Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Wildtierforschung

Zum Vorkommen von Tularämie und Brucellose beim Feldhasen in Niedersachsen

INAUGURAL - DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

Vorgelegt von Martina Wedekind Hamburg

Hannover 2008

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Dr. habil. K. Pohlmeyer Priv. Doz. Dr. M. Runge (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit - Veterinärinstitut Hannover)

1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. habil. K. Pohlmeyer

2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2008

Finanziell gefördert wurden die Untersuchungen durch Jagdabgabemittel des Landes Niedersachsen sowie unterstützt durch die Landesjägerschaft Niedersachsen e.V..

Meinen Eltern

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

M. Wedekind , M. von Keyserlingk, A. Grauer, U. Voigt, K. Pohlmeyer, F. Melzer, M. Runge (2007) Untersuchungen zur Verbreitung von Francisella tularensis und Brucellen in niedersächsischen Hasen- und Kaninchenpopulationen - erste Ergebnisse Poster, Arbeits- und Fortbildungstagung des Arbeitskreises für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID), Fachgruppe „Bakteriologie“ der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, Bad Staffelstein / Kloster Banz, 24. - 26.10.2007

M. Wedekind , M. von Keyserlingk, A. Grauer, U. Voigt, W. Splettstößer, P. Otto, W. Müller, F. Melzer, K. Pohlmeyer, M. Runge (2008) Prävalenz von Francisella tularensis und Brucella suis beim Feldhasen in Niedersachsen - aktuelle Ergebnisse Poster, Jahrestagung der DVG-FG „Bakteriologie und Mykologie“, Braunschweig, 25. - 27.06.2008

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG...... 9

2 LITERATURÜBERSICHT...... 11 2.1 Tularämie...... 11 2.1.1 Historischer Überblick...... 11 2.1.2 Biologie und Taxonomie des Erregers...... 15 2.1.3 Diagnostik...... 18 2.1.4 Tularämie beim Feldhasen ...... 19 2.1.4.1 Übertragungswege beim Feldhasen ...... 19 2.1.4.2 Klinik der Tularämie beim Hasen ...... 19 2.1.4.3 Pathologisch-anatomische Befunde beim Hasen...... 20 2.1.4.4 Bekämpfung, Impfungen...... 21 2.1.5 Tularämie beim Menschen...... 21 2.1.5.1 Übertragungswege der Tularämie auf den Menschen ...... 21 2.1.5.2 Klinik der Tularämie beim Menschen ...... 22 2.1.5.3 Prophylaxe, Therapie und Impfung ...... 24 2.1.6 Epidemiologie/Epizootiologie...... 25 2.1.7 F. tularensis als biologische Waffe ...... 31

2.2 Brucellose...... 32 2.2.1 Historischer Überblick...... 32 2.2.2 Biologie und Taxonomie des Erregers...... 33 2.2.3 Diagnostik...... 35 2.2.4 Brucellose beim Feldhasen...... 36 2.2.4.1 Übertragungswege beim Feldhasen ...... 36 2.2.4.2 Klinik der Brucellose beim Feldhasen ...... 37 2.2.4.3 Pathologisch-anatomische Befunde...... 38 2.2.4.4 Bekämpfung, Impfungen...... 39 2.2.5 Brucellose beim Menschen...... 39 2.2.5.1 Übertragungswege der Brucellose auf den Menschen ...... 40 2.2.5.2 Klinik der Brucellose beim Menschen ...... 40

2.2.5.3 Prophylaxe, Therapie und Impfung ...... 41 2.2.6 Epidemiologie/Epizootiologie...... 42

2.3 Zielsetzung ...... 47

3 MATERIAL UND METHODEN ...... 49 3.1 Material...... 49 3.1.1 Probenmaterial ...... 49 3.1.1.1 Fallwild...... 49 3.1.1.2 Erlegte Hasen ...... 50

3.2 Methoden...... 51 3.2.1 Probengewinnung...... 51 3.2.2 Bakteriologische Untersuchungsmethoden...... 52 3.2.2.1 Anlegen der Bakterienkultur...... 52 3.2.2.2 Stamp-Färbung...... 52 3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungsverfahren ...... 53 3.2.3.1 Nukleinsäure-Extraktion...... 53 3.2.4 Nachweis von F. tularensis ...... 55 3.2.4.1 Auswahl der Primer...... 55 3.2.4.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)...... 55 3.2.4.3 Ermittlung der Nachweisgrenze ...... 58 3.2.4.4 Nachweis der PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese...... 59 3.2.5 Nachweis von Brucella sp...... 61 3.2.5.1 PCR ...... 61 3.2.5.2 Sequenzierung von PCR-Produkten ...... 63 3.2.5.2.1 Aufreinigung der PCR-Produkte ...... 63 3.2.5.2.2 DNA-Sequenzierung...... 64 3.2.6 Statistik ...... 66

4 ERGEBNISSE ...... 67 4.1 Validierung der PCR ...... 67 4.1.1 Ermittlung der Nachweisgrenze von F. tularensis ...... 67 4.1.2 Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucella sp...... 71 4.2 Nachweis von F. tularensis und Brucella sp. mittels PCR...... 72 4.2.1 Nachweis von F. tularensis ...... 72 4.2.1.1 Prävalenzratio ...... 76 4.2.2 Nachweis von Brucella sp...... 77 4.2.2.1 Prävalenzratio ...... 78

4.3 Sequenzierung von Amplifikationsprodukten ...... 79

4.4 Typisierung von Brucella sp...... 79

4.5 Bakteriologische Untersuchung zum Nachweis von Brucella sp...... 80

4.6 Pathologisch-anatomische Untersuchungen...... 81 4.6.1 Hasen mit Nachweis von F. tularensis ...... 81 4.6.2 Hase mit Nachweis von Brucella sp...... 84

5 DISKUSSION ...... 85

6 ZUSAMMENFASSUNG...... 98

7 SUMMARY ...... 99

8 LITERATURVERZEICHNIS ...... 100

9 ANHANG...... 111 9.1 Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Reagenzien, Nährmedien, Puffer und Lösungen ...... 111

9.2 Tabellen...... 117

9.3 Basensequenzen ...... 121

Abkürzungsverzeichnis AMOS Abortus Melitensis Ovis Suis ATCC American Type Culture Collection bp engl.: base pair(s) (Basenpaare) dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat dGTP Desoxyguanintriphosphat dNTP Desoxynukleosidtriphosphat DNase Desoxyribonuklease DNA engl.: Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dTTP Desoxythymidintriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure °C Grad Celsius g Erdbeschleunigung HPLC-Wasser engl.: High Performance Liquid Chromatography (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Wasser) IfSG Infektionsschutzgesetz IPC engl.: Internal Positiv Control (interne Positivkontrolle) k.A. keine Angaben KBE Kolonie bildende Einheit(en) kDa Kilodalton Kap. Kapitel mM Millimolar mol. biol. H2O molekular-biologisch aufgereinigtes Wasser PCR engl.: polymerase chain reaktion (Polymerasekettenreaktion) Rnase Ribonuklease sp. Spezies ssp. Subspezies TAE Tris-Acetat-EDTA Tris Tri- (Hydroxymethyl-) Aminomethan VO Verordnung

Einleitung

1 Einleitung

Tularämie und Brucellose sind in Deutschland selten vorkommende, hochkontagiöse, melde- bzw. anzeigepflichtige bakterielle Infektionskrankheiten bei Tieren, die auf den Menschen übertragbar sind (A NONYMUS 2007a, G RUNOW & P RIEBE 2007). In der Gefährdung des Menschen liegt die besondere Bedeutung dieser Erreger. Die Tularämie wird durch Francisella tularensis ( F. tularensis ) verursacht. Sie kommt weltweit auf der nördlichen Hemisphäre im Wesentlichen bei Feldhasen, Wildkaninchen, verschiedenen Mäusearten sowie Ratten vor. Eine große Zahl weiterer Säugetiere, aber auch Vögel und Amphibien, können den Erreger ebenfalls beherbergen. Für die Tularämie als Naturherderkrankung in Europa existieren seit Jahrzehnten bekannte enzootische Regionen in Österreich, Deutschland, der Slowakei und Tschechien, im Kosovo sowie in Italien, Spanien und Teilen

Skandinaviens (H OFER 1997, H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999, A NONYMUS 2001, E LLIS et al.

2002, H OFER 2002, R EINTJES et al. 2002). Der Erreger der Hasen- und Schweinebrucellose in Europa ist Brucella suis Biovar 2 ( B. suis Biovar 2). Er ist in fast allen europäischen Ländern nachgewiesen (B ENDTSEN et al. 1954, E NGLERT et al. 1964, V ALENTINCIC 1964, D EDEK

1983, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988). Zwischen der Schweinebrucellose und der Hasenbrucellose bestehen epizootiologische Wechselbeziehungen, in die mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auch das europäische Wildschwein eingeschlossen ist

(H ELLMANN 1982, H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999, S ELBITZ 2007). Die Hasenbrucellose tritt nicht nur in Gebieten mit enzootischer Haustierbrucellose sporadisch auf, sondern unterhält auch ein selbstständiges, meist enzootisches Infektionsgeschehen mit jahrelanger Erregerpersistenz in der betroffenen Hasenpopulation (C HRISTIANSEN &

THOMSEN 1956, E NGLERT et al. 1964, H ELLMANN 1982). Beim Menschen erschwert die Variabilität des Krankheitsbildes der Tularämie sowie der oft grippeähnliche Verlauf der Tularämie und der Brucellose die klinische Diagnose. Endemiegebiete können daher unentdeckt bleiben, vor allem, wenn Krankheitsfälle bei Mensch und Tier nur sporadisch auftreten. Das Wissen über Vorkommen und Verbreitung der Tularämie und Brucellose ist Voraussetzung für

9 Einleitung

eine erfolgreiche Diagnose, Prophylaxe und Bekämpfung dieser Krankheiten beim

Menschen (H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999). Aktuell aufgetretene Tularämie-Erkrankungen beim Menschen sind in den letzten zehn Jahren aus Hessen, Baden-Württemberg, Nordrhein-Westfalen, Brandenburg, Mecklenburg-Vorpommern, Berlin, Bayern, Niedersachsen, Rheinland-Pfalz, Sachsen-Anhalt und aus Hamburg gemeldet. Über die Prävalenz des Erregers in der Hasenpopulation in Niedersachsen liegen bisher keine Daten vor. Deshalb schien es interessant herauszufinden, wie sich der derzeitige Infektionsstatus der Feldhasenbestände darstellt. Mit der vorliegenden Arbeit sollen möglichst flächendeckend und mit ausreichendem Material Angaben zum Vorkommen und zur Verbreitung beider Erreger gemacht werden. Die Untersuchungen wurden am Institut für Wildtierforschung (IWFo) an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und dem Veterinärinstitut Hannover des Niedersächsischen Landesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) durchgeführt. Die Ergebnisse der aus den eigenen Untersuchungen als tularämie- oder brucelloseverdächtig erkannten Proben wurden am Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen des Friedrich-Loeffler-Instituts (FLI) in Jena und dem Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in München verifiziert. Ziel der Untersuchungen ist es darüber hinaus, einen Beitrag zur Ermittlung von Naturherden der Tularämie und Brucellose in Niedersachsen zu leisten. In Niedersachsen wurden molekularbiologische Untersuchungen dieser Art und in dem Umfang bislang nicht durchgeführt.

10 Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Tularämie

2.1.1 Historischer Überblick

F. tularensis ist als Krankheitserreger seit Beginn des 20. Jahrhunderts bekannt

(S PLETTSTÖßER et al. 2005, S JÖSTEDT 2007, T OMASO et al. 2007). Im Jahre 1911 beschrieb McCoy eine der Pest ähnliche Erkrankung, die er bei Erdhörnchen im

Tulare County, Kalifornien, USA, beobachtet hatte. MCCOY & C HAPIN (1912) isolierten den Erreger und nannten ihn „ Bacterium tularense “. Später wurde es von Edward

Francis intensiv untersucht (J ELLISON 1972). Der bekannte und namensgebende Arzt kultivierte und beschrieb das Bakterium im Jahre 1912. Der erste bestätigte Fall von

Tularämie beim Menschen ereignete sich 1913 in Ohio, USA (W HERRY & L AMB 1914,

WEINBERG 2004). Schon vor 1912 beschrieben verschiedene Dokumentationen Erkrankungen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine Tularämie hinweisen, so z.B. ein Bericht von

PEARSE (1911) aus Utah, USA, aus dem Jahr 1908. Aus Norwegen gibt es Aussagen zum sogenannten Lemming-Fieber aus den 1890er Jahren (M ÖRNER 1992). OHARA (1954) berichtet von einer Hasen-Krankheit aus Yato-Byo, Japan aus dem Jahre 1818. Weitere Schilderungen Tularämie-ähnlicher Krankheiten bei Lemmingen stammen von 1653 aus Norwegen (S CHEEL et al. 1992). Für die Tularämie gibt es verschiedene andere Bezeichnungen, wie z.B. Hasenpest, Nagerpest, Ohara- Krankheit oder auch Lemming-Fieber, Hirschfliegenfieber, Zeckenfieber und

Kaninchenfieber (K ERSCHAGL 1965, F RÖLICH et al. 2001, G RUNOW et al. 2001, T ITBALL

& S JÖSTEDT 2003). Die Tularämie kommt weltweit auf der nördlichen Hemisphäre zwischen dem 30. und

70. Breitengrad vor (R EINTJES et al. 2002), so in Nordamerika, Europa, im Nahen

Osten, in den Ländern der früheren Sowjetunion, in China und Japan (B OSSI et al. 2004). In den meisten Ländern ist F. tularensis ein eher selten vorkommender

Erreger (S JÖSTEDT 2007). Größere Ausbrüche wurden aus Teilen Amerikas, der südlichen ehemaligen Sowjetunion und Nordskandinavien berichtet (J OHANSSON et

11 Literaturübersicht

al. 2000). In der Zeit von 1924 bis 1935 erkrankten in Amerika 6.149 Personen, bei einer Mortalität von 4,8 % (K ERSCHAGL 1965). In Europa tritt die Tularämie periodisch gehäuft in Endemiegebieten Nord-, Mittel- und neuerdings auch Süd- und Westeuropas auf. F. tularensis kommt in Form von vier Subspezies vor, wobei die weniger virulente Variante

F. tularensis subsp. holarctica vorherrscht (M ÖRNER et al. 1993, G RUNOW et al. 2001). In Nordeuropa wurden in Norwegen, Schweden, Finnland und Dänemark in den 1920er und 30er Jahren annährend 200 Krankheitsfälle beim Menschen durch Tularämie-Infektionen diagnostiziert. Als Tierreservoir wurden dort Hasen, als

Überträger Stechmückenarten festgestellt (S CHMIDT 1947). Biber können ebenfalls ein mögliches Reservoir darstellen (M ÖRNER & S ANDSTEDT 1983). Im Kosovo erkrankten in den Jahren 1999/2000 327 Personen durch den Verzehr von nicht genügend erhitztem, kontaminierten Hasenfleisch und der Aufnahme von Wasser, welches mit Tularämie-Erregern verseucht war (R EINTJES et al. 2002). In Deutschland datiert der erste nachgewiesene Fall von Tularämie aus dem Jahr

1939 (K ERSCHAGL 1965). Sicher ist, dass die Tularämie schon viel früher in allen genannten Ländern vorkam, als solche aber nicht erkannt wurde. 1943/44 wurde im Tilsiter Raum die Krankheit bei Menschen registriert. 1947 folgte eine Epidemie um

Königsberg (J USATZ 1961) und 1948 wurden weitere Fälle von Tularämie in der

Umgebung von Berlin festgestellt (T RAUTMANN & S CHNEEMANN 1949). Eine regional begrenzte Epidemie ereignete sich 1950 im Taubertal im Grenzbereich der Bundesländer Bayern und Baden-Württemberg. Die 13 Patienten hatten alle Kontakt mit Feldhasen (S CHUERMANN & H ÜTTNER 1950). Im weiteren zeitlichem Verlauf mehrten sich die Fälle auch in anderen Bezirken. So wurden in Franken bis 1952 insgesamt 50 Fälle von F. tularensis -Infektionen beim Menschen nachgewiesen

(L EMBKE 1969). Die meisten humanen Tularämie-Infektionen wurden seit ihrem erstmaligen Auftreten in Schleswig-Holstein 1950 aus Eiderstedt berichtet. 1950/51 erkrankten dort 130 Menschen, im Winter 1956/57 wurden sieben Tularämie-

Erkrankungen gemeldet, 1958 waren es 28. 1968 gab es erneut sechs Fälle (L EMBKE 1969).

12 Literaturübersicht

In der Zeit von 1956 bis Ende 1968 sind in Deutschland insgesamt 128 Tularämie- Erkrankungen beim Menschen gemeldet worden. Hiervon stammen 46 Fälle aus Schleswig-Holstein, 21 aus Bayern und 14 aus Neubrandenburg. Die restlichen 48 Krankheits-Fälle verteilen sich auf die übrigen Bundesländer. Bei diesen Infektionen war mit wenigen Ausnahmen der Feldhase die Infektionsquelle (L EMBKE 1969). Seit Anfang der 1970er Jahre tritt die Krankheit nur noch sporadisch und zwar vornehmlich in Endemiegebieten auf. Während sich in den Jahren unmittelbar nach dem Zweiten Weltkrieg noch 100 bis 200 Menschen jährlich mit dem Erreger infizierten, sind seit Anfang der 1960er Jahre in Deutschland und den meisten europäischen Ländern die Fallzahlen deutlich rückläufig. Die starken Schwankungen des Tularämie-Geschehens beim Menschen hängen hauptsächlich mit den zyklischen Wellenbewegungen der Besätze in den

Nagetierpopulationen der Endemiegebiete zusammen (JUSATZ 1961, S PLETTSTÖßER et al. 2006). Seit etwa 2005 kommt es wieder zu einer Zunahme von Infektionen mit Tularämie. Eine Darstellung erfolgt in Tab. 1.

13 Literaturübersicht

Tab. 1: Nachweis von Tularämie-Erkrankungen in den einzelnen deutschen Bundesländern von 1998 – 2007 beim Menschen

Jahr Bundesländer Anzahl der Quelle Erkrankungsfälle

1998 Baden-Württemberg 2 (H IRSCH et al. 2001)

Nordrhein-Westfalen 1 (H IRSCH et al. 2001)

1999 Brandenburg 1 (K ÄSSLER et al. 2000)

Mecklenburg-Vorpommern 1 (K ÄSSLER et al. 2000)

2000 Berlin 1 (K ÄSSLER et al. 2000)

Brandenburg 1 (G RUNOW & P RIEBE 2007)

2001 Baden-Württemberg 2 (A NONYMUS 2002a)

Bayern 1 (G RUNOW & P RIEBE 2007)

2002 Baden-Württemberg 1 (A LPERS et al. 2003)

Berlin 1 (A LPERS et al. 2003)

Hessen 1 (A LPERS et al. 2003)

Niedersachsen 1 (A LPERS et al. 2003)

Nordrhein-Westfalen 1 (A LPERS et al. 2003)

2003 Baden-Württemberg 2 (J ANSEN et al. 2005)

Nordrhein-Westfalen 1 (J ANSEN et al. 2005)

2004 Baden-Württemberg 2 (J ANSEN et al. 2005)

Mecklenburg-Vorpommern 1 (J ANSEN et al. 2005)

2005 Baden-Württemberg 1 (S URV STAT @RKI 2008a)

Brandenburg 1 (S URV STAT @RKI 2008a)

Hamburg 1 (S URV STAT @RKI 2008a)

Hessen 10 (H OFSTETTER et al. 2005)

Niedersachsen 1 (S URV STAT @RKI 2008a)

Rheinland-Pfalz 1 (S URV STAT @RKI 2008a)

Sachsen-Anhalt 1 (S URV STAT @RKI 2008a)

2006 Bayern 1 (G RUNOW & P RIEBE 2007)

2007 Baden-Württemberg 11 (S URV STAT @RKI 2008b)

Bayern 3 (S URV STAT @RKI 2008b)

Brandenburg 1 (S URV STAT @RKI 2008b)

Mecklenburg-Vorpommern 1 (S URV STAT @RKI 2008b)

Niedersachsen 1 (S URV STAT @RKI 2008b)

Nordrhein-Westfalen 3 (S URV STAT @RKI 2008b)

14 Literaturübersicht

Im Jahr 2007 wurden 20 mikrobiologisch bestätigte Tularämie-Fälle registriert. Dies ist die höchste Fallzahl seit 1958. Ungewöhnlich waren hierbei der Schweregrad und die unterschiedlichen Erkrankungsformen der Tularämie. In nur 40 % der Fälle werden Hasen als Infektionsquelle genannt. Als weitere Ansteckungsquellen geben

SPLETTSTÖßER & K OPF (2008) kleine Nager, Ektoparasiten und kontaminierte

Oberflächengewässer an. Nach GRUNOW & P RIEBE (2007) muss auch in Zukunft damit gerechnet werden, dass die Erkrankung in verschiedenen Regionen Deutschlands als sporadische Infektion des Menschen auftritt bzw. auch größere Ausbrüche hervorruft. In Deutschland besteht eine gesetzliche Meldepflicht bei Nachweis des Krankheitserregers der Tularämie beim Menschen, die in dem seit 2001 geltenden Infektionsschutzgesetz (IfSG §7) festgeschrieben ist. Von 2001 bis 2004 wurden jährlich zwischen drei und fünf Erkrankungsfälle gemeldet (W EBER 2004, H OFSTETTER et al. 2005). Es ist allerdings von einer hohen Dunkelziffer auszugehen. Die Ursache könnte darin liegen, dass die Erkrankung auf Grund ihres variablen klinischen Erscheinungsbildes und möglicherweise klinisch inapparenten Verlaufes nicht erkannt oder differenzialdiagnostisch nicht in Betracht gezogen wurde (G RUNOW &

PRIEBE 2007).

2.1.2 Biologie und Taxonomie des Erregers

F. tularensis ist ein unbewegliches, pleomorphes, strikt aerobes, fakultativ intrazelluläres, gramnegatives Stäbchenbakterium. Es ist mit 0,2 - 0,7 x 0,2 µm verhältnismäßig klein und bildet keine Sporen. Die optimalen Bedingungen für sein Wachstum ist eine Temperatur von 37°C und ein pH-Wert von 6,8 - 7,3. F. tularensis stellt bei der Isolierung hohe Ansprüche an den Nährboden. Francisellen sind wärmeempfindlich; gegenüber Kälte, Feuchtigkeit und Laugen besteht dagegen hohe

Widerstandsfähigkeit (B ELL & R EILLY 1981, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988, D EUTZ &

GUGGENBERGER 2005, S ELBITZ 2007). Das Bakterium kann in Häuten 40 Tage, in feuchter Erde 50 Tage und im Wasser bis zu drei Monate überleben und infektionsfähig bleiben (S TEINECK 2000). In gefrorenem Kaninchenfleisch ist der Erreger bis zu vier Monate ansteckungsfähig und in Zecken soll er sogar 530 Tage

15 Literaturübersicht

infektiös sein können (B ELL & R EILLY 1981). SONGER & P OST (2005) gaben die Dauer der Überlebensfähigkeit in trockenem Stroh mit über sechs Monaten, in Kadavern mit mehr als vier Monaten und in Brackwasser und Schlamm bis zu drei Monaten sowie einen Monat in Kaninchenfleisch an. Bei 56 - 58°C wird das Bakterium innerhalb von zehn Minuten und durch direktes Sonnenlicht innerhalb von drei Stunden abgetötet

(D EUTZ & G UGGENBERGER 2005). Anfänglich wurde F. tularensis in das Genus Pasteurella eingegliedert. Im Jahre

1947 wurde der Erreger in das Genus Francisella reklassifiziert (S ONGER & P OST 2005). Analysen der 16S rRNA Sequenz ergaben, dass F. tularensis taxonomisch zu der γ-Untergruppe der Proteobacteria , der Ordnung Thiotrichales und der Familie der Francisellaceae gehört. Innerhalb des Genus Francisella werden phänotypisch die zwei Spezies F. tularensis und F. philomiragia unterschieden (F ORSMAN et al. 1994,

HOFER 2002, S ONGER & P OST 2005), welche eine Sequenzhomologie im 16S rRNA-

Gen von über 98 % aufweisen (F ORSMAN et al. 1994).

Von F. tularensis sind vier Subspezies bekannt, die aufgrund ihrer biochemischen

Eigenschaften, Verbreitung und Virulenz unterschieden werden (O LSUFJEV &

MESHCHERYAKOVA 1983, J OHANSSON et al. 2004, D EUTZ & G UGGENBERGER 2005,

SPLETTSTÖßER et al. 2005).

1. F. tularensis subsp. tularensis ( F. tularensis nearctica , Jellison Typ A) wird vorwiegend im Westteil Nordamerikas von Alaska bis Mexiko nachgewiesen. Der hochvirulente Typ A ist von besonderer Bedeutung. In letzter Zeit ist er auch in Europa aufgetreten. Die Subspezies kommt vor allem bei Hasenartigen vor. Sie wird hauptsächlich durch Zecken und Stechfliegen übertragen und ist für den Menschen und das Kaninchen hoch virulent.

(M ÖRNER et al. 1993, S JÖSTEDT et al. 1997, G URYCOVÁ 1998, D EUTZ &

GUGGENBERGER 2005, S ONGER & P OST 2005, S ELBITZ 2007). 2. F. tularensis subsp. holarctica ( F. tularensis palaearctica , Jellison Typ B) umfasst in Eurasien Gebiete von Nordsibirien bis Iran, Skandinavien, Mittel-

und Südeuropa, Nordafrika, Vorderasien, Indien, China und Japan (M ÖRNER et

16 Literaturübersicht

al. 1988, M ÖRNER et al. 1993, S JÖSTEDT et al. 1997). Dieser Typ kommt ganz vorwiegend bei Hasenartigen und kleinen Nagern vor und wird über Wasser

oder Arthropoden als Vektoren übertragen (S ONGER & P OST 2005). F. tularensis subsp. holarctica ist für Mensch und Kaninchen mäßig virulent.

BISPING & A MTSBERG (1988) beschreiben eine Resistenz des Kaninchens gegenüber F. tularensis palaeartica .

Diese Subspezies wird wiederum in drei Biovare unterteilt (O LSUFJEV &

MESHCHERYAKOVA 1983, D EUTZ & G UGGENBERGER 2005): • Biovar 1 (sensibel gegenüber Erythromycin) • Biovar 2 (resistent gegenüber Erythromycin) und • Biovar Japonica Biovar Japonica zeigt eine engere genetische Verwandtschaft zu

F. tularensis subsp. tularensis als zur F. tularensis subsp. holarctica (M ÖRNER et al. 1993). 3. F. tularensis subsp. mediaasiatica wurde nur in Zentralasien gefunden und ist

mäßig virulent für den Menschen und das Kaninchen (O LSUFJEV &

MESHCHERYAKOVA 1983, J OHANSSON et al. 2004, D EUTZ & G UGGENBERGER 2005). 4. F. tularensis subsp. novicida kommt im US-Bundesstaat Utah vor. Hasen sind

dem Erreger gegenüber resistent (D EUTZ & G UGGENBERGER 2005).

Klinisch von Bedeutung sind die ersten drei Subspezies. Serologisch sind die verschiedenen Subspezies, mit Ausnahme von F. tularensis subsp. novicida , nicht voneinander abzugrenzen. Obwohl seit langem bekannt ist, dass F. tularensis subsp. tularensis im Vergleich mit den anderen Subspezies eine wesentlich höhere Virulenz aufweist, sind dafür verantwortliche

Pathogenitätsfaktoren bis heute nicht bekannt (O LSUFJEV & M ESHCHERYAKOVA 1983).

17 Literaturübersicht

2.1.3 Diagnostik

Der labordiagnostische Nachweis wird entweder als direkter oder indirekter Erregernachweis geführt. Der direkte Erregernachweis kann mittels Bakterienkultur, Nukleinsäurenachweis und Antigennachweis aus verschiedenen Materialien wie z.B. Gewebeproben, Blut, Urin, Abstrichen oder Tränenflüssigkeit erfolgen. Der indirekte Erregernachweis ist durch den Nachweis spezifischer Antikörper im Serum möglich. Hierfür stehen der enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA), Western-Blot, Mikroagglutinationstest, Immunfluoreszenztest (IFT), Röhrchen-Agglutinationstest, Hämagglutinationstest oder Komplementbindungsreaktion (KBR) zur Verfügung. Kreuzreaktionen mit

Brucellen sind zu beachten (G RUNOW et al. 2001, P ORSCH -ÖZCÜRÜMEZ et al. 2004,

HOFSTETTER et al. 2005, S PLETTSTÖßER et al. 2005, S ELBITZ 2007). Antikörper sind in der Regel erst am Ende der zweiten Krankheitswoche nachzuweisen (K OSKELA &

SALMINEN 1985). In acht der 2007 gemeldeten 20 Fälle beim Menschen gelang der Direktnachweis des Erregers mittels PCR oder kultureller Anzüchtung. Zeitgleich wurde auch eine Zunahme von mikrobiologisch oder molekularbiologisch gesicherten F. tularensis -

Infektionen bei Feldhasen in der gleichen Region beobachtet (S PLETTSTÖßER & K OPF 2008). Früher wurde der Nachweis von Tularämie im Tierversuch geführt, indem

Meerschweinchen infiziert wurden (K ERSCHAGL 1965). Eine weitere frühe

Diagnostikmethode beschreibt SCHMIDT (1947) in Form einer „Hautprobe“, mit der schon ab dem fünften Krankheitstag eine Diagnose gestellt werden konnte. Hierbei wurde Tularin, ein Analogon zu Tuberkulin, in die Haut des Unterarms injiziert. Bei positivem Ausfall trat nach 12 - 24 Stunden eine deutliche Rötung und ödematöse Schwellung auf, die wenigstens vier Tage bestehen bleiben sollte.

18 Literaturübersicht

2.1.4 Tularämie beim Feldhasen

In Mitteleuropa haben Feldhasen, Wildkaninchen, Wühl- und Feldmäuse die größte Bedeutung in der Epidemiologie der Tularämie. Stechfliegen, Zecken, Flöhe und Läuse können nicht nur als Erregerreservoir, sondern auch als Vektoren fungieren

(E LLIS et al. 2002). Die Ermittlung von Naturherden ist Voraussetzung für die Bekämpfung bzw. für Vorbeugemaßnahmen gegen die Tularämie. In Deutschland gehört die Tularämie bei Tieren zu den meldepflichtigen Tierkrankheiten (Tierseuchengesetz, Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten, §1, in der Fassung vom 20.12.2005).

2.1.4.1 Übertragungswege beim Feldhasen Die Übertragung beim Feldhasen erfolgt über Ausscheidungen oder auch Ektoparasiten wie Zecken, Stechfliegen, Mücken, Bremsen, Flöhe, Läuse, Milben, und Wanzen (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). STEINECK (2000) zieht außerdem eine Übertragung durch den Deckakt in Betracht. Als weitere Ansteckungsmöglichkeit nennen BELL & R EILLY (1981) und BOCH & S CHNEIDAWIND (1988) den Kontakt von Tier zu Tier sowie die Aufnahme von kontaminiertem Futter.

2.1.4.2 Klinik der Tularämie beim Hasen Die Krankheit verläuft bei Hasen in der Regel akut und führt innerhalb weniger Tage zum Tod. Wenngleich charakteristische Krankheitserscheinungen nach Angaben verschiedener Autoren nicht existieren (K ERSCHAGL 1965, K ONRAD 1986, S TEINECK 2000), so verhalten sich an Tularämie erkrankte Hasen gegenüber Gesunden auffällig. Sie zeigen mangelndes oder sogar fehlendes Fluchtverhalten, sind abgeschlagen oder benommen. Häufig sind unkoordinierte Sprungbewegungen augenfällig. Aufgrund der Verhaltensstörungen lassen sie sich leicht fangen oder werden vom Hund gegriffen (S CHMIDT 1947, K ERSCHAGL 1965, K ONRAD 1986). Mit der regelmäßig erhöhten Körpertemperatur geht eine beschleunigte Atmung einher.

BOCH & S CHNEIDAWIND (1988) berichten neben dem akut-septikämischen Verlauf auch von einem subakut bis chronischem Verlauf. Hierbei verenden die stark

19 Literaturübersicht

abgemagerten Tiere nach 14 Tagen bis drei Wochen. In Einzelfällen kann die Tularämie auch subklinisch verlaufen. Die betreffenden Tiere sind dann bis zu elf Monate Bakterienträger bzw. -ausscheider.

2.1.4.3 Pathologisch-anatomische Befunde beim Hasen

Pathologisch-anatomisch werden unterschiedliche Bilder beschrieben. KERSCHAGL (1965) hält eine hochgradig geschwollene, dunkelschwarzrot gefärbte Milz von weicher breiiger Konsistenz für einen typischen Zerlegungsbefund. Auch andere

Autoren beschreiben ähnlich befundete Milzen (B ELL & R EILLY 1981, K ONRAD 1986,

BOCH & S CHNEIDAWIND 1988, H OFER 1997, S TEINECK 2000). Bei einem akuten Verlauf ist in der Regel eine auffallende Milzschwellung sowie mitunter eine hämorrhagische Enteritis zu beobachten. Bei einem chronischen Krankheitsgeschehen sind die Lymphknoten stark vergrößert, ihre Schnittfläche gerötet und mit teils speckigen, teils verkäsenden Herden durchsetzt. Ebensolche verschieden große Knötchen von gelblicher bis grauweißer Farbe finden sich in der stark vergrößerten Milz, aber auch in der Leber, der Lunge und am Bauchfell (B OCH & S CHNEIDAWIND 1988).

V. KEYSERLINGK (2006) beschreibt zum Teil massive Vergrößerungen von Milz, Leber, Nieren und Lymphknoten. Knotige Eiterherde in der Milz, zahlreiche, hirsekorngroße, gelbliche Herde in der Leber, vereinzelte Einschmelzungsherde in den Nieren, sowie entzündliche Beteiligungen der Lunge charakterisieren das pathologisch- anatomische Bild. Von fokalen, eitrig-nekrotisierenden Prozessen in Lunge, Herzbeutel, Nieren, Leber, Milz sowie Peritoneum, Präputium und Subkutis im

Brustbereich berichtet HOFER (1997). Auch STEINECK (2000) beschreibt, vor allem bei längerem Krankheitsverlauf, Nekroseherde in Lunge, Leber, Herz, Nieren, Milz, und Hoden. Stecknadelkopfgroße weiße Herde unter anderem im Knochenmark haben

BELL & R EILLY (1981) beobachtet. Sie berichten auch von Gefäßeinsprossungen mit einer plastikartig erscheinenden Haut. Insgesamt ist das Krankheitsbild dem anderer klassischer Hasenerkrankungen wie der Pasteurellose, der Pseudotuberkulose oder der Hämorrhagischen Septikämie sehr ähnlich (K ERSCHAGL 1965, B ELL & R EILLY 1981, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988). Infolge der Tularämie treten beim Hasen häufig weitere parasitäre oder bakterielle

20 Literaturübersicht

Erkrankungen auf, die als Sekundärinfektion zu interpretieren sind (K ERSCHAGL 1965).

2.1.4.4 Bekämpfung, Impfungen

Da es keine Schutzimpfungen für Tiere gibt (S TEINECK 2000), schlagen KERSCHAGL

(1965) und STEINECK (2000) als vorbeugende Maßnahmen in Tularämie-Gebieten eine gründliche Fallwildsuche sowie die Tötung erkrankter Hasen vor. Feldhasen, die Mattigkeit, verändertes Fluchtverhalten oder Abmagerung zeigen, sind nach Aussage der Autoren zu erlegen und einer Untersuchung zuzuführen oder, falls dies nicht möglich ist, unschädlich zu beseitigen. Von einem Vergraben oder dem Verbringen auf den Luderplatz ist unbedingt abzuraten (B OCH & S CHNEIDAWIND 1988), da - wie erwähnt - die Erreger in Kadavern und im Boden längere Zeit infektionsfähig bleiben. Tritt die Seuche im Herbst auf, sollte das Revier sofort bejagt werden. Durch die Verringerung der Populationsdichte wird die Gefahr einer gegenseitigen Ansteckung herabgesetzt (K ERSCHAGL 1965).

2.1.5 Tularämie beim Menschen

Der Mensch ist sehr empfänglich gegenüber Infektionen mit F. tularensis . In Deutschland werden jährlich durchschnittlich zwischen drei und fünf Humaninfektionen gemeldet. Von einer weitaus höheren Dunkelziffer ist aber auszugehen (W EBER 2004, H OFSTETTER et al. 2005). In Deutschland ist der direkte oder indirekte Nachweis von F. tularensis beim Menschen meldepflichtig (Infektionsschutzgesetz, §7, Abs. 1, Nr. 13, vom Januar 2001, zuletzt geändert Juli 2007).

2.1.5.1 Übertragungswege der Tularämie auf den Menschen Die Übertragung auf den Menschen kann durch Haut- oder Schleimhautkontakt mit infiziertem Tiermaterial, erregerhaltigem Staub, durch den Verzehr von unzureichend erhitztem infizierten Wildbret oder verseuchtem Wasser stattfinden (A NONYMUS

21 Literaturübersicht

2001). KERSCHAGL (1965) gibt die Übertragung über Mikroläsionen der Haut sowie der Bindehäute des Auges mit Blut oder Ausscheidungen an. HORNICK & E IGELSBACH (1966) beschreiben Infektionen des Menschen bereits nach intradermalem Eindringen über Mikroläsionen und Hautwunden oder Inhalation von 10 - 50 Keimen.

BOSSI et al. (2004) halten die Inokulation oder Inhalation von nur zehn Organismen ausreichend, um einen Menschen zu infizieren. Folglich können auch Schmierinfektionen bei Kontakt mit Harn oder Kot, Fellen und Bälgen auftreten. Darüber hinaus werden Laborinfektionen beim Umgang mit den Erregern oder bei der Inhalation von erregerhaltigen Aerosolen beschrieben (A NONYMUS 2001, W ÖLFEL 2002). Von Infektionen durch Bisse oder Stiche blutsaugender, infizierter

Ektoparasiten als Vektoren berichtet WÖLFEL (2002). Eine Übertragung von Mensch zu Mensch ist nicht bekannt (S CHMIDT 1947, P UNTIGAM 1960, K ERSCHAGL 1965,

ANONYMUS 2001) und wird als unwahrscheinlich angesehen (G RUNOW et al. 2001,

WÖLFEL 2002).

2.1.5.2 Klinik der Tularämie beim Menschen In Abhängigkeit von der Eintrittspforte, der Virulenz des Erregers und der Infektionsdosis kann die Inkubationszeit von zumeist drei bis sechs Tagen bis hin zu

21 Tagen variieren (S CHÄTZLE & S CHWENK 2008). Die Krankheit beginnt abrupt mit starken Kopf- und Gliederschmerzen, Fieber, Schüttelfrost sowie ausgeprägter Mattigkeit. Neben diesen grippeähnlichen Allgemeinsymptomen sind weitere vielfältige klinische Bilder bei der Tularämie nicht ungewöhnlich (S CHÄTZLE &

SCHWENK 2008). Eine Auflistung der verschiedenen Formen mit ihren entsprechenden Symptomen der Infektion gibt Tab. 2 wieder.

22 Literaturübersicht

Tab. 2: Formen der Tularämie mit den entsprechenden Symptomen (T ÄRNVIK et al. 2004,

ANONYMUS 2007b)

Form der Tularämie Symptome der Erkrankung Ulzeroglandulär (Häufigkeit 70 - 80 %) äußere Form Hautgeschwüre mit regionaler Lymphknotenschwellung Glandulär (Häufigkeit 2 - 12 %) Regionale Lymphknotenschwellung ohne Hautulzera Oculoglandulär (Häufigkeit 1 - 2 %) Konjunktivitis mit Schwellung ohrnaher Lymphknoten Oropharyngeal (Häufigkeit 2 - 4 %) innere Form Stomatitis, Pharyngitis, Tonsillitis, zervikale Lymphknotenschwellung Intestinal (Häufigkeit 7 - 14 %) Bauchschmerzen, Durchfall, Erbrechen Pulmonal (Häufigkeit 8 - 13 %) Primäre Erkrankung von Lunge und Pleura (Dyspnoe, Pneumonie) Typhoidal (Häufigkeit 7 - 14 %) Primär fieberhafte Erkrankung mit Sepsis

An der Eintrittspforte des Erregers kann es, je nach Erregertyp und Infektionsdosis, zu Entzündungserscheinungen (Papel, Ulkus) bis zur starken Vergrößerung, Schmerzhaftigkeit und evtl. geschwürigem Zerfall der tributären Lymphknoten kommen (K ERSCHAGL 1965, W EBER 1994, S TEINECK 2000, H OFSTETTER et al. 2005).

SCHÄTZLE & S CHWENK (2008) berichten über eine auffällige Wundheilungsstörung eines Patienten. Nach einer Brandblase am Mittelfinger, die die mögliche Eintrittpforte darstellte, schwoll der Finger stark an und heilte erst nach Wochen. Durch die Diagnose Tularämie in einem Fall, der sich 1950 im Taubertal ereignete, wurden im Nachhinein zwölf weitere Fälle dieser Infektion aufgeklärt. Hier lauteten die Fehldiagnosen z.B. Lymphdrüsentuberkulose, Panaritium, Tonsillarabzeß,

Appendicitis und sehr häufig Grippe (S CHUERMANN & H ÜTTNER 1950). Es ist daher anzunehmen, dass bis heute eine vermutlich höhere Zahl von Tularämie- Erkrankungen unerkannt geblieben ist.

23 Literaturübersicht

2.1.5.3 Prophylaxe, Therapie und Impfung Prophylaxe Menschen sollten sich in Endemiegebieten vor Ektoparasiten durch die Anwendung wirksamer Repellents schützen (W EBER 1994). In diesen Gebieten sollte kein Wasser aus Quellen oder Brunnen, die mit Exkrementen von Nagetieren kontaminiert sein könnten, getrunken werden (D EUTZ & G UGGENBERGER 2005). Ferner sollten Personen bei Umgang und Verarbeitung von Wildtieren stets Mundschutz und

Schutzhandschuhe tragen (W EBER 1994). Besonders gefährdete Personengruppen sind Jäger, Forstpersonal, Wildbret verarbeitende Personen, Präparatoren, Landwirte sowie Laborpersonal (H OFSTETTER et al. 2005). Die gleichen hygienischen Vorkehrungen sind auch bei der Verarbeitung von importiertem Wildbret, vor allem bei Hasen aus Gebieten mit enzootischer Tularämie, einzuhalten (W EBER 1994). Beim Ausnehmen der Hasen ist auf eine Vergrößerung von Milz und/oder Leber sowie gelbliche Herde in den Organen zu achten. Das Wildbret erkrankter Hasen ist als genußuntauglich anzusehen (K ONRAD 1986, S TEINECK 2000). Hasenfleisch sollte grundsätzlich nur gekocht oder vollständig durchgebraten verzehrt werden (K ONRAD

1986, S TEINECK 2000).

Therapie Bei frühzeitiger Diagnose und adäquater Therapie gibt es beim Menschen kaum Todesfälle. Eine antibiotische Therapie über mindestens 14 Tage ist das Mittel der

Wahl (S TEINECK 2000). Aktuell wird der Einsatz von Streptomycin und Gentamicin empfohlen. Quinolon ist eine wirksame Alternative (B OSSI et al. 2004, S PLETTSTÖßER et al. 2006). In weniger schweren Fällen kann die Behandlung oral mit Ciprofloxacin oder Doxycyclin durchgeführt werden (G RUNOW & P RIEBE 2007).

Impfung Eine früher in den USA produzierte Lebendvakzine wird nicht mehr hergestellt

(G RUNOW & P RIEBE 2007). In Deutschland ist eine Impfung nicht zugelassen (H OFER 2002). Ein Impfstoff ist gegenwärtig in den westlichen Ländern nicht verfügbar. Lediglich in Russland wird in Endemiegebieten ein Lebendimpfstoff verbreitet

24 Literaturübersicht

eingesetzt (G RUNOW & P RIEBE 2007). Eine überstandene Tularämie-Infektion hinterlässt eine lebenslange Immunität (K ERSCHAGL 1965).

2.1.6 Epidemiologie/Epizootiologie

Nach ELLIS et al. (2002) sind die Möglichkeiten für die Ausbreitung der Tularämie vielfältig. Über infizierte Nagetiere oder Zugvögel bzw. deren Ektoparasiten kann der

Erreger eingeschleppt werden. ALIBEK (1999) berichtet unter anderem von militärischen Forschungsprogrammen, in denen F. tularensis zur Herstellung bakteriologischer Waffen während der Zeit des so genannten „kalten Krieges“ Verwendung fand. Es gibt Mutmaßungen, dass bei experimentellen Arbeiten F. tularensis subsp. tularensis freigesetzt wurde und sich im Ökosystem ausgebreitet hat. Die Voraussetzungen für das Vorkommen der Tularämie aus geomedizinischer Sicht sind optimale Lebensbedingungen für die Reservoirtiere Hasenartige und Nagetiere (Lagomorpha und Rodentia ). Steppenartige Landschaften mit niedriger Bodenbedeckung bei gleichzeitigen günstigen klimatischen Bedingungen (z.B. Jahresniederschläge unter 450 mm) bieten gute Voraussetzungen für die

Vermehrung von Feldhasen und Nagetieren (S CHMIDT 1947, J USATZ 1961, H OFER

1997, H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999). Man könnte daher annehmen, dass die regenreichen Gebiete Westeuropas von größeren Tularämie-Epidemien verschont bleiben werden. Diese Ansicht bedarf nach LEMBKE (1969) einer gewissen Einschränkung. Seinen Beobachtungen zufolge kommt den klimatischen und geographischen Faktoren nur eine geringere Bedeutung zu. Das bedeutende norddeutsche Endemiegebiet um die Halbinsel Eiderstedt mit seinen sumpfigen Marschwiesen und dem ausgesprochen feucht-maritimem Klima scheint die Aussagen von Lembke zu belegen. Nur wenige andere Bakterien haben ein so breites Wirtsspektrum wie F. tularensis , das nahezu alle untersuchten Säugetierspezies einschließlich Haus- und Nutztiere umfasst (E LLIS et al. 2002). So konnte der Erreger bisher in über 250 verschiedenen Tierarten, darunter Säugetiere, Vögel, Fische, Amphibien und Arthropoden nachgewiesen werden (M ÖRNER 1992). Für den Menschen stellen kleine Säugetiere

25 Literaturübersicht

die wahrscheinlichsten Infektionsquellen bzw. Ansteckungsquellen dar. HOFSTETTER (2005) nennt als Erregerreservoir verschiedene kleine, wildlebende Säugetiere wie

Hasen, Kaninchen, Mäuse, Ratten, Eichhörnchen. JUSATZ (1940) zählt zu den Reservoirtieren in Osteuropa die Schermäuse, in Nordeuropa die Lemminge und in Mittel- und Südeuropa Hasen, Wildkaninchen und eventuell auch Bisamratten. Die Übertragung erfolgt horizontal zwischen den Reservoirtieren. Auch Ektoparasiten (Arthropoden), vor allem Zecken, spielen als Vektoren eine wichtige Rolle bei der

Aufrechterhaltung des Naturherdes (H UBALEK et al. 1998, G URYCOVA et al. 2001).

HUB ÁLEK et al. (1997) diagnostizierten in Tschechien, der Slowakei und Österreich bei 2,3 % der von ihnen untersuchten Zecken F. tularensis . Zecken nehmen beim Saugakt von infizierten Wirtstieren die Francisellen auf, können diese lange Zeit beherbergen und sogar transovariell an die nächste Generation weitergeben

(H UBÁLEK et al. 1997, H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999). Die Zecken beherbergen den

Erreger zwar, erkranken selbst aber nicht (S TEINECK 2000).

ISING & V. SPROCKHOFF (1978) unterscheiden je nach Empfänglichkeit bzw. Empfindlichkeit verschiedener Tierarten gegenüber F. tularensis drei epidemiologische Gruppen:

1. Tiere mit sehr hoher Empfänglichkeit, die schon durch geringe Keimzahlen infiziert werden können. Bei ihnen kommt es zu einem akut-septikämischen Verlauf mit Todesfolge. Zu dieser Gruppe gehören auch heimische Tierarten, wie z.B. der Feldhase, die Feld-, die Wald- und die Schermaus. 2. Die Tierarten der zweiten Gruppe, z.B. die Wanderratte oder das Eichhörnchen, sind hoch empfänglich, aber wenig empfindlich. Auch sie werden durch niedrige Keimdosen infiziert, sterben aber nur nach Aufnahme hoher Keimzahlen virulenter Stämme. Sie scheiden die Keime über lange Zeit aus und tragen so zur Aufrechterhaltung von Endemien bei. 3. Zur dritten Gruppe gehören Tierarten mit geringer Empfänglichkeit, die kaum erkranken, wie z.B. der Fuchs, der sich durch das Fressen von erkrankten Mäusen und Hasen infizieren kann. Auch Haus- und Nutztiere wie z.B. Pferd und Rind gehören in diese Gruppe ebenso wie verschiedene Vogelarten.

26 Literaturübersicht

KERSCHAGL (1965) sieht für Jagdhunde keine Infektionsgefahr bei Kontakt mit infizierten Wildtieren. Nach HARMS & H ÖRTER (1953), GRATZL (1960) und SONGER &

POST (2005) dagegen muss aber bei Jagdhunden, die Kontakt zu infizierten Tieren hatten, mit einer Infektion und Erkrankung durch F. tularensis gerechnet werden. Sie können außerdem den Erreger mechanisch übertragen, indem sie nach Kontakt z.B. mit infizierten Hasen oder Wasser den Erreger aus Fang oder Fell schütteln (S ONGER

& P OST 2005). Ein jahreszeitlich gehäuftes Vorkommen der Tularämie-Infektionen beschreiben

BOSSI et al. (2004) in den Sommermonaten (Juni bis September). In dieser Zeit ist die Übertragung durch Arthropoden (Zecken, Bremsen, Mücken) die Regel.

HÖFLECHNER -PÖLTL (1999) dagegen sieht in unseren Breitengraden einen deutlichen Schwerpunkt der Tularämie-Erkrankungen im Spätherbst und Winter: Nach einer Massenvermehrung der Feldmäuse im Herbst kommt es zu Übertragungen des Infektionserregers auf den Hasen, sodass während der Jagdsaison ab Oktober nach diesem Autor für den Menschen eine erhöhte Infektionsgefahr besteht. KNOTHE et al. (1959) vermuten, dass die Seuche zuerst unter Mäusen ausbricht und dann auf

Feldhasen übertragen wird. BSTEH (1937) stellt als epidemiologische Besonderheit heraus, dass der Tularämie-Epidemie bei Feldhasen von 1936/37 in Österreich eine Feldmausplage vorausging. Im November 1941 traten in Russland im Rostower Gebiet 8.500 Fälle von Tularämie beim Menschen auf, die im Januar 1942 auf

14.000 Erkrankungen anstiegen (S CHMIDT 1947). Auch hier ging der Epidemie eine durchschnittlich alle zehn Jahre rhythmisch wiederkehrende herbstliche Massenvermehrung der Mäuse voraus. Im Herbst 1948/49 sowie 1959/60 infizierten sich Beschäftigte von Zuckerfabriken in Russland bzw. in Niederösterreich. In beiden Fällen kam es im angefangenen Herbst zu einer Massenvermehrung bei Feldmäusen. Die Rübenmieten waren von höchsten Populationsdichten von Mäusen besiedelt. Bei der Rübenwäsche kam es zur Bildung eines hochinfektiösen Aerosols

(P UNTIGAM 1960), das von den Beschäftigten eingeatmet wurde. Von Infektionen durch Inhalation erregerhaltigen Staubes, z.B. bei Erntearbeiten mit Stroh, Heu oder Getreide, kontaminiert mit Sekreten und Exkreten oder Kadaver infizierter Hasen oder Nagetiere berichtete HOFER (1997). In den östlichen

27 Literaturübersicht

Bundesländern Österreichs kam es in der ersten Hälfte der 1990er Jahre zu einem solchen Krankheitsgeschehen, nachdem dort gehäuft Tularämie-Fälle bei Feldhasen vorgekommen waren (H OFER 1997). Ebenso ein Infektionsgeschehen, an dem mehrere tausend Menschen erkrankten, wurde in den Jahren 1966/67 in Schweden beobachtet (E LLIS et al. 2002). BELL (1981) berichtet von einer Entwicklung hochansteckender Stäube nach Umsetzen und Verladen von Heu, in dem sich nach einem massenhaften Sterben von Nagetieren die Kadaver befanden.

SPLETTSTÖßER & K OPF (2008) geben als weitere Infektionsquelle

Oberflächengewässer an. REINTJES et al. (2002) berichten von einem Ausbruch der Tularämie im Kosovo in den Jahren 1999/2000, bei dem 327 Personen an einer Infektion mit F. tularensis nach dem Verzehr von kontaminiertem Wasser erkrankten.

SCHMIDT (1947) zog die Kontamination von Gewässern durch Kot und Urin infizierter Wasserratten in Betracht. Weiter beschrieb der Autor die Anschauung russischer Forscher, nach denen die Infektion leicht von der Wasserratte auf die Feldmaus übertritt, da beide Nagerarten in den Schilfgebieten an den Ufern von Gewässern gemeinsam vorkommen. In den Jahren 1926 - 1928 traten im Südosten Russlands einige hundert Fälle von Tularämie bei der Uferbevölkerung großer russischer Flüsse nach dem Fang von Wanderratten auf, dem dortigen Reservoir des Tularämie-

Erregers. BERDAL (1996) sieht das vermehrte Auftreten der Tularämie in der Nähe von Gewässern in Zusammenhang mit der Fähigkeit der Francisellen, sich im

Inneren von Amöben zu vermehren. ELLIS (2002) berichtet ebenfalls, dass freilebende Amöben in Oberflächengewässern ein mögliches Reservoir der Francisellen darstellen können. Als weitere Ansteckungsquellen neben dem Feldhasen sind kleine Nager und

Ektoparasiten zu nennen (S PLETTSTÖßER & K OPF 2008). H IRSCH et al. (2001) beschrieben zwei Fälle aus Baden-Württemberg und Nordrhein-Westfalen, die eine typische epidemiologische Anamnese der Erkrankung demonstrieren. Die Patienten haben sich offenbar beim Aufenthalt in Naturherden der Tularämie durch engen Kontakt mit natürlichen Reservoiren wie Hasen oder blutsaugenden Insekten, die als Vektoren dienten, infiziert. Epidemiologisch besonders interessant ist ein Fall eines 18 Monate alten Kindes aus Freiburg, das durch den Stich einer Mücke infiziert

28 Literaturübersicht

wurde (S PLETTSTÖßER & K OPF 2008). Dieser Übertragungsweg war bisher nur aus Skandinavien berichtet worden und stellt möglicherweise auch für Deutschland ein potentielles Risiko für größere Bevölkerungsgruppen dar. Auch WEBER (2004) berichtet von einer möglichen Übertragung durch Bisse bzw. Stiche blutsaugender Insekten nach Urlaubsaufenthalten in Mecklenburg-Vorpommern oder Ungarn. Die Übertragung erfolgt auch auf andere Tiere wie z.B. Ratten, Biber, Waschbären, Lemminge sowie Huftiere. Hier sind unter anderem Rehe und Wildschweine zu nennen. Dass auch Vögel am Infektionsgeschehen beteiligt sind, zeigt eine

Erkrankung an Tularämie nach dem Biss einer Eule (SCHMIDT 1947). Unerkannt bleibende Verseuchungen von Nagetierpopulationen, die sich auf weitere Gebiete ausdehnen, stellen ein hohes Infektionsrisiko für Menschen dar, da Nagetiere die Hauptverbreitungsquelle der Tularämie sind. Aus ihnen heraus kann dann die Seuche als Epidemie auf den Menschen übergreifen. Eine Ausbreitung der Tularämie in Europa korreliert daher weitgehend mit der Entwicklung und Verbreitung der Nagetiere. So bringen russische Fachleute eine auffällige Nagetierwanderung in den 1940er Jahren von Osten nach Westen in Zusammenhang mit der Ausbreitung der Tularämie in die gleiche Richtung (S CHMIDT 1947). Auch JUSATZ (1961) berichtete von einer Ausbreitung der Tularämie nach Westen. In Deutschland tritt die Tularämie eher selten auf. Studien belegen jedoch, dass eine Seroprävalenz von bis zu 2 % beim Menschen vorliegt und die Fallzahlen unterschätzt werden (P ORSCH -ÖZCÜRÜMEZ et al. 2004). Wie bei allen Seuchen wechseln auch bei der Tularämie Seuchenzüge mit Zeiten ab, in denen die Krankheit scheinbar erloschen ist. Das trifft aber sicher nicht zu. Einzelne Krankheitsfälle werden bedingt durch die unspezifischen Krankheitssymptome beim Menschen häufig falsch diagnostiziert (K ERSCHAGL 1965). Auch in Niedersachsen traten sporadisch Tularämie-Infektionen auf. Bei einem 1950 im Kreis Helmstedt tot aufgefundenen Hasen und 1953 bei einem Hasen aus dem

Kreis Gifhorn wurde Tularämie diagnostiziert (H ARMS & H ÖRTER 1953). JUSATZ (1961) berichtet zeitgleich von Erkrankungsfällen beim Menschen - 1950 im Kreis Helmstedt und 1953 in Gifhorn -, bei denen jeweils ein Hase die Infektionsquelle darstellte. Er berichtet außerdem von einer Person, die sich 1958 im Regierungsbezirk Hildesheim

29 Literaturübersicht

infizierte. 1965 wurden weitere vier Fälle von Tularämie beim Menschen in

Niedersachsen gemeldet (L EMBKE 1969). SPLETTSTÖßER et al. (2007) beschreiben einen Tularämie-Ausbruch bei einer Gruppe von 62 Callitrix-Affen ( Callithrix jacchus ) im Göttinger Primatenzentrum. Von den halb-freilebenden Affen verstarben fünf der Tiere im Herbst 2004 an Tularämie. In diesem Primatenzentrum wurden nachfolgend über einen Zeitraum von zwei Jahren 18 Tularämie-Infektionen bei

Langschwanzmakaken (Javaneraffen) ( Macaca fascicularis ) festgestellt (M ÄTZ -

RENSING et al. 2007).

30 Literaturübersicht

2.1.7 F. tularensis als biologische Waffe

Die Übertragung der hochinfektiösen Krankheit durch erregerhaltige Aerosole machte das Bakterium in den 1940er und 1950er Jahren zu einer potentiellen biologischen Waffe. Mehrere Staaten, vor allem die USA, Japan und die frühere Sowjetunion haben an Programmen gearbeitet, um Tularämie-Erreger als biologische Kampfstoffe einzusetzen. F. tularensis ist auch heutzutage eines der Agenzien bei dessen Umgang höchste Sicherheitsanforderungen einzuhalten sind. Bis in die späten 1960er Jahre lagerte das U.S.-Militär Vorräte dieser biologischen

Waffe (D ENNIS et al. 2001, S ONGER & P OST 2005). Ken Alibek, ein früherer sowjetischer Militärwissenschaftler, hatte der Roten Armee im Zweiten Weltkrieg vorgeschlagen, die Bakterien gegen die deutschen Truppen einzusetzen. Er behauptete außerdem, dass die Sowjetunion noch bis in die frühen 1990er Jahre an einem Stamm von F. tularensis geforscht hat, der resistent gegen

Antibiotika ist und Vakzinen ihm gegenüber unwirksam sind (A LIBEK 1999). Durch Inhalation verursachte Tularämie-Erkankungen infolge absichtlicher Freisetzung eines virulenten Stammes von F. tularensis würden wegen der hohen Infektiosität nach der Aerosolisierung schwerwiegendste Auswirkungen für Menschen haben

(B OSSI et al. 2004). Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) nimmt an, dass eine Bakterienmasse von 50 kg über einer urbanen Region mit fünf Millionen Einwohnern verteilt, 19.000 Menschen töten und weitere 250.000 erkranken lassen würde

(A NONYMUS 1970). DENNIS et al. (2001) berichten von Fällen, in denen F. tularensis bei direkten Versuchen mit Menschen eingesetzt worden ist. Im Rahmen eines Programms der amerikanischen Kriegsführung wurden Freiwillige dem Aerosol in einer Kammer ausgesetzt. Ausbrüche pulmonaler Tularämie, besonders in Gegenden mit geringer Inzidenz, sollten Anlass sein, Bioterrorismus in Betracht zu ziehen (D ENNIS et al. 2001). Ein weiterer Infektionsweg bei absichtlicher Freisetzung könnte die Kontamination von Wasser sein. DENNIS et al. (2001) vermuten in einem Tularämie-Ausbruch unter sowjetischen und deutschen Soldaten im Zweiten Weltkrieg eine vorangegangene bewusste Freisetzung von Tularämie-Erregern.

31 Literaturübersicht

2.2 Brucellose

2.2.1 Historischer Überblick

Der Name Brucella geht auf den Militärarzt David Bruce zurück, der 1887 erstmals die zunächst als Micrococcus melitensis bezeichnete Art aus der Milz eines verstorbenen Soldaten mit „Maltafieber“ isolieren konnte (C ORBEL & M ORGAN 1982,

BOCH & S CHNEIDAWIND 1988, C UTLER et al. 2005). Die Brucellose ist eine weltweit verbreitete, chronische Infektionskrankheit der Tiere und des Menschen (D EDEK 1994). Es existieren verschiedene Vertreter der Gattung Brucella , die zum Teil in verschiedene Biovare unterteilt werden. In Europa tritt unter anderem B. suis Biovar 2, als Erreger der Hasen- und Schweinebrucellose auf.

B. suis Biovar 2 wurde erstmals von THOMSEN (1935) in Dänemark bei Schweinen nachgewiesen und rief hier eine von 1929 - 1932 andauernde Epizootie hervor

(H ELLMANN 1982). Den ersten bakteriologisch gesicherten Fall von Brucellose beim

Feldhasen beschrieb WITTE (1941).

Vermutlich ist die von BOLLINGER (1874) bereits 1872 in der Schweiz beobachtete

„Syphilis der Hasen“ mit der Brucellose identisch (B OUVIER et al. 1954). Auch

WILLINGER (1960) ist der Meinung, dass es sich bei der schon von OLT & S TRÖSE (1914) als „Knotenseuche des Hasen“ oder „Tuberosis caseosa“ beschriebenen seuchenhaften Geschlechtskrankheiten bzw. der „Hasensyphilis“ (K REMBS 1939) um eine Brucellose handelte, wogegen andere Autoren eine Erkrankung mit dieser

Bezeichnung der Spirochätose zuordnen (K ERSCHAGL 1965, K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Wie schon erwähnt, wird die Brucellose beim Feldhasen durch B. suis Biovar 2 ausgelöst. Daneben sind in einigen Fällen in Tschechien (N IZNANSKY et al. 1956) und

Frankreich (J OUBERT et al. 1970) von Hasen isolierte Stämme auch als Biovar 1 diagnostiziert worden (H ELLMANN 1982). In Einzelfällen konnte auch B. abortus

(W ITTE 1941) und B. melitensis (B OUVIER et al. 1953) isoliert werden. Die Brucellen haben ein breitgefächertes Infektionsspektrum und sind für fast alle

Haus- und Wildtiere pathogen (H ELLMANN 1982). Sie verursachen unter anderem

Aborte (C ARDOSO et al. 2006). B. suis ruft eine chronisch verlaufende Erkrankung

32 Literaturübersicht

hervor, die bei den Tieren pathologisch-anatomisch fast immer in den Geschlechtsorganen und darüber hinaus mit wechselnder Häufigkeit in weiteren inneren Organen sowie im Bereich der Unterhaut und Skelettmuskulatur durch Knötchen- oder Knotenbildung in Erscheinung tritt. Bei Hasen verläuft die

Erkrankung häufig tödlich (H ELLMANN 1982). Als Zoonoseerreger stellen die Brucellen auch für den Menschen eine Gefahr dar (B OCH & S CHNEIDAWIND 1988).

Die Hasenbrucellose wird in fast ganz Europa beschrieben (W ILLINGER 1960, F ENSKE

1963, F RITZSCHE 1963, E NGLERT et al. 1964, V ALENTINCIC 1964, K ERSCHAGL 1965,

DEDEK 1983, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988, D EDEK 1994). KERSCHAGL (1965) berichtet vom Vorkommen der Hasenbrucellose in der Schweiz, wo die Brucellosen über 10 % der Todesursachen bei eingegangenen Hasen ausmachten. In Deutschland tritt die Brucellose vor allen in den neuen Bundesländern enzootisch beim Feldhasen und flächendeckend beim Schwarzwild auf. Erreger ist zumeist B. suis Biovar 2. Bei serologischen und bakteriologischen Untersuchungen von Hasen von Jagdstrecken sowie bei an den Wildhandel gelieferte Hasen konnten bei bis zu 8 % der Probanden serologisch positive Ergebnisse ermittelt werden. Es besteht dabei eine teilweise sehr gute Übereinstimmung zwischen dem Vorhandensein der Hasenbrucellose und dem zeitgleichen Auftreten von Schweinebrucellose im Befallsgebiet (K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990). WEBER (2001) ist der Meinung, dass für das Hausschwein bei Freilandhaltung die in der Wildpopulation sporadisch auftretende Hasenbrucellose epidemiologisch eine Rolle spielen kann. Diese Feststellung gilt auch für das Wildschwein als weiteres mögliches Reservoir der Schweinebrucellose.

2.2.2 Biologie und Taxonomie des Erregers

Brucellen sind fakultativ intrazelluläre, gramnegative, unbewegliche, kokkoide bis kurze Stäbchenbakterien (0,5 - 0,7 x 0,6 - 1,7 µm). Sie sind nicht sporenbildend, aerob, zum Teil mikroaerophil wachsend und bilden keine Kapseln aus (H ELLMANN

1982, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988, C ARDOSO et al. 2006, A NONYMUS 2007a, S ELBITZ 2007). Gegenüber der Einwirkung von Hitze und Desinfektionsmitteln sind sie empfindlich. In wässriger Suspension werden sie bei Temperaturen von mehr als 60°C innerhalb von zehn Minuten abgetötet. Relativ resistent sind sie gegenüber

33 Literaturübersicht

Umwelteinflüssen. Bei niedrigen Umgebungstemperaturen können sie in Urin, Staub, Wasser, Erde und insbesondere in Milch und Milchprodukten bis zu einigen Wochen

überleben (A NONYMUS 2005). In feuchtem Kot bleiben sie bis zu 75 Tage infektiös, in abortierten Feten bis zu vier Monaten und in Milch ca. vier Wochen überlebensfähig

(V. SECK -LANZENDORF 1997). In gekühltem Fleisch sind sie bis zu drei Wochen kontagiös (D EDEK 1994). Auf künstlichem Nährboden wachsen nach drei- bis fünftägiger Inkubation bei 37°C zwei bis drei mm große, runde, glatte, vorgewölbte Kolonien, die gegen das Licht durchscheinend wirken. B. suis reagiert deutlich

Oxidase- und Katalase-positiv (D AMOSER & H OFER 1995, H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999). Seine Virulenz wird sowohl vom intrazellulären Parasitismus als auch von

Endotoxinen bestimmt (S ELBITZ 2007).

Der Genus Brucella gehört zu der Familie der Neisseriaceae und umfasst acht phänotypisch unterscheidbare Spezies, die z.T. in Biovare untergliedert werden

(D EDEK 1994, A NONYMUS 2007a, S ELBITZ 2007):

1. B. abortus , sieben Biovare, Erreger der Rinderbrucellose 2. B. melitensis , drei Biovare, Erreger der Schaf- und Ziegenbrucellose 3. B. suis , vier Biovare, Erreger der Schweine- und Hasenbrucellose 4. B. ovis , Erreger der Brucellose beim Schaf 5. B. canis , Erreger der Brucellose beim Hund 6. B. neotomae , Erreger der Brucellose der Ratte 7. B. cetaceae , Erreger der Brucellose bei Meeressäugetieren 8. B. pinnipediae , Erreger der Brucellose bei Meeressäugetieren 9. DNA-Analysen führten zu der Schlussfolgerung, dass alle Brucellen zu einer Spezies gehören. Aus Prioritätsgründen kann diese Spezies nur B. melitensis heißen, die übrigen Vertreter der Gattung sind demnach Biovare von B. melitensis . In dieser Arbeit werden, wie auch in der Literatur, weiter die herkömmlichen Namen benutzt

(S ELBITZ 2007). B. abortus , B. suis und B. melitensis sind die medizinisch wichtigsten

34 Literaturübersicht

Vertreter. Die Virulenz der Biovare ist für die verschiedenen Wirte unterschiedlich

(A NONYMUS 2007a).

2.2.3 Diagnostik

Das Vorliegen einer eitrigen Hoden- bzw. einer Gebärmutterentzündung beim Hasen ist als wesentlicher diagnostischer Hinweis auf das mögliche Vorliegen einer

Brucellose zu interpretieren (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Wie erwähnt, sind bei derartigen Erkrankungserscheinungen differentialdiagnostisch andere Hasenerkrankungen wie Pseudotuberkulose, Staphylokokkose sowie Spirochätose zu berücksichtigen (K ERSCHAGL 1965). Nur der definitive Erregernachweis kann eine entsprechende Verdachtsdiagnose verifizieren. Als Untersuchungsmaterial können Sperma, Blut, Feten, Eihäute, Knochenmark, Liquor, Urin, Gewebeproben oder Milch dienen (A NONYMUS 2005). Der direkte Erregernachweis kann durch die kulturelle Anzüchtung und durch die bakterioskopische Untersuchung z.B. nach Stamp erbracht werden. Bei der Kultivierung stellen die Brucellen hohe Ansprüche an Nährmedien. Brucellen-Arten sind morphologisch nicht voneinander zu unterscheiden und besitzen auch gemeinsame Antigene. Auffälliges Merkmal dieses Erregers ist die starke

Ureasebildung, die bereits innerhalb von 30 Minuten auftritt (S ELBITZ 2007). Eine weitere Bestätigungsmöglichkeit ist der Nukleinsäurenachweis mittels PCR. Auch der

Tierversuch mit Meerschweinchen kann in Erwägung gezogen werden (K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990, S ELBITZ 2007, T OMASO et al. 2007). Als indirekter Erregernachweis ist der Anikörpernachweis aus dem Serum z.B. mittels Coombs-Test, ELISA, Komplementbindungsreaktion (KBR), Serumlangsamagglutination (SLA), Fluoreszenz-Polarisations-Assay (FAP) und

Milchring- bzw. Rose-Bengal-Plattentest möglich (S ZULOWSKI et al. 1999, A L DAHOUK et al. 2003, A NONYMUS 2005, B AHN & N ÖCKLER 2005, S ELBITZ 2007). Serologische Kreuzreaktionen mit Antigenen von Yersinisa enterocolotica , Salmonella ssp ., F. tularensis und Escherichia coli sind möglich und können zu falsch positiven

Ergebnissen führen (A NONYMUS 2005, S ELBITZ 2007). Eine negative Agglutination (Widal-Reaktion) zu Beginn der Erkrankung schließt bei verdächtigem klinischen Bild

35 Literaturübersicht

eine Brucellose nicht aus. Daher empfiehlt sich eine wöchentliche Wiederholung der Untersuchung.

2.2.4 Brucellose beim Feldhasen

Während die Brucellose bei landwirtschaftlichen Nutztieren zu den anzeigepflichtigen Tierseuchen (Tierseuchengesetz, Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen

§ 1) zählt (A NONYMUS 2007a), ist die Brucellose beim Feldhasen nicht im Tierseuchengesetz aufgeführt. Diese Erkrankung beim Wild wird im Bundesjagdgesetz geregelt (Bundesjagdgesetz, 6.Abschnitt, Jagdschutz, § 24 Wildseuchen, zuletzt geändert am 31.10.2006). Die Seuche ist vom Jagdausübungsberechtigten unverzüglich der zuständigen Behörde anzuzeigen

(B OCH & S CHNEIDAWIND 1988).

2.2.4.1 Übertragungswege beim Feldhasen Hauptsächlicher Übertragungsweg unter den Hasen ist die genitale Ansteckung. Sowohl erkrankte Rammler als auch Häsinnen beherbergen im Genitaltrakt

Brucellen, die wechselseitig übertragen werden (K ONRAD 1986, K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990, V. SECK -LANZENDORF 1997). Die Ansteckung kann außerdem über Abortmaterialien, oral durch kontaminierte Nahrung oder über den Saugakt erfolgen

(V. SECK -LANZENDORF 1997). Die konjunktivale und perkutane Übertragung hält

DEDEK (1994) eher für nachrangig. BOCH & S CHNEIDAWIND (1988) messen der Nahrungsaufnahme und dem Saugakt bei der Übertragung eine große Bedeutung zu. KWAPIL (1993) gibt als wichtigste Infektionsquelle die abortierten Feten an. Wie

BENDTSEN et al. (1956) gezeigt haben, ist eine orale und konjunktivale Infektion von Hasen mit B. suis leicht möglich. Offenbar besitzen aber einzelne Tiere eine

Resistenz, so dass eine Infektion nicht in allen Fällen erfolgt. WEIDENMÜLLER & B ECK (1970) hingegen diskutieren neben dem Deckakt eine subkutane Infektion über Verletzungen oder Ektoparasiten (z.B. Bremsen, Flohstiche). Die Autoren halten immunologische Defizite für die Ausbildung der Brucellose für erforderlich. Die infizierten Hasen scheiden den Erreger mit Harn, Kot und Genitalsekret aus, wodurch

36 Literaturübersicht

im Wesentlichen die Äsung kontaminiert wird (K ONRAD 1986, K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990). Der Erreger dringt, nachdem er mit der Äsung aufgenommen wurde, vom Darmtrakt in den Körper ein und siedelt sich vorwiegend in den

Geschlechtsorganen an (K ERSCHAGL 1965).

2.2.4.2 Klinik der Brucellose beim Feldhasen

SELBITZ (2007) geht von einer Resistenz adoleszenter Tiere gegenüber der Brucellose aus, die in vielen Fällen eine klinische Manifestation bis zum Eintritt der

Geschlechtsreife verhindert. Aufgrund experimenteller Untersuchungen beschreiben

KÖTSCHE & G OTTSCHALK (1990) zwei Formen des Infektionsgeschehens, die sie so auch in der freien Wildbahn erkennen. Demnach spielt die akute septische Infektion neben der chronischen Erkrankung eine eher untergeordnete Rolle. Das individuelle Krankheitsgeschehen kann sich über mehr als ein Jahr erstrecken

(V. BRAUNSCHWEIG 1956). Das Allgemeinbefinden erkrankter Tiere scheint in der

Regel wenig gestört, und der Ernährungszustand ist gut (C HRISTIANSEN & T HOMSEN 1956). Bei chronischem Verlauf zeigen sich erst kurz vor dem Verenden die üblichen Erscheinungen kranker Hasen wie Abmagerung und Mattigkeit. In diesem Zustand sind die Tiere von Mensch und Hund leicht zu greifen (K ERSCHAGL 1965, K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990). VALENTINCIC (1964) und ANONYMUS (2007a) führen unter anderem Bewegungsstörungen und Lahmheiten als klinisches Symptom aufgrund Brucellen-bedingter Veränderungen der Gelenke an. Erst bei genauerer Betrachtung der erlegten Hasen können sichtbare, auf das Vorliegen einer Brucellose hinweisende Veränderungen festgestellt werden. Die Veränderungen betreffen vornehmlich die Geschlechtorgane. Bei Rammlern manifestiert sich die Infektion nicht selten nur in den Hoden (B ENDTSEN et al. 1954, H ELLMANN 1982). Diese können einseitig oder beidseitig stark anschwellen und später vereitern. An der Außenseite des Skrotums werden gelegentlich Geschwüre gefunden. Der Penis kann geschwollen und gerötet sein. Bei den Häsinnen sind ebenfalls die Geschlechtsorgane entzündet. Aus der Vagina entleert sich über die Vulva rötlicher

Schleim (K ERSCHAGL 1965, K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990) oder eitriger Ausfluss

37 Literaturübersicht

(K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Auch bei Hasen kann die Brucellose Aborte verursachen (K ONRAD 1986).

2.2.4.3 Pathologisch-anatomische Befunde Das pathologisch-anatomische Bild der Hasenbrucellose wird bestimmt durch das Vorhandensein teilweise konfluierender hirsekorn- bis kirschgroßer Knoten, die ausnahmsweise bis hühnereigroß werden können und zu zentraler Erweichung neigen. Die Prozesse sind durch eine Bindegewebskapsel von der Umgebung abgegrenzt und zeigen gelegentlich Kalkeinlagerungen (B ENDTSEN et al. 1956,

FENSKE 1963, H ELLMANN 1982, K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990, S ELBITZ 2007). Sie sind in einer Vielzahl von Organen zu finden, wie z.B. in der Uterusschleimhaut, der Uteruswand, in Leber, Lunge, Lymphknoten, im Zaekum sowie im entwickelten

Milchdrüsenparenchym (H ELLMANN 1982, K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990, D AMOSER &

HOFER 1995). Häufig ist die Milz vergrößert und mit Knoten durchsetzt. Die Nieren bleiben in der Regel unverändert. Zu den auffälligsten Manifestationen zählt die

Knotenbildung in der Subkutis und der Muskulatur (HELLMANN 1982). WITTE (1941) fand multiple bis haselnussgroße, leicht verschiebliche Knötchen am Sternum und beidseitig an der äußeren Brustwand, die mit gelbem, geruchslosem Eiter angefüllt waren. Veränderungen durch eitrig-nekrotisierende Entzündungen konnten DAMOSER

& H OFER (1995) in Darmbein-, Kniekehl- und Mandibularlymphknoten feststellen. Da sich die Brucellose vorrangig in den Geschlechtsorganen manifestiert, ist bei den Rammlern ein besonderes Augenmerk auf die Hoden zu richten. Sie können, einseitig oder beidseitig, bis zu Längen von 14 cm (K ERSCHAGL 1965), bzw. bis 28 cm

(F ENSKE & P ULST 1973) vergrößert sein. Das Parenchym ist häufig nahezu vollständig durch nekrotisches Gewebe ersetzt (H ELLMANN 1982, K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990,

DAMOSER & H OFER 1995). Bei weiblichen Tieren wird mit wechselnder Häufigkeit ein verdickter Uterus, der häufig ein eitriges Sekret enthält (H ELLMANN 1982, K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990) sowie eine Vaginitis (K ERSCHAGL 1965) diagnostiziert. Häufig ist die Schleimhaut des Uterus ebenfalls eitrig-entzündlich verändert (K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990), Uterusschleimhaut und -wand sind von Abszeßbildungen betroffen (F ENSKE 1963, V ALENTINCIC 1964). BENDTSEN et al. (1956) beschreiben

38 Literaturübersicht

darüberhinaus Nekroseherde im Darm, VALENTINCIC (1964) beobachtete hier

Schleimhautverdickungen. VALENTINCIC (1964) konnte in einem Fall eine Arthritis und Periarthritis mit Abszessbildung diagnostizieren. Eine Schwellung der Hinterläufe beobachteten DAMOSER & H OFER (1995), die durch eine flächenhafte, eitrig- verkäsende Entzündung der Subkutis hervorgerufen war. Differentialdiagnostisch muss die Brucellose von der Pseudotuberkulose, der Staphylokokkose und der

Spirochätose abgegrenzt werden (K ERSCHAGL 1965, H ELLMANN 1982).

2.2.4.4 Bekämpfung, Impfungen

KERSCHAGL (1965) sieht bei der Seltenheit der Erkrankung der Hasen an Brucellose keine Notwendigkeit besonderer Bekämpfungsmaßnahmen. KÖTSCHE & G OTTSCHALK (1990) halten es dennoch für sinnvoll, in Revieren, in denen Hasenbrucellose festgestellt wurde, einen verstärkten Hasenabschuss und das Absuchen mit Hunden durchzuführen, um den Hasenbestand und damit das Infektionsrisiko in der Population, zu minimieren. Alle geschossenen Tiere sind auf ihren Allgemeinzustand, starke Abmagerung sowie auf sichtbare Veränderungen wie Hodenabszesse und

Vaginalausfluss zu untersuchen (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Tiere mit Veränderungen, die nicht zur Untersuchung gelangen, sind unschädlich zu beseitigen (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Mögliche Impfungen sind beim Hasen unnötig und nicht durchführbar (S ELBITZ 2007).

2.2.5 Brucellose beim Menschen

B. abortus , B. suis und B. melitensis sind die wesentlichen humanpathogenen

Brucellen (C ARDOSO et al. 2006, A NONYMUS 2007a). TOMASO (2007) gibt zudem noch B. canis als pathogen für den Menschen an. Für die Erkrankung beim Menschen existieren eine Reihe von Synonymen: Maltafieber, Mittelmeerfieber, Gibraltarfieber und Morbus Bang (A NONYMUS 2007a). In Deutschland wurden in den Jahren 2002 und 2003 insgesamt 62 Fälle von Brucellose gemeldet. Mit Ausnahme eines einzelnen B. suis Biovar 1-Stammes wurden alle Isolate B. melitensis zugeordnet (A L

DAHOUK et al. 2005). MANTUR et al. (2007) geben die Erfassungsrate von Brucellose

39 Literaturübersicht

beim Menschen mit weniger als 10 % an. Bei B. suis werden vier Biovare unterschieden, von denen Biovar 2 nur in Europa vorkommt. Erkrankungsfälle durch

B. suis Biovar 2 beim Menschen sind nicht bekannt (D EDEK 1983). Daher halten

BENDTSEN et al. (1956), DEDEK (1983), GODFOID & K ÄSBOHRER (2002) und ANONYMUS (2007a) B. suis Biovar 2 im Gegensatz zu B. suis Biovar 1,3 und 4 für das Infektionsgeschehen beim Menschen für marginal bedeutend. Auf die grundsätzliche

Infektionsgefahr für den Menschen muss jedoch hingewiesen werden (F ENSKE 1963,

DEDEK 1983). Der direkte oder indirekte Nachweis der Brucellose beim Menschen ist meldepflichtig (A NONYMUS 2005, 2007a), soweit die Nachweise auf eine akute Infektion hinweisen (Infektionsschutzgesetz §7).

2.2.5.1 Übertragungswege der Brucellose auf den Menschen In erster Linie erfolgt die Übertragung der Brucellen auf den Menschen durch direkten Kontakt mit Ausscheidungen infizierter Tiere über die Lidbindehäute und

Mikroläsionen der Haut (K ERSCHAGL 1965, D EDEK 1994, W EBER 1994, A L DAHOUK et al. 2003, A NONYMUS 2007a). WEBER (1994) berichtet von Infektionen durch Aerosole oder erregerhaltige Staubpartikel. Kontaktmöglichkeiten sind vor allem beim

Abbalgen und Zerlegen infizierter Hasen gegeben (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Eine Infektion ist auch durch den Verzehr von infiziertem, nicht genügend erhitztem Fleisch möglich. Die Übertragung von Mensch zu Mensch wurde bisher selten beobachtet (A NONYMUS 2007a).

2.2.5.2 Klinik der Brucellose beim Menschen Die Inkubationszeit beim Menschen beträgt im Schnitt 10 - 14 Tage, sie kann aber auch mehrere Monate andauern. Die Krankheit beginnt schleichend ( B. abortus , B. suis , B. canis ) oder abrupt ( B. melitensis ) mit Fieber, Schüttelfrost, Übelkeit, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Nachtschweiß und gelegentlich Diarrhoe. Das Fieber, bis zu 21 Tage andauernd, wird nicht selten von fieberfreien Intervallen unterbrochen. Undulierendes Fieber ist typisch für eine Brucellose beim Menschen. Bei chronischen Krankheitsverläufen sind, nach vorausgehendem Unwohlsein, Muskel-,

40 Literaturübersicht

Kopf-, und Nackenschmerzen sowie abendlichem Temperaturanstieg, das Auftreten von Gelenkbeschwerden und Veränderungen der inneren Organen möglich. Letztere stellen sich als Schwellungen und Entzündungen von z.B. Leber, Milz, Nieren, Hoden, Nebenhoden dar. Die Leisten- und Achsellymphknoten können ebenfalls anschwellen. Endokarditiden und Meningoencephalitiden sowie andere neurale

Veränderungen sind möglich (K ERSCHAGL 1965, D EDEK 1994, A L DAHOUK et al. 2005,

ANONYMUS 2007a).

2.2.5.3 Prophylaxe, Therapie und Impfung Prophylaxe

Eine berufliche Exposition besteht für Tierärzte, Fleischer und Landwirte (W EBER

1994, A NONYMUS 2005) sowie für Laborpersonal und Wildhändler (K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990). Das Verbot lebende Hasen aus Gebieten mit Hasenbrucellose zu importieren bzw. exportieren, ist einzuhalten und als prophylaktische Maßnahme zu werten (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Vor dem Versorgen der Hasen sollten diese makroskopisch auf Abmagerung, Veränderung der Hoden bzw. Vaginalausfluss untersucht werden. Lassen die Hasen Abweichungen von der Norm erkennen, sind sie mit entsprechender Vorsicht aufzubrechen (K ÖTSCHE &

GOTTSCHALK 1990). Es sind allgemeingültige Hygienevorschriften einzuhalten, wie z.B. das Tragen von Einmalhandschuhen, vor allem dann, wenn Hautverletzungen vorliegen (D EDEK 1994). Durch Anwendung geeigneter Handsalben wird zusätzlich transdermalen Infektionen vorgebeugt (A NONYMUS 2005). Aufgrund der erläuterten Infektionswege erweist sich die Verwendung von Mund- und Augenschutz als sinnvoll. Des Weiteren sollte Wildfleisch generell nur gut durchgegart verzehrt werden. An Brucellose erkrankte Hasen sind ungenießbar (K ERSCHAGL 1965).

Therapie und Impfung Bei nicht erkannten oder nicht korrekt behandelten Infektionen sind längere

Erkrankungsverläufe nicht ungewöhnlich (A NONYMUS 2005). Die Therapie der Brucellose beim Menschen ist langwierig, die Prognose aber günstig. Das Mittel der Wahl ist eine Antibiotikatherapie mit Rifampicin und Doxycyclin (sechs bis zwölf

41 Literaturübersicht

Wochen) (A NONYMUS 2005) oder Tetracyclin und Streptomycin (D EDEK 1994). Für den Menschen ist aktuell keine Vakzination möglich (A L DAHOUK et al. 2003, S ELBITZ 2007).

2.2.6 Epidemiologie/Epizootiologie

Bei Wildtieren existiert in weiten Teilen Ost- und Mitteleuropas ein Naturreservoir von

B. suis Biovar 2. GODFOID & K ÄSBOHRER (2002) geben hier in erster Linie den Hasen und das Wildschwein an. Das Vorkommen der Hasenbrucellose wurde in Deutschland, Dänemark, Österreich, der Schweiz, Frankreich und den osteuropäischen Ländern beschrieben (B ENDTSEN et al. 1954, E NGLERT et al. 1964,

VALENTINCIC 1964, D EDEK 1983, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988, D EDEK 1994). Durch das enzootische Vorkommen der Brucellose in Hasen- und Wildschweinpopulationen besteht eine ständige Infektionsgefährdung für

Hausschweinbestände (B ENDTSEN et al. 1954, E NGLERT et al. 1964, D EDEK 1983, 1994). Die Frage nach Verbreitung, Herkunft und Zusammenhängen der Haustierbrucellose und hier insbesondere die Infektionen der wirtschaftlich wichtigen Nutztiere ist zweifelsohne von Bedeutung für die gesamte Brucellosebekämpfung und -forschung. Von verschiedenen Autoren wird dieses Thema kontrovers diskutiert. Erkrankungen können sowohl von Wild- als auch von Nutztierbeständen ausgehen und eine wechselseitige Infektion auslösen (K ONRAD 1986), wobei der Übertragung von den Hasen auf das Hausschwein und umgekehrt eine besondere Bedeutung beigemessen wird (K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Die in Dänemark in den Jahren zwischen 1929 und 1959 aufgetretenen Fälle von Schweinebrucellose sind offenbar ausschließlich von infizierten Hasen ausgegangen

(B ENDTSEN et al. 1954, T HOMSEN 1959, B ENDTSEN 1960). Auch in Deutschland ist bei einer Schweineherde ein solcher Fall mit der gleichen Pathogenese aufgetreten. In Frankreich wurden sieben Brucellose-Ausbrüche im Jahr 2000 bei Schweinen registriert, bei denen ebenfalls B. suis Biovar 2 isoliert werden konnte. Auch hier infizierten sich die Hauschweine bei der Weidehaltung durch die Aufnahme verendeter Feldhasen (G ODFROID & K ÄSBOHRER 2002). Daneben spielt nach

KÖTSCHE & G OTTSCHALK (1990) auch die Verfütterung von Grünfutter, das auf der

42 Literaturübersicht

Weide kontaminiert wurde, eine Rolle. THOMSEN (1959) berichtet von Infektionsversuchen, in denen Schweine durch B. suis -Stämme, die vom Feldhasen isoliert wurden, infiziert wurden. BENDTSEN et al. (1956) erbrachten den Nachweis, dass die Verfütterung von Innereien mit an Brucellose infizierter Hasen ursächlich für den Ausbruch der Schweinebrucellose in Dänemark war. Im Gegenzug haben die Autoren Übertragungsversuche mit B. suis auf Feldhasen durchgeführt. Es waren relativ leicht Infektionen auszulösen, die serologisch und pathologisch-anatomisch verifiziert werden konnten. FENSKE (1963) sieht mögliche Infektionen des Feldhasen durch das Ausbringen erregerhaltigen Schweinemistes zu Düngezwecken. Hasen infizieren sich in erster Linie auf Schweineweiden, auf denen brucellosebedingte Aborte stattfanden, wobei dem oralen Infektionsweg die größte Bedeutung zukommt

(K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990).

Von FRITZSCHE (1963), BENDTSEN et al. (1956) und WEIDENMÜLLER & B ECK (1970) vorgenommene Infektionsversuche mit B. abortus in Hasen brachten keine Bestätigung der wiederholt geäußerten Auffassung, dass infizierte Rinder oder kleine Wiederkäuer die Infektionsquelle für die Hasen darstellen, vielmehr weist alles auf ein selbständiges Infektionsgeschehen bei der Hasenbrucellose hin. Auch KÖTSCHE

& G OTTSCHALK (1990) sehen keine Beziehung zwischen der Hasenbrucellose und der Rinderbrucellose. Für KLÄHN (1962) dagegen war die in Teilen Mecklenburgs stark verbreitete Rinderbrucellose Ursache für die Hasenbrucellose, da die Weiden infolge von Aborten kontaminiert sind. WILLINGER (1960) erklärte die vorangegangenen widersprüchlichen Ansichten über die Entstehung der Hasenbrucellose mit einer gewissen temporären Resistenz der Hasen gegenüber B. abortus . Der Nachweis tatsächlich in freier Wildbahn stattgefundener Erkrankungen des Feldhasen durch Brucellen des bovinen Typs belegt unzweifelhaft die Möglichkeit einer solchen Infektion, die unter Umständen erst nach resistenzmindernden Unwelteinflüssen manifest werden kann. In der Tat sind Brucellose-Enzootien unter den Hasen in manchen Gegenden über viele Jahre hinweg beobachtet worden, ohne dass sich Beziehungen zu Haustiererkrankungen erkennen ließen (T HOMSEN 1959, E NGLERT et al. 1964).

43 Literaturübersicht

Wildkarnivoren sind bei der Verbreitung von Brucellen epidemiologisch ebenfalls zu beachten (D EDEK 1994). PAVLOV et al. (1960) berichteten, dass in Bulgarien, wo die Weidehaltung der Schweine die vorwiegende Haltungsform darstellt, B. suis neben den schon erwähnten Hasen, Haus- und Wildschweinen unter anderem auch bei Zecken und Füchsen nachgewiesen wurde. Die Füchse infizierten sich vermutlich durch die Aufnahme abortierter Feten oder Nachgeburten von Schweinen. Des

Weiteren sind Vögel an der Verbreitung des Bakteriums beteiligt (S ELBITZ 2007).

STOLL & M ANZ (1971) führten außerdem den Nachweis von B. suis Biovar 2 bei einer Wanderratte. Auch in Deutschland wird das regionale enzootische Vorkommen der Schweinebrucellose auf die dort ebenfalls heimische Hasenbrucellose zurückgeführt

(F RITZSCHE 1963, E NGLERT et al. 1964, S CHEIBNER 1974, K ONRAD 1986). Im Umkehrschluss gehen die Autoren davon aus, dass Enzootien der Hasen von infizierten Schweineweiden ihren Ausgang nehmen können. In Rheinland-Pfalz und Rheinhessen wurden sieben Fälle von Hasenbrucellose ermittelt, bei denen von epidemiologischen Zusammenhängen zwischen Schaf- und Hasenbrucellose ausgegangen wird (F RITZSCHE 1956). FRITZSCHE (1959) berichtete weiter von 14 positiven Reaktionen bei 188 Hasenblutproben. In dem untersuchten Gebiet von Rheinland-Pfalz trat in den vergangenen vier Jahren keine Schweinebrucellose auf. Der Autor sieht demnach in der Feldhasenpopulation das natürliche Brucellosereservoir. Von zwölf Brucellose-Fällen bei Hasen aus fünf Kreisen

Mecklenburgs berichtet KLÄHN (1962). In vier Gebieten der Bezirke Frankfurt/Oder und Neubrandenburg wurden 15 Brucellose-Erkrankungen bei Hasen diagnostiziert, hervorgerufen durch B. suis Biovar 2 (F ENSKE 1963). Bei Fallwilduntersuchungen in den Jahren 1950 - 1970 wurden von 1307 untersuchten Hasen 24 Fälle von

Brucellose in Bayern ermittelt (W EIDENMÜLLER 1971). Bei Brucellose-Untersuchungen im Bezirk Potsdam reagierten 16,6 % der untersuchten Hasen positiv. Die isolierten

Stämme wurden als B. suis Biovar 2 differenziert (F ENSKE & P ULST 1973). DEDEK (1983) beschrieb Untersuchungen in sechs Kreisen des Bezirkes Rostocks, die zur Ermittlung eines zusammenhängenden Hasenbrucellosegebietes in den Kreisen Wolgast und Greifswald führten. In den 1980er Jahren wurden gelegentlich

44 Literaturübersicht

brucellosekranke Hasen aufgefunden; somit ist z.B. im Bezirk Rostock (D EDEK et al.

1990a, D EDEK et al. 1990b) wie auch in Bayern (S CHELLNER 1982) von einem regionalen Fortbestehen der Hasenbrucellose auszugehen. KÖTSCHE & G OTTSCHALK (1990) vermuten einen Zusammenhang zwischen der Hasenbrucellose und der im Gebiet der ehemaligen DDR in den 1980ern weit verbreiteten Brucellose des

Schwarzwildes. PULST (1968) berichtete über den Nachweis von B. suis Biovar 2 in Deutschland beim Wildschwein. Systematische Untersuchungen in Ostdeutschland erbrachten dort den positiven Nachweis in allen Kreisen dieser Bundesländer beim Schwarzwild und, auf bestimmte Regionen begrenzt, auch beim Feldhasen. Hinsichtlich der epidemiologischen Bedeutung hat das Schwarzwild dort den Feldhasen verdrängt. Es liegt die Vermutung nahe, dass Brucellose-Titer, die bei Rot-, Reh- und Damwild nachgewiesen wurden mit der Aufnahme kontaminierter

Äsung in Zusammenhang stehen (D EDEK 1994). 1988 wurde B. suis Biovar 2 aus einem in Schleswig-Holstein verendeten Hasen isoliert (K WAPIL 1993). WAGATHA (1989) konnte in der Umgebung Münchens bei 279 untersuchten Hasen dagegen keine Brucellose feststellen. Von anderen Teilen Westdeutschlands liegen bei

Wildtieren keine Informationen über den Verbreitungsgrad der Brucellose vor (D EDEK

1994). In den Jahren 1990 - 1993 isolierten DAMOSER & H OFER (1995) in Österreich aus pathologisch veränderten Organen von fünf adulten Feldhasen B. suis Biovar 2. Das Untersuchungsmaterial wurde von Jägern eingesandt, denen Veränderungen an den Hasen bzw. an deren Organen aufgefallen waren. Mehrere Autoren vermuten, dass von der Hasenbrucellose immer nur relativ eng begrenzte Gebiete einer Region betroffen sind (F ENSKE & P ULST 1973, W AGATHA

1989). FENSKE (1963) fand in der ehemaligen DDR infizierte Gebiete mit einer Fläche von nicht mehr als 100 - 200 ha. ANDERSEN (1951) zitiert in (B ENDTSEN et al. 1956) erklärt die geringe Flächenausdehnung der Brucellose mit der Territorialität der Hasen. Seine Ergebnisse belegen, dass Hasen sich nicht über einen Umkreis von 3 km hinaus bewegen. Auch BENDTSEN et al. (1956) bestätigen diese Aussagen zur Standorttreue. Aufgrund erfolgreich durchgeführter staatlicher Bekämpfungsmaßnahmen ist Deutschland seit 1999 laut EU-Kommission amtlich frei von Rinderbrucellose

45 Literaturübersicht

(A NONYMUS 2007a) bzw. frei von B. abortus und B. melitensis (W EBER 2004). Auftretende Erkrankungsfälle bei Tieren müssten daher durch den Tierhandel importiert oder von Wildtieren auf Nutztiere übertragen sein (A NONYMUS 2005). In Südeuropa dagegen kommt B. melitensis nach wie vor bei Schafen und Ziegen vor. Das Infektionsgeschehen mit diesem Erreger spiegelt sich hier beim Menschen wieder (G ODFROID & K ÄSBOHRER 2002). Da die Brucellose beim Hasen häufig schleichend oder chronisch verläuft, übertragen infizierte Rammler beim Geschlechtsakt die Brucellose weiter

(K ERSCHAGL 1965). Die Ergebnisse eines Infektionsversuches, bei dem ein Kaninchenrammler mit Hasenbrucellose infiziert wurde, belegen diese Aussage augenfällig (B OUVIER et al. 1954). Das brucelloseinfizierte Tier blieb lange fruchtbar, belegte erfolgreich eine mit ihm gehaltene Häsin, die keine Geburtsstörungen zeigte. Nach 18 Monaten erreichte der infizierte Hoden die Größe eines Gänseeies. Dies spricht für einen auffallend langsamen Krankheitsverlauf und damit für eine äußerst langfristig bestehende Infektionsquelle. Die Jungtiere stecken sich wahrscheinlich beim Saugakt am infiziertem Muttertier an und erkranken auch erst später manifest.

46 Literaturübersicht

2.3 Zielsetzung

Ziel der Arbeit war es, zu klären wie hoch die Prävalenz der Erreger von Tularämie und Brucellose der Feldhasenbesätze in Niedersachsen ist. Wie in Abb. 1 dargestellt, weisen die Regionen im Westen und Norden Niedersachsens sowie Teile der Börde im Vergleich zu den Heide- und Mittelgebirgsregionen deutlich höhere Hasenbesätze auf (S TRAUß 2007). Die Probennahme erfolgte in den Hauptvorkommensgebieten der Hasen. Zudem wurden wegen aktueller Tularämie-Vorkommen bei Langschwanzmakaken (Affen) im Bereich Südniedersachsens ebenfalls Feldhasen beprobt, da hier eine Übertragung über Nagetiere auf die Hasenpopoulation vermutet wird. Zusätzlich zu den geschossenen Hasen wurde zur Untersuchung eingeschicktes Fallwild aus ganz Niedersachsen in die Untersuchungen miteinbezogen. Aufgrund der Bedeutung von Tularämie und Brucellose als Zoonosen sowie der dargelegten aktuellen Fälle von Tularämie beim Menschen in Deutschland existiert Klärungsbedarf über die Verbreitung dieser Erkrankungen auch in Niedersachsen, vor allem vor dem Hintergrund, dass annährend 25 % der Bundesstrecke an Hasen in Niedersachsen erzielt wird (DJV 2008).

47 Literaturübersicht

Abb. 1: Besatzdichte des Feldhasen in Niedersachsen 2007 (S TRAUß 2007)

48 Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 Material

Die verwendeten Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Reagenzien, Nährmedien, Puffer und Lösungen sind im Anhang aufgelistet.

3.1.1 Probenmaterial

Es wurde Probenmaterial von insgesamt 930 Feldhasen aus Niedersachsen auf die Erreger F. tularensis und Brucella sp. untersucht. Diese Untersuchungszahl von 930 Proben setzt sich aus 680 geschossenen Hasen und 250 Fallwildhasen zusammen. Der Zeitraum der Untersuchung erstreckt sich von August 2006 bis Januar 2008. Für die bakteriologischen und molekularbiologischen Untersuchungen, wurde jeweils die Leber als Untersuchungsmaterial verwendet. Wenn die Leber nicht gewonnen werden konnte, wurde die Milz für die Untersuchung ausgewählt.

3.1.1.1 Fallwild Unter dem Begriff „Fallwild“ werden verendet aufgefundene Feldhasen und moribunde Tiere, die daraufhin erlegt wurden, zusammengefasst. Diese Hasen wurden an das Veterinärinstitut Hannover gesandt und dort auf ihre Todesursache untersucht. Den Hasen lag, in den meisten Fällen, ein Vorbericht bzw. Begleitschreiben über Fundort, Todeszeitpunkt und gegebenen Auffälligkeiten bei. Eine tabellarische Auflistung der Herkunftsorte der eingesandten Fallwildhasen befindet sich im Anhang (Tab. 12). Eine graphische Übersicht der Herkunftsorte stellt Abb. 2 dar.

49 Material und Methoden

Abb. 2: Übersicht über die Herkunft der untersuchten Probanden in Niedersachsen

3.1.1.2 Erlegte Hasen Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Proben, die nicht von Fallwild stammten, wurden Hasen von Treibjagdstrecken entnommen. Die Jagdsaison auf Hasen beginnt am 01. Oktober und endet am 15. Januar eines jeden Jahres. Es wurden 30 Reviere in 13 verschiedenen Landkreisen in Niedersachsen beprobt. Hierbei handelt es sich um sehr hasenreiche Reviere. Eine Übersicht über die Verteilung der Proben gibt Tab. 13 (siehe Anhang). Eine graphische Darstellung enthält Abb. 2. Das Probenmaterial wurde von Mitarbeitern und Hilfskräften des Instituts für Wildtierforschung an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gewonnen. Die Entnahme der Organe erfolgte unmittelbar nach der Jagd.

50 Material und Methoden

3.2 Methoden

3.2.1 Probengewinnung

Die inneren Organe wurden während oder direkt nach den Jagden den frischtoten, geschossenen Hasen entnommen. Die Feldhasen und deren Proben wurden markiert und mit einer fortlaufenden Nummerierung versehen. Jeder Organsatz wurde in eine separate, saubere Plastiktüte verbracht und in einer isolierten Transportkiste mit Kühlakkus gelagert. Der Organsatz bestand aus: Trachea, Ösophagus, Lunge, Herz, Leber, Niere, Milz, Zwerchfell, Magen sowie dem Darmkonvolut und seinen Anhangsdrüsen. So konnte im Falle einer nicht vorhandenen Leber die Milz zur Aufarbeitung Verwendung finden. Die Proben wurden anschließend zur Sektion in das Veterinärinstitut Hannover des LAVES verbracht. In der Kühlkammer der Sektionshalle wurden die Organe kurzzeitig bei 4°C zwischengelagert. Dort wurden auch die Fallwildhasen angeliefert und kurzeitig gelagert. Alle Organe wurden vor der Abfüllung in die Probengefäße makroskopisch beurteilt. Bei den Fallwildhasen wurde zusätzlich der gesamte Tierkörper einer Sektion unterzogen. Danach wurde jeweils ein Stück aus Lunge, Herz, Leber, Niere, Milz und Zwerchfell in ein Probengefäß abgefüllt. Die Probengefäße wurden mit Nummern versehen, um eine eindeutige Zuordnung zum Tier, Revier und Probennahmezeitpunkt zu gewährleisten. Die Gewebeproben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C eingefroren. Zur Verhinderung von Kontaminationen wurde unter entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen gearbeitet. Es wurde das Präparationsbesteck zur Vermeidung von Kontaminationen der Organproben nach jeder Präparation eines Organsatzes dekontaminiert. Des Weiteren wurden zum persönlichen Schutz Kittel, Schürze, Handschuhe, Mundschutz und Überziehschuhe getragen.

51 Material und Methoden

3.2.2 Bakteriologische Untersuchungsmethoden

Die Bakterienkultur sollte zum qualitativen Nachweis von Brucellen in klinischem Material vom Hasen angewandt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 250 Fallwildproben kulturell auf Brucellen untersucht. Des Weiteren wurde eine Stamp- Färbung von Abklatschpräparaten dieser Proben durchgeführt.

3.2.2.1 Anlegen der Bakterienkultur Die Anzüchtung von Brucellen erfordert aufgrund ihrer hohen Nährstoffansprüche

Selektivnährmedien und spezifische Kulturbedingungen (S ELBITZ 2007). Für die Anzüchtung der Brucellen wurde Lebergewebe gewählt. Als Nährmedium wurde ein spezieller Brucella -Selektivnährboden, welcher im LAVES, Lebensmittelinstitut Braunschweig hergestellt wurde, verwendet. Unter sterilen Bedingungen wurde dem Ausgangsmaterial eine Teilprobe entnommen. Das ca. haselnussgroße Organstückchen wurde mit der frisch hergestellten Schnittfläche auf der Plattenoberfläche ausgestrichen. Nach dem fraktionierten Ausstreichen von Lebergewebe auf dem Brucella -Selektivnährboden wurde für mindestens 3 bis 5 Tage bei 37 °C aerob inkubiert. Brucella -verdächtige Keime stellen sich kulturell- morphologisch auf dem verwendeten Brucella -Agar als kleine, weiße Kolonien, zumeist in S-Form dar (S ELBITZ 2007). Die Brucellen-Arten sind morphologisch nicht zu differenzieren. Die Bearbeitung wurde unter der Werkbank durchgeführt.

3.2.2.2 Stamp-Färbung Die Stamp-Färbung diente dem lichtmikroskopischen, orientierenden Nachweis von

Brucellen. Die Färbung wurde nach den Vorgaben von BISPING & A MTSBERG (1988) durchgeführt. Die Methode wurde in der Färbedauer sowie in der Konzentration der Färbelösungen leicht modifiziert. Das hitzefixierte Präparat wurde mit 1 : 3 verdünnter Karbolfuchsinlösung für 3 min gefärbt. Nach dem Abspülen mit Aqua dest. wurde 30 sec in 1 %ger Essigsäure entfärbt. Erneut wurde mit Aqua dest. abgespült und für 2 min mit filtriertem Malachitgrün gegengefärbt. Im letzten Schritt

52 Material und Methoden

wurde das Präparat noch einmal mit Aqua dest. abgespült und anschließend getrocknet. In der Stamp-Färbung weisen leuchtend rote, in Nestern liegende, kokkoide Kurzstäbchen auf eine Infektion mit Brucellen hin. Mit dieser Färbemethode werden auch andere Bakterienarten gefärbt. Ein eindeutiger Nachweis, wie auch eine morphologische Unterscheidung der Brucellen-Arten ist mit der Stamp-Färbung nicht möglich.

3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungsverfahren

3.2.3.1 Nukleinsäure-Extraktion Die Isolierung der Gesamt-DNA aus den genannten Proben erfolgte nach dem Protokoll für Gewebematerial des QIAamp ® DNA Mini Kit. Das Prinzip beruht auf der Lyse von Gewebe mit anschließender selektiver Bindung der DNA an die Membran der im Kit enthaltenen Säulen. Es folgen zwei Wasch-Schritte zur Entfernung von Proteinen sowie anderen Zellbestandteilen und anschließend die Elution der gebundenen DNA, die dann als Template in der PCR eingesetzt werden kann. Bei jeder DNA-Isolierung wurden jeweils eine positive und eine negative Kontrollprobe mitgeführt. Als Positivkontrolle für die DNA-Isolierung wurde dem Gewebe eine 20 µl Suspension des Typstammes F. tularensis subsp. holarctica (ATCC 29684) in einer Konzentration von 3 x 10 3 Bakterien zugesetzt. Der Typstamm wurde freundlicherweise von Herrn Dr. Müller, Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen des Friedrich-Loeffler-Instituts, Jena, zur Verfügung gestellt. Als Negativkontrolle wurde Francisella- bzw. Brucella-freies Organmaterial verwendet. Die negative Kontrolle soll einen Hinweis auf eine mögliche Kreuzkontaminationen während der DNA-Extraktion geben. Die Kontrollen wurden in gleicher Weise wie die anderen zu präparierenden Proben behandelt. Bei allen Arbeitsschritten wurden Nitril-Handschuhe und Kittel getragen und die entsprechenden Sicherheitshinweise befolgt. Dem Protokoll für Gewebeproben des QIAamp ® DNA Mini Kits entsprechend wurde mit sterilen Bestecken nach Auftauen der Probe ein kleines Gewebestück (ca.

53 Material und Methoden

20 mg) der Leber in ein DNA-, DNase-, RNase-freies, verschraubbares 2.0 ml Reaktionsgefäß verbracht. Dieser Arbeitsschritt erfolgte unter einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2. Nun wurden 180 µl ATL-Puffer und 20 µl  Proteinase K zugegeben und die Proben mit Hilfe einer Stahlkugel im Tissue Lyser 2 min bei 20 U/sec zerkleinert. Anschließend wurde die Suspension bei 55°C in einem Heizblock unter mehrmaligem Aufschütteln für 30 min inkubiert. Nach vollständiger Lyse des Gewebes wurden 200 µl AL-Puffer hinzugegeben, kräftig gemischt und erneut bei 70°C für 10 min im Heizblock inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Proben wiederholt mit einem Rüttler gut durchmischt. Es folgte die Zugabe von 200 µl 96 %igem Ethanol. Erneut wurde für 20 sec kräftig gemischt. Die gesamte Probenmenge (max. 600 µl) wurde auf eine im Kit enthaltene Silicagelsäule gegeben und bei 6.800 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen und die Säule auf ein neues Reaktionsgefäß gesteckt. Auf die Säule wurden nun 500 µl Waschpuffer 1 gegeben, und es wurde erneut bei 6.800 x g zentrifugiert. Das Eluat wurde wiederum verworfen, die Säule auf ein neues Reaktionsgefäß gesteckt und 500 µl Waschpuffer 2 auf die Säule gegeben. Es folgte ein zweiminütiger Zentrifugationsschritt: zunächst 1 min bei 6.800 x g, anschließend 1 min bei 20.800 x g. Eluat und Reaktionsgefäß wurden verworfen. Die Säule wurde auf ein neues Reaktionsgefäß gesteckt. Auf die Säule wurden jetzt 200 µl auf 70°C erwärmtes, molekularbiologisch aufgereinigtes Wasser gegeben und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 6.800 x g für 1 min wurde die Säule verworfen und das Eluat (ca. 200 µl) mit der gelösten DNA in ein 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß überführt.

54 Material und Methoden

3.2.4 Nachweis von F. tularensis

Die PCR wurde im Blockcycler durchgeführt. Bei dem Nachweis F. tularensis - spezifischer DNA wurde zur Bestätigung des Ergebnisses die Aufarbeitung und die PCR im Blockcycler sowie im LightCycler ® wiederholt.

3.2.4.1 Auswahl der Primer Zum spezifischen Nachweis einer bestimmten Ziel-DNA sollten die Primer, die in der PCR eingesetzt werden, komplementär zur DNA-Vorlage sein. Die Primer sollten eine Länge von 15 - 30 Nukleotiden haben. Die Spezifität nimmt nicht weiter zu, wenn die Primer aus mehr als 30 Nukleotiden bestehen (N EWTON & G RAHAM 1994). Es sollten nach Möglichkeit keine Primer verwendet werden, die an ihrem 3`-Ende komplementär sind. Damit wird verhindert, dass sich Primerdimere ausbilden, ein Vermehrungsartefakt, welches auftritt, wenn die DNA-abhängige DNA-Polymerase den einen Primer komplementär zum anderen Primer oder zu sich selbst synthetisiert und so ein kurzes, unerwünschtes DNA-Stück entsteht (N EWTON & G RAHAM 1994). Das entstehende Amplifikat sollte eine Länge von 100 - 1000 Basenpaaren (bp) haben. Zum Nachweis von F. tularensis wurden Primer verwendet, die im Bereich des

16S rRNA-Gens hybridisieren (S PLETTSTÖßER et al. 2005). Die als TUL4-435 und TUL4-863 bezeichneten Primer, wurden bei der Anwendung der PCR im Blockcycler ® eingesetzt und von der Fa. Biometra synthetisiert (M ÜLLER et al. 2007). Das PCR- Produkt hat eine Länge von 428 bp. Die Primer hybridisieren zwischen Position 435 und 863 des 16S rRNA Gens (M ÜLLER et al. 2007). Für die Bestätigungsreaktionen im LightCycler ® wurden, die im Kit (LightMix ® für F. tularensis ) enthaltenen Primer eingesetzt.

3.2.4.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) Blockcycler In ein Eppendorf-Reaktionsgefäß wurde der als Mastermix bezeichnete Ansatz entsprechend den Angaben in Tab. 3 pipettiert. Dieser und die folgenden

55 Material und Methoden

Arbeitsschritte wurden im Kühlblock durchgeführt. Für den PCR-Ansatz wurde die HotStarTaq ®DNA Polymerase verwendet.

Tab. 3: Mastermix-Ansatz für F. tularensis im Blockcycler

Reagenzien µl/Probe Konzentration Puffer (PCR Buffer, 10x) 5 Qiagen

MgCl 2 1 2,0 mM dNTP Mix Biometra 1 200 µM Primer 1 (TUL 4-435) 0,2 20 pmol Primer 2 (TUL 4-863) 0,2 20 pmol Polymerase (HotStarTaq ®DNA) 0,2 1U

Mol. biol. H2O 37,4

Der Mastermix wurde gemischt und kurz zentrifugiert. Pro Ansatz wurden 45 µl je PCR-Gefäß pipettiert. Anschließend wurden 5 µl DNA-Extrakt aus der jeweiligen Probe hinzugefügt. Als Positivkontrolle der PCR wurden 5 µl der Referenz-DNA aus der DNA-Extraktion des Typstammes ATCC 29684 als Ziel-DNA eingesetzt. Als Negativkontrolle der PCR wurden 5 µl Aqua dest. anstatt des DNA-Templates verwendet. Nach dem Ansetzen wurde die PCR sofort gestartet.

Folgendes Temperatur-Zeit-Programm wurde für die Amplifikation verwendet:

• Aktivierung der Polymerase 95°C 15 min • Denaturierung 95°C 30 sec • Annealing 60°C 30 sec 35 Zyklen • Synthese 72°C 30 sec • Elongation 72°C 5 min

Hieran schloss sich eine Agarosegelelektrophorese an, wie in Kap.3.2.4.3 beschrieben.

56 Material und Methoden

LightCycler ® Die Detektion findet bei der real-time PCR mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen statt, die in der Regel an Oligonukleotid-Sonden gekoppelt sind, welche spezifisch an das PCR-Amplifikat binden. Die Detektion der Fluoreszenzintensitäten im Verlauf der real-time PCR ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung der Produkte, ohne die Probenröhrchen nach der PCR wieder öffnen zu müssen (M ACKAY 2004).

Als Mastermix wurde der LightMix ® zum Nachweis von F. tularensis in Kombination mit dem Lightcycler ® FastStart DNA Master Hybridization Probes verwendet. Für den 15 µl Ansatz wurden folgende Reagenzien pipettiert (Tab. 4):

Tab. 4: Mastermix-Ansatz für F. tularensis im Lightcycler ®

Reagenzien µl/Probe* Enzym-Mix (FastStart) 2 Primermix Francisella 4,0 Primermix IPC 4,0

MgCl 2 2,4

Mol. biol. H2O 2,6 *Konzentration im Kit nicht bekannt

Der Mastermix wurde gemischt, kurz zentrifugiert und pro Ansatz wurden 15 µl je PCR-Reaktionsgefäß eingesetzt. 5 µl DNA-Extrakt wurden jeder Probe hinzugefügt. Der Positivkontrolle der PCR wurden 5 µl der Standardreihe der Fa. TIB ® MOLBIOL in der Verdünnung von 10 2 bzw. 10 3 Kopien zugesetzt. Als Negativkontrolle wurden 5 µl Aqua dest. anstatt des DNA-Extraktes hinzugefügt. Der Primermix IPC (Internal Positive Control) diente hier als interne Kontrolle, um eine Inhibition der PCR auszuschließen. Nach dem Ansetzen der PCR wurden die Kapillare in den Lightcycler ® eingesetzt und der Durchlauf gestartet. Diese Arbeitsschritte wurden im Kühlblock durchgeführt.

57 Material und Methoden

Hierbei galten folgende Amplifikationbedingungen:

• Aktivierung der Polymerase 95°C 10 min • Denaturierung 95°C 10 sec • Annealing 55°C 8 sec 45 Zyklen • Synthese 72°C 15 sec • Schmelzkurve 95°C 20 sec • Schmelzkurve 40°C 20 sec • Schmelzkurve auf 85°C in 0,2°C Schritten • Kühlen 40°C 30 sec

Um Kontaminationen und damit falsch-positive Ergebnisse zu verhindern, wurden bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen: • Strikte räumliche Trennung der verschiedenen Arbeitsschritte: DNA- Extraktion, Vorbereitung der PCR und Vervielfältigung der Zielsequenz, Analyse und Charakterisierung der PCR-Produkte. • Kittel und Handschuhe wurden für jeden Arbeitsbereich gewechselt. • UV-Dekontamination der Arbeitsplätze • Portionierung der Reagenzien in kleinen Mengen zur Vermeidung einer Kontamination der Vorratslösungen.

3.2.4.3 Ermittlung der Nachweisgrenze Nachweisgrenze; Zellsuspension (Blockcycler) Zur Methodenetablierung und Festlegung der Nachweisgrenze wurde anhand eines Mc-Farland-Standards eine Bakteriensuspension in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Hierfür wurde der Typstamm F. tularensis subsp. holarctica (ATCC 29684) verwendet. Es wurde von einem Mc-Farland 0,5 ausgegangen. Die Bakterienkonzentration betrug ca. 1,5 x 10 8 Bakterien/ml entsprechend einer Konzentration von 3 x 10 6 Bakterien in 20 µl. Diese Suspension wurde bis zu einer Konzentration von 15 Bakterien verdünnt. Je 20 µl von jeder Verdünnungsstufe

58 Material und Methoden

wurden mit dem QIAamp ® DNA Mini Kit aufgearbeitet. Im Anschluss an die DNA- Extraktionen der einzelnen Verdünnungsstufen wurde eine PCR im Blockcycler durchgeführt.

Nachweisgrenze; Gewebe (Blockcycler) Zur Ermittlung der Nachweisgrenze in Gewebeproben wurde infiziertes Gewebe simuliert, indem von den oben beschriebenen Verdünnungsstufen jeweils 20 µl zu 20 mg eines F. tularensis DNA-negativen Leber-Gewebes zugesetzt wurden. Aus dieser Suspension wurde ebenfalls mit dem QIAamp ® DNA Mini Kit die DNA extrahiert und in der PCR eingesetzt.

Nachweisgrenze der PCR im LightCycler ® Zur Ermittlung der Nachweisgrenze von F. tularensis im LightCycler ® wurde eine im Kit (LightMix ® für F. tularensis ) enthaltene Standardreihe mit definierten Anteilen von 10 1 bis 10 6 Kopien verwendet. Diese Standardreihe wurde in der PCR eingesetzt.

3.2.4.4 Nachweis der PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese Zur Detektion der PCR-Produkte wurden die Amplifikate im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Für die Herstellung des Agarose-Gels wurde 2,25 g Agarose abgewogen und zusammen mit 75 ml TAE-Puffer in der Mikrowelle unter mehrmaligem Schwenken bis zum vollständigem Auflösen zum Kochen gebracht. Nach kurzeitigem Abkühlen wurde die Flüssigkeit in eine Gelkammer gegossen. Es wurde ein Kamm, der als Platzhalter für die Geltaschen diente, in das flüssige Gel eingesetzt. Nach einer Abkühlungsphase von ca. 30 min war das Agarose-Gel erstarrt und der Kamm wurde entfernt. Zum Auftragen der Proben wurde das Gel in eine Elektrophoresekammer mit TAE- Puffer als Laufpuffer eingesetzt. Nun wurden jeweils 2 µl Gel Solution/Probenpuffer in einer Mikrotiterplatte vorgelegt. Diese wurden mit jeweils 10 µl Probe vermengt und auf das Agarose-Gel in die Geltaschen aufgetragen. Zur Bestimmung der DNA-

59 Material und Methoden

Fragmentgröße wurde in die letzte Geltasche ein Marker aufgetragen, der als Größenstandard diente. Hierzu wurden 1 µl Markerpuffer mit 5 µl Marker vermischt. Es folgte der Lauf der DNA im Gel, der bei einer Spannung von 60 Volt ca. 1,5 Stunden dauerte. Während der Agarosegelelektrophorese wurden die Amplifikate im elektrischen Feld aufgetrennt und anschließend mit Hilfe von Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Das Gel wurde hierfür zunächst 3 min in Ethidiumbromidlösung und anschließend 3 min in entmineralisiertem Wasser geschwenkt. Die Visualisierung und Dokumentation erfolgte mit dem BioDocAnalyse- System basierend auf der Wechselwirkung von doppelsträngiger DNA mit Ethidiumbromid und dessen Fluoreszenz unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 312 nm.

Auswertung der PCR Die Analyse der PCR-Produkte wurde durch Auftrennung der Amplifikate in der Agarosegelelektrophorese und Vergleich mit DNA-Fragmenten des Größenstandards analysiert. Ein PCR-Ergebnis wurde als positiv gewertet, wenn die Negativkontrolle keine, die Positivkontrollen deutliche Banden ergaben und sich bei der Probe eine Bande zeigte, die dieselbe elektrophoretische Mobilität wie die Positivkontrolle zeigte. Schwache Banden wurden bedingt als positiv gewertet und die Proben erneut untersucht. Zur Bestätigung der positiven Proben auf F. tularensis , wurden diese an das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (Konsiliarlabor für Tularämie) nach München geschickt. Ebenfalls zur Untersuchungen auf F. tularensis wurden die Proben, die eine positive Reaktion zeigten, an das FLI, Jena, gesandt. Das Amplifikat mit den Primern TUL4- 435 / TUL4-863 diente dem Speziesnachweis F. tularensis . Die Subspezies F. tularensis subsp . holarctica gilt als nachgewiesen, wenn für die Proben-DNA und für die DNA des Typstammes nach der PCR mit den Primern FtC1 / FtC4 ein gleich großes Amplifikat von 300 bp detektiert wurde. Ist das Amplifikat größer, so ist es nicht F. tularensis subsp . holarctica zuzuordnen (A NONYMUS 2006) (Tab. 5). Hierfür

60 Material und Methoden

wird das Primerpaar FtC1 / FtC4 zusammen mit dem Primerpaar TUL4-435 / TUL4-

863 in der Multiplex-PCR verwendet (J OHANSSON et al. 2000) (Tab. 6).

Tab. 5: Primersequenzen zum Nachweis von F. tularensis

Primer Sequenz Fragmentlänge Referenz TUL4-435 5´- GCT GTA TCA TCA TTT AAT AAA CTG CTG -3´ 400bp Sjöstedt 1997 TUL4-863 5´- TTG GGA AGC TTG TAT CAT GGC ACT - 3´ FtC1 5´- TCC GGT TGG ATA GGT GTT GGA TT - 3´ 300bp/ 330bp Johansson 2000 FtC4 5´- GCG CGG ATA ATT TAA ATT TCT CAT A - 3´

Tab. 6: Auswertung der PCR im Blockcycler zum Nachweis von F. tularensis

Amplifikationsprodukte unter Verwendung der Primer Bewertung der PCR TUL4-435/TUL4-863 FtC1/FtC4

400 bp 300 bp F. tularensis subsp . holarctica 400 bp 330 bp F. tularensis Negativ Negativ Negativ

3.2.5 Nachweis von Brucella sp.

3.2.5.1 PCR Zum Nachweis von Brucella sp. wurden Primer und eine DNA-Sonde der Fa. TIB ® MOLBIOL verwendet, die eine Sequenz des 16S rRNA-Gens hybridisieren. Das Primerpaar amplifiziert ein Fragment von 207 bp. Die Untersuchungen wurden im LightCycler ® 2.0 durchgeführt. Für den folgenden PCR-Ansatz wurde der LightMix ® zur Ermittlung von Brucella sp. in Kombination mit dem LightCycler ® FastStart DNA Master Hybridization Probes Tab. 7 verwendet. Pro Ansatz (15 µl) wurden die folgenden Lösungen in beschriebener Reihenfolge pipettiert:

61 Material und Methoden

Tab. 7: Mastermix-Ansatz für Brucella sp. im LightCycler ®

Reagenzien µl/Probe* Enzym-Mix (FastStart) 2 Primermix Brucellen 4,0 Primermix IPC 4,0

MgCl 2 2,4

Mol. biol. H2O 2,6 *Konzentration im Kit nicht bekannt

Der Mastermix wurde gemischt und kurz anzentrifugiert. Pro Ansatz wurden 15 µl je LightCycler ®-Kapillare eingesetzt. Anschließend wurden 5 µl DNA-Extrakt der jeweiligen Probe hinzugefügt. Für diese PCR wurde derselbe DNA-Extrakt wie für den Nachweis von F. tularensis verwendet. Der Positivkontrolle der PCR wurden 5 µl der Standardreihe der Fa. TIB ® MOLBIOL in der Verdünnung von 10 2 bzw. 10 3 Zielmoleküle zugesetzt. Als Negativkontrolle wurden 5 µl Wasser anstatt des DNA- Extraktes hinzugefügt. Der Primermix IPC (Internal Positive Control) diente hier als interne Kontrolle um eine Inhibition der PCR auszuschließen. Für die Durchführung der PCR galten folgende Amplifikationsbedingungen:

• Aktivierung der Polymerase 95°C 10 min • Denaturierung 95°C 10 sec • Annealing 55°C 8 sec 45 Zyklen • Synthese 72°C 15 sec • Schmelzkurve 95°C 20 sec • Schmelzkurve 40°C 20 sec • Schmelzkurve auf 85°C in 0,2°C Schritten • Kühlen 40°C 30 sec

62 Material und Methoden

Ermittlung der Nachweisgrenze; (LightCycler ®) Zur Ermittlung der Nachweisgrenze wurde eine Standardreihe der Fa. TIB ® MOLBIOL mit Konzentrationen von 10 1 - 10 6 Kopien verwendet.

3.2.5.2 Sequenzierung von PCR-Produkten Die Sequenzierung diente der Ermittlung der Basensequenz eines PCR-Produktes. Die Sequenzierungsreaktion wurde als so genanntes „Cycle-Sequencing“ unter Verwendung des ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer durchgeführt. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde als Template in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt. Der Ansatz wurde mit spezifischen Primern, HotStarTaq ®DNA Polymerase, dNTP´s und Fluoreszenzfarbstoff-markierten didesoxyNTP´s versetzt. Es wurde wiederholt die Template-DNA denaturiert, der Sequenzierprimer angelagert und dNTP´s eingebaut. Durch den Einsatz von dNTP´s und, entsprechend den vier Basen, mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten didesoxyNTP´s kommt es bei der Synthese nach dem Zufallsprinzip zu Strangabbrüchen. Sobald sich an ein dNTP ein Fluoreszenzfarbstoff-markiertes didesoxyNTP anschließt, wird die Polymerisation gestoppt und das Fragment bleibt in seiner erreichten Größe. Dadurch entstehen Fragmente unterschiedlicher Größen, die jeweils ein an einem Ende mit einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff markiertes Nukleotid tragen (S EARS et al. 1992). Das Reaktionsgemisch der Sequenzierungsreaktion wird ebenfalls aufgereinigt. Anschließend werden die Reaktionsprodukte nach Größe in einer Kapillarsäule aufgetrennt. Die Zuordnung der Basen erfolgt über die Fluoreszenzfarbstoffe, die über einen Laser gescannt werden.

3.2.5.2.1 Aufreinigung der PCR-Produkte Um eine Sequenzierung zur Ermittlung der Basensequenz durchführen zu können, müssen die Amplifikate aufgereinigt werden. Hierfür wird im Anschluss an die PCR das Produkt von Primern, dNTP’s und Salzen getrennt. Die Amplifikationsprodukte wurden mit Hilfe des MinElute PCR Purification Kits aufgereinigt. Dafür wurden 75 µl PBI-Puffer (Binding-Buffer), mit 15 µl des PCR-

63 Material und Methoden

Reaktionsansatzes gemischt, auf die Säule gegeben und für 1 min bei 4.300 x g zentrifugiert. Dabei erfolgte die Adsorption der DNA-Fragmente an die Silica-Gel- Matrix der Säulen. Das Eluat wurde verworfen. Der sich anschließende Waschschritt wurde mit 750 µl PE-Puffer durchgeführt, um Verunreinigungen wie Salze, Enzyme, ungebundene Primer und freie Nukleotide, die nicht an die Silica-Matrix gebunden wurden, zu entfernen. Nach zweimaliger Zentrifugation für jeweils 1 min bei 4.300 x g wurde das Eluat erneut verworfen. Anschließend wurden 10 µl Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf die Säule gegeben und diese dann nochmals bei 4.300 x g für 1 min zentrifugiert. Das aufgereinigte Eluat wurde für die Sequenzierungsreaktion mit 90 µl mol. biol. Wasser verdünnt und die Konzentration der aufgereinigten PCR- Produkte photometrisch bestimmt. Anschließend konnte das Eluat für die DNA- Sequenzierung verwendet werden.

3.2.5.2.2 DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung wurde mit dem Big Dye ® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit durchgeführt. Zusätzlich wurde das Polymer POP-6 (Performance Optimized Polymer) und die „500 bp“ Kapillarsäule (47 cm x 50 µm) benutzt bzw. ausgewählt. Abhängig von der Länge werden je 100 bp 1 ng PCR-Produkt eingesetzt (entspricht hier ca. 2 ng). Es wurden die Primern Bru F und Bruc-5 (Tab. 8) als „Hin-“ bzw. „Rückprimer“ zur Sequenzierung des Amplifikationsproduktes verwendet.

Tab. 8: Sequenzierungsprimer

Bru F („Hinprimer“) 5`- GGC TCG GTT GCC AAT ATC AAT -3` Bruc-5 („Rückprimer“) 5`- CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG -3`

64 Material und Methoden

Die Probe wurde jeweils mit dem Ansatz der Sequenzierungsreaktion mit „Hin-“ bzw. „Rückprimer“ versetzt. Dementsprechend wurden pro Probe zwei Sequenzierungsreaktionen durchgeführt. Die Reagenzien wurden, wie in Tab. 9 aufgeführt, pipettiert:

Tab. 9: Ansatz der Sequenzierungsreaktion

Reagenzien µl/Probe Konzentration Sequencing-Puffer 2 k.A. Premix 4 k.A. Primer 1 (“Hin-“) bzw. 0,5 5 pmol Primer 2 („Rückprimer“) PCR Produkt 100 bp / 1 ng

Mol. biol. H2O ad 20 µl

Ansatz: 6,5 Mix + jeweilige Produktmenge + ad 20 µl H 2O (mol. biol.)

Für die DNA-Sequenzierung galten folgende Amplifikationsbedingungen:

• Aktivierung der Polymerase 96°C 1 min • Denaturierung 96°C 10 sec • Annealing 60°C 5 sec 25 Zyklen • Synthese 60°C 4 min • Kühlung 10°C

Zur Verringerung der Hintergrundfluoreszenz wurden die Ansätze der Sequenzierungsreaktion im Anschluss mit Centri Sep-Säulen aufgereinigt. Dabei handelt es sich um eine Gelfiltration im Säulenformat, bei der die im Überschuss vorhandenen BigDye ® Terminatoren im Gel zurückgehalten werden, während sich die DNA-Fragmente im Durchfluss befinden. Die Säulen wurden jeweils mit 750 µl Wasser mit HPLC-Qualität 30 min vorgequollen. Daraufhin wurde die Flüssigkeit abgelassen und 2 min bei 600 x g

65 Material und Methoden

zentrifugiert. Das Wasser wurde verworfen. Im Anschluss wurden jetzt 20 µl des Reaktionsansatzes zentral auf die Säule aufgegeben und nochmals 2 min bei 600 x g zentrifugiert. 4 µl des Eluats wurden mit 16 µl HPLC-Wasser verdünnt, das Probengefäß mit einem Gummistopfen versehen und anschließend in den ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer eingesetzt und der Sequenzierungslauf gestartet. Die Datenanalyse der zwei Sequenzen aus „Hin-“ und „Rückprimer“ wurde mit Hilfe der Datenbank BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) im Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi ) (Datenstand: 07.05.08) durchgeführt. Zur Charakterisierung bzw. Typisierung wurde die Probe an das FLI, Jena, gesandt.

3.2.6 Statistik

Die beobachteten Anteilswerte der beiden Erregerarten in der untersuchten Hasenpopulation (Prävalenzratio) werden durch Angabe der 95 %- Konfidenzintervalle beschrieben und bewertet. Die Berechnung der Vertrauensgrenzen aus einer dichotomen Grundgesamtheit (positive bzw. negative

Befunde) erfolgte nach SACHS (2002).

66 Ergebnisse

4 Ergebnisse

In der Zeit von August 2006 bis Januar 2008 wurden 930 auf Treibjagden in Niedersachsen erlegte bzw. als Fallwild eingeschickte Hasen beprobt. Von 927 Hasen wurde das Lebergewebe, von drei Hasen das Milzgewebe mittels PCR auf das Vorkommen von F. tularensis und Brucella sp. untersucht. Die Gewebeproben vom Fallwild wurden zusätzlich mikroskopisch und kulturell auf Brucellen untersucht. Des Weiteren wurde das Fallwild pathologisch-anatomisch begutachtet.

4.1 Validierung der PCR

4.1.1 Ermittlung der Nachweisgrenze von F. tularensis

Festlegung der Nachweisgrenze in Bakterienzellsuspension (Blockcycler) Als Nachweisgrenze wurde die Gesamtkeimzahl definiert, die bei der Auswertung der PCR mittels Agarosegelelektrophorese noch eine deutlich sichtbare Bande von 428 bp erzeugte. Vom Typstamm F. tularensis subsp. holarctica (ATCC 29684) wurde ausgehend von Mc-Farland 0,5 eine Verdünnungsreihe mit Konzentrationen von 15 bis 15 x 10 7 Bakterien je ml angefertigt. Nach Extraktion der DNA, Amplifikation des entsprechenden Genomfragmentes mittels PCR und Darstellung in der Agarosegelelektrophorese konnten Amplikons bis zu einer Konzentration von 15 x 10 3 Bakterien/ml in der Ausgangssuspension entsprechend rechnerisch 75 Bakterien pro PCR-Ansatz sicher nachgewiesen werden (Abb. 3).

67 Ergebnisse

Abb. 3: Festlegung der Nachweisgrenze von Francisella tularensis in Zellsuspension 1: 15x10 7 Bakterien / ml 9: negative Extraktion-Kontrolle 17: 15x10 2 Bakterien / ml 2: 15x10 6 Bakterien / ml 10: negative PCR-Kontrolle 18: 15x10 1 Bakterien / ml 3: 15x10 5 Bakterien / ml 11: positive PCR-Kontrolle 19: 15x10 0 Bakterien / ml 4: 15x10 4 Bakterien / ml 12: 15x10 7 Bakterien / ml 20: negative Extraktion- 5: 15x10 3 Bakterien / ml 13: 15x10 6 Bakterien / ml Kontrolle 6: 15x10 2 Bakterien / ml 14: 15x10 5 Bakterien / ml 21: Größenstandard 7: 15x10 1 Bakterien / ml 15: 15x10 4 Bakterien / ml 8: 15x10 0 Bakterien / ml 16: 15x10 3 Bakterien / ml

68 Ergebnisse

Festlegung der Nachweisgrenze in Gewebe (Blockcycler) Nach Extraktion der Nukleinsäuren aus Geweben, welche mit jeweils 20 µl einer Bakteriensuspension in einer Konzentration von 15 bis 15 x 10 7 Bakterien/ml versetzt wurden, konnte nach PCR, Auftrennung im Agarosegel und Färbung bis zu einer Konzentration von 15 x 10 3 Bakterien/ml eine Bande sicher erkannt werden. Dies entspricht einer Konzentration von 300 Bakterien in 20 µl (75 Bakterien/PCR-Ansatz). Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt.

Abb. 4: Festlegung der Nachweisgrenze von Francisella tularensis in Gewebe

1: 15x10 7 Bakterien / ml 9: 15x10 7 Bakterien / ml 17: positive PCR- 2: 15x10 6 Bakterien / ml 10: 15x10 6 Bakterien / ml Kontrolle 3: 15x10 5 Bakterien / ml 11: 15x10 5 Bakterien / ml 18: negative PCR- 4: 15x10 4 Bakterien / ml 12: 15x10 4 Bakterien / ml Kontrolle 5: 15x10 3 Bakterien / ml 13: 15x10 3 Bakterien / ml 19: Größenstandard 6: 15x10 2 Bakterien / ml 14: 15x10 2 Bakterien / ml 7: 15x10 1 Bakterien / ml 15: 15x10 1 Bakterien / ml 8: negative Extraktionskontrolle 16: negative Extaktionskontrolle

In den weiteren Untersuchungen wurde zur Kontrolle der DNA-Extraktion Gewebe verwendet, dem jeweils 20 µl einer Bakteriensuspension mit einer Konzentration von

69 Ergebnisse

15 x 10 4 Bakterien/ml, entsprechend einer Anzahl von 3000 Bakterien, zugesetzt wurden.

Nachweisgrenze der PCR im LightCycler ® Zur Festlegung der Nachweisgrenze im LightCycler ® wurde auf die im Kit enthaltene Standardreihe zurückgegriffen. Hierbei handelte es sich um Konzentrationen von 10 1 bis 10 6 Zielmolekülen. Die Verdünnungsstufen von 10 6 bis 10 2 Zielmolekülen lassen ein Signal in den Zyklen 17, 21, 24, 27 und 30 erkennen. Ein positives Signal konnte bis zu der Konzentration von 10 Zielmolekülen (32. Zyklus) je PCR-Ansatz nachgewiesen werden (Abb. 5).

Abb. 5: Standardreihe zur Ermittlung der Nachweisgrenze von Francisellen im LightCycler ® 6: Std 10*6: 10 6 Zielmoleküle / ml 7: Std 10*5: 10 5 Zielmoleküle / ml 8: Std 10*4: 10 4 Zielmoleküle / ml 9: Std 10*3: 10 3 Zielmoleküle / ml 10: Std 10*2: 10 2 Zielmoleküle / ml 11: Std 10*1: 10 Zielmoleküle / ml 12: neg PCR: negative PCR-Kontrolle

70 Ergebnisse

4.1.2 Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucella sp.

Nachweisgrenze der PCR im LightCycler ® Zur Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucellen im LightCycler ® wurde die im Kit mitgelieferte Standardreihe, die 10 1 bis 10 6 Kopien enthält, verwendet. Die Verdünnungsstufen von 10 6 bis 10 2 Zielmolekülen lassen ein Signal in den Zyklen 17, 21, 24, 28 und 30 erkennen. Eine Reaktion konnte bis zu einer Konzentration von 10 Zielmolekülen nachgewiesen werden (Abb. 6). In dieser Verdünnungsstufe konnte eine Amplifikation ab dem 32. Zyklus festgestellt werden.

Abb. 6: Standardreihe zur Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucellen im LightCycler ®

1: Standard 10E1: 10 Zielmoleküle/ Reaktion 2: Standard 10E2: 10 2 Zielmoleküle/ Reaktion 3: Standard 10E3: 10 3 Zielmoleküle/ Reaktion 4: Standard 10E4: 10 4 Zielmoleküle/ Reaktion 5: Standard 10E5: 10 5 Zielmoleküle/ Reaktion 6: Standard 10E6: 10 6 Zielmoleküle/ Reaktion 7: neg PCR: negative PCR-Kontrolle 8-12: negative Proben 13: neg Aufarb Hasenleber: negative Kontrolle der DNA-Extraktion

71 Ergebnisse

4.2 Nachweis von F. tularensis und Brucella sp. mittels PCR

4.2.1 Nachweis von F. tularensis

Bei insgesamt sieben der 930 Proben konnten F. tularensis -spezifische Genomfragmente sowohl im Blockcycler (Abb. 7) als auch im LightCycler ® nachgewiesen werden. Der Vollständigkeit halber soll hier der Nachweis F. tularensis -spezifischer DNA bei einem Wildkaninchen, welcher bei den Reihenuntersuchungen ebenfalls festgestellt wurde, angegeben werden. Zur Differenzierung der Subspezies und weiteren Charakterisierung wurden die PCR-positiven Proben zum Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, FLI, Jena, und zum Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr nach München gesandt. Bei allen Proben konnte der Nachweis von F. tularensis mittels PCR bestätigt werden. Durch die Subspeziesdifferenzierung mittels 30 bp-Delections-PCR konnte bei drei der sieben Proben F. tularensis subsp. holarctica nachgewiesen werden. Aus zwei Proben konnte im Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in München F. tularensis angezüchtet werden. Zur weiteren Differenzierung des Erregers wurde hier eine Resistenztestung gegenüber dem Antibiotikum Erythromycin durchgeführt

(S PLETTSTOESSER et al. 2005). Eines der beiden F. tularensis -Isolate konnte aufgrund der Resistenz gegenüber Erythromycin dem Biovar 2 zugeordnet werden. Das andere Isolat erwies sich sensibel gegen Erythromycin und ist somit dem Biovar 1 zugehörig. Die übrigen Proben konnten nicht weiter differenziert werden.

72 Ergebnisse

Abb. 7: Nachweis Francisella tularensis -spezifischer DNA-Fragmente im Blockcycler

1: Mol 9358: positive Probe 7: Mol 3336 positive Probe 2: Mol 9359 negative Probe 8: negative Extraktionskontrolle 3: Mol 9497: positive Probe 9: positive Extraktionskontrolle 4: Mol 9498 positive Probe 10: negative PCR-Kontrolle 5: Mol 9499 negative Probe 11: positive PCR-Kontrolle 6: Mol 797 positive Probe 12: Größenstandard

Bei positiv getesteten Organproben wurden die DNA-Extraktionen und die PCR im Blockcycler sowie im LightCycler ® jeweils zweimal wiederholt. Die Reaktionen konnten bestätigt werden (Abb. 8 und Abb. 9).

73 Ergebnisse

Abb. 8: Bestätigungen der Reaktionen im LightCycler®

1-8, 10: Verschiedene Proben, die nach der Amplifikation keine Francisella tularensis -spezifische DNA-Fragmente aufwiesen. 9: (9498): positive Probe (Mol 9498) 11: (9358): positive Probe (Mol 9358) 12: pos PCR: positive PCR-Kontrolle 13: neg Auf: negative Extraktions-Kontrolle 14: neg PCR: negative PCR-Kontrolle

Eine positive Extraktions-Kontrolle wurde bei den Wiederholungen aufgrund der bekannten, positiven Proben nicht mitgeführt.

74 Ergebnisse

Abb. 9: Bestätigungen der Reaktionen im LightCycler®

1: 9360: negative Probe (Mol 9360) 2: 9497: positive Probe (Mol 9497) 3: 9498: positive Probe (Mol 9498) 4: 9499: negative Probe (Mol 9499) 5: posPCR 10*3: positive PCR-Kontrolle (entsprechend 10 3 Bakterien) 6: negPCR: negative PCR-Kontrolle

Graphisch sind die Fundorte in (Abb. 10) dargestellt.

75 Ergebnisse

4.2.1.1 Prävalenzratio Von 930 untersuchten Hasen konnte siebenmal F. tularensis -spezifische DNA nachgewiesen werden. Der 95 %-Vertrauensbereich für die erwartete Prävalenz von 0,75 % liegt zwischen 0,30 % und 1,54 %. Die positiven Befunde traten sowohl in der Gruppe der Fallwildhasen als auch in der Gruppe der erlegten Hasen auf. Beim Fallwild konnte viermal F. tularensis - spezifische DNA nachgewiesen werden. Dreimal gelang dieser Nachweis bei den erlegten Hasen.

Abb. 10: Fundorte mit positiven Tularämie- und Brucellosenachweisen

76 Ergebnisse

4.2.2 Nachweis von Brucella sp.

Es wurden 927 Lebergewebeproben sowie 3 Milzgewebeproben auf Brucellen untersucht. Bei einem Tier konnten mittels der Genus-spezifischen PCR entsprechende Genomfragmente von Brucellen im LightCycler ® nachgewiesen werden (Abb. 11). Es folgte eine zweimalige erneute DNA-Extraktion und PCR- Untersuchung der positiv getesteten Organprobe. Das Ergebnis war reproduzierbar. Bei den Proben der übrigen Tiere verlief die PCR-Untersuchung negativ. Der Fundort der positiven Probe ist in Abb. 10 dargestellt. Die positive PCR-Kontrolle wurde mit einer Konzentration von 10 3 Zielmolekülen in der PCR eingesetzt. Ab dem 28. Zyklus zeigte sich das Signal der positiven PCR- Kontrolle, wohingegen sich das Signal bei der positiven Probe bereits ab dem 23. Zyklus darstellte.

Abb. 11: Nachweis Brucella -spezifischer DNA-Fragmente im LightCycler ®

1-20, 22-30: Die Proben wiesen nach der Amplifikation keine Brucella -spezifischen DNA-Fragmente auf. 21: (1567): positive Probe/Reaktion (TB 633, W 6922/07, Mol 1567) 31: pos PCR 10*3: positive PCR-Kontrolle (entsprechend 10 3 Zielmoleküle) 32: neg PCR: negative PCR-Kontrolle

77 Ergebnisse

4.2.2.1 Prävalenzratio Von 930 untersuchten Hasen konnte ein Nachweis Brucella-spezifischer DNA erbracht werden. Der 95 %-Vertrauensbereich für die erwartete Prävalenz von 0,11 % liegt zwischen 0,003 % und 0,6 %. Der positive Befund trat in der Gruppe der Fallwildhasen auf, d.h. jagdlich erlegte Hasen waren frei von erregerspezifischer DNA. Wird die Prävalenzratio nur für die Gruppe des Fallwildes berechnet, ergibt sich ein Erwartungswert von 0,4 % sowie das 95 %-Konfidenzintervall zwischen 0,01 % und 2,21 %.

78 Ergebnisse

4.3 Sequenzierung von Amplifikationsprodukten

Durch die PCR wurde ein Genomfragment von Brucella sp. im LightCycler ® amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt wurde anschließend sequenziert. Die Sequenzierung bestätigte, dass es sich bei der Nukleotidsequenz um Brucellen- spezifische DNA handelte. Eine weitere Charakterisierung ist mit der Sequenzierung aber nicht möglich. Mittels BLAST-Analyse wurde eine 100 %ige Übereinstimmung des Amplifikates mit identischen Abschnitten im Genom von B. melitensis, B. abortus , B. suis , B. canis , B. ovis nachgewiesen. Die Übereinstimmung in der Basensequenz war über den gesamten Abschnitt lückenlos (gaps 0/224). Der E- Wert, welcher eine Aussage zur Übereinstimmung der Basensequenzen zulässt, liegt bei 6 x 10 -113 . Je kleiner der E-Wert, desto größer sind die Übereinstimmungen in der Basensequenz. Die entsprechenden Basensequenzen von B. suis ATCC 23445 und B. suis 1330 mit einer Größe von 990 bp sind beispielhaft im Anhang aufgelistet (Anhang 9.3).

4.4 Typisierung von Brucella sp.

Die weitere Typisierung der positiven Gewebeprobe wurde im Nationalen Referenzlabor für Brucellose am FLI, Jena, durchgeführt. Weiteres Organmaterial, welches bis dahin bei -80°C gelagert wurde, wurde ebenfalls mitgesendet. Das FLI bestätigte den Nachweis von Brucellen -spezifischer DNA. In der B. abortus -, B. melitensis -, B. ovis -, B. suis -spezifischen PCR (AMOS-PCR) hingegen gelang jedoch kein Nachweis.

79 Ergebnisse

4.5 Bakteriologische Untersuchung zum Nachweis von Brucella sp.

Die 250 Fallwildhasen wurden auch kulturell auf Brucellen untersucht. Als Probenmaterial wurde die Leber ausgewählt. In keiner Probe konnte Brucella sp. kulturell nachgewiesen werden. Mittels Stamp-Färbung wurden ebenfalls keine entsprechend gefärbten Bakterien nachgewiesen. Die in der PCR positive Probe wurde auch im Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, FLI, Jena, mittels kultureller Methoden untersucht. Auch hier konnten keine Brucellen aus der Organprobe isoliert werden.

80 Ergebnisse

4.6 Pathologisch-anatomische Untersuchungen

4.6.1 Hasen mit Nachweis von F. tularensis

F. tularensis -spezifische DNA-Sequenzen wurden sowohl in der Gruppe der Tiere, die verendet oder krank aufgefunden und als Fallwild eingesandt wurden, als auch bei den erlegten Hasen, nachgewiesen. Die pathologisch-anatomischen Befunde der Untersuchung, welche Teil dieser Arbeit waren, sind in Tab. 10 zusammengefasst.

Tab. 10: Pathologisch-anatomische Befunde der F. tularensis -positiv getesteten Tiere

Bezeichnung der Befunde der Pathologie untersuchten Hasen TB 813, W 1468/07, • Ernährungszustand mäßig bis gut Mol, 9358 • Leber dunkelbraun, vereinzelt gelbliche Nekroseherde • Milz hochgradig geschwollen, vereinzelt gelb-graue Nekroseherde • Nieren dunkelbraun-rot • Fibrinös-eitrige Herzbeutelentzündung • Lungengewebe mit flächigen Blutungsherden • Luftröhrenschleimhaut ödematös-blutig, vereinzelt fibrinös-eitrige Beläge • Dünndarminhalt breiig-mukoid mit eitrigen Einlagerungen TB 823, W 1576/07, • Leber hochgradig geschwollen Mol, 9497 • Milz mittelgradig geschwollen, zahlreiche Nekroseherde • Lunge hochgradig marmoriert TB 824, W 1577/07, • Ernährungszustand schlecht Mol, 9498 • Lebergewebe mit zahlreichen eitrigen Nekroseherden • Hochgradige Milzschwellung • Hochgradige eitrige Entzündung des Bauchfells und der serösen Organüberzüge • Mittelgradiger Nachweis von Kokzidien • Dünndarm mit mukoid-eitrigen Einlagerungen

81 Ergebnisse

Bezeichnung der Befunde der Pathologie untersuchten Hasen TB 851, W 1637/07, • Ernährungszustand gut Mol 9476 • Milchdrüse laktierend • Zahlreiche, teils herdförmige, teils konfluierende Nekrosen im Lebergewebe • Milz mittelgradig geschwollen • Hochgradige Hyperämie der Lunge mit ausgeprägtem Ödem • Zahlreiche Lungenwurmlarvenanschnitte • Starker Magenwurmbefall TB 854, W 1651/07, • Dreiläufer, 2,2 kg Mol 9479 • Leber hochgradig blutgefüllt und gestaut • Blutung auf der linken Niere (ca. 5 x 5 mm) • Lungen dunkelrot gefüllt • Hochgradiger Kokzidien-Nachweis, mittelgradiger Magen-Darm- Strongylideneier-Nachweis TB 1108, W 2903/07, • Ernährungszustand gut Mol 3336 • Leber hochgradig geschwollen • Milz hochgradig geschwollen • Gelbe Verfärbung von Unterhautgewebe, Sehnen und Muskelhäuten TB 1253, W 202/08, • Ernährungszustand mäßig Mol, 797 • Zahlreiche eitrige Entzündungsherde in der Leber • Hochgradige Milzschwellung mit zahlreichen Blutungspunkten im Gewebe • Hochgradig perivaskuläre Entzündungsherde und extravasale Blutungen in der Lunge • Hochgradige eitrige Entzündungen und Verklebungen der serösen Organüberzüge • Hochgradige eitrige Verklebung des Brustfells

82 Ergebnisse

Die verschiedenen Befunde der sieben positiv getesteten Hasen geben unterschiedliche Hinweise auf eine Infektion mit F. tularensis . In Kapitel 2.1.4.3 wurden die unterschiedlichen Befunde, wie sie von verschiedenen Autoren im Falle einer Tularämie beobachtet wurden, bereits beschrieben. Demnach wurden bei dem Hasen TB 813 klare Veränderungen gefunden, die somit auf eine Tularämie-Infektion schließen lassen. Die Leber wies vereinzelte Nekroseherde auf, die Milz war hochgradig geschwollen mit ebenfalls einzelnen Nekroseherden. Auch bei dem Hasen TB 823 war die Leber hochgradig geschwollen und die Milz, die mittelgradig geschwollen war wies zahlreiche Nekroseherde auf. Dieses sind eindeutige Anzeichen einer Erkrankung mit Tularämie. Bei dem Hasen TB 824 konnte neben den klassichen Anzeichen der zahlreichen eitrigen Nekroseherde im Lebergewebe und der hochgradigen Milzschwellung eine hochgradige eitrige Entzündung des Bauchfells festgestellt werden. Diese wurde ebenfalls in der Literatur als Hinweis auf eine Tularämie-Infektion beschrieben. Der mittelgradige Nachweis von Kokzidien lässt sich als eine, in der Literatur erläuterte, Sekundärinfektion interpretieren. Diese lässt sich auch bei dem Hasen TB 851 in Form von parasitären Erkrankungen beobachten. Hinzu kommen die zahlreichen, teils herdförmigen, teils konfluierenden Nekrosen im Lebergewebe und eine mittelgradig geschwollene Milz, die auf eine Tularämie-Infektion hinweisen. Die Symptome des Hasens TB 854 lassen bis auf den parasitären Befall nicht unbedingt auf eine Infektion mit Tularämie schließen. Im Gegensatz dazu geben die hochgradig geschwollene Leber und Milz des Hasens TB 1108 klare Hinweise auf eine Tularämie. Auch die Befunde von dem Hasen TB 1253 weisen deutlich auf eine Tularämie hin. Es wurden zahlreiche eitrige Entzündungsherde in der Leber gefunden. Die hochgradig geschwollene Milz wies zahlreiche Blutungspunkte im Gewebe auf, und auch in der Lunge wurden Entzündungsherde gefunden. Die hochgradig eitrigen Veränderungen im Bauch- und Brustraum sind ebenfalls klare Anzeichen einer Tularämie. Der bei dem überwiegenden Teil der Hasen gute bis mäßige Ernährungszustand lässt auf eine akute Infektion mit F. tularensis schließen.

83 Ergebnisse

4.6.2 Hase mit Nachweis von Brucella sp.

Die positiv untersuchte Probe gehörte zu der Gruppe der Fallwildhasen. Das pathologisch-anatomische Untersuchungsergebnis ist in Tab. 11 aufgeführt.

Tab. 11: Pathologisch-anatomisches Untersuchungsergebnis des Brucella sp.-positiv getesteten Tieres

Bezeichnung des Befunde der Pathologie untersuchten Hasen TB 633, W 6922/07, • Ernährungszustand gut Mol 1567 • Zahlreiche, bis haselnussgroße, gelbe, subkutan und subfaszial liegende Umfangsvermehrungen im Bereich von Schultern, Unterbrust und Bauch • Kein sichtbares Fettgewebe (mehr) vorhanden • Zahlreiche, bis stecknadelkopfgroße gelb-graue Herde in der Leber • Inguinallymphknoten hochgradig vergrößert und abszediert • Erbsengroßer Abszess im rechten Ovar • Zahlreiche hirsekorngroße gelb-graue Herde in der Wand des Blinddarmfortsatzes

Das von verschiedenen Autoren dargestellte pathologisch-anatomische Bild der Hasenbrucellose wurde in Kapitel 2.2.4.3 beschrieben. Somit geben die Umfangsvermehrungen im Bereich von Schultern, Unterbrust und Bauch, die gelb- grauen Herde in der Leber, die vergrößert und abszedierten Inguinallymphknoten sowie der Abszess im Ovar einen deutlichen Hinweis auf ein Vorliegen einer Hasenbrucellose.

84 Diskussion

5 Diskussion

In der Auswertung und Diskussion der Ergebnisse werden vorausgehend Art und Umfang der Probennahme sowie die Eignung des Untersuchungsverfahrens bewertet. Ergebnisse der Untersuchung werden mit denen in der Literatur verglichen. Daran schließt sich die epidemiologische Bewertung an. Hierbei werden endemische Herde anderer Bundesländer sowie serologische und bakteriologische Ergebnisse vorhergehender Untersuchungen in die Diskussion mit einbezogen.

Probenvolumen Der Hase stellt für den Jäger ein beliebtes jagdbares Wild dar. Im Rahmen der Hege sowie der Jagd werden das Populationsgeschehen und die -dynamik des Hasen durch den Jäger intensiv beobachtet. Die Hasenbesätze in Niedersachsen haben zwischen 1995 und 2005 deutlich zugenommen. In 2006 ist gegenüber dem Vorjahr ein leichter Rückgang zu verzeichnen. Niedersachsen beteiligte sich im Jagdjahr 2005/2006 mit 122.907 Hasen zu 23,7 % an der Gesamtstrecke der Bundesrepublik von insgesamt 519.565 Hasen. Im Jagdjahr 2006/2007 wurden bundesweit 465.163 Hasen erlegt. In Niedersachsen kamen davon 111.754 Hasen zur Strecke. Dieses stellt einen Anteil von 24 % an der Gesamtstrecke dar (S TRAUß 2007, DJV 2008). Von den insgesamt 930 Hasenprobanden stammten die 680 auf Treibjagden erlegten Hasen aus Gebieten Niedersachsens mit vergleichsweise hohen Dichten (siehe Abb. 2). Die verbleibenden 250 tot oder moribund aufgefundenen Fallwildhasen wurden überwiegend ebenfalls aus hasenreichen Regionen eingesandt. In Gebieten mit einer hohen Populationsdichte (> 25 Hasen/100 ha) verbreiten sich Erreger typischerweise sehr schnell. Aber auch in kleinen Hasenpopulationen mit einer geringeren Dichte (< 10 Hasen/100 ha) kommt es zur Ausbreitung der Erreger unter den Hasen. Ein positiv auf F. tularensis getesteter Hase stammte aus dem hasenärmeren Landkreis Holzminden, die restlichen sechs positiv getesteten Hasen wurden aus

85 Diskussion

hasenreicheren Regionen eingesandt. Hierbei handelt es sich um die Landkreise Region Hannover, Vechta, Northeim und Wittmund. Der Nachweis von Brucella sp. gelang bei einem Hasen aus dem Landkreis Wilhelmshaven. Diese Region ist durch eine mittlere Populationsdichte (10 - 25 Hasen/100 ha) gekennzeichnet.

Selektivität der Probennahme Erlegte Hasen contra Fallwild Es ist zu hinterfragen, ob Organuntersuchungen von auf Treibjagden als äußerlich gesund erlegten Hasen Aussagen zum Krankheitsgeschehen der Tularämie und Brucellose vermitteln können. Diese Frage ist zu bejahen, da mit den hier angewandten molekularbiologischen Methoden die Infektion mit beiden Erregern auch in der klinisch symptomlosen Inkubationszeit oder bei subklinischem Verlauf nachweisbar ist. Dies gilt im Besonderen für den Nachweis der Brucellose, bei der

über einen längeren Zeitraum die Erkrankung symptomlos verläuft (C HRISTIANSEN &

THOMSEN 1956, K ERSCHAGL 1965, K ÖTSCHE & G OTTSCHALK 1990). Da in dieser Zeit der Erreger vom infizierten Tier verbreitet wird (BOUVIER et al. 1954), kann eine Hasenpopulation verseucht sein, ohne dass die Erkrankung am Tier oder an seinem Verhalten erkannt wird. Bei den erlegten Hasen wurde dreimal ein positives Ergebnis im Rahmen der Tularämieuntersuchungen erzielt. Auch bei älteren, schon autolytischen Fallwildproben kann mit dieser Untersuchungsmethode ein DNA-Nachweis erbracht werden. Dieses gelang viermal im Rahmen der Tularämieuntersuchungen und einmal bei den Brucelloseuntersuchungen. Demnach sind die Probanden aus beiden Gruppen für diese Untersuchungen von Bedeutung.

Sachgerechte Behandlung des Probenmaterials Die gekühlte, sachgemäße Lagerung der frisch entnommenen Organproben nach der Jagd, auf dem Transport und im Veterinärinstitut bis zur weiteren Behandlung war gegeben. Insbesondere für die Kultivierung der Erreger ist die zeitnahe Verarbeitung der Proben wichtig. Im Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in

86 Diskussion

München konnte durch kulturelle Anzüchtung das Bakterium F. tularensis zweimal bestätigt werden. Bei den eigenen Untersuchungen war die Kultivierung der Brucellen nicht möglich. Die DNA von F. tularensis bzw. B. suis konnte dagegen in sieben bzw. einem Fall nachgewiesen werden. Da die Hasen in der kalten Jahreszeit zur Untersuchung gelangten, ist zu vermuten, dass es nicht zu einer Beeinträchtigung des Erregers bzw. der Denaturierung der DNA gekommen sein kann. Im Umkehrschluss liegt hier die Vermutung nahe, dass die Proben, die in der wärmeren Jahreszeit zur Untersuchung gelangten, evtl. Schaden genommen haben könnten.

Eignung der Untersuchungsmethode Die hier verwendeten PCR-Methoden sind als adäquate und geeignete Untersuchungsverfahren anzusehen. Im Allgemeinen liegen die Vorteile gegenüber den bakteriologisch-kulturellen Untersuchungsmethoden in der hohen Sensitivität. Ein weiterer Vorteil der PCR ist es, dass sowohl abgetötete Bakterien als auch lebende, aber nicht kultivierbare Bakterien nachgewiesen werden können. Letztere können zwar nicht kulturell isoliert werden, aber dennoch im Wirtsorganismus vermehrungsfähig sein. Zudem ermöglicht diese Untersuchungsmethode insbesondere bei hoch virulenten Zoonoseerregern einen Nachweis ohne eine künstliche Vermehrung des Pathogens und birgt so ein geringeres Risiko einer Laborinfektion. Die Nachweisgrenze von F. tularensis in Bakterienzellsuspension und somit die analytische Sensitivität der konventionellen PCR lag bei 15 x 10 3 Bakterien/ml entsprechend rechnerisch 75 Bakterien pro PCR-Ansatz. In Gewebe (diagnostische Sensitivität) lag die Nachweisgrenze ebenfalls bei 15 x 10 3 Bakterien/ml (75 Bakterien/PCR-Ansatz). Dieses liegt annährend im Rahmen dessen, was auch von anderen Autoren als Nachweisgrenzen bei Untersuchungen mittels PCR auf

F. tularensis angegeben wurde. LONG et al. (1993) erreichten eine Nachweisgrenze von 10³ Kolonie-bildenden Einheiten (KBE)/ml dotiertem Blut. Auch JUNHUI et al. (1996) gaben als Nachweisgrenze ihres PCR-Systems 10³ KBE/ml verdünnter Reinkultur an. Mit einer Standard-PCR unter Verwendung von verdünnten

87 Diskussion

4 Reinkulturen wiesen FULOP et al. (1996) 5 x 10 KBE/ml nach. In klinischen Proben wurden je nach verwendeter Extraktionsmethode 3 x 10 3 bzw. 5 x 10 2 KBE/Reaktion nachgewiesen. Die Autoren LONG et al. (1993), JUNHUI et al. (1996) und FULOP et al. (1996) haben die Nachweisgrenzen durch Bestimmung der Lebendkeimzahl festgelegt. Die Anzahl der Bakterien, die durch Lebendkeimzahlbestimmung der in der Kultur vermehrungsfähigen Bakterien ermittelt werden, ist jedoch geringer, als die Anzahl der tatsächlich vorhandenen Bakterien, die durch die Bestimmung der Gesamtkeimzahl ermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde im Gegensatz zu den Untersuchungen von LONG et al. (1993), JUNHUI et al. (1996) und FULOP et al. (1996) die Gesamtkeimzahl bestimmt. Vor diesem Hintergrund kann die Nachweisgrenze von F. tularensis in dieser Arbeit im Vergleich zu den oben angeführten Untersuchungen als durchaus ausreichend angesehen werden. Alle Gewebeproben wurden mit Hilfe der PCR auf F. tularensis und Brucella sp. untersucht. Bei sieben Tieren konnten F. tularensis -spezifische Genomfragmente nachgewiesen werden. Bei einem Tier war der Nachweis von Brucella -spezifischen Genomfragmenten möglich. Diese Untersuchungsergebnisse konnten vom Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, FLI, Jena, und dem Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in München bestätigt werden. Des Weiteren wurden die Fallwildproben mittels kultureller Methoden auf Brucellen untersucht. Hierdurch waren jedoch keine Brucellen nachweisbar. Es ist also anzunehmen, dass das die Bakterien bereits nicht mehr vermehrungsfähig waren und daher nicht mehr angezüchtet werden konnten. Wenn auch ein Einzelfall könnte dies ein Hinweis darauf sein, dass die PCR der kulturellen Untersuchungsmethode hier überlegen ist. Frühere Untersuchungen, die vor Etablierung der PCR in den 1990er Jahren durchgeführt wurden, sind in Kenntnis der Limitierungen serologischer und bakteriologischer Untersuchungsverfahren zu hinterfragen. WAGATHA (1989) konnte bei 279 Blutproben von Feldhasen, die serologisch untersucht wurden, keine Brucellen-Antikörper nachweisen. Hier stellt sich die Frage, ob tatsächlich keine Infektionen mit Brucellen vorgelegen hatten oder ob lediglich das Nachweisverfahren nicht sensitiv genug war. Zudem sind Antikörper erst zwei Wochen post infectionem nachzuweisen (A NONYMUS 2005). Die vorliegende Arbeit bietet diesbezüglich einen

88 Diskussion

Erkenntnisgewinn. Da WAGATHA (1989) keine Brucellen nachweisen konnte und bei den Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit nur ein Brucellose-Fall aufgezeigt werden konnte, besteht die Möglichkeit, dass die Brucellose beim Feldhasen weniger verbreitet ist als angenommen. Da die Brucellen in der Kultur phänotypisch nicht weiter differenziert werden können

(A NONYMUS 2007a), kann immer nur eine Aussage über das Vorkommen von Brucella sp. getroffen werden. Zum Nachweis des beim Hasen vorkommenden Biovar B. suis Biovar 2 wurde zunächst eine genusspezifische PCR, welche den Nachweis Brucella sp. erbringen konnte, durchgeführt. Weiterführende Untersuchungen mit einer speziesspezifischen PCR, der so genannten AMOS-PCR (B. abortus -, B. melitensis -, B. ovis -, B. suis -spezifische PCR) wurden im Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, FLI, Jena, durchgeführt (A NONYMUS 2005). Die AMOS-PCR erkennt B. abortus , B. melitensis , B. ovis und B. suis Biovar 1.

B. suis Biovar 2 kann hingegen nicht erkannt werden (B RICKER & H ALLING 1994). Da bei der in der genusspezifischen PCR positiven Probe der Nachweis von B. abortus , B. melitensis , B. ovis und B. suis Biovar 1 nicht erbracht werden konnte, handelt es sich in diesem Fall um eine Ausschlussdiagnose und demnach wahrscheinlich um B. suis Biovar 2. Ein weiterer Vorteil der PCR ist das zeitnahe Vorliegen der Ergebnisse gegenüber dem zeitaufwendigen kulturellen Nachweis (A L DAHOUK et al. 2003). Die Kultivierung von Brucellen erfordert 3 bis 5 Tage. Die PCR hingegen liefert schon nach 4 bis 5 Stunden zuverlässige Ergebnisse. Negativ zu werten sind die vergleichsweise hohen Laborkosten. Zusammenfassend ist herauszustellen, dass die PCR eine sowohl hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität als auch des benötigten Zeitaufwandes, der leichten Durchführbarkeit und dem geringeren Infektionsrisiko im Labor ein adäquates und zuverlässiges Untersuchungsverfahren von auch schon autolytischen

Gewebeproben darstellt (A L DAHOUK et al. 2003).

89 Diskussion

Sequenzierung/ Typisierung Die für die Sequenzierung verwendeten Primer erkennen einen DNA-Abschnitt auf dem Genom mit der Größe von 224 bp. Derselbe DNA-Abschnitt ist bei B. melitensis, B. abortus , B. suis , B. canis und B. ovis vorhanden. Eine Differenzierung zwischen diesen Spezies ist in der Sequenzierung aber nicht möglich. Bei der Typisierung mittels der genusspezifischen PCR konnten entsprechende Sequenzen ebenfalls am FLI, Jena, nachgewiesen werden. In der erwähnten AMOS- PCR, welche verschiedene Spezies von Brucella ( B. abortus , B. melitensis , B. ovis und B. suis Biovar 1) erkennt, gelang jedoch kein Brucella-Nachweis. Die AMOS- PCR kann aber B. suis Biovar 2 nicht erkennen. Somit liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei der nachgewiesenen DNA um B. suis Biovar 2 spezifische DNA handeln könnte. Es kann weder bei der Sequenzierung noch bei der Typisierung eine eindeutige Aussage über die Spezies der Brucellose gemacht werden. Hier handelt es sich im Fall der Typisierung um eine Ausschlussdiagnostik.

Pathologisch-anatomische Befunde der Tularämie Diverse Autoren berichten von einer auffälligen Milzschwellung bei an Tularämie erkrankten Hasen (B ELL & R EILLY 1981, K ONRAD 1986, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988,

HOFER 1997, S TEINECK 2000). Neben den Milzschwellungen wurden weitere Organschwellungen, wie z.B. die der Leber und der Lymphknoten, bei den zur Untersuchung gelangten Probanden dokumentiert. Einige Autoren beschreiben zu der Schwellung der Organe eitrige Einschmelzungen u.a. in Milz, Leber, Niere,

Lunge, Knochenmark und Lymphknoten, (B ELL & R EILLY 1981, B OCH &

SCHNEIDAWIND 1988, H OFER 1997, S TEINECK 2000, V. KEYSERLINGK 2006). Bestätigt werden konnten diese Auffälligkeiten in Milz und Leber. Der von BOCH &

SCHNEIDAWIND (1988) beschriebene Befund einer mitunter vorkommenden, hämorrhagischen Enteritis traf hier bei einem positiv befundeten Probanden zu. Des

Weiteren traten, wie beispielsweise schon von KERSCHAGL (1965) beschrieben, neben F. tularensis Organinfektionen mit anderen Bakterien auf. Es wurde auch aus den veränderten Organen ein hochgradiger Keimgehalt an Escherichia coli ,

90 Diskussion

Enterobacter sp. sowie Yersinia sp. nachgewiesen (mündliche Mitteilung: (B RAUNE 2008). Vermutlich handelt es sich um Sekundärinfektionen, was im Zusammenhang mit der Manifestation einer Tularämie auf eine deutliche Schwächung des Immunsystems schließen lässt. Es könnte sich aber auch um unspezifische Kontaminationen handeln, die wiederum nicht auf andere Krankheiten schließen lassen. BOCH & S CHNEIDAWIND (1988) berichteten von einer starken Abmagerung der Hasen bei einem chronischen Verlauf der Tularämie, welche hier nur bedingt bestätigt werden konnte. Diese Tatsache lässt darauf schließen, dass es sich bei den hier begutachteten Hasen um akute Infektionen der Tularämie mit rascher Todesfolge gehandelt haben mag.

Pathologisch-anatomische Befunde der Brucellose Art und Lokalisation der pathologisch-anatomischen Veränderungen der Brucellose stimmen weitgehend mit den in der Literatur beschriebenen Befunden überein (W ITTE

1941, F ENSKE 1963, V ALENTINCIC 1964, W EIDENMÜLLER & B ECK 1970, H ELLMANN

1982, B OCH & S CHNEIDAWIND 1988, D AMOSER & H OFER 1995, S ELBITZ 2007). Als charakteristisches Bild der Brucellose sind die multiplen bis haselnussgroßen, mit

Eiter gefüllten Knötchen zu werten. HELLMANN (1982) und SELBITZ (2007) beschrieben neben der hier in der Subkutis vorliegenden Knotenbildung auch ein solches Vorkommen in der Muskulatur. WITTE (1941) berichtete von zahlreichen Knötchen äußerlich an Sternum und Brustwand, wie sie auch hier diagnostiziert wurden. Die hier gefundenen, multipel vorkommenden Nekroseherde in der Leber werden in der Literatur ebenfalls genannt (D AMOSER & H OFER 1995). Nach BOCH &

SCHNEIDAWIND (1988) sind die Geschlechtsorgane am häufigsten verändert. Ovarialabszesse, wie am rechten Ovar nachgewiesen, werden in der vorliegenden

Literatur nicht erwähnt. Die von FENSKE (1963) und VALENTINCIC (1964) beschriebenen Abszessbildungen in der Uterusschleimhaut und -wand scheinen häufiger als Ovarialabszesse zu sein. Entzündungen wie sie DAMOSER & H OFER (1995) in Darmbein-, Kniekehl- und Mandibularlymphknoten diagnostizierten, konnten nicht beobachtet werden. Dagegen waren die Inguinallymphknoten hochgradig vergrößert und abszediert.

91 Diskussion

Die nachgewiesenen Nekroseherde im Darm decken sich mit den Befunden von

BENDTSEN (1956). Die hier ebenfalls vorliegende Pseudotuberkulose könnte die

Ansicht von WEIDENMÜLLER & B ECK (1970) bestätigen, die eine vorausgehende Schwächung des Immunsystems für die Manifestation einer Brucellose für notwendig erachten. Welche Infektion in diesem Fall als primäre anzusehen ist, kann nicht geklärt werden. Auffällig ist, dass trotz der eindrucksvollen Organveränderungen, das Tier einen guten Ernährungszustand aufwies, welches durch die Aussage von

CHRISTIANSEN & T HOMSEN (1956) bestätigt wird.

SELBITZ (2007) geht von einer Resistenz adoleszenter Hasen gegenüber der Brucellose aus, die in vielen Fällen bis zum Eintritt der Geschlechtsreife eine klinische Manifestation verhindert. Bei dem hier betroffenen Tier handelte es sich um eine adulte Häsin, bei der aufgrund ihres Alters eine Infektion erwartet werden konnte.

Jahreszeitliches Auftreten der Tularämie-Erkrankungen Von den in die vorliegende Untersuchung eingegangenen tot oder moribund aufgefundenen 250 Fallwildhasen wurden während der Herbst- und Winterjagdzeit 170 Hasen zur Abklärung der Todesursache eingesandt. Die verbleibenden 80 Tiere gelangten außerhalb der Hauptjagdzeit zur Untersuchung. Hier führt sicherlich die während der Hasenjagdsaison (01.10. - 15.01.) verstärkte Revierbegehung zu einem vermehrten Auffinden verendeter Tiere. Fünf der sieben positiv getesteten Hasen gelangten innerhalb der Jagdzeit und damit in den Wintermonaten zur Untersuchung. Zwei dieser Probanden sind dem Fallwild zuzuordnen, drei Hasen gehören zu der Gruppe der erlegten Hasen. Die übrigen zwei Hasen sind außerhalb der Jagdsaison als Fallwild eingesandt worden.

Die fünf Probanden bestätigen die Aussage von HÖFLECHNER -PÖLTL (1999), die von einem deutlichen Schwerpunkt des Tularämie-Vorkommens im Spätherbst und Winter ausgeht. Nach einer Massenvermehrung infizierter Feldmäuse in dieser Zeit erfolgt anschließend eine Übertragung der Infektion auf den Feldhasen.

BOSSI et al. (2004) hingegen beschreiben eine jahreszeitliche Abhängigkeit der Tularämie-Infektionen in den Sommermonaten Juni bis September durch

92 Diskussion

blutsaugende Insekten. Von den 80 Fallwild-Hasen, die außerhalb der Jagdsaison zu

Untersuchung gelangten, fallen nur die Hälfte auf den von BOSSI et al. (2004) angegebenen Zeitraum. Somit kann die Aussage des Autors nur bedingt bestätigt werden, da nur ein tularämie-positives Tier Ende September zur Untersuchung gelangte. Ob ein Zusammenhang zwischen der Übertragung durch blutsaugende Insekten und der Massenvermehrung der Mäuse in der sich anschließenden Jahreszeit besteht, ist nicht zu klären und unwahrscheinlich. Es könnte aber durchaus zu einer Übertragung des Erregers durch die Arthropoden auf die Feldmäuse kommen mit einer anschließenden extrem raschen Verbreitung in der Mäusepopulation. Danach kann der Krankheitserreger unschwer durch Arthropoden von den Mäusen auf Hasen übertragen werden.

Herkunft der B. suis -Infektion Unter den Probanden wurde ein positiver Fall von Hasenbrucellose aus dem Landkreis Wilhelmshaven nachgewiesen. Da es in der Gegend um Wilhelmshaven kein Wildschweinvorkommen gibt und auch die Nutztierbestände frei von Brucellose sind (W EBER 2004, A NONYMUS 2007a), könnte diese Infektion auf ein selbständiges Infektionsgeschehen in den Hasenbesätzen hinweisen. Dies unterstreicht die Aussage, dass die Brucellose ein selbständiges, in der Regel enzootisches Infektionsgeschehen mit jahrelanger Erregerpersistenz in den Hasenpopulationen unterhalten kann (C HRISTIANSEN & T HOMSEN 1956, E NGLERT et al. 1964, H ELLMANN 1982). Hasen gelten neben anderen Wildtieren als Naturreservoir für B. suis . Der hier erhobene Befund wird durch Aussagen verschiedener Autoren über die Eigenständigkeit der Hasenbrucellose in einigen Regionen Deutschlands bestätigt

(B ENDTSEN et al. 1954, F RITZSCHE 1963, E NGLERT et al. 1964, S CHEIBNER 1974,

KONRAD 1986). KLÄHN (1962) hingegen vermutet Zusammenhänge zwischen Hasen- und Rinderbrucellose. BENDTSEN et al. (1956) gehen von einer Interaktion der Brucellose zwischen Hase und Haus- bzw. Wildschwein und umgekehrt aus. Dieses können die Autoren mit erfolgreichen wechselseitigen Infektionsversuchen belegen.

93 Diskussion

Bestand früher eher die Tendenz der Ansteckung der stark verseuchten Nutztierbestände in Richtung Wild, so hat sich diese Situation scheinbar umgekehrt. Heute scheint der Infektionsdruck vom Wild auf die Nutztiere auszugehen. Letztere sind durch langjährige, gezielte seuchenmedizinische Maßnahmen seit 1999

Brucellose-frei (A NONYMUS 2007a). Zum Schutz der empfänglichen landwirtschaftlichen Nutztiere ist ein Infektionsmonitoring bei Hase und Wildschwein als wertvolle seuchenprophylaktische Maßnahme zu werten.

Eigene Ergebnisse vor dem Hintergrund der epidemiologischen Situation der Tularämie in Deutschland Die Literatur berichtet von Tularämie-Infektionen beim Menschen in den vergangenen zehn Jahren in Deutschland ganz überwiegend über Nachweise in Teilen von Baden-Württemberg und Hessen. Die weitere Verteilung in Deutschland beläuft sich auf ein bis drei Erkrankungen in den restlichen Bundesländern (K ÄSSLER et al. 2000, H IRSCH et al. 2001, A NONYMUS 2002b, A LPERS et al. 2003, H OFSTETTER et al. 2005, J ANSEN et al. 2005, G RUNOW & P RIEBE 2007, S CHÄTZLE & S CHWENK 2008,

SPLETTSTÖßER & K OPF 2008, S URV STAT @RKI 2008a). Zum Infektionsgeschehen der Tuläramie in Niedersachsen lagen bisher keine Daten vor. Im Rahmen der Untersuchungen zu dieser Arbeit konnte in sieben Fällen der Nachweis F. tularensis - spezifischer DNA erbracht werden. Für die Prävalenz ergibt sich daraus die

Obergrenze des Vertrauensbereiches von 1,54 % (S ACHS 2002). Dieser Wert ist im Hinblick auf ein Infektionsrisiko für den Menschen als äußerst gering einzustufen. Werden zudem Hygiene- bzw. Schutzmaßnahmen ergriffen und jedes erlegte Tier einer kritischen und gewissenhaften Begutachtung auf sinnfällige Veränderungen der Organe unterzogen, muss von einem minimalen Infektionsrisiko ausgegangen werden. Personen, die Kontakt zu tot aufgefundenen Hasen haben, haben ebenfalls die geltenden Hygienemaßnahmen beim Einsammeln der Kadaver einzuhalten. Es existieren auch in Niedersachsen vereinzelte Tularämie-Endemiegebiete beim

Feldhasen. Bekanntlich verlaufen die Tularämie-Infektionen undulierend (L EMBKE 1969). Das Auftreten der Tularämie in typischen, mehrjährigen Abständen korreliert in der Regel positiv mit Massenvermehrungen bei Feldmäusen nach

94 Diskussion

Trockenperioden (H ÖFLECHNER -PÖLTL 1999). Diese Massenvermehrungen sind Voraussetzungen für Epizootien bei Mäusen und Feldhasen, aus denen sich in der

Folge auch Krankheitsfälle beim Menschen ableiten (H OFER 1997). Hieraus erwächst für den Menschen in diesen Gebieten ein Infektionsrisiko, wie ein Tularämie-Fall beim Menschen in Wittmund deutlich machte (mündliche Mitteilung: (K ÖHLER 2008). Die meisten Erkrankungen von Tularämie beim Menschen lassen sich auf den Kontakt mit infizierten Feldhasen zurückführen. Der Feldhase wiederum infiziert sich u.a. über die Nagetierpopulation sowie durch Ektoparasiten (H UBALEK et al. 1998,

GURYCOVA et al. 2001, E LLIS et al. 2002). Zwei der sieben Probanden dieser Arbeit, bei denen F. tularensis -spezifische DNA nachgewiesen wurde, stammten aus dem südlichsten Niedersachsen, den Landkreisen Einbeck bzw. Northeim. Es handelt sich um Spekulation, wenn man einen Zusammenhang zwischen den 2004 aufgetretenen

Infektionen von Affen im nahegelegenen Göttinger Primatenzentrum vermutet (M ÄTZ -

RENSING et al. 2007, S PLETTSTÖßER et al. 2007). Die Affen, die in einem halboffenem Gehege untergebracht sind, sollen allerdings Kontakt mit der ebenfalls mit Tularämie befallenen örtlichen Nagetierpopulation gehabt haben. Der Fund F. tularensis -spezifischer DNA bei einem Wildkaninchen, welcher der Vollständigkeit halber erwähnt wurde, bestätigt, dass die Population weiterer

Lagomorphen ebenfalls mit F. tularensis infiziert sein kann (S TEINECK 1994). In drei Fällen konnte das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr

F. tularensis subsp. holarctica bestätigen. Dadurch wird die Aussage von MÖRNER

(1993) und GRUNOW (2001), dass F. tularensis subsp. holarctica in Europa vorherrscht, weiter gestärkt.

Brucellose-Vorkommen auf kleine Endemiegebiete beschränkt In der Literatur wird die epidemiologische Situation der Hasenbrucellose in

Deutschland vor allem aus Teilen von Rheinland-Pfalz, Rheinhessen (F RITZSCHE

1956, 1959), Mecklenburg (K LÄHN 1962, F ENSKE 1963, D EDEK et al. 1990a, D EDEK et al. 1990b), Brandenburg (F ENSKE 1963, F ENSKE & P ULST 1973), Bayern

(W EIDENMÜLLER 1971, S CHELLNER 1982) und des Schwarzwaldes (E NGLERT et al. 1964) dargestellt. Aus Niedersachsen lagen bisher keine Untersuchungen zum

95 Diskussion

Infektionsgeschehen der Hasenbrucellose vor. Das Ergebnis dieser Arbeit dokumentiert für die Prävalenz eine Obergrenze des Vertrauensbereiches von

Brucella suis Biovar 2 von 0,6 % (S ACHS 2002) bei 930 untersuchten Hasen. Die Brucella -spezifische DNA wurde bei einem Stück Fallwild nachgewiesen. Legt man ausschließlich die 250 Fallwildhasen der statistischen Berechnung zugrunde, so erhält man eine Obergrenze des Vertrauensbereiches von 2,21 %. Dieser Wert ist als sehr gering einzustufen. Personen, die Kontakt zu tot aufgefundenen Fallwildhasen haben, sind mit einem erhöhten Infektionsrisiko behaftet, insbesondere, wenn keine Hygiene- bzw Schutzmaßnahmen beim Einsammeln der Kadaver eingehalten werden. Aufgrund dieses positiven Untersuchungsergebnisses könnte möglicherweise in Niedersachsen ebenfalls ein einzelnes Endemiegebiet der Brucellose aufgezeigt werden. Derartige kleine und isolierte Gebiete werden in der Literatur von FRITZSCHE

(1956), KLÄHN (1962), WEIDENMÜLLER (1971), SCHELLNER (1982) und DEDEK (1990a) beschrieben. Dieses Ergebnis bestätigt die Vermutung der Autoren, dass von der Hasenbrucellose offensichtlich immer nur relativ kleine, begrenzte Gebiete einer

Region betroffen sind (F ENSKE & P ULST 1973, W AGATHA 1989). Die Aussagen korrelieren mit den Ergebnissen der Untersuchungen von ANDERSEN (1951) zitiert in

(B ENDTSEN et al. 1956) zur Standorttreue der Hasen. FENSKE (1963) fand übereinstimmend dazu heraus, dass die Lebensräume, in denen infizierte Hasen nachgewiesen wurden, Flächengrößen von 100 - 200 ha nicht überschritten. Wenngleich bei der Brucellose nur ein einmaliger Erregernachweis gelang, so ist es aufgrund der Territorialität der Hasen und die sich daraus ergebende bekannte räumliche Begrenzung der Brucellose-Endemieherde in Hasenpopulationen nicht auszuschließen, dass weitere Endemiegebiete existieren. Weitere Flächenuntersuchungen auf den Erreger sollten in sinnvollen Zeitabständen folgen.

96 Diskussion

Schlussbemerkung Die epidemiologischen Beobachtungen und die klinischen Erkrankungsfälle beim Menschen belegen, dass die Tularämie in der Hasenpopulation in Deutschland etabliert ist. Sicherlich gestatten die durchgeführten Untersuchungen, wie auch die anderer Autoren, nur einen zeit- und raummäßig begrenzten Einblick in den Hasenbestand und erfassen nicht alle möglicherweise vorhandenen Endemiegebiete. Die Brucellose wird bei landwirtschaftlichen Nutztieren regelmäßig tierärztlich überwacht. Die Zahl der Neuinfektionen bei Haus- und Nutztieren ist bekannt. Dies ist bei freilebendem Wild nicht der Fall. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollten einen Beitrag zur Überschaubarkeit einer für Mensch und Tier ansteckenden Krankheit geben. Darüber hinaus belegen die Ergebnisse, dass gezielte molekularbiologische Untersuchungen auch beim Feldhasen geeignet sind, die Bestände epizootiologisch zu überwachen und Risiken für Wild- und Haustiere sowie für den Menschen aufzudecken. Aus den genannten Ergebnissen lässt sich ableiten, dass für den Menschen nur ein geringes Infektionsrisiko besteht. Dieses kann zudem durch die Einhaltung entsprechender Vorsichtsmaßnahmen und fleischhygienischer Grundsätze, bspw. dem Durchgaren des Wildbrets, weiter reduziert werden. Es ist aber zu erkennen, dass nicht nur von den als Fallwild gefundenen und als krank erlegten Hasen offensichtlich eine Gefahr ausgeht. Auch die gesunden Hasen können mit dem Erreger infiziert sein. Somit wird die Tularämie für den Menschen noch weniger greifbar und noch gefährlicher. Noch in diesem Jahr sollen weitere Untersuchungen zur Infektionssituation mit Tularämie und Brucellose die verbliebenen geographischen Untersuchungslücken in Niedersachsen reduzieren. Hierbei werden sowohl erlegte Hasen als auch Fallwild zur Untersuchung gelangen.

97 Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Martina Wedekind Zum Vorkommen von Tularämie und Brucellose beim Feldhasen in Niedersachsen

Die Zoonosen Tularämie und Brucellose wurden in Deutschland in den letzten Jahren wiederholt beim Menschen nachgewiesen. Dabei zeichnet sich bei der Tularämie ein leichter Anstieg der jährlich gemeldeten Fälle seit 2005 ab. Da der Hase eines der Hauptreservoirtiere für beide Erreger darstellt, wurde in der vorliegenden Arbeit das Vorkommen der Erreger in den Feldhasenbesätzen in Niedersachsen untersucht. Aus diesem Bundesland liegen hierzu noch keine epidemiologisch basierten Daten vor. In die Untersuchungen wurden 930 Feldhasen einbezogen. Die den Lebern entnommenen Gewebsproben (in drei Fällen ersatzweise Milzgewebsproben) wurden mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorkommen der Nukleinsäure der beiden Krankheitserreger Francisella tularensis und Brucella spp. untersucht. Bei sieben Hasen wurde F. tularensis -spezifische DNA, in nur einem Fall Brucella spp.-spezifische DNA nachgewiesen. Alle vom Fallwild entnommenen Proben wurden zudem kulturell-mikrobiologisch auf Brucellen untersucht. Allerdings konnte der Nachweis von Brucella spp. mittels PCR kulturell nicht bestätigt werden. Schlussfolgernd ist festzuhalten, dass in Niedersachsen lokale Endemiegebiete der Tularämie beim Feldhasen existieren. Die lokale Begrenztheit erklärt sich aus der Territorialität der Hasen. Aus diesem Grund sind wegen der Humanpathogenität für beide Erreger Flächenuntersuchungen in Niedersachsen in sinnvollen Zeitabständen angezeigt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sowie daraus resultierende seuchenhygienisch prophylaktisch sinnvolle Maßnahmen sind den Jägern der betroffenen Regionen zu deren Schutz mitzuteilen.

98 Summary

7 Summary

Martina Wedekind Occurrence of Tularaemia and Brucellosis in the European Brown Hare in Lower Saxony, Germany

The zoonoses tularaemia and brucellosis has repeatedly been diagnosed in humans in Germany during the last years. In the case of tularaemia a slight increase in the annually reported cases has emerged since the year 2005. Since the hare represents one of the main reservoir of both diseases, the objective of this work was to investigate the occurrence of the aetiological pathogens Francisella tularensis and Brucella spp. among the European brown hare population in the German federal state Lower Saxony , as epidemiologically-based data are yet not available. In total 930 European brown hares were examined. The tissue samples taken from the liver (in three cases substituted tissue samples taken from the spleen) were investigated for DNA of both pathogens with the polymerase chain reaction (PCR). In the samples of seven hares F. tularensis specific DNA, in only one case Brucella specific DNA was detected. All samples taken from animals which died without human influence were additionally investigated for Brucella spp. using microbiological culture methods. However, the detection of Brucella spp. in one sample by PCR could not be confirmed by cultural examination. As a result of this investigation it can be concluded that in Lower Saxony local endemic areas of tularaemia exist in the European brown hare population. This could be explained by the loyality of hares to their habitat. For this reason and particularly with regard to the zoonotic potential, further investigations of these specific regions should be indicated at reasonable intervals. The hunters of the affected regions should, for their own protection, be informed of the results of these investigations as well as of hygienic and prophylactic measures to prevent diseases.

99 Literaturverzeichnis

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110 Anhang

9 Anhang

9.1 Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Reagenzien, Nährmedien, Puffer und Lösungen

Laborgeräte ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer inklusive Kapillarsäule 500 bp (5 - 47 cm x 50 µm) Applied Biosystems, Darmstadt Agarosegelkammer Midi-Wide Biometra, Göttingen BioDocAnalyse System Biometra, Göttingen BioPhotometer Eppendorf, Hamburg Blockcycler T Gradient Biometra, Göttingen Blockcycler GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, Norwalk CT., USA Brutschrank 37°C Memmert, Schwabach Eieruhr TFA über Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen Elektophorese Power Pack P25 Biometra, Göttingen Erlenmeyerkolben 500 ml Schott, Mainz Erlenmeyerkolben 2000 ml Schott, Mainz Färbebank über Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen Färbewannen Emsa, Jena Feinwaage Kern 770 Kern & Sohn, Albstadt Fireboy plus Integra Biosciences, Wallisellen, Schweiz Gefrierschrank -20°C Liebherr, Langenhagen Gefriertruhe -80°C GFL Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel Gefriertruhe -80°C MDF-192 Ultra-Low Temperature Freezer Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd., Bunkyoku, Tokyo, Japan

111 Anhang

Heizblock SBH 139 DC Stuart, England Kapillarsäule Applied Biosystems, Darmstadt Kühlblock über Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen Kühlzelle 4°C Viessmann, Hof/Saale LightCycler ® 2.0 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim LightCycler Centrifuge Adapters Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Mehrkanalpipette Brand, Wertheim Messzylinder 100 ml Brand, Wertheim Messzylinder 1000 ml Brand, Wertheim Mikroskop Wild Leitz GmbH, Wetzlar Mikrowelle Panasonic, Wiesbaden MS 2 Minishaker IKA Works, Wilmington, USA Netzgerät Power Pack 300 Bio-Rad, München Pipetten 0,1 - 2,5 µl PreCision Biozym, Hess. Oldendorf 0,5 - 10 µl Proline Biohit, Helsinki, Finnland 5 - 50 µl Proline Biohit, Helsinki, Finnland 50 - 200 µl PreCision Biozym, Hess. Oldendorf 100 - 1000 µl PreCision Biozym, Hess. Oldendorf  Tissue Lyser Qiagen, Hilden Waage Precision Advanced GT4100DV Ohaus, New Jersey, USA Werkbank (Reinraum) Kojair Kojair Tech Oy, Vilppula, Finnland Werkbank Tecnoflow, Integra 2F120-II GS Integra Bioscienes, Wallisellen, Schweiz Wipptisch WT 12 Biometra Biometra, Göttingen Zentrifugen: Biofuge primo R Heraeus, Osterode Biofuge 15 Heraeus Sepatech Heraeus, Osterode Centrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg miniSpin Eppendorf, Hamburg

112 Anhang

Verbrauchsmaterialien

Centri Sep-Säulen Princeton Separations,Inc., Adelphia, New Jersey, USA Chirurgische Einmal-Skalpelle Aesculap, Tuttlingen Eppendorfreaktionsgefäße 0,5 ml mit Gummistopfen Applied Biosystems, Darmstadt Gaskartuschen CV 360 Campingaz, Paris, Frankreich Hi-Di Formamide Applied Biosystems, Darmstadt Kühlakkus Ezetil ice Akku Ezetil, Hungen-Inheiden Küvetten UVette ® 220 - 1600 nm Eppendorf, Hamburg 50 - 2000 µl LightCycler ® Capillaries 20 µl Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Mikrotiterplatte nerbe plus, Winsen/Luhe Nobaglove-Nitril Noba, Wetter Objektträger IDL, Nidderau PCR Soft Tube 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf Pipettenspitzen 10 µl Safe Seal-Tips Biozym, Hess. Oldendorf 12,5 µl Matrix Technologies Corp., Hudson, USA 50 µl nerbe plus nerbe, Winsen/Luhe 200 µl Safe Seal-Tips Biozym, Hess. Oldendorf 1250 µl Safe Seal Tips Professional Biozym, Hess. Oldendorf Probengefäß 50 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Ständer Biozym, Hess. Oldendorf Reaktionsgefäße 2,0 ml Biozym, Hess. Oldendorf Stahlkugeln Qiagen, Hilden

113 Anhang

Chemikalien und Reagenzien Agarose 3:1 Amresco, Solon, USA Aqua dest. d’NTPS Mix Qiagen, Hilden EDTA Sigma, Steinheim

EDTA-Na 2 Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe Elipur Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen Essigsäure 1 %ig Merck, Darmstadt Ethanol 96 %ig Merck, Darmstadt Ethidiumbromid Sigma Chemical Co., St. Louis, USA Marker (Größenstandard) Amresco, Solon, USA Hot Star Taq DNA Polymerase Qiagen, Hilden Immersionsöl Merck, Darmstadt Karbolfuchsin Fluka, Seelze Kohrsolin 1,5 % Bode Chemie GmbH & Co.,Hamburg Malachitgrün (Oxalat)-Lösung Fa. VWR, Darmstadt Mc Farland (Standard) bioMérieux ® SA, Marcy l’Etoile, Frankreich Pop-6 Polymer Applied Biosystems, Darmstadt Tris AppliChem GmbH, Darmstadt Wasser (HPLC-Standard) Merck, Darmstadt

Kits: Big Dye ® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Darmstadt HotStarTaq ®DNA Polymerase Qiagen, Hilden LightCycler ®-FastStart DNA Master Hybridization Probe (für Brucella genus und F. tularensis ) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim LightMix ® für Brucella genus (enthält eine Standardreihe) TIB ® MOLBIOL GmbH, Berlin LightMix ® für F. tularensis

114 Anhang

(enthält eine Standardreihe) TIB ® MOLBIOL GmbH, Berlin MinElute PCR Purification Kit Qiagen, Hilden QIAamp ® DNA Mini Kit Qiagen, Hilden

Nährmedien Basisnährboden Brucella -Agar-Basis 45 g Aqua dest. 1 l bis zum Lösen erhitzen und 15 min bei 121°C autoklavieren 5 % Pferdeserum nach dem Autoklavieren bei < 50°C zugeben

Brucella -Selektivnährboden Brucella -Agar-Basis nach Vorschrift mit Zusatz von Pferdeserum zubereiten (s. oben). 500 ml Brucella -Selektivsupplement Oxoid Limited, Hampshire, England 1 Röhrchen (Polymyxin B 2.500 IU, Bacitracin 12.500 IU, Cycloheximide 50 mg, Nalidixic acid 2,5 mg, Nystatin 50.000 IU, Vancomycin 10 mg) in Methanol 5 ml Aqua dest. 5 ml suspendieren Zu 500 ml abgekühltem Pferdeserum-Basisnährboden geben Die Nährböden wurden im LAVES, Lebensmittelinstitut Braunschweig, hergestellt.

Puffer und Lösungen TAE-Puffer Tris 242 g Essigsäure 57 ml

EDTA Na 2-Lsg. (0,5 mol/l) 100 ml Aqua dest. ad 1000 ml

115 Anhang

TAE-Laufpuffer (1:50) TAE-Puffer 1 ml Aqua dest. ad 50 ml

Vorgefertigte Puffer AL-Puffer (Lysis Buffer) Qiagen, Hilden ATL-Puffer (Tissue Lysis Buffer) Qiagen, Hilden Elutionspuffer Qiagen, Hilden Markerpuffer Amresco, Solon, USA PBI-Puffer Qiagen, Hilden PE-Puffer Qiagen, Hilden Sequenzierpuffer Applied Biosystems, Darmstadt Solution/Probenpuffer (Auftragspuffer) Sigma, Steinheim Waschpuffer 1 Qiagen, Hilden Waschpuffer 2 Qiagen, Hilden

Gel Agarose 2,25 g TAE-Laufpuffer 75 ml

EDTA-Na 2-Lsg- 0,5 mol/l (pH 8,0)

EDTA-Na 2 186,1 g Aqua dest. ad 800 ml Auf pH 8,0 einstellen Aqua dest. ad 1000 ml 15 min bei 121°C autoklavieren.

Ethidiumbromid-Lösung 6 µg Ethidiumbromid in 1 ml Aqua dest. lösen.

116 Anhang

9.2 Tabellen

Tab. 12: Auflistung der Herkunftsorte der eingesandten Fallwildhasen

Landkreis Samtgemeinde Ortsname Ammerland Edewecht Edewecht, Gemeinde Rastede Rastede Aurich Aurich (Ostfriesland), Stadt Aurich, Stadt Brookmerland Osteel Großefehn Großefehn Hinte Hinte Ihlow Barstede Südbrookmerland Engerhafe Cloppenburg Cloppenburg, Stadt Cloppenburg Friesoythe, Stadt Altenoythe Lastrup Lastrup Lindern (Oldenburg) Lindern (Oldenburg) Cuxhaven Cuxhaven, Stadt Cuxhaven Hagen Rechtenfleth Hemmoor Osten Delmenhorst Kreisfreie Stadt Delmenhorst Delmenhorst, Kreisfreie Stadt Diepholz Altes Amt Lemförde Lembruch, Gemeinde Quernheim, Gemeinde Barnstorf Hespe Bruchhausen-Vilsen Ochtmannien Weyhe Weyhe, Gemeinde Emden Kreisfreie Stadt Emden Emden Emden, Kreisfreie Stadt Emsland Emsbüren Emsbüren, Gemeinde Herzlake Lähden Spelle Lünne Friesland Wangerland Mederns Gifhorn Boldecker Land Jembke, Gemeinde Hankensbüttel Hankensbüttel, Samtgemeinde Grafschaft Bentheim Schüttdorf Schüttorf, Samtgemeinde Uelsen Wilsum Hannover, Region Barsinghausen, Stadt Langreder Garbsen, Stadt Garbsen Hannover Stadt Hannover, Landeshauptstadt krfr./reg Isernhagen Isernhagen Hohenhorster Bauerschaft Isernhagen Kircher Bauerschaft Laatzen, Stadt Laatzen Lehrte, Stadt Lehrte

117 Anhang

Landkreis Samtgemeinde Ortsname Sehnde, Stadt Sehnde Wedemark Wedemark Harburg Tostedt Wistedt, Gemeinde Helmstedt Velpke Rümmer Holzminden Polle Polle, Samtgemeinde Leer Bunde Bunde Hesel Hesel Holtland Jemgum Jemgum Leer (Ostfriesland), Stadt Coldam Moormerland Moormerland Ostrhauderfehn Ostrhauderfehn Rhauderfehn Holte (Rhauderfehn) Uplengen Hollen Weener, Stadt Weener Westoverledingen Westoverledingen, Gemeinde Lüchow-Dannenberg Lüchow Bösel Lüneburg Ostheide Reinstorf Nienburg (Weser) Stolzenau Stolzenau Uchte Warmsen Northeim Einbeck, Stadt Kohnsen Oldenburg Kreisfreie Stadt Oldenburg Stadt Oldenburg (Oldenburg), Kreisfreie Stadt Osnabrück Bersenbrück Ankum, Gemeinde Gehrde Bissendorf Bissendorf Bramsche, Stadt Bramsche Fürstenau Bippen, Gemeinde Melle, Stadt Bennien Neuenkirchen Osnabrück Kreisfreie Stadt Osnabrück Stadt Osnabrück, Kreisfreie Stadt Peine Hohenhameln Soßmar Ilsede Groß Bülten Wendeburg Wendeburg Rotenburg (Wümme) Bremervörde, Stadt Bremervörde, Stadt Sottrum Eversen Zeven Zeven Schaumburg Bückeburg, Stadt Bückeburg, Stadt Eilsen Bad Eilsen, Gemeinde Nenndorf Bad Nenndorf, Stadt Rodenberg Algesdorf Apelern, Gemeinde Sachsenhagen Hagenburg Stadthagen, Stadt Stadthagen

118 Anhang

Landkreis Samtgemeinde Ortsname Soltau-Fallingbostel Bispingen Bispingen, Gemeinde Stade Harsefeld Bargstedt Himmelpforten Himmelpforten, Gemeinde Uelzen Bevensen Hagen Wrestedt Wrestedt Vechta Bakum Bakum Damme Damme, Ort Lohne (Oldenburg), Stadt Lohne Steinfeld (Oldenburg) Harpendorf Visbek Visbek Wesermarsch Berne Berne Butjadingen Burhave Elsfleth, Stadt Elsfleth Jade Jade, Gemeinde Stadland Stadland, Gemeinde Wilhelmshaven Kreisfreie Wilhelmshaven Kreisfreie Stadt Utwarfe Stadt Wittmund Esens Holtgast Neuharlingersiel Werdum Spiekeroog Spiekeroog Wittmund, Stadt Groß Charlottengroden Wolfenbüttel Oderwald Achim Achim, Gemeinde

119 Anhang

Tab. 13: Überblick der beprobten Jagdreviere der untersuchten Proben aus Niedersachsen

Landkreis Samtgemeinde Revier Datum Anzahl der Hasen Aurich Aurich Diedrichsfeld 06.02.08 6 Cuxhaven Hemmoor Osten/Altendorf 10.11.06 40 Sandstedt Rechtenfleth 02.12.06 11 Diepholz Bassum Klenkenborstel/Dimhausen 04.10.06 21 Altes Amt Lemförde Lembruch 18.11.06 31 Rehden Barver 09.12.06 12 Lemförde Lemförder Berg 12.12.06 16 Friesland Wangerland Mederns 01.12.06 43 Harburg-Land Tostedt Heidenau-West 06.01.07 14 Winsen (Luhe) Hoopte 13.01.07 12 Leer Jemgum Hatzumerfehn 03.12.06 14 keine Angaben 25.11.06 25 keine Angaben 09.12.06 34 Peine Hohenhameln Stedum 02.12.06 35 Soßmar 07.12.06 37 Bierbergen 11.12.06 36 Reg. Hannover Hemmingen Hemmingen Hiddesdorf 04.12.06 5 Barsinghausen Langreder 29.12.06 9 Laatzen Ingeln-Oesselse 28.12.06 42 Gehrden Leveste 03.01.07 15 Schaumburg Rodenberg Apelern 16.12.06 37 Stade Himmelpforten Großen Wörden 10.12.06 37 Vechta Steinfeld Harpendorf 18.10.06 25 Damme Hüde XII 24.11.06 13 Wesermarsch Butjadingen Sillens-Isens lll 10.12.06 22 Elsfleth Burwinkel 12.12.06 41 Wittmund Wittmund Groß Charlottengroden 08.11.06 23 Esens Dunum 06.02.08 1 Holtriem Eversmeer 06.02.08 6 Westerholt 06.02.08 17

120 Anhang

9.3 Basensequenzen

Basensequenz: Brucella suis ATCC 23445

LOCUS CP000911 990 bp DNA linear BCT 28-DEC-2007 DEFINITION Brucella suis ATCC 23445 chromosome I, complete sequence. ACCESSION CP000911 REGION: 1190650..1191639 VERSION CP000911.1 GI:163673000 PROJECT GenomeProject: 20371 KEYWORDS . SOURCE Brucella suis ATCC 23445 ORGANISM Brucella suis ATCC 23445 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Brucellaceae; Brucella. REFERENCE 1 (bases 1 to 990) AUTHORS Setubal,J.C., Bowns,C., Boyle,S., Crasta,O.R., Czar,M.J., Dharmanolla,C., Gillespie,J.J., Kenyon,R.W., Lu,J., Mane,S., Mohapatra,S., Nagrani,S., Purkayastha,A., Rajasimha,H.K., Shallom,J.M., Shallom,S., Shukla,M., Snyder,E.E., Sobral,B.W., Wattam,A.R., Will,R., Williams,K., Yoo,H., Bruce,D., Detter,C., Munk,C. and Brettin,T.S. TITLE Brucella suis ATCC 23445 whole genome shotgun sequencing project JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 990) AUTHORS Setubal,J.C., Bowns,C., Boyle,S., Crasta,O.R., Czar,M.J., Dharmanolla,C., Gillespie,J.J., Kenyon,R.W., Lu,J., Mane,S., Mohapatra,S., Nagrani,S., Purkayastha,A., Rajasimha,H.K., Shallom,J.M., Shallom,S., Shukla,M., Snyder,E.E., Sobral,B.W., Wattam,A.R., Will,R., Williams,K., Yoo,H., Bruce,D., Detter,C., Munk,C. and Brettin,T.S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (06-DEC-2007) The Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), Virginia Bioinformatics Institute at Virginia Polytechnic Institute and State University, Bioinformatics I, Washington Street, Blacksburg, VA 24061, USA COMMENT Draft sequencing of Brucella suis ATCC 23445 was performed at the Joint Genome Institute (JGI) production genomics facility in Walnut Creek, CA using a combination of 3 kb and 8 kb DNA libraries. Two rounds of genome finishing were performed by the JGI at Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. The completed genome sequences of Brucella canis ATCC 23365 contain 39183 reads, achieving an average of 10-fold sequence coverage per base with an error rate less than 1 in 100,000. Annotation and database submission were carried out by the Pathosystems Resource Integration Center, Blacksburg, VA (PATRIC http://patric.vbi.vt.edu/ ), a Bioinformatics Resource Center supported by the NIH/NIAID. FEATURES Location/Qualifiers source 1..990 /organism="Brucella suis ATCC 23445" /mol_type="genomic DNA" /strain="ATCC 23445" /culture_collection="ATCC: 23445 " /db_xref="taxon: 470137 " /chromosome="I" gene complement(1..990) /locus_tag="BSUIS_A1242" CDS complement(1..990) /locus_tag="BSUIS_A1242" /note="GO_function: transporter activity ; GO_process: transport " /codon_start=1

121 Anhang

/transl_table= 11 /product="TRAP transporter solute receptor, TAXI family" /protein_id=" ABY38293.1 " /db_xref="GI:163674182" /translation="MKFGSKIRRLAVAAVAGAIALGASFAVAQAPTFFRIGTGGTAGT YYPIGGLIANAISGAGEKGVPGLVATAVSSNGSVANINAIKSGALESGFTQSDVAYWA YNGTGLYDGKGKVEDLRLLATLYPETIHIVARKDANIKSVADLKGKRVSLDEPGSGTI VDARIVLEAYGLTEDDIKAEHLKPGPAGERLKDGALDAYFFVGGYPTGAISELAISNG ISLVPISGPEADKILEKYSFFSKDVVPAGAYKDVAETPTLAVAAQWVTSAKQPDDLIY NITKVLWNEDTRKALDAGHAKGKLIKLDSATSSLGIPLHPGAERFYKEAGVLK"

ORIGIN 1 ttatttcagc acgcccgctt ccttgtaaaa gcgttctgcg ccgggatgca gcggaatacc 61 gaggctgctc gtcgcactat cgagcttgat gagcttgccc ttcgcatggc ccgcatcgag 121 tgccttgcgt gtatcctcgt tccagagaac cttggtgatg ttatagatga ggtcgtccgg 181 ctgcttggcg ctcgtcaccc actgtgcggc gacggcaagg gtcggtgttt ccgccacgtc 241 cttataggct ccggcaggaa ccacatcctt cgagaagaag gaatatttct ccagaatctt 301 gtccgcttcc ggcccggaga tcggaacgag cgaaataccg ttcgagatgg ccagttccga 361 gattgcgccc gtcggatagc cgcccacaaa gaaataggcg tccagcgcac catctttcag 421 cctctcgcct gccggtcccg gcttcaggtg ttcagccttg atatcgtctt ccgtgaggcc 481 gtaggcttca agaacgatac gcgcatcgac gatggtgcca gaacccggct catccagcga 541 aa cgcgcttg cctttcaggt ctgcgaccga tttgatgttt gcatccttac gcgcaacgat 601 atggatcgtt tccgggtaaa gcgtcgccag aaggcgcaaa tcttccacct tgcccttgcc 661 atcataaagg ccggtgccgt tataggccca ataggcaacg tctgactgcg taaagccgga 721 ctccagagcg cccgacttga tcgcattgat attggcaacc gagcca ttcg acgaaacggc 781 cgtcgcgacg agacccggca cgcccttttc gcctgcgccg gaaatcgcgt tcgcgatcag 841 accaccaatc ggataatagg ttccggctgt gccgccagtg ccgatacgga aaaatgtcgg 901 ggcctgtgca accgcaaagc tcgctcccaa cgcaatcgcg cccgccaccg ctgcaacagc 961 caagcgacgg attttgcttc cgaatttcat

Basensequenz: Brucella suis 1330

LOCUS AE014291 990 bp DNA linear BCT 13-OCT-2004 DEFINITION Brucella suis 1330 chromosome I, complete sequence. ACCESSION AE014291 REGION: 1169895..1170884 VERSION AE014291.4 GI:54112365 KEYWORDS . SOURCE Brucella suis 1330 ORGANISM Brucella suis 1330 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Brucellaceae; Brucella. REFERENCE 1 (bases 1 to 990) AUTHORS Paulsen,I., Seshadri,R., Nelson,K.E., Eisen,J.A., Heidelberg,J.F., Read,T.D., Dodson,R.J., Umayam,L.A., Brinkac,L.M., Beanan,M.J., Daugherty,S.C., Deboy,R., Durkin,A.S., Kolonay,J.F., Madupu,R., Nelson,W.C., Ayodeji,B., Kraul,M., Shetty,J., Malek,J.A., Van Aken,S.E., Riedmuller,S., Tettelin,H., Gill,S., White,O., Salzberg,S.L., Hoover,D.L., Lindler,L., Halling,S.M., Boyle,S.M. and Fraser,C.M. TITLE The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts JOURNAL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (20), 13148-13153 (2002) PUBMED 12271122 REFERENCE 2 (bases 1 to 990) AUTHORS Paulsen,I., Seshadri,R., Nelson,K.E., Eisen,J.A., Heidelberg,J.F., Read,T.D., Dodson,R.J., Umayam,L.A., Brinkac,L.M., Beanan,M.J., Daugherty,S.C., DeBoy,R.T., Durkin,A.S., Kolonay,J.F., Madupu,R., Nelson,W.C., Ayodeji,B., Kraul,M., Shetty,J., Malek,J.A., Van Aken,S.E., Riedmuller,S., Tettelin,H., Gill,S.R., White,O., Salzberg,S.L., Hoover,D.L., Lindler,L., Halling,S.M., Boyle,S.M. and Fraser,C.M.

122 Anhang

TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (14-AUG-2002) The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Dr, Rockville, MD 20850, USA REFERENCE 3 (bases 1 to 990) AUTHORS Paulsen,I., Seshadri,R., Nelson,K.E., Eisen,J.A., Heidelberg,J.F., Read,T.D., Dodson,R.J., Umayam,L.A., Brinkac,L.M., Beanan,M.J., Daugherty,S.C., DeBoy,R.T., Durkin,A.S., Kolonay,J.F., Madupu,R., Nelson,W.C., Ayodeji,B., Kraul,M., Shetty,J., Malek,J.A., Van Aken,S.E., Riedmuller,S., Tettelin,H., Gill,S.R., White,O., Salzberg,S.L., Hoover,D.L., Lindler,L., Halling,S.M., Boyle,S.M. and Fraser,C.M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (13-OCT-2004) The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Dr, Rockville, MD 20850, USA REMARK Sequence update by submitter

…

FEATURES Location/Qualifiers source 1..990 /organism="Brucella suis 1330" /mol_type="genomic DNA" /strain="1330" /db_xref="taxon: 204722 " /chromosome="I" gene complement(1..990) /locus_tag="BR1194" CDS complement(1..990) /locus_tag="BR1194" /note="identified by similarity to EGAD:7185; match to protein family HMM TIGR02122" /codon_start=1 /transl_table= 11 /product="TRAP transporter solute receptor, TAXI family" /protein_id=" AAN30113.1 " /db_xref="GI:23348028" /translation="MKFGSKIRRLAVAAVAGAIALGASFAVAQAPTFFRIGTGGTAGT YYPIGGLIANAISGAGEKGVPGLVATAVSSNGSVANINAIKSGALESGFTQSDVAYWA YNGTGLYDGKGKVEDLRLLATLYPETIHIVARKDANIKSVADLKGKRVSLDEPGSGII VDARIVLEAYGLTEDDIKAEHLKPGPAGERLKDGALDAYFFVGGYPTGAISELAISNG ISLVPISGPEADKILEKYSFFSKDVVPAGAYKDVAETPTLAVAAQWVTSAKQPDDLIY NITKVLWNEDTRKALDAGHAKGKLIKLDSATSSLGIPLHPGAERFYKEAGVLK"

ORIGIN 1 ttatttcagc acgcccgctt ccttgtaaaa gcgttctgcg ccgggatgca gcggaatacc 61 gaggctgctc gtcgcactat cgagcttgat gagcttgccc ttcgcatggc ccgcatcgag 121 tgccttgcgt gtatcctcgt tccagagaac cttggtgatg ttatagatga ggtcgtccgg 181 ctgcttggcg ctcgtcaccc actgtgcggc aacggcaagg gtcggtgttt ccgccacgtc 241 cttataggct ccggcaggaa ccacatcctt cgagaagaag gaatatttct ccagaatctt 301 gtccgcttcc ggcccggaga tcggaacgag cgaaataccg ttcgagatgg ccagttccga 361 gattgcgccc gtcggatagc cgcccacaaa gaaataggcg tccagcgcac catctttcag 421 cctctcgcct gccggtcccg gcttcaggtg ttcagccttg atatcgtctt ccgtgaggcc 481 gtaggcttca agaacgatac gcgcatcgac gatgatgcca gaacccggct catctagcga 541 aa cgcgcttg cctttcaggt ctg cgaccga tttgatgttt gcatccttac gcgcaacgat 601 atggatcgtt tccgggtaaa gcgtcgccag aaggcgcaaa tcttccacct tgcccttgcc 661 atcataaagg ccggtgccgt tataggccca ataggcaacg tctgactgcg taaagccgga 721 ctccagagcg cccgacttga tcgcattgat attggcaacc gagcca ttcg acgaaacggc 781 cgtcgcgacg agacccggca cgcccttttc gcctgcgccg gaaatcgcgt tcgcgatcag 841 accaccaatc ggataatagg ttccggctgt gccgccagtg ccgatacgga aaaatgtcgg 901 ggcctgtgca accgcaaagc tcgctcccaa cgcaatcgcg cccgccaccg ctgcaacagc 961 caagcgacgg attttgcttc cgaatttcat

123

Danksagung Die vorliegende Arbeit konnte nur durch Unterstützung von vielen Seiten entstehen, hiermit danke ich allen Beteiligten herzlich.

Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Dr. habil. Klaus Pohlmeyer, danke ich für die Bereitstellung des Themas sowie für die jederzeit gewährte freundliche und humorvolle Unterstützung. Herrn Dr. Michael von Keyserlingk möchte ich für die Idee dieser Arbeit, die konstruktive Kritik sowie für die interessanten Sektionen danken. Herrn Priv.-Doz. Dr. Martin Runge danke ich für sein großes Engagement, die freundliche Unterstützung und die fachliche Beratung bei der Durchführung der Untersuchungen und der Abfassung der Dissertation. Ulrich Voigt und Andreas Grauer danke ich für die „erste Hilfe“ am PC sowie für den jederzeit gewährten Einsatz, der weit über das Selbstverständliche hinausging. Den Mitarbeitern und Hilfskräften des Instituts für Wildtierforschung an der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie allen freiwilligen Helfern sage ich ganz herzlich Dank für die Unterstützung und die fröhlichen Stunden beim Probennehmen. Bei Herrn Prof. Dr. Neubauer, Herrn Dr. Melzer, Herrn Dr. Müller und Herrn Dr. Otto vom Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, FLI, Jena bedanke ich mich u.a. für das zur Verfügungstellen des ATCC-Stammes von F. tularensis und für die Typisierung der Brucelle. Herrn Dr. Splettstößer und Herrn Dr. Kayßer vom Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in München danke ich für die freundliche Unterstützung und die Bestätigungen der Nachweise von F. tularensis . Ingola von Keyserlingk, Sabine Baumann und Sandra Schoebel danke ich für die Einarbeitung, für die hervorragende technische Unterstützung, die immerwährende Hilfe und den geduldigen Beistand bei allen Problemen im Laborbereich während des gesamten praktischen Teils. Weiterhin danken möchte ich Frau Dr. Silke Braune, Iris Albrecht und Kirsten Dolle sowie allen Mitarbeitern des LAVES für ihre stete freundliche Hilfsbereitschaft.

Insbesondere danke ich den Revierinhabern und -pächtern für die Möglichkeit der Probennahme während der Treibjagden, für die tollen Jagden und die anschließende Gastfreundschaft. Gedankt sei auch den interessierten Jägern für ihre bereitwillige Hilfe. Ferner danke ich denjenigen Personen, die die Fallwildhasen zur Untersuchung eingesandt haben. Drago, mein treuer Wegbegleiter und freiwilliger Helfer beim Sammeln der Hasen! Er war mir im Verlauf dieser Arbeit eine moralische Unterstützung, der mich viel zum Lachen brachte. Von ganzem Herzen danke ich meinen Eltern für ihr Verständnis und die langjährige Unterstützung, die mir dieses Studium erst ermöglichte.