRed sont ajoutés dans la cuve. Ce colorant fluorescent s’intercale au niveau de la double hélice d’ADN et la rend donc fluorescente. Après 30 minutes, le gel est placé sur un transilluminateur et une photo est prise.

II.2.18. Séquençage de l’ADNc du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88

L’ADNc issu de la RT-PCR est d’abord purifié et concentré à l’aide du kit « DNA Clean & Concentrator TM -5 ». Une partie d’ADNc est mélangée avec deux parties de DNA binding buffer et le mélange est passé sur une colonne Zymo-Spin TM . Le filtrat est éliminé et l’ADNc fixé sur la colonne est lavé deux fois avant l’élution avec un petit volume d’eau. Pour le séquençage de produits de PCR purifiés, d’une taille allant de 300 à 1000 pb, il faut mélanger l’ADNc (5 ng/µl) avec une amorce reconnaissant le fragment à séquencer (15 pmoles), dans un volume minimal de 15 µl. L’ADNc purifié et concentré est dosé à l’aide du NanoDrop TM 2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA, Etats-Unis) et est ensuite dilué avec de l’eau. Pour chaque échantillon deux mélanges sont réalisés, le premier contenant 15 picomoles d’amorce sens et le deuxième contenant 15 picomoles d’amorce antisens. Les échantillons sont ensuite envoyés en Allemagne chez Eurofins MWG Operon. Cette société utilise la technique de « cycle sequencing », qui est une modification de la méthode de Sanger, pour le séquençage.

II.2.19. Détermination de la structure secondaire des peptides antimicrobiens à l’aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée (ATR-FTIR)

La structure secondaire des peptides KR-20 (5 mg/ml dans de l’HEPES 2 mM) et CRAMP (5 mg/ml dans du DMSO) est déterminée à l’aide de la spectroscopie infrarouge à

94 Matériel et Méthodes transformée de Fourier. Avant de commencer la mesure, 2 µl de CRAMP sont déposés pendant 10 minutes sur un disque de dialyse possédant des pores de 0,025 µm (Millipore VSWP02500) et flottant sur une solution d’HEPES 2 mM, pH 7,4. L’échantillon dialysé est ensuite utilisé pour l’analyse. Les spectres infrarouges des deux peptides sont obtenus comme décrit précédemment (Vigano et al., 2000). Un microlitre de la solution de peptide (KR-20 ou CRAMP dialysé) est déposé sur un élément de réflexion interne, constitué d’un diamant. Les échantillons sont séchés avec de l’azote. Les spectres sont obtenus à l’aide d’un spectrophotomètre Bruker IFS 55 FTIR (Bruker, Ettlingen, Allemagne), équipé avec un détecteur MCT (mercure cadmium tellure) refroidi par de l’azote liquide, à une résolution de 2 cm -1. Les spectres de la vapeur d’eau résiduelle contribuant au signal sont soustraits. L’échange hydrogène/deutérium est réalisé comme décrit par Vigano et collègues (2000). Les échantillons sont traités par de l’azote saturé au deutérium par passage à travers une série de quatre flacons contenant du deutérium. L’échange est analysé par la diminution de l’aire du pic amide II autour de 1550 cm -1 qui est sensible à l’échange hydrogène/deutérium comparé à l’aire du pic amide I de 1600-1700 cm -1 pris comme référence. Les spectres après deutération sont analysés par une technique de déconvolution spectrale, l’auto-déconvolution par Fourier (Goormaghtigh et al., 2006).

II.2.20. Analyse statistique des résultats

Afin de pouvoir appliquer des tests paramétriques plusieurs conditions doivent être respectées (taille des échantillons, distribution normale et égalité des variances). Etant donné le nombre restreint d’échantillons testés lors de ces expériences, les résultats ont été comparés à l’aide du test non paramétrique de Mann-Whitney, basé sur la comparaison de rangs entre deux groupes de données quantitatives (GraphPad Prism). Ce test ne tient pas compte de l’importance de la différence entre les résultats et il est donc moins puissant que le test paramétrique correspondant. *** P < 0,001 ; ** P < 0,01 ; * P < 0,05 ; non significatif P > 0,05.

95 Résultats : Expression des récepteurs P2X

CHAPITRE III : RESULTATS

EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X DANS LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES

Les récepteurs purinergiques sont des récepteurs ubiquitaires, exprimés par un grand nombre de cellules et de tissus, notamment par les glandes exocrines et par diverses cellules immunitaires. Parmi ces récepteurs, les sous-types P2X 4 et P2X 7 sont souvent co-exprimés. Avant d’étudier les réponses couplées à l’activation de ces récepteurs dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires, nous avons confirmé leur expression dans ces deux types de cellules.

III.1. L’EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X 7

L’expression de récepteurs P2X 7 dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT et P2X 7-KO a été analysée par Western blot. Ces expériences ont été effectuées en utilisant un anticorps dirigé contre la partie intracellulaire C-terminale du récepteur P2X 7. Les résultats confirment l’absence du récepteur P2X 7 dans les macrophages péritonéaux et les glandes sous-maxillaires des souris P2X 7-KO et sa présence dans les cellules des souris P2X 7-WT (Fig. 3.1).

Afin de vérifier si les récepteurs P2X 7 exprimés par les macrophages et les glandes 2+ sous-maxillaires de souris P2X 7-WT sont fonctionnels, un dosage de la [Ca ]i a été réalisé. En effet, l’activation de ces récepteurs par des concentrations élevées d’ATP ouvre un canal 2+ ionique laissant passer des cations tels que le Ca . Les macrophages de souris P2X 7-WT ou

P2X 7-KO ont été chargés avec du fura-2/AM. Après lavage, les cellules ont été resuspendues 2+ dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, et la [Ca ]i a été mesurée. Une augmentation 2+ rapide de la [Ca ]i a été observée dans les macrophages de souris P2X 7-WT en réponse à

96 Résultats : Expression des récepteurs P2X l’ATP 1 mM (Fig. 3.2 haut, de 113 ± 20 nM à 789 ± 151 nM 15 secondes après l’ajout d’ATP, n = 7). Cette augmentation rapide était suivie d’une augmentation soutenue pendant 2+ au moins 3 minutes (la [Ca ]i a atteint des valeurs de 1301 ± 164 nM 3 minutes après l’ajout d’ATP). Dans les macrophages de souris P2X 7-KO, l’ajout d’ATP 1 mM a provoqué une 2+ augmentation de la [Ca ]i plus faible que chez les souris P2X 7-WT (Fig. 3.2 bas, de 155 ± 9 nM à 197 ± 49 nM 15 secondes après l’ajout d’ATP, n = 3), et qui était transitoire.

Dans les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7- 2+ WT l’ajout d’ATP 1 mM a augmenté la [Ca ]i (Fig. 3.3 haut, de 110 ± 8 nM à 234 ± 30 nM 2+ 15 secondes après l’ajout d’ATP, n = 3). La [Ca ]i a continué à augmenter de manière progressive et soutenue pendant au moins 5 minutes jusqu’à atteindre des valeurs de 362 ± 16 nM. Le carbachol, un agoniste des récepteurs muscariniques, a provoqué une augmentation 2+ rapide et transitoire de la [Ca ]i (Fig. 3.3 haut, de 127 ± 8 nM à 257 ± 40 nM 15 secondes après l’ajout de carbachol, diminuant jusqu’à 199 ± 16 nM 5 minutes après l’ajout de carbachol, n = 3). Dans les cellules des souris P2X7-KO la réponse au carbachol a été 2+ similaire à la réponse obtenue chez les souris de type sauvage, la [Ca ]i a augmenté après 15 secondes de 117 ± 8 nM à 269 ± 30 nM et a diminué jusqu’à 201 ± 16 nM 5 minutes après l’ajout de carbachol (Fig. 3.3 bas, n = 6). Cette réponse au carbachol a montré que les cellules de souris P2X 7-KO étaient en bon état et possédaient des récepteurs fonctionnels. La réponse

à l’ATP a été diminuée par rapport à celle observée chez les souris P2X 7-WT : une augmentation de 107 ± 2 nM à 127 ± 2 nM (Fig. 3.3 bas, n = 3) a été observée 15 secondes après l’ajout d’ATP, cette augmentation était transitoire.

2+ Ces résultats confirment que l’ATP, à concentration élevée, augmente la [Ca ]i dans les macrophages et les cellules de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT, et que cette réponse est médiée principalement par les récepteurs P2X 7. La faible réponse des cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-KO à l’ATP n’était pas due à une mauvaise préparation de cellules, puisque ces mêmes cellules répondaient bien au carbachol.

97 Résultats : Expression des récepteurs P2X

Macrophages kDa

P2X 7 64

WT KO

Glandes sous-maxillaires kDa

P2X 7 64

KO WT

Figure 3.1 : Mise en évidence par Western blot des récepteurs P2X 7 dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Les protéines membranaires des macrophages et des glandes sous-maxillaires de souris P2X 7- KO et P2X 7-WT ont été extraites comme décrit dans la partie Matériel et méthodes. Les échantillons ont ensuite été séparés par électrophorèse et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Après incubation avec un anticorps anti-récepteur P2X 7, dirigé contre la partie C-terminale intracellulaire du récepteur, puis avec un deuxième anticorps anti-lapin couplé à la peroxydase, les protéines immunoréactives ont été mises en évidence grâce au substrat de la peroxydase, ECL Plus. Les films illustrés ici sont représentatifs de 3 expériences.

98 Résultats : Expression des récepteurs P2X

Macrophages souris P2X 7-WT 1750 ATP 1 mM (n=7) 1500

1250

1000 (nM) i ] 2+ 750 [Ca

500 ATP

250

0 1 2 3 4 5 Temps (minutes)

Macrophages souris P2X 7-KO 1750 ATP 1 mM (n=3) 1500

1250

1000 (nM) i ] 2+ 750 [Ca

500 ATP

250

0 1 2 3 4 5 Temps (minutes)

2+ Figure 3.2 : Effet de l’ATP 1 mM sur la [Ca ]i de macrophages. Les macrophages de souris P2X 7-WT ou P2X 7-KO, stimulés pendant 1 nuit en présence de LPS 250 ng/ml, ont été incubés avec du fura-2/AM. Les cellules ont ensuite été incubées dans du milieu If en présence de CaCl 2 1 mM, à 25°C. Deux minutes après le début de l’expérience, les cellules ont été stimulées par l’ATP 1 mM. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique, la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

99 Résultats : Expression des récepteurs P2X

Glandes sous-maxillaires souris P2X 7-WT

400 ATP 1 mM (n=3) Cb 100 µµµM (n=3)

300 (nM) i ]

2+ 200 ATP/Cb [Ca

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Temps (minutes)

Glandes sous-maxillaires souris P2X 7-KO

400 ATP 1 mM (n=3) Cb 100 µµµM (n= 6)

300 (nM) i ]

2+ 200 ATP/Cb [Ca

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Temps (minutes)

2+ Figure 3.3 : Effet de l’ATP 1 mM et du carbachol 100 µM sur la [Ca ]i de glandes sous- maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ou P2X 7-KO ont été incubées avec du fura-2/AM. Les cellules ont ensuite été incubées dans du milieu If en présence de CaCl 2 1 mM, à 25°C. Deux minutes après le début de l’expérience, les cellules ont été stimulées par l’ATP 1 mM ou le carbachol (Cb) 100 µM. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique, la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

100 Résultats : Expression des récepteurs P2X

III.2. L’EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X 4

L’expression de récepteurs P2X 4 a ensuite été étudiée à l’aide d’un anticorps anti- récepteur P2X 4, dirigé contre la partie C-terminale de ce récepteur. L’analyse des films obtenus suite au Western blot montre la présence d’une bande correspondant à une protéine d’environ 54 kDa, reconnue par l’anticorps anti-récepteur P2X 4, et ce aussi bien pour les macrophages que pour les glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT et P2X 7-KO (Fig. 3.4).

Macrophages kDa 64

P2X 4 51 KO WT

Glandes sous-maxillaires kDa 64

P2X 4 51

WT KO

Figure 3.4 : Mise en évidence par Western blot des récepteurs P2X 4 dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Les protéines membranaires des macrophages ou des glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-KO et P2X 7-WT ont été extraites comme décrit dans la partie Matériel et méthodes. Les échantillons ont ensuite été séparés par électrophorèse et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Après incubation avec un anticorps anti-récepteur P2X4, puis un deuxième anticorps couplé à la peroxydase, les protéines immunoréactives ont été mises en évidence grâce au substrat de la peroxydase, ECL Plus. Les films illustrés ici sont représentatifs de 3 expériences.

101 Résultats : Expression des récepteurs P2X

Un dosage de calcium a ensuite été effectué en présence ou en absence d’ivermectine, une lactone macrocyclique qui potentialise les réponses couplées au récepteur P2X 4 (Priel et Silberberg, 2004). Comme le montre la figure 3.5, une faible concentration d’ATP (10 µM) a 2+ provoqué une augmentation faible et transitoire de la [Ca ]i dans les macrophages de souris

P2X 7-KO (de 46 ± 10 nM à 238 ± 36 nM 15 secondes après l’ajout d’ATP, diminuant jusqu’à 94 ± 13 nM 3 minutes après l’ajout d’ATP, n = 6). Chez les macrophages incubés en 2+ présence d’ivermectine, la variation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP 10 µM a été augmentée et prolongée (Fig. 3.5, de 51 ± 10 nM à 321 ± 47 nM 15 secondes après l’ajout d’ATP, et 397 ± 58 nM 3 minutes après l’ajout du nucléotide, n = 5). Ceci confirme que les macrophages 2+ expriment des récepteurs P2X 4 fonctionnels, ouvrant un canal cationique perméable au Ca .

700

600 ATP 10 µM (n=6) ATP + Ivermectine 3 µM (n=5) 500

400 (nM) i ] 2+ 300 [Ca

200 Ivermectine ATP

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (minutes)

2+ Figure 3.5 : Effet d’une combinaison ATP plus ivermectine sur la [Ca ]i de macrophages. Les macrophages de souris P2X 7-KO, préalablement stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit, ont été chargés avec du fura-2/AM. Les cellules ont ensuite été incubées à 25°C dans du milieu If, en présence de 1 mM CaCl 2. Deux minutes après le début de la mesure, de l’ivermectine 3 µM a été ajouté à certains échantillons. A 5 minutes de l’ATP 10 µM a été ajouté au milieu d’incubation. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

102 Résultats : Expression des récepteurs P2X

Dans les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7- 2+ WT, l’ajout d’ATP 10 µM n’a pas augmenté la [Ca ]i (Fig. 3.6, n = 3). Cependant, en 2+ présence d’ivermectine 3 µM, le nucléotide a provoqué une augmentation rapide de la [Ca ]i (Fig. 3.6, de 148 ± 29 nM à 217 ± 47 nM 15 secondes après l’ajout d’ATP) restant stable pendant au moins 3 minutes (219 ± 52 nM 3 minutes après l’ajout d’ATP, n = 3). Les glandes sous-maxillaires expriment donc également des récepteurs P2X 4 fonctionnels.

400 ATP 10 µµµM (n=3) ATP + Ivermectine 3 µµµM (n=3)

300

Ivermectine ATP (nM) i ] 200 2+ [Ca

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

2+ Figure 3.6 : Effet d’une combinaison ATP plus ivermectine sur la [Ca ]i de glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du fura-2/AM. Les cellules ont ensuite été incubées à 25°C dans du milieu If, en présence de 1 mM CaCl 2. Deux minutes après le début de la mesure, de l’ivermectine 3 µM a été ajouté à certains échantillons. A 5 minutes de l’ATP 10 µM a été ajouté au milieu d’incubation. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

103 Résultats : Régulation de la production de ROS

CHAPITRE IV: RESULTATS

PRODUCTION DE ROS EN REPONSE A L’ATP DANS LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES

IV.1. INTRODUCTION Considérés pendant longtemps comme produits secondaires du métabolisme cellulaire, les ROS sont aujourd’hui reconnus comme acteurs de la défense contre les pathogènes et de la signalisation cellulaire. La production de ROS est une réponse majeure à l’invasion de micro- organismes et contribue à l’élimination de ces derniers. Les phagocytes expriment une NADPH oxydase qui subit une translocation vers la membrane suite à son activation (Sheppard et al., 2005). Ce complexe enzymatique génère l’anion superoxyde, précurseur de divers ROS. Parmi les phagocytes, les macrophages sont une source majeure de ROS. Ils produisent des ROS non seulement après exposition à des pathogènes, mais également en réponse à l’ATP extracellulaire qui provoque l’activation de la NADPH oxydase via les récepteurs purinergiques (Cruz et al., 2007 ; Pfeiffer et al., 2007 ; Noguchi et al., 2008 ; Moore et MacKenzie, 2009). Les cellules non phagocytaires produisent également des ROS. Geiszt et ses collaborateurs (2003) ont suggéré que la production de ROS par les glandes exocrines pourrait jouer un rôle protecteur et pourrait prévenir la colonisation de la lumière de ces glandes par des bactéries. Les glandes salivaires sont localisées à l’entrée du tractus digestif. La production de salive est essentielle pour le maintien de l’intégrité de la muqueuse orale. La xérostomie est fréquemment associée à des cancers et à des infections récurrentes de la cavité buccale (Brosky, 2007). En effet, la salive ne contient pas seulement des ions et des enzymes digestives, mais également des substances à propriétés fongicides, bactéricides ou virocides, comme les IgA, la peroxydase et le lysozyme (Amerongen et Veerman, 2002). Les glandes sous-maxillaires expriment de nombreux récepteurs, dont divers sous-types des récepteurs purinergiques. Il nous est apparu intéressant de rechercher une possible production de ROS en réponse à des agents purinergiques par les glandes salivaires. Nous avons essayé de mettre en évidence le récepteur ainsi que certains mécanismes intracellulaires impliqués

104 Résultats : Régulation de la production de ROS dans ce processus, afin de déterminer si la production de ROS est régulée de la même manière dans les glandes sous-maxillaires et les macrophages.

IV.2. RESULTATS

IV.2.1 Production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages péritonéaux

Les cellules du système immunitaire produisent des ROS en réponse à l’ATP extracellulaire. En 2003, Parvathenani et ses collaborateurs ont observé que la production de ROS en réponse à l’ATP dans les cellules de la microglie implique la stimulation de la

NADPH oxydase, secondaire à l’activation de récepteurs P2X 7. D’autres études ont montré l’implication de ces récepteurs purinergiques dans la production de ROS dans les monocytes ou les macrophages (Cruz et al., 2007 ; Pfeiffer et al., 2007 ; Kim et al., 2007 ; Noguchi et al., 2008 ; Hewinson et al., 2008 ; Moore et MacKenzie et al., 2009). Avant d’étudier la production de ROS chez les glandes sous-maxillaires, nous avons voulu reproduire ces résultats dans les macrophages péritonéaux de souris, grâce à l’utilisation de l’indicateur fluorescent DCFH/DA. Après incubation pendant 45 minutes en présence de l’indicateur, les macrophages ont été lavés et resuspendus dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. La fluorescence a été mesurée à 25°C à l’aide d’un fluorimètre Photon Technology International (Birmingham, NJ, Etats-Unis). Elle a augmenté légèrement au cours du temps (Fig. 4.1). Deux minutes après le début de la mesure, de l’ATP 1 mM ou de l’HEPES ont été ajoutés. Suite à l’ajout du nucléotide, la fluorescence a augmenté plus rapidement qu’en condition contrôle (Fig. 4.1). En considérant que l’augmentation de la fluorescence était secondaire à l’oxydation du DCFH en DCF, l’ATP extracellulaire a probablement augmenté la production de ROS dans les macrophages péritonéaux. En accord avec cette hypothèse, l’ajout de N- acétylcystéine (20 mM), un capteur de ROS, a inhibé l’augmentation de la fluorescence du DCF en condition basale et a complètement bloqué la réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.1).

105 Résultats : Régulation de la production de ROS

375000 ATP 1 mM (n=7) Contrôle (n=3) 325000 N-Acétylcystéine 20 mM + ATP 1 mM (n=3)

275000

225000

175000 ATP 1 mM Fluorescence(u.a.f.)

125000

75000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (minutes)

Figure 4.1 : Effet de l’ATP 1 mM sur l’oxydation du DCFH dans les macrophages. Les macrophages de souris P2X 7-WT, incubés pendant 1 nuit en présence de LPS 250 ng/ml, ont été chargés avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans 2 ml de milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, en absence (triangles) ou en présence (cercles) de N- acétylcystéine 20 mM. Les cellules ont ensuite été transférées dans la cuvette d’un fluorimètre (Photon Technology International, Birmingham, NJ, Etats-Unis). Deux minutes après le début de la mesure, certaines cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme d’unités arbitraires de fluorescence (u.a.f.) et ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique, la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

Comme décrit dans la littérature (Parvathenani et al., 2003 ; Noguchi et al., 2008 ; Hewinson et al., 2008 ; Moore et MacKenzie, 2009), cette production de ROS était secondaire à l’activation de la NADPH oxydase par l’ATP. Le DPI (500 µM), un inhibiteur de la NADPH oxydase et d’autres flavoprotéines (Cross et Jones, 1986), a inhibé la formation de ROS en réponse à l’ATP (Fig. 4.2, variation de la fluorescence de 878 ± 146 % par rapport au contrôle, pour l’ATP en présence de DMSO, n = 5 ; et de 131 ± 9 % par rapport au contrôle, pour l’ATP en présence de DPI, n = 4, P < 0,05). Dans les macrophages la production de ROS en réponse à l’ATP est régulée par des kinases (Pfeiffer et al., 2007). Des inhibiteurs de différentes kinases ont été testés sur la production de ROS. Le PD98059, un inhibiteur de

106 Résultats : Régulation de la production de ROS

MEK1 (Alessi et al., 1995), et la chélérythrine, un inhibiteur de la PKC (Herbert et al., 1990), n’ont pas eu d’effet sur la production de ROS en réponse à l’ATP (Fig. 4.2, variation de la fluorescence de 936 ± 85 % par rapport au contrôle, pour l’ATP en présence de PD98059, n = 3 ; et de 776 ± 132 % par rapport au contrôle, pour l’ATP en présence de chélérythrine, n = 3). L’inhibition de la PI3K par le LY294002 (Vlahos et al., 1994) n’a pas diminué la production de ROS de manière significative (Fig. 4.2, variation de la fluorescence de 551 ± 62 % par rapport au contrôle, n = 3, P > 0,05 quand comparé à l’ATP en présence de DMSO).

1000

750

500

250 *

Variation de la fluorescence deVariationcontrôle) dula (% 0 DMSO + DPI 500 µM + ATP PD98059 10 µ chélérythrine 5 µM + ATPLY294002 1 mM (3)

ATP 1 00 1 M mM ( + ATP 1 mM (3) µM + AT 1 mM (4) 5 ) P 1 mM (3)

Figure 4.2 : Caractérisation de la production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages. Les macrophages de souris P2X 7-WT, incubés pendant 1 nuit en présence de LPS 250 ng/ml, ont été chargés avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Les cellules ont été exposées pendant 10 minutes à 25°C à des conditions contrôle (DMSO) ou aux inhibiteurs mentionnés sur la figure. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Le rapport de la pente de la courbe entre 150 et 480 secondes après l’ajout de d’ATP, et de la pente de la courbe pendant les 120 secondes avant l’ajout d’ATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05 quand comparé à l’ATP 1 mM en présence de DMSO.

107 Résultats : Régulation de la production de ROS

La production de ROS en réponse à l’ATP est calcium-dépendante. En effet, l’incubation des macrophages dans un milieu dépourvu de calcium mais contenant de l’EGTA 100 µM, un chélateur de calcium, a diminué la production de ROS en réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.3, variation de la fluorescence de 741 ± 159 % par rapport au contrôle, n = 7, en présence de CaCl 2 1 mM ; et de 243 ± 78 % par rapport au contrôle, n = 4, en présence d’EGTA, P < 0,05).

Divers récepteurs purinergiques sont exprimés par les macrophages (Coutinho-Silva et al., 2005 ; Ito et al., 2008 ; Myrtek et al., 2008 ; Del Rey et al., 2006 ; Raouf et al., 2007 ; résultats chapitre III). Il a été montré que le récepteur P2X 7 contribue principalement à la production de ROS en réponse aux nucléotides dans les macrophages, grâce à l’utilisation de différents agonistes ou antagonistes de ces récepteurs, ainsi que de souris n’exprimant pas de récepteurs P2X 7 (Cruz et al., 2008 ; Pfeiffer et al., 2007 ; Noguchi et al., 2008). Le récepteur

P2X 7 diffère des six autres récepteurs P2X non seulement par sa structure (il possède un long domaine C-terminal intracellulaire, absent chez les autres récepteurs P2X), mais également par le fait qu’il a une très faible affinité pour l’ATP. En effet, l’EC 50 est de l’ordre des 100 micromolaires (Khakh et al., 2001). Les effets de l’ATP sont augmentés lorsque le milieu extracellulaire ne contient qu’une faible concentration en ions bivalents (Khakh et al., 2001 ; North, 2002). Nos résultats montrent que la production de ROS nécessite des concentrations élevées d’ATP. En effet, suite à l’ajout d’ATP 100 µM on observe une variation de la fluorescence de 193 ± 14 % par rapport au contrôle (Fig. 4.3, n = 4), contre 741 ± 159 % avec l’ATP 1 mM (Fig. 4.3, n = 7). L’effet du magnésium, qui, en présence d’ATP forme de l’ATPMg 2- et diminue ainsi la concentration d’ATP 4-, a été testé sur la production de ROS en réponse à l’ATP. En présence de MgCl 2 5 mM la production de ROS en réponse à l’ATP 1 mM a diminué (Fig. 4.3, variation de la fluorescence de 207 ± 35 % par rapport au contrôle, n

= 3, en présence de MgCl 2, P < 0,05). Le KN-62, un inhibiteur des récepteurs P2X 7 (North, 2002), a diminué la production de ROS en réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.3, variation de la fluorescence diminuée jusqu’à 327 ± 61 % par rapport au contrôle, n = 3).

108 Résultats : Régulation de la production de ROS

1000

750

500

*

250 *

Variation de la fluorescence contrôle) dula deVariation (% 0 ATP 100 µM ATP 1 mM (7) M KN- EGTA 100 µM + ATP 1 mM (4) gCl 6 2 2 5 1 0 m M + A µ M (4) +

T A P TP 1 1 m m M (3 M (3 ) )

Figure 4.3 : Rôle des récepteurs P2X 7 dans la production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages. Les macrophages de souris P2X 7-WT, incubés pendant 1 nuit en présence de LPS 250 ng/ml, ont été chargés avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues soit dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, soit dans du milieu If dépourvu de calcium et contenant de l’EGTA 100 µM. Certains échantillons ont été incubés en présence de KN-62 10 µM ou en présence de MgCl 2 5 mM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 100 µM ou 1 mM. Le rapport de la pente de la courbe entre 150 et 480 secondes après l’ajout de d’ATP, et de la pente de la courbe pendant les 120 secondes avant l’ajout d’ATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05 quand comparé à l’ATP 1 mM dans un milieu contenant du CaCl 2 1 mM et en absence de KN-62 ou de MgCl 2.

Tous ces résultats suggèrent que les récepteurs P2X 7 sont impliqués dans la formation de ROS. L’effet de l’ATP a ensuite été testé sur des macrophages de souris P2X 7-KO. Malgré l’absence de récepteur P2X 7 on observe une augmentation de la fluorescence et donc de la production de ROS suite à l’ajout du nucléotide à une concentration de 1 mM (Fig. 4.4). Dans le but de déterminer si des récepteurs P2Y interviennent dans la production de ROS suite à une stimulation par l’ATP chez les macrophages de souris P2X 7-KO, un inhibiteur de la PLC, l’U73122, a été testé (Bleasdale et al., 1990). La préincubation en présence d’U73122 10 µM

109 Résultats : Régulation de la production de ROS a bloqué l’effet de l’ATP 1 mM, la variation de la fluorescence étant de 186 ± 22 % par rapport au contrôle (Fig. 4.4, n = 6) après une préincubation avec l’U73122, contre 294 ± 35 % en absence d’inhibiteur (Fig. 4.4, n = 7, P < 0,05). La préincubation en présence d’U73343 10 µM, un analogue de l’U73122 inactif sur la PLC, n’a pas inhibé la formation de ROS (Fig. 4.4, variation de la fluorescence de 272 ± 27 % par rapport au contrôle, n = 5). L’effet de l’ivermectine sur la réponse à l’ATP a également été étudié. Suite à l’ajout d’ATP 10 µM, une augmentation de la production de ROS a été observée (Fig. 4.4, variation de la fluorescence de 294 ± 38 % par rapport au contrôle, n = 19). L’ivermectine 3 µM a potentialisé la réponse à l’ATP 10 µM (Fig. 4.4, variation de la fluorescence de 479 ± 59 % par rapport au contrôle, n = 19), suggérant que les récepteurs P2X 4 participent à la production de ROS dans les macrophages.

110 Résultats : Régulation de la production de ROS

600

500

400

300

*

(% du contrôle) du (% 200

Variation de la fluorescence la de Variation 100

0 DMSO + U7 U7 31 3 34 2 2 10 µM 3 1 A 0 TP 1 mM µ M + + A A T T (7 P P 1 mM ) 1 mM (

6 (5) )

600

500

400

300

(% du contrôle) du (% 200

Variation de la fluorescence la de Variation 100

0 ATP Iv er 3 10 µM + µM (19) ATP 10 µ M (19)

Figure 4.4 : Effet de l’ATP sur l’oxydation du DCFH chez les macrophages de souris P2X 7-KO. Les macrophages de souris P2X 7-KO, incubés pendant 1 nuit en présence de LPS 250 ng/ml, ont été chargés avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Figure du haut : Les cellules ont été incubées dans un milieu contenant du DMSO, de l’U73122 10 µM ou de l’U73343 10 µM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Figure du bas : Certaines cellules ont été incubées dans un milieu contenant de l’ivermectine (Iver) 3 µM. Cinq minutes après le début de la mesure, de l’ATP 10 µM a été ajouté aux cellules. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 90 secondes après l’ajout de d’ATP, et de la pente de la courbe pendant les 120 secondes avant l’ajout d’ATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05 quand comparé au DMSO plus ATP (figure du haut).

111 Résultats : Régulation de la production de ROS

IV.2.2. Production de ROS suite à l’activation de récepteurs purinergiques dans les glandes sous-maxillaires

Nous avons par la suite tenté de mettre en évidence une éventuelle production de ROS en réponse à l’ATP dans les glandes salivaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires, préincubées avec du DCFH/DA, ont émis de la lumière à une longueur d’onde de 525 nm, après avoir été excitées à 485 nm (Fig. 4.5). En condition basale, la fluorescence a augmenté faiblement au cours du temps. Cette augmentation était linéaire pendant au moins 7 minutes. L’ajout d’ATP 1 mM à la cuvette a provoqué une augmentation rapide de la pente de la courbe. La pente de la courbe pendant les 120 secondes suivant l’ajout d’ATP 1 mM était 2,6 ± 0,2 fois plus élevée que la pente de la courbe pendant les 60 secondes précédant l’ajout du nucléotide. L’ATP extracellulaire a donc augmenté l’oxydation du DCFH en DCF dans les glandes sous-maxillaires, signe d’une augmentation de la production de ROS.

2.1 Contrôle (n=26) 1.9 ATP 1 mM (n=32)

1.7

1.5 ATP 1 mM 1.3 Fluorescence(u.a.f.)

1.1

0.9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Temps (minutes)

Figure 4.5 : Effet de l’ATP 1 mM sur l’oxydation du DCFH dans les glandes sous- maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans 2 ml de milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, et elles ont été transférées dans la cuvette d’un fluorimètre (SLM Aminco Bowman, Urbana, IL, Etats-Unis). Deux minutes après le début de la mesure, certaines cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme d’unités arbitraires de fluorescence (u.a.f.) et ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique, la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

112 Résultats : Régulation de la production de ROS

L’ajout de N-acétylcystéine (20 mM) a inhibé l’augmentation de la fluorescence du DCF en condition basale (Fig. 4.6), la pente passant de 576 ± 42 x 10 -4 u.a.f. par minute (n = 43) à 441 ± 49 x 10 -4 u.a.f. par minute en présence de N-acétylcystéine (n = 16, P < 0,05). La réponse à l’ATP 1 mM a été complètement bloquée en présence de N-acétylcystéine (Fig. 4.6).

2.1 Contrôle (n= 43) ATP 1 mM (n=10) 1.9 N-Acétylcystéine 20 mM (n=16) N-Acétylcystéine 20 mM + ATP 1 mM (n=15)

1.7 ATP 1 mM

1.5

1.3 Fluorescence(u.a.f.)

1.1 ATP 1 mM

0.9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temps (minutes)

Figure 4.6 : Effet de la N-acétylcystéine sur l’oxydation du DCFH en réponse à l’ATP dans les glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, en absence (triangles) ou en présence (cercles) de N- acétylcystéine 20 mM. Sept minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme d’u.a.f. et ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique, la SEM n’a été représentée que pour un point sur vingt.

113 Résultats : Régulation de la production de ROS

Afin de déterminer si la N-acétylcystéine ne bloque pas l’interaction entre l’ATP et les 2+ récepteurs purinergiques, l’effet de ce capteur de ROS sur l’augmentation de la [Ca ]i en 2+ réponse à l’ATP a été analysé. En condition contrôle, une augmentation rapide de la [Ca ]i, suivie d’une augmentation progressive et soutenue a été observée suite à l’ajout d’ATP 1 mM 2+ (Fig. 4.7). En présence de N-acétylcystéine 20 mM, l’augmentation rapide de la [Ca ]i en réponse à l’ATP a été partiellement bloquée. Aucun effet n’a été observé sur l’augmentation 2+ progressive et soutenue de la [Ca ]i.

400 ATP 1 mM (n=3) ATP 1 mM + N-Acétylcystéine 20 mM (n=3)

300 (nM) i ] 2+ 200 [Ca

ATP 1 mM

100

0 1 2 3 4 5 6 7 Temps (minutes)

2+ Figure 4.7 : Effet de la N-acétylcystéine sur la [Ca ]i en réponse à l’ATP dans les glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT, chargées avec du fura-2/AM, ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, en absence (triangles) ou en présence (cercles) de N-acétylcystéine 20 mM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. A la fin de la mesure les tracés ont été calibrés par ajout successif de digitonine 100 µM, d’EGTA 40 2+ mM et de MnCl 2 100 mM, et la [Ca ]i a été calculée. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

114 Résultats : Régulation de la production de ROS

Les glandes sous-maxillaires n’expriment pas uniquement des récepteurs purinergiques, mais également des récepteurs muscariniques et adrénergiques. Des agonistes de ces récepteurs ont été testés afin de déterminer si la production de ROS est spécifique aux agonistes purinergiques (Fig. 4.8). La carbachol, un agoniste des récepteurs muscariniques, n’a pas eu d’effet sur la vitesse d’oxydation du DCFH (variation de la fluorescence de 104 ± 3 % par rapport au contrôle, n = 5). Le (-) isoprotérénol, un agoniste des récepteurs β- adrénergiques dont la stimulation entraîne l’activation de l’adénylate cyclase, a diminué la pente de la courbe (variation de la fluorescence de 44 ± 2 % par rapport au contrôle, n = 6). Cette inhibition a été reproduite dans deux expériences avec le (+) isoprotérénol, l’isomère inactif sur les récepteurs adrénergiques (variation de la fluorescence de 34 et 46 % par rapport au contrôle pour ces deux expériences). La forskoline, qui active également l’adénylate cyclase, n’a pas eu d’effet sur l’oxydation du DCFH (variation de la fluorescence de 100 ± 4 % par rapport au contrôle, n = 8). Ces résultats suggèrent que l’isoprotérénol pourrait être un capteur de ROS.

400

300

200

100

0 Variation de la fluorescence (% du contrôle) du (% fluorescence la de Variation ATP 1 Ca (- F ) o rb Isop rskol a c m h ro i M ol té ne 1 10 (3 rénol 2) 0 0 µM µM (8) 1 ( 00 µM 5 ) (6 ) Figure 4.8 : Effet de divers agonistes sur l’oxydation du DCFH dans les glandes sous- maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées aux agonistes mentionnés. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout de l’agoniste, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout de l’agoniste a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans agoniste). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

115 Résultats : Régulation de la production de ROS

IV.2.3. Caractérisation des récepteurs purinergiques impliqués dans la production de ROS dans les glandes sous-maxillaires

Les glandes sous-maxillaires expriment des récepteurs purinergiques métabotropes

(P2Y 1 et P2Y 2) et ionotropes (P2X 4 et P2X 7) (Dehaye et al., 1999 ; Turner et al., 1999 ; résultats chapitre III). Afin de déterminer si la production de ROS est secondaire à l’activation de récepteurs P2Y et/ou P2X, les cellules ont été exposées à l’U73122 ou à son analogue U73343. Ces deux aminostéroïdes n’ont pas affecté la réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.9, variation de la fluorescence de 263 ± 16 %, 236 ± 49 % et 205 ± 43 % par rapport au contrôle, avec l’ATP seul, en présence d’U73122, et en présence d’U73343 respectivement).

400

300

200

100

Variation de la fluorescenceducontrôle) deVariationla (% 0 A ATP ATP + U73343 TP 1 m + U73 M (32) 122 1 1 0 µM 0 µM (4)

(4)

Figure 4.9 : Effet d’un inhibiteur de la PLC sur l’oxydation du DCFH en réponse à l’ATP dans les glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, en condition contrôle ou en présence d’U73122 10 µM ou d’U73343 10 µM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout d’ATP, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout d’ATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

116 Résultats : Régulation de la production de ROS

L’effet de l’ivermectine sur la réponse à l’ATP a ensuite été étudié. Ce produit, à une concentration supra-maximale (100 µM), n’a pas modifié la production de ROS en réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.10, variation de la fluorescence de 269 ± 11 %, n = 4), suggérant que les récepteurs P2X 7 sont à l’origine de cette réponse plutôt que les récepteurs P2X 4. Les récepteurs P2X 7 sont activés par des concentrations élevées d’ATP. Nos résultats montrent que la production de ROS est augmentée suite à l’ajout d’ATP à des concentrations supérieures à 300 µM (Fig. 4.10). En présence de MgCl 2 5 mM, la production de ROS en réponse à l’ATP 1 mM a diminué de manière significative (Fig. 4.10, variation de la fluorescence de 263 ± 16 % par rapport au contrôle, n = 32, pour l’ATP seul ; et de 130 ± 6 % par rapport au contrôle, n = 4, en présence de MgCl2, P < 0,01). Le KN-62 et l’oATP, deux inhibiteurs des récepteurs P2X 7 (North, 2002), ont également bloqué la production de ROS en réponse à l’ATP (variation de la fluorescence diminuée jusqu’à 99 ± 8 % par rapport au contrôle, n = 6, P < 0,001, pour le KN-62 ; et jusqu’à 96 ± 12 % par rapport au contrôle, n =

6, P < 0,001, pour l’oATP). Le récepteur P2X 7 est moins sensible à l’ATP qu’à son analogue, le BzATP. Comme le montre la figure 4.10, 100 µM de BzATP ont augmenté la production de ROS presqu’autant que 1 mM d’ATP. Tous ces résultats suggèrent que les récepteurs P2X 7 sont impliqués dans la formation de ROS dans les glandes sous-maxillaires. Cette hypothèse a

été confirmée grâce à l’utilisation de souris P2X 7-KO. L’exposition de cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de ces souris à l’ATP 1 mM n’a pas augmenté l’oxydation du DCFH (Fig. 4.11).

117 Résultats : Régulation de la production de ROS

300

200

** *** *** 100 Variation de la fluorescence ducontrôle) dela Variation (% 0 ATP 100 ATP 300 A A B ATP 1 mM + ivermectineATP 1 m 100ATP µM 1 m(4) ATP 1 m TP 600 T z P A 1 T P mM 100 µM (11) µ µ µ M M + M M (4) M (3 M (3 + + (3) 2) M KN o ) gCl A -62 5 µM TP 2 5 100 µ m M (4) (6) M (6)

Figure 4.10 : Rôle des récepteurs P2X 7 dans l’oxydation du DCFH dans les glandes sous- maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, en condition contrôle ou en présence de 100 µM d’ivermectine, de 5 mM de MgCl 2, de 5 µM de KN-62 ou de 100 µM d’oATP. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées aux concentrations mentionnées d’ATP ou à 100 µM de BzATP. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout d’ATP/BzATP, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout d’ATP/BzATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans agoniste). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. ** P < 0,01 ; *** P < 0,001 quand comparé à l’ATP 1 mM.

118 Résultats : Régulation de la production de ROS

2.1

Souris P2X 7-WT (n=32) 1.9 Souris P2X 7-KO (n=7)

1.7

1.5 ATP 1 mM 1.3 Fluorescence(u.a.f.)

1.1

0.9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Temps (minutes)

Figure 4.11 : Effet de l’ATP 1 mM sur l’oxydation du DCFH dans les glandes sous- maxillaires de souris P2X 7-WT et P2X7-KO. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ou P2X 7-KO ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans 2 ml de milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, et elles ont été transférées dans la cuvette d’un fluorimètre (SLM Aminco Bowman, Urbana, IL, Etats-Unis). Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme d’u.a.f. et ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique, la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

IV.2.4. Mécanismes couplant l’activation des récepteurs P2X 7 à la production de ROS dans les glandes sous-maxillaires

Nous avons montré auparavant que l’activation de récepteurs P2X 7 dans les glandes sous-maxillaires provoque une entrée massive de calcium extracellulaire responsable d’une 2+ augmentation soutenue de la [Ca ]i (résultats chapitre III). L’incubation des cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires dans un milieu dépourvu de calcium mais contenant de l’EGTA 500 µM n’a pas eu d’effet sur la production de ROS en réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.12, variation de la fluorescence de 279 ± 40 % par rapport au contrôle, n = 4, P

= 0,6688 quand comparé au milieu contenant 1 mM de CaCl 2). Ce résultat suggère que l’ATP

119 Résultats : Régulation de la production de ROS

2+ n’augmente pas la production de ROS suite à une augmentation de la [Ca ]i. L’effet de deux 2+ molécules augmentant la [Ca ]i a ensuite été testé, l’ionomycine, un calcium ionophore, et la thapsigargine, qui bloque les ATPases du réticulum endoplasmique (Sagara et Inesi, 1991). L’ionomycine et la thapsigargine n’ont pas augmenté l’oxydation du DCFH de cellules incubées dans un milieu contenant du calcium extracellulaire (variation de la fluorescence de 92 ± 15 %, n = 3, et de 79 ± 8 %, n = 5, par rapport au contrôle, pour l’ionomycine et la thapsigargine respectivement). Ces résultats suggèrent que les ions Ca 2+ ne jouent pas de rôle dans la production de ROS en réponse à l’ATP.

400

300

200

100

Variation de la fluorescenceducontrôle) laVariation de (% 0 AT AT Io T n hapsigarg P 1 mM (32) P 1 omycin m M + e i E 5 µM ne 10 µM (5) G T A 500 µM (4 (3 )

)

2+ Figure 4.12 : Effet de divers agonistes augmentant la [Ca ]i sur l’oxydation du DCFH dans les cellules de glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM, ou dans du milieu If dépourvu de calcium et contenant de l’EGTA 500 µM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM, à l’ionomycine 5 µM ou à la thapsigargine 10 µM. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout de l’agoniste, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout de l’agoniste a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans agoniste). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

120 Résultats : Régulation de la production de ROS

Dans les monocytes/macrophages la production de ROS en réponse à l’ATP est régulée par des kinases. Des inhibiteurs de différentes kinases (Fig. 4.13) ont donc été testés sur la production de ROS. L’inhibition de la PI3K par le LY294002 n’a pas eu d’effet sur la production de ROS en réponse à l’ATP (Fig. 4.14, variation de la fluorescence de 187 ± 11 % par rapport au contrôle, n = 20, en présence de DMSO ; et de 199 ± 17 % par rapport au contrôle, n = 10, en présence de 100 µM de LY294002). Le bisindolylmaléimide (BIM I), un inhibiteur de la PKC (Toullec et al., 1991), a bloqué la réponse à l’ATP de manière dose- dépendante, à des concentrations de 1 à 10 µM (Fig. 4.14). La chélérythrine a également inhibé la réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.14, variation de la fluorescence de 137 ± 8 % par rapport au contrôle, n = 8, P < 0,05 quand comparé au DMSO plus ATP). L’inhibiteur de MEK1 PD98059 a bloqué la réponse à l’ATP (Fig. 4.14, variation de la fluorescence de 133 ± 11 % par rapport au contrôle, n = 10, P < 0,01 quand comparé au DMSO plus ATP).

Etant donné que les inhibiteurs de PKC (bisindolylmaléimide et chélérythrine) ont inhibé la production de ROS en réponse à l’ATP, l’effet d’un activateur de la PKC a été testé (Fig. 4.15). Le phorbol myristate acétate (PMA) n’a pas eu d’effet sur la fluorescence du DCFH (variation de la fluorescence de 101 ± 3 % par rapport au contrôle, n = 3), de même que la combinaison ionomycine plus PMA (variation de la fluorescence de 110 ± 3 % par rapport au contrôle, n = 3).

LY294002 BIM I chélérythrine PD98059

Figure 4.13 : Structure des inhibiteurs de différentes kinases utilisés.

121 Résultats : Régulation de la production de ROS

250

200

* ** 150 * **

100

50 Variation de la fluorescence (% du contrôle) fluorescence de la Variation

0 A ATP 1 ATP 1 ATP 1 mM + BIM ATP1 µM (5) ATP ATP TP 1 1 1 1 m m mM m m m M M M M M + + L + BIM 100 nM (4) + + + D B c P Y h D MSO IM élé 100 µM 1 1 00 0 µM (6) rythrin (20) µ M ( (10 10) e 5 µ ) M (8)

Figure 4. 14 : Effet des inhibiteurs de différentes kinases sur l’oxydation du DCFH en réponse à l’ATP dans les glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Elles ont été exposées pendant 10 minutes à 25°C à des conditions contrôle (DMSO), à 100 µM de LY294002 (LY), à différentes concentrations de bisindolylmaléimide (BIM), à 5 µM de chélérythrine ou à 100 µM de PD98059 (PD). Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout d’ATP, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout d’ATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05 ; ** P< 0,01 quand comparé au DMSO plus ATP.

122 Résultats : Régulation de la production de ROS

400

300

200

100

Variation de la fluorescencedu la contrôle) deVariation (% 0 AT PMA 1 µM (3 Ionomycine 5 µM + PMA 1 µM (3) P 1 m M (3 2 ) )

Figure 4.15 : Effet d’un activateur de la PKC sur l’oxydation du DCFH dans les glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM, au PMA 1 µM ou à l’ionomycine 5 µM. Cinq minutes plus tard, du PMA 1 µM a été ajouté aux échantillons stimulés par l’ionomycine. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout d’ATP/PMA, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout d’ATP/PMA a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

IV.2.5. Identification de la source de ROS produits suite à l’activation des récepteurs P2X 7 dans les glandes sous-maxillaires

Plusieurs mécanismes pourraient contribuer à la production de ROS, tels que la chaîne mitochondriale de transport des électrons ou des activités enzymatiques. Afin d’identifier la source de ces ROS, différents inhibiteurs (Fig. 4.16) ont été testés sur l’oxydation du DCFH

123 Résultats : Régulation de la production de ROS en réponse à l’ATP. La préincubation des cellules d’une suspension brute de glandes sous- maxillaires avec 1 µM d’oligomycine, un inhibiteur de l’ATPase mitochondriale, avec 1 µM de FCCP, un agent découplant la mitochondrie, avec 1 mM d’allopurinol, un inhibiteur de la xanthine oxydase, ou avec 1 mM de L-NAME, un inhibiteur de la NO synthase, n’a pas eu d’effet sur la réponse à l’ATP 1 mM (Fig. 4.17). A une concentration de 100 µM, l’apocynine, un inhibiteur de la translocation de la sous-unité p47 de la NADPH oxydase du cytoplasme jusqu’à la membrane plasmique (Stolk et al., 1994), a complètement bloqué la réponse à l’ATP (Fig. 4.17, variation de la fluorescence de 181 ± 15 % par rapport au contrôle, n = 11, pour l’ATP en présence de DMSO ; et de 101 ± 8 % par rapport au contrôle, n = 4, pour l’ATP en présence d’apocynine, P < 0,01). L’AEBSF (1 mM), un inhibiteur de l’assemblage des sous-unités de la NADPH oxydase (Diatchuk et al., 1997), et le DPI (500 µM) ont également inhibé la formation de ROS en réponse à l’ATP (Fig. 4.17, variation de la fluorescence de 143 ± 4 % par rapport au contrôle, n = 8, pour l’AEBSF ; et de 112 ± 13 % par rapport au contrôle, n = 4, pour le DPI, P < 0,05 pour les deux inhibiteurs quand comparés au DMSO plus ATP).

Oligomycine FCCP Apocynine DPI

AEBSF Allopurinol L-NAME

Figure 4.16 : Structure des différents inhibiteurs utilisés.

124 Résultats : Régulation de la production de ROS

250

200

* 150 * ** 100

50

Variation de la fluorescencecontrôle) dula deVariation (% 0 ATP 1 mM + DMSATP 1 m ATP ATP 1 m ATP ATP 1 m ATP ATP 1 m

1 1 1 mM mM mM M M M M + O + + Allo + + Apoc + + DP FCCP L-NAME 1 mM (6) A l E igomy BSF 1 m I pu 5 O y 0 (11) 1 ni 0 µM (4 µ rin ci M o ne ne 1 l (5) 1 100 M m (8) ) µM M (5 µ M ( (4) ) 4)

Figure 4.17 : Effet de différents inhibiteurs enzymatiques sur l’oxydation du DCFH en réponse à l’ATP dans les glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du DCFH/DA. Après lavage, les cellules ont été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM. Elles ont été exposées pendant 10 minutes à 25°C à des conditions contrôle (DMSO) ou aux antagonistes mentionnés sur la figure. Deux minutes après le début de la mesure, les cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Le rapport de la pente de la courbe pendant les 120 secondes après l’ajout d’ATP, et de la pente de la courbe pendant les 60 secondes avant l’ajout d’ATP a été calculé. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence par rapport au contrôle (sans ATP). Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05 ; ** P< 0,01 quand comparé au DMSO plus ATP.

125 Résultats : Régulation de la production de ROS

IV.3. DISCUSSION

Nos résultats montrent que l’exposition des macrophages de souris P2X 7-WT à l’ATP 1 mM a augmenté le taux d’oxydation du DCFH. L’oxydation de cet indicateur est secondaire à la production de ROS (Melino et al., 1990 ; Loetchutinat et al., 2005). Cette méthode a cependant des limites : le DCFH lui-même peut générer des ROS en conditions anaérobies (Bonini et al., 2006 ; LeBel et al., 1992). Nous avons évalué la contribution des ROS dans l’oxydation du DCFH en incubant les cellules en présence d’un capteur de ROS, la N- acétylcystéine. Ce produit a inhibé l’augmentation basale de la fluorescence du DCFH et il a également bloqué l’augmentation de la fluorescence secondaire à l’ajout d’ATP. En accord avec la littérature (Parvathenani et al., 2003 ; Noguchi et al., 2008 ; Hewinson et al., 2008 ; Moore et MacKenzie, 2009), la production de ROS en réponse à l’ATP est calcium- dépendante et implique la NADPH oxydase. Les inhibiteurs de la PKC, de la PI3K et de MEK1 qui intervient dans l’activation d’ERK1/2, n’ont pas diminué cette production de ROS de manière significative dans les macrophages péritonéaux. Selon Parvathenani et ses collaborateurs (2003), dans les cellules de la microglie, la production de ROS en réponse à l’ATP est calcium-dépendante, et la MAPK intervenant dans l’effet de l’ATP est inhibée non par le PD98059, un inhibiteur de MEK1-ERK1/2, mais par le SB203580, un inhibiteur de la p38 MAPK. Cette réponse est sensible à un inhibiteur de la PI3K (Parvathenani et al., 2003). Contrairement à ceci, Lenertz et ses collègues (2009) ont montré que dans les macrophages de la lignée RAW264.7 la production de ROS en réponse au BzATP fait intervenir la voie MEK1-ERK1/2, mais n’est pas affectée par des inhibiteurs de la PKC et de la p38 MAPK.

Nos résultats montrent que dans les macrophages péritonéaux les récepteurs P2X 7 contribuent à la production de ROS en réponse à l’ATP, cette réponse étant secondaire à l’ajout de concentrations élevées d’ATP et étant bloquée par le magnésium extracellulaire. Dans les cellules de souris P2X 7-KO une augmentation de la fluorescence en réponse à l’ATP a été observée. Cette réponse était diminuée en présence d’U73122, un inhibiteur de la PLC.

L’ivermectine, un modulateur allostérique des récepteurs P2X 4 (Khakh et al., 1999 b), a potentialisé la production de ROS. Ces résultats suggèrent l’intervention d’autres récepteurs purinergiques dans la production de ROS, notamment les récepteurs P2X 4 ainsi que des récepteurs P2Y, couplés à l’activation de la PLC. Dans les éosinophiles, il a été montré que les récepteurs P2Y 2 jouent un rôle dans la production de ROS induite par l’ATP (Müller et al.,

126 Résultats : Régulation de la production de ROS

2010). Les récepteurs P2Y sont également impliqués dans la formation de ROS en réponse à l’ATP dans les cellules de la lignée cellulaire thyroïdienne cancéreuse ARO (Pines et al., 2005). Dans les monocytes, l’implication de plusieurs récepteurs purinergiques dans la production de ROS a été suggérée, car les antagonistes des récepteurs P2X 7 ont seulement partiellement bloqué cette oxydation, alors que ces mêmes antagonistes ont complètement inhibé la formation de pore en réponse à l’ATP (Hewinson et al., 2008).

Dans les glandes sous-maxillaires l’ajout d’ATP 1 mM a augmenté l’oxydation du DCFH, suggérant que la production de ROS a augmenté en réponse au nucléotide. En présence de N-acétylcystéine l’augmentation de la fluorescence en condition basale et en réponse à l’ATP a été inhibée. Le capteur de ROS a bloqué l’augmentation initiale de la 2+ [Ca ]i suite à l’exposition de cellules de glandes sous-maxillaires à l’ATP. L’augmentation 2+ soutenue de la [Ca ]i n’a pas été affectée par la N-acétylcystéine. Notre groupe a décrit que la phase initiale de la réponse à l’ATP 1 mM implique principalement des récepteurs P2X 4, et que les récepteurs P2X 7 contribuent à la phase tardive de la réponse (Pochet et al., 2007). Les résultats obtenus avec la N-acétylcystéine suggèrent que ce produit bloque probablement l’interaction entre l’ATP et le récepteur P2X 4, et non le récepteur P2X 7. Les divers récepteurs P2X possèdent dix résidus cystéine formant des ponts disulfures essentiels pour la fonction du récepteur ou sa translocation au niveau de la membrane plasmique (Ennion et Evans, 2002).

La N-acétylcystéine pourrait réduire certains des ponts disulfures des récepteurs P2X 4 et ainsi affecter l’interaction entre ce récepteur et son agoniste. L’isoprotérénol, un agoniste β- adrénergique, a inhibé plutôt qu’augmenté la fluorescence basale du DCFH. La réponse à l’isoprotérénol n’était probablement pas secondaire à l’activation du récepteur adrénergique et à la stimulation de l’adénylate cyclase, car l’effet a été reproduit avec l’isomère inactif de l’isoprotérénol, et car la forskoline, un activateur de l’adénylate cyclase, n’a pas eu d’effet sur la fluorescence du DCFH. Ces résultats suggèrent que l’isoprotérénol lui-même pourrait avoir des propriétés antioxydantes grâce à son groupement phénol (Gillissen et al., 1997).

La production de ROS en réponse à l’ATP nécessite des concentrations élevées (supérieures à 100 µM) du nucléotide. La réponse à l’ATP a été bloquée par le magnésium extracellulaire, le KN-62 et l’oATP, et a été reproduite par le BzATP. Cette réponse n’était pas sensible à l’U73122 ni à l’ivermectine. De plus, dans les cellules de souris P2X 7-KO aucune augmentation de la fluorescence en réponse à l’ATP n’a été observée. Tous ces résultats suggèrent que la production de ROS en réponse à l’ATP est médiée par les

127 Résultats : Régulation de la production de ROS

récepteurs P2X 7. L’incubation des cellules dans un milieu dépourvu de calcium n’a pas affecté la réponse à l’ATP, suggérant que la production de ROS n’est pas secondaire à 2+ l’augmentation de la [Ca ]i. Ceci est cohérent avec les résultats obtenus avec le carbachol. 2+ Cet agoniste muscarinique a augmenté la [Ca ]i de manière transitoire (résultats chapitre III) sans avoir d’effet sur la production de ROS. La thapsigargine et l’ionomycine, qui provoquent 2+ une augmentation soutenue de la [Ca ]i, n’ont pas eu d’effet sur le taux d’oxydation du DCFH, confirmant que les ions Ca 2+ ne sont pas impliqués dans la production de ROS. Bradford et Soltoff (2002) ont démontré l’implication de la PKC et d’ERK1/2 dans les voies de signalisation activées par le récepteur P2X 7 dans les glandes parotides. Nos résultats montrent que les inhibiteurs de la PKC et de MEK1, la kinase responsable de l’activation d’ERK1/2, ont bloqué la production de ROS en réponse à l’ATP. Des résultats différents ont été observés dans les glandes sous-maxillaires de rat. Dans ces cellules, les agonistes des récepteurs P2X 7 ont provoqué une augmentation de la production de ROS, mais cette réponse n’était pas inhibée par les inhibiteurs de la PKC ou d’ERK1/2 (Fontanils et al., 2010). Cette divergence est en accord avec d’autres études montrant des différences entre espèces par rapport à la signalisation des récepteurs P2X 7 (Young et al., 2007 ; Donnelly-Roberts et al., 2009). Dans les glandes sous-maxillaires de souris, l’activation de la PKC était nécessaire mais pas suffisante pour stimuler la production de ROS, car l’incubation des cellules avec le PMA, un activateur de la PKC, n’a pas eu d’effet sur la fluorescence du DCFH. De même, la combinaison ionomycine plus PMA était sans effet sur la production de ROS. Ces résultats sont cohérents avec les résultats observés avec le carbachol : l’agoniste muscarinique qui augmente l’activité de la PKC (Bradford et Soltoff, 2002) n’a pas eu d’effet sur la production de ROS. Contrairement au carbachol, les réponses couplées à l’activation des récepteurs P2X 7 sont multiples et variées. Les agonistes de ces récepteurs n’augmentent pas seulement la phosphorylation de diverses protéines, mais provoquent également des modifications majeures dans la composition ionique du cytoplasme (sodium, potassium, calcium, protons), du métabolisme des phospholipides et de la perméabilité de la membrane plasmique (Garcia- Marcos et al., 2006 a).

Après l’exclusion de diverses sources de ROS en réponse à l’ATP (chaîne mitochondriale de transport des électrons, xanthine oxydase, NO synthase), une possibilité était que la NADPH oxydase ou une de ses isoformes contribue à la réponse à l’ATP extracellulaire. En effet, il a été montré que les glandes exocrines expriment un des homologues de la sous-unité gp91 phox de la NADPH oxydase, la Duox2 (Geiszt et al., 2003).

128 Résultats : Régulation de la production de ROS

Duox2 ne contient pas seulement un domaine NADPH oxydase, mais également un domaine homologue aux peroxydases (Lambeth et al., 2000), ainsi qu’une longue extension N- terminale contenant deux motifs EF-hand permettant la liaison du calcium, ce qui explique sa régulation par cet ion (Ameziane-El-Hassani et al., 2005). Etant donné que le calcium n’a pas eu d’effet sur la production de ROS, Duox2 n’était probablement pas impliqué dans cette réponse. Cependant, dans les glandes sous-maxillaires de rat, la production de ROS en réponse à l’ATP est calcium-dépendante (Fontanils et al., 2010), suggérant l’implication de Duox2. Cette différence entre souris et rat pourrait être secondaire au niveau d’expression de Duox2 dans les deux espèces. A ce jour, l’expression de Duox2 a été démontrée dans les cellules ductales des glandes sous-maxillaires de rat (Geiszt et al., 2003), mais pas dans celles de souris. D’autre part, il a été confirmé que des facteurs de maturation interagissent avec Duox2 et sont nécessaires à la translocation de Duox2 au niveau de la membrane et à son activité (Morand et al., 2009). Quelle que soit la raison de cette différence entre rat et souris, les trois inhibiteurs de la NADPH oxydase, le DPI, l’apocynine et l’AEBSF, ont inhibé la production de ROS en réponse à l’ATP dans les glandes sous-maxillaires de souris. A partir de ces résultats nous avons tiré la conclusion que la NADPH oxydase est l’enzyme responsable de la production de ROS en réponse à l’ATP dans ces cellules.

Les récepteurs P2X 7 sont donc couplés à la production de ROS non seulement dans les cellules phagocytaires, mais également dans d’autres cellules ou tissus comme dans les glandes salivaires (Fig. 4.18). Dans ces deux types de cellules, la NADPH oxydase est la source des ROS produits, mais la voie de signalisation activant cette enzyme est différente. Dans les cellules phagocytaires, les ROS participent à la défense de l’hôte en tuant des micro- organismes invasifs et en provoquant la libération de cytokines (Cruz et al., 2007 ; Hewinson et al., 2008 ; Spooner et Yilmaz, 2011). Dans les glandes salivaires, la production de ROS en réponse à des agonistes purinergiques pourrait contribuer à l’élimination de pathogènes présents dans la cavité buccale (Geiszt et al., 2003). En effet, en présence de la lactoperoxydase et du thiocyanate il y a production d’hypothiocyanite, substance possédant des propriétés antimicrobiennes et délivrée directement au niveau de la bouche.

129 Résultats : Régulation de la production de ROS

Macrophages ATP

- Ca 2+ O2 O2 NADPH (ROS ) NH 2 oxydase extracellulaire P2X 7 P2X 4 P2Y

intracellulaire

NH 2 NH 2 COOH COOH

COOH ROS phagosome

Ca 2+

(

O

R

2

O

-

S

)

O 2

Glandes sous-maxillaires

ATP

O2 NADPH O - P2X 7 2 oxydase (ROS )

NH 2

PKC ERK1/2 COOH

Figure 4.18 : Modèle proposé pour la production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages péritonéaux et les glandes sous-maxillaires de souris. Dans les macrophages péritonéaux murins (figure du haut), la production de ROS en réponse à l’activation des récepteurs P2X 7 par l’ATP est calcium-dépendante et implique la NADPH oxydase. Les récepteurs P2X 4 ainsi que des récepteurs P2Y semblent également intervenir dans la production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages. L’activation des récepteurs P2X 7 des glandes sous-maxillaires de souris (figure du bas) par des concentrations élevées d’ATP active la NADPH oxydase. Cette stimulation est calcium-indépendante, mais implique probablement la PKC ainsi que ERK1/2. L’anion superoxyde formé génère ensuite d’autres ROS, pouvant traverser la membrane.

130 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

CHAPITRE V: RESULTATS

ETUDE DE L’EXPRESSION ET DE LA SECRETION D’IL-1βββ PAR LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES

V.1. INTRODUCTION

L’IL-1β est une cytokine pro-inflammatoire exprimée et sécrétée principalement par les monocytes et les macrophages (Dinarello, 2009). La stimulation par des LPS des récepteurs TLR4 de ces cellules induit l’expression de la pro-IL-1β, le précurseur inactif d’IL- 1β (Dinarello, 2004). La sécrétion de la cytokine nécessite son clivage par une protéase, la caspase-1. Cette enzyme est activée suite à des stimuli tels que l’activation du récepteur P2X 7 par l’ATP (Kahlenberg et Dubyak, 2004). L’IL-1β n’est pas seulement exprimée par des cellules du système immunitaire mais également par d’autres types de cellules comme par exemple les glandes salivaires (Tanda et al., 1998 ; Yao et al., 2005). La muqueuse buccale constitue une des premières barrières aux agressions. L’intégrité de cette muqueuse est maintenue grâce aux cellules épithéliales, aux fibroblastes, aux cellules immunitaires et à la salive (Sugawara, 2005). Cette sécrétion exocrine joue un rôle dans la protection de la bouche, grâce à diverses protéines possédant des propriétés antimicrobiennes (Denny et al., 2008). D’autres constituants de la salive sont des cytokines (Walker, 2004) et des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance des nerfs (NGF). Ces facteurs de croissance contribuent à la réparation de tissus abimés et participent à la différenciation et à la maturation de structures spécialisées comme les bourgeons du goût (Zelles et al., 1995). Nous avons également vu dans le chapitre précédent que les glandes salivaires produisent des ROS en réponse à des agents purinergiques, contribuant à la protection de nos muqueuses. Dans cette partie du travail nous avons essayé

131 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β de déterminer si l’expression et la sécrétion d’IL-1β dans les glandes sous-maxillaires sont régulées de la même manière que dans les macrophages.

V.2. RESULTATS

V.2.1. Concentration salivaire d’IL-1βββ

Nous avons commencé par doser l’IL-1β dans la salive de souris contrôles ou injectées avec des LPS. Des souris P2X 7-WT ont été injectées dans la cavité péritonéale avec une solution saline isotonique ou avec 10 µg de LPS. Six heures plus tard, les souris ont été anesthésiées et de la pilocarpine (1 mg/kg) a été injectée par voie sous-cutanée. Cet agoniste muscarinique stimule la sécrétion salivaire. Le volume de salive collectée chez les souris injectées avec une solution saline a été significativement plus élevé (Fig. 5.1, 393 ± 11 mg, n = 4) que celui collecté chez les souris traitées par des LPS (250 ± 19 mg, n = 4, P < 0,05). La salive des souris contrôles contenait 665 ± 164 µg/ml de protéines (n = 4) et l’activité de l’amylase était de 709 ± 35 µmoles maltose/ml (n = 4). L’injection de LPS a augmenté le contenu en protéines de la salive de manière non significative (1009 ± 111 µg/ml, n = 4, P = 0,2), et a augmenté l’activité de l’amylase de manière significative (818 ± 8 µmoles maltose/ml, n = 4, P < 0,05 quand comparé aux souris contrôles). La concentration en IL-1β a été mesurée dans la salive des deux groupes de souris. Les résultats sont exprimés sous forme de pg équivalents IL-1β/ ml car les anticorps utilisés pour le dosage ELISA reconnaissent à la fois la pro-IL-1β et la forme mature de l’IL-1β. La concentration d’équivalents IL-1β était de 264 ± 33 pg/ml dans les souris injectées avec une solution saline (n = 3), et a diminué de 40 % jusqu’à 152 ± 8 pg/ml dans les souris traitées par des LPS (n = 4).

Les souris P2X 7-KO injectées avec une solution saline ont sécrété 255 ± 56 mg de salive (Fig. 5.1, n = 4, P = 0,2 quand comparé aux souris P2X 7-WT). La salive de ces souris n’avait ni une concentration en protéines (443 ± 56 µg/ml, n = 5, P = 0,41 quand comparé aux souris P2X 7-WT) ou en IL-1β (188 ± 36 pg/ml, n = 5, P = 0,14 quand comparé aux souris

P2X 7-WT), ni une activité amylase (577 µmoles maltose/ml, n = 4, P = 0,057 quand comparé aux souris P2X 7-WT) significativement différente de la salive des souris P2X 7-WT.

132 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

L’injection de LPS n’a pas eu d’effet sur le volume de salive collectée (277 ± 10 mg, n = 4, P

= 0,48 quand comparé aux souris contrôles P2X 7-KO) ni sur la concentration en protéines

(727 ± 130 µg/ml, n = 4, P = 0,064 quand comparé aux souris contrôles P2X 7-KO), et a augmenté de manière significative la sécrétion d’amylase (713 ± 16 µmoles maltose/ml, n = 4,

P < 0,05 quand comparé aux souris contrôles P2X 7-KO). La sécrétion d’IL-1β était variable parmi les quatre souris testées mais la moyenne n’était pas différente des valeurs des souris

P2X 7-KO contrôles (P = 0,41).

133 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

Volume Protéines * 1200

0.4 1000

0.3 800

600 0.2

400 Volume de salive (g) desalive Volume Contenu en protéines Contenuen 0.1 salive) protéines/ml (µg 200

0.0 0

(4) (4) (4) (4) S S WT (4) P KO (4) WT P L L KO (5) + + + LPS (4) T O WT KO + LPS W K

Amylase IL-1 βββ 1000 400 * * 800 300

600 (pg/ml salive) (pg/ml β β β β 200

400 Activité amylase Activité 100

(µmoles maltose/ml salive) maltose/ml (µmoles 200 EquivalentsIL-1

0 0 ) 4) 5) 4 (4) ( T O W KO (4) WT (3) K LPS (4) LPS (4) LPS ( + LPS ( + T WT + KO + W KO

Figure 5.1 : Composition de la salive de souris contrôles ou injectées avec des LPS. Des souris P2X 7-WT ou P2X 7-KO ont été injectées dans la cavité péritonéale avec une solution saline ou avec 10 µg de LPS. Six heures plus tard, les animaux ont été anesthésiés et injectés avec 1 mg/kg de pilocarpine. La salive a été collectée pendant 20 minutes dans un tube Eppendorff préalablement pesé. Le poids de la salive collectée ainsi que sa concentration en protéines et en IL-1β, et l’activité de l’amylase ont été mesurés. Les résultats sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05.

134 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

V.2.2. Expression d’IL-1βββ dans les macrophages et les glandes sous- maxillaires

Expression d’IL-1βββ dans les glandes sous-maxillaires et les macrophages Par la suite nous avons étudié et comparé l’expression d’IL-1β dans les glandes sous- maxillaires et dans les macrophages péritonéaux. Des études menées par l’équipe de Layé (Mingam et al., 2008 ; Labrousse et al., 2009) ont montré que l’expression d’IL-1β était plus faible dans le cerveau et l’hippocampe de souris P2X 7-KO que de souris P2X 7-WT. Nous avons donc mesuré l’expression d’IL-1β dans ces deux populations de souris afin de déterminer si l’expression de la cytokine est régulée par l’expression de récepteurs P2X 7. Les cellules ont été incubées en condition contrôle ou en présence de LPS 250 ng/ml pendant 2 heures, avant d’effectuer le dosage d’IL-1β. Dans les macrophages incubés en condition contrôle, le contenu en IL-1β était très faible (Fig. 5.2, 162 ± 27 pg/mg protéines dans les cellules de souris P2X 7-WT, n = 3 ; et 152 ± 48 pg/mg protéines dans les cellules de souris

P2X 7-KO, n = 3). La stimulation de ces cellules par 250 ng/ml de LPS a provoqué une augmentation massive de l’expression d’IL-1β, la concentration de la cytokine a atteint des valeurs supérieures à 6000 pg/mg protéines, concentration maximale pouvant être dosée. En effet, la courbe d’étalonnage n’est linéaire que jusqu’à des valeurs de 1000 pg/ml d’équivalents IL-1β. Il ne nous a pas semblé essentiel de refaire le dosage sur des dilutions de ces échantillons.

L’IL-1β est exprimée dans les cellules d’une suspension brute de glandes sous- maxillaires de souris P2X 7-WT, incubées en condition contrôle. Son taux était de 390 ± 50 pg/mg protéines (n = 4), ce qui était plus élevé que dans les macrophages non stimulés par des LPS. L’incubation des cellules avec 250 ng/ml de LPS pendant 2 heures n’a pas modifié le contenu d’IL-1β (412 ± 51 pg/mg protéines, n = 4, P = 0,89). Dans les glandes sous- maxillaires de souris P2X 7-KO, la concentration d’IL-1β était similaire à celle des souris

P2X 7-WT (538 ± 95 pg/mg protéines, n = 6 ; et 513 ± 139 pg/mg protéines, n = 3 ; dans les cellules de souris P2X 7-KO incubées respectivement en condition contrôle ou en présence de LPS). Le niveau basal d’IL-1β (en condition contrôle) dans les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires était significativement plus élevé que dans les macrophages (P < 0,05).

135 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

Macrophages

10000

7500 (pg/mg protéines) (pg/mg β β β β 5000

2500 Equivalents IL-1 Equivalents

0 4) 3) 3) ( ( ( WT (3) KO LPS + WT KO + LPS

Glandes sous-maxillaires 750

500 (pg/mg protéines) (pg/mg β β β β

250 Equivalents IL-1 Equivalents

0 (4) WT (4) KO (6) + LPS T W KO + LPS (3)

Figure 5.2 : Effet des LPS sur l’expression d’IL-1βββ dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Les macrophages et les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ou P2X 7-KO ont été préparés et incubés pendant 2 heures en condition contrôle ou en présence de LPS 250 ng/ml. Le contenu en protéines et en IL-1β de ces préparations a été dosé. Les résultats sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

136 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

Mise en évidence de l’expression d’IL-1βββ par RT-PCR et par Western blot L’expression d’IL-1β dans les cellules des glandes sous-maxillaires et les macrophages a été confirmée par RT-PCR et par Western blot. Après extraction des ARN totaux et transcription inverse des ARNm en ADNc, une PCR a été effectuée afin de mettre en évidence la présence de l’ADNc de la pro-IL-1β. Cet ADNc était présent dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT, comme le montre la présence d’une bande aux environs de 700 pb dans les deux types de cellules (Fig. 5.3).

S M

pro-IL-1β 706 bp

Figure 5.3 : Détection par RT-PCR de l’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous- maxillaires. Les ARN totaux de macrophages de souris P2X 7-WT préalablement incubés pendant 2 heures en présence de LPS 250 ng/ml (M), ou de cellules d’une suspension brute de glandes sous- maxillaires de souris P2X 7-WT (S), ont été extraits et ont subi une transcription inverse. Les ADNc ont été amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques de la pro-IL-1β.

Un Western blot a également été réalisé afin de déterminer la forme d’IL-1β présente dans les cellules. Dans les macrophages de souris P2X 7-WT incubés pendant 4 heures avec des LPS une bande correspondant à la pro-IL-1β d’environ 31 kDa est observée en condition contrôle (Fig. 5.4). Suite à la stimulation des macrophages par 10 µM de nigéricine, un échangeur H+/K+, une faible bande correspondant à la pro-IL-1β est visible dans le surnageant et une bande plus intense apparaît aux environs de 17 kDa, correspondant à la forme mature d’IL-1β, produite suite au clivage par la caspase-1. Dans les glandes sous- maxillaires une bande est visible aux environs de 20 kDa correspondant à la forme mature de l’IL-1β.

137 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

M M S kDa Cont Nig 39 β pro-IL-1 28

19 IL-1β

Figure 5.4 : Analyse par Western blot de l’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Les macrophages de souris P2X 7-WT (M) ont été incubés pendant 4 heures en présence de LPS 250 ng/ml et puis pendant 15 minutes à 37°C, dans du milieu If contenant du BSA 0,05 %, le mélange d’acides aminés 1 % et du CaCl 2 1 mM, en absence (Cont) ou en présence de nigéricine (Nig) 10 µM. L’IL-1β a ensuite été mise en évidence dans les cellules lysées (Cont) ou dans le surnageant concentré à l’aide d’un filtre cut-off 3 kDa (Nig). Après préparation de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT (S), les cellules ont été lysées. Les lysats, concentrés à l’aide d’un filtre cut-off 3 kDa, ont été utilisés pour le Western blot.

Dosage de l’IL-1βββ dans les canaux et les acini de glandes sous-maxillaires Les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires ont été centrifugées sur un gradient de Percoll afin de séparer les canaux et acini et de déterminer laquelle de ces fractions synthétise l’IL-1β. Le dosage d’IL-1β n’a pas montré de différence entre ces deux fractions. L’IL-1β a été détectée dans les canaux et les acini de souris P2X 7-WT (Fig. 5.5, 676 ± 123 pg/mg protéines, n = 7 ; et 941 ± 108 pg/mg protéines, n = 7 ; respectivement, P =

0,097), et de souris P2X 7-KO (916 ± 195 pg/mg protéines, n = 4 ; et 1180 ± 407 pg/mg protéines, n = 3 ; respectivement).

138 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

2000

Souris P2X 7-WT Souris P2X 7-KO

1500

(pg/mg protéines) (pg/mg 1000 β β β β

500 EquivalentsIL-1

0 7) ( x au n naux (4) Acini (7) a Acini (3) a C C

Figure 5.5 : Concentration d’IL-1βββ dans les fractions acinaires et ductales de glandes sous-maxillaires. Les acini et les canaux de souris P2X 7-WT et P2X 7-KO ont été séparés et leur contenu en IL-1β a été dosé par ELISA. Les résultats sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

V.2.3. Etude de la phosphorylation d’IκκκB

Dans les macrophages, les LPS augmentent l’expression de la pro-IL-1β par activation du facteur de transcription NF-κB. L’activation et la translocation nucléaire de NF-κB sont secondaires aux voies de signalisation de TLR4 menant à la phosphorylation, l’ubiquitination et la dégradation d’I κB-α, une protéine inhibant NF-κB (Kawai et Akira, 2007). Un Western blot a été réalisé afin d’analyser la phosphorylation d’IκB-α. Dans les macrophages de souris

P2X 7-WT, l’incubation avec 250 ng/ml de LPS a provoqué une phosphorylation rapide de la sérine en position 32 d’IκB-α, avec un maximum à 5 minutes d’incubation (Fig. 5.6). Le taux d’I κB-α dans ces cellules était inversement corrélé avec le taux de phosphorylation. Dans les glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT, les LPS n’ont modifié ni la phosphorylation ni le taux basal d’I κB-α.

139 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

M S Temps(min) 0 5 30 60 120 120 30 5 0

κ Phospho-I B 38 kDa

IκB 38 kDa

Figure 5.6 : Analyse par Western blot de la phosphorylation d’I κκκB dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Les macrophages (M) et les glandes sous-maxillaires (S) de souris P2X 7-WT ont été incubés à 37°C pendant différents temps d’incubation en présence de LPS 250 ng/ml. Les cellules ont ensuite été lysées et sonifiées, et le surnageant a été utilisé pour analyser la phosphorylation d’IκB par Western blot.

V.2.4. Expression du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88

L’absence d’effet des LPS sur l’activation de NF-κB et sur l’expression d’IL-1β nous a amenée à étudier certaines protéines impliquées dans la réponse aux LPS. Le CD14 lie le complexe formé par les LPS et la protéine fixant les LPS et active ensuite le récepteur TLR4 qui interagit avec MyD88. Cette protéine couple l’activation des récepteurs TLR4 à des voies de signalisation intracellulaires. Une RT-PCR réalisée avec des macrophages stimulés pendant 2 heures avec des LPS et avec des cellules de glandes sous-maxillaires a montré la présence d’ARNm correspondant à CD14, TLR4 et MyD88 dans ces deux populations de cellules (Fig. 5.7). L’identité des ADNc amplifiés a été confirmée par séquençage (voir Annexes).

140 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

S M

TLR4 540 pb

CD14 302 pb

MyD88 660 pb

Figure 5.7 : Détection par RT-PCR des transcrits de TLR4, CD14 et MyD88 dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Les ARN totaux de macrophages de souris P2X 7-WT incubés préalablement pendant 2 heures en présence de 250 ng/ml LPS (M), ou de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT (S) ont été extraits et ont subi une transcription inverse. Les ADNc ont été amplifiés par PCR en utilisant les amorces décrites dans la partie Matériel et méthodes.

V.2.5. Régulation de la sécrétion d’IL-1βββ dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires

Dans les macrophages stimulés préalablement par des LPS, l’IL-1β est sécrétée en réponse à l’activation des récepteurs P2X 7 par des concentrations élevées d’ATP. L’ouverture + du canal cationique entraîne une diminution de la [K ]i et l’activation de l’inflammasome NLRP3. Il s’ensuit une activation de la caspase-1 qui va cliver la pro-IL-1β en IL-1β mature qui sera sécrétée (Perregaux et Gabel, 1994 ; Kahlenberg et Dubyak, 2004). Des expériences ont donc été menées afin de déterminer si la sécrétion d’IL-1β est régulée de la même manière dans les glandes sous-maxillaires de souris.

Effet sur l’efflux de potassium

L’ouverture du canal cationique secondaire à une stimulation des récepteurs P2X 7 2+ permet l’entrée du calcium, ce qui entraîne une augmentation de la [Ca ]i (voir chapitre III). Afin de déterminer si l’activation de ces récepteurs provoque également un efflux de

141 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β potassium, les macrophages et les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargés avec du PBFI/AM, un indicateur fluorescent sensible au potassium. Les cellules ont ensuite été resuspendues dans du milieu If contenant du CaCl 2 1 mM avant de commencer la mesure. Dans les macrophages incubés dans un milieu If avec une concentration normale en potassium (6 mM KCl), l’ajout d’ATP 1 mM a entraîné une + diminution de la fluorescence suggérant que l’ATP diminue la [K ]i (Fig. 5.8, de 98,5 ± 0,6 % du signal initial jusqu’à 90,9 ± 0,5 % du signal initial 4 minutes après ajout d’ATP, n = 13). Dans un milieu riche en K + (passant de 6 mM à 100 mM KCl), l’ATP n’a pas eu d’effet significatif sur la fluorescence du PBFI (de 99,5 ± 0,9 % du signal initial jusqu’à 96,1 ± 0,6 % du signal initial 4 minutes après ajout d’ATP, n = 4). Le gradient électrochimique n’étant plus favorable à la sortie de K +, il n’y a pas d’efflux de ce cation suite à l’ouverture du canal.

Macrophages souris P2X 7-WT 120

Milieu If normal (6 mM KCl) (n=13) 110 Milieu riche en potassium (100 mM KCl) (n=4)

100

90 ATP 1 mM

80 Fluorescenceinitial) dusignal (%

70 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (minutes)

+ Figure 5.8 : Effet de l’ATP 1 mM sur la [K ]i de macrophages. Les macrophages de souris P2X 7-WT, stimulés pendant une nuit par des LPS 250 ng/ml, ont été chargés avec du PBFI/AM. Les cellules ont ensuite été incubées à 25°C, soit dans du milieu If normal (6 mM de KCl), soit dans du milieu riche en K + (100 mM de KCl), en présence de CaCl 2 1 mM. Cinq minutes après le début de l’expérience, les cellules ont été stimulées par de l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de la fluorescence mesurée au début de la mesure. Ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

142 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

Ces expériences ont ensuite été réalisées avec les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT. Dans un milieu de concentration normale (6 mM) en potassium, la fluorescence du PBFI diminuait légèrement au cours du temps (Fig. 5.9, 94,1 ± 1,0 % du signal initial après 5 minutes, n = 4). L’ajout d’ATP 1 mM a accéléré la diminution de la fluorescence (85,0 ± 2,3 % du signal initial 4 minutes après ajout d’ATP, n = 4). Dans un milieu riche en K +, l’ATP n’a pas provoqué de diminution de la fluorescence du PBFI (de 96,4 ± 1,1 % du signal initial jusqu’à 93,2 ± 2,3 % du signal initial 4 minutes après ajout d’ATP, n = 4). Ces résultats montrent que dans les glandes sous-maxillaires, comme dans les macrophages, des concentrations élevées d’ATP activent un canal perméable non seulement au Ca 2+ mais également au K +. Contrairement à l’ATP, le carbachol, à une + concentration de 100 µM, n’a pas affecté la [K ]i (Fig. 5.10, de 95,9 ± 0,4 % du signal initial jusqu’à 93,3 ± 0,6 % du signal initial 4 minutes après ajout de carbachol, n = 3).

Glandes sous-maxillaires souris P2X -WT 120 7

Milieu If normal (6 mM KCl) (n=4) 110 Milieu riche en potassium (100 mM KCl) (n=4)

100

90

ATP 1 mM 80 Fluorescenceinitial) signaldu (%

70 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

+ Figure 5.9 : Effet de l’ATP 1 mM sur la [K ]i de glandes sous-maxillaires. Les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été chargées avec du PBFI/AM. Ensuite les cellules ont été incubées à 25°C, soit dans du milieu If normal (6 mM de KCl), soit dans du milieu riche en K + (100 mM de KCl), en présence de CaCl 2 1 mM. Cinq minutes après le début de l’expérience, les cellules ont été stimulées par de l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de la fluorescence mesurée au début de la mesure. Ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

143 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

Glandes sous-maxillaires souris P2X -WT 120 7

ATP 1 mM (n=4) 110 Cb 100 µM (n=3)

100

90

Agoniste 80 Fluorescenceinitial) signaldu (%

70 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

+ Figure 5.10 : Effet de l’ATP 1 mM et du carbachol 100 µM sur la [K ]i de glandes sous- maxillaires. Après avoir été chargées avec du PBFI/AM, les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été incubées à 25°C, dans du milieu If normal, en présence de CaCl 2 1 mM. Cinq minutes après le début de l’expérience, les cellules ont été stimulées par de l’ATP 1 mM ou du carbachol (Cb) 100 µM. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de la fluorescence mesurée au début de la mesure. Ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

Effet sur la sécrétion d’IL-1βββ

L’activation des récepteurs P2X 7 des macrophages et des glandes sous-maxillaires ouvre donc un canal perméable à différents cations dont le K +. L’effet de l’ATP sur la sécrétion d’IL-1β a alors été testé. Les macrophages, stimulés préalablement par des LPS à la concentration de 250 ng/ml, et les cellules d’une suspension brute de glandes sous-maxillaires de souris P2X 7-WT ont été incubés pendant 15 minutes à 37°C, en condition contrôle ou en présence de l’agent testé. L’IL-1β a ensuite été dosée par ELISA dans le surnageant des cellules incubées. Dans les macrophages, des concentrations élevées d’ATP (supérieures à 100 µM) ont provoqué une sécrétion d’IL-1β (Fig. 5.11, 414 ± 137 pg/ml, n = 23, en condition contrôle ; et 1199 ± 370 pg/ml, n = 18, avec l’ATP 1 mM, P < 0,01). La cytokine a + également été libérée suite à une stimulation par la nigéricine qui diminue la [K ]i (Fig. 5.11,

144 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

1554 ± 208 pg/ml, n = 10, P < 0,001 quand comparé au contrôle). Contrairement à ce qui a été observé chez les cellules du système immunitaire, l’ATP n’a pas stimulé la sécrétion d’IL-1β par les cellules de la suspension brute de glandes sous-maxillaires. De même, aucune augmentation de la sécrétion de la cytokine n’a été observée suite à la stimulation avec le carbachol. Les valeurs d’absorbance mesurées pour les échantillons issus de glandes sous- maxillaires étant inférieures aux valeurs obtenues pour la courbe d’étalonnage, les résultats obtenus avec ces cellules ne sont pas montrés ici.

Macrophages souris P2X 7-WT

2000 ***

** 1500 (pg/ml) β β β β

1000

500 Equivalents IL-1

0 )

le (23) M (18) ô µM (3 µM (3) µM (10) 0 m 10 P 10 Contr ATP T A ATP 1 Nig 10

Figure 5.11 : Sécrétion d’IL-1βββ en réponse à l’ATP dans les macrophages. Après incubation pendant 4 heures en présence de LPS 250 ng/ml, les macrophages de souris P2X 7-WT ont été incubés pendant 15 minutes en condition contrôle, en présence de différentes concentrations d’ATP, ou de nigéricine (Nig) 10 µM. Le contenu en IL-1β du surnageant a été analysé par ELISA après centrifugation et sonification. Les résultats sont les moyennes + SEM de (n) expériences. ** P < 0,01 ; *** P < 0,001 quand comparé au contrôle.

145 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

V.3. DISCUSSION

L’injection de LPS à des souris P2X 7-WT a diminué le volume de salive en réponse à la pilocarpine. Ce résultat est en accord avec des études antérieures montrant que l’injection de LPS dans la cavité péritonéale diminue de plus de 50 % la sécrétion salivaire induite par des agonistes muscariniques (métacholine ou pilocarpine) chez le rat ou la souris (Lomniczi et al., 2001 ; Yao et al., 2010). Yao et ses collègues suggèrent qu’une diminution de l’expression du canal hydrique aquaporine 5, secondaire à la stimulation par des LPS, serait à l’origine de cette réduction du volume de salive (Yao et al., 2010). En désaccord avec ces études, il a été décrit que la perfusion rétrograde de LPS dans les canaux de glandes salivaires augmente le volume de salive (Correia et al., 2010). Des approches méthodologiques différentes utilisées pour la délivrance de LPS pourraient être à l’origine des différences entre ces résultats. En effet, l’injection de LPS dans la cavité péritonéale provoque l’endotoxémie, alors que la perfusion de cette endotoxine à l’intérieur des canaux limite la diffusion des LPS et prévient la plupart des effets systémiques. Les deux modèles présentent également des résultats différents par rapport à la sécrétion de protéines et d’amylase. Nos résultats suggèrent que la salive de souris injectées par des LPS contient plus de protéines et d’amylase que celle des souris injectées par du NaCl. En prenant en considération le volume plus faible de salive chez les animaux injectés par des LPS, le traitement par l’endotoxine n’a pas d’effet sur la sécrétion de protéines et d’amylase. Selon Correia et ses collègues, les LPS augmentent la sécrétion de protéines par les glandes sous-maxillaires, alors que Barta et ses collaborateurs ont décrit que les LPS diminuent la sécrétion d’amylase par les acini des glandes parotides (Correia et al., 2010 ; Barta et al., 2005).

Le volume de salive collecté pendant 20 minutes suivant la stimulation par la pilocarpine chez les souris P2X 7-KO ne diffère pas de manière significative du volume récolté chez les souris contrôles. Ceci est en accord avec des résultats précédents montrant que seule la composition de la salive (la concentration en potassium) varie parmi les deux types de souris (Pochet et al., 2007). Ces résultats sont également en accord avec ceux de Nakamoto et collègues, qui ont décrit que la déficience en récepteur P2X 7 a pratiquement aboli la sécrétion salivaire induite par le BzATP dans les glandes sous-maxillaires, sans avoir d’effet sur la salivation en réponse à des agonistes muscariniques (Nakamoto et al., 2009). Lors de cette étude la sécrétion ex vivo des glandes sous-maxillaires a été mesurée pendant les 10 minutes

146 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β suivant la stimulation par l’agoniste purinergique ou muscarinique. Récemment, Novak et ses collaborateurs (2010) ont étudié la sécrétion salivaire, lacrimale et pancréatique par des souris

P2X 7-WT et P2X 7-KO en réponse à la pilocarpine. Leurs résultats montrent que chez les souris P2X 7-KO la sécrétion lacrimale est augmentée, alors que les sécrétions pancréatiques et salivaires sont diminuées. L’effet sur la sécrétion salivaire semble être le plus apparent au cours de la phase plateau de la sécrétion, entre 30 et 60 minutes (Novak et al., 2010). Selon ces auteurs, de l’ATP est libéré suite une stimulation cholinergique, ce qui, chez les souris

P2X 7-WT, augmente les sécrétions salivaires et pancréatiques via l’activation des récepteurs

P2X 7.

Nos résultats confirment que l’IL-1β est présente dans la salive collectée chez des souris injectées par de la pilocarpine. Des analyses par RT-PCR et Western blot montrent que la cytokine est exprimée de manière constitutive par les glandes sous-maxillaires. L’IL-1β détectée dans ces glandes a une taille de 20 kDa. Cette forme n’est pas générée par la caspase- 1, mais peut être produite suite à l’incubation de la pro-IL-1β avec diverses sérine protéases, comme l’élastase, la cathepsine G ou la protéinase 3 (Netea et al., 2010). Yao et ses collègues ont également décrit la présence de la forme de 20 kDa dans les glandes sous-maxillaires, en plus de la forme de 17 kDa (Yao et al., 2006). Les acini et les canaux des glandes sous- maxillaires expriment l’IL-1β. De manière inattendue, les concentrations d’IL-1β détectées dans ces deux fractions étaient deux fois plus élevées que dans la suspension brute. Cette augmentation apparente de la concentration d’IL-1β suite à la purification de populations cellulaires n’est pas unique. En effet, Kauma et ses collaborateurs ont décrit que l’isolement de trophoblastes des villosités placentaires augmente fortement l’expression d’IL-1β ( Kauma et al., 1992) . Une autre hypothèse est qu’au cours du processus d’isolement des cellules un antagoniste interagissant avec l’IL-1β pourrait être éliminé (Kemp et al., 1986). Quelle que soit la raison de cette augmentation, les canaux et les acini expriment tous les deux l’IL-1β de manière similaire. Plus important, en condition basale, le taux d’IL-1β par mg de protéines était plus élevé dans les glandes sous-maxillaires que dans les macrophages, cellules qui sont les producteurs majeurs d’IL-1β.

L’exposition de macrophages aux LPS a augmenté leur expression d’IL-1β. Par contre un traitement similaire des glandes sous-maxillaires n’a pas modifié l’expression de la cytokine. De même, l’injection préalable de LPS aux souris n’a pas changé la concentration

147 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β d’IL-1β dans la salive collectée. Nous avons montré que les LPS induisent la phosphorylation rapide (endéans de 5 minutes) de la sérine en position 32 d’I κB-α et diminuent le taux d’I κB- α total dans les macrophages. Ces résultats sont en accord avec des études antérieures montrant que les LPS induisent la phosphorylation d’I κB et sa dégradation subséquente, menant à l’activation de NF-κB et à l’expression d’IL-1β ( Croker et al., 2008 ). Dans les glandes sous-maxillaires, la phosphorylation d’I κB en réponse aux LPS n’a pas été observée, ce qui explique pourquoi le traitement de ces cellules avec les LPS n’a pas augmenté l’expression de la cytokine. L’absence d’activation de NF-κB dans les glandes sous- maxillaires pourrait être due à l’absence d’expression de certaines protéines impliquées dans la voie de signalisation menant à la phosphorylation d’I κB. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons étudié la présence d’ARNm du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88 par RT- PCR. Après extraction et transcription inverse, l’ADNc correspondant à ces protéines a pu être amplifié dans des extraits de glandes sous-maxillaires et de macrophages. Ceci est en accord avec des résultats antérieurs décrivant l’expression de ces protéines par des glandes salivaires (Uehara et al., 2003 ; Kawakami et al., 2007 ; Yao et al., 2010). L’injection de LPS à des souris C57Bl/6J a augmenté l’expression de quatre chimiokines (CCL3, CCL5, CXCL2 et CXCL10) mais pas l’expression de CCL2, CCL4, CCL9 et CXCL12 (Sharma et al., 2009). Ces résultats confirment le couplage de ces protéines avec des voies de signalisation intracellulaires dans les glandes sous-maxillaires. Nos résultats sont en accord avec les résultats d’Uehara et collègues (2007) qui ont observé que, en réponse à l’activation des récepteurs TLR4, les glandes salivaires sécrètent des peptides antimicrobiens mais pas de cytokines pro-inflammatoires.

Les macrophages et les glandes sous-maxillaires ne diffèrent pas seulement par rapport à l’expression d’IL-1β mais également par rapport à la régulation de la sécrétion. + + L’ATP, via les récepteurs P2X 7, et la nigéricine, un échangeur H /K , entraînent la sécrétion d’IL-1β par les macrophages. L’incubation des glandes sous-maxillaires avec une concentration élevée d’ATP n’a pas eu d’effet sur la libération d’IL-1β. Or, cet agoniste purinergique a activé un canal cationique non-sélectif dans les glandes sous-maxillaires. Il a 2+ ainsi augmenté la [Ca ]i et provoqué une diminution de la fluorescence du PBFI, un indicateur fluorescent sensible à la concentration de K +. Malgré ces variations ioniques l’ATP n’a pas augmenté la sécrétion d’IL-1β.

148 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

La concentration d’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires était similaire chez les souris P2X 7-WT et P2X 7-KO. Ces résultats suggèrent que l’expression d’IL-1β dans ces tissus n’est pas régulée par la signalisation du récepteur P2X 7. Ceci est différent de résultats antérieurs montrant que l’expression d’IL-1β est plus faible dans le cerveau et l’hippocampe de souris P2X 7-KO quand comparé aux souris P2X 7-WT (Mingam et al., 2008 ; Labrousse et al., 2009). Dinarello (2009) a montré que l’IL-1β, une fois sécrétée, se fixe de façon autocrine sur des récepteurs qui augmentent l’expression de la cytokine dans la cellule. On peut émettre l’hypothèse selon laquelle la sécrétion d’IL-1β est réduite chez les souris P2X 7-KO. En conséquence les récepteurs de l’IL-1β seraient moins stimulés et la cytokine moins exprimée dans le cerveau de ces souris.

Les résultats présentés dans ce travail sont différents de résultats récents de Yao et collègues (Yao et al., 2005). Ce groupe a décrit que l’IL-1β est exprimée par les glandes sous- maxillaires de souris C3H/HeN. La cytokine était localisée dans des granules sécrétrices où elle a été clivée par mK3, une isoforme de kallikréine présente dans les granules sécrétrices de cellules tubulaires (Yao et al., 2006). Ceci est plutôt inattendu étant donné que la pro-IL-1β est une protéine dépourvue de séquence signal et qui est localisée, au moins dans les cellules inflammatoires, dans le cytosol où elle est clivée suite à l’activation de l’inflammasome avant sa sécrétion dans le milieu extracellulaire. L’injection de LPS aux souris C3H/HeN, mais pas aux souris C3H/HeJ, une souche mutante pour les récepteurs TLR4, a augmenté l’expression d’IL-1β. Il existe plusieurs différences entre leur protocole expérimental et notre démarche. Ces auteurs ont utilisé non seulement une autre souche de souris (C3H/HeN contre C57Bl/6J), mais également des LPS d’une autre souche. Ils ont stimulé les cellules avec des LPS d’ E.coli O111-B4 et nous avons utilisé des LPS d’ E.coli O55-B5. Koyama et ses collègues (2000) ont décrit que les LPS des deux souches affectent de manière différente les cellules du poumon, en ce qui concerne la libération d’IL-8, du facteur stimulant les granulocytes (G-CSF) et d’activité chimiotactique des neutrophiles. Il a également été décrit que des souches distinctes de LPS affectent la température corporelle de rats de manière différente (Dogan et al., 2000 ; Akarsu et Mamuk, 2007). Ces différences pourraient être à l’origine des divergences entre les résultats de Yao et de nos travaux.

Nous avons montré que l’IL-1β est exprimée de manière constitutive par les glandes sous-maxillaires de souris, et ceci à un taux plus élevé que celui trouvé dans les macrophages.

149 Résultats : Régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL-1β

Ceci confirme l’importance des glandes salivaires dans l’immunologie orale. L’expression de la cytokine n’est pas affectée par la stimulation des cellules par des LPS et sa sécrétion n’est pas régulée par des agonistes purinergiques. L’IL-1β stimule la sécrétion de facteurs de croissance par les fibroblastes gingivaux qui entraînent la prolifération de cellules épithéliales (Sugiyama et al., 1996). Son expression et sa sécrétion constitutives par les glandes salivaires pourraient contribuer à l’intégrité de la muqueuse buccale. Ceci est différent des macrophages où l’expression d’IL-1β est régulée par l’activation de NF-κB. Dans ces cellules phagocytaires la sécrétion de la cytokine en condition basale est négligeable, mais augmente considérablement suite à un deuxième stimulus tel que l’activation des récepteurs P2X 7.

150 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

CHAPITRE VI: RESULTATS

REGULATION DES REPONSES DES MACROPHAGES PERITONEAUX A L’ATP PAR LE PEPTIDE ANTIMICROBIEN CRAMP

VI.1. INTRODUCTION

Pendant longtemps l’ATP a été considéré comme seul agoniste endogène des récepteurs P2X 7. Lors de la dernière décennie, il a été décrit que d’autres agents physiologiques comme le NAD, substrat de l’ADP-ribosyltransférase ART 2.2 qui catalyse le transfert d’un radical ADP-ribosyle sur le récepteur P2X 7 (Seman et al., 2003 ; Adriouch et al., 2008), ou le LL-37, un peptide cationique de la famille des cathélicidines, activent le récepteur P2X 7 (Elssner et al., 2004). Les cathélicidines sont des peptides antimicrobiens exprimés par différents types de cellules dont les cellules du système immunitaire, les cellules épithéliales et les glandes salivaires (Sorensen et al., 1997 ; Agerberth et al., 2000 ; Frohm Nilsson et al., 1999 ; Bals et al., 1998 ; Murakami et al., 2002). Leur clivage par une protéase telle que la protéinase-3 ou l’élastase libère le domaine C-terminal qui constitue le peptide antimicrobien mature ayant des propriétés antimicrobiennes (Sorensen et al., 2001 ; Gudmundsson et al., 1996). Le peptide antimicrobien humain LL-37 a également des propriétés immunomodulatrices. Il interagit avec divers récepteurs, comme les récepteurs FPR (Yang et al., 2000) ou certains sous-types des récepteurs purinergiques (Elssner et al., 2004 ; Brandenburg et al., 2010). Elssner et ses collaborateurs (2004) ont montré que le LL-37 augmente la libération d’IL-1β par les monocytes humains. La réponse étant bloquée par des inhibiteurs des récepteurs P2X 7, et l’apyrase n’ayant pas d’effet sur la réponse, ils ont conclu que le LL-37 active les récepteurs P2X 7 des monocytes (Elssner et al., 2004). Récemment il a

été montré que le récepteur P2X 7 est impliqué dans l’augmentation de l’expression d’IL-8 en réponse au LL-37 dans les fibroblastes gingivaux humains (Montreekachon et al., 2011). En effet, les antagonistes de ce récepteur inhibent l’augmentation de l’expression de la cytokine

151 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

(Montreekachon et al., 2011). Notre groupe a montré que le LL-37 affecte certaines réponses couplées à l’activation du récepteur P2X 7 par l’ATP dans les glandes sous-maxillaires de 2+ souris P2X 7-WT (Pochet et al., 2006). Le peptide a ainsi inhibé l’augmentation de la [Ca ]i et l’activation de la PLD, mais il a potentialisé l’activation de la PLA 2 en réponse à l’ATP (Pochet et al., 2006). Ces résultats pourraient être expliqués soit par une différence d’espèces (le LL-37 est un peptide humain et il a été testé sur des cellules de souris), soit par une différence de tissu (Elssner et ses collègues ont étudié l’effet du LL-37 sur des monocytes alors que notre groupe a utilisé des glandes sous-maxillaires). Nous avons alors décidé d’évaluer les réponses de macrophages murins au CRAMP, l’unique cathélicidine exprimée par les souris (Gallo et al., 1997).

VI.2. RESULTATS

2+ VI.2.1. Effet du CRAMP sur la variation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP

Avant de tester l’effet du CRAMP sur les réponses couplées aux récepteurs P2X 7 dans les macrophages péritonéaux, un test MTT a été réalisé afin d’étudier l’effet de différentes concentrations de CRAMP sur la viabilité cellulaire. Aux concentrations utilisées (1-10 µM), le CRAMP n’entraîne pas de mort cellulaire (Fig. 6.1). Un contrôle positif a été effectué avec la nigéricine (10 µM), qui a diminué la viabilité cellulaire après 60 minutes d’incubation jusqu’à 67,1 ± 10,4 % (n = 6).

Les macrophages péritonéaux de souris P2X 7-WT ont ensuite été incubés en présence 2+ de l’indicateur fluorescent fura-2/AM. La [Ca ]i a été mesurée dans du milieu If en présence de CaCl 2 1 mM et en absence de magnésium extracellulaire. Dans les macrophages incubés 2+ en condition contrôle, à 25°C, la [Ca ]i est restée stable (Fig. 6.2). L’ajout d’ATP 1 mM à 7 2+ minutes a augmenté la [Ca ]i de 97 ± 8 nM à 486 ± 54 nM endéans 10 secondes, cette concentration a pratiquement doublé au cours des 3 minutes suivantes (n = 16). A des concentrations allant de 1 à 10 µM, le peptide antibactérien CRAMP, ajouté 2 minutes après 2+ le début de la mesure, n’a pas affectée la [Ca ]i de façon significative. Le peptide a par contre inhibé d’une manière dose-dépendante la réponse tardive à l’ATP (de 816 ± 56 nM sans CRAMP jusqu’à 336 ± 39 nM avec CRAMP 1 µM, 3 minutes après l’ajout d’ATP),

152 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

2+ sans avoir d’effet sur l’augmentation rapide de la [Ca ]i (486 ± 54 nM sans CRAMP versus 420 ± 68 nM avec CRAMP 1 µM, 10 secondes après l’ajout d’ATP).

2+ La variation de la [Ca ]i entre 30 secondes avant et 1 minute après l’ajout d’ATP dans le milieu a ensuite été représentée en fonction de la concentration de CRAMP (Fig. 6.3). La concentration inhibitrice à 50 % était comprise entre 300 nM et 1 µM. Ces résultats suggèrent que le CRAMP inhibe un des récepteurs purinergiques exprimés par les macrophages péritonéaux.

125

100

75

50

25

Viabilité cellulaire (% du contrôle) (% cellulaire Viabilité 0

(6) M µ 3 µM(6) 10 µM (6) 10 AMP ine ic CRAMP 1 µM (6) CR CRAMP Nigér

Figure 6.1 : Effet du CRAMP sur la viabilité cellulaire (test MTT). Les macrophages de souris P2X 7-WT ont été stimulés pendant 1 nuit par des LPS à une concentration de 250 ng/ml. Le lendemain, les cellules ont été incubées pendant 60 minutes à 37°C dans du milieu If contenant 0,1 % de BSA, 1 % de mélange d’acides aminés et du CaCl 2 1 mM, en condition contrôle, en présence de différentes concentrations de CRAMP ou en présence de nigéricine 10 µM. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage du contrôle. Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

153 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

800

ATP 1 mM (n=16) 700 ATP 1 mM + CRAMP 1 µM (n=7) ATP 1 mM + CRAMP 3 µM (n=14) 600 ATP 1 mM + CRAMP 10 µM (n=6)

500 (nM) i ] 400 2+ [Ca 300

200 ATP CRAMP

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Temps (minutes)

2+ Figure 6.2 : Effet de CRAMP sur la [Ca ]i en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT, préalablement stimulés par 250 ng/ml de LPS pendant 1 nuit, ont été incubés avec du fura-2/AM. Les cellules ont ensuite été incubées dans du milieu If en présence de CaCl 2 1 mM, à 25°C. A 2 minutes, différentes concentrations de CRAMP ont été ajoutées au milieu. Sept minutes après le début de l’expérience, les cellules ont été stimulées par de l’ATP 1 mM. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

154 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

500 (12)

400

(4) (nM) i 300 ] 2+

[Ca (6) ∆ ∆ ∆ ∆ 200 (9) (6) 100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 [CRAMP] (µM) Figure 6.3 : Courbe dose-inhibition du CRAMP. 2+ La variation de la [Ca ]i entre 30 secondes avant et 1 minute après l’ajout d’ATP 1 mM a été représentée en fonction de la concentration de CRAMP. Les résultats sont les moyennes + SEM de (n) expériences.

VI.2.2. Interaction entre le CRAMP et le canal cationique activé par l’ATP

L’effet du peptide sur l’entrée de calcium extracellulaire a ensuite été testé (Fig. 6.4). Après avoir été chargées avec du fura-2/AM, les cellules ont été incubées dans du milieu If sans calcium. De l’EGTA 100 µM a été ajouté 2 minutes après le début de la mesure afin de chélater le calcium résiduel éventuellement présent dans le milieu. A 3 minutes du CaCl 2 1 mM a été ajouté au milieu d’incubation. En condition contrôle, l’ajout de CaCl 2 a provoqué 2+ une augmentation rapide de la [Ca ]i (de 33 ± 6 nM à 108 ± 11 nM en 20 secondes, n = 5).

Dans les cellules stimulées par 1 mM d’ATP 30 secondes avant l’ajout de CaCl 2, une 2+ augmentation initiale plus forte de la [Ca ]i (de 81 ± 45 nM à 421 ± 78 nM en 20 secondes, n = 5), suivie d’une augmentation soutenue (jusqu’à 937 ± 160 nM, 4 minutes après l’ajout de

CaCl 2) ont été observées suite à l’ajout de CaCl 2. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’entrée du calcium en condition basale. En présence d’ATP 1 mM, il a inhibé en partie 2+ l’augmentation initiale de la [Ca ]i (de 53 ± 14 nM à 183 ± 24 nM endéans de 20 secondes, n = 6) et il a complètement bloqué l’entrée soutenue de calcium en réponse à l’ATP (jusqu’à

300 ± 30 nM, 4 minutes après l’ajout de CaCl 2). Ces résultats suggèrent que l’ATP active un récepteur P2X couplé à un canal ionique restant ouvert pendant plusieurs minutes. Ce canal est bloqué par le CRAMP.

155 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Entrée de calcium extracellulaire en absence de CRAMP 1500

1250 Contrôle (n=5) ATP 1 mM (n=5) 1000 (nM) i ] 750 2+ [Ca 500 ATP Ca 250 EGTA

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

Entrée de calcium extracellulaire en présence de CRAMP 3 µM 1500

Contrôle (n=6) 1250 ATP 1 mM (n=6)

1000 (nM) i ] 750 2+ [Ca 500 ATP 250 EGTA

Ca 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

Figure 6.4 : Effet du CRAMP sur l’entrée de calcium extracellulaire en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT, préalablement stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit et chargés avec du fura-2/AM, ont été incubés à 25°C dans du milieu If, en absence de calcium extracellulaire, et en absence (haut) ou en présence (bas) de CRAMP 3 µM. A 2 minutes, 100 µM d’EGTA ont été ajoutés au milieu. Trente secondes plus tard, de l’ATP 1 mM a été ajouté au milieu d’incubation de certains échantillons, suivi par l’ajout de CaCl 2 1 mM à 3 minutes. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

156 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Les principaux récepteurs P2X exprimés par les macrophages sont les récepteurs

P2X 7 et P2X 4 (Coutinho-Silva et al., 2005 ; résultats chapitre III). Afin de déterminer lequel de ces récepteurs est régulé par le CRAMP, des expériences ont été réalisées avec des macrophages de souris P2X 7-KO. Les macrophages de ces souris expriment des récepteurs

P2X 4 (Fig. 3.4), mais pas de récepteurs P2X 7 (Fig. 3.1). Une faible concentration d’ATP (10 2+ µM) a provoqué une augmentation faible et transitoire de la [Ca ]i dans les macrophages de souris P2X 7-KO (Fig. 6.5, haut, n = 6). L’ivermectine potentialise les réponses couplées au récepteur P2X 4 (Priel et Silberberg, 2004). Dans les macrophages incubés en présence 2+ d’ivermectine, la variation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP 10 µM a été augmentée et prolongée (Fig. 6.5, haut, n = 4). Le CRAMP, à une concentration de 3 µM, n’a pas eu d’effet sur la réponse des macrophages de souris P2X 7-KO à l’ATP 10 µM seul ou à la combinaison ivermectine plus ATP (Fig. 6.5, bas), suggérant que le peptide ne bloque pas le canal couplé aux récepteurs P2X 4.

2+ L’activation du récepteur P2X 7 ouvre un canal perméable non seulement au Ca , mais également à d’autres cations comme le K +. Les macrophages ont été incubés en présence de PBFI/AM, un indicateur fluorescent sensible à la concentration de K +. La fluorescence est restée stable dans les macrophages incubés en condition contrôle, à 25°C dans du milieu If contenant 6 mM de KCl et 1 mM de CaCl 2. L’ajout d’ATP 1 mM au milieu d’incubation a provoqué une diminution continue du signal (Fig. 6.6., haut, n = 6). Le CRAMP, par lui-même, n’a pas eu d’effet sur la fluorescence du PBFI, confirmant qu’il n’affecte pas le canal cationique (Fig. 6.6, bas, n = 6). La diminution de la fluorescence en réponse à l’ATP 1 mM a été inhibée en présence de CRAMP 3 µM (Fig. 6.6, bas, n = 6). Ces résultats nous ont confirmé que le CRAMP inhibe le canal cationique couplé aux récepteurs

P2X 7.

157 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

2+ [Ca ]i dans les souris P2X 7-KO en absence de CRAMP

ATP 10 µM (n=6) 1200 ATP 10 µM + Iver 3 µM (n=4)

1000

800 (nM) i ] 600 2+

[Ca 400 ATP

200

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

2+ [Ca ]i dans les souris P2X 7-KO en présence de CRAMP 3 µM ATP 10 µM (n=6) 1200 ATP 10 µM + Iver 3 µM (n=4)

1000

800 (nM) i ] 600 2+ ATP [Ca 400 CRAMP

200

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Temps (minutes)

2+ Figure 6.5 : Effet du CRAMP sur la [Ca ]i en réponse à l’ATP dans les macrophages de souris P2X 7-KO. Les macrophages de souris P2X 7-KO, préalablement stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit, ont été chargés avec du fura-2/AM. Les cellules ont ensuite été incubées à 25°C dans du milieu If, en présence de 1 mM CaCl 2, et en absence (cercles) ou en présence (triangles) de 3 µM ivermectine (Iver). A 2 minutes, le CRAMP a été ajouté à certains échantillons, à une concentration de 3 µM (bas). Trois minutes plus tard, de l’ATP 10 µM a été ajouté au milieu d’incubation. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

158 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Efflux de potassium en absence de CRAMP 11000 Contrôle (n=6) ATP 1 mM (n=6)

10000

ATP 9000 Fluorescence(u.a.f.)

8000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temps (minutes)

Efflux de potassium en présence de CRAMP 3 µM 11000 Contrôle (n=6) ATP 1 mM (n=6)

10000

CRAMP ATP 9000 Fluorescence(u.a.f.)

8000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temps (minutes)

+ Figure 6.6 : Effet du CRAMP sur la [K ]i en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT ont été stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit, puis ils ont été chargés avec du PBFI/AM. Les cellules ont ensuite été incubées à 25°C, dans du milieu If contenant du KCl 6 mM, et en présence de CaCl 2 1 mM. A 2 minutes, le CRAMP a été ajouté à une concentration de 3 µM (bas). Trois minutes plus tard, de l’ATP 1 mM a été ajouté au milieu d’incubation de certains échantillons. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

159 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

VI.2.3. Effet des agonistes des récepteurs des peptides formylés (FPR) sur 2+ l’augmentation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP

Les peptides dérivés des cathélicidines activent les récepteurs FPR (Le et al., 2002). Ces récepteurs couplés aux protéines G sont exprimés dans les neutrophiles et monocytes et ils jouent un rôle important dans la défense immunitaire et l’inflammation. Chez l’homme, trois récepteurs FPR existent : FPR1, FPR2/ALX2 et FPR3 (appelés anciennement FPR, FPRL1 et FPRL2 respectivement). Ces récepteurs peuvent fixer divers ligands (Ye et al., 2009). En considérant que les macrophages murins expriment certaines classes de ces récepteurs (Kurosaka et al., 2005), l’inhibition exercée par le CRAMP sur le canal couplé aux récepteurs P2X 7 pourrait être secondaire à l’activation de ces récepteurs. Afin de tester cette hypothèse, l’interaction entre le récepteur P2X 7 et d’autres agonistes des récepteurs FPR a été testée. Comme le montre la figure 6.7 (haut), 1 µM de fMLF, un agoniste spécifique des récepteurs FPR1 (Le et al., 2002), et 10 µM de MMK-1, un agoniste 2+ spécifique des récepteurs FPR2 (Hu et al., 2001), n’ont pas eu d’effet sur la [Ca ]i. L’ajout de 10 µM WKYMVm, activant les récepteurs FPR2 et FPR3 (Ye et al., 2009), a doublé la 2+ [Ca ]i de manière transitoire (de 74 ± 6 nM à 191 ± 18 nM après 15 secondes, n = 4, Fig. 6.7, bas). Cette réponse n’a pas été affectée par une préincubation en présence de CRAMP 3 µM (Fig. 6.8, de 80 ± 11 nM à 236 ± 17 nM, n = 3). Le fMLF, le MMK-1 et le WKYMVm n’ont pas inhibé la réponse tardive à l’ATP 1 mM comme le fait le CRAMP (Fig. 6.7). A partir de ces résultats on peut conclure que l’inhibition par le CRAMP de l’augmentation de 2+ la [Ca ]i en réponse à l’ATP n’est pas reproduite par des agonistes spécifiques des récepteurs FPR. Ces résultats suggèrent aussi que le CRAMP n’est pas un inhibiteur des récepteurs activés par le WKYMVm.

160 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

1750 fMLF 1 µM + ATP 1 mM (n=5) 1500 MMK-1 10 µM + ATP 1 mM (n=5) ATP 1 mM (n=4)

1250

1000 (nM) i ] 2+ 750 [Ca

500

agoniste FPR ATP 250

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (minutes)

1750 WKYMVm 10 µM + ATP 1 mM (n=4)

1500

1250

1000 (nM) i ] 2+ 750 [Ca

500 WKYMVm ATP 250

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (minutes)

2+ Figure 6.7 : Effet des agonistes des récepteurs FPR sur la [Ca ]i en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT, préalablement stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit et chargés avec du fura-2/AM, ont été incubés à 25°C dans du milieu If, en présence de 1 mM CaCl 2. A 2 minutes, divers agonistes des récepteurs FPR ont été ajoutés à certains échantillons. Trois minutes plus tard, de l’ATP 1 mM a été ajouté au milieu d’incubation. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

161 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

800

CRAMP 3 µµµM + WKYMVm 10 µµµM (n=3)

600 (nM) i ] 400 2+ [Ca

200 CRAMP WKYMVm

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temps (minutes)

2+ Figure 6.8 : Effet du CRAMP sur la [Ca ]i en réponse au WKYMVm. Les macrophages de souris P2X 7-WT, préalablement stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit et chargés avec du fura-2/AM, ont été incubés à 25°C dans du milieu If, en présence de 1 mM CaCl 2. A 2 minutes, 3 µM de CRAMP ont été ajoutés. Trois minutes plus tard, du WKYMVm 10 µM a été ajouté au milieu d’incubation. Les résultats sont les moyennes + SEM de 3 expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

VI.2.4. Effet du CRAMP sur la formation d’un pore en réponse à l’ATP

L’activation prolongée du récepteur P2X 7 entraîne la formation d’un pore perméable à des ions de poids moléculaire élevé, comme le bromure d’éthidium (314 Da). S’il est à l’intérieur des cellules, le bromure d’éthidium peut interagir avec les acides nucléiques bicaténaires et devient alors fluorescent (Alzola et al., 2001). La fluorescence émise par le bromure d’éthidium augmente légèrement au cours du temps dans les macrophages incubés en condition contrôle (Fig. 6.9, haut). Après ajout d’ATP 1 mM au milieu d’incubation, la pente de la courbe a augmenté d’environ trois fois. Les macrophages ont ensuite été exposés au CRAMP 3 µM avant l’ajout d’ATP. Le peptide n’a pas eu d’effet par lui-même sur l’entrée de bromure d’éthidium, mais il a bloqué presque complètement la réponse à l’ATP (Fig. 6.9, bas).

162 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Entrée du bromure d'éthidium en absence de CRAMP 40 Contrôle (n=4) ATP 1 mM (n=5) 30

20 ATP

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Temps (minutes) -10 Entrée de bromure d'éthidium (% du maximum) du bromure(% de Entrée d'éthidium

Entrée du bromure d'éthidium en présence de CRAMP 3 µM 40 Contrôle (n=4) ATP 1 mM (n=4) 30

20 CRAMP ATP

10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Temps (minutes) -10 Entrée de bromure d'éthidium (% du maximum) du (% debromureEntrée d'éthidium

Figure 6.9 : Effet du CRAMP sur l’entrée de bromure d’éthidium en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT ont été stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit, puis incubés à 37°C dans du milieu If contenant 20 µM de bromure d’éthidium, en absence de calcium. A 2 minutes, 3 µM de CRAMP ont été ajoutés (bas). Cinq minutes plus tard, de l’ATP 1 mM a été ajouté au milieu d’incubation de certains échantillons. Les résultats sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

163 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

A part la formation de pore, l’activation prolongée du récepteur P2X 7 provoque également la libération de la LDH. L’incubation des macrophages à 37°C pendant 30 minutes avec 1 mM d’ATP a augmenté la libération de la LDH de 19 ± 1,5 % (Fig. 6.10, n = 11) à 42,2 ± 2,2 % (n = 10, P < 0,001). Par lui-même, le CRAMP, à une concentration de 3 µM, n’a pas affecté la libération de la LDH (20,4 ± 1,8 %, n = 10), mais le peptide a bloqué l’effet de l’ATP 1 mM (30,8 ± 3,9 %, n = 6, P < 0,05 quand comparé à l’ATP seul). Ces résultats suggèrent que le CRAMP n’inhibe pas seulement le canal cationique couplé aux récepteurs

P2X 7, mais aussi la formation de pore et la mort cellulaire subséquente.

Contrôle ATP 1 mM *** * 50 (10) 40 (6)

30 (11) (10) 20

(% LDH totale) 10 Libération de la LDH la de Libération 0

µM ontrôle C MP 3 A CR

Figure 6.10 : Effet du CRAMP sur la sortie de la LDH en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT ont été stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit. Le lendemain ils ont été incubés pendant 30 minutes à 37°C dans du milieu If contenant 0,1 % de BSA, 1 % de mélange d’acides aminés et du CaCl2 1 mM, en condition contrôle, en présence d’ATP 1 mM, de CRAMP 3 µM ou en présence d’une combinaison ATP plus CRAMP. L’activité de la LDH a ensuite été mesurée dans le surnageant. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de la LDH libérée par rapport à la LDH totale intracellulaire. Ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. * P < 0,05 ; *** P < 0,001.

164 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

VI.2.5. Effet du CRAMP sur la libération d’acide oléique en réponse à l’ATP

Les agonistes purinergiques augmentent la libération d’acide oléique par les macrophages péritonéaux et cette réponse est probablement secondaire à l’activation de diverses phospholipases (Garcia-Marcos et al., 2006 a). L’ATP 1 mM augmente la libération d’acide oléique par les macrophages chargés avec de l’acide [ 3H]-oléique (Fig. 6.11, de 6,8 ± 0,8 % au cours d’une incubation de 20 minutes en condition contrôle, à 12,8 ± 0,8 % après 20 minutes d’incubation en présence d’ATP 1 mM, n = 11, P < 0,001). Par lui-même le CRAMP n’a pas eu d’effet sur la libération basale d’acide oléique (6,0 ± 0,7 % en présence de 3 µM CRAMP, n = 11). Le peptide a inhibé la réponse à l’ATP extracellulaire : le nucléotide a augmenté la libération d’acide oléique de seulement 8,5 ± 1,0 % (n = 11, P < 0,01 quand comparé à l’ATP seul) en présence de CRAMP 3 µM.

20 Contrôle ATP 1 mM *** ** 15 H] oléique H] 3

10

5 Libérationd'acide [ (% radioactivité (% totale incorporée)

0

µM trôle 3 n o C MP A CR

Figure 6.11 : Effet du CRAMP sur la libération d’acide oléique en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT ont été chargés en présence de LPS 250 ng/ml et d’acide [ 3H]-oléique comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 20 minutes à 37°C, en condition contrôle ou en présence d’ATP 1 mM, de CRAMP 3 µM, ou en présence d’une combinaison ATP plus CRAMP. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage de la radioactivité totale incorporée dans les cellules et ce sont les moyennes + SEM de 11 expériences. ** P < 0,01 ; *** P < 0,001.

165 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

VI.2.6. Effet du CRAMP sur la production de ROS en réponse à l’ATP

La production et libération des ROS est une réponse majeure des macrophages à l’ATP extracellulaire (voir chapitre IV). Comme le montre la figure 6.12, la fluorescence du DCFH était stable dans les macrophages incubés en condition contrôle (Figure du haut) ou en présence de CRAMP 3 µM (Figure du bas). Ces résultats suggèrent que l’indicateur fluorescent reste sous forme réduite quand les cellules sont incubées en conditions basales. L’ajout d’ATP 1 mM au milieu d’incubation a provoqué une augmentation de la fluorescence du DCFH secondaire à son oxydation par les ROS produits en réponse à l’ATP (augmentation de 6364 ± 1191 u.a., n = 10, après 3 minutes d’exposition à l’ATP). La préincubation avec 3 µM de CRAMP a fortement bloqué la réponse à l’ATP (augmentation de 3320 ± 415 u.a. après 3 minutes d’exposition à l’ATP, n = 9, P < 0,01 quand comparé à la fluorescence de l’ATP seul).

166 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Production de ROS en absence de CRAMP 10000 Contrôle (n=10) ATP 1 mM (n=10) 8000

6000

4000

ATP 2000 Variation de la fluorescence dela Variation (u.a.) 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Temps (minutes)

Production de ROS en présence de CRAMP 3 µM 10000 Contrôle (n=8) ATP 1 mM (n=9) 8000

6000

4000

2000 CRAMP ATP Variation de la fluorescence la deVariation (u.a.) 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Temps (minutes)

Figure 6.12 : Effet du CRAMP sur la production de ROS en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT, préalablement stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit, puis chargés avec du DCFH/DA, ont été incubés à 25°C dans du milieu If, en présence de 1 mM CaCl 2. Deux minutes après le début de la mesure, 3 µM de CRAMP ont été ajoutés (bas). Cinq minutes plus tard, certaines cellules ont été exposées à l’ATP 1 mM. Les résultats sont exprimés sous forme de variation de la fluorescence et ce sont les moyennes + SEM de n expériences. Pour la clarté du graphique la SEM n’a été représentée que pour un point sur dix.

167 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

VI.2.7. Effet du CRAMP sur la libération d’IL-1βββ en réponse à l’ATP

Les agonistes des récepteurs P2X 7 provoquent l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β par les macrophages (Kahlenberg et Dubyak, 2004). Après 20 minutes d’incubation en présence d’ATP 1 mM, la concentration d’IL-1β dans le milieu a augmenté de 411 ± 81 pg/ml (n = 5) à 2634 ± 434 pg/ml (n = 10, P < 0,001, Fig. 6.13). Le CRAMP, à une concentration de 3 µM, n’a pas modifié la libération basale d’IL-1β (552 ± 130 pg/ml, n = 4), mais le peptide a bloqué la sécrétion d’IL-1β en réponse à l’ATP extracellulaire (1554 ± 195 pg/ml, n = 5).

Contrôle 4000 ATP 1 mM *** (10) 3000 (pg/ml) β β β β

2000 (5)

1000 (4) EquivalentsIL-1 (5)

0 M µ 3 Contrôle AMP CR

Figure 6.13 : Effet du CRAMP sur la libération d’IL-1βββ en réponse à l’ATP. Les macrophages de souris P2X 7-WT ont été stimulés par des LPS 250 ng/ml pendant 1 nuit. Le lendemain ils ont été incubés pendant 15 minutes à 37°C, dans du milieu HBSS dépourvu de magnésium mais contenant 1 mM de CaCl 2 et 0,1 % de BSA, en condition contrôle ou en présence d’ATP 1 mM, de CRAMP 3 µM, ou en présence d’une combinaison ATP plus CRAMP. Le surnageant a ensuite été prélevé afin de doser l’IL-1β par ELISA. Les résultats sont exprimés sous forme d’équivalents IL-1β (pg/ml) et ce sont les moyennes + SEM de (n) expériences. *** P < 0,001.

168 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

VI.2.8. Etude de la structure secondaire du CRAMP

Selon une étude publiée par Tomasinsig et ses collègues (2008), la capacité du peptide LL-37 à moduler le récepteur P2X 7 dépend de sa structure secondaire. Dans une dernière série de mesures, la structure secondaire du CRAMP a donc été analysée à l’aide de la spectroscopie ATR-FTIR. Ces mesures ont été réalisées avec 5 µg de CRAMP ou de KR- 20, un peptide composé des vingt derniers acides aminés du LL-37 (Murakami et al., 2004). Les spectres des deux peptides ont été comparés aux spectres de la myoglobine, utilisée comme référence pour une structure α-hélicoïdale, et de l’avidine, référence pour une structure en feuillet β. Comme le montre la figure 6.14, le spectre de la myoglobine présente deux pics pratiquement symétriques dans la zone de 1500 à 1800 cm -1. Le pic centré à 1655 cm -1 correspond au signal amide I, tandis que la seconde bande à 1545 cm -1 est le signal amide II. Dans le spectre de l’avidine un premier pic à 1630 cm -1 est observé. Ce pic a un épaulement aux environs de 1650 cm -1. Un second pic pour l’avidine est centré aux alentours de 1530 cm -1. Le spectre du KR-20 était très similaire au spectre de la myoglobine avec deux pics symétriques à 1656 et 1545 cm -1, suggérant que le peptide était formé d’une hélice α en milieu aqueux. Le spectre du CRAMP se rapprochait de celui d’une hélice α, à l’exception du signal amide I qui n’était pas symétrique : il y avait une queue aux alentours de 1640 cm -1 suggérant une faible composante de feuillet β, et une épaule aux environs de 1675 cm -1 probablement due à un coude. Ces résultats initiaux suggéraient que le CRAMP et le KR-20 forment de manière prédominante une hélice α dans nos conditions expérimentales. Ensuite les deux peptides ont été deutérés suite au barbotage d’azote gazeux saturé au deutérium (Fig. 6.15). La mesure des vitesses d’échange du proton de l’amide par le deutérium est généralement utilisée afin d’évaluer la contribution possible dans le spectre de séquences de la protéine dépourvues de structure secondaire (random coil). Dans ces séquences, les atomes d’hydrogène sont relativement accessibles et plus facilement échangeables avec du deutérium. Suite à la deutération l’asymétrie du pic amide I a été amplifiée, et une analyse de la courbe deutérée a révélé un pic majeur aux environs de 1652 cm -1 et également deux pics mineurs centrés à 1674 cm -1 et 1630 cm -1. Le pic amide II des deux peptides a diminué au cours du temps (environ 20 % après 15 minutes pour le KR-20 et 40 % pour le CRAMP). En même temps, un pic autour de 1440 cm -1 a augmenté. Ces résultats suggèrent qu’en solution aqueuse le KR-20 forme une structure en hélice α pratiquement parfaite, alors que la

169 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP structure secondaire du CRAMP est plus complexe mais forme également, au moins partiellement, une hélice α.

2.0

1.5 M

1.0 C Absorbancerelative K 0.5

A

0.0 1800 1700 I 1600 II 1500 1400 Nombre d'ondes (cm -1 )

Figure 6.14 : Spectre ATR-FTIR du CRAMP, du KR-20, de l’avidine et de la myoglobine. Les spectres du CRAMP (C) et du KR-20 (K) ont été comparés aux spectres de l’avidine (A), structure de référence des feuillets β, et de la myoglobine (M), structure de référence d’une hélice α.

170 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

KR-20 0.3

Amide I 0.2 Amide II

0.1

Absorbance relative Absorbance A

D C 0.0 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400 Nombre d'ondes (cm -1 )

CRAMP 0.3

0.2

Amide I Amide II

0.1

Absorbance relative Absorbance A

D 0.0 C 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400 Nombre d'ondes (cm -1 )

Figure 6.15 : Spectre ATR-FTIR du KR-20 et du CRAMP deutérés. Les spectres du KR-20 (haut) et du CRAMP (bas) ont été réalisés avant (C) et après (D) deutération. Les spectres après deutération ont été analysés par la méthode de déconvolution de Fourier (A).

171 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

VI.3. DISCUSSION

Nos résultats montrent que le peptide murin CRAMP inhibe l’augmentation 2+ + prolongée de la [Ca ]i, la diminution de la [K ]i, l’entrée de bromure d’éthidium, la libération de LDH, d’IL-1β et d’acide oléique, et la production de ROS provoquées par l’ATP extracellulaire dans les macrophages péritonéaux de souris P2X 7-WT. Les macrophages expriment divers récepteurs P2Y et P2X. Les réponses à l’ATP extracellulaire affectées par le CRAMP sont toutes médiées par les récepteurs P2X 7, suggérant que le CRAMP bloque l’activation de ces récepteurs. Ceci est confirmé par des expériences réalisées avec des macrophages de souris P2X 7-KO. Dans ces cellules, l’ATP a seulement 2+ 2+ provoqué une augmentation transitoire de la [Ca ]i. La faible augmentation de la [Ca ]i a été potentialisée par l’ivermectine. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’augmentation de la 2+ [Ca ]i suite à l’ajout d’une combinaison ATP plus ivermectine, montrant que le peptide n’inhibe pas le canal cationique couplé aux récepteurs P2X 4. La sélectivité du CRAMP pour les récepteurs P2X 7 par rapport aux récepteurs P2X 4 exclut un effet non spécifique du peptide sur la membrane plasmique.

Des études ont montré que le LL-37 et le CRAMP attirent des neutrophiles, des lymphocytes T, des monocytes ou des macrophages après fixation du récepteur FPR2, faisant partie de la famille des récepteurs FPR, couplés aux protéine G (Yang et al., 2000 ; Kurosaka et al., 2005). Dans les macrophages murins le fMLF et le MMK-1, des agonistes des 2+ récepteurs FPR1 et FPR2 respectivement, n’ont pas augmenté la [Ca ]i. Le WKYMVm, un agoniste du récepteur FPR3 dont l’activation entraîne une mobilisation du calcium 2+ (Christophe et al., 2001 ; Kang et al., 2005), a doublé transitoirement la [Ca ]i. Ceci est cohérent avec le fait que les macrophages murins expriment occasionnellement le récepteur FPR3 (Devosse et al., 2009). Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur la réponse de WKYMVm, suggérant qu’il n’interagit pas avec le récepteur FPR3. Aucun des trois agonistes des récepteurs FPR ne reproduit l’inhibition exercée par le CRAMP sur l’augmentation de la 2+ [Ca ]i provoquée par l’ATP. Ces résultats suggèrent que les récepteurs FPR ne sont pas 2+ impliqués dans l’inhibition exercée par le CRAMP sur l’augmentation de la [Ca ]i en réponse à l’ATP.

172 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Cette inhibition par le CRAMP des réponses à l’ATP était inattendue puisque dans les monocytes humains le LL-37 reproduit les réponses à l’ATP extracellulaire et augmente la sécrétion d’IL-1β. Comme les antagonistes des récepteurs P2X 7 ont bloqué ces réponses, on en a conclu que le récepteur P2X 7 était activé par le LL-37 (Elssner et al., 2004). Plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’expliquer cette activation du récepteur P2X 7 par le peptide. Il a été suggéré que le LL-37 perturbe la membrane plasmique, ce qui pourrait induire une libération transitoire et faible d’ATP (Elssner et al., 2004 ; Pochet et al., 2006). Les réponses au LL-37 n’étant pas inhibées en présence d’apyrase, une ATP diphosphohydrolase qui dégrade l’ATP en AMP, il semble plutôt que le peptide interagit directement avec le récepteur (Elssner et al., 2004 ; Pochet et al., 2006). Le LL-37 pourrait interagir avec la partie extracellulaire du récepteur (Wewers et Sarkar, 2009), ou avec son domaine C-terminal intracellulaire, après avoir traversé la membrane plasmique via un mécanisme d’endocytose au niveau des rafts (Sandgren et al., 2004). Ainsi, il a été montré que dans les monocytes le LL-37 peut se lier à une protéine intracellulaire, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (Mookherjee et al., 2009). Cette dernière hypothèse à récemment été exclue par Tomasinsig et ses collaborateurs (2008), qui ont observé que le

LL-37 peut interagir avec le récepteur P2X 7 même s’il est dépourvu du domaine C-terminal intracellulaire. Ce groupe a également observé que la capacité de stimuler les récepteurs

P2X 7 varie parmi les peptides dérivés des cathélicidines. Le LL-37 d’orang-outan et celui du gibbon qui, comme le peptide humain, forment une hélice α non seulement dans des milieux organiques mais également dans des solutions aqueuses, ont stimulé le récepteur P2X 7. Le LL-37 de macaque ou celui de semnopithèque obscur, qui forment une hélice α uniquement en milieu organique, n’interagissent pas avec le récepteur. Ces résultats ont amené Tomasinsig et ses collègues (2008) à conclure que la capacité des peptides antimicrobiens à interagir avec le récepteur P2X 7 était liée à leur capacité à former une hélice α amphipathique en solution aqueuse. Le LL-37 et le CRAMP partagent des propriétés structurales majeures : ce sont de petits peptides cationiques, ne possédant pas de résidu cystéine, avec une charge nette de + 6 pour les deux, et un pourcentage élevé de résidus hydrophobes (35 % pour le LL-37 et 29 % pour le CRAMP, Tableau 6.1). Ils partagent également la capacité de former une structure α-hélicoïdale dans les solvants organiques. A l’aide de la spectroscopie ATR-FTIR nous avons étudié la structure secondaire de CRAMP et du peptide composé des 20 derniers acides aminés de LL-37, le KR-20. Ces peptides ont été dissous dans un tampon HEPES 2 mM (pH 7,4). Il a été démontré que la spectroscopie ATR-

173 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

FTIR peut fournir des informations importantes sur la structure secondaire d’une protéine et sur ses modifications après l’interaction avec un ligand, un lipide ou une autre protéine (Vigano et al., 2000). Ces informations peuvent être obtenues par l’analyse du pic amide I (correspondant à la vibration C=O) et du pic amide II (correspondant à la déformation N-H). Ces pics sont observés à des longueurs d’onde différentes en fonction de la présence d’une séquence dépourvue de structure secondaire (random coil) , d’une hélice α ou d’un feuillet β. Les spectres des deux peptides ont révélé que les pics amide I et amide II étaient centrés à des longueurs d’onde correspondant aux hélices α. La capacité d’échanger un hydrogène du groupement N-H par du deutérium est également reliée au contenu relatif de structures secondaires de la protéine : cet échange est très lent dans les régions bien structurées d’une protéine ou d’un peptide. La hauteur des pics amide I et amide II en présence de vapeurs de deutérium peut ainsi être utilisée comme index d’une structure compacte. La diminution des pics était plutôt faible, suggérant que les deux peptides avaient des structures secondaires bien définies plutôt que des structures non organisées. La deutération a modifié l’allure du pic amide I et a accentué les épaules observées autour de 1630 et 1670 cm -1, surtout pour le CRAMP. A partir de ces résultats on peut conclure que le KR-20 forme surtout une hélice α en solution aqueuse. La structure du CRAMP semble plus complexe, combinant une hélice α et un coude. La présence de deux résidus proline dans la région C-terminale de CRAMP (positions 30 et 32) pourrait être à l’origine de ce coude. Nos résultats sont en désaccord avec les observations de Yu et collaborateurs (2002). Ces auteurs ont utilisé des analyses de dichroïsme circulaire et la spectroscopie RMN, et ils ont décrit qu’en solution aqueuse le CRAMP possède une structure non organisée (random coil) . Dans des environnements ayant une composition proche de celle des membranes (solution 50 % (v/v) trifluoroéthanol/H 2O, liposomes, micelles de dodécylsulfate de sodium ou de dodécylphosphocholine) le CRAMP forme une hélice α. Ces différences pourraient être expliquées par le fait que les deux peptides utilisés dans ces deux études possèdent des structures primaires différentes. Il y a environ 85 % de similitude entre ces peptides. Nous avons utilisé un peptide de 34 acides aminés. Sa séquence a été décrite par Pestonjamasp et ses collaborateurs (2001) et correspond au peptide enregistré comme CRAMP dans la base de données des peptides antimicrobiens (http://aps.unmc.edu/AP/main.php , numéro d’accès AP00281, Wang et al., 2009). Le peptide utilisé par Yu et ses collègues (2002) est formé de 38 acides aminés : il ne contient pas la glutamine C-terminale mais possède 5 acides aminés supplémentaires (ISRLA) au niveau N-terminal (Tableau 6.1). Ce peptide a également une charge positive

174 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP supplémentaire à pH neutre (+ 7), et a une proportion plus élevée d’acides aminés hydrophobes (34 %). Dix de ces acides aminés sont localisés sur le même côté d’une hélice α potentielle du peptide utilisé par Yao et ses collaborateurs, et seulement 6 résidus ont une position similaire dans le CRAMP que nous avons utilisé. Ces différences dans la structure primaire des deux peptides pourraient être à l’origine de conformations distinctes dans l’eau. Ainsi, le LL-37 et le CRAMP peuvent former une hélice α en solution aqueuse et peuvent interagir avec le récepteur P2X 7. Or le LL-37 est un agoniste des récepteurs P2X 7 humains et le CRAMP est un antagoniste des récepteurs P2X 7 murins. Les deux peptides possèdent un index de potentiel de liaison (index de Boman) différent : 2,99 kcal/mol pour le LL-37 et seulement 1,74 kcal/mol pour le CRAMP (Wang et al., 2009). Cet index correspond à la somme des énergies libres des chaînes latérales respectives pour le transfert du cyclohexane dans l’eau, divisée par le nombre total de résidus (Boman, 2003). Des valeurs élevées prédisent un potentiel de liaison élevé. Cette différence d’énergie pourrait expliquer la capacité du LL-37 de placer le récepteur P2X 7 en conformation active. Mais, cette hypothèse ne peut pas expliquer pourquoi le LL-37 a bloqué certaines réponses couplées au récepteur

P2X 7 dans les glandes sous-maxillaires de souris (Pochet et al., 2006). Une explication pourrait être le fait que non seulement les peptides, mais également les récepteurs eux-mêmes contribuent à la différence d’interaction entre peptides antimicrobiens et récepteurs P2X 7.

Les récepteurs P2X 7 murins et humains ont 80 % d’homologie, mais sont différents par rapport à leur sensibilité envers divers agonistes (surtout le BzATP) ou antagonistes (surtout les dérivés de l’isoquinolone) (Young et al., 2007 ; Donnelly-Roberts et al., 2009). Il est donc raisonnable de concevoir que les récepteurs P2X 7 de l’homme et de la souris ont différentes réponses aux peptides antimicrobiens. Les résultats obtenus avec un modèle murin (CRAMP et macrophages murins) confirment que les peptides antimicrobiens de la famille des cathélicidines et le récepteur P2X 7 peuvent interagir, mais que cette interaction n’est pas toujours positive, et que ces peptides ne sont donc pas des agonistes universels des récepteurs

P2X 7.

175 Résultats : Régulation des réponses des macrophages par le CRAMP

Peptide Séquence Charge c AA hydrophobes CRAMP a G LL RKGGEK IGEK LKK IGQK IKN FF QK LV PQPEQ + 6 29 % CRAMP b ISR LA GLL RKGGEK IGEK LKK IGQK IKN FF QK LV PQPE + 7 34 % LL-37 LLGD FF RKSKEK IGKE FKR IVQR IKD FL RN LV PRTES + 6 35 % KR-20 KR IV QR IKD FL RN LV PRTES + 4 35 %

Tableau 6.1 : Séquence primaire et propriétés physico-chimiques de diverses cathélicidines. Les séquences primaires et propriétés physico-chimiques du CRAMP ( a séquence du peptide enregistré dans la base de données des peptides antimicrobiens ; b séquence du peptide utilisé par Yu et al., 2002), du LL-37 et du peptide dérivé du LL-37, le KR-20. En jaune : acides aminés différents entre les deux séquences du CRAMP. En bleu : acides aminés hydrophobes. En bleu souligné : acides aminés hydrophobes localisés sur le même côté d’une hélice α potentielle. c charge du peptide à pH physiologique

176 Conclusion

CHAPITRE VII

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Les principales conclusions des résultats présentés dans ce travail sont résumées ci- dessous :

Les récepteurs purinergiques sont couplés à la production de ROS aussi bien dans les glandes salivaires que dans les cellules phagocytaires. Dans les macrophages, l’ATP stimule la production de ROS via les récepteurs P2X 7, et probablement les récepteurs P2X 4 et P2Y. Cette réponse est calcium-dépendante et implique la NADPH oxydase. Dans les glandes sous- maxillaires, la production de ROS en réponse à l’ATP est secondaire à l’activation des récepteurs P2X 7 et est calcium-indépendante. La voie de signalisation menant à cette production implique la PKC ainsi que ERK1/2 qui activent la NADPH oxydase.

L’expression et la sécrétion de la cytokine IL-1β sont également régulées différemment dans les macrophages et les glandes salivaires. Nous avons montré que l’IL-1β est exprimée de manière constitutive par les cellules ductales et les acini des glandes sous- maxillaires, à un taux plus élevé que celui trouvé dans les macrophages. Contrairement aux cellules phagocytaires, l’expression de la cytokine n’est pas augmentée suite à la stimulation des récepteurs TLR4 par des LPS. L’IL-1β est également sécrétée de manière constitutive par les glandes salivaires. Cette sécrétion n’est pas régulée par les agonistes des récepteurs P2X 7, malgré les variations ioniques secondaires à l’activation de ces récepteurs.

Nous avons finalement montré grâce à un modèle murin (CRAMP, un peptide murin dérivé de la cathélicidine et macrophages murins) que ce peptide antimicrobien et les récepteurs P2X 7 interagissent, mais que cette interaction n’est pas toujours positive. Le

CRAMP inhibe spécifiquement les réponses couplées à l’activation des récepteurs P2X 7 murins, ceci malgré sa capacité de former une hélice α en solution aqueuse. Les récepteurs FPR, dont le CRAMP est un agoniste, n’interviennent pas dans l’inhibition exercée sur 2+ l’augmentation de la [Ca ]i secondaire à l’activation des récepteurs P2X 7. Les peptides

177 Conclusion antimicrobiens de la famille des cathélicidines ne sont donc pas des agonistes universels des récepteurs P2X 7.

Ces résultats confirment l’importance des glandes salivaires dans l’immunologie orale. Dans ces glandes, la production de ROS en réponse à des agonistes purinergiques ainsi que l’expression et la sécrétion constitutives d’IL-1β pourraient contribuer à la protection et au maintien de l’intégrité de la muqueuse buccale (Fig. 7.1). En présence de la lactoperoxydase et du thiocyanate, les ROS sont à l’origine de la production d’hypothiocyanite, à propriétés antimicrobiennes, qui est délivré directement au niveau de la bouche. Suite à la sécrétion constitutive d’IL-1β, la libération de facteurs de croissance par les fibroblastes gingivaux serait stimulée, entraînant la prolifération de cellules épithéliales. La cytokine intervient ainsi dans les processus de cicatrisation et joue un rôle de protection de la muqueuse buccale. Le rôle des macrophages semble différent. Dans ces cellules phagocytaires, les ROS produits en réponse à l’ATP participent à la défense de l’hôte en tuant des micro-organismes invasifs. L’expression d’IL-1β par les macrophages est négligeable en condition basale, mais augmente considérablement en réponse à des dangers ou des agressions tels que des LPS. Suite à un deuxième stimulus, par exemple l’activation des récepteurs P2X 7 par l’ATP extracellulaire, la cytokine est clivée en sa forme mature et elle est sécrétée en grande quantité. Les macrophages sont donc activés suite à une invasion bactérienne et sont à l’origine de phénomènes inflammatoires dans le but d’éliminer les pathogènes.

Ces travaux nous permettent de conclure que les récepteurs P2X 7 ne sont pas seulement des canaux cationiques, mais sont couplés à diverses voies de signalisations dans les macrophages et dans les glandes exocrines, comme montré par le modèle des glandes sous-maxillaires. Cependant, les voies couplées aux récepteurs P2X 7, ainsi que la régulation de ces récepteurs diffèrent en fonction du tissu ainsi que de l’espèce étudiés. Ces données ne sont pas négligeables lors de la mise au point de nouveaux médicaments ayant comme cible les récepteurs P2X 7.

Notre travail de recherche ouvre plusieurs pistes d’investigations sur les voies de signalisation activées par les récepteurs P2X 7. Afin d’obtenir plus d’informations quant aux domaines des récepteurs P2X 7 importants dans l’activation ces voies de signalisation, on pourrait envisager d’exprimer des formes tronquées de ces récepteurs dans des cellules en

178 Conclusion

culture. Il serait également intéressant d’étudier le rôle de la PLA 2 dans la production de ROS. En effet, Chetterjee et ses collègues (2011) ont récemment montré que la peroxyrédoxine-6, une enzyme bifonctionnelle avec une activité de glutathion peroxydase et de PLA 2, participe dans l’activation de la NADPH oxydase des neutrophiles. Un autre point intéressant serait d’étudier les voies intracellulaires couplées aux récepteurs TLR4 dans les glandes salivaires, afin de déterminer pourquoi la stimulation par les LPS n’entraîne pas d’activation de NF-κB. Des analyses par Western blot permettraient ainsi de mettre en évidence si toutes les protéines impliquées dans l’activation de ce facteur de transcription en réponse aux LPS sont exprimées dans les glandes salivaires.

Figure 7.1 : Modèle montrant le rôle des glandes salivaires dans l’immunologie orale, notamment par la production de ROS en réponse à l’activation des récepteurs P2X 7 et par la sécrétion constitutive d’IL-1βββ. L’ATP, libéré par les acini ou les cellules ductales en réponse à des stimulations mécaniques ou par des agonistes, active des récepteurs P2X 7. Ceci est suivi par l’activation de la NADPH oxydase et la production subséquente de ROS. En présence de thiocyanate (SCN -) et de la lactoperoxydase (LPO) il y a formation d’hypothiocyanite (OSCN -), à propriétés antimicrobiennes. La cytokine IL-1β est sécrétée de manière constitutive dans la lumière des glandes salivaires. La salive finale hypotonique contient ainsi divers composants contribuant à la protection et au maintien de l’intégrité de la muqueuse buccale.

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216

ANNEXES

I. Liste des publications

1. Pochet, S., Garcia-Marcos, M., Seil, M ., Otto, A., Marino, A., Dehaye, J.P. Contribution of two ionotropic purinergic receptors to ATP responses in submandibular gland ductal cells. Cell Signal 2007; 19: 2155-2164.

2. Seil, M., Fontanils, U., Gorrono Etxebarria, I., Pochet, S., Garcia-Marcos, M., Marino, A., Dehaye, J.P. Pharmacological evidence for the stimulation of NADPH oxidase by P2X 7 receptors in mouse submandibular glands. Purinergic Signal 2008; 4: 347-355.

3. Seil, M., Kabré, E., Nagant, C., Vandenbranden, M., Fontanils, U., Marino , A., Pochet, S., Dehaye, J.P. Regulation by CRAMP of the responses of murine peritoneal macrophages to extracellular ATP. Biochim Biophys Acta-Biomembranes 2010; 1798: 569-578.

4. Seil, M ., El Ouaaliti, M., Abdou Foumekoye, S., Pochet, S., Dehaye, J.P. Distinct regulation by lipopolysaccharides of the expression of interleukin-1β by murine macrophages and salivary glands. Innate Immunity 2010; doi:10.1177/1753425910377101.

5. Fontanils*, U., Seil*, M ., Pochet, S., El Ouaaliti, M., Garcia-Marcos, M., Dehaye, J.P., Marino, A. Stimulation by P2X 7 receptors of calcium-dependent production of reactive oxygen species (ROS) in rat submandibular glands. Biochim Biophys Acta-General subjects 2010; 1800: 1183-1191. * ont contribué de manière égale au travail

6. Seil, M., Nagant, C., Dehaye, J.P., Vandenbranden, M., Lensink, M.F. Spotlight on human LL-37, an antimicrobial peptide with promising cell-penetrating properties. Pharmaceuticals 2010; 3: 3435-3460.

7. Seil, M ., El Ouaaliti, M., Fontanils, U., Gorrono Etxebarria, I., Pochet, S., Dal Moro, G., Marino, A., Dehaye, J.P. Ivermectin-dependent release of IL-1β in response to ATP by peritoneal macrophages from P2X 7-KO mice. Purinergic Signal 2011; 6: 405-416.

8. Seil, M ., El Ouaaliti, M., Garcia-Marcos, M., Pochet, S., Marino, A., Dehaye, J.P. P2X purinergic receptors and exocrine glands. Glob J Biochem Accepté le 13 janvier 2011.

9. Seil*, M ., El Ouaaliti*, M., Dehaye, J.P. Secretion of interleukin-1β triggered by dynasore in murine peritoneal macrophages. Innate Immunity Accepté le 14 janvier 2011. * ont contribué de manière égale au travail.

217

II. Résultats du séquençage de l’ADNc du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88

1. TLR4 dans les macrophages, amorce sens (M TLR4 s)

2. TLR4 dans les macrophages, amorce antisens (M TLR4 as)

3. TLR4 dans les glandes sous-maxillaires, amorce sens (S TLR4 s)

4. TLR4 dans les glandes sous-maxillaires, amorce antisens (S TLR4 as)

5. CD14 dans les macrophages, amorce sens (M CD14 s)

6. CD14 dans les macrophages, amorce antisens (M CD14 as)

7. CD14 dans les glandes sous-maxillaires, amorce sens (S CD14 s)

8. CD14 dans les glandes sous-maxillaires, amorce antisens (S CD14 as)

9. MyD88 dans les macrophages, amorce sens (M MyD88 s)

10. MyD88 dans les macrophages, amorce antisens (M MyD88 as)

11. MyD88 dans les glandes sous-maxillaires, amorce sens (S MyD88 s)

12. MyD88 dans les glandes sous-maxillaires, amorce antisens (S MyD88 as)

218