Banco Português de Germoplasma Animal e Tecnologias da Reprodução

AEM Horta

Investigador Coordenador

Unidade de Recursos Genéticos Reprodução e Melhoramento Animal

Instituto Nacional de Recursos Biológicos – IP, INIA Santarém Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas Introdução

 Portugal possui um património genético animal extremamente rico e diversificado

 Raças autóctones reconhecidas  Bovinos - 15  Ovinos - 15  Caprinos - 5  Suínos - 3  Equídeos - 4  Aves - 3

 Maioria das raças estão consideradas em risco de extinção BPGA - Objectivos

 Assegurar a preservação dos Recursos Genéticos Animais  Bovinos, ovinos, caprinos e suínos

 Garantir a conservação de raças em risco de extinção

 Promover a manutenção da variabilidade genética intra-racial, contrariando a erosão genética que se tem verificado

 Divulgar o património genético autóctone. BPGA - Organização

 Projecto AGRO 438  Recolha de sémen, embriões e DNA

 Parceiros do Projecto

 INRB – ex-EZN: Vale de Santarém

 Direcção Geral de Veterinária

 DRAP Norte  Merelim - Braga  FERA – S. Torcato

 DRAP Alentejo  Hde Abóbada  Universidade de Évora: Évora BPGA – Sémen bovino

Raça Nº machos Nº doses 40 43870 Algarvia 4 2005 18 23030 Barrosã 39 12077 12 4045 9 2767 3 1039 13 9973 - - 28 13288 20 43330 17 7818 Preta 18 8167 5 3500 Total 226 174 909 BPGA – Sémen ovino e caprino

Raça Nº machos Nº doses Ch Gal Mirand 10 1808 Saloia 2 363 S Estrela 14 1698 Mer B Baixa 7 564 Bord E D Minho 9 1144 Ch Campo 1 16 Mondegueira 1 18 Mer Preta 16 2133 Mer Branca 19 1351 Campaniça 1 33 Serpentina 16 691 Bravia 14 2223 Serrana 12 2076 Charnequeira 6 1226 Montesinho 3 554 Total 131 15 898 BPGA – Embriões

Raça Nº fêmeas Nº embriões Ch Gal Mirand 6 20 Churra Algarvia 7 41 Mer Preta 29 161 Serpentina 14 93 Bravia 2 10 Serrana 4 41 BPGA – DNA

• Amostras de DNA de todos os animais com sémen ou embriões representados no BPGA

• Avaliação da diversidade genética intra- e inter-racial BPGA – Balanço

 Grande maioria das raças portuguesas têm actualmente sémen armazenado

 Necessidade de assegurar:  Duplicações  Continuidade  Renovação Limitações à inseminação artificial (IA) em Ovinos

Anatomia e alterações bioquímicas do cérvix durante o estro

Congelação do sémen IA em Ovinos

. A IA global (vag+cerv) em ovinos apresenta taxas de fertilidade aceitáveis quando se utiliza sémen fresco ou refrigerado (30-60%). . A IA global (vag+cerv) com sémen congelado raramente atinge os 20% de fertilidade.

Tipo de Machos Total IA Fertilidade Mínimo Máximo Sémen (n) (n) (%) (%) (%) SR 16 420 48,51a 28,57 63,15 SC 5 696 13,04 b 6,66 20,13 Total 21 1116 P<0,001

Resultados obtidos na raça saloia pela nossa equipa no efectivo de Pegões - DRAP LVT IA em Ovinos

Problema:

O sémen congelado nesta espécie não consegue atingir taxas de fertilidade aceitáveis após IA por via transvaginal. IA em Ovinos

Dificuldades identificadas: . A estrutura anatómica do cérvix só permite a inseminação intracervical em 41-56% dos animais, dependendo da raça. . A deposição vaginal de sémen congelado na IA origina taxas de fertilidade muito baixas (0- 5%). IA em Ovinos

A proporção de IA intra-cervicais depende das raças e raramente ultrapassa 50% do total das IA.

70

60 58,6 55,6

50 44,4 41,4 % 40 Serra 30 Saloia

20

10

0 Vaginal Cervical IA em Ovinos

. Na cobrição natural o sémen é depositado na vagina mas o número de espermatozóides é cerca de 10 vezes superior ao que se utiliza na IA. . Como existe um número significativo de spz expulsos para o exterior após deposição vaginal, a fertilidade das IA vaginais fica seriamente comprometida: IA vaginal com sémen refrigerado: 30% (fert) IA vaginal com sémen congelado: 0% (fert) IA em Ovinos

Estratégias da investigação: A. Aumentar a proporção de IA cervicais através de tratamentos de amolecimento e dilatação cervical, que permitam a penetração do dispositivo de inseminação. B. Impedir a expulsão dos espermatozóides da vagina após a IA (ex.: aumento da adesividade dos spz à mucosa vaginal). IA em Ovinos

Tratamentos: I. O sulfato de terbutalina é um b2-agonista com propriedades miorelaxantes (da musculatura lisa da vagina e do cérvix) II. A prostaglandina E1 (PGE1) promove o amolecimento e dilatação cervical, além de modificações na composição das secreções cervicais durante o estro (+ ácido hialurónico, Leethongdee et al., 2007).

A membrana dos espermatozóides contêm uma proteína de ligação ao ácido hialurónico (HABP1) que promove a sua adesividade às mucosas genitais (Ranganathan et al., 1994). IA em Ovinos

 O tratamento PGE1+Terbutalina induz a abertura do cérvix durante o estro, que atinge o máximo cerca de 1 hora após a sua administração (Barbas et al., 2001).  Quando o tratamento PGE1+Terbutalina é administrado no momento da IA (sémen refrigerado), não existe aumento da taxa de fertilidade (assincronia das alterações estruturais do cérvix e suas secreções com a IA) (Barbas et al., 2003).  Quando o tratamento é administrado 6 horas antes da IA (sémen refrigerado) existe um aumento significativo da taxa de fertilidade global de 43% para 64% (Horta et al., 2010). IA em Ovinos

Sémen refrigerado (Horta et al, 2010 - RDA) Site of insemination Row Overall fertility Treatments Vagina Cervix P level (treatments) n Fert (%) n Fert (%) n Fert (%) Control 23 30.4 a1 19 57.9 a1 0.07 42 42.9 a Treated 28 60.7 b1 17 70.6 a1 0.37 45 64.4 b Column P level - 0.03 - 0.33 - - 0.035 Overall fertility 51 47.1 1 36 63.9 1 0.09 87 - (site of insemination) Sémen congelado (resultados preliminares, 2010) Site of insemination Row Overall fertility Treatments Vagina Cervix P level (treatments) n Fert (%) n Fert (%) n Fert (%) Control 15 0 1 18 33.3 2 0.02 33 18.2 Treated 17 5.8 1 22 45.5 2 0.01 39 28.2 Column P level - 0.53 - 0.33 - - 0.24 Overall fertility 32 3.1 1 40 40,0 2 0.0002 72 23.61 (site of insemination) Model of hyaluronan binding by HABP1. Yadav G et al. J. Biol. Chem. 2009;284:3897-3905

©2009 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology Hipótese

Sémen fresco / refrigerado Misoprostol  ácido hialurónico vaginal + HABP1 (nos spz)

+ adesividade espermática ao epitélio vaginal + reserva de espermatozóides + fertilidade das IA vaginais

Sémen congelado Misoprostol  ácido hialurónico vaginal – HABP1 (nos spz)

- adesividade dos spz ao epitélio vaginal - reserva de spz - fertilidade das IA vaginais ligeiro aumento da fertilidade das IA cervicais Hipótese vs. resultados

Testemunha Fertilidade / tipo de sémen 70 57,9 60

50

40 33,3 30,4 HABP1 30 20

10 HABP1 0 0 Ac. Hialurónico Fresco Congelado

Tratado 80 Epitélio vaginal 70,6 70 60,7 60

Congelação diminui a HABP1 no spz ? 50 45,5 40 30 Ac. Hialurónico 20 10 5,8 0 Epitélio vaginal Fresco Congelado

Vaginal Cervical Estratégia de investigação

1. Investigar se existem alterações no conteúdo e função da HABP1 nos spz provocadas pelos métodos de congelação actuais 2. Caso se confirmem aquelas alterações, investigar procedimentos de congelação ou descongelação seminal que as minimizem. 3. Continuar a investigar métodos que promovam o aumento da proporção de inseminações intracervicais.