Mykologische Und Holzanatomische Untersuchungen Zur Massaria-Krankheit an Platanen

Mykologische und holzanatomische Untersuchungen zur Massaria-Krankheit an Platanen

Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Umwelt und Natürliche Ressourcen der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von

Timo Börker

Freiburg im Breisgau

Februar 2019

Dekanin: Prof. Dr. D. Kleinschmit Referent: Prof. Dr. S. Fink Korreferent: Prof. Dr. F. Schwarze Zweiter Betreuer: PD Dr. B. Metzler

Datum der Disputation: 06.06.2019

DANKSAGUNG

Danksagung

Zuerst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. S. Fink für die Vergabe des Themas bedanken. Insbesondere für die Möglichkeit, die mir geboten wurde, dieses spannende Thema selbstständig mit dem nötigen Freiraum zu bearbeiten.

Herrn Prof. Dr. F. Schwarze gilt mein Dank für die freundliche Übernahme des Korreferats und die damit verbundene Arbeit.

Einen sehr großen Dank gehört Herrn PD Dr. B. Metzler für die Zweitbetreuung sowie Anregungen und Aufmunterungen mykologischer Fragestellungen während der gesamten Zeit.

Besonders danke ich Herrn Prof. Dr. R. Kehr, der bereits während meiner Studienzeit mein Interesse für die Gehölzpathologie weckte. Seine Tipps und Anregungen waren eine große Bereicherung bei der Bearbeitung des Themas.

Ganz herzlich möchte ich mich bei Herrn Dr. J. Grüner bedanken. Seine Ratschläge waren eine große Hilfe dieses Thema zu bearbeiten. Als Ansprechpartner stand er mir jederzeit zur Verfügung. Vielen, vielen Dank Jörg!

Dem gesamten Team der Forstbotanik danke ich für die freundliche Unterstützung der Arbeiten. Bei Frau Dr. M. Alabed Alkader möchte ich mich für die wertvollen Tipps bei der Vorgehensweise mikrobiologischer Arbeiten bedanken. Frau S. Röske danke ich vor allem für die damit verbundenen Arbeiten der PCR, Frau N. Streit und ganz besonders Frau S. Diener gilt mein Dank für die Unterstützung der Labor- und Feldarbeiten sowie die Anfertigung diverser histologischer Präparate. Herrn R. Schönle gilt mein Dank vor allem bei der Hilfestellung photometrischer Messungen. Ein großer Dank gehört dem Team des Forstbotanischen Gartens, besonders Herrn K. Merz für die Anlage der Feldarbeiten, Herrn R. Dietrich für die Aufbereitung der Holzproben und Herrn W. Jäger für die Wasserversorgung der Versuchsbäume. Bei Frau L. Gschwend möchte ich mich ganz besonders für die nette, angenehme Zeit mit hilfreichen Ratschlägen bedanken. Des Weiteren danke ich meinen Kollegen /Kolleginnen (M. Göttelmann, L. Blanquer & K. Drozella) für das tolle Arbeitsklima in dieser Zeit.

Herrn U. Uhlich (Professur für Forstliche Biomaterialien) gilt mein Dank für die Möglichkeit der Druckfestigkeitsprüfung. Dem Garten und Tiefbauamt der Stadt Freiburg sowie den Baumpartnern-Breisgau danke ich für das Probematerial diverser Äste.

Abschließend möchte ich mich ganz herzlich bei meiner gesamten Familie und meinen Freunden bedanken, die mich jederzeit unterstützt haben und mir während der gesamten Promotion Rückhalt gaben. Ohne diese Unterstützung wäre dies alles nicht möglich gewesen. Vielen, vielen Dank für Alles.

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ...... 1 1.1 Die Gattung Platanus ...... 2 1.1.1 Platanen im urbanen Raum ...... 3 1.2 Stand des Wissens zur „Massaria-Krankheit“ ...... 4 1.2.1 Krankheitsverlauf und Symptome der „Massaria-Krankheit“ ...... 5 1.2.2 Holzanatomie von Platanen ...... 7 1.2.3 Fäuletypen holzzersetzender Pilze ...... 8 1.3 Zielsetzung der Arbeit ...... 9

2. Material und Methoden ...... 11 2.1 Pilzmaterial ...... 11 2.1.1 Isolierung und Kultivierung von Splanchnonema platani ...... 11 2.1.2 Pilzidentifikation ...... 12 2.2 Nährmedien ...... 15 2.2.1 Nährmedien mit Holz- bzw. Rindenzusatz ...... 17 2.3 Wachstumsversuche ...... 18 2.3.1 Temperaturoptimum ...... 18 2.3.2 Substratansprüche ...... 18 2.4 Holzabbau ...... 19 2.4.1 Herstellung der Prüfkörper ...... 19 2.4.2 Verwendete Pilzkulturen ...... 20 2.4.3 Vorgehensweise zur Anzucht der Pilze und Beimpfung der Versuchsgefäße ...... 21 2.4.4 Druckfestigkeitsprüfung an pilz-infizierten Platanenhölzern ...... 23 2.5 Herstellung histologischer Präparate ...... 24 2.5.1 Färbungen ...... 25 2.6 Nachweis qualitativer Enzymaktivität ...... 26 2.6.1 Dualkultur-Test zum antagonistischen Potential von Trichoderma sp. .. 27 2.7 Holzanatomische Strukturen an Platanenästen ...... 29 2.8 Infektionsversuch an Bäumen bei unterschiedlicher Wasserversorgung .... 30 2.8.1 Versuchsfläche im Forstbotanischen Garten ...... 30 2.8.2 Versuchsaufbau ...... 30 2.8.3 Herstellung des Inokulums ...... 35 2.8.4 Isolation von Mikroorganismen aus Rindengewebe der Platanenäste...... 36 2.8.5 Wetterdaten ...... 37 2.9 Statistische Auswertung ...... 37

3. Ergebnisse ...... 38 3.1 Molekulargenetische Bestimmung ...... 38 3.2 Kultivierung ...... 40 3.3 Wachstumsversuche ...... 41 3.3.1 Temperaturoptimum ...... 41

INHALTSVERZEICHNIS

3.3.2 Substratansprüche ...... 45 3.4 Holzabbau ...... 50 3.4.1 Holzfeuchte der Platanenhölzer ...... 55 3.4.2 Beziehung zwischen Gewichtsverlust und Holzfeuchte...... 58 3.4.3 Druckfestigkeitsmessungen an pilz-infizierten Hölzern ...... 60 3.4.4 Durchlichtmikroskopische Untersuchungen über das Besiedlungs- und Holzzersetzungsmuster in vitro ...... 63 3.4.5 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Zellwände ...... 72 3.5 Ergebnisse der qualitativen Enzymaktivität ...... 74 3.5.1 Dualkultur-Test zur Ermittlung des antagonistischen Potentials von Trichoderma sp...... 75 3.6 Zugholz in Platanenastgewebe ...... 80 3.6.1 Makroskopische Auswertung ...... 80 3.6.2 Mikroskopische Auswertung ...... 80 3.7 Ergebnisse der Infektionsversuche (in vivo) ...... 83 3.7.1 Wetterdaten...... 83 3.7.2 Zuwachsmessungen an den Versuchsbäumen ...... 84 3.7.3 Infektionsversuch I Erreger auf intaktem Rindenperiderm ...... 86 3.7.4 Astbasis als natürliche Barriere ...... 93 3.7.5 Infektionsversuch II Erreger auf geschädigtem Rindenperiderm ...... 95 3.7.6 Isolation aus Rindengewebe von Platanenästen ...... 100 3.7.7 Gemeinsames Auftreten von S. platani und Phomopsis/ Diaporthe spp. im Rindengewebe ...... 104 3.8 Holz-Beimpfung mit Pilzen aus Platanenrindengewebe in vitro ...... 104

4. Diskussion ...... 106 4.1 Wachstumsvoraussetzungen für S. platani ...... 106 4.2 Holzanatomische Strukturen von Platanenästen ...... 110 4.3 Holzabbau in-vitro (Masseverlust) ...... 113 4.3.1 Beziehung zwischen Masseverlust und Holzfeuchte ...... 115 4.3.2 Einfluss vom Holzabbau auf Festigkeitseigenschaften von Platanenhölzern ...... 117 4.4 Interpretation der histologischen Präparate ...... 119 4.4.1 Durchlichtmikroskopie ...... 119 4.4.2 Fluoreszenzmikroskopie ...... 121 4.5 Interpretation der Ergebnisse des Infektionsversuchs ...... 122 4.5.1 Reaktionsvermögen von Platanenästen nach S. platani Infektion ...... 124 4.5.2 Durchdringen der Reaktionszone physiologisch geschwächter Äste ..... 125 4.5.3 Astbasis als natürliche Barriere gegen ein Eindringen ins Stammgewebe ...... 126 4.5.4 S. platani als „opportunistischer Schwächeparasit“ ...... 128 4.6 Molekulargenetische Identifizierung von Pilzen anhand von ITS-Sequenzen ...... 129 4.6.1 Pilze im Rindengewebe von Platanenästen...... 130 4.6.2 Isolation weiterer Pilzflora mit lignicolen Potential ...... 131

INHALTSVERZEICHNIS

4.7 Enzymaktivität von S. platani ...... 134 4.7.1 Laccase als Vitalitätsindikator in den Dualkultur-Tests ...... 136 4.8 Bedeutung der Erkenntnisse für die Baumpflege ...... 137 4.9 Ausblick ...... 139

5. Zusammenfassung ...... 141

6. Summary ...... 144

7. Literaturverzeichnis ...... 146

8. Anhang ...... 163

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abkürzungsverzeichnis abzgl. abzüglich ANOVA Analysis of Variance (Varianzanalyse) Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) BAH Bergahorn (Acer pseudoplatanus) BU Rotbuche (Fagus sylvatica) BGB Bürgerliches Gesetzbuch CBS The Dutch Centraalbureau voor Schimmelcultures (Westerdijk Institute) DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

EC- Enzyme Commission numbers, numerisches Klassifikationssystem für Enzyme FI Gemeine Fichte (Picea abies) ITS- Internal transcribed spacer konz. konzentrierte ln(x) Natürlicher Logarithmus MEA Malzextraktagar N Anzahl o. g. oben genannt PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PDA Kartoffel-Dextrose-Agar (Potato dextrose agar) PK Prüfkörper PLA Ahornblättrige Platane (Platanus x hispanica) PLA-RI Platanenrinde (Platanus x hispanica) SD Standardabweichung SEA Spezifische Enzymaktivität SEM Standardfehler des Mittelwertes SNA Synthetischer Nährstoffarmer Agar (Synthetic Nutrient-Poor Agar) StU Stammumfang (gemessen in 1m Höhe) TBP2014.1 Isolat-Nr. S. platani

[u…] Holzfeuchte % x̅ Mittelwert

EINLEITUNG

1 Einleitung

Bäume nehmen im urbanen Lebensraum eine besondere Stellung ein. Aus heutiger Sicht sind sie in Park- und Siedlungsanlagen oder im Straßenraum als Gestaltungsgrün nicht mehr wegzudenken. Für den Menschen tragen Stadtbäume zum Wohlbefinden bzw. der Erholung bei, verbessern des Stadtklimas, kühlen ihre Umgebung durch Beschattung und

Transpiration, senken die Lufttemperatur, binden Kohlenstoffdioxid sowie die Reduktion von Stickstoffoxiden. Zudem bieten Stadtbäume durch die Besiedlung zahlreicher Flechten, Pilze und Moose einen idealen Lebensraum für Tiere mitten in der Stadt

(NOWAK et al. 2013; ROLOFF 2013).

Im städtischen Bereich wachsen Bäume teilweise unter extremen Bedingungen, die weit von den Verhältnissen ihres natürlichen Standortes abweichen. Speziell diese Standorte sind durch einige extreme Besonderheiten gekennzeichnet sowie einer Vielzahl von Belastungen und Immissionen ausgesetzt. Besonders Straßenbäume sind durch widrige standörtliche Gegebenheiten, wie stark beeinträchtigten Gasaustausch aufgrund versiegelter, verdichteter Flächen, mangelnde Lichtverhältnisse, ober- und unterirdischen Platzmangel, unterbrochenen Nährstoffkreislauf sowie baumpflegerischen Schnittmaß- nahmen beeinträchtigt (BALDER et al. 1997; BALDER 1998). Hinzu kommen in den letzten Jahre vermehrt saisonale Extremsituationen, wie langanhaltende Trockenperioden während der Vegetationszeit in Kombination mit hohen Lufttemperaturen, was sich negativ auf die

Baumphysiologie auswirkt (MAIER & DEUTSCHLÄNDER 2010; HERDEN 2017). All diese Faktoren schwächen die Vitalität der Bäume und machen diese anfällig gegenüber

Schädlingen wie Insekten oder holzzersetzende Pilze.

Insbesondere holzzersetzende Pilze können für den städtischen Bereich eine große Gefahr darstellen. Genau genommen sind holzzersetzende Pilze „fakultative“ Parasiten, die sowohl parasitisch als auch saprophytisch leben. Als Parasiten beginnen sie ihre Entwicklung im lebenden Baum, aber sobald dieser abgestorben ist, leben sie als Saprophyten im toten Holz weiter. Durch Umstürzen und Abbrechen erkrankter Bäume bzw. Äste können somit Sach- und Personenschäden entstehen, sodass für Baumeigentümer die aus § 823 Abs. 1 BGB1) abgeleitete Verkehrssicherungspflicht zu erfüllen ist.

In der heutigen Zeit bieten die Straßenbaumliste der Deutschen Gartenamtsleiterkonferenz

(GALK), die KLimaArtenMatrix (KLAM) sowie das Forschungsprojekt Stadtgrün 2021,

1) Allgemeine Delikthaftung § 823- Schadensersatzpflicht (BGB) Bürgerliches Gesetzbuch 1

EINLEITUNG

Entscheidungshilfen für geeignete Baumarten im urbanen Bereich unter stadttypischen Belastungen. Eine der häufigsten Baumarten stellen Platanen, insbesondere P. x hispanica dar. Besonders im öffentlichen Grün, in Parkanlagen, an repräsentativen Plätzen, als Formgehölz oder im Straßenraumbereich findet sie als Einzel- oder Alleebaum vielseitige Verwendung.

1.1 Die Gattung Platanus

Platanus bildet die einzige Gattung innerhalb der Platanengewächse (Platanaceae). Die Gattung umfasst 9-10 Arten. Drei Arten sind im kühlgemäßigten bis mediterranen Klima der nördlichen Hemisphäre anzutreffen (ASLANBOĞA & GEMICI 1998; SCHÜTT & LANG 2002).

Die Amerikanische Platane (Platanus occidentalis L.) hat ihr natürliches Verbreitungs- gebiet auf dem nordamerikanischen Kontinent, vom südlichen Kanada, USA bis in die nördlichen mexikanischen Bundesstaaten. Das Verbreitungsgebiet der Morgenländischen Platane (Platanus orientalis L.) erstreckt sich von europäisch-südländischen Mittelmeerregionen über Syrien bis hin zum westlichen Himalaya. Dennoch kann nicht von einem zusammenhängenden Gebiet gesprochen werden, da diese Baumart als

Vertreter der Auwald-Gesellschafter strikt an feuchte Standorte gebunden ist (SANTAMOUR

& MCARDLE 1986; ASLANBOĞA & GEMICI 1998; GILMAN & WATSON 2014).

Den wichtigsten Vertreter dieser Gattung im urbanen Bereich bildet die Ahornblättrige Platane (Platanus x hispanica Münchh., Synonym.: Platanus x acerifolia Aiton Willd.). Diese Art, eine Hybride aus P. orientalis und P. occidentalis, ist vermutlich im 17. Jahrhundert aus botanischer Züchtung in England hervorgegangen; sie nimmt in Städten und Metropolregionen als Straßen- und Gestaltungsgrün eine ganz besondere Rolle ein

(HENRY & FLOOD 1919; SANTAMOUR & MCARDLE 1986; ASLANBOĞA & GEMICI 1998;

BÖHLMANN 2009; ROLOFF 2013).

In der Vergangenheit erlangte P. x. hispanica große Beliebtheit aufgrund ihrer Resistenz gegenüber urbane Stressoren, einschließlich baumpflegerischen Schnitteingriffen, und galt lange Zeit als einer der beliebtesten urbanen Baumarten (ROLOFF 2013). Hinsichtlich der Standortansprüche verträgt die Platane frische, mäßig nasse, neutrale bis stark alkalische Böden. Besonders bevorzugte Standorte sind Auewälder auf kiesigen Substraten an

EINLEITUNG

Flussufern. Aufgrund ihrer tiefwachsenden, ausbreitenden Wurzeln kann die Platane in Sommermonaten längere Trockenperioden überstehen, sofern ihr Wurzelsystem ans

Grundwasser reicht (OBERDORFER 1994; ASLANBOĞA & GEMICI 1998; BÄRTELS 2001;

GILMAN & WATSON 2014). Hinsichtlich Streusalzeinträgen zählt P. x hispanica zu den toleranteren Gehölzen (BERNATZKY 1994).

1.1.1 Platanen im urbanen Raum

Die Verantwortlichen für Grünanlagen in Ballungsgebieten Deutschlands streben einen vielfältigen und artenreichen Baumbestand zur Steigerung der Biodiversität an. Angesichts der urbanen Baumartenzusammensetzung wird ersichtlich, dass nur wenige Baumarten zahlreich vertreten sind. Die Zusammensetzung einzelner Arten variiert aufgrund von regional-klimatischen sowie geschichts-kulturellen Gegebenheiten. Innerhalb der Bundesrepublik besteht ein ungleiches Verteilungsmuster dieser Baumart. Als Allee- oder Einzelbäume prägt sie das Stadtbild der Ballungsgebiete, während im ländlichen Raum weitaus weniger Exemplare existieren.

In Metropolen der Rhein-Ruhr Gegend stellt die Platane bspw. in der Stadt Gelsenkirchen mit einem Anteil von annährend 20 % des gesamten Baumbestandes die dominierendste 2) Art dar (GELSENDIENSTE 2017 ). In dieser Region kann die Platane als Relikt vergangener 3) Schwerindustrie betrachtet werden (LANUV NRW 2017 ). Aufgrund positiver Eigenschaften als robuste, winterharte, anspruchslose sowie emissionstolerante Baumart wurde sie in der Vergangenheit bevorzugt im Straßenraumbereich angepflanzt

(OBERDORFER 1994). In Berlin ist die Platane mit rund 433.000 Baumexemplaren im

Straßenraum vertreten [6 % des gesamten Straßenbaumbestandes (SENUVK BERLIN 4) 5) 2017 ); vgl. Hamburg ca. 5 % (BUE HAMBURG 2017 ); Freiburg: ca. 7 % (GUT 6) FREIBURG 2018 )].

Laut KLimaArtenMatrix (KLAM) ist die Verwendung der Platane als Stadtbaum in der Kategorie Trockentoleranz als „sehr geeignet“, in der Kategorie Winterhärte mit „geeignet“ eingestuft. Anhand neuer Erkenntnisse hinsichtlich Pathogenität einiger Schaderreger, wird diese Art mit Verwendungseinschränkungen im Straßenraumbereich der GALK-Straßenbaumliste aufgeführt. 2) Gelsendienste ehem. Grünflächenamt Stadt Gelsenkirchen [31.12.2017] 3) Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen [31.12.2017] 4) Senatsverwaltung für Umwelt, Verkehr und Klimaschutz Berlin [31.12.2017] 5) Behörde für Umwelt und Energie Hamburg [31.12.2017] 6) Garten und Tiefbauamt Stadt Freiburg im Breisgau (schriftliche Mitteilung Hog, R.) [10.01.2018] 3

EINLEITUNG

Obwohl diese Baumart lange Zeit widerstandsfähig gegenüber urbanen Stressfaktoren galt, traten in den letzten Jahren vermehrt neuartige Pflanzenkrankheiten sowie Schaderreger auf, die sich von mediterranen Klimazonen bis in kontinentale Regionen Mitteleuropas ausbreiteten (Ceratocystis platani, syn.: Ceratocystis fimbriata f. platani, Platanenwelke, - krebs; Corythucha ciliata Platanennetzwanze; Phyllonorycter platani syn.: Lithocolletis platani; Platanenminiermotte). In den vergangenen Jahren erlangte eine weitere Krankheit, die sog. „Massaria-Krankheit“ immer größere Bedeutung.

1.2 Stand des Wissens zur „Massaria-Krankheit“

Seit über einem Jahrzehnt kommt es in ganz Mitteleuropa zu einem vermehrten, flächendeckenden Auftreten der Massaria-Krankheit an der Gattung Platanus. Als Erreger wurde der Pilz Splanchnonema platani (Ces.) M.E. Barr 1982:364, Anamorphe Macrodiplodiopsis desmazieri [Mont.] Petrak (1922: 343) bekannt. In Deutschland erfolgte der offizielle Erstnachweis im Jahr 2003 und wurde somit erstmalig auf der Nordseite der Alpen nachgewiesen. Bereits in den 90er Jahren konnten jedoch ähnliche Verdachtsymptome im südwestdeutschen Raum beobachtet werden, welches auf ein früheres Auftreten hindeutet (KEHR & KRAUTHAUSEN 2004).

Die melanisierten Konidiosporen sind stets dreifach septiert, Ascosporen hingegen 1-6 - fach. In den Asci der Perithecien finden sich je 8 Sporen. Konidiosporen weisen i. d. R. geringere Abmessungen in Längen und Breite als Ascosporen auf. In der Literatur variieren diese unter den einzelnen Autoren mit folgenden Maßen:

Ascosporen: 40-68 x 10-17,5 µm (SHEAR & DAVIDSON 1936; BARR 1982; BUTIN 2011). Konidiosporen: 32-52 x 13-20,5 µm (PETRAK 1922; SHEAR & DAVIDSON 1936; MORGAN-JONES 1975; SUTTON 1980; BARR 1982; GLAWE 1985). Pyknidien sowie Perithecien finden sich einzeln oder in Gruppen im Rindenperiderm der Platanenäste wieder. Pyknidien weisen geringere Abmessungen im Durchmesser [350-

1000 µm (MORGEN-JONES 1975; SUTTON 1980; KEHR & KRAUTHAUSEN 2004)] als

Perithecien [500–1200 µm (BARR 1982; KEHR & KRAUTHAUSEN 2004)] auf. Bei Sporenreife treten Konidiosporen auf die Rindenoberfläche hervor (siehe Abb. 1).

Lange Zeit wurde S. platani in der Gattung Massaria geführt, von SHEAR & DAVIDSON (1936) bzgl. Holomorphe Massaria platani Ces. und Hendersonia desmazieri Mont.,

EINLEITUNG

taxonomisch eingeordnet und von BARR (1982) in die Gattung Splanchnonema morphologisch klassifiziert. In Nordamerika ist S. platani häufig unter dem Synonym Massaria platani bekannt, beschrieben als typischer Verursacher des Platanen-Aststerbens „branch dieback in sycamore“ an P. occidentalis und P. x. hispanica vom äußersten Osten Nordamerikas bis zur westlichen Seite der Vereinigten Staaten (HEPTING 1971; BARNARD & DIXON 1983;

ALFIERI et al. 1984; SINCLAIR & LYON 2005).

Von WIJAYAWARDENE (2014) irrtümlicherweise in die Familie Lophiostomataceae eingestuft, doch durch CROUS (2015) phylogenetisch mittels molekulargenetischer

Analysen weiterbestehend in der Familie Macrodiplodiopsidaceae geführt. Der Begriff „Massaria“ setzte sich dennoch in der Vergangenheit durch und blieb weiterhin bis heute als Synonym bestehen.

In Europa gelang es NALLI (1981), S. platani aus nekrotischem Rindengewebe zu isolieren und berichtet von Infektionsversuchen an Jungpflanzen (P. x hispanica) mit einhergehender Bildung nekrotischer Rindenbereiche. GROSCLAUDE & ROMITIT (1991) zeigten im südlichen Frankreich in Kombination mit Trockenstress ein Aststerben junger Zweige und Äste an Jungbäumen von P. occidentalis, mit Übergang in das Stammgewebe.

Hinsichtlich des Pilzmaterials weist BARR (1982) darauf hin, dass zwischen dem europäischen und der nordamerikanischen Form morphologisch keine Differenzen bestehen, sondern lediglich die mykologischen, wissenschaftlichen Begrifflichkeiten sich unterscheiden.

1.2.1 Krankheitsverlauf und Symptome der „Massaria-Krankheit“

Nach DUJESIEFKEN & KEHR (2008) und KEHR (2011) lassen sich die Symptome der Massaria-Krankheit im Wesentlichen in zwei Schadbilder unterscheiden. Einerseits kommt es binnen weniger Wochen zum Absterben dünner, untergeordneter Äste in der Oberkrone, wobei die Rinde durch die Sporulation der Konidio- und Ascosporen schwärzlich verfärbt erscheint. Doch andererseits tritt seit einigen Jahren das Phänomen auf, dass der Erreger zudem Äste im Starkastbereich befällt sowie eine schnell voranschreitende, intensive Holzzersetzung hervorruft, so dass befallene Äste innerhalb weniger Monate bruchgefährdet sind und die Verkehrssicherheit nicht mehr gegeben ist. Im Anfangsstadium zeigen befallene Äste keine Vitalitätsverluste im Belaubungsgrad, sind 5

EINLEITUNG dennoch durch die Ausbildung von rosa bis violetten, langgestreckten Rinden-

Verfärbungen auf der Astoberseite charakterisiert (KEHR & KRAUTHAUSEN 2004; KEHR 2011). Im weiteren Krankheitsverlauf kommt es zum Absterben von Rinden- und Kambiumgewebe. Diese nekrotischen Bereiche grenzen sich scharf zum gesunden Gewebe ab und bilden sich oftmals streifenförmig aus. An der Astbasis treten diese Rinden- und Kambiumnekrosen breiter in Erscheinung und laufen im weiteren Astverlauf spitzförmig aus. Im fortgeschrittenen Stadium kommt es zum Absterben des Astgewebes mit einhergehender Holzzersetzung (siehe Abb. 1.1). Die Holzfäule, klassifiziert als „Typ

Moderfäule“, ist im Bereich nahe der Astbasis am intensivsten (RAMIN & KEHR 2008;

KEHR 2011). Aufgrund einhergehender Holzzersetzung der Astoberseite entsteht binnen kurzer Zeit nahe der Astbasis die sog. „Soll-Bruchstelle“ mit anschließendem sprödem

Astbruch (siehe Abb. 1.1D). Zersetzte Holzbereiche erscheinen hierbei in einem dunkleren Farbton und wirken oftmals trockener als umliegendes gesundes Holz.

Darauffolgend müssen betroffene Bäume in regelmäßigen Abständen auf Bruchsicherheit kontrolliert werden. Besonders für Städte und Kommunen mit hohem Platanenbestand stellen diese Kontrollen sowie daraus resultierende Pflegemaßnahmen einen hohen Personal- und Kostenaufwand dar. Oftmals scheint die visuelle Inaugenscheinnahme im Rahmen der Regelbaumkontrolle nicht ausreichend, da speziell die Astoberseite vom Boden aus schwer einsichtig ist. Zunächst erscheint der Ast gesund, da noch intakte Bereiche in der Lage sind, die Blattmasse ausreichend zu versorgen.

Abb. 1.1: Symptome an Platanenästen hervorgerufen durch S. platani, A: Beginnende Rinden- und Kambiumnekrosen im Anfangsstadium (rosa-violette Rindenverfärbungen). B: Zunehmender Befall, Auftreten von Fruchtkörpern im Rindenperiderm (Anamorphe und Teleomorphe). C: M assenhaftes Austreten von Konidiosporen sowie Ablösen der Rinde. D: Befallender Seitenast eines Starkastes (roter Pfeil) mit erfolgreicher Abschottung bzw. Kompartimentierung zum Hauptast , E: Typ. Massaria-Astbruch mit typ. sprödem Bruchbild. F: Soll-Bruchstelle“, Bereich mit intensivster Holzzersetzung. G: Befallener Starkast mit S. platani, Draufsicht auf befallene Rindenpartien mit S. platani, Fruchtkörper im Rindenperiderm, Ast erscheint wie mit Ruß bedeckt F: Durchlichtmikroskopische Aufnahme Querschnitt durch Rindenperiderm mit Perithecien und austretenden Ascosporen (x10). 6

EINLEITUNG

1.2.2 Holzanatomie von Platanen

Das Holz der Platane zählt zu den Vertretern der zerstreutporigen Holzarten. Der Wassertransport findet über eine Tracheiden-Gefäß-Stufe, ähnlich der Baumart Rotbuche

(Fagus sylvatica), statt (BRAUN 1970). Xylemgewebe setzt sich aus den wasserleitenden Gefäßen (Tracheen), die in einer Matrix von Fasertracheiden eingebettet sind, zusammen welche die Wasserleitung im engeren Sinne ermöglichen. Über die Jahrringgrenze hinweg wird Wasser ausschließlich zwischen Tracheiden geleitet (BRAUN 1970; SCHWARZE 2007; 2018). Gefäße sind einzeln zerstreut, seltener paarig oder in Gruppen mit einem Durchmesser von 30 µm bis 105 µm, variierend nach Früh- oder Spätholz sowie in Abhängigkeit der Lage im Baum (Stamm-, Wurzel- oder Astholz). Holzanatomische

Untersuchungen von SÜSS & MÜLLER-STOLL (1973) zeigten, dass die Anzahl an Gefäßen pro Flächeneinheit im Astholz höher als im Stamm- oder Wurzelholz ist, dabei nehmen die Gefäßdurchmesser im Astholz deutlich ab. Gefäßdurchbrechungen sind teils einfach, teils leiterförmig angeordnet (WAGENFÜHR 2007).

UV-Mikroskopische Untersuchungen nach BAUM (2001) zeigten unterschiedliche Konzentrationen der einzelnen Ligninmonomere in Relation der Zelltypen und in Abhängigkeit der Hydrosysteme. Sowohl Gefäße als Fasertracheiden sind am Wassertransport beteiligt, dennoch zeichnen sich nur die ligninreichen Sekundärwände der Gefäße durch eine erhöhte Konzentration an Guaiacyl-Einheiten aus. Die Mittelschicht der Fasertracheiden ist stets durch hohe Gehalte an Guaiacyl-Einheiten charakterisiert, während Sekundärwände umliegender Fasertracheiden erhöhte Syringyl-Einheiten aufweisen (SCHWARZE 2007; 2018; SCHMITT et al. 2014).

Längsparenchym findet sich apotracheal zerstreut und paratracheales Parenchym spärlich im Grundgewebe (Anteil ca. 9 %) wieder. Holzstrahlen sind besonders groß und der Anteil beträgt in etwa 31 % des Holzes. Die Anordnung ist unregelmäßig, an der Jahrringgrenze charakteristisch verbreitet (WAGENFÜHR 2007).

Äste sind aufgrund des Eigengewichtes, Stellung (Astabgangswinkel) sowie jahreszeitlicher Bedingungen (Schneelasten, Laubgewicht) permanenten Belastungen ausgesetzt. Die zugbelastete Astoberseite von Laubhölzern kann sehr unterschiedlich auf

Belastungen reagieren und eine Vielfalt verschiedener Bautypen aufweisen (AUFSEß 1973;

GHISLAIN & CLAIR 2017). Diese zeichnen sich bei zahlreichen Laubhölzern durch einen geringen Verholzungsgrad aufgrund uneinheitlicher Lignin-Einlagerungen sowie erhöhter

EINLEITUNG

Cellulose-Gehalte der Sekundärwand aus. Zudem ist der Faseranteil in diesem Gewebetyp erhöht und der Gefäßanteil sichtlich geringer.

1.2.3 Fäuletypen holzzersetzender Pilze

Holzzersetzende Pilze können nach dem Chemismus enzymatischer Ausscheidung in Weiß-, Braun- und Moderfäuleerreger klassifiziert werden. Weißfäuleerreger sind im Gegensatz zu Braunfäuleerregern befähigt, neben Hemicellulose und Cellulose, Lignin im gleichen Maße (simultan) oder bevorzugt (selektiv) abzubauen (BLANCHETTE et al. 1985;

ADASKAVEG & GILBERTSON 1986). Bei der Braunfäule diffundieren cellulolytische Enzyme in die Sekundärwand ein, wobei Lignin in leicht veränderter Form erhalten bleibt

(RAYNER & BODDY 1988, SCHWARZE et al. 1999). Die Moderfäule zeichnet sich durch Hyphenwachstum und bevorzugtem Abbau von Cellulose und Hemicellulose an der

Hyphenspitze, innerhalb der Sekundärwand, aus (LIESE 1964). Im Anfangsstadium wird Lignin nicht oder kaum angegriffen, dann in erster Linie durch Demethylierung, sodass diese Fäule biochemisch der Braunfäule ähnelt (SCHMIDT 1994). Die Moderfäule lässt sich in zwei Typen unterscheiden, - „Typ 1“ gekennzeichnet durch ein Hyphenwachstum vom

Zelllumen ausgehend, wobei mit Hilfe dünner Perforationshyphen die S3-Schicht durchdrungen wird. Als Feinhyphe verläuft das Wachstum innerhalb der Sekundärwand, parallel entlang der Zellulosemikrofibrillen (in longitudinaler Richtung) mit dem bevorzugten Abbau der S2-Schicht. - „Typ 2“ ist durch den Abbau der Zellwand vom

Lumen her durch V-förmige Einkerbungen der S3-Schicht charakterisiert (SAVORY 1954). Die unterschiedliche enzymatische Aktivität einzelner Moderfäulepilze kann einerseits bewirken, dass die S3-Schicht je nach spezifischer Aktivität der Pilze vollständig abgebaut wird oder andererseits keinerlei sichtbare Veränderungen aufweist (LIESE 1964). Allerdings sind einige Moderfäuleerreger befähigt, beide Typen des Zellwandabbaus zu bewirken (COURTOIS 1963a; HALE & EATON 1985).

Einige Holzzersetzer besitzen dennoch die Fähigkeit, durch äußere Umstände zwischen den einzelnen Fäuletypen ihre Abbaustrategie umzuschalten bzw. an die Abwehrreaktion des Wirtes anzupassen. Untersuchungen an Platane mit Befall von Inonotus hispidus haben gezeigt, dass der Pilz in der Lage ist, von einer typischen Weißfäule, auf eine Moderäule umzuschalten, um somit die Reaktionszone im Platanenholz zu umgehen (SCHWARZE et al

1995; SCHWARZE & FINK 1997; SCHWARZE et al 1999; BAUM & SCHWARZE 2001).

EINLEITUNG

1.3 Zielsetzung der Arbeit

Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, über experimentelle Untersuchungen mykologische Erkenntnisse zu S. platani in Hinblick auf Substratansprüche sowie Besiedlung des Wirtgewebes unter Berücksichtigung der Holzanatomie sowie über Strategien des Holzabbaus zu erlangen. Diese Erkenntnisse sollten einerseits mittels Laboruntersuchungen (in vitro) und andererseits (in vivo) durch Infektionsversuche im Feld gewonnen werden. Diese folgenden Untersuchungen sollen eine Hilfestellung zum besseren ökologischen Verständnis der Pathogenität von S. platani liefern und bisherige Beobachtungen über den Krankheitsverlauf verständlicher machen.

Laborversuche

Im Hinblick auf Laborversuche sollte überprüft werden, welchen Einfluss Temperaturen und unterschiedliche Ausgangssubstrate auf das Wachstum von S. platani besitzen. Strategien des Holzabbaus sollen durch künstlich pilz-infizierte Holzprüfkörper (in vitro), in Form von Masse- bzw. Gewichtsverlusten in Abhängigkeit von Umweltfaktoren beleuchtet werden. Eine vergleichbare Einstufung der gewonnenen Ergebnisse sollte helfen, den Masseverlust im Kontext mit zwei Referenzprüfpilzen einzuordnen. Über insgesamt vier Inkubationszeiten (12, 16, 24 und 32 Wochen) sollte der Masseverlust verifiziert und im Anschluss pilz-inkubierten Holzproben auf Holzfeuchtigkeit sowie Auswirkungen der Abnahme der Gewichtsverluste auf die Materialeigenschaften überprüft werden.

Ergänzend sollten histologische Untersuchungen mittels Durchlicht- und Fluoreszenz- mikroskopie zeigen, inwieweit sich spezifische Besiedlungsstrategien, Zersetzungsmuster und Abbauverhalten unter holzanatomischen Gesichtspunkten in vitro erkennen lassen. Hierbei sollten Verbreitungs- und Abbaustrategie von S. platani nahegelegt werden. Die Zielsetzungen dieser Arbeit lassen sich prägnant in folgende Fragen formulieren:

 Welche Substrat- und Temperaturoptima weist S. platani auf?  Wie hoch ist der von S. platani hervorgerufene Masse- bzw. Gewichtsverlust an pilz-infiziertem Platanenholz?  Welche Auswirkung hat der Masseverlust auf die Materialeigenschaften?  Welche Bedeutung nimmt die Holzfeuchtigkeit bei der Holzzersetzung ein?

EINLEITUNG

Feldstudie

Ein Schwerpunkt dieser Untersuchungen war die künstliche Infektion mit S. platani am Astgewebe von 10-jährigen Platanen (P. x hispanica). Mit Hilfe von Pilzisolaten wurde der Erreger unter Berücksichtigung limitierender Wasserverfügbarkeit an symptomfreien Platanenästen inokuliert.

Beobachtungen im Feld sowie ergänzender Mikroskopie sollten zum besseren Verständnis der Pilz-Wirt-Interaktion führen. Darüber hinaus wurden holzanatomische Strukturen von Platanenästen genauer analysiert und ausgewertet, inwieweit diese Strukturen mit der Besiedlung und Zersetzung durch S. platani einhergehen. Mykologische Isolationsversuche aus Rindengewebe sollten Aufschluss über die Biodiversität der Pilzarten am Sukzessionsverlauf, pathogener Pilze sowie potentielle natürliche Antagonisten liefern. Hierbei standen folgende Fragen im Vordergrund:

 Über welche Eintrittspforten besiedelt S. platani seinen Wirt?  Ist S. platani in der Lage, gesundes Rindengewebe vitaler Äste zu durchdringen?  Welche Besonderheiten zeigt die zugbelastete Astoberseite beim Holzabbau?  Ist S. platani in der Lage, Stammgewebe zu besiedeln?  Mit welchen Pilz-Gesellschaftern tritt S. platani gemeinsam am Wirt auf?  Gibt es potentielle Antagonisten von S. platani im Rindengewebe befallener Platanenäste?

MATERIAL UND METHODEN

2 Material und Methoden

2.1 Pilzmaterial Bei dem Erreger der Massaria-Krankheit handelt es sich um einen pilzlichen Erreger der Abteilung der Ascomycota (Ordnung: Pleosporales) aus der Familie der Pleomassariaceae. Dieser ist kein neuartiger Pilz, Splanchnonema platani ist seit langer Zeit in der Mykologie bekannt und wurde in der Vergangenheit bereits mehrfach unter verschiedenen Synonymen beschrieben: Teleomorphe: Splanchnonema atroinquinans [Shoemaker & LeClair 1975]; Splanchnonema desmazieri [Mont.] O. Kuntze; Massaria atroinquinans [Berk. & Curt. 1876] O. Kuntze; Massaria platani Ces.; Sphaeria platani Ces., in Rabenhorst, Klotzschii Herb. Viv. Mycol.: no. 1842 (1854).

Anamorphe: Macrodiplodiopsis desmazieresii (Mont.) Petrak (SUTTON 1980); Stegonsporium platani Preuss (1853: 723); Hendersonia desmazieri Mont. (1849: 310); Hendersonia platani Pk.

2.1.1 Isolierung und Kultivierung von Splanchnonema platani

Anfangs wurden Konidiosporen von S. platani (Anamorphe: Macrodiplodiopsis desmazieri) eines infizierten Platanenastes (Ø> 10 cm, mit Perithecien sowie pyknidialer Fruchtkörper im Rindenperiderm) aus dem Stadtgebiet Freiburg [Juli 2014] gesammelt und gemäß folgendem Schema (Abb. 1.2) kultiviert: Austretende Konidiosporen wurden vorsichtig entfernt, einem Kältereiz [-26° C, 48 h] und anschließend UVC-Licht (Wellen- länge: 254 nm; 10-15 min.) ausgesetzt. Daraufhin wurden Konidiosporen zum Vorkeimen in H2O [steril] gelegt, im Anschluss auf ein H2O-Medium pipettiert und zum Auskeimen gebracht. Auskeimende Konidiosporen wurden zunächst auf MEA-A Nährmedien [pH- Wert 4,5 - 5] inkubiert, unter Ausschluss weiterer Mikroorganismen vereinzelt, sowie anschließend auf ein HM1 Platanen-Nährmedium (mit ca. 0,2 % Rindenanteil) übertragen. Zur Umgehung der Trübung des Nährmediums wurde Mycel erneut auf MEA Medien [pH 6] übertragen und Subkulturen für nachfolgende Untersuchungen angefertigt. Gewonnene Kulturen wurden konstant bei 25° C dunkel gelagert. Nach 5-7 Wochen traten pyknidiale Fruchtkörper mit beginnender Sporulation auf.

MATERIAL UND METHODEN

Abb. 2.1: Schematische Vorgehensweise der Kultivierung von S. platani (Isolat: TBP2014.1) aus Konidiosporen (M. desmazieri) als Ausgangsmaterial; (*) HM1 Platane mit ca. 0,2 % Platanenrindenanteil im Nährmedium).

2.1.2 Pilzidentifikation Zunächst erfolgte die Pilzidentifikation anhand makro- und mikromorphologischer Charakteristika unter Verwendung des ZEISS Primostar. Für weitere Untersuchungen wurde dem Pilz-Isolat eine Sequenz-Nummer (S. platani TBP2014.1) zugewiesen. An dieser Stelle muss ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass die vorliegenden Untersuchungen mit dem Pilzmaterial der Anamorphe, Macrodiplodiopsis desmazieri von Splanchnonema platani (Ces.) M.E. Barr 1982:364 durchgeführt wurden und im Text mit S. platani angeführt wird.

Molekulargenetischer Nachweis

Von den gewonnenen Reinkulturen wurden Flüssigkulturen im Erlenmeyer-Kolben mit 70 ml 2 %iger Malzextrakt-Lösung angelegt. Somit konnte jedes in Flüssigkultur gewachsene Mycel zur DNA-Extraktion für molekulargenetische Untersuchungen gewonnen werden. Mycelien wurden zur Vorbereitung der DNA-Extraktion bei -60° C gefriergetrocknet.

MATERIAL UND METHODEN

DNA-Extraktion

Probenvorbereitung und DNA-Extraktion folgten nach Anleitung: Genomic DNA from ® plant NucleoSpin Plant II (Version 07/2014 MACHEREY-NAGEL). Um die Probe zu homogenisieren, wurde eine Probenmenge von 0,2 mg Pilzmycel in 2 ml- Eppendorf-Mikrozentrifugengefäße gegeben (MP Biomedicals, Lysing Matrix A). Durch die Zugabe von 400 μl Lysispuffer AP1 und 4 μl RNase A erfolgten Zellaufschluss sowie Freisetzen der DNA. Die Konzentrationsmessung der DNA-Extrakte folgte mit dem NanoPhotometer (IMPLEN).

Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse der Nukleotidsequenz des 5,8S rRNA-Gens und der benachbarten ITS- DNA-Sequenz für die Identifizierung auf Gattung- und

Speziesebene bei Pilzen (WHITE et al. 1990). Mit dem Vergleich der 5,8S rRNA- Gensequenz eines zu identifizierenden Pilzstammes mit schon vorliegenden Daten aus der GenBank, können Sequenzgleichartigkeiten erlesen werden. Diese Übereinstimmungen können als Grundlage für taxonomische Einteilungen herangezogen werden. Je nach Primerkombination werden unterschiedliche PCR-Profile benötigt, welche sich hinsichtlich Annealing- und Extensionsschritten unterscheiden. Mit Hilfe des Primerpaares ITS1-ITS4 konnte die ITS-Region aus pilzlicher DNA erfolgreich amplifiziert werden

(WHITE et al. 1990). Die Auswahl geeigneter Annealing-Temperaturen richtet sich nach dem Schmelzpunkt der Primer sowie der Extensionszeit entsprechend Länge des PCR- Produktes. Die verwendeten PCR-Profile müssen auf den Thermocycler abgestimmt sein.

Tab. 2.1: Amplifikation der pilzlichen DNA.

Primer Primersequenz Region Amplifikation

ITS1 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3' ITS1 5.8S IST4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' ITS2

Für einen Reaktionsansatz von 20 µl wurden in einem 200 μl-Cup, 5 μl DNA-Extrakt, 10 μl FastGene® Optima HotStart ReadyMix (NIPPONGENETICS) und je Primer 2,5 μl der Arbeitslösung (5 μM) gemischt. FastGene® Optima HotStart ReadyMix besitzt die Eigenschaft, unspezifische Amplifikate zu unterbinden.

MATERIAL UND METHODEN

PCR-Hauptdurchgang und Gelelektrophorese

Die Gesamtmenge der Reagenzien wurde für den PCR-Hauptdurchgang gemischt und portionsweise den Proben zugegeben. Mit Hilfe des Thermocycler Biometra Trio (ANALYTIK JENA) erfolgte die Durchführung der PCR nach dem entsprechenden ITS - Programm innerhalb 35 Wiederholungen. Im Anschluss wurden die PCR-Produkte auf einem Agarose-Gel (Gel 2 % Agarose, 60 ml TAE-Puffer) verifiziert. Unter UV-Licht wurden die DNA-Banden mit dem Fluoreszenzfarbstoff (Roti®-GelStain) unter dem Geldokumentationsgerät sichtbar gemacht. Die Dokumentation der Gele erfolgte photographisch mit der Kamera Axiocam 105 Color (ZEISS). Von jeder DNA-Probe wurden 10 μl getestet.

Tab. 2.2: Bedingungen im Thermocycler während der PCR.

Primer Amplifikationsschritt Zeit [min] Temperatur [° C] Zyklen [Anzahl]

Initiale Denaturierung 5 95 1

Denaturierung 0,5 95 ITS1 Annealing 1 54 35 / ITS4 Extension 2 72 Finale Extension 7 72 1

Kühlung ∞ 16

Sequenzierung von PCR-Produkten

Die Reinigung ausgewählter PCR-Produkte erfolgte gemäß den Angaben des PCR Reinigungskit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHERY-NAGEL 02/2017) im Verhältnis 1:2 (Probe: Puffer). Mit dem NanoPhotometer (IMPLEN) wurde dann eine photometrische Bestimmung der Reinheit und Menge an gereinigter DNA vorgenommen. Eine Einordnung des Reinheitsgrades einer Probe wurde durch den Wert der Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm gewonnen. Für die Sequenzierungsarbeiten wurde die Firma SEQLAB beauftragt.

MATERIAL UND METHODEN

Auswertung von ITS Sequenzen

Für die Auswertung wurden sequenzierte Basenabfolgen in die Software Chromas (Technelysium Pty Ltd; Version 2.6) eingespeist, um eine Darstellung der Signalintensität in Form von unterschiedlichen Peaks zu erhalten. Im nächsten Schritt wurden die Sequenzen in digitaler Form in die öffentliche zugängliche GenBank (NCBI National Center for Biotechnology Information) eingespeist und ein Abgleich weiterer Sequenzen folgte mit dem Programm BLAST (Basic local alignment search tool) zur Analyse von biologischen Sequenzdaten, welche eine Homologie anhand von Score und E-Wert beschreibt. Anschließend wurden sauber sequenzierte Genabschnitte der jeweiligen Kulturen miteinander verglichen, indem verschiedene Sequenzierungsergebnisse einer Alinierung mit der Software ClustalX (Version 2.1) verglichen wurde. Diese reiht die eingegebenen Sequenzen untereinander an, sodass sich Unterschiede und Gemeinsamkeiten der Basenabfolge graphisch darstellen lassen. Die phylogenetische Einteilung erfolgte mit Hilfe der Software NJPlot (Version 2.3).

2.2 Nährmedien

Die Nährmedien für folgende Untersuchungen wurden an der Professur für Forstbotanik hergestellt. Diese wurden bei einer Temperatur von 120° C für 20 min autoklaviert (Autoklav DB-150 SYSTEC) und anschließend in Petrischalen (Ø 94 mm) gegossen. Eine Einstellung und Messung des pH-Wertes erfolgte ggf. mit dem pH-Meter (HI 991001 HANNA INSTRUMENTS) und entsprechenden NaOH- und HCl-Lösungen. Folgende Nährmedien wurden für die Untersuchungen verwendet:

MEA – Malzextraktagar [pH 4,5 – 6] Malzextrakt 20 g Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: Kultivierungsarbeiten, Masseverlust, Inokulum Infektionsversuch, Enzym- aktivität, Wachstumsversuch Temperaturoptimum, Substratansprüche

MATERIAL UND METHODEN

T-MEA – Malzextraktagar + Thiabendazole [pH 4,5 – 6] Malzextrakt 20 g Thiabendazole 2 ml (0,46 mg gelöst in 2 ml Milchsäure) Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: Auskeimen Konidiosporen, Vorversuch

MEA-A – Malzextraktagar + Antibiotika [pH 4,5 – 6] Malzextrakt 20 g Streptomycin 1 ml (400mg gelöst in 100ml H2O) Penicillin 1 ml (124mg gelöst in 100ml H2O) Tetracyclin 1 ml (100mg gelöst in 100ml H2O) Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: Kultivierungsarbeiten, Re-Isolation

PDA – Kartoffel-Dextrose-Agar [pH 4,5 – 6] Kartoffelstärke 4 g Glucose 20 g Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: Auskeimen Konidiosporen, Vorversuch

H20-Agar [pH 5,5 – 6] Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: Kultivierung, Inokulum Infektionsversuch (Kontrolle)

SNA – Synthetischer Nährstoffarmer Agar [pH 5,5] KH2PO4 1 g KNO3 1 g MgSO4 7H2O 0,5 g KCL 0,5 g Saccharose 0,2 g Glucose 0,2 g Agar 20 g Aqua dest. 1000ml

Verwendung: Auskeimen Konidiosporen, Vorversuch

MATERIAL UND METHODEN

PA1-Nährmedium [pH 5; pH 7] Pektin (von Apfel) 10 g Hefeextrakt 2 g Agar 30 g Mineralsalzlösung*) 1000 ml Aqua dest. 1000 ml

*) Mineralsalzlösung (NH4)2SO4 2g KH2PO4 4 g Na2HPO4 6 g FeSO47H2O 0,2 g CaCl2 1 mg H3BO3 10 µg MnSO4 10 µg ZnSO4 70 µg CuSO4 50 µg MOO3 10 µg Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: zur Bestimmung der pektolytischen Aktivität

2.2.1 Nährmedien mit Holz bzw. Rindenzusatz

Aus Astholz wurden je 20 g Sägemehl [Holzfeuchte u12] unterschiedlicher Baumarten (Buche, Platane, Fichte und Ahorn) sowie Platanenrinde für 5 Tage in 1 l Aqua dest. gelegt, anschließend mit einem Analysesieb (≤45 µm) überschüssiges, grobes Holz- bzw. Rindenmaterial ausgeschlossen und die Suspension für die Nährmedien verwendet. Diese gelösten, mit Agar angereicherten Substrate wurden rotierend unter sterilen Bedingungen in die einzelnen Versuchsgefäße (Petrischalen) gegossen.

Holzmedien (HM I) [pH 5,2] Sägemehl 20 g (je Holzart: Buche, Platane, Bergahorn, Fichte) Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml

Verwendung: Wachstumsversuch Substratansprüche

Rindenmedium (PLA-RI) [pH 5,2] Rindenmehl 20 g (Platanenrinde) Agar 20 g Aqua dest. 1000 ml Verwendung: Wachstumsversuch Substratansprüche

MATERIAL UND METHODEN

2.3 Wachstumsversuche

Wachstumsversuche von S. platani Kulturen wurden einerseits angelegt, um bevorzugte Temperaturbereiche zu quantifizieren, sowie andererseits, um allgemeine Substrat- ansprüche zu bestimmen. Da Kulturen kein konzentrisch gezontes Mycelwachstum aufweisen, wurde zur Ermittlung die zugewachsene Mycelausbreitung als Fläche (mm²) ausgedrückt. Über den gesamten Versuchszeitraum wurden diese photographisch festgehalten, digitalisiert und mit Hilfe der Analyse-Software ImageJ (Version 1.50i) die zugewachsene Mycelfläche gemessen. Mittelwerte wurden über den gesamten Versuchszeitraum für die statistische Auswertung herangezogen und als Wachstumseinheit (mm²/Tag) wiedergegeben. Versuchsgefäße (Petrischalen) wurden im Zentrum mit einem Inkubationspunkt (Ø 5 mm) unter sterilen Bedingungen beimpft.

2.3.1 Temperaturoptimum

Über einen Versuchszeitraum von 35 Tagen [Beginn der konidialen Sporulation (Lagerung dunkel; 25° C)] wurde die Mycelausbreitung zu 7 Versuchszeiten in jeweiligen Zeitabschnitten (5, 8, 11, 18, 25, 29, 35 Tage) die zugewachsene Mycelfläche ermittelt. Die Mycelausbreitung wurde über 10 verschiedene Temperaturbereiche im 5° C Turnus, beginnend bei 5° C bis 40° C (zusätzlich 38° C; 42° C) gemessen und ermittelt. Als Nährsubstrat diente MEA (2 % pH 6); die Platten wurden dunkel gelagert.

Tab. 2.3: Versuchs-Temperaturen und Anzahl der Wiederholungen für den Wachstumsversuch.

Temperatur 5° C 10° C 15° C 20° C 25° C 30° C 35° C 38° C 40° C 42° C

S. platani [N] 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

2.3.2 Substratansprüche

Als Basis wurden Nährmedien (HM I) aus verschiedenen Ausgangssubstarten (siehe 2.2.1) hergestellt. Hierfür wurden Hölzer [Buche (BU), Bergahorn (BAH), Platane (PLA), Fichte (FI)] und Platanenrinde (PLA-RI) mit unterschiedlicher Lignin-Zusammensetzungen und – Konzentrationen sowie das standardisierte MEA-Nährmedium (2 %), gewählt. Holz- chemisch betrachtet weist Fichtenholz hohe Guaiacyl-Einheiten auf, wohingegen

MATERIAL UND METHODEN

Festigungsgewebe von Buchen- und Platanenholz vor allem aus Syringl-Einheiten besteht und Gefäßwände durch erhöhte Guaiacyl-Gehalte charakterisiert sind. Ahornholz weist dagegen höhere Syringl-Einheiten im Grundgewebe und niedrigere Guaiacyl-Einheiten in

Gefäßwänden als Platanen- oder Buchenholz auf (SCHWARZE 2007; SCHWARZE 2018). Die Versuchsgefäße (Petrischalen) wurden unter sterilen Bedingungen beimpft und Kulturen unter gleichen Versuchsbedingungen (25° C) dunkel gelagert. Mittelwerte wurden hierbei nach 4, 7, 11, 18 und 21 Tagen ermittelt.

Tab. 2.4: Verwendete Substrate unterschiedlicher Ausgangsbasis für den Wachstumsversuch.

Substrat MEA Platanenholz Buchenholz Fichtenholz Bergahornholz Platanenrinde (2%) (PLA) (BAH) (FI) (BAH) (PLA-RI)

S. platani [N] 20 20 20 20 20 20

2.4 Holzabbau

2.4.1 Herstellung der Prüfkörper

Aus Starkästen von P. x hispanica wurden Holz-Prüfkörper (PK) herausgearbeitet. Die Maße der Prüfkörper wurden in Anlehnung an die DIN EN 113 (1996) (Prüfverfahren zur Bestimmung der vorbeugenden Wirksamkeit gegen holzzerstörende Basidiomyceten) hergestellt. Dabei wurden folgende Maße berücksichtigt: 50 mm x 25 mm x 15 mm (L x B x H, Variabilität von ± 0,5 mm). Visuell wurden Prüfkörper auf Holzfehler untersucht und jene, die Äste, Risse oder andere Holzfehler aufwiesen im Vorfeld ausgeschlossen. Zur späteren Identifizierung wurden Prüfkörper mit Nummern markiert und für 24 h bei 103° C im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstante darrgetrocknet. Nach Entnahme aus dem Trockenschrank wurden Prüfkörper für 20 min bei 20° C (± 60 % Luftfeuchte) klimatisiert und im Anschluss auf 0,001 g genau gewogen und als Anfangstrockenmasse ausgedrückt.

Abb. 2.2: A: Prüfkörper aus Platanenstarkästen für den Laborversuch Masseverlust; B: Maße der verwendeten Prüfkörper und Lage histologischer Präparate [roter Bereich Prüfkörper- Gradient]. 19

MATERIAL UND METHODEN

Sterilisation

Für den weiteren Versuchsablauf wurden die PK für 24 h in H2O gewässert und nachfolgend in den Autoklaven für 20 min bei einer Temperatur von 121° C und einem Druck von ca. 210 kPa sterilisiert.

2.4.2 Verwendete Pilzkulturen

Folgende Pilzkulturen wurden für in vitro Versuche als Prüf- bzw. Referenzpilze herangezogen:

Tab. 2.5: Verwendete Pilzkulturen für den Masseverlust (in vitro) an Platanenastholz.

Pilzart Isolat-Nr.

Trametes versicolor (Linnaeus: Fries) Pilát Schmetterlingstramete DSMZ 3086

Inonotus hispidus (Bull.: Fr.) Karsten Zottiger Schillerporling CBS 32.29

Splanchnonema platani (Ces.) M.E. Barr1) TBP2014.11) Massaria-Pilz 1) Isoliert aus Konidiosporen (M. desmazieri) von P. x hispanica im Stadtgebiet Freiburg.

Trametes versicolor (Linnaeus: Fries) Pilát

Dieser pilzliche Erreger, zur Familie der Polyporaceae (Stielporlingsverwandten) gehörend, verursacht eine simultane Weißfäule, bei der alle Holzkomponenten gleichermaßen abgebaut werden. Aufgrund der saprophytischen sowie parasitischen Lebensweise findet man T. versicolor häufig an Wunden nach Sonnenbrand an lebenden Bäumen sowie an toten Stubben von Laubhölzern. Seltener tritt dieser an Nadelholz in

Erscheinung (JAHN 1979, SCHEIDING et al. 2016). Zudem zählt dieser Pilz nach DIN EN 113 (1996) zu den obligatorischen Prüfpilzen hinsichtlich der Wirksamkeit von Holzschutzmitteln, die als schnellwüchsig (bis zu 18 mm pro Tag) beschrieben sind

(SCHEIDING et al. 2016).

Inonotus hispidus (Bull.: Fr.) Karsten

Inonotus hispidus zählt zur Familie der Hymenochaetaceae (Borstenscheiblingsartigen). Dieser Pilz hat ein breites Wirtsspektrum auf der nördlichen Hemisphäre und befällt bevorzugt Laubhölzer wie Esche, Walnuss, Eiche, Ulme und Apfel und vor allem Platane.

MATERIAL UND METHODEN

Eine Besiedlung des Wirtes erfolgt oftmals über große Astungswunden oder Astabbrüche mit freiliegendem Kernholz. Der Zottige Schillerporling ist in der Lage, Splintholz und

Kambium lebender Bäume zu parasitieren (BUTIN 2011). Einst von CAMPBELL (1931) als Weißfäuleerreger klassifiziert, nach neueren Erkenntnissen als „Dualer-Holzzersetzer“ beschrieben, ist I. hispidus in der Lage, Abwehrmechanismen des Splintholzes mit dem

Wechsel von einer simultanen Weißfäule auf eine Moderfäule zu umgehen (SCHWARZE et al. 1995, SCHWARZE & FINK 1997, SCHWARZE et al. 1999, BAUM & SCHWARZE 2001).

Splanchnonema platani (Ces) M.E. Barr (siehe Kap. 1.2; 1.2.1.; 2.1)

2.4.3 Vorgehensweise zur Anzucht der Pilze und Beimpfung der Versuchsgefäße

Eine einheitliche Ausgangssituation wurde gewährleistet, indem die verwendeten Holzzersetzer vor Versuchsbeginn auf Substrat-Nährmedien (HM I Medium PLA) gesetzt und im Anschluss in Versuchsgefäße (1000 ml SCHOTT-DURAN Flaschen) übertragen wurden. Diese wurden jeweils mit ca. 80 ml Nährmedium (MEA 2 %) gefüllt, so dass sich eine Nährmediumstiefe von etwa 4-5 mm einstellen konnte.

Konidiosporen von S. platani (bzw. M. desmazieri) wurden aus Subkulturen unter sterilen Bedingungen in Versuchsgefäße übertragen. Versuchsgefäße von T. versicolor und I. hispidus wurden mit jeweils drei Inkubationspunkten (Ø 10 mm) pro Gefäß angelegt (siehe Abb.2.3). Nachdem das Mycel die Oberfläche des Nährmediums komplett bewachsen hatte, wurden Versuchsgefäße unter sterilen Bedingungen mit Abstandshaltern und Prüfkörpern bestückt. Die Prüfkörper standen weder im direkten Kontakt zum Nährboden, noch berührten sich die einzelnen PK untereinander (siehe Abb. 2.3). Anschließend wurden die Gefäße mit einem 2-Wege-Membranverschluss verschlossen und in Versuchsposition gebracht.

Abb. 2.3: Schematischer Versuchsaufbau der Masse- bzw. Gewichtsverluste. A: Inkubation der S. platani Versuchsgefäße mittels Konidiosporen. B: Inkubation der T. versicolor und I. hispidus Versuchsgefäße mit je drei Inkubationspunkten. 21

MATERIAL UND METHODEN

Nach Beendigung der Inkubationszeiten wurde das Mycel jeden PK entfernt und diese im frischen Zustand und anschließend im darrtrockenen Zustand (103° C; 24 h) gewogen. Somit ergibt sich aus der Differenz beider Proben der prozentuale Holzfeuchtegehalt für jeden Prüfkörper. Der Masseverlust entspricht dem Gewichtsverlust durch Pilzabbau und wurde als Prozentanteil der Ausgangstrockenmasse ausgedrückt. Der nicht pilzbedingte Masseverlust wurde als mittlerer prozentualer Masseverlust der Kontroll-PK (ohne Pilz) ausgedrückt und korrigiert, indem dieser Wert vom prozentualen Masseverlust eines jeden Prüfkörpers abgezogen wurde.

Die Ermittlung der Masseverluste erfolgte mit folgenden Formeln nach DIN EN 113 (1996):

m m MV  0 3 *100 % m 0 Prozentualer Masse-/Gewichtsverlust Masseverlust in [g] pro Volumeneinheit [cm³]

MV Masseverlust durch Pilzabbau m0 Anfangstrockenmasse des Prüfkörpers vor Inkubation [g] m3 Endtrockenmasse des Prüfkörpers nach Inkubation ohne Prüfpilz [g] MA Masseverlust [g] pro Volumeneinheit [cm³] m0 Ausgangstrockenmasse des Prüfkörpers vor Inkubation [g] m3 Endtrockenmasse des Prüfkörpers nach Inkubation [g] V0 Volumen des Prüfkörpers [cm³]

Tab. 2.6: Anzahl der Prüfkörper für den Versuch Masseverlust.

Inkubationszeit Prüfkörper [N] Prüfkörper [N] Pilzart [Wochen] Masseverlust Mikroskopie

12 100 2 16 100 1 S. platani 24 100 1 32 76 2 52 - 1 80 - 2 12 50 1 T. versicolor 16 50 1 24 50 1 12 50 1 I. hispidus 16 50 1

24 56 1 12 14 1 16 14 1 Kontrolle 24 14 1 32 8 - 732 18

[N] gesamt 750

MATERIAL UND METHODEN

2.4.4 Druckfestigkeitsprüfung an pilz-infizierten Platanenhölzern

Die Pilz-infizierten Prüfkörper wurden anschließend auf biomechanische Eigenschaften überprüft. Angesichts der Belastungen beim Astabbruch wäre ein Prüfverfahren hinsichtlich der Schlagebiegefestigkeit oder Prüfungen der Druck- und Zugfestigkeit quer zum Faserverlauf zu wählen. Aufgrund der Prüfkörper-Dimensionierung sowie Beschaffenheit der Proben konnte aber ausschließlich eine Druckfestigkeitsprüfung pilz- inkubierter Prüfkörper parallel zur Faser in Betracht gezogen werden. Dennoch sollte diese Messung erste hinreichende Erkenntnisse auf in vitro inkubierte Hölzer im Hinblick auf den Einfluss der Pilze auf die Festigkeitseigenschaften liefern.

Die Prüfbedingungen lehnen sich an die DIN 52 185, „Bestimmung der Druckfestigkeit parallel zu der Faser“ (1976) unter homogenen, einachsigen Druckspannungen an. Pilz- inkubierte Proben wurden bei einer Temperatur von 20° C sowie einer relativen Luftfeuchte von 65 % bis zur Gewichtskonstante klimatisiert, sodass sich eine Holzfeuchte von annährend 12 % einstellen konnte. Die Untersuchungen wurden mit der Materialprüfmaschine ZWICK ROELL 1488 am Institut für Forstliche Biomaterialen (Universität Freiburg) durchgeführt.

Die Zugfestigkeit parallel zur Faserrichtung ist in etwa doppelt so hoch wie die

Druckfestigkeit bei Vollholz (SCHREIBER et al. 2007; NIEMZ & SONDEREGGER 2017). Als

Druckfestigkeit (σdB) wird jener Punkt bezeichnet, ab dem erste Anrisse auftreten, bevor das Material versagt und der eigentliche Bruch eintritt. Unter Zugbeanspruchung zerreißen die Holzfasern, doch unter Druckbeanspruchung in Faserrichtung versagt Holz durch Ausknicken der Faserbündel sowie durch Aufreißen des Verbundes. Bei weiterer

Belastung bildet sich eine Gleitebene (Abb. 2.4) schräg zu den Fasern (BODIG & JAYNE

1993; NIEMZ & SONDEREGGER 2017).

Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Druckfestigkeitsprüfung parallel zur Holzfaser, mit Ausknicken der Faserbündel (links) und Bildung der Gleitebene schräg zur Faser (rechts). Auswirkung der Druckbeanspruchung Bruchbild nach NIEMZ & SONDEREGGER (2017).

MATERIAL UND METHODEN

Das Verhalten Pilz-inkubierter Prüfkörper unter Druckbeanspruchung wurde mit Hilfe von Spannungs-Dehnungs-Diagrammen angegeben (Prüfsoftware testXpert®). Als Druck- festigkeit wird die maximal aufnehmbare Spannung eines Werkstoffes bei einer Druckbeanspruchung definiert. Diese bestimmt sich aus dem Ausgangsquerschnitt der Prüfkörper sowie aus dem Quotienten der maximal aufnehmbaren Druckkraft.

Daraus ergibt sich folgende Formel:

퐹 σ = dB 퐴 σ dB Druckfestigkeit[N/mm²] F Bruchkraft [N] A Querschnittsfläche der Prüfkörper [mm²]

2.5 Herstellung histologischer Präparate

Fixierung

Für die mikroskopische Untersuchung wurde zunächst pro Charge (Inkubationszeit) ein PK verwendet. Aus dem Inneren des Prüfkörpers wurden ca. 2,5 mm x 2,5 mm x 15 mm Stücke herausgearbeitet. Das geschah über alle PK in etwa an der gleichen Stelle, um Proben untereinander besser vergleichen zu können (siehe Abb. 2.2). Anschließend wurden die Proben in Fixierlösung (2 %iges Glutaraldehyd, Phosphatpuffer 0,1M, pH 7,2) eingelegt und im weiteren Anschluss im Exsikkator mit Hilfe einer Vakuumpumpe bei ca. 950 mbar entgast, so dass die gesamte Luft der Proben entweichen konnte.

Entwässern

Folgend wurden die bereits fixierten Proben drei Mal für je 2 h in H2O im Rotator geschwenkt und im Anschluss für je 12 h mit einer aufsteigenden Isopropanol-Reihe (50 %, 70 %, 90 %, 100 %) entwässert.

Einbettung

Im weiteren Verlauf wurden die Proben mit 100 %igem Isopropanol und Einbettlösung (Methacrylatharz) im Verhältnis 1:1 für 12 h infiltriert. Darauffolgend wurden diese für zwei Mal für 12 h ausschließlich in Einbettlösung eingelegt. Die Holzproben konnten anschließend in einer mit 0,4 %igen Katalysator versetzten Methacrylatharzlösung

MATERIAL UND METHODEN eingebettet werden. Folgend wurden diese in Gelatinekapseln ausgerichtet sowie mit Einbettlösung aufgefüllt und für 24 h im Wärmeschrank bei 60° C ausgehärtet.

Gewebeschnitte Mit einem Rotationsmikrotom (LEICA REICHERT-JUNG Typ Autocut 2040) erfolgten 1 und 3 μm dünne Gewebeschnitte. Diese wurden als Quer-, sowie Längsschnitte (Radial, Tangential) unter Verwendung eines Diamantmessers angefertigt und auf einem Objektträger fixiert. Unter Verwendung einer absteigenden Isopropanol-Reihe von

100 %igem Isopropanol bis einschließlich reinem H2O erfolgte ein Herauslösen des Einbettmittels.

2.5.1 Färbungen

Färbung Lignin Nachweis (makroskopisch)

 3 g Pholoroglucin in 100 ml Ethanol [Reagenz I]  100 g konz. Salzsäure in 362 g Aqua dest. (=8 %ige Lösung) [Reagenz II]

Reagenz I und II wurde im Verhältnis 1:4 gemischt und auf die Querschnittsflächen des Astholzes aufgetragen.

Mit dem Färbeautomaten HMSTM (CARL ZEISS Series Programmable Slide Stainer) wurden die Gewebeschnitte angefärbt. Hierbei wurden folgende Färbungen verwendet:

Normfärbung (nach FINK)

 12 h in 2 % iger wässriger Safranin- und 1 %iger Acriflavinlösung  30 min in 1 %iger wässriger Acid-Yellow 29-Lösung  5 min in 1 %iger wässriger Methylenblaulösung  2 min in 20 %iger wässriger Saccharoselösung

Kontrast-Färbung Cellulose Nachweis

 10 min. in 1 %iger Astrablaulösung (gelöst in 2 %iger Weinsäure)  30 min in 2 %iger wässriger Safraninlösung

MATERIAL UND METHODEN

Färbung Fluoreszenz

 30 min in 0,1 %iger alkoholischer Acridinorangelösung (nach FINK)Acridinorange

Mit Hilfe des Fluorochromes Acridinorange ist es möglich, Verholzungsunterschiede unter fluoreszierendem Licht hervorzuheben (SACHSSE 1965; AUFSEß 1973). Die gewonnenen Aufnahmen wurden unter Anwendung folgender Filterkombination: BP 450 nm - FT 510 nm - LP 520 nm im ZEISS® Axiophot-Mikroskop; Quecksilber-Hochdrucklampe 50 W) angefertigt und konnten unter Verwendung der Digitalkamera (ZEISS® Axiocam MRc 5) festgehalten und dokumentiert werden.

Suberin Nachweis  30 min in 0,2 %iger alkoholischer Sudan III Lösung (Zugabe von Glycerol im Verhältnis 1:1)

Zuletzt wurden die Präparate mit Hilfe von Eindeckmittel „DPX Mountant for histology“ (SIGMA) und einem Deckglas versiegelt.

2.6 Nachweis qualitativer Enzymaktivität

Die qualitative Nachweismethodik sollte erste Erkenntnisse liefern, welche Enzym-(sub)- klassen S. platani befähigt ist zu produzieren, die bei der Besiedlungs- und Zersetzungs- strategie eine wesentliche Rolle einnehmen. Inkubierte Pilzkulturen wurden auf MEA (2 %; pH-Wert 5,5 – 6) sowie auf PA1 Nährmedium (pH-Wert 5 und 7) angezogen und folgende Lösungen auf den aktiv wachsenden Rand des Mycels getropft [N=5]:

Polyphenoloxidase: Guajakharz 0,5 g in 30 ml Ethanol (95 % Ethanol) nach NOBLES (1958; 1965) auf MEA-Nährmedium.

Bei Anwesenheit von Polyphenoloxidase kommt es zu einer blauen Farbreaktion.

*) Laccase : 0,1 M α-Naphthol gelöst in 96 %igem Ethanol nach KÄÄRIK (1965) und STALPERS (1978) auf MEA-Nährmedium.

Bei Anwesenheit von Laccase kommt es zu einer purpurrötlichen Verfärbung des Mycels.

*) Tyrosinase : Lösung von 0,1 M p-Kresol in Ethanol (96 %) nach KÄÄRIK (1965); STALPERS (1978) auf MEA-Nährmedium.

Bei Anwesenheit von Tyrosinase verfärbt sich das Reagens orange- bis rotbraun.

MATERIAL UND METHODEN

*) Peroxidase : 0,4 % H2O2 in Aqua dest. und 1 % Pyrogallol nach TAYLOR (1974) & STALPERS (1978) auf MEA-Nährmedium.

Pyrogallol (1,2,3-Trihydroxybenzol) wird durch die Zugabe von H2O2 zum Purpurogallin (Trihydroxy-benz-tropolan) oxidiert. So zeichnet sich vorhandene Peroxidase durch eine rot-braune Farbreaktion aus.

Pektin-abbauende 1 % wässrige Lösung von Hexadecyltrimethylammoniumbromid Enzyme: nach HANKIN & ANAGNOSTAKIS (1975) auf PA1 Nährmedium [pH 7: Pektatlyase*) und pH 5: Polygalacturonase*)]

Da das Reagens intaktes Pektin im Nährboden präzipitiert, wird der Pektinabbau durch eine Klarzone um die Kolonie im sonst opaken Nährmedium sichtbar. Beim Vorhandensein der o. g. Enzyme kann eine Farbreaktion nach Auftragen der Lösungen als positiv gewertet werden. Nach Verabreichung der Lösungen wurden die Kulturen nach 3 h, 24 h, 48 h und 72 h auf Reaktionen kontrolliert.

2.6.1 Dualkutur-Test zum antagonistischen Potential von Trichoderma sp.

Das antagonistische Potential der Gattung Trichoderma spp. gegen pathogene Pilze ist seit längerer Zeit im Pflanzenschutz bekannt (CHET 1987, CHET et al. 1997, DE MEYER et al.

1998, HARMAN 2000, HOWELL et al. 2003, SCHUBERT 2006, SCHUBERT et al. 2008,

SCHWARZE et al. 2012, SINGH et al. 2012). Grundlage dieser Tests waren zum einen das wiederholende Auftreten von Vertretern der Gattung Trichoderma spp. bei Kultivierungs- und späteren Isolationsarbeiten. Zum anderen konnte eine spontan kontaminierte Kultur von S. platani mit Trichoderma sp. aus parallelen Versuchen im Labor an der Professur für Forstbotanik (VOGEL 2017) beobachtet werden. Es schien, als würde Trichoderma sp. das Mycelwachstum von S. platani zu unterdrücken. Nach molekulargenetischen Abgleich konnte der kontaminierende Pilz zweifelsfrei als Trichoderma harzianum klassifiziert werden. Um das antagonistische Potential von T. harzianum gegen S. platani zu qualifizieren, wurden Dualkultur-Tests durchgeführt. Petrischalen (MEA 2 %) wurden am Rand mit S. platani (Inkubationspunkt Ø 10 mm) inokuliert, eine Woche lang angewachsen, im Anschluss mit T. harzianum auf gegenüberliegender Seite inokuliert und bei 25° C im Wärmeschrank dunkel gelagert (siehe Abb. 2.5).

*) EC-Nomenklatur: Laccase (EC 1.10.3.2); Tyrosinase (EC 1.14.18.1); Peroxidase (EC 1.11.1.7); 27 Pektatlyase (EC 4.2.2.2); Polygalacturonase (EC 3.2.1.15)

MATERIAL UND METHODEN

Als Indikator für die Vitalität wurde die Laccase-Aktivität der Reinkultur (S. platani) sowie der Dualkultur (S. platani mit T. harzianum) herangezogen. Zum einen wurden diese qualitativ [N=3] nach Methodik KÄÄRIK (1965) und STALPERS (1978) mittels α-Naphthol sowie zum anderen quantitativ [N=3], photometrisch (Spektral-Photometer Specord S 100 ANALYTIK JENA) bestimmt. Die Absorptionsmenge wurde bei einer Wellenlänge von 420 nm über einen Zeitraum von 30 min gemessen. Für die Messung wurden wöchentlich je drei Dualkulturen herangezogen und die Ergebnisse mit denen der Reinkulturen (S. platani) über einen Versuchszeitraum von 5 Wochen gegenübergestellt. Je 1 g Pilzmycel [abzgl. Nährmedium; am aktiven Zuwachsrand] wurden aus den Versuchsgefäßen entnommen und ein Probe-Lösungsverhältnis (1:5) mit CP-Puffer hergestellt. Im weiteren Verlauf wurden Proben mittels Rotator [3 h 15 U/min] homogenisiert und anschließend bei 4000 x g sowie den filtrierten Überstand bei

10.000 x g zentrifugiert.

Citrat-Phosphat-Puffer (CP-Puffer)

 Zitronensäure (C6H8O7) 0,1 M in 500 ml Aqua dest.  Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) 0,2 M in 500 ml Aqua dest. pH 5

Durch die Zugabe des Redoxindikators ABTS 10 mM [2,2´-Azino-bis(3- ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)] in Aqua dest. war es möglich, die Spezifische Enzymaktivität (SEA) der Laccase mittels UV-Küvetten (halbmikro 1,5 ml) photometrisch zu bestimmen. Sobald ABTS zugegeben wird, beginnt die Oxidation und die SEA wurde im folgenden Zeitintervall: 0 min, 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min und 30 min gemessen. Die Kalibrierung erfolgte mit gereinigter Laccase aus Trametes versicolor (≥0.5 U/mg; 5 mg/ml dest. H2O). Als Referenz diente die Messung, CP-Puffer mit versetzten ABTS.

.Abb. 2.5: Schematischer Versuchsaufbau. A: Anlage Rein- und Dualkultur von S. platani und T. harzianum mit Entnahmestelle für photometrische Messungen (roter Kreis). B. Messung der Proben im Spektral-Photometer zur Bestimmung der Spezifischen Enzymaktivität von Laccase (SEA). 28

MATERIAL UND METHODEN

Die Einheit der SEA wird in [U/g] wiedergegeben. Diese beschreibt die Menge eines µ푚표푙 bestimmten Enzyms, die unter Standardbedingungen 1 µmol Substrat pro Minute [1 ] min umsetzt. In der heutigen Zeit wird die Einheit in vielen Forschungsarbeiten als Katal (kat, katalytische Aktivität) angegeben [1U =16,67 nkat].

2.7 Holzanatomischen Strukturen an Platanenästen

Um der Hypothese nachzugehen, ob ein bevorzugter Holzabbau der Astoberseite mit dem Vorhandensein von Zugholzstrukturen einhergehen, wurden Platanenäste diesbezüglich makro- und mikroskopisch kontrolliert. Zu Beginn der Untersuchungen zeigte die Astoberseite keine eindeutigen Zugholzstrukturen, dennoch traten im weiteren Versuchszeitraum diese Strukturen vermehrt auf. Versuchsbegleitend sowie im Rahmen einer Bachelorarbeit an der Professur für Forstbotanik (Universität Freiburg) wurden aus ca. 40 Jahre alten Platanen (P. x hispanica) Astproben für histologische Untersuchungen im Grob- und Starkastbereich entnommen (DOHRMANN 2018). Diese standen auf dem angrenzenden Nachbargrundstücks des Forstbotanischen Gartens. Die Äste wurden in je drei Segmente (Astbasis, zunehmender Astverlauf ca. Astmitte und Richtung Astende) sowie in Astober- und Astunterseite aufgetrennt (siehe Abb. 8.3.1 Anhang). Zunächst wurde die Phloroglucin-Salzsäure-Lösung (siehe 2.5.1) auf den gesamten Astquerschnitte aufgetragen, um bereits makroskopisch Bereiche vermehrter Cellulose über den gesamten Astquerschnitt zu bewerten sowie Bereiche für histologische Untersuchungen zu selektieren. Diese Methode eignet sich als Nachweis für Lignin, kann jedoch als sog. „Negativ-Nachweis“ für Cellulose herangezogen werden. Normalholz- Bereiche färben sich nach dem Auftragen der Phloroglucin-Salzsäure-Lösung in einem purpurroten Farbton, hingegen Zugholzbereiche aufgrund des höheren Cellulosegehalt weitaus heller mit einer geringeren Farbintensität in Erscheinung treten (CLARKE 1937). Anschließend wurden mikroskopische Gewebeschnitte für Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie angefertigt. Die Probenaufbereitung erfolgte unter dem Ablaufschema 2.2.4. Somit sollten Verholzungsunterschiede aufgrund der zugbelasteten Astoberseite oder ein mögliches Bestehen einer gelantiösen Schicht (G-Schicht) aufgedeckt werden.

MATERIAL UND METHODEN

2.8 Infektionsversuch an Bäumen bei unterschiedlicher Wasserversorgung

2.8.1 Versuchsfläche im Forstbotanischer Garten

Die Versuchsfläche befindet sich im Forstbotanischen Garten der Universität Freiburg auf einer (Streuobst-)Wiese neben der heute eingedämmten Dreisam. In früheren Zeiten mäandrierte diese durch das gesamte Gebiet, was sich deutlich an der Beschaffenheit des Bodens äußert. Grundsätzlich besteht ein recht homogenes, sandig-lehmiges Substrat. Ab einer Tiefe von etwa 40 cm zeigt sich eine deutliche Schicht mit abgerundeten Kieselsteinen (fluvialer Transport). Der Grundwasserspiegel kann generell entlang der Dreisam als relativ hoch angesehen werden; in einer Tiefe von etwa <100 cm (unterhalb der Geländeoberfläche), unter Berücksichtigung jahreszeitlicher sowie saisonaler *) Schwankungen (LANDSCHAFTSPLAN 2020 2006; MERZ 2014 , mündl. Mitteilung). Ab einer Höhe von ca. 12 m findet sich auf der Fläche eine technische Einrichtung (Stromversorgungsleitung) wieder.

2.8.2 Versuchsaufbau

In der Vegetationsruhe (Nov. 2014) wurden 10 Platanen im Forstbotanischen Garten gemäß den technischen Anforderungen, EMPFEHLUNGEN FÜR BAUMPFLANZUNGEN – TEIL 1

(2005; 2015; -Teil 2 2010); ZTV-GROßBAUMVERPFLANZUNG (2005) gepflanzt (Abb. 2.6). Die Jungbäume stammen einst aus der Baumschule [BROSSMER Ettenheim (Baden)].

Pflanzsortiment: Platanus x hispanica Anzahl [N]: 10 Höhe: ca. 900 cm StU: 31,0 – 36,0 cm Alter: 9,5 Jahre Wurzelballen Ø: ca. 80 cm Vermehrungsart: vegetativ aus Steckhölzern

Allen Versuchsbäumen wurde in regelmäßigen Abständen, je nach Wetterlage, die gleiche Wassermenge zugefügt, sodass diese bis dato gleiche Versuchsbedingungen aufwiesen und ein Anwachsen der Bäume gewährleistet war.

*) Technischer Leiter im Forstbotanischen Garten der Universität Freiburg 30

MATERIAL UND METHODEN

Aufgrund der Baum-Dimensionen mit reduziertem Wurzelvolumen sowie hoher Luft- temperaturen und fehlender Sommerniederschläge (Wassermangel/Trockenstress) während der Vegetationszeit musste den Bäumen der Variante b) „Unbewässert“ und c) „Unbewässert + Astschaden“ zusätzlich Wasser zugefügt werden, allerdings mit einer erheblich geringeren Menge (EMPFEHLUNGEN FÜR BAUMPFLANZUNGEN – TEIL 1 2005;

2015; -TEIL 2 2010). Einerseits war dieser Stress nahezu wünschenswert, doch andererseits musste ein erfolgreiches Anwachsen der Jungbäume gewährleistet sein. Ab Versuchsbeginn (Juli 2015) wurden nur gezielt Bäume der Variante a) „Bewässert“ (Baum Nr. 1, Nr. 6. Nr. 10 sowie d) „Kontrolle“ Nr. 7) eine zusätzliche Wassermenge von 100 l/Tag zugefügt.

Abb. 2.6: Pflanzung der Versuchsbäume im Forstbotanischen Garten in Freiburg. A: Wurzelballen ca. 80 cm Durchmesser. B: Vorbereiten der Versuchsfläche, mit ausreichendem Pflanzloch. C: Versuchsbäume nach Pflanzung mit Baumanbindung.

Vor Beginn der Inokulation wurden die Baum- und Astparameter Stammumfang, Astdurchmesser, -höhe, -abgangswinkel und die jeweilige Ast-Exposition aufgenommen, sowie inokulierte Äste eine Nummer zur späteren Identifikation zugeteilt. Zum Zeitpunkt der Pflanzung wurden alle Versuchsbäume im Kronenmantelbereich und auf einer Baumhöhe von 8 m, aufgrund standörtlicher Gegebenheiten (Stromversorgungsleitung) sowie zur Kompensation von Wurzelverlusten eingekürzt. 31

MATERIAL UND METHODEN

Vorversuche an Platanen-Steckhölzern

Im Vorfeld sollte überprüft werden, ob Inokula eine ausreichende Persistenz für folgende Feldversuche liefern. Aus einjährigen Platanenhölzern (P. x hispanica) wurden zum Ende der Vegetationsperiode, Steckhölzer [N=16] geschnitten, im Gewächshaus (Forst- botanischer Garten Freiburg) in Versuchsgefäße gepflanzt. Die Steckhölzer wurden zu Beginn der folgenden Vegetationsperiode nach dem Blattaustrieb mit je einem Inokulum mit Mycel von S. platani beimpft. Nach 5 Wochen wurden die Inokula entfernt. Ersichtlich war, dass bereits vor Abnahme der Inokula neu-ausgebildete Blätter welkten. Erste Anzeichen auf Rinden- und Kambiumnekrosen mit eingehender Holzzersetzung wurden ersichtlich. Die Inokula wiesen nach 5 Wochen noch aktives Mycel auf. Eine ausreichende Persistenz für die Inkubationszeit von 5 Wochen war somit gewährleistet. Die Wurzelausprägung der einzelnen Steckhölzer war dennoch unterschiedlich stark ausgeprägt, gleichwohl die Versuchspflanzen am Bewässerungssystem angeschlossen und eine ausreichende Wasserversorgung jederzeit gewährleistet war.

Infektionsversuch I: Erreger auf intaktem Rindenperiderm

Inokuliert wurden ausschließlich Äste nahe des Astbasis, astober und –unterseits auf intaktem Abschlussgewebe. Der Versuch wurde in drei verschiedene Behandlungsvarianten und einer Kontrollvariante gegliedert: a) „Bewässert“ [100 l/Tag], b) „Unbewässert“, c) „Unbewässert + Astschaden“ sowie d) „Kontrolle“ bewässert [100 l/Tag] ohne Schaderreger (siehe Tab. 2.8). Der Astschaden sollte den Effekt der Minderung des Xylemflusses bewirken.

Infektionsversuch II: Erreger auf geschädigtem Rindenperiderm

Mit einem Seziermesser wurden etwa 10 x 10 mm große Rindenstücke entfernt und anschließend auf dem Wundbereich mit S. platani inokuliert. Hierbei sollten Beobachtungen und Dokumentation im Feld sowie mikroskopische Analysen nahe dem Inkubationspunkt Aufschluss über mögliche Eintrittspforten in den Wirt liefern.

MATERIAL UND METHODEN

Tab. 2.7: Parameter für den Infektionsversuch.

Infektions- Laufzeit Ast-Dimension Periderm Äste [N] Asthöhe [cm] versuch [Monate] [Ø in cm]

I 28 Intakt 105*1) 2,0 – 4,1 220 - 515

II 16 Geschädigt 33*²) 1,4 – 3,8 280 - 525 *1) abzgl. Kontrolle ohne Schaderreger [N=10] *²) abzgl. Kontrolle ohne Schaderreger [N=4]

Tab. 2.8: Parameter für den Infektionsversuch I und II mit unterschiedlichen Behandlungsvarianten.

Infektions- Variante Bäume [N] Äste [N] Baum-Nr. versuch

a) „Bewässert“ *) 3 32 1, 6, 10

b) „Unbewässert“ 3 31 4, 8, 9 I c) „Unbewässert 3 32 2, 3, 5 + Astschaden“ d) „Kontrolle“ *) 1 10 7

a) „Bewässert“ *) 3 11 1, 6, 10

b) „Unbewässert“ 3 9 4, 8, 9 II c) „Unbewässert 3 9 2, 3, 5 + Astschaden“ d) „Kontrolle“ *) 1 4 7

) * Bewässerung von 100 l/Tag H2O während der gesamten Vegetationsperiode

MATERIAL UND METHODEN

Abb. 2.7: Versuchsfläche Forstbotanischer Garten (Freiburg), Versuchsbäume Platanen [N=10] mit jeweils unterschiedlichen Behandlungsvarianten; schematisch. Bäume mit Verankerungssystem (Seilverankerung) nach ZTV- GROßBAUMVERPFLANZUNG (2005).

MATERIAL UND METHODEN

2.8.3 Herstellung des Inokulums

Die Grundbasis für die Inokulate bildete ein 2 %iges MEA-Nährmedium. Nährmedien im flüssigen Zustand wurden mit Silikonschläuchen (Innen-Ø: 10 mm; Länge: 10 mm) bestückt. Der Flächeninhalt der Inokula betrug in etwa 78,54 mm², welche mit reproduzierten Konidien (aus Subkulturen) beimpft wurden (Abb. 2.8). Die Anzahl einzelner Konidien variierte unterschiedlich stark. Auf 1 mm² fielen in etwa 24 Konidio- sporen (gesamte Inokulum in etwa ± 1900 Konidiosporen; stichprobenartig ermittelt).

Nach 5 Tagen Anwachszeit konnten die Inokulate mit angewachsenen Mycel aus dem Medium herausgelöst werden. Inokula wurden an den Versuchsbäumen am Rindengewebe mittels Parafilm und Fixierbinden als Strahlungs- und Verdunstungsschutz angebracht (Abb. 2.9).

Abb. 2.8: Herstellung Inokulum. A: Vorbereitung Inokulum vor Beimpfung mit Konidiosporen. B: Medium nach Beimpfung mit Konidiosporen nach 24 h. C: Mikroskopische Aufnahme aus- keimender Konidiosporen (x4) D: Mycelentwicklung nach 72 h. E: Mikroskopischer Auszug von D. (x4). F: Inokulum nach 5 Tagen Wachstum mit ausreichender Mycelentwicklung.

MATERIAL UND METHODEN

Abb. 2.9: Anlage Infektionsversuch mit Inkubationspunkt. Schematische Darstellung der Ast- Inokulation (links), reale Darstellung am Platanenast (rechts).

Visuelle Inaugenscheinnahme der Versuchsbäume Inokulierte Äste wurden im 10 Tage Rhythmus während der Vegetationszeit sowie im blattlosen Zustand alle 14 Tage visuell auf Befall und Symptomausprägung von S. platani kontrolliert. Nach Entnahme inokulierter Äste wurden diese zunächst makroskopisch auf Ausprägung von Massaria typischen Symptomen ausgewertet und ergänzend Proben für histologische Untersuchungen mittels Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie aufbereitet (2.5.; 2.5.1).

2.8.4 Isolation von Mikroorganismen aus Rindengewebe der Platanenäste

Im Laufe des Versuchs wurden Rindenproben im Bereich der Inkubationspunkte entnommen. Diese wurden gründlich mit H2O gespült, im Anschluss oberflächensterilisiert [5 min in Ethanol (70 % Vol.); 5 min in 3 %iger NaOCl Lösung (6 % wirksames Chlor)] und im Anschluss auf Nährmedien (MEA-A, PLA-RI) gesetzt. Im Laufe des gesamten Versuchs wurden insgesamt 82 Rindenproben entnommen. Um die Koch`schen Postulate zu gewährleisten, war es wichtig, den Schadorganismus nach abgeschlossener Inkubation erneut in Reinkultur zu überführen.

Die im Zuge der Re-Isolationen gewonnen Mikroorganismen wurden zur Identifizierung und Bestimmung in regelmäßigen Abständen vereinzelt und bei 25° C im Wärmeschrank gelagert. Bakterien wurden hierbei nicht quantifiziert und ausgeschlossen. Der Fokus wurde hierbei auf das Reich der Pilze (Fungi) gelegt. Nach Anwachsen der Pilzkulturen

MATERIAL UND METHODEN erfolgte die systematische Einordnung anhand makro- und mikromorphologischer Charakteristika sowie mittels Molekulargenetik (siehe 2.1.2).

2.8.5 Wetterdaten

Die Wetterdaten stammen aus der meteorologischen Stadtstation der Professur für Umweltmeteorologie der Universität Freiburg. Alle 10 min wurden die Mittelwerte der Messgrößen berechnet, anschließend pro Tag in eine Datei geschrieben und grafisch mittels dem Programm MATLAB (MATHWORK) aufbereitet. Berücksichtigt wurden hierbei Niederschlagmengen und die Anzahl heißer Tage mit Maximalwerten ≥30° C Luft- temperatur.

2.9 Statistische Auswertung

Ermittelte Daten wurden auf Normalverteilung und Varianzgleichheit überprüft. Anschließend einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) unterzogen und auf Signifikanzen bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,05, für sehr signifikante Ergebnisse p≤0,01 und bei Hochsignifikanzen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,001 überprüft. Um Unterschiede aufzuzeigen, folgte ein Vergleich der Mittelwerte mit Hilfe des Post-Hoc-Tests nach Duncan sowie nach Tukey HSD. Für Analyse bestehender Korrelationen wurden der Bravais-Pearson und der Spearman’sche Korrelations- koeffizient bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit p≤0,05 sowie p≤0,01 berechnet.

Die Datenaufarbeitung erfolgte mit dem Programm EXCEL. Die statistische Auswertung wurde mit dem Programm SPSS für Windows (Versionen 24.0) durchgeführt.

ERGEBNISSE

3. Ergebnisse 3.1 Molekulargenetische Bestimmung

Die im Zuge der Isolation gewonnenen S. platani Kulturen wurden für die DNA- Sequenzierung mittels ITS 1 und ITS 2 Region vervielfältigt und im Anschluss sequenziert. Die sequenzierten Basenabfolgen wurden in die Software Chromas (Technelysium Pty Ltd; Version 2.6) eingespeist, um eine Darstellung der unterschiedlichen Peaks zu erhalten. Ein Chromatogramm mit hoher Signalintensität von S. platani Isolat TBP2014.1 findet sich im Anhang (Abb. 8.2.1). Mit Hilfe der BLAST-Search in der Gendatenbank (NCBI) konnte die Art durch die generierte Sequenz bestimmt werden. Für das Isolat TBP2014.1 sind die zwei ähnlichsten Einträge der Gendatenbank Macrodiplodiopsis desmazieri (Akzessionsnummer KR873236.1) sowie Splanchnonema platani (Akzessionsnummer MH855895.1); (vgl. Tab. 3.1). Die Sequenzübereinstimmung lag bei dem Isolat TBP2014.1 bei 99 %, der „E-Wert“, als Angabe der Wahrscheinlichkeit ging gegen Null (0.0).

Durch diese Methode erfolgte eine Verifizierung der am Isolationsspunkt auftretenden Arten im Rindengewebe. Somit konnten Kulturen zweifelsfrei als S. platani molekulargenetisch bestimmt und zugeordnet werden.

Tab. 3.1: Ergebnisse für PCR-Amplifikate des Pilz-Isolates S. platani TBP2014.1 der ITS 1 und ITS 2 Regionen; Datenbankeinträge in GenBank für die Suchsequenz mit Akzessions- sowie CBS- Nummer, Score- und E-Wert. Akzessions- (bp) Länge Score E-Wert Ident CBS-Nr Nr. 1094 MH855895.1 0.0 99 % CBS 222.37 599 1086 KR873236.1 0.0 99 % CBS 221.37

Somit konnte am Beispiel von TBP2014.1 gezeigt werden, dass für „Distance tree of results“ (Abb. 3.1) mittels BLAST Tree View Widget, das Pilzisolat direkt bei S. platani eingeordnet werden konnte. Grundlegend kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei dem Isolat TBP2014.1 zweifelsfrei um eine Kultur von S. platani handelt. Die Sequenz wies eine Basenlänge von 599 bp auf (gelb hinterlegt) und zeigte kürzere Längen als hinterlegte Sequenz-Einträge der Gendatenbank.

ERGEBNISSE

MH855895.1 Splanchnonema platani strain CBS 222.37 Sequenz:

GTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAATGGCCCAACACCCTCGGTCGCCCCCAGGCG TTCCGTTGCTGAGTGCTGGTCCGCACATGCCTCGTGTCAGTACGCACGCGATCGTGCCGAACCTCAGCCCGTC ACCGGGTGCGGCTCTTCGTCGCCGGGGCATCTGTGGGAACCCTTTGTCTACGTGTACCTTTTGTTGTTTCCTC GGTGGGCGCGAGCCCGCCGCCAGGAACCCCACAAACCCTTTTGCATCAGCATCCATTCTTCTGAACAAAACCT AAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT AGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGC ATGCCTGTTCGAGCGTCATTTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCGGCTCCGCGTGG ACTCGCCCCAAAGGCATTGGCGGCGGTCTTGCCAGCTTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCTGGAGGCAACGGA AAGGCCCGCGTCCATCAAGCACACCACGACTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAA

KR873236.1 Macrodiplodiopsis desmazieri strain CBS 221.37 Sequenz: AACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAATGGCCCAACACCCTTCGGTCGCCCCCAGGCGT TCCGTTGCTGAGTGCTGGTCCGCACATGCCTCGTGTCAGTACGCACGCGATCGTGCCGAACCTCAGCCCGTCA CCGGGTGCGGCTCTTCGTCGCCGGGGCATCTGTGGGAACCCTTTGTCTACGTGTACCTTTTGTTGTTTCCTCG GTGGGCGCGAGCCCGCCGCCAGGAACCCCACAAACCCTTTTGCATCAGCATCCATTCTTCTGAACAAAACCTA AATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA GTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCA TGCCTGTTCGAGCGTCATTTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCGGCTCCGCGTGGA CTCGCCCCAAAGGCATTGGCGGCGGTCTTGCCAGCTTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCTGGAGGCAACGGAA _GGCCCGCGTCCATCAAGCACACCACGACTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT CAA

[ ] Sequenz-Übereinstimmung Isolat S. platani TB2014.1 [ ] keine Sequenz -Übereinstimmung Isolat S. platani TB2014.1

Abb. 3.1: Ergebnisse aus BLAST Tree View Widget für Isolat S. platani TBP2014.1 Distance tree of results Report im distanzbasierten Verfahren (Neighbor-Joining-Methode) für die Suchsequenz als („unknown”) hinterlegt. Grün hinterlegt: NCBI-Taxonomie-Datenbank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ taxonomy) enthält eine Annotation des Typ-Materials, von CROUS (2015), mit den Genomen der GenBank-Sequenzen markiert werden; [Stand: 17.10.2018].

ERGEBNISSE

3.2 Kultivierung

Im Rahmen der Kultivierung konnte die Anamorphe von S. platani (Macrodiplodiopsis desmazieri) aus Konidiosporen von symptomatischen Platanenstarkästen im Stadtgebiet Freiburg kultiviert werden.

Binnen 24 h kam es bei 25° C zum Auskeimen der Konidiosporen. Diese wiesen eine Auskeimrate von >98 % auf. Durch regelmäßiges Umsetzen der Mycelien (Schema Abb. 2.1) konnten mit der Zeit weitere Pilze ausgeschlossen und eine Reinkultur gewonnen werden. Bei der Kultivierung mittels Konidiosporen konnten mehrfach wiederholt folgende Pilze bzw. Pilztaxa erfasst werden:

Pleosporales (Alternaria spp., Epicoccum nigrum); Hypocreales (Trichoderma spp., Fusarium spp.); Eurotiales (Aspergillus spp., Penicillium spp.); Capnodiales (Cladosporium spp.); Diaporthales (Phomopsis/Diaporthe spp.)

Die gewonnene Reinkultur diente als Grundlage für anschließende Untersuchungen und wurde in regelmäßigen Abständen auf folgende Nährmedien übertragen: H2O, MEA-A, HM1 (Platane mit ca. 0,2 %Rindenanteil), MEA und Subkulturen angelegt. Nach ca. 5-7 Wochen, dunkel bei 25° C gelagert, kam es zur Bildung pyknidialer Fruchtkörper mit beginnender Sporulation der Konidien.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte mehrfach aus Referenz-Bäumen im Stadtgebiet Freiburg S. platani aus infiziertem Gewebe von Schwach-, Grob- und Starkästen in Reinkultur isoliert werden. Aus infiziertem Holzgewebe erwies sich eine Kultivierung dennoch sehr aufwändig und schwierig, da S. platani gegenüber schnellwachsenden Pilzen benachteiligt ist. Nährmedien mit Thiabendazole (T-MEA 2 %) waren wachstumshemmend und verhinderten ein Auskeimen von Konidiosporen. Das nährstoffarme SNA-Medium erwies sich wirksam gegen bakterielle Verunreinigung und Ausbreitung, hierbei keimten Konidiosporen aus, dennoch stagnierte das Mycelwachstum innerhalb weniger Tage. Vorversuche zeigten, dass das Mycelwachstum auf PDA-Nährmedium auf ähnlichem Niveau anzusehen war wie MEA-Nährmedien. Im Zuge der Kultivierungsarbeiten wiesen sich Nährmedien im sauren pH-Milieu, wie MEA–A (Antibiotika) pH 4,5-5 als besonders wachstumsfördernd und effektiv. Im weiteren Versuchsverlauf zeigte das Platanenrindenmedium (PLA-RI) zwar hohe Wachstumstraten, wurde dennoch im Rahmen der Kultivierungsarbeiten aufgrund seiner Opazität zur Identifizierung und Vereinzelung gegenwärtiger Mikroorganismen als „bedingt geeignet“ eingestuft.

ERGEBNISSE

3.3 Wachstumsversuche

Um Unterschiede verschiedener Temperaturen und Substrate vergleichen zu können, wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Duncan durchgeführt.

3.3.1 Temperaturoptimum

Die Mittelwerte der Wachstumsraten sowie der statistischen Auswertung sind in Tab. 3.2 zusammengefasst. Die höchste Wachstumsrate zeigten S. platani Kulturen bei einer Versuchstemperatur von 30° C [42,18 mm²/Tag]. Diese unterschieden sich signifikant (p≤0,01) zu allen weiteren Versuchstemperaturen. Über die gesamte Versuchslaufzeit lagen die Wachstumsraten bei 20° C [26,32 mm²/Tag], 25° C [25,23 mm²/Tag] und 35° C [24,71 mm²/Tag] auf ähnlich hohem Niveau, sodass nach der statistischen Auswertung keine signifikanten Unterschiede (p≤0,01) bestanden (Abb. 3.3). Dennoch wiesen S. platani Kulturen bei 35° C nach 35 tägiger Versuchslaufzeit das höchste Mycelwachstum [1695,15 mm²] auf. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied (p≤0,01) zu Kulturen bei einer Temperatur von 20° C [880,21 mm²] und 25° C [939,45 mm²], allerdings kein signifikanter Unterschied zu 30° C [1580,66 mm²], sodass die Werte zum Zeitpunkt der Versuchsauswertung auf ähnlich hohem Niveau lagen (siehe Tab. 3.2).

Die Kulturen <20° C zeigten binnen 24 h eindeutig geringere Wachstumsraten. Die geringste Wachstumsrate konnte bei einer Temperatur von 5° C [0,76 mm²/Tag] festgestellt werden. Mit steigenden Temperaturen konnte ein verstärktes Mycelwachstum beobachtet werden, dennoch lagen die Wachstumsraten bei 10° C [1,34 mm²/Tag] sowie 15° C [4,67 mm²/Tag] auf ähnlich niedrigem Niveau wie bei 5° C und unterschieden sich nicht signifikant (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01) untereinander (vgl. Tab. 3.2; Abb. 3.3). Versuchstemperaturen >35° C zeigten rückläufige bis stagnierende Wachstumsraten [vgl. 38° C; 7,00 mm²/Tag], so zeigte sich bei Temperaturen ≥40° C keinerlei Mycelwachstum. Generell wiesen Wachstumsraten gleicher Versuchstemperaturen ein hohes Maß an Streuung auf (siehe Tab. 3.2 [SEM]; Abb. 3.4).

Nach 35-tägiger Versuchslaufzeit konnte eine zunehmende Bildung pyknidialer Fruchtkörper mit beginnender Sporulation bei Temperaturen ≥30° C und ≤35° C beobachtet werden. Kulturen bei 5° C Lagerung zeigten nach 12 Monaten immer noch ein stagnierendes Mycelwachstum ohne die Bildung von Pyknidien. 41

ERGEBNISSE

Während der gesamten Versuchslaufzeit wiesen S. platani Kulturen bei Temperaturen ≥20° C und ≤35° C das höchste Mycelwachstum auf. Somit findet dieser Erreger unter diesen Temperaturbedingungen ideale Wachstumsvoraussetzung vor (siehe Abb. 3.2).

Abb. 3.2: Verlauf Mycelwachstum von S. platani TBP2014.1 bei verschiedenen Lufttemperaturen über einen Versuchs- zeitraum von 35 Tagen auf MEA-Nährmedium (x̅ Mittelwerte).

Abb. 3.3: Wachstumsraten von S. platani TBP2014.1 [mm²/Tag] . (roter Kreis) Mittelwert (x̅ ), Balken Konfidenzintervall (99 %) bei verschiedenen Lufttemperaturen über einen Versuchszeitraum von 35 Tagen auf MEA-Nährmedium. Temperaturen mit gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht signifikant nach der ANOVA Varianzanalyse (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01). 42

ERGEBNISSE

Tab. 3.2: Mittelwerte (x̅ ) Mycelwachstum [mm²] und Wachstumsrate [mm²/Tag] von S. platani bei unterschiedlichen Lufttemperaturen; Werte mit gleichen Buchstaben in der Zeile unterscheiden sich nicht signifikant nach der ANOVA Varianzanalyse (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01); [SEM] Standardfehler des Mittelwertes.

Wachstumszeit Mycelwachstum [mm²] N [Tage] 5 °C 10 °C 15 °C 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 38 °C 40 °C 42 °C 3,04 4,13 15,79 44,16 67,02 253,80 72,13 12,34 0 0 5 10 [±0,39] [±0,96] [±1,62] [±5,33] [±3,05] [±17,99] [±8,36] [±3,56] [-] [-] a a a b bc d c a a a 4,10 5,71 17,99 148,74 175,04 365,96 119,75 27,78 0 0 8 10 [±0,55] [±0,76] [±2,22] [±18,75] [±10,45] [±40,72] [±20,87] [±8,06] [-] [-] a a a b b c b a a a 5,46 8,93 31,17 338,22 298,07 439,84 146,33 42,94 0 0 11 10 [±0,81] [±1,61] [±3,91] [±31,28] [±36,42] [±60,01] [±27,56] [±10,14] [-] [-] a a a c c d b a a a 7,30 10,81 46,86 433,88 345,20 473,00 173,64 56,31 0 0 14 10 [±0,99] [±1,72] [±5,63] [±38,57] [±52,91] [±67,24] [±35,86] [±12,42] [-] [-] a a a cd c d b ab a a 12,13 17,59 100,68 563,41 540,70 662,28 332,71 138,43 0 0 18 10 [±1,90] [±2,90] [±8,53] [±59,81] [±92,35] [±89,32] [±64,02] [±15,31] [-] [-] a a a c c c b a a a 23,49 45,29 166,60 732,46 735,49 1025,48 816,68 259,43 0 0 25 10 [±4,59] [±7,76] [±18,83] [±101,93] [±173,49] [±179,73] [±194,47] [±16,57] [-] [-] a a a b b b b a a a 32,38 66,03 202,11 802,39 825,81 1281,26 1246,32 336,59 0 0 29 10 [±5,66] [±10,86] [±28,24] [±112,88] [±197,12] [±239,14] [±283,89] [±20,74] [-] [-] a a a bc bc c c ab a a 41,64 87,92 228,24 880,21 939,45 1580,66 1695,15 436,29 0 0 35 10 [±6,96] [±13,18] [±34,63] [±102,18] [±201,04] [±288,53] [±314,56] [±22,97] [-] [-] a a a b b c c ab a a 0,76 1,34 4,67 26,32 25,23 42,18 24,71 7,00 0 0

x̅ [Tag] [±0,05] [±0,11] [±0,30] [±1,36] [±1,71] [±2,16] [±2,49] [±051] [-] [-] ab ab ab c c d c b a a

ERGEBNISSE

Abb. 3.4: Übersicht Mycelwachstum von S. platani TBP2014.1 mit Streuungswerten (Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil) bei unterschiedlichen Lufttemperaturen über die gesamte Wachstumszeit von 35 Tagen auf MEA-Nährmedium.

ERGEBNISSE

3.3.2 Substratansprüche

Die Ergebnisse der Wachstumsraten sind in Abhängigkeit der Versuchsdauer in Tab. 3.3 gegenübergestellt. An zwei Versuchsschalen des Buchen-Substrats (BU) traten Kontaminationen (Penicillium sp.) auf, sodass diese aus jener statistischen Auswertung entfielen. Das Mycelwachstum von S. platani kann allgemein als exzentrisch ungezont bezeichnet werden und zeigte unter gleichen Versuchsbedingungen eine breite Heterogenität der Streuung. Mit Ausnahme des MEA-Nährmediums bildete sich auf allen verwendeten Nährmedien ein hoher Anteil an Substratmycel. Dieses Nährmedium wies einen vergleichsweisen hohen Anteil an Luftmycel (siehe Abb. 3.5) auf.

Tab. 3.3: Mittelwerte (x̅ ) Mycelwachstum [mm²] und Wachstumsrate [mm²/Tag] von S. platani TBP2014.1 über einen Zeitraum von 21 Tagen auf unterschiedlichen Substraten, [SEM]. Werte mit gleichen Buchstaben in der Spalte unterscheiden sich nicht signifikant nach der ANOVA Varianzanalyse (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01).

Mycelwachstum [mm²] N Substrate 4 Tage 7 Tage 11 Tage 14 Tage 18 Tage 21 Tage x̅ [Tag]

30,07 90,91 281,54 505,14 878,89 1175,75 31,17 Platanenholz 20 [±0,92] [±3,94] [±16,08] [±33,14] [±70,55] [±91,79] [±4,75] b ab ab b b b b

63,00 347,36 1218,86 2044,04 2668,55 2945,21 100,99 Bergahorn 20 [±4,55] [±29,32] [±125,60] [±212,50] [±279,91] [±326,45] [±16,36] c c c c c c c

54,44 341,67 1336,37 2160,11 3398,81 4265,50 121,69 Platanenrinde 20 [±5,96] [±19,09] [±55,90] [±63,90] [±93,58] [±128,31] [±16,27] c c c c d d d

32,04 143,09 453,31 811,38 1187,07 1473,55 43,96 Buche 18 [±1,56] [±8,23] [±49,16] [±108,91] [±146,79] [±166,36] [±7,54] b b b b b b b

14,45 35,15 70,10 103,58 143,70 200,56 6,66 Fichte 20 [±0,82] [±1,11] [±3,36] [±4,99] [±5,81] [±9,92] [±0,54] a a a a a a a

39,08 113,75 369,29 646,67 1055,99 1360,38 38,20 MEA 20 [±3,15] [±8,17] [±20,43] [±40,40] [±85,96] [±119,40] [±5,66] b b b b b b b

Die geringste Wachstumsrate zeigte sich mit 6,66 mm²/Tag auf dem Fichten-Substrat (FI) und unterschied sich signifikant (p≤0,01) zu allen weiteren Substraten. Auf dem Platanenholz-Substrat (PLA) konnte eine Wachstumsrate von 31,17 mm²/Tag festgestellt werden. Über den gesamten Versuchszeitraum wies das PLA-Substrat geringere

ERGEBNISSE

Mycelzuwächse bzw. Wachstumsraten als MEA-Nährmedien oder BU-Substrat auf (siehe Tab 3.3).

Abb. 3.5: Mycelwachstum nach 21 Tagen auf Nährmedien mit unterschiedlichen Ausgangs- substraten. Auf dem MEA Nährmedium mit sichtbar höherem Anteil an Luftmycel im Vergleich zu den Nährmedien mit Rinden- bzw. Holzzusatz.

Nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Duncan zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (p≤0,01) und die Wachstumsraten verblieben auf dem PLA-Substrat auf ähnlichem Niveau wie MEA-Nährmedien [38,20 mm²/Tag] oder BU-Substrat [43,96 mm²/Tag]. Allerdings war nach 7 und 14 Tagen ein signifikant höheres Mycelwachstum auf dem BU-Substrat mit einer Irrtums- wahrscheinlichkeit von 5 % im Vergleich zum PLA-Substrat zu beobachten.

Hinsichtlich Holz- und Rindengewebe bestanden gravierende Unterschiede. Die höchste Wachstumsrate wies das Platanenrinden-Substrat (PLA-RI) mit einer Mycelfläche von 121,69 mm²/Tag auf und unterschied sich signifikant (p≤0,01) zu allen weiteren Substraten. Auf dem PLA-RI-Substrat war die Wachstumsrate 3,9-mal so hoch wie auf dem PLA-Substrat. Nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc-Test konnte über den gesamten Versuchszeitraum hochsignifikante Unterschiede auf dem Signifikanzniveau p≤0,001 beider Substrate festgestellt werden. So zeigte sich nach 21 tägiger Versuchsdauer auf dem PLA-RI-Substrat ein Mycelwachstum mit einer Fläche von 4265,50 mm² [SEM ±128,31] sowie mit 1175,75 mm² [SEM ±91,79] auf dem PLA-Substrat.

Zwischen dem Bergahorn und Platanenholz konnten maßgebende Unterschiede festgestellt werden. Die zweithöchste Wachstumsrate mit einem Zuwachs von 100,99 mm²/Tag wies das BAH-Substrat auf. Diese lag 3,2-mal so hoch wie auf dem PLA-Substrat. Während der gesamten Versuchslaufzeit bestanden zwischen dem BAH- und dem PLA-Substrat signifikante Unterschiede (p≤0,01), sodass zum Zeitpunkt der Versuchsauflösung das Mycelwachstum auf dem BAH-Substrat das 2,5 –fache der Fläche vom PLA-Substrat aufwies. 46

ERGEBNISSE

Zu Versuchsbeginn lagen Mycelien auf dem BAH- und dem PLA-RI-Substrat bis einschließlich dem 14. Versuchstag auf ähnlichem Niveau. Bis zu diesem Zeitpunkt konnten keine signifikanten Unterschiede (p≤0,001; p≤0,01; p≤0,05) beider Substrate festgestellt werden. Nach 18 tägiger Versuchsdauer zeigten sich jedoch hochsignifikante Unterschiede (p≤0,001). Auf dem PLA-RI-Substrat konnte eine Mycelfläche von 3398,81 mm² [SEM ±93,58] und auf dem BAH-Substrats eine Fläche von 2668,55 mm² [SEM ±279,91] festgehalten werden, hiermit lag die Mycelfläche um 21,49 % niedriger. Dieser Trend setzte sich nach 21 Tagen fort. Das PLA-RI-Substrat verzeichnete eine Fläche von 4265,50 mm² [SEM ±128,31] und lag somit um 30,95 % höher als das Mycelwachstum auf dem BAH-Substrat 2945,21 mm² [SEM ±326,45].

Auf dem BAH-Substrat zeigte sich jedoch das höchste Maß an Streuung. Das Mycelwachstum verblieb ab dem 14. Versuchstag bis zur Versuchsauflösung auf konstantem Niveau und die Mittelwerte unterschieden sich nicht signifikant (p≤0,01) zu den weiteren Wachstumszeiten. Auf dem PLA-RI-Substrat konnte hingegen eine kontinuierliche Mycelausbreitung zwischen den einzelnen Wachstumszeiten mit signifikanten Unterschieden (p≤0,01) bis zur Versuchsauflösung festgestellt werden (siehe Abb. 3.8).

Abb. 3.6: Entwicklung Mycelwachstum von S. platani TBP2014.1 (x̅ Mittelwerte) auf den verschiedenen Substraten über einen Zeitraum von 21 Tagen bei 25° C. 47

ERGEBNISSE

Abb. 3.7: Mycelwachstum von S. platani TBP2014.1 auf den verschiedensten Substraten bei 25° C mit Streuungswerten [Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil]; Tage mit gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht signifikant nach der ANOVA Varianzanalyse (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01).

Abb. 3.8: Wachstumsraten von S. platani TBP2014.1 [mm²/Tag] (roter . Kreis) Mittelwert (x̅ ), Balken Konfidenzintervall (99 %) auf verschieden Substraten bei 25° C über einen Versuchszeitraum von 21 Tagen. Substrate mit gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht signifikant nach der ANOVA Varianzanalyse (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01). 48

ERGEBNISSE

Abb. 3.9: S. platani TBP2014.1 Vergleich der einzelnen Substrate nach der Wachstumszeit bei 25° C. Werte mit gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht signifikant nach der ANOVA Varianzanalyse (Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01) [Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil].

ERGEBNISSE

3.4 Holzabbau

Die mittleren Gewichtsverluste, ausgedrückt als Masseverluste (absolut und relativ) der Prüfkörper-Pilz-Varianten, sind in Tab 3.4 zusammengefasst. Um die einzelnen Inkubationszeiten vergleichen zu können, wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Duncan auf dem Signifikanzniveau (p≤0,01) durchgeführt. Je ein PK der Kontrollvariante 12 und 16 Wochen waren mit Aspergillus sp. kontaminiert und fielen somit aus jener statistischen Auswertung.

Tab. 3.4: Ergebnisse der Masse- bzw. Gewichtsverluste und Holzfeuchte in Abhängigkeit der Inkubationszeit *[SEM].

Inkubationszeit Masseverlust Masseverlust Masseverlust Holzfeuchte Pilzart N [Wochen] [g] [%] [g] pro [cm³] [%]

0,63 5,89 0,033 71,68 12 100 [±0,01] [±0,11] [±0,001] [±0,74] 0,69 6,42 0,04 70,57 16 100 [±0,02] [±0,16] [±0,001] [±1,06] S. platani 0,96 8,8 0,051 69,38 24 100 [±0,02] [±0,21] [±0,001] [ ±0,95] 1,09 10,15 0,06 75,05 32 76 [±0,03] [±0,31] [±0,002] [±1,19] 2,91 28,44 0,155 62,92 12 50 [±0,05] [±0,52] [±0,003] [±1,85] 3,2 31,2 0,17 69,89 T. versicolor 16 50 [±0,07] [±0,70] [±0,004] [±1,96] 4,03 39,45 0,215 101,75 24 50 [±0,09] [±0,88] [±0,004] [±4,71] 0,91 8,97 0,048 101,13 12 50 [±0,02] [±0,20] [±0,001] [±1,82] 1,15 11,4 0,061 98,47 I. hispidus 16 50 [±0,02] [±0,17] [±0,001] [±1,40] 1,51 15,06 0,081 101,6 24 56 [±0,02] [±0,22] [±0,001] [±1,78] 0,11 1,1 0,01 79,58 12 13 [±0,01] [±0,10] [±0,0006] [±1,29] 0,13 1,22 0,01 84,37 16 13 [±0,01] [±0,06] [±0,0003] [±1,48] Kontrolle 0,14 1,35 0,01 80,44 24 14 [±0,01] [±0,07] [±0,0003] [±2,71] 0,14 1,38 0,01 86,54 32 8 [±0,01] [±0,12] [±0,0007] [±3,16]

ERGEBNISSE

Bereits nach 5 Wochen bildeten sich auf der PK-Oberfläche der mit S. platani inkubierten PK erste pyknidiale Fruchtkörper, welche massenhaft Konidiosporen aufwiesen, die bereits zu diesem Zeitpunkt auskeimfähig waren (siehe Abb. 3.10).

Abb. 3.10: Bildung pyknidialer Fruchtkörper von S. platani auf der PK-Oberfläche mit massen- haftem Austreten von Konidiosporen nach 5 Wochen in vitro. A: PK-Oberfläche mit Pyknidien und Austreten der Konidiosporen B: Mikroskopische Aufnahme massenhaft austretender Konidiosporen (x10).

Über alle Inkubationszeiten wiesen mit T. versicolor inkubierte PK die höchsten Gewichtsverluste auf. Während der gesamten Versuchslaufzeit konnten signifikante Gewichtsunterschiede (p≤0,01) nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc-Test zwischen den einzelnen Prüfpilzen festgestellt werden (siehe Abb. 3.12).

Kontrolle

Kontroll-Prüfkörper wiesen während der gesamten Versuchslaufzeit minimale Gewichts- bzw. Masseverluste auf. Mit steigender Inkubationszeit stiegen die Gewichtsverluste der Kontroll-PK kontinuierlich von 0,11 g (1,10 %) bis auf 0,14 g (1,38 %). Zwischen einzelnen Versuchszeiten zeigten sich keine signifikanten Gewichtsunterschiede (p≤0,01) und die Werte verblieben somit auf konstantem Niveau.

12 Wochen

Nach 12-wöchiger Inkubationszeit wiesen PK mit T. versicolor einen Gewichtsverlust von 28,44 % (2,91 g) auf, allerdings verzeichneten diese die höchsten Streuungswerte [SD 3,67]. Die geringsten Gewichtsverluste wiesen mit S. platani inkubierte PK von 5,89 % (0,63 g) auf, jedoch konnte das geringste Maß an Streuung [SD 1,14] aller Pilz- Kombinationen festgehalten werden. Mit T. versicolor inkubierte PK wiesen einen 4,8

ERGEBNISSE

-fach höheren prozentualen Gewichtsverlust als S. platani inkubierte PK auf. Somit bestanden zwischen beiden Pilzarten signifikante Unterschiede (p≤0,01). Mit I. hispidus inkubierte PK zeigten einen durchschnittlichen Gewichtsverlust von 8,97 % (0,91 g) und unterschieden sich signifikant (p≤0,01) zur T. versicolor und S. platani Variante.

16 Wochen

Nach 16-wöchiger Inkubationszeit zeigte sich ein ähnliches Bild. Mit T. versicolor inkubierte PK wiesen einen Gewichtsverlust von 3,20 g (31,20 %). Prüfkörper der S. platani Variante wiesen zu diesem Zeitpunkt einen Verlust von 0,69 g (6,42 %) auf, sodass die Werte der T. versicolor Variante um ein Vielfaches höher lagen und ein signifikanter Unterschied (p≤0,01) bestand. Die Behandlungsvariante mit S. platani zeigte nach 12- und 16-wöchiger Inkubation zwischen beiden Versuchszeiten keinen signifikanten Unterschied auf dem Signifikanzniveau p≤0,01, sowie p≤0,05, sodass der Masseverlust statistisch auf konstantem Niveau verblieb. Entsprechendes Bild spiegelte sich zwischen der Behandlungsvariante T. versicolor nach 12- und 16-wöchiger Versuchslaufzeit wider. Die Masseverluste nahmen zu, jedoch ohne statistisch signifikante Unterschiede. Einzig mit I. hispidus inkubierte PK wiesen signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Inkubationszeiten (p≤0,01) auf (siehe Abb. 3.13).

24 Wochen

Bei der T. versicolor Variante wurden die höchsten Gewichts- bzw. prozentualen Masseverluste ersichtlich. Der Weißfäuleerreger wies einen Masseverlust von 39,45 % [SD 6,21] sowie einen Gewichtsverlust von 4,03 g auf. Die geringsten Gewichtsverluste zeigten mit S. platani inkubierte PK mit einem durchschnittlichen Masseverlust im Mittel von 8,80 % [SD 2,05] sowie einen Gewichtsverlust von 0,96 g. So wiesen T. versicolor inkubierte PK nach 24-wöchiger Inkubation einen 4,5 –fach höheren Gewichts- bzw. Masseverlust, als S. platani inkubierte PK auf. Bei der I. hispidus Variante konnten nach dieser Zeit ein prozentualer Masseverlust von 15,06 % [SD 1,65] bzw. ein Gewichtsverlust von 1,51 g festgestellt werden. Dennoch zeigten mit I. hispidus inkubierte PK die geringsten Streuungswerte auf. Bei allen verwendeten Pilzen konnten nach 24-wöchiger Inkubationszeit signifikante Gewichtsunterschiede auf dem Signifikanzniveau (p≤0,01) festgestellt werden (siehe Abb. 3.12).

ERGEBNISSE

Verlängerte Inkubationszeit nach 32 Wochen

Für mit S. platani inkubierte PK wurde eine erweiterte Inkubationszeit gewählt. Nach 32 Wochen betrug der Masseverlust 10,15 % [SD 2,73] bzw. der Gewichtsverlust 1,09 g. Zwischen der 12- und 16-wöchigen Inkubation zeigte sich kein signifikanter Unterschied (p≤0,01), doch mit zunehmender Versuchsdauer stiegen die Gewichtsverluste an. Nach Anwendung der Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Duncan, konnten nach verlängerter Inkubationszeit signifikante Unterschiede (p≤0,01) verzeichnet wurden (Abb. 3.13).

Beschaffenheit der Prüfkörper nach Versuchsende

Prüfkörper der einzelnen Versuchsvarianten wiesen nach Versuchsauflösung verschiedene strukturelle Veränderungen sowie Unterschiede der oberflächigen Holzbeschaffenheit auf. Nach Entfernung des Mycelien trat das Holz der mit S. platani infizierten PK in einem deutlich dunkleren Farbton in Erscheinung als gesundes Platanenholz (PK der Kontroll- Variante). Das Mycel ließ sich schwerer vom PK entfernen als die Referenzpilze (T. versicolor, I. hispidus). Der Mycelbewuchs war anfangs sehr heterogen, sodass nach 5 Wochen die PK einen Bedeckungsgrad von ca. 50 % aufwiesen, doch nach 16 Wochen war ein Großteil der PK (90 %) komplett mit Mycel bewachsen. Im Anschluss wurden die PK mittels Stechbeitel gespalten und auf Holzbeschaffenheit kontrolliert (stichprobenartig). Das mit S. platani infizierte Holz wies eine spröde Konsistenz auf, dennoch geprägt durch ein hohes Maß an Steifigkeit. An den mit I. hispidus infizierten PK konnten an sämtlichen Proben pseudosklerotische Schichten in Form von Demarkationslinien nachgewiesen werden. Diese traten in einem orange-roten bis braunen

Farbton in Erscheinung (siehe Abb. 3.11F; mikroskopische Darstellung Abb. 3.26A). Das Holz erwies sich von spröder Beschaffenheit und zeigte ein helleres Erscheinungsbild als gesundes Platanenholz. Ein ähnlich charakteristisches Bild zeigten mit T. versicolor infizierte Prüfkörper, diese waren optisch heller als gesundes Holz und von spröder Beschaffenheit. Bereits nach zwei Wochen hatte das Mycel der T. versicolor und I. hispidus Variante die gesamte Oberfläche der PK zu 100 % vollständig umwachsen. Prüfkörper der T. versicolor Variante waren nach Versuchsauflösung bereits sichtlich durch pilzlichen Abbau geprägt.

ERGEBNISSE

Abb. 3.11: Prüfkörper nach 24- wöchiger Inkubation. A: PK mit Mycel von S. platani, Bedeckungsgrad ca. 90 %. B: PK mit S. platani nach Entfernung des Mycels. C: PK mit Mycel von T. versicolor Bedeckungsgrad 100 %. D: PK mit T. versicolor nach Entfernung des Mycels. E: PK mit Mycel von I. hispidus, Bedeckungsgrad 100 %. F: PK mit I. hispidus ohne Mycel mit Demarkationslinien im Holz. G: PK Kontrolle (gesundes Holz) nach Versuchsauflösung.

Abb. 3.12: Masseverlust der pilz-infizierten PK untereinander nach einzelnen Inkubationszeiten [Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil] Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse [Gruppenvergleich nach Duncan (p≤0,01) sowie nach 32-wöchiger Inkubation mittels T-Test (p≤0,01)].

ERGEBNISSE

Abb. 3.13: Masseverlust der pilz-infizierten PK nach unterschiedlichen Inkubationszeiten [Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil] Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse [Gruppenvergleich nach Duncan (p≤0,01)].

3.4.1 Holzfeuchte der Platanenhölzer

Der folgende Ergebnisteil soll Aufschluss darüber liefern, inwiefern sich Abbauleistungen durch Pilze und Feuchtigkeitskonzentrationen der PK untereinander unterscheiden. Über alle Inkubationszeiten verblieb die Holzfeuchte der Kontroll-PK auf ähnlichem Niveau. Die Holzfeuchte konnte nach 12 Wochen mit 79,58 % [SD 4,64], nach 16 Wochen mit 84,37 % [SD 5,35] und nach 24 Wochen mit 80,44 % [SD 10,14] festgehalten werden. Nach der verlängerten Versuchslaufzeit von 32 Wochen betrug die Holzfeuchte 86,54 % [SD 8,94].

Die Kontrollvariante zeigte während der gesamten Versuchsdauer (12, 16, 24, 32 Wochen) keine signifikanten Unterschiede (p≤0,01) nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse

ERGEBNISSE mit anschließendem Post-Hoc-Test nach Duncan und verblieb konstant auf einheitlichem Niveau.

Beim Vergleich einzelner Pilz-Varianten bzgl. der Versuchsdauer wiesen nach 12 Wochen alle Pilz-Varianten signifikante Unterschiede auf (p≤0,01). Die geringste Holzfeuchtigkeit zeigten T. versicolor inkubierte PK mit einer Holzfeuchte von 62,92 % [SD 13,05]. Die Holzfeuchte der S. platani Variante konnte mit 71,68 % [7,42] festgehalten werden. Die höchsten Gehalte der Holzfeuchte stellten Proben der I. hispidus Variante mit 101,13 % [SD 12,90] dar (siehe Abb. 3.14).

Abb. 3.14: Holzfeuchte der pilz-infizierten PK untereinander, mit Streuungs-

werten [Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil]; Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse [Gruppenvergleich nach Duncan (p≤0,01) sowie nach 32-wöchiger Inkubation mittels T-Test (p≤0,01)].

ERGEBNISSE

Nach 16-wöchiger Inkubationszeit verzeichneten mit S. platani infizierte PK eine Holzfeuchte von 70,57 % [SD 10,57], nach 24 Wochen eine Feuchte von 69,38 % [SD 9,49], sodass zwischen diesen Gruppen keine signifikanten Unterschiede (p≤0,01) bestanden. Nach der erweiterten Inkubationszeit von 32 Wochen verzeichneten PK eine Holzfeuchte von 75,05 % [SD 10,35]. Ferner konnten keine signifikanten Unterschiede der 12- und 32-wöchigen Inkubationszeit festgestellt werden. Lediglich die Holzfeuchte der 16- und 24-wöchigen Inkubationszeit unterschieden sich signifikant (p≤0,01) von der 32- wöchigen Inkubationszeit (Abb. 3.15).

Abb. 3.15: Holzfeuchte der pilz-infizierten PK mit unterschiedlichen Inkubationszeiten und Streuungswerten [Boxplot: Minimum, Maximum, Median, unteres und oberes Quartil]. Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant nach Anwendung der ANOVA Varianzanalyse [Gruppenvergleich nach Duncan p≤0,01) sowie nach 32-wöchiger Inkubation mittels T-Test (p≤0,01)].

Die I. hispidus Variante wies nach 12 Wochen eine Holzfeuchte von 101,13 % [SD 12,90] auf, nach 16 Wochen 98,47 % [SD 9,90] und nach 24 Wochen 101,12 % [SD 13,30].

ERGEBNISSE

Während der gesamten Versuchsdauer verblieb die Holzfeuchte auf konstantem Niveau, sodass keine signifikanten Unterschiede (p≤0,01) bestanden.

Prüfkörper der T. versicolor Variante wiesen anfangs geringere Gehalte der Holzfeuchte auf, doch mit steigender Inkubationszeit stieg die Holzfeuchte nach 16 Wochen auf 69,89 % [SD 13,87] sowie nach 24 Wochen auf 101,75 % [SD 33,28]. Somit lag die Holzfeuchte nach 12- und 16-wöchiger Versuchslaufzeit auf ähnlichem Niveau. Lediglich Proben, die einer erhöhten Versuchsdauer (24 Wochen) ausgesetzt waren, zeigten weitaus höhere Holzfeuchten und unterschieden sich signifikant (p≤0,01) zur 12- und 16-wöchigen Inkubationszeiten. Dieses wiesen allerdings das höchste Maß an Streuung auf.

Nach erweiterter Versuchslaufzeit von 32 Wochen betrug die Holzfeuchte der Kontroll-PK 86,54 % [SD 8,94] und lag somit nach Anwendung des T-Tests signifikant höher (p≤0,01) als S. platani inkubierte Proben mit 75,05 % [SD 10,35].

3.4.2 Beziehung zwischen Gewichtsverlust und Holzfeuchte

Im folgenden Ergebnisteil soll der Zusammenhang zwischen Gewichtsverlust und Holz- feuchte erfasst werden. In Abb. 3.16 sind Messwerte der Gewichtsverluste mit denen der Holzfeuchte gegenübergestellt. Es wird ersichtlich, dass signifikante Unterschiede der einzelnen Holzzersetzer auf Platanenholz bestehen.

Um auf mögliche Zusammenhänge zwischen Masseverlust und Holzfeuchte schließen zu können, wurde ein Kolmogorow-Smirnow-Test (KS-Test) zur Überprüfung auf Abweichungen von Normalverteilung der Datensätze mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,05 durchgeführt. Datensätze zeigten zum Teil Werte mit p>0,05 sowie p<0,05, weshalb ein Zweifel über ein Verwerfen der Nullhypothese bestand. Daraus folgerte sich eine Überprüfung der nicht-parametrischen Korrelation nach Spearman-Rho (p≤0,01) sowie der normalverteilten, parametrischen Korrelationsanalyse nach Bravais-Pearson (p≤0,01). Bezüglich ihrer Aussagekraft signifikanter Korrelationszusammenhänge konnte zwischen beiden Verfahren kein Unterschied festgestellt werden, dennoch zeigten sich geringe Abweichungen der ermittelten Korrelationskoeffizienten auf Grundlage der Berechnungsmethodik. Um den Zusammenhang zwischen dem Gewichtsverlust und der Holzfeuchte zu verdeutlichen, wurden für die Pilz-Wirt Beziehungen das Bestimmt- heitsmaß R² ermittelt sowie eine Regressionskurve in Abb. 3.16 eingefügt.

ERGEBNISSE

Bei den mit I. hispidus inkubierten PK konnte kein signifikanter Unterschied der Holzfeuchte über den gesamten Versuchsablauf festgestellt werden. Die Holzfeuchte verhielt sich über alle Inkubationszeiten auf ähnlichem Niveau, während Gewichtsverluste mit steigender Versuchsdauer zunahmen. Die statistische Auswertung nach Spearman-Rho auf dem Signifikanzniveau p≤0,01 zeigte positive Korrelationskoeffizienten von 0,09 (Bravais-Pearson 0,08), dennoch keinen bestehenden Zusammenhäng zwischen Holzfeuchte und Gewichtsverlust (R²=0,01).

Proben der T. versicolor Variante zeigten folgendes Bild: Bei der Gegenüberstellung der Masseverluste mit Werten der Holzfeuchte wird ersichtlich, dass mit steigendem Gewichtsverlust die Holzfeuchte der Proben anstieg. Prüfkörper mit hohen Gewichtsverlusten zeigten relativ hohe Gehalte der Holzfeuchtigkeit. Die statistische Korrelationsanalyse nach Spearmann-Rho zeigte eine positive Beziehung zwischen Holzfeuchte und Gewichtsverlust mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,67 (Bravais- Pearson 0,76), bei einem Signifikanzniveau von p≤0,01. Die mit T. versicolor inkubierten Proben wiesen das höchste Bestimmtheitsmaß (R²=0,57) aller Pilz-Wirt Proben auf (Kontroll-PK R²=0,12).

Prüfkörper der S. platani Variante zeigten dagegen einen entgegengesetzten Trend. Während bei T. versicolor inkubierten PK mit steigendem Gewichtsverlust eine Zunahme der Holzfeuchte beobachtet werden konnte, zeigten die PK der S. platani Variante mit steigendem Gewichtsverlust eine Abnahme der Holzfeuchte (beidseitig signifikant). Die statistische Auswertung der Spermann`schen Korrelationsanalyse zeigte eine negative Beziehung zwischen Holzfeuchte und Masseverlust bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,16 (Bravais-Pearson 0,27) und einem Signifikanzniveau von p≤0,01. Das Bestimmtheitsmaß an den mit S. platani inkubierten Proben war hingegen deutlich geringer (R²=0,10) als bei T. versicolor.

ERGEBNISSE

60 T. versicolor I. hispidus

S. platani R² = 0,57 50 Kontrolle

Masseverlust [%] Masseverlust 20

R² = 0,01 R² = 0,10 10

R² = 0,12 0 0 50 100 150 200 250 Holzfeuchte [%] Abb. 3.16: Beziehung zwischen Masseverlust [%] und Holzfeuchtigkeit [%] der pilz-infizierten PK mit Regressionskurve ln(x) sowie Bestimmtheitsmaß R².

3.4.3 Druckfestigkeitsmessungen an pilz-infizierten Hölzern

Durch Druckfestigkeitsmessungen parallel zur Faser sollte überprüft werden, inwiefern die Gewichts- bzw. der Masseverlust der PK die Druckfestigkeit beeinflusst. Hierbei soll die Messung erste hinreichende Erkenntnisse auf den Einfluss der Druckfestigkeit bei einer Abnahme der Rohholzdichte mit S. platani liefern. Die Ergebnisse der Druckfestigkeitsmessung pilz-infizierter PK sind in Tab. 3.5 dargestellt. Um Zusammenhänge zwischen Abnahme der Rohholzdichte und Druckfestigkeit schließen zu können, wurde eine parametrische Korrelationsanalyse nach Bravais-Pearson auf dem Signifikanzniveau p≤0,01 durchgeführt.

ERGEBNISSE

Tab. 3.5: Mittelwerte der Druckfestigkeitsmessung parallel zur Faser [*SEM].

Abnahme **) Druckfestigkeit Masseverlust Pilze N Fäuleart Rohholzdichte σ [N/mm²]* [%]* dB [g/cm³]* 43,99 0,051 9,05 S. platani 52 Moder- [±0,82] [±0,003] [±0,52] 20,19 0,199 36,88 T. versicolor 32 Weiß- [±1,12] [±0,007] [±1,33] 40,44 0,069 12,82 I. hispidus 33 Weiß-, Moder- [±0,90] [±0,003] [±0,50] 54,48 0,005 0,92 Kontrolle 21 - [±1,08] [±0,0004] [±0,08] **) gemittelter Masseverlust geprüfter PK [N]

Gesundes Platanenastholz war mit einer durchschnittliche Druckfestigkeit von 54,48 N/mm² [SD 4,96] bei einer Abnahme der Rohholzdichte von 0,005 g [SD 0,002] zu verzeichnen. S. platani inkubierte PK wiesen hingegen eine Druckfestigkeit von 43,99 N/mm² [SD 5,91] bei einer Abnahme der Rohholzdichte von 0,051 g/mm³ [SD 0,022] bzw. einem Masseverlust von 9,05 % [SD 3,73] auf. Somit lagen PK der S. platani Variante mit einem Mittelwert um 19,25 % niedriger als PK der Kontroll- Variante. Die statistische Auswertung der Korrelationsanalyse nach Bravais-Pearson zeigte eine negative Korrelation (r=0,823), bei einem zweiseitigen Signifikanzniveau von p≤0,01. Somit wird deutlich, dass die Abnahme der Rohholzdichte der S. platani inkubierten Proben mit einer Abnahme der Druckfestigkeit parallel zur Faser korrelierte.

Besonders deutlich wurde dieses bei mit T. versicolor infizierten PK. Bei einem Masseverlust von 36,88 % [SD 7,53] konnte bei den Proben eine Druckfestigkeit von 20,19 N/mm² [SD 6,36] ermittelt werden. Die Korrelationsanalyse von Bravais-Pearson zeigte eine negative Korrelation (0,934) bei einem zweiseitigen Signifikanzniveau von p≤0,01. Somit lag die Druckfestigkeit der mit T. versicolor infizierten PK lediglich bei 37,06 % im Vergleich zur Kontrollvariante.

Um den Zusammenhang zwischen der Abnahme der Rohholzdichte bzw. Masseverlust und Minderung der Festigkeitseigenschaften zu verdeutlichen, wurde eine Regressionsgerade in Abb. 3.17 eingeführt sowie das Bestimmtheitsmaß der Pilz/Holz Variationen ermittelt. Das Bestimmtheitsmaß der S. platani Variante konnte mit R²=0,68 festgehalten werden. Bei PK der T. versicolor Variante lag das Bestimmtheitsmaß hingegen bei R²=0,87 und

ERGEBNISSE somit um das 1,25 –fache höher. Das geringste Bestimmtheitsmaß konnte an PK mit zeigten mit I. hispidus infizierte PK (R²=0,22).

Prüfkörper der I. hispidus Variante lagen um 25,77 % niedriger als PK der Kontroll- Variante. Die statistische Auswertung verdeutlichte, dass nach der Bravais-Pearson Korrelation ein negativer Zusammenhang (r=0,471) auf dem Signifikanzniveau p≤0,01 bestand, dennoch war dieser nicht so stark charakteristisch wie bei der S. platani oder der T. versicolor Variante. Der als „dualer Holzzersetzer“ bekannte Pilz zeigte trotz höherer Abnahme der Rohholzdichte von 0,069 g/mm³ [SD 0,017] bzw. einem Masseverlust von 12,82 [SD 2,85] höhere Verluste der Druckfestigkeit als S. platani, dennoch ein geringeres Bestimmtheitsmaß.

60 S. platani T. versicolor R² = 0,87 I. hispidus 50 Kontrolle

Masseverlust [%] Masseverlust

20 R² = 0,68

R² = 0,22

R² = 0,05 0 60 50 40 30 20 10 0 Druckfestigkeit [N/mm²]

Abb. 3.17: Beziehung zwischen prozentualen Masseverlust und Abnahme der Druckfestigkeitseigenschaften parallel zur Holzfaser der pilz-infizierten PK [R²=Bestimmtheitsmaß mit Regressionsgeraden (linear)].

ERGEBNISSE

3.4.4 Durchlichtmikroskopische Untersuchungen über das Besiedlungs- und Holz- zersetzungsmuster in vitro

Holzabbau durch S. platani

Die histologischen Gewebeschnitte zeigten nach 12-wöchiger Inkubationszeit ein inhomogenes Bild. Auf der einen Seite traten Bereiche mit vollständig intakten Zellwandstrukturen ohne Hyphenaufkommen hervor, zum anderen tauchten Bereiche mit erhöhtem Hyphenaufkommen sowie mit einem intensiv vorangeschrittenen Zellwandabbau auf (siehe Abb. 3.18). Über den gesamten Prüfkörper-Gradienten entstand somit ein recht uneinheitliches Bild. Im Initialstadium lagen Hyphen vermehrt im Lumen parenchymatischer Zellen. Mit steigender Inkubationszeit waren Hyphen nicht auf diese Zelltypen beschränkt, sondern zeigten sich vermehrt im Zelllumen aller Gewebetypen (Gefäße, Fasertracheiden, Holzstrahlen sowie Axialparenchym). Die einzelnen Hyphendurchmesser waren hierbei unterschiedlich stark variierend, in Abhängigkeit besiedelter Zellkomponenten. So zeigten Hyphen innerhalb der Sekundärwand eindeutig geringere Durchmesser als Hyphen im Zelllumen.

Abb. 3.18: Nach 12-wöchiger Inkubation mit S. platani, (Querschnitt) Bereiche mit intakter Holzstruktur (dunkle Bereiche) und Bereiche, die sichtlich durch Zellwandabbau geprägt sind, helle Bereiche Bildmitte; gefärbt mittels Normfärbung (x10).

ERGEBNISSE

Die Hyphenverbreitung erfolgte hierbei über die Tüpfel von Zelle zu benachbarten Zellen sowie durch Gefäßenddurchbrechungen zweier Gefäße, nach dem Ausbreitungsschema des geringsten Widerstandes. Auffällig war, dass Hyphen in Gefäßlumina sowie parenchymatischen Zellen (axial-, apotrachealem-, paratrachealem-) über das gesamte Präparat vorkamen, obwohl die Zellwände dieser Zellen vollkommen intakt waren. Es scheint, als ob S. platani parenchymatische Zellen zur schnelleren Hyphenverbreitung bevorzugt. Auf den histologischen Präparaten war häufig ein Ablösen der Sekundärwandschicht von der Mittelschicht zu beobachten, welche nicht auf pilzlichen Abbau zurückzuführen war. Gleiches charakteristisches Bild zeigte sich bei der Kontroll- Variante gesundem Platanenholzes. Der pilzliche Zellwandabbau äußerte sich durch einen bevorzugten Abbau der S2-Schicht mit den typischen Symptomen einer Moderfäule. Ein einheitlicher Moderfäule-Typ lässt sich aus den histologischen Präparaten nicht eindeutig ableiten. Im Initialstadium der Holzzersetzung war der Anteil mit Symptomen des Typ 1 überwiegend hoch, dennoch tauchten im Laufe der Untersuchungen mit zunehmender Inkubationszeit Zellwände auf, die dem Typ 2 zugeschrieben werden konnten (siehe Abb. 3.19-3.21). Der Zellwandabbau erfolgte ausschließlich in Hyphennähe in Form von kreisrunden Löchern und Kavernen innerhalb der S2-Schicht, während ein Großteil der S3- Schicht längere Zeit erhalten blieb. Auf histologischen Präparaten traten dennoch immer wieder vereinzelt Bereiche hervor, bei denen Hyphen in die S3-Schicht hinein erodierten. Mit steigender Inkubationszeit verschmolzen Löcher und Kavernen zu immer größeren Hohlräumen innerhalb der Sekundärwand.

Abb. 3.19: Künstliche Infektion von Platanenholz. Querschnitt (x40) A: Gesundes Platanenholz (Kontrolle). B: Hyphenaufkommen in allen Gewebezelltypen, bevorzugter Abbau der Faser- tracheiden nach 16-wöchiger Inkubationszeit. Holzstrahlen und Gefäße trotz des intensiven

Hyphenaufkommens intakt. Abbau der Sekundärwand der Fasertracheiden mit Resten der S3- Schicht, Mittelschicht intakt, gefärbt mittels Normfärbung (x40).

ERGEBNISSE

Die S1- und S2-Schicht waren zum Teil vollständig abgebaut, die S3-Schicht hingegen blieb längere Zeit erhalten und kollabierte erst mit steigender Inkubationszeit, was sich durch ein Zusammenfallen zum Lumen hin äußerte (siehe Abb. 3.21). Dieses charakteristische Bild zeigte sich auch bei Referenzproben auf histologischen Gewebeschnitten natürlich infizierten Platanenholzes. Mit zunehmender Inkubationszeit wurde der Zellwandabbau

über den gesamten Prüfkörper-Gradienten ersichtlich und die S3-Schicht konnte verstärkt abgebaut werden. Die S2-Schicht war von größeren Hohlräumen durchsetzt. Allerdings traten über das gesamte Präparat Bereiche auf, wo diese Schicht in veränderter Form erhalten blieb. Nach 16- und 24-wöchiger Inkubationszeit wiesen Gefäßwände, Axialparenchym und Holzstrahlen trotz der zahlreichen Hyphenbesiedlung keinerlei Zersetzungserscheinungen auf und waren zu diesem Zeitpunkt nahezu intakt. Längsschnitte der histologischen Untersuchungen zeigten keine T-förmige Hyphen- verzweigung innerhalb der Sekundärwand dieser Zellen.

Abb. 3.20: Künstlich infiziertes Platanenholz mit S. platani nach 16-wöchiger Inkubationszeit (x100) A: Längsschnitt: Hyphenverbreitung durch Gefäßdurchbrechungen (Tüpfel) der wasserleitenden Gefäße B: Längsschnitt: Abbau von Fasertracheiden vom Zelllumen her, Einerodieren der Sekundärwand und Durchdringen der S3-Schicht C: Querschnitt: bevorzugter Abbau der S2-Schicht mit kreisrunden, ovalen Löchern und Kavernen in der Sekundärwand die ineinander zu größeren Hohlräumen verschmolzen; längeres Bestehen der S3-Schicht D: Längsschnitt: Hyphenwachstum und Abbau der Sekundärwand in longitudinaler Richtung, im Verlauf der Cellulose-Mikrofibrillen gefärbt mittels Normfärbung (x100). 65

ERGEBNISSE

Hinsichtlich des Holzzersetzungsgrades konnten zwischen Fasertracheiden im Früh- und Spätholz keine Unterschiede festgestellt werden, dennoch erwiesen sich Zellwände im Bereich der Jahrringsgrenzen aufgrund höheren Lignifizierungsgrades widerstandsfähiger gegen einen Zellwandabbau als Fasertracheiden im Grundgewebe. Nach 24-wöchiger Inkubationszeit war der Bereich des Zellwandabbaus über das gesamte Präparat verbreitet. Gefäßwände wiesen bis zu diesem Zeitpunkt vollständig intakte Zellwandstrukturen auf. Mit steigender Inkubationszeit kamen immer mehr Bereiche zum Vorschein, bei denen die

S3-Schicht komplett abgebaut wurde und nur noch die ligninreiche Mittelschicht bestehen blieb.

Abb. 3.21: Künstliche Infektion von Platanenastholz nach 24 Wochen. A: Querschnitt Durchlicht- mikroskopie: Gefäße weisen intakte Zellwände auf, Fasertracheiden hingegen bevorzugter Abbau der Sekundärwandschicht S2, mit zum Teil noch vorhandener S3-Schicht, gefärbt mittels Normfärbung (x40). B: Querschnitt Fluoreszenzmikroskopie, bevorzugter Abbau der S2-Schicht, mit zum Lumen hin kollabierender S3-Schicht, gefärbt mittels Acridinorange (orange-roter Farbton, Bereiche erhöhter Cellulose (x100).

Nach 32-wöchiger Inkubationszeit zeigten Gefäß- und Holzstrahlenwände vereinzelt erste Anzeichen des Zellwandabbaus (siehe Abb. 3.22). Dennoch kann festgehalten werden, dass diese hier nur vereinzelt auftauchten. Bei Betrachtung des gesamten Prüfkörper- Gradienten traten nach 32-wöchiger Inkubation im Wesentlichen immer wieder Bereiche mit intakten Zellwänden hervor.

ERGEBNISSE

Abb. 3.22: Querschnitt künstliche Infektion von Platanenastholz mit S. platani nach 32–wöchiger Inkubationszeit. A: Übersicht Abbau von Fasertracheiden (x10). Holzstrahlen intakt, mit widerstandsfähiger Jahrringgrenze. B: Abbau von Fasertracheiden und Parenchymzellen (x40). C: erste Anzeichen des Gefäßwandabbaus, Zellwände der Holzstrahlen intakt (x100); gefärbt mittels Normfärbung.

ERGEBNISSE

Mikroskopische Untersuchungen nach erweiterter Inkubationszeit mit S. platani

Nach einjähriger sowie 1,5-jähriger Inkubationszeit traten vermehrt Bereiche auf, bei denen Gefäßwände, Parenchymzellen sowie Holzstrahlen vom Abbau geprägt waren. Über das gesamte Präparat zeigten sich Bereiche, bei denen die Sekundärwand der Fasertracheiden großenteils vollständig abgebaut war und lediglich die Mittelschicht als Grundgerüst erhalten blieb. Zunehmend konnte beobachtet werden, dass S. platani in der Lage war, nach der erweiterten Inkubationszeit von 1,5 Jahren vereinzelt die Mittelschicht zu durchbrechen (siehe Abb. 3.23C, D). Dieses Bild zeigte sich in Unabhängigkeit der einzelnen Zelltypen im Platanenholz.

Abb.3.23: Künstliche Infektion von Platanenastholz mit S. platani. Nach erweiterter Inkubationszeit A: Längsschnitt durch einen Holzstrahl, Sekundärwandabbau im Holzstrahl mit Resten der S3- Schicht nach einjähriger Inkubation (x40), B: Querschnitt Gefäßwandabbau nach einjähriger Inkubation Mittelschicht bleibt als Grundgerüst erhalten (x40), C: Querschnitt nach 1,5 jähriger Inkubation Sekundärwand weitgehend abgebaut, übrig bleibt die ligninreiche Mittelschicht (x40), D: Vergrößerung von C, Abbau der Gefäßwand bzw. Mittelschicht nach 1,5 Jahren; gefärbt mittels Normfärbung (x100).

ERGEBNISSE

Holzabbau durch Trametes versicolor

Nach 12-wöchiger Inkubation zeigten sich über das gesamte histologische Präparat zahlreiche Hyphen in jedem Zelltyp (Fasertracheiden, Gefäßen, Holzstrahlen, Axialparenchym). Die Pilzhyphen lagen hierbei im Lumen. Tüpfelöffnungen zu benachbarten Zellen waren sichtlich erweitert (siehe Abb. 3.24A). Bis zu diesem Moment waren bereits alle Zelltypen befallen und Abbauerscheinungen deutlich sichtbar. Der Zellwandabbau erfolgte progressiv in allen Zelltypen. Abbauerscheinungen der Zellwand zeigten sich über den gesamten Querschnitt bzw. Prüfkörper-Gradienten. In Hyphennähe folgte der Abbau der Sekundärwand und Mittelschicht. Die Randbereiche der Proben, welche in den Gefäßen direkten Außenkontakt mit Mycel hatten, zeigten verstärkt Bereiche mit vermehrtem Zellwandabbau. In histologischen Gewebeschnitten wird deutlich, dass T. versicolor die Zellwände des Platanenholzes mit der typischen Form einer simultanen Weißfäule abbaut, wobei die Zellwandbestandteile (Cellulose, Hemicellulose und Lignin) gleichzeitig durch die Hyphenspitze vom Lumen aus zur angrenzenden S3- Schicht abgebaut werden. Wasserleitende Gefäße zeigten im Lumen hohes Hyphenaufkommen, dennoch war die Zellwand nach 12-wöchiger Inkubation lediglich vereinzelt durchbrochen. Im weiteren Verlauf verdünnten sich die Sekundärwände vom Lumen her und die Mittelschicht wurde zunehmend angegriffen. Mit zunehmender Inkubationszeit waren Gefäßwände vermehrt durchbrochen und die Abbauerscheinungen sichtlich vorangeschritten. Die Längs-Schnitte (tangential) verdeutlichen, dass im Holzstrahl ein bevorzugter Zellwandabbau der Mittelschicht erfolgte. Dieser Abbau äußerte sich durch Abbau der stark lignifizierten Zellwand und der daraus resultierende Vergrößerung der interzellularen Bereiche zwischen einzelnen Zellwänden (siehe Abb.

3.25C). Mit zunehmender Inkubationszeit zeigten die histologischen Präparate vermehrten Zellwandabbau.

Nach 16-wöchiger Inkubation mit T. versicolor tauchten Bereiche auf, bei denen Gefäßwände sichtlich durch pilzlichen Abbau geprägt waren. Mit steigender Inkubationszeit erhöhte sich die Holzzersetzungsintensität, sodass nach 24 Wochen Zellwände bereits komplett abgebaut waren und immer mehr Bereiche mit Hohlräumen auftraten. Die stark lignifizierten Zellzwickel blieben längere Zeit bestehen. Besonders wasserleitende Gefäße waren hierbei betroffen. Im Allgemeinen wies das Platanenholz stark vorangeschrittene Abbauerscheinungen im Holzkörper über die gesamten Prüfkörper- Gradienten auf.

ERGEBNISSE

Abb. 3.24: Künstliche Infektion von Platanenastholz mit T. versicolor; gefärbt mittels Normfärbung: A: Querschnitt Gefäßwandabbau nach 12 Wochen, in Form einer simultanen Weißfäule (x100). B: Tangentialschnitt Verbreitung durch Tüpfel mit erweiterten Tüpfelkanälen und progressivem Zellwandabbau (x40). C: Nach 16-wöchiger Inkubation, zunehmender Zellwandabbau an Bereichen der Jahrringsgrenze (x40). D: Nach 24-wöchiger Inkubation mit zunehmenden Hohlräumen und erhaltenen Zellzwickeln im Holzkörper (x40).

Holzabbau durch Inonotus hispidus

Nach 12-wöchiger Inkubationszeit war der gesamte Prüfkörper-Gradient mit Hyphen durchzogen. Die Hyphen lagen hierbei im Zelllumen auf der S3-Schicht oder bereits innerhalb der S2-Schicht. An sämtlichen Präparaten konnten Demarkationslinien nachgewiesen werden, bei denen melanisierte Hyphen zum Vorschein traten. Diese Demarkationslinien waren nicht auf einzelne Zelltypen beschränkt, sondern ließen sich in allen Zelltypen (Gefäße, Fasertracheiden, Holzstrahlen sowie Axialparenchym) im

Zelllumen wiederfinden (Abb. 3.24A).

In Form einer simultanen Weißfäule konnte beobachtet werden, dass I. hispidus in der

Lage ist, die S3-Schicht der Zellwand zu durchdringen und diese vom Zelllumen her in Hyphennähe progressiv abzubauen. Der Zellwandabbau äußerte sich zum einen durch erweiterte Tüpfelverbindungen und zum anderen tauchten Bereiche auf, in welchen die 70

ERGEBNISSE

Hyphen innerhalb der S2-Schicht wuchsen und kreisrunde bis ovale Löcher verursachten (Typ Moderfäule). Mit steigender Inkubationszeit vergrößerten sich diese anfangs kleinen Löcher und es entstanden immer größere Hohlräume und Kavernen, bis ein Großteil der Zellwand abgebaut war. Auf Längsschnitten in radialer Richtung wird ersichtlich, dass

I. hispidus nach dem Durchdringen der S3-Schicht innerhalb der S2-Schicht T-förmig verzweigte Seitenhyphen bildet und in longitudinaler Richtung der Zellwandabbau erfolgt. Mit steigender Inkubationszeit wurden vermehrt Gefäßwände abgebaut, wobei die ligninreichen Zellzwickel längere Zeit erhalten blieben. Holzstrahlen wiesen vermehrt Hyphen auf, waren aber längere Zeit intakt und zeigten erst ab der 16-wöchigen Inkubation erste Anzeichen des Abbaus. Dieser äußerte sich durch eine Vergrößerung der interzellularen Bereiche. Nach 24-wöchiger Inkubation waren Sekundärwände der Holzstrahlen relativ intakt und wiesen kein Hyphenvorkommen auf. Dennoch scheint es, dass I. hispidus diese interzellularen Bereiche für die weitere Hyphenausbreitung nutzt

(siehe Abb. 3.27D).

Abb. 3.26: Künstliche Infektion von Platanenastholz mit I. hispidus nach 12 Wochen; gefärbt mittels Normfärbung. A: Querschnitt Bildung einer Demarkationslinie, (pseudosklerotische Schicht) betroffen sind hierbei alle Zelltypen im Platanenholz (x10). B: Tagentialschnitt Verbreitung über Tüpfel und Zellwandabbau in Form einer Moderfäule. Typische T- und L- Hyphenverzweigung innerhalb der Sekundärwand (x40). C: Querschnitt nach 16 Wochen Holzabbau in Form von kreisrunden Löchern (x40), D: Querschnitt nach 24 Wochen immer größeren Hohlräumen in der Sekundärwand und Abbau der Mittelschicht (x100).

ERGEBNISSE

Abb. 3.27: Tangentialschnitt durch einen Holzstrahl (HS) nach 24-wöchiger Inkubationszeit; gefärbt mittels Normfärbung (x100). A: Kontrolle gesunder HS ohne pilzlichen Erreger. B: Mit S. platani, Zellwände der HS intakt. C: Mit T. versicolor, Abbau der Sekundärwand und Mittelschicht, Vergrößerung der interzellularen Bereiche. D: Mit I. hispidus bevorzugter Abbau der Mittelschicht im HS, Vergrößerung der interzellularen Bereiche, Sekundärwand weitgehend intakt.

3.4.5 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Zellwände

In Abb. 3.28 sind die Aufnahmen der Fluoreszenzmikroskopie gegenübergestellt. Im Gegensatz zur Durchlichtmikroskopie konnten mit Hilfe des Fluorochromes Acridin- orange bereits geringe Unterschiede des Verholzungsgerades unter fluoreszierendem Licht hervorgehoben werden. Die histologischen Gewebeschnitte verdeutlichen, dass beim Holzabbau von S. platani neben dem Abbau der Holocellulose ein weiterer Bestandteil der Zellwand abgebaut wurde. Auf Präparaten der S. platani inkubierten Proben traten Sekundärwände der Fasertracheiden in einem orange-rötlichen Farbton in Erscheinung; dies im Vergleich zur Kontroll-Variante oder dem simultanen Weißfäuleerreger T. versicolor, wo alle Holzbestandteile gleichermaßen abgebaut wurden. Dieser orange- rötliche Farbumschlag ist auf ein Vorhandensein von Cellulose und eine Minderung der Lignin-Einheiten, vor allem der Syringyl-Einheiten der Fasertracheiden, innerhalb der

ERGEBNISSE

Sekundärwand zurückzuführen. Der „Duale Holzzersetzer“ I. hispidus zeigte ein eindeutiges Bild. Hierbei traten Bereiche des Sekundärwandabbaus der Fasertracheiden in einem noch intensiveren rötlicheren Farbton in Erscheinung als Sekundärwände bei S. platani inkubierten Proben.

Abb. 3.28: Künstliche Infektion von Platanenastholz nach 24 Wochen. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (x40); gefärbt mittels Acridinorange. A: Gesundes Platanenastholz (Kontrolle). B: Mit S. platani infiziertes Holz, Sekundärwände treten in einem „orange-roten“ Farbton in Erscheinung, Indiz auf Abbau von Lignineinheiten (Syringyl). C: Mit T. versicolor infiziertes Holz (alle Zellwand- bestandteile werden gleichermaßen, simultan abgebaut). D: Mit I. hispidus infiziertes Holz mit intensiv „roten“ Farbumschlag der Sekundärwand; bevorzugter Abbau von Lignin-Einheiten, erhöhter Cellulose-Anteil.

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3.5 Ergebnisse der qualitativen Enzymaktivität

Nach Verabreichung der Reagenz-Lösungen (Kapitel 2.5) wurden S. platani Kulturen nach den jeweiligen Zeitintervallen (1 h, 3 h, 24 h, 48 h und 72 h) kontrolliert und nach Reaktion des Farbumschlags positiv (+) und bei fehlender Reaktion negativ (-) bewertet. Die Ergebnisse sollten erste Erkenntnisse auf enzymatischer Ebene liefern, welche Enzyme am Zellwandabbau beteiligt sind und können aus Tab. 3.3 entnommen werden. Eine positive Farbreaktion konnte für die Polyphenoloxidase, genauer genommen für Laccase (+) festgestellt werden, die als Grundlage für weitere Untersuchungen bzgl. Antagonismus (Kapitel 2.5.1) herangezogen wurde. Hierbei kam es binnen 1 h nach Verabreichung mit

der α-Naphthol-Lösung zu einem purpur-rotem Farbumschlag der Kulturen. Tyrosinase (-) konnte nicht ermittelt werden, sodass nach 10 Tagen die Farbreaktion mittels p-Kresol ausblieb und negativ gewertet wurde. Vorhandene Peroxidase zeichnete sich durch eine rot-braune Farbreaktion nach 1 h aus und wurde positiv (+) gewertet. Für Pektin- abbauende Enzyme konnte nach 72 h eine Pektatlyase (+), welche bevorzugt die glykosidische Bindungen der Polygalakturonsäure des Pektins spaltet, festgestellt werden, jedoch keine Polygalacturonase (-), die α-1,4-galacturosidischen Bindungen im Inneren der Pektine hydrolysiert und Galacturonsäure freisetzt.

Tab. 3.3: Qualitativer Enzymnachweis von S. platani [+ positiver Nachweis; - negativer Nachweis].

Polyphenoloxidase Peroxidase Pektin-abbauende Enzyme Pektatlyase Polygalacturonase

+ + + -

[MEA] Laccase Tyrosinase

+ -

[MEA] [PA1 (pH 7)] [PA1 (pH 5)]

[MEA] [MEA]

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3.5.1 Dualkultur-Test zur Ermittlung des antagonistischen Potentials von Trichoderma sp. Dualkulturen (S. platani + Trichoderma harzianum) wurden zunächst wöchentlich [N=3] qualitativ mittels α-Naphthol über den Versuchszeitraum von 5 Wochen getestet. Mycel von T. harzianum wuchs zielgerichtet in Richtung Wirtsorganismus (S. platani) und dieser wurde bereits nach 5 Tagen parasitiert. Eine längerfristige Hemmzone von Antibiosis war in Dualkulturen nicht zu beobachten. Bereits nach einwöchiger Inkubation in Dualkultur konnte keine messbare Mycelausbreitung von S. platani mehr vermerkt werden.

Alle Versuchsgefäße [N=15] zeigten nach Verabreichung der qualitativen Laccase-Tests mittels α-Naphthol-Lösung einen purpurroten Farbumschlag binnen 24 h (siehe Abb.

3.29A). Um Unterschiede der Laccaseaktivität quantifizieren zu können bzw. potentiell- antagonistische Wirkung von T. harzianum gegenüber S. platani zu ermitteln, wurden Rein- und Dualkulturen photometrisch getestet, die Absorptionsmenge gemessen sowie die Spezifische Enzymaktivität der Laccase (SEA) bestimmt.

Abb. 3.29: Rein- und Dualkulturen von S. platani und T. harzianum auf MEA-Nährmedium. A: Viitale Reinkultur von S. platani mit positiver Farbreaktion nach Verabreichung α-Naphthol Lösung. B: Referenzprobe Kultur von T. harzianum nach Verabreichung mittels α-Naphthol, ohne Reaktion, negativer extrazellulärer Laccasenachweis. C: Referenzprobe S. platani, thermisch abgetötet (80° C). negative Farbreaktion, kein Laccasenachweis mittels α-Naphthol- Lösung. D: Dualkultur von T. harzianum und S. platani 24 h nach Inkubation mit T. harzianum. E: Nach 5 tägiger Inkubation, beginnende Sporulation von T. harzianum. zielgerichtetes Mycelwachstum von T. harzianum auf S. platani. F: Dualkultur nach 3-wöchiger Inkubation, G: Dualkulturen 3 Wochen nach Verabreichung mittels α-Naphthol Lösung mit positiven Laccasenachweis nach 24 h, trotz negativen, quantitativen Nachweises mittels Spektral- Photometer. H: Rückseite von G.

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Nach Versuchsende wurden die wöchentlichen photometrischen Einzelmessungen der SEA beider Varianten nach 30 min gegenübergestellt und auf signifikante Unterschiede mittels T-Test (p≤0,05; p≤0,01; p≤0,001) getestet (siehe Abb. 3.31). Die Mittelwerte der Messungen können aus Tab. 3.6 entnommen werden. Bei Dualkulturen der 3- und 4- wöchigen Inkubation traten nach 30 min. teils negative Werte bzw. negative Absorptionsmengen [U/g] auf. Für weitere Berechnungen und zur visuellen Anschauung wurden negative Werte auf 0 gesetzt.

Zwischen den Varianten der Rein- und Dualkulturen konnten signifikante Unterschiede festgestellt werden. Die Laccase-Aktivität der Reinkulturen zeigte signifikant höhere Absorptionsmengen (SEA) als Dualkulturen.

Nach einwöchiger Inkubation mit T. harzianum konnte auf den Platten der Reinkultur zwar höhere Laccase-Aktivitäten nachgewiesen werden, dennoch konnten nach Anwendung des T-Tests keine signifikanten Unterschiede (Signifikanzniveau p≤0,01 und p≤0,05) zwischen Rein- und Dualkulturen festgestellt werden. So zeigten Reinkulturen eine SEA von 9,41 U/g [±5,80], Dualkulturen eine Absorptionsmenge von 3,98 U/g [±1,19].

Nach 2- und 3-wöchiger Inkubation zeigten Rein- und Dualkulturen gravierende Unterschiede, wobei Reinkulturen signifikant (p≤0,01) höhere Absorptionsmengen aufwiesen. In beiden Fällen lag das Signifikanzniveau bei p=0,003.

Nach 2-wöchiger Inkubationszeit stieg die Laccaseaktivität der Reinkultur auf 21,33 U/g [±2,34], nach drei Wochen auf 32,73 U/g [±4,86]. Dualkulturen konnten nach zwei Wochen lediglich eine Aktivität von 3,17 U/g [±1,58] verzeichnen und nach drei Wochen konnte über alle Proben keine Aktivität gemessen werden, bzw. negative Werte festgehalten, welche auf 0 gesetzt wurden. Die Ergebnisse sind somit kleiner p≤0,01 und können daher als sehr signifikant gesehen werden. Bei Betrachtung der SEA zeigten Dualkulturen nach 4-wöchiger Laufzeit eine SEA von 0,93 U/g, wobei eine negative Absorptionsmenge verzeichnet wurde. Reinkulturen wiesen nach 4-wöchiger Inkubation hingegen die höchste Enzymaktivität mit einer Absorptionsmenge von 34,99 U/g [±9,35] auf. Diese stellten allerdings das höchste Maß an Streuung dar. Beim Vergleich beider Varianten können signifikante Unterschiede auf dem Signifikanzniveau p≤0,05 beobachtet werden. Nach 5-wöchiger Inkubationszeit zeigte sich ein abnehmender Trend der Reinkulturen. Die SEA fiel auf 26,57 U/g, wohingegen Dualkulturen eine Aktivität von 1,81 U/g aufwiesen. Nach Anwendung des T-Tests war dennoch ein hochsignifikantes

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Ergebnis (p≤0,001) zu verzeichnen, wobei Reinkulturen das geringste Maß an Streuung zeigten.

Tab. 3.6: Ergebnisse der spezifischen Enzymaktivität [SEA] der photometrischen Laccase- Messung von Rein- und Dualkulturen über einen 5-wöchigen Versuchszeitraum; *[SEM].

Versuchsdauer Absorptionsmenge Absorptionsmenge Kultur N [Wochen] Konz. end[U/g] [x]min-[0]min 30 min [U/g ] x̅ * 2,79 9,41 3 1 4,48 [±5,80] 20,96 20,16 21,33 3 2 25,84 [±2,34] 17,99 Reinkultur 25,57 32,73 3 3 30,60 [±4,86] S. platani 42,00 51,96 34,99 3 4 33,33 [±9,35] 19,70 22,54 26,57 3 5 26,74 [±2,29] 30,45 3,38 3,98 3 1 2,29 [±1,19] 6,28 6,30 3,17 3 2 1,98 Dualkultur [±1,58] 1,23 -0,01 S. platani 0 3 3 -0,43 [-] + -0,48 T. harzianum -0,40 0,93 3 4 2,33 [±0,71] 0,45 2,07 1,81 3 5 1,92 [±0,20] 1,42

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Abb. 3.30: Spezifische Enzymaktivität [SEA] der Laccase von Rein- (blau) und Dualkulturen (grün) der einzelnen Versuchswochen. Linien: Mittelwerte (x̅ ) der Messung über einen Zeitraum von 30 min [Boxplot: Streuung der einzelnen Messungen].

Abb. 3.31: Spezifische Enzymaktivität [SEA] der Laccase von Rein- (blau) und Dualkulturen (grün) nach 30 min über einen 5-wöchigen Versuchs- zeitraum [N=3]. Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,01) nach Anwendung des T-Tests [* signifikant (p≤0,05); ** hochsignifikant (p≤0,001)].

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3.6 Zugholz in Platanenastgewebe

3.6.1 Makroskopische Auswertung

Nach Anwendung der Phloroglucin-Salzsäure-Lösung auf die Querschnittsflächen wies die Astoberseite im Vergleich zur Unterseite eine weitaus weniger intensive Farbintensität auf. Bei an der Astbasis entnommener Ästen war die Farbintensität weniger intensiv. Vereinzelt waren an der Astbasis punktuell hellere Bereiche zu verzeichnen. Im weiteren Astverlauf wurde die Farbintensität zwischen Astober- und -unterseite deutlicher und Querschnittsflächen astoberseits wiesen eine deutlich höhere Farbintensität auf, welche auf einen geringeren Lignifizierungsgrad, bzw. erhöhten Cellulosegehalt zurückzuführen ist. (siehe Abb. 8.1.1.2 Anhang).

3.6.2 Mikroskopische Auswertung

Im Allgemeinen zeigten histologische Präparate der Astoberseite eine geringere Anzahl an Gefäßen sowie stärkere Zellwänddicken mit einer höheren Dichte der Fasertracheiden und engeren Zelllumina. Zugholzstrukturen der Astoberseite, bei denen Zellwände vermehrte Einlagerungen an Cellulose zeigten, sind in Abb. 3.32 denen der Astunterseite gegenübergestellt. Dieses charakteristisches Bild zeigte sich unabhängig der Aststellung zwischen steilen und flachen Astwinkeln (45° und 85°). Histologische Gewebeschnitte mittels Astrablau-Safranin-Kontrastfärbung verdeutlichen, dass bei allen entnommenen Ästen in Bereichen der Astbasis keine klassischen Zugholzstrukturen, wie geringe Verholzungsgerade in Form einer G-Schicht, vorgefunden wurden. Im Astverlauf von der Basis bis zur Spitze konnten mit zunehmender Entfernung von der Basis aber vermehrt Strukturen mit erhöhtem Celluloseanteil vorgefunden werden. An der Astspitze traten diese hingegen weniger auf (siehe Abb. 8.1.1 Anhang). Auf histologischen Präparaten der Astoberseite war häufig ein Ablösen der cellulosehaltigen Sekundärwand von der Mittelschicht zu beobachten. Zudem waren diese Schichten von Rissen und Hohlräumen geprägt (siehe Abb. 3.32C, G).

Fluoreszenzmikroskopische Gewebeschnitte mittels Acridinorange zeigten reichhaltige Celluloseanteile in einem orange-rötlichen bis hin zum blauen Farbton. Hingegen trat die Astunterseite (Normalholz) grüngelb bis orangegelb in Erscheinung. Auf diesen Präparaten waren die Zellwände weniger eingefallen und Abstufungen der Färbung innerhalb der

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Sekundärwand deutlich erkennbar. Somit können im Fasergewebe von Platanenästen oberseits, ferner der Astbasis, Zugholz bis zugholzähnliche Strukturen festgestellt werden.

Ein einheitlicher Bautyp der Celluloseeinlagerungen lässt sich bei der Baumart Platane nicht herleiten, vielmehr können verschiedenste Grade der Lignifizierung aufgezeigt werden (siehe Abb. 3.32G). Somit kann festgehalten werden, dass der Moderfäuleerreger S. platani nicht primär auf Zugholzstrukturen der Astoberseite angewiesen ist, um in Bereichen nahe der Astbasis eine intensive Holzzersetzung hervorzurufen. In diesen Bereichen sind Zugholzfasern nicht vorhanden oder nur sehr gering ausgeprägt.

Abb. 3.32: Platanenstarkast (Querschnitt) mikroskopische Aufnahmen Astober- und Astunterseite mit zunehmender Entfernung von der Astbasis. A-D, G Durchlichtmikroskopie mittels Astrablau/ Safranin Kontrastfärbung. A: Astoberseite mit typischen Zugholzstrukturen (x10) der Fasertracheiden (blaue Bereiche) mit geringem Verholzungsgrad der Sekundärwand und geringerem Gefäßanteil. B: Astunterseite Normalholz mit höherem Gefäßanteil und höherem Lignifizierungsgrad der Fasertracheiden (x10). C: Vergrößerung aus A mit erhöhtem Cellulosegehalt in Form von G-Schichten (x40). D: Vergrößerung aus B (x40) Normalholz mit parenchymatischen Zellen (blau). E-F: Fluoreszenzmikroskopie. E: Astoberseite mit unterschiedlichem Verholzungsgerad der Sekundärwand von Fasertracheiden (x40). F: Astunterseite Normalholz (x40). G: Übersicht des unterschiedlichen Verholzungsgrade der Astoberseite (x100) mit z. T. Spalten und Hohlräumen in den G-Schichten. H: Astunterseite Normalholz (mit Parenchymzellen blauer Rand) ohne erhöhten Anteil von Cellulose in der Sekundärwand (x100). 81

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3.7 Ergebnisse der Infektionsversuche (in vivo)

3.7.1 Wetterdaten

Die durchschnittliche jährliche Niederschlagsmenge (1981-2010) beträgt in Freiburg i. Br. in etwa 934 mm (gemessen in 236.3 m über NN). Die Anzahl an heißen Tagen mit Luft- temperaturen ≥30° C beträgt im Mittel (1981-2010) 15,4 Tage (DWD 2018a; 2018b1)).

Die maximale Lufttemperatur sowie die Niederschlagsmengen während der gesamten Versuchslaufzeit sind in Abb. 3.33 und Abb. 3.34 zusammengefasst. Da Kulturen von S. platani in vitro ein bevorzugtes Mycelwachstum ≥30° C aufwiesen, wurde die Anzahl „heißer Tage“ mit Maximalwerten ≥30° C festgehalten. Im Jahr 2015 konnten 27 Tage ermittelt werden, bei denen die max. Lufttemperatur ≥30° C lag. Im Jahr 2016 waren es lediglich 10 Tage und das Jahr 2017 wies 19 Tage mit Werten ≥30° C auf. Somit lag die Anzahl an heißen Tagen im Jahr 2015 deutlich, und im Jahr 2017 knapp über dem 30- jährigen Mittel. Lediglich das Jahr 2016 mit einer Anzahl von 10 „heißen Tagen“, lag unter dem 30-jährigen Mittel. Die jährliche Niederschlagsmenge (kumuliert) betrug im Jahr 2015 in etwa 880,6 mm und lag somit unter dem 30-jährigen Mittel (1981-2010). Das Jahr 2016 wies eine Niederschlagsmenge von 971,8 mm auf und lag somit über dem 30- jährigen Mittel (1981-2010). Im Zeitraum von Januar bis November 2017 konnte ein Niederschlag von 687,8 mm festgehalten werden.

Abb. 3.33: Maximale Lufttemperaturen über die gesamte Versuchslaufzeit von November 2014 (Pflanzung) bis zur Entnahme der Bäume November 2017, (rote Sterne) heiße Tage mit max. Werten über 30° C Lufttemperatur [2015: 27 Tage; 2016: 10 Tage; 2017: 19 Tage].

1) Deutscher Wetterdienst [Stand 01.06.2018] 83

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Während der gesamten Versuchslaufzeit wurde der Variante „Bewässert“ täglich 100

Liter H2O zugefügt, sodass eine ausreichende Wasserverfügbarkeit an jenen der „heißen Tagen“ gewährleistet war.

Abb. 3.34: Niederschlagsmenge über die gesamte Versuchslaufzeit von November 2014 (Pflanzung) bis zur Entnahme der Bäume im November 2017 [2014:196,2 mm; 2015: 880,6 mm; 2016: 971,8 mm; 2017 bis einschließlich November 2017: 687,8 mm].

3.7.2 Zuwachsmessungen an den Versuchsbäumen

In regelmäßigen Abständen (Beginn, Ende der Vegetationsperioden) wurden die Stammumfänge der einzelnen Bäume bonitiert. Hiermit sollte der Effekt der Bewässerung auf Zuwachsleistungen der Versuchsbäume sowie die Anfälligkeit (aufgrund limitierender Wasserverfügbarkeit) gegenüber S. platani überprüft werden. Hierbei wurden die Behandlungsvarianten zwischen „Bewässert“ (Variante a) „Bewässert“ d) „Kontrolle“) und „Unbewässert“ (Variante b) „Unbewässert“, c) „Unbewässert mit Astschaden“) in zwei Gruppen getrennt. Zwischen beiden Varianten „Bewässert“ und „Unbewässert“ konnte nach Anwendung des T-Tests signifikante Unterschiede (p≤0,05) in Umfang und Zuwachs festgestellt werden (siehe Abb. 3.35).

Somit war der positive Effekt der künstlichen Bewässerung (100 l/Tag) gegeben. Ab dem Zeitpunkt der Pflanzung (Nov. 2014), bis zur Versuchsauflösung (Okt. 2017) ist die Entwicklung der Stammumfänge in Tab. 3.7 dargestellt. Die „Unbewässerte“ Variante zeigte während der Vegetationsperiode (2015, 2016) bereits erhebliche Vitalitätseinbußen hinsichtlich Kronentransparenz und Belaubungsgrad mit vorzeitigem Blattverlust sowie zahlreiche Pilzfruchtkörper auf der Blattoberfläche (u. a. Apiognomonia veneta bzw. Discula platani). Darauffolgend wurde „Unbewässerten“ Bäumen im ersten Jahr an Tagen

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über 30° C eine zusätzliche Menge an H2O zugeführt, dennoch mit einer erheblich geringeren Menge als der Variante „Bewässert“.

9 8 Unbewässert Bewässert 7

Stamzuwachs[cm] StU 2

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Baumnummer

Abb. 3.35: Entwicklung der Stammzuwächse [Stammumfang gemessen in 1 m Höhe] der einzelnen Versuchsbäume über einen Zeitraum von 3 Jahren.

Tab. 3.7: Stammumfänge und Zuwachsleistungen der Versuchsbäume über den gesamten Versuchszeitraum von der Pflanzung bis zur Versuchsauflösung.

Stammumfang Stammumfang Stammzuwachs Variante Baum-Nr. Versuchsstart [cm] Versuchsende [cm] [cm] [SD] 1 31 39 8,00 6 34,50 41 6,50 7 32,50 40,40 7,90 „Bewässert“ 10 34,50 40,50 6,00 - - 7,10 gesamt [±1,00] 2 32 37 5,00 3 36 41 5,00 4 32,50 38,50 6,00 „Unbewässert“ 5 32 36 4,00 8 34 37,60 3,60 9 34,50 37,70 3,20 - - 4,47 gesamt [±1,05]

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3.7.3 Infektionsversuch I Erreger auf intaktem Rindenperiderm

Insgesamt wurden 9 Versuchsbäume, 95 Äste (Ast-Dimension Ø 2,0 cm bis 4,1 cm) mit dem Erreger S. platani (TBP2014.1) inokuliert. Ein Baum (10 Äste) diente der Kontrolle. An 6 Ästen (6,32 %) erfolgte eine Besiedlung im Periderm- und Xylem-Gewebe mit eingehender Holzzersetzung. Eine Übersicht befallener Äste kann aus Tab. 3.8 entnommen werden. Äste wurden hierbei in 2 Gruppen getrennt ausgedrückt mit „primärer Stellung“

(Astanbindung am Hauptstamm Ø≥2,5 cm) oder als „sekundärer Stellung“ (Astanbindung am Hauptstamm, Ø<2,5 cm oder als untergeordneter Seitenast im gesamten Kronenbereich). Befallene Äste mit direkter Anbindung an den Hauptstamm beschränkten sich auf unterste Kronenbereiche bis 320 cm Höhe und wiesen eine untergeordnete Stellung am Baum auf. Stärker dimensionierte Äste („primärer Stellung“) zeigten keinerlei verdächtige Massaria- Symptome. Auffällig war, dass etliche stärker dimensionierte Äste eine Abwehrreaktion im Rindenperiderm zeigten. Diese äußerten sich äußerlich in Form von engräumigen Abschottungsprozessen sowie durch ein vorzeitiges Abwerfen des Rindenperiderms am

Inkubationspunkt (siehe Abb. 3.36A, B).

Tab. 3.8: Mit S. platani befallene Platanenäste Freilandversuch I, Inkubation am gesunden Rindengewebe [+ positiv; - negativ].

Ast- Holz- Anzahl Höhe Stellung FK im Variante Dimension Symptome zersetzung [N] [cm] im Baum Periderm Ø [cm] Xylem

a) „Bewässert“ 1 2,3 2,50 sekundär + + +

2,2 240 sekundär + + + b) „Unbewässert“ 2 2,1 270 sekundär + + +

2,0 320 sekundär + + +

c) „Unbewässert 3 2,3 290 sekundär + + + mit Astschaden“

2,1 265 sekundär + + +

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Abb.: 3.36: Ablösen des Periderms am Inkubationspunkt, infolge der Reaktion im Rindenperiderm (Variante: Unbewässert, Ø 3,4 cm „primärer Stellung“), Ablösen nach 2-jähriger Versuchslaufzeit B: Variante: Bewässert, (Ø 3,7 cm „primärer Stellung“), nach 14 monatiger Inkubation Abwerfen des Periderms am Inkubationspunkt. C: Natürlich infizierter Seitenast, mit Sprödbruch und pyknidiale Fruchtköper im Rindenperiderm. D: Natürlich infizierter Ast mit direkter Stammanbindung im unteren Stammbereich „sekundärer Stellung“ (Ø 1,8 cm).

Bei den mikroskopischen Analysen am Inkubationspunkt zeigte sich bei allen befallenen Ästen ein annäherndes deckungsgleiches Bild. Eine ursachliche Infektionshyphe (Penetrationshyphe) am Inkubationspunkt inokulierter Äste konnte in keinem Fall als Ursache der Wirt-Besiedlung mikroskopisch nachgewiesen werden. Auf den histologischen Präparaten konnte kein Durchdringen suberinisierter und cutinhaltiger Korkschichten beobachtet werden (Abb. 3.37). Im Peridermgewebe inokulierter Platanenäste zeigte sich eine erhöhte Aktivität parenchymatischer Zellen in Form von Einlagerungen polyphenolischer Substanzen im Zellumen. Dennoch zeigten Versuchsbäume über den gesamten Zeitraum immer wieder neu-infizierte Äste, die nicht mit dem Erreger inkubiert wurden. Dieses waren ausnahmslos untergeordnet schwach-dimensionierte Äste im

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Feinastbereich ≤2,0 cm Astdurchmesser, mit z. T. direkter Stammanbindung oder im Feinastbereich als untergeordneter Seitenast („sekundärer Stellung“).

Abb. 3.37: Querschnitt am Inkubationspunkt, 12 Wochen nach Inkubation, Suberin in den Kork- schichten stellt eine natürliche Barriere gegen das Eindringen von S. platani in den Wirt dar; gefärbt mit Sudan III A: Mycelien von S. platani suberinisierte Korkzellen stellen eine natürliche Barriere gegen exogene Besiedlung des Periderms dar (x10). B: Vergrößerung von A (x40).

Versuchsbäume der „Bewässerten“ Variante wiesen natürliche Infektionen mit S. platani auf, dennoch schienen diese im geringeren Ausmaß als die „Unbewässerte“ Variante zu sein. In den Vegetationsperioden tauchten kontinuierlich natürliche Infektionen mit S. platani an untergeordneten Ästen „sekundärer Stellung“ auf. Hierbei lagen Fruchtkörper im Rindenperiderm und eine eingehende Holzzersetzung im Xylemgewebe vor (Abb. 3.38; 3.39).

Fruchtkörperbildung Während der Vegetationsperiode konnten stets ausgebildete Fruchtkörper im Periderm natürlich bedingter Infektionen vorgefunden werden. Ab dem Frühjahr (Mitte April) bis in den Herbst (Oktober) konnte die ananmorphe Form (Pyknidien) kontinuierlich neuausgebildet werden. Demgegenüber traten Perethecien der Teleomorphe verstärkt im Sommer bis Hochsommer (Juni-August) hervor. Zu Zeiten der Vegetationsruhe zeigten sich jedoch Fruchtkörper, welche Reste von Konidio- und Ascosporen beinhalteten. Eine

Überprüfung auf künstlichen Nährmedien (H2O) bestätigte die Auskeimfähigkeit der Sporen während dieser Jahreszeit. Die versuchsbegleitenden Beobachtungen zeigten, dass eine Infektion von S. platani, bzw. die Ausprägung der Symptome sowie Bildung von Perithecien und pyknidiale Fruchtkörper, nicht ausnahmslos über die Astoberseite, sondern in Einzelfällen über die Astunterseite oder seitlich erfolgen kann (siehe Abb. 3.38).

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Abb. 3.38: Ausbildung von Massaria typischen Symptomen sowie Bildung von Perithecien und Pyknidien im Rindenperiderm eines natürlich infizierten Astes. A: Symptome an der Astunterseite, bis -seitlich mit scharfer Abgrenzung zum intakten Rindengewebe. B.: Querschnitt, mikroskopische Darstellung der („Massaria-typischen“ Symptome), Rindennekrosen mit eingehender Zersetzung, im Rinden- und Xylemgewebe, Bildung einer Reaktionszone mit erhöhter Aktivität von Rinden- sowie Xylemparenchym mit scharfem Übergang zum gesunden Gewebe, sowie pyknidiale Fruchtkörper mit Konidiosporen im Peridermgewebe, nahe der Astbasis; gefärbt mittels Normfärbung (x4).

Abb. 3.39: Querschnitt Platanenast („sekundärer Stellung“), natürliche Infektion von S. platani. Bevorzugter Abbau von Fasertracheiden im Xylemgewebe mit z. T. erhaltener S3-Schicht. Gefäßwände intakt, dennoch Gewebe am Inkubationspunkt ohne Hyphenbefall und Holzzersetzungserscheinungen; gefärbt mittels Normfärbung (x40). A: Variante a) „Bewässert". B: Variante b) „Unbewässert“.

Bildung Reaktionszone

Im Astgewebe konnte beobachtet werden, dass betroffene Äste eine Abwehrreaktion zeigten. Trotz Bildung einer Reaktionszone mit Einlagerungen polyphenolischer Substanzen konnte eine weitere Hyphenverbreitung in diesen Bereichen nicht verhindert und die baumeigene Abwehrreaktion umgangen werden. Histologische Gewebeschnitte zeigten, dass Pilzhyphen diese Einlagerungen durchwachsen konnten (Abb. 3.40). Die

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Reaktionszonen wiesen einerseits Wandauflagerungen im Zelllumen der S3-Schicht auf, andererseits waren Zelllumia sowie Tüpfel komplett mit diesen Substanzen gefüllt. Im Bereich der wasserleitenden Gefäße kam es vorwiegend zum Gefäßverschluss durch wasserunlösliche, fettartige Substanzen wie Suberin. Auf histologischen Präparaten (Quer- und Längsschnitt) zeigten Gefäße vereinzelt die Fähigkeit zur Thyllenbildung.

Abb. 3.40. Reaktionszone mit polyphenolischen Einlagerungen stellen für S. platani keine Barriere im Astgewebe dar; gefärbt mittels Normfärbung (x40). A: Querschnitt Hyphenwachstum im Lumen gefüllter Zellen mit polyphenolischen Einlagerungen sowie innerhalb der Sekundärwand. Gefäße zeigen Wandauflagerungen. B: Längsschnitt (Radial) Hyphenwachstum im Holzstrahl, Zelllumen komplett mit polyphenolischen Substanzen gefüllt.

Variante c) „Unbewässert mit Astschaden“ Die Platane erwies sich als ausgesprochen reaktionsfreudig gegenüber dem hervorgerufenen Astschaden mit Abschottungsprozessen. Längsparenchym und Parenchymzellem der Holzstrahlen zeigten vermehrten Transport polyphenolischer Substanzen. In Wundnähe angrenzender Gefäße kam es zur Einlagerung dieser Substanzen. Vereinzelt zeigten Gefäße Verthyllungen, häufiger jedoch Einlagerungen im gesamten Gefäßlumen. Bis auf eine Ausnahme konnte der verursachte Astschaden in allen Fällen abgeschottet und erfolgreich kompartimentiert sowie ein Wundperiderm angelegt werden. Lumia umliegender Fasertracheiden waren komplett mit diesen Substanzen gefüllt. Aus dem Verbleib teilungsfähiger Kambialzellen konnte ein Wundperiderm gebildet werden, sodass die Wunde bereits nach 9 Wochen vollständig überwallt werden konnte (siehe Abb. 3.41).

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Abb. 3.41: Infektionsversuch I Variante c) „Unbewässert mit Astschaden“ auf der Astoberseite. A: 9 Wochen nach Auslösen des Astschadens, erfolgreiche Überwallung. B: Mikroskopischer Radial- schnitt, Anlage von Wundperiderm und Abschottungsreaktion im Xylemgewebe, Einlagerung phenolischer Substanzen im Zelllumia und Verthyllung angrenzender Gefäße, gefärbt mittels Normfärbung (x4).

Entnahme infizierter Platanenäste

An befallenen Ästen konnte nach Entnahme kein Befall von Stammgewebe vorgefunden werden. Die Astbasis Bäume erwies sich als effiziente Barriere gegen ein Eindringen von S. platani in den Hauptstamm. Bereits nach wenigen Wochen entwickelte sich infolge der Astentnahme ein Kallusgewebe am Wundrand, aus dem sich im weiteren Verlauf der Überwallungswulst bildete (siehe Abb. 3.42).

ERGEBNISSE

Abb. 3.42: Infektionsversuch I. A: Befallener Ast mit Massaria-Symptomen, (Rindenverfärbung/- nekrosen, mit Pyknidien und Perithecien von S. platani) nach 12-wöchiger Inkubation. B: Längsschnitt am Bereich der Astbasis stellen eine effiziente Abschottung gegen ein Eindringen in den Stamm dar, vergleichbar einer „statischen Grenze“, befallenes mit angrenzenden, gesundem Holzgewebe. C: Astungswunde (ca. 22 mm Ø) nach Entnahme, gesund, kein Übergang zum Stammgewebe. D: Astungswunde nach 24 Monaten bereits komplett überwallt. E: Makroskopischer Längsschnitt, effiziente Abschottungsreaktion mit erfolgreicher Überwallung (vgl. CODIT-Modell).

ERGEBNISSE

3.7.4 Astbasis als natürliche Barriere Die Astbasis, als Übergang von Ast- zu Stammgewebe, stellt eine natürliche Barriere gegen ein Eindringen von Mikroorgansimen in Stammgewebe dar. Der Anteil parenchymatischer Zellen war an diesen Bereichen mit abknickendem Faserverlauf sichtlich erhöht im Vergleich zum weiteren Astverlauf. Parenchymzellen waren sehr aktiv und reaktionsfreudig sowie mit Einlagerungen polyphenolischer Substanzen gefüllt. Ein ausgesprochen hoher Anteil an Reservestoffen (in Form von Stärkekörnern) zeigte sich im Übergangsbereich der Zelllumina und deutete auf eine erhöhte Aktivität in diesen

Bereichen hin (siehe Abb. 3.43A.; Abb. 3.44B). Vereinzelt kam es zur Verthyllung der wasserleitenden Gefäße. Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen sowie Färbungen mittels Sudan III legen nahe, dass die Wände der Thyllen Suberin beinhalten und eine Barriere zur weiteren Hyphenverbreitung darstellen (siehe Abb. 3.44c).

Abb. 3.43: Mikroskopische Bereiche nahe der Astbasis aus Abb 3.42B. A: Abknickender Faserverlauf im Xylemgewebe, hohe Anzahl parenchymatischer Zellen gefüllt mit polyphenolischen Inhaltsstoffen, hohe Aktivität sowie erhöhter Transport von Reservestoffen in Form von Stärkekörnern (x20). B: Längsschnitt durch Periderm- und Holzgewebe (gelb-rote Bereiche) „statische Grenze“ mit der Wandsubstanz Suberin gegen ein Eindringen von Pilzhyphen in Stammgewebe (x10). C: Querschnitt Xylemgewebe, Einlagerung im Zelllumen parenchymatischer Zellen und Fasertracheiden sowie teilweise Verthyllung der Gefäße (x40). D: Vergrößerung aus B, Aktivität im Peridermgewebe mit z. T. suberinisierten Zellwänden (x20). A, C: Durchlichtmikroskopie gefärbt mittels Normfärbung; B, D: Fluoreszenzmikroskopie gefärbt mit Acrdinorange. 93

ERGEBNISSE

Des Weiteren konnten Suberineinlagerung vermehrt innerhalb der Zellwände, mit erhöhtem Widerstand gegen pilzlichen Abbau in Bereichen der Astbasis vorgefunden werden. Diese Einlagerungen können bei einem mit S. platani infizierten Ast ein Eindringen in den Hauptstamm verhindern, vergleichbar einer „statischen Grenze“. In durchbrochenen Reaktionszonen fernab der Astbasis zeigten sich Einlagerungen phenolischer Substanzen im Zelllumen, dennoch erfolgte hier kein erhöhter Transport an Reservestoffen in Form von Stärkekörnern sowie Ein- und Auflagerungen von Suberin.

Abb. 3.44: Durchlichtmikroskopische Aufnahme der Astbasis, A: Übersicht Rinden- und Holzgewebe mit erhöhtem Suberinanteil, „statische Grenze“ für S. platani, (x4). B: Übergang von Ast- zu Stammgewebe mit abknickenden Faserverlauf und höheren Anteil aktiver parenchymatischer Zellen, gefüllt mit pilzwidriegen Substanzen und hohem Anteil an Reservestoffen, in Form von Stärkekörnern (x20), A+B gefärbt mit Sudan III und Astrablau. C: Längsschnitt (Radial), Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme gefärbt mittels Acridinorange (x40) Thyllenbildung mit suberinisierten Wänden als Barriere.

ERGEBNISSE

3.7.5 Infektionsversuch II Erreger auf geschädigtem Rindenperiderm

Aus dem Infektionsversuch I erwies sich die Abwehrreaktion auf intaktem Rindenperiderm, ohne äußerlich sichtbare Schäden, als ausgesprochen effizient gegen eine Besiedlung des Wirtes. Darauffolgend wurde ein weiterer Versuch an geschädigtem Rindenperiderm angelegt (Juni 2016). Hierbei wurde mit Hilfe eines Seziermessers ein ca. 10 x 10 mm großer Rindenschaden im Peridermgewebe simuliert und anschließend ein Inokulum (siehe 2.4) direkt auf den Schadbereich angebracht (Abb. 3.45).

Nach 5 Wochen wurden die Inokula entfernt und Äste in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Es zeigte sich an inokulierten Ästen ein Wundkallus am Schadensbereich, mit unterschiedlichen Reaktionen je nach Abhängigkeit und Tiefe des Schadens.

Insgesamt wurden 29 Äste in der Größenordnung 1,4 cm bis 3,8 cm Ø mit dem Erreger inokuliert, vier Äste dienten der „Kontrolle“. An insgesamt sechs Ästen (20,7 %) konnten Pyknidien von S. platani nachgewiesen werden. An vier Ästen war ein Austreten der Konidiosporen auf der Rindenoberfläche zu beobachten [Variante a) „Bewässert“: ein Ast; Variante c) „Unbewässert mit Astschaden“: drei Äste]. Über den gesamten Versuchszeitraum zeigten zwei Äste (6,9 %) Symptome [Variante: a) „Bewässert“ und Variante c) „Unbewässert mit Astschaden“ je ein Ast] mit einhergehenden Holzzersetzung. Dennoch waren diese lediglich auf den Bereich des Inkubationspunktes begrenzt. Ein Ast war bereits komplett abgestorben, wies Pyknidien von S. platani im Rindenperiderm auf, allerdings keine typischen Rindennekrosen eines mit Massaria befallenen Astes. Auf der Querschnittsfläche zeigte sich eine Demarkationslinie. Nach Isolation aus infektiösem Xylemgewebe konnte nach molekulargenetischen Abgleich Diaporthe eres zweifelsfrei bestimmt werden.

Infizierte unterständige Äste (Ø 1,4; 1,5 cm) zeigten stärkere Zersetzung. Stärker dimensionierte Äste wiesen hingegen Pyknidien nahe dem Inkubationspunkt auf, allerdings ohne die Ausprägung typischer „Massaria-Symptome“ (Rindenverfärbungen, bzw. -nekrosen) sowie Holzzersetzungserscheinungen. Aus infiziertem Xylem- und Rinden- gewebe konnte S. platani nicht in Kultur isoliert werden, obwohl Fruchtkörper der Anamorphe (Pyknidien) bzw. austretende Konidiosporen vorlagen. Da während des gesamten Infektionsversuchs stetig wiederholend Infektionen an Ästen „sekundärer Stellung“ auftraten, die nicht mit dem Erreger inokuliert wurden, kann nicht zweifelsfrei

ERGEBNISSE ausgeschlossen werden, dass der Inkubationspunkt als ursächliche Eintrittspforte für spontane Infektionen diente.

Abb. 3.45: Infektionsversuch II Rindenverletzung am Inkubationspunkt. A: Anlage Inkubationspunkt simulierte Verletzung Rindengewebe. B: Inkubationspunkt nach 5-wöchiger Inkubationszeit, nach Abnahme des Inokulums. C: Schaden mit Wundperiderm nach 16- monatiger Versuchslaufzeit. D: Querschnitt vom Schaden, erfolgreich abgeschottet/ eingekapselt ohne Nachweis S. platani.

Tab. 3.9: Mit S. platani befallene Platanenäste Infektionsversuch II, Inkubation an geschädigtem Rindengewebe [+ positiv; - negativ].

Ast- Holz- Anzahl Höhe Stellung im FK im Variante Dimension Symptome zersetzung [N] [cm] Baum Periderm Ø [cm] Xylem 1,4 440 sekundär + + + a) „Bewässert“ 2 2,8 480 primär - - +

b) „Unbewässert“ ------

1,5 445 sekundär + + +

2,3 495 sekundär - - + c) „Unbewässert + 4 Astschaden“ 3,4 515 primär - - +

1,4 460 sekundär - +*) +

*) Holzzersetzung von Phomopsis/Diaporthe-Arten mit Auftreten von Demarkationslinien im Xylem- gewebe 96

ERGEBNISSE

Reaktion am Wundbereich

Je nach Tiefe des Schadbereiches zeigten sich unterschiedliche Wundreaktionen. Direkt im Wundbereich kam es zum Absterben parenchymatischer Zellen. Sobald am Schadbereich teilungsfähige Kambialzellen nicht geschädigt oder ausgetrocknet waren, zeigte sich eine Kallusbildung angrenzender Zellen auf der Wundfläche. Bei Schadbereichen mit Verletzung der Kambialzellen folgte eine Kallusbildung vom Wundrand ausgehend, mit den nach CODIT beschriebenen Wänden sowie der Bildung einer Barrierezone in Folge von Lufteintritt nach Verletzungen (siehe Abb. 3.44; 3.45).

Auf histologischen Gewebeschnitten wird deutlich, dass sich im Bereich des Schadens am Wundrand aus verbliebenen Kambialzellen zunächst ein Kallus bildete, der sich im weiteren Verlauf zum Überwallungswulst ausdifferenzierte. Dieses Gewebe unterscheidet sich holzanatomisch zum Normalholz. Hierbei ist der Anteil an Parenchymzellen sichtlich erhöht und es bilden sich zunächst dünnwandige, kaum bis gering lignifizierte Zellwände

(siehe Abb. 3.46A; C, blaue Bereiche; Färbung mittels Astrablau und Sudan III). Der Anteil an Gefäßen und Fasertracheiden war in diesen Bereichen deutlich geringer. Die Barrierezone mit verstärkter Polyphenol- bzw. phenolische Hydroxygruppen sowie Suberin-Einlagerung wurde am Wundrand gebildet. Suberin mit fungiziden Eigenschaften, in den Korkschichten natürlich vorkommend, wurde verstärkt am Wundbereich im Xylem- und Phloemgewebe neugebildeter Zellen ein- und aufgelagert. Im Rindengewebe konnte der Bereich der Siebröhren effizient mit diesen Einlagerungen verschlossen werden. Im hinterliegenden Xylemgewebe kam es in Wundbereichsnähe zur Einlagerung dieser Substanzen im gesamten Zelllumen. Im neu-gebildeten Kallusgewebe hingegen zeigten Färbungen mit Sudan III vermehrt suberinisierte In- und Akkrustierungen der Zellwände. Somit waren inkubierte Äste in der Lage, ein Wundperiderm anzulegen (siehe Abb. 3.45; 3.46; 3.47). Der inokulierte Bereich mit Einlagerungen dieser Substanzen erwies sich als effiziente Barriere gegen ein Eindringen in den Wirt. Im weiteren Verlauf bildete sich an der Kallusoberfläche das Korkkambium (Phellogen), aus dem später das Periderm hervorgeht. Im angrenzenden Xylemgewebe zeigten Zellen vermehrte Einlagerungen phenolischer Substanzen im Lumen. Auf histologischen Präparaten im Längsschnitt zeigten Gefäße einen Verschluss durch diese Substanzen sowie vereinzelt Thyllen mit suberenisierten Wänden. Ursächliche Penetrationshyphen als erfolgreiche Infektionsstrukturen in den Wirt konnten nirgends vorgefunden werden und die

ERGEBNISSE baumeigene Abwehrreaktion infolge des Lufteintritts erwies sich damit als ausgesprochen effektiv gegen eine Besiedlung von S. platani.

Abb. 3.46: Platanenast am Inkubationspunkt. Infektionsversuch II Erreger auf geschädigtem Rindenperiderm nach 9-wöchiger Versuchslaufzeit mit Bildung Kallusgewebe. A: Kontrolle, Längsschnitt (Radial), gefärbt mit Sudan III und Astrrablau. B: Kontrolle, Längsschnitt (Radial) Bildung von Parenchymzellen (blau) mit geringerem Verholzungsgrad am Wundbereich und phenolischen Einlagerungen, Normfärbung (x10). C: Kontrolle, Querschnitt gefärbt mit Sudan III und Astrablau. Bildung von Wundperiderm, Verbleib teilungsfähiger Kambialzellen mit hohem Anteil parenchymatischer Zellen (x10). D: Inkubationspunkt (S. platani) mit Schadbereich, hinterliegende Kambialzellen inaktiv. Kallusbildung mit späterer Überwallung erfolgt vom Wundrand des verletzten Kambialbereichs, (x4). E: Vergrößerung von D, rote Bereiche mit erhöhter Polyphenol- und Suberineinlagerung im Phloem- und Xylemgewebe gegen ein Eindringen von S. platani (x10). D: Vergrößerung von E, am Wundrand, Bildung einer Barrierezone (Wand 4 nach CODIT) mit verstärkter Suberinauflagerung am Kambialbereich und gefüllter Zellen im intakten Xylemgewebe (x40). 98

ERGEBNISSE

Abb. 3.47: Platanenast („sekundärer Stellung“) am Inkubationspunkt. Infektionsversuch II Erreger auf geschädigtem Rindenperiderm (S. platani) mit Schadbereich nach 14 Monaten, Variante a) „Bewässert“; Querschnitt gefärbt mittels Normfärbung. A: Übersicht Schaden mit beginnender Überwallung, (x4). B: Bildung Barrierezone vom Kambialbereich mit vermehrten Einlagerung pilzwidriger Substanzen (Polyphenole) im Zelllumen und erhöhtem Anteil parenchymatischer Zellen sowie Suberin in den Zellwänden, gegen ein Eindringen von Mikroorganismen (x10) C: Sekundärwandabbau im ersten Jahrring nach Verletzung, suberinisierte Einlagerungen werden nicht abgebaut (x40). D: Vergrößerung aus C. Sekundärwandabbau, Mittelschicht sowie Füllsubstanz der Tüpfel bleiben weitgehend erhalten (x100).

Stamminkubation von S. platani an geschädigtem Rindengewebe

Zur weiteren Überprüfung wurde ein Inokulum direkt am Stamm (Schema Feldversuch II) auf verletztes Rindengewebe angebracht. Bereits nach wenigen Wochen zeigten sich am angrenzenden Rindenperiderm pyknidiale Fruchtkörper von S. platani. Infiziertes Gewebe konnte dennoch engst-räumig bereits im Periderm abgeschottet und im weiteren Verlauf der Vegetationsperiode abgestoßen werden (siehe Abb. 3.48, vergleichbar der Inkubation an intaktem Rindengewebe stärker dimensionierter Äste). Aus infiziertem Rindengewebe gelang keine Re-Isolation von S. platani, trotz Bildung pyknidialer Fruchtkörper mit beginnender Sporulation.

ERGEBNISSE

Abb. 3.48: Inkubation am Stamm. A: Anlage Inokulum am Stamm in 1,30 m Höhe. B: Austreten von Pyknidien mit Konidiosporen sowie Abschottung im Rindenperiderm und Abstoßung des infizierten Rindengewebes nach 12-wöchiger Inkubation mit S. platani.

3.7.6 Isolation aus Rindengewebe von Platanenästen

Die im Zuge der Re-Isolationen gewonnen Pilzisolate sind in Abb. 3.49 dargestellt. Bei der Bestimmung am Inkubationspunkt vorkommender Pilzarten konnten 7 Taxa erfasst werden. Die überwiegende Anzahl isolierter Pilze ist der Abteilung der Ascomycota zuzuordnen. Lediglich eine Probe konnte den Basidiomyceten zugezählt werden. Eine Re- Isolation von S. platani aus gesundem oder gar nekrotischem Rindengewebe konnte an den 10-jährigen Versuchsbäumen nicht erzielt werden. An Ästen mit Fruchtkörperbildung der Teleo- und Anamorphe im Rindengewebe war ein Austreten von Sporen auf der Rindenoberfläche zu beobachten, dennoch gelang keine Isolierung des Erregers aus symptomatischem Rindengewebe in Kultur.

Auf die Probemenge [N=82] bezogen, stellten die Diaporthales mit 69,51 % die größte Gruppe dar. Es folgten Hypocreales mit 40,24 %, Pleosporales mit 30,48 % sowie Xylariales mit 19,51 %. Vertreter der Ordnung Helotiales [6,10 %] und Amphishaeriales [3,66 %] scheinen eine untergeordnete Rolle einzunehmen.

Fünf Proben konnten taxonomisch nicht erfasst werden. Hierbei ergab die mikroskopische Bestimmung sowie der molekulargenetische Abgleich keine eindeutige Bestimmung, sodass diese als „unknown“ angegeben wurden. Pilzliche Vertreter der Basidiomyceten [Ordnung: Polyporales] schienen ebenfalls eine sekundäre Position einzunehmen [1,22 %].

100

ERGEBNISSE

Diaporthales

Hypocreales

Pleosporales

Xylariales

Helotiales

Amphisphaeriales

Polyporales unknown

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Vorkommen im Rindengewebe [%] Abb. 3.49: Am Infektionspunkt festgestellte Pilz-Taxa im Rindengewebe von Platanenästen [bezogen auf die Anzahl der Proben].

Die Anzahl isolierter Pilzgattungen, bezogen auf die Anzahl der Pilzisolate [N=145] sowie auf die Anzahl der Proben [N=82], ist in Abb. 3.50 dargestellt.

Insgesamt konnten 145 Pilzisolate aus 14 Gattungen festgestellt und identifiziert werden. Den größten Vertreter dieser Gruppe bildete die Gattung Diaporthe/Phomopsis spp. (69,51 % auf Probemenge; 39,31 % auf Anzahl Pilzisolate). Den zweitgrößten Vertreter isolierter Pilze stellte die Gattung Trichoderma spp. (24,39 % auf Probemenge; 13,79 % auf Anzahl Pilzisolate) dar. Der Vertreter der Basidiomyceten [Ordnung: Polyporales] konnte zweifelsfrei als Bjerkandera adusta bestimmt werden. Am beprobten Ast wurde eine eindeutige Weißfäule diagnostiziert.

Isolierte Kulturen von Phomopsis/Diaporthe ssp. differenzierten sich morphologisch untereinander. Die Ermittlung des Artniveaus folgte über die Molekulargenetik der Nukleotidsequenzen mitochondrialer SSU rDNA (nach Ablaufschema 2.1.2). Verschiedene Sequenzierungsergebnisse einer Alinierung wurden mit der Software ClustalX (Version 2.1) verglichen, sodass sich Unterschiede und Gemeinsamkeiten der Basenabfolge graphisch darstellen lassen. Drei verschiedene Diaporthe –Arten (Diaporthe eres, Diaporthe rudis, Phomopsis theicola) konnten bestimmt und D. eres in zwei unterschiedliche Stämme: (Isolat D. eres TBP2017.1 sowie Isolat D. eres TBP2017.2) unterteilt werden. Die Isolate D. eres TBP2017.1 und TBP2017.2 zeigten keine 101

ERGEBNISSE morphologischen Differenzen, dennoch zeigte das Alignment an 5 Basenpaaren Unterschiede und bei Kulturen von D. eres TB2017.2 trat das Nährsubstrat (MEA 2 %) in einem dunkleren Farbton in Erscheinung. Eine Übersicht des Alignments der Nukleotidsequenzen mit anschließender phylogenetischer Einteilung findet sich in Abb. 3.51.

Phomopsis/Diaporthe spp Trichoderma spp. Daldinia pyrenaica Fusarium spp. Alternaria spp. Phoma sp. Epicoccum nigrum Pezicula cinnamomea Lophiostoma corticola Pestalotiopsis funerea Bjerkandera adusta Pezicula neocinnamomea Hypoxylon fragiforme Nemania diffusa unknown

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Vorkommen im Rindengewebe [%]

Phomosis/Diaporthe spp. Trichoderma spp. Daldinia pyrenaica Fusarium spp. Alternaria spp. Phoma sp. Epicoccum nigrum Pezicula cinnamomea Lophiostoma corticola Pestalotiopsis funerea Bjerkandera adusta Pezicula neocinnamomea Hypoxylon fragiforme Nemania diffusa unkown

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Vorkommen im Rindengewebe [%] Abb.3.50: Am Infektionspunkt festgestellte Pilz-Gattungen/Arten, (oben) bezogen auf die Anzahl der Proben [N=82]; (unten) bezogen auf die Anzahl isolierter Pilze [N=145].

102

ERGEBNISSE

Abb. 3.51: Alignment der Nukleotidsequenzen mitochondrialer SSU rDNA der Pilzisolate, isolierter Phomopsis/Diaporthe Arten aus dem Infektionsversuch mit Hilfe der Software ClustalX (Version 2.1). Identische Positionen sind in der Kopfzeile mit Sternchen versehen. Entstandene Lücken durch die Alinierung werden mit „-“ angezeigt (oben). Phylogenetische Einteilung der einzelnen Phomopsis/Diaporthe Arten mit der Software NJPlot (Bootstrap- Wert: 1000); (fett) Akzessionsnummer des nächst-ähnlichen Eintrages der Gendatenbank NCBI mittels BLAST; (unten rechts).

103

ERGEBNISSE

3.7.7 Gemeinsames Auftreten von S. platani und Phomopsis/Diaporthe spp. im Rindengewebe Die Isolationsarbeiten verdeutlichen ein sich stetig wiederholendes Auftreten von Phomopsis/Diaporthe spp. gemeinsam mit S. platani im Rinden- und Xylemgewebe (siehe Abb. 3.52). Auf der einen Seite zeigten Äste Massaria-typische Symptome im Rinden- und Xylemgewebe mit eingehender Holzzersetzung, auf der anderen Seite traten Bereiche im Xylemgewebe mit Demarkationslinien hervor. Das Holzgewebe wies in diesen Bereichen ein generell helleres Erscheinungsbild als S. platani infiziertes Holz auf. Im Rahmen der Isolierungsarbeiten konnte an Rindenproben mit Ausbildung pyknidialer Fruchtörper von S. platani häufig nach Anwendung der Oberflächensterilisation und anschließender Bestückung der Nährmedien beobachtet werden, dass Mycelien von Phomopsis/ Diaporthe spp. aus diesen Bereichen hervortraten. Speziell Kulturen von D. eres waren schnellwüchsig und bei Kultivierungsarbeiten gegenüber S. platani bevorteilt, sodass nach 14 Tagen in Reinkultur die Petrischalen bereits vollständig mit Mycel bewachsen waren.

Abb. 3.52: Natürlich infizierter Ast mit S. platani, (links) Infektion und Symptome äußern sich über die Astunterseite (Variante b) „Unbewässert“); (rechts) Oberseite: Zersetztes Xylemgewebe Phomopsis/Diaporthe spp. mit filigranen Demarkationslinien im Xylemgewebe; Astunterseite mit pyknidialen Fruchtkörpern und austretenden Konidiosporen (S. platani) im Rindengewebe; Holz befallen, bis auf wenige cm von der Astbasis entfernt.

3.8 Holz-Beimpfung mit Pilzen aus Platanenrindengewebe in vitro Die im Zuge der Isolation auftretenden Phomopsis/Diaporthe spp. [Isolat: D. eres TBP2017.1 und P. theicola TBP2016.1] aus infiziertem Rinden- und Holzgewebe wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, eine Holzzersetzung im Xylemgewebe hervorzurufen, in vitro mittels künstlicher Beimpfung an Platanenhölzern inkubiert. Es zeigte sich bereits nach 6-

104

ERGEBNISSE wöchiger Inkubation mit D. eres die Bildung einer Demarkationslinie sowie nach 9 Wochen eine intensiv vorangeschrittene Holzzersetzung. Diese äußerte sich als charakteristische Moderfäule (Typ 1), wobei die Sekundärwand bevorzugt unter längeren

Erhalt der S3-Schicht abgebaut wurde. Die Mittelschicht der Zellen konnte bis zu diesem Zeitpunkt nicht durchbrochen werden. Histologische Präparate verdeutlichen, dass D. eres (Isolat TBP2017.1) befähigt ist, bei allen Zelltypen (Faser, Gefäße, Parenchymzellen) unter

Erhalt der Mittelschicht einen Sekundärwandabbau hervorzurufen (siehe Abb. 3.53C,D). Ein anderes Bild zeigte dagegen P. theicola (Isolat TBP2016.1). Nach 16-wöchiger Inkubation wies das Platanenholz ein geringes Hyphenaufkommen auf. Lediglich die Randbereiche der Präparate zeigten vermehrtes Hyphenaufkommen, jedoch ohne jegliche

Strukturveränderung der Zellwand (siehe Abb. 3.53A,B). Bevorzugt waren Hyphen im Lumen parenchymatischer Zellen zu finden. Eine Überprüfung beider Pilz-Isolate D. eres TBP2017.1 und P. theicola TBP2016.1 mittels α-Naphthol-Lösung zur Nachweiskontrolle qualitativer extrazellulärer Laccase war an beiden Isolaten negativ.

Abb. 3.53: Künstliche Infektion an Platanenastholz gefärbt mittels Normfärbung. A: Mit Phomopsis theicola Isolat TBP2016.1 nach 16-wöchiger Inkubation; Grundgewebe vollständig intakt; Hyphenaufkommen lediglich an Randbereichen der Präparate (x10). B: Randbereiche mit Hyphen von Phomopsis theicola durchzogen, trotz des Hyphenaufkommen Zellwandstruktur intakt (x100). C: Künstliche Infektion mit Diaporthe eres Isolat TBP2017.1 nach 6-wöchiger Inkubation (x10). Bildung einer Demarkationslinie im Grundgewebe (x10). D: Zellwandabbau bis auf die Mittelschicht, Fasertracheiden, Gefäße sowie Axial- und Längsparenchym nach 9-wöchiger Inkubation mit Diaporthe eres Isolat TBP2017.1 (x40). 105

DISKUSSION

4 Diskussion

4.1 Wachstumsvoraussetzungen für S. platani

Die Untersuchungen haben gezeigt, dass Wachstum und Entwicklung von S. platani stark temperaturabhängig sind. Im Allgemeinen zeigten Mycelien eine hohe Schwankungsbereite. Ein bevorzugtes Mycelwachstum konnte bei Temperaturen ≥20° C und ≤35° C beobachtet werden. Kulturen bei ≥40° C zeigten keinerlei Mycelwachstum. Angesichts des täglichen Wachstums binnen 24 h konnten die höchsten Wachstumsraten bei einer Temperatur von 30° C mit einer Mycelfläche von 42,18 mm²/Tag festgestellt werden und diese waren 1,6-mal höher als Kulturen bei 20° C. Bei Temperaturen ≥35° C waren die Wachstumsraten rückläufig, sodass Kulturen bei einer Versuchstemperatur von 35° C eine Fläche von 24,71 mm²/Tag und bei 38° C [7,00 mm²/Tag] aufwiesen.

Bei den gemessenen Temperaturen kann somit festgehalten werden, dass S. platani wie bereits in der Literatur beschrieben (NALLI 1981; CICCARONE 1988; GROSCLAUDE &

ROMITI 1991; KEHR & KRAUTHAUSEN 2004; SINCLAIR & LYON 2005, KEHR 2011), zu den wärmeliebenden Pilzen zu zählen ist, zumal Wachstumsraten <20° C vergleichsweise gering waren. Kulturen, die ≥30° C und ≤35° C ausgesetzt waren, zeigten höhere Wachstumsraten sowie vorzeitige Bildung pyknidialer Fruchtkörper mit beginnender Sporulation. Somit besteht ein bedeutender Zusammenhang zwischen hohen Lufttemperaturen und erhöhter Sporulation. Allgemein kann festgehalten werden, dass S. platani im Bereich der mesophilen Erreger einzuordnen ist. Der offizielle Erstnachweis der Massaria-Krankheit erfolgte in der Bundesrepublik im Jahr 2004 durch KEHR &

KRAUTHAUSEN (2004). Oftmals wurde der warm-trockene Sommer 2003 (limitierende Wasserverfügbarkeit) mit einem vermehrten Auftreten der Massaria-Krankheit in

Verbindung gebracht. KEHR & KRAUTHAUSEN (2004) erwähnen dennoch, dass ähnliche Verdachtssymptome schon in Regionen des Weinbauklimas in den 90er Jahren zu beobachten waren. An dieser Stelle muss ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass es sich um keinen neuartigen Erreger handelt, sondern vielmehr, dass ab diesem Zeitraum ein Auftreten der Massaria-Symptome verstärkt beobachtet wurde.

In Sommermonaten zu Zeiten hoher Lufttemperaturen findet S. platani somit ideale Wachstumsvoraussetzungen. Einerseits prädisponieren diese heißen Tage (Tage, an denen die Tageshöchsttemperatur 30° C erreicht oder übersteigt) mit hohen Lufttemperaturen in Kombination mit langanhaltenden Trockenperioden die bereits geschwächten Stadtbäume gegenüber S. platani, andererseits begünstigen diese Faktoren das Wachstum und die 106

DISKUSSION

Ausbreitung des Erregers. Da hohe Temperaturen die Sporulation fördern, besteht besonders zu Zeiten hoher Lufttemperaturen ein erhöhter Infektionsdruck auf bereits geschwächte Platanenäste.

Substratansprüche Untersuchungen zeigten, dass signifikante Unterschiede verwendeter Ausgangssubstrate unter gleichen Versuchsbedingungen bestanden. Die Substrat-Nährmedien unterschieden sich baumartenbedingt, holzanatomisch sowie chemisch vor allem durch die unterschiedliche Lignin-Komposition der einzelnen Holzarten. Dennoch wiesen Substrat- Nährmedien eine gewisse Inhomogenität auf, welche die hohen Streuungswerte begründen könnte. Allerdings zeigten standardisierte Nährmedien (MEA-) ein entsprechend hohes Maß an Streuung (siehe Tab. 3.3). Zu den Hauptbestandteilen des Holzes zählt das Biopolymer Lignin, es bildet weltweit die größte Aromatengruppe. Das Ligninpolymer ist aufgrund der hydrophoben Eigenschaft sowie seiner molekularen Struktur resistenter gegenüber Abbau durch Mikroorganismen als andere Holzsubstanzen und stellt eine natürliche Barriere gegen einige Holzzersetzer dar (KIRK & FARRELL 1987). Lignin setzt sich generell aus drei Komponenten zusammen (p–Cumarylalkohol, Coniferylalkohol und Sinapinalkohol), wobei zwischen Laub- und Nadelhölzern gravierende Unterschiede bestehen. Laubhölzer zeichnen sich durch GS- Lignine (Guaiacyl-Syringyl-Einheiten) aus, wobei Syringyleinheiten in etwa die Hälfte des Anteils ausmachen, diese setzen sich aus unterschiedlichen Anteilen Sinapinalkohol und Coniferylalkohol zusammen. Demgegenüber werden Nadelhölzer als G-Lignine bezeichnet und sind überwiegend aus Coniferylalkohol-Komponenten zusammengesetzt.

Generell weisen Gefäßwände und Mittelschicht der Laubhölzer erhöhte Ligningehalte sowie hohe Konzentrationen von Guaiacyl-Lignin auf und sind somit widerstandsfähiger gegenüber einigen Moderfäuleerregern (OBST 1982; BLANCHETTE et al. 1988; SCHWARZE et al. 1995b, SCHWARZE et al. 1999).

Das geringste Mycelwachstum konnte auf dem Fichtensubstrat mit einem Zuwachs von 6,66 mm²/Tag festgestellt werden. Nadel- bzw. Fichtenholz ist gegenüber Laubholz anatomisch homogener aufgebaut. Die chemische Zusammensetzung des Lignins setzt sich im Fichtenholz vorwiegend aus Coniferylalkohol-Komponenten zusammen, mit einen

Größen-verhältnis 94:1:5 (G:S:H) (ERICKSON et al. 1973).

107

DISKUSSION

Das Lignin der Angiospermen ist hinsichtlich Anteil und Zusammensetzung einzelner Komponenten nicht einheitlich und variiert unter einzelnen Zelltypen. Gefäßwände zeigen erhöhte Guaiacyl-Einheiten, Fasertracheiden hingegen höhere Syringyl-Einheiten.

Buchenholz setzt sich bspw. aus dem Verhältnis 56:40:4 (G:S:H) zusammen (CHOI et al.

2001). Die Ligninkomposition im Xylemgewebe der Platane kann auf ein vergleichbares

Niveau wie die des Buchenholzes gesetzt werden (SCHWARZE 2007; 2008; 2018). Die Wachstumsrate auf dem PLA-Substrat betrug 31,17 mm²/Tag, auf dem BU-Substrat hingegen 43,96 mm²/Tag. Die ermittelten Zuwachsraten auf dem BU-Substrat gegenüber dem PLA-Substrat waren sichtlich erhöht. Nach einwöchiger Versuchsdauer zeigten sich signifikante Unterschiede (p≤0,05), doch mit zunehmender Versuchsdauer (11, 18, 21 Tagen) konnten keine signifikanten Unterschiede (p≤0,05; p≤0,01) beider Substrate festgestellt werden und die Wachstumsraten verblieben einheitlich auf konstantem Niveau. MEA-Nährmedien, denen ein zusätzlicher Anteil von 1 % Cellulose (10 g Cellulosepulver FLUKA) beigefügt wurde, zeigten in Vorversuchen ähnliche Wachstumsraten mit hohen Streuungswerten. Auf dem SNA-Nährmedium stellte sich ein Mycelwachstum als gehemmt dar, wobei es zur Stagnation des Mycels binnen weniger Tage kam.

Bergahorn-Substrat (BAH) zeigte bei diesem Versuch die zweit-höchste Mycelausbreitung mit einer Fläche des 2,5 –fachen (100,99 mm²/Tag) wie Platanen-Substrat (PLA). Holzanatomisch betrachtet weist das Grundgewebe von Bergahorn höhere Komponenten an Syringl-Lignin als Platanen- oder Buchenholz auf (BAUM 2001; SCHWARZE 2007; 2008; 2018). Dies könnte die vergleichsweisen hohen Wachstumsraten auf dem Bergahorn- Substrat erklären, als dass S. platani die Syringl -Einheiten enzymatisch verwerten kann, aber nicht oder nur bedingt in der Lage ist, Guaiacyl-Einheiten des Lignins anzugreifen. Somit stellt speziell die Ligninkomposition der Gefäßwände der Baumart Platane aufgrund erhöhter Guaiacyl-Einheiten zum umliegenden Grundgewebe eine natürliche Barriere beim Holzabbau dar. Das geringe Mycelwachstum auf dem Fichten-Substrat unterstützt die Ansicht, dass S. platani Schwierigkeiten hat, die Guaiacyl-Einheiten enzymatisch zu verwerten, aber dennoch auf Syringyl-Einheiten des Lignins angewiesen ist.

Das Platanenrindensubstrat (PLA-RI) wies die höchsten Wachstumsraten mit einem

Zuwachs von 121,69 mm²/Tag auf. KÄÄRIK (1974) weist darauf hin, dass sich Rindenlignin chemisch erheblich vom Lignin des Holzes aufgrund der schlechteren Löslichkeit und höheren Heterogenität unterscheidet. Im Gegensatz zu Holz ist die Rinde ein viel komplexeres Gewebe, welches sich vor allem durch einen erhöhten Anteil an

108

DISKUSSION

Polyosen, stärkerer Lignifizierung und aufschlusserschwerten Extraktstoffen sowie sekundären Inhaltsstoffen zusammensetzt. TREIBER (1957) führt an, dass die Extraktstoffe im Xylemgewebe aus etwa 2-4 % des Trockengewichtes bestehen, hingegen diese beim Rindengewebe ca. 20-30 % ausmachen. Der Anteil an Cellulose ist im Rindengewebe im Vergleich zum Holzgewebe [Splintholz ca. 41,1 %; Kernholz 47,7 %] deutlich geringer

(HOLZEIGENSCHAFTSTAFEL 1943; TREIBER 1957; FENGEL & GROSSER 1975).

Zwischen phenolhaltigen Rinden- und Holzgewebe zeigten sich hoch-signifikante Unterschiede (p≤0,001). Bei genauerer Gegenüberstellung war das Wachstum auf dem PLA-RI-Substrat 3,9-mal so hoch, wie auf dem Platanenholz-Substrat. Um Unklarheiten und potentielle Kontaminationen auszuschließen, wurde der Versuch ein weiteres Mal wiederholt und die Ergebnisse spiegelten entsprechend hoch-signifikante Resultate wider. Im Rahmen einer Bachelorarbeit an der Professur für Forstbotanik (Uni Freiburg) zeigte

KIMMIG (2016) in vergleichbaren Versuchen ein bevorzugtes Wachstum von S. platani auf Bergahorn- und Platanenholzsubstrat, wenn auch das Platanenholzsubstrat geringe Anteile an Rindengewebe enthielt. Somit macht es den Anschein, dass S. platani primär auf Rindengewebe und sekundär auf Xylemgewebe spezialisiert ist.

In Fachdiskussionen wurde die Massaria-Krankheit oftmals mit Acer Gewächsen in Verbindung gebracht. Angesichts der hohen Wachstumsraten auf dem BAH-Substrat stellt diese Baumart aufgrund der Holzanatomie ein mögliches Potential für die Besiedlung von S. platani an diesen Gewächsen dar. Dennoch kann nicht zweifelsfrei davon ausgegangen werden, dass es sich unter den Beschreibungen hinsichtlich Pilz- und Wirtmaterial um Splanchnonema platani und Gewächse der Gattung Acer handelt (vgl. „Massaria atroinquinans” SHOEMAKER & LECLAIR 1975; BARR 1982; vgl. Gattung „Platanus”

SINCLAIR et al. 1987; SINCLAIR & LYON 2005).

109

DISKUSSION

4.2 Holzanatomische Strukturen von Platanenästen

Eingangs dieser Untersuchungen stellte sich die Frage, ob mögliche Zugholzstrukturen mit erhöhtem Cellulosegehalt an der Astoberseite den Befall von S. platani begünstigen. Mit Hilfe der Pholorglucin-Salzsäure-Lösung konnten bereits makroskopisch Ast-Bereiche quantifiziert werden, die weniger stark lignifiziert waren. Durch diese Methode war es möglich, den gesamten Astquerschnitt zu betrachten. Das Vorgehen eignete sich bereits makroskopisch, Bereiche erhöhten Celluloseanteil sowie geringeren Lignifizierungsgrad für nachfolgende mikroskopische Analysen im Vorfeld zu selektieren. Mittels Kontrastfärbung Astrablau/ Safranin war es anschließend möglich, Zugholzstrukturen der Zellwände in Platanenästen mikroskopisch hervorzuheben. Im Laufe dieser Untersuchungen erwies sich ein wiederholtes Färben (45 min in 1,5 %-iger Astrablaulösung; 5 min in 2 %-iger Safraninlösung; 5 min in 1,5 %-iger Astrablau) als ausgesprochen hilfreich, um unterschiedlich starke Lignifizierungsgrade aufzudecken und Bereiche vermehrter Cellulosegehalte zu präzisieren. Jedoch ist bei der Interpretation der Kontrastfärbung zu beachten, dass Astrablau die Eigenschaft besitzt, auch lebende Parenchymzellen sowie Bereiche pilz-bedingten Holzabbaus (selektive Delignifizierung) anzufärben (PECHMANN 1972; SREBOTNIK & MESSNER 1994; SCHWARZE & ENGELS 1998;

SCHWARZE 2007). Bei genauerer Betrachtung histologischer Präparate mittels Normfärbung ließen sich keine eindeutigen Zugholzstrukturen an der Astoberseite erkennen. Versuchsbegleitend wurden aus 40-jährigen Platanen Äste unterschiedlicher Stellung im Baum (Astabgangswinkel ca. 45° - 85°) entnommen und makro- und mikroskopisch (mittels Fluoreszenz und Kontrastfärbung) auf das Vorhandensein und Fehlen von Zugholzstrukturen überprüft. Der holzanatomische Aufbau von Zugholzfasern kann sehr variabel sein und verschiedene Bautypen aufweisen (HÖSTER & LIESE 1966;

PECHMANN 1972; GHISLAIN & CLAIR 2017).

HÖSTER & LIESE (1966) folgerten aus ihren Untersuchungen, dass eine Korrelation zwischen erhöhtem Anteil an Libriformfasern und Häufigkeit des Zugholzes besteht. An

P. occidentalis konnten die Autoren keine Zugholzbildung nachweisen. SCHMITT et al. (2014) zeigten an Untersuchungen über den natürlichen Holzabbau von S. platani nahe der Astbasis mittels UV-mikroskopischen Untersuchungen kein Bestehen einer G-Schicht im Fasergewebe von P. x hispanica, dennoch konnten erhöhte Cellulosegehalt innerhalb der

Sekundärwand nachgewiesen werden. HÖSTER & LIESE (1966), PECHMANN (1972) und

AUFSEß (1973) differenzieren zwischen „intakten“ und „konvoluten“ Zugholztyp. Beim

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DISKUSSION

„intakten“ Typ ist die G-Schicht im Gegensatz zum „konvoluten“ Typ fest mit den übrigen Zellwandschichten verbunden, hingegen lösen sich beim „konvoluten“ Typ die G- Schichten der Faserwände an lignifizierten Wandschichten leichter ab und erscheinen oftmals zum Lumen hinein gefaltet. Mit Hilfe des Fluorochroms Acridinorange ist es allerdings möglich, diese Strukturen zu erkennen (AUFSEß 1973). Nach neueren Erkenntnissen kann Lignin in der G-Schicht eingelagert werden, wobei verschiedenste Formen der Lignin-Einlagerung vorkommen können. Eine Übersicht verschiedener Typen von Verholzungs- bzw. Lignifizierungsgrad findet sich in GHISLAIN & CLAIR (2017). Bei den unterschiedlichen Typen der G-Schicht wird von Unterschieden zwischen Anzahl an Sekundärwänden und G-Schicht bzw. den unterschiedlichen Verholzungsgerad innerhalb der Sekundärwand differenziert. Diese Schichten können stark bis kaum lignifiziert oder unlignifiziert, einschichtig oder gar mehrschichtig sein. Zudem finden sich hierbei Typen mit dickerem lignifizierten Rand innerhalb der G-Schicht oder als dünner Ring zum

Zelllumen angrenzend (GHISLAIN & CLAIR 2017).

Holzanatomische Untersuchungen an Bereichen nahe der Astbasis zeigten kein Bestehen dieser Zugholzstrukturen in Form dieser beschriebenen Schichten. Weiter entfernt von der Astbasis im weiteren Astverlauf, unabhängig vom Astwinkel, konnten diese Strukturen jedoch mehrfach aufgedeckt werden (siehe Abb. 4.1). Über den gesamten Querschnitt der Astoberseite tauchten diese vereinzelt bis spärlich auf. In diesen Bereichen erhöhter Cellulose-Einlagerungen war der Anteil an Gefäßen deutlich geringer. Angrenzende Zellen im Bereich der Gefäße zeigten ein deutlich höheres Maß an Lignifizierung. Einem einheitlichen Typ lässt sich die Holzart Platane allerdings nicht zuordnen, vielmehr können verschiedenste Grade der Lignifizierung aufgezeigt werden (siehe Abb. 3.30G). Somit kann festgehalten werden, dass in Bereichen nahe der Astbasis, also Bereichen, an denen S. platani eine intensive Holzzersetzung hervorruft, keine typischen Zugholzstrukturen in

Form dieser Schichten nachgewiesen werden konnten. HILSCHER (2016) zeigte im Rahmen seiner Untersuchungen Unterschiede der Gewichtsverluste zwischen Astober- und Astunterseite. Er quantifizierte den Masse- bzw. Gewichtsverlust über 3 Inkubationszeiten (6, 9 und 12 Wochen) und stellte fest, dass die Astunterseite höhere Abbauraten als die Astoberseite aufwies. Es ließen sich dabei keine „klassischen“ Zugholzfasern, jedoch zugholzähnliche Strukturen in Form von erhöhtem Cellulosegehalt innerhalb der Sekundärwand lichtmikroskopisch mittels Normfärbung nachweisen.

111

DISKUSSION

Eine holzanatomische Übersicht der Platanenäste bzgl. Gefäßanzahl, Zellwanddicke und Verteilung von Zellen erhöhter Celluloseanteile zwischen Astober- und Astunterseite, mit

Referenz zu den Baumarten Bergahorn und Rotbuche, findet sich in DOHRMANN (2018).

Demnach könnte nach den Erkenntnissen von GHISLAIN & CLAIR (2017) der Baumart

P. x hispanica weiter entfernt von der Astbasis ein Bestehen dieser G-Schicht zugeschrieben werden. Häufig zeigen besonders alte Baumexemplare von Platanen astunterseits der Basis (Übergangsbereich von Ast- zu Stammgewebe) vermehrte Anlagerungen von Stützgewebe. Dieses könnte u. a mit dem Fehlen oder den geringeren Anteilen an Cellulose auf der Astoberseite in diesen Bereichen nahe der Astbasis im Zusammenhang stehen. Letztendlich kann festgehalten werden, dass kein paralleler Zusammenhang zwischen Zugholz- oder zugholzähnlichen Strukturen astoberseits mit dem schnellen Voranschreiten der Holzzersetzung von S. platani an Bereichen nahe der Astbasis existiert.

Auffallend häufig konnten Risse und Spalten auf den histologischen Gewebeschnitten astoberseits beobachtet werden. Artefakte der Präparation durch Lösungswechsel (steigende bzw. sinkende Alkohol Reihe) können aufgrund des Quellen und Schwinden des Holzes sowie weiterer Bearbeitungsschritte (siehe Punkt 2.5) nicht zweifelsfrei ausgeschlossen werden, worauf bereits SACHSSE (1961) hinwies.

Abb. 4.1: Vorkommen von Zugholzstrukturen (erhöhter Cellulosegehalt innerhalb der Sekundärwände) im Platanenast unabhängig des Astwinkels (blaue Bereiche) und Massaria Befall (rote Bereiche). A: Spitzer Winkel (ca. 45°). B: Rechter Winkel (ca. 90°), Befallene Astpartien von S. platani mit „statischer Grenze“ an der Astbasis gegen ein Eindringen in Stammgewebe.

112

DISKUSSION

4.3 Holzabbau in-vitro (Masseverlust)

Die vorliegenden in vitro Untersuchungen der Masse- bzw. Gewichtsverluste zeigten, dass die unterschiedlichen Pilze am selben Wirt signifikante Unterschiede verzeichneten. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass bei allen untersuchten Pilz-Wirt-Beziehungen mit zunehmender Inkubationszeit signifikant (bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 1 %) mehr Holzsubstanz abgebaut wurde. Beim Vergleich der Masseverluste wird ersichtlich, dass die Gewichtsverluste der Referenzpilze, vor allem T. versicolor, um ein Vielfaches höher lagen als S. platani inkubierte Proben. Nach 12 Wochen wiesen mit T. versicolor inkubierte PK das 4,8 -fache und nach 24 Wochen das 4,5 -fache vom Gewichtsverlust der mit S. platani inkubierten PK auf. Prüfkörper der I. hispidus Variante wiesen nach 24 Wochen das 1,5 -fache vom Gewichtsverlust der S. platani Variante auf. Bisweilen ist bekannt, dass einige Moderfäuleerreger einen langsameren Holzabbau hervorrufen als Braun- oder Weißfäuleerreger, der mit weitaus geringerem Gewichtsverlust verbunden sein kann (LIESE 1959, LIESE & PECHMANN 1959; KÄÄRIK 1974, SCHMIDT 1994).

Bereits COURTOIS (1963) teilte Moderfäuleerreger bzgl. ihrer Abbauintensität (bemessen an Gewichtsverlusten, Hyphenaufkommen, Anzahl und Verteilung der Befallsmuster) in unterschiedliche Gruppen ein. Diese Methode ermöglichte, die Gruppenzugehörigkeit aggressiver Pilze bei kürzeren Inkubationszeiten ausdrücklich erkennen zu lassen. Der Masse- bzw. Gewichtsverlust allein stellt für die Einteilung aggressiver Pilze ein unbefriedigendes Instrument dar, zumal qualitative Merkmale mikromorphologischer

Befallserscheinungen außer Acht gelassen werden. Anhand dieser Einteilung (COURTOIS 1963) ließe sich S. platani in die zweit-höchste Gruppe, beschrieben als Gruppe mit mäßiger Abbauintensität, einordnen. Dabei lagen Gewichtsverluste auf ähnlichem Niveau wie in der Literatur beschrieben. Hyphenaufkommen und Verteilung der Befallsmuster bzgl. Kavernenbildung innerhalb der Sekundärwand wurden annähernd deckungsgleich beschrieben. Die histologischen Präparate zeigten zu diesem Zeitpunkt bereits eine weit vorangeschrittene Kavernenbildung in den Fasertracheiden, dennoch wiesen Gefäße und Parenchymzellen intakte Zellwände auf sowie weitaus geringere Masseverluste [6,4 %]. Der hervorgerufene Holzabbau wird dennoch als besonders schnell-voranschreitend vom

Zeitpunkt der Infektion bis zum Zeitpunkt des Astbruchs beschrieben (DUJESIEFKEN et al.

2011; KEHR 2011). Die Ergebnisse der Masse- bzw. Gewichtsverluste lassen sich nur bedingt mit weiteren Ergebnissen aus der Literatur vergleichen. Bei der Ermittlung des Masseverlustes können

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DISKUSSION verschiedenste Faktoren einen wesentlichen Einfluss auf die Untersuchungsergebnisse ausüben. Neben der Probenanzahl, -größe, und angewandten Sterilisationsverfahren sind Berechnungsmethodik, Versuchsdauer sowie die Beschaffenheit des Holzes entscheidende Parameter, welche sich auf die Untersuchungsergebnisse auswirken. Aufgrund der Tatsache, dass alles Probenmaterial von einem einzigen Baum stammte, wurde die Vergleichbarkeit während des Versuchs gewährleistet, da identische Holzstrukturen, wie Jahrringbreite, Verhältnis Früh-Spätholz etc. vorlagen; andererseits muss die Inhomogenität des Platanenholzes bzgl. Anteil und Anordnung der Lignocellulose im Astverlauf mitberücksichtigt werden. Vorversuche zeigten, dass autoklavierte Hölzer aufgrund des Sterilisationsverfahrens (thermischer Überdruck) minimale Gewichtsverluste aufwiesen. Bei den Kontrollen wurde ersichtlich, dass PK einen Gewichtsverlust von 1,10 % bis 1,38 % des Gesamtgewichtes nach Versuchsende aufwiesen, welches auf Auswaschungsprozesse freiverfügbarer Holz- inhaltsstoffe durch das Sterilisationsvorfahren zurückzuführen ist. Darüber hinaus stellt allein die Pilzart durch den Einsatz verschiedener Pilzstämme mit unterschiedlichem Abbauvermögen eine entscheidende Variable dar (BELLMANN 1988a,

1988b). Allerdings bezeichnen PECHMANN & SCHAILE (1950) die Gewichtsabnahme des Holzes als den meist genutzten Weiser für das Maß des Pilzabbaus, der mit fortschreitendem Substanzverlust immer deutlicher in Erscheinung tritt. Bevor es jedoch zu Gewichtsveränderungen kommt, kann das Holz bereits erhebliche Änderungen anderer Eigenschaften aufweisen.

Vergleichbare Untersuchungen nach SCHWARZE (1995) und SCHWARZE et al. (1999) mit I. hispidus an Platanenholz zeigten nach 12-wöchiger Inkubationszeit weitaus höhere

Abbauraten bei gleicher Laufzeit. HILSCHER (2016) zeigte, dass der Moderfäuleerreger Kretzschmaria deusta bei gleicher Inkubationszeit das 4 -fache der prozentualen Abbaurate im gleichen Versuchszeitraum wie S. platani an Platanenastholz verzeichnete, obwohl dieser mit Hauptvorkommen im Wurzel-, Wurzelstockbereich zu finden ist und sich dieser

Gewebetyp eindeutig zum Astholz differenziert (REINARTZ & SCHLAG 1999; SCHWARZE et al. 1999; BRANDSTETTER 2007). Bei den o. g. Versuchen ermittelte HILSCHER (2016) den Gewichtsverlust durch S. platani an künstlich infiziertem Platanenastholz und stellte nach 12-wöchiger Inkubationszeit im Allgemeinen weitaus geringere Abbauraten (3,36 %) sowie höhere Gehalte der Holzfeuchte (132,4 %) bei gleichen Versuchsbedingungen und unter Verwendung desselben Pilzstammes fest. Daher müssen entscheidende Parameter wie die Holzfeuchtigkeit genauer betrachtet werden.

114

DISKUSSION

4.3.1 Beziehung zwischen Masseverlust und Holzfeuchte

Einen wichtigen Einflussfaktor beim pilzbedingten Holzabbau stellt die Holzfeuchte dar. Es ist bekannt, dass Pilze die Holzfeuchtigkeit im Rahmen der Holzzersetzung entscheidend beeinflussen. Oftmals werden Moderfäulepilze mit hohen Holzfeuchten in

Verbindung gebracht. BRISCHKE (2007) verweist aber darauf, dass Moderfäuleerreger befähigt sind, eine breite Nische zu besiedeln und große Schwankungen der Holzfeuchte überstehen. Einige holzzersetzende Pilze sind in der Lage, wassergesättigtes Holz bei hohen Holzfeuchten (>200 %) aufgrund unterschiedlicher Besiedlungs- und

Holzzersetzungsstrategie abzubauen (METZLER 1994; SCHUMACHER & GROSSER 1995). Andere holzzersetzende Pilze sind dagegen befähigt, Holz unterhalb des

Fasersättigungspunktes (25 % Holzfeuchte) abzubauen (AMMER 1964). So erzielte

BLECHTLY (1959) in Versuchsreihen mit Moderfäulepilzen an Buchenholz bereits erhebliche Gewichtsverluste bei einer Holzfeuchte von 22 %.

Das Feuchtigkeitsoptimum variiert bei den einzelnen Versuchspilzen unterschiedlich stark. Bei den Versuchen wurde deutlich, dass bei Betrachtung der Streuungswerte PK von P. x hispanica, unter Verwendung des gleichen Prüfpilzes, unterschiedliche Holzfeuchte- gehalte aufwiesen, obwohl diese unter gleichen Versuchsbedingungen gelagert wurden. In vitro Versuche haben gezeigt, dass mit sinkender Holzfeuchte Gewichtsverluste bei S. platani inkubierten Proben zunahmen und ein erhöhter Holzabbau unter diesen Voraussetzungen stattfand. Somit scheint eine verringerte Holzfeuchte ein entscheidender Parameter bei der Holzzersetzung darzustellen. Es macht den Anschein, als ob S. platani geringere Feuchtigkeitsbedürfnisse hat, um Holz enzymatisch verwerten zu können.

AMMER (1964) zeigte in Laborversuchen an Fichtenholz bereits einen Zusammenhang von Gewichtsverlust und Holzfeuchtigkeit. Versuche mit Kretzschmaria deusta zeigten, dass derselbe Pilz unter Berücksichtigung gleicher Versuchsbedingungen in der Lage ist, wirtsspezifisch unterschiedliche Werte der Holzfeuchte in Abhängigkeit der Holzart hervorzurufen (SCHWARZE 1995). Über die gesamte Versuchslaufzeit verblieb die Holzfeuchte bei S. platani inkubierten PK auf relativ konstantem Niveau. Lediglich nach erweiterter Inkubationszeit (32 Wochen) wiesen PK erhöhte Werte auf, welches auf den Substanzverlust pilzbedingten Abbaus der Zellwand zurückzuführen sein könnte. Über alle Versuchszeiten waren die Gehalte der Holzfeuchte bei der S. platani Variante niedriger als die Kontrollvariante und wiesen signifikante Unterschiede (p≤0,01) nach 12-, 16- und 32-wöchiger Inkubationszeit auf. Die 115

DISKUSSION

Korrelation von Holzfeuchte und Masseverlust war beidseitig signifikant (p≤0,01) und es zeigte sich ein negativer Zusammenhang mit Korrelationskoeffizienten (Bravis-Pearson 0,27; Spearman 0,16; Bestimmtheitsmaß (R²=0,10).

AMMER (1963) zeigte durch experimentelle Untersuchungen, dass die Sorption braunfaulen Holzes mit zunehmendem Gewichtsverlust abnimmt und das Holz an Wasseraufnahme- fähigkeit verliert. Das könnte mit S. platani infiziertem Platanenholz im Einklang stehen, da aufgrund des bevorzugten Sekundärwandabbaus mit einhergehender Kavernenbildung und zunehmenden Hohlräumen, unter weitgehender Erhaltung der Mittelschicht, das Absorptionsvermögen der Holocellulose gemindert wird. Dennoch muss an dieser Stelle ein weiterer entscheidender Parameter berücksichtigt werden. Es ist bekannt, dass Pilze im Laufe des enzymatischen Holzabbaus selbst Wasser freisetzen und damit die Holzfeuchtigkeit entscheidend beeinflusst wird (AMMER 1964). Um Rückschlüsse vom Einfluss der Holzfeuchte auf den Holzabbau für S. platani ziehen zu können, müssten Versuchshölzer mit verschiedenen Holzfeuchtigkeitsgehalten gewählt und diese über den gesamten Versuch auf konstantem Niveau gehalten werden. Versuchsgefäße wurden mit einem 2-Wege-Membranverschluss verschlossen, sodass ein Luftaustausch unter Berücksichtigung steriler Bedingungen gegeben war. Diese wurden konstant im Wärmeschrank bei 25° C dunkel gelagert, dennoch zeigte sich eine Variation der Holzfeuchtigkeitsgehalte innerhalb eines Versuchgefäßes. Laboruntersuchungen zur Prüfung des Einflusses der Holzfeuchtigkeit zeigten beim Weißfäuleerreger Heterobasidion annosum an Nadelholz, dass mit zunehmender Holzfeuchtigkeit die

Gewichtsverluste anstiegen (COURTOIS 1970). Gleiches charakteristisches Bild zeigten PK mit dem simultanen Weißfäuleerreger T. versicolor, wobei erhöhte Gewichtsverluste sowie die resultierende Abnahme der Rohdichte mit einer Zunahme der Holzfeuchte korrelierten. Über die gesamte Versuchslaufzeit wiesen die Werte der Holzfeuchte ein hohes Maß an Streuung mit einer Breite von 44 % bis hin zu 199 % auf. Zu vergleichbaren Ergebnissen kam SCHMIDT (1994) und zeigte ähnlich hohe Variationen der Holzfeuchte beim Holzabbau durch T. versicolor (Holzfeuchte-Schwankungen von 78 % bis 236 %).

ENGELS (1998) konnte bei Laboruntersuchungen an künstlich pilz-infizierten Hölzern für eine Reihe von Weißfäuleerreger einen Zusammenhang zwischen steigender Abbaurate und steigender Holzfeuchte feststellen. Allerdings kann dieser Zusammenhang nicht generell für alle Weißfäuleerreger festgehalten werden. Somit bewirkt T. versicolor unter den getesteten Bedingungen mit zunehmender Holzzersetzung eine höhere Absorption von

H2O im Holz. Beim I. hispidus infizierten PK ließ sich zwischen beiden Kenngrößen kein

116

DISKUSSION eindeutiger Zusammenhang erkennen. Die Werte der Holzfeuchte blieben konstant auf gleichem Niveau (Signifikanzniveau p≤0,01), wohingegen Gewichtsverluste zunahmen, sodass zwischen den einzelnen Inkubationszeiten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnte. SCHWARZE (1995) folgerte aus Versuchen mit I. hispidus an Platanenholz auf eine hohe Variabilität der Feuchtigkeitsverhältnisse, wobei er auf den ökologischen Spielraum der Besiedlungsstrategie an frischen Astungswunden hinweist. An dieser Stelle muss betont werden, dass die Bedingungen für den Pilz im lebenden Baum von in vitro Studien abweichen können. Hinsichtlich des Sterilisationsverfahrens (Autoklav) sind PK im Labor thermisch beeinflusst und dies wirkt sich somit auf die Holzeigenschaft sowie das Wachstumsverhalten holzzersetzender Pilze aus. Dennoch liefern diese in vitro Studien erste Anhaltspunkte, unter Ausschluss von anderen Umwelteinflüssen, dass S. platani bei niedrigeren Werten der Holzfeuchte eine intensivere Holzzersetzung hervorruft. Somit legen diese Untersuchungen nahe, dass S. platani im lebenden Baum auf bereits physiologisch geschwächten Ästen aufgrund des Wasserdefizits mit der resultierenden Verringerung der Holzfeuchte ideale Voraussetzungen der Mycelausbreitung vorfindet und in der Lage ist, eine eingehende Holzzersetzung hervorzurufen.

4.3.2 Einfluss vom Holzabbau auf Festigkeitseigenschaften von Platanenhölzern

Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde überprüft, inwieweit sich der Masseverlust auf die Festigkeitseigenschaften auswirkt. Wie eingangs erwähnt, wäre eine zusätzliche Überprüfung der Schlagbiegefestigkeit oder Prüfverfahren der Zug- und Druckfestigkeit quer zum Holzfaserverlauf wünschenswert, um Aussagen über biomechanische Auswirkungen beim Astbruch treffen zu können, jedoch konnte im Rahmen dieser Untersuchungen nur die Druckfestigkeit parallel zum Faserverlauf geprüft werden.

Biomechanisch betrachtet verleiht die Mittelschicht der Zellwand die Eigenschaft der Druckfestigkeit und Steifigkeit. Im Vergleich zur Sekundärwand ergibt sich eine höhere Druckfestigkeit der Mittelschicht aus dem geringeren Anteil in die Matrix eingelagerter

Mikrofibrillen und den damit verbundenen höheren Lignifizierungsgrad (SCHWARZE et al. 1999). Lignin ist in den Zwischenräumen der Fibrillen eingelagert und sorgt somit für die axiale Druckfestigkeit des Holzes. Cellulose stellt die Gerüstsubstanz dar, wobei Ketten von Zellulosemolekülen sich zu Mikrofibrillen zusammen lagern und schraubenförmig in

117

DISKUSSION der Zellwand verlaufen. Cellulosefibrillen hingegen nehmen die Zugspannung auf und setzen ihnen hohen Widerstand entgegen (KOLLMANN 1964; BRAUN 1998).

LIESE & PECHMANN (1959) sowie LIESE & AMMER (1964) zeigten an Versuchen zur Schlagbiegefestigkeit den Einfluss von Moderfäulepilzen auf die Holzfestigkeit. Bereits geringe Gewichtsverluste führten zu einer wesentlichen Abnahme der Bruchschlagarbeit. Gewichtsverlust und Abnahme der Festigungseigenschaften korrelierten linear miteinander, so zeigten PK mit hohen Gewichtsverlusten auch höhere Abnahmen der

Druckfestigkeit (σdB).

Gesundes Platanenholz wird nach SELL (1997) mit einer axialen Druckfestigkeit (σdB) von 2 52 N/mm angegeben; WAGENFÜHR (2006) hingegen verweist auf Spannweiten von 38- 53 N/mm2. Kontroll-Prüfkörper wiesen deutlich höhere Werte als Pilz-infizierte Proben auf. Bei den Untersuchungen zeigten gesunde Kontroll-PK einen Mittelwert von 54,5 N/mm2 [±1,08]. An dieser Stelle muss ausdrücklich hingewiesen werden, dass die Untersuchungen hier ausschließlich an Astholz durchgeführt wurden, so können ermittelte Festigkeitseigenschaften zum Stammholz abweichen. Astholz ist in der Ausgestaltung der Gewebe und Zellformen vom Stammholz zu differenzieren, auch wenn Gewebearten und Zelltypen die gleichen sind. Jahrringe sind häufig schmaler als Jahrringe im Stammholz und die Rohdichte nimmt durch dickwandige Faserzellen zu. Unterschiede sind vor allem an der Astober- und -unterseite aufgrund unterschiedlicher Lignifizierungsgrade zu finden sowie zwischen stammnahen und stammfernen Astpartien (AUFSEß 1973; WAGENFÜHR

1989; vgl. DOHRMANN 2018).

Mit S. platani inkubierte Proben wiesen 19,25 % geringere Druckfestigkeiten als gesundes Holz (Kontrolle) auf. Die histologischen Präparate zeigten, dass die ligninreiche Mittelschicht nach 32-wöchiger Inkubation nahezu intakt war. Da Moderfäuleerreger Lignin zeitlich versetzt oder kaum enzymatisch verwerten können, ist die Mittelschicht der Prüfköper noch in der Lage, axiale Druckkräfte parallel zur Faser aufzunehmen. Darüber hinaus kann nur spekuliert werden, inwiefern die Auswirkungen quer zur Faser verlaufen, dennoch ist anzunehmen, dass Messwerte deutlich abnehmen, da Zugspannungen aufgrund des Sekundärwandabbaus nicht versagensfrei aufgenommen werden können. Der bevorzugte Abbau der cellulosereichen S2-Schicht hat zur Folge, dass ein erheblich hoher Anteil der Zug- und Schlagebiegefestigkeit gemindert wird. Mit zunehmender Holzzersetzung zeichnet sich das Platanenholz durch eine Versprödung mit einer relativ hohen Steifigkeit aus.

118

DISKUSSION

Beim simultanen Weißfäuleerreger T. versicolor war eine weitaus höhere Abnahme der Druckfestigkeit zu beobachten. Prüfkörper verzeichneten eine Abnahme der Druckfestigkeit von 63 %. T. versicolor ist in der Lage, alle Zellwandbestandteile gleichermaßen (simultan) enzymatisch anzugreifen; so zeigten histologische Präparate einen weit vorangeschrittenen Zellwandabbau, wobei die Mittelschicht nicht mehr in der Lage war, axiale Druckkräfte aufzunehmen.

I. hispidus als „Dualer Holzzersetzer“ konnte im besiedelten Holz mit einer Abnahme der Druckfestigkeit parallel zur Faser von 25,77 % bonitiert und zwischen S. platani und T. versicolor eingeordnet werden. Die Mittelschicht wies auf den histologischen Gewebeschnitten bereits sichtliche Abbauerscheinungen auf, sodass axiale Druckkräfte nicht mehr versagensfrei aufgenommen werden konnten.

4.4 Interpretation der histologischen Präparate

4.4.1 Durchlichtmikroskopie

Die histologischen Untersuchungen zeigten, dass bei der Besiedlung von S. platani unter den verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zersetzungsintensitäten zu finden waren. Bei Betrachtung der Hyphenverbreitung wiesen Holzstrahlen, Längsparenchym sowie Gefäße höhere Hyphenaufkommen im Zelllumen auf, bei dennoch vollkommen intakten Zellwandstrukturen. Der bevorzugte Befall dieser Zelltypen konnte bereits von

DUJESIEFKEN et al. (2011) und HILSCHER (2016) mittels Licht- und Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Hierbei könnte es sich um eine bevorzugte Verbreitungsstrategie der Initialphase handeln, wobei durch S. platani die primäre Verbreitung über Parenchymzellen und Gefäße im Xylemgewebe erfolgt, um möglichst viele Bereiche für den Holzabbau zu erschließen. Parenchymatische Zellen beinhalten leicht verfügbare Stoffe wie Proteine, Kohlenhydrate und Fette, die der Ernährung von S. platani dienen könnten. Im Allgemeinen sind holzzersetzende Pilze befähigt, sich von diesen Inhaltsoffen und Zuckern parenchymatischer Zellen sowie dem Splintholz- Kapillarwasser zu ernähren, bevor der eigentliche Zellwandabbau erfolgt (SCHMIDT 1994). Im Gegensatz zu den Fasertracheiden waren Gefäß- und Holzstrahlenwände bis zur 32-wöchigen Inkubationszeit nahezu intakt, wohingegen ein Großteil der Fasertracheiden bereits bis auf die Mittelschicht abgebaut war. Die Widerstandsfähigkeit dieser Zelltypen beruht zum einen

119

DISKUSSION auf den bereits o. g. erhöhten Ligningehalten und zum anderen auf der unterschiedlichen Zusammensetzung der einzelnen Lignin-Monomere innerhalb der Zellwand

(Sekundärwände) im Vergleich zum Fasertracheiden-Grundgewebe (BAUM 2000;

SCHWARZE 2007; SCHWARZE 2008; SCHMITT et al. 2014).

UV-Mikroskopische Untersuchungen durch SCHMITT et al. (2014) zeigten an natürlich infizierten Platanenästen mit S. platani einen hohen Zersetzungsgrad der Fasertracheiden bei nahezu intakten Gefäßwänden. Begründet wurde dies durch den Gefäßwandaufbau mit erhöhten Lignin-Konzentrationen an Guaiacyl-Einheiten im Vergleich zu den Fasertracheiden mit erhöhten Syringl-Einheiten. Bereits nach 12-wöchiger Inkubation waren Fasertracheiden sichtlich angegriffen und es kamen mehr Lücken zum Vorschein, wobei Zellwände mit den typischen Merkmalen der Moderfäule bis auf die Mittelschicht abgebaut wurden. Allerdings können Abbaumuster nicht einen einzelnen Moderfäule- Typus zugeordnet werden, vielmehr konnten beide Typen (Typ 1 sowie Typ 2) vorgefunden werden, wobei auf der einen Seite im Initialstadium ein langes Bestehen der

S3-Schicht auf Typ 1 hindeutet. Auf der anderen Seite waren mit steigender

Inkubationszeit Pilzhyphen zu beobachten, die sich vom Lumen her in die S3-Schicht einerodierten (siehe Abb. 3.18; vgl. SCHMITT et al. 2014). Diese S3-Schicht weist im

Gegensatz zur S2-Schicht wesentlich geringere Gehalte an Zellulose auf. Erste Anzeichen des Sekundärwandabbaus zeigten sich innerhalb der S2-Schicht. Die vom Zellwandabbau betroffenen Sekundärwände der Holzfasern haben mit einem relativen Anteil an Zellulose

(bis zu 94 %), einen entsprechend niedrigen Ligningehalt (SCHWARZE et al. 1999). Die stark lignifizierten Bereiche der Mittelschicht, speziell die Zellzwickel, waren bei allen eingesetzten Prüfpilzen (T. versicolor, I. hispidus und S. platani) am wenigsten betroffen. Präparate der Durchlichtmikroskopie legen nahe, dass S. platani, neben den Zellwandbestandteilen Cellulose und Hemicellulose, Syringyl-Einheiten des Lignins innerhalb der Sekundärwand abgebaut werden. Es scheint, als ob S. platani auf diese Einheiten des Lignins innerhalb der Sekundärwand angewiesen ist, um eine intensive

Holzzersetzung hervorzurufen (vgl. SCHMITT et al. 2014). Dennoch muss an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, dass jene Mikroorganismen, die in der Lage sind, Lignin zu verwerten, auch immer Bestandteile der Holocellulose mit abbauen. Da Lignin in einer Matrix von Hemicellulose eingelagert ist, kann es als alleinige

Nahrungsgrundlage nicht dienen. Untersuchungen von SCHWARZE (1995); SCHWARZE &

FINK (1997); SCHWARZE et al. (1999); BAUM (2000); BAUM & SCHWARZE (2001a; 2001b) zeigten, dass bestimmte Fäuletypen nicht immer eindeutig in eine bestimmte Kategorie 120

DISKUSSION eingeordnet werden können, vielmehr besitzen holzzersetzende Pilze jeweils mehrere verschiedene Strategien, um die Abwehrmechanismen der Bäume zu umgehen. Die erhöhte Widerstandsfähigkeit der Gefäßwände ist somit auf die generell höheren Lignin-Konzentrationen an Guaiacyl-Einheiten im Vergleich zu umliegenden Faser- tracheiden zurückzuführen. Bei genauer Betrachtung der histologischen Präparate nach erweiterter Inkubationszeit (1,5 Jahre) wird ersichtlich, dass neben dem bevorzugten Abbau der Fasertracheiden auch Gefäßwände angegriffen wurden. Auf den Präparaten zeigten sich einerseits vollständig intakte Gefäßwände, anderseits kamen Bereiche zum Vorschein, bei welchen Gefäßwände Anzeichen vom Abbau zeigten. Hierbei ließ sich neben dem Abbau der Sekundärwand beobachten, dass die ligninreiche Mittelschicht vereinzelt durchbrochen wurde. Jedoch kann angenommen werden, dass zu diesem Zeitpunkt die Menge frei-zugänglicher Kohlenhydrate nach 1,5–jähriger Inkubationszeit nahezu erschöpft war und unter dem Aspekt der Substrat-Armut schließlich auch die Mittelschicht der Gefäßwände abgebaut wurde.

4.4.2 Fluoreszenzmikroskopie

Die fluoreszenzmikroskopischen Präparate ermöglichten, unterschiedliche Verholzungs- grade im Holzgewebe genauer zu identifizieren, zu lokalisieren sowie den pilzlichen Abbau zwischen Geweben mit erhöhtem Lignifizierungsgrad einzuordnen. Diese

Untersuchungen verdeutlichen, dass beim bevorzugten Sekundärwandabbau der S2- Schicht, neben den kohlenhydrathaltigen Bestandteilen der Holocellulose, auch verbleibende Syringyl-Einheiten des Lignins innerhalb der Sekundärwand von

Fasertracheiden abgebaut und verwertet werden (vgl. SCHMITT et al. 2014). An dieser Stelle muss jedoch berücksichtigt werden, dass diese Untersuchungen an Astholz durchgeführt wurden und mögliche/potentielle Unterschiede bzgl. Lignifizierungsgrad der Sekundärwände, wie diese in Platanenästen vorkommen, mit einbezogen wurden. Auf den fluoreszenzmikroskopischen Präparaten traten Zugholzstrukturen vermehrt mit Wandablösungen sowie Spalten und Rissen innerhalb der Sekundärwand hervor. Zudem war häufig ein auffallend „grün-blauer“ Farbton, angrenzend an das Lumen, charakteristisch.

121

DISKUSSION

4.5 Interpretation der Ergebnisse des Infektionsversuchs

Nach der ZTV- GROßBAUMVERPFLANZUNG (2005) ist eine Bewässerung gepflanzter Großbäume (Baumgröße: StU 30-50 cm) unter durchschnittlichen Standortverhältnissen, im ersten Standjahr während der Vegetationsperiode mit einem Richtwert von 20 Bewässerungsgängen mit je 200-400 Liter Wasser vorgesehen. Dies kann je nach Ausmaß der Trockenperioden unterschiedlich stark variieren. Infolge der Bewässerung konnte bei „bewässerten“ Versuchsbäumen, denen zusätzlich eine Wassermenge von 100 l/Tag (Variante: a) „bewässert“, d) „Kontrolle“) während der Vegetationsperiode zugeführt wurde, ein positiver Effekt vermerkt werden. Versuchsbäume wiesen zum Zeitpunkt der Versuchsauflösung signifikant höhere (p≤0,05) Stammzuwächse als „unbewässerte“ Bäume (Variante: b) „unbewässert“, c) „unbewässert mit Astschaden“) auf. Über die gesamte Versuchsdauer zeigte sich bei „bewässerten“ Versuchsbäumen ein gemittelter Stammzuwachs von 7,1 cm im Umfang und bei „unbewässerten“ Bäumen lediglich ein Zuwachs von 4,5 cm. Vor allem während der Vegetationsperiode im ersten (2015) und zweiten Jahr (2016), zeigten „bewässerte“ Versuchsbäume höhere Belaubungsgrade sowie ein geschlossenes Kronenbild, während „unbewässerte“ Bäume sichtlich erhöhte Kronentransparenz aufwiesen. Im Folgejahr 2017 konnten Versuchsbäume ihre Blattmasse entsprechend regenerieren (siehe Anhang Abb. 8.3.1). Die Stammzuwächse müssen dennoch unter gewissen Vorbehalten infolge der Wurzelverletzungen (Kappungen im Fein- bis Grobwurzelbereich) zum Zeitpunkt der Pflanzung sowie aufgrund standörtlicher Gegebenheiten (Grundwasserspiegel auf der Versuchsfläche <1 m unter Gelände- oberfläche) betrachtet werden. Die Messdaten der in Abb. 3.31 dargestellten Lufttemperaturen und in Abb. 3.32 aufgeführten Niederschlagsmengen stammen einst aus der meteorologischen Stadtstation der Professur für Umweltmeteorologie der Universität Freiburg (Luftlinie: 5 km Entfernung zur Versuchsfläche). Somit können die Wetterdaten der Versuchsfläche aufgrund kleinklimatischer sowie regionaler Gegebenheiten geringfügig davon abweichen.

Über den gesamten Versuchszeitraum traten kontinuierlich bei allen Varianten [a) „bewässert“, b) „unbewässert“ c) „unbewässert mit Astschaden“, d) „Kontrolle“], bevorzugt ab Mitte der Vegetationsperiode natürliche Infektionen von S. platani auf. An Bäumen der „unbewässerten“ Variante zeigten sich dabei vermehrt natürliche Infektionen an Ästen „sekundärer Stellung“ (im unteren Kronenbereich mit direkter Anbindung an den Hauptstamm oder als Seitenast im gesamten Kronenraum). Allerdings handelt es sich vor

122

DISKUSSION allem um Äste im Feinastbereich <2 cm Astdurchmesser. Stärker dimensionierte Äste „primärer Stellung“ wiesen hingegen keinen Befall auf. An diesen Ästen zeigte sich gleiches charakteristisches Bild wie bei der Behandlungsvariante der Stamminokulation. Hier konnte S. platani bereits im Peridermgewebe engsträumig abgeschottet werden, trotz Bildung pyknidialer Fruchtkörper und Sporulation von Konidiosporen.

Die verschiedenen Untersuchungen (Feldversuch, in vitro) zeigten, dass S. platani in der Lage war, bei wechselnden Bedingungen (vor allem Wasserdefizit mit sinkender Holzfeuchte) den Holzabbau zu begünstigen. An Ästen stärkerer Dimensionen („primärer Stellung“) konnte keine eingehende Holzzersetzung festgestellt werden. Über die gesamte Vegetationsperiode wurden ab Frühjahr (Mitte April) bis in den Herbst (Oktober) kontinuierlich pyknidiale Fruchtkörper ausgebildet, welche massenhaft Konidiosporen beinhalteten. Demgegenüber waren Perethecien der Teleomorphe verstärkt im Sommer bis Hochsommer (Juni bis August) zu beobachten. So bestand besonders zu diesen Zeiten ein erhöhter Infektionsdruck.

Die Beobachtungen über eine schubweise Ausbreitung der Rindennekrosen, wie diese von

KEHR & KRAUTHAUSEN (2004); KEHR (2011) beschrieben sind, könnten auf Veränderungen des Holzfeuchtegehaltes innerhalb des Astgewebes physiologisch geschwächter Äste zurückgeführt werden. KEHR & KRAUTHAUSEN (2004) vermuten sinkenden Rindenturgor sowie höhere Temperaturen astoberseits als mögliche Ursache der schubweisen Ausdehnung nekrotischer Rindenbereiche. Die Infektionsversuche zeigten, dass die Ausprägung der Symptome nicht zwangsläufig über die Astoberseite erfolgen muss. Mehrfach konnten Symptome natürlich infizierter Äste seitlich am Astgewebe oder sogar auf der Astunterseite beobachtet werden.

Entsprechende Beobachtungen konnten auch von STOBBE & DUJESIEFKEN (2017) aufgezeigt werden.

123

DISKUSSION

4.5.1 Reaktionsvermögen von Platanenästen nach S. platani Infektion

Die Infektionsversuche an gesundem Rindengewebe zeigten, dass die äußersten Periderm- Schichten bzw. suberinisierte Zellwände, eine natürliche Barriere gegen das Eindringen in den Wirt darstellen (siehe Abb. 3.35). Ein Hyphenwachstum konnte an diesen Schichten abrupt gestoppt werden und die histologischen Gewebeschnitte verdeutlichen, dass ein Durchdringen dieser Schichten meist nicht stattfand. Zudem zeigte sich ein bevorzugter Befall an untergeordneten, schwächer dimensionierten Ästen „sekundärer Stellung“. Diese traten bevorzugt im unteren Kronenbereich mit direkter Anbindung an den Hauptstamm oder als untergeordnete Seitenäste im gesamten Kronenbereich auf. Eine ursächliche Penetrationshyphe als Wirts-Besiedlung konnte an keinem der Inokulationspunkte vorgefunden werden.

An Inokulationspunkten mit geschädigtem Rindengewebe (Versuch II) kam es in Folge der Schädigung mit einhergehenden Luftembolien zur Abwehrreaktion der Äste. Diese Bereiche zeigten vermehrte Auf- bzw. Einlagerungen von Suberin bei neugebildeten Zellen, was auf histologischen Gewebeschnitten mittels Sudan III ersichtlich wurde. Zudem zeigten sich weitere polyphenolische Verbindungen mit pilzwidriegen Substanzen im Zelllumen. Je nach Ausmaß und Tiefe des Schadbereiches konnte der äußerste Jahrring nach Verletzung an Ästen „sekundärer Stellung“ von S. platani besiedelt werden und es zeigte sich der beschriebene Zellwandabbau mit der typischen Abbaustrategien der Moderfäule (Typ 1 und Typ 2). Histologische Gewebeschnitte zeigten ein gleiches charakteristisches Bild aus den Feldversuchen wie jene aus in-vitro Versuchen. Allerdings konnten infolge vermehrter Einlagerungen in angrenzende Zellen diese Bereiche erfolgreich kompartimentiert werden. Die baumeigene Abwehrreaktion der Platane, charakterisiert durch Anteil und Anordnung parenchymatischer Zellen, zeigte sichtlich erhöhte Einlagerungen von pilzwidrigen Substanzen. Zwar besitzt die Platane einen ausgesprochen hohen Anteil an Holzstrahlenparenchym, doch Axialparenchym findet sich nur spärlich verstreut im Grundgewebe wieder. Das Konzept der Reaktions- und

Barrierezone, von SHIGO & MARX (1977) als CODIT modellhaft beschrieben, wurde mehrfach erweitert unter holzanatomisch- baumphysiologischen sowie mykologischen

Aspekten (SCHWARZE et al. 1999; DUJESIEFKEN & LIESE 2006; DUJESIEFKEN & LIESE 2008;

SCHWARZE 2018). Eine solche Kompartimentierung konnte hier gebildet werden und erwies sich an stärker dimensionierten Ästen „primärer Stellung“ als ausgesprochen effektiv. An Ästen der Behandlungsvariante c) „unbewässert mit Astschaden“ zeigte sich

124

DISKUSSION ein gleiches charakteristisches Bild. Bis auf eine Ausnahme konnte der künstlich hervorgerufene Astschaden erfolgreich abgeschottet, ein Wundperiderm gebildet und der Schadbereich effektiv kompartimentiert werden.

4.5.2 Durchdringen der Reaktionszone physiologisch geschwächter Äste

An schwächer dimensionierten Ästen „sekundärer Stellung“ zeigten mikroskopische Untersuchungen, dass angelegte Reaktionszonen immer wieder neu durchbrochen werden konnten. Histologische Untersuchungen verdeutlichten ein Hyphenwachstum innerhalb der Einlagerungen in diesen Zellen. Vereinzelt zeigten Gefäße die Fähigkeit zur Tyhllenbildung sowie Einlagerung phenolischer Substanzen im Zelllumen. Teilweise war das gesamte Zelllumina mit diesen Substanzen gefüllt, teilweise zeigten sich diese in Form von Auflagerungen auf die S3-Schicht.

Obgleich Reaktionszonen der Baumart Platane als effektiv gegen pilzlichen Abbau im Rahmen der Kompartimentierung zu werten sind, konnten diese Gewebe eine weitere Hyphenausbreitung im Xylemgewebe nicht verhindern. Andererseits ist durch Pilz-Wirt- Interaktionsstudien bekannt, dass Pilze (wie z. B. I. hispidus) durch Änderung des Wachstumsverhaltens, wie etwa Umschalten auf ein Hyphenwachstum innerhalb der

Sekundärwand, die zellulären Einlagerungen umgehen können (SCHWARZE & FINK 1997;

SCHWARZE et al. 1999; BAUM & SCHWARZE 2001a). Untersuchungen nach BAUM (2000);

SCHWARZE & BAUM (2000); BAUM & SCHWARZE (2001b) zeigten durch in vitro Studien mit anschließender lichtmikroskopischer Auswertung, dass einige Pilze (wie der Weißfäuleerreger Ganoderma adspersum) in der Lage sind, phenolische Einlagerung der baumeigenen Abwehrreaktion (Reaktionszone) abzubauen und sogar Suberin für ihren eigenen Stoffwechsel zu nutzen.

Enzymaktivitätstests zeigten positive Reaktionen auf Polyphenoloxidasen, z. B. extra- zellulärer Laccase. Basierend auf diesen Enzymausscheidungen ist es offensichtlich möglich, Reaktionszonen „physiologisch geschwächter“ Äste zu durchwachsen. Obwohl einige höhere Pilze komplexe phenolische Verbindungen metabolisieren können, ist noch unklar, inwieweit S. platani diese Verbindungen durch extrazelluläres Enzymsystem verwerten kann. Bei Betrachtung der histologischen Gewebeschnitte macht es aber den Anschein, als ob dieser Erreger befähigt ist, einen Teil dieser Verbindungen enzymatisch verwerten zu können.

125

DISKUSSION

4.5.3 Astbasis als natürliche Barriere gegen ein Eindringen ins Stammgewebe

GROSCLAUDE & ROMITI (1991) berichten über Begünstigung des Befalls durch Wasserdefizit an Jungbäumen und führen an, dass S. platani bei akutem Trockenstress befähigt ist, in den Hauptstamm zu gelangen und folglich zum Komplettausfall führen kann. Ausnahmslos zeigte sich jedoch hier bei infizierten Platanen kein Übergang der Hyphen von Ast- zu Stammgewebe. Bei Betrachtung histologischer Gewebeschnitte der Astbasis konnte kein Hyphenwachstum über die Basis von Ästen hinaus beobachtet werden. Diese Bereiche erwiesen sich somit als ausgesprochen effektiv gegen ein Eindringen von Pilzhyphen (S. platani) in den Hauptstamm und konnten erfolgreich zum Stammgewebe abgeschottet werden. In Bereichen der Astbasis war ein erhöhter Anteil parenchymatischer Zellen mit hoher physiologischer Aktivität zu beobachten. Ein hoher Anteil dieser Zellen war komplett mit polyphenolischen Substanzen gefüllt. Suberinisierte Zellwände verhinderten ein Hyphenwachstum in axialer Richtung (Richtung Stamm). Dies ist vergleichbar einer „statischen Grenzschicht“, sodass Hyphen in radialer oder tangentialer Richtung ausweichen müssen. Hinter dieser „statischen Grenzschicht“ zeigte sich eine hohe Aktivität parenchymatischer Zellen. Verstärkt zeigten diese Bereiche Reservestoffe in

Form von Stärkekörnern (siehe Abb. 3.42) im Axial- sowie Längsparenchym. AUFSEß (1975) beschrieb die Bildung einer Schutzzone an der Astbasis von Laubbäumen als wirksame Sperre gegen das Eindringen von Moderfäuleerreger in den Stamm und führt erhöhte Aktivität dieser Zellen in Kombination mit hohem Anteil von Stärke an (ähnlich wie bei der Kernholzbildung). Es macht den Anschein, dass im Übergangsbereich Reservestoffe vom Hauptstamm mobilisiert werden können. Dadurch unterscheiden sich

Zonen der Astbasis zum normalen Astgewebe. AUFSEß (1975) meint, dass nicht nur die Astbasis an dieser Schutzsperre beteiligt ist, sondern auch dahinter liegende stärkeführende Schichten mit erhöhter Aktivität. Somit stellt die Astbasis als Übergang von Ast- zu Stammgewebe eine natürliche Barriere gegen das Eindringen von Mikroorgansimen (wie S. platani) in den Stamm dar und kann als natürliche Reaktions- bzw. Schutzschicht für eine Besiedlung von Pathogenen vom Ast- in Stammgewebe gewertet werden.

Das Xylemgewebe der Astbasis mit abknickendem Faserverlauf weist eindeutige anatomische Differenzen zum normalen Astgewebe auf und zeigt holzanatomische Parallelen zur Wand vier („Barrierezone“ nach dem CODIT-Modell). Die

126

DISKUSSION polyphenolischen Einlagerungen waren mit verschiedenen Färbungen in einem breiteren intensiveren Farbspektrum gefärbt als umliegendes Grundgewebe infizierter Äste ferner der Astbasis. Bei Betrachtung histologischer Präparate mittels Durchlichtmikroskopie (Astrablau, Sudan III) sowie fluoreszenzmikroskopisch (Acridinorange) wurde deutlich, dass in diesen Bereichen erhöhte Aktivität bestand sowie vermehrt Suberin eingelagert wurde. Gefäße zeigten Suberin-Einlagerungen in Form von suberinisierten Thyllenwänden, Wandauflagerungen im Zellumen sowie durch Verschlüsse an Gefäßenden. Lumina der Parenchymzellen und Fasertracheiden waren komplett mit polyphenolischen Substanzen gefüllt. Im weiteren Verlauf erfolgt die einhergehende Holzzersetzung welche sich von der Astbasis in radialer Richtung fortsetzt. In Bereichen der Astbasis ist diese am intensivsten, sodass hier die sog. „Soll-Bruchstelle“ entsteht. Aufgrund des Eigengewichts der Äste mit der einhergehenden Moderfäule und der daraus resultierenden Minderung der Zugfestigkeitseigenschaften quer zum Faserverlauf folgt letztlich der beschriebene typische „Sprödbruch“. Der Astbruch lässt somit auf einen bevorzugten Abbau der

Sekundärwand (S2) schließen. Die Widerstandsfähigkeit der S3-Schicht zeigte sich in vitro sowie bei der Feldstudie natürlich infizierter Äste. Diese Beobachtungen decken sich mit den UV-Mikroskopischen Untersuchungen nach SCHMITT et al. (2014) an natürlich infizierten Platanenästen. Die Reaktion der Astbasis erwies sich als ausgesprochen effektiv, doch im weiteren Verlauf des Astgewebes konnten Reaktionszonen dennoch durchbrochen werden. Somit legen die Befunde nahe, dass S. platani an physiologisch geschwächten Ästen die baumeigene Abwehrreaktion umgehen und besonders an Bereichen der Astbasis eine intensive Holzzersetzung hervorruft. Astungswunden zeigten während der gesamten Versuchsdauer an Wundbereichen effektive Abschottungsprozesse mit Bildung einer Barrierezone sowie Kallusgewebe und den späteren Überwallungswulsten. Bereits zwei Jahre nach Astentnahme konnte eine vollständige Einkapselung mit erfolgreicher Überwallung beobachtet werden (siehe Abb. 3.40). Somit wiesen Astungswunden die typischen beschriebenen Phasen der

Kompartimentierung nach CODIT auf (STOBBE et al. 1998; DUJESIEFKEN & STOBBE 2002;

LIESE & DUJESIEFKEN 2008).

127

DISKUSSION

4.5.4 S. platani als „opportunistischer Schwächeparasit“

Umweltfaktoren haben einen entscheidenden Einfluss auf den Krankheitsverlauf von Phytopathogenen. Oftmals sind Wirt und Pathogene nebeneinander vorhanden, dennoch entscheiden über das Zustandekommen einer parasitären Phase häufig wechselnde Umweltbedingungen. Klimatische Faktoren, wie Temperatur und Niederschlag, wirken sich sowohl auf den Erreger als auf den Wirt aus. Bei ausreichenden Niederschlagsmengen in Kombination mit geringen Transpirationsraten ist das Xylemgewebe im Splintholzbereich sehr wasserreich und die daraus resultierende Holzfeuchte vergleichbar hoch. Besonders urbane Baumstandorte im Straßenraumbereich sind aufgrund der widrigen Standortbedingungen sowie saisonaler Witterungsextreme mit mangelnder Wasser- verfügbarkeit, ohne direkten Wurzelanschluss an das Grundwasser, charakterisiert. Damit verschieben sich die Bedingungen seitens des Erregers und zu Lasten des Wirtes. Somit sind besonders diese urbanen Standorte zu Zeiten hoher Lufttemperaturen in Kombination mit langanhaltenden Trockenperioden für ein vermehrtes Auftreten von S. platani prädispositioniert. Bei Betrachtung des natürlichen Verbreitungsgebietes der Morgenländischen Platane (P. orientalis) wird ersichtlich, dass diese Art ursprünglich strikt an feuchte Standorte gebunden ist (ASLANBOĞA & GEMICI 1998).

Mit S. platani infizierte Äste nehmen eine unterständige („sekundäre“) Stellung ein und können zum Zeitpunkt der Infektion als bereits physiologisch geschwächt angesehen werden. Die Untersuchungen unterstützen die Aussage, dass S. platani als Moderfäule- erreger die „natürliche Astreinigung“ unterversorgter geschwächter Äste vom Fein- bis

Starkastbereich verursacht (GROSCLAUDE & ROMITIT 1991; BUTIN 2011; KEHR 2011). Dies betrifft vor allem Astpartien, die vom Baum nicht mehr ausreichend mit Wasser versorgt werden können, wobei die daraus resultierende sinkende Holzfeuchte eine entscheidende

Schlüsselvariable darstellt (NALLI 1981; GROSCLAUDE & ROMITI 1991; BUTIN 2011;

GAERTIG & BERGMANN 2011; KEHR 2011). BUTIN (2011) und KEHR (2011) sprechen in diesem Zusammenhang von einem Schwächeparasit, der erst auf stärker dimensionierte Äste übergreift, sobald die Abwehrreaktionen des Baumes durch Stressoren wie heiße, trockene Sommer mit limitierender Wasserverfügbarkeit eingeschränkt sind.

Die Ergebnisse der Untersuchungen legen nahe, dass S. platani als „opportunistischer Schwächeparasit“ eingestuft werden kann, der in der Lage ist, bei veränderten Umwelt- bedingungen (vor allem die Kombination von hohen Lufttemperaturen mit lang-

128

DISKUSSION anhaltenden Trockenperioden) in bereits unterversorgten Ästen vom Rinden- ins Xylemgewebe überzugehen und eine Holzzersetzung hervorzurufen. Nach ihren zahlreichen Untersuchungen über die natürliche Astreinigung besteht nach

BUTIN & KOWALSKI`S Forschungsreihen (1983a; 1983b; 1986; 1989, 1990, 1992) die Bedeutung von Moderfäuleerregern im Ökosystem darin, die „natürliche Astreinigung“ im Baum zu beschleunigen. Der Begriff „Natürliche Astreinigung“ stammte einst aus der Forstwirtschaft und beschreibt den natürlichen Vorgang (z. B. aufgrund mangelnden Lichtes), der durch Vermorschen und Abfallen der Äste einen mehr oder weniger astfreien

Stammes bewirkt (KNIGGE & SCHULZ 1966). Moderfäuleerreger stehen oftmals in Konkurrenz untereinander und fungieren in ökologischen Nischen, in denen es weitaus weniger Konkurrenz durch Basidiomyceten gibt (DANIEL & NILSSON 1998). Am natürlichen Sukzessionsverlauf bei der Besiedlung von Ästen sind Moderfäulepilze unter den Erstbesiedlern und Zerstörern des Holzes zu finden (KÄÄRIK 1974; EATON & HALE

1993; DEACON 2006). Vermutlich ist das Wachstum von S. platani als Besiedler von Platanenrinde auf niedrige Holzfeuchtekonzentrationen optimiert, sodass dieser bei geringfügigen Holzfeuchtegehalten günstige Bedingungen vorfindet und als konkurrenzkräftiger als Pilz-Vertreter anderer Arten anzusehen ist. BUTIN & KOWALSKI (1986) zeigten in ihren Studien, dass an Ahornästen (Acer pseudoplatanus) Splanchnonema pupula (Fr.) Kuntze (1898), die zweithäufigste festgestellte Pilzart, in Konkurrenz mit anderen Moderfäule verursachenden Ascomyceten in Bereichen nahe der Astbasis steht.

4.6 Molekulargenetische Identifizierung von Pilzen anhand von ITS-Sequenzen

Eine Überprüfung der sequenzierten PCR-Produkte des gewonnenen Isolats S. platani TBP2014.1 erfolgte mit dem Programm BLAST (Basic local alignment search tool). Öffentliche zugängliche GenBank-Einträge (NCBI National Center for Biotechnology Information) zeigten im Laufe dieser Untersuchungen (ab dem Jahr 2015) vermehrte Sequenzeinträge von identischen Pilzmaterial. Als Grundlage für die Zuordnung einer taxonomischen Gruppe werden Sequenzähnlichkeiten bestimmt, die durch den Vergleich der ermittelten ITS-Sequenzen sowie der 5,8S rRNA-Gensequenz eines unbekannten Pilzstammes herangezogen werden. Isolat TBP2014.1 konnte zweifelsfrei bei hinterlegten Sequenzeinträgen der GenBank neben S. platani eingeordnet werden. Allerdings zeigten sequenzierte GenBank-Einträge höhere Basenlängen und weniger uncodierte Bereiche.

129

DISKUSSION

Unterschiedliche Basenlängen können auf Verwendung verschiedener spezifischer Primerpaare bei den hinterlegten Datenbankeinträgen zurückzuführen sein.

Die Nukleotidsequenz der ITS-Region beträgt in etwa 500-600 Basenpaare (Bp). Auf Grundlage der ITS-Regionen isolierter Pilze war es möglich, eine klare Differenzierung auf Artniveau festzustellen (BVL 20121)). Bei allen Pilzen kommen hoch konservierte Bereiche vor, bei denen die Sequenz identisch ist. Neben diesen Bereichen kommen über den Bereich des 5,8S rRNA Gens auch variable bis hochvariable Bereiche vor. Diese Bereiche sind jedoch nicht hinreichend, um eindeutige Unterschiede innerhalb einer Art festzustellen, die auf virulentere Stämme unterschiedlicher Pathogenität hindeuten könnten. Dies bezüglich kann das Vorhandensein virulenterer Stämme mit erhöhter Pathogenität als S. platani Isolat TBP2014.1 nicht ausgeschlossen werden.

4.6.1 Pilze im Rindengewebe von Platanenästen

Bei Betrachtung der Isolation aus infiziertem Gewebe kann an dieser Stelle festgehalten werden, dass die Kultivierung bei S. platani schwierig verläuft. Wie bereits KEHR &

KRAUTHAUSEN (2004) ausführlich erwähnen, sind Kulturen auf künstlichen Nährmedien (MEA, PDA) langsamwüchsig und gegenüber schnellwachsenden Pilzen bei der Isolation aus infiziertem Gewebe benachteiligt. Nährmedien im sauren pH-Milieu zeigten bevorzugtes Mycelwachstum.

Bereits KÄÄRIK (1974) wies darauf hin, dass holzzersetzende Pilze ihr Wachstums- optimum bei einem pH-Wert 4-5 besitzen, hingegen das Wachstum bei pH-Werten im neutralen bis basischen Bereich gehemmt wird. Daher sind speziell diese Medien mit pH- Werten im sauren Milieu für eine Isolation aus infektiösem Gewebe entscheidend. Da die pH-Bestimmung des Platanenholzes pH-Werte zwischen 5,0 und 5,4 aufzeigte, folgten die Einstellungen der Nährmedien dementsprechend.

1) Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) 130

DISKUSSION

S. platani als natürlicher Besiedler im Rindengewebe?

Eine Re-Isolation von S. platani (TBP2014.1) aus künstlich infiziertem Rindengewebe konnte während der gesamten Versuchslaufzeit nicht nachgewiesen werden. Dennoch gelang es, an Referenzbäumen im Stadtgebiet Freiburg mehrfach S. platani aus symptomfreien, angrenzenden nekrotischen Gewebe im Schwach- bis Starkastbereich mit Hilfe des PLA-RI Substrat-Nährmediums zu isolieren. Dieses Nährmedium erwies sich effektiv bzgl. Mycelwachstum, wurde dennoch aufgrund seiner Opazität bei Isolations- und Kultivierungsarbeiten nur als „bedingt geeignet“ eingestuft.

Es kann weitgehend ausgeschlossen werden, dass die Infektion primär über Astungswunden bzw. Wundflächen verläuft. Vielmehr tritt S. platani als natürlicher Rindengesellschafter bei physiologisch geschwächten Ästen auf. Obgleich anzunehmen ist, dass S. platani latent im gesunden Rindengewebe vorhanden ist, darf dieser Pilz nicht fälschlicherweise zu den Endophyten gezählt werden. Vielmehr ist S. platani in der Lage, an bereits physiologisch geschwächten Platanenästen eine Holzzersetzung hervorzurufen und nimmt eine besondere Stellung am Sukzessionsverlauf der Astreinigung ein. Hingegen ist der Begriff Endophyt auf Mikroorganismen begrenzt, welche den gesamten Lebenszyklus asymptotisch im Inneren des Pflanzengewebes leben, ohne negative Effekte auf die Pflanzenphysiologie (BUTIN 1986; PETRINI 1991).

4.6.2 Isolation weiterer Pilzflora mit lignicolen Potential

Im Rindengewebe der Jungbäume kommen nach den vorliegenden Untersuchungen, überwiegend Vertreter der Ascomycota vor. Vertreter der Abteilung Basidiomycota konnten lediglich in einem Fall diagnostiziert werden. Der Weißfäuleerreger Bjerkandera adusta konnte aus infektiösem Gewebe isoliert und bestimmt werden. Dieser scheint im weiteren Sukzessionsverlauf bei der Besiedlung von Platanenästen als lignicoler Vertreter beteiligt zu sein, jedoch beim vorliegenden Feldversuch 10-jähriger Platanen eine untergeordnete Rolle einzunehmen.

Insgesamt konnten 14 Gattungen nach Isolierung und Kultivierung mikroskopisch sowie molekulargenetisch identifiziert werden. Den größten Vertreter dieser Gattungen stellten Phomopsis/Diaporthe-Arten dar. Von den 145 Pilzisolaten wiesen insgesamt 39,31 % der Proben Phomopsis/Diaporthe-Arten auf. Angesichts der Abimpfungen auf die

131

DISKUSSION

Probenmenge bezogen, verschiebt sich das Bild noch einmal deutlich; so kommen auf 82 Rindenproben 69,51 % Phomopsis/Diaporthe-Arten. Baumalter und Vitalität haben einen entscheidenden Einfluss auf die Diversität der erfassten Pilztaxa. Desgleichen können Art und Umfang des Sterilisationsverfahrens die Diversität erheblich beeinflussen. Somit kann es zu einer Verschiebung des Artenspektrums bei stärker dimensionierten Ästen kommen. Die im Zuge der Isolierung gewonnenen Pilz-Isolate wiesen im Gegensatz zu S. platani geringere Wirtsspezifität auf. Im Hinblick auf die Vielzahl an Variationen und den vorliegenden Probenumfang kann keine allgemeingültig fundierte Aussage über die Pilzflora in Bezug auf befallene Platanen-Starkäste getroffen werden. Die Ergebnisse beziehen sich vor allem auf Äste im Fein- bis Schwachastbereich 10 Jahre alter Jungbäume.

Die Gattung Phomopsis/Diaporthe umfasst pathogene, endophytische sowie saprophytische Arten, die sowohl in den gemäßigten Breiten als in tropischen Gebieten vorkommen. Die Gattung besitzt ein breites Wirtsspektrum mit zahlreichen Krankheiten an krautigen sowie Gehölzpflanzen (Fabaceae, Ericaceae, Juglandaceae Pinaceae, Rosaceae, Sapindaceae, Ulmaceae, Vitaceae) und ist assoziiert mit Symptomen wie

Blatterkrankungen sowie nekrotischem (Rinden-) Gewebe (VAJNA 2002; ANAGNOSTAKIS

2007; THOMIDIS & MICHAILIDES 2009; BAUMGARTNER et al. 2013; UDAYANGA et al. 2014; McTravish et al. 2018). Die Gattung Phomopsis/Diaporthe spp., darunter die Art D. eres, konnte mehrfach aus infiziertem und symptomlosen Xylem- und Rindengewebe isoliert sowie über molekulargenetischen Abgleich auf Artniveau bestimmt werden. So berichten MCTRAVISH et al. (2018) von einem vermehrten Absterben von Fichten in Nordamerika (Michigan; USA) und einem erhöhten Auftreten von Diaporthe-Arten in betroffenen Regionen. In Infektionsversuchen testeten die Autoren unterschiedliche Diaporthe spp.-Stämme auf Virulenz gegenüber verschiedener Fichten-Taxa und folgerten auf unterschiedlich stark virulente Stämme, welche sich phylogenetisch nur um ein bis zwei Basenpaare unter Verwendung der ITS-Region unterscheiden.

UDAYANGA et al. (2014) weisen darauf hin, dass die Sequenzheterogenität der nuklearen ribosomalen internen transkribierten Spacers (ITS) innerhalb von Diaporthe eres stark variieren kann und dies oftmals zu einer Überschätzung der Artenvielfalt führt. Kulturen des D. eres Isolat TBP2017.1 und Isolat TBP2017.2 zeigten keine eindeutigen morphologischen Unterscheidungsmerkmale, dennoch trat das Nährsubstrat (MEA- Nährmedium) bei TBP2017.2 in einem dunkleren Erscheinungsbild auf. Bei 132

DISKUSSION

Gegenüberstellung beider Isolate zeigte das Alignment Differenzen an 5 Basenpaaren. Öffentliche Sequenzdatenbanken sind weder qualitätsgesichert noch vollständig für alle in Frage kommenden Pilze geeignet. Dennoch eignen sich diese Gendatenbankeinträge der öffentlichen, umfangreichen, universellen, qualtitäts-kontrollierten NCBI-Datenbank mittels BLAST für die Sequenzauswertung (BVL 2012). Untersuchungen an urbanen Kopf- Platanen in Frankreich zeigten die letzten Jahre vermehrt Ast- und Stamm-übergreifende nekrotische Rindenbereiche. Aus befallenem Gewebe konnte FERNER (2016/2017; mündliche Mitteilung) mehrfach wiederholt u. a. Diaporthe eres, Phomopsis theicola isolieren. Allerdings scheinen beginnende Rindenverfärbungen in einer dunkleren

Erscheinung aufzutreten als vergleichsweise Rindenverfärbungen durch S. platani.

BARNARD & DIXON (1983) erwähnen bei ihren Untersuchungen über das Platanen- Aststerben „branch dieback in sycamore“ in Florida an Platanus occidentalis u. a. ein gemeinsames Auftreten von S. platani mit Phomopsis spp. Arten. Die isolierten Pilze aus den Versuchsbäumen [D. eres (TBP2017.1, TBP2017.2); P. theicola (TBP2016.1)] wurden im Labor künstlich auf Platanenholz geimpft. Nach 6– wöchiger Inkubationszeit konnte bei Diaporthe eres eine intensive Moderfäule mit filigraner, schwarzer Demarkationslinien-Bildung diagnostiziert werden (Abb. 3.52). Das Holz wies ein helleres Erscheinungsbild als S. platani infiziertes Holz auf. Dennoch zeigte sich auf histologischen Schnitten nach 9-wöchiger Inkubation ein weit vorangeschrittener Zellwandabbau der Sekundärwandschichten bis auf die Mittelschicht. Dieses charakteristische Bild zeigte sich bei allen Zelltypen (Axial- und Längsparenchym, Gefäße, Fasertracheiden); es ist ein mikroskopisches Unterscheidungsmerkmal zu S. platani. Bei genauerer Betrachtung der histologischen Präparate scheint das lignicole Potential von einigen Vertretern der Phomopsis/Diaporthe spp., speziell D. eres (Isolat TBP2017.1), höher zu sein als bei S. platani, da dieser befähigt ist Gefäßwände, mit mehr Guaiacyl- Einheiten abzubauen. Dagegen zeigten sich auf histologischen Präparaten bei P. theicola nach 16-wöchiger Inkubationszeit nahezu intakte Zellwände ohne jegliche Strukturveränderungen. Über das gesamte Präparat war nur ein geringes Hyphenaufkommen ersichtlich. An Randbereichen der Gewebeschnitte zeigten sich Hyphen im Zelllumen, jedoch ohne Anzeichen eines Zellwandabbaus. Es macht den Anschein, als ob P. theicola zur bevorzugten Verbreitung parenchymatische Zellen nutzt. Dennoch ist anzunehmen, dass P. theicola zu den endophytischen Pilz-Gesellschaftern im Rindengewebe der Platanenäste zu zählen ist, ohne an der Holzzersetzung, bzw.

Astreinigung im Xylemgewebe beteiligt zu sein. ANNESI et al. (2016) zeigten jedoch die

133

DISKUSSION

Pathogenität sowie Fähigkeit zur Hervorrufung von Rindennekrosen bei Infektions- versuchen an Edelkastanie (Castanea sativa) mit P. theicola.

Das stetig wiederholende Auftreten von D. eres gemeinsam mit S. platani im Rinden- und Xylemgewebe physiologisch geschwächter Äste legt nahe, dass beide Erreger am natürlichen Sukzessionsverlauf der Astbesiedlung sowie Zersetzung von Platanenästen beteiligt sind und sie die Funktion der natürlichen Astreinigung übernehmen.

4.7 Enzymaktivität von S. platani

Die sog. „Bavendamm-Reaktion“, ein diagnostisches Verfahren zur Differenzierung von Braun- und Weißfäulepilzen, ermöglichte über Jahrzehnte eine klare Einteilung holzzersetzender Pilze in diese beiden Gruppen (BRAUNS & BRAUNS 1960). Aus

Beobachtungen folgerte BAVENDAMM (1928), dass Weißfäuleerreger Tannin und Gallussäure zu dunkel gefärbten Produkten oxidieren, während Braunfäuleerreger keine

Reaktion aufwiesen. BUTIN & KOWALSKI (1983a, 1983b, 1986, 1989, 1990; 1992) zeigten in Versuchen zum Holzabbau durch Moderfäulepilze, welche als natürliche Astreiniger im Zuge ihrer Untersuchungen an Laub- und Nadelholz klassifiziert und bestimmt wurden, teils positive, teils negative „Bavendamm-Reaktionen“, die auf ein Vorhandensein extrazellulärer Laccase schließen lassen. Nach der Einstufung der Moderfäule als eigenständigen Fäuletyp, beschrieben in FINDLAY & SAVORY (1954), zeigte sich bereits durch Untersuchungen von SEIFERT (1968) ein uneinheitliches Muster. Von den getesteten Moderfäuleerregern reagierten mehr als 50 % positiv auf die Bavendamm-Reaktion. Somit schien die Reaktion für die Charakterisierung und Identifizierung von Moderfäuleerregern nur bedingt geeignet zu sein. Nach HIGUCHI & KITAMURA (1953) besteht diese Reaktion vor allem aus einem Großteil an Laccase und zu einem geringen Teil an Tyrosinase. Darauf schlugen die Autoren eine Differenzierung zur Überprüfung der Enzymaktivität mittels α-Naphthol für Laccase sowie mit p-Kresol für Tyrosinase vor.

In der Mykologie ist bekannt, dass die meisten Weißfäuleerreger Laccase produzieren, dennoch sind unter den lignicolen Pilzen Vertreter (wie z. B. Phanerochate chrysosporium) zu finden, welche in der Lage sind, effektiv Lignin durch die Bildung einer Mangan-abhängigen-Peroxidase sowie Lignin-Peroxidase abzubauen, ohne dabei Laccase zu produzieren (KIRK & FARRELL 1987; KIRK & CULLEN 1998; BERNAUER 2016). Laccasen sind Oxidasen, die mehrere Kupferatome enthalten und katalysieren Ein- 134

DISKUSSION

Elektron-Oxidation von phenolischen Verbindungen unter gleichzeitiger Reduktion von

Sauerstoff zu Wasser (HÖLKER et al. 2002; JEON et al. 2012). Diese kommen vor allem in den pilzlichen Abteilungen der Basidiomycota und Ascomycota vor. Die Enzyme sind besonders in ligninolytischen Basidiomyceten verbreitet und am oxidativen Abbau von Lignin beteiligt, während Laccasen bei Ascomyceten vor allem die Synthese von komplexen Polymeren, wie Melanin katalysieren (BELL & WHEELER 1986). In vitro Untersuchungen an S. platani zeigten die Fähigkeit, extrazelluläre Laccase zu bilden. Somit ist vorstellbar, dass diese eine entscheidende Funktion auf enzymatischer Ebene bei der Degradation der Zellwand einnimmt. Dabei werden neben den holocellulosen Bestandteilen verbleibende Syringyl-Einheiten des Lignins innerhalb der Sekundärwand verwertet. Gleiches legt den Schluss nahe, die Fähigkeit, polyphenolische Verbindungen der Reaktionszonen physiologisch geschwächter Äste zu durchwachsen, auf dieses Enzym zurückzuführen. Kulturen von D. eres sowie P. theicola zeigten keine extrazelluläre Laccase-Bildung (qualitativ mittels α-Naphthol-Lösung), obwohl D. eres befähigt ist, bei relativ kurzen Inkubationszeiten Sekundärwände der Gefäße mit hohen Guaiacyl-Anteilen abzubauen.

Der Peroxidase-Test nach TAYLOR (1974) & STALPERS (1978) zeigte an Kulturen von S. platani positive Reaktionen, dennoch konnte die Stellung dieses Enzyms bei der Degradation der Zellwand nicht genauer betrachtet und zweifelsfrei aufgeklärt werden.

Die Überprüfung der Pektin-spaltenden Enzyme zeigte bei S. platani Kulturen nach

HANKIN & ANAGNOSTAKIS (1975), dass S. platani bedingt befähigt ist, Pektin zu verwerten, aufgrund positiver Reaktion auf Pektatlyase, welche die α-(1→4) -glykosidischen Bindungen zwischen den Galakturonsäureeinheiten spaltet.

Inwiefern all diese Enzyme bei der Degradation von Platanenholz beteiligt sind, bzw. polyphenolische Verbindungen von Platanen zu verwerten, konnte im Rahmen dieser Untersuchungen nicht genauer geklärt werden. Erst das Zusammenspiel mannigfaltiger Enzyme macht einen vollständigen Abbau verholzter Zellwände möglich. Diesbezüglich besteht auf enzymatischer Ebene weiterer Forschungsbedarf.

135

DISKUSSION

4.7.1 Laccase als Vitalitätsindikator in den Dualkultur-Tests

Im Zuge der Isolierungsarbeiten traten nahe dem Inkubationspunkt auch Trichoderma spp. als die zweithäufigste Gattung isolierter Pilze im Platanen-Rindengewebe (24,39 %, bezogen auf Probemenge; 13,79 % auf Anzahl isolierter Pilze) auf. Daher war eine Überprüfung zum antagonistischen Potential von Trichoderma sp. angebracht. Der als Trichoderma harzianum mittels molekular-genetischer Analyse bestimmte Pilz wurde somit zur Auswahl potentieller Antagonisten für die Dualkultur-Tests herangezogen.

Die qualitative Nachweismethode von Laccase nach KÄÄRIK (1965) und STALPERS (1978) ermöglichte es, im Vorfeld mittels α-Naphthol auf ein qualitatives Vorhandensein der Laccase zu testen. Reinkulturen von S. platani zeigten bereits binnen 1 h positive Farbreaktion, während Kulturen von T. harzianum nach einer Woche keine Reaktion aufwiesen und hinsichtlich vorhandener Laccase negativ gewertet wurden. Entsprechend zeigten Vorversuche an Reinkulturen von T. harzianum (Nährmedium MEA 2 %, pH 6) keine messbaren Absorptionsmengen [SEA] (quantitativ mittels Spektral-Photometer), während S. platani Kulturen signifikant höhere Absorptionsmengen aufwiesen.

Studien von HÖLKER et al. (2002); BAKDEWADI et al. (2017) zeigten mittels Spektral- Photometer jedoch einen positiven extrazellularen Laccasenachweis für T. harzianum unter Berücksichtigung spezifischer Parameter. Unter Verwendung stickstoffreicher Nährmedien (mittels Natriumglutamat) mit geringen pH-Werten (pH 3,5 und 5,5), zeigten Kulturen von T. harzianum eine Aktivität in Bereichen der Konidiophoren, wenn auch von relativ kurzer Persistenz.

Mit zunehmender Inkubationszeit schien die Laccaseaktivität in Reinkulturen (S. platani) rückläufig zu sein; so zeigten 16 Wochen alte Reinkulturen keine messbare quantitative Laccaseaktivität mittels Spektral-Photometer (Zeitraum: 30 min). Eine qualitative Überprüfung mittels α-Naphthol zeigte dennoch positive Reaktionen binnen 24 h, aber zeitlich verzögert und mit einer eindeutig geringeren intensiven Farbreaktion als frische Kulturen. Sobald Kulturen thermisch behandelt, bzw. abgetötet wurden (80° C, 1 h), zeigte sich kein Nachweis extrazellularer Laccase, weder quantitativ noch qualitativ.

Somit wurde die Bildung extrazellularer Laccase als Vitalitätsindikator für Dualkultur- Tests herangezogen. Gewöhnlicherweise werden für Dual-Kulturtests selektive Nährmedien mit fungiziden Eigenschaften, wie bspw. Thiabendazole verwendet, doch selektive Nährmedien erzielten immer wieder den Ausschluss beider Arten. 136

DISKUSSION

Die Fähigkeiten von T. harzianum, zellwandauflösende Enzyme, wie ß-1,3 Glucanasen,

Chitinasen und Cellulasen zu produzieren, wurden von ELAD et al. (1982; 1984); LORITO et al. (1993; 1994) nachgewiesen; eine Übersicht findet sich in MARKOVICH & KONONOVA

(2003) sowie HANSAN et al. (2014). Der antagonistische Effekt von T. harzianum gegenüber S. platani konnte nach 2-wöchiger Versuchslaufzeit mittels in vitro Studien durch signifikante Unterschiede der Rein- und Dualkulturen nachgewiesen werden. Eine längerfristige Hemmzone, wie sie für die

Bildung von Antibiosis in Dualkultur beschrieben ist (DENNIS & WEBSTER 1971 a; 1971 b) war nicht zu beobachten. Die Gegenüberstellung von Rein- und Dualkulturen zur photometrischen Bestimmung der Laccaseaktivität eignete sich somit als Vitalitätsindikator, um antagonistisches Potential von Mikroorganismen, in vitro zu quantifizieren. Das antagonistische Potenzial kann nicht nur zwischen den einzelnen Arten, sondern auch zwischen einzelnen Stämmen stark variieren. Zahlreiche Studien finden sich über die Wirkung und Effektivität von Mycoparasitismus sowie Antagonismus mit

Trichoderma spp. gegenüber Pflanzenpathogenen (LUNDBORG & UNESTAM 1980; BELL et al. 1982; CHET 1987; LORITO et al. 1994; CHET et al. 1997; DE MEYER et al. 1998;

HARMAN 2000; HOWELL et al. 2003; SCHUBERT 2006; SCHUBERT et al. (2008a; 2008b);

SCHWARZE et al. 2012; SINGH et al. 2012; QUALHATO et al. 2013). SCHUBERT (2006) zeigte durch ad planta Studien mit der Aufbringung durch Sporensuspension der Gattung Trichoderma spp. einen prophylaktischen Schutz nach baumpflegerischen Schnittmaßnahmen auf Wundflächen der Bäume gegen holzzersetzende Pilze. Die Ergebnisse zeigten aber auch eingeschränkte Persistenz der Suspensionen auf Schnittflächen. An dieser Stelle muss noch einmal ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass S. platani seinen Wirt nicht über große Astungswunden besiedelt.

4.8 Bedeutung der Erkenntnisse für die Baumpflege

Für den urbanen Baumstandort mit den verbundenen widrigen Standortverhältnissen wird die Massaria-Krankheit auch zukünftig zu Zeiten hoher Lufttemperaturen in Kombination mit langanhaltenden Trockenperioden das Risiko bruchgefährdeter Äste erhöhen. Es ist anzunehmen, dass S. platani als natürlicher Pilzgesellschafter im Platanenrindengewebe anzutreffen ist, der unter wechselnden Bedingungen bei physiologisch geschwächten Wirten in eine parasitäre Phase übergeht sowie eine Holzzersetzung hervorruft.

137

DISKUSSION

Die Gattung Platanus wird weiterhin aufgrund ihrer positiven Eigenschaften (gute Schnitt- und Kompartimentierfähigkeit hohe Toleranz gegenüber Winterkälte) bedeutsam für den urbanen Baumstandort sein. Diese Gattung ist aus den internationalen Metropolen nicht mehr wegzudenken. Die uneinheitliche Verteilung der Platanenbestände in Städten und Kommunen führt dazu, dass die Massaria-Krankheit für Garten- und Grünflächenämter mit hohem Platanenanteil auch zukünftig einen erhöhten Personal- und Pflegeaufwand erfordert. Befallene Astpartien der Oberseite sind oftmals schwer zu erkennen, sodass bei der visuellen Inaugenscheinnahme dieser Baumart erhöhte Aufmerksamkeit geboten ist. Im Anfangsstadium zeigen befallene Äste eine nahezu vollständige Belaubung und sind schwer einsehbar, da die Wasserversorgung über nicht befallene Astpartien erfolgen kann. Somit führt die Massaria-Krankheit besonders auf Standorten im Straßenraumbereich mit den widrigen Bedingungen nach langanhaltenden Trockenperioden für Städte und Kommunen mit hohem Platanenanteil weiterhin zu einem erhöhten Kontroll- und Pflegeaufwand.

STOBBE & DUJESIEFKEN (2011; 2017) testeten den Einfluss von Kronenschnittmaßnahmen auf eine Reduzierung des Massaria-Befalls und folgerten aus ihren Untersuchungen, dass

Kroneneinkürzung und Kronenauslichtung (gemäß ZTV-BAUMPFLEGE 2006) zu einem prophylaktischen Schutz gegen ein Neubefall führen können. An 40- und 70-jährigen Platanen folgerten sie eine Reduzierung von über 50 % bzw. um 90 % an 70-jährigen Platanen.

Schnittmaßnahmen bereits unterversorgter, physiologisch geschwächter Äste im Inneren der Krone unter Berücksichtigung des artgerechten Habitus könnten zukünftig eine sinnvolle Maßnahme gegen einen Neubefall von S. platani darstellen. Diese Äste könnten nicht nur eingekürzt, sondern aufgrund effizienter Reaktions- und Kompartimentier- fähigkeit dieser Baumart an der Basis der Äste komplett entfernt werden.

In den Lebensphasen eines Baumes ist die Entstehung von Totästen ein ganz normal verlaufender Prozess. Daher darf auch angesichts der Massaria-Krankheit nicht jeder entstehende Totast ohne Prüfung S. platani zugeschrieben werden.

In jüngster Vergangenheit wurde P. x hispanica forstwirtschaftlich als potentielle Alternative zur heimischen Esche aufgrund des auftretenden Eschen-Triebsterbens diskutiert und als gut geeignet für die Anpassung an geändertes Klima eingeschätzt

(WILLOUGHBY et. al 2007; METTENDORF 2016). Aus forstwirtschaftlicher Sicht im Rahmen

138

DISKUSSION der Holzproduktion, wo eine möglichst große astfreie Schaftlänge erstrebenswert ist, wäre die Rolle von S. platani als „natürlicher Astreiniger“ positiv zu werten, da dieser zur Astreinigung beiträgt, ohne ins Stammgewebe von Platanen überzugehen. Zumal die Platane eine ausgesprochen effektive Abschottung an der Astbasis mit hohem Überwallungsvermögen und einem hohen Maß an Bildung von Wundkallus aufweist. Dennoch stellt diese Krankheit für den urbanen Raum mit den widrigen Standortbedingungen weiterhin eine große Gefahr dar, da sie das Risiko des Astbruches auch stärkerer Äste erhöhen. Durch Vorsorgemaßnahme im Rahmen der Baumkontrolle, z. B. die Erhöhung des Kontrollintervalls stark frequentierter Baumstandorte, können aber Schadensansprüche abgewendet werden.

4.9 Ausblick

Die vorliegenden Untersuchungen beziehen sich auf das Isolat S. platani TBP2014.1; dieses wurde im Stadtgebiet Freiburgs aus Konidiosporen eines befallenen Platanenastes gewonnen und kultiviert. Nukleotidsequenzen von ITS-Regionen sind auf Artniveau hinreichend genau, stellen dennoch auf Stammniveau keine ausreichende Methodik dar. Somit können potentiell virulentere Stämme als S. platani Isolat TBP2014.1 nicht zweifelsfrei ausgeschlossen werden. Daher besteht diesbezüglich weiter Forschungsbedarf auf molekulargenetischer Ebene hinsichtlich Pathogenität bzw. virulenterer Stämme oder Mutationen. Sequenzeinträge der GenBank-Einträge (NCBI National Center for Biotechnology Information) erweitern sich stetig, daher wird sich zukünftig zeigen, ob virulentere Stämme hervortreten.

Die erhöhte Prädisposition urbaner Platanen aufgrund der stadttypischen Stressoren sowie zunehmenden Witterungsextreme könnte in den kommenden Jahren ein vermehrtes Auftreten der Massaria-Krankheit mit sich ziehen. Um zukünftig einen Befall der Krankheit zu minimieren, müssten langfristige standortverbessernde Maßnahmen in Betracht gezogen werden, dennoch stoßen gerade diese Maßnahmen bei älteren Baumexemplaren auf ihre natürlichen Grenzen. Das Entfernen unterständiger Äste im inneren Kronenbereich kann als Präventivmaßnahme gegen ein vermehrtes Auftreten der Massaria-Krankheit als Alternative in Erwägung gezogen werden.

Das von Jahr zu Jahr unterschiedliche sowie saisonal mehr oder weniger vermehrte Auftreten der Krankheit rechtfertigt in keiner Weise die generelle Entfernung von Platanen

139

DISKUSSION im urbanen Straßenraumbereich oder gar ein Pflanzverbot dieser Gattung. Zukünftig könnten bei der Neuanlage von Straßenbegleitgrün allerdings prophylaktische Maßnahmen, wie Baumarten-Mischung verschiedenster Arten, in Betracht gezogen werden, sodass bei erhöhtem Massaria-Befall das Risiko infizierter Äste in Baumbeständen gestreut wird. In Anbetracht dessen wäre dies gegenüber weiteren Platanenkrankheiten, wie dem Quarantäne-Schaderreger Ceratocystis platani (Platanenwelke/-krebs) eine nachhaltige ergänzende Maßnahme. Dieser Erreger hat bereits in den süd-westlich angrenzenden Nachbarländern (Frankreich, Schweiz) zu großen Schäden geführt. Letztendlich ist ein Auftauchen dieses Erregers im Bundesgebiet nur eine Frage der Zeit, wobei diesem durch präventive Maßnahmen vorzubeugen gilt.

140

ZUSAMMENFASSUNG

5. Zusammenfassung

Die vorliegenden Untersuchungen lieferten Aufschluss über bevorzugte Substratansprüche sowie begünstigende Lebensbedingungen von Splanchnonema platani als Verursacher der Massaria-Krankheit. Neue Erkenntnisse wurden durch Laborversuche in vitro sowie Infektionsversuche in vivo in Feldstudien unter Berücksichtigung von Umweltparametern und Holzanatomie erlangt.

Die Untersuchungen wurden mit dem Pilz-Isolat S. platani (TBP2014.1) durchgeführt. Dieses wurde anhand von Konidien aus einer natürlich infizierten Platane in Freiburg gewonnen und lichtmikroskopisch und molekulargenetisch bestimmt. Die molekulargenetischen Analysen erfolgten hierbei über die Nukleotidsequenz des 5,8S rRNA-Gens und der benachbarten ITS- DNA-Sequenz (ITS1-ITS4).

Im Labor gaben künstliche Beimpfungen von Holzproben mit S. platani Aufschluss über Holzzersetzungsintensität und Auswirkungen auf die Materialeigenschaften pilz-befallenen Holzes. In vitro Studien zeigten, dass eine Schlüsselvariable bei der Holzzersetzung die Holzfeuchtigkeit darstellt und mit sinkendem Holzfeuchtegehalt die Zersetzung intensiviert wird. Untersuchungen mittels Durchlicht- und Fluoreszenzmikrokopie zeigten eine typische Moderfäule. Bevor der wesentliche Holzabbau erfolgt, verläuft die Hyphenverbreitung auf dem Weg des geringsten Widerstandes durch Gefäßlumina und Zellwandöffnungen. Die Holzzersetzung erfolgt durch den bevorzugten Sekundärwand- abbau der S2-Schicht. Die S3-Schicht zeigte einen erhöhten Widerstand gegen Pilzhyphen, doch mit zunehmender Inkubationszeit wurde die gesamte Sekundärwand mit Ausnahme der ligninreichen Mittelschicht vollständig abgebaut. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte, unterschiedliche Verholzungsgrade und deren Beziehung zur Holzzersetzung aufzuzeigen. Histologische Untersuchungen zeigten den enzymatischen Abbau von Syringyl-Einheiten des Lignins innerhalb der Sekundärwand. Hingegen zeigten Guaiacyl-Einheiten, wie in den Gefäßwänden von Platanen, höhere Resistenz.

Kulturen von S. platani zeigten optimales Mycelwachstum bei einer Temperatur von 30° C. Platanenrinden-Agar war in Wachstumsversuchen das optimale Nährmedium für das Mycelwachstum. Dagegen ergab Platanenholz-Agar niedrige Wachstumsraten, verglichen mit standardisierten künstlichen Nährmedien.

141

ZUSAMMENFASSUNG

Auf enzymatischer Ebene ist S. platani befähigt, extrazelluläre Laccase zu bilden. Diese konnte qualitativ sowie quantitativ erfasst werden. Im weiteren Versuchsablauf eignete sich diese als Vitalitätsindikator zur Heranziehung potentieller Antagonisten.

Infektionsversuche an 10-jährigen Platanen (P. x. hispanica) zeigten auf gesundem sowie geschädigtem Rindengewebe effektive Wundreaktionen mit Bildung pilzwidriger Substanzen (wie z. B. Suberin), welche für S. platani eine natürliche Barriere gegen eine Besiedlung in den Wirt darstellen.

Eine Bewässerung von Jungbäumen hatte im Allgemeinen erhöhte Stammzuwächse, dichtere Belaubung sowie weniger natürliche Infektionen untergeordneter Äste zur Folge. Die Untersuchungen zeigten, dass S. platani auch nicht künstlich infizierte, physiologisch geschwächte Äste spontan besiedelt. Vitale Äste „primärer Stellung“ zeigten hingegen effektive Reaktionen im Periderm- und Holzgewebe der nach CODIT beschriebenen Wände. Somit kann S. platani phytopathologisch als „opportunistischer Schwächeparasit“ betrachtet werden, der infolge sich ändernder Umweltbedingungen von erhöhten Temperaturen und sinkender Holzfeuchte profitiert und die Rolle der „natürlichen Astreinigung“ einnimmt.

Entsprechend ist der Wirt aufgrund hoher Temperaturen sowie stadttypischer Baumstressoren mit den verbundenen widrigen Standortbedingungen prädispositioniert. Letztendlich entscheiden mehrere Einflussfaktoren sowie die Konkurrenzfähigkeit gegenüber weiteren Rinden- und Holzbewohnern das Ausmaß der Massaria-Krankheit mit dem häufig verbundenen Astbruch.

Isolierungen aus Rindengewebe zeigten ein vermehrtes Auftreten weiterer Pilze, teils mit endophytischem (Phomopsis theicola), teils mit lignicolem Potential (Diaporthe eres). Die ebenfalls gewonnenen Isolate von Trichoderma spp. zeigten in nachfolgenden in-vitro- Studien antagonistisches Potential.

Mikroskopische holzanatomische Untersuchungen gaben Aufschluss über die Bildung von Zugholz an der Oberseite von Platanenästen. Dies wurde charakterisiert durch erhöhtem Faseranteil, geringerem Gefäßanteil sowie erhöhtem Celluloseanteil und geringerem Lignifizierungsgrad der Zellwände. Stammnahe Bereiche zeigten einen deutlich geringen Anteil an Cellulose als distale Astpartien. Es bestand kein Zusammenhang zwischen dem bevorzugten Holzabbau astoberseits nahe der Astbasis und Zugholzstrukturen. Die Astbasis ist gekennzeichnet durch einen Bereich mit abknickendem Faserverlauf, erhöhtem 142

ZUSAMMENFASSUNG

Anteil vitaler parenchymatischer Zellen mit Einlagerungen pilz-widriger Substanzen sowie der Fähigkeit, Reservestoffe aus dem Hauptstamm zu mobilisieren. Dies erwies sich als natürliche effektive Barriere gegen ein Eindringen von S. platani in Stammgewebe.

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SUMMARY

6. Summary

This research provided information on favorable environmental conditions for the wood decay fungus Splanchnonema platani as the causative agent of Massaria disease on plane trees. New findings were obtained from the observation of the fungal infected wood in field (in vivo) and laboratory tests (in vitro).

The investigations were carried out using the fungus isolate S. platani (TBP2014.1), which was isolated from isolated conidia of the anamorph stage (Macrodiplodiopsis desmazieri). It was found on infected branches of London plane (Platanus x hispanica) in the urban area of Freiburg. The conidia were microscopically identified. Additional molecular genetic analyses were carried out by sequencing the 5.8S rRNA gene and ITS DNA (ITS1- ITS4) fields.

In the laboratory tests, artificial inoculations of wood samples with S. platani during different time periods showed the patterns of wood decomposition and effects on the material properties of infected wood. With decreasing wood moisture, decomposition was intensified. Microscopic studies (via transmitted light and fluorescence) showed hyphal spread in vessel lumina and natural openings (pits) of cell walls. S. platani caused a typical soft-rot, characterized by hyphal growth inside the secondary cell wall layer S2. The S3-layer showed high resistance against fungal attack. However, with increasing duration of the incubation period, the secondary cell wall was completely degraded, except for the lignin- rich middle lamella. Fluorescence microscopy showed different degrees of lignification and their relation to wood decomposition. S. platani enzymatically utilizes syringyl units in secondary walls, whereas guaiacyl units in vessel walls of plane trees showed higher resistance.

Cultures of S. platani showed optimal mycelial growth at a temperature of 30° C. Agar medium with added Plane xylem tissue showed similar growth rates like in standardized, artificial nutrient media. However, nutrient agar with plane bark was the substrate for optimal growth of the fungus.

S. platani is capable to produce the extracellular enzyme laccase, it`s activity could be recorded by qualitatively and quantitatively tests. The laccase activity could be used in further experimental procedures for the examination of potential antagonists effects, too.

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SUMMARY

In field inoculation tests, 10-year-old trees showed very effective defense reactions by formation of antifungal substances (polyphenols) in healthy or damaged bark tissue (such as suberin) which form a natural barrier in the host against the S. platani colonization. Irrigation of young trees increased stem and foliage growth and decreased natural infection of lower branches. S. platani preferably infects physiologically weakened branches. Vital, light exposed branches showed effective responses in periderm and wood according to the CODIT model. Phytopathologically, S. platani can be classified as an "opportunistic parasite", which profits from increasing temperatures and decreasing wood moisture. Adversely, however, the host is predisposed by high temperatures with the typical urban tree stressors and the associated adverse site conditions. So this fungus is associated with "natural pruning of branches".

Isolations from bark tissue showed an increased occurrence of other fungi with endophytic (Phomopsis theicola) and lignicole potential (Diaporthe eres). Also, microorganisms with antagonistic potential (Trichoderma spp.) against S. platani were confirmed by subsequent in vitro studies.

Wood anatomical investigations showed the formation of tension wood in plane tree branches. The upper side of branches was characterized by an increased fiber content, lower content of vessels, increased cellulose content and lower lignification in cell walls. Proximal branch bases showed a significantly lower proportion of cellulose than distal tissue further down the branches. There was no relationship between tension wood formation with increased cellulose content and preferential wood degradation by S. platani in branch sectors near the base.

Branch bases were characterised by a kinking fiber flow, increased proportion and activity of parenchyma cells, with incorporation of antifungal substances and the ability to mobilize reserve substances from trunk. They proved to be a natural, effective barrier to invasion of S. platani into the xylem of the trunk.

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LITERATURVERZEICHNIS

7. Literaturverzeichnis

ADASKAVEG, J. E.; GILBERTSON, R. L. (1986): In vitro decay studies of selective delignification and simultaneous decay by the white-rot fungi Ganoderma lucidum and Ganoderma tsugae. Can. J. Bot. 64: 1611–1619.

ALFIERI, S. A. J.; LANGDON, K. R.; WEHLBURG, C.; KIMBROUGH, J. W. (1984): Index of plant diseases in Florida, revised edition. Florida Department of Agriculture and Consumer Serv., Div. Plant Ind.

AMMER, U. (1963): Untersuchungen über die Sorption pilzbefallenen Holzes. Holz als Roh- & Werkstoff 21 (12): 465-470.

AMMER, U. (1964): Über den Zusammenhang zwischen Holzfeuchtigkeit und Holzzerstörung durch Pilze. Holz als Roh- & Werkstoff 22 (2): 47-51.

ANAGNOSTAKIS, S. L. (2007): Diaporthe eres (Phomopsis oblonga) as a pathogen of butternut (Juglans cinerea) in Connecticut. Plant Dis 91 (9):1198.

ANNESI, T.; LUONGO, L.; VITALE, S.; GALLI, M.; BELISARIO, A: (2016): Characterization and Pathogenicity of Phomopsis theicola Anamorph of Diaporthe foeniculina Causing Stem and Shoot Cankers on Sweet Chestnut in Italy. Phytopathol 164: 412-416.

ASLANBOĞA. I.; GEMICI, Y. (1998): Platanus orientalis LINNÉ. In: ROLOFF, A; WEISGERBER, H.; LANG, U. M.; STIMM, B. (Hrsg.): Enzyklopädie der Holzgewächse: Handbuch und Atlas der Dendrologie. 11. Erg.Lfg. 3: 1-8.

AUFSEß, H. V. (1973): Mikroskopische Darstellung des Verholzungsgrades durch Färbe- methoden. Holz als Roh- und Werkstoff 31: 24-33.

AUFSEß, H. V. (1975): Über die Bildung einer Schutzsperre an der Astbasis von Laub- und Nadelbäumen und ihre Wirksamkeit gegen das Eindringen von Pilzen in das Kernholz lebender Bäume. Forstw. Cbl. 94: 140-152.

BAGDEWADI, Z. K.; MULLA, S. I.: NINNEKAR, H. Z. (2017): Purification and immobilization of laccase from Trichoderma harzianum strain HZN10 and its application in dye decolorization. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 15: 139–150.

BALDER, H.; EHLEBRACHT, K.; MAHLER, E (1997): Straßenbäume – Planen, Pflanzen, Pflegen, - am Beispiel Berlin. Platzer Verlag Berlin.

BALDER, H. (1998): Die Wurzeln der Stadtbäume. Ein Handbuch zum vorbeugenden und nachsorgenden Wurzelschutz. Parey Buchverlag Berlin.

BALDRIAN, P.; GABRIEL, J. (2002): Copper and cadmium increase laccase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology Letters 206: 69-74.

146

LITERATURVERZEICHNIS

BARNARD, E. L.; DIXON, W. N. (1983): Insects and diseases: Important problems of Florida`s forest and shade tree resources. Florida Department of Agriculture & Consumer Service, Division of Forestry. 196-A. 102.

BARR, M. E. (1982): On the Pleomassariaceae (Pleosporales) in North America. Mycotaxon 15: 349-383.

BÄRTELS, A. (2001): Enzyklopädie der Gartengehölze. Ulmer Verlag, Stuttgart.

BASTIDE, F.; SERANDAT, I.; GOMBERT, J.; LAURENT, E.; MOREL, E. KOLOPP, J.; GUILLERMIN, P. L.; HAMON, B.; SIMONEAU, P.; BERRUYER, R.; POUPARD, P. (2017): Characterization of fungal pathogens (Diaporthe angelicae and D. eres) responsible for umbel browning and stem necrosis on carror in France. Plant Pathology 66: 239-253.

BAUM, S. (2000): Abbau- und Ausbreitungsstrategien holzzersetzender und endophytischer Pilze in Buche und anderen Laubbäumen. Dissertation, Uni Freiburg.

BAUM, S.; SCHWARZE, F. W. M. R.; FINK, S. (2000): Persistence of the gelatinous layer within altered tensionwood fibres of beech degraded by Ustulina deusta. New Phytologist 147: 347–355.

BAUM, S.; SCHWARZE F. W. M. R. (2001a): Ansprache und Biologie holzzersetzender Pilze. Folge 1: Zottiger Schillerporling. AFZ/Wald 6: 271-272.

BAUM, S.; SCHWARZE F. W. M. R. (2001b): Ansprache und Biologie holzzersetzender Pilze. Folge 2: Die Lackporlinge. AFZ/Wald 10: 532-533.

BAUMGARTNER, K.; FUJIYOSHI, P. T.: TRAVADON, R.; CASTLEBURY, L. A.; WILCOX, W. F.; ROLSHAUSEN, P. E. (2013): Characterization of species of Diaporthe from wood cankers of grape in eastern North American vineyards. Plant Dis. 97:912-920.

BAVENDAMM W. (1928): Über das Vorkommen und den Nachweis von Oxidasen bei holz- zerstörenden Pilzen. Z. Pflanzenkr. Pflanzenschutz 38: 257-276.

BELL, D. K.; WELLS, H. D.; MARKHAM, C. R. (1982): In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathol 72: 379–382.

BELL, A. A.; Wheeler M. H. (1986): Biosynthesis and functions of fungal melanins. Ann Rev. Phytopathol. 24: 411-451.

BELLMANN, H. (1988a): Zur Frage der Bewertung von Labor-Versuchsergebnissen über die Basidiomyceten-Resistenz der Holzarten: Bisherige Ergebnisse, Vergleichbarkeit -Literaturüberblick. Holz als Roh- und Werkstoff 46: 259-267.

BELLMANN, H. (1988b): Relative Resistenz der Holzarten gegenüber Basidiomyceten. Auswertung früherer Laboratoriumsprüfungen. Holz als Roh- und Werkstoff 46: 417-425.

BERNATZKY, A. (1994): Baumkunde und Baumpflege. Thalacker Verlag, Braunschweig.

147

LITERATURVERZEICHNIS

BERNAUER, T. (2016): Charakterisierung des lignocellulolytischen Degradationssystems des xylobiontischen Phanerochaete chrysosporium (Basidiomycota). Dissertation, Uni Kassel.

BLANCHETTE, R. A.; OTJEN, L.; EFFLAND, M. J.; ESLYN, W. E. (1985): Changes in structural and chemicalcomponents of wood delignified by fungi. Wood Sci. Technol. 19: 35- 46.

BLANCHETTE, R. A.; OBST, J. R.; HEDGES, J. I.; WELIKY, K. (1988): Resistance of hardwood vessels to degradation by white rot Basidiomycetes. Can. J. Bot. 66: 1841–1847.

BODDY, L.; RAYNER, A.D.M. (1983): Origins of decay in living deciduous trees: the role of moisture content and re-appraisal of the expanded concept of tree decay. New Phytol. 94: 623-641.

BODING, J.; JAYNE, B. A. (1993): Mechanics of Wood and wood composites (2. Ausg.) Malabar (FL): Krieger Publishing Company.

BÖHLMANN, D. (2009): Hybriden bei Bäumen und Sträuchern. Weinheim Wiley-VCH.

BOURBONNAIS, R.; PAICE, M. G. (1990): Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation. FEBS Lett. 267 (1): 99-102.

BRANDSTETTER, M. (2007): Der Brandkrustenpilz (Ustulina deusta) – eine fast unsichtbare Gefährdung für zahlreiche Laubbäume. Forstschutz Aktuell 38: 18-20.

BRAUN, H. J. (1970): Funktionelle Histologie der sekundären Sproßachse. I. Das Holz. Handbuch der Pflanzenanatomie, 2. Aufl. IX/1. Bornträger, Berlin.

BRAUN, H. J. (1998): Bau und Leben der Bäume. 4. Auflage, Rombach Verlag, Freiburg.

BRAUNS, F. E.; BRAUNS, D. A. (1960): The chemistry of lignin. Supplement volume, covering the literature for the years 1949-1958. Academic Press Inc. New York.

BRISCHKE, C. (2007): Untersuchung abbaubestimmender Faktoren zur Vorhersage der Gebrauchsdauer feuchtebeanspruchter Holzbauteile. Dissertation, Uni Hamburg.

BUNDESAMT FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ UND LEBENSMITTELSICHERHEIT (BVL) (2012): Methodensammlung der Bund/Länder-AG Gentechnik (LAG) Molekularbio- logische Identifizierung von Pilzen mittels ITS-PCR und nachfolgender Sequenzierung J. Verbr. Lebensm. 7 (1):71–76.

BUTIN, H. (1986): Endophytische Pilze in grünen Nadeln der Fichte. Zeitschrift für Mykologie. 52 (2): 335-345.

BUTIN, H. (2011): Krankheiten der Wald- und Parkbäume: Diagnose-Biologie- Bekämpfung. – 4., neubearb. u. erw. Aufl., Ulmer Verlag, Stuttgart.

BUTIN, H.; KOWALSKI, T. (1983a): Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraussetzungen I. Die Pilzflora der Buche (Fagus sylvatica L.). Eur. J. For. Path. 13: 322-334. 148

LITERATURVERZEICHNIS

BUTIN, H.; KOWALSKI, T. (1983b): Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraussetzungen II. Die Pilzflora der Stieleiche (Quercus robur L.). Eur. J. For. Path. 13: 428-439.

BUTIN, H.; KOWALSKI, T. (1986): Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraussetzungen III. Die Pilzflora von Ahorn, Erle, Birke, Hainbuche und Esche. Eur. J. For. Path. 16: 129-138.

BUTIN, H.; KOWALSKI, T. (1989): Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraussetzungen IV. Die Pilzflora der Tanne (Abies alba Mill.). Zeitschrift für Mykol. 55 (2): 189-196.

BUTIN, H.; KOWALSKI, T. (1990): Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraussetzungen V. Die Pilzflora von Fichte, Kiefer und Lärche. Eur. J. For. Path. 20: 44-54.

BUTIN, H.; KOWALSKI, T. (1992): Die natürliche Astreinigung und ihre biologischen Voraus-setzungen VI. Versuche zum Holzabbau durch Astreiniger-Pilze. Eur. J. For. Path. 22: 174-182.

CAMPBELL, W. G. (1931): The chemistry of white rots of wood. II. The effect on wood substance of Armillaria mellea (Vahl) Fr., Polyporus hispidus (Bull.) Fr. and Stereum hirsutum Fr. Biochem. J. 25: 2023–2097.

CHET, I. (1987): Trichoderma – application, mode of action, and potential as a biocontrol agent of soilborne plant pathogenic fungi. In: CHET, I. (Hrsg.): Innovative Approaches to Plant disease Control. John Wiley & Sons, New York. 137-160.

CHET, I.; INBAR, J.; HADAR, Y. (1997): Fungal antagonists and mycoparasites. In Mycota Environmental and Microbial Relationships. Vol. IV. Ed. S Wicklow. Springer- Verlag, Berlin, Heidelberg. 165–184.

CHOI, J.-W.; FAIX, O.; MEIER, D. (2001): Characterization of residual lignins from chemical pulps of spruce (Picea abies L.) and beech (Fagus sylvatica L.) by analytical pyrolysisgaschromatography/mass spectrometry. Holzforschung 55 (2): 185-192.

CICCARONE, C. (1988): Macrodiplodiopsis desmazieri su alberate di Platanus orientalis L. in Emilia. Mic. Ital. 1: 27-30.

CLARKE, S. H. (1937): The distribution, structure and properties of tension wood in beech. Forestry 11 (2): 85-91.

COLLINS, P. J.; DOBSON, A. D.; FIELD, J. A. (1998): Reduction of the 2,2′-Azinobis(3- Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonate) Cation Radical by Physiological Organic Acids in the Absence and Presence of Manganese. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6): 2026- 2031.

COURTOIS, H. (1963a): Mikromorphologische Befallssymptome beim Holzabbau durch Moderfäulepilze. Holzforschung und Holzverwertung 15: 88–101.

149

LITERATURVERZEICHNIS

COURTOIS, H. (1963b): Beitrag zur Frage holzabbauender Ascomyceten und Fungi imperfecti. Sonderdruck aus Holzforschung 17 (6): 88–101.

COURTOIS, H. (1970): Einfluß von Rohdichte, Holzfeuchtigkeit und Jahrringbreite auf den Abbau des Nadelholzes durch Fomes annosus (Fr) Cke.. Holz als Roh- und Werkstoff 28 (2): 67-75.

CROUS, PW.; CARRIS, LM.; GIRALDO, A.; GROENEWALD, JZ.; HAWKSWORTH, DL.; HERNÁNDEZ-RESTREPO, M.; JAKLITSCH, WM.; LEBRUN, M-H.; SCHUMACHER, RK.; STIELOW, B.; VAN DER LINDE, EJ.; VILCĀNE, J.; VOGLMAYR, H.; WOOD, AR. (2015) The Genera of Fungi - fixing the application of the type species of generic names– G 2: Allantophomopsis, Latorua, Macrodiplodiopsis, Macrohilum, Milospium, Protostegia, Pyricularia, Robillarda, Rotula, Septoriella, Torula, and Wojnowicia. IMA Fungus 6:163–198.

DALLY, S. (2007): Auswirkungen der Massaria-Krankheit der Plantane in Göttingen auf Verkehrssicherheit, Kontroll- und Pflegeaufwand. Bachelorarbeit, HAWK Göttingen.

DANIEL, G.; NILSSON, T. (1998): Development in the study of soft rot and bacterial decay. In: BRUCE, A., PALFREYMAN, J. W. (Eds.), Forest Products Biotechnology. Taylor and Francis, London. 37-62.

DEACON, J. W. (2006): Fungal biology. Blackwell Publishing, Oxford.

DE MEYER, G.; BIGIRIMANA, J.; ELAD, Y.; HÖFTE, M. (1998): Induced systemic resistance in Trichoderma harzianum T39 biocontrol of Botrytis cinerea. Eur. J. For. Path. 104: 279-286.

DENNIS, C.; WEBSTER, J. (1971a): Antagonistic Properties of species-groups of Trichoderma. I. Production of non-volatile antibiotics. Trans. Br. mycol. Soc. 57 (1): 25-39.

DENNIS, C.; WEBSTER, J. (1971b): Antagonistic Properties of species-groups of Trichoderma. II. Production of volatile antibiotics. Trans. Br. mycol. Soc. 57 (1): 41-48.

DENNIS, C.; WEBSTER, J. (1971C): Antagonistic Properties of species-groups of Trichoderma III. Hyphal Interactions. Trans. Br. mycol. Soc. 57 (3): 363-369.

DIN 52 185 (1976): Prüfung von Holz Bestimmung der Druckfestigkeit parallel zur Faser

DIN EN 113 (1996): Prüfverfahren zur Bestimmung der vorbeugenden Wirksamkeit gegen holzzerstörende Basidiomyceten. Bestimmung der Grenze der Wirksamkeit.

DUJESIEFKEN, D.; KEHR, R.; POTSCH, T.; SCHMITT, U. (2005): Akute Bruchgefahr an Platane (Platanus x hispanica MÜNCH.). Untersuchungen zur Biologie und Schadensdynamik der Massaria-Krankheit (Splanchnonema platani [Ces.] Barr). In DUJESIEFKEN, D.; KOCKERBECK, P. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2005, Thalacker Medien, Braunschweig. 61-73.

150

LITERATURVERZEICHNIS

DUJESIEFKEN, D.; LIESE (2006): Die Wundreaktion von Bäumen – CODIT heute. In: DUJESIEFKEN, D.; KOCKERBECK, P. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2006, Thalacker Medien, Braunschweig. 21-40.

DUJESIEFKEN, D.; LIESE, W. (2008): Das CODIT-Prinzip. Von Bäumen lernen für eine fachgerechte Baumpflege. Haymarket Media GmbH & Co. KG, Braunschweig.

DUJESIEFKEN, D.; KEHR, R. (2008): Massaria-Krankheit in Deutschland als Folge des Klimawandels? Stand des Wissens und Empfehlungen für den weiteren Umgang mit der Platane. In: DUJESIEFKEN, D.; KOCKERBECK, P. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2008, Haymarket Media, Braunschweig. 49-56.

DUJESIEFKEN, D.; LÜER, B.; SCHMITT, U.; FROMM, J. (2011): Warum verläuft die Fäulnis- entwicklung bei der Massaria-Krankheit der Platane so rasch. In: DUJESIEFKEN, D.; KOCKERBECK, P. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2011, Haymarket Media, Braunschweig. 191-197.

EATON, R. A.; HALE, M. D. C. (1993): Wood decay, pests and protection. Chapman & Hall, London.

ELAD, Y.; CHET, I.; HENIS, Y. (1982): Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum. Can. J. Microbiol. 28: 719-725.

ELAD, Y.; BARAK, R; CHET, I. (1984): Parasitism of Sclerotia of Sclerotium rolfsii by Trichoderma harzianum. Soil Biol. Biochem. 16 (4): 381-386.

EMPFEHLUNGEN FÜR BAUMPFLANZUNGEN – TEIL 1 (2015): Planung, Pflanzarbeiten, Pflege 2. Ausgabe. Forschungsgesellschaft Landschaftsentwicklung Landschaftsbau e. V.

EMPFEHLUNGEN FÜR BAUMPFLANZUNGEN – TEIL 2 (2010): Standortvorbereitungen für Neupflanzungen; Pflanzgruben und Wurzelraumerweiterung, Bauweisen und Substrate Pflege 2. Ausgabe. Forschungsgesellschaft Landschaftsentwicklung Landschaftsbau e. V.

ENGELS, J. (1998): Studien zur Besiedlung und Holzzersetzung an. ausgewählten Laub- und Nadelbäumen durch wurzelbürtige Pilze. Wissenschaftliche Berichte FZKA 6068. Institut für Materialforschung.

ERICKSON, M.; Larsson, S.; Miksche, G. E. (1973): Gas-chromatographic analysis of lignin oxidation products. Structure of the spruce lignins. Acta Chemica Scandinavica 27(3): 903-914.

FALCONI, D. (2001): Alternative Bekämpfungsmöglichkeiten des Fußfäuleerregers Corticium rolfsii Sacc. Dissertation, Uni Gießen.

FENGEL, D.; GROSSER, D. (1975): Chemische Zusammensetzung von Nadel-und Laubhölzern. Eine Literaturübersicht. Holz als Roh- und Werkstoff (33): 32-34.

FINDLAY, W. P. K.; SAVORY, J. G. (1954): Moderfäule. Die Zersetzung von Holz durch niedrige Pilze. Holz als Roh- und Werkstoff 12 (8): 293-296.

151

LITERATURVERZEICHNIS

GAERTIG, T.; BERGMANN, M., (2011): Möglichkeiten zur Verringerung des Befalls der Massaria-Krankheit durch Bewässerungsmaßnahmen. In: DUJESIEFKEN, D. (Hrsg.): Jahrbuch der Baumpflege 2011. Haymarket Media, Braunschweig. 198-207.

GHISLAIN, B.; CLAIR, B. (2017): Diversity in the organisation and lignification of Tension wood fibre walls – A review. IAWA Journal 38 (2): 245-265.

GILMAN, E. F.; WATSON, D. G. (2014): Platanus x acerifolia 'Liberty': 'Liberty' London Planetree. Gainesville: Environmental Horticulture Department, UF/IFAS.

GLAWE, D. A. (1985): Haplocystis berkeleyi and Macrodiplodiopsis desmazieri in artificial culture. Mycologia 77 (6): 880-886.

GRIFFIN, D. W.; WESTPHAL, D. L.; GRAY, M. A. (2006): Airbone microorganisms in the African desert dust corridor over the mid-Atlantic ridge, Ocean Drilling Program, Leg 209. Aerobiologia 22 (3): 211-226.

GROSCLAUDE, C.; ROMITI, C. (1991): Observations sur Massaria platani parasite du Platane en Provence. Petria 1: 189-194.

GROSSER, D., 1977: Die Hölzer Mitteleuropas. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

HALE, M. D. C.; EATON, R. A. (1985): The ultrastructure of soft-rot fungi. II. Cavity forming hyphae in wood cell walls. Mycologia 77: 594-605.

HANKIN, L.; ANTAGNOSTAKIS, S. L. (1975): The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. – Mycologia 67: 597-607.

HARMAN, G.E. (2000): The myths and dogmas of biocontrol: changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease 84: 377- 393.

HASAN, S.; GUPTA, G.; ANAND, S.; KAUR, H. (2014): Lytic Enzymes of Trichoderma: Their Role in Plat Defense. Review Paper. International Journal of Applied Research and Studies (IJARS) 3 (2): 2-5.

HERDEN, R. B. (2017): Klimawandel. Fachprojekt an der Hochschule für öffentliche Verwaltung Kehl. BoD Norderstedt.

HENRY, A.; FLOOD, M.G. (1919): The history of the London plane, Platanus acerifolia with notes on the genus Platanus. Proc. Roy. Irish Acad. 35: 9-28.

HEPTING, G. H. (1971): Diseases of forest and shade trees of the United States. U. S. Department of Agriculture. Forest Service Agriculture Handbook No. 386. Forest Disease Research Branch Division of Forest Insect and Disease Research. University of Illinois.

HIGUCHI, T.; KITAMURA, K. (1953): Biochemical study of wood-rotting fungi (II), Journal of the Japanese Forestry Society 35 (11): 350-354.

152

LITERATURVERZEICHNIS

HIGUCHI, T. (1985): Biosynthesis of lignin. In Higuchi, T: Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components. Academic Press, Orlando. 141-160.

HÖLKER, U.; DOHSE, J.; HÖFER, M. (2002): Extracellular lacases in Ascomycetes Trichoderma atroviride and Trichoderma harzianum. Folia Microbiol. 47 (4): 423- 427.

HOLZEIGENSCHAFTSTAFEL (1943): Platane. Holz als Roh- und Werkstoff 6 (7): 219-220.

HÖSTER, H., R.; LIESE, W. (1966): Über das Vorkommen von Reaktionsgewebe in Wurzeln und Ästen der Dikotyledonen. Holzforschung 20 (3): 80-90.

HOWELL, C.R. (2003): Mechanisms Employed by Trichoderma Species in the Biological Control of Plant Diseases: The History and Evolution of Current Concepts. Plant Disease 87: 4-10.

JAHN, H. (1979): Pilze, die an Holz wachsen. Herford.

JEON, J-R.; BALDRIAN, P.; MURUGESAN, K.; CHANG, Y-S. (2012): Laccase-catalysed oxidations of naturally occurring phenols: from in vivo biosynthetic pathways to green synthetic applicatioins. Microb. Biotechnol. 5 (3): 318–332.

KÄÄRIK, A. (1965): The identification of the mycelia of wood-decay fungi by their oxydation reactions with phenolic compounds. Studia Forest. Succ. 31: 1-80.

KÄÄRIK, A. (1974) Decomposition of wood. In: Biology of Plant Litter Decomposition. (Hrsg.) DICKINSON, C.H., PUGH, G.J.F. Academic Press, New York. 1: 129–174.

KEHR, R.; KRAUTHAUSEN, H.J. (2004): Erstmaliger Nachweis von Schäden an Platanen (Platanus x hispanica) durch den Pilz Splanchnonema platani in Deutschland. Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdienstes 56: 245-251.

KEHR, R.; DUJESIEFKEN, D. (2006): Zur Verbreitung der Massaria-Krankheit der Platane in Deutschland. In: DUJESIEFKEN, D.; KOCKERBECK, P. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2006, Thalacker Medien, Braunschweig. 21-40.

KEHR, R. (2011): Entwicklung der Massaria-Krankheit in Deutschland in den letzten Jahren. In: DUJESIEFKEN, D. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2011, Haymarket Media, Braunschweig. 179-190.

KIRK, T. K.; FARRELL, R. L. (1987): Encymatic “Combustion”. The microbial degradation of lignin. Ann. Rev. Microbiology 41: 465-505.

KIRK, T. K., CULLEN, D. (1998). Enzymology and Molecular Genetics of Wood Degradation by White-Rot Fungi. In: YOUNG, R. A., AKHTAR, M. (1998). Environmentally Friendly Technologies for the Pulp and Paper Industry. 1. Auflage. John Wiley & Sons, New York. 273-307.

KLUG, P. (2016): Massariabefall durch unbedachte Baumpflege. AFZ/ WALD 16: 33-35.

153

LITERATURVERZEICHNIS

KNIGGE, W.; SCHULZ, H. (1966): Grundriss der Forstbenutzung. Entstehung, Eigen- schaften, Verwertung und Verwendung des Holzes und anderer Forstprodukte. Verlag Paul Parey Hamburg und Berlin.

KOLLMANN, F. (1964) Über die Beziehungen zwischen rheologischen und Sorptions- Eigenschaften (am Beispiel von Holz). Rheologica Acta, 3 (4): 260-270.

KREISEL, H.; SCHAUER, F. (1987): Methoden des mykologischen Laboratoriums. Fischer Verlag Stuttgart – New York.

LANDSCHAFTSPLAN 2020 (2006): Zukunft Freiburg Flächennutzungsplan 2020. Freiburg.

LIESE, W. (1964): Über den Abbau verholzter Zellwände durch Moderfäulepilze. Holz als Roh-und Werkstoff 22 (8): 289–295.

LIESE, W.; AMMER, U. (1964): Über den Einfluß von Moderfäulepilzen auf die Schlagbiegefestigkeit von Buchenholz. Holz als Roh- und Werkstoff 22 (12): 455- 459.

LIESE W.; PECHMANN, H. (1959): Untersuchungen über den Einfluß von Moderfäulepilzen auf die Holzfestigkeit. Forstwissenschaftliches Centralblatt; 78: 271-279.

LORITO, M.; HARMAN, G. E.; HAYES, C. K.; BROADWAY, R. M.; TRONSMO, A.; WOO, S. L.; DI PIETRO, A. (1993): Chinolotic enzymes produced by Trichoderma harzianum: Antifungal activity of purified endochitinase and chitobiosidase. Phytopathology 83 (3): 302-307.

LORITO, M.; HAYES, C.K.; DI PRIETO; A.; WOO, S.L.; HARMAN, G. E. (1994): Purification, characterization, and Synergistic Activity of a Glucan 1,3-ß-Glucosidase and an N- Acetyl-ß-Glucosaminidase from Trichoderma harzianum. Phytopathology 84 (4): 398-405.

LORITO, M; PETERBAUER, C.; HAVES, C. K.; HARMAN, G. E. (1994): Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination. Microbiology 140: 623-629.

LIESE, W.; DUJESIEFKEN, D. (1996): Wound reaction of trees. In: RAYCHAUDHURI, S. P.; MARAMOSCH, K (ED.). Forest Trees and Palms. – Disease and Control. Oxford & IBH Publishings Co. PVT. LTD, New Delhi, India. 20-42.

LÜDTKE, H. (1902): Die Platane, kein Straßenbaum für rauheres Klima. Die Gartenkunst 4: 72.

LUNDBORG, A.; UNESTAM, T. (1980): Antagonism against Fomes annosus. Comparision between different test methods in vitro and in vivo. Mycopathologia 70 (2): 107- 115.

MAIER, H.; DEUTSCHLÄNDER, T. (2010): Stadtklima im Klimawandel – Konsequenzen für die Stadtplanung In: DUJESIEFKEN, D. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2010, Haymarket Media, Braunschweig. 19-37.

154

LITERATURVERZEICHNIS

MARKOVICH, N. A.; KONONOVA, G. L. (2003): Lytic enzymes of Trichoderma and Their Role in Plant Defense from Fungal Diseases: A Review. Applied Biochemistry and Microbiology 39 (4): 341-351.

MATTHECK, C.; SCHWARZE, F. W. M. R. (1994): Die Holzstrahlen als getarnte I-Balken in einem mechanischen Ersatzmodell für Holz. All. Forst und Jagdzeitung 165: 197– 201.

MCTAVISH, C. K.; CATAL, M.; FULBRIGHT, D. W.; JAROSZ, A. M. (2018): Spruce Decline and Diaporthe: incidence, taxonomy, virulence and tree susceptibility in Michigan. Plant Disease 102 (11): 2330-2340.

METTENDORF, B. (2016): Eingeführte Baumarten als Alternativen zur Esche. AFZ/Wald 4: 50‐54.

METZLER, B. (1994): Die Luftversorgung des Hallimasch in nassem Fichtenholz. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., 46 (12): 292-294.

MORGAN-JONES, G. (1975): Notes on Coelomycetes. I. Ceratopycnis, Clypeopycnis, Macrodiplodiopsis, Mastigosporella, Paradiscula and Septopatella. Mycotaxon II 1: 167-183.

NALLI, R., 1981: Un cancro dei platano da Massaria platani Ces. nel Lazio.Ann. dell Istit. Speri. Patol. Veg. Roma 7: 27-37.

NIMMENICH, H. (2008): Unterschiede im Kronenschnitt der Platane in Europa und ihre möglichen Auswirkungen auf das Auftreten der Massaria-Krankheit. Bachelor- arbeit, HAWK Göttingen.

NIEMZ, P.; SONDEREGGER, W. (2017): Holzphysik. Physik des Holzes und der Holzwerkstoffe. Hanser Fachbuchverlag Leipzig, München.

NOBLES, M. K. (1958): Cultural characters as a guide to the taxonomy and phy1ogeny of the Polyporaceae. - Can. J. Bot. 36: 883-926.

NOBLES, M. K. (1965): Identification of Cultures of Wood-inhabiting Hyphomycetes. Can. J. Bot. 43: 1097-1139.

NOWAK, D. J.; HIRABAYASHI, S.; BODINE, A.; HOEHN, R. (2013): Modeled PM2.5 removal by trees in ten U.S. cities and associated health effects. Environmental Pollution 178: 395-402.

OBERDORFER, E. (1994): Pflanzensoziologische Exkursionsflora. 7. Auflage. Ulmer Verlag, Stuttgart.

OBST, J. R. (1982): Guaiacyl and Syringyl Lignin Composition in Hardwood Cell Components. Holzforschung 36 (3):143-152.

PECHMANN, H., V.; SCHAILE, O. (1950): Über die Änderung der dynamischen Festigkeit und der chemischen Zusammensetzung des Holzes durch den Angriff holzzerstörender Pilze. Forstwissenschaftliches Centralblatt. 69 (8): 441-466. 155

LITERATURVERZEICHNIS

PECHMANN, H., V. (1972): Das mikroskopische Bild einiger Holzfehler. Holz als Roh- und Werkstoff 30 (2): 62-66.

PETRAK, F. (1922): Mykologische Notizen. IV. Annales Mycologici. 20 (5-6): 300-345.

PETRINI, O. (1991): Fungal endophytes of tree leaves. In: ANDREWS, J.H.; HIRANO, S. S. (Hrsg). Microbial Ecology of Leaves. 179-197.

PRENCIPE, S.; NARI, L.; VITTONE, G.; SPADARO, G. (2017): First Report of Diaporthe eres Causing Stem Canker on Peach (Prunus persica) in Italy. Plant Disease 101 (6): 1052.

PREUSS, C. G. T. (1853): Übersicht untersuchter Pilze, besonders aus der Umgegend von Hoyerswerda. Linnaea 2: 723.

QUALHATO, T. F.; LOPES, F. A. C.; STEINDORFF, A. S.; BRANDAO, R. S.; JESUINO, R. S. A.; ULHOA, C. J. (2013): Mycoparasitism studies of Trichoderma species against three phytopathogenic fungi: evaluation of antagonism and hydrolytic enzyme production. Biotechnol. Lett. 35: 1461-1468.

RAMIN, S.; KEHR, R. (2008): Untersuchungen zur Sporenbelastung gesunder Platanenäste durch den Erreger der Massaria-Krankheit, Splanchnonema platani. In DUJESIEFKEN, D.; KOCKERBECK, P. (Hrsg.): Jahrbuch der Baumpflege 20008, Haymarket Media, Braunschweig. 232-237.

RAYNER, A. D. M.; BODDY, L. (1988): Fungal decomposition of wood: its biology and ecology. Wiley, Chichester.

RAYNER, A.D.M. (1993): New avenues for understanding processes of tree decay: Arboricultural Journal 17: 171-189.

REINARTZ, H.; SCHLAG, M. (1999): Schadwirkung und Kontrolle des Brandkrustenpilzes – Neue Landschaft 09/99.

RICHTLINIE ZUR ÜBERPRÜFUNG DER VERKEHRSSICHERHEIT VON BÄUMEN (2010): Baumkontrollrichtlinie. Forschungsgesellschaft Landschaftsentwicklung Land- schaftsbau e. V.

ROLOFF, A.; WEISGERBER, H.; LANG, J. U.; STIMM, B.; SCHÜTT, P. (19xx): Enzyklopädie der Holzgewächse: Handbuch und Atlas der Dendrologie. Weinheim: Wiley-VCH.

ROLOFF, A. (2013): Bäume in der Stadt. Ulmer Verlag, Stuttgart.

SACHSSE, H. (1961): Anteil und Verteilung von Richtgewebe im Holz der Rotbuche. Holz als Roh- und Werkstoff 19 (7): 253-259.

SACHSSE, H. (1965): Untersuchungen über die Eigenschaften und Funktionsweise des Zugholzes der Laubbäume. Schriftenreihe der. Forstl. Fakultät der Universität Göttingen und Mitteil. d. Niedersächsischen Forstl. Versuchsanstalt. 35: 110.

156

LITERATURVERZEICHNIS

SANDMERMANN, W.; ROTHKAMM, M. (1959): Über die Bestimmung der pH-Werte von Handelshölzern und deren Bedeutung für die Praxis. Holz als Roh- und Werkstoff 11: 433 – 440.

SANTAMOUR, F. S. JR.; MCARDLE A. J. (1986): Checklist of cultivated Platanus (Planetree). Journal of Arboriculture 12: 78-83.

SAVORY, J. G. (1954): Breakdown of timber by ascomycetes and fungi imperfecti. Ann. Appl. Biol. 41: 336-347.

SCHEIDING, W.; GRABES, P.; HAUSTEIN, T.; HAUSTEIN, V. H.; NIEKE, N.; URBAN, H.: WEIß, B. (2016): Holzschutz. Holzkunde –Pilze und Insekten- Konstruktive und chemische Maßnahmen – Technische Regeln – Praxiswissen. 2. Aktual. und erw. Aufl. München: Fachbuchverlag Leipzig Verlag 1-296.

SCHMIDT, O. (1994): Holz- und Baumpilze. Biologie, Schäden, Schutz, Nutzen. Springer Verlag Berlin.

SCHMITT, U.; LÜER, B.; DUJESIEFKEN, D.; KOCH, G. (2014): The Massaria disease of plane trees: Its wood decay mechanism. IAWA Journal 35 (4): 395-406.

SCHREIBER, J.; NIEMZ, P.; MANNES, D. (2007): Vergleichende Untersuchungen zu ausge- wählten Eigenschaften von Holzpartikelwerkstoffen bei unterschiedlicher Belastungsart. Holztechnologie 48 (1): 1-10.

SCHUBERT, M.(2006): In vitro und ad planta Studien zum Einsatz von Trichoderma-Arten für die Biologische Kontrolle Holz abbauender Pilze an Bäumen. Dissertation, Uni Freiburg.

SCHUBERT, M.; FINK, S.; SCHWARZE, F. W. M. R. (2008a): Evaluation of Trichoderma spp. as a biocontrol agent against wood decay fungi in urban trees. Biological Control 45: 111–123.

SCHUBERT, M.; FINK, S.; SCHWARZE, F. W. M. R. (2008b): In vitro screening of an antagonistic Trichoderma strain against wood decay fungi. PartI. Arboricultural Journal 31: 227-248.

SCHUMACHER, P.; GROSSER, D. (1995): Befall länger beregneten Fichtenstammholzes durch Hallimasch (Armillaria spp.) und sonstige Holzpilze. Holz als Roh- & Werkstoff 53: 137-145.

SCHÜTT, P.; LANG, U. M. (2002): Platanus racemosa NUTT., 1873. In: ROLOFF, A; WEISGERBER, H.; LANG, U. M.; STIMM, B. (Hrsg.). In Enzyklopädie der Holzgewächse: Handbuch und Atlas der Dendrologie. 30. Erg.Lfg. 12: 1-6.

SCHWARZE, F. W. M. R. (1995): Entwicklung und biomechanische Auswirkungen von holzzersetzenden Pilzen in lebenden Bäumen und in vitro. Dissertation, Uni Freiburg.

SCHWARZE, F. W. M. R. (2001): Development and prognosis of decay in the sapwood of living trees. Journal of Arboriculture 25 (4): 321-337. 157

LITERATURVERZEICHNIS

SCHWARZE, F. W. M. R. (2007): Wood decay under the microscope. Fungal Biology Reviews 1: 133-170.

SCHWARZE, F. W. M. R. (2008): Diagnosis and Prognosis of Wood Decay in Urban Trees. ENSPEC Pty Ltd. Australia.

SCHWARZE, F. W. M. R. (2018): Diagnose und Prognose der Fäuledynamik in Stadt- bäumen. MycoSolution AG, St. Gallen. ISBN 978-3-033-06671-7.

SCHWARZE, F. W. M. R.: LONSDALE, D.; FINK, S. (1995a). Soft rot and multiple T- branching by the basidiomycete Inonotus hispidus in ash and London plane. Mycol. Res. 99: 813–820.

SCHWARZE, F. W. M. R.: LONSDALE, D.; MATTHECK, C. (1995b): Detectability of wood decay caused by Ustulina deusta in comparison with other tree-decay fungi. Eur. J. For. Path. 25: 327-341.

SCHWARZE, F. W. M. R.; FINK, S. (1997): Reaction zone penetration and prolonged persistence of xylem rays in London plane wood degraded by the basidiomycete Inonotus hispidus. Mycol. Res. 101: 1201-1214.

SCHWARZE, F. W. M. R.; ENGELS, J. (1998): Cavity formation and the exposure of peculiar structures in the secondary wall (S2) of tracheids and fibres by wood degrading basidiomycetes. Holzforschung 52: 117–123.

SCHWARZE, F. W. M. R.; ENGELS, E.; MATTHECK, C. (1999): Holzzersetzende Pilze in Bäumen. Strategien der Holzzersetzung. 1. Auflage. Rombach Verlag, Freiburg.

SCHWARZE, F. W. M. R.; BAUM, S. (2000): Mechanisms of reaction zone penetration by decay fungi in wood of beech (Fagus sylvatica) New Phytol. 146: 129–140

SCHWARZE, F. W. M. R.; JAUSS, F.; SPENCER, C.; HALLAM, C.; SCHUBERT, M. (2012): Eva- lution of an antagonistic Trichoderma strain for reducing the rate of wood decompostion by the white rot fungus Phellinus noxius. Biological Control 61: 160-168.

SEIFERT, K. (1968): Zur Systematik der Holzfäulen, ihre chemischen und physikalischen Kennzeichen. Holz als Roh- und Werkstoff 26 (6): 208-215.

SELL, J. (1997) Eigenschaften und Kenngrößen von Holzarten. 4. Aufl. Zürich. Baufachverlag.

SHEAR, C. L.; DAVIDSON, R. W. (1936): The life histories of Botryosphaeria melanops and Massaria platani. Mycologia 28: 476-482.

SHIGO, A. L.; MARX, H. G. (1977): Compartmentalization of decay in Trees. U.S. D.A. For. Serv Agric. Bull. No 405.

SHOEMAKER, R. A.; LECLAIR, P. M. (1975): Type studies from the Wehmeyer Collection. Can. J. Bot., 53 (15): 1568-1598.

158

LITERATURVERZEICHNIS

SINCLAIR, W. A.; LYON, H. H.; JOHNSON, W. T. (1987): Diseases of Trees and Shrubs. Cornell Univiversity Press, 574.

SINCLAIR, W. A.; LYON, H. H. (2005): Diseases of Trees and Shrubs. 2. Aufl. Cornell Univiversity Press, 660 S.

SINGH, H.B.; SINGH; B.N.; SINGH, S.P.; SARMA, B.K. (2012): Exploring Different avenues of Trichoderma as a potent biofungicidal and plant growth promoting candidate-an over-view. Plant-Phatology 5: 315-426.

SOMMER, C. (2009): Infektionsversuche mit dem Erreger der Massaria-Krankheit Splanchnonema platani (Ces.) Barr. an drei Platanenarten. Bachelorarbeit, HAWK Göttingen.

SREBOTNIK, E.; MESSNER, K. (1994): A simple method that uses differential staining and light microscopy to assess the selectivity of wood delignification by white rot fungi. Applied and Environmental Microbiology 60 (4): 1383–1386.

STALPERS, J. A. (1978): Identification of wood inhabiting Aphyllophorales in pure culture. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Studies in Mycology 16: 1-248.

STOBBE, H.; DUJESIEFKEN, D. (2011): Können vorbeugende Schnittmaßnahmen in der Krone den Befall durch die Massaria-Krankheit vermindern? In: DUJESIEFKEN, D. (Hrsg): Jahrbuch der Baumpflege 2011, Haymarket Media, Braunschweig. 208- 214.

STOBBE, H.; DUJESIEFKEN, D. (2011): Einluss von Schnittmaßnahmen in der Krone auf die Massaria-Krankheit der Platane. In: DUJESIEFKEN, D. (Hrsg): Jahrbuch der Baum- pflege 2011, Haymarket Media, Braunschweig. 290-301.

SÜSS, H.; MÜLLER-STOLL, W. R. (1973): Zur Anatomie des Ast-, Stamm- und Wurzelholzes von Platanus x acerifolia (AIT.) WILLD. Österr. Bot. Z. 121: 227- 249.

SUTTON, B. C. (1980): The Coelomycetes. Fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and stromata. Commonwealth Mycol. Inst., Kew.

SVIHRA, P.; MCCAIN, A. H. (1992): Susceptibility of planetrees to anthracnose and powdery mildew in California. Journal of Arboriculture 18 (3): 161-163.

TAYLOR, J. B. (1974): Biological tests for identification of mycelial cultures of Basidio- mycetes. Ann Appl. Biol. 78: 113-123.

THOMIDIS, T.; MICHAILIDES, T. J. (2009): Studies on Diaporthe eres as a new pathogen of peach trees in Greece. Plant Dis. 93 (12): 1293-1297.

TREIBER, E. (1957): Die Chemie der Pflanzenzellwand. Springer Verlag Berlin – Göttingen – Heidelberg.

159

LITERATURVERZEICHNIS

UDAYANGA, D.; CASTLEBURY, L. A.; ROSSMAN, A. Y.; Chukeatirote, E.; Hyde, K. D. (2014): Insights into the genus Diaporthe: phylogenetic species delimitation in the D. eres species complex. Fungal diversity 67 (1): 203–229.

VAJNA, L. (2002): Diaporthe oncostoma causing stem canker of black locust in Hungary. New Disease report. Plant Pathology 51 (3): 393.

WAGENFÜHR, R. (1989): Anatomie des Holzes: unter besonderer Berücksichtigung der Holztechnik. 4. neubearb. Auflage. Fachbuchverlag Leipzig.

WAGENFÜHR, R. (2006): Holzatlas. 6. Auflage, Hanser Fachbuchverlag Leipzig, München.

WEBSTER, J. (1983): Pilze. Eine Einführung. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

WEGENER, C.; HENNIGER, H. (1987): Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten einer Pektatlyase aus Erwinia carotovora. Die Nahrung 31 (4): 297-303.

WHITE, T.; BRUNS, T.; LEE S. & TAYLOR, J. (1990): Ampilfication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: INNIS, M.; GELFAND, D.; SNINSKY, J.; WHITE, T.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications: 315-322.

WHITE, N. A.; BODDY, L. (1992): Extracellular enzyme localization during interspecific fungal interactions. FEMS Microbiology Letters 98: 75-80.

WIJAYAWARDENE, N. N.; CAMPORESI, E.; BHAT, D. J.; SONG Y.; THILINI CHETHANA, K. W.; CHUKEATIROTE, E.; WANG, Y.; HYDE, K. D. (2014): Macrodiplodiopsis in Lophiostomataceae, Pleosporales. Phytotaxa 176: 192–200.

WILLOUGHBY, I.; STOKES, V.; POOLE, J.; WHITE, J. E.; HODGE, S. J. (2007): The potential of 44 native and non‐native tree species for woodland creation on a range of contrasting sites in lowland Britain. Forestry. 80 (5): 531‐553.

ZTV-GROßBAUMVERPFLANZUNG (2005): Zusätzliche Technische Vertragsbedingungen und Richtlinien für das Verpflanzen von Großbäumen und Großsträuchern. FLL, Forschungsgesellschaft Landschaftsentwicklung Landschaftsbau e. V.

ZTV-BAUMPFLEGE (2017): Zusätzliche Technische Vertragsbedingungen und Richtlinien für Baumpflege. FLL, Forschungsgesellschaft Landschaftsentwicklung Land- schaftsbau e. V.

160

LITERATURVERZEICHNIS

Internetquellen

BEHÖRDE FÜR UMWELT UND ENERGIE HAMBURG (2016): Hamburgs Straßenbäume. http://www.hamburg.de/hamburgs-stadtbaeume/6125908/hamburgs- strassenbaeume-ein-privileg/ [Stand: 31.12.2017]

DEUTSCHER WETTERDIENST (2018a): Temperatur: Vieljährige Mittelwerte 1981-2010. https://www.dwd.de/DE/leistungen/klimadatendeutschland/mittelwerte/temp_8110 _fest_html.html?view=nasPublication [Stand: 01.06.2018]

DEUTSCHER WETTERDIENST (2018b): Niederschlag: Vieljährige Mittelwerte 1981-2010. https://www.dwd.de/DE/leistungen/klimadatendeutschland/mittelwerte/nieder_811 0_fest_html.html?view=nasPublication [Stand: 01.06.2018]

GELSENDIENSTE (2017): Bäume in Gelsenkirchen. https://www.gelsendienste.de/Baeume_und_Gruenflaechen/Unsere_Leistungen/Bae ume/Strassenbaeume.asp?highmain=2&highsub=2&highsubsub=1 [Stand: 31.12.2017]

LANDESAMT FÜR NATUR, UMWELT UND VERBRAUCHERSCHUTZ NORDRHEIN WESTPHALEN : Alleen in Nordrhein-Westphalen. Aus welchen Baumarten bestehen die Alleen? http://alleen.naturschutzinformationen-nrw.de/nav2/Auswertungen.aspx?P=3 [Stand: 31.12.2017]

SENATSVERWALTUNG FÜR UMWELT, VERKEHR UND KLIMASCHUTZ BERLIN (2017): Straßen- und Parkbäume - Übersichten der Bestandsdaten. Straßenbäume in Berlin. Bestand nach Hauptgattungen in den Berliner Bezirken. https://www.berlin.de/senuvk/umwelt/stadtgruen/stadtbaeume/de/daten_fakten/uebe rsichten/index.shtml [Stand: 31.12.2017]

161

LITERATURVERZEICHNIS

Betreute Abschlussarbeiten an der Professur für Forstbotanik in Zusammenhang mit der Massaria-Krankheit

DOHRMANN, S. (2018): Makro- und mikroskopische Nachweismethoden von Zugholz- strukturen an Laubgehölzen. Bachelorarbeit an der Professur für Forstbotanik, Uni Freiburg.

HARWARDT, L. (2014): Untersuchungen zum Befall und zur Fäuledynamik von Splanchnonema platani an Platanen. Bachelorarbeit an der Professur für Forstbotanik, Uni Freiburg.

HILSCHER, C. (2016): In vitro Untersuchungen zur Fäuledynamik von Splanchnonema platani. Masterarbeit an der Professur für Forstbotanik, Uni Freiburg.

KIMMIG, T. (2016): In vitro Untersuchungen zum Wachstums- und Infektionsablauf von Splanchnonema platani. Bachelorarbeit an der Professur für Forstbotanik, Uni Freiburg.

LÖW, C. (2015): Pilzanalysen an Platanenrinde im Zusammenhang mit der Massaria- Krankheit. Masterarbeit an der Professur für Forstbotanik, Uni Freiburg.

VOGEL, T. (2017): Auswirkungen einer Behandlung des Pflanzsubstrates mit Trichoderma harzianum auf das Wachstumsverhalten einiger Baumarten unter Berücksichtigung unterschiedlicher Stressoren. Masterarbeit an der Professur für Forstbotanik, Uni Freiburg.

162

ANHANG

8. Anhang

Abb. 8.1.1: 1) Lage Platanenstarkast (Ø 11,8 cm an der Astbasis, 70° Astabgangswinkel). 2) Querschnitt nach Auftragen der Phloroglucin-Salzsäure-Lösung. Intensivere purpur-rote Färbung, höherer Lignin-Anteil, hellere Bereiche erhöhte Cellulose-Anteile. A: Astbasis. B: Zunehmender Astverlauf ca. Astmitte mit exzentrischen Wuchs. C: Richtung Astende. 3+4) Mikroskopische

Gewebeschnitte gefärbt mit Astrablau-/Safranin-Lösung (x10), 3) Astoberseite mit Zugholzstrukturen; 4) Astunterseite Normalholz (x10).

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ANHANG

Abb. 8.2.1: Chromatogramm einer Sequenzierung mit hoher Signalintensität, gleichmäßig verlaufenden Peaks und geringem Hintergrund- rauschen. Sequenzausschnitt (599 Basenpaare) Isolat S. platani TBP2014.1.

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ANHANG

Abb.: 8.3.1: Kronenentwicklung und Blattmasse der Versuchsbäume über den gesamten Versuchszeitraum von 3 Jahren (2015-2017), „Bewässerter“ und „Unbewässerter“ Varianten.

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