INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE ÁGUA DOCE E PESCA INTERIOR - BADPI

CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE Cichla BLOCH & SCHNEIDER, 1801 (PERCIFORMES, CICHLIDAE) COM ÊNFASE NOS HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS

JANICE MACHADO DE QUADROS

MANAUS-AM 2019 JANICE MACHADO DE QUADROS

CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE Cichla BLOCH & SCHNEIDER, 1801 (PERCIFORMES, CICHLIDAE) COM ÊNFASE NOS HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS

ORIENTADORA: Eliana Feldberg, Dra.

COORIENTADOR: Efrem Jorge Gondim Ferreira, Dr.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, área de concentração Biologia de Água Doce e Pesca Interior.

MANAUS-AM 2019 Ficha Catalográfica

Q1c Quadros, Janice Machado de CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE Cichla BLOCH & SCHNEIDER, 1801 (PERCIFORMES, CICHLIDAE) COM ÊNFASE NOS HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS / Janice Machado de Quadros; orientadora Eliana Feldberg; coorientadora Efrem Ferreira. -- Manaus:[s.l], 2019. 56 f.

Dissertação (Mestrado - Programa de Pós Graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior) -- Coordenação do Programa de Pós- Graduação, INPA, 2019.

1. Hibridação. 2. Tucunaré. 3. Heterocromatina. 4. FISH. 5. DNAr. I. Feldberg, Eliana, orient. II. Ferreira, Efrem, coorient. III. Título.

CDD: 639.2

Sinopse: A fim de investigar a existência de híbridos entre espécies de Cichla, nós analisamos, por meio de técnicas de citogenética clássica e molecular indivíduos de C. monoculus, C. temensis, C. pinima, C. kelberi, C. piquiti, C. vazzoleri de diferentes locais da bacia amazônica e entre eles, três indivíduos foram considerados, morfologicamente, híbridos. Todos os indivíduos apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos. A heterocromatina foi encontrada preferencialmente em regiões centroméricas e terminais, com variações entre indivíduos de C. monoculus, de diferentes locais. Os resultados mostraram que os sítios de DNAr e sequências repetitivas estão envolvidas na evolução da macroestrutura cariotípica do gênero. A localização dos genes DNAr 5S permitiu sugerir os possíveis parentais dos híbridos analisados no presente estudo.

Palavras-chave: Hibridação, tucunaré, Heterocromatina, FISH, DNAr 5S.

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Ata de Defesa Pública

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A realização deste estudo foi possível devido:

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), à Divisão de curso de Pós- graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior - BADPI e ao laboratório de Genética Animal (LGA). Aos financiamentos fornecidos pelos projetos: NCT – Centro de Estudo das Adaptações da Biota Aquática - ADAPTA-AMAZÔNIA-Fase II, para CHAMADA PÚBLICA MCTI/CNPQ/FAPS No. 16/2014, Edital Nº 047/2012. Estudos citogenéticos e citogenômicos da biodiversidade da Amazônia, com implementação de avanços técnicos (AUXPE – Pró-Amazônia, CAPES 3297/2013/Processo nº 23038.009446/2013-09). Citogenética clássica e molecular em peixes da bacia amazônica frente a diferentes desafios ambientais. Taxa da bolsa de produtividade de Eliana Feldberg, CNPq - Processo Nº 302421/2014-9.

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Agradecimentos

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), pelo suporte para o desenvolvimento do presente trabalho.

À coordenação do programa de pós-graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Inteior, corpo docente e colegas do curso.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pelo financiamento do projeto.

À Profª. Drª. Eliana pelo apoio, incentivo, orientação e por sempre estar disposta a partilhar seus valiosos conhecimentos. Agradeço especialmente pela amizade, paciência, pela confiança em mim depositada e por ter me apresentado a citogenética.

Ao Prof. Dr. Efrem pela orientação e valiosa colaboração nesse trabalho.

A todos os colegas do Laboratório de Genética Animal, em especial: Ramon, Léo, Milena e Francy.

Aos meus queridos amigos Alex e Luana e ao meu namorado Luciano pela amizade e por todo o apoio prestado nesse processo.

A minha aluna Ketlen e aos meus colegas Patrik, Marajó, Erika e Ezequiel por todo o suporte prestado durante as coletas.

Aos meus pais, por serem o meu alicerce e sempre me apoiarem nesse caminho. Às minhas irmãs e ao Pietro pelo incentivo e amizade, os quais foram fundamentais para que a minha jornada fosse concluída.

Obrigada!

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“... Sirvam nossas façanhas de modelo a toda Terra...”

(Francisco Pinto da Fontoura)

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Resumo

O gênero Cichla compreende 15 espécies válidas, conhecidas como tucunaré, que se distribuem por toda Amazônia. Algumas espécies foram introduzidas em diferentes bacias hidrográficas brasileiras, onde tiveram uma boa adaptação. Alguns estudos têm apontado a existência de híbridos interespecíficos, em ambientes onde ocorrem mais de uma espécie deste gênero. Ainda, pode ocorrer o retrocruzamento com os parentais, fenômeno que pode levar à introgressão de genes. Este processo também é comum entre diferentes linhagens, particularmente quando espécies alopátricas são introduzidas em novos habitats. A fim de investigar a existência de híbridos entre as espécies deste gênero, nós coletamos indivíduos de diferentes espécies de tucunaré (C. monoculus, C. temensis, C. pinima, C. kelberi, C. piquiti, C. vazzoleri) em diferentes locais da bacia amazônica. Estes foram analisados citogeneticamente, e todos os indivíduos apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos. A heterocromatina foi encontrada preferencialmente em regiões centroméricas e terminais, com variações entre indivíduos de Cichla monoculus, de diferentes locais. Essa variabilidade intraespecífica no padrão heterocromático pode ser o resultado de adaptação e/ou respostas epigenômicas da cromatina a mudanças no ambiente, devido a sua ampla distribuição pela Amazônia. A região organizadora do nucléolo (RON) foi localizada no par 2, coincidente com DNAr 18S, em todos os indivíduos analisados. O DNAr 5S, entretanto, apresentou dois padrões: no 4º e no 6º par. Entre todos os indivíduos, três foram considerados híbridos, morfologicamente, coletados na UHE de Balbina, junto com C. temensis, C. monoculus e C. vazzoleri. Do ponto de vista citogenético, estes indivíduos se diferenciaram em relação ao padrão de banda C, que mostrou-se similar entre híbridos e a C. monoculus coletado em Anavilhanas e em relação à localização do DNAr 5S, que em um indivíduo esteve em posição intersticial no primeiro cromossomo do par 4 e no segundo cromossomo do par 6 (C. temensis ou C. monoculus X C. vazzoleri), em outro indivíduo, a marcação do DNAr 5S se fez presente em ambos os cromossomos do par 4 (C. temensis X C. monoculus) e num terceiro indivíduo, a marcação evidenciou o segundo cromossomo dos pares 4 e 6 (C. temensis ou C. monoculus X C. vazzoleri), o que nos permite sugerir os possíveis parentais dos híbridos. Os sítios teloméricos foram restritos às regiões terminais dos cromossomos e os retrotransposons Rex3 e Rex6 apresentaram um padrão de distribuição disperso em porções de heterocromatina e eucromatina.

Palavras-chave: Hibridação, tucunaré, Heterocromatina, FISH, DNAr 5S.

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Abstract

The genus Cichla comprises 15 valid species, known as tucunare, that are distributed throughout the Amazon. Some species were introduced in different Brazilian river basins, where they had a good adaptation. Studies show the existence of interspecific hybrids in environments where more than one species of this genus occurs. Hybridization is a common process among fish species and backcrossing with the parental is a phenomenon that, when it occurs, can lead to introgression of genes. This process is also common among different strains, particularly when allopatric species are introduced into new habitats. In order to investigate the existence of hybrids among species of this genus, we collected individuals of different species (C. kelberi, C. monoculus, C. pinima, C. piquiti, C. temensis, C. vazzoleri) at different sites in the Amazon basin. We analyzed cytogenetically and all individuals presented 2n = 48 acrocentric chromosomes. The constitutive heterochromatin was found preferentially in centromeric and terminal regions, with variations among individuals of C. monoculus from different locations. This intraspecific variability in the heterochromatic pattern may be the result of adaptation and / or epigenomic responses of the chromatin to changes in the environment due to its wide distribution in the Amazon. The nucleolus organizer region (Ag- NOR) was found in pair 2, coincident with 18S rDNA, in all individuals analyzed, however, the 5S rDNA presented two patterns: in the 4th and 6th pair. Among all individuals, three were considered hybrids, morphologically, collected at the Balbina UHE, together with C. temensis, C. monoculus and C. vazzoleri. For cytogenetics, these individuals differed in relation to the C-band pattern, that was like C. monoculos from Anavilhanas, and the rDNA 5s, that was found in one individual at the first chromosome of 4th pair and in the second chromosome of 6th pair (C. temensis ou C. monoculus X C. vazzoleri),. Another individual presented rDNA 5s at 4th chromosomal pair (C. temensis X C. monoculus), and the last hybrid presented the rDNA 5s at the second chromosome of 4th and 6th pair (C. temensis ou C.monoculos X C. vazzoleri), allowing us to suggest the possible parenting of hybrids. The telomeric sites were restricted to the terminal regions of the chromosomes and the Rex3 and Rex6 retrotransposons showed a dispersed distribution pattern in heterochromatin and eucromatin portions.

Key words: Hybridization, tucunaré, Heterochromatin, FISH, 5S rDNA.

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Sumário

INTRODUÇÃO ...... 1 Hibridação interespecífica em peixes ...... 1 O gênero Cichla ...... 4 A Citogenética ...... 7 OBJETIVOS ...... 11 Objetivo Geral ...... 11 Objetivos Específicos ...... 11 MATERIAL E MÉTODOS ...... 12 Material ...... 12 Métodos - Citogenética Clássica ...... 16 Obtenção dos Cromossomos Mitóticos ...... 16 Análise Cromossômica ...... 16 Detecção da Heterocromatina Constitutiva ...... 17 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo ...... 17 Métodos - Citogenética Molecular ...... 17 Extração de DNA...... 17 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 18 Marcação das sondas ...... 19 FISH - Hibridização in situ fluorescente ...... 19 Análise Cariotípica ...... 20 RESULTADOS ...... 21 DISCUSSÃO ...... 29 CONCLUSÕES ...... 34 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 35

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INTRODUÇÃO

Hibridação interespecífica em peixes

Hibridação é o cruzamento genético entre duas espécies diferentes, animal ou vegetal. Os indivíduos gerados por hibridação são chamados híbridos. Estes podem ser estéreis, com baixa fertilidade ou férteis. A hibridação é uma questão amplamente discutida em vários estudos com espécies de peixes. Para alguns autores, hibridações podem estar relacionadas à diversificação e especiação de muitos grupos, ou à extinção de populações ou espécies. A dificuldade para diferenciar espécies e híbridos pode ser um problema para o manejo correto de espécies selvagens, porque linhagens híbridas, especialmente as mais avançadas, podem assemelhar-se aos parentais (Mourão et al. 2017). A produção de híbridos no Brasil tornou-se, nas últimas décadas, a forma mais usual de se obter material genético mais produtivo. A presença de híbridos na estatística de produção comprova o bom resultado zootécnico do processo de hibridação entre espécies nativas. Entretanto, a grande dificuldade de manter estes híbridos sob controle (em cativeiro) e sua fertilidade constituem uma grande ameaça, a longo prazo, à integridade genética das populações selvagens, fonte de variabilidade para os programas de melhoramento (Hilsdorf e Orfão 2011). Independentemente do ponto de vista adotado, os estudos de hibridação são cruciais para a compreensão da base do isolamento reprodutivo e da origem da biodiversidade (Arnold e Meyer 2006). As alterações dos ambientes e a introdução de espécies têm grande influência no processo evolutivo dos organismos. Este fenômeno ocorre devido à pressão seletiva exercida sobre os indivíduos sujeitos à nova condição ambiental (Futuyma 2003). Presença de híbridos tem sido notada entre espécies introduzidas e espécies locais, geneticamente compatíveis (Arthington 1991; Alves-Brinn et al. 2004). A hibridação é uma maneira eficaz de prevenir a degeneração das variedades e produzir uma variedade melhorada e pode ser interespecífica ou intraespecífica. A interespecífica combina os genomas de diferentes espécies e pode resultar em mudanças significativas nos fenótipos e genótipos dos descendentes. A intraespecífica, que é definida como um cruzamento entre diferentes subespécies (linhagens), pertencentes à mesma espécie, também pode levar a alterações fenotípicas e genotípicas nos descendentes, porém, aparentemente, a hibridação interespecífica pode levar a mudanças maiores nas progênies resultantes, do que as da intraespecífica (Wang et al. 2019). Segundo Hubbs (1955), hibridação interespecífica é um fenômeno comum entre vários grupos de peixes de água doce, e, geralmente, está relacionada com fatores ambientais. Uma 1 mudança climática pode facilitar invasões biológicas e causar perda de biodiversidade, uma vez que as espécies ocupam diferentes nichos climáticos (Walther et al. 2002; Root et al. 2003; Parmesan 2006; Rahel e Olden 2008; Sorte et al. 2013). Ainda, o retrocruzamento com os parentais é um fenômeno que, quando ocorre, pode levar à introgressão de genes. Este processo também é comum entre linhagens, particularmente quando populações alopátricas são introduzidas em novos habitats (Hubbs 1955; Avise et al. 2002; Rubidge e Taylor 2004). Assim, hibridação e introgressão genética entre espécies nativas e invasoras são consequências evolutivas importantes de invasões biológicas, mediadas pelo homem (Simberloff 2014). Mas, também podem ocorrer de forma natural, levando à transferência de alelos adaptativos de uma espécie para outra e ao aumento da diversidade de espécies (Moy et al. 2019). Particularmente entre os ciclídeos, Smith et al. (2003) discutem as vantagens adaptativas da hibridação e introgressão para o aumento da variabilidade genética, entretanto, é necessário ressaltar que este processo pode levar à extinção de espécies locais (Perry et al. 2002), pois a existência de híbridos férteis deve conter uma maior variabilidade genética, e deste modo, apresentar maior vigor e capacidade adaptativa, sendo mais competitivos e agressivos que as espécies originais (Arthington 1991; Bernatchez et al. 1995). Na Amazônia, um exemplo de híbrido natural foi descrito para os jaraquis, com base em estudos morfológicos (Semaprochilodus insignis vs Semaprochilodus taeniurus) (Ribeiro 1985) e uma hipótese de hibridação natural entre Cichla monoculus (Agassiz 1831) vs Cichla temensis (Humboldt 1821) foi levantada, com base em análises cariotípicas (Alves-Brinn et al. 2004) e por sequenciamento de DNA mitocondrial (Andrade et al. 2001). Alves-Brinn et al. (2004) analisaram as espécies C. monoculus e C. temensis, provenientes da Usina Hidrelétrica de Balbina (bacia do rio Uatumã). Neste estudo, os autores encontraram indivíduos que apresentaram características morfológicas e cariotípicas intermediárias entre as duas espécies e sugeriram tratar-se de um possível híbrido ao que denominaram Cichla sp. Embora todos os indivíduos analisados tenham apresentado 2n=48 cromossomos acrocêntricos, a região organizadora de nucléolo (RON) foi um marcador espécie-específico, onde os exemplares de C. monoculus e cinco indivíduos Cichla sp. apresentaram marcação no segundo par cromossômico e C. temensis e três Cichla sp. apresentaram a RON no terceiro par. Como C. monoculus e C. temensis são encontrados em simpatria na bacia amazônica, os autores sugerem que o ancestral de Cichla sp. teria sido o resultado do cruzamento destas espécies. Um outro estudo, utilizando os mesmos indivíduos

2 do estudo de Alves-Brinn et al. (2004) e outros de áreas de comprovada simpatria entre Cichla monoculus e Cichla temensis, por sequenciamento de DNA mitocondrial, confirmou a hibridação entre as duas espécies nas bacias dos rios Uatumã, Tapajós, Moju, Tocantins e Guamá (Andrade et al. 2001). Teixeira e Oliveira (2005), com base em padrões eletroforéticos da esterase, confirmaram a presença de híbridos em áreas de simpatria de C. monoculus e C. temensis. Willis et al. (2010), usando dados multilocus, estudaram a possível hibridação interespecífica entre espécies de Cichla em seu habitat natural, bacia do Tocantins-Araguaia, e nesta investigação não foram encontradas evidências de hibridação e/ou introgressão de genes entre C. kelberi (Kullander e Ferreira 2006) e C. piquiti (Kullander e Ferreira 2006) e na genealogia mitocondrial, as duas espécies encontram-se em clados diferentes. Por outro lado, quando estas espécies, coletadas na região Sul-Sudeste, onde foram introduzidas, foram analisadas, híbridos foram encontrados. No entanto, Mourão et al. (2017), utilizando marcadores nuclear (RAG1) e mitocondrial (COI), analisaram as espécies C. kelberi, C. piquiti e indivíduos híbridos em potencial, denominado carijó, coletados nos rios Paraná e Tietê (SP, Brasil), sugerem que o carijó não é um híbrido interespecífico, porque apresentou padrão genético idêntico e morfologia próxima à C. piquiti. Assim, os autores propuzeram que o carijó é um morfotipo de C. piquiti. Híbridos artificiais são muito comuns na aquicultura. Interessante notar que as principais espécies de peixes utilizadas para a formação de híbridos têm uma constituição cariotípica muito semelhante tanto no número diploide como na fórmula cromossômica, como é o caso do tambaqui (Colossoma macropomum) e pacu (Piaractus mesopotamicus). Desde a década de oitenta vem sendo produzidos diversos híbridos com a finalidade de sua inserção na piscicultura. Estudos citogenéticos foram conduzidos por Toledo-Filho et al. (1994) em ambas as espécies para sua caracterização citogenética e monitoração dos resultados destes cruzamentos. Com relação ao número diploide, as duas espécies parentais apresentam cariótipos indistinguíveis com 2n=54 cromossomos, com 20 cromossomos metacêntricos e 34 submetacêntricos. Porém, analisando a heterocromatina constitutiva da geração F1, ficaram evidentes cinco cromossomos com padrão de bandamento diferenciado, o que permitiu identificar os genomas parentais. Ainda, resultados mais refinados, como o estudo por microscopia eletrônica do complexo sinaptonêmico, sugeriram a existência de espermatogênese anômala nos híbridos, o que poderia inviabilizar a formação de gametas geneticamente funcionais (Toledo Filho et al. 1994).

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Em relação ao tucunaré, na bacia do rio Paraná, Oliveira et al. (2006) investigaram a diversidade genética de populações de C. monoculus e Cichla sp., depois confirmadas como C. kelberi e C. piquiti, respectivamente (Kullander e Ferreira 2006), e demonstraram um padrão de diferenciação, com indivíduos geneticamente intermediários entre as duas espécies, indicando uma forte evidência da quebra do isolamento reprodutivo destas duas espécies, e deste modo resultando no híbrido. Entretanto, Willis et al. (2010), usando dados multilocus, estudaram a possível hibridação interespecífica entre espécies de Cichla da região norte da América do Sul (Bacias do Amazonas, Tocantins-Araguaia e do Orinoco), onde as duas espécies (C. kelberi e C. piquiti) são nativas e coexistem, não encontraram híbridos e nem evidências de introgressão de genes entre elas e, na genealogia mitocondrial, as duas espécies encontram-se em clados diferentes. Em referência à adaptação e à especiação em Cichla, sua localização originária restrita à bacia amazônica permite inferir que o mecanismo de especiação para este gênero tenha ocorrido em simpatria e parapatria (Aparício et al. 2002). Redução da variação genética foi observada em todas as populações invasivas para C. kelberi e C. piquiti. Por exemplo, a heterozigosidade foi menor na faixa invasiva, quando comparada às populações nativas da bacia amazônica. Portanto, apesar da invasão bem sucedida de Cichla no sudeste do Brasil, baixa diversidade genética foi observada nas populações introduzidas. Isso, segundo Carvalho et al. (2014), pode ser devido a uma combinação de fatores, como estratégias reprodutivas, de alimentação e a fraca resistência biótica às modificações antrópicas do ecossistema.

O gênero Cichla

Cichla pertence à família Cichlidae e são conhecidos como tucunaré, no Brasil, pavón na Venezuela, toekoenali no Suriname e lukanani na Guyana (Kullander 2003). Os tucunarés são preferencialmente piscívoros e têm sido utilizados para peixamentos em barragens e açudes. São animais de grande interesse econômico, por possuírem carne de excelente qualidade e serem muito apreciados na pesca esportiva (Kullander e Ferreira 2006). De hábito diurno, podem utilizar diferentes locais para alimentação (Winemiller 2001). Durante a noite, repousam nas beiradas rasas de rios e lagos, embaixo ou ao lado de coberturas vegetais (Taphorn e Barbarino 1993). Espécies de Cichla, como os demais ciclídeos, têm desova parcelada e cuidado parental. O local de desova escolhido é geralmente um substrato duro e resistente, onde macho e fêmea limpam a superfície, com auxílio da boca protrátil e movimentação das nadadeiras, retirando algas ou outros vegetais (Sawaya e Maranhão 1946; Fontenele 1950; 4

Zaret 1980; Taphorn e Barbarino 1993). Uma vez ocorrida a fecundação, os reprodutores se revezam na tarefa de cuidar do ninho (Zaret 1980; Taphorn e Barbarino 1993). Ao nascerem, as larvas são aspiradas pela boca e colocadas no ninho e, se perturbado, o casal pode mudar as larvas de local ou mesmo abandonar o ninho (Sawaya e Maranhão 1946; Zaret 1980; Taphorn e Barbarino 1993). O cuidado parental pode ser realizado por ambos os pais (Zaret 1980) ou por apenas um deles (Fontenele 1950). Devido a este cuidado com ovos e larvas, as espécies de tucunaré são classificadas como guardadores e o casal torna-se altamente territorialista no período reprodutivo (Zaret 1977). Representantes do gênero Cichla são facilmente distinguidos de todos os outros ciclídeos sul-americanos pela forma da nadadeira dorsal, a boca larga, mandíbula e maxila proeminentes, um ocelo na base da nadadeira caudal e barras verticais escuras, variando de 1 a 4 (Kullander e Ferreira 2006). Entretanto, sua coloração é extremamente variável, devido, aparentemente, a alterações ontogenéticas e período reprodutivo, o que causa grande dificuldade na identificação de suas espécies (Kullander e Ferreira 2006). Segundo Kullander e Ferreira (2006), este gênero compreende 15 espécies (Tabela 1) reconhecidas morfologicamente, sendo que sua distribuição é um tanto particular. Por exemplo, C. monoculus e C. temensis são encontradas na bacia do rio Amazonas, mas C. piquiti e C. kelberi são restritas ao rio Tocantins. Algumas espécies foram introduzidas em diversas bacias hidrográficas brasileiras e encontram-se bem estabelecidas, como C. monoculus, C. kelberi e C. piquiti (Nascimento et al. 2001). Devido à abundância natural, à natureza esportiva e à qualidade de sua carne, as espécies do gênero Cichla são um importante recurso natural em muitas regiões da América do Sul (Jepsen et al. 1999). Um exemplo é a espécie Cichla ocellaris (Schneider 1801), que foi introduzida no Sudeste e Pantanal, e por sua vez, teve seus estoques parentais originários da Amazônia (Gomiero e Braga 2003). Outra espécie introduzida foi C. kelberi, no reservatório de Juturnaíba, localizado no Rio de Janeiro e uma área a jusante do rio São João, juntamente com C. monoculus restrito a áreas fluviais a jusante. Essa introdução se deu por pescadores esportivos, devido ao valor econômico das espécies (Diamante et al. 2017). Já, C. piquiti é naturalmente encontrada nas bacias dos rios Tocantins-Araguaia, mas as populações não-nativas são registradas em muitos reservatórios do centro, sul e sudeste do Brasil (Dos Santos et al. 2016).

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Tabela 1. Espécies do gênero Cichla em ordem cronológica de descrição e sua distribuição, de acordo com Kullander e Ferreira (2006), e números diploides conhecidos. Número Espécie Distribuição Referência diploide C. ocellaris Guianas, Suriname, alto rio Branco no Brasil Schneider 1801 C. temensis Drenagens dos rios Negro e Orinoco no Brasil, 48 Alves- Brinn et al. Humboldt 1821 Colômbia e Venezuela; rios de águas negras ao acrocêntricos 2004 longo dos Rios Solimões-Tefé, Puraquequara, Rio Uatumã e Silves C. orinocensis Rios Negro e Orinoco no Brasil, Colômbia e Humboldt 1821 Venezuela C. monoculus Planícies de inundação da bacia Amazônica, na 48 Alves- Brinn et al. Agassiz 1831 Colômbia, Peru e Brasil, nos rios do Amapá e acrocêntricos 2004; Schneider et no baixo rio Oyapock na fronteira entre o Brasil al. 2012 e Guiana Francesa. C. nigromaculata Alto Rio Orinoco na Venezuela e médio Rio Jardine 1843 Negro no Brasil. C. intermedia Restrita às drenagens dos rios Casiquiare e Machado-Alisson Orinoco na Venezuela 1971 C. kelberi Kullander Rio Tocantins, drenagens dos rios Paraná, 48 Mourão 2013 e Ferreira 2006 Paraíba do Sul e região Nordeste do Brasil. acrocêntricos C. pleiozona Rios Madre de Dios, Beni e Guaporé na Bolívia Kullander e Ferreira e no Rio Jamari no Brasil 2006 C. mirianae Alto rio Tapajós, rios Juruena, Teles Pires, alto Kullander e Ferreira rio Xingu no Brasil. 2006 C. melaniae Baixo rio Xingu, no Brasil Kullander e Ferreira 2006 C. piquiti Kullander Rios Tocantins, Paraná no Brasil e Paraguai. 48 Mourão 2013 e Ferreira 2006 acrocêntricos C. thyrorus Rio Trombetas no Brasil, à montante da Kullander e Ferreira Cachoeira Porteira. 2006 C. jarina Kullander e Rio Jari no Brasil, corredeiras de Santo Ferreira 2006 Antônio. C. pinima Kullander Afluentes do sul do Rio Amazonas no Brasil e Ferreira 2006 (Tapajós, Curuá-Una, Xingu) e baixos rios Tocantins e Capim. rios Amapá, Araguari e Canumã no Brasil. C. vazzoleri Baixo rios Uatumã e Trombetas no Brasil Kullander e Ferreira 2006

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A Citogenética

O primeiro autor a propor a utilização de dados cariotípicos para identificar espécies e para elaborar padrões de relacionamento ou filogenias foi Mathey (1949 apud Sczepanski 2008), no primeiro trabalho de revisão de dados cromossômicos de vertebrados. As técnicas de bandeamento em cromossomos mitóticos de anfíbios, introduzidas na década de 1970 (Schimid e Krone 1976; Schimid 1978; Schimid e Guttembach 1988) deram início a uma nova fase nos estudos cromossômicos. Os padrões de bandas observados para cada espécie passaram então a permitir relacionar alguns grupos, ampliando o entendimento sobre a estrutura dos cromossomos eucariotos e fornecendo importantes dados para a compreensão molecular da organização dos cromossomos de vertebrados. Entretanto, a citogenética teve um grande avanço nos últimos anos com a aplicação da técnica de Hibridização in situ Fluorescente (FISH), que faz uso de sondas obtidas a partir de segmentos específicos de DNA, nos cromossomos (Martins et al. 2010). Oliveira et al. (2009) destacam ainda que os estudos citogenéticos contribuem com informações para o entendimento da divergência genética entre espécies coespecíficas, bem como da relação entre grupos, da ocorrência de espécies crípticas e de complexos de espécies. Ainda, destacam a relevante contribuição que a citogenética tem acerca dos mecanismos e evolução dos sistemas de cromossomos sexuais, da mesma forma com a descrição de cromossomos B, ocorrência de poliploidia e suas relações com a evolução dos grupos. O número de cromossomos, as fórmulas cromossômicas, a localização das regiões organizadoras de nucléolos (RON) e o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva são características cariotípicas que são consideradas caracteres importantes no entendimento da história evolutiva de grupos relacionados e também são importantes na identificação de espécies crípticas e/ou de taxonomia problemática (Garcia e Almeida-Toledo 2010). Arai (2011) catalogou 3.425 espécies de peixes com cariótipos descritos. O número diploide variou de 2n=20 cromossomos em Pterolebias longipinnis (Scheel 1973) a 2n=134 cromossomos em Corydoras aeneus (Turner et al. 1992). Outras especificidades já foram observadas para os peixes neotropicais por análises cariotípicas, tais como: polimorfismos estruturais (rearranjos), numéricos (euploidias e aneuploidias), cromossomos sexuais e cromossomos supernumerários (Garcia e Almeida-Toledo 2010). A visualização dos cromossomos pela coloração com Giemsa permite a determinação do número diploide e da constituição cariotípica de uma espécie, abrindo assim um importante caminho para a comparação interespecífica. Os cromossomos portadores das 7 regiões organizadoras de nucléolo (RONs) podem ser localizados de maneira rápida e fácil pelo método de coloração com o nitrato de prata (AgNO3). Porém, a coloração com AgNO3 permite apenas a localização das RONs ativas antes da divisão celular. O nitrato de prata cora apenas proteína não-histona ácida (nucleosina, também chamada de proteína C23), presente nas RONs ativas durante a interfase, no momento da fixação das células. Essa técnica deve ser considerada como um método indireto para a localização das RONs, uma vez que não há associação direta com o DNA ribossômico, mas sim com proteínas a ele associadas (Guerra 1988; Nirchio e Oliveira 2006). As regiões organizadoras de nucléolo (RON) são regiões cromossômicas que contém os genes responsáveis pela codificação do RNA ribossomal. A variação dessa região em peixes (RON simples e múltipla, RON heteromórfica, RON associada à heterocromatina constitutiva e RON ativa em cromossomos sexuais) tem sido utilizada como um marcador para tentar entender os processos que levaram à diferenciação de populações e espécies estritamente relacionadas (Almeida-Toledo e Foresti 1985). A observação das RONs, como um marcador cromossômico, permite detectar grupos de organismos em que sua distribuição se dá em apenas um par de cromossomos e grupos com múltiplos sítios desses elementos (RONs múltiplas). Schmid (1980) sugere que os cariótipos com RONs simples sejam ancestrais em relação a cariótipos com RONs múltiplas. Estes sítios são importantes marcadores cromossômicos, uma vez que seu número e localização são característicos de espécies e de populações (Lourenço et al. 1998). A heterocromatina constitutiva constitui as regiões dos cromossomos altamente repetitivas, que se mantêm condensadas durante todo o ciclo celular e é tida por alguns autores como um estado reprimido ou inativo da cromatina. Tal região é encontrada, preferencialmente, em blocos centroméricos, teloméricos ou intersticiais. Heterocromatina associada às RONs, braços cromossômicos ou cromossomos inteiros são algumas alterações do padrão da heterocromatina constitutiva encontradas em peixes. Alguns autores sugerem que essas alterações podem estar refletindo processos de diferenciação de populações ou a origem e evolução de cromossomos sexuais (Guerra 1988; Andreata 1991). Sua detecção se dá pela técnica de Bandeamento C, que consiste numa remoção diferencial de DNA da cromatina após o tratamento com ácido, base e solução salina, enquanto que a região heterocromática permanece aparentemente intacta (Sumner 1972). A eucromatina é composta pela maioria dos genes estruturais e sequências de DNA de cópia única; enquanto que a heterocromatina é caracterizada pela ausência de atividade gênica (Guerra 1988). As porções

8 de DNA repetitivo são essenciais para o comportamento cromossômico próprio (Wallrath 1998). Essas sequências repetitivas apresentam uma função estrutural e são de grande importância para a evolução do genoma de diversos organismos (Bieé mont e Vieira 2006). Isso deve-se ao fato de que vários tipos de cópias de DNA repetitivo estão intimamente associados com regiões heterocromáticas, indicando que esse DNA não se distribui de maneira aleatória no genoma e que tal associação pode estar relacionada com a manutenção destas cópias no genoma (Mazzuchelli e Martins 2009). Garcia e Almeida-Toledo (2010), por meio de análises citogenéticas realizadas em cinco espécies de Pimelodella, coletadas nas principais sub-bacias do Alto Rio Paraná e Rio Paraíba do Sul, verificaram que o número diploide variou de 2n=46 a 2n=58 cromossomos e que todas as populações diferiram na constituição cariotípica. Observaram ainda, um polimorfismo de heterocromatina envolvendo o primeiro par cromossômico do cariótipo, o qual se mostrou restrito a alguns machos. Um outro exemplo é o gênero Bunocephalus, Aspredinidae, que é considerado monofilético com 13 espécies válidas. Ferreira et al. (2017), analisando indivíduos de quatro populações amazônicas da espécie Bunocephalus coracoideus, por meio de análises citogenéticas e moleculares, encontraram que cada população pode representar uma unidade significativa evolutiva (ESU). Os marcadores citogenéticos número diploide e fórmula cromossômica foram distintos, bem como o número e localização dos sítios de DNA ribossomal entre as ESUs. Uma destas populações se destacou por apresentar vários citótipos, indicando um polimorfismo, provavelmente devido a rearranjos cromossômicos e não- disjunções meióticas. Sendo assim, a diversidade citogenética observada em grupos de peixes até o momento justifica as pesquisas envolvendo estes animais. Uma outra técnica que vem sendo muito utilizada na citogenética é a hibridização in situ fluorescente (FISH), que consiste na incorporação de uma sonda, composta por sequências específicas de nucleotídeos marcados com fluorescência, aos cromossomos mitóticos em análise. Várias sondas são utilizadas, e as de uso mais comum em peixes são as sondas de DNA repetitivo (Martins et al. 2010; Guerra 2012). DNAs repetitivos são sequências de DNA de tamanhos variados, organizadas em tandem, dispersas ou repetidas milhares de vezes no genoma, podendo ter ou não função codificadora. Estudos acerca dessas sequências têm sido de grande relevância para a compreensão da evolução genômica de determinadas espécies, pois elas nos remetem a dados mais consistentes sobre a diversificação de cromossomos sexuais, origem de cromossomos

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Bs, bem como na detecção de homeologias cromossômicas existentes entre espécies relacionadas (Griffiths et al. 2008; Vicari et al. 2010; Blanco et al. 2013; Dulz et al. 2019). As famílias multigênicas são sequências de DNA repetitivo que codificam moléculas importantes como os RNAs ribossômicos (Martins et al. 2004). Os DNAs ribossômicos 18S e 5S, mapeados por hibridização in situ fluorescente, têm sido amplamente usados como marcadores citogenéticos em peixes neotropicais, por contribuírem na elucidação de problemáticas taxonômicas, biogeográficas e filogenéticas (Bellafronte et al. 2005; Teixeira et al. 2009; Vicari et al. 2010; Ferreira et al. 2016). Quanto aos elementos transponíveis, sua classificação baseia-se nas características estruturais e moleculares de suas sequências, podendo ser agrupados em classes em que o modo de transposição é o critério utilizado para o agrupamento. Os elementos da classe I (retrotransposons) utilizam a transcriptase reversa para se transporem via um intermediário de RNA, sempre originando uma nova cópia (mecanismo replicativo) e os elementos da classe II (transposons) se transpõem diretamente de DNA a DNA usando a enzima transposase por eles codificada (Finnegan 1985). Ainda, o mecanismo de replicação via DNA pode ser conservativo ou replicativo. No primeiro, o elemento transponível é removido de um local e inserido em outro, enquanto que no segundo o transposon é duplicado antes de ser transportado para outro sítio (Burt e Trivers 2006). Os retrotransposons podem ser classificados de acordo com a presença ou ausência de longas repetições terminais (LTRs, do inglês long terminal repeats). As LTRs são necessárias para a transcrição e integração do cDNA depois da transcrição reversa, sendo encontrados nestas sequências, domínios para proteinase, integrase, transcriptase reversa e RNAse. Já, os retrotransposons não-LTRs utilizam promotores internos para a sua transposição e codificam uma transcriptase reversa e uma RNAse, sendo também conhecidos como LINES (long interspersed elements) ou retrotransposons TP (target-primed). Além disso, dentro da categoria dos não-LTRs, existem também os SINES (short interspersed nucleotide elements), que não codificam a maquinaria enzimática necessária para a transposição, mas obtém esta provavelmente por meio dos elementos LINES (Bohne et al. 2008). Os transposons também podem ser subdivididos em duas subclasses. Na subclasse I estão agrupados os elementos que possuem a tríade conservada DDE (D=ácido aspártico; E=ácido glutâmico) na transposase, que é responsável pela excisão do elemento do seu sítio original e sua integração em um novo sítio, mecanismo conhecido como “corta e cola”. Os da subclasse II não apresentam a transposase DDE, sendo sequências alternativas utilizadas para este fim (Bohne et al. 2008).

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A utilização de elementos transponíveis pode proporcionar uma melhor visão do genoma das espécies e de como este genoma está organizado. Ainda, verificar se esta espécie está sob estresse, uma vez que, como já se tem verificado estes elementos podem aumentar em número de sequências frente a condições de estresses seja intrínseco, climático ou ambiental (Ribeiro et al. 2017; Ferreira 2019).

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Avaliar alterações citogenéticas em espécies de Cichla, que possam sugerir a presença de híbridos interespecíficos.

Objetivos Específicos

 Caracterizar o cariótipo (número diploide, morfologia cromossômica, distribuição da heterocromatina C-positiva e Ag-RONs) de espécies de Cichla;  Realizar o mapeamento cromossômico de sequências repetitivas de DNA (DNAr 5S e 18S, telômero), como marcadores cromossômicos;  Localizar os elementos transponíveis do tipo Rex em espécies de Cichla e nos possíveis híbridos;  Investigar a ocorrência de indivíduos híbridos em Cichla, onde suas espécies ocorrem em simpatria.

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MATERIAL E MÉTODOS

Material

Neste estudo, 50 indivíduos de Cichla foram citogeneticamente analisados (Tabela 2). Na Figura 1 é apresentada a distribuição das espécies estudadas no presente trabalho e, na Figura 2, os locais de coleta: rio Negro (Lago Catalão e Anavilhanas), rio Uatumã (UHE de Balbina), rio Tapajós e rio Araguaia. Na Figura 3 estão os representantes das espécies analisadas. Os peixes coletados foram transportados vivos até o laboratório de campo ou ao de Genética Animal do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA), Manaus, e mantidos em aquários aerados até serem processados. Após o processamento, os animais foram numerados, registrados, fixados em formol 10% durante 24h e acondicionados, posteriormente, em recipientes contendo álcool 70%. Todas as espécies terão vouchers depositados na Coleção de Peixes do INPA. Este trabalho seguiu os padrões éticos para pesquisa animal de acordo com o Comitê de Ética para Uso Animal do INPA, sob o protocolo número 01280.000338/2018-62. A autorização para a coleta dos indivíduos foi concedida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), de acordo com a licença SISBIO número nº 28095-1. A classificação dos peixes foi feita pelo Dr. Efrem Ferreira, que considera híbridos, os indivíduos que apresentam características de mais de uma espécie e quando a linha lateral é contínua de um lado. O híbrido C (Figura 3), por exemplo, apresentou manchas na região pós occipital e barras verticais oceladas contornadas de amarelo se assemelhando mais a C. vazzoleri. Os híbridos A e B (Figura 3) apresentaram manchas brancas de forma “desorganizada” se assemelhando a C. monoculus e a C. temensis, respectivamente.

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Tabela 2. Espécies analisadas, número de indivíduos e locais de coleta. Espécies Número de Local de Coleta Coordenadas Voucher Indivíduos C. kelberi 4♂ 3♀ Rio Araguaia - São Félix – 11°39'03.9"S50°52'59.4 "W MZUSP125273 MT C. monoculus 5♀ Anavilhanas (Médio Rio 2°33'28.4"S 60°46'29.7"W INPA-ICT059047 Negro) - AM C. monoculus 3♀ UHE Balbina (Rio 1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059044 Uatumã) - AM C. monoculus 1♀ Rio Tapajós – Santarém - 2°24'53.0"S 54°46'48.3"W INPA-ICT059045 PR C. monoculus 4♂ 1♀ Lago Catalão (Rio Negro) - 3°10'30.8"S 59°56'30.3"W INPA-ICT059046 AM C. pinima 7♂ 6♀ Rio Tapajós – Santarém - 24°21'16.4"S54°70'23.16"W INPA-ICT059045 PR C. piquiti 2♂ 2♀ Rio Araguaia- São Félix- 11°38'01.7"S50°40'11.3"W MZUSP125272 MT C. temensis 2♂ 2♀ UHE de Balbina (Rio 1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059043 Uatumã) - AM C. vazzoleri 2♂ 3♀ UHE de Balbina (Lago 1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059048 Uatumã) - AM Híbrido 3♂ UHE de Balbina (Lago 1°55'02.2"S 59°28'23.7"W INPA-ICT059047 Uatumã) - AM

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Figura 1. Mapa da distribuição das espécies de Cichla, de acordo com Kullander e Ferreira 2006 estudadas no presente estudo.

Figura 2. Mapa evidenciando os pontos de coleta das espécies de Cichla analisadas no presente estudo.

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Figura 3. Espécies de Cichla e indivíduos considerados morfologicamente híbridos (A, B e C), analisados no presente trabalho.

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Métodos - Citogenética Clássica

Obtenção dos Cromossomos Mitóticos

Para se obter um maior número de células em metáfase, foi utilizada a técnica para indução de mitoses, descrita por Oliveira et al. (1988), na qual uma solução de fermento biológico foi aplicada nos espécimes. A solução de fermento biológico foi preparada com 0,3 g de fermento biológico comercial, 0,3 g de açúcar e 10 mL de água destilada, sendo esta mantida em estufa (37 °C) por um período de 15-20 minutos, e posteriormente injetada na região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1mL para cada 100 g de peso do animal. Os peixes submetidos ao tratamento com solução de fermento biológico foram colocados em aquários bem aerados por 24 horas. Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizado o protocolo de Gold et al. (1990).Após o período de estimulação, o animal foi eutanasiado com eugenol na proporção de 5mL para 12L de água. Foram retiradas porções do rim e transferidas para uma cubeta de vidro contendo de 2 a 10 mL de meio RPMI. Em seguida, o rim foi dissociado com uma seringa hipodérmica de vidro. Foram adicionadas de 3 a 4 gotas de colchicina 0,0125%, ressuspendendo com movimentos leves de aspiração e expiração, para a obtenção de uma solução celular homogênea e foi deixada em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a solução celular foi transferida para um tubo do tipo falcon, ressuspendida e centrifugada por 10 minutos a 900 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados à solução 10mL de solução hipotônica de KCl 0,075M, a qual foi incubada em estufa a 37 ºC por 40 minutos. Terminado o período de hipotonização, foi adicionado 1mL de fixador Carnoy (3 partes de metanol para 1 parte de ácido acético glacial), a solução foi homogeneizada e centrifugada por 10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi diluído em 8mL de fixador Carnoy, homogeneizado e centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. Este passo se repetiu por mais 2 vezes. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 1,5mL de fixador. A suspensão celular foi homogeneizada e acondicionada em tubos do tipo Ependorff em freezer a -20 °C.

Análise Cromossômica

Para a análise cromossômica foram gotejadas de duas a três gotas da suspensão celular sobre uma lâmina de vidro limpa e coberta por uma lâmina d’água a uma temperatura de 60 ºC. Logo em seguida a lâmina foi corada com Giemsa 10% em tampão fosfato (pH=6,8) por 10 minutos.

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Detecção da Heterocromatina Constitutiva

Para determinar o padrão de heterocromatina constitutiva (banda C) foi utilizada a metodologia descrita por Sumner (1972), que consistiu em tratar as lâminas, contendo a suspensão celular, em ácido clorídrico (HCl) 0,2N, a 37 ºC, durante 2 minutos e depois lavada com água destilada. Em seguida, a lâmina foi incubada em solução de hidróxido de Bário

(Ba(OH)2.8H2O) a 5%, recém preparada e filtrada, a 42 ºC, durante 50 segundos e para interromper a ação do hidróxido de bário, a lâmina foi lavada brevemente em ácido clorídrico 0,2N e depois lavada com água destilada. Em seguida, a lâmina foi incubada em solução salina 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,06M em pH 6,8), a 60 ºC, durante 40 minutos e foi lavada com água destilada. Depois de seca, a lâmina foi corada com Iodeto de ® propídeo (1µL de iodeto + 20µL de Vectashield) e coberta com uma lamínula para espalhar o iodeto (Lui et al. 2012).

Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo

Para determinar o padrão de distribuição das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi utilizado o protocolo de Howell e Black (1980), que consistiu em colocar sobre uma lâmina, contendo a preparação cromossômica, três gotas de solução de gelatina a 2% (acrescida de ácido fórmico na proporção de 1mL para cada 100mL de solução); sobre cada gota de gelatina foram colocadas duas gotas de solução aquosa de nitrato de prata a 50%. As soluções foram misturadas delicadamente e cobertas com uma lamínula. As lâminas foram incubadas em câmara úmida a 60 °C por 5 a 7 minutos ou o tempo necessário para que a lâmina adquirisse uma coloração amarelada ou marrom escura. A lamínula foi retirada com um jato de água destilada e a lâmina lavada e deixada secar ao ar.

Métodos - Citogenética Molecular

Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada a partir do tecido muscular de Cichla kelberi, monoculus, C. pinima, C. piquiti, C. temensis, C. vazzoleri e dos indivíduos híbridos, utilizando o protocolo de extração de DNA – Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Aproximadamente 20mg de tecido muscular foi macerado, com auxílio de tesoura, dentro de um tubo estéril de 1,5mL do tipo Ependorff. Foram adicionados 300μL de EDTA/Nuclei Lysis Solution (este mix foi preparado usando 60μL de EDTA. + 250μL de Nuclei Lysis Solution e colocado em geladeira por 10 minutos, até ficar turvo) e 10μL de Proteinase K (10ng/μL). O conteúdo do tubo foi homogeneizado e deixado a 55 ºC por cerca 17 de 2 horas ou até o tecido ser totalmente dissolvido. Em seguida, foram adicionados 5μL de RNAse, misturado cuidadosamente, por inversão, por alguns minutos e deixado em estufa a 37 ºC durante 30 minutos (este passo é opcional). Em seguida, foram adicionados 100μL de Protein Precipitation Solution, vortexado até a solução ficar espumante (aproximadamente 20 segundos) e colocado em freezer por 5 minutos. Posteriormente, o tubo foi colocado em centrifuga a 13000 rpm durante 8 minutos, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e o pellet descartado. Então foram adicionados 300μL de isopropanol gelado, homogeneizado por inversão e centrifugado a 13000 rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado, com o auxílio de uma pipeta, e foram adicionados 300μL de etanol 70% gelado e novamente centrifugado a 13000 rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado e o pellet foi colocado para secar a 37 ºC por 15 minutos. Por fim, foram adicionados 50μL de DNA Rehydrate Solution e armazenado em freezer. Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com GelRed Acid Gel Stain Biotium (1:500). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency). As quantificações foram feitas em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare).

Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction)

A amplificação do DNAr 18S e 5S dos indivíduos amostrados foi realizada a partir do DNA celular total, previamente isolado, sendo a amplificação realizada através da técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction, Saiki et al. 1988), utilizando os primers 18S F (5’ -CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT-3’) e R (5’ -CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross et al. 2010) e os primers 5S F (5’ -TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’) e R (5’ -CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’) (Martins e Galetti Jr. 1999). Elementos transponíveis já identificados e caracterizados como conservados em outras espécies de peixes, tais como os retroelementos do tipo Rex foram estudados. Primers foram testados para amplificar os elementos transponíveis Rex3 (RTX3-F3 5’CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG e RTX3-R3 5’TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT) (Volff et al. 1999; 2000; 2001a), Rex6 (Rex6-Medf1 5’TAA AGC ATA CAT GGA GCG CCAC e Rex6-Medf2 5’AGG AAC ATG TGT GCA GAA TATG) (Volff et al. 2001b). Estes primers já foram

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Marcação das sondas

As Sondas foram marcadas seguindo o método de Nick Translation, utilizando o Kit Dig-NickTM Translation Mix para a marcação das sondas em vermelho e o Kit Biotin- NickTM Translation Mix para a marcação das sondas em verde. Foram colocados em um tubo do tipo eppendorf de 0,2 ml: 5μL de DNA obtido na PCR, 4μL de mix do kit e 11μL de água destilada (volumes para 8 lâminas com DNA a 300ng). Foi incubada em termociclador a 16 ºC por 45 minutos, 65 ºC por 10 minutos e posteriormente a sonda marcada foi armazenada em freezer -20 °C.

FISH - Hibridização in situ fluorescente

Para a detecção das sondas foi realizada a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) descrita por Pinkel et al. (1986), com estringência de 77%, com algumas modificações.

Preparação das lâminas:

As lâminas contendo a suspensão celular foram lavadas durante 5 minutos em PBS 1x, em temperatura ambiente e posteriormente desidratadas em série alcoólica de etanol gelado (70%, 85% e 100%) por 5 minutos cada.

Fixação:

As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1x/50nM de cloreto de magnésio durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas durante 5 minutos em PBS 1x em temperatura ambiente, novamente desidratada em série alcoólica de etanol gelado (70%, 85% e 100%) por 5 minutos cada e deixadas secar ao ar.

Pré-hibridização:

O material contido na lâmina foi desnaturado em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5 minutos, desidratado em série alcoólica de etanol gelado (70%, 85% e 100%) por 5 minutos cada e deixadas secar ao ar.

Solução de hibridização:

Em um tubo do tipo eppendorf foram adicionados 50μL de formamida 100%, 20μL de sulfato de dextrano 50%, 10μL de 20xSSC, 5μL de sonda 1 Roche, 5μL de sonda 2 Roche e 10μL de 19

água destilada (volume total para 2 lâminas). A sonda foi desnaturada em banho seco a 99 °C por 10 minutos e transferida imediatamente ao gelo.

Hibridização:

Sobre uma lamínula limpa foram colocados 40μL da solução de hibridização e inverteu-se a lâmina seca sobre a lamínula e deixadas com o material voltado para baixo em câmara úmida a 37 ºC overnight (14 horas).

Lavagens:

Após o período de hibridização, as lâminas foram lavadas em formamida 15 % a 42ºC durante 10minutos e posteriormente lavadas em solução de Tween 0,5 % durante 5 minutos em temperatura ambiente.

Detecção do Sinal:

Para a detecção do sinal as lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos e lavadas duas vezes (5 minutos cada) em solução de Tween 0,5 % em temperatura ambiente.

Amplificação do Sinal:

Sobre uma lamínula foram colocados 100μL do mix de amplificação (20µL de anti- digoxigenina e 100µL de estreptavidina/NFDM (2 μL de estreptavidina + 998 μL de NFDM). Inverteu-se a lâmina sobre a lamínula e incubadas em câmara úmida e escura a 37 ºC durante 60 minutos. Posteriormente, as lâminas foram lavadas 3 vezes (5 minutos cada) em solução de Tween 0,5% em temperatura ambiente e desidratadas em série alcoólica de etanol gelado (70%, 85% e 100%), por 5 minutos cada e deixadas secar ao ar.

Montagem das lâminas:

Sobre cada lâmina foi colocado 20μL de uma solução contendo 1μL de DAPI diluído em 20μL de Vectashield®, coberta com uma lamínula e mantida em recipiente escuro.

Análise Cariotípica

As preparações convencionais (Giemsa, banda C e Ag-RONs) foram analisadas em microscópio óptico. As contagens cromossômicas e observações mais detalhadas foram feitas com a objetiva de imersão, num aumento de 1.000 vezes. As lâminas de FISH e fluorocromos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência sob filtro apropriado. As melhores metáfases foram capturadas, utilizando sistema de captura de imagens DPController e processadas pelo programa DPManager. Posteriormente, os cariótipos foram montados, utilizando o programa 20

Adobe Photoshop CS6, onde os cromossomos metafásicos mitóticos foram recortados, emparelhados, medidos no programa ImageJ e colocados em ordem decrescente de tamanho, separados por grupos. A morfologia dos cromossomos foi determinada de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964) e classificados com base no índice de relação de braços (RB= comprimento do braço maior/comprimento do braço menor), podendo ser metacêntricos (RB= 1,0-1,7), submetacêntricos (RB= 1,71-3,0), subtelocêntricos (RB= 3,01-7,0) e acrocêntricos (RB= 7,00). Na determinação do número de braços (NF) foram considerados os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e os acrocêntricos como tendo apenas um braço.

RESULTADOS

As seis espécies analisadas no presente trabalho: C. kelberi, C. monoculus, C. pinima, C. piquiti, C. temensis e C. vazzoleri apresentaram número diploide igual a 48 cromossomos acrocêntricos e número fundamental (NF) igual a 48. A região organizadora do nucléolo (Ag- RON), bem como o DNAr 18S, esteve presente no segundo par em posição terminal no braço longo de todas as espécies (Figuras 4 e 5). Já, a localização do sítio de DNAr 5S localizou-se, intersticialmente em posição proximal no par 6 de quatro espécies (C. kelberi, C. pinima, C. piquiti e C. vazzoleri) e quase terminal no par 4 em duas (C. monoculus e C. temensis) (Figura 5). Quanto ao padrão de banda C, as seis espécies apresentaram blocos heterocromáticos centroméricos em todos os cromossomos e a região organizadora do nucléolo foi banda C positiva. Entretanto, alguns blocos foram espécie-específicos: blocos terminais foram observados no braço longo dos pares 1, 3 e 4 de C. kelberi; par 3 de C. pinima e C. temensis; pares 1 e 3 de C. piquiti; e nos pares 3 e 6 de C. vazzoleri (Figura 4). Já, C. monoculus, que foi coletada em quatro locais apresentou uma variabilidade quanto ao padrão de banda C, onde os indivíduos coletados na UHE de Balbina também apresentaram blocos terminais no braço longo dos pares 1, 6, 9, 12, 15, 19; os indivíduos do Catalão parecem ter blocos terminais em todos os pares, mas os mais conspícuos foram os dos pares 1, 3, 5, 6, 7, 8, 10 12; o mesmo ocorreu nos indivíduos coletados em Anavilhanas, mas nestes os blocos foram mais conspícuos em praticamente todos os cromossomos e ainda apresentaram marcações intersticiais nos pares 1, 3 e 6. Os indivíduos do rio Tapajós tiveram os blocos terminais nos pares 1, 3, 5, 11, 14,15 e intersticial nos pares 14 e 15 (Figura 6).

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Dentre os 50 indivíduos analisados, 3 foram considerados morfologicamente híbridos. Esses híbridos apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos e NF=48, RON e DNAr 18S no segundo par em posição terminal no braço longo (Figuras 7 e 8). A banda C mostrou-se presente na região centromérica de todos os cromossomos nos três indivíduos, região organizadora do nucléolo foi banda C positiva e o primeiro par dos três indivíduos tem um bloco intersticial. Ainda, o indivíduo A (Figura 7b) também apresentou blocos terminais nos pares 1 e 5; o indivíduo B (Figura 7e) tem blocos terminais na maioria dos cromossomos e intersticial nos pares 3 e 6; o indivíduo C (Figura 7h) terminal nos pares 3, 10 e 11. A localização do DNAr 5S foi detectada intersticialmente em um homólogo do par 4 e em um homólogo do par 6 em dois indivíduos híbridos (A e C). O indivíduo B teve a marcação do DNAr 5S em ambos homólogos do par 4 (Figura 8). A hibridização com sondas teloméricas mostrou, como esperado, marcações nas porções terminais de ambos os braços de todos os indivíduos analisados (Figura 9). Com relação à localização cromossômica dos retrotransposons Rex3 e Rex6, estes apresentaram um padrão de distribuição predominantemente disperso, tanto em regiões de heterocromatina como de eucromatina, sendo que alguns pares cromossômicos apresentaram um maior acúmulo dessas sequências nas regiões heterocromáticas (Figura 10). Entretanto, não visualizamos qualquer diferença mais evidente entre as duas espécies (C. temensis e C. vazzoleri) e o indivíduo considerado híbrido.

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Figura 4. Cariótipo das espécies analisadas em coloração convencional com Giemsa, bandeamento C e Ag-RON: Cichla kelberi (a, b, c); C. pinima (d, e, f); C. piquiti (g, h, i); C. temensis (j, k, l); C. vazzoleri (m, n, o).

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Figura 5. Cariótipos das espécies analisadas com marcadores cromossômicos moleculares. “Double” FISH com sondas de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde). Cichla monoculus (a); Cichla kelberi (b); C. pinima (c); C. piquiti (d); C. temensis (e); C. vazzoleri (f).

Figura 6. Cariótipo da espécie Cichla monoculus de diferentes localidades em coloração convencional com Giemsa, bandeamento C. (a) UHE Balbina (Rio Uatumã); (b) Lago Catalão (Rio Negro); (c) Anavilhanas (Médio Rio Negro); (d) Santarém (Rio Tapajós).

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Figura 7. Cariótipo dos indivíduos híbridos A, B e C (conforme Figura 3) respectivamente, em coloração convencional com Giemsa (a, d, g); bandeamento C (b, e, h) e Ag-RON (c, f, i).

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Figura 8. Cariótipos dos indivíduos híbridos A, B e C (conforme Figura 3) respectivamente com marcadores cromossômicos moleculares. “Double” FISH com sondas de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde).

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Figura 9. Metáfases evidenciando o padrão de hibridização com sondas teloméricas (vermelho). Cichla monoculus (a); Cichla kelberi (b); C. pinima (c); C. piquiti (d); C. temensis (e); C. vazzoleri (f); indivíduo híbrido C (conforme Figura 3) (g).

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Figura 10. Cariótipos mostrando a distribuição dos elementos retrotransponíveis Rex3 e Rex6. (a e b) Cichla temensis; (c e d) Cichla vazzoleri; (e e f) Indivíduo híbrido C (conforme Figura 3).

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DISCUSSÃO

Para Cichlidae, o número diploide igual a 48 cromossomos acrocêntricos é considerado um caráter ancestral (Thompson 1979). A evolução cromossômica dessa família é considerada conservada, do ponto de vista da macroestrutura cromossômica (Feldberg et al. 2003). Cichla, ocupa uma posição basal para os ciclídeos neotropicais (Smith et al. 2008), e tem todas as espécies, até agora cariotipadas, com 2n=48 cromossomos acrocêntricos (Alves- Brinn et al. 2004; Schneider et al. 2012; Mourão et al. 2013), sendo que, C. pinima e C. vazzoleri tiveram seus cariótipos descritos pela primeira vez neste trabalho. O mapeamento das sequências teloméricas apresentou-se em porções terminais de ambos os braços para todas as espécies e híbridos analisados e nenhuma sequência telomérica insterticial (ITS) foi encontrada. Entretanto, a medida que mais espécies da família são estudadas e técnicas mais acuradas são aplicadas, encontramos fórmulas cariotípicas diversas e mudanças na posição/localização de vários marcadores (Schneider et al. 2013; Poletto et al. 2010; Gross et al. 2009), sugerindo, que nesse grupo, os principais rearranjos cromossômicos ocorridos foram os não robertsonianos. Interessante que em várias espécies dos clados derivados de Cichlinae foram observadas ITSs, como em Astronotus ocellatus e Hypselecara temporalis (Schneider et al. 2013) e os autores sugerem que inversões devem ter ocorrido, envolvendo a região telomérica. Alves-Brinn et al. (2004), com base em dados cariotípicos, Andrade et al. (2001), com base em dados mitocondriais e Teixeira e Oliveira (2005), com base em padrões eletroforéticos da esterase, sugeriram a presença de híbridos entre as espécies C. monoculus e C. temensis, em ambientes onde estas espécies co-existiam, como nas bacias dos rios Uatumã, Tapajós, Moju, Tocantins e Guamá. Entretanto, nesta época apenas quatro espécies de Cichla eram descritas (C. monoculus, C. ocellaris, C. orinocensis e C. temensis). Em um trabalho inédito de Kullander e Ferreira (2006), foram descritas novas espécies para este gênero, que hoje compreende 15 espécies. Nos indivíduos de Cichla analisados por Alves-Brinn et al. (2004), os autores encontraram a RON em pares diferentes, ou seja em C. monoculus no 2º par do complemento e em C. temensis no 3º par, enquanto em alguns indivíduos “intermediários” morfologicamente, a RON foi observada no 2º e 3º par do complemento, que foram considerados híbridos. Entretanto, Kullander e Ferreira (2006) verificaram que alguns destes indivíduos seriam C. vazzoleri. Por outro lado, no presente estudo tal diferença não foi 29 detectada, e a RON foi considerada estar no 2º par, terminal, no braço longo para todos os indivíduos de todas as espécies e dos híbridos, sendo esta região confirmada pelo mapeamento do gene DNAr 18S. Em um trabalho inédito, Schneider et al. (2012) analisaram 13 espécies de ciclíneos e encontraram RON simples para 12 e múltipla para uma espécie, sendo que todas foram confirmadas pela sonda DNAr 18S, exceto Pterophyllum leopoldi que além de confirmar a RON, marcou todos os outros pares. Quanto ao DNAr 5S, Schneider et al. (op. cit.) encontraram para 12 da 13 espécies analisadas apenas um par com sítios 5S e uma com dois pares. Porém, em Cichla o mapeamento do DNAr 5S vaiou estre as espécies e encontramos dois padrões: no 4º par (C. monoculus e C. temensis) e no 6º par (C. kelberi, C. pinima, C. piquiti e C. vazzoleri) e em três indivíduos, considerados híbridos morfologicamente, dois tiveram a marcação em um homólogo do 4º par e e em um homólogo do 6º par. O outro teve a marcação em ambos homólogos do par 4 Visto que estes híbridos foram capturados na UHE de Balbina, onde ocorrem C. monoculus, C. temensis e C. vazzoleri (Kullander e Ferreira 2006), acreditamos que o híbrido A (figura 3) possa ser o resultado do cruzamento entre C. monoculus X C. vazzoleri ou C. temensis X C. vazzoleri. O híbrido B (figura 3) pode ser do cruzamento entre C. monoculus X C. temensis e o híbrido C (figura 3) do cruzamento de C. monoculus X C. vazzoleri ou C. temensis X C. vazzoleri. Ainda, não podemos descartar a introgressão (que pode ser definida como o movimento do DNA de uma espécie para o pool genético de outra espécie, por retrocruzamentos repetidos de indivíduos híbridos com uma ou ambas as espécies parentais) entre os indivíduos híbridos e os parentais, pelo fato de que nos três indivíduos híbridos foi observada gônada (masculina). Introgressão já foi verificada em cruzamentos intergenéricos e intragenéricos na família Cichlidae, como por exemplo em Tilapia x Oreochromis e Cichlasoma nigrofascatum x C. cyanoguttatum e os híbridos de alguns cruzamentos assemelham-se mais a um dos parentais e outros são intermediários (Kornfield 1984). Willis et al. (2012), utilizando dados multilocus, verificaram que a introgressão é um fenômeno comum em espécies de Cichla. Geralmente, a hibridização introgressiva é esperada ocorrer em habitats modificados, mas os autores verificaram que a maioria dos casos foi encontrada em habitats naturais não perturbados, sugerindo que a introgressão é uma parte natural da evolução de muitas espécies tropicais e esta pode aumentar a diversidade genética. Um ponto importante a ser considerado no estudo de híbridos é a presença de marcadores específicos. Um exemplo disto pode ser verificado no trabalho de Ribeiro et al.

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(2017), onde os autores diferenciaram os híbridos resultantes do cruzamento de Colossoma macropomum e Piaractus mesopotamicus dos híbridos resultantes do cruzamento entre C. macropomum e P. brachypomus pelo mapeamento dos sítios de DNAr 18S. Já, no presente estudo, o mapeamento dos sítios de DNAr 18S não foi considerado um bom marcador para identificar os peixes estudados, pois o padrão de localização observado foi o mesmo para todos indivíduos. Por outro lado, o mapeamento dos sítios de DNAr 5S foi útil para sugerir que as três espécies que ocorrem em Balbina podem estar envolvidas na formação dos híbridos. O gene ribossômico 5S é um importante marcador citotaxonômico e evolutivo, pois auxilia na compreensão da diversidade cromossômica dos organismos (Bellafronte et al. 2005; Teixeira et al. 2009; Vicari et al. 2010). Em estudo realizado por Ferreira et al. (2016), dados cromossômicos com mapeamento de DNAr 5S revelaram um sistema de cromossomos sexuais múltiplo em uma população de Bunocephalus coracoideus e inédito em Silurifores

(X1X1X2X2/X1Y1X2Y2). As sequências repetitivas de DNA ribossomal 5S e 18S são as mais estudadas, e vêm ganhando destaque principalmente em estudos sobre as relações evolutivas entre as espécies, na caracterização de populações e na estrutura do genoma (Martins et al. 2004, Schneider et al. 2012; Terencio et al. 2012). Quanto à heterocromatina constitutiva, o padrão de distribuição, muitas vezes, pode ser utilizado como um marcador espécie-específico ou populacional (Feldberg et al. 2003; Vicari et al. 2006; Benzaquem et al. 2008; Perazzo et al. 2011). No caso de Cichla, o padrão da heterocromatina é muito similar entre cinco espécies. Entretanto, C. monoculus, da qual analisamos indivíduos de quatro localidades, encontramos quatro padrões de heterocromatina constitutiva (Figura 5). C. monoculus é uma das espécies com a mais ampla distribuição pela Amazônia (Kullander e Ferreira 2006) e também a mais utilizada para introduções em represas de todo o Brasil (Johnson et al. 2011; Santos et al. 2016; Diamante et al. 2017). Essa variabilidade intraespecífica no padrão heterocromático desta espécie pode ser o resultado de adaptação e/ou respostas epigenômicas da cromatina a mudanças no ambiente. A heterocromatina é reconhecida por desempenhar atividades importantes, como auxiliar na segregação cromossômica, organização nuclear e regulação da expressão gênica, associada a respostas às mudanças no ambiente, podendo afetar também o processo de recombinação gênica (Grewal e Jia 2007; Varriale et al. 2008; Bühler 2009).

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Interessante foi que o padrão heterocromático dos três indivíduos híbridos foi muito similar entre si e muito mais próximo do padrão descrito para C. monoculus do rio Negro (Anavilhanas), com alguns blocos intersticiais. Poderia ser uma heterocromatinização? Tal variabilidade na heterocromatina também pode ser explicada pela presença de fatores estressantes, como mudanças ambientais ou processos de hibridação (Richards et al. 2010), o que explicaria as diferenças na distribuição da heterocromatina, encontradas em C. monoculus e nos indivíduos híbridos. Willis et al. (2012) inferem também, que vários exemplos de hibridização são descritos a partir de habitats modificados por influência humana, o que normalmente altera o comportamento dos organismos que ali vivem. Considerando o represamento do Rio Uatumã para formação da UHE de Balbina, que alterou o ambiente natural de pelo menos três espécies de Cichla, e a variabilidade no padrão de cores entre suas espécies, talvez associada a algum comportamento, a escolha de parceiros para esses predadores visuais pode ter sido dificultada, levando assim a uma facilitação para formação de híbridos. Não só as espécies de Cichla, mas todos os peixes, que permaneceram na área após os impactos da instalação da UHE de Balbina, devem apresentar diferenças significativas nas suas características, relacionadas à ocupação de dois ambientes com características ecológicas e dinâmicas muito diferentes (reservatório e rio) (Willis et al. 2012). Em se tratando dos peixes, uma característica importante do seu genoma é a diversidade de classes de elementos transponíveis (ETs), tanto transposons como retrotransposons (Volff et al. 2003). Diferentes classes de ETs foram mapeadas no genoma dos ciclídeos neotropicais, tais como transposon Tc1 que foi mapeado em Cichla kelberi, evidenciando blocos conspícuos em regiões centroméricas e marcações dispersas nos cromossomos (Teixeira et al. 2009). Três novas classes de retroelementos foram descritas: RCk que apresenta marcações dispersas nos cromossomos de C. kelberi; AoRex3 e AoLINE que são agrupados na heterocromatina centromérica de todos os cromossomos de Astronotus ocellatus (Mazzuchelli e Martins 2009), por exemplo. O mapeamento dos retroelementos Rex também tem sido realizado neste grupo, visando compreender a organização genômica e os resultados têm mostrado um padrão de distribuição compartimentalizado na heterocromatina pericentromérica, entretanto, sinais dispersos e agrupados em regiões eucromáticas também já foram observados (Gross et al. 2009; Mazzuchelli e Martins 2009; Teixeira et al. 2009; Valente et al. 2011).

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De forma geral, os elementos transponíveis acumulam-se principalmente em regiões heterocromáticas do genoma em diversos grupos, incluindo peixes (Fischer et al. 2004; Mazzuchelli e Martins 2009; Gross et al. 2009; Valente et al. 2011; Schneider et al. 2013). O acúmulo dessas sequências, preferencialmente em regiões heterocromáticas, tem sido relatada para muitos organismos (Dimitri e Junakovic 1999; Bartolomé et al. 2002; Da Silva et al. 2002), sugerindo que a heterocromatina pode atuar também como um refúgio de ETs funcionais ou degenerados. A distribuição de Rex no genoma dos ciclídeos sugere que estes retroelementos estão sob ação de mecanismos evolutivos que tendem a acumulá-los em regiões cromossômicas específicas (principalmente em heterocromatinas) (Schneider et al. 2013). No entanto, nossos dados mostram que os ETs do tipo Rex (Rex3 e Rex6) se apresentam dispersos nos cromossomos de C. temensis, C. vazzoleri e em um dos híbridos, diferente dos dados encontrados por Schneider et al. (2013) para C. monoculus do lago Catalão, onde estes elementos se apresentaram em blocos mais compartimentalizados. Esse acúmulo de ETs em regiões específicas do genoma de ciclídeos foi evidenciada e associada a possíveis eventos de alterações cromossômicas (Teixeira et al. 2009; Mazzucheli e Martins 2009; Gross et al. 2009; Ferreira et al. 2010; Valente et al. 2011). Por outro lado, o padrão de distribuição disperso, como encontrado no presente estudo, pode ser devido ao fato desses elementos transponíveis possuírem funções estruturais e regulatórias, que justifiquem sua dispersão em ambos os tipos de cromatina. A ação dessas sequências tem grande importância em funções regulatórias do genoma, no que diz respeito ao direcionamento da expressão gênica, além de terem papel importante na adaptação do hospedeiro a mudanças ambientais (Brookfield 2005; Slotkin e Martienssen 2007; Carareto et al. 2015; Rey et al. 2016). Esta hipótese foi corroborada no trabalho realizado por Ribeiro et al. (2017), no qual observaram um aumento na quantidade desses retrotransposons no híbrido tambacu, provavelmente devido à necessidade de ajustes nos processos de divisão celular. Junto a isso, um dos quesitos aceitos para explicar a origem e dispersão de elementos móveis está na hibridação introgressiva, envolvendo espécies aparentadas (Capy 1998; Rouzic e Capy 2005), o que explicaria o fato dos elementos do tipo Rex estarem dispersos no híbrido analisado no presente trabalho. Em uma revisão, Cioffi e Bertollo (2012) afirmam que essas sequências vêm sendo encontradas, preferencialmente em regiões heterocromáticas, em diversos grupos de peixes, nos quais, essas sequências teriam um papel estrutural. No entanto, no presente trabalho, essas

33 sequências foram encontradas tanto em regiões heterocromáticas quanto em regiões eucromáticas, o que nos leva a crer, que por estarem também em regiões de eucromatina, as sequências do tipo Rex encontram-se ativas no genoma das espécies de Cichla aqui estudadas. Sendo assim, a atividade dessas sequências pode contribuir para a evolução do genoma deste gênero, servindo como fonte de variabilidade genética, ou ainda podem estar relacionadas com processos de adaptação a agentes estressores, gerando diferentes padrões de expressão gênica. Junto a isso, não é possível afirmar que essas sequências estejam relacionadas a ajustes de expressão gênica, ou ainda processos de disgenesia hibrida, uma vez que o padrão encontrado nos indivíduos analisados foi muito similar. Para elucidar essa questão, estudos aprofundados se fazem necessários, afim de gerar mais informações a respeito do comportamente desses ETs no genoma, assim como suas possíveis contribuições ao genoma das espécies de Cichla.

CONCLUSÕES

As espécies de Cichla e os híbridos aqui analisados mantêm a macroestrutura cariotípica conservada. Entretanto, a localização das regiões heterocromáticas e do gene DNAr 5S mostraram-se como marcadores resolutivos para evidenciar processos diferenciais de evolução cromossômica entre as espécies. O processo de heterocromatização encontrado em Cichla monoculus pode estar relacionado a condições ambientais, tratando-se de uma resposta epigenética relacionada a adaptações locais. Espécies do gênero Cichla apresentam tendência à formação de híbridos, quando ocorrem em simpatria e em ambientes modificados. Dos três indivíduos híbridos encontrados, com base no marcador DNAr 5S, dois devem ter C. vazzoleri envolvido, sendo que o outro parental pode ser C. monoculus ou C.temensis e um indivíduo deve ser resultado do cruzamento entre C. monoculus X C.temensis. O padrão de distribuição dos retroelementos Rex3 e Rex6 encontrado nas espécies analisadas evidencia que estas sequências estão ativas no genoma, não apresentando apenas função estrutural. No entanto, não estão relacionadas com ajustes nos indivíduos híbridos.

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