Der anaerobe Abbau von Monoterpenen durch das 3-Proteobakterium Alcaligenes defragrans
DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaft
- Dr. rer. nat. -
dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen vorgelegt von
Udo Heyen aus Aurich
Oktober 1999 Die Planck-Institut
2.
Tag
1.
vorliegende
Gutachter: Gutachter:
des
Promotionskolloquiums:
für
Doktorarbeit
Prof.
Priv.-Doz.
marine
Dr.
Mikrobiologie
Friedrich
Dr.
wurde
Jens
13.12.1999
Widdel
in
Harder
der
in
Bremen
Zeit
von
angefertigt.
November
1996
bis
Mai
1999
am
Max Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
Zusammenfassung 1
Teil 1: Darstellung der Ergebnisse im Gesamtzusammenhang
A Einleitung
1. Terpene und Terpenoide 4
1.1 Biosynthese und Strukturen 5
2. Monoterpene 7
2.1 Vorkommen, Strukturen und chemische Eigenschaften 7
2.2 Biosynthese 9
2.3 Physiologische und ökologische Bedeutung 9
3. Abbau biogener Monoterpene durch aerobe Mikroorganismen 12
3.1 Azyklische Monoterpene 12
3.2 Monozyklische Monoterpene 14
3.3 Bizyklische Monoterpene 15
4. Mikrobieller Abbau isoprenoider Naturstoffe unter anoxischen
Bedingungen 17
5. Zielsetzung 19
B Ergebnisse und Diskussion 21
1. Beschreibung der vier monoterpenverwertenden,
nitratreduzierenden Bakterien 21
2. Wachstumsversuche mit Alcaligenes defragrans 23
2.1 Bilanzierung des anaeroben Monoterpenabbaus 23 2.2 Versuche zur Erweiterung des Substratspektrums 24 Teil
II:
C
A B
3.
4.
5. 6.
Literaturverzeichnis
Publikationen
Publikationsilste Publikationen
1
2
2.3
2.4
2.5
3.1 Metabolite 3.2 3.3
Zellsuspensionsversuche
Anaerobe
Ökologische 6.1
6.2
Alcaligenes
2-carene, isolated
Cometabolic
denitrifying
Konkurrenzversuche Resistenz Monoterpenen Mass
Neutrale Biotransformation
Isolierung
Alcaligenes
Ätherische
Ätherische
on
enanzucht
Umsetzung
and
des
alkenoic
defragrans
Aspekte
Alcaligenes
mit
Metabolite
isoterpinolene
a-phellandrene)
von
und
anaeroben
Öle
Öle
defragrans
Erläuterungen
Alcaligenes
Identifizierung
als
als
von
monoterpenes
von
von
Wachstumssubstrat
Wachstumssubstrat
sp.
Alcaligenes
defragrans
mit
des
mit
Monoterpenstoffwechsels
Monoterpenen
Isolimonen
nov.,
formation
Alcaligenes
Abbaus
verschiedenen
defragrans
and
description
saurer
nitrate
((+)-menthene,
defragrans
bizyklischer
from
zu
defragrans
Metabolite
in
gegenüber Isoterpinolen
Monoterpenen
für
für
vitro
isolimonene
offour
Anreichemngen
im
Monoterpene
a-pinene,
Fermenter
strains
by
25
28 29
30
30
31
34
35
37
38
39
40
42
61
63
83 3 Geranic acid formation, an initial reaction of anaerobic
monoterpene metabolism in Alcaligenes defragrans 95
4 Monoterpene tolerance of denitrifyingAlcaligenes defragrans 110
5 Denitrification on essential oils 118 Abkürzungen
Abb. AT1458 Ade441
ATP BET42a
C
CoA d
Da DAPI
DMADP DNS,
DSMZ
ECL
Eco440, E EI et EMBL
EUB eV F
FAME FID
DTA
AD
al.
338
DNA
1455,
1464
Azoarcus Abbildung Oligonukleotidsonde, Oligonukleotidsonde,
Adenosintriphosphat Oligonukleotidsonde, Untergruppe
Grad Kohlenstoff
Coenzym Tag
Dalton 4,6-Diamidino-2-phenylindol
Desoxyribonukleinsäure Dimethylallydiphosphat
Deutsche GmbH Equivalent Oligonukleotidsonden,
Ethylendiamintetraessigsäure Elektronenionisierung et European
Oligonukleotidsonde,
Elektronenvolt Flavinadenindinukleotid
Fettsäuremethylester Flammenionisationsdetektor
alten
Celsius
(und
und
A
Sammlung
Molecular
cham
der
Thauera andere)
Proteobakterien
Iength
von
spezifisch spezifisch
spezifisch
Biology
spezifisch
sowie
spezifisch
Mikroorganismen
für
Laboratory
für
für
für
Alcaligenes
für
für
Alcaligenes
Bakterien
Bakterien
Eubakterien
Escherichia
und
defragrans
der
der
defragrans
Zellkulturen
Genera
Beta
coli FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung
g Gramm g Erdbeschleunigung G+C Guanin und Cytosin
GAM42a Oligonukleotidsonde, spezifisch flurBakterien der Gamma Untergruppe der Proteobakterien
GC Gaschromatographie
GC-M S Gaschromatographie-Massenspektroskopie GDP Geranyldiphosphat
h Stunde
HEPES N-(2-Hydroxyethyl-)piperazin-N ‘-2-ethansulfonsäure HMN 2,2,4,4,6,8,8-Heptamethylnonan (RP)-HPLC (Reversed-Phase)-High Performance Liquid Chromatography
IDP Isopentenyldiphosphat
k Kilo Liter
log P Dekadischer Logarithmus des Verteilungskoeffizienten im Zweiphasensystem n-Octanol/Wasser Mikro
m Milli
M Molar oder Mega
min Minute
mol Mol MPN Most probable number
n Nano
NAD(P) H Reduziertes Nikotinamid-adenin-dinukleotid(-phosphat) OD Optische Dichte
p Piko
Pa Pascal
% Prozent %o Promille
PCR Polymerase cham reaction pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PVMS Polyvinylmethylsilikon
RT Retentionsindex rDNS, rDNA DNS-Bereiche, die flurdie ribosomale Ribonucleinsäure kodieren
rRNS, rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure
rpm Umdrehungen pro Minute
s Sekunde s(p)p. Spezies
Tab. Tabelle
TMP B 1‚2,3‚4-Tetramethoxy-5-(2-propenyl)-benzol
UV Ultraviolett
vol (v) Volumen
wt (w) Gewicht Zusammenfassung
1 Die zuvor unter nitratreduzierenden Bedingungen mit den zyklischen, ungesättigten
Monoterpenkohlenwasserstoffen p-Menth- 1-en, a-Pinen, 2-Caren und a -Phellandren
isolierten Bakterienstämme 5lMen, 54Pin, 62Car und 65Phen waren einander physiologisch
und phylogenetisch sehr ähnlich. Alle Isolate waren bewegliche, mesophile, Gram-negative
Stäbchen mit einem strikt respiratorischen Metabolismus. Neben Nitrat dienten auch
reduziertere Stickstoffverbindungen(Nitrit, Distickstoffoxid) sowie Sauerstoff als Elektronen
akzeptoren. In quantitativen Wachstumsansätzen wurde eine vollständige Oxidation der Monoterpene zu 2CO nachgewiesen. Alle Stämme metabolisierten neben den Monoterpenen auch einige Amino- und Fettsäuren. Kohlenhydrate, aromatische Verbindungenund Alkane
wurden nicht verwertet. Auf der Grundlage der Bakterienzellfettsäuren und den Unterschieden
in den 16S rDNS-Sequenzen wurden die vier monoterpenverwertenden Bakterienstämme als
eine neue Spezies, Alcaligenes defragrans, innerhalb der Gattung Alcaligenesmit Stamm 54Pin
als Typstamm beschrieben.
2 Alle vier Stämme waren in der Lage, unter anoxischen Bedingungenmit verschiedenen
aliphatischen, mono- und bizyklischen Monoterpenen als alleiniger Kohlenstoffquelle zu
wachsen. Aufgrund der übereinstimmenden Substratmuster scheint ein gemeinsamerAbbau-
weg flur die Monoterpenkohlenwasserstoffe wahrscheinlich. Die beobachtete Bildung von
monozyklischen p-Menthadienen während des Wachstum mit bizyklischen Monoterpenen
deutet auf eine anfängliche Umwandlung der bizyklischen Strukturen zu monozyklischen
Verbindungen hin. Diese Hypothese wird unterstützt durch den gleichzeitigenAbbau von
mono- und bizyklischen Strukturen innerhalb definierter Terpengemische, wobei monozyklische Diene leicht bevorzugt wurden. In kometabolischen Studien konnte eine
Isomensierung von Isolimonen zu Isoterpinolen nachgewiesen verden. Beide Verbindungen
dienten nicht als Wachstumssubstrate. Diese Beobachtung belegt, daß A. defragrans zu
Umlagerungen innerhalb des Kohlenstoffgerüstes der Monoterpene befähigt ist. In Wachstumsuntersuchungen mit unterschiedlichen Strukturisomeren einer Verbindung wurden selektiv die Isomere mit einem sp2-hybridisierten, methylsubstituierten Cl -Kohlenstoffatom vollständigen abgebaut.
Cl entsprechenden anhand 3
Zellen
anaeroben a-Phellandren, Dabei den
erfolgte
Umsetzung
Enzymtest Enyzmtest Monoterpenabbau.
A. 4
verwertet.
kohlenwasserstoffen vollständiger
Minzöl
angereicherten ffihrte
auf und aromatische populationen
-Kohlenstoffatom
defragrans
Suspensionen
Monoterpenen
Thauera
wurde
Die
von
Ätherische vom
zu
ein
nur
Die
Studien
In
azyklische
keiner früheren
ermöglicht
von
für
Abbau
verwertet
Abbau mit entsprechenden
Stamm Nitratreduktion,
Gegenwart Methoxypropenylbenzo
Mikroorganismen
als a-Pinen,
in
Alkoholen
linaloolentis) die 3-Myrcen
der
Nitratreduktion.
Öle erreicht.
auch
den
mit
der
Untersuchungen
anaerobe
isolierten
eine
der
azyklischen
65Phen
bestehenden
Geraniumsäure
eine
wurden,
als
gebildeten
Anreicherungskulturen dichten
von
Limonen des Monoterpene
essentielle
natürlich
weitere
zu
als
Unter
reinen
denitrifizierenden Cl-sp3-hybridisierten
Alkentransformation
Geraniumsäure wohingegen
sowie
Bakterienstämmen
nach
initialer
wenn
Zellsuspensionen
metabolisiert
Verbindung
und
C-limitierten
Aufklärung
Geraniumsäure
Öls
Öle,
Verbindungen,
vorkommende
Voraussetzung.
als
anaerobem
Bomylacetat, wurde le.
sie
f3-Myrcen
durch
führten
Schritt
unwahrscheinlich.
Zitronen-
in
Eine
Petersiliensamen-,
einer
als
A.
in
-Myrcen
der
2 wurden,
molekularökologische
nur
Anreicherungskulturen
des
ergab,
erstes Bedingungen
zelifreien
Wachstum defragrans
HMN-Phase
(Alcaligenes
Bedeutung
zu
Monoterpengemische
innerhalb die
die
Isomere
konnte
entwickelt
und anaeroben
Eine
a-,
Geraniumsäure
beiden
potentielles
in
daß
waren
Kiefernnadelöl,
die
Hydratisierung
3-Thujon,
den Extrakten
wurden eine
ist sie
mit
höchste
Campher-, der
hauptsächlich
der
und
Wachstumssubstrate
defragrans,
verschiedenen Monoterpenabbaus
verdünnt und
somit
eindeutige
nicht
Reaktion Zellsuspensionen.
a-Phellandren
in
Aktivierungsprodukt
nicht
etabliert
konnte
Campher,
Analyse
Transformationsrate
Gegenwart
nachgewiesen
als
das
von
Salbei-,
vorlagen.
wurden
der
zu
verwertet.
Kohlenstoffquellen
für
Thauera
sp2-hybridisierte
aus
der
Umsetzung
Alkene
werden.
Wachstum
den
Ölen
den
der
Monoterpen
erste
Borneol
Fenchel-
sowohl
isoliert.
von
Thymianöl
bisher
anaeroben
erscheint Bakterien-
der
durch
Für
Mit
terpenica
werden.
zu
in
Dieser
Nitrat
bisher
vitro
den
den
von
aus
von
und
und
der
und
In
die
auf
in Monoterpenen isolierten Bakterienstämmen dominiert wurden, was ein Anzeichen flur die weite Verbreitungder Fähigkeit zur anaerobenMonoterpenoxidation in der Natur ist.
5 Die Alcaligenes defragrans Stämme wuchsen in Anwesenheit einer reinen
Monoterpenphase, z.B. 30 % (vollvol) Limonen. Diese beobachtete Toleranz ist das erste
Beispiel flur ein anaerobes Bakterium mit der Fähigkeit, in Gegenwart von hohen
Konzentrationen an wasserlöslichen Kohlenwasserstoffen zu wachsen. Molekularökologische Populationsanalysen von denitrifzierenden Anreicherungskulturen, die mit verschiedenen Monoterpenen und ohne Zusatz einer HMN-Trägerphase gewonnen wurden, zeigten eine selektive Anreicherungvon Aicaligenes defragrans-verwandten Bakterien.
3 Teil
A
1. flüchtigen Schon (quinta
zusammengesetzt erhielten,
aus Jahrhundert ‘essential Öle,
natürliche Terpene
700
Oligomer
Ruzicka gemeinsame
1991). Entsprechend 1887 deren
erweiterten
üblicherweise Ketone,
komplizierten
dem
von
verschiedene
1:
die
Einleitung
Terpene
die
Struktur Otto
essentia
bezeichnet Harz dessen
(1953)
oils‘
Aldehyde werden Inhaltsstoffen
‘Isopren-Regel‘ Kohlenwasserstoffe
des
Alchimisten
gelang
Begriff
Zwischenstufe Wallach
Darstellung
zusammengefaßt
von
wird
Strukturen
C5-Kohlenwasserstoffs
Verwendung
mit
und
die
sich
oder
seien. Terpene auch
Pistacia
die
wurden.
Ursache
heute
und
Terpenoide
Terpenoide
Trivialnamen
beobachtete,
durch
Isolierung
äther),
heute
von
Die
des
Ester
wenig
vor,
der
isoliert
terebinthus
Kräutern
Öle,
bei
In schon
dieser
die
Mittelalters
noch
der
aus der
Begriff
nach
(Loomis
den
erfaßt
praktikabel
der
oder die
der Vervielfachung
und
Zusammensetzung
Ergebnisse
daß
welchem
unter im
strukturellen
folgenden
belegt,
Biosynthese
der
sie
wesentlichen
und
alten
‘Terpen‘
charakterisiert
Isoprenoide
(Terpentin-Pistazie),
(Hoffmann
einige
Isopren
und
durch
viele
dem
Gewürzen.
widmeten
ist. Ägyptern
Croteau
da
nach
Terpene Jahrzehnten
aus
Sammelbegriff 4 Extraktion
für
aufgefaßt
Ähnlichkeit:
die
von
aller
ätherischen
im
Inhaltsstoffe
ihrer
et
werden
eine
1980).
(Erman
C10H16,
systematische
ihre
Sie
berichtet
Isopren-Einheiten
Terpene
Gesamtzusammenhang al.
periodisch
Gruppe Ansicht
suchten
mit
wurden
1982).
werden
besondere
Terpentinöl,
war
auch
‘ätherische -
1985;
die
Alkohol
Ölen
das
wurde
(Loomis
des
eines
aufgrund
nach
von
Die
aufgebaut
die die
in
‘aktive
können.
Gershenzon
isolierte
Terpentinöls.
mühevoller Nomenklatur
Aufmerksamkeit
der abgeleiteten
(Erman
aus
Naturstoffen
himmlischen
dem Verbindungen
ursprünglich
Öle‘
und
ergibt.
ersten
Isopren‘ ihrer
Pflanzengeweben
fünften
Später sind
Naturstoffe
Croteau
oder
1985).
Herkunft
und
Arbeit
ätherischen
Unter
und
Es
Alkohole,
englisch: -
Element
erkannte
bei
benutzt, Croteau Körper
isoliert als
Im
werden
waren
schlug
1980).
über
den
dem
eine
19.
den
als
als [
Zur leichteren Differenzierung werden in dieser Arbeit die Begriffe ‘Terpen‘ als
Synonym für reine Kohlenwasserstoffe und ‘Terpenoid‘ als Synonym für sauerstoffhaltige Derivate der Terpene verwendet.
1.1 Biosynthese und Strukturen
Terpene und Terpenoide werden in großer struktureller Vielfalt hauptsächlich von Pflanzen gebildet, werden aber in allen Organismen gefunden. Sie sind die größte Gruppe natürlich vorkommender Verbindungen; mehr als 23 000 individueller Isoprenoidverbindungen sind
bereits beschrieben (Sacchetti und Poulter 1997). Einige besitzen essentielle Funktionen im
Grundstoffwechsel, z.B. Gibberelline und Abscisinsäure (Pflanzenhormone), Sterole und
Hopane (Strukturelemente der Biomembranen), Carotinoide und Phytol-Seitenketten des
Chlorophylls (photosynthetische Pigmente), wie auch die Polyprenylgruppen der Elektronen-
übertragenden Chinone (McGarvey und Croteau 1995). Die Mehrzahl der produzierten
Verbindungen sind nicht am Primärstoffwechsel beteiligt und werden daher als sekundäre Stoffwechselprodukte klassifiziert.
Lange Zeit ging man davon aus, daß alle Organismen Isoprenoide über einen
einheitlichen Weg synthetisieren. Dieser ‘klassische‘ Biosyntheseweg verläuft über die Mevalonsäure, eine 6C-Säure, wobei zuerst 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA durch Kondensation von drei Molekülen Acetyl-Coenzym A gebildet wird (Acetat-Mevalonat
Weg). Unter Verbrauch von ATP und anschließender Decarboxylierung wird die Mevalonsäure zu Isopentenyldiphosphat (IDP) umgesetzt, der universalen C-Vorstufe für die Isoprenoid 5 gezeigt, daß biosynthese in allen lebenden Organismen. Neuere Untersuchungen haben
Eubakterien (Rohmer 1993), Grünalgen (Schwender et al. 1996) und auch höhere Pflanzen
(Lichtenthaler et al. 1997a; Zeidler et al. 1997) einen zweiten Isopentenyldiphosphat Syntheseweg besitzen. Dieser alternative Weg verläuft über die Thiaminpyrophosphat
abhängige Kondensation einer C-,-Einheit aus Pyruvat an die Aldehydgruppe von Glyceraldehyd-3-phosphat (Rohmer et al. 1996). Als erstes C-Intermediat wurde l-Desoxyxylulose-5-phosphat identifiziert (Arigoni et al. 1997; Schwender5 et al. 1997).
5 Über 2-Methylerythritol-4-phosphat,
et
Streptomyces -
Desoxyxylulose-Weg,
Prokaryoten,
Dimethylallyldiphosphat Terpenoide aktive Kondensation
Molekül
Schwanz-Kondensation Geranylgeranyldiphosphat Biosynthese
intramolekularen Croteau Cyclasen,
(Sacchettini Hemiterpene
(C25), ausgesprochene nachfolgende und
al.
in
molekularem
1998).
den
Im
das
Triterpene
Isopren,
anfügen.
1997).
wobei
Verlauf
Weitere
werden
Plastiden
und hypothetische
zu in
aerioiivfer,
(C5),
Transformationen,
von dem
zyklischen
Katalysiert
Mannigfaltigkeit
wobei
Terpenoide
die
Sauerstoff
Poulter Reaktionen
(C30),
Monoterpene
der
die
Studien
durch
IDP
Röntgenstruktur
im
erfolgt
Existenz
aus
weiteren
(DMADP) Cytosol
DMADP
Tetraterpene
ein
1997).
und
zwei Prenyltransferasen
Verbindungen
(C,0).
zeigten,
als
werden
mit Zwischenprodukt
Gram-positives
der
Cosubstrat
das die
beider
Molekülen
DMADP
z.B. 30
(C10),
über Entsprechend
Biosynthese
der Variationen
entsprechenden
anschließend
oder
daß
als
Biosynthese
isomerisiert.
diese
durch
einiger
Synthesewege
gesamten
den
(C40)
Sesquiterpene
höhere
mehr
‘Starter‘-Molekül
ergeben
(Karp
Umlagerungen
Farnesyldiphosphat
entsteht
Mevalonat-Weg
Hydroxylierung
Terpenoidsynthasen
6
Kohlenstoffatomen und Bodenbakterium,
gebildet,
des
wird Pflanzen
weiter der
und
2-Methylerythrose-4-phosphat
Beide sich
Stoffgruppe
isoprenoider
Polyterpene
Diphosphat-Vorstufen
Kohlenstoffgerüstes
nachgewiesen
Anzahl
Croteau
Geranyldiphosphat
Isopentenyldiphosphat
aus
(C15),
zu
Verbindungen
die
über
durch
den
IDP
dient.
weitere
(Lichtenthaler
mit
Diterpene
der
1988).
beide
räumlichen
erklärt
umgesetzt
ist
(C15)
spezifische
Cytochrom-P45
(>C40)
Verbindungen
entstehen
Isopren-Einheiten
inzwischen
wurde
der Durch
Möglichkeiten
IDP-Einheiten
bzw.
bilden
sich
erste
(C20),
unterschieden.
(Seto
bei
Anordnungen
wird
(GDP).
et zwei
(McCaskill
durch
Kopf-Schwanz-
Synthasen
durch
das
Vertreter
zunächst
der al.
aufgeklärt
Sesterterpene
et
(Takahashi
0-Enzymen
über
Molekülen
al.
biologisch
Schwanz-
1997a,b).
verfügen
entsteht
weiteren
Höhere
weitere,
1996).
an
werden
den
und
und der
und
das
Die
zu
ist 2. Monoterpene
2.1 Vorkommen, Strukturen und chemische Eigenschaften
Monoterpene und Monoterpenoide werden von Pflanzen als sekundäre Stoffwechselprodukte, oft in hochspezialisierten Sekretionsgeweben, synthetisiert. Sie bilden die größte Gruppe natürlich vorkommender Alkene und sind die geruchsintensiven Hauptkomponenten der
ätherischen Öle, die durch Wasserdampfdestillation oder Extraktion aus pflanzlichen
Materialien gewonnen werden. Eine Vielzahl dieser Öle und deren Terpen-Komponenten werden wirtschaftlich genutzt als Duftstoffe und Aromen sowie als pharmazeutische
Produkte, letzteres bedingt durch die antibakteriellen und fungiziden Eigenschaften einigerÖle
(Janssen et al. 1987;Billingund Sherman 1988; Huhn et al. 1998). Die Kohlenstoffskelette der Monoterpene besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher
Strukturen, die azykhisch, monozyklisch oder bizyklisch aufgebaut sein können. Bei den bizyklischen Verbindungen können 63-,C-C -64C-C und -C-Ringsysteme unterschieden werden. Innerhalb der drei Gruppen der Monoterpene kommen65C weitere Strukturisomere vor, die sich durch die Position von Doppelbindungen unterscheiden (Abb. 1). Die Mehrzahl der natürlich vorkommenden Verbindungen sind ungesättigte Kohlenwasserstoffe, aber auch die oxygenierten Verbindungensind in der Natur zu finden (Erman 1985).
Die Monoterpene besitzen eine geringe Wasserlöshichkeit, wobei eine deutliche
Zunahme von den Terpenkohlenwasserstoffen (ca. 50 iM) zu den oxyfunktionalisierten
Terpenen (bis zu 20 mM) festzustellen ist (Weidenhamer et al. 1993). Neben der geringen
Wasserlöslichkeit ist die Flüchtigkeit eine weitere charakteristische Eigenschaft. Terpenkohlen wasserstoffe weisen Dampfdrücke von 0,2-0,5 kPa (25° C) auf, während die Dampfdrücke der
Monoterpenalkohole nur 1-5 % der Dampfdrücke der Kohlenwasserstoffe betragen
(Fichan et al. 1999).
7 azyklisch monozyklisch Abb. bizyklisch 1. Strukturen
Grundgerüste 2,6-Dimethyloctan p-Menthan Caran Pinan Thujan und Fenchan Boman Trivialnamen einiger wichtiger p-Menth-1-en 8
Monoterpene Monoterpene. ct-Thujen 2-Caren -Fenchen 2-Bornen Myrcen a-Pinen a-Phellandren Ocimen 3-Caren Sabinen Limonen 3Pinen Terpinolen 2.2 Biosynthese
Die Biosynthese der azyklischen und zyklischen Kohlenstoffgerüste der Monoterpene findet von Geranyldiphosphat (GDP) ausgehend statt. Die beteiligten Enzyme sind membran- gebundene Synthasen bzw. Cyciasen, die zweiwertige Metallionen ‘2(Mg oder )2Mn als Cofaktoren benötigen (Croteau 1987). GDP wird zunächst zu einem allylischen Kation ionisiert und anschließend zu dem enzymgebundenen Linalyldiphosphat isomerisiert. Diese
Reaktion ist notwendig, da die räumliche Struktur von GDP eine direkte Zyklisierung nicht ermöglicht. Eine weitere Aktivierung über eine zweite kationische Zwischenstufe führt zur
Bildung des enzymgebundenen, zyklischen a -Terpinyl-Kations, das universale Intermediat der Ringbildungsreaktionen. Durch intramolekulare Additionen, Wasserstoff-Verschiebungen und Umlagerungen leiten sich von diesem hochreaktiven Zwischenprodukt die weiteren
Grundgerüste der zyklischen Monoterpene ab. Offenkettige Monoterpene, wie z.B.
13-Myrcen,entstehen durch Deprotonierung der azyklischen Carbokationen (Bohimaim et al.
1997). Viele Synthasen katalysieren die gleichzeitigeBildung von Monoterpengemischen, z.B. bildet die Limonen-Synthase neben Limonen auch geringe Mengen an 3-Myrcen, ct- und
3-Pinen (Bohlmann et al. 1998). Die Primärprodukte der pflanzlichen Biosynthese sind die ungesättigten Kohlenwasserstoffe, aus denen nachfolgend die oxygenierten Derivate gebildet werden.
2.3 Physiologische und ökologische Bedeutung
Die Bedeutung der Monoterpene in der Natur ist vielschichtig und im Detail noch nicht
vollkommen verstanden. Die biogenen Kohlenwasserstoffe werden nicht nur in den Pflanzen
am Bildungsort gespeichert, sondern diffundieren auch in beträchtlichem Umfang in die
Atmosphäre. Zimmerman et al. (1978) schätzten die weltweite Emission biogener
Monoterpene auf ca. 4.8 x 1014 g C pro Jahr. Monoterpene und Isopren bilden zusammen den wesentlichen Anteil (>75%) der biogen emittierten, sogenannten Nicht-Methan- Kohlenwasserstoffe. Nach neueren Modelirechnungen beträgt die Emissionsrate der
9 Monoterpene Prozent
Erhöhung
wichtigen
Bestäubern pflanzliche
Monoterpenen 1997). angelockt, ähnelt von
Trockenmasse
In
(kalifornischer
Diese vorsorgender mit
Wirkung Wirtspflanze, beginnen
Diese
Insekten
Beeinflussung Nahrungsbedarf a-, nachhaltige
Funktion
indem
den
Monoterpenen Schädlingen
3-Pinen,
(Gershenzon
Alternativ Es
induzierte
nach permante
des
Nadeln
der
dieser
(Par wird
Faktoren
da
sehen
einige
abhängig
Vermehrung.
pflanzlich
Keimungsinhibitoren Insekten-
Wärmetoleranz
ca.
Fraßschutz
Camphen,
das
von Parasit
Laurel)
die
vermutet,
(Wut
und
der
basiert
Substanzen,
1.3
emige
können
der
Emission
Pflanzenarten
Duftmuster
Speicherung
männlichen
Pflanzen
in
und
sind,
x
Kiefer
ökologischer
Tumlinson
eigenen
Pflanzen
fixierten
10
oder
et
und
von
der Autoren
Croteau
Campher
die
So
gegenüber
ist
al.
daß
g
Schutzmechanismus
bis bewirkt
Virenbefall
dessen
Pinus
eine werden C
der
flüchtigen
beispielsweise
sondern
Art
1993)
Kohlenstoffs
Vertreter
pro zu
der die
liefert
Pflanzen
von
1991). in
1997).
Rolle.
bestimmte
gegenüber
20
Beziehungen
sicherzustellen
oder nionophvlla
Jäger. Jahr Freisetzung
Pflanzen
Herbivoren.
der
z.B.
bei
ihre
und
mg/g
teilweise
Monoterpenen
Isoprenoide
Monoterpene
Eine
So
intraspezifischen
1,8-Cineol Flüchtige
(Guenther
bestimmter einigen
die
beiträgt
Funktion
Nach
werden
Trockenmasse
in
das
(Bolin
weitere
andere
Anlockung
den
Monoterpene
10
den
wurden
nicht
auf
Bei
der Anlocken
werden.
Besiedlung Orchideen-Arten
(Sharkey
Terpene
Sexualduftstoffen
von (Loomis
ausgeschieden,
et
1983).
freigesetzt
als
einer
einem
Erklärung
flüchtigen Pflanzen Blättern
Bienen
allein
in
al.
einigen
chemische
in
Monoterpengehalte
der
von
1995).
induzierten
Da Kommunikation
von
komplexen (Wood
auf
den und
spielen
und
Umgebung
mit
oder
an
Freßfeinden
viele
wirken,
Pflanzenarten
von
ifir
werden,
der
Insekten
Kohlenwasserstoffe
Singsaas
Dies
Pflanzengeweben
Croteau
pflanzenfressenden
die
das
Verteidigungsmechanismen. Grabwespen
die
durch
toxischen et
auch
Pflanzen
Umbellularia
der
Biosynthese
al.
entspricht
verbreitete
im
Umgebung
Wechselspiel
um
die
der
lebenswichtig
die
l995) weiblichen
bei
1995;
Boden
1980).
der
zwischen
so die
Pflanzen
Verbindungen
oder
Freisetzung
von
der
von
entsprechenden
den
Produktion
Zimmer
nachgewiesen.
sehr
mehr
vor
Vorkommen
gegenseitigen
Eine
insektiziden
ca.
nach
calfornica
abzugeben.
Platz-
tierischen
dient
zu
zwischen
Insekten
effizient
auch
Pflanzen,
allem
Insekten
5
als
für
weitere
et
Befall
einer
mg/g
von
ein
die
zu
al. und
wie
von
als
als Abwehrstoffen bei nicht befallenenPflanzen der eigenen Art induzieren (Baldwin und Schultz
1983; Shulaevet al. 1997).
Neben der erwähnten insektiziden Wirkungwurde für verschiedene Monoterpene auch eine artspezifische Toxizität für Mikroorganismen nachgewiesen (Andrews et al. 1980; Uribe et al. 1985; Knobloch et al. 1986; 1988). Die Toxizität wird generelldurch die Akkumulation der lipophilen Monoterpene in den Zellmembranen verursacht. Die damit verbundene Aufhebung der Membranintegrität bewirkt eine Hemmung des respiratorischen Elektronen- transports, der Protonentransiokation und letztlich der oxidativen Phosphorylierung, so daß der Energiestoffwechsel zum Erliegen kommt (Knobloch et al. 1986; 1988; Silckemaet al.
1995). Untersuchungen mit aeroben Bakterien zeigten, daß Monoterpenoide im Vergleichzu den Monoterpenkohlenwasserstoffen einen stärkeren toxischen Effekt besitzen (Knobloch et al. 1986; 1988). Dies ist möglicherweiseauf die höhere Bioverfligbarkeit,aufgrund der höheren
Wasserlöslichkeit (Weidenhameret al. 1993), und auf die Anwesenheit von Ketogruppen, die mit Proteinen reagierenkönnen, zurückzuführen.
Umfangreiche ökologische Studien zeigten einen bedeutenden Einfluß von
Monoterpenen auf die Nährstoffkreisläufe in Waldböden. So stellte White (1986) in Labor-
experimenten bei Anwesenheit von Monoterpenen (a-, f3-Pinen, 3-Myrcen, Limonen,
(3-Phellandren)in der Gasphase eine 68%ige Reduktion der Nettostickstoffmineralisierung
(Summe der Ammonium- und Nitrat-Bildungsraten) im Waldboden fest. Mit den flüchtigen
Verbindungen, die aus einem Pinus ponderosa-Waldboden emittierten, wurde eine Reduktion
um 74 % erreicht. Diese Beobachtungen werden erklärt durch die spezifische Hemmung der
mikrobiellenAmmonium-Monooxygenase in Gegenwart bereits niedrigerKonzentrationen, vor
allem an ungesättigten Terpenkohlenwasserstoffen (White 1988; 1994;Ward et al. 1997). Eine
spezifische Hemmung der Methan-Monooxygenase durch die Monoterpenkohlenwasserstoffe
wurde auch für einigemethanotrophe Bakterien beschrieben (Amaral et al. 1998).
11 3.
Nur
Gram-positive
nur alleiniger
Aufklärung wasserstoffe. und
gewonnenen Trudgill der
Werf Monoterpene
3.1
Bereits Abbau
Famesol (Seubert
Untersuchungen bindungen f3
wird
(3-Methyl-a,3-ungesättigten
CoA-Carboxylase). Lyase-Reaktion Form
-methylverzweigten
beteiligten
für
identifiziert
wenige
et die
Abbau
von
Azyklische
einzelne
der
vor
al.
1984;
Kohlenstoffquelle
3-ständige (3,7,11
1960;
Essigsäure.
1997).
verzweigten der ermöglichen:
mehr
Einsichten
Bakterien,
Stoffwechselprodukte,
zusammengefaßt. biogener
Enzyme
Kieslich
Actinomyceten,
Seubert
-Trimethyl-2 initialen
Verbindungen
wurden,
die mit
als
Im
Methylgruppe
Im
Monoterpene
Eliminierung
gereinigten
dreißig
folgenden
sind et
Das
Kohlenwasserstoffen, angesichts
Anschluß und
hauptsächlich
Monoterpene
Kohlenstoffgerüste
Aktivierungsprozesse
al.
Nach
begründen
isoliert.
gereinigt
entstehende
Remberger
1986;
‚6,1
Jahren
Säuren
wurden
erfolgt.
Oxidation
sind
0-dodecatrien-
Enzymen
an
der
Trudgill
der
in
Untersuchungen
die
und
die
gelang
die
Strukturvielfalt postulierte
einer
und
in Die
Fseudomonas-ähnliche
durch
durch 1963; während
Hydratisierung
3-Ketoacy1-CoA-Derivat
charakterisiert
Kenntnisse
den
1986;
Aktivierung
der
Studien Biotin-abhängigen
es
zeigten
von
Seubert
Carboxylierung
letzten
12
die Seubert
aerobe
1
primären
dieser
-ol)
des
Mikami
GeranioL
Abbauwege.
einen
beschäftigten
eine
zum in
Wachstums
der
über
vierzig
et
Mikroorganismen
Pseudomonas azyklischen
und
der
worden
durch
al.
Monoterpene neue
aeroben
1988;
Alkohole
vollständigen
(3
den
a,f3-Doppelbindung
seinen
1963;
‚7-Dimethyl-2
Jahren
Reaktion
aktivierten
Variante
Coenzym
Gram-negative
Insgesamt mikrobiellen
(Übersicht
Trudgill
im
sich
Katabolismus
Seubert
wird
Mitarbeitern,
und
Kulturmedium
zu
mit
citronellolis
hauptsächlich
begrenzt.
carboxyliert
anschließend
zur
zyklischen
1990;
den
Abbau
Monoterpenen
3-Methylgruppe
und A-Thioesterbildung
gesehen,
‚6-octadienol)
in:
Abbau
Aktivierung
entsprechenden
Kieslich
Fass
Spezies
1994;
erfolgt
sind
den Nur
dieser
aufzuklären
gefunden
(Geranyl
einzelner
sind
1964a,b).
Kohlen
mit
van
über
aeroben bislang
wenige
in
1976;
oder
einer
Ver
und der
von der
die als
die
in Reaktionen der -Oxidation weiter verkürzt. Diese Variante wird nur bis zum Dimethylacryl
CoA eingeschlagen.Der weitere Abbau erfolgt über die Reaktionen des Leucinabbaus (Seubert und Fass 1964b).
Neben den erwähnten Verbindungenverwertet P. citronellolis weitere funktionalisierte lsoprenoide wie das Isolationssubstrat Citronellol, Citronellal, Citronellsäure, 3,7-Dimethyl-1- octanol und Nerol als einzige Kohlenstoffquelle (Seubert 1960; Cantwell et al. 1978). Der aerobe Abbau dieser Terpenoide unter Beteiligung einer Geranyl-CoA-Carboxylase wurde auch für die Organismen P. aeroginosa und P. mendocina gezeigt (Cantwell et al. 1978). Die Verwertung von 2,6-Dimethyl-2-octen, einemverzweigten Alken, durch die Kombination einer Monooxygenase-Reaktion und anschließender Carboxylierung durch die Geranyl-CoA
Carboxylase wurde von Fall et al. (1979) durch n-Alkan verwertende Mutanten (Deck) von
P. citronellolis nachgewiesen. Von den genannten Monoterpenen metabolisiert F. citronellolis unter anaeroben Wachstumsbedingungenin Gegenwart von Nitrat nur Dimethyl-1-octanol und
Citronellol (Harder und Probian 1995).
Im Vergleich zu den Alkoholen ist über den aeroben Abbau der azyklischen Monoterpenkohlenstoffe nur sehr wenig bekannt. Pseudomonas putida Stamm S4-2 wurde mit
13-Myrcen (7-Methyl-3-methylen-1,6-octadien) als einziger Kohlenstoffquelle isoliert
(Narushima et al. 1982). Nach erfolgtem Wachstum wurden aus dem Kulturüberstand
2-Methyl-6-methylen-2,7-octadiensäure und die -Verbindungen 4-Methylen-5-hexensäure isoliert. AusgehendC von diesen Produkten wurde als und 4-Methyl-3-hexensäure 7 Abbaumechanismus eine Hydroxylierung der terminalen C8-Methylgruppe vorgeschlagen.Die entsprechenden -Verbindungen resultieren möglicherweise aus der Abspaltung einer C Durch genetische und physiologische Studien 3C-Einheit über die7 Reaktionen der -Oxidation. mit dem erst kürzlich auf j3-Myrcen isoliertem Bakterium, Pseudomonas sp. Stamm Ml, wurden die postulierten, initialen Schritte des Abbaus bestätigt (Iurescia et al. 1999). So wurde
in Untersuchungen mit dichten Zellsuspensionen einer Myrcen-negativen Mutante (N22) des
Stammes die Akkumulation von 2-Methyl-6-methylen-2,7-octadiensäure als initiales Hydroxylierungsprodukt nachgewiesen. Desweiteren konnten vier Gensequenzen identifiziert
werden, die für eine Alkohol- und eine Aldehyd-Dehydrogenase, eine Acyl-CoA-Synthetase und eine Enoyl-CoA-Hydratase kodieren.
13 Auch die Monoterpenalkohole Linalool, Geraniol und Citronellol werden von
P. incognita und Aspergillus niger durch eine Hydroxylierung der terminalen C8-
Methylgruppe metabolisiert (Madyastha et al. 1977; Madyastha und Murthy 1988). Als katalysierendes Enzym wurde in P. putida var. incognita Stamm PgG 777 eine lösliche,
Linalool umsetzende Cytochrom-P450-Monooxygenase gefunden (Ullah et al. 1990).
3.2 Monozyklische Monoterpene
Limonen (4-Isopropenyl- 1-methyl- 1-cyclohexen) ist das in der Natur am weitesten verbreitete monozyklische Monoterpen. Der Abbau des ungesättigten p-Menthen-Grundgerüstes
erfordert eine Spaltung des Cyciohexenrings in ein offenkettiges Intermediat. Erste Untersuchungen zum Abbau von monozyklischen Monoterpenen wurden mit Pseudomonas putida Stamm PL, einem auf Limonen isolierten Bakterium, durchgeführt (Dhavalikar und
Bhattacharyya 1966). Produkte, die im Kulturmedium beim Wachstum auf Limoneri gefunden
und nachträglich als Wachstumssubstrate identifiziert wurden, führten zum Vorschlag eines
Reaktionsweges. Die Hydroxylierung der C7-Methylgruppe von Limonen führt zur Bildung
von Perillaalkohol, gefolgt von einer weiteren Oxidation zur Perillasäure. Diese wird
anschließend in einer Coenzym A- und ATP-abhängigen Reaktionsfolge, analog zur
(3-Oxidation, zu 3-Isopropenylpimelyl-CoA gespalten (Dhavalikar et al. 1966). Eine ent
sprechende Perillaalkohol-Dehydrogenase und eine Perillaaldehyd-Dehydrogenase konnten
gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden (Ballal et al. 1966; 1967; 1968). Pujar und
Bhattacharyya (1973) beschrieben eine analoge Reaktionsfolge unter Bildung von
3-lsopropylpimelyl-CoA auch für die mikrobielle Oxidation von p-Menth- 1-en (4-Isopropyl- 1-methyl-cyclohexen). Ein Abbauweg für die offenkettige 3-Isopropenylpimelinsäure bzw.
3-Isoproylpimelinsäure wurde von Hungund et al. (1970) vorgeschlagen. Der Perillaalkohol
Weg wurde auch für andere Bakterien beschrieben, die mit Limonen als alleiniger
Kohlenstoffquelle wachsen (Cadwallader et al. 1989; Chang und Oriel 1994; Chang et al.
1995).
14 Kürzlich wurde ein weiteres Limonen-verwertendes Bakterium, Rhodococcus eiythropolis Stamm DCL 14, isoliert, das im Gegensatz zum P. putida Stamm PL nicht in der
Lage ist, mit Penilaalkohol zu wachsen (van der Werf und de Bont 1998). Biochemische
Untersuchungen führten zur Postulierung eines zweiten Abbauweges. Im Unterschied zum
Perillaalkohol-Weg wird der Abbau durch einen Angriff an die 1,2-Doppelbindung von
Limonen durch eine FAD- und NADH-abhängige Monooxygenase eingeleitet und führt zur
Bildung von Limonen- 1‚2-epoxid. Dieses Epoxid wird hydrolytisch zu Limonen-1‚2-diol gespalten, das weiter zu l-Hydroxy-2-oxolimonen oxidiert wird. Über eine NADPH abhängige Monooxygenase-Reaktion entsteht 7-Hydroxy-4-isopropenyl-7,2-oxo-oxepanon.
Durch spontane Umlagerung des instabilen Lactons kommt es zur Ringspaltung; als Produkt entsteht 3-Isopropenyl-6-oxoheptansäure, die voraussichtlich über die Reaktionen der f3-Oxidationweiter abgebaut wird (van der Werf et al. 1999). Zwei der beteiligten Enzyme, die
Limonen- 1‚2-epoxid-Hydrolase und die Limonen- 1‚2-diol-Dehydrogenase, konnten gereinigt und charakterisiert werden (Barbirato et al. 1998; van der Werf et al. 1998). Limonen-1,2-diol wurde auch als ein wesentliches Transformationsprodukt von Limonen in verschiedenen
Pilzkulturen nachgewiesen (Abraham et al. 1986).
3.3 Bizyklische Monoterpene
a- und 3-Pinen, Hauptkomponenten des Terpentinöls, sind die am häufigsten in der Natur vorkommenden bizyklischen Monoterpene. Obwohl das aerobe Wachstum mit a-Pinen
(2,6,6-Trimethyl-bicyclo[3. 1.1]hept-2-en) für verschiedene Mikroorganismen beschrieben wurde, ist der mikrobielle Abbau, der die Spaltung von zwei Kohlenstoffringsystemen erfordert, noch nicht vollständig aufgeklärt. Shukla und Bhattacharyya (1968) und Shukla et al.
(1968) untersuchten den Metabolismus von ct- und f3-Pinen in Pseudomonas Stamm PL, einem Bakterium, das mit verschiedenen Monoterpenen als einziger Kohlenstoffquelle wächst.
Basierend auf der Analyse der beim Wachstum auf a-Pinen akkumulierten Produkte wurde
von den Autoren folgender Reaktionsweg vorgeschlagen: Die initiale Spaltung des Cyclo butanrings über eine Protonierung führt zur Bildung eines monozyklischen Intermediats,
15 Limonen oder p-Menth- 1-en. Der weitere Abbau erfolgt auf dem bereits beschriebenen Weg
über Perillaalkohol zu Pimelinsäurederivaten (Shukla und Bhattacharyya 1968). Für ein weiteres auf a-Pinen isoliertes Bakterium, Pseudomonas Stamm PIN 18, wird ebenfalls dieser
über Limonen verlaufende Abbau vermutet (Griffiths et al. 1987a).
Im Gegensatz dazu konnte in Untersuchungen mit Zellextrakten von Fseudornonas fluorescens Stamm NCIMB 11671 ein NADH-abhängiger Sauerstoffverbrauch in Gegenwart
von a-Pinen beobachtet werden (Best et al. 1987). Als Produkt dieser Reaktion wurde
2-Methyl-5-isopropylhexa-2,5-dien-1-al isoliert, das oxidativ zu 2-Methyl-5-isopropylhexa-
2,5-diensäure umgesetzt werden kann. Dieses Intermediat wurde auch von Pseudononas
Stamm PX 1 und Pseudomonas putida Stamm PIN 11 beim Wachstum auf a-Pinen angehäuft
(Gibbon und Pirt 1971; Tudroszen et al. 1977). Anhand dieser Beobachtungen wurde eine
initiale Hydroxylierung von a-Pinen zu einem 1‚2-Epoxid vermutet, dessen Spaltung in einer
Lyase-Reaktion zur Bildung von 2-Methyl-5 -isopropylhexa-2,5-dien- 1-al flihrt. Weitere Inkubationsstudien mit Zellextrakten von Nocardia sp. Stamm P18.3 konnten eine eindeutige
Umsetzung von a-Pinenepoxid zu dem entsprechenden Aldehyd zeigen (Griffiths et al.
1987a). Untersuchungen mit den gereinigten a-Pinenepoxid-Lyasen aus Nocardia sp. Stamm
P18.3 (Griffiths et al. 1987b) und P. putida Stamm PXI (Trudgill 1990) belegten, daß die
Lyasen eine gleichzeitige Spaltung beider Rinysteme zu einem azyklischen Produkt
katalysieren (Abb. 2).
coo
a-Pinen a-Pinen- 1,2- 2-Methyl-5-iso- 2-Methyl-5-iso- epoxid propylhexa-2,5 - propylhexa-2,5-
dien- 1-al diensäure
Abb. 2 Initiale Aktivierung von a-Pinen durch Bildung des 1,2-Epoxids (Griffiths et al. 1987a,b).
16 2-on) funktionalisierte
Baeyer-Villinger-Oxidation Dehydrogenierung
atom einem Baeyer-Villinger-Oxidation
gebildet (-)-Campher
Monooxygenasen Jones
Ringöffnung Williams
4.
bindungen Die
langsamen Moldewan wasserstoffe und
photosynthetischer
Methanogene Triterpen
denitrifizierenden wurde,
Analyse
in
monozyklischen gefunden.
et
Ein
mit
Mikrobieller Bedingungen
das
vollständig (Ougham
et
al.
anderer
Abbau
mit
al.
Ringsystem
zu
1993).
1993).
führt,
anaerob
ist
durch 1989) von
Anreicherungskulturen
bizyklische
15-40
bis Eingeleitet
Methan
von
wurden
et
Mechanismus
unter Bakterium,
wird
zu
Die
organischen
heute
Über
und
al.
Pigmente
Abbau
isoprenoiden
Kohlendioxid
Intermediat
Pseudonionas
Kohlenstoffatomen,
inkubierten
Beteiligung
eingefügt.
auch Menthol 1983;
Bildung
nur
bisher
des und
den
wird das
Monoterpenoid
isoprenolder
sehr
Ketons
für
Stamm
Trudgill
anaeroben
CO2
nachgewiesen
Verbindungen
azyklische der gereinigt
die
(Williams
den
gespalten. wenig
Das
des
Naturstoffen.
einer mineralisiert.
mikrobiellen
Seewasserproben
mit
Reaktionsfolge
wird
um
putida aeroben
72Chol,
entstehende
entsprechenden
1986).
bekannt.
ähnlichen Squalen
(Ougham
Abbau
in
(Schink
und
als
Campher
Naturstoffe
Nach
a-Stellung
Intermediat 17
Abbau
in
(Leavitt
das Stamm
Drei
sogenannte
Trudgill
Daher
In
In
als
Ringspaltung
einer
anaeroben
dieser
Lacton
Monooxygenase
jüngster
von
Untersuchungen
et
1985).
der
alleiniger
durch
(1,7,
von
al.
CoA-Aktivierung
werden
zur
Diketons.
1994)
wurde
Harder Cl
1993; am unter
komplexen
7-Trimethylbicyclo[2.
1983;
ist
3,4
1,8-Cineol
Biomarker
Carbonylgruppe
eine
Zeit
Cholesterin
Abbau
Sedimenten
‚4-Trimethyl-A3-pimelyl-CoA instabil
beteiligten
vermutet.
Kohlenstoffquelle
diese
wurde
anoxischen
Steenbergen
Taylor und
wurde
Hydroxylierung
ein
Durch
in
Reaktion,
von
Substanzen,
Probian
und
isoprenoiden (MacRae
anaeroben
für
mikrobieller
genutzt
und ein
wird
(+)-Campher
zeigte
wird
wird
das
Baeyer-Villinger
eine
denitrifizierendes
ein
Trudgill
durch
et
(1997)
(sauerstoff-)
die
2.1
spontan
et
(Peters
biologische
Sauerstoff-
von
setzten
Sedimenten
einen
meist
al.
und
Iheptan al.
zu
erneute
Kohlen
Abbau
isoliert
1986;
1979;
1994).
einem
einer
eine
und
Ver
sehr
und
zu
das Anreicherung Bakterium isoprenoiden nachgewiesen. Carboxylierung p-Menth-1-en, Acetonabbau 6,10,1 und
Kohlenstoffquelle nitratreduzierenden
oxygenierten Gattung
3-Proteobakterien
Reaktionen,
mit
enzymatische eine 1998). Geraniol. wurde postuliert
anderen wurde funktionelle
Cyclohexanol
Probian
Geraniol.
regioselektive
4-Trimethylpentadecan-2-on.
Erste
für
Thauera
Menthon
Thauera
Erste
Menthanalkoholen
Basierend
(Rontani
(Foß Thaiiera,
die
die
(1995)
Untersuchungen
Sauerstoffgruppe
Keton,
bekannt
Monoterpenen
(Hirschler
Tests physiologische
(Dangel
weitere
Die
a-Phellandren,
im und
als
Die
linaloolentis
terpenica
gefunden.
beschrieben
zu
folgenden
Identifizierung
et
Umlagerung
durchgeführt.
Bakterien, Harder
Initialreaktion
mit
auf
als
Charakterisierung
ist Thauera
al.
wachsen.
et
Mineralisierung
cytosolischem dieser
al.
alleiniger
(Ensign 1997) et
Stamm
Es
1997).
1988;
kurz
Stamm und
zum al.
isolierten
Studien
tragen.
Beobachtung
wird
wurden
die
2-Caren
erhalten,
des
Nähere
linaloolentis
1998)
beschrieben et
Anreichemngen
1989) -ketonen,
anaeroben
2IMol Kohlenstoffquelle
von
hin,
in
vermutet,
47L0IT
al.
tertiären
Als
Zellextrakt
der
zum
der
(Foß
Bakterien
1998).
2-(
erfolgen
von
eine
wurde
und
Untersuchungen
das
Metabolite
wächst
beschriebene
1
Lage
wächst
und
-Hydroxyethyl)pentadecanoat
Abbau
die
Abbau
und
mit
werden.
18
Reaktion,
a-Pinen
Metaboliten daß
Alkohols
Die
und
könnte.
die
der
in
Harder
6.10,14-Trimethylpentadecan-2-on,
waren,
führten
mit
der
durchgeführt,
auf
Anreicherungsicultur
mit
von
ergaben tneta-Position
transienten
Mineralisierung
Thauera
wächst.
der
Abbau Linalool,
dem
führten
dem
Geraniolabbauweg Linalool
Monoterpenen
die
1997;
zum
mit
anaeroben
wurden
in
Isolationssubstrat
Isolationssubstrat
Hinweise
vom
in
Monoterpenen In
Nachweis
Foß
Menthol,
wachsenden
zur
Akkumulation
Analogie terpenica,
die
zu
einer
bisher
aeroben
zur
Oxidation 1998;
dem
Isolierung
als
von
auf
wurden
sulfatreduzierenden
verwertet
Methylgruppe
folgender
neue
Eukalyptol
zur
nur
primären
deutet von
Foß
Hexadecan-2-on
unterschiedliche und
innerhalb
Kulturen
Oxidation
mit als
Menthol
von
von Linalool
P.
Spezies
von
von und
anaeroben
citronellis
auf
Reaktion: ebenfalls
alleiniger
den
Menthol
Geranial
Alkohol
Harder
Harder
einem
sieben
sowie
eine
und und
eine auf
der und der
von Thauera terpenica Stamm 58EuT wurde mit Eukalyptol isoliert und wächst in
Gegenwart von Nitrat auch mit einigenp-Menthanalkenen sowie mit a-Terpineol. Als erste
Reaktion beim Abbau von Eukalyptol wurde daher eine intramolekulare Etherspaltung unter
Bildung des monozyklischen Intermediats a-Terpineol vorgeschlagen.
5. Zielsetzung
Der mikrobielle Abbau von Kohlenwasserstoffen wurde lange Zeit als ein rein aerober Prozeß angesehen. Erst in den letzten zehn Jahren konnte eine anaerobe Mineralisierung von Kohlenwasserstoffen durch Reinkulturen nachgewiesen werden. Verschiedene Bakterien wurden isoliert, die aromatische Verbindungen (Übersicht in: Harwood und Gibson 1997;
Heider und Fuchs 1997; Heider et al. 1999), Alkane (Aeckersberg et al. 1991; Rueter et al.
1994; Aeckersberg et al. 1998; Behrends 1999; So und Young 1999) oder Alkene (Schink 1985;
Gilewicz et al. 1991) als alleinige organische Kohlenstoffquelle unter strikt anaeroben
Bedingungen verwerten. Bisher wurde die Biochemie der Aktivierungsreaktion nur für die
aromatische Verbindung Toluol aufgeklärt. Der initiale Schritt ist eine Addition von Fumarat
an die Methylgruppe des Toluols, welche zur Bildung von Benzylsuccinat führt (Evans et al.
1992; Biegert et al. 1996; Beller und Spormann 1997a,b; Rabus und Heider 1998; Zengler
1999). Diese Reaktion wird durch die Benzylsuccinat-Synthase, ein Glycinradikal-Enzym,
katalysiert (Coschigano et al. 1998; Leuthner et al. 1998). Benzylsuccinat wird anschließend
zu Benzoyl-CoA, dem zentralen Intermediat beim anaeroben Abbau aromatischer
Verbindungen, oxidiert, bevor die Ringreduktion erfolgt. Harder und Probian (1995) gelang erstmalig die Isolierung von Bakterien mit der
Fähigkeit, unter anaeroben Bedingungen zyklische Alkene als alleinige Kohlenstoffquelle zu
verwerten. Vier nitratreduzierende Stämme wurden mit den zyklischen Monoterpen
kohlenwasserstoffen p-Merith- 1-en (Stamm 51Men), a-Pinen (Stamm 54Pin), 2-Caren
(Stamm 62Car) und c-Phellandren (Stamm 65Phen) erhalten. Die Stämme 5lMen und 54Pin
wurden aus Belebtschlamm (Kläranlage Lintel, Osterholz-Scharmbeck) und die Stämme 62Car
19 und 65Phen aus Schlamrngemischen aus Mischwaldgräben (Bremen) isoliert. Eine erste partielle Charakterisierungder Stämme wurde von S. Foß (1998) durchgeführt.
In der vorliegenden Arbeit sollten ergänzende Untersuchungen unternommen werden, die eine taxonomische und physiologische Charakterisierung der monoterpenverwertenden, nitratreduzierenden Bakterienstämme ermöglichen. Über die Biochemie der anaeroben
Aktivierung nichtpolarisierter C-C-Doppelbindungen von Alkenkohlenwasserstoffen war bis zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Erste Hinweise auf die zentralen Reaktionen der anaeroben Alkenoxidation sollten durch Wachstumsuntersuchungen mit verschiedenen Mono terpenisomeren und definierten Monoterpengemischen sowie durch die Isolierung und
Identifizierung von potentiellen Intermediaten gewonnen werden. Als Grundlage für weiter führende biochemische Untersuchungen war der Aufbau einer anaeroben Massenanzucht der monoterpenverwertenden Bakterien geplant. Mit der gewonnen Biomasse sollte die
Monoterpenumsetzung in dichten Zellsuspensionen und zelifreien Extrakten, insbesondere in
Hinblick auf die Bildung eines ionischen Aktivierungsproduktes, analysiert werden. Zentrales
Ziel war die Entwicklung und die Etablierungeines anaeroben Enzymtests, um eine Aufklärung der initialen Aktivierungsreaktion in vitro zu ermöglichen.
Monoterpene sind in der Umwelt ubiquitär verbreitet. In der Regel liegen sie als
Substanzgemische vor, die neben Monoterpenen und Monoterpenoiden auch Sesquiterpene und aromatische Verbindungen enthalten. Zur Beurteilung der ökologischen Relevanz der
Monoterpenoxidation sollte die Abbaubarkeit dieser natürlichen Gemische am Beispiel verschiedenen ätherischer Öle, in den Reinkulturen und in denitrifizierenden Anreicherungen untersucht werden. Anschließende molekularökologischePopulationsanalysen der Anreicher ungskulturen sollten durchgeführt werden, um die Häufigkeit und phylogenetische Verbreitung dieser Fähigkeit der anaeroben Monoterpenoxidation abzuschätzen.
20 B
und 1. Isolate Die von Jim. im strikt Nitratreduktion Nitritakkumulation Sauerstoff
einigen Schwefelverbindungen Elektronenakzeptoren. Alkane auf Monoterpen
weitgehend durch Cycloheptadecanoat Wachstum
wurden. Pseudomonaden in
mesophilen
Alcaligenes
den
65Phen 5,9-8,4,
Der
monoterpenverwertenden,
respiratorischen
Ergebnisse
Beschreibung Bakterien
waren
einen
Die
Amino-
Isolationssubstraten.
wurden
G+C
Das
als
auf Zusammensetzung
mit waren
identisch.
war
bewegliche, hohen
Vorhandensein
Gehalt
Elektronenakzeptor
Temperaturbereich
Acetat und
einem
spp.,
der nachgewiesen
nicht
nicht
einander
Fettsäuren
rRNA-Gruppe und
Anteil
im von
(30-33
Metabolismus. Optimum
Achromobacter
Die
feststellbar.
der Alle
(Sulfat, neben
verwertet.
Gram-negative
Stamm
Diskussion
Medium
vier Fettsäureprofile
morphologisch
Stämme
an
von
%)
Hexadecanoat
nitratreduzierenden der
zu werden. monoterpenverwertenden,
Sulfit,
Hexadecanoat
bei
54Pin
3-Hydroxy-tetradecanoat
mit
und
Eine Alle
zellulären
wachsen. genutzt.
6,7-7,5.
II
waren
nur
Neben
einem
(Vancanneyt
spp.,
Thiosulfat),
Isolate
betrug
Cyclononadecanoat
Vitaminabhängigkeit
Stäbchen
In
in unter und
zeichneten
Alle
Elementarer
Nitrat, Optimum
hauptsächlich
Kohlenhydrate, Kulturen
21
Fettsäuren
Bordetella der
66,9
wuchsen
(22-35
physiologisch
waren
Lage,
mit
C-limitierten
Bakterienstämme
±
et
Nitrit
CO2
0,3
einer
al.
%)
von
sich
fakultativ
neben
mit
ebenfalls
der
Stickstoff
spp.
1996). %.
oder
und
und ist
ungesättigte 300
Größe
bei
nitratreduzierenden
vier
(6-8
Die
während
aromatische 10
ein sehr
den
Distickstoffoxid
und C
Wachstum
den
Fumarat
Diese
anaerob Bakterienstämme
unter
Stämme
mM
Bedingungen
taxomomischer
und
von
%)‚
Monoterpenen,
ähnlich.
konnte
51
Taylorella Cyclopropanfettsäuren,
in
Fettsäure
1,3-1,8
des
Men,
aeroben
Nitrat
aus, Fettsäuren
und einem
Verbindungen
dienten
war
auf Die
als
Wachstums
während
54Pin,
besaßen
im
untereinander
Produkt
Bedingungen
wurde
Monoterpen
wurde
pH-Bereich
Zellen
equigenitalis
beobachtet.
ist
Marker
x
nicht
wuchsen
auch
gefunden
ebenfalls
0,5-0,8
62Car
einen
auch
aller
nach eine
und
der
mit
auf
als
für vorhanden (Rossau et al. 1987; Weyant et al. 1995; Vandamme et al. 1996). Das Gesamtprofil der Zellfettsäuren der vier neuen Stämme, nach Wachstum auf Monoterpen, zeigte eine große
Ähnlichkeit zu den Fettsäuremustem von Achromobacter ylosoxidans und Alcaligenes faecalis (Vandamme et al. 1996), während zu den Bordetella Spezies deutliche Unterschiede bestanden (Weyant et al. 1995). Die phylogenetische Einordnung erfolgte auf der Basis der Sequenzdaten der
16S rRNS-Gene. Durch Vergleich mit bekannten Sequenzdaten wurden die Isolate der
-Untergruppe der Proteobakterien zugeordnet. Sie bilden eine Gruppe innerhalb der
Alcaligenaceaen, die die Gattungen Alcaligenes, Achrornobacter und Bordetella umfaßt
(De Ley et al. 1986; Yabuuchi et al. 1998). Die Sequenzen aller vier Stämme waren zueinander sehr ähnlich und hatten den höchsten Ähnlichkeitsgrad mit den 16S rDNS-Sequenzen von
Bordetella parapertussis (96,7 %)‚ Achromobacter denitrficans (96,0 %)‚ Achromobacter
*alosoxidans (95,8 %)und Alcaligenesfaecalis (95,2 %).Die Achro,nobacter Spezies sind zur
Denitrifikation bzw. zu einer Reduktion bis zum Nitrit fähig, jedoch nicht die untersuchten
Bakterienstämme von Bordetella parapertussis (Vandamrne et al. 1996). Für einige Vertreter der Familie Alcaligenaceaewurde eine aerobe Verwertung von halogenierten und aromatischen
Kohlenwasserstoffen beschrieben (Ewers et al. 1990; Weissenfels et al. 1990; Busse et al.
1992). Achromobacter denitrficans wurde auch unter denitrifizierenden Bedingungen mit
Resorcinol isoliert (Stamm LuBResl, Gomy et al. 1992).
Basierend auf der Analyse der Bakterienzellfettsäuren und den Unterschieden in den
l6S rDNS-Sequenzen von mindestens 3,3 % zu B. parapertussis, A. xylosoxidans, A.
denitrficans und A.faecalis, wurde nach den Kriterien von Stackebrandt und Goebel (1994)
vorgeschlagen, die monoterpenverwertenden, denitrifizierenden Bakterienstämme als neue
Spezies, A. defragrans, innerhalb der Gattung Alcaligenes mit Stamm 54Pin als Typstamm zu
definieren. Die Spezies wurden inzwischen validiert (Int. J. Syst. Bacteriol. (1998) 48: 1083).
Nach Erscheinen der Artbeschreibung (Foß et al. 1998; Teil II-B-1) wurde eine Neubeschreibung der Familie Alcaligenaceae vorgenommen; sie umfaßt zur Zeit die drei Gattungen Alcaligenes, Achrornobacter und Bordetella. Ein Teil der zuvor als Alcaligenes
beschriebenen Spezies, wie z.B. A. denitrficans und A. ylosxidans, wurden als
22 Achromobacter
Bacteriol.
2.
2.1 Zur
Stämmen Isolationssubstrate den
Oxidation
Menge elementarem wurde
eine Dimethyl-2
mineralisiert mikrobiellen Stamm Nitrat Monoterpene
Wachstumsphase. korrelierte
von
18,4
Quantifizierung
Stämmen
Geraniumsäure
Umsetzung
und
Wachstumsversuche Bilanzierung zur
(20
In
65Phen
an
54PinT
(1998)
21,6
Experimenten
des
Bildung
mM)
mit
‚6-octadiensäure)
Reduktionsäquivalenten,
Stickstoff
oder
Umsetzungen
sowohl wurden dissimilierten
mg
einer
Spezies
48:
und
wurde
zugegeben.
von
lediglich
von
Protein‘F‘.
a-Pinen
Der
des
wurde
1083).
65Phen Nitratreduktion
jeweils 3-Myrcen
des
assimiliert
notwendig Biomasse
anaeroben
überprüft,
Verbrauch
reklassifiziert
mit
anaeroben
in
und
transformiert
Nach von
Monoterpens
durchgefiihrt. beobachtet
ZeHsuspensionen
diesen
als
Demnach
mit
a-Phellandren
alleinige
assimiliert,
3-Myrcen (3,7-Dimethyl-1,3,6-octadien)
als
waren.
Abbaus
15
Alcaligenes
ob
von
Ansätzen
auch
von
Tagen
die
Monoterpenabbaus
3-Myrcen und
wird
(Teil
0,90
Ein
wird.
Kohlenstoffquelle
7,6
der
für
gebildeten
Die
vollständig
validiert Inkubation
während
und
Drittel
3-Myrcen
I-B
23
mM
Monoterpene
nicht
und
zeigte,
Bilanzierung
die
und
Dazu
defragrans
-4.
ct-Phellandren
unter
8,1
beobachtete
f3-Myrcen
beobachtet.
Zellextrakten
der
u.
Reduktionsäquivalente etwa
(Yabuuchi daß
wurden
zu
mM 5.).
waren
verbrauchten
komplett
anaeroben
CO2
die
zwei
In
des
wurden
(1
und
eingesetzten
Wachstumsuntersuchungen
in
die
mM)
und
oxidiert
denitrifizierenden
Drittel
zu
Reduktion
miteinander
et
einer
quantitativen
von
Kulturen
mineralisiert.
Geraniumsäure
0,97
Untersuchungen
al.
Bedingungen
mit
Menge
Stamm
Biomassenbildung
dissimiliert
wurden.
1998;
einem
mM
Monoterpene
in
entsprachen
von
an
verglichen.
65Phen
der
Int.
ct-Phellandren Überschuß
Ansätzen
Monoterpen
Eine Die
Abbaus
Nitrat
vollständig
stationären
wurden.
J.
(E,E-3,7-
mit
bei
Bildung
wurde
Syst.
von
den
der der
der
Die mit von
zu
die
an 2.2 Versuche zur Erweiterung des Substratspektrums
Erste Untersuchungen zur Charakterisierung der vier monoterpenverwertenden Stämme wurden von 5. Foß (1998) durchgeflihrt und zeigten, daß alle vier Stämme mit verschiedenen mono- und bizyklischen Monoterpenen als alleiniger Kohlenstoffquelle wuchsen. Unter denitrifizierenden Bedingungen wurden folgende Verbindungen verwertet: p-Menth- 1-en,
Limonen, a-Phellandren, a-Terpinen, ‘y-Terpinen, Terpinolen (monozyklische Monoterpen kohlenwasserstoffe), Sabinen. 2-Caren, 3-Caren, cx-Pinen, f3-Pinen (bizyklische Monoterpen kohlenwasserstoffe) und die Terpenalkohole a-Terpineol und Terpinen-4-ol.
In ergänzenden Untersuchungen zum Substratspektrum wurde gezeigt, daß alle
A. defragrans Stämme auch azyklische Monoterpene als Kohlenstoffquellen nutzten. So
wurde 3-Ocimen (3,7-Dimethyl-l ‚3,6-octatrien) als erstes azyklisches Monoterpen identi
fiziert, welches ein Wachstum aller vier Stämme ermöglichte. Alle Stämme, mit Ausnahme von
Stamm 54PinT, wuchsen ebenfalls mit f3-Myrcen. Trotz der strukturellen Vielfalt der
verwertbaren Monoterpene besaßen alle ein gemeinsames Merkmal: Sie enthielten ein sp-hybridisiertes, methylsubstituiertes Kohlenstoffatom (Cl der p-Menthan-Nomenklatur). 2In Wachstumsuntersuchungen mit verschiedenen Monoterpenisomeren einer Verbindung wurden selektiv die Isomere mit einem sp-hybridisierten CI-Atom anaerob vollständig abgebaut, z.B. Limonen. Das C1-sp-hybridisierte 2 Strukturisomer Isolimonen hingegen wurde von allen vier Stämmen nicht3 als Substrat verwertet. Diese Ergebnisse wurden am Beispiel weiterer Paare bestätigt: 2-, 3-Caren wurden metabolisiert, während die am Cl-Atom -3sp hybridisierten Isomere 4-cis-, 4-trans-Caren kein Wachstum ermöglichten. Auch das azyklische f3-Myrcen wurde im Gegensatz zu dem sp-hybridisierten 13-Citronellenverwertet. Das bizyklische a-Pinen diente allen Stämmen als3 Substrat, während das entsprechende gesättigte Isomer trans-Pinan kein Wachstumssubstrat darstellte. Moleküle ohne die
Isopropylgruppe, wie 1-Methyl-cyclohexen und 1-Methyl-cyclohexa- 1‚4-dien, wurden im
Gegensatz zu den korrespondierenden Monoterpenen, Menth- 1-en oder y-Terpinen, nicht
umgesetzt.
24 Aufgrund der übereinstimmenden Substratmuster wird ein gemeinsamer Abbauweg für die Monoterpenkohlenwasserstoffe vermutet. Für den vollständigen Abbau der Monoterpene durch A. defragrans scheint die sp-Hybridisierung am C1-Atom eine essentielle Voraussetzung zu sein. Hingegen sind 2die Bakterienstämme pCyN 1 und pCyN2, die unter nitratreduzierten Bedingungen mit der aromatischen Verbindung p-Cymol isoliert wurden, in
der Lage, neben einigen aromatischen Kohlenwasserstoffen auch mit den verschiedenen Monoterpenen cx-Terpinen, y-Terpinen, a-Phellandren, Limonen sowie mit dem -3sp hybridisierten Isolimonen zu wachsen (Harms 1998; Harms et al. 1999).
2.3 Konkurrenzversuche mit verschiedenen Monoterpenen
Erste Untersuchungen zum denitrifizierenden Wachstum auf Monoterpengemischen wurden
von S. Foß (1998) durchgeführt. In den jetzigen Inkubationsstudien sollte die Verwertung von Monoterpenen innerhalb verschiedener Monoterpengemische systematisch untersucht werden.
In Wachstumsversuchen mit definierten, äquimolaren Gemischen verschiedener
Monoterpene wurden die angebotenen mono- und bizyklischen Verbindungen von allen vier
Stämmen nicht sequentiell, sondern gleichzeitig mit unterschiedlichen Raten abgebaut. Anhand
der unterschiedlichen Abbauraten wurde für Stamm 65Phen folgende Abbaureihenfolge
nachgewiesen: a-Phellandren, Terpinolen, a-Terpinen, Limonen, y-Terpinen (monozyklische
Menthadiene mit je unterschiedlicher Position der Doppelbindungen); ct-Pinen, 2-Caren
(bizyklische Monoterpene mit einer Doppelbindung); und Menth-1-en (Monozyklus mit
einer Doppelbindung). Stamm 51Men zeigte nur kleinere Abweichungen innerhalb dieser Serie.
Von beiden Stämmen wurden die angebotenen monozyklischen Menthadiene gegenüber den bizyklischen Verbindungen bevorzugt verwertet. Dies galt auch für die mit bizyklischen Monoterpenen isolierten Stämme 54pT und 62Car, mit der Ausnahme, daß beide Stämme das
bizyklische Sabinen am effektivsten metabolisierten. Sabinen (1-Isopropyl-4-methylen-
bicyclo(3. 1.O)hexan) ist gekennzeichnet durch einen endozyklischen Propanring, dessen
Bindungswinkel eine Ringspannung der Molekülstruktur bewirkt, so daß die Ringöfffiung und
25 die Umlagerung in eine Propylenfunktion thermodynamisch begünstigt ist (Suckling, 1988). In weiteren Wachstumsuntersuchungen wurde überprüft, ob diese erhöhte chemische Reaktivität eine effektivere Verwertung dieser Verbindung begünstigt. In detaillierten Untersuchungen mit den Stämmen 54PinTund 65Phen, beide entweder vorgezogen auf ct-Phellandren oder Sabinen, wurden von Stamm 54pT weiterhin jeweils Sabinen und von Stamm 65Phen a-Phellandren bevorzugt metabolisiert, wenn beide Verbindungen in einem Gemisch angeboten wurden
(Abb. 3). Eine begünstigte Verwertung von Sabinen - ausschließlich bedingt durch die erhöhte
Ringspannung - konnte somit ausgeschlossen werden. Der zeitlich parallele Abbau der unterschiedlichen Monoterpene scheint die Hypothese eines einheitlichen Abbauweges zu bestätigen. Dabei besitzen die katabolen Enzyme anscheinend eine erhöhte Affinität gegenüber monozyklischen Menthadienen.
Auch in einem Gemisch der vier Isolationssubstrate (p-Menth-1-en, a-Phellandren,
a-Pinen, 2-Caren) wurde das monozyklische a-Phellandren von allen vier Isolaten als Substrat
bevorzugt verwertet. Die nächst bevorzugte Verbindung war das jeweilige Isolationssubstrat.
Dieses Merkmal konnte in Wiederholungsversuchen mehrfach bestätigt werden und
ermöglichte erstmals eine physiologische Unterscheidung der vier Stämme. Weitere Differenzierungsmerkmale bestanden darin, daß Stamm 54PinT Myrcen und Stamm 62Car
Arginin und Gluconat im Vergleich zu den anderen Stämmen nicht als Kohlenstoffquellen nutzten.
26 0.35 30 30 180 180 0.12 0.30 160 — 160 25 25 140 0.10 1140 0.25 120 20 120 20 D 0.08 0 2 0.20 100 100 0 2 0 15 15 0.06 o 80 o 0.15 o80 0 60 10 60 10 0.04 0.10 40 40 000 5 0.02 5 20 0.05 20
0 0 1 fl 0 0.00 0 0.00 12 14 16 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 30 30 0.21 180 0.32 180 I‘3 160 160 0.28 25 0.18 25 140 140 0.24 0.15 120 20 120 0.20 2 100 100 0.12 0.16 15 80 80 0.09 o 0 0 0 60 0.12 10 60 0.06 40 0.08 40 20 0.03 20 0.04 0 0 0.00 0 0.00 024681012 0 2 4 6 8 10 Zeit (d) Zeit (d)
54p111T wurden Abb. 3 Wachstum der Stämme (links) und 65Phen (rechts) auf einem Gemisch aus Sabinen (V) und x-Phellandren (A); die Stämme entweder auf Sabinen (oben) oder ci-Phe1landren (unten) vorgezogen. Kohlenwasserstoffe 2.4 und Bont
der dieser
routinemäßig methylnonan in von
1995).
in substrates Thauera 65Phen
werden. Konzentrationen. Anwesenheit verbrauch
kohlenwasserstoffe im HMN-Phase
defragrans
von Aerobe
Horikoshi 50
den
der
Ansatz
Alcaligenes Membranintegrität
5
%
hohen
1998;
Verbindungen
werden
Lage Resistenz Um
Wachstumsansätzen
Alle
Diese
(vol/vol)
Jedoch
wurden
terpenica
Kohlenwasserstoff-verwertende
in -
potentiell
1989;
van
auch
mit
ist übersättigte
Konzentrationen
Alcaligenes
Gegenwart
(HMN)
verwertet. relative
von
im
in
das
defragrans
wurde der
30
ohne
Cruden
allgemeinen
Toluol
einer
von
30
im
Sie
erste
% Werfet
mit in
Stämme
toxische
enthielten
Toleranz %
vorverdünnt.
Alcaligenes
den
eine
Detail HMN-Trägerphase
(vol/vol)
wuchsen
und
Lösung
von Beispiel
einem
wasserunlöslichen, (vollvol)
et
defragrans
oder
Zellmembranen
Abnahme
in
al. der
al.
damit
0,1
als
Gegenwart
21
Konzentrationen
an
untersucht; 1992).
Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten
p-Xylol
gegenüber
1997).
monoterpenverwertenden -
% Limonen
(Zitronenöl
für toxisch
in
zu
bedingt
Limonen
Mol
(vol/vol)
zur
In
Gegenwart defragrans wachsen.
ein
der
Stämme
Die den
Zerstörung
und
anaerobes
angesehen,
wachsen, Biomassenbildung
erhöhter
hohen
festgestellt.
wasserlöslichen
verursacht.
in Toxizität
folgenden
konnte
sie
Limonen
Bakterien.
organischen
58EuT Gegenwart
und 28
Die
in
sowie
zeigten
von
Monoterpenkonzentrationen
gegenüber
Monoterpenkonzentrationen
der Alcaligenes
Bakterium Wachstum
Fichtennadelöl),
wurden
des
u.
wird
als
Studien zu
3
wäßrigen Dies
Ätherische
die
a.
% Membranpotentials
2
von die
eine
auch
auch
Bakterien vor
Trägerphase,
g
Kohlenwasserstoffen
führt
mit
von
(vol/vol)
Protein
bereits
wurde 0,07
mit
Monoterpenen defragrans
allem
vom
in
Toleranz
die
Phase Thauera
Monoterpenoiden 10
letztlich
der
Öle,
%
Gegenwart
Monoterpene
g Stamm
durch
das
die pro
beschrieben
wurden
Protein
(vollvol)
Monoterpen.
Fähigkeit,
zu
die
Wachstumssubstrate
Wachstumsverhalten
(log
Mol 2,2,4,4,6,8,8-Hepta-
zu
verhindern,
Stämme
linaloolentis
gegenüber
die
54PinT
nur
einer
pro (Sikkema
P)
Nitratverbrauch
von
ebenfalls
Akkumulation
des
untersucht.
von
Monoterpen
in
zwischen
zu
Mol
(Isken
Aufhebung
54PinT
(Inoue
Alcaligenes
beobachtet
Isolations
Gegenwart
isolierten
Auch
wachsen.
wurden
höheren
bis
Nitrat
waren
et
ohne
und
und
und
al.
zu
in
1 Ein möglicher Resistenzmechanismus könnte in der Synthese von Cyclopropan fettsäuren bestehen, die in hoher Konzentration in Zellen von Alcaligenes defragrans nach Wachstum auf Monoterpenen gefunden wurden, nicht jedoch in Zellen, die auf Acetat wuchsen. Die physiologische Rolle der Bildung von Cyclopropanfettsäuren ist bislang nicht vollständig verstanden (Grogan und Cronan 1997).
25 Massenanzucht von Alcaligenes defragrans im Fermenter
Zur Vorbereitung von biochemischen Untersuchungen sollte eine Massenanzucht von Alcaligenesdefragrans entwickelt und etabliert werden.
Alcaligenes defragrans ist in der Lage, in Gegenwart von hohen Konzentrationen an ungesättigten Monoterpenen zu wachsen; auch die Akkumulation von bis zu 16 mM Nitrit flihrte zu keiner Hemmung während des Wachstums mit 100 mM Nitrat. Dieses Resistenz- verhalten ermöglichte eine Optimierung des bakteriellen Wachstums von Stamm 65Phen in einem pH-reguLierten 10-Liter Fermenter durch die einmalige Zugabe von 15-22 mM
Monoterpen und 100 mM Nitrat. Auf den Einsatz einer organischen Trägerphase konnte somit verzichtet werden. Die Anzucht von Stamm 65Phen wurde unter anoxischen
Bedingungen bei pH 7,0 und einer Temperatur von 30° C durchgeffihrt. Eine vollständige
Nitratreduktion erfolgte nach ca. 5-7 Tagen; dabei wurde eine optische Dichte von 2,5-3,0 erreicht, was einer Feuchtmasse von ca. 37 g entsprach (Abb. 4). Die Zellernte erfolgtejeweils unter strikt anoxischen Bedingungen.
Die maximale Denitrifikationsrate betrug 218 nmol Nitrat(mg Protein)*min* Dies entspricht nach den quantitativen Bestimmungen (Teil I-B-2.l) einer Monoterpenoxidations rate von 31 nmol Monoterpen(mg Protein)‘ ‘min* Wachstumsuntersuchungen in Kultur- röhrchen ergaben unter entsprechenden Bedingungen eine vergleichbare Oxidationsrate von 27 nmol Monoterpen(mg Protein)‘ min‘.
29 Abb.
3.
3.1
In
Wachstums aber Analysen
Verhältnis
mit Versuchsdauer
mit
kometabolischen
veröffentlichten
4
einem
auch
Metabolite
Biotransformation
Massenanzucht
zeigten
authentischen zur von
von
O 1.0
•
i
nicht
Alcaligenes
2.5
2.0
1.5 0.5
Isolimonen-Abnahme. 0.0
dem
des
die
Wachstumsansätzen
Spektren
metabolisiert.
von
0
anaeroben
Entstehung
sp3-hybridisierten
Alcaligenes
Standard
von
defragrans
25
(McLafferty
Isolimonen
50
Monoterpenstoffwechsels
Durch
einer
wurde
defragrans
Stamm
Zeit
Diese
75
mit
neuen,
und
einen
Isolimonen
diese
(h)
zu
Limonen
30
54PinT
Stauffer
100
Verbindung
Isoterpinolen
Vergleich Stamm
Verbindung
neutralen
125
die 1_
und
1989)
beobachtet.
65Phen
Abnahme
des
150 Isolimonen
Substanz
wurde
und
als
erhaltenen
im
175
Isoterpinolen
durch
10-Liter
von
während
Gaschromatographische
80 120
60V 100
40Z
20
0
im
Nitrat
wurde
Koinjektionsanalyse — 1 .
Z
v
Massenspektrums
stöchiometrischen
Fermenter.
und
der
während
identifiziert,
Limonen,
gesamten
des einem C 1-sp-hybridisierten Isomer von Terpinolen. Bei der beobachteten Transformation von Isolimonen3 zu Isoterpinolen kommt es zu einer Umlagerungder Doppelbindung innerhalbder Isopropenyl-Seitenkette. Die mikrobielle Bildung von Isoterpinolen erfolgte nur in physiologisch aktiven Kulturen und in Gegenwart verwertbarer Monoterpene wie z.B.
Limonen, a-Pinen, a-Phellandren, a-Terpinen und y-Terpinen. In kometabolischen Ansätzen mit den Wachstumssubstraten Glutamat oder Gluconat wurde keine Abnahme oder
Biotransformation von Isolimonen beobachtet. Alle vier A. defragrans Stämme katalysierten diese allylische Isomerisation der Doppelbindung und zeigten somit eindeutig, daß sie zu
Transformationen innerhalb des Kohlenstoffgerüstes von Monoterpenen befähigt sind.
Thauera terpenica 58EuT,ein mit Eukalyptol isoliertes Bakterium, war ebenfalls in der
Lage,unter nitratreduzierenden Bedingungenmit Limonen und einigenweiteren Monoterpen kohlenwasserstoffen zu wachsen (Foß 1998; Foß et al. 1998). Im Gegensatz zu den
A. defragrans Stämmen wurde jedoch das Wachstum von T. terpenica 58EuT auf Limonen in Gegenwart von Isolimonen vollständig unterdrückt.
3.2 Neutrale Metabolite des Abbaus bizyklischer Monoterpene
Während des anaeroben Wachstums von A. defragrans auf verschiedenen bizyklischen
Monoterpenen (Sabinen, a-, f-Pinen, 2-, 3-Caren) wurde eine Akkumulation von neutralen
Produkten bis zu einer Konzentration von 30 j.tM beobachtet. Diese mikrobiellen
Transformationsprodukte wurden anhand von GC-MS-Analysen als Monoterpene, vor allem
Menthadiene, identifiziert (Abb. 5). Azyklische sowie (sauerstoff)-funktionalisierte Mono terpene wurden, mit Ausnahme von Eukalyptol, nicht gefunden. Eine mögliche abiotische Transformation der bizyklischen Monoterpene konnte durch die Analysen von nichtbeimpften Kontrollansätzen ausgeschlossen werden. Ähnliche Transformationsprodukte wurden auch in den ursprünglichen Monoterpenanreicherungen gefunden (Harder und Probian
1995).
31 Abb.
auf
bizyklischer Monoterpene Strukturen Teil
und
eine (Shukla
Verbindungen
Gibbs
Beobachtung
Grabe bizyklischen
für
entsprechende
5
Die
1998).
13-Phellandren
Neutrale
a-Terpinen die
p
und
beobachtete
1992).
zu
industrielle
Strukturen
Diese
des
monozyklischen
Bhattacharyya
über
ausgeht.
Metabolite
Auch
Substraten
gleichzeitigen
Transformation
das
Hypothese
Bildung
sind
beim
Synthese
y-Terpinen
Verbenen
Entsprechende
monozyklische
des
bekannt
aeroben
deutet
Abbaus
von
1968).
Verbindungen
vom
Abbaus
von
monozyklischen
von
(Erman
monozyklischen
Abbau
bizyklischer
auf
mono-
Ebenso
3-Caren
cz-Terpinyl-Kation
thermisch-
a-Pinen
Terpinolen
von
eine
von
1985;
32
und
hin,
mono-
erfolgt
anfängliche
a-Pinen
Monoterpene
zum azyklischen
von
Cruz
Menthadienen
und
2,3-bis-Methylene-
bicyclo{3.2.
Intermediat
und
monozyklischen denen
die
Costa
Limonen
in
säure-katalysierte
bizyklischen
Pseudornonas
(McCaskill
Biosynthese
Umlagerung
dann durch
Monoterpene 1
et
]octan
al.
scheint
während
A.
der
1996)
defragrans
weitere
Limonen und
p-Cymol
bestätigt
Eukalyptol
Strukturen,
der
der
Stamm
und
des
genutzt
Croteau
Umlagerungen
bizyklischen
werden
bizyklischen
Wachstums
Abbau
Stamm
PL
postuliert
durch
(Bauer
wurde
wobei
1997,
zum
der
die monozyklische Menthadiene scheinbar bevorzugt werden. Die kometabolische Studie mit
Isolimonen belegt, daß A. defragrans zu Transformationen innerhalb des Kohlenstoffgerüstes von Monoterpenen befähigt ist. Eine initiale Aktivierung durch Hydratisierung der Alkene zu den entsprechenden Alkoholen ist unwahrscheinlich, da Monoterpenalkohole in Wachstums- ansätzen nicht detektiert wurden und die Alkohole das mikrobielleWachstum von Alcaligenes defragrans auf Monoterpenen spezifisch hemmen (Foß 1988; Teil II-B-4). Ähnliche
Beobachtungen einer inhibitorischen Wirkung von Benzylalkoholen auf den anaeroben Abbau von Toluol in nitrat- und sulfatreduzierenden Bakterien wurden beschrieben (Altenschmidt und Fuchs 1992; Rabus und Widdel 1995).
Eine Aromatisierung von Menthadienen zu dem Dead-End-Produkt p-Cymol wurde auch in nitratreduzierenden (Harder und Probian 1995) und in methanogenen Anreicherungen
(Harder und Foß 1999)beobachtet. Einep-Cymol-Bildung durch anaerobeTransformation von c-Terpinen wurde ebenfalls für Bakterien des Intestinaltraktes von Raupen der Mottenart
Spodoptera litura Fabricius beschrieben. Aufgrund der Detektion von 4-Isopropyl-1,3- cyciohexadienmethanol, ein aerobes Transformationsprodukt von a-Terpinen, wird jedoch eine Anwesenheit von Sauerstoff während des Versuchs vermutet (Miyazawa et al. 1996).
33 3.3 Die
des Metabolite verlaufen. sp2-hybridisierten
aus p-Cymol-verwertenden, freie mittels (22
gefunden. identifiziert. sowohl
von al. Anhand den
für gewachsenen Zellen nicht
aerob spezifisches Verbindung Zellsuspensionen
1999).
der bisher
Menthadiens
mM)
Geraniumsäure
470
organische
zugegebenen
aber
auf
Isolierung
Nach
Massenanzucht
beobachtet.
Mit
GC-MS,
in
von
1iM;
wurden
Zur
Limonen
durchgeführten
Azyklische
den in
p-Isopropylbenzoesäure
und
für
der
GC-
Monoterpen-limitierten
ariaerobem
Zellen
Die
Produkt
weiteren
Zellen
im
den
Säuren
Isolierung
könnte
GC,
und die
C1-Atom sowohl
und
Gegensatz
und
aromatische
gewachsene
Eine
Wachstumssubstraten
bei
wurde
anaeroben
als
HPLC-Untersuchungen
Geraniumsäure Isolimonenumwandlung
zelifreien
HPLC
des auf
Identifizierung biochemischen
mit
nitratreduzierenden der
Akkumulation
über
Wachstum auch
Untersuchungen
aus
eventuell
die
von
als
anaeroben zehn
HPLC-Methode
dazu Zellen
die und
im
Bildung
Edukt
Zellen
Abbau
Extrakten
Verbindung
Geraniumsäure
Kohlenstoffatomen Kulturüberstand,
Bildung
durch
wurden
gebildete
wurde
vom Zellen
mit
für
akkumulierte
enthielten
Charakterisierung
der
Monoterpenabbaus
der
dieser
saurer
die
zur
Koinjektionsanalyse Nitrat Stamm
eingehend
einer
Monoterpene
Geraniumsäure
nachgewiesen.
enthalten
Bakterien
ebenfalls
im
zentrale
Cuminsäure
ionische
34 Substratpräferenz, wurde bei
Säure
sprechen
Kulturüberstand
keine
ionischen,
wurde
Metabolite
65Phen
und
1
in in
untersucht
iM
gezeigt,
Abbaureaktion.
wurde
isoliert. Geraniumsäure.
den
Monoterpenverbindungen
Konzentrationen
nachgewiesen
waren, in
einem
erstmalig
der
sollte
lag.
als
für
Anaerob
Zellen
den
auch (p-Isopropylbenzoesäure)
intrazellulär
gefunden.
Abbaureaktionen
nur
daß
auch
Neben
Die
Überschuß
ein
mit
werden.
wobei
Wachstumsüberständen
in
in
die
diese in
bis nur
eine
nachfolgenden gebildeten
mit
aus
auf
Menthadien
authentischen
aufgefundenen
Nitrat-limitierten
(Harms
Die
zu
den
etwa
Die
Acetat
Limonen
Verbindungen
dem ionische
von
die
fixierten
einer
initiale
an auf
Bedeutung
2
Kulturüberstand
25
Nachweisgrenze
1998,
Säuren
wurden
und
jiM a-Phellandren
Konzentration
a-Phellandren
und
untersucht.
gewachsenen
Substanz
Aktivierung
Verbindung
mit
Studien
Nitrat
Standards
neutralen
Harms
gefunden.
20
wurden
nicht
Zellen
Zellen,
wurde
einem
dieser
1iM,
von
und
mit
als
et
in 4.
und In Zellen Massenanzucht Untersuchungen vorhandenen
späten
mit metabolisierten
Voraussetzungen untersuchen. Abb.
hitze-inaktivierten
Phellandren,
Untersuchungen
einer
Nitrat
6 — exponentiellen
Zellsuspensionsversuche
.l0
•
Die
vom
Untersuchungen
spezifischen
quantitativ
untersuchten
1
5
0 die Elektronenakzeptor
Stamm
weder
weiterhin
eine
. •
V7
zu
0
geschaffen,
Zellen
mit
den
Denitrifikation
Wachstumsphase
65Phen
Rate
bestimmt
0
Nitrat
v
dichten
angegebenen
Zellsuspensionen
in
(geschlossene
physiologisch
10
von
dichten
noch
die
mit
Zellsuspensionen
123
V
werden,
(Nitrat)
Zellsuspensionen Umsetzung
das pmoF(mg
mit
mit
einer
Zeitpunkten
20
Symbole) unter
zugegebene
Speicherstoffen
Alcaligenes
um
0
v
aktiv
im
Zeit
reduzierten
limitierenden
strikt
zu
Fermenter
Protein)‘ 35
(h)
.
waren. 30
von v
überprüfen,
extrahiert
von
sollten
anoxischen
mit
Monoterpen
Monoterpenen
Stamm
defragrans
Nitrat
Um
nativen
min1. als
angezogen.
0 V
die
40
Menge
wurden.)
Elektronendonor
zu
Umsatzraten
ob 65Phen.
und
Bedingungen
Durch
Zellen
verhindern,
die
verbrauchten
(Abb.
0
an
Die
geernteten 50
in
(Einzelansätze
Hitze
(offene
Limonen
Zellen
V.o.5
0.
Zellsuspensionen
6).
von
inaktivierte
daß
geerntet.
Damit
erfolgte, 15
1.0 Symbole) 0.0 .
Zellen
wurden o-Phel1andren
c&Phellandren
während
relativ
waren
mit
v
wurden aus
und
Zellen
in
reinem
zum
der der
der
die
zu Die Biomassen aus den Nitrat-limitierteri Fermentationen enthielten neben der
Geraniumsäure auch Restmengen an Monoterpen (Wachstumssubstrat), möglicherweise assoziiert an die Lipidphasen der Zellen. Solche auf a-Phellandren gewachsene Zellen wurden flur Untersuchungen zum Abbau der intrazellulär akkumulierten Geraniumsäure in dichten
Zellsuspensionen verwendet. In dem Suspensionsansatz ohne Nitrat stieg die Konzentration an Geraniumsäure während des Untersuchungszeitraumes von 101 j.iM auf 370 M. In der denitrifizierenden Zellsuspension wurde ein anfänglicher Anstieg der Geraniumsäure bis zu 195 jiM beobachtet. Nach dem Verbrauch des Nitrats stieg die Konzentration auf 341 1.tM. Die Bildung von Geraniumsäure ist möglicherweise auf den Abbau von Restmengen an a-Phellandren zurückzuflihren. Eine Verwertung der intrazellulär gebildeten Geraniumsäure setzte in der denitrifizierenden Suspension nach dem Verbrauch von mehr als 16 mM Nitrat ein. Am Ende des Untersuchungszeitraumes wurde in dem denitrifizierenden Ansatz eine
80%ige Abnahme der intrazellulären Geraniumsäure nachgewiesen.
Die bisher gefundenen Mengen an Geraniumsäure waren gering im Vergleich zu den angebotenen Mengen an Monoterpen. In Zellsuspensionen mit einer limitierten Menge an
Nitrat wurde der Einfluß von unterschiedlichen Monoterpenen auf die Bildungsrate von
Geraniumsäure untersucht. Ausgehend von den zyklischen Monoterpenen, ct-Pinen, Limonen und a-Phellandren, bildeten die denitrifizierenden Zellen 50, 54 und 68 i.LMGeraniumsäure innerhalb von 48 h. Die azyklische Verbindung 3-Myrcen hingegen erbrachte die Synthese von
508 iM Geraniumsäure; dies entsprach einer Transformation von 13 % des eingesetzten
Substrats. Zellsuspensionen mit unterschiedlichen Konzentrationen an 3-Myrcen zeigten eine enge Korrelation zwischen der Bildung von Geraniumsäure und der angebotenen Menge an
(-Myrcen. Mit den weiteren azyklischen Monoterpenen, f3-Citronellen oder 3-Ocimen, wurde keine Bildung der Geraniumsäure beobachtet. Anhand von GC-Analysen wurde eindeutig gezeigt, daß die in Gegenwart der zyklischen Monoterpene gebildeten Mengen von Geraniumsäure nicht auf eventuelle Myrcen-Verunreinigungen dieser Verbindungen zurückzuführen waren.
36 Nach
5.
anschließender beobachtet, zu kurzer 24
beobachtete 52 Extrakte Inkubation
ToIuol-Aktivierung, Inaktivierung spezifische
49
Zellsuspensionen anaeroben
Monoterpenen Reaktion eine
(Croteau Zellsuspensionen
Isomergemisch Stämmen Geraniumsäure Alken-Transforrnation
über
pmoI(mg
pmol(mg
h
Umkehrung
anaerobem
Anaerobe
umgesetzt
Mit
Die
lag-Phase
90
wäre
zeigten
1987;
nicht
%
Umsetzung
Aktivierung
wobei des
der
Aktivität
Bildung
Protein)*min
der
Protein)‘min‘,
in
Ultrazentri
eine
mit zu
Gibbs im
Isolierung
als
Extraktes
der
Geraniumsäure-Bildung.
Umsetzung
wurden. Aufschluß
konnte dem Geraniumsäure
eine der
insgesamt
zellfreien Nerylsäure
Dezyklisierung in
Wachstumssubstrat
die
löslichen
erfolgte
1988). Gegenwart
der der
pflanzlichen
entwickelt
Verdünnungsfaktor
zeitlich
in
fugation
von
eindeutig
zyklischen
von
für Benzylsuccinat-Synthase, Während
ähnlich
bestimmt
Extrakten
Ein
6
der
nur
nichtaromatisierten
Fraktion
von
erhältlich.
bei
zehn Geraniumsäure
%
lineare
wurde nachgewiesen
Abbau
Zellen
über
in
Monoterpenen
einer
von
präparierten
und des
eine
Biosynthese
Monoterpene
Gegenwart
dieser
wurde
Minuten
konnte
eine
wiedergefunden.
die
eingesetzten
Nitrat
Dieses
verwertet.
der Proteinkonzentration
etabliert Umsetzung
Die
Transformation
von
katalytische
kationische
entsprechend
(Leuthner
intrazellulär 37 Zeit
gemessene
der
werden.
Stamm
wurde
Isomergemisch
bei
nachgewiesen.
Rohextakten
von
erste
von
Kohlenwasserstoffen
werden.
in
betrug
erfordert
Mit 950
f3-Myrcens
vitro
dem
von
Myrcen
et
erstmalig
Zwischenstufe 65Phen
zyklischen Aktivität
in
In
Umsatzrate
der gebildeten
al.
C
von
vitro
die
eine
kinetischen
Schlüsselenzym
f3-Myrcen
1998).
Dieses
tlihrte
eine
Umsetzung
von
von
wurde
zyklischen
Geraniumsäure Geraniumsäure-Bildungsrate
und
Enzymtest mittels
ein
niedrigere
der
Ringöffuung.
(10
Thauera
Geraniumsäure
Monoterpenen
10
zu
ist ermöglicht
benötigte ionisches
von
-Myrcen-Umsetzung
denkbar
mM)
Studien
vergleichbar
mgml‘.
zu
einer
French-Press
gefunden.
von
den
und
für
Aktivität.
Geraniumsäure
aromatica
der
innerhalb
A.
vollständigen
3-Myrcen
Als
(Abb.
kein Produkt
wurde
die
ist
azyklischen
die
Verdünnte
defragrans
anaeroben
wurde
mögliche
anaerobe
darstellt
mit
In
nur
Nitrat.
weitere
7),
nach
und
von
Die
mit
den der
der
die
als
zu
in Aufklärung dieser Reaktion und ihre Bedeutung bei der initialen Aktivierung der nichtpolarisierten C-C-Doppelbindungen von Alkenkohlenwasserstoffen auf der Grundlage von enzymatischen Untersuchungen, die möglicherweise eine Isolierung der beteiligten
Enzyme erlauben.
Abb. 7 VorgeschlageneRingöffnungsreaktionzyklischer Monoterpene.
6. Ökologische Aspekte
Alcaligenes defragrans ist in der Lage, mit definierten Monoterpengemischen zu wachsen. In
weiteren Studien mit verschiedenen ätherischen Ölen als Beispiele für natürliche Monoterpen
gemische sollte die ökologische Relevanz der ariaeroben Monoterpenoxidation bewertet
werden. Erste Untersuchungen zum anaeroben Abbau von FichtennadeLölwurden bereits von
S. Foß (1998) beschrieben.
Die natürlich vorkommenden ätherischen Öle variieren in ihrer chemischen Zusammensetzung: Einerseits können sie fast ausschließlich Monoterpenkohlenwasserstoffe enthalten, andererseits einen hohen Anteil an Monoterpenoiden (Formcek und Kubeczka
1982). Für die Untersuchungen wurden Zitronenöl, Kiefernnadelöl und Petersiliensamenöl als
Vertreter der ersten Gruppe und Campher-, Salbei-, Fenchel-, Minz- und Thymianöl als
Beispiele für die zweite Gruppe ausgewählt. Um potentiell toxische Wirkungen von Inhaltsstoffen dieser Öle abzuschätzen, wurden sie in zwei unterschiedlichen
Konzentrationen, sowohl in HMN verdünnt als auch unverdünnt, zugegeben. Die Abbaubarkeit dieser ätherischen Ölen unter anoxischen, denitrifizierenden Bedingungen wurde
38 in Reinkulturen von Alcaligenes defragrans und in Anreicherungskulturen geprüft. Als
Inokulum für die Anreicherungskulturen diente Belebtschlamm (KläranlageLintel, Osterholz Scharmbeck)und Waldgrabenschlamm(Hambergen).Der Grabenschlamm erwies sich dabei als ungeeignetes Inokulum, möglicherweise zurückzuführen auf endogene toxische lnhaltsstoffe.
GC-MS-Analysen der ätherischen Öle und GC-Analysen der Öle nach dem mikrobiellen
Wachstum ermöglichtendie Identifikation der Komponenten, die biologisch verwertet wurden.
Zur Überprüfung, ob die angereicherten Bakterien phylogenetisch verwandt waren mit den
A. defragrans Stämmen, wurde die Zusammensetzung der Bakterienpopulationen mittels in situ Hybridisierung mit Gruppen-spezifischen Oligonukleotidsonden und der Spezies- spezifischen Ade441-Sondefür Alcaligenes defragrans (Rabus et al. 1999) analysiert.
6.1 Ätherische Öle als Wachstumssubstrat für Alcaligenes defragrans
Eine Nitratreduktion durch Alcaligenes defragrans Stamm 54pT konnte auf allen Ölen in
Gegenwart der HMN-Trägerphase beobachtet werden. Die anschließenden GC- und GC-MS
Analysen zeigten, daß in allen Ölen, mit Ausnahme von Minz- und Thymianöl, eine
Verwertung der Monoterpene erfolgte, die schon früher als Wachstumssubstrate identifiziert wurden. Wachstum und eine vollständigeReduktion der eingesetzten 10 mM Nitrat wurde nur bei den hauptsächlich aus ungesättigten Monoterpenkohlenwasserstoffen bestehenden Zitronen-, Kiefemnadel- und Petersiliensamenöl beobachtet. Die unvollständige Nitrat reduktion mit Campher-, Salbei-und Fenchelöl ist vermutlich auf einen Mangel an verwert baren Monoterpenen innerhalb dieser Öle zurückzuführen, wohingegen Inhaltsstoffe des Minz- und Thymianöls anscheinend die Verwertung der nutzbaren Monoterpenen verbindungen hemmten. Ohne HMN-Phase erfolgte Wachstum und eine vollständige Nitratreduktion nur mit Zitronen- und Kiefernnadelöl. Im Vergleich zu den HMN-Kulturen wurde ein geringerer Nitratverbrauch beobachtet, wenn Petersilien-, Fenchel-, Minz- oder Thymianöl direkt zugegeben wurde. Dies läßt auf eine toxische Wirkung dieser Öle auf
Alcaligens defragrans bei erhöhten Konzentrationen der Öle schließen.
39 p-Cymol 6.2
Ausgehend
innerhalb vorlagen.
anoxischen Abbau
Untersuchungen
p-Methoxypropenylbenzole toxischste
ermöglichten, Petersiliensamen-,
Effekte
Monoterpenalkoholen
einer Salbei-,
organismen
Monoterpenen
Campher
wurden Thauera charakterisiert
Antibiotika propenyl)-benzol beobachtet
HMN-Trägerphase
Ätherisclie
von
Die
Verbindungen,
verschiedener
Minz-,
in
Hauptsächliche
und
von
und linaloolentis).
aller
den vom Thymol
Bedingungen
werden.
einzigen
metabolisiert
und
Thymol.
waren vier
Bomeol
Monoterpene
Anreicherungskulturen durch
Petersiliensamen-
Belebtschlamm
isolierten
mit
zwei
Campher-,
Monaten
Öle
(1,2,3,4-TMPB)
wurde
aeroben
die
Zitronenöl
Inhaltsstoffe,
Öle,
Erst
beobachtet.
im
die
verwandter
als
Zusätzlich
mit
aromatischen Komponenten
vorverdünnt
Bakterienstämme
bisher
Campher-,
wurden,
kürzlich
in
die Wachstumssubstrat
p-Cymol
zu
identifiziert.
und
Bakterien
Salbei-,
den
führten
erfolgreichen
eine
nur
und und
Fenchon
Methoxypropenylbenzole,
z.B.
wurden
wurde verschiedenen
entsprachen
Verbindungen
für
konnte
Campheröl
wurden.
mit
Salbei-
Insektizide Fenchel-
erfolgreiche Kiefernnadelöl.
zu
des
alle
wurde
Polymethoxypropenylbenzole
ein
Fenchelöl
wachsen
eine zwei
Thymianöls
aerobes ätherischen
im
(Alcaligenes
in
Anreicherungen,
und
40
von
und
Fenchelöl
Abnahme
den
Bakterien
verwertbare
den
Apiol
Minzöl
für
Elemicin
Anreicherung
Ölen (Harms Bakterium
Knobloch
teilweise
Minzöl
Anreicherungen
Wachstumssubstraten
Die
Anreicherungskulturen
Öle,
und
sind
defragrans,
durch
sowie
isoliert,
von zurückzuführen.
nicht
1998;
Myristicin.
mit
ist
verwertet.
und
Kohlenstoffquellen, die
Estragol,
et
beschrieben
wenn
Bornylacetat, möglicherweise
Ausnahme
aromatischen
al.
die
auf
erfolgte
1,2,3 auch
Harms
die
(1986)
sie
Thauera
angereicherten
den
in
mit
im
cis-
‚4-Tetramethoxy-5-(2-
Petersiliensamenöl
Eine
der
in
ohne
Petersiliensamenöl,
et
(Dagley
Anreicherung
und
hohen
Petersiliensamenöl
von HMN Thymol
Lage
Hingegen
Abnahme
al.
der
Verbindungen
cx-,
terpenica
trans-Anethol
HMN-Phase
auf
Thymianöl,
1999).
wenn
sind,
bisher
Gehalt
verdünnt
f3-Thujon, 1971).
toxische
als
Mikro
waren
unter
sie
dieser
Der
das
mit
und
auf
In
an
ist
in Die molekulare Populationsanalyse ergab, daß die erhaltenen denitrifizierenden Bakterienpopulationen nicht von den bisher auf Monoterpenen isolierten Stämmen
(Alcaligenes defragrans, Thauera terpenica und Thauera linaloolentis) dominiert wurden; dies ist ein Anzeichen für die weite Verbreitung dieser metabolischen Fähigkeit der anaeroben
Monoterpenoxidation unter Mikroorganismen. Diese Beobachtung steht im Einklangmit den zuvor von S. Foß (1998; Teil II-B-5) durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl monoterpenverwertender, nitratreduzierender Bakterien. MPN-zählungen
belegten, daß ca. 1 % der nitratreduzierenden Gesamtpopulation im Belebtschlamm und
nahezu 100 % der Bakterien eines Fichtenwaldbodens zur Monoterpenoxidation befähigt
waren.
Die beobachtete Diversität steht im Kontrast zu der phylogenetisch selektiven
Anreicherung der vier Alcaligenes defragrans Stämme. Um zu überprüfen, ob möglicherweise
die beschriebene Monoterpentoleranz dafür verantwortlich ist, wurden nochmals Anreicher
ungskulturen mit Belebtschlamm (KläranlageLintel, Osterholz-Scharmbeck) gestartet, in denen
die Monoterpene olme organischeTrägerphase zugesetzt wurden. Innerhalb von fünf Wochen
konnte bakterielles Wachstum und ein Verbrauchvon mehr als 30 mM Nitrat mit p-Menth-1-
en, allen getesteten Menthadienen (a-Phellandren, ct-Terpinen, y-Terpinen und Limonen)
sowie mit Geraniumsäure beobachtet werden. Die Monoterpenverbindungen a-Pinen,
p-Cymol und Menthol führten zu keiner erfolgreichen Anreicherung innerhalb des Unter
suchungszeitraumes. Die anschließende molekularökologische Analyse der Anreicherungen
bestätigte den Einfluß der erhöhten Monoterpenkonzentration auf die phylogenetische
Zusammensetzung der sich entwickelnden Bakterienpopulationen. Während im Belebt-
schlamm nur eine geringe Anzahl an Alcaligenes defragrans-verwandten Bakterien gefunden
wurden, machten diese nach erfolgter Anreicherung den wesentlichen oder sogar den dominanten Anteil innerhalb der mikrobiellenPopulation aus.
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(1960)
265-275.
Fass,
Fass,
Fass,
Bacteriol.
Mechanismus
Bhattacharyya, Remberger,
ofdegradation
Singsaas,
E.
E.
E.,
Degradation
5:
H.,
aeriouvfer.
(1
(1964b)
III.
II. und
Remberger,
92-10
79: 964a)
of
pathway
Furihata,
Die
Reinigung
Eigenschaften
426-434. an
U.
E.L. 1.
Rolle des
Untersuchungen
Untersuchungen
isoprenoid-degrading
P.K.
of
(1963) of
Tetrahedron
Isoprenoidabbaues.
U.
K. isoprenoid
(1995)
der a-
in
und
(1963)
(1968)
and
(1996)
Kohlensäure.
the
Eigenschaften
Untersuchungen
der
-pinenes
Why
Untersuchungen
biosynthesis
Microbial
Lett.
compounds
(3-Isohexenylglutaconyl-CoA-Hydratase Simultaneous
über
über 55
plants
37:
Biochem. den
den
Biochem. bacterium,
by
Biochem.
der
7979-7982.
bakteriellen
bakteriellen
soil
transformation
by
emit über
Geranylcarboxylase.
of
Operation
Pseudomonad
über
Z. microorganisms.
Z.
Z.
isopentenyl
Fseudomonas
den
341: isoprene.
338:
341:
den
Abbau
Abbau
23-34.
baktenellen
245-264.
of
bakteriellen 3
5-44.
of
the
Nature
(PL-strain).
terpenes. von
von
diphosphate
mevalonate
1.
citronellolis
Biochem.
Isoprenoiden.
Isoprenoiden.
Isolation
Abbau
Abbau
374:
Part
und
Indian.
Z.
and
and
769.
von
von
XI.
l
in
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Ward,
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biotransformation
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biocatalysts;
York,
J. from
contains 2092-2
monoterpenes
Chem.
Werf,
Werf,
Werf,
Werf,
Bacteriol.
Hinz,
P.,
M.,
Rhodococcus
Courtney,
Int.
und
Oxfort,
M.J.,
Ecol.
102. M.J., Heyndrickx, in
M.J.,
M.J.,
Witt,
into a
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whoLe-ceIl
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carvone,
S.,
from
(1996)
de de
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25
5052-5057.
Bacteriol.
ofmonoterpenes.
degradation
Abraham,
van
eiythropolis
83-2598.
Bont,
Bont,
M.,
coastal
Syst.
Langenheim, hydrolysates
in
H.J.,
and
den
Bordetella
pp. Singapore,
organic
Vancanneyt,
K.,
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reassessment
J.A.M.,
AppI.
de
Tweel 46:
23
W.R.,
redwood
de
pathway
Bont,
1-234.
DCL
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Bont,
chemistry
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trematum
Tokyo.
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Leak,
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belongs
phospholipid
for
of
Biochem.
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Alcaligenes
limonene.
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sempervirens)
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a
Eng.
novel
Rhodococcus
de
Limonene-1,2-epoxide
for
fractions
Appl.
C.P. isolated
Biotechnol.
Vos,
den
of
Amsterdam,
Opportunities
dass
microorganisms
in
Nitrosornonas
itrflcans
van
P.,
Environ.
screening
HL.
in
from
of
of
der
Falsen,
whole-cell
erythropolis
epoxide
pseudomonads: (1996)
55:
Beek,
wounds
Rüger
Lausanna,
Microbiol.
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for
E.,
in
europaea
hydrolases.
Fatty
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Kersters,
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and microbial
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59 Wood,
Yabuuchi,
Zeidler,
Zengler,
Zimmer,
Zimmerman,
piechaudii Achroinobacter ca1fornia
of
denitrficans S.E.,
synthesized
von
15-23.
34-39. the
vegatation.
K.
J.G.,
W.
Achrornobacter
production E.,
Kohlenwasserstoffen.
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P.R., (1997)
Lichtenthaler,
Kawamura,
leaflitter.
(Kiredjian
Geophys.
Chatfield,
via
(Rüger
Mikrobielle
J.F.,
Funktion
and of
the
CO
Langenheim,
Biochem.
and
Achromobacter novel
ruhlandii
Y.,
et
R.B.,
Res.
and
H.K.,
Tan)
und
Diversität
al.
isopentenyl
Kosako,
H2 Dissertation,
Lett.
Fishman,
Bedeutung
)
com.
Syst.
from
May,
(Packer
com.
J.H.
5:
nov..
679-682.
Ecol. the
xylosoxidans und
Y.,
(1995)
nov.,
J.,
H.U.
pyrophosphate
oxidation
60
and
Universität Microbiol.
der
Crutzen,
23:
neuartige
Ezaki,
and
Loss
Isoprenabgabe 581-519. (1997)
Vishniac)
Achromobacter
of
T.
of
(Yabuuchi P.J.,
Fähigkeiten
Immunol.
hydrocarbon
Bremen.
monoterpens
Is
(1998)
Hanst, pathway?
comb.
isoprene
durch
and
42:
P.L.
Emendation
beim
nov.,
emissions
429-438.
xylosoxidans
Yano)
Z.
emitted
Pflanzen.
from (1978)
Naturforsch.
anaeroben
Achromobacter
and
Umbellularia
Estimates
from
by
of
proposal
BiuZ
subsp.
Abbau
plants
genus
52c:
27:
on Teil II: Publikationen
A Publikationsilste mit Erläuterungen
Diese Dissertation beruht auf den folgenden flinf Publikationen bzw. Manuskripten. Die angefilgtenErläuterungensollen meinenBeitrag an derjeweiligen Arbeit aufzeigen.
1. A!caligenes defragrans sp. nov.,description offour strains isolated on alkenoic monoterpenes ((+)-menthene, ct-pinene, 2-carene, and a-phellandrene) and nitrate
SabineFoß, Udo Heyen and Jens Harder
Durchfiihrung der Fettsäure-Analytik, der quantitativen Wachstumsversuche und der Experimente mit Terpengernischen.RedaktionelleMitarbeit am Manuskript.
2. Cometabolic isoterpinolene formation from isolimonene by denitrifying
AIcaligenes defragratis Udo Heyen and Jens Harder
Entwicklung des Konzepts und Durchfiihrung aller mikrobiologischen und analytischen
Arbeiten. Redaktionelle Mitarbeit am Manuskript.
61 3.
Entwicklung
Arbeiten.
4.
Gemeinsame
Arbeiten
Anreicherungen.
5.
Gemeinsame
Arbeiten Redaktionelle
B
Geranic metabolism Udo
Monoterpene Udo
Denitrification Jens
Publikationen
Gemeinsame
Heyen
Heyen,
zur
zum Harder,
Entwicklung
des
Entwicklung
Mitarbeit
acid
Monoterpenkohlenwasserstoff-Toleranz
Redaktionelle
anaeroben
and
Konzepts
Christina
in
Udo
formation,
tolerance
A
Jens
Erstellung
icaligen
on
Heyen,
am
des
Harder
essential
des
Probian,
Manuskript.
Abbau
und
Konzepts
Mitarbeit
Konzepts
Christina
of
an
es
des
Durchfiihrung
denitrifying
initial defragrans
Sabine
Manuskripts
oils ätherischer
am
mit
Probian
mit
reaction
Foß
Manuskript.
J.
J.
62
Harder.
Harder.
and Alcaligenes
and
aller
Öle
mit
Jens
ofanaerobic
Sabine
J.
sowie mikrobiologischen
Durchfiihrung
Durchführung
Harder.
Harder
in
Foß
defragrans
den
ein
monoterpene
Teil
Reinkulturen
aller
aller
der
und
mikrobiologischen
mikrobiologischen
GC-Analysen.
analytischen
und
den Alcaligenes
Max-Planck-Institut *
Corresponding
alkenoic
defragrans
monoterpenes
author
Systematic
for
Marine
Sabine
a-phellandrene)
and
sp.
Microbiology,
FoB,
Applied
nov.,
((+)-menthene,
Udo
Microbiology
description
Heyen
1
63
Celsiusstr.
and
and
Jens
nitrate
(1998)
a-pinene,
of
1,
Harder*
0-28359
four
21:
237-244
strains
Bremen,
2-carene,
isolated
Germany
and
on Abstract
Four pseudomonad strains 5lMen, 54Pin, 62Car and 65Phen were recently isolated on the monoterpenes (+)-menthene, a-pinene, 2-carene and a-phellandrene as sole carbon source and nitrate as electron acceptor. These bacteria were characterised. The motile, mesophilic, Gram-negative rods had a strictly respiratory metabolism.
Monoterpenes as carbon sources were completely mineralised to carbon dioxide. The physiology of all strains was very similar, but displayed an individual utilisation preference for the isolation substrate. The fatty acid composition of whole cells showed a high degree of similarity to that of Alcaligenesfaecalis. Comparative 16S rDNA data analysis placed the isolates into the beta-subclass of Proteobacteria in a common offshoot together with Alcaligeizes and Bordetella species. On the basis of these characteristics, the strains are described as a new species belonging to the genus 12141 Alcaligenes, A. defragrans sp. nov., with strain 54Pin (DSM T) as type strain.
64 Introduction
Monoterpenes are an important natural source of alkenoic hydrocarbons. They are the primary product of the monoterpene biosynthesis in plants. Naturally occurring hydroxylated monoterpenes are made by the activity of plant hydroxylases on alkenoic monoterpenes.
Oxygenation is the typical activation reaction for alkenes in general,because these compounds with a carbon-carbon double bond as sole functional group are as such not degradableon the
(3-oxidationpathway. Enzymes of aerobic microorganisms, mono- and dioxygenases, require molecularoxygen as a cosubstrate to transform alkenes into degradablesubstances (Hartmans et a!. 1989; Hartmans et al. 1991; Miura and Dalton 1995). The degradation of alkenoic monoterpenes has been studied in aerobic microorganisms, primarily with a-pinene. Strains that were isolated on a-pinene as sole carbon sources were identified as species of the genera
Pseudomonas (Bhattacharyya et a!. 1960; Trudgill 1986), Mycobacterium (van Ginkel et al.
1987) and Nocardia (Griffiths et al. 1987a) and as Serratia marcescens (Wright et al. 1986).
Several degradation pathways have been proposed on the basis of accumulated metabolites, but only Griffiths et al. (1987a,b) studied the microbialprocess on the subcellular level. Their studies suggest the presence of two catabolic pathways in microorganisms: (I) a-pinene monooxygenation yields a-pinene oxide,where three rings are cleaved in an isomerisinglyase reaction and the product cis-2-methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienal is further degraded, or (II) the initial reaction may involve a ring cleavageof the cyclobutane in ci-pinene, thus producing limonene and other monoterpenes. Whether oxygenases are essential for the further degradation of these initial products, has not been investigated.
Alkenes are also degraded in the absence of molecular oxygen, in methanogenic communities (hexadecene: Schink 1985) and by sulfate- and nitrate-reducing bacteria
(hexadecene: Aeckersberg et al. 1991; heptadecene: Gilewicz et al. 1991). The catabolic pathway has only been revealed for acetylene, an alkine (Rosner and Schink 1995). Recently we reported that alkenoic monoterpenes can serve as sole carbon sources for denitrifying bacteria (Harder and Probian 1995). The isolates acquired on the alkenoic monoterpenes
(+)-menthene, ci-pinene, 2-carene, and ci-phellandrene are described in this contribution.
65 Materials
(Widdel 0.5
trace mg ZnSO47H,O, NaHCO3
(Widdel
reduced
ascorbate source.
FeS the
carrier (4 prepared
in shaker to phase 15
and
in Substrate
an
mM
improve
gNH4C1,
ml
CoCl,6H,O, culture
reduced
(0.5
kept
element
inverted
anoxic
Culture
to
To phase
Strain rotating
Thus,
Growth and monoterpene
and
media,
M)
solution
the
culture or at
competition
verify
tubes.
the
and state
Bak
8
Bak was 1
0.5
medium mixture
butyl
under
ascorbate
36
°C
position mM
maintenance.
at
conditions.
supply
anoxic
experiments.
gKH,P04,
mg
1992). media
prepared was till Methods
1992),
that 24
(1
60
A
rubber ferrous
an
the M) NaMoO47H,O.
(per
rpm.
and mg
and
confirmed
HMN
N,-C02
the
experiments with
occurred
media
could
of
The
next
were
1
0.4
NiCl,6H,O,
I:
stopper 10
ml
from
monoterpene,
sulfide. process Thus,
2100
0.1
Anoxic
an
medium
transfer.
mM
ml
phase
routinely
of added,
Stock were
(90:10,
Substrate
angle
g
FeSO47
by
every degassed
each
mg
the
CaCI,
nitrate).
was
The
occured
contained decolourisation media
was
prereduced
FeSO47H,O,
and
cultures
of contained
surface
vitamin 5.2
v:v)
two
avoided.
be
strains
2
about
and
utilisation
H,O the
and
used
g
anoxic and
added
mg
atmosphere. Transfer
months.
EDTA,
not
0.85 pH
between
a
30
were
and
solution
cultivation 66
fifteen
CuC1,2H,O,
did
for detrimental
in
Grown
only
was
to
in
lImol
2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane
g
Na2S
11
30
not
of
assure
unpolar and
NaNO3.
performed
pH
control
The
of
adjusted
degrees of
resazurin mg
in
medium
monoterpene
(Aeckersberg
utilise
an
competition cultures
(Hanert
Selective
6.0),
culture
distilled
oxygen-free,
techniques
H3B0,
anaerobic
inoculum
contact
experiments
After
or
25
2
ascorbate
from
to
and in
ml
(1
tubes
potentially
1981).
were
7.0.
growth
mg
water:
culture
mg
100
selenite-tungstate
autoclaving,
carrier of
the
conditions
tests of
in
were
et
CuSO45H,O,
were 11).
transferred
but
the
mg total.
In 6.7
horizontal
al.
as
0.5
conditions
with
were
tubes FeS-reduced
heptamethylnonane used
phase
MnC1,4H20,
also
carbon
%
1991), incubated
g
toxic This
v:v
MgSO47H2O,
also
either
in
2
in
in
(21
was
ml
to
the corresponds into
this and
on
and
chemically
substances. (HMN)
were performed
the
ml)
chelated
solution
144
at
a
enlarged
culture.
4
freshly energy
study media,
50
rotary
28
fridge
mM
with
used
190
mg
ml
°C
as to a calculated concentration of 2 mM monoterpene for the aqueous phase. Growth was monitored by turbidimetry at 660 nm, and nitrate, nitrite and monoterpene content were analysed in the late stationary phase.
The quantification of monoterpene degradation was determined in 156m1serum bottles that contained 100 ml of anoxic medium, 10 ml of HMN, 1 mmol nitrate and 200 .tmol monoterpene. Inoculation occurred with I % v:v. Control experiments lacked either monoterpene or nitrate or cells. The data presented in table 3 were determined after 29 days of incubation. In separate experiments, a 2He-CO atmosphere (90:10, v:v) was used to measure the formation of dinitrogen.
Chemical analysis of biomass, educts and products. Turbidimetric determinations at 660 nm were performed to measure biomass formation. The cell dry weight determination was performed as described (Harder 1997). Ammonium was measured by the indophenol method, nitrate and nitrite by HPLC and gases by packed-column gas chromatography as described (Harder and Probian 1997). Monoterpenes were determined by dual-column capillary-column gas chromatography (FoB and Harder 1997).
Light microscopy. Cells were observed with a standard phase contrast microscope
(Zeiss, Oberkochen, Germany) with an oil immersion objective 100/1.6. Dense cultures were wet mounted on glass slides coated with 2% washed agar (Pfennig and Wagener 1986) and photographed using an Ortho 25 film (Agfa-Gevaert, Leverkusen, Germany). For cultures with an OD66Onmof below 0.2, a centrifugation step was required to obtain a sufficiently dense culture.
Stains. The Gram-stain was performed with a kit (Merck, Darmstadt, Germany) according to the manufacturer’s protocol. Flagellawere stained according to Gray (1926).
Lipid analysis. Cells for the analysis of whole cell fatty acids as methyl ester
(FAME) were grown on either the isolation substrate or acetate and nitrate, and harvested by centrifugation. The cell pellet was resuspended in 20 mM ammonium acetate to wash the cells. After centrifugation, the cell pellet was freeze-dried. FAME synthesis was performed close to the method of Sasser (1997). 0.52 ml aqueous NaOH (30 gNaOH dissolved in 100 ml water) and 0.5 ml methanol were added to 40 mg dry cells to start the saponification. The mixture was vortexed, incubated for 5 mm at 100 °C, mixed again and incubated for 30 mm at
67 were
cooling. ether
separation. 100 3 GC-analysis. 0.32 flow column
optimisation 300 bacterial
to the
A. amplification Rainey,
under
al the
relatives again
resolution phylogenetic
package
ml
Mesbah
denitrficans 1989).
C.
procedure
type
°C
0.3
mm
added.
rate
(1:
sequenced
accession
G+C
16S After
The
140
at
M
1,
FAME
by
(Felseristein
DSMZ,
of
strain
For
were
10
v:v).
The NaOH.
et
of °C
methyl
50 After
2.0
content.
rDNA
cooling and
Separation
°C this and
al.
dendrogram
of
relatedness for
m,
of
DSM30026T
lower
ml
determined no. After
mix
(1989). and Cashion
mind,
sequencing
FAME
work,
A
0.32
vortexing, 2 as
Two-third
mini
esters
.xylusoxidans
M22509
mm,
(Supelco,
sequencing
the
in
1993). described
DNA
aqueous
vortexing,
.tm
an
and
The F.
phylogenetic
of
and increasing
et
were
identification
was
ice-bath,
was A.
film
al.
FAMEs 300
was
using
determination
of the is -
the
of
Rainey,
Deisenhofen,
reconstructed due (1977).
phase
currently
extracted
thickness; the
performed
the
°C
(Harder
isolated
mixture
a
following
(DSM
and
to
2 the
to
few for organic
16S
ml
was
was
the
analysis
270
DSMZ,
The
analysis.
5 database
were
of
rDNA
NaCI
deposited by
by
10346T),
the was
and mm;
performed
withdrawn.
°C
Perkin
a
G+C was
using phase
Germany),
temperature
chromatography
mixture
using addition
taxonomic
performed
at
68 was
incubated Probian
Braunschweig,
flame
crystals
gene
performed
4
content
ARB
Elmer,
were the °C
Alcaligenes
The
treeing
performed
as
of
of
mm1, on of
ionisation
A.
ae2
The
6.0
transferred
the
extraction
1997).
(Strunk
were
history xylosoxidans
1.25
was
Uberlingen,
with programme: for
a
algorithms
at
N
editor
PVMS
isolates
organic 270
the on
10
HC1 determined
ml
kindly
at
denitrficans
added
a
A
°C
hydroxylapatite detector
mm the of
FAME
DSMZ, of
and
and (Maidak
into
both of
for
54
hexane/methyl
16S were phase
DSMZ.
contained
provided
Germany)
at
to
in
injection
Ludwig
methanol
genomic
0.1 column
a
80
the
facilitate species
rDNA
reference
by
Braunschweig.
performed 350 vial
was
mm,
DSM
°C,
et
EMBL-gene
HPLC
First,
for
°C.
the
in
al.
1995). port
washed
(5%
(1.85:1, followed
with
increasing
DNA,
(Dewhirst
sequence according
the subsequent
30026T
sequence
the
Separation
1994).
tert-butyl
mix
the
according
by
300
phenyl,
PHYLIP
H2
phase
A
closest
and
with
F.
v:v)
PCR
bank
at
°C;
by
was
The
fine
to
A.
to
of
of
a
et
a Results
Strain 5lMen was isolated on (+)-menthene, strain 54Pin on ct-pinene. strain 62Car on
2-carene and strain 65Phen on a-phellandrene. The denitrifying bacteria grew on a monoterpene as sole carbon and energy source in anoxic and chemically reduced media, formed homogeneous colonies and were microscopically pure (Harder and Probian 1995). The purity of the isolates was confirmed in liquid media under fermentative and denitrifying conditions
(AC broth (Difco, Detroit, Michigan) or yeast extract (5 g 1’); AC broth, yeast extract (5 g 1
acetate (2 mM), pyruvate (2 mM) or fiamarate (2 mM) in the presence of 10 mM nitrate) and on oxic nutrient plates (per 1:5 g peptone, 3 g meat extract, 15 g agar; the pH was adjusted to 7.0). Cells that grew in the presence of a utilisable substrate and oxygen or nitrate showed the morphology of the isolated bacteria. No growth occurred in fermentative media. All strains grew as colourless white colonies on MacConkey plates that turned yellow in the course of growth.
Cells of all four strains were small rods, 1.3-1.8 p.m x 0.5-0.8 p.m in size (Fig. 1). All strains were motile with peritrichous flagella. The cell walls stained Gram-negative. The G+C content of strain 54Pin was 66.9 ± 0.3 %. The whole cell fatty acid analysis demonstrated a strong dependence on the culture conditions (Table 1). Unsaturated fatty acids that were present in acetate-grown cells were replaced by fatty acids containing cyclopropane rings in cells grown on a monoterpene that was dissolved in heptamethylnonane. I, 1% •i S “III, ‘I 1%
A B C D
Fig. 1. Phase contrast micrographs of cells of strains 51Men (A), 54Pin (B), 62Car (C) and 65Phen (D) grown with a inonoterpene and nitrate (bar 10 jim).
69 Table
Fatty
Dodecanalb
3-OH
12:0 14:0 15:0
16:1 16:0 ‘ 17:0 18:1
19:0
The
rRNA
spp.,
a
with 1996).
neutral 65Phen
was
is were showed
and
were
Cells nonane at Dodecanal separation
major
not
least
9-cis
cyclo
cyclo
acid
1l-cisor9-trans
presence
also
1.
14:0
an dinitrogen
and were
not
limited
group
The
hampered
Growth
one or
pH-values
difference
Electron
Whole
optimum
at
a
observed
on
necessitated
system
Taylorella
grown
was
lag
sample
30
absence
acetate.
11
of by
phase
identified
and
cell
on
(Vancanneyt
under
oxide.
is
3-hydroxy-tetradecanoate
acceptors
the at
by
around
to
(Table
10.96.
37 the
fatty in Amounts
levels
of
the
before
equigenitalis
the
amount denitrifying
chemically
5lMen Strain (menthene)
°C
2-hydroxy-dodecanoate
34.1 for isolation 32.6
by
Nitrite
4.0
5.5
0.5
5.1
1.0 3.6
8.4 1.7 acid
described
above
lack
30 GC-MS
were
2).
growth
of
for
they
°C.
composition
The
et
fatty
of
of
I
accumulation
growth
similar
substrate conditions
%
al.
On
and electron prereduced
molecular
started
maximal acids
on
are
(Rossau 54Pin Strain
(pinene)
fatty
1996) 35.1
32.7
by
acetate
3.6 5.9 2.6 2.2
2.1
7.8
monoterpene 1.7
1.7
included.
are
GC
and
on
acid
either
of to
donor
given
and
and
together
the growth
decreased
et
oxygen. is
isolated
and
grow
media,
pattern
was
Therefore,
nitrate Strain 62Car (carene)
al.
is
on a
isolation
in
33.9
and 32,9
70
3.7
6,2
2.2
3.1 or 1.3 3.1 1.6
7.9
nitrate,
taxonomic
also percentage.
a
1987;
with
with
only rate
monoterpene
and
were the
thus
strains
In
of
exhibited
at
present
a
of
presence the
nitrate.
standard. Alcaligenes
oxygen
addition,
Weyant observed
substrate
the
42
started
confirming
Strain 65Phen (phellandrene)
0.045
percentages
21.5
30.4
Only
6.5
0.7
8.1
9.4
8.6 1.6 1.3 6.2
°C. marker
growth
that
in
a
The fatty
h
as
The
of
with
et
mesophilic
Alcaligenes
anaerobically
was
occasionally
were
electron
on dodecanal
al. determined
and
for acids
rates
that may
strains
dissolved
20
monoterpene
1995;
Bordetella
the
oxygen,
Strain 54Pin not (acetate)
that
the
mM
28.6 24.6
19.7
of
4.5
0.4 0.0 6.0
7.6
0.2
1.0
add
acceptor. pseudomonads
were
grew
temperature
strains
Vandamme
microbial
ECL
in spp.,
in
nitrate.
up
in
grown
heptamethyl
the
present
nitrate,
to
value
optimally
cultures
species.
65Phen Strain
(acetate)
Bordetella
and
100%.
isolates 54Pin
28.6
19.2
18.3
18.4
4.8
0.5 5.7 0.0
0.8
Vitamins
1.2
Balanced
in
cultures process
in
nitrate
et
our
nitrite
range
and
that
al.
of
is
at incubations never accumulated nitrite (Fig. 2). Nitrate, nitrite and dinitrogen oxide reduction to dinitrogen was concluded from nitrate and nitrite analysis, from the production of gas, from the failure to detect other gases (dinitrogen oxide, methane) by gas chromatography performed with nitrogen as carrier gas, from the formation of dinitrogen in cultures containing a 2He-CO atmosphere by gas chromatography with helium as carrier gas, and from the assimilation of ammonium during growth. No growth was observed with thiosulfate (10 mM), sulfite (2 and
10 mM), sulfate (10 mM), fumarate (25 mM) as electron acceptor or under fermentative conditions.
Table 2. Morphologicaland physiological characteristics of the isolated A. defragrans strains.
strain 5lMen strain 54Pin strain 62Car strain 65Phen
Cell size (imx tm) 1.3-1.8 x 0.6-0.8 1.3-1.8 x 0.5-0.8 1.3-1.8 x 0.5-0.8 1.3-1.8 x 0.5-0.6 Growth parameter on monoterpene and nitrate pH-range 6.4-8.3 6.3-8.4 5.9-7.9 5.9-7.9 pH-optimum 7.1-7.8 6.7-7.5 6.7-7.5 6.7-7.5 Temperature range n.d. 15-40 °C n.d. n.d. Vitamin demand none none none none
The fate of monoterpenes during denitrification was quantitatively analysed (Table 3).
The amount of electrons consumed by the denitrification process can be provided by the complete oxidation to carbon dioxide of approximately 60 % of the consumed amount of monoterpene. Roughly one-third of the monoterpene consumed was used for biomass formation.
71 Fig.
Table
Amount Amount Amount Electron Amount Amount
Electron
a b
Calculated
(1
Calculated consumed considered
were Calculated terpene
monoterpene
subtracting
17
0
o 2.
OD&anrn
C10H16
C
E C
3.
consumed
Growth
of 0.15 of of of of
0.05
0.00
balancec
to
ratio1’
Quantification
biomass gas nitrate + nitrite carbon monoterpene
to
ratio
to
from the ratio
60
321
numbers
be
formed
amount
was H20 of
and
of
mg the
of
accepted
dioxide
formed
consumed
numbers
strain _
50 .
E o
a)150 C •100
not
formed
+
numbers
calculated
dry 200
increase
54
of
of
recovered (ml)
wt.
electrons to CO2
monoterpene consumed
65Phen
0
of
for
(lImol)
of
numbers
(mg)a
1’
monoterpene
0
electrons
(imol)
each
of
in
—4
for
via
as
electrons
optical
56 on strain
consumed
molecule
the
nitrite.
of
(iimol)
phellandrene,
100
assimilated
donated
electrons
cell
54Pin
density
released
consumption
dry
by of
and
time
by
nitrite
nitrate 200
The
consumed
weight
from
using
complete
I
72
during
OD66onm
dissimilated
sabinene
(h)
the formed
reduction.
strain 984
146
formed
an
amount
12
300 and
by
0
9.75
1,66 1.33 oxidation
complete =
experimentally
and
nitrate
327
and 54Pin nitrate
and
amount
For
of
five
mg
nitrate.
monoterpene
400
reduction.
the
nitrate
of
mineralisation
dry
reduction
electrons
the
of
following
wt.
monoterpene
dissimilated
determined
reduction,
r’
30
V
15 10 5 0
The
strain
894
for
126
for
consumed.
by
1
0
1
•O 8.11
-5 -c
strain a) assimilation 1.58 c 1.28 V
U)
ci) nitrate
C
assimilated
A.
of
two
65Phen
conversion
was
amount the
defragrans.
65Phen).
molecules
electrons
calculated
monoterpene
amount
of
equation:
mono
fctor
were
that
by
cf I Carbon sources used were restricted to some amino acids, fatty acids and monoterpenes. The isolates were not able to utilise sugars. Under denitrifying conditions all strains utilised (concentrations are given in mM in parenthesis) acetate (10), propionate (5), butyrate (5), hexanoate (5), heptanoate (5), octanoate (5), pyruvate (5), malate (5), succinate
(5), fumarate (5), 3-methylbutyrate (5), glutarate (5), glutamate (5), alanine (5), valine (5), ethanol (10) and the monoterpenes (+)-p-menth- 1-ene (4), (+)-limonene (4),
(-)-a-phellandrene (4), ct-terpinene (4), ‘‘-terpinene (4), (+)-sabinene (4), (+)-2-carene (4),
(+)-3-carene (4), (-)-c-pinene (4), (-)--pinene (4), terpinolene (4), (+)-a-terpineol (4), and
(+)-terpinen-4-ol (4). All strains except 54Pin grew on myrcene (4). Structural formulas for the monoterpenes are given in Fig. 3. Arginine (5) and gluconate (5) supported biomass formation of all strains except 62Car. No growth occurred on D-glucose (5), D-fructose (5),
D-sorbitol (5), meso-inositol (5), D-ribose (5), D-arabinose (5), D-xylose (5), D-saccharose
(5), D-trehalose (5), D-cellobiose (5), ascorbate (5), phenylalanine (5), formate (40), L-tartrate
(2, 10), adipate (2, 5), pimelate (2, 5), suberate (2, 10), sebacate (2, 10), itaconate (2, 10), methanol (40), cyclohexanol (2), cyclohexane- I,2-diol (2), cyclohexane-1,4-diol (2), decane
(2), hexadecane (2), heptamethylnonane, cyclohexane (2), benzoate (2), toluene (2), 2,6- dimethyloctane (4). 3,7-dimethyl-1-octene (4), (-)-13-citronellene (4), 3,7-dimethyloctanol-l
(4), (-)-13-citronellol (4), geraniol (4), nerol (4), linalool (4), (+)-trans-isolimonene (4), p-cymene (4), (+)-perilla alcohol (4), (-)-carveol (4), (+)-dihydrocarveol (4), menthol (4), menthone (4), (+)-isopulegol (4), (+)-isomenthol (4), (+)-pulegone (4), (-)-carvone (4),
(+)-dihydrocarvone (4), (-)-trans-pinane (4), eucalyptol (4), (-)-cis-myrtanol (4), (+)-trans myrtanol (4), (-)-myrtenol (4), (+)-isopinocampheol (4), (-)-borneol (4), (+)-fenchol (4),
(a+3)-thujone (4), (+)-fenchone (4), (-)-verbenone (4), (+)-campher (4). Denitrifying growth of all strains was also observed on pine needle oil. This essential oil represents a natural substrate.
73 Fig.
monoterpenes
displayed the
65Phen overall
strains substrate preference
maximal
et control caused
al.
isolation
3.
1993).
In
Monoterpene
substrate
(-)-cz-phellandrene
by exhibited
utilised
of (-4-)p
solubility
(-)-3-pinene
our in
an
the
the
for
the
substrates, -menth-
Our
individual
initial
that
substrate
observed
a-pinene.
enrichment
also
consumption
determinations
the
I
of -ene
were
structures.
studies
menth-1-ene,
the
highest
monoterpene
a-phellandrene
specificity
selectivity
alkenes
supporting
(±)-terpinen-4-ol The
(+).
(+)-sabjnene
and
on
limonene
pattern
relative
alkenoic
isolation
the
yielded
was
however,
of
seems
biodegradation
utilisation
reported
growth
was
the
preference
was
similar
monoterpenes
of
(4-)-2-carene
enzymes
to
similar (±)-a-terpineol
terpinolene
the the
the
be
as 74
to
values. preferred
strain.
pattern
bicycles
excluded.
be single
for
for
that
pathway
100-200
the
Similarly,
the Thus,
are
initially
(Fig.
substrate
(+)-3carene
strains
substrate were
a-terpinene
The
monoterpene
all
p.M
2
of
a
individual barely not
and
solubility-based myrcene
transform
51
monoterpenes,
strain
monoterpene
were
Men
for
degraded
Table
soluble
all
54Pin
(.)-a-pinene
tested. and
‘-terpinene preference
that
four
4).
the
62Car,
efficiently.
In
demonstrated
monoterpenes.
in strains.
(Weidenhamer was
mass
a
The
mixtures
water.
mixture
but
the
might
transfer
strains
Strain
both
The
sole
The
of
of
be
a Table 4. Monoterpene utilisation pattern in competition experiments
Strain Relative substrate preference (%)a
a-phellandrene menth- 1-ene 2-carene ct-pinene
65Phen 100 52 17 0 5lMen 100 70 84 39 62Car 100 54 91 43 54Pin 100 46 73 80
a 100 % corresponds to a-phellandrene consumption of 6.58 .tmol (65Phen), 6.73 j.tmol (5lMen), 4.54 .tmo1(62Car) and 6.44 j.mol (54Pin).
The I6S rRNA gene sequences of the isolates were determined and deposited at the EMBL Data Library under accession numbers AJ005448 (strain 5lMen), AJ005447 (strain
54Pin), AJ005449 (strain 62Car) and AJ005450 (strain 65Phen). The sequence similarity
between the strains 5lMen, 62Car and 65Phen was 99.8%. Strains 54Pin and 65Phen had an
identical 16S rDNA sequence. The 16S rRNA gene sequence of the type strains of 15173 30026 10346 A. denitrflcans (ATCC T DSM T) and A, xylosoxidans (DSM T) was 99.7%. The 16S rDNA dissimilarity search to phylogenetically related organims yielded approximately equal degrees of dissimilarity between the isolates and species of the Bordetella
group (Alcaligenesxylosoxidans, Alcaligenenes denitrzficans and Bordetella parapertussis) and
to Alcaligenesfaecalis (Tab. 5, Fig. 4).
75 Fig. 65Phen. performed determined Zeilkulturen,
Table
Strains
10.
2. 4. 3. 5. 1. 6. 7. 8. 9.
4.
Strain Strain Strain
Alcaligenesxylosoxidans Bordetella Strain Alcaligenesfaecalis Alcaligenesdenitrificans
Oxalobacterformigenes Taylorellaequigenitalis
5.
Phylogenetic The
16S by
62Car
5lMen 54Pin
65Phen
by
Braunschweig,
scale
F.
rDNA ______
inclusion
parapertussis
A.
bar
Rainey
dissimilarity
dendogram
represents
of
Germany).
and
Escherichia
.10
E.
0.2 0.2 0.0 1.
4.0 3.3 4.0 4.8
5.6 9.0
values
10
indicating — —
Stackebrandt Bordetella
Oxalobacter
62Car 51 Raistonia 65Phen
54Pin
Burkholderia
Nitrococcus -
Zoo Rhodocyclus Alcaligenes
nucleotide
A/cal/genes
Men
Comamonas
Alcaligenes
Telluria
2.
0.2 0.2
4.2 4.1 3.4 Spirlilum 4.9
9.2 5.7
between Taylorella
gioea
coli
the
eutropha parapertussis
3.
0.2
4.1 3.3 mixta 4.0 4.8
5.6 9.1
as
ramigera
formigenes
volutans mobil/s substitutions (Deutsche
76
denitrificans
cepacia isolated
position
xylosoxidants an
purpureus
equigenitalis faecalis
testosteroni
4.
4.0 4.0 3.3 4.8
5.6 9.0
outgroup.
strains
of
5.
Sammiung
4.8
6.3 1.8 1.4 8.2
per
DSM
strains
Escherichia
DSM
The
and
100 6.
4.8 0.3
6.5 9.2
30026’
related
phylogenetic 5lMen,
10346T
von nucleotides.
7.
4.8
6.3 9.1
coil
Mikroorganismen
species
54Pin,
8.
9.7 6.6
The
analysis
9.
62Car
10.0
root
was and und was I Discussion
The family Alcaligenaceae (De Ley et a!. 1986) incorporates members of the generaBordetella and Alcaligenes. Bordetella includes the species B. parapertussis, B. pertussis, B. avium
(De Ley et al. 1986), B. holrnesii (Weyant et al. 1995), B. hinzii (Vandammeet al. 1995) and
B. trematum (Vandarnmeet al. 1996). In contrast to these pathogenic parasites, Alcaligenes species are not only isolated from human samples, but are also regularly found in environmental samples. In clinicalsamples, Alcaligenes species are seldom encountered in the genitourinary tract and rarely in the gastrointestinal tract. They present around 0.35 % of all aerobic Gram-negative rods isolated from clinical specimen (Pickett et al. 1991). One of the species, A. xylosoxidans, is recognised as an opportunistic pathogen occasionally involved in disease formation (Isenberg and D’Amato 1991; Pickett et al. 1991; Decrè et al. 1992). The genus accommodates currently A.faecalis as type species, A.piechaudii and two species with a longtaxonomic history which were recently assessed as A. denitr/Icans and A. xylosoxidans
(Vandamme et al. 1996). Many strains isolated aerobically on aromatic or halogenated compounds were tentatively assigned to the species A. xylosoxidans (Ewers et al. 1990) and
A. denitrficans (Weissenfels et al. 1990; Busse et al. 1992). Strain LuBResi was isolated under denitrifying conditions on resorcinol and was tentatively affiliated with A. denitrfIcans
(Gorny et al. 1992). These studies propose a significant role for Alcaligenes species in the environment, even in deep subsurface environments (Boivin-Jahns et al. 1995).
Our characterisation of monoterpene-degrading denitrifiers indicated that the isolated strains share common taxonomic features with Alcaligenes species. The I6S rDNA sequence divergence between the isolates and B. parapertussis, A. xylosoxidans, A. denitrficans and
A.faecalis is accordingto the study of Stackebrandt and Goebel (1994) sufficient evidence to describe the isolates as a new species. The 16S rRNA gene sequences of A. piechaudii is currently not available. In contrast to A. .cylosoxidans, the isolates are not able to utilise glucose and xylose. Itaconate, sebacate and suberate are supporting growth of A. xylosoxidans and A. denitrficans, but not of A.Jaecalis and the isolated strains (Kersters and De Ley 1984).
Nitrate respiration to dinitrogen was only reported for A. xylosoxidans and A. denitrificans.
A. piechaudii is unable to denitrify (Vandamme et al. 1996). The fatty acid methyl ester
77 (Woese analyses
Afipia to
adequately
their (chemolithotrophs), taxonomic
species, limited, isolation
and by genotypically type
and non-pathogenic
Description
de.fra.grans; annihilate
ends. dinitrogen anaerobic
(+)-p-menth- (+)-2-carene,
(+)-terpinen-4-ol,
any
Vandamme
our
obligate
species 16S
of
Sequence
Cells
1987).
Gram-negative,
the
proposed
especially
indicate
and
(human
the
rDNA
markers
fragrance,
chemoorganotrophic
indicate
isolated
oxide
characterised are
pathogenic
genotypical
of
L.
I
Taken
more of
-ene,
the
species et
similarity (+)-3-carene, prep.
motile
that
sequence
Alcaligenes
species,
(motility,
and can with
a!. recently
genus
closely
pathogens),
strains
and (+)-limonene,
referring
together,
the
de
(1996):
many
rod-shaped
with
in
serve
A.
species
characterisation
Rhodopseudornonas
isolated
Alcaligenes,
Alcaligenes
from,
the
analysis faecalis,
A.
less
may
related
evolved
lipid
volatile
peritrichous
to
genus
defragrans,
the
as
defragrans.
as
than
(-)-a-pinene, the
metabolism
of
away;
be
strains
fatty
electron
observations
(-)-a-phellandrene, A.
the
to
cells, Bradvrhizobiwn based
capacity assigned
Alcaligenes.
and
genera.
fatty 3%
species.
the
it
xvlosoxidans,
family
acids, L.
might
as
of
belong
(Teske 1.3-1.8
on
type
flagella
is
adj.
acids.
more Alcaligenes
long
acceptor.
For
required to is as
the
growth
palustris
Alcaligenaceae
78
fragrans be
degrade
species
strictly a
show
(-)-3-pinene,
example, to
Sugar
as
tm
et
highly
environmental
new
appropriate
and
the
information al.
A.
long substrates)
to
that
species
occur
Carbon
compounds a-terpinene,
(plant monoterpenes.
of 1994). 3-2
oxidative. (photosynthetic
justify piechaudii defragrans
conserved
sweet-scented;
the
by
Bordetella
the
subgroup
as
0.5-0.8
in
physiologically
to
to
isolated
As
terpinolene,
and
a
single
species the
concerning
in
symbionts), reclassify
the
concept
Oxygen,
our
and
common
16S
and y-terpinene,
genus
sp.
energy
than
im genus
of
unit.
strains
aromatic
isolates
rRNA related
M.L. A.
anaerobe)
the
wide,
nov.
recently
Bordetella
to
the
Alcaligenes.
differentiation
with The
nitrate,
denitrificans
Proteobacteria sources
A.
(+)-a-terpineol,
diverse
do
defragrans gene
opportunistic
to
Al.ca.li’ge.nes
have with
hydrocarbons faecalis,
(+)-sabinene,
Nitrobacter
facultatively
Alcaligenes
not
A.
suggested
differ
nitrite
can
faecalis
and
rounded
several belong
genera
include
The
not
the
the
are
in
is
to
or
advice
and Acknowledgement.
Bremen,
und
analysis,
strain
at
activated
carrier
The
freshwater
are
the
not
a
Zeilkulturen,
G+C
grant
DSM
54Pin
on
phase
utilised
for
and
sludge
bacterial
content
from minimal
as
performing
is
C.
(Harder
DSM12144,
under
deposited
the
and
Probian
Braunschweig,
of
nomenclature.
medium
Deutsche
strain
strains
We
denitrifying
and
GC-MS
for
as
like
54Pin
DSM12142, Probian
with
62Car
DSM12141T
technical
Forschungsgemeinschaft
to
Germany.
This
analysis
nitrate
was
conditions.
thank
and
1995).
study
assistance.
66.9
65Phen
0.
and
and
and
at
±
Strains
Strains
Kniemeyer,
was
DSM12143
79
a
the
Growth
0.3
to
monoterpene
from
Deutsche
supported Prof.
%.
We
5lMen,
5lMen
The
are
parameters
a
to
H.-G.
ditch
who
respectively.
J.
strains
grateful
H..
62Car,
Sammlung
by
that
and
in
Trüper,
kindly
the
a
were
was
are
54Pin
to
forest
and
Max-Planck-Gesellschaft
P.
summarised
dissolved
helped
von
selectively
Universität
65Phen
Schuize,
were
in
Mikroorganismen
1995.
in
isolated
are
in
the
Universität
enriched in
an
Bonn,
The
deposited
Table
FAME
organic
type
from
for
in 1. References
Aeckersberg,
Bhattacharyya, Boivin-Jahns,
Busse,
Cashion,
Decrè,
De
Dewhirst
Ewers,
Felsenstein,
FoB,
Gilewicz,
Gorny,
Gray,
Griffiths,
Griffiths,
by
transformation
Ley, of from
isolates rRNA
ratio
(1992)
isolated Alcaligenaceae.
similarities
Neisseria, Proleobacteria
and
degrading
Genetics,
isomerisation 7
252-256.
growing
1 Nocardia
Bacterial
a-pinene
S.,
H.J.,
a
-n-heptadecene
1-75.
phenotypical
D., P.H.H.
J., new
N.,
Sitnonsiella
P.,
J.,
a
determination
Harder,
partial
M.,
Arlet, deep
E.T., F.E.,
E.T.,
Freier-Schröder,
El-Banna,
from A
Segers,
Wahi,
Holder-Franklin, from F.,
type
J.
V.,
with
Monpert, 3-lactamase-overproducing
University
bacteria
(1926) Simonsiella,
metabolism
(1993)
oxide
Bak, sp.
of
P.K.,
subsurface
Bianchi,
Harries,
the
Pasteur. sequencing.
Bociek, G.,
of
a
J.
resorcinol
G.,
the strain
of
of
P.,
case
by
sulfate-reducing
F,,
to mt.
(1997) and
beta Danglot,
lyase
monoterpenes:
A linalool
Brune,
T.,
Prema,
Bordetella
that
PHYLIP Kersters,
by 16S
the
of Widdel,
G., of
method
p18.3.
J.
molecular
P.C., of A.,
subclass
S.M.,
Oyaizu,
environment.
bacterial
B.J., from
a meningitis.
ribosomal
Syst.
of
family
resist
Acquaviva, and
Washington.
D.,
and mt. Microbial
Ruimy, A.,
M.A.,
marine
ct-pinene:
to
C.,
Jeffcoat,
B.R.,
F.
J.
Harries,
Nocardia
Bacteriol. Vitreoscilla (phylogenetic of
K.,
Bright, Knackmuss, Schink,
other
J.
geraniol inactivation
of
ribosomal
Lucet,
Bacteriol.
Neisseriaceae
(1991)
H.,
staining
Syst.
DNA.
McCully,
methods
bacterium.
Mannheim,
the
R.,
hydration
ribonucleic
denitrifying
Kulkarni,
J.
Auling,
aromatic
M.,
transformation
Garcin,
Appl.
Proteobacteria
Antimicro.
R., pathway B.
Bacteriol.
P.C.,
J.C.,
P.L.
Seattle.
strain
Anaerobic Anal.
without
sp.
36:
Mule,
bacterial (1992)
species
Trudgill,
ribonucleic
169:
J.,
for
strain
by
H.J.
Fournier,
405-4
Environ.
G. Jeffcoat,
inference
Arch. (1989)
of
Biochem.
Franklin,
J.,
of
(emend.).
compounds.
W.,
80 TCE. B.D.,
acid
the 4972-4979.
G.,
(1992)
ct-pinene. from
nerol
bacterium.
42:
A
Daumus,
Alcaligenes
(1990)
p18.3.
comprise
Chemoth.
oxidation
flagella.
14.
Bertrand, Lievens,
Microbiol. P.W.
strictly
identification sequence
Arch.
19-26.
Pradhan,
Chroinobacteriuin, acid of
G., Microbiol. by a-pinene
R.,
formation.
package)
M.
Identification
81:
mt.
J.
a
a
(1987b)
Bcrgogne-Bérézin,
Selection
Nature S.,
Sissons,
cistrons:
Arch.
J.
Bacteriol. Microbiol.
(1977)
polyphasic
anaerobic
tertiary 461-466.
a
A.
J. Appl.
30: of
J.C.
Bacteriol.
comparison:
Christen,
denitrUlcans
major
156:
Syst.
saturated
(1986)
S.K.
oxide
769-779.
version
Microbiol. 61:
(1991)
187:
of
Purification
A
FEMS
D.J.,
5-14.
Microbiol.
proposal
Bacteriol.
of
allylalcohol:
rapid 3400-3406.
branch
bacterial
169:
nitrate-reducing
(1960)
154:
of
to
689-690. approach
R.
12:
Intra-
trichioroethene
Trudgill,
Anaerobic
hydrocarbons
3.5.1.
xenobiotic-degrading
Microbiol.
acyclic
transfer Eikenella,
(1995) 4980-4983.
method
410-413.
subsp.
273-274.
158:
of E.,
for
39:
and
Microbiological
strains
and
Biotechnol.
the
Department
Philippon,
including
48-53. a
metabolites xylosoxidans
P.W. regioselective
Comparison
258-266.
for
of
new intergeneric
properties
oxidation
beta
Lett.
Eikenella
Kingella,
bacterium
the
isolated
to
family,
(1987a)
(TCE)
group
CO2
base
16S
149:
A.
36:
of
of
of
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Trudgill,
Vancanneyt,
Vandamme,
Vandamme,
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Weidenhamer,
Weissenfels,
Weyant,
Widdel,
Woese, Wright,
Bacteriol. Microbiology,
relationships 16S Pseudornonas. (ed.),
content evaluation.
von poultry
Hinz, humans, Bacteriol.
hydrocarbons
monoterpenes?
fluoranthene Whitney,
nov., Ginkel,
In: 2nd
Serratia
0.,
A.,
rRNA
A.
C.R. Konig,
P.W. F.,
edn.
S.J.,
R.S.,
K.H.
a
The Ludwig,
Aim, Balows,
and P.,
P., new Bak, in
C.G., M.,
E.,
(1987) and
niarcescens.
W.D., 44:
Springer, Caunt,
46:
sequence
(1986)
whole-cell
AM.,
J.D.,
Heyndrickx, (1996) Syst. Hollis,
Hommez, C.H.,
humans.
bacteria:
Goebel,
Gram-negative
among
Witt,
E.,
F.
846-849. by
reassessment
Technical
by
849-858.
W.
Welten,
Academic
H.G.
J.
(1992)
Macias, pure
Appi.
Bacterial
Beyer,
Regan,
P.,
selected
Daneshvar, Kersters,
Terpenoid
Chem.
(1995)
Bordetella
D.G.,
Berlin.
S.,
ammonia- analysis
B.M. Trüper,
Tnt. Carter,
hydrolysates
bacterial
Appl. J.,
a
Abraham,
Microbiol.
H.G.J.,
Gram-negative
M.,
University
J.M.,
M.,
F.A.,
J.
press, Weaver, Vancanneyt, treatise
Ecol.
alkene-utilizing
(1994)
ARB
evolution.
K.,
Syst.
of
species
Vancanneyt, Microbiol.
D.,
M.
in
Klein,
metabolism
M.T.,
trernaturn
Toze, cultures. Alcaligenes
Fischer,
Blackall,
and
New
19:
de -
the
Dworkin,
Baker,
Bacteriol.
Taxonomic
a
W.R.,
19: on
and
RE.,
Bont,
nitrite-oxidizing
Moss, associated 1799-1897.
software
of
present
York.
J.
Microbiol.
S.,
528-540.
M., Munich, structure phospholipid
N.H.,
Biotech.
(1990) Appl.
mesophilic
P.B.
P.J.
sp.
Kersters,
Amin,
Rittmann,
bacteria. M.,
J.A.M.
by
C.W.,
W.
45:
Monsieurs,
denitrificans
nov.,
82
species environment
(1995)
Pseudornonas,
(1986)
Hoste,
Williamson, note:
Microbiol.
with
Harder,
37-45.
Munich,
Degradation
Rev.
23: M.F.M.,
Brenner
and
(1987)
isolated
K.,
Appl.
septicemia.
a
sulfate-reducing
bacteria.
B.E.,
fractions
224-227.
Bordetella
definition
B.,
place
51: Microbial
function,
KR.
Frederickson,
M.,
Germany.
De
Ruger
Environ. Biotechnol.
221-271.
D.J.
Oxidation
Steigerwalt,
Stahl, from
for G.B.
for
Hoste,
Schieifer
Vos,
J.
of pp.
of
(1995)
sequence
J.
Bacteriol.
DNA-DNA
in
and
hinzii (1993)
oxidation
wounds
phenanthrene, pseudomonads:
Clin.
Vol.
483-528. D.A.
P.,
Microbiol.
bacteriology.
B.,
bacteria,
Tan
H.L. Falsen, of
32:
(eds.),
Bordetella sp.
Microbiol.
A.G.,
Cookson,
X,
(1994)
Just
data.
and
gaseous
479-484.
176: nov.,
1983.
of
(1996)
reassociation
The
In:
how
The
ear
E.,
OConnor,
53:
Department
pp. aipha-pinene
6623-6630,
Evolutionary
I.C.
isolated
a
mt. Kersters,
fluorene infections
mt.
insoluble and 2903-2907.
prokaryotes,
biology 33:
B.,
holmesii
3352-3378.
taxonomic
Fatty
Gunsalus
J.
Wirsing
1-7.
J.
volatile
Syst.
from
Syst.
and
acid
S.P.,
K.,
and
of
are
of
sp.
in
by 2
Cometabolic isoterpinolene formation from isolimonene by denitrifying AIcaligen es defragrans
Udo Heyen and Jens Harder*
FEMS Microbiology Letters (1998) 169: 67-71
Max-Planck-Institut for Marine Microbiology, Celsiusstr. 1, D-28359 Bremen, Germany * Corresponding author
83 Alcaligenes
Abstract
from hydrocarbon
biotransformation sp2-hybridized atom monoterpenes
by
A.
defragrans.
isolimonene,
of
the
defragrans
structure.
menthane
with
Cl
of atom
a
was
isolimonene,
sp2-hybridized
A
strains
as
detected
skeleton,
new
structural
cometabolic
denitrify
a
in
Cl
contrasts
monocyclic
property
cultures
atom.
on
84
reaction,
This
with
for
monoterpenes
monoterpene
that
monoterpenes selectivity
the
the
grew
complete
formation
on
indicates
with
with
a
that
a
monoterpene.
mineralization
sp3-hybridized
of
an
can
a
isoterpinolene
demand
unsaturated
be
oxidized
for
The
Cl
of
a
A.
nonane
were
respectively,
Materials
requirement
6-methyl-3-(
study,
four
identified.
et
microbes absence
commenced.
considerable
emission and
(Biegert has
molecule
hydrocarbons,
Dolfing (Aeckersberg Environmental
Introduction
defragrans
al.
been
Fuchs
strains
cultivated
1978).
(HMN)
Isoprene
neutral
et
of
rates
et
revealed.
by
on
al.
We
1997)
that
for
molecular
and
I
We
interest
al.
on
-methylethylidene)-cyclohexene)
1990).
(+)-p-menth-
the
et
strains
are
report
which
anaerobically
metabolites
the
phase
concerns
al.
and
were
have
a
1996;
Methods
in
action
and
bicarbonate-buffered
central
A
1991;
the So
monoterpenes
5 for
as
resulted
the
described
recently
carbon-hydrogen
IMen,
raises
oxygen
far,
Coschigano
order
described
our
of
have
Rueter
stoichiometric
hydrocarbon
1
-ene,
only
formed
benzylsuccinate
on
understanding
the
54PinT,
of
in
shown
(Harder
monoterpene
led
as
5
the
et
question
the
(-)-a-phellandrene,
x
(Harder
Alcaligenes
are
al.
to
i0
during
et biochemistry
62Car
isolation
that
the
1994)
activation
an
bond
al.
and
defined
g/year 1
formation
largest
and
how
monoterpenes
of
intensive
monoterpene
and
1998).
85
and
Probian
synthase,
and
of
enzymes
Probian
defragrans
of
from
the
65Phen
medium
for
the
natural
nitrate
reaction.
new
aromatic
of
of
This
mineralization
each
isolimonene
the
research
methyl
(+)-2-carene
1995).
isoterpinolene
1995;
bacteria
(Harwood
as
and
a
source
initial
were
class
with
unprecedented
consumption
sp.
putative
sole
compounds
FoIl Thauera
group
The
nov.
on
microbially
of
activation
a
capable
electron
of
and
2,2,4,4,6,8,8-heptamethyl-
and
compounds
and
and
anaerobic
alkenes.
of
(FoB
isolation
glycine
is
Harder
(2,4(8)-p-menthadiene,
alkanes
terpenica
propose
Gibson
added
(-)-a-pinene
of
(Lovley
donor
were
et
reaction
observation
degrading
degradable
Estimated
al.
radical
1998;
of
degradation
and
to
(Zimrnermann
analyzed
1998).
and
1997;
strain
a
et
denitrifying
a
of
alkenes
structural
FoIl
acceptor,
al.
fumarate
enzyme
yielded
toluene
ailcanes
In
Heider
annual
58EuT
in
is
1989;
et
this
and
the
al.
of
of is phase
nm
Nitrite phases
1998).
determined
by
commercially identified 1995). a-phellandrene
a-pheliandrene
then
a-phellandrene
and
Results
The
nomenclature structural
(-)-13-pinene
sp3-hybridized Therefore
also
and strains
disappeared
were
gas
was
incubated
monoterpenes
Harder
capable
and
Typically,
and
Concentrations
were chromatography-mass
(FoB
In
performed
used
15
by
nitrate and
by
motif:
cultures
we
1998).
withdrawn
ml
not
and
of as
were dual-column
and
mass
for (Erman
in
(70.6%),
Discussion according Cl
isoterpinolene investigated freshwater
growing
30 available
were
Harder
HMN
the 30
a
atom, supporting
to
Isolimonene
utilized,
limol
of
spectroscopy
new mm
measure
methyl
of
quantified
1985))
A.
was
with
a-terpinene 1998; anaerobically
in
at monoterpenes
isoterpinolene to
monoterpene
capillary-column
neutral
defragrans
medium
cultures
67
mixed
the
but the
spectroscopy
sterile,
denitrifying
group-carrying standard.
FoB is
°C.
biomass
does
by
sp2-hybridized.
literature
not
fate
The
metabolite
once
et
before
of
anion and
(23.0%),
al.
not
N2-flushed
on A.
isolimonene
reaction strain
of
and
with formation.
relate
was
1998).
defragrans
retention
exchange a
support
growth
inoculation.
isolimonene,
(Erman
gas
limited
150 (Harder
synthesized
20
86 54PinT
accumulated
‘-terpinene
carbon
to
chromatography
yielded
jimol
ml
For plastic
the
of
HPLC
microbial Samples
range or
of
1985). time
A.
strains and
on aqueous nitrate
atom
example, 60%
Turbidimetric
according
defragrans
(-)-trans-pinane
by
Probian
a
and
of
analysis limonene
as
(3.3%)
A
corresponding
(w/w)
and
monocyclic
of
acid-catalyzed
(Cl
unsaturated
described
growth
were
glass
1.5-mi
the
phase.
(FoB
T.
limonene,
to
in and
1995).
aqueous
present
strains
terpenica
aqueous
GC
(Kovàts
and
syringes,
the
or
determinations
and
portion
isoterpinolene
Monoterpenes
(Harder
analysis
denitrification
(FoB
nitrate,
compound
monoterpenes
Compounds menthane
Harder
contain
to in
sulfuric (-)-a-pinene isomerization
and
58EuT,
indices).
1.5
respectively. the
of
et
and
a
the
ml
isolimonene 1997)
mixture
a
al.
100
decline
acid
Probian
common
skeleton
which at
HMN
HMN
(3.2%)
with
1998). were
were
of
660 mM
The
and
(FoB
and
and
of
of
the
of
is
a
fresh
Fig.
limonene
comigrated et performed
with
published
based published
Because isolimonene
.
al.
1.
water
isoterpinolene
200
240
1985),
120.
160
on
80.
Formation
0.
the
(•),
RI
spectra
differences
medium.
and
with
differentiation
(Fig.
were
values
isolimonene
0.10 0
C
yielded
isoterpinolene,
(McLafferty
1).
of
close
0.00 0.05
0.15
0.25
0.20
or
of
A
a
in
isoterpinolene
terpinolene
comparison
new
a
to
the
(V)
Kovàts
from
the
0
metabolite
signal
and
and
thus
determined
other
nitrate
standards
Stauffer
retention
2 of
I
corroborating
intensity
and
structural
the
(A)
terpinolene,
(cO).
mass
4 value.
I
1989)
during
87
was
index
of
A
spectrum
isomers,
culture
mass
time
performed
the
identified
Therefore 6
I
growth
(RI)
1085
GC-MS
ions,
(d)
tube
e.g.
obtained
of
and 8
I
(0)
the
terpinolene.
an
contained
(Fig.
1091
a
analysis.
1088,
retention
metabolite
of
identification
by
10
2B).
A. for
I
GC-MS
respectively
defragrans
3
the
The
ml
was
time
12
as
metabolite.
HMN
new
predominantly
isoterpinolene.
by
(Fig.
A
analysis
coinjection
(Bestmann
metabolite 14
54 pT
and
2A)
4
6
8
0
14
12 16
17
with
The
was ml 0 physiologically The carbon
had consumed
metabolized
A 1). amount indicates
reduction experiments
isoterpinolene
and Fig. isoterpinolene
The
the
microbial
100
the
2.
limitation.
concentration
of
required
30
that
A:
metabolite
of
39 isolimonene
the
40
Mass further
(Harder
the more
is 50
synthesis
(b), active
growth-supporting
a
physiological
consumed
Hence 60
spectrum
dead-end
electrons
terpinolene
and
during
and
70
of
culture
77
Mass
as
terpinolene
1 OIl
isolimonene
Probian
mM of
isoterpinolene
an 91
90
of
product. became amounts
/
isoterpinolene
and
Charge
incubation
100
(c), of
the
traits.
limonene
1995;
110
the
and
monoterpene
new
(e).
available
120
and
presence
of
However,
standard
FoB
metabolite.
130
135
time nitrate.
isoterpinolene
attests
in
140
and
144
from
from the
of
150
of additions
88
Harder
156
to
the
3
Electron presence
that 160
a
isolimonene
the
weeks.
B:
monoterpene
carbon
170
recovery
complete
GC
these
1997)
tOO
of could
analysis
ratios Analysis
of
the
190
dioxide
compounds
and
10
200 be
metabolite
of
required
oxidation
mM
as
of oxidized
sustain
between
of
than
growth of
1
B
the
.1-1.5
of
the
are
and nitrate
the
the
are
of
metabolite
when
electron
64-98
substrate
required
the
resemble
hypothesis
isoterpinolene
presence
not I
Retention
represents
the disappeared
13.5
efficiently
% I
balances I
bacteria
(trace I for
(Table
of
earlier
14.0
of
f
that
time
the
the
a a
(d)
a),
water-soluble
gluconate
alkenes) degrading
and
substrate
(1
specific
this
allylic comparison
Surprisingly,
mM),
‘‘-terpinene),
strain
isomenzation,
Isoterpinolene
inhibition
that
but
for
enzymes
(5
on
of
restricts
mM).
growth
could
substrate.
limonene
the
all
but
strains
of
in
growth-supporting
be
This
the
but
((-)-a-pinene,
the
could
these
formation
restored
(1
limonene
indicated
not
rates
difference
mM)
not
cultures
T.
of
by
be
terpenica
was
from
turnover
degradation.
a
detected
the
limonene,
might
toxic
or
completely
isolimonene
addition
the
monoterpene
effect.
58EuT
be
in
low
in
89
comparison
caused
(-)-a-phellandrene
cultures
of
solubility
All
isolated
suppressed
5
occurred
mM
four
by
was
utilizing
either
on
A.
acetate.
to
of
with
defragrans
not
eucalyptol.
the
in
monoterpenes
the
the
either
fast
or
all
completely
Thus
absence a
presence
monoterpenes
growth
mixture
glutamate
isolimonene
strains
Microbial
of
rate
(ca.
of of
consumed.
catalyzed
monoterpene
a-terpinene
isolimonene
on
(5
50
growth
tested
causes
mM)
a
jiM
highly
the
for
or as
of
A a strains and T. terpenica 58EuT Table 1 Quantification of monoterpene metabolism by nitrate-reducing A. defragrans
Amount of Amount of Amount of Strain and substrate Bacterial Amount of growth nitrate consumed growth terpene isolirnonene isoterpinolene (AOD65011) (l.tmol, consumed (lJ.mol, consumed (imol, formed % consumption) % consumption) % consumption) (lImol)
54p1T Alcaligenes defragrans 0.222 154 (100) 17.0 (59) 0.0 0.0 Limonene (2 mM) 0.0 - 0.2 Isolimonene (2 mM) 0.017 15 (10) 12.9 (86) 2.3 (15) 2.1 Limonene (1 mM)+ isolimonene (1 mM) 0.156 105 (76) 13.2 (88) 10.1 (67) 9.5 cc-Pinene (1 mM)+ isolimonene (1 mM) 0.139 101 (66)
Alcaligenes defragrans 5 1 Men 14.2 (95) 1.7 (ii) 1.1 Limonene (1 mM)+ isolimonene (1 mM) 0.204 122 (85)
Alcaligenes defragrans 62Car 7.8 (52) 1.4 (9) 0.9 Limonene (1 mM)+ isolimonene (1 mM) 0.053 77 (51)
Alcaligenes defragrans 65Phen 12.3 (82) 2.9 (19) 2.3 Limonene (1 mM)+ isolimonene (1 mM) 0.122 125 (81) 13.7 (91) 5.6 (37) 5.5 -Phe1landrene (1 mM)+ isolirnonene (1 mM) 0.151 118 (79)
Thauera terpenica 58EuT 14.1 (47) 0.0 0.0 Limonene (2 mM) 0.190 138 (95) 0.0 0.0 0.0 Limonene (1 mM)+ isolimonene (1 mM) 0.019 26 (18) Besides isolimonene,further monoterpenes with a sp-hybridized Cl atom were tested to identify stoichiometric biotransformations. A. defragrans3 strains 54pT and 65Phen grow on (+)-2-carene and on (+)-3-carene (FoB et al. 1998). cis-4-Carene and trans-4-carene could not serve as growth substrate and were not cometabolically transformed during growth on
2-carene. Myrcene was utilized by A. defragrans 65Phen, whereas (-)-13-citronellenewas neither transformed nor mineralized. A delocalized st-system is present in p-cymene. This compound was not attacked as sole carbon source (FoB et al. 1998) or cometabolicallyduring growth on (-)-a-phellandrene.
isolimonene isoterpinolene
Fig. 3. Biotransformation of isolimoneneto isoterpinolene.
In enrichment cultures, trace amounts of microbially formed monoterpenes were noticed
(Harder and Probian 1995). Similar observations were now made with pure cultures of A. defragrans. Neutral monoterpenes were accumulatedto concentrations of up to 30 iM during growth on different monoterpenes. GC-MS analyses of HMN phases identified verbenene,
2,3-bis(methylene)-bicyclo[3.2.1]octane, 3-carene, eucalyptol, limonene, -phellandrene, a-terpinene, ‘-terpinene, p-cymene and terpinolene. These substances may be perceived either as fortuitously formed dead-end metabolites (p-cymene) or as intermediates of the degradation pathway (menthadienes).
91 rearrangement
with alkene transformed
Acknowledgement
supported Gesellschaft.
localized
bonds
In
summary,
by
into
of
of
bonds
the unsaturated
an
isolimonene
ionic
We
Deutsche
the
for
compound like
accumulation
the
monoterpenes
to
(Fig.
thank
Forschungsgemeinschaft
further
3)
that
manifests
Sabine
stays
metabolism
of
and
isoterpinolene
intracellular
FoB
92
the
the
for
necessity
capacity
in
critical
which
(to
as
as
substrate.
of
of
J.H.)
discussions.
the
the
A. a
sp2-hybridized
product
defragrans
monoterpene
and
the
This
of
Max-Planck
to
an
work
Cl
may
activate
allylic
atom
was
be
Harwood,
McLafferty,
Lovley, Harder, FoB,
Leuthner, Heider, FoB,
Erman,
FoB,
Dolfing, Coschigano,
Biegert,
Bestmann,
Aeckersberg,
References
Wiley
297-299.
(1989) aromatica: unique oxygen.
(1998)
metabolism. and
5 Appl. on
isolated
7
Arch.
characterization
isomerisation
Appi.
involved toluene denitrifying
mit
Menthenolen
by
S.,
S.
77-596.
S.
1-75.
a
J.,
Harder,
J.
oxygen-containing
W.
Heyen,
D.
nitrate.
Bildungsenthalpien
Harder,
T.,
new
Probian,
J.,
CS.,
B.,
Fuchs,
Microbiol.
Environ.
Microbiol.
&
to
R.,
F.
Oxidation
Biochemical
H.
and
on
F.
Appi.
Fuchs,
P.W.,
Sons,
F.,
Leutwein, in
type
prokaryotes?
(1985)
Zeyer,
Baedecker,
W.
Gibson,
J.(1998)
U.
J.,
alkenoic
anaerobic
Syst.
fumarate.
a
bacterium
Bak,
Mol.
J.
G.
of
new
of
Environ.
C.
Stauffer, durch
New
Harder,
Kobold,
(1997)
Microbiol.
(1997)
G.,
Wehrman,
of
21:
linalool
Appl.
sulfate-reducing
Chemistry
154:
F.,
(1995)
of
Microbiol.
J.,
J.
a
C.,
glycyl
York.
Heider,
and
aromatic
Widdel,
Thauera
monoterpenes
365-373.
bacterium
Reaktionsgaschromatographie.
(1997)
toluene
M.
Eur.
Binder-Eicher,
336-341.
Thauera
Schulz, J.
Anaerobic
J.
monoterpenes
aus
Microbiol.
D.
Microbial
Microbiol.
U.
genetic Microbial
Bacteriol.
(1998) to
J.,
64:
B.
J.
radical
Kraftfeldberechnungen.
T.S.
J.
of
geraniol
F.
Lonergan,
28:
Biochem. Vostrowsky,
(1989)
Shedding
metabolism
linaloolentis
contaminants
H., (1996)
1650-1656.
the
(1991)
that
arornatica
6
characterization
Alcaligenes
Young,
bacterium.
metabolism
15-628. Hörth,
21: transformation
enzyme
monoterpenes,
degradation
61:
179:
((+)-menthene,
mineralizes
The
without
237-244.
Evidence
(linalool,
P.,
Anaerobic
3804-3808.
light
238:
D.
30
P.,
Wiley/NBS L.Y.
by
93
J., 0.
sp.
is
Schwarzenbach,
1-309.
catalysing
66
coupled Arch.
on
strain
Haehnel,
defragrans
initiated
nerol
Cozarelli,
of
nov.
1-668.
(1985)
of
(1998)
anaerobic
toluene
that
menthol
aromatic
oxidation
of monoterpenes
Microbiol.
1709
of
Liebigs.
Ti:
ct-pinene,
and
formation.
to
benzylsuccinate
Korrelation
registry
anaerobic
a
W.,
by
microbial the
putative
Identification
Gasphasen-Dehydratisierung
pp.
in
I.
Thauera
tertiary
sp.
formation
benzene
and
compounds.
M.,
Schlitz,
the
Ann.
of
Marcel
first
nov.,
R.
of
156:
saturated
eucalyptol)
2-carene
Phillips,
absence
FEMS
role
oxidation
mass
Chem.
in
iron
P.
terpenica allylalcohol:
step
der
E., description 5-14.
ring
Dekker,
the
of of
synthase
(1990)
spectral
reduction.
Schagger,
and
Eliminierungsprodukte
Eur.
Microbiol.
in
of
a
degradation:
benzylsuccinate
absence
1986:
hydrocarbons
E.
and
glycine
molecular
anaerobic of
and
J.
analysis
J.
sp.
New
a-phellandrene)
P.,
toluene
Biochem.
234-24
data,
of
Isolation
from
nov.,
regioselective
nitrate.
H.,
of
Nature
York.
Siegel,
free
four
Lett.
molecular
Heider,
6315
of
aprocess
Thauera
oxygen.
von
isolated
toluene
1.
radical.
to
strains
in
genes
from
D.
Syst.
243:
339:
149:
CO,
and
pp.
the
J. I. Rueter,
Zimmermann,
Anaerobic Nature
the Geophys.
P.,
production
Rabus,
372:
Res.
P.
oxidation
455-458.
R.,
R.,
Lett.
of
Chatfield,
Wilkes,
CO
5:
of
and
679-682.
hydrocarbons
H.,
H,
R.B.,
from
Aeckersberg,
Fishman,
the
in
oxidation
crude
J.,
F.,
94
Crutzen,
Rainey,
oil
of
by
hydrocarbon
new
F.A.,
P.J.,
types
Hanst,
Jannasch,
of
emissions
P.L.
sulfate-reducing
H.,
(1978)
Widdel,
from
Estimates
vegetation.
F.
bacteria.
(1994)
of 3
Geranic acid formation, an initial reaction of anaerobic monoterpene metabolism in Alcaligenes defragrans
Udo Heyen and Jens Harder
Manuscript in preparation
Max-Planck-Institut for Marine Microbiology, Celsiusstr. 1, D-28359 Bremen, Germany
95 Abstract
Monoterpenes
acids anaerobically the
defragrans grown
limonene, carbon geranic
extracts.
pathway
monoterpenes
monoterpene
present
on
limitation.
acid
involves
These
ct-phellandrene
and
strain
in
was
by
in
a-pinene.
cells
with
the activation
plants. ring results
65Phen
Myrcene
catalyzed
and
denitrifying
opening
an
culture
The
suggest
under produced
unsaturated reaction.
yielded
in
alicyclic
reactions
vitro
broth
nitrate-limitation.
3-proteobacterium
that
the
Geranic
geranic
by
were
acid
highest
the
that
heat-labile
hydrocarbon
96
was
examined
reverse
anaerobic acid
acid
transformation
consumed
had
from
partly
Cell
substances Alcaligenes
accumulated
to
structure
monoterpene
identify
-myrcene,
suspensions
by
the
cell
rates.
biosynthetic
potential
present
defragrans.
suspensions
to
are
The
a-phellandrene,
0.5
mineralization
of
mineralized
formation
mM
in
Alcaligenes products
pathway
Organic
cytosolic
in
during
cells
of
of
of Introduction
The mineralization of organic matter by microorganisms is often severely hampered by the
chemical structure of the substrate. One evolutionary solution is presented by mono- and
dioxygenases that catalyze the oxidative functionalization of recalcitrant compounds, i.e.,
hydrocarbons. Microbial mineralization of these substances does also occur in nature in the
absence of molecular oxygen, and in the last decade anaerobic bacteria were isolated on
alkylbenzenes (Lovley et al. 1989; Dolfing et al. 1990; Heider et al. 1999), alkanes
(Aeckersberg et al. 1991; Rueter et al. 1994; So and Young 1999) and alkenes (Gilewicz 1991).
The biochemistry of the initial activation reactions has so far only been revealed for toluene.
Catalysis via radicals seems to be involved in the addition of toluene to fumarate by the
enzyme benzylsuccinate synthase, a putative glycine radical enzyme (Coschigano et al. 1998;
Leuthner et al. 1998). This novel enzyme raises the question how the activation of alkanes and
alkenes is commenced.
Monoterpenes are alkenes ubiquitous in nature. The enrichment and isolation of
Alcaligenes defragrans and Thaurea terpenica demonstrated the physiological trait of
anaerobic monoterpene mineralization (Harder and Probian 1995;FoB and Harder 1998;FoBet
al. 1998). The former species catalyzes cometabolically the transformation of isolimoneneto isoterpinolene (Heyen and Harder 1998). This -mutase3,1-hydrogen-z’-A reaction confirms the microbialactivation of alkene bonds that are not polarized by adjacent functional groups. Here we report our efforts to identify the first ionic3 compound of the mineralization pathway present in Alcaligenesdefragrans.
97 Material
maintained have values
obtained trans,trans-octadiene acid).
as applied acetate
established with
terpene) run
of fermentations.
centrifuge suspended
in medium
suspensions obtained bar
carbon 2,2,4,4,6,8
28
described
liquid
Fe(II)C17
at
°C
and
a
pH-
low
that
Materials.
Culture
150
in
Anaerobic
and
in
sources
then
from
(Harder
to
nitrogen
cell
and
solubility the
in and
all
tubes.
related
,8-heptamethylnonane in
rpm
in
the
nitrate
(Widdel our
and
dispensed
suspension
was
equal temperature-controls
Aldrich
experiments
dark a
Cell
Methods
conditions
aqueous
andJor
to
101-fermenter
laboratory
and
2
After and
Alcaligenes
to
rapidly
harvest
volumes
optimize with
mM
cell
of
occurred
Probian
the
acid
and
(Steimheim,
stored
50
nitrate into
centrifugation
was aqueous
phase
efficient suspension
of
to
Bak (geranic
thawn
to started
under
and
of
I
dithiothreitol. 200
at
5-ml 1995).
mass
stirred
obtain
defragrans
in
(Biostat anoxic,
from
1992;
-80
containing
cell
iM
5-1
and selective
phase
to
phase
with
Germany) vials acid)
maintaining
transfer
°C.
for
harvest.
anoxic anoxic
in
obtain
bottles.
FoIl
nitrate-free
diluted
experiments.
(1 the
A, water;
20
or
Aerobic
and
in
mixing
1300x
strains
conditions
30-mi
mm and
addition Braun 100 Then
the
from
conditions
stock
manageable
3
Microorganisms and
98 in
,7-dimethyl-2
Large-scale
presented
pH
at
experiment. Harder mM
via
g
cultures
80
tubes.
medium, 5lMen,
the
room cells
contained
Biotech,
7.0
for
solutions.
of
an
ml
of
(Foil
rnonoterpene
A
and
an
were
20
temperature
(Macy internal
1998).
nitrate
The
of
concentrations
solutions.
were
twenty-mi
additional
54pT
transferred
cultures
and
30 mm
Melsungen,
,6-cis,trans-octadiene anoxic,
Geranic
two
reactions
transferred
Monoterpenes
°C. were
Harder
The
grown
in et
magnetic
at
isomers,
anaerobic A
al.
62Car,
4
phase nitrate-free
cultured
Incubation
on
with
Hungate
reductant,
acid
four
to
aliquot
°C),
1972).
1998). were
in
are
Germany)
monoterpenes
serum
by
phosphate
bar. an
(85%
blade
and
(10
3,7-dimethyl-2,6-
solely
the
started
without
internal
single-fed
gas
Monoterpenes
Cultivation were
technique
Reactions
of
to
65Phen
finally
flasks,
took
medium.
purity)
impeller
pellets
pressure
acid
22
frozen
calculated
equipped
by
diluted
magnetic
buffered
oxygen
mM place
50
(neric
frozen
were adding
batch
were
was
were
was
was
were
The
urn
on
cell
of
to
in at stopped by addition of 0.4 ml of 100 mM sodium hydroxide per ml of sample (geranic acid analysis) or by addition of 2 ml of hexane (monoterpene analysis). Preparation of anaerobic cell-free extracts and in vitro experiments. Cells were suspended in one volume of 100 mM of HEPES, pH 7.0, inside an anaerobic chamber and passed three times through a French Press cell at 7.6 MPa. Cellularfractions were obtained by centrifugation at 150 000xg for 45 mm. The reactions were performed anaerobicallywith 1-mi aliquots in 2-mi vials as described above for cellsuspension experiments.
Metabolite preparation. For the preparation of free fatty acids, 20 g wet cells were disintegrated with a French Press and then dialyzed against 0.75 1of distilled water for 24 h at
4 °C. The water containing the metabolites as well as the culture broth of the fermentation
(101)were acidified to pH 2.0 with sulfuric acid (60% w/v), and extracted three times with
0.1 1 of diethylether per 1 of sample. The combined ether phases were clarified by centrifugation (3800xg for 10 mm at 4 °C), and extracted three times with 300 ml of 50 mM
NaOH per I of ether phase. The aqueous phases were neutralized with HCL and concentrated by freeze-drying. For GC and GC-MS analysis, 10 to 20 mg of sample was derivatized with
2 ml 3BF in methanol (10% w/v) at 60 °C for 1 h and the methyl esters were then extracted with 1.25 ml of hexane. Control experiments revealed that this method yielded methanol adducts and rearrangements. Hence, trimethylsulfonium-hydroxide was applied to obtain methyl esters (Butte 1983).
Monoterpenes were recovered by addition of 2 ml of hexane per 5 ml of cell suspension, intensive mixingfor 10 mm, and phase separation by centrifugation (3800x g 10 mm at 4 °C). Camphene in hexanewas added as internal standard prior to GC analysis. For HPLC analysis of acids, lml-samples were stopped with NaOH solution and were incubated at 80 °C for 20 mm. After centrifugation (11300xg for 20 mm), the supernatants were acidified with 150 jil of phosphoric acid (1.5 M) and centrifuged again. Supernatants obtained were filtrated (pore size 0.45 .tm) prior to HPLC analysis.
Chemical analysis. Whole cell protein was determined after lysis by the method of
Bradford (Harder and Probian 1997). Nitrite and nitrate analysis by HPLC and monoterpene analysis by GC was performed as described (Harder and Probian 1995;FoB and Harder 1997). Organic acid methyl esters were analysed with the following temperature program: injection
99 port
of
Finnigan 5 temperature speed acid
Herrenberg,
eluent Identification and
Results
solvent
pH-controlled mM
nmol of
16 determination (mg
compounds derivatization,
anaerobic cultures 65Phen.
mm;
4°C
nitrate
mM,
standard
temperature,
were
protein)
of
of at
detection
mm1, nitrate
Monoterpene
nitrate.
Free
MAT
tolerant
that and
Free 1
I
separated
in
ml
monoterpene
Germany)
gradient
s
with
addition
the
other
200°C
were of
fatty
acids
mm1 decade’
min’. fermenter
8200
(FoB
These (mg
and
temperature,
metabolites
absence
250
to
a
grown
metabolites mass
containing
acids
at
on
system
by
GC
protein)1
for
et monoterpenes
analysis.
°C;
features
with
and
25
a
and
al.
RP-HPLC
0.1
of
as
DB-5
of
column and
mineralization
anaerobically
°C.
in
0.75
less nitrate
single 1998)
mm, an
(Finnigan, an
was
280
GC-MS
cells
UV-detection
ten
of
column
organic
of
ion
min* than
mM
increasing
temperature,
based
resistance
carbon °C.
fed-batch
the
a
on
consumption source
and
(Heyen
monoterpene
aqueous
10
Mass denitnfication
Bremen,
(0.32 a carrier
on analysis
on
This
kDa,
pathway
Sperisorb
atoms
culture
a-phellandrene
coherent
to
temperature
allowed
culture
was
spectra
mm
et
phosphoric
220 phase.
100 and
60 comprises
Germany)
were
for al.
performed
°C by
mm
culture
fluid.
rates
oxidation
present
OD
on
the data
of
1999). for acidic
process
30
Maximum
found
°C
22
methyl
2 m,
optimization
S2
of
in
sets
‘Whole
at acid mm,
fluids
in
according mM (Fig.
0.25 oxidation
Accumulation column
in as
in a
200
the
vivo.
did
rate
rate
from
and
increasing the
scan
esters
Alcaligenes
of
denitrification 1),
El
were
im
not
cells,
°C
of
monoterpene
culture of Alcaligenes acetonitrile
mode
but
and
GC-MS,
(5
film
10°C
hamper to
after
of surveyed
products were
31
not
by
water-soluble
at
bacterial
(70 to
thickness).
earlier
nmol
fluid
215 min’,
of
in separation 250
obtained
defragrans 200
eV)
retention
growth
cells
(45:55 rates
nitrite,
defragrans
and via and
of and
°C
monoterpene
mm,
with
220°C
growth quantitative
of
extraction,
the
at
in were
235
100
Organic
using
v:v)
on
Grom, cultures
a
a cellular
cells up
by
time,
scan
initial
strain
rate
nm.
mM
for
in
218
100
as
to
a
a
is
of
a grown anaerobicallyon acetate. Cumic acid (p-isopropyl-benzoic acid) was present in cells as well as in culture broth at concentrations of 25 and 20 jiM, respectively, after consumption of close to 22 mM of a-phellandrene and 100 mM of nitrate. Free geranic acid had accumulated to a concentration of 470 jiM in cells,but the culture liquid did contain only 2 jiM of geranic acid. Analysis of the monoterpenes supplied as substrate did not reveal the presence of geranic acid, as judget by GC and by HPLC with an UV-detection limit of I jiM of geranic acid. ‘Whencells from several fermentations on a-phellandrene or limonene and nitrate were analyzed by the HPLC method, geranic acid was found in the biomass of nitrate-limited, but not in that of monoterpene-limited cultures. In addition, anaerobic cells grown on acetate and aerobic cells grown on limonenedid not contain geranicacid. Monoterpene, geranic acid, and nitrate metabolism in anaerobic cell suspensions. Cells of strain 65Phen were grown with a limited amount of limonene to avoid denitrification from intracellular storage compounds in cell suspension experiments. The biomass was harvested in the late exponential growth phase and suspended under strictly anoxic conditions. Cell suspensions reduced nitrate and consumed ct-phellandrene with a specific rate of 123 pmol (mg 1protein) min* Heat-inactivated inocula did not metabolize the carbon source and the electron acceptor.
The biomass of nitrate-limited fermentations contained geranic acid and a residual
amount of growth-supporting monoterpene probably associated with lipid phases. The fate of
geranicacid was studied in such cells grown on a-phellandrene during a suspension experiment
(Fig. 2). In the absence of nitrate, the concentration of geranic acid increased from 101 jiM to
370 jiM in the assay. In denitrifying cell suspensions, the initial increase of geranic acid
stopped at 195 jiM. Nitrate depletion correlatedwith a further increase to 341 jiM of geranic
acid. These formation of geranic acid may originate from the microbial metabolism of residual
a-phellandrene. The denitrifying cell suspensions started to consume geranic acid after the
reduction of over 16 mM of nitrate. Three quarter of geranic acid present disappeared. Nitrate
reduction was at this stage of the cell suspension limited to nitrite formation, likely a sign of
electron donor limitation.
101 p-isopropylbenzoic acid methyl ester
•1 0 0.
0 U
t’J
geranic acid methyl ester
Retenilon timo (mm)
cells (bottom trace). Fig. 1. GC analysis of organic acids present in culture fluid (top trace) and in __
400
25 I - o 0 15 200 V 0
ci) • 10 100 . 0 A
0 0
0 30 60 90 120 150 180 210 time (h)
Fig. 2. Metabolism of geranic acid in the presence (•) and in the absence (0) of nitrate by dense cell suspensions of Alcaligenes defragrans strain 65Phen. Arrows show the addition of nitrate (9, 20 mM) after consumption.
The amounts of geranic acid formed in the different experiments were small with respect to the monoterpene supplied. Hence we tested various monoterpenes as precursors for geranic acid in nitrate-limited cell suspensions with 5 mM of nitrate and 4 mM of monoterpene. The denitrifying cells produced within two days 50, 54 and 68 p.M of geranic acid from u-pinene, limonene, and ct-phellandrene, respectively. The acyclic 3-myrcene supported the synthesis of 508 p.M of geranic acid, presenting a transformation rate of approximately 13% of the myrcene supplied. Cell suspension experiments with different amounts of myrcene indicated a tight correlation between yield of geranic acid to the supply of myrcene (Fig. 3). To test whether an acyclic monoterpene is essential, we examined citronellene and the growth substrate ocimene. These monoterpenes did not support geranic acid formation. Myrcene was not present, according to GC analysis, in the monoterpenes ct—pinene,limonene, and ct-phellandrene which did support geranic acid formation.
103 related Fig.
fractionated after recovered cytosolic
6% protein acid extract
of
3.
synthesis
cell
to
10mM
Geranic
for
ml*
Geranic
disintegration the
location.
to
10
to
amount
over
The
mm
of
locate
rate
acid
myrcene
acid
at -
reaction
90%
After
was
95
of
formation
the
formation 600 myrcene
by 400 500
300 200
°C
100
in
52
a
site
within
0
passage
inactivated small
the
required
pmol
of
0
soluble
by
provided.
geranic
lag
one
2
(mg
cell through
in
phase,
myrcene,
day
completely 4
fraction
proteiny’
cell-free
suspensions
acid
of
6
myrcene
the
a
incubation
formation.
104
French
8
but
reaction
after
mind
the
10
extracts.
did
of
Press
[mM] ultracentrifugation,
capacity
12
not Alcaligenes
(Fig.
at proceeded
The
14
a
require
under
Cells catalytic protein
4).
16
to
During
form
anoxic 18
linear
nitrate. defragrans
of
concentration
20
activity
geranic
strain
this
up
conditions
an
Incubation
to
time,
indication
acid
was
strain
65Phen
a
turnover
the
(Tab.
preserved
of
and
65Phen
geranic
of 10
for
were
1).
was
the
mg
of
a Tab. 1. Geranic acid formation by cell-free cyctosolic extracts. The assay were incubated for 20 h
Experiment Protein content Myrcene provided Geranic acid formed (mg m1) (mM) (mM)
Complete 10.1 10 0.590
- myrcene 10.1 0 0.000 + heat treatment (95°C for 10 mm) 10.1 10 0.000 + nitrate (20 mM) 10.1 10 0.581 diluted extract (1:5) 1.85 10 0.127 diluted extract (1:10) 1.15 10 0.029
700
D 600 - 400 -
300 D 200 . Q 100. V
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 time (h)
Fig. 4. Time- and protein-dependence of geranic acid formation by cell-free cytosolic extracts. Protein concentration 1):(mg.m1 0 10.1, V 1.85, A 1.15.
Growth experiments with Alcaligenes defragrans. Myrcene supports denitrifing growth of Alcaligenes defragrans strains 51Men, 62Car and 65Phen, but not growth of the type strain 54pjriT (FoB et al. 1998). In an extended survey, ocimene was identified as the first
105 monoterpene-limited verify as acyclic
mM in
detectable biomass
methylcyclohexenes. neric
strains. cyclohexa-
The Discussion
monoterpenes, 1
absence contains
monoterpenes and dimethyl-2,6-octadienic obtained were
well HPLC
-ene
the
control,
mineralization
of
Probian
as
acid
grown and
the
late
monoterpene
Other
analysis
a-phellandrene
the
of
Molecules
formation
complete
many
y-terpinene. from
in
stationary
(0,5
1
of the
,4-diene,
mass
these
anaerobically
substrates
1995).
a-phelland.rene
cosubstrate,
as
mM)
review the
unknown with
spectrum
substrates
cultures.
of mineralization
of
initial
that
experiments were
lacking
Cumic
In
growth
did
hydrocarbons
mass
Trudgill
18.4
went
this
tested
acid,
supports
not
not
on
anaerobic
features
indicated
anaerobic
acid
spectra,
and
study,
phase.
for
monoterpenes.
the
was
utilized,
with
support
was
as
1994
(0.5
the containing
21.6
sole
of
found
isopropyl growth
the
studied
by (Fuchs we The
myrcene.
hydrocarbon the
FID
mM)
isolation
bacteria
organic
lurescia
in
mg
denitrification
aerobic
denitrification
describe
trans,trans
as
consumption contrast
of and
and
protein
major
1
with
1999).
The
all
carbon
have
mM
106 group,
After
et UV-scan
of the
microorganisms
four
identification
the a!.
metabolite
to
anaerobic, Alcaligenes
activation available
of
to
II,
Interested
configuration.
the
strains.
15
source
1999;
monoterpene
use
first
and
of
1-methyl-cyclohexene
of
days
respectively.
corresponding
detection.
7.6
0.90
a
growth
identification
van
different isomer
included
The
formed
nitrate-respiring
of
reaction.
and
defragrans
of
mM
in requires
der incubation,
degradation
geranic
8.1
alkenes,
of
mixture
Retention
and
Werf
in
of
monoterpenoic
biochemistry,
Alcaligenes
Geranic
nitrate-limited
mM
monoterpenes,
Geranic
myrcene
20
molecular
acid
of
et
strains
of
mM
the
we
of
of
an
al.
involved geranic
bacteria
time
and
acid
myrcene
cultures
nitrate
of acid,
chose
ionic
1999).
and
oxygen
65Phen defragrans
nitrate,
analysis
which
1-methyl-
acids
was
acid
cells
of
EE-3,7-
product
(Harder
menth
GC
natural
and
In
were
0.97
and,
and
and not
(for
still
that
and the
to
in
a
as
Acknowledgement.
study
alkene
frontier are
on
monoterpenes
myrcene,
the
Thermal
order
attributed
precursor
1985;
monoterpenes
the
synthesized
menthane
was
to
Cruz
transformation
anaerobic
Experiments
of
become
rearrangement
respectively.
to
supported
of
enzymatic
Costa
the
carbocycle
geranic
via
(a-pinene,
via
fact
acyclic.
formation
et
ionic
cationic
We
al.
by
with
that
has
acid.
catalysis.
The
of
1996).
thank
intermediates
the
(En-nan
provided
Ring
the
limonene,
a-
Myrcene
cell
intermediates
mechanisms
of
Max-Planck--Society
other
Peter
and
The
geranic
opening
1985).
The
suspensions
the
compounds
f3-pinenes
opposite
Schuize,
and
development
transformation
has,
means.
acid
A
reactions
involves
a-phellandrene)
(Croteau transformation
to
from
107
Universität
is
and
our
is
well
have
and
biradicals
monoterpenes
can
industrially
of
knowledge,
1987;
cell
known:
the
to
went
the
involve
experience
Deutsche
of free
Bremen,
Gibbs
and
first
and
with
cyclic
all
ionic
extracts
used
myrcene
in
never
comprises
natural
1998).
will
higher
for
monoterpenes
Forschungsgemeinschaft.
vitro
a
or
to
ring
expand
GC-MS
been
Hence,
radical
cyclic
showed
obtain
assay
rates.
served
opening
a
reported
decyclization
our
analysis.
monoterpenes
future
intermediates.
This
for
ocimene
as
into
that
knowledge
reaction
anaerobic
metabolic
may
(Erman
studies
acyclic
cyclic
This
and
be
of in References Aeckersberg,
Butte,
Coschigano,
Cruz Croteau,
Dolfing,
Erman,
Fo!3,
Fo13,
Fo13.
Fuchs,
Gibbs,
Gilewicz,
Harder,
Harder,
Heider, Heyen,
by
using
Appi. involved
and
characterization Cat. Arch.
Dekker,
isomerisation
7
on App!.
isolated and
Microbiol.
Vol. 31-118.
25 Costa, oxygen. 1-n-heptadecene S., denitrifying
hydrocarbons.
denitrifying S.,
S.,
1-75.
W.
a
2-256. G.
R.A. W.F.
Harder, oxygen-containing
A:
nitrate. new J., Heyen, radical
J., R.
Harder,
trimethylsulfonium J.,
U.,
1.
M.,
Environ. (1983)
J.,
Microbiol.
(1999)
Microbiol.
Probian M.C.,
Chem.
Spormann,
(1987)
Academic
Inc.,
(1985)
P.W., in Probian (1998) F., on
type
Appi.
In:
Monpert,
Harder,
Zeyer,
anaerobic
Rev.
Bak,
J.
alkenoic rearrangements
U.,
Syst.
bacterium. Johnstone, A New J.
M.
Rapid
of Novel
(1998)
of
104:
Wehrman,
icaligenes
Microbiol.
C. Environ.
Biosynthesis
FEMS Chemistry
(1997)
Harder
Prenyl
22: of F., sulfate-reducing
linalool
Sinnott 154:
21:
C.
Appi.
York.
(1995) by
J. Press,
J.,
G., a
A.M., 251-259. Widclel,
method
339-340.
reactions
bacterium
(1997)
365-373.
monoterpenes
toluene
Thauera
(1998)
336-341.
a
Acquaviva,
Microbiol.
monoterpenes J. transfer
Binder-Eicher,
Microbiol.
R.A.W., Arch. Basel.
Microbial
London.
hydroxide
marine
Microbiol.
defragrans.
(ed.),
T.S.,
to
Microbial
Beller, (1998) 64:
of
F.
for of
geraniol
and
Anaerobic
metabolism
the
(1991)
Cometabolic
1650-1656.
Microbiol. linaloolentis
and
that
a- Young,
Comprehensive
Whittaker, the
and
bacterium.
denitrifying
H.R.,
Alcaligenes monoterpenes:
catabolism
Rev. M.,
21: catalytic
and
transformation
for
degradation
61: mineralizes
determination
((+)-menthene,
the
FEMS
Anaerobic
without Mule,
237-244.
(linalool, trans-esterification.
22:
Widdel,
3804-3
L.Y.
3-pinene
mineralisation
P.,
enzymes
by
167:
J.D.
45
sp.
isoterpinolene Microbiol.
108
Arch.
G., mechanisms
strain
of
9-473.
(1998)
defragrans
Schwarzbach,
nerol 269-274.
bacterium.
nov.
(1996) 808.
F.
biological
of
Bertrand, toluene
oxidation monoterpenoids.
menthol
An
by
Ti:
Microbiol.
of
(1999)
monoterpenes
of of
and
formation.
a-pinene,
encyclopedic
metal(IV)phosphate
terpenoid
Identification
fatty-acid putative
Cataysis
a
Lett.
of in
Thauera
in
tertiary
sp.
J.C.
and
of
Appi.
Anaerobic
catalysis:
the J.
formation
cholesterol
anaerobic
169:
Chrom.
nov.,
saturated
R.P.
156:
(1991)
eucalyptol)
role
absence
of
2-carene
FEMS
and
profiles
Microbiol.
67-71.
terpenica in
allylalcohol: gas
Chem.
handbook,
4-14.
description
of
(1990)
the
a
and
steroid
261:
bacterial Anaerobic
and
microorganisms.
a
mechanistic hydrocarbons
of
Microbiol. from
by
glycine
absence
and
Rev. from
polymers.
analysis
molecular
142-145.
liquid
and
sp.
a
biosynthesis,
a-phellandrene)
Biotechnol.
Isolation
Part isolimonene
novel
of 87:
metabolism
nov.,
regioselective fats
nitrate.
free
of
oxidation phase
four
A.
Lett.
of
929-954.
reference,
molecular
and
oxygen.
J.
radical.
to
isolated type
Marcel
genes
strains
FEMS
ionic
Mol.
CO2
Syst.
149:
oils
and
pp.
36:
of
by
of
of
Trudgill,
Widdel,
van
So,
Macy,
Rueter, Lovley,
Leuthner,
lurescia,
Heyen,
C.M.,
A. 2092-2102.
contains
33-61.
Anaerobic
Publishers, bacteria.
anaerobically Pseudornonas
(1989)
Clin,Nutr. aromatica:
297-3 A
(1998)
metabolism.
M.J.
der
Icaligenes
J.M.,
Balows,
P.,
F.,
Ed,
U.,
S.,
D.R.,
Werf,
P.W.
Young,
B.,
00.
Rabus,
(1999)
Bak
Oxidation
Biochemical
In: Marconi.
Springer,
Snellen,
Probian,
Nature
Leutwein,
a
(1994)
H.
Dordecht,
25:
Baedecker,
M.J.,
oxidation
F.
C.
a
defragrans,
novel
Mol.
L.Y.
R.,
degrades
G.
(1992) new
sp.
1318-1323.
Ratledge
Identification
372:
J.E.,
Truper,
Wilkes,
Swarts,
Berlin.
A.M.,
strain
of
Microbiol.
C.,
(1999)
Microbial
degradation
glycyl
C.,
aromatic
and
The
455-458.
Hungate,
Gram-negative
of
FoB,
Schulz,
M.J.,
alkanes.
Tofani,
Ml.
in
H.,
M.
(ed.),
H.J.,
genetic
hydrocarbons
Netherlands.
Isolation
preparation.
radical
S.,
Aeckersberg,
Dworkin,
Appl.
28:
Lonergan,
metabolism
contaminants
de
H.,
and
R.E.
Biochemistry
D.,
Appi.
Harder,
pathway
615-628.
characterization
Bont,
Hörth,
Environ.
enzyme
Gambacorta,
and
(1972) sequencing
mesophilic
Environ.
W.
characterization
D.J., J.
in
J.A.M.
P.,
Harder,
F.,
and
109
for
(1999)
Microbiol.
Use coupled
crude
catalysing
Haehnel,
Rainey,
of
Cozzarelli,
transformation
Microbiol.
limonene.
A.,
of
(1999)
sulfate-reducing
microbial
of
and of
oil
syringe
Monoterpene
Paternô,
to
benzylsuccinate
F.A.,
K.H.
W.,
-myrcene
65:
microbial
by
the
of
Rhodococcus
Schlitz,
I.M.,
65:
Jannasch,
2871-2876.
Appl.
Schleifer
new
methods
a
first
degradation.
A.,
sulfate-reducing
of
2969-2976.
Phillips,
Devirgiliis,
types
iron
bacteria,
selected
step
E.,
Environ.
tolerance
catabolism
(eds.),
H.W.,
for
synthase
Schagger,
reduction.
in
of
erythropolis
anaerobiosis.
E.J.P.,
monoterpenes,
Kluwer
anaerobic
p.
The
Widdel,
sulphate-reducing
C.,
Microbiol.
3352-3378.
of
bacterium
from
van
Prokaryotes,
H.,
genes
Nature
denitrifying
Siegel,
Academic
F.
Heider,
der
Thauera
DCL14
toluene
(1994)
Am.
Werf,
from
339:
D.I.
that
pp.
65:
In:
J. J. Max-Planck-Institut
Monoterpene
Udo
for
Heyen,
tolerance
Marine
Christina
Microbiology,
Manuscript
of
Probian,
denitrifying
4
in
110
Celsiusstr.
Sabine
preparation
FoB
Alcaligenes
1,
and
D-28359
Jens
Harder
Bremen,
defragrans
Gennany Abstract
Organic solvents are toxic for microorganims. We now report that Alcaligenes defragrans tolerates a pure monoterpene phase during denitrifying growth, i. e., 30%
(vollvol) limonene. Molecular analysis of enrichment cultures on monoterpenes and nitrate revealed a large population of Alcaligenes defragrans-affiliated bacteria, indicating an ecological advantage of the monoterpene tolerance.
Introduction
The isolation of anaerobic microorganisms on water-soluble hydrocarbons is severely hampered by the toxicity of the substrates. Alkylbenzenes and monoterpenes have partition coefficient values of log PoctanoI/,ater between 1 and 5 and are, in general, toxic (van der Werf 1997; Isken and Bont 1998). The toxicity is due to accumulation in cell membranes, causing finally a disruption of the protein-lipid bilayer structure and the membranepotential (Sildcema et al. 1995). Hence, successful anaerobic growth procedures maintained a low concentration in the aqueous phase either by a repeated fed (Altenschmidt and Fuchs 1991) or by an organic carrier phase that is nearly water-insoluble, not biodegradable,and not toxic, e.g., mineraloil or
2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane (Rabus et al. 1993;Harder and Probian 1995).
Ten years ago, the first aerobic bacterium was isolated that thrived in the presence of
50% (vollvol) toluene (Inoue and Harikoshi 1989). Next, solvent-tolerant bacteria were cultivated that utilized the organicphase, e. g. grew on 50% (vollvol) p-xylene (Cruden et al.
1992; reviewed in Isken and Bont 1998). In this study, we show that anaerobic microorganismsalso possess the physiological capacity of tolerance towards organicsolvents.
111 Results
procedure
heptamethylnonane (Harder
Harder applying at method al. collection. monoterpene
monoterpene experiment.
54PinT, of linaloolentis
tolerance a-pinene
of Strain
of Essential without
organic first
large
660
protein
monoterpene).
1998)
protein
example
mm
Resistance amounts
54pT and
of
and
The
solvents.
62Car,
anoxic
an
and
towards and
and
oils
\Vhole Bradford
per Probian
Due
of
organic per
In
Probian
grew
high
concentrations
supplied
thrived
a-phellandrene, Discussion containing
mol
for the Thauera
of media monoterpene-degrading
and
mol
to
cells
monoterpene
One on
Alcaligenes
of
an
cyclopropane of growth absence
1995;
carrier
(HMN)
the
as
their
65Phen, Alcaligenes
1995).
of
nitrate also
anaerobic
were
and
tolerance
described
formed
nitrate low
spp.
FoB
only
isolation phase. on
cultivation
substrates:
of lysed
Now are
as
consumed
30%
et
solubility,
Thauera
defragrans
monoterpenes strains
respectively, the
resistance organic
only
an mechanism
al.
consumed bacterium
(Harder
fatty in
defragrans
we (vollvol)
HMN
substrate
1998).
organic
hot,
calculated
techniques
tested
they (FoB
on
phase
acids
terpenica
alkaline
50
denitnfying and
of Biomass
phase,
2
strains
with
on
limonene. of phase
mM
prospered
that
Alcaligenes in
and
to
the
in (lemon against
Probian
to
112
Alcaligenes
30°/o
values
the
monoterpene-grown
the 200 solution,
of corresponded
as reduce
all
biocidal
Harder
strains
54pT
in formation
presence
monoterpene
described
physiological Alcaligenes
(vol/vol)
oil,
j.tM The that
a the
1997).
on
bacteria
monoterpene
defragrans the
spruce
and
2lMol 1998)
defragrans effect
biomass and relate
culture
concentrations
(Weidenhamer
of
toxic
was Alcaligenes
protein
earlier
limonene
to
65Phen
a
needle
to defragrans
were of and
monoterpene
measured
comprised
3%
and
tubes, effects trait
yield
the
is, different
(Widdel
cells
10
was
may (voL/vol)
phase.
oil) from 58EuT,
to
aqueous
exhibited
of mM
and
decreased
defragrans
of determined
our and
et
of
(FoB
be were
tolerance
turbidimetrically
strains,
up of
10 our
and
al.
morioterpenes monoterpenes
the knowledge,
Our
2,2,4,4,6,8,8-
phase
all
and monoterpene.
nitrate
phase
mM
to et
also
Bak
1993), an
presence laboratory
presented
from isolation
al. 200
Thauera
51 (FoB
extreme
by towards (4
utilized
nitrate.
1992;
in
to
Men,
1998).
mM
mM
the 10
the
the
2
the et
of
g
g However, the physiological role of cyclopropane fatty acid synthesis is not well understood
(Grogan and Cronan 1997).
Resistance of Alcaligenes defragrans 54PinT against monoterpene alcohols. The toxicology of monoterpenes and monoterpenoids, as defined by studies with aerobic organisms, has shown that monoterpenoids are more toxic than monoterpenes, causing a reduction of the energy conservation rate (Knobloch et al. 1986). Alcaligenes defragrans does not utilize monoterpene alcohols and ketones (FoBet al. 1998). Hence, we tested the effect of monoterpene alcohols on growth of Alcaligenes defragrans 54PinT on 20 mM of acetate,
2 mM of a-pinene (diluted in 0.5 ml of HMN) or 20 j.tlof spruce needle oil (Roth, Karlsruhe,
Germany). The presence of 1 mM of (-)-carveol, (-)-myrtenol, (+)-isopinocampheol,
(+)-isopulegol, menthol, (+)-perilla alcohol, or cis-verbenol impaired marginally growth on acetate, 4 to 8 d* In contrast, these alcohols caused reduced growth rates and biomass yields during growth on a-pinene or spruce needle oil. The extent of inhibition depended on the individual monoterpenoid and on the amount of substrate present. Carveol, myrtenol and perilla alcohol completely suppressed growth on 2 mM of a-pinene diluted in a HMN phase above 100 iM of alcohol. Nitrate reduction on 20 p1 of spruce needle oil, that corresponded to a menthadiene concentration of 8.6 mM, was not observed in the presence of 1 mM of carveol within one month of incubation. Enrichments of denitrifying bacteria on monoterpenes in the absence of HMN.
Originally, we isolated on four different monoterpenes four strains of Alcaligenes defragrans but no strain of another genus (Harder and Probian 1995; Fo13et al. 1998). To test whether the solvent tolerance of Alcaligenes defragrans may contributes as major selection factor, we started enrichment cultures without an organiccarrierphase. The culture bottles contained 200 ml of freshwater medium with 10 mM of monoterpene and 5 ml of activated sludge as inoculum. Overpressure due to gas formation was determined with a gas-tight syringe and depletion of nitrate (initially 10 mM) was observed with a semi-quantitative indicator strip
(Merck, Darmstadt, Germany). Upon electron acceptor depletion, 10 mM of nitrate were re-established in the enrichment culture by addition of an anoxic nitrate stock solution (5 M).
Microbial growth and consumption of totally more than 30 mM of nitrate was observed within five weeks with menth- 1-ene, all menthadienes tested (a-phellandrene, a-terpinene,
113 ‘-terpinene,
Alcaligenes
added
fluorescent
were
In genera
labelled Ade441
defragrans-related inoculum
(Tab.
1999).
Table
monoterpenes
Culture
Alcaligenes
Activated
Enrichment
a
nested
a-phellandrene y-terpinene a-terpinene
menth-1-ene limonene
geranic labelled
organic
1).
Thauera
Bacteria
competitor
1
for
(activated
approach
sludge in defragrans
Alcaligenes
limonene)
acid
Detection
with
defragrans
cultures
situ
carbon
(10
detectable
and
(inoculate)
the
mM)
hybridization
probe,
bacteria
sludge,
Azoarcus (Amann
on
fluorescent source.
and
in
defragrans
of by
(pure
these
geranic
GAM42a,
fluorescent
with Table
Alcaligenes
were
et
strains)
To
plus
al.
enrichment
the
with
dye
acid,
identify 1). a
were
1995),
major
Alcaligenes
After
probe
for
Cy3.
in
but
I
6S
situ
applied defragrans
Proteobacteria
probes
part
Probe-positive not the
18
successful rRNA-targeted
EUB338
cultures,
Ade441
hybridization.
77
96
(Biological
with
growth
114
43
75
81 77
63 ± 83
of
±
as
defragrans,
EUB338
10
2
the
described
a-pinene,
in
were
the
growth
microbial success
of
denitrifying
cells
Detection
BET42a
36
cells
97
the
for
oligodeoxynucleotide present
45
68
56 79 65
33 ±
±
/ and
(Manz
p-cymene,
of
beta
Bacteria,
1 DAPI-stained
2
grown
of
1
the population
the
bacteria
Systems,
subclass,
in
enrichments,
et
enrichment
AT1458
were
species-specific
94
small
4
al.
BET42a
30 49
40 17 menthol
27 ±
12
±
closely
4 1992;
6
cells
characterized
Pittsburgh,
AT
or
amounts
dominated
1458
(%)
probes
Rabus with
or
Alcaligenes
cultures
related
Ade441
97
without 3
for 41 54
63
29 ±
a
in
±
probe
0
et
Pa.).
non-
3
that
2
the
by
the
to
al.
on
it
H..
by
Acknowledgements
hybridization
bacteria
an and
440.
Concluding
coli problem
Eco
The
(Rabus
the
anaerobic
can
1455
(Fuchs
probe
Max-Planck-Gesellschaft
be
et
in
of
and
biotechnology,
selectively
a!.
AT
the
et
remarks.
Eco
solvent-tolerant
and
1999)
al.
1458
in
situ
1998),
1464
Dr.
specific
detected
We
enriched
accessibility
Andreas
Alcaligenes
have
the
e.g.,
thank
probe
for
only
biocatalysis
bacterium apparently
on
Schramm
and
the
Dr.
monoterpenes
37%
defragrans
of
Eco440
Azoarcus-Thauera
a
Rudi
the
grant
and
opens
for
less
16S
in
has
Amann
4%,
from
115
helpful
organic
rRNA.
tolerates
cells
one
new without
respectively,
the
of
for than
solvents.
discussions.
Deutsche
horizonts
According
the
the
group
providing
a
the
carrier
presence
brightest
probe
of
and
Forschungsgemeinschaft
for
to
the
phase.
This
for
the
a
Ade44
the
of
brightness
signals,
study
Alcaligenes
study
a
facilities
This
application
monoterpene
1.
with
whereas
first
was
This
of
Escherichia
for
example
defragrans
supported
probe
may
of
in
probes
phase
to
such
be
situ
Eco
of
J.
a I References
Altenschmidt,
Amann,
Cruden,
Foil,
Foil,
Fuchs,
Grogan,
Harder,
Harder,
Inoue,
Isken,
Knobloch,
Manz,
Rabus,
Rabus.
sp.:
intermediate. of Pseudornonas
Appi.
on Appi.
isolated and
cytometric
labeled
Microbiol.
oxygen.
denitrifying S.,
S., 338:
229-23
monoterpenoids essential
oligodeoxynucleotide solutions.
strictly
Anaerobic of
1444-
1:
individual
A.,
B.
oxygen-containing Harder, S., D.
Heyen,
R. J.,
denitrifying 145-157. R.,
nitrate. R.,
D. indication
W,
J.,
264-266.
Environ.
Microbiol.
L.,
I.,
Probian M., Horikoshi
de
W., 145
oligonucleotide
Nordhaus,
8. Wilkes,
K., Probian
on
anoxic
App!.
Amann,
Ludwig,
U.,
oil
Wolfram,
Bont,
System.
1. Mol.
J.
Wailner,
Cronan,
U., analysis alkenoic
utilization
Syst.
Weigand,
microbial
bacterium.
research.
Arch.
Fuchs
(1998)
strain
C.
Environ.
Microbiol.
Harder
for
conditions
bacteria
Biol.
H.,
J.
21:
C.
K. Appi.
W.,
(1995)
on
R.,
R.,
A. Microbiol. Appi.
G.
of
J.
J. toludne
(1989)
(1997)
Schramm,
365-373. monoterpenes
Thauera
which G.,
Rev. Schleifer,
energy
cells (1 E. H.,
Walter
of Ludwig, M. the
H.,
J. probes.
monoterpenes
probes
Ludwig, Microbiol.
Arch.
99
Microbiol.
affiliating
(1997)
Beisker, (1998) Microbial
alkylbenzenes
MicrobioL.
Rogers,
58:
in
(1998)
by 61:
Weis, without
1)
A
grows
Anaerobic
methyihydroxylation
situ
Anaerobic
Microbiol.
metabolism. linaloolentis de
a Pseudornonas
2723-2729.
156:
429-441. Appi.
W.,
for
K.H.
A., new
Cyclopropane
Gruyter,
W.,
Alcaligenes
accessibility
N.,
R.
21:
W,,
with
Bacteria
with
cultivation.
degradation
61:
152-158.
Harms,
((+).menthene, the
Widdel
sulfate-reducing
15:
(1995) Environ.
D.,
Schwarm, 237-244. (linalool,
Wagner,
3804-3
Schwippl,
and p-xylenein
mineralisation
the
593-600.
degradation
major
Gibson,
167:
Berlin.
sp.
pp.
n-alkanes G., F.
116 tolerant 13-subclass
Phylogenetic
thrives
defragrans
of
269-2
Microbiol.
nov.
808.
(1993)
ring
Microbiol.
of
429-446.
Behrends,
subclasses
Escherichia menthol
M.,
H.
D.
monoterpenes
1.,
formation and
and
a 74. ct-pinene,
in T. bacterium.
of
M.,
to
from two-phase
Schleifer,
Ludwig,
high
of Complete
toluene
(1992) of
Thauera
benzoyl-CoA
sp.
organic
64:
Proteobacteria. Vigenschow
and
In: identification Rev.
A.,
of
cholesterol
concentrations
crude
nov.,
coli
4973-4982.
E.J. eucalyptol) in
Amann,
Proteobacteria: 2-carene
Physiological
W., in
59:
App!.
membrane
K.H. 1
in terpenica
(organic-aqueous)
solvents.
oil denitrifying oxidation
6S
description
Brunke
143-169.
the
Amann
in
rRNA
Environ.
H.
as
R., by
(1992)
an
absence and
and
Environ.
and
(1986)
central
of
enrichment
sp. a
Widdel (ed.),
Extremophiles
lipids
for in
of
a-phellandrene)
R.
properties
toluene.
novel
Pseudoinonas
of
situ
nov.,
nitrate.
Microbiol. problems
toluene
fluorescently
of
Phylogenetic
1998.
four
of
Progress
detection
Action
aromatic
molecular
R.
Microbiol.
medium.
bacteria.
type isolated
strains
Nature
(1999)
culture
Syst.
Flow
of
under
and
59:
of
a
of
2:
in Sikkema, J., de Bont, J. A. M., Poolman, B. (1995) Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiol. Rev. 59: 20 1-222. van der Werf, M. J., de Bont, A. A. M., Leak, D. J. (1997) Opportunities in microbial biotransformation of monoterpenes. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 55: 147-177.
Weidenhamer, J. D., Macias, F. A., Fischer, N.H., Williamson GB. (1993) Just how insoluble are monoterpenes? J. Chem. Ecol. 19: 1799-1807.
Widdel, F., Bak F. (1992) Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria, p. 3352-3378. In: A. Balows, H. G. TrUper, M. Dworkin, W. Harder, and K.H. Schleifer (eds.), The Prokaryotes, 2nd Ed. Springer, Berlin.
117 Max-Planck-Institut
Jens
for
Harder,
Marine
Denitrification
Udo
Microbiology,
Manuscript
Heyen,
Christina
5
on in
118
Celsiusstr.
preparation
essential
Probian
1,
and
D-28359
oils
Sabine
Bremen,
FoB
Germany Abstract
Essential oils represent a surrogate for plant volatile organic compounds, a major carbon source in nature. Enrichment of anaerobic microorganisms was attempted from sewage sludge, with essential oils as organic substrate and nitrate as electron acceptor. Lemon and pine needle oil supported microbial growth in the presence of pure oil, whereas parsley seed, camphor, sage, fennel, and mint oil were only utilized when the essential oils were diluted in 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane. Thyme oil did not support denitrification. GC analyses of the essential oils after microbial consumption revealed the disappearance of monoterpenes, of several monoterpenoids, and of methoxy-propenyl-benzenes. Most-probable-number determinations for denitrifying populations in sewage sludge and forest soil yielded 106to 7i0 monoterpene-utilizing cells m1’, representing a significant portion of the total cultivable nitrate-reducing population. This common occurrence of the metabolic trait together with the utilization of essential oils suggests that plant hydrocarbons and other volatiles released from litter and roots may be anaerobically mineralized in the soil, thereby restricting the diffusive flux of these greenhouse compounds into the atmosphere.
119 Introduction
Plants
Monoterpenes
unsaturated plants
herbivores:
Pare
products,
volatiles
products. compounds
Billing monoterpenoids,
monoterpenoids
bioavailability
of
monoterpenes as
inhibition
we a Alcaligenes
1988). essential
isolated
degrading
1998).
few
alcohol
one
investigated,
and
produce
(Sharkey
years
Essential
Monoterpenes
and
The
contain target
Tumlinson
that monoterpene
oils
The
and
of
plants
hydrocarbons
and
population
(Harder
defragrans contribution
Sherman
ammonium
under
mineralizes
ketone
are
caused
in
latter
volatile
and
oils
site
sequiterpenes.
are
mainly
forest
to
induce
a
as
major
are Singsaas
anoxic,
and
our
1997).
more utilization
where
by
groups
defined
and
alcohols
1998;
organic
obtained
litter
Probian as
in
a the and
knowledge
monoterpenes
of that
group
monoterpenes
higher
monoterpenoids
toxic
inoculum.
denitrifying
Monoterpenes
enrichment bacteria
monoterpenes
synthesis
1995).
which methane
may
Hulin
contribute
The
compounds
and
by
is
by
of
1995; watersolubility
than
cause,
based
ketones, these
oils steam
can
A
for
studies
related
et
oxidation Alcaligenes
monoterpenes.
reviewed
second upon
react
are conditions
the and
al.
cultures
together
anaerobically
volatiles. according
on
distillation
are
that are
used
phylogenetically
act are
first
1998).
insect monoterpenoids
antimicrobial
with
with
120
physiological
known
also
named
(Ward
in
diffuse
(Sikkema
(Weidenhamer
as time,
with
was
defragrans Hylemon
proteins.
Primarily
using
to
damage
The oxidized
aerobic
flavours,
of
recent
This
to
monoterpenoids.
et
(Harder
isoprene
the
plant
determined
into
sewage
be
al.
toxicology
properties
et
(Gershenzon biodegradability
is
Membranes
anaerobically
and
function
1997;
studies, synthesized
to
in the
parts.
organisms,
together
fragrances
represents al.
presumably
et and
Alcaligenes
to
plants
Harder
sludge,
atmosphere
al.
1995).
Amaral
the
Probian These
by
an
1993)
of
is
(Janssen
with
thermal by
the
1998). ecological
forest
have
and and
monoterpenes whole
monoterpenes
biodegradable
the has
The
mixtures
et
oxygenases.
due
and
defragrans
of
defence
1995;
some
pharmaceutical
Croteau
al.
been
first and
representative
ditch
In
shown tolerance
the
et
presence
to
1998;
cell
this
important
the
FoB al.
identified
aromatic
bacterium
presence
of
a
against
mud,
in
1991; higher
study,
plant
White 1987;
soil.
to
The
et
since
that
are
and
of
situ
the
of
al.
or hybridization with fluorescent 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes. The population size of denitrifying monoterpene-utilizing bacteria was appraised to test whether the metabolic capacity is common in nature.
Materials and Methods
Culture conditions. Anoxic media and cultivation techniques were used as described
(Widdel and Bak 1992; FoB et al. 1998). Alcaligenes defragrans strain 54PinT was from our laboratory culture collection. Experiments performed with the species included a chemical reductant, 4 mM of ascorbate. Due to the low solubility, all presented monoterpene concentrations are calculated values that relate to the aqueous phase in the experiment. Natural oils (Italian lemon oil, pine needle oil, parsley seed oil, camphor oil, Dalmatian sage oil, fennel oil, mint oil (China), and thyme oil) were obtained from Roth, Karisruhe, Germany.
Enrichment cultures on essential oils were attempted in 250m1-round bottle flasks with
5 ml of activated sludge or 20 ml of a mud-ditch water slurry from a forest ditch as inoculate.
The cultures were incubated for four months at 28 °C in the dark. Overpressure due to gas formation was determined regularly with a gas-tight syringe and depletion of nitrate (initially
10 mM) was observed with a semi-quantitative indicator strip (Merck, Darmstadt, Germany).
Upon electron acceptor depletion, 10 mM of nitrate were re-established in the enrichment culture by addition of an anoxicnitrate stock solution (5 M).
The size of denitrifying populations in activated sewage sludge from a localwastewater treatment plant (Lintel, Osterholz-Scharmbeck, Germany) and in soil of a local forest near
Bremen was estimated with most-probable-number dilutions in liquid medium (APHA, 1969).
MPN counts were performed in steps of a tenfold dilution with three portions per dilution.
Each portion contained 10 ml of freshwater medium including 10 mM of nitrate (FoB et al.
1998) and (i) a mixture of acetate, butyrate, succinate, lactate and ethanol (1 mM of each compound), (ii) a mixture of eucalyptol, 2-carene, a-pinene, (+)-sabinene and a-terpinene
(0.3 mM of each compound in totally 0.4 ml of HMN), or (iii) 1.5 mM of a-terpinene in
0.4 ml of HMN. The MPN culture tubes were incubated for eight weeks at 20 °C in the dark.
121 They
degrees
performed by determined
Turbochrom Germany)
column
2 column 320 was
based authentic Alcaligenes
Formácek
oligodeoxynucleotide Detection Alcaligenes
Proteobacteria EUB338
were
ml
capillary-column
°C
performed
were
mm’,
applied
Chemical
on
above
In
at
temperature,
(0.32
standards.
a
and
relative placed
for with
equipped
quantitatively
Systems,
situ rate
and
digital defragrans,
defragrans
the
mm
as
Kubeczka
Bacteria,
of
of
as
an
described
the
horizontal
hybridization on
by
analyses.
40
retention
data-analyzing
described
the
indicatior
The
a
60
GC
following
with
Pittsburgh,
50
probes °C
rotary
beta
°C
m,
(1982).
composition
and
min’, by with
in
BET42a
(Manz
flame for
to
0.25
HPLC
enrichment subclass, shaker
times,
Semi-qantitative
that by
the
strip
improve 2
a
temperature
320
mi
Perkin-Elmer
Harder
im
Pa.).
with
species-specific ionization et
system.
were
with (Merck, (Harder
(60
al.
°C
mass
increasing
film
of
AT1458
the In
1992;
rpm)
for labelled
oligodeoxynucleotide
and
the
cultures
a
thickness,
Compounds
a
spectra
bioavailability
5
and
non-labelled
Darmstadt,
programs:
nested
essential
detectors,
Rabus
in
Probian
mm;
122
measurements
Autosystem
to
Probian
an
with
for
probe
140
flame
was
inverted
and,
et
approach
the
Macherey-Nagel),
the
oils
(1995).
al. °C
were
injection
a
1995).
detected Germany).
ionization
genera in
Ade441
of
1999).
competitor at
fluorescent
agreed
CTC
position
the gas
a several
separated
rate
of
Compound
(Amann
Monoterpenes
monoterpene.
chromatograph
Thauera
A200S probes.
port
with
nitrate
of
for
with
detector
Nitrate
cases,
4 with
dye
Alcaligenes probe,
by
°C
analyses temperature,
H2
et
autosampler
16S
consumption
using miW’,
and
an
Cy3.
The
identification
al.
at
comparison
350 and
angle
were
a
rRNA-targeted
GAM42a,
Azoarcus
1995),
18
an
published
increasing flow presence (Uberlingen,
nitrite
°C.
defragrans
(Biological
Optima-S of
analysed
270
GC-MS
rate fifteen
probes
and
were
were
with
was
plus
°C;
by
for of
to
of
a Results
Enrichments of denitrifying bacteria on essential oils. Essential oils vary in their chemical composition from oils containing only monoterpenes to oils with a large amount of monoterpenoids (Formácek and Kubeczka 1982). We selected lemon, pine needle, and parsley seed oil as examples of the former group, and campher, sage, fennel, mint, and thyme oil as representatives of the latter group. The essential oils served as sole electron donor in attempts to enrich denitnfying bacteria from sewage sludge or a forest ditch mud sample. We enriched also on essential oils diluted in 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane (HMN) that is nearly water- insoluble, not biodegradable,and not poisonous, in order to reduce detrimental effects of the essential oils. Forest ditch mud was an inferior inoculum, probably due to endogeneous toxic compounds. Lemon and pine needle oil enabled growth of enrichment cultures from sewage sludge in the absence of an organic carrier phase. To the opposite, thyme oil did not support denitrification even in the presence of HMN. Other essential oils containing monoterpenoids were not toxic when diluted into HMN, e.g., sage and mint oil were excellent carbon sources for enrichment cultures (Tab. 1).
Denitrification of 10 mM of nitrate is coupled to the mineralization of 1.2 to 1.5 mM of monoterpene, according to pure culture studies (Fo13and Harder 1997; Fo13and Harder
1998; FoB et at 1998). We tested two amounts of essential oil. The lower amount, corresponding to 4 mM of monoterpene, was expected to limit nitrate reduction closely to
30 mM of nitrate and to select for consumption of all substances present in the oil. The higher amount, corresponding to 10 mM of monoterpene, was anticipated to reveal the compounds preferentially consumed. Nitrate reduction correlated with the amount of oil supplied (Tab. 1). GC and GC-MS analyses of the essential oils, and GC analyses of the residual essential oil after microbial growth enabled the identification of compounds that were biologically consumed or formed (Tab. 2). Myrcene was the least degradable monoterpene in lemon oil, whereas camphene and a-thujene were recalcitrant in pine needle oil. Camphene was also fractious in camphor and sage oil. Parsley seed oil is characterized by the aromatic insecticides apiole and myristicin. These antibiotics and two related compounds, elemicin and 1,2,3,4- tetramethoxy-5-(2-propenyl)-benzene (1,2,3 ,4-TMPB), were depleted in the enrichment
123 Table 1 Essential oils as growth substrates for enrichment cultures and Alcaligenes defragrans.
as inoculate A.defragrans 54Pin1 Essential oil Activated sludge as inoculate Forest ditch mud d e a b c d c a b + 1-IMN - HMN + HMN - HMN - HMN + HMN + HMN - HMN - HMN + HMN
-H--I- -H-+ - - + +++ +++ Lemon oil + ++ +-l-
- + ++ Pine needle oil (Pinus) + -H- -H- -H- -
- + ±++ - - - Parsley seed oil - - - + - + - + Camphor oil - - + -H- - ± ± ++ -H-I- - - - + Sageoil ------± Fennel oil - - - + -
- - ± I I - - - Mint oil - - ++
- - ± Thyme oil ------
4 mM monoterpene; 3.2 % vol HMN / vol aqueous phase. 96 p.1 essential oil, corresponding to 0.62 %o vol essential oil / vol aqueous phase and to and to 10mM monoterpene; 3.2 % vol HMN I vol aqueous phase. 240 p.1 essential oil, corresponding to 1.55 %o vol essential oil / vol aqueous phase and to 4 mM monoterpene; 2.9 % vol HMI’4 I vol aqueous phase. 96 p1 essential oil, corresponding to 0.56 %o vol essential oil / vol aqueous phase to 10 mM monoterpene; 2.9 % vol HMI”J / vol aqueous phase. 240 p.1 essential oil, corresponding to 1.41 %o vol essential oil / vol aqueous phase and a d nitrate were added. Each (+) indicates the consumption of 10 mM Nitrate concentrations were monitored. Upon electron acceptor depletion, 10 mM according to control experiments the consumption of less than nitrate by the culture. Endogeneous electron donors present in the inoculum caused 10 mM nitrate. Heptamethylnonane did not serve as electron donor. monoterpene; 6.5 % vol HMN I vol aqueous phase. Consumption of nitrate 0.65 %o vol essential oil / vol aqueous phase, corresponding to 4 mM or completely (10 mM) occurred not at all (-), up to 20 % (±), up to 50 % (+), more than 50 % (++) (+++). oil Table 2 Biological consumption of essential oils by 3-prnene 0.9 3 96 Mint 108 denitri1’ing enrichment cultures. myrcene 1.0 12 154 o.-pinene 0.9 5 a-phellandrene 0.3 11 157 3-pinene 1.1 3 104 a-terpinene 0.6 0 297 myrcene 0.5 4 110 Essential oil Content incubation (%‘b Recovery after cymene 2.0 1 125 3-octanol 0.6 0 0 /compound (%) mM 4 mM 10 eucalyptol 33.5 0 21 limonene 2.3 0 93 Lemon oil trans-ocimene 0.3 74 277 isopulegol 0.9 0 0 a-pinene 1.3 0 n.d.c y-terpinene 1.2 10 131 menthone 20.4 0 67 sabinene 1.3 1 n.d. terpinolene 2.2 0 87 isomenthone 11.7 0 37 4.1 0 Il 13-pinene 11.5 0 n.d. endo-fenchol 11.4 0 0 neonienthol 3 myrcene 0.7 18 nd. camphor 32.1 0 107 menthol 46.1 0 limonene 71.7 0 n.d. borneol 0.6 0 11 isomenthol 1.4 0 0 ‘-terpinene 9.0 0 n.d. 4-terpineol 5.6 2 0 a-terpineol 0.5 0 15 2 neral 0.6 0 n.d. a-terpineol 2.9 0 0 pulegone 0.3 0 geranial 0.3 0 nd. trans-isosafrole 1.5 0 0 peritone 1.0 0 0 geranyl 0.3 3 nd. . menthyl acetate 0.6 68 Sage oil geranyl acetate 0.3 5 n.d. ce-thujene 0.6 3 31 Thyme oil Pine needle oil ce-pinene 2.8 I 14 cc-pinene 0.2 94 105 ix-thujene 0.2 68 112 camphene 6,3 38 108 camphene 0.3 93 104 108 ce-pinene 35.7 0 60 sabinene 0.8 0 2 myrcene 0.3 92 camphene 4.5 28 109 3-pinene 0.7 0 19 3-carene 0.4 94 107 3-pinene 28.4 0 47 myrcene 0.6 13 62 cymene 42.6 86 110 18 myrcene 2.4 0 83 ca-terpinene 0.7 6 151 limonene 0.9 15 115 3-carene 4.2 1 86 cymene 6.3 0 6 y-terpinene 3.7 91 Ui 114 cymene 2.6 0 82 eucalyptol 9.8 0 0 terpinolene 1.4 89 77 115 limonene 11.5 0 34 terpinolene 0.8 0 10 endo-fenchol 5.1 72 107 ‘y-terpinene 0.2 1 88 ci-thujone 21.8 0 0 borneol 1.5 81 107 terpinolene 1.2 0 16 3-thujone 4.9 0 1 ce-terpineol 2.3 86 109 ce-terpineol 0.2 0 0 camphor 27.5 0 57 thymol 33.5 4.6 81 108 bornyl acetate 1.9 1 34 borneol 1.8 0 0 carvacrol 4-tepineol 0.5 31 7 Essential oil composition was analysed by OC with a flame- Parsley seed oil acetate 1.8 0 13 bornyl ionization detector and individual contents were calculated cz-pinene 22.4 5 84 4 sabinyl acetate 1.0 0 from peak areas. Sequiterpenes present in several oils could 3-pinene 15.4 4 81 not unambiguously be identified and were not included in the 1.3 21 57 Fennel oil cymene table. 44 47 cz-pinene 2.3 57 26 eucalyptol 3.3 Enrichment cultures containing 96 III or 240 jii of essential oil 6 132 myrcene 0.3 78 90 2.4 - cresol - correspondingly 4 or 10 mM monoterpene, respectively 4! 32 ci-terpineol 2.4 0 1 limonene 4.0 were incubated together with chemical control experiments camphor 0.4 0 0 y-terpinene 0.4 84 104 that included 240 tI of oil, 5 ml of HMN and ISO ml of myristicin 29.8 7 0 fenchone 4.8 101 111 anoxic fresh water medium. After incubation, all cultures elemicin 4.7 1 1 fenchyl acetate 0.5 0 0 were extracted with 6 ml of hexane and the organic phase Peak areas of individual l,2,3,4-TMPB 3.1 0 0 ce-terpineol 1.7 0 0 was analysed by GC-FID. control experiments were set 0 0 estragol 5.1 40 119 compounds recovered from the apiol 9.3 of GC determinations is ± cs-anethole 1.0 41 107 to 100%. The standard deviation 5%. Camphor oil trans-anethole 74.3 65 91 ce-pinene -1.2 3 92 n. d. not determined. A hexane phase was not recoverable of the culture. camphene 0.4 58 110 due to a high surfactant activity sabinene 0.6 5 76 cultures.
of
resembled cymene,
4-terpineol, Other
disappeared estragol,
hybridization
detectable phylogenetically Azoarcus
enriched specific sometimes of
Alcaligenes and Eco440
oils
carrier that
thyme
camphor,
growth-supporting
thyme observed
indication
monoterpene
the
4%,
were
were
The
16S
phase major
Growth
oil
The has oil for
cis-
respectively,
populations,
trans-ocimene,
and the
with
in previously
(data sage
fewer of
cells
rRNA. tested
inhibited
the
defragrans from one
a-thujone,
organic
and
cultures
(Tab. in
the
substrate
Thauera,
monoterpenoids
the
and Azoarcus-Thauera
a
not
of
grown of
contained
trans-anethole,
cells thyme closely
antimicrobial
nested
as the
According
oligonucleotide
Alcaligenes
1).
shown).
fennel
phase
monoterpenes
the
containing
identified
of than
growth
brightest
but
GC
in
strain
range oil.
approach,
f3-thujone, and
the
consumption
related
these
and
recovered
did probe and oil
increased
brightness
Consequently,
for
54PinT to
of
in
substrates
property
‘‘-terpinene.
not
GC-MS
enrichment
signals,
as
defragrans
parsley
were
a
Alcaligenes
degraded
to
HMN-containing Ade441.
Thauera
probes
study
growth
group
in
dominate
in
Alcaligenes camphor,
from
occurred
order
partially
amounts
these
of
whereas
of
analyses
of
seed,
with
and
AT probe campher
for
This
substrates monoterpenes.
telpenica
these
cultures to
the
on were
Monoterpenoid
defragrans oils,
1458 the
for identify
126
on
Alcaligenes Escherichia
fennel,
depleted
might and
essential
incomplete
probes
Eco440.
of
essential defragrans
all
indicated Alcaligenes populations
whereas
and
oil
bornylacetate,
cultures
were
myrcene,
essential
borneo!.
strain
for
be
enrichments
the
mint,
Ade441
Eco1455
a from
(Rabus
the characterized
oils.
growth
problem
oils.
Reduced
coli
defragrans.
the
reduction
21
compounds
was
and
(Amann
oils
strain
defragrans
consumption
Mo!
fennel
(Tab.
a-pheHandrene,
Methoxy-propenyl-benzenes,
consumption
(Fuchs
that
The
and
thyme
et
in
due
success
corresponding
of
eucalyptol,
(Foil
in
the
are
al.
nitrate
aforementioned 3). Eco1464
oil.
of
to
the
et all
et
by
specific presence
1999)
Nitrate
nitrate
oil present The
a
Traces
detected
and oils al.
al.
of
in
fluorescent
limiting
consumption
and
situ
1998), bacteria
of from
1995).
probe except
Harder
have
were
observed for
monoterpenes
a-terpinene,
no a-terpineol,
reduction
of
of
accessibility
in
to
apparently
the
mint
amount only
an the
limonene
HMN,
found
mint
AT1458
10
Bacteria
mint
essential
that
1998).
in
organic
genera
probe
mM
37%
situ
with
are oil
was
and
and
in
of
of
an Table 3 Detection of Alcaligenes defragrans in growinga denitrifying enrichment cultures on essential oils by fluorescent in situ hybridization.
Essential oil Amount of oil Presence Probe-positive cells / DAPI-stained cells (%) of HMN EUB338 BET42a AT1458 Ade441
Activated sludge as inoculate
Lemonoil 96.d - 67 33 11 12
240tl - 91 74 44 77 96p1 + 75 25 27 24 240111 + 82 59 10 9
Pine needle oil (Pinus) 96 111 - 66 3 0 0
240.i.l - 68 46 20 43 96tl + 67 26 22 17 240111 + 92 47 5 25
Camphoroil 96111 + 56 34 32 26 24Ojil + 62 22 11 6 Parsley seed oil 240 tl + 72 50 48 44
Mint oil 96 1.tl + 85 20 9 0 2401.tl + 85 37 36 11
Sage oil 240 l.tl + 28 3 0 2
Forest ditch mud as inoculate
Lemon oil 96 111 + 89 35 4 0 240tl + 69 51 0 5 Pine needle oil 96 lii + 52 51 5 Il 240111 + 66 50 11 24
Camphor oil 96 111 + 63 40 14 12
Sage oil 240 l.t1 + 28 3 0 2
a All cultures had consumed more than 10 mM nitrate (see Tab. 1). Ten cultures with lower nitrate consumption were tested by FISH. Nine of these enrichments showed a low hybridization with AT1458 and Ade441: 72% for EUB338, 30% for BET42a, 12 % for AT 1458, and 12 % for Ade441. The exception was the enrichment on 96 jil parsley seed oil containing activated sludge and HMN: 100 % cells hybridized with EUB338, 85 % with BET42a, 65 % with AT1458, and 87 % with Ade441.
127 Most-probable-number mixture denitrifying capacity natural sewage Table
Carbon
Acetate,
a-Terpinene,
a-Terpinene a
Discussion
Carbon
substances, habitats.
assimilated monoterpenoids
wanted
Thauera
1.5
and ethanol
Values
x
eucalyptol
4
Population
unsaturated
i0
source
sludge
of
butyrate,
MPN
was
to
sources
terpenica,
The in
bacteria
apply
monoterpenes,
g
parentheses
e.g.,
by
sabinene,
widespread:
and C
determination
annual
and
/
plants
the succinate,
can electron available
year1
substrate
hydrocarbons.
each
size
and
and
volatiles
emission
be
2-carene,
estimations describe the
(Bolin
Thauera
denitrifying
(Guenther
of
mineralized
donor
one
lactate
monoterpene-utilizing
for
and
of
conditions
monoterpene-mineralizing
that
denitrifying
in
rate
1983).
ct-pinene
95%
microorganisms
a-terpinene
linaloolentis
one
and
diffuse
of
et
with
confidence
microbe
hundred
anaerobically
plant
We al.
more
bacteria. a
from
Population Activated
(cells 1995), 4.7
3.1
3.1
have
volatiles
mixture
related
(FoB 128
were
in (0.7
(0.5
(0.5
and
limits
plant mli)i
in
previously coniferous
subpopulation
representing
and - - -
fifty
sludge
performed
to nature 14)
by 16)
16)
size
of into
parts
Harder
the
x
x
x
denitrifying
primary
nitrate-reducing
of
108 106
the 106
denitrifying environmental
or
denitrifying
are
soil
shown
1998; atmosphere
litter
more
to
(Tab.
constituted
grew
fermentation
quantify
Coniferous
(cells
FoB
1.0
1.6
1.6
into
than that
Alcaligenes
4).
anaerobically
bacteria
(0.2
(0.2-
(0.2
et
bacteria ml!)a
atmospheric
microorganisms.
The
monoterpenes
situation.
is
1%
al. - -
of
estimated
2.9)
the
8.7)
8.7)
1998).
soil
physiological
of
products,
mixtures
present
defragrans,
x
x
x
the
cultivable
106
10
Essential
Now
on
or
carbon
to
the
soil
and
in
we
a
be
of oils were considered as a suitable substitute for plant volatiles and served as sole carbon sources in studies with enrichment cultures and Alcaligenes defragrans. In nature, a concentration gradient is present from the releasingplant part to its environment. Therefore our enrichment cuLtureswere not shaken to allow initially the transient formation of a gradient of oil components from the lighter organic phase to the mud on the bottom of the culture bottle.
Denitrifying enrichment populations grew within four months of incubation on several essential oils, with the exception of thyme oil. Major constituents of this oil are the aromatic cymene and the phenolic thymol. Recently, Azoarcus sp. strain pCyNl and Thauera sp. strain pCyN2 were isolated on cymene under denitrifying conditions (Harms 1998). The degradation of thymol has so far only observed in aerobic bacteria involving oxygenation reactions (Dagley 1971). Knobloch et al. (1986) identified thymol as one of the most toxic monoterpenoids. Hence, the failure to enrich on thyme oil may be caused by the biocidal property of the oil. Enrichments were also not formed on parsley seed, camphor, sage, fennel, and mint oil in the absence of an organiccarrier phase as diluting solvent. This can be explained by the toxic effects of polymethoxy-propenyl-benzenes in parsley seed oil, of p-methoxy propenyl-benzenes and fenchone in fennel oil, and of monoterpenoids in camphor, sage and mint oil. The only essential oils supporting microbial growth of enrichments without an organic carrier phase were lemon and pine needle oils whose content is dominated by monoterpenes.
Reducing equivalents for nitrate reduction of the enrichment cultures were expected to originate from the oxidation and mineralization of parts of the essential oils. GC analyses after incubation of the enrichment cultures revealed indeed a consumption of monoterpenes and monoterpenoids; small absolute increases of some monoterpenes were only observed in a culture on camphor oil, similar to earlier observations in enrichment cultures (Harder and
Probian 1995). Quantitative formation of cymene, as observed under methanogenicenrichment conditions (Harder and Fo131999), or of dead-end metabolites, e.g., isoterpinolene (Heyen and
Harder 1998), did not occur. The compounds consumed included growth substrates for pure strains (Alcaligenes defragrans, Thauera terpenica, and Thauera linaloolentis) and enrichment cultures already established (reviewed by Hylemon and Harder 1998) as well as substances
129 poly-methoxy-propenyl-benzenes. that
released
with support
products
effects.
cycle. is FISH
1999).
3-proteobacteria terpenica,
past
anaerobic common.
more
into volatiles, oxidation.
Acknowledgements
hybridization. the
likely
have
Deutsche
the
the
focused
detail
analyses
Additional
The
Menthadienes
Research
We
from
this
most-probable-number
a
atmosphere as
not
Hence
biological
and
bacteria
and
growth
found
substrate
the
opinion,
roots
been
on
Forschungsgemeinschaft
Thauera
of
This
processes ecological
volatiles
in
related
evidence
plant-eucaryal
a
the
or
shown of
chemical
large
are
response
study
we
and
support
litter
denitrifying
together
enrichment
We
linaloolentis.
capable
population
to
determined
released
contribute
interactions
for
to
inhibited
thank
in
the
was
ecology
be
a
the to
the
with
isolated wide
technique.
of
supported
herbivore the biodegradable
soil
Dr.
cultures: from populations whole
utilizing
size
to the
of huge
distribution an
by
can between
Rudi
to
the
plant
litter
denitrifying
organic
microbial
of
the
cultivable
J.
participation
Earlier serve
interactions.
monoterpene-degrading
by
greenhouse
the
H..
Amann
plant
or
volatiles, volatiles,
130
the
on
under plants,
denitrifying
roots
as
carrier
of
we
essential population
Max-Planck-Gesellschaft
carbon
volatiles
denitnfiing
the
species
demonstrated
for
anoxic
may
soil
notably
metabolic
effect.
of
e.g.,
phase
Now
providing
monoterpenes source
microbes, be
oils
Alcaligenes
cultures
and
conditions,
aerobic
able
our
mineralized
It
were
the
population
suggests
that
seems capability
for
that
study
to
denitrifying
monoterpenes,
the
used
were
anoxic
monoterpenes
grow
methane
this
primary
defragrans,
desirable
notably
facilities
that in
indicated
before
to
not
(Kniemeyer on metabolic
the
was
soil
and
minimize
plant
monoterpenes
dominated
bacteria.
and global
fermentation
bacteria.
provided
they
a mono-
to
for was
grant
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a 1: Danksagung
Herm Prof. Dr. Widdel danke ich für die Ubernahmedes Gutachtens und die Bereitschaft, die Anfertigung der vorliegenden Dissertation am Max-Planck-Institut für marine Mikrobiologie zu ermoglichen.
Herrn Priv.-Doz. Dr. Jens Harder danke ich besonders für die Uberlassung des Themas, sein
Interesse am Fortgang der Arbeit (,,Haste schon neue Ergebnisse?”), die tatkräfiige
Unterstützung und für die vielen wertvollen Anregungen und konstruktiven Diskussionen.
Dr. Sabine FoB gilt mein besonderer Dank für die anfángliche Einfithrung in das Thema. Auch
Olaf Kniemeyer danke ich für die Einweisung in die Fettsäure-Analytik. Bei beiden sowie bei
Jannis Toannidisbedanke ich mich für das gemeinsameDurchstehen der ‘Vip-Seminare’.
Mein ganz besonderer Dank gilt Christina Probian für das gute Hand-in-Hand-Arbeiten, für die
Einweihung in die Geheimnisse der ‘Anaeroben-Welt’, der super Laboratmosphäre, den SpaB mit den Spritzflaschen und naturlich für die all morgendlichen Dienstgesprache (,,Teechen’?”).
Mein Dank gilt nicht zuletzt allen jetzigen und früheren Mitarbeitern der Abteilung
Mikrobiologie und des gesamten Instituts, die mit Rat und Tat zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Bei Dr. Gerda Harms und Anja Heinrichsdorff möchte ich mich für die zahlreichen Plaudereien in unserer ‘Muttersprache’ bedanken. Mark Hünken danke ich für sein engagiertes Arbeiten während seines Praktikums. Weiterhin möchte ich mich bei Bernd
Stickfort für die stets prompte Besorgung von Literatur bedanken.
Danken möchte ich Herm Dr. P. Schulze vom Fachbereich II der Universität Bremen für die
Einffihrung und die gemeinsame Durchfühmng zahireicher GC-MS-Analysen.
Ansonsten möchte ich ganz herzlicb all jenen - auBerhaib des Instituts - danken, die auf die eine oder andere Art und Weise zum Gelingen der Arbeit beigetragenhaben. Besonderem Dank gilt Andreas für das Korrekturlesen und die Einfiihrung in die parallele Deklination von
Attributen, die sich mit als oder wie auf em anderes Satzglied beziehen.