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Das 3-Proteobakterium Alcaligenes Defragrans

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Das 3-Proteobakterium Alcaligenes Defragrans Der anaerobe Abbau von Monoterpenen durch das 3-Proteobakterium Alcaligenes defragrans DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaft - Dr. rer. nat. - dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen vorgelegt von Udo Heyen aus Aurich Oktober 1999 Die vorliegende Doktorarbeit wurde in der Zeit von November 1996 bis Mai 1999 am Max Planck-Institut für marine Mikrobiologie in Bremen angefertigt. 1. Gutachter: Prof. Dr. Friedrich Widdel 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Jens Harder Tag des Promotionskolloquiums: 13.12.1999 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen Zusammenfassung 1 Teil 1: Darstellung der Ergebnisse im Gesamtzusammenhang A Einleitung 1. Terpene und Terpenoide 4 1.1 Biosynthese und Strukturen 5 2. Monoterpene 7 2.1 Vorkommen, Strukturen und chemische Eigenschaften 7 2.2 Biosynthese 9 2.3 Physiologische und ökologische Bedeutung 9 3. Abbau biogener Monoterpene durch aerobe Mikroorganismen 12 3.1 Azyklische Monoterpene 12 3.2 Monozyklische Monoterpene 14 3.3 Bizyklische Monoterpene 15 4. Mikrobieller Abbau isoprenoider Naturstoffe unter anoxischen Bedingungen 17 5. Zielsetzung 19 B Ergebnisse und Diskussion 21 1. Beschreibung der vier monoterpenverwertenden, nitratreduzierenden Bakterien 21 2. Wachstumsversuche mit Alcaligenes defragrans 23 2.1 Bilanzierung des anaeroben Monoterpenabbaus 23 2.2 Versuche zur Erweiterung des Substratspektrums 24 2.3 Konkurrenzversuche mit verschiedenen Monoterpenen 25 2.4 Resistenz von Alcaligenes defragrans gegenüber Monoterpenen 28 2.5 Mass enanzucht von Alcaligenes defragrans im Fermenter 29 3. Metabolite des anaeroben Monoterpenstoffwechsels 30 3.1 Biotransformation von Isolimonen zu Isoterpinolen 30 3.2 Neutrale Metabolite des Abbaus bizyklischer Monoterpene 31 3.3 Isolierung und Identifizierung saurer Metabolite 34 4. Zellsuspensionsversuche mit Alcaligenes defragrans 35 5. Anaerobe Umsetzung von Monoterpenen in vitro 37 6. Ökologische Aspekte 38 6.1 Ätherische Öle als Wachstumssubstrat für Alcaligenes defragrans 39 6.2 Ätherische Öle als Wachstumssubstrat für Anreichemngen 40 C Literaturverzeichnis 42 Teil II: Publikationen A Publikationsilste mit Erläuterungen 61 B Publikationen 1 Alcaligenes defragrans sp. nov., description offour strains isolated on alkenoic monoterpenes ((+)-menthene, a-pinene, 2-carene, and a-phellandrene) and nitrate 63 2 Cometabolic isoterpinolene formation from isolimonene by denitrifying Alcaligenes defragrans 83 3 Geranic acid formation, an initial reaction of anaerobic monoterpene metabolism in Alcaligenes defragrans 95 4 Monoterpene tolerance of denitrifyingAlcaligenes defragrans 110 5 Denitrification on essential oils 118 Abkürzungen Abb. Abbildung Ade441 Oligonukleotidsonde, spezifisch für Alcaligenes defragrans AT1458 Oligonukleotidsonde, spezifisch für Bakterien der Genera Azoarcus und Thauera sowie für Alcaligenes defragrans ATP Adenosintriphosphat BET42a Oligonukleotidsonde, spezifisch für Bakterien der Beta Untergruppe der Proteobakterien C Kohlenstoff Grad Celsius CoA Coenzym A d Tag Da Dalton DAPI 4,6-Diamidino-2-phenylindol DMADP Dimethylallydiphosphat DNS, DNA Desoxyribonukleinsäure DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ECL Equivalent cham Iength Eco440, 1455, 1464 Oligonukleotidsonden, spezifisch für Escherichia coli E DTA Ethylendiamintetraessigsäure EI Elektronenionisierung et al. et alten (und andere) EMBL European Molecular Biology Laboratory EUB 338 Oligonukleotidsonde, spezifisch für Eubakterien eV Elektronenvolt F AD Flavinadenindinukleotid FAME Fettsäuremethylester FID Flammenionisationsdetektor FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung g Gramm g Erdbeschleunigung G+C Guanin und Cytosin GAM42a Oligonukleotidsonde, spezifisch flur Bakterien der Gamma Untergruppe der Proteobakterien GC Gaschromatographie GC-M S Gaschromatographie-Massenspektroskopie GDP Geranyldiphosphat h Stunde HEPES N-(2-Hydroxyethyl-)piperazin-N ‘-2-ethansulfonsäure HMN 2,2,4,4,6,8,8-Heptamethylnonan (RP)-HPLC (Reversed-Phase)-High Performance Liquid Chromatography IDP Isopentenyldiphosphat k Kilo Liter log P Dekadischer Logarithmus des Verteilungskoeffizienten im Zweiphasensystem n-Octanol/Wasser Mikro m Milli M Molar oder Mega min Minute mol Mol MPN Most probable number n Nano NAD(P) H Reduziertes Nikotinamid-adenin-dinukleotid(-phosphat) OD Optische Dichte p Piko Pa Pascal % Prozent %o Promille PCR Polymerase cham reaction pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PVMS Polyvinylmethylsilikon RT Retentionsindex rDNS, rDNA DNS-Bereiche, die flur die ribosomale Ribonucleinsäure kodieren rRNS, rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute s Sekunde s(p)p. Spezies Tab. Tabelle T MP B 1 ‚2,3 ‚4-Tetramethoxy-5-(2-propenyl)-benzol UV Ultraviolett vol (v) Volumen wt (w) Gewicht Zusammenfassung 1 Die zuvor unter nitratreduzierenden Bedingungen mit den zyklischen, ungesättigten Monoterpenkohlenwasserstoffen p-Menth- 1 -en, a-Pinen, 2-Caren und a -Phellandren isolierten Bakterienstämme 5lMen, 54Pin, 62Car und 65Phen waren einander physiologisch und phylogenetisch sehr ähnlich. Alle Isolate waren bewegliche, mesophile, Gram-negative Stäbchen mit einem strikt respiratorischen Metabolismus. Neben Nitrat dienten auch reduziertere Stickstoffverbindungen (Nitrit, Distickstoffoxid) sowie Sauerstoff als Elektronen akzeptoren. In quantitativen Wachstumsansätzen wurde eine vollständige Oxidation der Monoterpene zu CO2 nachgewiesen. Alle Stämme metabolisierten neben den Monoterpenen auch einige Amino- und Fettsäuren. Kohlenhydrate, aromatische Verbindungen und Alkane wurden nicht verwertet. Auf der Grundlage der Bakterienzellfettsäuren und den Unterschieden in den 16S rDNS-Sequenzen wurden die vier monoterpenverwertenden Bakterienstämme als eine neue Spezies, Alcaligenes defragrans, innerhalb der Gattung Alcaligenes mit Stamm 54Pin als Typstamm beschrieben. 2 Alle vier Stämme waren in der Lage, unter anoxischen Bedingungen mit verschiedenen aliphatischen, mono- und bizyklischen Monoterpenen als alleiniger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Aufgrund der übereinstimmenden Substratmuster scheint ein gemeinsamer Abbau- weg flur die Monoterpenkohlenwasserstoffe wahrscheinlich. Die beobachtete Bildung von monozyklischen p-Menthadienen während des Wachstum mit bizyklischen Monoterpenen deutet auf eine anfängliche Umwandlung der bizyklischen Strukturen zu monozyklischen Verbindungen hin. Diese Hypothese wird unterstützt durch den gleichzeitigen Abbau von mono- und bizyklischen Strukturen innerhalb definierter Terpengemische, wobei monozyklische Diene leicht bevorzugt wurden. In kometabolischen Studien konnte eine Isomensierung von Isolimonen zu Isoterpinolen nachgewiesen verden. Beide Verbindungen dienten nicht als Wachstumssubstrate. Diese Beobachtung belegt, daß A. defragrans zu Umlagerungen innerhalb des Kohlenstoffgerüstes der Monoterpene befähigt ist. In Wachstumsuntersuchungen mit unterschiedlichen Strukturisomeren einer Verbindung wurden 2-hybridisierten, methylsubstituierten Cl -Kohlenstoffatom selektiv die Isomere mit einem sp Cl-sp3-hybridisierten Isomere wurden nicht verwertet. Für den abgebaut. Die entsprechenden sp2-hybridisierte vollständigen Abbau der Monoterpene durch A. defragrans ist somit das Cl -Kohlenstoffatom eine essentielle Voraussetzung. Eine Hydratisierung der Alkene zu den entsprechenden Alkoholen als initialer Schritt des anaeroben Monoterpenabbaus erscheint anhand von früheren Untersuchungen als unwahrscheinlich. 3 Die azyklische Geraniumsäure wurde als erstes potentielles Aktivierungsprodukt aus Zellen vom Stamm 65Phen nach anaerobem Wachstum mit a-Phellandren isoliert. In anaeroben Studien mit dichten Zellsuspensionen konnte eine eindeutige Umsetzung von a-Phellandren, a-Pinen, Limonen und f3-Myrcen zu Geraniumsäure nachgewiesen werden. Dabei wurde mit der azyklischen Verbindung -Myrcen die höchste Transformationsrate in den Suspensionen erreicht. Unter C-limitierten Bedingungen und in Gegenwart von Nitrat erfolgte ein Abbau der gebildeten Geraniumsäure innerhalb der Zellsuspensionen. Mit der Umsetzung von 3-Myrcen zu Geraniumsäure in zelifreien Extrakten konnte der erste in vitro Enzymtest für die anaerobe Alkentransformation entwickelt und etabliert werden. Dieser Enyzmtest ermöglicht eine weitere Aufklärung der Bedeutung der Reaktion für den anaeroben Monoterpenabbau. 4 Ätherische Öle als natürlich vorkommende Monoterpengemische wurden sowohl von A. defragrans als auch von denitrifizierenden Anreicherungskulturen als Kohlenstoffquellen verwertet. In Gegenwart des reinen Öls führten nur die beiden hauptsächlich aus Monoterpen kohlenwasserstoffen bestehenden Öle, Zitronen- und Kiefernnadelöl, zu Wachstum und vollständiger Nitratreduktion, wohingegen Petersiliensamen-, Campher-, Salbei-, Fenchel- und Minzöl nur verwertet wurden, wenn sie in einer HMN-Phase verdünnt vorlagen. Thymianöl ffihrte zu keiner Nitratreduktion. Verbindungen, die in den verschiedenen Ölen durch die angereicherten Mikroorganismen metabolisiert wurden, waren Wachstumssubstrate der bisher auf Monoterpenen isolierten Bakterienstämmen (Alcaligenes defragrans, Thauera terpenica und Thauera linaloolentis) sowie Bomylacetat, a-, 3-Thujon, Campher, Borneol und aromatische Methoxypropenylbenzo le. Eine molekularökologische Analyse der Bakterien- populationen in den Anreicherungskulturen ergab, daß sie nicht von den bisher auf 2 Monoterpenen isolierten Bakterienstämmen dominiert wurden, was ein Anzeichen flur die weite Verbreitung der Fähigkeit zur anaeroben Monoterpenoxidation in der Natur ist. 5 Die Alcaligenes defragrans
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