Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Wildtierforschung Zum Vorkommen von Tularämie und Brucellose beim Feldhasen in Niedersachsen INAUGURAL - DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) Vorgelegt von Martina Wedekind Hamburg Hannover 2008 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Dr. habil. K. Pohlmeyer Priv. Doz. Dr. M. Runge (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit - Veterinärinstitut Hannover) 1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. habil. K. Pohlmeyer 2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2008 Finanziell gefördert wurden die Untersuchungen durch Jagdabgabemittel des Landes Niedersachsen sowie unterstützt durch die Landesjägerschaft Niedersachsen e.V.. Meinen Eltern Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: M. Wedekind , M. von Keyserlingk, A. Grauer, U. Voigt, K. Pohlmeyer, F. Melzer, M. Runge (2007) Untersuchungen zur Verbreitung von Francisella tularensis und Brucellen in niedersächsischen Hasen- und Kaninchenpopulationen - erste Ergebnisse Poster, Arbeits- und Fortbildungstagung des Arbeitskreises für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID), Fachgruppe „Bakteriologie“ der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, Bad Staffelstein / Kloster Banz, 24. - 26.10.2007 M. Wedekind , M. von Keyserlingk, A. Grauer, U. Voigt, W. Splettstößer, P. Otto, W. Müller, F. Melzer, K. Pohlmeyer, M. Runge (2008) Prävalenz von Francisella tularensis und Brucella suis beim Feldhasen in Niedersachsen - aktuelle Ergebnisse Poster, Jahrestagung der DVG-FG „Bakteriologie und Mykologie“, Braunschweig, 25. - 27.06.2008 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG..............................................................................................................9 2 LITERATURÜBERSICHT.........................................................................................11 2.1 Tularämie............................................................................................................11 2.1.1 Historischer Überblick.................................................................................11 2.1.2 Biologie und Taxonomie des Erregers........................................................15 2.1.3 Diagnostik...................................................................................................18 2.1.4 Tularämie beim Feldhasen .........................................................................19 2.1.4.1 Übertragungswege beim Feldhasen .................................................19 2.1.4.2 Klinik der Tularämie beim Hasen ......................................................19 2.1.4.3 Pathologisch-anatomische Befunde beim Hasen..............................20 2.1.4.4 Bekämpfung, Impfungen...................................................................21 2.1.5 Tularämie beim Menschen..........................................................................21 2.1.5.1 Übertragungswege der Tularämie auf den Menschen ......................21 2.1.5.2 Klinik der Tularämie beim Menschen ................................................22 2.1.5.3 Prophylaxe, Therapie und Impfung ...................................................24 2.1.6 Epidemiologie/Epizootiologie......................................................................25 2.1.7 F. tularensis als biologische Waffe .............................................................31 2.2 Brucellose...........................................................................................................32 2.2.1 Historischer Überblick.................................................................................32 2.2.2 Biologie und Taxonomie des Erregers........................................................33 2.2.3 Diagnostik...................................................................................................35 2.2.4 Brucellose beim Feldhasen.........................................................................36 2.2.4.1 Übertragungswege beim Feldhasen .................................................36 2.2.4.2 Klinik der Brucellose beim Feldhasen ...............................................37 2.2.4.3 Pathologisch-anatomische Befunde..................................................38 2.2.4.4 Bekämpfung, Impfungen...................................................................39 2.2.5 Brucellose beim Menschen.........................................................................39 2.2.5.1 Übertragungswege der Brucellose auf den Menschen .....................40 2.2.5.2 Klinik der Brucellose beim Menschen ...............................................40 2.2.5.3 Prophylaxe, Therapie und Impfung ...................................................41 2.2.6 Epidemiologie/Epizootiologie......................................................................42 2.3 Zielsetzung .........................................................................................................47 3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................49 3.1 Material...............................................................................................................49 3.1.1 Probenmaterial ...........................................................................................49 3.1.1.1 Fallwild..............................................................................................49 3.1.1.2 Erlegte Hasen ...................................................................................50 3.2 Methoden............................................................................................................51 3.2.1 Probengewinnung.......................................................................................51 3.2.2 Bakteriologische Untersuchungsmethoden.................................................52 3.2.2.1 Anlegen der Bakterienkultur..............................................................52 3.2.2.2 Stamp-Färbung.................................................................................52 3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungsverfahren ..........................................53 3.2.3.1 Nukleinsäure-Extraktion....................................................................53 3.2.4 Nachweis von F. tularensis .........................................................................55 3.2.4.1 Auswahl der Primer...........................................................................55 3.2.4.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)......................................................55 3.2.4.3 Ermittlung der Nachweisgrenze ........................................................58 3.2.4.4 Nachweis der PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese........59 3.2.5 Nachweis von Brucella sp...........................................................................61 3.2.5.1 PCR ..................................................................................................61 3.2.5.2 Sequenzierung von PCR-Produkten .................................................63 3.2.5.2.1 Aufreinigung der PCR-Produkte ............................................................63 3.2.5.2.2 DNA-Sequenzierung..............................................................................64 3.2.6 Statistik .......................................................................................................66 4 ERGEBNISSE ..........................................................................................................67 4.1 Validierung der PCR ...........................................................................................67 4.1.1 Ermittlung der Nachweisgrenze von F. tularensis .......................................67 4.1.2 Ermittlung der Nachweisgrenze von Brucella sp.........................................71 4.2 Nachweis von F. tularensis und Brucella sp. mittels PCR...................................72 4.2.1 Nachweis von F. tularensis .........................................................................72 4.2.1.1 Prävalenzratio ...................................................................................76 4.2.2 Nachweis von Brucella sp...........................................................................77 4.2.2.1 Prävalenzratio ...................................................................................78 4.3 Sequenzierung von Amplifikationsprodukten ......................................................79 4.4 Typisierung von Brucella sp................................................................................79 4.5 Bakteriologische Untersuchung zum Nachweis von Brucella sp.........................80 4.6 Pathologisch-anatomische Untersuchungen.......................................................81 4.6.1 Hasen mit Nachweis von F. tularensis ........................................................81 4.6.2 Hase mit Nachweis von Brucella sp............................................................84 5 DISKUSSION ...........................................................................................................85 6 ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................98 7 SUMMARY ...............................................................................................................99 8 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................100 9 ANHANG................................................................................................................111