Universidade Federal do Amapá Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical Mestrado e Doutorado UNIFAP / EMBRAPA-AP / IEPA / CI-Brasil

COCCÍDIOS (PROTOZOA: ) EM PEIXES DA PLANÍCIE DE INUNDAÇÃO DO RIO CURIAÚ, ESTADO DO AMAPÁ: PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

MACAPÁ, AP 2018 MÁRCIO CHARLES DA SILVA NEGRÃO

COCCÍDIOS (PROTOZOA: APICOMPLEXA) EM PEIXES DA PLANÍCIE DE INUNDAÇÃO DO RIO CURIAÚ, ESTADO DO AMAPÁ: PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical (PPGBIO) da Universidade Federal do Amapá, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Biodiversidade Tropical. Orientador: Dr. Lúcio André Viana Dias

MACAPÁ, AP 2018 MÁRCIO CHARLES DA SILVA NEGRÃO

COCCÍDIOS (PROTOZOA: APICOMPLEXA) EM PEIXES DA PLANÍCIE DE INUNDAÇÃO DO RIO CURIAÚ, ESTADO DO AMAPÁ: PREVALÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

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Dr. Lúcio André Viana Dias

Universidade Federal do Amapá (UNIFAP)

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Dr. Marcos Tavares Dias

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)

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Dra. Marcela Nunes Videira

Universidade Estadual do Amapá (UEAP)

Aprovada em 11 de abril de 2018, Macapá, AP, Brasil. À Deus pela vida; Aos meus pais; Aos meus irmãos; Aos meus tios e primos; A todos os meus amigos. AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pela vida e oportunidades.

Aos meus pais Benedito Vilhena Negrão e Maria Esmeralda da Silva Negrão, pelo amor dedicado, pela educação transmitida e exemplos de caráter, personalidade e luta;

Ao meu irmão Emerson, in memorian, que me enchia de elogios ao se referir a minha capacidade de desenvolvimento intelectual e postura profissional. Hoje me enche de saudade;

Às minhas irmãs Eliane, Elem e Lana, grandes incentivadoras que renovam as minhas forças para continuar sempre em frente;

Aos meus tios, tias, primos, primas, por me amarem de forma incondicional, por confiarem em minhas escolhas, apoiando e incentivando sempre;

Ao meu orientador Dr. Lúcio André Viana Dias, pelos ensinamentos, por sua dedicação ao trabalho sem descuidar de sua família, por acreditar que eu conseguiria, pelo exemplo de competência e ousadia que inspiraram a elaboração desta dissertação, pela amizade, cuidado e, sobretudo, pela paciência em todos os momentos;

A todos os professores e colaboradores do Programa de Mestrado em Biodiversidade Tropical da Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), pelo empenho e dedicação ao desenvolvimento da pesquisa científica na Amazônia;

À Universidade Estadual do Amapá (UEAP), pela estrutura do Laboratório de Morfofisiologia e Sanidade (LABMORSA) para a realização do trabalho;

À Dra. Marcela Nunes Videira, Chefe do Laboratório de Morfofisiologia e Sanidade Animal da UEAP, que permitiu a realização das coletas e análises em seu laboratório, disponibilizando seu espaço, material, arcabouço teórico e know-how.

Aos colegas do grupo de pesquisa de Sanidade de Organismos Aquáticos na Amazõnia (SOOA) Abthyllane, Josafá, Priscila e Roger, pela ajuda e pelo companheirismo nas coletas e análises;

À Dra. Cecile de Souza Gama, do Laboratório de Ictiologia do Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Estado do Amapá (IEPA), pelo auxílio na identificação taxonômica das espécies de peixes. Aos colegas da turma de Mestrado, pela força e companheirismo nos momentos difíceis do curso. RESUMO

Negrão, Márcio Charles da Silva . Coccídios (Protozoa: Apicomplexa) em peixes da planície de inundação do Rio Curiaú, Estado do Amapá: Prevalência e Caracterização Molecular. Macapá, 2018. Dissertação (Mestre em Biodiversidade Tropical) – Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Tropical – Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação - Universidade Federal do Amapá.

Os peixes são vulneráveis aos coccídios, sendo registrados diferentes estágios desses parasitos em todas as classes de vertebrados. O objetivo deste estudo foi investigar coccídios do gênero Calyptospora em espécies de peixes da planície de inundação do Rio Curiaú, estado do Amapá, Brasil. Foram coletados 130 peixes, das espécies Astyanax bimaculatus, lippincottianu, Hoplias malabaricus, Hoplerythrinus unitaeniatus; Astronotus ocellatus, Cichla ocellaris, Crenicichla lepidota, Geophagus proximus, efasciatus, festivus, Pterophyllum scalare e jurupari. Os peixes foram eutanasiados, pesados (g), medidos (cm), e dissecados para coleta de fragmentos de fígado, coração e vesícula e examinados pelo método de exame a fresco entre lâmina e lamínula, em microscópio de luz (ML), para verificar a presença de oocistos de Calyptospora spp. Os

fragmentos de fígado de G. proximus e H. malabaricus foram armazenados em álcool etílico 80%. Posteriormente, o DNA total de cada amostra foi extraído e submetido a reação em cadeia da polimerase, mediante o uso de primers designados para detecção de um seguimento do gene SSU rDNA de Calyptospora spp. Os produtos das amplificações foram sequenciados e as seqüências obtidas foram comparadas com outras disponíveis no Genbank quanto à similaridade. Foi registrado a presença de oocistos de Calyptospora em 55% dos 130 animais examinados, ou seja, 10 das 12 espécies estudadas. Não foram observadas infecções em A. bimaculatus e M. lippincottianus, peixes de hábito herbívoro. As taxas de infecção variaram entre os órgãos parasitados, onde em todos os hospedeiros positivos foram encontrados oocistos no fígado, seguido por 30% na vesícula biliar e 9% no coração. As sequencias obtidas na biologia molecular apresentaram 99% de similaridade com Calyptospora serralsami descrita de piranha Serrasalmus rhombeus no . No presente estudo foi registrado pela primeira vez a ocorrência de Calyptospora sp. em A. Ocellatus, G. proximus, H. efasciatus, H. unitaeniatus, H. malabaricus, M. festivus P. Scalare e S. jurupari. Foi determinado a ocorrência de C. serrasalmi na planície e em dois novos hospedeiros. Por último, novos primers foram criados neste estudo e testados com sucesso para diagnóstico de Calyptospora. Palavras-chaves: Parasito; Calyptospora; Ictiofauna; Ocorrência; Amazônia.

ABSTRACT

Negrão, Márcio Charles da Silva . Coccidia (Protozoa: Apicomplexa) in from the floodplain of the Curiaú River, State of Amapá: Prevalence and Molecular Characterization. Macapá, 2018. Dissertação (Mestre em Biodiversidade Tropical) – Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Tropical – Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós- Graduação - Universidade Federal do Amapá.

Fish are vulnerable to coccidia, with different stages of these parasites being recorded in all vertebrate classes. The objective of this study was to investigate coccidia of the Calyptospora in fish from the Curiaú River floodplain, Amapá state, Brazil. A total of 130 fish belonging to species Astyanax bimaculatus, Metynnis lippincottianu, Hoplias malabaricus, Hoplerythrinus unitaeniatus; Astronotus ocellatus, Cichla ocellaris, Crenicichla lepidota, Geophagus proximus, Heros efasciatus, Mesonauta festivus, Pterophyllum scalare e Satanoperca jurupari. The fish were euthanized, weighed (g), measured (cm), and dissected for collection of fragments of liver, heart and vesicle and examined by fresh method between lamina and laminula under light microscopy (ML) to verify the presence of oocysts of Calyptospora spp. The liver fragments of G. proximus and H. malabaricus were stored in ethyl alcohol 80%. Subsequently, total DNA from each sample was extracted and subjected to polymerase chain reaction using primers designated to detect a follow-up of the SSU rDNA gene from Calyptospora spp. The products of the amplifications were sequenced and the sequences obtained were compared with others available from Genbank for similarity The presence of Calyptospora oocysts was recorded in 55% of the 130 examined, that is, 10 of the 12 species studied. No infections were observed in A. bimaculatus and M. lippincottianus, herbivorous habit fish. Infection rates varied among the parasitized organs, where in all positive hosts oocysts were found in the liver, followed by 30% in the gallbladder and 9% in the heart. The sequences obtained in molercular biology presented 99% similarity with Calyptospora serralsami described of piranha Serrasalmus rhombeus in Brazil. In the present study, the occurrence of Calyptospora sp. in A. Ocellatus, G. proximus, H. efasciatus, H. unitaeniatus, H. malabaricus, M. festivus P. Scalare and S. jurupari. The occurrence of C. serrasalmi in the plain and two new hosts was determined. Finally, new primers were created in this study and tested successfully for Calyptospora diagnosis.

Key words: Parasite; Calyptospora; Icthyofauna; Occurrance; Amazon. SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL...... 10 1.1. Distribuição taxonômica de espécies de peixes dulcícolas no Brasil...... 11 1.2. Caracterização da ictiofauna da Amazônia brasileira...... 12 1.3. A bacia e a ictiofauna do Rio Curiaú...... 13 1.3.1. Aspectos biológicos de Astyanax bimaculatus (Linnaeus, 1758)...... 16 1.3.2. Aspectos biológicos de Astronotus ocellatus (Agassiz 1831)...... 17 1.3.3. Aspectos biológicos de Cichla ocelaris (Cuvier 1819)...... 19 1.3.4. Aspectos biológicos de Crenicichla lepidota (Heckel 1840)...... 20 1.3.5. Aspectos biológicos de Geophagus proximus (Castelnau, 1855)...... 21 1.3.6. Aspectos biológicos de Heros efasciatus (Heckel, 1840)...... 23 1.3.7. Aspectos biológicos de Hoplerythrinus unitaeniatus (Agassiz, 1829)...... 24 1.3.8. Aspectos biológicos de Hoplias malabaricus (Bloch 1794)...... 26 1.3.9. Aspectos biológicos de Mesonauta festivus (Heckel, 1840)...... 27 1.3.10. Aspectos biológicos de Metynnis lippincottianus (Cope 1870)...... 29 1.3.11. Aspectos biológicos de Pterophyllum scalare (Lichtenstein 1823)...... 30 1.3.12. Aspectos biológicos de Satanoperca jurupari (Heckel 1840)...... 31 1.4. Ictioparasitologia...... 32 1.5. Parasitos do Filo Apicomplexa...... 33 1.5.1. Ciclo de vida dos Apicomplexa...... 35 1.6. Gêneros de coccídios em peixes...... 38 1.6.1 Ocorrência de coccídios em peixes dulcícolas no Brasil...... 39 2. PROBLEMAS...... 41 3. HIPÓTESES...... 41 4. OBJETIVOS...... 41 4.1. Objetivo Geral...... 41 4.2. Objetivos Específicos...... 41 4. REFERÊNCIAS...... 42 5. ARTIGO CIENTÍFICO...... 53 6. CONCLUSÕES...... 70 7. ANEXO...... 71 10

1. INTRODUÇÃO GERAL

O Brasil é um país mundialmente reconhecido por apresentar alta biodiversidade. A riqueza e a diversidade de peixes em águas brasileiras são tão grandes que a literatura considera a hipótese de haver um número superior de espécies que ainda não foram catalogadas em relação ao número de espécies já descritas (Buckup et al. 2007). A bacia amazônica é a mais extensa bacia hidrográfica do planeta (MMA 2006). Em algumas regiões banhadas pelo rio Amazonas, ocorre o encontro com o oceano Atlântico onde localiza-se o estuário amazônico, formado pelas áreas de várzeas e toda região que sofre influência das marés atlânticas, apresentando enchentes e vazantes em seu ciclo diário (Queiroz e Amaral 2007), o qual empurram de volta as águas do Rio Amazonas que inundam as superfícies, transportando um alto teor de sedimentos (Junk et al. 2008). Esses sedimentos são depositados, na preamar e na baixamar, nas planícies inundáveis tornando-as bastante fértil, onde se destacam três unidades de paisagem: as florestas de várzea, florestas de mangue e os campos inundáveis (Ferreira 1997, Junk 2008). No estado do Amapá, a planície de inundação do Rio Curiaú, fazem parte desse tipo de ecossistema, apresentando lagos temporários e lagos permanentes (Sá-Oliveira e Chellapa 2002), ambientes estes, propício ao desenvolvimento de espécies de peixes que impulsionam a aquicultura, a indústria e o comércio do estado. Portanto, é importante avaliar a sanidade desses organismos e estudar sua fauna parasitária, que podem estar relacionadas com a sua história de vida e dieta (Tavares-Dias et al. 2014, Baia et al. 2018). Os peixes, como todos os vertebrados, são organismos vulneráveis a diversos parasitos, onde a maioria das espécies serve como hospedeiro de uma ou mais espécies de parasitos (Hoshino 2013). Os coccídios são protozoários que se alojam em tecidos de seus hospedeiros, intermediários ou definitivos, onde encontram aspectos favoráveis ao desenvolvimento de seu ciclo de vida (Molnár 2006). A atividade parasitária de coccídios em peixes é potencialmente patogênica (Azavedo et al. 2003, 2005), o que sugere considerar que as lesões nos órgãos dos hospedeiros podem prejudicar seu desenvolvimento tornando-os suscetíveis à predação. Portanto, a crescente identificação de espécies diferentes de coccídios em peixes no Brasil desperta o interesse de verificar sua ocorrência em espécies da fauna ictiológica de água doce na Amazônia, onde ocorre grande número de espécies representantes das principais famílias de peixes dulcícolas da região Neotropical. 11

O objetivo do presente trabalho, foi identificar coccídios do gênero Calyptospora, descrever sua ocorrência e realizar identificação taxonômica do parasito por biologia molecular em espécies de peixes representantes da ictiofauna dulcícola da Área de Proteção Ambiental do Rio Curiaú, estado do Amapá, Brasil.

1.1. Distribuição taxonômica de espécies de peixes dulcícolas no Brasil Estima-se que no Brasil existem 2.587 espécies de peixes exclusivamente de água doce e 1.297 de água salgada, incluindo 2481 espécies formalmente descritas e 106 em fase de descrição no final do ano de 2006 (Buckup et al. 2007). Este quantitativo de espécies dulcícolas equivale a cerca de 55% do total de espécies registradas em toda a região Neotropical (Reis et al. 2003). A distribuição taxonômica das espécies de peixes dulcícolas do Brasil apresenta três classes de vertebrados, classificados em nove ordens, 39 famílias e 517 gêneros válidos. Seu maior grupo, o Ostariophysi, é composto por 2.099 espécies distribuídas em três ordens: Siluriformes com 1.056 espécies, com 948 espécies e Gymnotiformes com 95 espécies (Reis et al. 2003, Buckup et al. 2007). Entre as famílias mais numerosas de espécies depeixes dulcícolas brasileiras destacam- se as famílias: Characidae, Loricariidae, Cichlidae e Rivulidae (Tabela 1).

Tabela 1 - Distribuição taxonômica das espécies de peixes dulcícolas ocorrentes no Brasil (Buckup et al. 2007).

Número de Número de Grupo Grupo espécies espécies

Classe Chondrichthyes 16 Ordem Siluriformes 1056 Ordem Rajiformes 16 Família Cetopsidae 16 Família Potamotrygonidae 16 Família Aspredinidae 14 Classe Sarcopterygii 1 Família Trichomycteridae 144 Ordem 1 Família Callichthyidae 123 Lepidosireniformes Família Lepidosirenidae 1 Família Scoloplacidae 4 Classe 2570 Família Loricariidae 418 Ordem Osteoglossiformes 3 Família Pseudopimelodidae 18 Família Osteoglossidae 3 Família Heptapteridae 100 Ordem Characiformes 948 Família Pimelodidae 83 Família Parodontidae 19 Família Doradidae 62 Família Curimatidae 75 Família Auchenipteridae 74 Família Prochilodontidae 12 Ordem Gymnotiformes 95 12

Família Anostomidae 92 Família Gymnotidae 23 Família Chilodontidae 5 Família Sternopygidae 21

Tabela 1. Continuação... Número de Número de Grupo Grupo espécies espécies Família Crenuchidae 52 Família Rhamphichthyidae 9 Família Hemiodontidae 25 Família Hypopomidae 12 Família Gasteropelecidae 5 Família Apteronotidae 30 Ordem Família Characidae* 597 139 Cyprinodontiformes Família Acestrorhynchidae 14 Família Rivulidae 174 Família Cynodontidae 10 Família Poeciliidae 54 Família Erythrinidae* 8 Família Anablepidae 11 Família 29 Ordem Synbranchiformes 7 Família Ctenoluciidae 5 Família Synbranchidae 7 Ordem 222 Família Polycentridae 2 Família Cichlidae* 220 (*) Famílias onde as espécies de peixes selecionadas como material para este estudo estão inseridas.

1.2. Caracterização da ictiofauna da Amazônia brasileira

A ictiofauna da Amazônia brasileira é caracterizada pela dominância de peixes das ordens Characiformes (43%), Siluriformes (36%) e Cichliformes (12%), com larga distribuição e grande capacidade adaptativa em ambientes diversos (Lowe-McConnell 1999). Existem cerca de 1.300 espécies de peixes da ordem Characiformes com ocorrência no Brasil, especialmente em regiões tropicais. Algumas dessas espécies como pacus, traíras e curimatãs possuem alto valor econômico, pois despontam como importante fonte alimentar para diversas populações ribeirinhas na amazõnia (Buckup et al. 2007). Os indivíduos da ordem Siluriformes são popularmente conhecidos como peixes-gatos ou bagres. São peixes de couro, sem escamas, com características morfológicas bem distintas como nadadeiras raiadas, estrutura do crânio e da bexiga natatória. Costumam apresentar barbilhões sensitivos presentes na mandíbula e maxila, mas não acontece par todos os elementos da ordem (Nelson 2016). Apresentam hábitos geralmente associados às porções mais próximas do substrato e são considerados grandes migradores reprodutivos com alta importância comercial (Buckup et al. 2007, Nelson 2016) A ordem Cichliformes é a maior ordem de peixes existente. Muitas famílias são incluídas em subordens que não são definíveis em termos de caracteres derivados, podendo 13

não ser monofilética. Inclui a maioria dos peixes de maior capacidade adaptativa (Nelson 2016). Entre elas destaca-se a família Cichlidae, composta por espécies que possuem corpo comprimido lateralmente, com grande variabilidade de formas (Buckup et al. 2007). Os Cichlifomes podem chegar a ter 100 escamas na linha lateral, apresentam nadadeira dorsal com 7 a 25 raios ósseos e 5 a 30 raios cartilaginosos, nadadeira anal com 3 a 15 raios ósseos, atividade reprodutiva altamente organizada, onde a maioria das espécies constrói ninhos. São altamente adaptáveis a ambientes diferentes (Nelson 2016). Os estudos de ictiologia mostam alta diversidade de peixes encontrada no Brasil, resultado de um rico sistema fluvial, principalmente na Amazônia. Neste estudo foram examinadas as espécies de peixes dulcícolas Astyanax bimaculatus e Metynnis lippincottianus (Characiformes: Characidae); Hoplias malabaricus e Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes: Erithrynidae); Astronotus ocellatus, Cichla ocellaris, Crenicichla lepidota, Geophagus proximus, Heros efasciatus, Mesonauta festivus, Pterophyllum scalare e Satanoperca jurupari (Cichliformes: Cichlidae). Representantes característicos da ictiofauna do Rio Curiaú.

1.2.3. A bacia e a ictiofauna do Rio Curiaú

As planícies de inundação localizadas na Área de Proteção Ambiental do Rio Curiaú, representam um ambiente importante para o desenvolvimento de peixes funcionando como abrigo e fonte de alimento para indivíduos jovens de espécies importantes na pesca ou para a aquariofilia (Gama e Habolth 2004). Nestes ambientes, a superfície coberta por plantas aquáticas como macrófitas e algas que fornecem alimento e abrigo aos peixes formam um ambiente propício para o desenvolvimento de peixes jovens. A penetração da luz do sol na superfície da água permite o desenvolvimento dessas plantas. Em locais onde a luz é interrompida pela floresta, os peixes são altamente dependentes de alimentos alóctones tais como restos vegetais e insetos aéreos (Lowe-McConnell, 1999). As espécies de peixes que ocorrem em áreas periodicamente alagadas como as da bacia do Rio Curiaú se relacionam com outras assembléias gerando uma complexa relação trófica, formando variadas teias alimentares que incluem grande variedade vegetal e outros animais de diferentes classes (Gama e Habolth 2004). A biomassa de peixes aumenta rapidamente durante o período de chuvoso, pois à rápida decomposição de gramíneas e de restos de animais enriquecem em nutrientes as águas que se 14

espalham pela planície e favorecem o crescimento excessivo de microorganismos, insetos, crustáceos e moluscos usados como alimento pelos peixes (Lowe-McConnell 1999). As condições favoráveis destes ambientes colaboram para que a maioria das espécies de peixes reproduza-se no início das estações das cheias. Assim, os peixes jovens nascem em épocas de grande disponibilidade de alimento e quando o rápido crescimento dos vegetais oferece abrigo contra os predadores. Este é o principal período de alimentação, crescimento e acúmulo de reserva de gorduras, a custa das quais o peixe irá resistir ao período de seca, quando come pouco (Lowe-McConnell 1999). À proporção que as águas das planícies de inundação baixam, ocorrem frequentes perdas de peixes, seja por sua retenção em poças que secam gradativamente e os expõem a predação por aves ou por peixes maiores, ou por sua saída pelos canais em direção aos rios. Aqueles que permanecem nas poças, fatalmente sofrem dessecação ou falta de oxigênio e morrem. (Lowe-McConnell 1999). Quando ocorre diminuição de chuvas e a consequente baixa das águas, algumas espécies cavam galerias na lama e conseguem respirar ar atmosférico (Pough et al. 1999). Alguns peixes Neotropicais adaptam-se tanto a viverem em corredeiras no período de águas altas como a resistirem a condições de poças estagnadas na estação de seca, dificultando estabelecer distinções entre espécies fluviais e lacustres, já que muitos deles têm uma existência lótica se retraindo para o canal do rio nos períodos de águas baixas, e uma lêntica ocupando as áreas inundadas nos períodos de cheias (Lowe-McConnell 1999). Diversas espécies de peixes do Curiaú são a principal fonte de proteína da comunidade ribeirinha. Em estudos de Gama e Habolth (2004), em áreas de ressaca da bacia do Rio Curiaú foram encontrados 41 morfotipos distintos de peixes, distribuídos em seis ordens e 15 famílias, entre os mais de 800 indivíduos capturados (Tabela 2). Grande parte dessas espécies encontradas se distribui homogeneamente nas bacias do rio Curiaú, como a Symbranchus marmoratus com baixa abundância. No entanto, Hyphessobrycon sp2 e Nannostomus beckfordi são espécies bastante abundantes, tornando baixos os valores de diversidade e equitabilidade embora sejam altos os valores para a riqueza descritos por Gama e Habolth (2004).

Tabela 2. Morfotipos identificados na bacia do Rio Curiaú (Gama e Habolth, 2004).

Morfotipos Número de indivíduos capturados

Symbranchus marmoratus 0-50 Serrasalmus denticulatus 15

Parauchenipterus sp. Loricaria sp. Eleotridae, Curimata incopta Tabela 2. Continuação… Morfotipos Número de indivíduos capturados

Crenicichla sp2 Acestrorhynchus sp. (jovem) Acestrorhynchus cf. nasutus Serrasalmus rhombeus Crenicichla sp1 Boulenguerella maculata Triportheus cf. trifurcatus Hypopomus sp. Cicla sp. Bryconops sp. Tetragonopterinae (jovem) Rivulus sp1 Nannostomus unifasciatus Hyphessobrycon sp1 Hoplias malabaricus Aequidens sp2 Mesonautta acora Bryconops melanurus Acaronia sp. Pyrrhulina rachoviana Heros sp. Acestrorhynchus altus Rivulus sp2 50-100 Não identificado Acestrorhynchus falcirostris Geophagus sp. Rivulidae sp. Brachyhypopomus brevirostris Eigenmannia cf. virescens 16

Astyanax abramis Microcharacidium sp. Aequidens sp1 Tabela 2. Continuação… Morfotipos Número de indivíduos capturados

100-200 Metynnis argenteus 200-300 Nannostomus beckfordi 300-850 Hyphessobrycon sp2

1.3.1. Aspectos biológicos de Astyanax bimaculatus (Linnaeus, 1758)

Figura 1 – Espécime de Astyanax bimaculatus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Characiformes e família Characidae, o Astyanax bimaculatus (Figura 1) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como lambari ou matupiri. Esta espécie apresenta ampla gama de distribuição geográfica que se estende do Panamá até as bacias hidrográficas da Amazônia e Orinoco (Adrian et al. 2001), podendo ser encontrado em grande variedade de biótopos, de rios e córregos que circulam rapidamente para lagoas, valas e reservatórios (Adrian et al. 2001). Esta espécie tem registro em praticamente todas as 17

drenagens da América do Sul, e é certamente um dos morfotipos mais abundantes do continente (Lucena e Soares 2016). Algumas características são próprias da espécie, o que facilita sua identificação e diferenciá-la de outras espécies da mesma família, como por exemplo, o ponto umeral preto e horizontalmente oval, com duas barras castanhas situadas na região umeral e um ponto no pedúnculo caudal que se estende até a extremidade dos raios do meio da barbatana caudal (Garutti 1999, Lucena e Soares 2016). Este peixe apresenta hábito alimentar com tendência à hervioria-insetivoria (Meschiatti 1995, Gaspar da Luz 1999, Adrian et al. 2001), alimentando-se de zooplâncton, detritos, plantas superiores e às vezes de escama de peixes (Arcifa et al. 1991), sendo o alimento principal de origem vegetal (Adrian et al. 2001). O Astyanax bimaculatus é um peixe comum, pequeno e detritívoro, de considerável importância econômica (Matsumoto e Cólus 2000). Sobre seus aspectos reprodutivos, a gametogênese ocorre durante a estação de estiagem, a tempo de a reprodução começar durante a estação chuvosa, onde ocorre a fecundação externa dessa espécie, e não apresentando cuidado parental. Seu processo reprodutivo é altamente influenciado pelas condições ambientais (Braga 2001). Neste período é possível observar que as fêmeas são um pouco menos coloridas que os machos, adquirem forma arredondada na barriga quando estão cheias de ovos e não sobem os rios para a desova, costumam desovar próximo a vegetação ou subrtratos. Uma únca fêmea é capaz de produzir milhares de ovos (Barbieri e Afonso-Marins 1995). 18

1.3.2. Aspectos biológicos de Astronotus ocellatus (Agassiz 1831)

Figura 2 – Espécime de Astronotus ocellatus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, o Astronotus ocellatus (Figura 2) é um peixe de água doce, conhecido popularmente no Brasil como apaiari, acará-açu ou dorminhoco. Esta espécie é originária da bacia amazônica, encontra-se disseminado em quase todo o Brasil e encontrado na Argentina, Colômbia, Guiana Francesa e Peru (Kullander 2003). Ocorre em praticamente em todas as drenagens da América do Sul, e certamente um dos morfotipos mais abundantes em drenagens do continente. Habita canais, lagos de várzea, lagoas marginais e rios lênticos, preferencialmente em águas paradas e rasas de fundo lamacento ou arenoso. Não é uma espécie migratória, geralmente são solitários e encontrados comumente embaixo de troncos (Granado-Lorencio et al. 2005, Soares et al. 2011). Este peixe de escamas, apresenta o corpo com manchas escuras verticais irregulares e uma grande mancha ocelar na parte superior do pedúnculo da nadadeira caudal. A cabeça e os olhos são grandes, apresenta boca grande com lábios grossos, primeiro arco préopercular branquial sem lobo; rastros branquiais curtos e grossos com diversos dentículos (Santos et al. 2004, Soares et al. 2011). Podem alterar sua coloração rapidamente de acordo com a necessidade do momento, seja ritual, comportamental ou de combate entre indivíduos da mesma espécie (Beeching, 1995). Dependendo do ambiente pode apresentar forte coloração avermelhada nos flancos e no ventre. Os ocelos são escuros no centro e alaranjados ao redor. 19

É considerado o maior dos Acarás brasileiros. Um indivíduo adulto pode atingir de 35 a 40 cm de comprimento total e cerca de 1,5 kg de peso (Santos et al. 2004, Soares et al. 2011, Almeida-Val et al. 2000).). É uma espécie de hábito alimentar carnívoro, em seu ambiente natural, e varia sua alimentação entre pequenos peixes, crustáceos, vermes, larvas de insetos e outros invertebrados (Mérona e Rankin-de-Mérona 2004, Granado-Lorencio et al. 2005, Soares et al. 2011). Astronotus ocellatus é ovíparo, tem reprodução monogâmica, até 3 vezes ao ano e atinge a maturidade sexual próximo aos 12 meses, com 13,5 cm de comprimrento. Geralmente o casal limpa o local para desova, que é parcelada. As fêmeas liberam de 300 a 2000 ovócitos que se estabelecem em superfícies planas ou substratos, em seguida são fertilizados pelo macho e eclodem em até 5 dias Keith et al. (2000). Machos e fêmeas apresentam cuidado parental nas primeiras semanas (Keith et al. 2000, Sánchez-Botero e Araújo-Lima 2001, Granado-Lorencio et al. 2005, Santos et al. 2006, Soares et al. 2011). Embora a espécie seja considerada largamente monomorfa sexualmente, machos crescem mais rápido e podem possuir manchas escuras na base da nadadeira dorsal, porém isto é bastante variável. Os machos são maiores e mais coloridos que as fêmeas (Keith et al. 2000, Sánchez-Botero e Araújo-Lima 2001, Granado-Lorencio et al. 2005, Santos et al. 2006, Soares et al. 2011).

1.3.3. Aspectos biológicos de Cichla ocelaris (Cuvier 1819) 20

Figura 3 – Espécime de Cichla ocelaris coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, o Cichla ocellaris (Figura 3) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como tucunaré amarelo. Esta espécie é distribuída geograficamente no Amazonas e nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e nordeste do Brasil, pode ser encontrado em ambientes variados, como açudes, represas, rios e adaptam-se com facilidade em tanques de pisciculture (Kullander 2006) As espécies do gênero Cichla, são basicamente restritas a águas transparentes com altas temperaturas e acesso a habitats lênticos de água para alimentação e reprodução (Winemiller 2001). Apresentam habitos sedentários, portanto não realizam migrações (Kullander 2006). É um peixe de escamas, com corpo alongado e um pouco comprimido, com coloração e amarelada, manchas pretas e verticais distribuídas regularmente pelo corpo, apresentam uma mancha redonda (ocelo) no pedúnculo caudal. Esta espécie pode chegar a medir 30 cm ou mais de 1 m de comprimento total. O gênero é composto por 15 espécies reconhecidas por caracteres externos de cor (Kullander 2006). Apresentam hábito alimentar piscívoro diurno dominante (Winemiller 2001). No entanto é uma espécie exclusivamente carnívora, alimentando-se preferencialmente de alimentos carnudos como peixes e camarões. Seu comportamento para capturar a presa é perseguir, até que consiga capturá-la. Esta espécie é territorialista, bastante rápido, forte e moderadamente agressivo (Shafland 1999). A reprodução das espécies do gênero Cichla mostram relações entre seu modo de vida e seu habitat (Gomiero e Braga 2004). Apresentam indivíduos de sexos separados que formam casais, constroem seus ninhos e colocam seus ovos no substrato, estabelecem um território onde os ovos são depositados e protegidos. O cuidado parental com fornecimento de alimento é feito em conjunto pelo casal até que as formas imaturas se tornem independentes (Zaret 1980, Winemiller 2001, Gomiero e Braga 2004). 21

1.3.4. Aspectos biológicos de Crenicichla lepidota (Heckel 1840)

Figura 4 – Espécime de Crenicichla lepidota coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, o Crenicichla lepidota (Figura 4) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como jacundá. Esta espécie é distribuída geograficamente em todo o Brasil, nas bacias amazônica, Tocantins-Araguaia, Prata e São Francisco, habitando rios, remansos de rio, lagoas e represas, sempre próximos a estruturas como paus, pedras, entre outras (Kullander 2013). No entanto, são espécies de hábitos diurnos e têm preferência por ambientes lênticos, este padrão é determinado pela observação de que suas atividade de forrageamento ocorrem do período da manhã ao período final da tarde (Britski et al. 2007). Por ser uma espécie considerada sensível a pressões ambientais, C. lepidota é um bioindicador de ambientes aquáticos conservados (Sabino e Andrade 2003). Este peixe de escamas, apresenta o corpo alongado, boca grande, com a mandíbula um pouco maior que o maxilar superior, sua cabeça é coberta por pintas escuras e a a borda posterior do pré-opérculo é serrilhada, possui mancha umeral escura ao longo do corpo, que da base da nadadeira peitoral se estende do olho até o pedúnculo da nadadeira caudal, e um ocelo na parte superior do pedúnculo caudal (Mega e Bemvenuti 2006). Apresenta nadadeiras dorsais contínuas, com espinhos e raios, as nadadeiras ventrais são um pouco menores, a nadadeira caudal é arredondada e a nadadeira anal apresenta espinhos. Este peixe pode chegar a medir até 20 cm de comprimento total (Mega e Bemvenuti 2006). 22

O Crenicichla lepidota é territorialista e pode ser encontrado sempre no mesmo lugar. Este peixe possui hábito carnívoro, alimentando-se de pequenos peixes, camarões e outros invertebrados (Gurgel et al. 1998). Esta espécie exibe conjunto comportamental elaborado, não realiza migrações para desova nos períodos de reprodução, construe ninhos e apresenta cuidado parental (Ferreira 2013).

1.3.5. Aspectos biológicos de Geophagus proximus (Castelnau, 1855)

Figura 5 – Espécime de Geophagus proximus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, a espécie Geophagus proximus (Figura 5) está distribuída na América do Sul com registros no rio Ucayali no Peru e nos rios Solimões, Tocantins e Trombetas no Brasil (Nelson 2016). Encontra-se registros em rios da bacia do Amazonas, na Bacia do Prata e Sub-bacias do Paraná (Farias et al. 1999, Garrone-Neto e Sazima 2009). É um peixe encontrado, predominantemente, no curso inferior dos rios e também tem sido coletado em lagos de várzea, além de lagos de águas permanentes (Farias et al. 1999, Santos 2004). Dependendo da localidade podem desenvolver-se em outros habitats como rochas espalhadas, raízes de árvores submersas e galhos. Nessas regiões é popularmente 23

conhecida como acará tinga, acará-roi-roi, cará, papa-terra ou porquinho, nome popular dado à espécie por emitir som semelhante ao de um porco (Farias et al. 1999). Apresenta hábito halimentar onívoro, em seu ambiente natural, alimenta-se de uma ampla variedade de alimentos como matéria vegetal, invertebrados aquáticos, pequenos peixes e matéria orgânica, estes triados com sua boca protrátil. Em cativeiro aceitam prontamente alimentos secos, vivos e congelados (Lucinda et al. 2010). O dimorfismo sexual é bastante evidente nesta espécie, onde os machos são maiores que as fêmeas e desenvolvem uma protuberância na testa chamada calo nupicial, em épocas de reprodução (Farias et al. 1999), apresentam a nadadeira caudal arredondada e a nadadeira dorsal bastante longa acabando em bico, enquanto que as fêmeas apresentam nadadeira dorsal com ponta levemente arredondada (Garrone-Neto e Sazima 2009). Geophagus proximus são peixes ovíparos. Sua maturação sexual ocorre quando atinge aproximadamente 12 cm de comprimento. O macho defende o território contra possíveis predadores enquanto as fêmeas depositam seus ovos no substrato durante o ritual de acasalamento, geralmente entre rochas (Santos et al. 2004). Estes peixes exibem desova parcelada, hábitos de incubar os ovos na boca e cuidar da sua descendência após incubação (Santos et al. 2004). A fêmea cuida dos ovos até que eclodam após três ou quatro dias liberando alevinos que serão transportados através de encubadores bucais dos pais por alguas semanas de seu desenvolvimento (Garrone-Neto e Sazima 2009). Embora esta espécie seja considerada uma das mais pacíficas, observa-se um comportamento territorialista quando em contato com outros ciclídeos de mesmo formato e cores. Esta possui uma definição de cores bastante interessante. Desenvolvem-se melhor em cardumes, formando uma rígida hierarquia (Farias et al. 1999), onde alguns espécimes podem apresentar diferenças significativas na cor do corpo e padronização dependendo da localidade (Lucinda et al. 2010). 24

1.3.6. Aspectos biológicos de Heros efasciatus (Heckel, 1840)

Figura 6 – Espécime de Heros efasciatus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, a espécie Heros efasciatus (Figura 6), popularmente conhecido como acará severo ou acará preto, ocorre na América do Sul, bacia do rio Amazonas; afluentes dos rios Ucayali e Amazonas, no Peru, e rio Solimões e Amazonas no Brasil (Kullander 2003). É uma espécie que apresenta hábito bento-pelágico, tem preferência por ambientes lênticos, como lagos de várzea com densa vegetação aquática. No entanto, é comum encontrar esta espécie nas correntes de águas claras ou escuras, onde facilita a captura de seus alimentos (Favero et al. 2010, Abe et al. 2016). Esta espécie tem hábito alimentar onívoro com tendência invertívoro-detritívoro, com dieta composta principalmente por plantas, frutas, peixes, invertebrados aquáticos e terrestres. Esta variação alimentar está relacionada a disponibilidade de alimento decorrente dos ciclos hidrológicos de seu habitat (Abe et al. 2016). Heros efasciatus geralmente são agressivos em relação a outros peixes da mesma espécie (Aguinaga et al. 2015). Um indivíduo H. efasciatus adulto podem chegar até 20 cm, com estimativa de vida ente 8 a 10 anos. Sua coloração exuberante varia de tons amarelo esverdeado no corpo e vermelho nas nadadeiras (Favero et al. 2010). 25

Assim como a maioria dos ciclídeos, esta espécie apresenta comportamento bastante variável. Em geral costumam ser pacíficos mas territoriais quando adultos, reservando a expulsar peixes de mesmo porte de seu território, onde em períodos de reprodução pode apresentar territorialismo (Favero et al. 2010). A maturidade sexual geralmente ocorre por volta dos 12 meses. Estes peixes tem dificuldade em formar casais, pois alterações no ambiente, como a temperatura da água, o crescimento da vegetação ou a diminuição da quantidade de oxigênio podem causar estresse e desfazer esta ligação (Favero et al., 2010). Possuem dimorfismo sexual, os machos são maiores e apresentam coloração mais intensa, apresentam marcações em ossos operculares e nadadeiras maiores e pontiagudas (Favero et al. 2010). É uma espécie ovípara, onde a fêmea da espécie pode depositar entre 200 e 1000 ovos em desovas parceladas em rochas ou galhos como substrato de desova, onde em seguida os ovos são fertilizados pelos machos. Apresentam cuidado parental, que pode durar até seis semanas (Kullander 2003, Favero et al. 2010).

1.3.7. Aspectos biológicos de Hoplerythrinus unitaeniatus (Agassiz, 1829)

Figura 7 – Espécime de Hoplerythrinus unitaeniatus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Characiformes e família Erythrinidae, o Hoplerythrinus unitaeniatus (Figura 7) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como Jeju ou Traíra Pixuna. 26

Esta espécie está distribuída geograficamente em boa parte da América do Sul, nas bacia do São Francisco, Amazonas, Paraná, Orinoco e Madalena, além de rios costeiros da Guiana, Suriname e Guiana Francesa (Oyakawa 2003). Este peixe geralmente ocorre em pântanos e riachos de fluxo lento, assim como margens de lagoas florestais, muitas vezes pode ser encontrada em águas rasas em meio da densa vegetação. Podendo apresentar facilidade de adaptação às mudanças ambientais, físicas e químicas da água (Nelson 1984, Polez et al. 2003). Hoplerythrinus unitaeniatus pode subir até a superfície para respirar ar atmosférico e sobreviver por longo tempo fora da água, pois possui vesícula natatória altamente vascularizada, que atua como órgão acessório de respiração, permitindo que sobreviva em águas estagnadas e com baixo nível de oxigênio dissolvido (Jucá-Chagas 2004). Possui o hábito de migrar curtas distâncias por terra para novos habitats, quando as águas sazonais começam a secar (Polez et al. 2003). Morfologicamente, apresenta o corpo coberto com grossas escamas cicloides e abundante camada de muco que protege contra parasitos externos como sanguessugas; cabeça grande e bem ossificada; sua musculatura é adaptada a natação curta e veloz, composta por poderosas fibras brancas que não acumulam gordura. Apresentam dentes fortes e afiados, pedúnculo caudal musculoso e forte, combinando eficientemente com seu metabolismo anaeróbio e com isso, permitindo rápidas reações em frações de segundos. Um indivíduo adulto pode alcançar até 40cm de comprimento. É territorialista e altamente voraz (Weitzman e Malabarba 1998) Em seu ambiente natural o H. unitaeniatus é onívoro (Graça e Pavanelli 2004, Moraes et al. 2004). Alimenta-se basicamente de peixes e insetos, porém frutos, sementes, detritos, camarões e outros pequenos invertebrados também fazem parte de sua dieta, principalmente em fases juvenis (Mariano et al. 2009). Esta espécie não apresenta dimorfismo evidente, embora as fêmeas tendam a ficar com ventre mais desenvolvido em época de reprodução, devido ao aumento dos ovários. (Sato et al. 2003). A construção de ninhos ocorre em ambientes rasos e a primeira maturação de gônadas nas fêmeas ocorre em média com 165 mm, nos machos com 140 mm (Suzuki et al. 2004). Hoplerythrinus unitaeniatus é ovíparo, realiza diversas desovas parceladas ao longo da temporada reprodutiva e seus ovos são fertilizados na nadadeira anal em forma de concha da fêmea, sendo posteriormente descartados em buraco no substrato, onde o macho os guardará 27

até que as larvas eclodam e evadam para vegetação aquática, evidenciando cuidado parental (Sato et al. 2003, Graça e Pavanelli 2004).

1.3.8. Aspectos biológicos de Hoplias malabaricus (Bloch 1794)

Figura 8 – Espécime de Hoplias malabaricus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Characiformes e família Erythrinidae, Hoplias malabaricus (Figura 8) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como traíra (Nelson 2016). Apresenta ampla distribuição geográfica, pois ocorre em quase todas as bacias hidrográficas da América do Sul (Reis et al. 2003, Vicari et al. 2005, Mello 2006). Esta espécie habita águas paradas de lagos, represas, brejos, remansos e rios, tendo preferência por barrancos com vegetação, onde espreitam e emboscam suas presas (Nelson 2016). É um peixe utilizado em açudes e represas como controlador de populações que se proliferam rapidamente e que podem causar desequilíbrio, como tilápias e piabas. Possuem alta resistência a locais com pouco oxigênio (Hauser e Benedito 2012). A traíra é um peixe de escamas, possui corpo cilíndrico e alongado, cabeça larga, boca grande com ramo mandibular saliente, olhos grandes e nadadeiras arredondadas, exceto a dorsal. A nadadeira caudal apresenta pontos escuros, ás vezes ordenados formando faixas. O dorso e lado do corpo apresentam manchas escuras ou barras irregulares e três listras pouco 28

visíveis atrás dos olhos, em posição dorsal, observa-se a mandíbula ultrapassando a maxila superior quando a boca está fechada (Azevedo e Gomes 1943). Sua coloração é marrom na região dorsal com manchas pelo flanco, que pode variar de acordo com ambiente e estado emocional do peixe, podendo possuir abundância de cromatóforos ou não (Azevedo e Gomes 1943). Apesar do excesso de espinhas, em algumas regiões é bastante apreciado como alimento. Esta espécie pode chegar a medir 60 cm de comprimento e 1,4 kg de peso (Hauser e Benedito 2012). Hoplias malabaricus é um peixe carnívoro, alimentando-se de pequenos peixes e rãs, mas espécimes mais jovens preferem insetos. Possui aparelho digestivo adaptado a dieta piscívora (Mello 2006). Espera a presa imóvel, junto ao fundo de lama ou em locas de pedras, desferindo um bote rápido e fatal. É um peixe predador de topo de cadeia alimentar, apresentando extrema importância na pesca artesanal e comercial (Petry et al. 2007). Esta espécie não apresenta dimorfismo evidente, mas é possível observar que o ventre das fêmeas aumenta seu volume em períodos de reprodução, devido ao aumento dos ovários (Azevedo e Gomes 1943). No período de reprodução, as traíras se reúnem em casais e preparam o lugar da desova, pois são ovíparos. Seus ovos são fertilizados na nadadeira anal em forma de concha na fêmea, sendo posteriormente descartados por várias desovas parceladas em buracos de cerca de 20 cm no substrato ao longo de sua temporada reprodutiva, onde o macho os guardará até que as larvas eclodam e evadam a vegetação aquática (Azevedo e Gomes 1943, Hauser e Benedito 2012).

1.3.9. Aspectos biológicos de Mesonauta festivus (Heckel, 1840) 29

Figura 9 – Espécime de Mesonauta festivus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, Mesonauta festivus (Figura 9) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como acará festivo. Apresenta ampla distribuição geográfica, pois ocorre em quase todas as bacias hidrográficas da América do Sul: Brasil, Bolívia, Paraguai e Peru (Kullander 2003). É comum e abundante ao longo das bacias do Amazonas, Paraná e Paraguai. Esta ampla faixa geográfica de distribuição destaca a capacidade de dispersão desta espécie (Pires et al. 2015). Em relação à sua capacidade de dispersão, é considerável sua habilidade de natação na região pelágica, o que é pouco comum em outras espécies de ciclídeos neotropicais (Siqueira-Souza et al. 2017). Esta espécie geralmente ocorre em águas calmas, podendo estabelecer populações em ambientes variados, que incluem áreas com forte presença de plantas, áreas marginais de grandes rios com diferentes tipos de água e lagos de planície de inundação (Pires et. al. 2015). O estabelecimento da população do acará festivo está relacionado a sua alta tolerância ambiental, permitindo que vivam sob diferentes condições abióticas. É conhecido por explorar as raízes dos prados de macrófitas em planícies de inundação na Amazônia (Casado del Castillo et al. 2012, Soares et al. 2014). É onívoro generalista, alimentando-se de invertebrados, crustáceos bentônicos, insetos, anelídeos e secundariamente de matéria vegetal, considerando que as mudanças alimentares ocorrem mediante a disponibilidade de alimento em cada ciclo hidrológico. Em ambientes temporariamente variáveis o comportamento alimentar onívoro detritívoro do M. Festivus desponta como importante aquisição evolutiva da espécie (Röpke et al. 2014). Mesonauta festivus é ovíparo, atinge maturidade sexual em 12 meses. Uma fêmea é capaz de desovar até 200 ovos, depositados em superfícies planas ou em plantas e raízes, em seguida os ovos são fertilizados pelo macho e tendem a eclodir em até 4 dias. As larvas do acará festivo nadam livremente após 3 ou 4 dias. O cuidado parental é feito tanto pelo macho quanto pela fêmea e geralmente perdura por seis semanas. O dimorfismo sexual é pouco perceptível, porém machos podem apresentar nadadeiras peitorais e anal, barbatanas dorsais e anais maiores que as das fêmeas (Keith et al. 2000). 30

1.3.10. Aspectos biológicos de Metynnis lippincottianus (Cope 1870)

Figura 10 – Espécime de Metynnis lippincottianus coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Characiformes e família o Metynnis lippincottianus (Figura 10) é um peixe de água doce, popularmente conhecido como pacu. Esta espécie é originária da América do Sul, encontrada nos rios da Guiana Francesa e Brasil, distribuídos pela Amazônia (Jégu 2003), Rio Paraná (Froese e Pauly 2018, Moreira et al. 2009, Yamada et al. 2012) e Rio Tocantins (Santos et al. 2004). Este peixe é encontrado ao longo das margens de rios e lagos (Santos et al. 2004, Moreira et al. 2010, Froese e Pauly 2018) Comercialmente, ele é mais valioso como um peixe ornamental, mas é importante na dieta das populações ribeirinhas (Moreira et al. 2009, Yamada et al. 2012). Metynnis lippincottianus é principalmente herbívoro, e sua alimentação baseia-se em fontes vegetais, sementes e algas fitoplanctônicas, ocasionalmente é invertívoro-detritívoro (Froese e Pauly 2018, Santos et al. 2004), ocupando assim o segundo nível trófico da cadeia alimentar. 31

São peixes ovíparos e apresentam sexos separados com dimorfismo sexual, pois a nadadeira anal é mais alongada no macho e um tom avermelhado pode estar presente. Este peixe pelágico chega a medir 20 cm de comprimento, tornando-se sexualmente maduro quando atinge 10 cm de comprimento (Santos et al. 2004).

1.3.11. Aspectos biológicos de Pterophyllum scalare (Lichtenstein 1823)

Figura 11 – Espécime de Pterophyllum scalare coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, Pterophyllum scalare (Figura 11) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como acará bandeira (Nelson 2016). Apresenta ampla distribuição geográfica, pois ocorre em quase todas as bacias hidrográficas da América do Sul, encontrado Peru, Colômbia, Guianas e Brasil, com preferencia em ambientes de água com baixa dureza e levemente ácida (Ribeiro et al. 2007). Esta espécie habita águas paradas de lagos, represas, brejos, remansos e rios, tendo preferência por barrancos com vegetação, onde espreitam e emboscam suas presas (Nelson, 2016). É um peixe utilizado em açudes e represas como controlador de populações que se proliferam rapidamente e que podem causar desequilíbrio, como tilápias e piabas, possuindo alta resistência a locais com pouco oxigênio (Hauser e Benedito 2012). A principal característica morfológica de P. scalare, como todos os ciclídios, é possuir a linha lateral interrompida. Estes peixes apresentam corpo em formato triangular e 32

comprimido lateralmente, cor prateda com listras verticais pretas, nadadeiras dorsal e anal fortes e alongadas, nadadeiras ventrais modificadas, finas e longas (Ribeiro et al. 2007). Indivíduos adultos podem atingir 15cm de comprimento, normalmente são calmos e territorialistas. Costumam ser encontrados junto a madeiras e vegetação submersa, que servem de abrigo contra predadores. Espécimes jovens geralmente são observadas em cardume e estabelecendo hierarquia (Cacho et al. 1999, Ribeiro et al. 2007).

1.3.12. Aspectos biológicos de Satanoperca jurupari (Heckel 1840)

Figura 12 – Espécime de Satanoperca jurupari coletado no Rio Curiaú (Arquivos do Laboratório de Morfologia e Sanidade Animal, 2017)

Da ordem Cichliformes e família Cichlidae, Satanoperca jurupari (Figura 12) é um peixe de água doce, conhecido popularmente como acará bicudo ou papaterra (Fernandes 2008). Apresenta ampla distribuição geográfica, pois ocorre em diversas bacias hidrográficas da América do Sul, como a do rio Amazonas, do Peru, Equador e Colômbia até a foz do rio Amazonas no Brasil, no Amapá (Brasil) e na Guiana Francesa Oriental, também na drenagem da Amazônia boliviana, exceto o rio Guaporé. (Kullander 2012). Espécie típica de águas calmas, ocorre nas águas doces de estuários e pântanos costeiros (Hahn e Cunha 2005). É bentofágica por natureza, escava no substrato lamacento filtrando a areia a procura de alimentos que incluem sementes de frutas, crustáceos e insetos, que são retirados e peneirados para serem digeridos, enquanto com o material restante é 33

expulso através das aberturas de brânquia e da boca (Hahn e Cunha 2005, Weller 2017). Sua pequena estrutura bucal subterminal com dentes pequenos e cônicos, assim como seus lábios desenvolvidos para a procura de alimentos em lamaçal, indicam a preferência alimentar por detritos. Por ser detritívoro costuma alimentar-se no substrato (Hahn e Cunha 2005, Cassemiro et al. 2008). Tal comportamento detritívoro sugere que os indivíduos desta espécie sejam caracterizados como algívoros, como organismos que apresentam maior fidelidade ao modo de obtenção de seus alimentos do que ao tipo de alimento que ingerem (Casatti et al. 2003). O tamanho reduzido do estômago nesta espécie resume a quantidade de alimento no corpo durante sua digestão química, enquanto que o intestino longo colabora para receber alimentos de baixa energia que requer um intestino mais lento para melhoras os processos de digestão, absorção e utilização dos nutrientes (Silva et al. 2012). Satanoperca jurupari obedece a um padrão metabólico com estilo de vida territorial e moderado como a maioria dos ciclídeos (Chippari-Gomes et al. 2003). Apresenta baixa variabilidade genética, que pode ser compensada por um grau de plasticidade. Este grau de plasticidade pode ser garantido pela regulação de genes estruturais invariáveis (Almeida-Val et al. 1995). Esta espécie não apresenta dimorfismo sexual aparente, pois são hermafroditas. No entanto, quando atingem a maturidade sexual os indivíduos sofrem autofertilização interna e ficam com o corpo ligeiramente mais dilatado, a maturidade demora cerca de dois anos a ser atingida e os casais formam-se por afinidade (Matos et al. 2002).

1.4. Ictioparasitologia

A Ictioparasitologia estuda especificamente os parasitos de peixes, pois estes vertebrados apresentam fauna parasitária própria com numerosas espécies classificadas nos mais importantes grupos de parasitos (Luque 2004). Os parasitos podem ser um importante fator limitante para o desenvimento da piscicultura por causar doenças que podem comprometer os peixes e levar a impactos econômicos negativos (Pavanelli et al. 2002). Dispor das mais variadas informações sobre os fatores abióticos e bióticos do ambiente a ser estudado é fundamental. O estudo da ecologia dos organismos que parasitam peixes pode oferecer informações importantes a respeito de seus hospedeiros e dos ambientes em que se desenvolvem, pois as alterações ambientais, principalmente as que decorrem de oscilações da dinâmica hidrológica, 34

servem para justificar a presença ou a ausência de determinadas espécies de parasitas, além de explicar as respectivas prevalências e intensidades médias de parasitismo (Luque 2004). Em estudos da intensidade sazonal das prevalências de protozoários, demonstraram que os picos das infecções ocorrem no verão e início do outono, quando a temperatura da água atinge os maiores valores. Para desenvolver estudos que contemplem a caracterização dos parasitas de peixes é importante conhecer seus conceitos ecológicos (Pavanelli 2013). Outro fator muito importante é o hábito alimentar dos peixes. Os endoparasitos possuem na maioria das vezes um ciclo de vida bastante complexo onde utiliza vários hospedeiros intermediários. A presença de determinados parasitos no sistema digestório dos peixes pode indicar quais são os itens alimentares destes hospedeiros ou pelo menos qual o seu hábito alimentar (Pavanelli 2013).

Apesar de o Brasil abrigar grande diversidade de espécies de peixes em suas águas, há poucas informações que esclareçam sobre a fauna de parasitos que infectam esses peixes, pois ainda existe grande carência de publicações acerca da ictioparasitologia no país. Estima-se que menos de um quarto das espécies de peixes brasileiros foi necropsiada com o objetivo de se estudar a fauna parasitária (Pavanelli 2013). Observa-se que nas últimas décadas houve aumento no número de estudos voltados a parasitologia em organismos aquáticos, principalmente relacionados a hospedeiros de relevante potencial econômico, devido a necessidade de manter a sanidade desses organismos em razão do crescente desenvolvimento de atividades comerciais com esses produtos no Brasil e no mundo (Luque 2004). Segundo pesquisadores ainda há muito por fazer nessa área do conhecimento e existem muitas espécies de parasitas ainda não registradas ou mesmo classificadas, sobretudo na Amazônia.

1.5. Parasitos do Filo Apicomplexa

Os membros do Filo Apicomplexa são protozoários parasitos intracelulares obrigatórios, que ocorrem em invertebrados e em todas as classes de vertebrados. O grupo apresenta algumas espécies de importância médica humana e veterinária, tais como Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii. Estes parasitos apresentam um conjunto de organelas, conhecido como complexo apical, que é responsável pela fixação e invasão das células hospedeiras o mesmo é composto por anéis polares, roptrias, micronemas, conóides e microtúbulos dispostos sob a membrana celular (Perkins et al. 2000, Souza 2010). O Filo Apicomplexa é o único grande grupo taxonômico em que todos os membros são parasitas, o que justifica ser, portanto, de grande interesse para a parasitologia. No 35

entanto, é um grupo pouco conhecido, seu quadro taxonômico é bastante tênue em muitos aspectos. Existem cerca de 300 gêneros e quase 4.800 espécies descritas para este filo, mas provavelmente existam dez vezes mais espécies a serem descritas (Levine 2018). Os Apicomplexa mais representativos estão divididos em cinco grandes grupos: gregarinas, hemogregarinas, hemosporídeos, piroplasmas e coccídios (Levine 2018). Gregarina é um dos grupos mais primitivos que se tem registro, com cerca de 1600 espécies, 225 gêneros e 40 famílias. São protozoários parasitas monoxênicos de invertebrados (Levine 2018). Em análises morfológicas é possível observar que gregarinas absorvem nutrientes de células infectadas de seus hospedeiros. A medida que se desenvolvem e, com sua maturação, os trofozoítos desenvolvem-se em gamões associados ao início da reprodução sexual no ciclo celular, culminando na formação do gametocisto esférico (Gigliolli et. al. 2016). As hemogregarinas, com cerca de 400 espécies conhecidas, são parasitos encontrados em células sanguíneas e outros tecidos (Siddall e Desser 2001). A hemogregarina pode ser encontrada em hospedeiros aquáticos e terrestres como peixes, tartarugas, tartarugas e anfíbios, sendo transmitidos por sanguessugas, mosquitos e carrapatos (Karadjian et al. 2015). Os sinais de infecção podem variar de anemia a interferência grave na condição física do hospedeiro (Calil et al. 2017). Os hemosporídeos são os parasitos maláricos e compreendem cerca de 450 espécies, em 10 gêneros. Estão presentes em células sanguíneas e de outros tecidos em répteis, aves e mamíferos e seus vetores são diferentes artrópodos hematófagos (Levine 1988a, 1988b). Os hematosporídeos são hemosporídeos parasitos generalizados em aves. Sua prevalência varia com os fatores intrínsecos e extrínsecos de seu hospedeiro como resistência, comportamento e características relacionadas ao habitat (Dutra et al. 2017). Os Piroplasmas incluem uma série de organismos clinicamente e economicamente relevantes, tema muito discutido entre parasitologistas. Três gêneros (Babesia, Theileria e Cytauxzoon) são reconhecidos com base nas características do ciclo de vida do parasito, mas as análises filogenéticas moleculares das sequências 18S sugerem a presença de cinco ou mais linhagens distintas (Schreeg et al. 2016). Os piroplasmas são parasitos importantes que causam doenças graves em animais de produção em diversos países. O grupo é composto por cerca de 170 espécies, seis gêneros e três famílias. Os mesmos se multiplicam em células sanguíneas e são transmitidos por carrapatos (Levine 2018).

Classe Esporozoa 36

Na classe Esporozoa ocorrem protozoários parasitas com reprodução sexuada e assexuada, onde produzem oocistos que originam formas infectantes. Não apresentam cílios e quando apresentam flagelos ocorrem apenas na estrutura de seus microgametas. Portanto, se locomovem por flexõs do corpo. Os pseudópodes, quando ocorrem, servem apenas para captura de alimentos (Levine 2018).

Subclasse Coccidia

Na subclasse Coccidia ocorrem protozoários com ciclo de vida com fase sexuada apresentando pequenos gametas intracelulares e assexuado desenvolve-se completamente nas células do organismo de seu hospedeiro. Esta subclasse apresenta quatro ordens: Agamococcidia, Protococcidia, Ixorheorida e Eucoccidia (Levine 2018). A ordem Eucoccidia é composta de três subordens que se diferenciam pela presença ou ausência de esporozoítos no interior de oocistos. Em representantes da subordem Haemosporina os esporozoítos não estão contidos em oocistos, já nos da subordem Eimeriina encontram-se oocistos contendo esporocistos com esporozoítos, enquanto que nos da subordem Adeleina os esporozoítos podem ou não estarem contidos em oocistos (Levine 1988, 2018). Os membros da subordem Eimeriina (Apicomplexa: Sporozoea: ) têm ciclo de vida complexo, com um ou dois hospedeiros vertebrados ou invertebrados em desenvolvimento endógenos ou exógenos. Como exemplo, variabilis ThClohan 1893, Reichenow 1921, Eimeria catostomi Molnar e Hanek 1974, Eimeria fernandoae Molnar e Hanek 1974, Eimeria myoxocephali Fitzgerald 1975 e Eimeria banyulensis Lom e Dykova 1982., apresentam esporulação endógena. Eimeria syngnathi Yakimoff e Gousseff 1936, Eimeria raiarum Van den Berghe 1937, Eimeria aurati Hoffmann 1965, Eimeria squali Fitzgerald 1975, Eimeria Dingleyi Davies 1978 e Eimeria halleri Upton, Bristol, Gardner e Duszynski, 1986, apresentam esporulação exógena (Davies e Ball 1993, Molnár 2006). Quase todas as espécies de Eimeria se desenvolvem dentro do citoplasma das células hospedeiras, mas em algumas espécies pode ocorrer a invasão do núcleo ou permanecem na região epicelular, onde o vacúolo parasitóforo é intracelular mas extracitoplasmático e coberto por uma simples unidade de membrana da célula hospedeira (Davies e Ball 1993, Molnár 2006). 37

1.5.1. Ciclo de vida dos Apicomplexa

O ciclo de vida dos Apicomplexa alterna fases de reprodução sexuada e assexuada (Figura 13). Na fase sexuada, chamada gametogonia, ocorre a formação dos gametas e fusão dos mesmos originando o zigoto. Este passa por uma divisão assexuada, chamada de esporogonia, que culmina com a formação dos esporozoítos. Estes últimos após penetrarem nas células hospedeiras se dividem assexuadamente (merogonia) e formam os merozoítos (Eiras 1994). Ciclos merogônicos podem ocorrer de forma geral de duas a três vezes. Posteriormente, os merozoítos penetram novas células, mas se diferenciam em gametócitos masculinos e femininos, chamados de microgametas e macrogametas, respectivamente. Os microgamentas reproduzem-se por divisão binária, podendo formar dois ou mais novos microgametas e se fundem com macrogametas para a formação do zigoto. Os Apicomplexa são haplóides em quase todos os estágios do seu ciclo de vida, com exceção apenas da fase de zigoto, que é diplóide por um período de tempo relativamente curto, antes da sua primeira divisão celular meiótica (Eiras 1994, Levine 2018). Os coccídios apresentam cerca de 2000 espécies, distribuídos em aproximadamente 65 gêneros e 22 famílias. Ocorrem em todos os grupos de vertebrados. Eles se multiplicam geralmente nas células intestinais, ou para alguns grupos na vesícula biliar, fígado e rins. Ao final deste processo são formados cistos, que podem permanecer nos próprios hospedeiros ou ser eliminados juntamente com as fezes (Levine 2018).

38

Figura 13 - Ciclo de vida geral de Eimeria spp. – Após deixarem os esporocistos os esporozoítos (1) penetram em uma célula do epitélio intestinal (2). Com divisões mitóticas sucessivas dentro de um meronte (3), se forma a primeira geração de merozoítos (4), que rompem as células parasitadas e são liberados para a luz intestinal (5), podendo assim penetrar em novas células (6), reiniciando um novo ciclo merogônico (7 e 8), que culmina com a formação da segunda geração de merozoítos (9 e 10). Após romper as células hospedeiras os merozoítos formados (11) podem entrar em uma nova célula epitelial do intestino (12) e gerar a terceira geração de merozoítos (13 e 14). Grande parte dos merozoítos de segunda (11) e todos da terceira geração (15) penetram em uma nova célula epitelial. Alguns se tornam microgametócitos (16 e 17), os quais produzem uma grande quantidade de microgametas (18), e outros se tornam macrogametas (19 e 20). Os macrogametas são fertilizados pelos microgametas e tornam-se zigotos (21), que posteriormente formam a parede cística para formar os oocistos. Após seu desenvolvimento, os oocistos caem na luz intestinal contendo um esporonte e são eliminados para o meio ambiente com as fezes (22) onde sofre divisão nuclear meiótica formando os esporoblastos (23) e divisão mitótica para a formação de quatro esporocistos, cada um contendo dois esporozoítos. Tem-se agora o oocisto maduro infectante (24) que pode ser ingerido por um hospedeiro vertebrado (Roberts e Janovy-Jr., 1996).

Os estudos de ciclos de vida dos coccídios de peixes apontam que, aparentemente, seu desenvolvimento sequencial é semelhante ao observado em outros vertebrados. Os esporozoítos iniciam a infecção do intestino dos peixes provavelmente quando estes ingerem um oocisto esporulado, seja um esporocisto livre (homoxênicos), ou ingerindo um hospedeiro intermediário do esporocisto (heteroxênicos). Em ambos os casos, os esporozoitos podem alojar-se nas células epiteliais do intestino do hospedeiro, ou migrar para outros locais, transformando-se em trofozoítos que se tornarão merontes (Davies e Ball 1993). A maioria dos coccídios de peixes é encontrada parasitando seu epitélio intestinal, mas em um alguns deles, especialmente aqueles com grandes oocistos, desenvolvem-se em outros locais, tais como o rim, baço, fígado e bexiga natatória (McLaughlin 1996). A esporogonia é muitas vezes endógena, embora possa ser exógena, ou ocorrer de ambas as formas. Desenvolvimentos endógenos podem ser classificados como intracelulares, extracelulares, intercelulares, intranucleares, epiplasmais ou epicelulares (Dyková e Lom 1981). Em peixes, 39

os zigotos podem apresentar-se cercados por paredes muito finas com 13-100nm (Lom 1971; Upton et al., 1984) ou paredes espessas com 1-2 µm (Duszynski et al. 1979, Upton et al. 1984) e tornam-se oocistos que eventualmente esporulam (Davies e Ball 1993). Contrariando ao que antes se presumia, estudos revelaram a existência de algumas espécies de coccídios de peixes apresentam oocistos não esporulados, contrariando ao que antes se presumia, que os oocistos produzidos por todas as espécies destes parasitas fossem esporulados. Estes esporocistos, esporulados ou não, geralmente são produzidos durante o ano inteiro, porém há espécies que seguem um ciclo sazonal e produzem oocistos apenas durante a primavera (McLaughlin 1996).

1.6. Gêneros de coccídios em peixes

Em relação ao parasitismo de coccídios em peixes marinhos e água doce quatro gêneros tem sido registrados, Calyptospora (Calyptosporidae Overstreet et al., 1984), Eimeria, Goussia ( Minchin, 1903) e Cryptosporidium (Cryptosporidiidae Léger, 1911) (Molnár, 2006). Coccídios do gênero Eimeria representam um risco para todas as espécies animais como causa de coccidiose, reduzindo a produtividade e comprometendo o bem-estar animal (Emily et al. 2015). Assim como ocorre em outos coccidios, o desenvolvimento do oocisto eimeriano parece ser dependente da conclusão do ciclo sexual do parasito (Walker et al. 2017). Os oocistos de Eimeria apresentam ciclo de vida monoxênico, contendo quatro esporocistos e, ocasionalmente, um a dois grânulos polares. Cada esporocisto contém dois sporozoítos e um corpo residual. Detalhes sobre o desenvolvimento do grupo já foi abordado em tópico acima (Lom e Dyková 1982; 1992). No gênero Goussia, os oocistos são compostos por quatro esporocistos sem corpo de Stieda e com paredes unidas por uma sutura, cada esporocisto com dois esporozoítos. A sutura dos esporocistos é dificilmente discernível por microscopia óptica, mas pode ser vista através de microscopia electrônica. Existe ainda uma evidência de que a compressão de amostras entre lâmina e lamínula possa levar a abertura dos oocistos e permitir a observação das suturas nos esporocistos (Lom e Dyková 1982, 1992). De acordo com Lom (1971) e Baska e Molnár (1989), em algumas espécies de Goussia o esporocisto também é cercado por um véu membranar, que é anexado ao esporocisto por membranas especiais (Molnár 2006). Os parasitos do gênero Goussia apresentam ciclo monoxênico e desenvolvimento no trato intestinal ou extra-intestinal, por exemplo células do fígado (Gestal e Azevedo 2006). 40

Molnár (2006) diferencia dois grandes grupos entre espécies de Goussia que parasitam peixes. O primeiro grupo desenvolve de forma lenta por um curto ciclo de desenvolvimento durante o ano, apresentando pequenos oocistos entre 8 e 13 µm de tamanho infectando aleatoriaente o eptélio intestinal. O segundo apresenta estrutura frouxa e oocistos relativamente grandes, entre 15 e 30 µm formados uma vez por ano, na primavera. Este grupo divide-se em três subgrupos de acordo com a localização do parasito no hospedeiro: epicelular (intracelular, mas extracitoplasmática), nodular (desenvolve-se no intestino dos hospedeiros em nódulos isolados, infectando células hospedeiras vizinhas) e os que infectam orgãos como fígado, baço, rim e membranas serosas da cavidade abdominal dos peixes (Molnár 2006). O desenvolvimento dos parasitos do gênero Cryptosporidium ocorre geralmente no estômago, intestino ou trato respiratório, na superfície das células epiteliais, encobertos por uma fina camada do citoplasma das mesmas. Possuem ciclos monoxênicos, com infecção oral. Seus oocistos são formados por quatro esporozoítos e a esporulação é endógena, sendo eliminados para o meio externo junto as fezes dos hospedeiros (Upton 2000). Os parasitos do gênero Calyptospora foram inicialmente designados como Eimeria, porém estudos posteriores mostraram peculiaridades que permitiram sua diferenciação (Daves e Ball 1993, Molnár 2006). Calyptospora possuem oocistos com morfologia esférica, podem ser elípticos, ovóides ou em forma de pêra, com quatro esporocistos, de formato elipsoidal, cada um com dois esporozoítos. Além disso, seus esporocistos apresentam na região apical estruturas granulares conhecidas como esporopódio, podendo ser encontrados parasitando o parênquima hepático ou outros órgãos tais como pâncreas e vesícula biliar. O seu ciclo de vida é heteroxênico com peixes como hospedeiros definitivos e camarões como intermediários (Dyková e Lom 1981, Fournie et al. 1985, Azevedo et.al. 1995). A diversidade destes parasitos ainda é pouco conhecida, sendo registradas somente cinco espécies, Calyptospora funduli (Duszynski, Solangi and Overstreet, 1979), Calytospora empristica Fornie et al. 1985, nos Estados Unidos. As outras 3 espécies foram registradas no Brasil.

1.6.1. Ocorrência de coccídios em peixes dulcícolas no Brasil Em peixes no Brasil existem apenas quatro espécies de coccídios formalmente descritos e distribuídos entre os gêneros Calyptospora e Eimeria. O registro de parasitos do gênero Eimeria se restringe a espécie E. lepidosirenis encontrado no intestino do peixe pulmonado Lepidosiren paradoxa (Lainson e Ribeiro 2006). 41

Parasitos do gênero Calyptospora possuem apenas três espécies registradas em peixes de água doce no Brasil. Calyptospora serrasalmi (Cheung et al. 1986), da piranha Serrasalmus niger (Cheung et al. 1986), C. tucunarensis (Békési e Molnár 1991) do tucunaré Cichla ocellaris (Békési e Molnár, 1991) e C. spinosa (Azevedo et al. 1993) de jacundá Crenicichla lepidota (Azevedo et al. 1993). Existe ainda o registros de parasitismo de Calyptospora sp. nos peixes Arapaima gigas (Bonar et al. 2006); Triportheus guentheri e Tetragonopterus chalceus (Albuquerque e Brasil-Sato, 2010); Brachyplatystoma vaillantii (Silva et al. 2012); Cichla temensis (Santiago et al. 2012; Velasco et al. 2012) e Aequidens plagiozonatus (Videira et al. 2013). Baseado na estimativa de que no país existam 2.587 espécies de peixes, e que existem apenas nove destes vertebrados com registro de parasitismo por coccídios, alerta-se sobre a necessidade de estudos nesta linha de pesquisa. Portanto, o presente estudo trata dos primeiros passos para lançar luz sobre aspectos como a diversidade, ciclo de vida e potenciais processos patológicos de parasitos Calyptospora em peixes de água doce da região amazônica. 42

2. PROBLEMAS

 Ocorre infecção por coccídios do gênero Calyptospora em peixes na planície de inundação do Rio Curiaú, estado do Amapá? A infecção por Calyptospora em peixes na planície de inundação do Rio Curiaú, estado do Amapá, pode ter relação com os diferentes hábitos alimentares dos peixes hospedeiros?

3. HIPÓTESES

 Deve ocorrer infecção por Calyptospora em mais de uma espécie de peixe da planície de inundação do Rio Curiaú, considerando que existem registros de infecção causada por este parasito, na região Norte, em duas espécies inclusas neste estudo e, que estas espécies se relacionam com as demais.  A infecção por Calyptospora deve variar entre os peixes hospedeiros em relação aos seus diferentes hábitos alimentares, pois o nível trófico pode ter relação direta com esses parasitos. Assim a frequência de infecção deve ser maior em peixes carnívoros e detritívoros, e menos frequente naqueles preferencialmente herbívoros.

4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo Geral

Investigar a ocorrência de coccídios do gêneno Calyptospora em diferentes espécies de peixes da planície de inundação do Rio Curiaú, Amapá.

4.2. Objetivos Específicos 43

 Descrever a ocorrência de Calyptospora em espécies de peixes da planície de inundação do Rio Curiaú;  Verificar a prevalência de Calyptospora em cada espécie estudada;

 Identificar os sítios de infecção por Calyptospora nas vísceras dos peixes estudados;

 Identificar as espécies de Calyptospora usando biologia molecular

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5. ARTIGO CIENTÍFICO

Prevalence and molecular characterization of Calyptospora (Apicomplexa: Calyptosporidae) in fishes from the eastern Amazon region, State of Amapá, Brazil.

Artigo submetido ao periódico “Parasitology” Qualis A2 em Biodiversidade. 55

Prevalence and molecular characterization of Calyptospora (Apicomplexa: Calyptosporidae) in fishes from the eastern Amazon, State of Amapá, Brazil

Márcio Charles da Silva Negrão1, Maria Regina Lucas da Silva2, Marcela Nunes Videira3, Lúcio André Viana4*

1Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical, Universidade Federal do Amapá, Macapá, AP, 21040-360, Brazil

2Instituto de Biociências, Departamento de Parasitologia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Junior, Botucatu, SP, 18618-689, Brazil

3Laboratório de Morfofisiologia e Sanidade Animal, Universidade do Estado do Amapá, Macapá, AP, 68900-070, Brazil

4Laboratório de Estudos Morfofisiológicos e Parasitários, Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal do Amapá, Macapá, AP, 68903-419, Brazil

Running title: Calyptospora in fishes from the eastern Amazon, Brazil

*Correspondence to: 56

Lúcio André Viana, Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal do Amapá, Macapá, AP, 68903-419, Brazil. E-mail: [email protected] 57

Abstract

This study reports the occurrence and molecular biology of coccidia of the genus Calyptospora in fish from the eastern Amazon. Fish were collected on flood plains in the municipality of Macapá, state of Amapá, Brazil. Fresh squash preparations of liver, heart and gallbladder were examined under light microscope. Positive samples of Geophagus proximus and Hoplias malabaricus were used for detection of parasites by PCR reactions with Calyptospora-specific primers mRF and mrR, that amplify the region of 18S rRNA gene. Oocysts were observed in 55% of 130 fish examined. The prevalence varied according to the feeding habits, with 100% in carnivores, 74% in omnivores (invertivores and detritivores) and without infection in herbivores. Variation in the frequency of parasitized organs was recorded, 100% of the livers, 30% in the gallbladder, and 9% in the heart. The sequences obtained from G. proximus and H. malabaricus were identical between then and showed 99% of similarity to Calyptospora serrasalmi. Our results show for the first time the occurrence of Calyptospora in 10 new species of fish from the region of the eastern Brazilian Amazon. They demonstrate the occurrence of C. serrasalmi in the region and contribute with new primers for the diagnosis of Calyptospora.

Keywords: Amazon, Infection, Freshwater fish, Parasites. 58

Introduction

Coccidians are intracellular parasites belonging to Phylum Apicomplexa, these are described in all vertebrate class (Perkins et al. 2000). Among the coccidia stricto sensu of marine and freshwater fish are known five genera, Calyptospora Overstreet, Hawkins and Fournie, 1984, Eimeria Schneider, 1875, Goussia Labbé, 1896, Crystallospora Labbé, 1896, and Cryptosporidium Tyzzer, 1907 (Molnar, 2006). Their disease impact is poorly understood, but there is increasing evidence that they are potential pathogens (See Sindermann,1987). The protozoan parasites of the genus Calyptospora have heteroxenic life cycles involving fishes and shrimp. Their oocysts are primarily confined to the liver tissue, but may occur in other organs, i.e. pancreas and gallbladder (Perkins et al., 2000). The diversity of these parasites is still little known, where there are only five species formally described, Calyptospora funduli Duszynski, Solangi and Overstreet, 1979, Calytospora empristica Fornie et al., 1985, in the United States. The other three species were recorded in Brazil, Calyptospora serrasalmi Cheung Nigrelli and Ruggieri, 1986 in Serrasalmus niger Jardine, 1841; Calyptospora tucunarensis Békési and Molnár, 1991 in Cichla ocellaris Bloch and Schneider, 1801 and Calyptospora spinosa Azevedo, Matos and Matos, 1993 described in Crenicichla lepidota Heckel, 1840. There is still the records of Calyptospora sp. in Arapaima gigas Schinz, 1822 (Bonar et al., 2006), Triportheus guentheri Garman, 1890, Tetragonopterus chalceus Spix & Agassiz, 1829 (Albuquerque and Brasil-Sato, 2010), Brachyplatystoma vaillantii Valenciennes, 1840 (Silva et al., 2012); Cichla temensis Humboldt, 1821 (Santiago et al 2012; Velasco et al 2012) and Aequidens plagiozonatus Kullander, 1984 (Videira et al. 2013), all in Brazil. It is estimated that in Brazil there are 2,587 fish species exclusively from freshwater and 1,297 from salt water (Reis et al., 2003). However, little is known about the diversity of protozoan parasites in these hosts in the country (Eiras et al., 2012; Martins et al., 2015), i.e. for parasites of the Phylum Apicomplexa there are approximately 12 records distributed among haemogregarines and coccidia stricto sensu. Therefore, the objective of this study was to describe the occurrence of coccidia of the genus Calyptospora, to identify infection sites and to perform taxonomic identification of the parasite by molecular biology in fish from a floodplain in the eastern Amazon. 59

Material and methods

Study área

This study was carried out on floodplain of the Curiaú River, within the environmental protection area of the Curiaú (APA Curiaú), with an extension of 23,000 he, located in the municipality of Macapá, in the state of Amapá, Brazil (0°08'43.1"N; -51°02'29.2"W; 20°08'44.3"N; -51°02'33.4"W; and 3: 0º14'55.79''N, -51°04'24.16''W (Fig. 1). The local includes amazonian savanna, terra firme and swamp forests, and seasonally flooded grasslands, as well as temporary and permanent lentic bodies of water (Chellappa et al. 2005). The region has a very marked seasonality, with the season of drought extending from July to December and rainy season from January to June. The highest rainfall occurs approximately from May to June (Tavares, 2014).

Capture of the fishes and examination

The fish were captured by the team of the Laboratory of Morphophysiology and Animal Health (LABMORSA) of the State University of Amapá (UEAP), assisted by local fishermen, through the use of 30 mm casting nets. The collection period was from June 2017 to January 2018, with the capture of 130 individuals belonging to 12 different species. The animals were stored alive in thermal boxes with artificial aeration and transported to LABMORSA, remained in aquaria until the analyzes were carried out. The fishes were anesthetized with MS-222 (Sandoz Laboratories) at the concentration of 50 mg/ml. Afterwards, fresh squash preparations of liver, heart and gallbladder were examined under light microscope to verify the presence of Calyptospora spp.

DNA extraction and sequencing

Liver fragments with oocysts of Calyptospora sp. from Geophagus proximus (Castelnau, 1855) and Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) were collected and stored in ethyl alcohol 80%. DNA was extracted from tissue samples using ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System (Promega), following the manufacturer’s instructions. Detection of the presence of parasites was initially made using PCR reactions with Calyptospora-specific primer call Cal1F and 18R, following Whipps et al. (2012) parameters. However, after sequencing was verified the amplification of the DNA of the host G. proximus. A new primer pair was designed based on the sequences of Calyptospora spp. (GU479670, FJ904836, FJ904637, FJ904643, FJ904644, FJ904638, FJ904642), available in GenBank®, 60

using GENEIOUS v.7.1.3 software (Biomatters; http://www.geneious.com). The primers mrF (5’-GGC-CGG-CGA-TAG-ATC-ATT-CA-3’) and mrR (5’-CGA-CAC-GCA-AAG-TCC- CTC-TA-3’) amplify approximately an 1187-bp fragment of the 18S rRNA gene of Calyptospora spp. PCR protocol involved 20 µl reaction mixture containing 10.0 µl of GoTaq® Green

Master Mix, 2X, 0.6 µl dimethyl sulfoxide (DMSO), 1.2 µl MgCl2 (25mM), 0.6 µl of each primer, 1µl of template DNA, and 6.0 µl MilliQ water. Thermocycler with initial denaturation at 95°C for 2 min, followed by 40 cycles of 95°C for 1 min, 52°C for 1 min, 72°C for 1 min, and a final extension at 72°C for 5 min. The PCR and sequencing reactions were performed by Helixxa Genomic Services (Paulínia, SP, Brazil). The amplified fragments were purified from the agarose gel and sequenced using the Applied Biosystems Big Dye v.3.1 kit with an ABI 3500 automatic sequencer (Applied Biosystems). All sequences were performed in both directions.

Sequence alignment and phylogenetic analysis

DNA sequences obtained were edited using the BioEdit software v7.2.5 (Hall 1999) and compared for similarity with sequences available in GenBank® by BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Multiple alignment, with 978 bp, for two sequences obtained in this study and 23 sequences retrieved from GenBank®, was performed using the MUSCLE algorithm and in the GENEIOUS v.7.1.3 software (Biomatters; http://www.geneious.com). The jModelTest v.2.1.10 program (Darriba et al. 2012) was used to identify the best evolutionary model for maximum likelihood analysis. The best fitting model based on the Akaike Information Criterion (AIC) was TIM3 + I + G. The phylogenetic tree was inferred by the Maximum Likelihood methods using PhyML v.3.0 (Guindon et al. 2010). To estimate internal nodes of the tree, a bootstrap with 1000 replicates was used.

Results

Calyptospora oocysts were observed in 55% of the 130 animals, being present in 10 of the 12 species studied (Table 1). The prevalence varied according to the feeding habit, where all carnivorous species, with piscivorous tendencies, were positive, omnivorous species (invertivorous and detritivore) presented 74% of infection. The herbivorous species Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) and Metynnis lippincottianus (Cope 1870), which together accounted for 25% (n = 33) of the sample, were negative. 61

All infected individuals were found sporoblast oocysts and completely sporulated (Fig 2). Infection rates varied in relation to the viscera, where all the hosts had parasitic forms in the liver, followed by 30% in the gallbladder and 9% in the heart. Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831), Mesonauta festivus (Heckel 1840) and Pterophillum scalare (Schultze 1823) had sporulated oocysts in the liver and gallbladder. In G. proximus oocysts were found in the liver, gallbladder, and heart. Livers with highest concentration of oocysts were swollen and lighter coloration than in places with lower concentration of the parasites. Melano- macrophage centres was observed in specimens of A. ocellatus, C. ocellaris, C. lepidota, H. unitaeniatus, Hoplias malabaricus (Bloch 1794), M. festivus and P. scalare, which had high infection intensity. The sequences obtained from G. proximus (MH167351) and H. malabaricus (MH167352) were identical between then and showed 99% of similarity to C. serrasalmi (FJ904642, FJ904639) isolated from Serrasalmus rhombeus Linnaeus, 1766 in Brazil and 97% of identity to C. funduli (FJ904643) from Fundulus grandis Baird and Girard, 1853 and C. spinosa (FJ904636) from C. lepidota, in the EUA and Brazil, respectively. A phylogenetic tree inferred on a 978 bp fragment of the 18S rRNA gene (Fig. 4) showed that C. serrasalmi sequences obtained in this study grouped within of a clade composed of Calyptospora spp. sequences and in the same branch which C. serrasalmi (FJ904642) isolated from S. rhombeus with 77% bootstrap support. Discussion In the present study the infection rates of Calyptospora spp. varied according to the type of feeding habits of fishes, with the highest number of infections in carnivorous fishes, with a piscivorous tendency, such as C. ocellaris, C. lepidota, H. unitaeniatus and H. malabaricus, in comparison with omnivorous and herbivorous. This is reinforced by the absence of infections A. bimaculatus and M. lippincottianus, both mainly herbivorous (Meschiatti, 1995; Gaspar-da-Luz and Okada, 1999; Resende et al. 1997; Dias et al. 2005). In the life cycle of Calyptospora fish infection occurs by ingestion of shrimps, and the latter become infected by ingesting remains of dead fish viscera containing sporulated oocysts (Overstreet et al. 1984). Attempts of experimental infection of fish by direct ingestion of C. funduli oocysts or infected viscera were not achieved (Solangi and Overstreet et al. 1980). Based on the findings of this study, we consider that new experiments should be performed with carnivorous fish to verify the transmission of Calyptospora by predation. Infected larger fish of the species A. ocellatus, C. ocellaris, C. lepidota, G. proximus, H. unitaeniatus, H. malabaricus, M. festivus and Satanoperca jurupari (Heckel 1840) had an 62

extensive part of the hepatic parenchyma with Calyptospora oocysts. Pathological changes such as swelling and whitish appearance of the pancreas and liver, appear relatively common in Calyptospora infections, i.e. A. gigas (Schinz, 1822) (Molnár et al., 2006) and Fundulus grandis (Solangi and Overstreet, 1980). Similar observations were described by Eiras (2013), Velasco et al. (1993), Albuquerque and Brasil-Sato (2010), Azevedo, Matos and Matos (1993) and Békési and Molnár (1991). Interestingly, despite the macro and microscopic damage observed in Calyptospora infection, inflammatory processes have not been recorded in fish infections (Bonar et al., 2006; Santiago et al., 2012). The coccidian C. serrasalmi has been described by Cheung et al. (1986) in piranhas S. niger of the northern region of Brazil, and the same parasite was later recorded in Serrasalmus striolatus (Steindachner, 1908) in the north and northeast of the same country (Whipps et al., 2012). Although there is no record of S. niger in the floodplain of the Curiaú River, three other species of the genus occur in the region, Serrasalmus calmoni (Steindachner, 1908), S. rhombeus, and Serrasalmus spilopleura Kner, 1858, and a species of Serrasalmus not identified (Gama and Halboth, 2003). These species are very likely to participate in the cycles of C. serrasalmi at the site of the present study. The identity of the invertebrate hosts of Calyptospora spp. in the region studied here is still unknown, but one or more species of shrimps may be involved in the cycles of transmission. At the study site occur seven species of decapods, all belonging to the family Palaemonidae: Palaemonetes carteri Gordon, 1935, Macrobrachium jelskii (Miers, 1877) and Euryrhynchus burchelli Calman, 1907 are recorded, the others are Euryrhynchus amazoniensis Tiefenbacher, 1978, Euryrhnchus wrzesniowskii Miers, 1877, Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) and Pseudopalaemon cf. chryseus Kensley and Walker, 1982 (Vieira, 2003). As the C. funduli cycle involves the Palaemonetes pugio shrimp in the United States (Holthius, 1949), it is strongly probable that P. carteri will participate in the cycles in the floodplain of the Riu Curiaú. In the present study the record of C. serrasalmi in two fish families, G. proximus (Cichlidae) and H. malabaricus (Erythrinidae), reinforces the idea that Calyptospora have low specificity in relation to their vertebrate hosts. Fournie and Overstreet (1993) recorded success in experimental infection of C. funduli by ingestion of P. pugio shrimps in fish from 5 different families. In addition, C. funduli was recorded in Opsanus beta (Goode & Bean, 1880) belonging to a sixth family, Batrachoididae (Oliveira et al., 1993). Our results show for the first time the occurrence of Calyptospora in 10 new species of fish, all of the floodplain of the Curiaú River, eastern Amazon. They demonstrate the 63

occurrence of C. serrasalmi in the region and in new hosts. In addition, the study contributes to the presentation of a new pair of primers for diagnosis of Calyptospora.

Acknowledgements We are grateful for the help in fieldwork to the field team of LABMORSA and fishermans of APA Curiaú.

Compliance with ethical standards

Conflict of interest The authors declare that they have no conflict of interest.

Ethical approval The capture of fishes was authorized by Secretary of State for the Environment from Amapá, Brazil (authorization No. 1014/2016) and by Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) through authorization number 50376- 1/2017, based on the pertinent Brazilian legislation.

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Figure Captions

Fig. 1. Location of the samples in the Area of Environmental Protection of the Curiaú River, Macapá, Brazil.

Fig. 2. Calyptospora serrasalmi from hepatic parenchyma of Hoplias malabaricus. (A) Separated oocysts of C. serrasalmi (arrows) and forming aggregates (*) s. sporocysts inside oocysts and (B) aggregates of oocysts containing four sporocysts (arrowheads) and oocysts not sporulated (*).

Fig. 3. Phylogenetic tree of maximum likelihood analysis based on the partial sequences (978 bp) of the 18S rRNA gene of Calyptospora serrasalmi from Geophagus proximus (acara) and Hoplias malabaricus (traira), isolated in this study, and sequences deposited in GenBank®. The branch length scale represents 0.08 substitutions per site. (●) sequences obtained in this study. 68

Table 1. Prevalence of Calyptospora spp., feeding habits, and site of infection in fishes from the Area of Environmental Protection of the River Curiaú, Macapá, Brazil.

Feeding Prevalence Site of Species # N habitats (%) infection*

Crenicichla lepidota (Heckel 1840) Carn 10 100 Lv

Cichla ocelaris (Bloch and Schneider 1801) Carn 8 100 Lv

Hoplias malabaricus (Bloch 1794) Carn 6 100 Lv

Mesonauta festivus (Heckel 1840) Omni 6 100 Lv, Gb

Hoplerythrinus unitaeniatus (Spix and Agassiz 1829) Omni 5 100 Lv

Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) Carn 2 100 Lv, Gb

Geophagus proximus (Castelnau 1855) Omni 12 75 Lv, Gb, He

Pterophyllum scalare (Schultze 1823) Omni 19 63 Lv, Gb

Satanoperca jurupari (Heckel 1840) Omni 22 54 Lv

Heros efasciatus (Heckel 1840) Omni 7 28 Lv

Metynnis lippincottianus (Cope 1870) Herb 21 0 -

Astyanax bimaculatus (Linnaeus 1758) Herb 12 0 -

Total 130 55

*Liver: Lv; Gallbladder: Gb; Heart: He #Herbivore: Herb; Carnivore: Carn; Omnivorous: Omni (Froese & Pauly 2018). 69

Fig. 1. Location of the samples in the Area of Environmental Protection of the Curiaú River, Macapá, Brazil. 80x51mm (300 x 300 DPI) 70

Fig. 2. Calyptospora serrasalmi from hepatic parenchyma of Hoplias malabaricus. (A) Separated oocysts of C. serrasalmi (arrows) and forming aggregates (*) s. sporocysts inside oocysts and (B) aggregates of oocysts containing four sporocysts (arrowheads) and oocysts not sporulated (*). 398x155mm (150 x 150 DPI) 71

Fig. 3. Phylogenetic tree of maximum likelihood analysis based on the partial sequences (978 bp) of the 18S rRNA gene of Calyptospora serrasalmi from Geophagus proximus (acara) and Hoplias malabaricus (traira), isolated in this study, and sequences deposited in GenBank®. The branch length scale represents 0.08 substitutions per site. (●) sequences obtained in this study. 80x57mm (300 x 300 DPI) 72

6. CONCLUSÕES

 No presente estudo foi registrado pela primeira vez a ocorrência de Calyptospora em A. Ocellatus, G. proximus, H. efasciatus, H. unitaeniatus, H. malabaricus, M. festivus, P. scalare e S. jurupari, todos da planície de inundação do Rio Curiaú, região da Amazônia oriental.

 Foram identificdos três sítios de infecção por Calyptospora com prevalência de 100% no fígado, 30% navesícula biliar e 9% no coração peixes infectados.

 Foi observada a presença de esporos de Calyptospora em 10 das 12 espécies estudadas, principalmente em espécies carnívoras, com tendência piscívora, onde a prevalência foi de 100%. Em espécies onívoras, que copreendem organismos invertívoros e detritívoros, observou-se a prevalência de 74%. Em A. bimaculatus e M. lippincottianus, espécies preferencialmente herbívoras, não houve registro de infecção por Calyptospora.

 Na planície de inundação do Rio Curiaú ocorre C. serrasalmi em dois novos hospedeiros de famílias diferentes.

 Os primers inicialmente designados como específicos para Calyptospora por Whipps et al. (2012) amplificaram DNA do hospedeiro G. proximus. Logo, novos primers foram designados neste estudo e testados com sucesso para diagnóstico de Calyptospora. 73

ANEXOS

Anexo I – Comprovante de submissão de artigo ao periódico Parasitology. 74