Faculté de Pharmacie Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques Contribution à l'étude des réponses cellulaires secondaires à l'activation de récepteurs purinergiques ionotropes dans les glandes salivaires et les macrophages de souris Michèle SEIL Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques Promoteur : Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie pharmaceutique) Composition du jury : Pierre DUEZ (Président) Carine DE VRIESE (Secrétaire) Jean-Michel KAUFFMANN Hassan JIJAKLI Astrid VANDEN ABBEELE (Faculté de Médecine, Université libre de Bruxelles) Bernard ROBAYE (Faculté des Sciences, Université libre de Bruxelles) 2011 REMERCIEMENTS Je voudrais tout d’abord remercier mon promoteur, le Professeur Jean-Paul Dehaye pour m’avoir accueillie dans son laboratoire. Sa motivation, sa disponibilité, son expérience, ses connaissances scientifiques et ses nombreux conseils m’ont permis de mener à bien cette thèse. Je tiens à exprimer ma sincère gratitude au Professeur Stéphanie Pochet pour m’avoir formé aux différentes techniques de laboratoire, pour ses nombreux conseils, sa disponibilité et sa gentillesse. Je remercie le Dr. Michel Vandenbranden pour avoir réalisé les analyses infrarouge et pour ses conseils scientifiques. Je voudrais également exprimer mes remerciements au Professeur Nathalie Verbruggen pour m’avoir donnée accès au spectrophotomètre NanoDrop 2000c. Mes remerciements vont à tous les membres, anciens et actuels, du Département de Biopharmacie dont le Service de Chimie Biologique et Médicale et de Microbiologie Pharmaceutique. Je remercie en particulier Sara, Manuela et Robert pour leur aide lors des manipulations effectuées et pour les moments passés ensemble aux travaux pratiques de Biochimie et de Biologie moléculaire. Merci également aux autres doctorants du service, dont Malika et Carole, pour leur soutien et les bons moments partagés, ainsi qu’à Anar avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir à donner les travaux pratiques de Biochimie médicale. Un grand merci aux doctorants étrangers, aux étudiants Erasmus et aux stagiaires avec lesquels j’ai eu l’occasion de travailler lors de leur séjour dans notre laboratoire : Unai, Irantzu, Giulia, Asma, Vivien, Christian et Souleymane. Je remercie sincèrement mes parents, ma grand-mère et ma sœur, Diane, qui ont toujours été présents pour moi et qui m’ont soutenu au cours de ces années de doctorat. Merci également à la famille d’Olivier pour leurs marques de sympathie et leurs encouragements. Enfin, merci à Olivier, pour sa présence, sa patience et ses encouragements tout au long de ces années de doctorat. TABLE DES MATIERES RESUME LISTE DES ABREVIATIONS CHAPITRE I : INTRODUCTION I.1. LES RECEPTEURS PURINERGIQUES........................................................................ 1 I.1.1. Historique ................................................................................................................. 1 I.1.2. Les nucléotides et les nucléosides............................................................................. 3 I.1.2.1. Stockage et libération d’ATP dans l’espace extracellulaire............................... 3 I.1.2.2. Métabolisme de l’ATP dans l’espace extracellulaire......................................... 4 I.1.3. Les récepteurs purinergiques.................................................................................... 6 I.1.3.1. Les récepteurs P1 ............................................................................................... 6 I.1.3.2. Les récepteurs P2 ............................................................................................... 7 I.1.3.2.1. Les récepteurs P2Y ......................................................................................... 7 Structure ..................................................................................................................... 7 Pharmacologie............................................................................................................ 9 Sous-types des récepteurs P2Y .................................................................................. 9 I.1.3.2.2. Les récepteurs P2X ....................................................................................... 11 Structure ................................................................................................................... 12 Pharmacologie.......................................................................................................... 13 Sous-types des récepteurs P2X ................................................................................ 16 I.1.3.3. Les récepteurs P2X 7 ......................................................................................... 18 Structure ................................................................................................................... 18 Pharmacologie.......................................................................................................... 19 Réponses secondaires à l’activation du récepteur P2X 7........................................... 21 I.1.4. Le potentiel thérapeutique de la signalisation purinergique.................................. 23 I.2. LES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE (ROS) .............................................. 26 I.2.1. Les ROS et leurs effets ............................................................................................ 26 I.2.2. Les systèmes antioxydants....................................................................................... 28 I.2.3. Les sources des ROS ............................................................................................... 30 I.3. LA CYTOKINE INTERLEUKINE-1β (IL-1β) ........................................................... 34 I.3.1. L’IL-1β et ses effets................................................................................................. 34 I.3.2. La synthèse de la pro-IL-1β.................................................................................... 36 I.3.3. Le clivage de la pro-IL-1β et la libération d’IL-1β mature.................................... 39 I.4. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DE LA FAMILLE DES CATHELICIDINES. 42 I.4.1. Les peptides antimicrobiens.................................................................................... 42 I.4.2. Les cathélicidines.................................................................................................... 43 I.4.2.1. La régulation de l’expression des cathélicidines.............................................. 45 I.4.2.2. La structure des cathélicidines ......................................................................... 46 I.4.2.3. Les propriétés antimicrobiennes des cathélicidines......................................... 47 I.4.2.4. Les effets des cathélicidines sur les cellules eucaryotes.................................. 49 I.5. LES MACROPHAGES ................................................................................................. 50 I.5.1. Historique ............................................................................................................... 50 I.5.2. Origine et différenciation........................................................................................ 50 I.5.3. Morphologie............................................................................................................ 52 I.5.4. Rôles dans l’immunité............................................................................................. 52 I.5.5. Les récepteurs purinergiques dans les macrophages ............................................. 53 I.6. LES GLANDES SALIVAIRES ET LA SALIVE ......................................................... 54 I.6.1. Anatomie et histologie des glandes salivaires ........................................................ 54 I.6.2. Physiologie de la sécrétion salivaire ...................................................................... 56 I.6.3. Composition et rôles de la salive ............................................................................ 59 I.6.4. Les récepteurs purinergiques dans les glandes salivaires...................................... 62 I.7. OBJECTIFS DU TRAVAIL......................................................................................... 62 CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES II.1. MATERIEL .................................................................................................................. 65 II.1.1. Les animaux........................................................................................................... 65 II.1.2. Les réactifs et substances ...................................................................................... 66 II.2. METHODES................................................................................................................. 68 II.2.1. Préparation des milieux......................................................................................... 68 II.2.2. Prélèvement des macrophages péritonéaux .......................................................... 70 II.2.3. Préparation de la suspension brute de cellules à partir des glandes sous- maxillaires de souris ........................................................................................................ 71 II.2.4. Séparation des cellules ductales et acineuses ....................................................... 71 II.2.5. Prélèvement de la salive.......................................................................................