Universidade Federal De Goiás Instituto De Ciências Biológicas Programa De Pós-Graduação Em Biodiversidade Vegetal Yanne S

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE VEGETAL

YANNE SOUSA FERNANDES

MORFOANATOMIA, TRICOMAS GLANDULARES E ANÁLISE FITOQUÍMICA DE Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE- EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREA DE CERRADO RUPESTRE

GOIÂNIA - GO FEVEREIRO/2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP) GPT/BC/UFG

Fernandes, Yanne Sousa. F363m Morfoanatomia, tricomas glandulares e análise fitoquímica de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) ocorrente em área de Cerrado Rupestre [manuscrito] : / Yanne Sousa Fernandes. - 2014. 116 f. : il.

Orientadora: Profª. Drª. Letícia de Almeida Gonçalves Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biológicas, 2014. Bibliografia. Inclui lista de figuras, abreviaturas, e quadros.

1.Óleos essenciais – Plantas do Cerrado 2. Plantas do Cerrado – Prospecção fitoquímica 2. Óleo essencial - Composição 3. Tricomas glandulares I. Título.

CDU: 665.528

YANNE SOUSA FERNANDES

MORFOANATOMIA, TRICOMAS GLANDULARES E ANÁLISE FITOQUÍMICA DE Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREA DE CERRADO RUPESTRE

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biodiversidade Vegetal do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como requesito à obtenção do título de Mestre em Biodiversidade vegetal. Orientadora: Profa. Dra. Letícia de Almeida Gonçalves

GOIÂNIA - GO FEVEREIRO/2014

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Yanne Sousa Fernandes E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não Vínculo empregatício do autor Agência de fomento: Sigla: País: Brasil UF:GO CNPJ: Título: Morfoanatomia, tricomas glandulares e análise fitoquímica de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) ocorrente em área de Cerrado Rupestre Palavras-chave: anatomia, estruturas secretoras, óleo essencial, prospecção fitoquímica Título em Morpho-anatomy, glandular trichomes and phytochemical analysis of Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) in cerrado rupestre outra língua: Palavras-chave em outra língua: anatomy, secretory structures , essential oil , phytochemical Área de concentração: Anatomia Vegetal Data defesa: (dd/mm/aaaa) 27/02/2014 Programa de Pós-Graduação: Biodiversidade Vegetal Orientador (a): Dra. Letícia de Almeida Gonçalves E-mail: [email protected] Co-orientador (a):* E-mail: *Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [X] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

______Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

YANNE SOUSA FERNANDES

MORFOANATOMIA, TRICOMAS GLANDULARES E ANÁLISE FITOQUÍMICA DE Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREA DE CERRADO RUPESTRE

Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Vegetal – Mestrado do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, para obtenção do grau de Mestre, aprovada em 27 de Fevereiro de 2014, pela Banca Examinadora constituída pelos seguintes professores

______Dra. Letícia de Almeida Gonçalves Orientadora Presidente da Banca

______Dra Giuliana Muniz Vila Verde Safadi Membro externo Universidade Estadual de Goiás

______Dra Maria Helena Rezende Membro interno Universidade Federal de Goiás

Aos meus Pais pelo amor e dedicação, ao meu irmão Yan pelo carinho e ao meu noivo por sempre estar ao meu lado, dedico.

AGRADECIMENTOS

À Deus pelo dom da vida e por me guiar em cada sonho de maneira mais perfeita e delicada, realizando-os em seu tempo. Em ti encontrei força e sabedoria, muito obrigada! À CAPES pela bolsa para a realização da pesquisa. À Universidade Federal de Goiás pelo suporte e auxílio para realização desta pesquisa. Ao Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LABMIC) do Instituto de Física e Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN) da Faculdade de Farmácia da UFG pelo apoio técnico e receptividade. À minha orientadora, Profa. Dra. Letícia de Almeida Gonçalves, pelos ensinamentos, incentivo, paciência, apoio constante, confiança e amizade ao longo dessa trajetória. Muito obrigada pelo carinho! À Profª. Drª. Maria Helena Rezende e Profº. Drº. José Realino de Paula pelas importantes contribuições e ajuda para realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos! Profª. Dra. Maria Tereza Faria por sempre ser tão solícita e dividir o seu conhecimento me ajudando no laboratório. Obrigada por tudo! Ao Danilo Luíz dos Santos, acadêmico de Farmácia, pelo auxilio no laboratório e nas análises fitoquímicas que foram essenciais na construção deste trabalho. Aos meus pais Sebastião Fernandes e Raimundinha Fernandes por sempre acreditarem no meu potencial, me apoiando em minhas escolhas e sempre vibrarem comigo em minhas conquistas. Muito obrigada pelos sacrifícios feitos para que eu pudesse conseguir conquistar mais essa vitória. Amo vocês! Á minha querida madrinha Maria da Paixão Guilherme pelos conselhos que me fazem refletir sobre a vida e por sempre acreditar em mim mesmo quando eu não acreditava. Ao meu querido irmão Yan Fernandes, pela sabedoria de suas palavras em momentos críticos, apesar da pouca idade já demonstra ser um grande homem. Ao meu Amor de toda vida, Benjamim Junior, pelo seu amor que me motiva e por sempre estar ao meu lado. Obrigada pela paciência, pela compreensão e companheirismo. Amo- te! Às amigas Luma Mota, Laís Nabuco e Mariana Vieira pelas agradáveis conversas e por fazerem meus dias no laboratório mais felizes. Jamais me esquecerei de vocês “suas lindas”. Aos colegas e amigos do Mestrado, por me acolherem tão bem, Vinicius Pina, Drª Divina Vilhalva e Taiza Moura pela nossa inesquecível viagem juntos e pelas lendárias coletas na Serra Dourada. Foi maravilhoso!

Ao Felipe Carvalho, Viviane Ovidio, Cínthia Silva, Raquel Morais, Bárbara Regina e Elga de Fátima por dividirem aflições e alegrias comigo. Irei guardá-los sempre no meu coração! A todos os professores e funcionários do programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal. Muitas pessoas contribuíram para esse trabalho, àqueles que não citei, peço desculpas, vocês foram, essenciais para conclusão deste trabalho. Muito Obrigada!

RESUMO

Morfoanatomia, tricomas glandulares e análise fitoquímica de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) ocorrente em área de Cerrado Rupestre. O Cerrado Rupestre é um subtipo de vegetação arbóreo-arbustiva que ocorre em ambientes rupestres e rochosos. Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob é uma Asteraceae, da tribo Eupatorieae e é endêmica do Brasil. Tendo em vista que a espécie é pouco conhecida sob ponto de vista botânico, o presente estudo teve como objetivo descrever a morfoanatomia da folha e caule de T. eupatorioides ocorrente em área de Cerrado Rupestre, caracterizar e identificar etapas do desenvolvimento dos tricomas glandulares, bem como detectar a presença de metabólitos por prospecção fitoquímica e determinar a composição do óleo essencial em seus órgãos reprodutivos e vegetativos aéreos. Amostras de T. eupatorioides foram coletadas na Reserva Biológica da Universidade Federal de Goiás “Prof. José Ângelo Rizzo”. Para o estudo morfoanatômico e para a caracterização dos tricomas glandulares foram utilizadas folhas completamente expandidas, caules, ápices caulinares, flores e brácteas involucrais. O estudo fitoquímico foi realizado em órgãos aéreos vegetativos e reprodutivos. T. eupatorioides apresenta características anatômicas comuns à outras espécies citadas na literatura como folha anfiestomática, estômatos anomocíticos e anisocíticos, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas e periclinais externas espessas, tricomas glandulars e tectores, endoderme com amido e estrias de Caspary, fibras associadas ao feixe vascular, e ductos secretores. Os tricomas glandulares são unisseriados e bisseriados e secretam óleos essenciais e compostos fenólicos. A diferenciação dos tricomas glandulares inicia-se com a expansão de uma célula protodérmica; nos tricomas bisseriados a primeira divisão desta célula é anticlinal e no unisseriado é periclinal. Na prospecção fitoquímica foram identificados heterosídeos flavonóides, heterosídeos cardioativos e cumarinas. Foram identificados vinte componentes do óleo essencial, 95% destes são sesquiterpenos. Os compostos majoritários foram os sesquiterpenos 3,5 -muuroladieno com 39,56%, Hidroxitolueno butilado com 13,07%, e o E- cariofileno com 5,63%.

Palavras chaves: anatomia, estruturas secretoras, óleo essencial, prospecção fitoquímica

ABSTRACT

Morpho-anatomy, glandular trichomes and phytochemical analysis of Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) in cerrado rupestre. Cerrado rupestre is a subtype of arboreal-shrub vegetation that occurs in rupestrian and rocky habitats. Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob belongs to the tribe Eupatorieae of the family Asteraceae, and it is endemic to Brazil. Given the scant knowledge of the botanical traits of this species, the present study aimed to describe the morpho-anatomy of leaves and stems, characterize and identify developmental stages of glandular trichomes, detect the presence of metabolites by phytochemical screening, and determine the composition of the essential oil from aerial vegetative and reproductive parts of T. eupatorioides from a cerrado rupestre area. Samples of T. eupatorioides were collected from the Biological Reserve “Prof. José Ângelo Rizzo” of Universidade Federal de Goiás (UFG). Fully expanded leaves, stems, stem apices, flowers and involucral bracts were used for the morpho- anatomical study and to describe glandular trichomes. Aerial vegetative and reproductive organs were used for the phytochemical study. T. eupatorioides shares anatomical traits with other species described in the literature, such as amphistomatic leaves, anomocytic and anisocytic stomata, epidermal cells with sinuous anticlinal walls and thick external periclinal walls, glandular and non-glandular trichomes, endodermis with starch and Casparian strips, fibers associated to the vascular bundle, and secretory ducts. The glandular trichomes secrete essential oils and phenolic compounds and may be uniseriate or biseriate. The differentiation of the glandular trichomes begins with the expansion of a protodermal cell. The first division is anticlinal for biseriate trichomes, and periclinal for uniseriate ones. The phytochemical screening identified flavonoid and cardiac glycosides and coumarins. Twenty components of the essential oil were identified; of these, 95% were sesquiterpenes. The major components were the sesquiterpenes 3,5-muuroladiene (39.56%), butylated hydroxytoluene (13.07%), and (E)- caryophyllene (5.63%).

Keywords: anatomy, secretory structures, essential oil, phytochemical screening

LISTA DE FIRURAS

FIGURA 1: Aspecto geral de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob em estágio vegetativo e reprodutivo...... 48 FIGURA 2: Aspectos da morfologia e venação foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 50 FIGURA 3: Epiderme da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob em Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia Óptica...... 52 FIGURA 4: Cortes transversais do terço médio da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 54 FIGURA 5: Cortes transversais do terço médio da nervura central da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 56 FIGURA 6: Cortes transversais da região apical da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 58 FIGURA 7: Cortes transversais da região basal da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 60 FIGURA 8: Cortes transversais do pecíolo de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 62 FIGURA 9: Cortes transversais e longitudinal do caule na região do 1º ao 3º entrenós de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 64 FIGURA 10: Cortes transversais do caule na região do 3° ao 5° entrenós de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 66 FIGURA 11: Tricomas glandulares e tectores de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 68 FIGURA 12: Microscopia eletrônica de varredura dos tricomas glandulares e tectores presentes na lâmina foliar e no caule de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 70 FIGURA 13: Microscopia eletrônica de varredura evidenciando os tipos e a ocorrência dos tricomas glandulares e tectores na flor e bráctea involucral de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 72 FIGURA 14: Caracterização histoquímica do secretado dos tricomas glandulares de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 74 FIGURA 15: Aspecto da região apical da planta jovem e dos cotilédones de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 76 FIGURA 16: Eventos ontogenéticos dos tricomas glandulares dos tipos I e III de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 78 FIGURA 17: Eventos ontogenéticos do tricoma glandular do tipo II de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 80

LISTA DE ABREVIAÇÕES

CCl3CHOH2O – Cloral Hidratado CG – Cromatografia Gasosa

CH2Cl2 – Diclorometano EM – Espectro de Massa

FAA50 – Formaldeído, Acido Acético Glacial, Etanol 50% IR – Índice de Retenção KI – Índice e Kovats LABMIC – Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução MEV – Microscópio de Alta Resolução NaOH – Hidróxido de Sódio UFG – Universidade Federal de Goiás LPPN - Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais PESD – Parque Estadual da Serra Dourada

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1: Resultados da prospecção fitoquímica realizada nos órgãos vegetativos aéreos e reprodutivo de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 100

QUADRO 2: Compostos identificados na amostra de óleo essencial de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob...... 101

QUADRO 3: Classes dos componentes do óleo essencial de Trichogonia eupatorioides ...... 102

SUMÁRIO

RESUMO ...... 9 1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 16 2. JUSTIFICATIVA ...... 17 3. OBJETIVOS ...... 17 3.1 Objetivo Geral ...... 17 3.2 Objetivos Específicos ...... 17 4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 18 4.1 O Cerrado Rupestre ...... 18 4.2 Família, tribo e gênero ...... 19 4.3 Tricomas glandulares em Asteraceae ...... 20 4.4 Metabólitos secundários em Asteraceae ...... 22 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 26 CAPÌTULO 1: MORFOANATOMIA, CARACTERIZAÇÃO E ONTOGENIA DOS TRICOMAS GLANDULARES DE Trichogonia eupatorioides (GARDNER) R. M. KING & H. ROB (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREAS DE CERRADO RUPESTRE ...... 34 RESUMO ...... 34 1. INTRODUÇÃO ...... 35 2. MATERIAL E MÉTODO ...... 37 2.1 Obtenção do material vegetal ...... 37 2.2 Padronização, coleta e processamento das amostras ...... 37 2.2.1 Diafanização ...... 38 2.2.2. Cortes a mão livre ...... 38 2.2.3 Histoquímica ...... 39 2.2.4 Microscopia eletrônica de varredura ...... 39 2.2.5 Historresina ...... 39 2.2.6 Inclusão em parafina ...... 40 2.3 Documentação fotográfica ...... 40 3. RESULTADOS ...... 41 3.1 Morfologia foliar ...... 41 3.2 Anatomia foliar ...... 41 3.2.1 Lâmina foliar ...... 41 3.2.2 Pecíolo ...... 43 3.3 Anatomia caulinar...... 44 3.4 Caracterização dos tricomas ...... 45 3.4.1. Tipos e ocorrência ...... 45 3.4.2. Histoquímica dos tricomas glandulares ...... 46 3.4.3 Ontogenia dos tricomas glandulares ...... 46 14

4. DISCUSSÃO ...... 81 5. CONCLUSÃO ...... 86 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 87 CAPÍTULO 2: PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA E COMPOSIÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Trichogonia eupatorioides (GARDNER) R. M. KING & H. ROB (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREA DE CERRADO RUPESTRE ...... 95 RESUMO ...... 95 1. INTRODUÇÃO ...... 96 2. MATERIAL E MÉTODO ...... 98 2.1 Material Vegetal ...... 98 2.2 Prospecção fitoquímica ...... 98 2.3 Extração do óleo essencial ...... 99 2.3.1 Análise da composição química do óleo essencial ...... 99 3. RESULTADOS ...... 100 3.1 Prospecção fitoquímica ...... 100 3.2 Composição química do óleo essencial ...... 100 4. DISCUSSÃO ...... 103 5. CONCLUSÃO ...... 108 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 109 CONCLUSÕES ...... 116

1. INTRODUÇÃO GERAL

O Cerrado está localizado essencialmente no Planalto Central do Brasil e é o segundo maior bioma do país em extensão, sendo superado apenas pela Floresta Amazônica. A flora do Cerrado é característica e diferenciada dos biomas adjacentes, devido ao clima que tem efeitos diretos sobre a vegetação, a físico-química do solo, a disponibilidade de água e de nutrientes, a geomeomorfologia e a topografia. A distribuição da flora é condicionada pela latitude, pela frequência de queimadas, pela profundidade do lençol freático e por inúmeros fatores antrópicos (RIBEIRO & WALTER, 2008). Considerando o estrato arbustivo e herbáceo que compõem o bioma Cerrado, destaca-se Asteraceae, que é a maior família dentre as Angiospermas (ANDERBERG et al., 2007; FUNK et al., 2009). As plantas que ocorrem neste ambiente apresentam características anatômicas como mesofilo compacto, geralmente grande espessura das paredes das células epidérmicas e da cutícula, presença de tricomas, e abundância de esclerênquima (HANDRO et al., 1970; PAVIANI, 1978). Os estudos sobre anatomia foliar podem fornecer dados que subsidiam trabalhos de fisiologia ecológica, principalmente de balanço hídrico, nos vários tipos de vegetações como o Cerrado, a Caatinga, e a Mata pluvial (FERRI, 1963; HANDRO et al., 1970), para a taxonomia (CASTRO et al, 1997), e para a química na formulação de novos modelos de fármacos entre outros. A presença de variados tipos morfológicos de tricomas glandulares são características marcantes para Asteraceae (METCALFE & CHALK, 1950). Estes secretam diversos metabólitos secundários que variam em suas atividades biológicas e farmacológicas, conferindo a esta família um status importante no que se refere à procura de compostos bioativos. Segundo Cutter (1986), as variadas formas e tipos de tricomas entre as espécies podem ser importantes para a taxonomia, para estudos ecológicos e farmacológicos. O estudo das lactonas sesquiterpênicas comumente presentes em óleos essenciais das Asteraceae tem recebido mais atenção nos últimos tempos devido ao seu potencial biológico com fins terapêuticos como propriedade antibacteriana, antifúngica e citotóxica (NEERMAN, 2003). Estudos com a biodiversidade vegetal do Cerrado visam não somente subsidiar várias áreas de conhecimento, mas também contribuir para a conservação das espécies neste bioma. Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob é endêmica do Brasil, (ROQUE, 2013) e não há na literatura registro de estudos anatômicos, fisiológicos e fitoquímicos da espécie em áreas de Cerrado Rupestre.

2. JUSTIFICATIVA

Um dos principais desafios na conservação do Cerrado é demonstrar a importância que a biodiversidade desempenha no funcionamento do ecossistema. O conhecimento da biodiversidade e suas implicações são fundamentais para o debate desenvolvimento x conservação. Neste contexto, Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (Asteraceae) ocorrente naturalmente em áreas de Cerrado ainda é pouco conhecida sob o ponto de vista botânico. Portanto, sua caracterização morfoanatômica, a identificação das principais classes de metabólitos secundários e a composição do óleo essencial fornecerão subsídios para estudos taxonômicos, fitoquímicos e para a conservação da espécie no ambiente de Cerrado.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Descrever a morfoanatomia da folha e do caule de Trichogonia eupatorioides ocorrente em área de Cerrado Rupestre, caracterizar os tricomas glandulares e sua ontogênese e realizar análise fitoquímica desta espécie ocorrente em área de Cerrado Rupestre.

3.2 Objetivos Específicos

 Caracterizar a arquitetura e a organização anatômica da folha;  Descrever a anatomia do caule;  Identificar e caracterizar os tricomas glandulares presentes no caule, nas folhas, nas flores e nas brácteas involucrais;  Identificar as principais classes de metabólitos secundários secretados pelos tricomas glandulares através de histoquímica;  Identificar as principais etapas envolvidas na ontogenia dos tricomas glandulares que ocorrem no caule e na folha;  Identificar os metabólitos secundários através de prospecção fitoquímica dos órgãos aéreos (vegetativos e reprodutivos);  Determinar a composição química do óleo essencial produzido pelos órgãos aéreos (vegetativos e reprodutivos).

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 O Cerrado Rupestre

O bioma Cerrado é o segundo maior bioma sul americano, ocupando uma área de aproximadamente dois milhões de km2, e cerca de 22% do território nacional (BRASIL, 2007). A biodiversidade do Cerrado é elevada, com um número de plantas vasculares superior àquele encontrado na maioria das regiões do mundo que somam mais de 7.000 espécies (MENDONÇA et al.,1998). Segundo Klink & Machado (2005), 44% da flora é endêmica e, nesse sentido, o Cerrado é a mais diversificada savana tropical do mundo e está na lista dos 25 hotspots para proteção e preservação da sua riqueza de biodiversidade (MYERS, 2000). A característica mais marcante do ambiente Cerrado é a variação climática sazonal onde a estação seca é bem definida, podendo durar até seis meses. Nestas condições a camada superficial do solo tende a secar, mas as camadas mais profundas mantêm-se úmidas durante o ano todo, assim plantas com sistemas radiculares profundos parecem não serem afetadas pelo período de estiagem. Em contrapartida, as plantas herbáceaes com sistemas radiculares menos profundos restringem seu crescimento provocando o secamento da parte aérea e retomando suas atividades fisiológias e fenológicas na estação chuvosa (OLIVEIRA, 2008). O Cerrado Rupestre diferencia-se dos demais subtipos pelo tipo de substrato, tipicamente com solos rasos e afloramentos de rocha. Possui cobertura arbórea variável de 5 a 20%, altura média de 2 a 4 m, e pode ocorrer em trechos contínuos, mas geralmente aparece em mosaicos, incluindo outros tipos de vegetação (RIBEIRO & WALTER, 2008). Os solos dos Cerrados Rupestres são os Neossolos Litolíticos originados da decomposição de arenitos e quartzitos, pobres em nutrientes, ácidos e com baixos teores de matéria orgânica (RIBEIRO & WALTER, 2008). Morfologicamente, este tipo de solo é bastante heterogêneo, com fragmentos de rochas parcialmente intemperizadas, pedras e cascalhos. Possui capacidade de água disponível que varia em média de 10 mm a 40 mm, conforme sua profundidade, e sua drenagem variam de boa a imperfeita. Por serem muito raros apresentam limitação à penetração do sistema radicular das plantas, assim, os indivíduos concentram-se nas fendas entre as rochas e as plantas de porte arbóreo só se estabelecem quando encontram abertura ou fendas entre as rochas (REATTO et al., 2008). No estrato subarbustivo-herbáceo algumas famílias são frequentemente encontradas como: Asteraceae, Bromeliaceae, Cactaceae, Eriocaulaceae, Melastomataceae, Myrtaceae, Rubiaceae, Velloziaceae, entre outras (RIBEIRO & WALTER, 2008).

4.2 Família, tribo e gênero

Asteraceae é considerada a maior família dentre as Angiospermas, com mais de 1.600 gêneros distribuídos em todo o mundo, exceto para a Antártida, e aproximadamente 24.000 espécies com estimativa de um número total 30.000 espécies (ANDERBERG et al., 2007; FUNK et al., 2009). Estas estão distribuídas em regiões tropicais, subtropicais e temperadas montanhosas, sendo mais abundantes nas regiões abertas e áridas do que nas florestas tropicais úmidas (BARROSO, 1991; JUDD et al., 2009). Estudos moleculares e morfológicos reconhecem para a família 12 subfamílias e 43 tribos. Asteroideae é a maior subfamília e compreende aproximadamente 15.500 espécies (mais de 60% das espécies da família), 1229 gêneros (mais de 70%) e 20 tribos (aproximadamente 60%) (FUNK et al., 2009). No Brasil as Asteraceae são representadas por 14 tribos, 275 gêneros e 2034 espécies. Destas, 1302 espécies são endêmicas e distribuídas em todos os domínios fitogeográficos do país (NAKAJIMA et al., 2013). É representada, predominantemente, por espécies herbáceas, arbustivas e subarbustivas, embora o hábito arbóreo e trepador também estejam presentes, exibindo uma variação contínua da condição de herbácea a lenhosa e às vezes plantas latescentes e resiníferas (JUDD et al., 2009). As folhas são alternas e espiraladas, opostas ou verticiladas, simples, mas ás vezes profundamente lobadas ou partidas, inteiras a diversamente denteadas, com venação peninérvea ou palmada e estípulas ausentes (JUDD et al.,2009). Uma característica típica de todos os seus membros é a inflorescência em capítulo. Este se encontra rodeado por um invólucro de uma ou mais séries de brácteas livres ou fundidas e flores que podem ser actinomórficas ou zigomórficas, monóicas ou dióicas, sendo o ovário ínfero e bicarpelar. Além destas características, a família possui uma apresentação secundária de pólen, ou seja, os grãos de pólen são depositados sobre os ramos do estilete, nas flores durante a pré-antese (YEO, 1993) e o fruto característico é a cipsela, que juntamente com o papus, caracteriza a unidade de dispersão (BREMER, 1994). A grande plasticidade evidenciada pela ocupação de diferentes habitats, leva ao surgimento de padrões anatômicos muito variados no que concerne à anatomia dos órgãos vegetativos (CRONQUIST, 1981). As espécies de Asteraceae podem ser encontradas em diferentes condições climáticas e nos mais variados habitats, desde regiões tropicais, subtropicais até temperadas, com exceção do ambiente aquático, pois poucas espécies são verdadeiramente aquáticas (BARROSO et al., 1991). A ampla distribuição dessa família ocorre em função ao seu extraordinário potencial de adaptação e de algumas características como a facilidade de dispersão das sementes pelo vento, 19

além de estruturas de aderência do papus modificados em espinhos com bárbulas retorcidas e ganchos (CRONQUIST 1968; BREMER, 1994; FUNK et al., 2005; JUDD et al., 2009). Algumas características anatômicas são constantes para a família, como feixes colaterais acompanhados por fibras, folhas anfiestomáticas, endoderme com grãos de amido e estrias de Caspary (METCALFE & CHALK, 1950), além de estruturas secretoras que secretam compostos provindos do metabolismo secundário que conferem proteção contra herbivoria e condições ambientais adversas (BREMER, 1994). A tribo Eupatorieae compreende 19 subtribos (ROBINSON et al., 2009), 170 gêneros e aproximadamente 2.400 espécies (JUDD et al., 2009). A tribo é composta de ervas perenes ou anuais, arbustos, trepadeiras, raras arvoretas e distingue-se das demais tribos por possuir os ramos do estilete com apêndices apicais estéreis, longos, lineares ou claviformes, papilosos, cobertos por tricomas na face dorsal até o ponto de bifurcação, geralmente coloridos, duas áreas estigmáticas distintas, curtas, na base dos ramos (FERREIRA, 2006). Trichogonia é um gênero sul-americano com 20 espécies, das quais 14 são endêmicas ao Brasil (ROQUE, 2013), pertence a Eupatorieae e subtribo Gyptidinae. É caracterizado por possuir hastes alongadas longitudinais, densa presença de tricomas glandulares ou não e por papus plumoso. As endemias brasileiras estão distribuídas nos estados do Ceará, Espırito Santo, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Piauí, Pernambuco, Rio de Janeiro e São Paulo. As espécies ocorrem principalmente no Cerrado, Campos Rupestres e Caatinga. O nome Trichogonia refere-se à presença de tricomas nos órgãos vegetativos e reprodutivos (ROQUE et al., 2012). Trichogonia eupatorioides é um subarbusto ereto de aproximadamente 0,5 m, folhas alternas dispostas em espiral, com presença densa de tricomas glandulares estipados e sésseis nas folhas, caule e flores. Possui origem nativa, endêmica do Brasil, ocorrente na região Nordeste (Ceará, Bahia), Centro-Oeste (Goiás), Sudeste (Minas Gerais), nos domínios fitogeográficos Cerrado e Caatinga (ROQUE, 2013). Não há na literatura registro de estudos anatômicos e fisiológicos sobre T. eupatorioides, em relação à fitoquímica, Borges (2006) ao estudar esta espécie (sin. T. menthaefolia) identificou triterpenos, sesquiterpenos, esteróides e flavonóides.

4.3 Tricomas glandulares em Asteraceae

Nos últimos anos as estruturas secretoras têm despertado grande interesse dos perquisadores, pois, segundo Solereder (1908) e Castro et al. (1997), o tipo e a posição ocupada por diferentes estruturas secretoras são parâmetros considerados de importância para a taxonomia da família, podendo inclusive servir para o reconhecimento de espécies

morfologicamente semelhantes. Além disto, o material secretado fornece dados para o esclarecimento das principais vias de síntese dos metabólitos produzidos, contribuindo para elucidar as funções fisiológicas e ecológicas que as plantas possuem (FANH, 1988). Para Asteracae já foram relatados hidatódios, nectários, ductos, cavidades, idioblastos, laticíferos, coléteres e diversos tipos de tricomas (SOLEREDER, 1908; METCALFE & CHALK, 1950; PYYKKÖ, 1966; CLARO, 1994; CASTRO et al.,1997) Dentre as estruturas secretoras de Asteraceae destacam-se os tricomas glandulares, que são anexos epidérmicos que possuem células responsáveis pela secreção e liberação de compostos de aspecto denso ou hialino que ficam armazenados, geralmente, no próprio protoplasto destas células ou, mais frequentemente, em um espaço subcuticular formado pela distensão da cutícula (CASTRO et al., 1997). Já segundo Gonçalves & Lorenzi (2007) tricoma é uma célula ou um conjunto de células diferenciadas da epiderme que se projetam como se fossem pêlos. Os tricomas glandulares têm origem em uma célula da protoderme, que se distingue das células vizinhas por ser mais volumosa e apresentar citoplasma mais denso e núcleo volumoso. Esta célula inicial aumenta gradualmente o volume seguindo o eixo longitudinal, dividindo-se periclinalmente ou anticlinalmente. Após esta primeira divisão que se estabelece a natureza unisseriada ou bisseriada dos tricomas, ocorrem novas divisões que resultam em células diferentes que compreenderão o pedúnculo e a cabeça glandular (ASCENSÃO & PAIS, 1987). A fase final da diferenciação dos tricomas glandulares é concomitante com o início do processo secretor e terminada a fase de secreção, as células glandulares passam por degeneração celular, o que leva ao colapso da cabeça glandular do tricoma e à sua perda de funcionalidade (ASCENSÃO, 2007). Os tricomas podem ser classificados em unicelulares ou pluricelulares, simples ou compostos, secretores ou não secretores (BEHNKE, 1984). O tricoma glandular é constituído, segundo Fahn (1979), por uma base que está inserida em outras células epidérmicas, pelo pedúnculo que eleva as células secretoras e pelo pescoço que conecta o pedúnculo à porção apical secretora. Além disso, para este mesmo autor, estes tricomas podem ser capitados e peltados. Os capitados possuem pedúnculo de tamanho variado e cabeça secretora globosa com até 4 células, os peltados possuem pedicelo curto e cabeça ampla e achatada formada por mais de 4 células. Os tricomas glandulares mais frequentes em Asteraceae são os pluricelulares bisseriados que, por vezes, possuem sua cabeça secretora com células fotossintéticas (ASCENSÃO et al., 2001). De acordo com Solereder (1908) os tricomas nas Asteraceae são polimorfos, sendo o mais

comum o vesiculoso que possui cabeça bisseriada elipsoidal, pedúnculo curto e se localizam em depressões na epiderme. Para Metcalfe & Chalk, (1950) os tricomas glandulares podem ser unisseriados a multisseriados, sua cabeça pode ser uni a pluricelular e podem liberar gotas translúcidas. Na literatura, tricomas glandulares do tipo bisseriado são relatados em diferentes tribos de Asteraceae como Anthemideae, Astereae, Eupatorieae, Heliantheae, Inuleae, Mutisieae e Vernoniea (CASTRO et al., 1997; CORTADI et al., 1999; Monteiro et al., 2001). Segundo Cutter (1986), dada a variada forma e tipos de tricomas entre as espécies, este é um importante dado, e pode ser significativamente importante para a taxonomia. Tricomas glandulares bisseriados estão presentes em diferentes órgãos de espécies de Asteraceae como em Achillea millefolium L. (GREGIO & MOSCHETA, 2006) nas flores, folhas e escapo; em Matricaria chamomilla L (ANDREUCCI et al., 2008), nas brácteas, folhas e caule; em Orthopappus angustifolius Sw. (APPEZZATO-DA-GLÓRIA et al., 2008) no rizóforo; em cinco espécies do gênero Flourensia (DELBÓN et al., 2007; 2012) nos caules e em folhas; Baccharis microcephala DC. e B. trimera (Less.) DC. (BUDEL & DUARTE, 2009) no cladódio; e Pteronia incana (Burm.) DC., (MAYEKISO et al., 2008) nas folhas. Em espécies de Ophryosporus (PLOS et al., 2011), os tricomas bisseriados longos possuem os pares das células organizados em diferentes níveis de altura e estão presentes nas folhas. Tricomas glandulares unisseriados também são relatados para espécies da família. Em Baccharis gaudichaudiana DC., os tricomas glandulares são pluricelulares, uni e bisseriados, com porção apical arredondada, reunidos pela base em tufos e localizados em pequena depressão nos cladódios (BUDEL et al., 2003); em Calea longifolia (DC.) Baker são pluricelulares e capitados, com e cabeça globóide (FARAGO et al., 2006); e em Eupatoruim macrocephalum Less., E. inulaefolium H.B.K. e E. subhastatum Hook. & Arn. (CORTADI & GATUSO, 1994), são recurvados sobre a epiderme com cabeça ovóide. Em Asteraceae os tricomas glandulares secretam material de natureza lipofílica que são geralmente óleos essenciais (ou oleoresinas) e compostos fenólicos (MONTEIRO et al., 2001; AGUILERA et al., 2004; DUJAK et al., 2010; RODRIGUES, 2011).

4.4 Metabólitos secundários em Asteraceae

Historicamente, as plantas produzem compostos que são essenciais para sua sobrevivência, estes são divididos em metabólitos primários e secundários. Os metabólitos primários, por definição, são moléculas que se encontram em todas as células vegetais e são necessários para a vida da planta, são os açúcares simples, aminoácidos, proteínas e os ácidos

nucleicos (RAVEN et al., 2010). Os metabólitos secundários, ao contrário, são restritos em sua distribuição, tanto dentro da planta quanto entre famílias, gêneros ou espécies. Estes compostos especiais possuem várias vias metabólicas que dão origem a diversos compostos como alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos, entre outros (CASTRO et al., 2004). As funções que os metabólitos secundários desempenham no organismo vegetal ainda não estão totalmente elucidadas, porém, estudos revelam que esses compostos são os responsáveis pelos efeitos medicinais ou tóxicos das plantas e apresentam grande importância ecológica, uma vez que podem atuar na atração de polinizadores, ou representar uma defesa química contra estresse ambiental funcionando como mediadores de interações ecológicas garantindo a sobrevivência em ambientes de alta competitividade (TAIZ & ZEIGER, 2009). Em Asteraceae, os principais produtos do metabolismo secundário são poliacetilenos, sesquiterpenóides, diterpenóides, triterpenóides, flavonóides, cumarinas, benzofuranos e benzopiranos (EMERENCIANO et al., 1998; BOLINA et al., 2009). Os óleos essenciais ou óleos voláteis são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. A composição química destes óleos essenciais pode variar amplamente desde hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com nitrogênio e exofre (SIMÕES & SPITZER, 2002). Toda essa diversidade funcional, no entanto pode ser agrupada em duas séries principais: a série aromática e a serie terpênica. Na série aromática são classificados como derivados do ácido cinâmico, oriundos do metabolismo do ácido chiquimico. Os derivados mais comuns em óleos essenciais são as cumarinas e alguns aldeídos aromáticos (SIMÕES & SPITZER, 2002). Na série terpênica, quantitativamente a mais numerosa e qualitativamente a mais variada encontram-se os terpenos. Os terpenos são sintetizados a partir do ácido mevalônico (no citoplasma) ou do piruvato e 3-fosfoglicerato (no cloroplasto). Os terpenóides são classificados de acordo com o número de unidades de isopreno (C5): monoterpenos, formados por duas unidades de isopreno (C10), sesquiterpenos, formados por três unidades de isopreno (C15) e diterpenos, formados por quatro unidades de isopreno (C20) que formam moléculas maiores e bem menos voláteis (TAIZ & ZEIGER, 2009). Os óleos essenciais têm papel na atração de agentes polinizadores, na defesa contra herbívoros e patógenos, como reguladores da taxa de decomposição da matéria orgânica no solo e como agentes antimicrobianos. Industrialmente, podem ser utilizados como antioxidantes ou aromatizantes dos alimentos e na indústria de cosméticos e perfumaria (CASTRO et al., 2004).

Os compostos fenólicos presentes nos óleos essenciais estão entre as mais difundidas classes de metabólitos secundários, sendo conhecidos pela sua grande importância no sistema solo-planta, além disto, estudos relacionam esses compostos com estresse metabólico, parede celular, na proteção contra pragas e doenças e ação alelopática sendo componentes estruturais e funcionais da matéria orgânica do solo (CASTRO et al., 2004). Os óleos essenciais são raramente encontrados em gimnospermas (exceção das coníferas). Em monocotiledôneas a ocorrência é rara com exceção de Poaceae e Zingiberaceae. No entanto, espécies ricas em óleos essenciais são abundantes em eudicotiledôneas, tais como em Asteraceae, Apiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Myristaceae, Piperaceae, Rutaceae, entre outras (SIMÕES & SPITZER, 2002). A grande maioria das lactonas sesquiterpênicas ocorre em Asteraceae (exceto a tribo Tagetae), sendo componentes característicos da família. Diferenças estruturais das lactonas sesquiterpênicas têm sido utilizadas em estudos quimiotaxonômicos em diferentes gêneros e espécies desta família (PICMAN, 1986; EMERENCIANO et al., 1987; DA COSTA et al., 2005). A relação de lactonas sesquiterpênicas com tricomas glandulares foi evidenciada por Spring et al. (1991), ao qual verificou-se a presença de vinte e quatro tipos de lactonas sesquiterpênicas e quatro benzofuranos isoladas a partir de tricomas glandulares da superfície foliar e partes da inflorescência de três espécies de Pappobolus sp. Em Helianthus annuus L. também foi verificada a presença tricomas glandulares contendo seis tipos de lactonas sesquiterpênicas (SPRING et al., 1989). Os compostos secundários de Asteraceae variam em suas atividades biológicas e farmacológicas conferindo a esta família um status importante no que se refere à procura de compostos bioativos. Os efeitos terapêuticos obtidos com os óleos essenciais são dependentes dos compostos predominantes, como a ação anti-séptica em bactérias, fungos e leveduras, sedativa, digestiva e expectorante (CUNHA et al., 2003). O estudo das lactonas sesquiterpênicas presentes em óleos essenciais tem recebido mais atenção nos últimos tempos devido ao seu potencial biológico com fins terapêuticos como propriedade antibacteriana, antifúngica, antiplasmódica e citotóxica (NEERMAN, 2003). Em Baccharis dracunculifolia D.C. e B. uncinella D.C. os óleos essenciais produzidos apresentam atividade antimicrobiana sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (FERRONATTO et al., 2007), Melampodium divaricatum Rich D.C. sobre as espécies Gram-positivas Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (PELISSARI et al,. 2010), e por fim quatro espécies de Tagetes L. possuem propriedade inseticidas sobre Ceratitis capitata e Triatoma infestans (LOPÉZ et al., 2011).

Uma característica química importante de Eupatorieae é a presença de benzofuranos em seus óleos essenciais, estes são responsáveis por muitas das espécies desta tribo serem venenosas. Além disto, várias espécies destacam-se por serem importantes economicamente como: Ageratum fastigiatum (Gardner) R.M.King & H.Rob utilizadas como cicatrizante, analgésico e anti-inflamatório (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2008), Eupatorium cannabinum L. usada no tratamento de úlceras; espécies de Mikania usadas no tratamento de mordidas de serpentes; óleos essenciais de Trilisa odoratissima (J.F.Gmel.) Cass como agente fixador em perfumes e o uso das folhas secas para adicionar sabor ao tabaco; Koanophyllon tinctorium Arruda e K. albicaule (Sch. Bip. ex Klatt) R. M. King & H. Rob. como corantes e Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni como adoçante (KING & ROBINSON, 1987). No que concerne o perfil fitoquímico de Trichogonia, Bohlmann et al. (1981), encontraram em cinco espécies: (Trichogonia grazielae R.M.King & H.Rob, T. pracci G. M. Barroso, T. salviaefolia Gardner, T. scottmorii R.M.King & H.Rob e T. viilosa (Spreng.) Sch.Bip. ex Baker) sesquiterpenos lactonas, derivados da acetofenoma, esteróides e triterpenos.

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CAPÌTULO 1

MORFOANATOMIA, CARACTERIZAÇÃO E ONTOGENIA DOS TRICOMAS GLANDULARES DE Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE-EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREAS DE CERRADO RUPESTRE

RESUMO

O Cerrado Rupestre é um subtipo de vegetação arbóreo-arbustiva que ocorre em ambientes rupestres e rochosos. Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob pertence à Asteraceae e a tribo Eupatorieae. Com o intuito de ampliar os conhecimentos sobre a sua anatomia, bem como identificar e caracterizar os principais eventos ontogenéticos dos tricomas glandulares, amostras foram coletadas na Reserva Biológica da Universidade Federal de Goiás “Prof. José Ângelo Rizzo”, situada no Parque Estadual da Serra Dourada (PESD). Foram utilizadas folhas completamente expandidas, entre-nós, ápices caulinares, flores e brácteas involucrais. Amostras de folhas foram diafanizadas e submetidas a cortes transversais na região do terço médio, ápice e base. Os entre-nós foram submetidos a cortes transversais e longitudinais e os ápices caulinares foram incluídos em parafina e submetidos a cortes longitudinais. Para caracterização dos tricomas glandulares foram realizadas também análises em microscopia de varredura. Além disto, foram realizados testes histoquímicos para detecção de classes de metabolitos primários e secundários secretados pelos mesmos. As folhas de T. eupatorioides são simples, lanceolada e peciolada, a nervação é peninérvea, com nervura principal pinada e secundária semibroquidódroma. As características anatômicas como folha anfiestomática, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas e periclinais externas espessas, feixes associados a fibras e envolvidos por endoderme com amido e estrias de Caspary, caule com contorno sinuoso, presença de tricomas (glandulares e tectores) e de ductos secretores registradas em T. eupatorioides estão de acordo com as encontradas para a família. Nesta análise foram identificados tricomas tectores pluricelulares com célula basal volumosa e célula apical afilada e tricomas glandulares unisseriados e bisseriados que secretam óleos essenciais compostos fenólicos. Os tricomas glandulares originam-se da expansão de células protodérmicas, que ao passarem por primeira divisão periclinal originará o tricoma unisseriado ou divisão anticlinal dando origem aos tricomas bisseriados.

Palavras chave: estruturas secretoras, histoquímica, anatomia vegetal.

1. INTRODUÇÃO

O Cerrado Rupestre é um subtipo de vegetação arbóreo-arbustiva que ocorre em ambientes rupestres e rochosos. A vegetação encontra-se nas fendas entre as rochas e a densidade arbórea é variável e depende do volume do solo. Os solos são os Neossolos Litolíticos que são originados da decomposição de arenitos e quartizitos, pobres em nutrientes e com baixos teores de matéria orgânica (RIBEIRO & WALTER, 2008). Dentre as famílias presentes na flora do Cerrado Rupestre destaca-se Asteraceae que é a maior família dentre as angiospermas com aproximadamente 24.000 espécies e mais de 1.600 gêneros possuindo distribuição cosmopolita. Estudos moleculares recentes reconhecem para a família 12 subfamílias e 43 tribos (FUNK et al., 2009). A Eupatorieae destaca-se sendo a mais rica em diversidade compreendendo 19 subtribos (ROBINSON et al., 2009), 170 gêneros e aproximadamente 2.400 espécies (JUDD et al., 2009). Estudos sobre a anatomia de Asteraceae revelam folhas anfiestomáticas com estômatos anomocíticos, células epidérmicas com paredes externas espessas e revestidas por cutícula delgada ou espessa, mesofilo compacto e presença de variados tipos de estruturas secretoras (METCALFE & CHALK, 1950; PYYKO, 1966; HANDRO et al., 1970; ALVES & NEVES, 2003; MILAN et al., 2006, FONSECA et al., 2006; MUSSURY et al., 2007; DUARTE & EMPINOTTI, 2012). Estas informações têm servido como base para estudos sobre taxonômicos, fisiologia ecológica e evolução. Dentre as estruturas secretoras relatadas para Asteraceae destacam-se os tricomas glandulares, que para esta família apresentam diversos tipos morfológicos, sendo o mais frequente o vesiculoso que possui cabeça bisseriada elipsoidal e pedúnculo curto (SOLEREDER, 1908). Estes podem se localizar em depressões na epiderme e por vezes, sua cabeça secretora pode conter células com cloroplastos (ASCENSÃO et al., 2001). Sua secreção pode conter diferentes compostos químicos, entre eles, terpenos presentes nos óleos essenciais e resinas, carboidratos, compostos fenólicos e alcalóides (AGUILERA et al., 2004; CORTADI & GATUSO, 1994; DELBON et al., 2012; DUJAK et al., 2010) que confere à família grande valor fitoquímico. Segundo Cutter (1986), a variada forma e tipos de tricomas entre as espécies é um importante dado podendo fomentar os estudos que envolvem as relações taxonômicas entre as famílias. Estes dados segundo Saha & Mukherjee (2012) têm maior valor como critério taxonômico se a informação for interpretada com outras linhas de evidência, obtidas a partir da morfologia, avaliação bioquímica e estudos moleculares.

Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob ainda é pouco conhecida sob ponto de vista botânico, possuindo origem nativa, endêmica do Brasil, ocorrente na região Nordeste (Ceará, Bahia), Centro-Oeste (Goiás), Sudeste (Minas Gerais), nos domínios fitogeográficos do Cerrado e da Caatinga (ROQUE, 2013). Segundo Roque et al., (2012) o nome Trichogonia refere-se à presença densa de tricomas no corpo vegetal A caracterização morfoanatômica dos órgãos vegetativos aéreos e dos tricomas glandulares, bem como a identificação dos metabólitos secundários sintetizados pela planta fornecem importantes dados para diferentes áreas de conhecimento como taxonomia, química e ecologia, e contribui para a conservação da espécie em áreas de Cerrado. Neste contexto o objetivo do trabalho foi descrever a morfoanatomia da folha e do caule de Trichogonia eupatorioides, enfatizando a caracterização dos tricomas glandulares e sua ontogenia, bem como investigar a natureza química dos produtos secretados.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção do material vegetal

O material vegetal foi coletado na Reserva Biológica da Universidade Federal de Goiás “Prof. José Ângelo Rizzo”, situada no Parque Estadual da Serra Dourada (PESD), que se localiza nos Municípios de Mossâmedes, Goiás e Buriti de Goiás. A altitude da Serra Dourada tem uma variação desde 726 a 900 m, onde se encontra o ponto mais alto da Serra, na formação de um “paredão” rochoso com 1080 m de altitude. As plantas utilizadas no presente estudo foram coletadas em regiões de solo arenoso nas seguintes coordenadas geográficas: S 09º 14.893’ W036º 25.836’, S 16 º04.613’ W 050º 11.318’, S 16º 04.640’ W 050 11.320’e S 16º 04.712’W 050º 11.481’. Para o estudo morfoanatômico e para a caracterização dos tricomas glandulares foram utilizadas plantas em estádio vegetativo e reprodutivo, coletadas entre os meses de abril de 2012 a junho de 2013. Para a realização dos testes histoquímicos, visando à identificação das principais classes de compostos primários e secundários produzidos pelos tricomas glandulares, foram utilizadas plantas em estádio vegetativo coletadas no meses de fevereiro a maio de 2013. Para o estudo ontogenético dos tricomas foram utilizados ápices caulinares de plantas jovens obtidas por germinação de sementes, coletadas no mês de maio de 2012 e maio de 2013. Para cada estudo foram utilizadas amostras de três indivíduos. A exsicata de Trichogonia eupatorioides foi depositada no herbário da UFG com número 3994.

2.2 Padronização, coleta e processamento das amostras

Foram utilizadas folhas completamente expandidas inseridas no 3º ao 5º nó (sentido ápice-base) das quais foram retiradas amostras da região mediana do pecíolo, e da lâmina foliar: terços apical, médio e basal (nervura central, internervura e bordo). Amostras do 2º ao 5º entrenós (sentido ápice-base), ápices caulinares, flores do disco e brácteas involucrais. Para os estudos histoquímicos dos tricomas amostras foliares e caulinares foram imediatamente processadas após a coleta. As demais amostras foram transportadas em embalagens plásticas até o laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Botânica do

Instituto de Ciências Biológicas da UFG, onde foram fixadas em FAA50 (formaldeído, ácido acético glacial, etanol 50%; 5:5:90 (v/v) (JOHANSEN, 1940) durante 48h e posteriormente armazenadas em etanol 70% para análise em microscopia óptica e fixadas em Karnovsky (KARNOVSKY, 1965 modificado) (glutaraldeído 2%, formaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH 7,2) por 48 horas e armazenadas em etanol 70% para posteriormente serem

desidratadas em soluções crescentes de etanol (30%, 50%, 70%, 80, 90% e 100%) para análise em microscopia eletrônica de varredura. As folhas foram utilizadas para a obtenção de cortes à mão livre, para diafanização, inclusão em historresina e análise em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os caules foram utilizados para a obtenção de cortes à mão livre, inclusão em historresina e análise em MEV. As flores e as brácteas involucrais inteiras foram utilizadas para montagem de lâminas a fresco com glicerina 50%, e microscopia eletrônica de varredura. Os ápices foram utilizados para a inclusão em parafina. Os ápices caulinares, destinados a ontogênese dos tricomas glandulares, foram coletados em plântulas obtidas através da germinação das sementes. As sementes foram germinadas em, em vaso de plástico contendo substrato coletado no local de ocorrência da planta com irrigação de aproximadamente três vezes na semana. No momento da coleta dos ápices, as plântulas estavam com aproximadamente 2,5-3 cm de altura. Os ápices coletados foram fixados em FAA50 por 24 horas e armazenados em etanol 70%. Este material, posteriormente, foi incluído em parafina.

2.2.1 Diafanização

Para descrever a morfologia foliar, a epiderme e os tricomas glandulares e foi realizado o processo de diafanização de amostras de folhas inteiras da região mediana das folhas. As amostras foram armazenadas em etanol 70% e posteriormente processadas seguindo procedimento adaptado de Johansen (1940): primeiramente foi adicionado a solução de NaOH 10% por 3h. Após lavagem em água destilada por três vezes, foi adicionada solução de hipoclorito de sódio a 5% até clarear e cloral hidratado (CCl3CHOH2O) 10% até o material ficar totalmente translúcido. O material foi lavado com água destilada por 5 vezes, submetido a safranina aquosa 0,1% (por aproximadamente 24h) e montado entre lâmina e lamínula em glicerina 50% ou passado em etanol/ acetato butílico (3:1; 1:1; 1:3), e acetato puro por 5 minutos cada e montados entre duas lâminas de vidro em resina Verniz Vitral incolor 500®, da marca Acrilex segundo Paiva et al., (2006).

2.2.2. Cortes a mão livre

Os cortes à mão livre foram clarificados com hipoclórito de sódio 5% (v/v), lavados em água destilada e submetidos à dupla coloração com fucsina básica 0,1% e azul de astra 0,3% - solução (1: 3) (ROESER, 1972 modificado). Posteriormente, os cortes foram montados, entre lâmina e lamínula, em glicerina (50%) ou desidratados em série alcoólica crescente (50%, 70%,

90% e 100%) e pós-desidratadas em álcool: xilol (3:1), álcool:xilol (1:1) álcool:xilol (1:3) e xilol puro segundo metodologia modificada de Johansen (1940) e montadas entre lâminas e lamínulas utilizando-se resina Verniz Vitral incolor 500®, da marca Acrilex (PAIVA et al., 2006).

2.2.3 Histoquímica

Para investigação das principais classes de metabólitos produzidos pelos tricomas presentes nas folhas e no caule, foram realizados cortes transversais de folha e caule recém coletados sem tratamento prévio, que posteriormente foram submetidos aos reagentes: lugol (JOHANSEN, 1940) para a detecção de amido; floroglucinol acidificado (JOHANSEN, 1940) para detecção de lignina nas paredes celulares; sudan IV (JOHANSEN, 1940), sudan III (JOHANSEN, 1940) e sudan Black B (JENSEN, 1962) para identificação de lipídios totais; sulfato ferroso (JOHANSEN, 1940), cloreto férrico (JOHANSEN, 1940), dicromato de potássio (GABE, 1968) para compostos fenólicos; Steinmetz conhecido com reagente universal, por possibilitar o reconhecimento simultâneo de amido, celulose, lignina, lipídeos diversos, látex, gomo-resinas; azul de bromofenol (MAZIA et al.,1953) e azul de comassie (FISHER, 1968) para proteínas; reagente de Dittmar (FURR & MAHBERG, 1981) para alcalóides e reagente de NADI (DAVID & CARDE, 1964) para óleo essencial.

2.2.4 Microscopia eletrônica de varredura

Fragmentos previamente desidratados em série crescente de etanol (30%, 50%, 70%, 80, 90% e 100%) 15 minutos cada, posteriormente foram levados ao dessecador utilizando ponto crítico de CO2 líquido e em seguida procedeu-se a deposição de filmes de ouro no Denton Vacuum. A análise das amostras foi realizada em Microscópio Eletrônico de Varredura (Jeol, JSM – 610, equipado com EDS e Thermo scientific NSS Spectral Imaging), operado a 4 Kv, instalado no Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LABMIC) no Instituto de Física/UFG.

2.2.5 Historresina

Para inclusão em historresina o material foi desidratado em série etílica gradual (70%, 80%, 90% e 100%), e mantido por 3 dias em solução de pré-infiltração e por 7 dias em solução de infiltração. Após este procedimento as amostras foram infiltradas em hidroxietilmetacrilato (Jung's Historesin – marca Leica). Posteriormente foram montados blocos utilizando a solução endurecedora, conforme instruções do fabricante. Os blocos, contendo o material, foram seccionados com 10 μm de espessura, em micrótomo de rotação Leica RM2245. As secções 39

foram distendidas sobre lâminas contendo água morna (42 oC). Depois da secagem das lâminas, o material foi submetido ao azul de toluidina (O’BRIEN et al., 1964) e montado com Verniz Vitral incolor 500®, da marca Acrilex (PAIVA et al., 2006).

2.2.6 Inclusão em parafina

Os ápices caulinares foram incluídos em parafina utilizando metodologia adaptada de Johansen (1940). Primeiramente as amostras foram submetidas à desidratação em série etílica (50%, 70%, 80%, 95% e etanol absoluto), deixando 1 hora em cada concentração etílica. Em seguida, as amostras foram submetidas a etanol/xilol (1:3, 1:1 e 3:1) e xilol absoluto por i 1 hora. Posteriormente foi adicionada parafina líquida sobre o material com xilol, na proporção de 1:1, deixando repousar por 24 horas mantendo-se na estufa a 60° C. Após esse período foi desprezada a solução xilol: parafina e foi adicionada apenas parafina líquida para completa infiltração, mantendo as amostras na estufa por 2 horas, quando a amostra permaneceu depositada no fundo do recipiente. A parafina foi então desprezada e adicionou-se uma nova solução de parafina deixando na estufa por mais 1 hora. Em seguida, o material foi emblocado em mistura de 70g de parafina e 30g de paraplast e esperou-se esfriar em recipiente com água gelada e gelo. O bloco foi então aparado e seccionado em micrótomo de rotação Leica RM2245 com espessura de 12 μm. Os cortes foram colocados na lâmina previamente preparada com adesivo Haupt (HAUPT, 1930) e distendidos em placa aquecedora. Posteriormente, o material foi desparafinizado e submetido à hematoxilina férrica (SASS, 1951), e dupla coloração de fucsina básica 0,1% e azul de astra 0,3% - solução (1: 3) (ROESER, 1972 modificado). A lâmina foi montada com Verniz Vitral incolor 500®, da marca Acrilex (PAIVA et al., 2006).

2.3 Documentação fotográfica

As fotomicrografias das estruturas analisadas em microscopia óptica foram realizadas em fotomicroscópio Leica DM500 com câmera ICC50 acoplada, com auxílio do Programa para aquisição de imagens LAZ EZ. O registro dos resultados obtidos em microscopia eletrônica de varredura foi realizado através do Microscópio Eletrônico de Varredura (Jeol, JSM – 610, equipado com EDS e Thermo scientific NSS Spectral Imaging).

3. RESULTADOS

Trichogonia eupatorioides é um subarbusto ereto, 60 - 120 cm de altura (Figura 1A-C), com folhas são alternas, lanceoladas e pubescentes em ambas as faces. Os capítulos são discóides (Figura 1D-E), contendo flores que possuem a corola róseo-lilás (Figura 1D-F) e brácteas involucrais seriadas glabra na face interna (Figura 1H) e pilosa na face externa (Figura 1G). As cipselas são cilíndricas com dois mm de comprimento e pápus ausente (Figura 1F). A espécie foi encontrada em ambiente de solo arenoso entre afloramentos de rochas, característicos de Cerrado Rupestre (Figura 1A, 1C).

3.1 Morfologia foliar

As folhas de T. eupatorioides são pecioladas cuja base é alargada com inserção marginal na lâmina (Figura 2A-B). São simples e inteiras (Figura 2A) e de textura pubescente. A filotaxia é alternada. A lâmina tem formato lanceolado (Figura 2A) e o seu tamanho variou de 6-10 cm de comprimento e 1-1,5 cm de largura. A margem é crenada com espaçamentos irregulares entre os dentes (Figura 2A, 2C-D). O ápice é agudo com formato reto (Figura 2C), já a base varia de aguda a atenuada com formato decurrente no qual o tecido foliar diminui gradativamente até o pecíolo (Figura 2E). A nervação é peninérvea com nervura principal pinada e nervura secundária semibroquidódroma (Figura 2A). Nervuras agróficas e perimarginais ausentes. Os espaços entre as nervuras secundárias de maior calibre aumentam abruptamente no sentido ápice-base (Figura 2A). O ângulo do primeiro par de secundárias é agudo em relação às demais no sentido base- ápice (Figura 2A). As nervuras terciárias intercostais são percurrentes opostas, pois variam o curso da curvatura em algumas regiões (Figura 2F). Nervuras terciárias epimediais são percurrentes alternadas com curso admedial perpendicular a nervura mediana, e percurso exmedial paralelo à nervura terciária intercostal (Figura 2F). O percurso da nervura terciaria exterior formam arcos de tamanhos e formas variadas (Figura 2G). As nervuras quaternárias formam um arranjo reticulado regular (Figura 2G), e, portanto não foi possível identificar as nervuras quinternárias. A areolação mostrou-se moderadamente desenvolvida e as F.E.V.s (últimas veias livres) são ramificadas somente uma vez (Figura 2H).

3.2 Anatomia foliar

3.2.1 Lâmina foliar

A lâmina foliar é densamente pilosa, com tricomas tectores (Figura 3A-B) e glandulares (Figura 3C-D) em ambas as faces. Os estômatos ocorrem nas faces adaxial e abaxial e são 41

recobertos por cutícula estriada (Figura 3E-F). No material diafanizado foi possível observar que os estômatos são, predominantemente, anomocíticos e raros anisocíticos e que as células epidérmicas possuem paredes anticlinais onduladas na face adaxial (Figura 3G) e sinuosas na face abaxial (Figura 3H). Em corte transversal da região mediana foi possível observar que a epiderme é uniestratificada (Figura 4A) e que suas células possuem as paredes periclinais externas espessas (Figura 4B) e são recobertas por cutícula delgada, visualizada com o reagente sudam III (Figura 4C). As células epidérmicas da face adaxial são maiores e volumosas e alongadas no sentido periclinal e as da face abaxial são menores e arredondadas (Figura 4A). Os estômatos situam-se levemente acima do nível das demais células epidérmicas em ambas as faces da lâmina foliar (Figura 4A, 4D), e suas células-guarda possuem grãos de amido evidenciados com o reagente lugol (Figura 4E). O mesofilo é compacto e tem organização dorsiventral (Figura 4A). O parênquima paliçádico é constituído por uma camada de células alongadas anticlinalmente que possuem o formato semelhante às letras X, H ou Y (Figura 4A-B) e parênquima esponjoso com 3-4 camadas de células (Figura 4A, 4D). Câmaras subestomáticas interrompem tanto o parênquima paliçádico, quanto o esponjoso (Figura 4A, 4D). Feixes vasculares de menor calibre circundados por endoderme são observados espaçadamente no mesofilo (Figura 4A). O bordo possui contorno arredondado e fletido para a face abaxial e as células epidérmicas apresentam-se mais alongadas no sentido periclinal. Na porção distal do bordo as células parenquimáticas exibem aspecto arredondado lobado com células do parênquima clorofiliano que formam um estrato elíptico que acompanha a curvatura do bordo (Figura 4F). A nervura central, em secção transversal, exibe contorno biconvexo com arco abaxial mais proeminente (Figura 5A). As células da epiderme nesta região possuem paredes periclinais externas e internas espessadas tanto na face adaxial (Figura 5B) quanto na abaxial (Figura 5C-D) recobertas por cutícula delgada e estriada (Figura 5D). Estômatos com células-guardas e subsidiárias elevadas são observados na região em que o parênquima clorofiliano acompanha parcialmente a nervura (Figura 5E). O colênquima é do tipo angular e compõe-se 2-3 camadas de células na face adaxial (Figura 5B) e 3-4 na face abaxial (Figura 5C). Adjacente a este ocorrem 4-5 camadas de células de parenquimática cortical de formato isodiamétrico e tamanhos variados (Figura 5C). Gotas lipofílicas foram visualizadas no parênquima cortical e colenquima com o auxílio do reagente Steinmetz (figura 5F). Os feixes vasculares são colaterais, com presença de câmbio e de fibras em diferenciação localizados externamente ao floema (Figura 5G). Estes são

circundados por endoderme (Figura 5G) contendo grãos de amido, também evidenciados nas células do parênquima fundamental (Figura 5H). A região apical da lâmina foliar (Figura 6A-B), assemelha-se a região mediana, ao que se refere às células epidérmicas com paredes periclinais externas espessadas em ambas as faces (Figura 6B-D), ao mesofilo dorsiventral compacto com células do parênquima paliçádico com formato semelhante às letras X, Y ou H (Figura 6C); feixes vasculares dde pequeno calibre imersos espaçadamente no mesofilo (Figura 6B-C). Diferentemente da região mediana, a nervura central possui contorno côncavo-convexo (Figura 6B, 6D), e com menor diâmetro (Figura 6D). O bordo é arredondado e ligeiramente fletido para a face abaxial (Figura 6E). Na região basal (Figura 7A-B) a epiderme possui células com paredes periclinais externas e internas espessadas (Figura 7C-D) recobertas por cutícula delgada e estriada. O mesofilo é dorsiventral com uma camada de células de parênquima paliçádico (Figura 7C) e de 3-4 camadas de células de parênquima esponjoso. Os estômatos apresentam as células guardas e subsidiárias acima das demais células epidérmicas e câmaras subestomáticas que interrompem o parênquima clorofiliano (Figura 7D). A nervura central apresenta contorno plano-convexo (Figura 7A-B), sob a epiderme, ocorrem 2-3 camadas de células de colênquima angular (Figura 7E) interrompidas por quatro faixas contendo 3-4 camadas de células de parênquima clorofiliano (Figura 7B, 7F). O parênquima cortical apresenta células com formato isodiamétrico (Figura 7E). O sistema vascular é formado por 3-4 feixes vasculares colaterais, sendo o central mais desenvolvido (Figura 7B), circundados pela endoderme (Figura 7G). Fibras em difrenciação podem estar associadas externamente ao floema (Figura 7G). O bordo apresenta contorno arredondado fletido para a face abaxial. Na porção distal do bordo o parênquima clorofiliano acompanha a curvatura (Figura 7H).

3.2.2 Pecíolo

O pecíolo apresenta contorno côncavo-convexo (Figura 8A). A epiderme é uniestratificada e suas células possuem paredes periclinais externas e internas espessas (Figura 8B), recobertas por cutícula delgada e estriada, e alta densidade de tricomas tectores e glandulares (Figura 8A, 8C). Estômatos cujas células-guardas e subsidiárias estão acima do nível das células epidérmicas também são observadas (Figura 8C). Sob a epiderme ocorrem 3-4 camadas de células colênquimáticas, em toda extensão do pecíolo, do tipo angular (Figura 8B) interrompidas nas regiões da câmara subestomática. Faixas com aproximadamente 3-4 camadas de células de parênquima clorofiliano (Figura 8D) interrompem o colênquima angular (Figura 8E). O parênquima cortical é formado por células de diferentes tamanhos e paredes ligeiramente

espessadas (Figura 8B). O sistema vascular possui de 3-5 feixes colaterais (Figura 8A) são circundados cada um pela endoderme (Figura 8F). Podem ser observadas fibras associadas ao floema (Figura 8F).

3.3 Anatomia caulinar

O caule exibe em secção transversal, contorno sinuoso, com arcos convexos arredondados e depressões semelhantes a sulcos (Figura 9A-B) e região medular bem desenvolvida em relação à região cortical (Figura 9A-B). Na região do 1º entrenó, a epiderme com células ainda em diferenciação, é uniestratificada (Figura 9C) e está recoberta por cutícula delgada e estriada (Figura 9D). As células epidérmicas na região do 2º entrenó possuem as paredes periclinais externas e internas espessadas (figura 9D). Tricomas tectores, tricomas glandulares e estômatos ocorrem em alta densidade (Figura 9A-C). O córtex na região dos arcos possui 4-5 camadas de células de colênquima do tipo angular (Figura 9E), e na região das depressões, faixas de 3-4 camadas de células de parênquima clorofiliano (Figura 9C, 9E) que acumula grãos de amido (Figura 9F) sendo interrompido por câmaras subestomáticas. A endoderme contém grãos de amido (Figura 9F) que circunda o sistema vascular do tipo eustélico (Figura 9A-B). Os feixes vasculares são colaterais e são acompanhados por calotas de fibras em diferenciação localizadas externamente ao floema (Figura 9E). Células procambiais ocorrem entre o protofloema e o protoxilema e metaxilema (Figura 9E). Os ductos secretores estão localizados entre os feixes (Figura 9G) e podem estar ou não associados à endoderme, possuem uma camada de células epiteliais e lúmen moderadamente desenvolvido (Figura 9G). A medula é formada por células parenquimáticas isodiamétricas de tamanhos variados que ocupam grande volume caulinar (Figura 9B). Em corte longitudinal as células do córtex, cilindro vascular e medula apresentam-se alongadas dificultando a visualização do ducto secretor (Figura 9H). No 5° entrenó, o caule apresenta características de crescimento secundário no cilindro vascular (Figura 10A). Nesta fase de crescimento a epiderme é persistente e suas células possuem as paredes periclinais externas e internas espessadas (Figura 10B) e estômatos com células-guardas e subsidiárias acima das demais células epidérmicas (Figura 10C-D). Tricomas glandulares e tectores são visualizados em abundância. O córtex é reduzido com células achatadas em função do crescimento secundário, com 4-5 camadas de células de colênquima angular e 3-4 camadas de células de parênquima cortical preenchendo os arcos (Figura 10A), e faixas de 3-4 camadas de células de parênquima clorofiliano nas depressões (Figura 10A-C). A endoderme apresenta estrias de Caspary (Figura 10C, 10E). O sistema vascular ocupa a maior

porção do caule sendo formado por uma menor quantidade de floema secundário e maior de xilema secundário que possui elementos de vasos agrupados em dois ou três (Figura 10A) que são separados pelo câmbio (Figura 10A, 10C). Calotas de fibras com as paredes lignificadas e lúmen reduzido localizam-se externamente ao floema (Figura 10A, 10C). Os ductos secretores ficam com aspecto “achatado” nas regiões entre as calotas de fibras (Figura 10F), dificultando a sua identificação e caracterização. A medula apresenta-se reduzida com células parenquimáticas isodiamétricas (Figura 10G).

3.4 Caracterização dos tricomas

3.4.1. Tipos e ocorrência

A análise de secções transversais de folha, do caule, da bráctea involucral e da flor (Figura 11, 12 e 13) permitiu a identificação de tricomas glandulares classificados, no presente trabalho, em três tipos: • Tipo I– Bisseriado curto, com pedúnculo composto por duas células e cabeça com 6 células (Figura 11A, 12A). • Tipo II– Bisseriado longo com número variável de células cuja base é composta por duas células, pedúnculo com células em que os pares não estão no mesmo nível de altura com 4- 10 células, cabeça com 8 células (Figura 11B, 12B). • Tipo III – Unisseriado pluricelular recurvado sobre a epiderme com número variável de células no pedúnculo (4- 6) e cabeça unicelular (Figura 11C, 12C). Além dos tricomas glandulares observou-se ainda a presença densa de tricomas tectores nas folhas, caule, flores e brácteas (Figura 11D, 12D-F, 13D, 13F). Estes são unisseriados com número variável de células (2-5), base com células volumosas e célula apical afilada (Figura 13F). O tricoma glandular tipo I possui grande espaço subcuticular (Fig. 11A e 12A) indicando o local de armazenamento do material secretado. Nos demais tricomas não se observou o espaço subcuticular. Em ambas as faces da lâmina foliar (Figura 12A-E), e no caule (Figura 12F) foram encontrados todos os tipos de tricomas sendo que o tipo I situa-se em pequenas depressões na epiderme. Nas flores (Figura 13A-C) somente tricomas do tipo I e II foram encontrados sendo o tipo II encontrado em maior quantidade (Figura 13B-C), e no ovário somente o tricoma glandular tipo I foi observado (Figura 13C). Nas brácteas involucrais (Figura 13D-E) ocorrem todos os tipos de tricomas glandulares, além de tricoma tector. Na base do ovário e no ápice das pétalas ocorrem também tricomas tectores (Figura 13B). 45

3.4.2. Histoquímica dos tricomas glandulares

Os secretados dos tricomas glandulares de Trichogonia eupatorioides possuem, in natura, coloração amarela. As células secretoras possuem cloroplastos (Figura 14A-C). Os testes histoquímicos com sudan IV e sudam III revelaram lipídios totais no espaço subcuticular do tricoma tipo I (Figura 14D) e nas células pedunculares e da cabeça dos tricomas tipo II e III (Figura 14E-F). Compostos fenólicos foram evidenciados nos três tipos de tricomas glandulares com sulfato ferroso (Fig. 14G-I), no tricoma tipo I com cloreto férrico (Figura 14J) e nos três tipos com dicromato de potássio (Fig. 14L-O). Com o reagente de NADI foi confirmada a presença de óleo essencial na forma de gotículas de coloração azul escuro no espaço subcuticular do tipo I (Figura 14P), nas células da cabeça do tipo II (Figura 14Q) e no pedúnculo e cabeça do tipo III (Figura 14R-S).

3.4.3 Ontogenia dos tricomas glandulares

Na planta jovem de T. eupatorioides os tricomas glandulares e tectores já estão presentes no hipocótilo, epicótilo (Figura 15A) e nos cotilédones (Figura 15A-D). No ápice caulinar foi possível observar tricomas glandulares em vários estádios de desenvolvimento (Figura 16A). Entretanto, a primeira etapa de diferenciação é comum aos três tipos: expansão de uma célula protodérmica. No tricoma glandular tipo I a célula protodérmica, após expandir-se e ganhar volume (Figura 16B) dividir-se anticlinalmente, dando origem a duas células (Figura 16C). Estas se expandem acropetamente e sincronizadamente e passam por sucessivas divisões periclinais, assumido a característica bisseriada com os pares de células paralelos (Figura 16D-E). No tricoma tipo III a célula protodérmica se expande recurvadamente (Figura 16F) e, posteriormente, ocorrem sucessivas divisões periclinais (Figura 16G-I). A diferenciação do tricoma glandular tipo II inicia-se com uma célula protodérmica expandida, volumosa e de conteúdo denso (Figura 17A). Esta célula divide-se anticlinalmente dando origem a duas células (Figura17B) que posteriormente dividem-se periclinalmente (Figura 17C). A partir destas, seguem-se sucessivas divisões periclinais que não são sincronizadas (Figura 17D-F). Nesta epata é possível observar células em várias fases da divisão celular (Figura 17E). Assim na fase final de diferenciação o tricoma bisseriado não terá seus pares no mesmo nível de altura (Figura 17G).

FIGURA 1: Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob em estágio vegetativo e reprodutivo. A-B: Aspecto da planta em estádio vegetativo e reprodutivo, respectivamente. C: Detalhe das inflorescências de coloração róseo-lilás e do solo arenoso em que crescem as plantas. D-E: Detalhe do capítulo discóide, com flores e brácteas involucrais seriadas. F: Detalhe da flor com a cipsela cilíndrica e papus ausente. G-H: Detalhe das brácteas involucrais glabras na face interna e densamene pilosas na face externa, respectivamente. 47

Fonte: Yanne S. F.

FIGURA 2: Aspectos da morfologia e venação foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral da folha com formato lanceolado, com pecíolo, nervação peninérvea camptódroma do tipo semibroquidódroma, nervura primária (1ª), nervura secundária (2ª) e nervura terciária (3ª). B: Detalhe do pecíolo com a base alagarda (seta). C: Detalhe do ápice agudo. D: Margem crenada com espaçamentos irregulares entre os dentes (setas). E: Detalhe da base foliar, ao qual o tecido foliar diminui gradativamente no sentido ápice-base. F: Nervura terciária intercostal percurrente oposta (seta preta), nervura terciária admedial (ad) e exmedial (ex). G: Detalhe das nervuras terciárias exteriores (3ª ext) na margem formando arcos. H: Nervuras quaternárias (4ª) formam um arranjo reticulado, a areolação (are) é moderadamente desenvolvida e F.E.V.s ramificadas somente uma vez.

FIGURA 3: Epiderme da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob em Microscopia Eletrônica de Varredura (A-F) e Microscopia Óptica (G-H). A- B: Aspecto geral das faces adaxial e abaxial lâmina foliar respectivamente. C: Detalhe da face adaxial da epiderme com tricomas glandulares (tg) e estômatos (seta). D: Detalhe da face abaxial da epiderme com tricomas glandulares (tg), tricomas tectores (tt) e estômatos (seta). E: Detalhe de estômatos (setas) com células guardas e subsidiárias acima do nível das demais células epidérmicas na face abaxial. F: Detalhe de um estômato com cutícula estriada (seta) na face abaxial. G: Vista frontal da face adaxial com células epidérmicas de paredes anticlinais onduladas (seta branca) e estômato anisocítico (seta preta). H. Vista frontal da face abaxial com células epidérmicas de paredes anticlinais sinuosas (seta branca) e estômatos anomocíticos (seta preta). 51

FIGURA 4: Cortes transversais da região internervura do terço médio da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral da região internervura evidenciando a epiderme uniestratificada com células de paredes periclinais externas espessas (seta preta), mesofilo dorsiventral e feixes vasculares de pequeno calibre circundados por endoderme (seta branca). B. Detalhe das células epidérmicas da face adaxial alongadas no sentido periclinal e com paredes periclinais externas espessas (seta), células de parênquima paliçádico com formato da letra “H” (estrela). C: Cutícula delgada recobrindo a epiderme evidenciada com sudam III (seta). D: Detalhe de estômatos com células-guardas e subsidiárias acima das demais células epidérmicas na face abaxial (seta) e ampla câmara subestomática interrompendo o parênquima esponjoso (estrela). E: Detalhe das células-guardas contendo grãos de amido evidenciados com lugol (seta). F: Bordo com contorno arredondado e fletido para face abaxial. 53

FIGURA 5: Cortes transversais da região mediana do terço médio da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral da nervura central com contorno biconvexo. B: Face adaxial com células epidérmicas com paredes periclinais externas e internas espessadas (setas) e colênquima angular (ca). C: Face abaxial com células epidérmicas com paredes periclinais externas e internas espessadas (seta), colênquima angular (ca) e parênquima cortical (pco). D: Detalhe da epiderme recoberta por cutícula delgada e estriada evidenciada com sudan III (seta) e das células de colênquima angular (ca) na face abaxial. E: Detalhe do estômato (seta) acima das demais células epidérmicas com câmara subestomática (estrela) e parênquima clorofiliano (pc) acompanhando parcialmente a nervura na face abaxial. F: Gotas lipofílicas no parênquima fundamental (seta) evidenciados com Steinmetz. G: Feixe vascular colateral circundado pela endoderme (en) com fibras em diferenciação (fi) associadas ao floema (fl), xilema (xi), e câmbio (cv). H: Detalhe da endoderme contendo grãos de amido (seta) evidenciados com lugol. 55

FIGURA 6: Cortes transversais da região apical da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral da lâmina foliar evidenciando a nervura primária (1ª), as secundárias (2ª). B: Detalhe da nervura central e dos feixes vasculares de menor calibre (setas). C: Células epidérmicas com células de paredes periclinais externas espessas (seta), mesofilo compactado com parênquima paliçádico (pp) e parênquima esponjoso (pe) e feixes vasculares de pequeno calibre circundados por endoderme (ponta de seta). D: Detalhe da nervura central com contorno côncavo-convexo, faixas de parênquima clorofiliano (pc) acompanhando grande porção da nervura, parênquima cortical (pco) e feixe vascular (fv) reduzido circundado por endoderme (em). E: Bordo com contorno arredondado e ligeiramente fletido para a face abaxial. 57

FIGURA 7: Cortes transversais da região basal da lâmina foliar de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geralda lâmina foliar. B: Nervura central com contorno plano-convexo, três feixes vasculares colaterais (setas) circundados por endoderme. C: Detalhe das células epidérmicas com paredes periclinais externas espessas (seta) e mesofilo compacto com parênquima paliçádico (pp) e parênquima esponjoso (pe). D: Detalhe de um estômato com células-guardas e subsidiárias acima das demais células epidérmicas. E: Detalhe do colênquima angular (Ca) e do parênquima cortical (pco). F: faixas de parênquima clorofiliano (pc) sob a epiderme interrompendo o colênquima angular. G: Detalhe do feixe vascular colateral central evidenciando o câmbio (cv) e fibras em diferenciação (fi) associadas ao floema (fl) que é circundado por endoderme (en). H: Bordo arredondado ligeiramente fletido para a face abaxial. 59

FIGURA 8: Cortes transversais do pecíolo de Trichogonia eupatorioides. A: Aspecto geral do pecíolo com contorno côncavo-convexo. B: Detalhe das células epidérmicas com paredes periclinais externas e internas espessas (setas), colênquima angular (ca) e parênquima cortical (pco). C: Estômato com as células-guardas e subsidiárias acima das células epidérmicas (seta), câmara subestomática (estrela) e tricomas glandulares (tg). D: Colênquima angular (ca) interrompido por parênquima clorofiliano (pc). E: Faixas de parênquima clorofiliano (pc). F: feixe vascular colateral com xilema (xi) e floema (fl) separados pela câmbio (cv), e fibras (fi) associadas ao floema e circundada por endoderme (en). 61

FIGURA 9: Cortes transversais (A-G) e longitudinal (H) do caule na região dos 1º ao 3º entrenós de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A-B: Aspecto geral do 1º entrenó evidenciando o contorno sinuoso, arcos convexos arredondados e depressões semelhantes a sulcos, córtex (co) reduzido e medula (me) ampla. C: Epiderme com estômato em diferenciação (seta preta), tricomas glandulares (ponta de seta) e tectores (tt), parênquima clorofiliano (pc) nas depressões e ducto secretor (seta branca) entre os feixes vasculares na região do 1º entrenó. D: Detalhe da cutícula delgada e estriada (ponta de seta) e das células epidérmicas com paredes periclinais externas e internas espessadas (setas) na região do 2º e 3º entrenó. E: Colênquima angular (ca) na região dos arcos, feixe vascular circundados por endoderme (en), com protoxilema (pxi), metaxilema (mxi) e protofloema (pfl) separados por células procambiais (pr) e calotas de fibras (fi) com paredes ainda em diferenciação associada ao protofloema (pfl). F: Grãos de amido (seta) evidenciados com Lugol em toda a extensão da endoderme e no parênquima clorofiliano (estrela). G: Detalhe do ducto secretor (seta branca) associado à endoderme (en). H: Aspecto geral dos tecidos em corte longitudinal. 63

FIGURA 10: Cortes transversais do caule na região do 5° entrenós de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral do 5º entrenó evidenciando a epiderme, o córtex constituído por colênquima angular (ca), parênquima cortical (pco) e parênquima clorofiliano (pc), a endoderme (en), o floema secundário (fs), o câmbio (cv) e o xilema secundário (xs) e protoxilema (pxi). B: Epiderme unisseriada formada por células que possuem paredes periclinais externas e internas espessas (setas) recobertas por cutícula estriada. C: Estômatos localizados acima das demais células epidérmicas (pontas de setas), parênquima clorofiliano interrompido por câmaras subestomáticas (estrelas), endoderme com estrias de Caspary (seta), calotas de fibras (fi), floema (fs) e câmbio (cv). D: Detalhe de um estômato recoberto por cutícula estriada em microscopia eletrônica de varredura. E. Detalhe da endodeme com estrias de Caspary (setas). F. Ducto secretor com epitélio uniestratificado (seta). G: Medula parenquimática (me). 65

FIGURA 11: Tricomas glandulares (A-C) e tectores (D) de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Tricoma glandular do tipo I – Bisseriado curto com cutícula distendida formando amplo espaço subcuticular. B: Tricoma glandular do tipo II – Bisseriado longo com pares de células no pedúnculo em diferentes níveis de altura. C: Tricoma glandular do tipo III – Recurvado sobre a epiderme. D: Tricomas tectores nas brácteas involucrais (setas). 67

FIGURA 12: Microscopia eletrônica de varredura dos tricomas glandulares e tectores presentes na lâmina foliar (A-E) e no caule (F) de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Tricoma glandular do tipo I presente na face abaxial, com cutícula distendida. B: Tricomas glandulares do tipo II presentes na face abaxial (setas). C: Tricoma glandular do tipo III presente na face adaxial. D: Aspecto geral da face adaxial com ocorrência dos tricomas glandulares dos tipos I (seta preta), tipo II (seta branca) e tipo III (ponta de seta) e tectores (tt). E: Aspecto geral da face abaxial com presença densa de tricomas tectores. F: Aspecto geral do caule com presença dos tricomas tipo I (seta preta), tipo II (seta branca) e tipo III (cabeça de seta) e tectores (tt). 69

FIGURA 13: Microscopia eletrônica de varredura evidenciando os tipos e a ocorrência dos tricomas glandulares e tectores na flor (A-C) e bráctea involucral (D-F) de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral da flor com presença densa de tricomas nas pétalas e no ovário. B: Tricomas glandulares do tipo II na inserção das pétalas com o ovário (seta). C: Tricomas glandulares do tipo I com a cutícula rompida no ovário (setas). D: Aspecto geral da face externa das brácteas involucrais com presença densa de tricomas glandulares e tectores. E: Detalhe dos tricomas glandulares dos tipos I (seta preta), II (seta branca) e III (cabeça de seta) nas brácteas involucrais. F: Tricomas tectores (seta) nas brácteas involucrais. 71

FIGURA 14: Caracterização histoquímica do secretado dos tricomas glandulares de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A-C: Tricomas glandulares dos tipos I, II e III in natura, respectivamente com cloroplastos nas células secretoras. D-F: Coloração róseo-avermelhada evidenciando a presença de compostos lipofílicos na presença de Sudan III. G-I: Coloração verde-escuro evidenciando a secreção de compostos fenólicos na presença de sulfato ferroso. J: Coloração negra evidenciando a secreção de compostos fenólicos no tricoma do tipo I na presença do reagente cloreto férrico. L-O: Coloração castanho- avermelhada (setas) evidenciando a secreção de compostos fenólicos na presença de dicromato de potássio. P-S: Coloração azul (setas) evidenciando a secreção de óleos essenciais na presença do reagente de NADI.

FIGURA 15: Aspecto da região apical da planta jovem (A) e dos cotilédones (B-D) de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Hipocótilo (hip), epicótilo (epi) e cotilédones (cot) com alta densidade de tricomas. B: Cotilédone diafanizado observado em lupa. C. Tricoma glandular do tipo II (seta) observado em microscopia óptica. D. Tricoma tector observado em microscopia óptica. 75

FIGURA 16: Eventos ontogenéticos dos tricomas glandulares dos tipos I e III de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Aspecto geral do ápice caulinar, em secção longitudinal, com alta densidade de tricomas em diferenciação. B-E: Eventos do desenvolvimento do tricoma glandular tipo I. F-I: Eventos do desenvolvimento do tricoma glandular do tipo III. B: Célula protodérmica expandida (seta) com núcleo volumoso. C: Divisão anticlinal (seta) da célula expandida. D: Divisões periclinais (seta) sincronizadas. E: Tricoma bisseriado curto em fase final de diferenciação. F: Célula protodérmica expandida com núcleo volumoso (seta). G: Primeira divisão periclinal com as células já recurvadas (seta) H-I. Sucessivas divisões periclinais (setas). 77

FIGURA 17: Eventos ontogenéticos do tricoma glandular do tipo II de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob. A: Célula protodérmica volumosa, proeminente e de conteúdo denso (seta). B: Divisão anticlinal (seta) da célula protodérmica. C-F: Divisões periclinais (setas pretas) não sincronizadas. E: Células distais do tricoma em fases diferentes de diferenciação (seta). F: Tricoma com múltiplas divisões periclinais não sincronizadas. G: Tricoma em fase final de diferenciação.

4. DISCUSSÃO

A morfologia foliar de Trichogonia eupatorioides está de acordo com a descrição feita por Roque et al. (2012) para a espécie. A arquitetura foliar, incluindo o padrão de nervação, mostra-se como uma importante ferramenta no controle de qualidade necessário a comercialização de plantas com interesse medicinal, fornecendo dados para evitar adulterações (LOLIS & MILANEZE-GUTIERRE, 2003). T. eupatorioides apresenta características anatômicas típicas de Asteraceae e da tribo Eupatorieae, já descritas por Solereder (1908) e Metcalfe & Chalk (1950). Células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas foram descritas também para outras espécies de Asteraceae (ALVES & NEVES, 2003; MILAN et al., 2006 e ADEDEJI & JEWOOLA, 2008). Para Haberlandt (1928) a sinuosidade das paredes aumenta a rigidez das células evitando assim o colapso das mesmas em condições de escassez de água. Segundo Medri & Lleras (1980) a menor sinuosidade da parede celular está relacionada às estratégias adaptativas contra perda de água. Castro et al. (2007) ao analisarem folhas de Sprengel, cultivadas em diferentes níveis de sombreamento, observaram que as sinuosidades das paredes das células epidérmicas foram mais acentuadas nas folhas expostas a uma menor intensidade luminosa. Assim como em Mikania glomerata, em T. eupatorioides a maior sinuosidade das células epidérmicas é na face abaxial já que a face adaxial está sujeita a uma maior luminosidade. A variação sazonal é uma característica básica do clima do Cerrado (OLIVEIRA, 2008). O clima do Cerrado é caracterizado pela presença de uma estação seca que pode durar ate seis meses, nestas condições o solo tende a secar até a profundidade de 2 m, mas as camadas mais profundas mantêm-se úmidas durante o ano todo (FRANCO, 2002). Folhas anfiestomáticas com estômatos anomocíticos e anisocíticos com predominância do primeiro tipo é, segundo Metcalfe & Chalk (1950), um caráter comum na família e também foram observados para espécies de diferentes gêneros de Asteraceae como: Calea uniflora Less (BUDEL et al., 2006); Flourencia campestris Griseb. e F. oolepis S.F. Blake (DELBÓN et al., 2007); Elephantopus mollis Kunth (EMPINOTTI & DUARTE, 2008) Baccharis obovata Hook (MORALES et al., 2009) e Ageratum conyzoides L. (MILLANI et al., 2010). Folhas anfiestomáticas é uma característica vantajosa em ambientes sazonais como o Cerrado que apresenta déficit hídrico por longo período. Segundo Fahn (1990), permite maior eficiência na troca gasosa em um período curto de tempo evitando a perda de água por transpiração e aumentando a taxa fotossintética em períodos de estresse. Estômatos com células guardas e subsidiárias acima das demais células epidérmicas é uma característica pouco relatada para a família (SAJO & MENEZES, 1994). Entretanto, já foi 81

relatada para outras espécies de Asteraceae como Siegesbeckia orientalis L.(AGUILERA et al., 2004; Gochnatia barrosii Cabrera e Gochnatia polymorpha (Less.) Cabrera (ROSSATTO & KOLB, 2012). Estômatos com células elevadas são comuns em plantas aquática ou em plantas de ambientes úmidos (LARCHER, 2006), e em T. eupatorioides esta característica pode estar relacionada a condição de elevada umidade do solo e do ar no período chuvoso do Cerrado. A cutícula que recobre a folha e o caule de T. eupatorioides é delgada e recoberta por ceras epicuticulares estriadas. Resultados semelhantes foram encontrados em espécies de Vernonia Screb (SAJO & MENEZES, 1994), Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass (MILAN et al., 2006, FONSECA et al., 2006) e Achyrocline alata (Kunth) DC (MUSSURY et al., 2007). Handro et al. (1970) consideram que espessura da cutícula está relacionada com a proteção contra a perda excessiva de água. Segundo Paviani (1978) é comum em espécies de Cerrado encontrar plantas cuja epiderme apresenta a cutícula delgada, apesar de passarem por longo período de déficit hídrico. Para Heredia et al. (1998) a resistência da cutícula, em relação à perda d’água, está mais ligada a estrutura molecular e arranjo das ceras e composição química, para maior ou menor difusão de água, do que simplesmente da espessura. Em T. eupatorioides a espessura delgada da cutícula pode ser compensada pela paredes periclinais externas espessas das células epidérmicas, pela presença de estrias epiculticulares e pela grande quantidade de tricomas, que conferem proteção contra intensa luminosidade, perda de água e funcionam como suporte mecânico contra ação do vento (PYYKKO, 1966). As células braciformes ou com dobras verificadas no mesofilo também foram verificadas em Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. (DEL-VECHIO-VIEIRA et al.,2008). Para Apezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro (2003) as dobras das células do parênquima clorofiliano aumentam a superfície da célula, aumentando assim, a eficiência fotossintética. Características como nervura biconvexa, bordo com contorno arredondado e fletido para a face abaxial evidenciadas em T. eupatorioides também foram verificadas em outros estudos anatômicos com Asteraceae (ALVES & NEVES, 2003; BUDEL et al., 2003; AGUILERA et al., 2004; MILAN et al., 2006 e FONSECA et al., 2006; MUSSURY et al., 2007; DUARTE & EMPINOTTI, 2012). A endoderme amilífera que contorna os feixes vasculares nas nervuras centrais e nas de menor calibre também foi visualizado em várias espécies no estudo anatômico realizado por Smiljak (2005). O caule de T. eupatorioides possui endoderme com estrias de Caspary e grãos de amido, o que segundo Metcalfe & Chalk (1950) e Espinar (1973) é comum para a família e já foi observada em espécies de Bacharis como B. myriocephala Baker (SÁ & NEVES,1996), em B. crispa Spreng e B. trimera (Less.) DC. (CORTADI et al., 1999); em Ageratum fastigiatum

(DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2008) e em Elephantopus mollis (EMPINOTTI & DUARTE, 2008). Ductos secretores associados ou não a endoderme evidenciados em T. eupatorioides, também foram registrados em outras espécies de Asteraceae: Calea unifolia (BUDEL et al., 2006); Calea longifolia (DC.) Baker (FARAGO et al., 2006); Porofilum ruderale (FONSECA et al., 2006); Achilea mielifolium L.(GREGIO & MOSCHETA, 2006); Ageratum fastigiatum (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2008); e Tithonia diversifolia (Hemsl.) A.Gray (DUARTE & EMPINOTTI, 2012). Tricomas glandulares bisseriados são característicos da família Asteraceae (METCALFE & CHALK, 1950), podendo ser considerados um caráter conservativo (CASTRO et al., 1997; MONTEIRO et al., 2001). Os tricomas glandulares bisseriados curtos (vesiculosos) observados em T. eupatorioides são semelhantes ao já descrito em órgãos aéreos de outras espécies de Asteraceae como Artemisia campestris L. (ASCENSÃO & PAIS, 1987); Achillea millefolium (FIGUEIREDO & PAIS, 1994; GREGIO & MOSCHETA, 2006); Santolina leucantha Bertol (PAGNI, 1995); Helichrysum aureonitens Sch.Bip. (AFOLAYAN & MEYER, 1995); Helichrysum stoechas (L.) Moench (ASCENSÃO et al., 2001); Sigesbeckia jurollensis Kunth (HEINRICH et al., 2002); Flourensia campestris Griseb, F. niederleinii S.F. e F. tortuosa Griseb. (DELBÓN et al., 2012; 2012) e em Matricaria chamomilla L. (ANDREUCCI et al., 2008). Além destes, Appezzato-Da- Glória et al., (2008) descrevem a presença deste tipo de tricoma na epiderme do rizóforo de Orthopappus angustifolius Sw. Tricomas glandulares bisseriados longos também foram observados em espécies do gênero Ophryosporus Meyen (PLOS et al.,2011) e em diversas espécies da tribo Eupatorieae, assim como o unisseriado recurvado sobre a epiderme e cabeça globóide (CASTRO et al., 1997). A presença destes dois tipos de tricomas foi verificada apenas em espécies pertencentes à tribo Eupatorieae ao qual pertence T. eupatorioides. Os tricomas glandulares recurvados são, segundo Castro et al. (1997), característicos da tribo Eupatorieae e Heliantheae, mostrando uma possível afinidade entre essas tribos. De encontro com esta afirmação, Cortadi & Gatuso (1994) verificaram o mesmo tipo de tricoma em Eupatoruim macrocephalum Less., E. inulaefolium H.B.K. e E. subhastatum Hook et Arn, e Duarte & Empinotti, (2012) em Tithonia diversifolia pertencente a tribo Helianteae. Aos tricomas glandulares, bem como aos tectores são atribuídas diversas funções em comum, e existem evidências de que o indumento denso representa uma adaptação à baixa disponibilidade de água e altas temperaturas (BARROS & SOARES, 2013). T. eupatorioides

ocorre em regiões de clima quente e em locais arenosos, podendo o indumento desempenhar um papel relevante na economia de água e na proteção dos tecidos clorofilianos contra a intensa radiação e elevadas temperaturas. Isso se deve ao fato de que os tricomas diminuem a taxa de transpiração, tanto pelo aumento da reflexão da radiação solar, que reduz a temperatura, quanto pelo espessamento da camada de ar retido acima da folha, que funciona como uma barreira à perda de água (BARROS & SOARES, 2013). A diversidade morfológica favorece, provavelmente, a assimilação de CO2 em períodos desfavoráveis, com elevada temperatura e pouca água disponível (EHLERINGER et al., 1976). Em adição, Manetas (2003) verificou que os tricomas protegem os tecidos contra danos causados por raios UV-B. Além disto, ao eliminarem produtos do metabolismo secundário, constituem uma barreira química protetora que defende as plantas do ataque de herbívoros e agentes patogênicos (RODRIGUES, 2011). A interpretação dos resultados obtidos nos testes histoquímicos efetuados para a caracterização química do secretado dos tricomas glandulares da espécies em estudo mostra que os mesmos produzem óleo essencial que, além dos terpenos, pode conter compostos fenólicos. Este tipo de composição é comum para a família sendo verificada em Siegesbeckia orientalis (AGUILERA et al., 2004), Porophyllum ruderale (FONSECA et al., 2006), Helichrysum italicum L. (RODRIGUES, 2011). Os terpenos formam uma classe de compostos cuja principal característica é a volatilidade, facilmente perceptível nos aromas exalados pelas plantas (SIMÕES & SPITZER, 2002). Em Asteraceae os sesquiterpenos são, geralmente, os compostos majoritários dos óleos essenciais (NEERMAN, 2003). Os óleos essenciais podem exercer diversas funções na planta como atração de agentes polinizadores, de defesa contra herbívoros, como reguladores da taxa de decomposição da matéria orgânica no solo e como agentes antimicrobianos (CASTRO et al., 2004). Os compostos fenólicos estão entre as mais difundidas classes de metabólitos secundários, sendo conhecidos pela sua importância no sistema solo-planta. Além disto, estudos relacionam esses compostos com estresses metabólicos, na proteção contra pragas e doenças e ação alelopática sendo componentes estruturais e funcionais da matéria orgânica do solo (CASTRO et al., 2004). Em T. eupatorioides os tricoma glandulares do tipo I e II desenvolvem-se no ápice caulinar em sequência acrópeta, iniciando sua formação com uma primeira divisão anticlinal de uma célula protodérmica. Este resultado é semelhante aos que foram observados em Madia sativa Molina (CARLQUIST, 1958); Artemisia crithmifolia L. (ASCENSÃO & PAIS 1982), A. campestris e A. maritima L. (ASCENSÃO & PAIS 1985, 1987); Artemisia annua L. (DUKE & PAUL, 1993); Stevia rebaudiana (Bert.) Bert.(MONTEIRO et al., 2001) e Solidago virgaurea Bigel (RODRIGUES, 2011).

O tricoma tipo III inicia sua diferenciação com uma divisão periclinal o que está de acordo com os resultados observados em Helichrysum aureonitens (AFOLAYAN & MEYER, 1995). Para Ascensão (2007), os tricomas glandulares têm origem numa célula da protoderme, que se distingue das células vizinhas por ser mais volumosa e apresentar citoplasma mais denso e núcleo hipertrofiado. Esta célula inicial dos tricomas aumenta gradualmente de volume segundo o eixo longitudinal, sofrendo ulteriormente uma divisão periclinal ou anticlinal. Após esta primeira divisão que estabelece de imediato a natureza unisseriada ou bisseriada dos tricomas sucessivas divisões darão origem ao pedúnculo e a cabeça secretora. A fase final da diferenciação dos tricomas glandulares é concomitante com o início do processo secretor. Terminada a fase de secreção, as células glandulares degeneram, o que leva ao colapso da cabeça glandular do tricoma e à sua perda de funcionalidade. Percebe-se que há poucos estudos relatados na literatura que descrevem a ontogenia dos tricomas glandulares de Asteraceae.

5. CONCLUSÃO

Em T. eupatorioides ocorrem características anatômicas que são comuns a outras espécies da família Asteraceae. A presença de estômatos em ambas as faces da folha e a ocorrência densa de tricomas estão relacionadas, provavelmente, à proteção da planta contra perda excessiva de água. Além disso, as células epidérmicas com paredes espessas e grande quantidade de fibras associadas ao sistema vascular no caule podem auxiliar a manutenção de sua arquitetura, importante na condição sazonal do Cerrado. Ocorrem dois tipos de estruturas secretoras: ductos secretores e tricomas glandulares. Os tricomas glandulares secretam óleos essenciais e compostos fenólicos e foram classificados em três tipos: unisseriado recurvado, bisseriado curto e bisseriado longo. Tendo em vista que são comuns em outras espécies da família, os resultados podem contribuir para os estudos sobre relações taxonômicas. O primeiro evento da diferenciação dos tricomas glandulares que ocorrem nas folhas e no caule é a expansão de uma célula protodérmica. Os tricomas glandulares bisseriados iniciam a diferenciação com a uma divisão anticlinal da célula protodérmica expandida e o unisseriado recurvado inicia sua diferenciação com uma primeira divisão periclinal. As sucessivas divisões periclinais no tricoma bisseriado longo não são sincronizadas.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO 2

PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA E COMPOSIÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob (ASTERACEAE- EUPATORIEAE) OCORRENTE EM ÁREA DE CERRADO RUPESTRE

RESUMO

Asteraceae é a maior família dentre as Angiospermas, com aproximadamente 24.000 espécies, distribuídas em varias regiões do planeta, e suas espécies produzem grande variedade de metabólitos secundários relacionados à proteção contra agentes bióticos e abióticos. Tendo em vista que Trichogonia eupatorioides é uma espécie endêmica do Brasil e ainda pouco conhecida sob ponto de vista fitoquímico, o presente estudo teve por objetivo realizar a prospecção fitoquímica, bem com identificar os compostos do óleo essencial produzido por seus órgãos aéreos. O material vegetal foi coletado na Reserva Biológica da Universidade Federal de Goiás “Prof. José Ângelo Rizzo”, situada no Parque Estadual da Serra Dourada, em uma área de Cerrado Rupestre. A prospecção fitoquímica foi realizada por metodologias usuais e o óleo essencial, extraído em Clevenger, foi analisado em equipamento de cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massa. A prospecção fitoquímica identificou heterosídeos flavonoides, heterosídeos cardioativos e cumarinas. Foram registrados 31 componentes no óleo essencial, dos quais 20 foram identificados, onde 95% destes são sesquiterpenos. Os compostos majoritários foram os sesquiterpenos 3,5 -muuroladieno com 39,56%, Hidroxitolueno butilado com 13,07%, e o E-cariofileno com 5,63%.

Palavras chaves: metabólitos secundários, flavonóides, terpenos, 3,5- muuroladieno

1. INTRODUÇÃO

Asteraceae é a maior família dentre as angiospermas, com aproximadamente 1.600 gêneros e 24.000 espécies e distribuídas em varias regiões do planeta, sendo mais comuns em habitas temperados, tropicais montanhosos, secos e abertos. Estudos moleculares recentes reconhecem para a família 12 subfamílias e 43 tribos (FUNK et al., 2009; JUDD et al., 2009). A ampla distribuição dessa família ocorre em função ao seu extraordinário potencial de adaptação e de algumas características como a facilidade de dispersão das sementes pelo vento, e pela diversidade de metabólitos secundários sintetizados por diversos tipos de estruturas secretoras que conferem proteção contra herbivoria e contra condições ambientais adversas (CRONQUIST, 1968; FUNK et al., 2005). Alguns estudos realizados verificaram que os principais produtos do metabolismo secundário da família são poliacetilenos, sesquiterpenóides, diterpenóides, triterpenóides, flavonóides, cumarinas, benzofuranos e benzopiranos (EMERENCIANO et al., 1998; BOLINA et al., 2009), contudo as lactonas sesquiterpênicas são os compostos químicos mais marcantes da família. São conhecidas mais de 2500 (dois mil e quinhentos) lactonas, a maioria isolada de espécies de Asteraceae (STEFANELLO, 1993). Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, líquidas e geralmente odoríferas (SIMÕES & SPITZER, 2002). Estes podem ter diferentes constituintes, sendo mais comumente encontrados hidrocarbonetos terpênicos, cetonas, aldeídos, álcoois terpênicos e simples, fenóis cumarínicos, compostos com enxonfre (SIMÕES & SPITZER, 2002) e lactonas sesquiterpênicas (SIMÕES & SPITZER, 2002, NEERMAN, 2003). Apesar da composição química do óleo essencial ser determinada geneticamente, vários fatores ambientais como sazonalidade climática, temperatura, a umidade relativa, a tempo de exposição ao sol e estágio fenológico podem influenciar sua composição química e seu rendimento (SIMÕES & SPITZER, 2002; CURADO et al., 2006; GOBBO-NETO & LOPES, 2007; PAOLINI et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2011). Os estudos sobre os óleos essenciais em espécies de Asteraceae vêm se destacando nos últimos anos devido seu potencial biológico, apresentando atividade antifúngica (NEERMAN, 2003), antibacteriana (FERRONATTO et al., 2007, PELISSARI et al., 2010), e inseticida (LOPÉZ et al., 2011). Além disto, a obtenção de óleos voláteis a partir de espécies aromáticas tem se constituído uma importante atividade econômica em decorrência da crescente utilização destas substâncias nas indústrias de cosméticos e alimentos (SIMÕES & SPITZER, 2002). As substâncias lipofílicas presentes nos óleos essenciais (principalmente os terpenos) atuam na atração de agentes polinizadores e dispersores de semente, além de promover 96

mecanismos de defesa contra herbívoros e patógenos, pois a toxidade atua como repelente. Já os compostos fenólicos atuam no sistema solo-planta, estresse metabólico, parede celular, na proteção contra pragas e doenças e ação alelopática sendo componentes estruturais e funcionais da matéria orgânica do solo e proteção contr os raios solares (CASTRO et al., 2004a). A tribo Eupatorieae, que inclui 19 subtribos, destaca-se como sendo a mais rica em diversidade (ROBINSON et al., 2009). Estudos indicam que esta tribo apresenta alcalóides pirrolizidínicos, flavonóides, óleos essenciais com benzofuranos, monoterpenos na forma de derivados do timol, como em Bishovia boliviensis R.M.King & H.Rob., em Mikania officinalis Mart. e M. purpurascens (Baker) R.M.King & H.Rob, estas duas últimas endêmicas do Brasil. Os sesquiterpenos ocorrem largamente dentre as espécies da tribo (KING & ROBINSON, 1987). Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob é um subarbusto ereto de aproximadamente 0,5 m que possui origem nativa, endêmica do Brasil, ocorrente na região Nordeste (Ceará, Bahia), Centro-Oeste (Goiás), Sudeste (Minas Gerais), principalmente nos domínios fitogeográficos do Cerrado e da Caatinga (ROQUE, 2013). Tendo em vista sua ampla distribuição e a escassez de estudos fitoquímicos, realizados unicamente por Borges (2006), o objetivo do presente trabalho foi investigar oas principais classes de metabólitos secundários atrave da prospecção fitoquímica e identificar os principais compostos do óleo essencial produzido nos órgãos aéreos (vegetativos e reprodutivos) de T. eupatorioides ocorrente no Cerrado Rupestre de Goiás. Vale ressaltar que estes estudos fornecem informações que podem ser utilizadas em diversas áreas botânicas, como taxonomia e ecologia, além de contribuir para a identificação de compostos a serem utilizados como protótipos para fármacos pela indústria farmacêutica.

2. MATERIAL E MÉTODO

2.1 Material Vegetal

O material vegetal foi coletado na Reserva Biológica da Universidade Federal de Goiás “Prof. José Ângelo Rizzo”, situada no Parque Estadual da Serra Dourada (PESD), que se localiza nos Municípios de Mossâmedes, Goiás e Buritis de Goiás. A altitude da Serra Dourada tem uma variação desde 726 a 900 m, onde se encontra o ponto mais alto da Serra, na formação de um “paredão” rochoso com 1080 m de altitude, e as coordenadas geográficas das populações de plantas: S 09º 14.893’ W036º 25.836’, S 16 º04.613’ W 050º 11.318’, S 16º 04.640’ W 050 11.320’e S 16º 04.712’W 050º 11. As amostras foram coletadas em abril de 2013. Neste mês a precipitação foi de 96 mm de chuva e nos horários das coletas (por volta das 11:00 horas da manhã) a umidade relativa do ar era de 71% e temperatura aproximadamente 23° C (INMET, 2013). Em ambas as coletas as amostras continham ramos férteis. Todas as amostras foram transportadas em embalagens plásticas até o Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Botânica do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás onde foram separadas para análise de óleo e para prospecção fitoquímica. As exsicatas foram depositadas no Herbário da Universidade Federal de Goiás com o número 3994.

2.2 Prospecção fitoquímica

Ramos aéreos (contendo órgãos reprodutivos) foram colocados em sacos de papel perfurado e levados para estufa de secagem e esterilização modelo 320-SE localizada no Laboratório de Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Goiás. A circulação de ar é mecânica com ventilação a 40° C para secagem, durante 8 dias. Posteriormente foram triturados e moídos em liquidificador. O pó obtido foi devidamente identificado, acondicionado e armazenado até sua utilização. A prospecção fitoquímica foi realizada no Laboratório de Pesquisas de Produtos Naturais da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás (LPPN). Visando obter um perfil qualitativo do material seco, foram utilizadas as técnicas descritas por Costa (2001), Oliveira & Akisue (1986), Matos (1988), Matos & Matos (1989), Oliveira et al. (1991), para as principais classes de metabólitos secundários, tais como alcalóides, heterosídeos cumarínicos, heterosídeos antraquinônicos, heterosídeos flavonóides, heterosídeos saponínicos, heterosídeos cardioativos, metilxantinas e taninos. Para estas análises foram utilizados cerca de 200g de material pulverizado.

2.3 Extração do óleo essencial

Para extração do óleo essencial foram utilizadas amostras frescas de ramos aéreos (com órgãos reprodutivos). Para a extração do óleo essencial, realizada também no LPPN, foram utilizadas 110 g de amostra fragmentada. Este material foi submetido à hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger (AKISUE, 1986) por 3 horas. O volume de óleo essencial foi medido no tubo graduado do próprio aparelho e o rendimento, em porcentagem, foi calculado em relação à quantidade inicial de material botânico empregado na extração. O óleo essencial obtido foi acondicionado, identificado e armazenado em freezer para análises subsequentes.

2.3.1 Análise da composição química do óleo essencial

O óleo essencial obtido foi submetido à análise cromatográfica, em fase gasosa, acoplada à espectrometria de massas (CG/EM) em aparelho SHIMADZU QP5050A no Laboratório de Química Orgânica da Faculdade de Química da Universidade Federal de Goiás. Utilizou-se coluna capilar de sílica fundida (CBP – 5; 30m x 0,25mm x 0,25µm), com um fluxo de 1ml/min de Hélio, como gás de arraste, aquecimento com temperatura programada (60oC/2min; 3oC min- 1/240°C; 10oC min-1/280oC; 280oC/10min), e energia de ionização de 70 eV. Os compostos foram identificados por base de dados computadorizada, usando biblioteca digital de dados de espectro de massas NIST11/2011/EPA/NIH e por comparação com seus índices de retenção e espectros de massa autênticos de Adams (2007). Os índices de retenção foram calculados através da coinjeção de uma mistura de hidrocarbonetos C8-C-32 da marca Sigma-Aldrich e a utilização da equação de Van Den Dool e Kratz (1963) (Equação 01).

IR = 100 . N [(tx – tn1)/(tn – tn1)] + 100 . Cn1 Onde:  N = Cn – Cn-1  Cn = número de carbonos do n-alcano que elui após a substância analisada  Cn-1 = número de carbonos do n-alcano que elui antes da substância analisada  tx = tempo de retenção da substância analisada  tn = tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância analisada  tn-1 = tempo de retenção do n-alcano que elui antes da substância analisada

3. RESULTADOS

3.1 Prospecção fitoquímica

Os resultados da análise fitoquímica para detecção das principais classes de metabólitos secundários presentes nas amostras de T. eupatoroides estão expressos no Quadro 1. Estas possuem heterosídeos flavonóides, heterosídeos cardioativos e hetoreosídeos cumarínicos. Não foram encontrados heterosídeos antraquinônicos, heterosídeos saponínicos, alcalóides, taninos e metilxantinas. Na reação para flavonóides foram identificados flavonóis pela reação de Shinoda (coloração róseo a vermelho), pela reação oxalo-bórica (fluorescência verde-amarelada) e pela reação com hidróxidos alcalinos (coloração amarela escura). Flavononas também foram identificadas pela reação positiva com cloreto férrico apresentando coloração verde-castanha. A partir dos resultados obtidos pelas reações para heterosídeos cardioativos foi possível identificar a presença de esteróides na reação de Liebermann-Burchard (coloração castanha da solução); compostos terpênicos pela reação de Pesez (fluorescência verde amarelada); desoxiaçucares pela reação de Keller-Kiliani (pela presença do anel castanho-avermelhado) e lactonas pela reação de Kedde (coloração castanho avermelhada).

QUADRO 1: Resultados da prospecção fitoquímica realizada nos órgãos vegetativos aéreos e reprodutivo de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob.

CLASSE DO METABÓLITO RESULTADO* SECUNDÁRIO Antraquinônas - Flavonóides + Cardioativos + Saponinas - Cumarinas + Taninos - Alcalóides - Metilxantinas -

*(+) Presente, (-) Ausente.

3.2 Composição química do óleo essencial

O teor de óleo essencial obtido de T. eupatorioides foi de 0,09%. A cromatografia gasosa acoplada à espectocmetria de massa (CG/EM) registrou 31 componentes, os resultados das

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análises encontram-se descritos detalhadamente no Quadro 2, com o teor de cada componente expresso em porcentagem. Foram identificados 20 compostos, sendo 95% destes sesquiterpenos. Os compostos majoritários são sesquiterpenos 3,5-muuroladieno com 39,56%, o hidroxitolueno butilado com 13,07%, e o E-cariofileno com 5,63%. Foram identificados monoterpenos oxigenados, hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sesquiterpenos oxigenados e sesquiterpenos alcoóis (Quadro 3).

QUADRO 2: Compostos identificados na amostra de óleo essencial de Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob.

PICO COMPONENTESa IRb KIc TEOR(%)d 1 4-ol-terpineno 1170,34 1177 0.67 2 5-eno-silfiperfol 1318,61 1328 0,8 3 NI* 1337,97 - 8.64 4 NI 1356,53 - 0.96 5 6-eno-silfiperfol 1368,62 1379 0,99 6 2-eno-modhelf 1374,92 1383 0,4 7 α-isocomeno 1380,60 1388 1,29 8 Cipereno 1393,14 1398 0,31 9 β-isocomeno 1399,52 1408 0,66 10 E-cariofileno 1413,25 1419 5,63 11 α-humuleno 1446,92 1454 1,76 12 3,5- muuroladieno 1447,47 1450 39,56 13 Biciclogermacreno 1489,96 1500 1,31 14 α-muuroleno 1493,18 1500 0,43 15 Hidroxitolueno butilado 1508,28 1515 13,07 16 7-epi-α-selineno 1510,78 1522 1,10 17 δ-amorfeno 1516,36 1512 1,27 18 Nerodiol 1555,62 1563 0,39 19 Óxido de cariofileno 1575,81 1583 1,69 20 Allo- Epóxido aromadendreno 1629,02 1641 0,29 21 Epi-α-cadinol 1633,69 1640 1,85 22 α-muurolol 1647,59 1646 1,75 23 NI 1795,73 - 0,47

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24 NI 1911,30 - 0,53 25 NI 1954,30 - 2,60 26 NI 1998,31 - 0,72 27 NI 2073,58 - 0,62 28 NI 2100,65 - 1,88 29 NI 2208,58 - 1,31 30 NI 2349,68 - 0,54 31 NI 2387,71 - 5,97 aConstituintes químicos listados de acordo com ordem de eluição. bIR = Índices de retenção calculado. cKI = Índices de Kovats da literatura. dPercentual obtido por EM-CG. *NI=Compposto não identificado.

QUADRO 3: Classes dos componentes do óleo essencial de Trichogonia eupatorioides

CLASSES PRINCIPAIS COMPONENTES

Monoterpeno 4-ol-terpineno oxigenado

5-eno-silfiperfol, 6-eno-silfiperfol, 2-eno-modhelf, α- Hidrocarbonetos isocomeno, Cipereno, β-isocomeno, E-cariofileno, α- Sesquiterpênicos humuleno, 3,5- muuroladieno, biciclogermacreno, α- muuroleno, 7-epi-α-selineno, δ-amorfeno

Sesquiterpenos Óxido de cariofileno, Allo- Epóxido aromadendreno oxigenados

Sesquiterpenos Hidroxitolueno butilado, Nerodiol, Epi-α-cardinol, α- álcoois muurolol

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4. DISCUSSÃO

A pesquisa fitoquímica tem como objetivo conhecer os constituintes químicos de espécies vegetais. Essa análise preliminar torna-se ainda mais importante quando se dispõe de poucos dados sobre a espécie em questão (FALKENBERG et al., 2002). Trichogonia eupatorioides possui classes de compostos secundários comuns a outras espécies da família Asteraceae como os heterosídeos flavonoides e os hetereosídeos cumarínicos. Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre no reino vegetal, sendo conhecidos mais de 4.200 tipos (ZUANAZZI, 2002). No organismo da planta podem atuar na proteção contra incidência de raios ultravioletas e visível; proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias; atração de polinizador; controle da ação de hormônios vegetais; agentes alopáticos e inibição de enzimas (ZUANAZZI, 2002), além de serem importantes para a pigmentação das flores e frutos (CASTRO et al., 2004). Os flavonóides possuem também importância farmacológica atuando como anticarcinogênico, antiinflamatório, antialérgico, antiulcerogenico, antioxidante, antixidante entre outros (ZUANAZZI, 2002). Os flavonóides são comuns nas espécies de Asteraceae e já foram descritos em espécies como Liabum polymnioides R.E.Fr e L. candidum Griseb (JUAREZ et al., 1995); Eupatorium cannabinum L. (STEVENS et al., 1995); Chromolaena hirsuta (Hook. & Arn.) R.M. King & H. Rob. e C. squalida (DC.) R.M.King & H.Rob (TALEB-CONTINI et al., 2007); Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schultz Bip. Ex Baker (BOLINA et al., 2009) e Eupatorium ballotifolium Kunth (ALBUQUERQUE et al., 2010). A fluorescência verde-amarelada observada como resultado do teste para cumarinas indica resultado positivo para esta classe. Isso porque as cumarinas quando expostas a luz ultravioleta e em solução alcalina rompem o anel lactônico desenvolvendo a coloração amarela (FALKENBERG et al., 2002). As cumarinas encontram-se distribuídas predominantemente em Angiospermas, sendo as estruturas mais simples, as mais encontradas. Estruturalmente são lactonas do acido o-hidroxi-ciâmico, sendo o representante mais simples a cumarina 1,2- benzopirona. As famílias mais citadas na literatura pelo conteúdo em cumarinas são: Asteraceae, Apiaceae, Rutaceae, Fabaceae, Oleaceae, Moraceae e Thymeleaceae (KUSTER & ROCHA, 2002). Para Proksh & Rodrigues (1983) os cromenos (benzopiranos) e os benzofurânicos, unidades básicas das cumarinas, são característicos de certas tribos de Asteraceae e estes representam caracteres taxonômicos úteis no nível de trobo e gênero para a família. Em Eupatorieae, as cumarinas foram registradas nas espécies de Eupatorium ballotifolium Kunth (ALBUQUERQUE et al., 2010) e Mikania glomerata Sprengel, Mikania laevigata Baker 103

(CZELUSNIAK, et al.; 2012). Além disto, a presença destes compostos representa uma importante vantagem adaptativa contribuindo contra herbívora de insetos e ataque microbiano (PROKSH & RODRIGUES, 1983). O resultado positivo para heterosídeos cardiotônicos é um grande motivador para a realização de pesquisa com a espécie, uma vez que esteróides presentes na natureza são caracterizados pela alta especificidade e ação estimulante do músculo cardíaco. Esses esteróides ocorrem como glicosídeos esteroidais e devido a sua ação sobre o músculo cardíaco são denominados de glicosídeos cardioativos (RATES & BRIDI, 2002). Porém não há relatos de heterosídeos cardioativos em Asteraceae, portanto é possível que as reações positivas em T. eupatoroides se devam a presença dos compostos presentes nos óleos essenciais como compostos terpênicos (triterpenos) e lactonas, já que os mesmos são características marcantes e amplamente relatadas para a família (STEFANELLO, 1993; EMERENCIANO et al., 1998; NEERMAN, 2003; BOLINA et al., 2009), e para o gênero (BOHLMANN et al.,1981; VICHNEWSKI et al., 1985). Algumas espécies de Trichogonia já foram objetos de estudos fitoquímicos. Trichogonia prancii G. M. Barroso, T. villosa (Spreng.) Sch.Bip. ex Baker e T. salviaefolia Gardner possuem sesquiterpenos, esteróides, lactonas sesquiterpênicas e derivados da acetofenona; em T. grazielae R.M.King & H.Rob, ocorrem sesquiterpenos e derivados da acetofenona, em T. scottmorii R.M.King & H.Rob, ocorrem esteroides e derivados da acetofenona (BOHLMANN et al.,1981). E em T. gardneri A. Gray, ocorrem lactonas sesquiterpênicas (VICHNEWSKI et al., 1985). Os óleos essenciais são misturas de hidrocarbonetos terpênicos, cetonas, aldeídos, álcoois terpênicos e simples, fenóis cumarínicos, compostos com enxonfre (SIMÕES & SPITZER, 2002) e lactonas sesquiterpênicas (SIMÕES & SPITZER, 2002, NEERMAN, 2003). Estes óleos são característicos de Asteraceae e já foram relatados em várias espécies: Ageratum conyzoides L. (CASTRO et al., 2004b), espécies de Bacharis (AGOSTINI et al., 2005), Chamomilla recutita (L.) Rauschert (BORSATO et al., 2007), Aster lanceolatus Willd (DIAS et al., 2009), Eupatorium ballotifolium Kunth (ALBUQUERQUE et al., 2010), Pteronia incana (Burm.) DC (HULLEY et al., 2010), Melampodium divaricatum (Rich.) DC. (PELISSARI et al.,2010), e espécies de Tagetes L. (LÓPEZ et al., 2011). Alguns compostos encontrados no óleo essencial de T. eupatorioides também foram observados em outras espécies de Asteraceae. Estes incluem o biciclogermacreno, o 4-ol terpineno e o selineno em Baccharis sp. L. (AGOSTINI et al., 2005); o E-cariofileno em Chromoleana laevigata (Lam.) R.M.King & H.Rob. (MURAKANI, 2009); o óxido de cariofileno em Chamomilla recutita (L.) Rauschert (BORSATO et al., 2007); o α-humuleno em

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Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish (SOUSA et al., 2008) e em Vernonia sp. Schreb. (MAIA et al., 2010); o allo-aromadendereno e o amorpheno em Heterothalamus sp. (SILVA, 2012); o α-muuroleno em Eupatorium polystachium DC. (SOUZA et al., 2007) e o epi-α-cadinol em Baccharis dracunculifolia DC (SANTOS et al., 2012). Em T. eupatorioides apenas uma pequena fração do óleo essencial é composta por monoterpenos e a grande maioria são sesquiterpenos hidrocarbonetos, assim como em espécies de Vernonia, que apresentaram dentre os compostos majoritários o cariofileno (MAIA, et al., 2010). O sesquiterpeno 3,5-dieno-muurola que também foi um dos compostos majoritários de T. eupatorioies, foi observado em Eremanthus erythropappus (SOUSA et al., 2008) e em Heterothalamus aliens Sprengel O. Kuntze (SILVA, 2012), porém em concentrações relativamente baixas. O grande motivador para estudos com óleos essenciais de Asteraceae é seu potencial terapêutico, podendo apresentar propriedades antibacterianas, antifúngicas, antiplasmódica e citotóxica (NEERMAN, 2003; OOTANI et al., 2013). Em Baccharis dracunculifolia D.C. e B. uncinella D.C. o óleo essencial produzido apresenta atividade antimicrobiana sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (FERRONATTO et al., 2007), já em Melampodium divaricatum Rich D.C. sobre as espécies Gram-positivas Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (PELISSARI et al., 2010). Além destas, os óleos de quatro espécies de Tagetes L. possuem propriedades inseticidas sobre Ceratitis capitata e Triatoma infestans (LOPÉZ et al., 2011) e de Ageratum conyzoides L. sobre o pulgão Macrosiphum euphorbiae (SOARES et al., 2011). As atividades biológicas dos óleos essenciais estão diretamente relacionadas aos seus constituintes. O sesquiterpeno biciclogermacreno quando isolado, por exemplo, demonstrou possuir atividade antifúngica (SILVA et al., 2007) e antimicrobiana (CYSNE et al., 2005); assim como o E-cariofileno (GARG & SIDDIQUI, 1992; FORMOSIANO et al., 2006). Segundo Costa et al. (2009) óleos ricos na mistura (E)-cariofileno/biciclogermacreno ou (E)- cariofileno/germacreno D presentes em Annona foetida Martius (Annonaceae) também demonstram potente atividade antimicrobiana. Além destes, espécies que produzem óleo contendo muuroleno apresentaram atividade alelopática (ALMEIDA et al., 2003). O rendimento do óleo essencial de T. eupatorioides foi baixo, aproximadamente 0,09%, e pode ter sido influenciado pela época chuvosa e horário de coleta (por volta de 11:00) e pela fase de desenvolvimento da planta. Isto porque, apesar da composição química do óleo essencial ser determinados geneticamente, vários fatores ambientais como temperatura, a umidade relativa,

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o tempo de exposição ao sol e o regime de ventos podem influenciar em sua composição quimica e rendimento (SIMÕES & SPITZER, 2002). O horário da coleta de T. eupatorioides pode ter influenciado no teor de óleo essencial, porque segundo Simões & Sptizer (2002), o aumento da temperatura ao longo do dia leva a diminuição do teor de óleo essencial em algumas espécies devido à volatilização deste. Silva et al. (2003) verificaram em Melaleuca alternifolia Cheel (Myrtaceae) oscilações no teor de óleo essencial ao longo do dia devido a variação da temperatura e da umidade. Em Pectis brevipedunculata (Gardner) Sch. Bip o teor do óleo essencial teve efeito deletério nas folhas e nos capítulos florais a temperatura ambiente ≅ 30° C e a altas temperaturas 50 e 60º C, tendo seu teor ideal in natura a 40° C (OLIVEIRA et al., 2011). Borsato et al. (2007) também perceberam que há uma diminuição no teor do óleo essencial ao avaliar o processo de secagem a 70° C em Chamomilla recutita (L.) Rauschert. A variação climática própria das estações do ano também é um dos fatores de maior importância para análise da presença e quantidade de metabólitos secundários (GOBBO-NETO & LOPES, 2007). Em Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) o teor de monoterpenos é maior no inverno e de sesquiterpenos é maior no verão (HUSSAIN et al., 2008) e em Lychnophora ericoides Mart., constatou-se uma diminuição no rendimento do óleo essencial no período de seca (CURADO et al., 2006). A coleta de T. eupatorioides se deu no final do período chuvoso, o que pode ter provocado a perda de substâncias produzidas no óleo essencial. As amostras de T. eupatorioides, utilizadas no presente trabalho, encontravam-se floridas e com frutos na época da coleta. A fase fenológica ao qual a planta de encontra também pode influenciar o teor e a composição, pois, neste período há uma maior alocação de energia para a floração, frutificação e dispersão de sementes (WATERMAN, 1993). Em Guarea macrophylla Vahl (Meliaceae) nos meses correspondentes às fases de floração e frutificação há uma maior produção de sesquiterpenos, possivelmente para favorecer sua polinização e dispersão (LAGO et al., 2007). Em adição, Paolini et al., (2010) ao estudarem a espécie Calendula arvensis L., observaram que a variação sazonal (Inverno ou Primavera) influenciou nas concentrações de dois compostos importantes durante o período de floração o α-cadinol e o δ-cadinene e este aumento pode estar associado à proteção da planta e atração de polinizadores durante esta estação. Portanto, o óleo essencial das espécies é influenciado pela fase de desenvolvimento, sazonalidade climática e horário de coleta das amostras vegetais. Sendo assim é necessária a análise destes fatores, para padronização do melhor período e horário para obtenção de um maior rendimento e teor de óleo essencial para a espécie em estudo.

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Os resultados da análise fitoquímica de T. eupatorioides corroboram os resultados de Borges (2006) para mesma espécie (sin. T. menthaefolia). Segundo este autor, a planta produz sesquiterpenos, esteróides e flavonóides. Assim como em T. eupatorioides no estudo realizado por Borges (2006) lactonas não foram identificadas. Entretanto, como estas são amplamente relatadas para o gênero Trichogonia, são necessários estudos mais específicos.

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5. CONCLUSÃO

Em T. eupatorioides ocorre heterosídeos flavonoides, heterosídeos cardioativos e cumarinas. Entretanto, o resultado positivo para cardioativos deve ser melhor investigado, pois não há relatos da presença destes compostos em Asteraceae. O óleo essencial de T. eupatorioides possui compostos monoterpenos e sesquiterpenos. Os compostos majoritários são os sesquiterpenos 3,5-muuroladieno com 39,56%, o hidroxitolueno butilado com 13,07%, e o E- cariofileno com 5,63%. A época, o horário da coleta e a fase fenológica das plantas utilizadas no presente trabalho podem ter influenciado no teor e na composição química do óleo essencial de T. eupatorioides, sendo, portanto, necessários estudos que busquem avaliar a influencia dessas varáveis em T. eupatorioides.

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CONCLUSÕES

Em T. eupatorioides ocorrem características anatômicas que são comuns a outras espécies da família Asteraceae. As folhas e o caule de T. eupatorioides possuem alta densidade de tricomas glandulares que foram identificados e classificados em três tipos: um unisseriado e dois bisseriados. Estes se originam a partir de uma célula protodérmica expandida e passam por divisões periclinais e anticlinais. Os ramos aéreos (incluindo os órgãos reprodutivos) de T. eupatorioides possuem heterosídeos flavonóides, heterososídeos cardioativos e cumarinas. Os compostos do óleo essencial são predominantemente da classe dos sesquiterpenos.

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