Banco Português de Germoplasma Animal e Tecnologias da Reprodução AEM Horta Investigador Coordenador Unidade de Recursos Genéticos Reprodução e Melhoramento Animal Instituto Nacional de Recursos Biológicos – IP, INIA Santarém Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas Introdução Portugal possui um património genético animal extremamente rico e diversificado Raças autóctones reconhecidas Bovinos - 15 Ovinos - 15 Caprinos - 5 Suínos - 3 Equídeos - 4 Aves - 3 Maioria das raças estão consideradas em risco de extinção BPGA - Objectivos Assegurar a preservação dos Recursos Genéticos Animais Bovinos, ovinos, caprinos e suínos Garantir a conservação de raças em risco de extinção Promover a manutenção da variabilidade genética intra-racial, contrariando a erosão genética que se tem verificado Divulgar o património genético autóctone. BPGA - Organização Projecto AGRO 438 Recolha de sémen, embriões e DNA Parceiros do Projecto INRB – ex-EZN: Vale de Santarém Direcção Geral de Veterinária DRAP Norte Merelim - Braga FERA – S. Torcato DRAP Alentejo Hde Abóbada Universidade de Évora: Évora BPGA – Sémen bovino Raça Nº machos Nº doses Alentejana 40 43870 Algarvia 4 2005 Arouquesa 18 23030 Barrosã 39 12077 Cachena 12 4045 Garvonesa 9 2767 Jarmelista 3 1039 Maronesa 13 9973 Marinhoa - - Mertolenga 28 13288 Minhota 20 43330 Mirandesa 17 7818 Preta 18 8167 Ramo Grande 5 3500 Total 226 174 909 BPGA – Sémen ovino e caprino Raça Nº machos Nº doses Ch Gal Mirand 10 1808 Saloia 2 363 S Estrela 14 1698 Mer B Baixa 7 564 Bord E D Minho 9 1144 Ch Campo 1 16 Mondegueira 1 18 Mer Preta 16 2133 Mer Branca 19 1351 Campaniça 1 33 Serpentina 16 691 Bravia 14 2223 Serrana 12 2076 Charnequeira 6 1226 Montesinho 3 554 Total 131 15 898 BPGA – Embriões Raça Nº fêmeas Nº embriões Ch Gal Mirand 6 20 Churra Algarvia 7 41 Mer Preta 29 161 Serpentina 14 93 Bravia 2 10 Serrana 4 41 BPGA – DNA • Amostras de DNA de todos os animais com sémen ou embriões representados no BPGA • Avaliação da diversidade genética intra- e inter-racial BPGA – Balanço Grande maioria das raças portuguesas têm actualmente sémen armazenado Necessidade de assegurar: Duplicações Continuidade Renovação Limitações à inseminação artificial (IA) em Ovinos Anatomia e alterações bioquímicas do cérvix durante o estro Congelação do sémen IA em Ovinos . A IA global (vag+cerv) em ovinos apresenta taxas de fertilidade aceitáveis quando se utiliza sémen fresco ou refrigerado (30-60%). A IA global (vag+cerv) com sémen congelado raramente atinge os 20% de fertilidade. Tipo de Machos Total IA Fertilidade Mínimo Máximo Sémen (n) (n) (%) (%) (%) SR 16 420 48,51a 28,57 63,15 SC 5 696 13,04 b 6,66 20,13 Total 21 1116 P<0,001 Resultados obtidos na raça saloia pela nossa equipa no efectivo de Pegões - DRAP LVT IA em Ovinos Problema: O sémen congelado nesta espécie não consegue atingir taxas de fertilidade aceitáveis após IA por via transvaginal. IA em Ovinos Dificuldades identificadas: . A estrutura anatómica do cérvix só permite a inseminação intracervical em 41-56% dos animais, dependendo da raça. A deposição vaginal de sémen congelado na IA origina taxas de fertilidade muito baixas (0- 5%). IA em Ovinos A proporção de IA intra-cervicais depende das raças e raramente ultrapassa 50% do total das IA. 70 60 58,6 55,6 50 44,4 41,4 % 40 Serra 30 Saloia 20 10 0 Vaginal Cervical IA em Ovinos . Na cobrição natural o sémen é depositado na vagina mas o número de espermatozóides é cerca de 10 vezes superior ao que se utiliza na IA. Como existe um número significativo de spz expulsos para o exterior após deposição vaginal, a fertilidade das IA vaginais fica seriamente comprometida: IA vaginal com sémen refrigerado: 30% (fert) IA vaginal com sémen congelado: 0% (fert) IA em Ovinos Estratégias da investigação: A. Aumentar a proporção de IA cervicais através de tratamentos de amolecimento e dilatação cervical, que permitam a penetração do dispositivo de inseminação. B. Impedir a expulsão dos espermatozóides da vagina após a IA (ex.: aumento da adesividade dos spz à mucosa vaginal). IA em Ovinos Tratamentos: I. O sulfato de terbutalina é um b2-agonista com propriedades miorelaxantes (da musculatura lisa da vagina e do cérvix) II. A prostaglandina E1 (PGE1) promove o amolecimento e dilatação cervical, além de modificações na composição das secreções cervicais durante o estro (+ ácido hialurónico, Leethongdee et al., 2007). A membrana dos espermatozóides contêm uma proteína de ligação ao ácido hialurónico (HABP1) que promove a sua adesividade às mucosas genitais (Ranganathan et al., 1994). IA em Ovinos O tratamento PGE1+Terbutalina induz a abertura do cérvix durante o estro, que atinge o máximo cerca de 1 hora após a sua administração (Barbas et al., 2001). Quando o tratamento PGE1+Terbutalina é administrado no momento da IA (sémen refrigerado), não existe aumento da taxa de fertilidade (assincronia das alterações estruturais do cérvix e suas secreções com a IA) (Barbas et al., 2003). Quando o tratamento é administrado 6 horas antes da IA (sémen refrigerado) existe um aumento significativo da taxa de fertilidade global de 43% para 64% (Horta et al., 2010). IA em Ovinos Sémen refrigerado (Horta et al, 2010 - RDA) Site of insemination Row Overall fertility Treatments Vagina Cervix P level (treatments) n Fert (%) n Fert (%) n Fert (%) Control 23 30.4 a1 19 57.9 a1 0.07 42 42.9 a Treated 28 60.7 b1 17 70.6 a1 0.37 45 64.4 b Column P level - 0.03 - 0.33 - - 0.035 Overall fertility 51 47.1 1 36 63.9 1 0.09 87 - (site of insemination) Sémen congelado (resultados preliminares, 2010) Site of insemination Row Overall fertility Treatments Vagina Cervix P level (treatments) n Fert (%) n Fert (%) n Fert (%) Control 15 0 1 18 33.3 2 0.02 33 18.2 Treated 17 5.8 1 22 45.5 2 0.01 39 28.2 Column P level - 0.53 - 0.33 - - 0.24 Overall fertility 32 3.1 1 40 40,0 2 0.0002 72 23.61 (site of insemination) Model of hyaluronan binding by HABP1. Yadav G et al. J. Biol. Chem. 2009;284:3897-3905 ©2009 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology Hipótese Sémen fresco / refrigerado Misoprostol ácido hialurónico vaginal + HABP1 (nos spz) + adesividade espermática ao epitélio vaginal + reserva de espermatozóides + fertilidade das IA vaginais Sémen congelado Misoprostol ácido hialurónico vaginal – HABP1 (nos spz) - adesividade dos spz ao epitélio vaginal - reserva de spz - fertilidade das IA vaginais ligeiro aumento da fertilidade das IA cervicais Hipótese vs. resultados Testemunha Fertilidade / tipo de sémen 70 57,9 60 50 40 33,3 30,4 HABP1 30 20 10 HABP1 0 0 Ac. Hialurónico Fresco Congelado Tratado 80 Epitélio vaginal 70,6 70 60,7 60 Congelação diminui a HABP1 no spz ? 50 45,5 40 30 Ac. Hialurónico 20 10 5,8 0 Epitélio vaginal Fresco Congelado Vaginal Cervical Estratégia de investigação 1. Investigar se existem alterações no conteúdo e função da HABP1 nos spz provocadas pelos métodos de congelação actuais 2. Caso se confirmem aquelas alterações, investigar procedimentos de congelação ou descongelação seminal que as minimizem. 3. Continuar a investigar métodos que promovam o aumento da proporção de inseminações intracervicais. .