Untersuchungen Zu Schwefelverbindungen Und
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Untersuchungen zu Schwefelverbindungen und Enzymaktivitäten in Allium-Arten des Subgenus Melanocrommyum Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) Dem Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Anja Vogt aus Wuppertal Marburg/Lahn 2008 Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation angenommen am ........................... Erstgutachter: Prof. Dr. Keusgen Zweitgutachter: Prof. Dr. Li Tag der mündlichen Prüfung am 19.12.2008 Meinen Eltern und meiner Schwester Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen. Albert Einstein Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. Keusgen für die Überlassung des interessanten Themas, seine unermüdliche Unterstützung und sein Engagement sowie für sein Vertrauen, das er mir und meiner Arbeit immer wieder entgegen gebracht hat. Herrn Prof. Dr. Li danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferates. Ausserdem danke ich den Mitgliedern meiner Prüfungskommission, Prof. Dr. Petersen und Prof. Dr. Bakowsky. Herrn Dr. Fritsch möchte ich danken für die Sammlung und die Bereitstellung der Allium-Proben, die taxonomische Zuordnungen und seine Hilfe. Ausserdem sei an dieser Stelle allen Kooperationspartnern des PharmAll Projektes und der VW-Stiftung für die Finanzierung des Projektes gedankt. Ich danke meiner ganzen Arbeitsgruppe für die gute Atmosphäre und den Spaß während und nach der Arbeitszeit, sowie Floris van Elsäcker und Matthias Brauschke für ihre unersätzliche praktische Hilfe im Labor und dafür, dass sie immer ein offenes Ohr für alle Probleme hatten. Dr. Uwe Reinscheid danke ich für die viele Hilfe bezüglich NMR-Messungen und der guten Zusammenarbeit für die Publikation. Dank auch an die MS-und NMR-Abteilung des Institutes für die Hilfe und die Messungen, besonders an Nina, Heike und Frau Dr. Laufenberg für die gute Zusammenarbeit. Dank auch an Verena Janiak und die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Petersen für die Hilfe bei den Anlaufschwierigkeiten mit der Gelelektrophorese. Außerdem danke ich meinen Kollegen bei der Praktikumsbetreuung für die vielen netten Tage und den Spaß den wir hatten. Thanks to my “new” working group in Saskatoon for their friendly welcome and their support. Ich danke meine Freunden, die immer für mich da waren und ein offenes Ohr für alle Probleme hatten. Besonders danke ich meinen Eltern und Ilona und Patrick, ohne deren Unterstützung und Interesse diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ich danke Uwe für seine Liebe, sein Verständnis, seine Geduld und sein Vertrauen in mich. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 8 1. Einleitung 11 1.1 Die Gattung Allium 11 1.2 Bedeutung der Gattung Allium 12 1.3 Inhaltsstoffe der Allium-Arten 13 1.3.1. Cysteinsulfoxide 14 1.3.2 Alliinase 15 1.3.3 primäre und sekundäre Aromakomponenten 17 1.3.4 γ-Glutamylpeptide 19 1.3.5 Andere Enzyme 19 1.3.6 Steroide in Allium-Arten 20 1.3.7 Weitere Inhaltsstoffe 21 1.4 Arten des Subgenus Melanocrommyum 22 1.5 Steroidglykoside in Pflanzen 23 1.5.1 Steroidsaponine des Subgenus Melanocrommyum 24 1.5.2 Hoodia-Arten und Steroidsaponine 26 1.6 Verfärbungen von Lebensmittel 33 1.6.1 Enzymatische Verfärbungreaktionen 33 1.6.2 Nicht enzymatische Verfärbungsreaktionen 34 1.6.3 Verfärbungen von Allium-Arten 34 1.7 Ziel der Arbeit 40 2. Material und Methoden 42 2.1 verwendete Chemikalien 42 2.2 Pflanzenmaterial 45 2.3 Lösungen und Puffer 51 2.3.1 Lösungen und Puffer für die Precursorextraktion und für die Cysteinsulfoxiduntersuchung 51 2.3.2 Lösungen und Puffer für die Proteinextraktion und Untersuchung 52 1 Inhaltsverzeichnis 2.3.3 Lösungen und Puffer für die Gel- und Affinitätschromatographie 54 2.3.4 Lösungen und Puffer für die Aktivitätsbestimmungen 56 2.3.5 Verwendete Geräte 58 2.4 Allgemeine Vorschriften 59 Parameter der HPLC-MS- und MS/MS- Messungen 59 Parameter der HR-MS und NMR Messungen 60 Dünnschichtchromatographische Untersuchungen von Allium Extrakten 60 Herstellung der synthetischen Cysteinsulfoxide 61 Quantitative Bestimmung der Cysteinsulfoxide nach Derivatisierung mit OPA 61 Proteinlösungen 62 2.5 Isolierung des Farbstoff-Precursors 63 2.5.1 Darstellung der enzyminaktivierten Rohextrakte 63 2.5.2 Aufreinigung der Rohextrakte durch HPLC 63 2.5.3 Überprüfung der Aufreinigung mittels Massenspektrometrie 64 2.5.4 Bestimmung der optischen Rotation 66 2.6 Proteinextraktion und -bestimmung 66 2.6.1 Proteinextraktion 66 2.6.2 Optischer Schnelltest auf enzymatische Aktivität 67 2.6.3 Proteinmengenbestimmung nach Lowry und Bradford 67 2.6.4 Proteingelanalytik 68 2.7 Enzymaufreinigung 73 2.7.1 Gelchromatographie 73 2.7.2 Affinitätschromatographie an einer Con A Säule 73 2.7.3 Affinitätschromatographie an einer Nickelsäule 74 2.7.4 Affinitätschromatographie an einer Lens culinaris-Lektin-Säule 75 2.8 Aktivitätsbestimmungen 75 2.8.1 Bestimmung der Enzymaktivität der Alliinase-ähnlichen Funktion 76 2.8.2 Bestimmung des pH-Optimums 77 2.8.3 Bestimmung des Temperatur-Optimums 77 2.8.4 Michaelis-Menten Kinetik 78 2 Inhaltsverzeichnis 2.8.5 Bestimmung der Substratspezifität 82 2.8.6 Hemmung der enzymatischen Aktivität 82 2.8.7 Bestimmung der Polyphenoloxidase-Aktivität 83 2.8.8 Bestimmung der kinetischen Parameter der Polyphenoloxidase-Aktivität 84 2.8.9 Substratspezifität der Polyphenoloxidase-Aktivität 85 2.8.10 Hemmung der Polyphenoloxidase-Aktivität und Effekte von Metallionen 85 2.8.11 Bestimmung der Aktivität der Farbstoffbildung 86 2.8.12 Bestimmung der kinetischen Parameter der Aktivität der Farbstoffbildung 86 2.9 Farbstoff 87 2.9.1 Herstellung der Farbstoffextrakte 87 2.9.2 Aufreinigung der Farbstoffextrakte 88 2.9.3 MS/MS Messungen der Farbstoffextrakte 88 2.9.4 HPLC-MS Messungen der Farbstoffextrakte 89 2.10 Inhaltstoffe von A. stipitatum 89 2.10.1 Extrakte von A. stipitatum 89 2.10.2 MS/MS und HPLC-MS Messungen der Extrakte von A. stipitatum 90 2.11 Extrakte von Allium Arten zur Steroidbestimmung 91 2.11.1 HPLC-MS Messungen zur Steroidbestimmung 91 2.12 Extrakte von Hoodia und verwandten Arten zur Steroidbestimmung 92 2.12.1 MS/MS und HPLC-MS Messungen der Extrakte 93 3. Ergebnisse 95 3.1 Farbstoff Precursor 95 3.1.1 Isolierung des Farbstoff Precursors 95 3.1.2 Strukturaufklärung des Precursors 97 3.2 Proteinuntersuchungen 103 3.2.1 Ergebnisse der Proteinextraktion 103 3.2.1.1 Bestimmung des Proteingehaltes 103 3.2.1.2 Proteingelanalytik 105 3.2.1.2.1 Vergleich unterschiedlicher Arten 105 3.2.1.2.2 Vergleich innerhalb einzelner Arten 106 3 Inhaltsverzeichnis 3.3 Aufreinigung eines unbekannten Enzyms 110 3.3.1 Enzymaufreinigung: Gelchromatographie 110 3.3.2 Proteinfraktion A 111 3.3.2.1 Enzymaufreinigung: Affinitätschromatographie über eine Con A Säule 111 3.3.2.2 Enzymaufreinigung: Eigenschaften des Proteinfraktion A 113 3.3.3 Proteinfraktion B 115 3.3.3.1. Enzymaufreinigung: Affinitätchromatographie über eine Lens culinaris-Lektin-Säule 115 3.3.3.2 Enzymaufreinigung: Metall-chelat-Komplex Chromatographie an einer Nickel-Säule 116 3.3.3.3 Enzymaufreinigung: Kombination der Aufreinigung mit einer Nickel-Chelat- und einer Lens culinaris-Lektin-Säule 118 3.3.3.4 Enzymaufreinigung: Eigenschaften der Proteinfraktion B 119 3.4 Kinetische Parameter der isolierten Proteinfraktion B 121 3.4.1 Charakterisierung der Alliinase-ähnlichen Aktivität 121 3.4.1.1 Bestimmung des pH-Optimums 122 3.4.1.2 Bestimmung des Temperatur-Optimums 124 3.4.1.3 Michaelis-Menten-Kinetik 125 3.4.1.4 Bestimmung der Substratspezifität 128 3.4.1.5 Hemmung der enzymatischen Aktivität 131 3.4.2 Charakterisierung der Polyphenoloxidase-Aktivität 132 3.4.2.1 Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten 132 3.4.2.2 Bestimmung des pH-Optimums 133 3.4.2.3 Bestimmung des Temperatur-Optimums 135 3.4.2.4 Michaelis-Menten-Kinetik 137 3.4.2.4.1 Brenzcatechin 138 3.4.2.4.2 Dopamin 139 3.4.2.4.3 Zusammenfassung der Km- und Vmax-Werte 142 3.4.2.5 Bestimmung der Substratspezifität 142 3.4.2.6 Hemmung der enzymatischen Aktivität 143 4 Inhaltsverzeichnis 3.4.3 Charakterisierung der kinetischen Parameter der Bildung des Farbstoffes 144 3.4.3.1 Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten 145 3.4.3.2 Bestimmung des pH-Optimums 146 3.4.3.3 Bestimmung des Temperatur-Optimums 147 3.4.3.4 Michaelis-Menten-Kinetik 147 3.5 Farbstoff und weitere Reaktionsprodukte 151 3.5.1 Identifizierung des Farbstoffes 151 3.5.1.1 Bestimmung des Farbstoffes mittels MS und HPLC-MS 152 3.5.2 Substanzen aus Farbstoffextrakten 154 3.6. Untersuchung der Extrakte aus A. stipitatum 161 3.6.1 Cysteinsulfoxide in A. stipitatum 161 3.6.2 Versuche zur Umsetzung des putativen Pyridinylcysteinsulfoxides mit Enzymrohextrakten 163 3.6.2.1 Ergebnisse der Umsetzung von A. stipitatum mit Enzymen direkt nach der Zugabe 164 3.6.2.2 Ergebnisse der Umsetzung von A. stipitatum mit Enzymen 24 Stunden nach der Zugabe 166 3.7 Steroide in Allium-Arten 170 3.8 Steroide in Arten der Gattung Hoodia 175 3.8.1 Untersuchungen an einigen Extrakten aus Hoodia, Stapelia sowie verwandten Arten 176 3.8.1.1 MS/MS Messungen 177 3.8.1.2 HPLC-MS Messungen der Extrakte 181 4. Diskussion 185 4.1 Isolierung des L-(+)-S-(3-Pyrrolyl) Cysteinsulfoxides 185 4.1.1 Rolle des L-(+)-S-(3-Pyrrolyl) Cysteinsulfoxides in der Bildung des roten Farbstoffes 185 4.1.2 Mögliche Biosynthese des L-(+)-S-(3-Pyrrolyl) Cysteinsulfoxides 187 4.1.2.1 Biogenese der bekannten Cysteinsulfoxide 187 4.1.2.2 Biogenese des Pyrrolylcysteinsulfoxides 192 4.1.2.3 Porphobilinogen 192 4.1.2.4 Pyrrol-2-carboxylat 193 5 Inhaltsverzeichnis