UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

FABILE SCHLICKMANN

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GASTROPROTETOR, ANTINOCICEPTIVO E ANTIPROLIFERATIVO DE Mimusops balata (ABRICÓ-DA-PRAIA)

Itajaí 2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

FABILE SCHLICKMANN

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GASTROPROTETOR, ANTINOCICEPTIVO E ANTIPROLIFERATIVO DE Mimusops balata (ABRICÓ-DA-PRAIA)

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Co-Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade

Itajaí, Março, 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

S39e Schlickmann, Fabile, 1989- Estudo químico e avaliação do potencial gastroprotetor, antinociceptivo e antiproliferativo de mimusops balata (abricó-da-praia) / Fabile Schlickmann, 2015. 111f. ; il., tab. ; fig.

Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Prof . Dr Valdir Cechinel Filho ” Bibliografia : p.95-111

1. Mimusops balata. 2. Fitoterapia. 3. Farmacologia. I. Título.

CDU: 615.32

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293

Dedicatória

Dedico este trabalho à minha mãe Alivir, que com sua força e doçura me ensinou a nunca deixar de seguir adiante e, ao meu pai Vicente (in memoriam), o qual se alegraria com este feito.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me proporcionar força e serenidade para seguir esta trajetória; À minha mãe e irmãos, pela compreensão e apoio nos momentos difíceis e à minha família, pelo carinho; Ao meu amor Ricardo, pela paciência e carinho; Às minhas amigas Fabiana, Adriana, Juarana, Ângela, Mariel, Beth que compartilharam importantes momentos comigo e às amigas distantes, mas que sempre estiveram presentes, Camila, Marja, Fernanda; Ao meu orientador Prof. Valdir Cechinel Filho, pela confiança, pelos ensinamentos e disposição para sempre fazermos um bom trabalho, além da amizade construída ao longo destes dois anos; Ao Prof. Theodoro Marcel Wagner, ao Funcionário Pedro Pablo Perez Netto (RMN), Marcel Petreanu, Prof. Oscar Iza e ao Herbário Barbosa Rodrigues, pela contribuição; À equipe da gastroproteção: Prof. Sérgio Faloni de Andrade, Prof. José Roberto Santin, Luísa, Thaise, Lincon e todos que contribuíram de alguma forma; Ao Prof. João Ernesto de Carvalho e ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) na Universidade de Campinas (UNICAMP) pelo desenvolvimento dos testes in vitro (atividade antiproliferativa); À Profa. Fátima de Campos Buzzi, Karla e equipe, pelos testes antinociceptivos; À banca avaliadora, Profa. Ângela Malheiros, Profa. Márcia Maria de Souza e Profa. Simone Andrade Gualberto pela disposição em avaliar e contribuir com o presente trabalho; À Profa. Tania Mari Belle Bresolin, pelo apoio e confiança e à equipe da coordenação do PPGCF/Univali – Juliano e Helenize, sempre solícitos e atenciosos. À CAPES e CNPq pela oportunidade e apoio financeiro. À todos que estiveram presentes durante esta trajetória e que contribuíram de alguma forma.

MUITO OBRIGADA!!!

EPÍGRAFE

“A percepção do desconhecido é a mais fascinante das experiências. O homem que não tem os olhos abertos para o mistério passará pela vida sem ver nada.”

Albert Einstein

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GASTROPROTETOR, ANTINOCICEPTIVO E ANTIPROLIFERATIVO DE Mimusops balata (ABRICÓ-DA-PRAIA)

FABILE SCHLICKMANN Março, 2015

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho. Co-Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de páginas: 111.

O abricó-da-Praia (Mimusops balata), família Sapotaceae, é uma árvore perene nativa da América tropical, ocorre geralmente no litoral por se adaptar bem aos solos arenosos e salinos. A presente pesquisa teve como objetivo proceder a análise biológica (gastroprotetora, antinociceptiva e antiproliferativa) de extratos, frações e substâncias puras a partir de diferentes partes de Mimusops balata. A análise fitoquímica foi realizada por meio de maceração das partes da planta com metanol, por sete dias. Os extratos foram evaporados, com exceção do extrato da semente, o qual foi particionado gerando as frações clorofórmio e acetato de etila. Para elucidação estrutural utilizou-se técnicas convencionais espectrométricas (RMN, MS) e cromatográficas (CLAE, CG/FID). Quanto à parte farmacológica, foram utilizados modelos experimentais em ratos e camundongos. Para avaliação de dor aguda utilizou-se modelo por contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. A atividade gastroprotetora foi avaliada pelos modelos de úlcera induzida por etanol/HCl, determinação da secreção gástrica e AINES. A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada, in vitro, em células neoplásicas humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama) e NCI-H460 (pulmão). Foram identificados e isolados os compostos taxifolina, nas sementes (fração acetato de etila) e mistura de α e β- amirina, nas folhas. Nos testes de dor aguda, todos os extratos exibiram efeito antinociceptivo, sendo o extrato da semente mais eficaz, possivelmente devido a presença da taxifolina. Nos diferentes modelos de úlcera utilizados, a dose de 300mg/kg teve resultado estatisticamente significativo. Em relação à atividade antiproliferativa, os extratos não tiveram efeitos estatisticamente significativos. A taxifolina é o mais abundante composto presente nas sementes e não foi identificado nas demais partes da planta em estudo, podendo as sementes se constituirem de fonte para a obtenção deste importante flavonóide. Os resultados obtidos permitem concluir que a planta em estudo, particularmente as sementes, possuem relevantes ações biológicas, especialmente em modelos de gastroproteção. Sugere-se a continuidade dos estudos tanto fitoquímicos como farmacológicos na busca de novos agentes medicinais considerando o potencial terapêutico evidenciado e a ausência de publicações científicas sobre a planta em estudo.

Palavras-chave: Mimusops balata. Triterpenos. Taxifolina. Gastroproteção. Antinocicepção. Antiproliferativo.

CHEMICAL STUDY AND EVALUATION OF GASTROPROTECTIVE, ANTINOCICEPTIVE AND ANTIPROLIFERATIVE POTENTIAL OF Mimusops balata (ABRICÓ-DA-PRAIA)

FABILE SCHLICKMANN March 2015

Supervisor: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho. Co-Supervisor: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 111.

Abricó-da-Praia (Mimusops balata), Sapotaceae family, is a perennial tree that is native to tropical America, where it occurs mainly on the coast, adapting well to sandy and saline soils. The aim of this study was to carry out a biological analysis of the gastroprotective, antinociceptive and antiproliferative properties of extracts, fractions, and pure substances from different parts of Mimusops balata. The phytochemical analysis was carried out by maceration of the parts of the plant with methanol, for seven days. The extracts were evaporated, except for the seed extract, which was partitioned, generating chloroform and ethyl acetate fractions. For structural elucidation, conventional spectrometric (NMR, MS) and chromatographic (HPLC, GC/FID) techniques were used. In the pharmacological phase, experimental models were used on rats and mice. For the evaluation of acute pain, the model of acetic acid-induced abdominal contractions was used. The gastroprotective activity was evaluated by the models of ethanol/HCl-induced ulcer, determination of gastric secretion, and NSAIDs. The evaluation of in vitro antiproliferative activity was performed in vitro, in human cancer cells: U251 (glioma), MCF-7 (breast), and NCI- H460 (lung). The compounds taxifolin, in the seeds (ethyl acetate fraction), and a mixture of α and β-amyrin, in the leaves, were identified and isolated. In the acute pain tests, all the extracts exhibited antinociceptive effect, the seed extract being the most effective, possibly due the presence of taxifolin. In the different ulcer models used at a dose of 300mg/kg, the result was statistically significant. In relation to the antiproliferative activity, the extracts had no statistically significant effects. Taxifolin is the most abundant compound present in the seeds, and was not identified in other parts of the studied plant, suggesting that the seeds are a source of this important flavonoid. These results suggest the need for further phytochemical and pharmacological studies in the search for new medicinal agents.

Keywords: Mimusops balata. Triterpenes. Taxifolin. Gastroprotection. Antinociception. Antiproliferative.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Foto de uma árvore de Mimusops balata (abricó-da-praia)...... 44 Figura 2 Organograma da análise fitoquímica das folhas de Mimusops balata (abricó-da-praia)...... 48 Figura 3 Organograma da análise fitoquímica do caule de Mimusops balata (abricó-da-praia)...... 49 Figura 4 Organograma da análise fitoquímica da polpa do fruto de Mimusops balata (abricó-da-praia)...... 50 Figura 5 Organograma da análise fitoquímica das cascas do fruto de 51 Mimusops balata (abricó-da-praia)...... Figura 6 Organograma da análise fitoquímica das sementes do fruto de Mimusops balata (abricó-da-praia)...... 52 Figura 7 Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN- 1H) da Taxifolina isolada das sementes de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD)...... 61 Figura 8 Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-13C) da Taxifolina isolada das sementes de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD)...... 62 Figura 9 Espectro expandido de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-13C) da Taxifolina isolada das sementes de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD)...... 63 Figura 10 Cromatograma de CLAE. Sobreposição das amostras: (a) extrato metanólico da semente de Mimusops balata e (b) Taxifolina no comprimento de onda 288 nm...... 64 Figura 11 Estrutura química da taxifolina (3',4'-di-hidroxifenil)-5,7-di-hidroxi- flavanon-3-ol) ou dihidroquercetina, isolada das sementes de Mimusops balata...... 65 Figura 12 Estruturas químicas de α-amirina e β-amirina...... 68 Figura 13 Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN- 1H) da mistura de a-amirina e ß-amirina isolada do resíduo das folhas de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD)...... 69 Figura 14 Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-13C) da mistura de a-amirina e ß-amirina isolada do resíduo das folhas de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD)..... 70 Figura 15 Cromatograma obtido por CG (FID) para a amostra 23...... 71 Figura 16 Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico da casca do fruto de Mimusops balata em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl...... 75 Figura 17 Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico da polpa do fruto de Mimusops balata em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl...... 75 Figura 18 Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl...... 76 Figura 19 Fotos dos estômagos de camundongos submetidos aos efeitos da

administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata, no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl... 76 Figura 20 Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e taxifolina (T) isolada do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (1,14mg/kg) em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl...... 77 Figura 21 Fotos dos estômagos de camundongos submetidos aos efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e taxifolina (T) isolada do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (1,14mg/kg), no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl...... 77 Figura 22 Quantificação de muco (µg de Alcian Blue/g de tecido) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (30, 100 e 300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol...... 79 Figura 23 Quantificação dos níveis de GSH (µg/g de tecido) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (30, 100 e 300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol...... 80 Figura 24 Quantificação dos níveis de MPO (D.O./mg proteína/ 3 minutos) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol...... 81 Figura 25 Quantificação dos níveis de LOOH (mmol/mg de tecido) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol...... 82 Figura 26 Quantificação de volume (ml) de suco gástrico após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica...... 84 Figura 27 Quantificação de pH após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica...... 85 Figura 28 Quantificação de acidez (mEq [H+]) após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica...... 86 Figura 29 Efeitos da administração oral de omeprazol (30mg/kg) extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) na atividade péptica (µM de tirosina/4 horas) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica...... 87 Figura 30 Quantificação de muco (µg de Alcian Blue/g de tecido) após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica...... 87 Figura 31 Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida por AINES (indometacina 80mg/kg)...... 89 Figura 32 Fotos dos estômagos de camundongos submetidos aos efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata, no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl... 90

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Princípios ativos, efeitos fisiológicos e principais fontes de alimentos funcionais...... 33 Tabela 2 Rendimento dos materiais vegetais de Mimusops balata no preparo de extratos metanólicos...... 59 Tabela 3 Resultados das Cromatografias de Camada Delgada dos extratos das partes de Mimusops balata conforme reveladores utilizados...... 59 Tabela 4 Comparação da estrutura química da taxifolina conforme literatura...... 64 Tabela 5 Porcentagem de inibição de contorções abdominais em camundongos após a administração de extratos metanólicos brutos de Mimusops balata e Paracetamol por via intraperitoneal na dose de 10mg/kg...... 72 Tabela 6 Porcentagem de inibição de contorções abdominais em camundongos após a administração de extratos metanólicos brutos de Mimusops balata e Paracetamol por via oral na dose de 50mg/kg...... 73 Tabela 7 Atividade antiproliferativa do controle positivo doxorrubicina e dos extratos metanólicos brutos da casca, caule e folhas de Mimusops balata contra linhagens tumorais humanas...... 90

LISTA DE ABREVIATURAS

AINES – Anti-Inflamatórios Não Esteroidais ATP – Adenosina Trifosfato Cbn – Carbenoxolona CCD – Cromatografia de Camada Delgada CG/FID – Cromatografia Gasosa com Detector por Ionização de Chama CG/MS - Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massa CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência COX – Ciclo-Oxigenase COX-1 – Ciclo-Oxigenase 1 COX-2 – Ciclo-oxigenase 2 DI50 – Dose Inibitória de 50% DMSO – Dimetilsulfóxido EITF – Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier EROs – Espécies Reativas de Oxigênio GR – Glutationa Redutase GSH – Glutationa reduzida i.p. – Intraperitonealmente LDL – Low Density Lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade) LOOH – Hidroperóxidos Lipídicos MPO – Mieloperoxidase MS – Mass Spectrometry (espectometria de massa) NADPH – Fosfato de Dinucleótido de Nicotinamida e Adenina Naive – Animais sem tratamento farmacológico Ome – Omeprazol OMS – Organização Mundial da Saúde Ran – Ranitidina RMN – Ressonância Magnética Nuclear RMN-1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN-13C – Ressonância Magnética Nuclear de carbono 13 RPMI – Roswell Park Memorial Institute SFB – Soro Fetal Bovino

SRB – Corante Protéico Sulforrodamina B T1,14 - Dose 1,14mg de taxifolina TGI – Total Growth Inhibition (inibição total de crescimento) TR – Tempo de Retenção Vei – Veículo v.o. – Via Oral

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 23 2 OBJETIVOS ...... 25 2.1 Objetivo Geral: ...... 25 2.2 Objetivos Específicos: ...... 25 3 REVISÃO DA LITERATURA ...... 27 3.1 Plantas e seus metabólitos ...... 27 3.1.1 Principais classes de metabólitos secundários ...... 28 3.2 Alimentos funcionais ...... 31 3.3 Análise fitoquímica e atividade biológica: aspectos gerais ...... 34 3.4 Dor ...... 36 3.5 Úlcera ...... 37 3.6 Carcinogênese ...... 40 3.7 Da planta em estudo: Mimusops balata (abricó-da-praia)...... 41 3.7.1 Família e Gênero ...... 41 3.7.2 Mimusops balata (abricó-da-praia) ...... 43 4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 45 4.1 Análise Fitoquímica ...... 45 4.1.1 Materiais e reagentes ...... 45 4.1.2 Equipamentos ...... 45 4.1.3 Obtenção de extratos ...... 46 4.1.4 Elucidação estrutural ...... 47 4.1.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ...... 47 4.1.6 Cromatografia Gasosa – FID ...... 48 4.2 Análise Farmacológica ...... 53 4.2.1 Avaliação da atividade antinociceptiva em modelo de dor aguda ...... 53 4.2.2 Avaliação da atividade gastroprotetora ...... 54 4.2.3 Avaliação da atividade antiproliferativa in vitro...... 57 4.2.4 Análise estatística ...... 58 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 59 5.1 Análise fitoquímica ...... 59 5.1.1 Identificação de compostos isolados ...... 59

5.2 Atividade Farmacológica ...... 72 5.2.1 Atividade antinociceptiva ...... 72 5.2.2 Atividade gastroprotetora...... 74 5.2.3 Atividade antiproliferativa in vitro ...... 90 6 CONCLUSÕES ...... 93 REFERÊNCIAS ...... 95

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1 INTRODUÇÃO

O registro da utilização de plantas como agentes terapêuticos são tão remotos quanto a era Paleolítica (FABRICANT; FARNSWORTH, 2001; RAMALINGUM; MAHOMOODALLY, 2014). Com o crescimento de doenças crônicas e complicações patológicas associadas, a saúde tornou-se alvo de investigação científica para encontrar novos alimentos e estratégias para abordar tal problema. Nos últimos anos ocorreram desafios significativos nos conceitos tradicionais de nutrição e farmacologia (RAMADAN; AL-GHAMDI, 2012; RAMALINGUM; MAHOMOODALLY, 2014). Os conhecimentos sobre o papel dos componentes fisiologicamente ativos dos alimentos, de fontes vegetais e animais tem mudado o entendimento do papel da dieta sobre a saúde (ADA, 2004). Em vista disto, há interesse mundial para melhorar a qualidade da nutrição e reduzir os gastos com saúde por meio da prevenção de doenças crônicas, da melhoria da qualidade e da expectativa de vida ativa (BADARÓ et al., 2008; STRINGHETA; OLIVEIRA; GOMES, 2007). Assim, foi esse interesse que levou a concepção do termo "alimentos funcionais", expressado também em uma variedade de termos como "pharmafoods", "medifoods", "vitafoods", ou "medicinalfoods" (KRUPA, 2008; RAMALINGUM; MAHOMOODALLY, 2014). Os alimentos funcionais possuem potencial para promover a saúde por meio de mecanismos não previstos na nutrição convencional, o que significa uma abordagem prática para alcançar o estado de saúde desejado, promovendo o bem estar e, possivelmente, a redução do risco de desenvolver enfermidades (COSTA et al., 2013; ROBERFROID, 2007; SIRÓ et al., 2008). A planta sintetiza susbtâncias químicas (metabólitos secundários) para elaboração de um sistema de proteção contra agressores presentes no ambiente, e, por conseguinte, algumas de suas funções podem ser de fungicida, de inseticida e/ou antibacteriana. Desta forma, a análise fitoquímica é realizada para conhecer os constituintes e eficácia terapêutica (VIZZOTTO; KROLOW; TEIXEIRA, 2010). É sabido que a utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das mais antigas formas de terapia medicinal 24

da humanidade (FERREIRA; DANTAS; CATÃO, 2014; LÓPEZ, 2006; VEIGA- JÚNIOR; PINTO, 2005). No que tange a efeitos gastroprotetores, diversas substâncias de origem vegetal, entre elas flavonóides, taninos e terpenóides, têm apresentado atividade gastroprotetora bastante significativa demonstrando o grande potencial dos vegetais como fontes alternativas para o tratamento desta patologia (BORRELLI; IZZO, 2000; DONATINI et al., 2009; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012a; MARQUES et al., 2006; RODRIGUEZ; HIRUMA-LIMA; SOUZA BRITO, 2004). Além disso, alguns estudos realizados com fitoconstituintes sugerem efeitos positivos no tratamento de dor e inflamação, sendo reportados por diversos autores (BRIOSCHI et al., 2009; GARCIA, 2011; MESQUITA et al., 2011). Como cita Brioschi et al. (2009, p.277) “a nutrição funcional, oferece ações úteis para auxiliar no tratamento coadjuvante da dor musculoesquelética e inflamatória, possibilitando abordagem multidimensional e maior eficácia terapêutica do que a medida medicamentosa isoladamente”. Ainda, a busca por conhecimentos acerca de plantas com potencial antiproliferativo para células carcinogênicas cresce progressivamente, sendo esta uma área promissora no que tange a saúde pública. De acordo com o INCA (2014), ocorreram 14,1 milhões de casos novos de câncer e um total de 8,2 milhões de mortes por câncer, em todo o mundo, em 2012. Esta condição continuará crescendo nos países em desenvolvimento e aumentará ainda mais em países desenvolvidos se medidas preventivas não forem vastamente aplicadas. Buscou-se, na presente pequisa, analisar a planta em estudo com o intuito de proceder o isolamento e identificação de substâncias com potencial gastroprotetor, antinociceptivo e antiproliferativo de Mimusops balata (abricó-da-Praia).

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Isolar e identificar as principais substâncias e avaliar o potencial gastroprotetor, antinociceptivo e antiproliferativo de extratos, frações e substâncias puras de Mimusops balata (abricó-da-Praia).

2.2 Objetivos Específicos:

- Preparar extratos e frações de diferentes partes de Mimusops balata; - Avaliar o material obtido em distintos modelos experimentais de dor aguda, úlcera em camundongos e ratos e avaliar a atividade antiproliferativa in vitro; - Selecionar as frações mais ativas para isolamento dos princípios ativos por meio de métodos de cromatografia convencionais (Cromatografia de Camada Delgada, Coluna Cromatográfica, etc.); - Identificar os princípios ativos obtidos por técnicas espectroscópicas usuais; - Avaliar farmacologicamente as substâncias majoritárias obtidas para verificar o potencial gastroprotetor, antinociceptivo e antiproliferativo; - Comparar o efeito biológico dos produtos obtidos com medicamentos usados na clínica.

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3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Plantas e seus metabólitos Ao longo dos tempos, o conhecimento sobre as plantas acompanhou a evolução do homem. As civilizações primitivas perceberam que as plantas comestíveis, de maior ou menor toxicidade, revelavam ainda que empiricamente, o seu potencial curativo (FERRO, 2006). São esses conhecimentos arraigados em grupos restritos que possibilitam o resgate do uso de plantas medicinais na terapêutica (CADETE et al., 2011; CARVALHO; ALMANÇA, 2003). Até o século XIX, os recursos para terapias e tratamentos de doenças eram provenientes, predominantemente, de plantas e extratos vegetais, o que pode ser comparado pelas Farmacopéias da época. Um exemplo é a Farmacopéia de Portugal (1974), na qual constam 11 produtos de origem animal, 30 produtos de origem mineral e mais de 400 espécies de vegetais (SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2010). Médicos ilustres na Antiguidade, como Hipócrates e Avicenna, já utilizavam plantas medicinais para tratamento de doenças. Em países como a China, a prática de uso de ervas como terapia é seguida há muitos séculos. No Brasil, os índios utilizavam as plantas em rituais de cura, assim como os africanos associavam-nas a rituais religiosos (FERRO, 2006). Desta forma, os recursos vegetais começaram a ser pesquisados e assim, deu-se a tendência de utilizar as substâncias ativas isoladas, denominadas “princípios ativos”, sendo este um resquício da linguagem alquimista da época (SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2010). As substâncias oriundas das plantas são comumente chamadas de fitoquímicos e podem ser classificadas como metabólitos primários ou secundários. Os metabólitos primários estão amplamente distribuídos na natureza e são necessários para o desenvolvimento fisiológico em plantas (BALANDRIN et al., 1985; YÁÑEZ et al., 2013). O metabolismo primário envolve as etapas metabólicas de fixação de carbono e nitrogênio, catabolismo e anabolismo de metabólitos primários como carboidratos, lipídeos e proteínas. Este processo é essencial à vida 28

e manutenção dos seres vivos. Têm como função a degradação de macromoléculas e fornecimento de energia (LEITE, 2009). Por outro lado, os metabólitos secundários são derivados dos metabólitos primários, são limitados em distribuição no reino vegetal e estão restritos a um grupo taxonômico particular. Metabólitos secundários são, na maioria das vezes, substâncias provenientes de adaptações a estresses ambientais (BALANDRIN et al., 1985; YÁÑEZ et al., 2013). Os metabólitos secundários têm como funções fisiológicas: defesa contra herbívoros e microrganismos, proteção contra raios ultravioleta, atração de animais polinizadores, ação alelopática e resposta ao estresse devido ao ataque microbiano. Alguns exemplos de metabólitos secundários são os flavonóides, terpenóides, alcalóides, taninos, cumarinas, óleos essenciais entre outros (LEITE, 2009). Esses geralmente não são vitais para as plantas; são a expressão química dos indivíduos e são distintos de espécie para espécie, em qualidade e quantidade; comumente são produzidos em pequenas quantidades e são intimamente influenciados pelo ambiente (FERRO, 2006). Além dos fatores ambientais comuns, outros podem influenciar o desenvolvimento de terpenos como a idade da folha, eventos fenológicos, acúmulo de nitrogênio foliar, herbivoria, injúria física e outras formas de estresse (GUENTHER, 1997; LIMA; KAPLAN; CRUZ, 2003).

3.1.1 Principais classes de metabólitos secundários As classes de metabólitos secundários mais representativas são terpenóides e compostos fenólicos e, abaixo são indicados resumidamente algumas informações de maior interesse: - Terpenóides: esta classe representa a maior classe química de constituintes ativos de vegetais, ocorrendo mais de 30.000 substâncias elucidadas (LIMA; KAPLAN; CRUZ, 2003; RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001; VERPOORTE; MARASCHIN, 2001). São obtidos pelas vias do mevalonato e da desoxixilulose-fosfato, onde ocorrem a biossíntese de unidades isoprênicas. Estas por sua vez, são precursores responsáveis pela formação de diversos produtos naturais conhecidos como terpenóides. Por este motivo, são conhecidos como isoprenóides. As unidades isoprênicas bioquimicamente ativas são identificadas como os ésteres de pirofosfato 29

(ou difosfato) de isopentenila (IPP) e pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) (LEITE, 2009). Há uma grande diversidade de terpenóides produzidos por vegetais, animais, fungos e bactérias, compondo mais de vinte mil espécies conhecidas. São compostos formados por 10, 15, 20, 30 ou 40 átomos de carbono. Nomeados, respectivamente, como mono, sesqui, di, tri e tetraterpenos. Compostos esteroidais também pertencem a esta classe, dentre eles o colesterol e os glicosídios cardiotônicos como a digitoxina e digoxina, molécula comercializada como fármaco para tratamento cardiovascular. Outros compostos, a exemplo do pigmento betacaroteno, também se incluem nessa classe (EMERY; SANTOS; BIANCHI, 2010). Em recente revisão, os monoterpenos são apontados devido a propriedades analgésica, anti-inflamatória, anestésica e antioxidante (GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2013). No artigo de revisão de Ntie-Kang e colaboradores (2014), são citados as atividades biológicas dos terpenóides (anti-inflamatório, antimicrobiano, antitripanossoma, antiplasmódico, antiúlcera) e o impacto da distribuição geográfica dos gêneros de plantas. Também são sugeridas ações para descoberta de fármacos a partir de produtos naturais na África Ocidental.

- Compostos fenólicos: estes têm como característica a presença de um grupamento hidroxila (-OH) ligado a um anel aromático (EMERY; SANTOS; BIANCHI, 2010). Este grupo ocorre vastamente na natureza, sendo de considerável importância fisiológica e morfológica para as plantas. Como um grande grupo de substâncias químicas bioativas, têm diversas funções biológicas (IGNAT; VOLF; POPA, 2011; POPA et al., 2008). Semelhantemente aos flavonóides, os ácidos fenólicos constituem importante classe de compostos fenólicos com funções bioativas, e são usualmente encontrados em plantas e produtos alimentícios. Os ácidos fenólicos podem ser divididos em dois subgrupos sendo eles ácidos hidroxibenzóicos (como ácidos gálico, vanílico, siríngico) e hidroxicinâmicos (ácidos cafeico, ferrílico, sináptico) (BRAVO, 1998; MARTINS et al., 2011). Os polifenóis são compostos de pequeno peso molecular (200-400g/mol) que ocorrem naturalmente. Eles são produzidos como metabólitos secundários que têm por função proteger o vegetal do bombardeio de patógenos e radiação ultravioleta. 30

Após a ameaça ambiental, a planta hospedeira ativa uma das vias de síntese e, assim, estruturas de polifenóis são produzidas e, posteriormente, secretadas. A especificidade do polifenol produzido dependerá em grande parte do seu hospedeiro, a região de origem e os estímulos ambientais. Muitos polifenóis são sintetizados pela via do fenilpropanóide. Entre as classes de polifenóis pode-se citar: flavonóides, estilbenos, isoflavonóides e lignanas (FERRER et al., 2008; YÁÑEZ et al., 2013). Os flavonóides têm estruturas complexas. Consistem de uma unidade de 15 carbonos com dois anéis de benzeno A e B ligados por uma cadeia de carbonos. Esta cadeia é fechada na maior parte dos flavonóides, constituindo o anel heterocíclico C; no entanto, chalconas e dihidrochalconas apresentam-se como um sistema de anel aberto. Dependendo do estado de oxidação do anel C e na ligação do anel B ao anel C, os flavonóides podem ser classificados em subclasses. Podem ser submetidos à hidroxilação, metilação, glicosilação, acilação, prenilação, e sulfonação; gerando subclasses distintas como: flavononas, flavonas, isoflavonas, flavonóis, diflavonóis e antocianidinas (BALANDRIN et al., 1985; BEECHER, 2003; STAFFORD, 1990; YÁÑEZ et al., 2013). Os taninos agregam sabor adstringente às folhas de plantas lenhosas. As ligninas são polímeros que conferem rigidez, resistência e impermeabilidade à parede celular de plantas. Há ainda outras classes conhecidas: derivados de ácidos graxos, moléculas produzidas por animais e corais marinhos, importantes para o sistema circulatório, hormonal e respiratório; policetídeos, como as naftoquinonas juglona e plumbagina, que inibem o crescimento de outras plantas competidoras que estão ao redor, aflatoxinas (substâncias tóxicas produzidas pelos fungos), tetraciclinas usadas como antibióticos no tratamento de infecções bacterianas; peptídeos, têm como exemplo as penicilinas, produzidas por fungos ou bactérias e que apresentam grande poder antibiótico (EMERY; SANTOS; BIANCHI, 2010). Os polifenóis de todas as classes são encontrados em uma grande variedade de plantas e produtos como suplementos fitoterápicos e cosméticos (FERRER et al., 2008; YÁÑEZ et al., 2013). Artigos relevantes de revisão (KHAN; HUMA; DANGLES, 2014; MUSHTAQ; WANI, 2013, YÁNEZ et al., 2013) apontam principalmente o potencial antioxidante dos polifenóis, sendo este um fator de proteção à saúde humana. 31

Foi em função dos metabólitos secundários que muitos organismos vivos sobreviveram com o passar dos séculos, transmitindo suas características de geração para geração, dando continuidade ao processo de evolução (EMERY; SANTOS; BIANCHI, 2010). Os produtos naturais, tanto de origem marinha como terrestre, especialmente as chamdas plantas superiores, são considerados uma excelente fonte de inspiração para o desenvolvimento de novos fármacos. Uma inspeção de aprovação de medicamentos revelou que aproximadamente 64% de todos os fármacos considerados, tiveram um produto natural envolvido em seu desenvolvimento, tanto em relação ao seu uso puro como modelos para a síntese destes fármacos (NEWMAN; CRAGG, 2012; VALLI et al., 2013). Neste contexto, cabe ressaltar a importância das plantas como fonte de substâncias com potencial terapêutico, podendo ser utilizadas também na forma de alimento funcional.

3.2 Alimentos funcionais Os alimentos funcionais surgiram na década de 80, no Japão, por meio de um programa de governo que tinha como objetivo desenvolver alimentos saudáveis para uma população que envelhecia e apresentava uma grande expectativa de vida, criando então outra concepção de alimentos (ANJO, 2004; COLLI, 1998; RAMALINGUM; MAHOMOODALLY, 2014; SIRÓ et al., 2008). Há duas resoluções brasileiras que aprovam o uso de alimentos com propriedades funcionais, são elas: Resolução ANVISA/MS 18/99 - Aprova o Regulamento Técnico que estabelece as Diretrizes Básicas para a Análise e Comprovação de Propriedades Funcionais e/ou de Saúde, alegadas em rotulagem de alimentos; Resolução ANVISA/MS 19/99 - Aprova o Regulamento Técnico de Procedimentos para Registro de Alimentos com Alegação de Propriedades Funcionais e ou de Saúde em sua Rotulagem (BRASIL, 1999a; BRASIL, 1999b). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 1999a, item 3.3) considera como alimento funcional “O alimento ou ingrediente que alegar propriedades funcionais ou de saúde pode, além de funções nutricionais básicas, quando se tratar de nutriente, produzir efeitos metabólicos e ou fisiológicos e ou benéficos à saúde devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica”. O termo nutracêutico é usado para alimento ou parte de um alimento que propicia benefícios à saúde, os quais incluem prevenção e/ou tratamento da doença. 32

Podem ser nutrientes isolados, suplementos dietéticos, produtos herbais e alimentos processados tais como cereais, sopas e bebidas, ou até na forma de cápsulas (ANDLAUER & FÜRST, 2002; HUNGENHOLTZ, 2002; KWAK; JUKES, 2001; MORAES; COLLA, 2006; ROBERFROID, 2002). Os nutracêuticos podem ser classificados em fibras dietéticas, ácidos graxos poliinsaturados, proteínas, peptídios, aminoácidos ou cetoácidos, minerais, vitaminas antioxidantes e outros antioxidantes (ANDLAUER; FÜRST, 2002; MORAES; COLLA, 2006) A prevenção e a redução do risco de doenças são atribuídas aos alimentos funcionais, enquanto aos nutracêuticos são atribuídas a prevenção e principalmente o tratamento das doenças (KWAK; JUKES, 2001; MORAES; COLLA, 2006). Assim, os nutracêuticos incluem suplementos dietéticos e outros tipos alimentares, enquanto que os funcionais apresentam-se sob a forma de alimento comum (ANJO, 2004). O aumento de interesse por alimentos funcionais está relacionado aos custos de tratamentos de saúde, à legislação e às descobertas científicas (IKEDA; MORAES; MESQUITA, 2010; MILNER, 2000). Considera-se ainda, o aumento da consciência dos consumidores, que desejando melhorar a qualidade de suas vidas, optam por hábitos saudáveis (MORAES; COLLA, 2006). O cultivo de vegetais que seja de simplificada execução e custo reduzido, para a produção de alimentos, pode ser uma forma importante de se oferecer alimentos de qualidade e em quantidade à população. No entanto, a cadeia produtiva nem sempre avança, devido, dentre muitos fatores, à carência de informações técnico-científicas sobre estas plantas (TOFANELLI; RESENDE, 2011). Assim, a nutrição humana tem conhecimento que os alimentos são instrumentos na prevenção de doenças, como já reportado anteriormente. A seguir, tabela proposta por ANJO (2004) adaptada de FAGUNDES & COSTA (2003) exemplifica esta prática, onde estão apresentados algumas classes de metabólitos secundários, seus efeitos e fontes alimentares:

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Tabela 1 – Princípios ativos, efeitos fisiológicos e principais fontes de alimentos funcionais. Composto ativo Efeito Fonte Terpenóides Carotenóides Atividade antioxidante e Frutas (melancia, mamão, anticancerígena melão, damasco, pêssego), verduras (cenoura, espinafre, abóbora, brócolis, tomate, inhame, nabo)

Fitoesteróis Redução dos níveis de Óleos vegetais, sementes, colesterol total e LDL-colesterol nozes, algumas frutas e vegetais

Glucosinolatos Detoxificação do fígado, Brócolis, couve-flor, repolho, atividade anticancerígena e rabanete, palmito e alcaparra antimutagênica Fenólicos Ácido fenólico Atividade antioxidante Frutas (uva, morango, frutas cítricas), vegetais (brócolis, repolho, cenoura, berin jela, salsa, pimenta, tomate, agrião), chá

Flavonóides Atividades antioxidante, Frutas cítricas, brócolis, couve, redução do risco de câncer e tomate, berinjela, soja, de doença cardiovascular abóbora, salsa, nozes, cereja

Isoflavonas Inibição do acúmulo de Leguminosas (principalmente estrogênio, redução das soja), legumes enzimas carcinogênicas Catequinas Atividade antioxidante, redução Uva, vinho tinto, morango, chá do risco de doença verde, chá preto, cacau cardiovascular

Antocianinas Atividade antioxidante, proteção Frutas (amora, framboesa) contra mutagênese

Ácidos graxos ϖ3 e ϖ6 Redução do risco de câncer e Peixes de água fria, óleo de de doenças cardiovasculares, canola, linhaça e nozes 34

redução da pressão arterial

Oligossacarídeos Redução do risco de câncer e Frutas, verduras, leguminosas, Polissacarídeos dos níveis de colesterol cereais integrais

Prebióticos Regulação do trânsito intestinal Raiz de chicória, cebola, alho, e da pressão arterial, redução tomate, aspargo, alcachofra, do risco de câncer e dos níveis banana, cevada, cerveja, de colesterol total e centeio, aveia, trigo, mel triglicerídeos, redução da intolerância à lactose

Probióticos Regulação do trânsito intestinal, Iogurte, leite fermentado redução do risco de câncer e dos níveis de colesterol total e triglicerídeos, estímulo ao sistema imunológico

3.3 Análise fitoquímica e atividade biológica: aspectos gerais Diante da imensidão das florestas, ainda não se têm conhecimento completo sobre a ocorrência, distribuição e densidade das plantas. A exploração racional e sustentável dos recursos naturais concebe oportunidades de desenvolvimento em setores como economia, agricultura, horticultura, cosméticos, alimentação e fármacos (LEITE, 2009). Distintos grupos de pesquisadores estudam a atividade biológica de plantas medicinais originárias de diversas regiões do mundo, orientados pelo uso popular das espécies nativas. A exploração científica contínua e ampliada é importante, pois o pesquisador pode determinar as qualidades e usos potenciais de produtos de espécies distintas, sendo capaz de determinar a localização dos recursos, o rendimento, problemas de logística e outros fatores que influenciam a utilização das plantas (DUARTE, 2006). O progresso na química de produtos naturais sempre esteve ligado às inovações na tecnologia analítica. A caracterização de metabólitos em misturas complexas exige técnicas sofisticadas, que deverão ter boa sensibilidade e seletividade, bem como a informação estrutural sobre os componentes de interesse. Apesar de diversos métodos de extração e estudos de compostos oriundos de 35

plantas serem demonstrados constantemente na literatura, o foco necessita ser em compostos que apresentem relevante atividade biológica. Assim, é extremamente importante a necessidade de estudos fitoquímicos guiados pelos bioensaios, seja “in vivo” ou “in vitro”. Ressalta-se importância da colaboração ampla entre químicos e farmacólogos para a análise de extratos, obtendo-se então extratos semi-puros, frações e, finalmente, os compostos puros (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; MARSTON; HOSTETTMANN, 2009; MALHEIROS et al., 2010). Geralmente extrai-se uma combinação de vários tipos de compostos bioativos ou substâncias químicas em diferentes polaridades da planta em estudo. A separação destas continua a ser um grande desafio para o processo de identificação e caracterização de compostos bioativos. É comum utilizar no isolamento destes compostos, diferentes técnicas de separação, tais como: Cromatografia de Camada Delgada (CCD), cromatografia em coluna, cromatografia flash, cromatografia de filtração em gel (Sephadex) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), entre outros (SASIDHARAN et al., 2011). Ao escolher projetos novos e inovadores para o laboratório, o pesquisador deve levar em consideração os princípios ativos que estão presentes no extrato que está sendo testado. Além disso, é imprescindível que os extratos utilizados na atividade biológica sejam padronizados, geralmente por meio de CLAE (WAGNER, 2012). Os compostos puros são então utilizados para a determinação da estrutura e atividade biológica. Além disso, as técnicas não-cromatográficas podem ser usadas para facilitar a identificação dos compostos bioativos, tais como: imunoensaio – que utilizam anticorpos monoclonais, ensaio de rastreio fitoquímico e Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (EITF) (SASIDHARAN et al., 2011). É valido ressaltar a contribuição de estudos de correlação entre estrutura química e atividade biológica, por meio da química medicinal clássica (via modificação estrutural ou síntese de análogos), que admite determinar quais são os principais fatores envolvidos na atividade de moléculas de interesse (YUNES; CECHINEL FILHO, 2012). Além disso, a avaliação biológica de um extrato vegetal necessita basear-se em informações de que a planta foi utilizada de forma etnomédica para uma condição semelhante ou idêntica, exceto quando da triagem de um alto número de plantas, usualmente in vitro. Ainda, a pesquisa somente terá valor científico se os 36

extratos demonstrarem atividades biológicas extraordinárias quando comparados com um agente antimicrobiano sintético ou natural padrão. Todos os resultados de triagens e outras investigações devem ser discutidos quanto à sua possível relevância terapêutica (WAGNER, 2012).

3.4 Dor A dor é definida como “uma sensação ou experiência emocional desagradável”, associada ao dano tecidual atual ou potencial, ou descrita em tais termos. Via de regra é subjetiva, não necessita ser verbal e relaciona-se com as experiências vividas (LOESER; TREEDE, 2008). A nocicepção abrange toda a difusão e processamento da informação dolorosa. A dor é um complexo sistema que está ligado ao aspecto comportamental devido ao processamento da informação ocorrer no sistema somatossensorial e também no sistema límbico. O começo da transmissão dolorosa se dá pelos neurônios sensoriais primários de alto limiar que também atuam como receptores chamados nociceptores. Estão subdivididos em mielínicos, do tipo A, e amielínicos, do tipo C, especializados em transmitir informações mecânicas, químicas e térmicas por meio de impulsos elétricos. Seus corpos celulares estão localizados no gânglio da raiz dorsal (GILRON et al., 2006; MONTINI; NEMAN, 2012). As fibras envolvidas na percepção tátil são as mielínicas grossas A-, já as fibras mielínicas finas A- e amielínicas C, tem como função transmitir a nocicepção e os estímulos térmicos. A nocicepção normal abrange a detecção de temperaturas altas e baixas e estímulos mecânicos intensos. Os nociceptores originam-se da pele e órgãos e findam na camada superficial do corno dorsal na medula espinhal. Os axônios das células do corno dorsal conduzem impulsos nociceptivos para o tálamo e, por meio deste, ao córtex cerebral que processa a consciência dolorosa (GILRON et al., 2006; MONTINI; NEMAN, 2012). A modulação inibitória da dor irá ocorrer com a diminuição dos estímulos periféricos e centrais que sensibilizam o sistema nervoso (GOSLIN, 2012; MOSELEY, 2003). Segundo o estudo de Calixto e colaboradores (2000), apesar da terapia da dor estar em progressivo avanço, ainda há necessidade de analgésicos potentes e eficazes, sobretudo para o tratamento da dor crônica. Uma das substâncias analgésicas mais importantes utilizados na prática clínica de hoje continua a ser o alcalóide morfina. Nesse estudo, ressaltaram a contribuição e história da Papaver 37

somniferum, as espécies de Salix, Capsicum e Cannabis sativa no desenvolvimento de analgésicos. Entre as principais classes de substâncias antinociceptivas, estão os alcalóides, terpenóides e flavonóides (CALIXTO et al., 2000). Em estudo de revisão elaborado por Gautam; Jachak (2009), estão descritos os produtos naturais anti-inflamatórios derivados de plantas e fontes marinhas relatados durante a última década. Os compostos expostos pertencem a diferentes classes químicas, tais como alcalóides, esteróides, terpenos, os polifenóis, fenilpropanóides, ácidos graxos e outros. Pan e colaboradores (2009) também estudaram as ações de compostos naturais bioativos dietéticos como frutas, vegetais, grãos, legumes, chás e vinho, demonstrando que compostos bioativos podem ser úteis no tratamento da inflamação. Na literatura, diversas plantas são citadas com potencial antinociceptivo e/ou anti-inflamatório como o trevo-roxo (OLIVEIRA et al., 2014), angico, cumaru, hortelã- graúda (LORENZI; MATOS, 2008), aroeira, barbatimão, cajueiro-roxo, canela, carqueja, camomila, catingueira, cebola branca, endro, faveleira, hortelã-miúda, juazeiro, sabugueiro (SOUSA, 2013), copaíba (MENDONÇA; ONOFRE, 2009), erva- cidreira (DANTAS, 2007) entre outras. Pesquisas experimentais em modelos de dor realizadas no NIQFAR/CCS/UNIVALI utilizando distintas espécies de plantas, exibiram efeitos promissores como: Litchi chinensis – lichia (CASTELLAIN et al., 2014), Chenopodium ambrosioides – erva de Santa Maria (GRASSI et al., 2013), Phyllathus niruri L. – quebra-pedra (MOREIRA et al., 2013), Polygala cyparissias – Gelol-da- praia (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012b), Piper methysticum – kava-kava (KORMANN et al., 2012), Litsea guatemalensis Mez. - condimento "laurel" (SILVA et al., 2012), Aleurites moluccana – nogueira-de-iguape (QUINTÃO et al., 2014; QUINTÃO et al., 2012).

3.5 Úlcera Úlceras gástricas podem ser definidas como uma ruptura no revestimento da mucosa estomacal, com uma profundidade considerável visualizada na endoscopia ou evidência histológica de implicação da submucosa. Já, as erosões são rupturas no epitélio de superfície que não tem profundidade perceptível. O termo “úlcera péptica” é usado de forma ampla para incluir úlceras e erosões, no estômago e no 38

duodeno com as mais variadas causas. Este termo se refere à pepsina, uma enzima proteolítica em solução ácida, que desempenha um papel importante na causa de ruptura das mucosas, independente do agente agressor (Helicobacter pylori, aspirina ou AINEs) (VAKIL, 2010). Décadas de investigação incidiram sobre o papel da secreção ácida e os efeitos do estresse, tipo de personalidade e genética na patogênese da úlcera. A descoberta de receptores de histamina-2 (H2) e desenvolvimento de drogas inibidoras da bomba de prótons geraram importantes mudanças na conduta da úlcera péptica. A descoberta da H. pylori e seu tratamento levaram a mudanças relevantes na prevalência e recorrência da doença, transformando a úlcera péptica, de uma doença crônica recorrente à uma doença curável (MARSHALL; WARREN, 1984; VAKIL, 2010). Diversos fatores são responsáveis pelo aparecimento da úlcera como a infecção por H. pylori, uso de AINEs, uso de álcool, fumo e outros fatores associados. Ao longo dos anos, observou-se que o desenvolvimento de úlcera não é exclusividade dos indivíduos infectados por H. pylori. Isto levou à hipótese da existência de cofatores como genética, ambiente ou ligado às distintas características das cepas de H. pylori (STEFANO; MICELI; CORAZZA, 2010). O uso de AINEs promove o aparecimento de danos na mucosa gástrica devido à inibição da enzima ciclo-oxigenase (COX-1), reduzindo a produção de prostaglandinas, muco e bicarbonato e inibição da proliferação de células epiteliais (AKAPA et al., 2014; CHAN; LEUNG, 2002; STEFANO; MICELI; CORAZZA, 2010). O tabagismo provoca redução da produção de prostaglandinas a nível da mucosa gástrica e duodenal e inibe a secreção de bicarbonato pela mucosa duodenal, além de aumentar a secreção de ácido e promover a proliferação H. pylori. Ainda, a fumaça do cigarro impede a cura das lesões ulcerativas e a sinergia com o H. pylori aumenta o risco de recorrência (AKAPA et al., 2014; CHAN; LEUNG, 2002; STEFANO; MICELI; CORAZZA, 2010). O consumo de álcool estimula a secreção de ácido gástrico, assim como o consumo excessivo de café e alguns tipos de chás. Outras condições médicas têm sido associadas ao aumento do risco de úlcera péptica, entre elas: infecção por citomegalovírus, tuberculose, doença de Crohn, cirrose, insuficiência renal, sarcoidose e doença mielo e linfoproliferativas. Outros fármacos são potencialmente ulcerosos, como esteróides, bisfosfonatos, agentes quimioterapêuticos e cloreto de 39

potássio (AKAPA et al., 2014; CHAN; LEUNG, 2002; STEFANO; MICELI; CORAZZA, 2010). Nos dias atuais, os fármacos utilizados para o tratamento de desordens gástricas produzem muitos efeitos adversos e não são tão eficientes quanto deveriam. Por esta razão, há um interesse crescente em terapias alternativas e a utilização de produtos naturais (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012a). Klein-Júnior e colaboradores (2012a) realizaram um levantamento sobre metabólitos secundários gastroprotetores naturais que foram classificados de acordo com a sua estrutura química, incluindo fontes terrestres e marinhas. Mais de 150 compostos distintos foram apresentados, dentre eles estão: flavonóides (chalconas [sofalcona], rutina, naringenina [presente em frutas cítricas e uva], catequinas [catequina, epicatequina, epicatequina galato, epigalocatequina, epigalocatequina galato]); terpenóides (sesquiterpenos, diterpenos, monoterpenóides e triterpenóides); saponinas (araloside A, ginsenoside, theasaponina, spartitrioside); polissacarídeos (xilose, galactose, glucose, arabinose, ramnose, manose, ácido galacturônico) e alcalóides (capsaicina, morfina), entre outros compostos. Alguns extratos provenientes de plantas estudadas na UNIVALI têm mostrado efeitos gastroprotetores eficazes publicados recentemente. Niero e colaboradores (2012) verificaram que os extratos obtidos a partir de G. achachairu e o composto isolado guttiferone A demonstraram resultados positivos contra úlcera em modelos de camundongos, em especial contra lesão por etanol/HCl e úlcera induzida por indometacina, suportando o uso popular desta planta. Esse efeito pode ser atribuído, a capacidade para diminuir a secreção gástrica. Guttiferone A, o principal componente das sementes, tem também potencial para utilização como um protótipo para obter novos e promissores agentes medicinais com perfis gastroprotetores. Lemos e colaboradores (2012) verificaram o efeito gastroprotetor de couve (B. oleraceae var. acephala). O tratamento de animais com o extrato foi mais eficaz do que a cimetidina na cura de lesões gástricas e também mais ativo do que as frações. O tratamento com extrato da couve foi capaz de reverter esse processo. Efeitos gastroprotetores foram observados por Silvério e colaboradores (2008), quando utilizaram o extrato alcóolico de Eremanthus erythropappus em camundongos submetidos aos modelos de úlcera induzida por indometacina e etanol. 40

3.6 Carcinogênese O termo câncer é dado a um conjunto de mais de cem tipos diferentes de doenças que têm em comum o desenvolvimento desordenado de células anormais com potencial invasivo. Origina-se por condições multifatoriais, essas causas podem agir em conjunto ou em sequência para iniciar ou promover a carcinogênese (HANAHAN; WEIBERG, 2011; INCA, 2014). O câncer é uma condição clínica grave que gera desafios sociais e econômicos significativos para o sistema de saúde. Apesar da melhoria das técnicas de imagem e de diagnóstico molecular, o câncer continua atingindo milhões de pessoas em todo o mundo. Em muitos países, o câncer é a segunda principal causa de morte, perdendo apenas para doenças cardíacas. A descoberta e identificação de novos fármacos antineoplásicos, com baixos efeitos colaterais sobre o sistema imunológico tornou-se alvo em diversos estudos de imunofarmacologia (AWASARE; BHUJBAL; NANDA, 2012; SUBHADRADEVI et al. 2010). Dados recentes de estimativas mundiais do projeto Globocan 2012, da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (International Agency for Research on Cancer), da Organização Mundial da Saúde (OMS), indicam que ocorreram 14,1 milhões de casos novos de câncer, totalizando 8,2 milhões de mortes por câncer, em 2012. Os tipos de câncer mais frequentes na população masculina foram de próstata, pulmão e cólon e reto; e entre as mulheres - mama, cólon e reto e pulmão. Em países em desenvolvimento, os cânceres de pulmão, estômago e fígado foram mais frequentes em homens; e mama, colo do útero e pulmão nas mulheres. Em 2030, a carga global será de 21,4 milhões de casos novos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, em decorrência do crescimento e do envelhecimento da população, bem como da redução na mortalidade infantil e das mortes por doenças infecciosas em países em desenvolvimento (INCA, 2014). No Brasil, a estimativa para o ano de 2014 e 2015, é a ocorrência de aproximadamente 576 mil casos novos de câncer, sendo os principais: câncer de pele do tipo não melanoma, tumores de próstata, mama feminina, cólon e reto, pulmão, estômago e colo do útero (INCA, 2014). Diante dessa situação mundial, pesquisadores têm buscado plantas com atividade antiproliferativa de carcinomas, como pode ser visto nos seguintes artigos intitulados como: eliminação de radicais livres, antiproliferativa e perfis de variações no nível de fitoquímicos em diferentes partes do brócolis (Brassica oleracea italica) 41

(CHAUDHARY et al., 2014); efeito anti-proliferativo e fitoquímica da análise do extrato de Cymbopogon citratus (HALABI; SHEIKH, 2014); atividades in vitro antioxidante e antiproliferativa, e estudo fitoquímico em diferentes extratos de flores de Nyctanthes arbortristis (KHANAPUR; AVADHANULA; SETTY, 2014); efeitos anticancerígenos de compostos bioativos berry (FOLMER et al., 2014); a capacidade antioxidante e antiproliferativa de fitoquímicos extraíveis de frutas tropicais (abacaxi, manga e mamão) (AGUIRRE et al., 2014), entre outros estudos.

3.7 Da planta em estudo: Mimusops balata (abricó-da-praia)

3.7.1 Família e Gênero Sapotaceae pertence à ordem Ericales (APG II, 2003). A família é Pantropical composta por 53 gêneros e em torno de 1100 espécies, com, aproximadamente, 400 espécies no Neotrópico, 250 na África e 350 na Ásia Tropical (MONTEIRO; ANDREATA; NEVES, 2007). Dentre os caracteres morfológicos da família, sobressai a presença de laticíferos, como espécies da América do Sul (Manilkara sp.). Embora a predominância dos laticíferos, outras estruturas e compostos ergásticos foram citados para distintos gêneros da família (MONTEIRO, 2006; MONTEIRO; ANDREATA; NEVES, 2007). Mimusops ou Manilkara é um gênero de árvores da família Sapotaceae, compreendendo 78 espécies distribuídas nos trópicos (30 no Sul e América Central, 35 na África e 13 no Sudeste Asiático) (ARMSTRONG et al., 2014; MCLOUGHLIN, 2001). A reconstrução da distribuição ancestral de classes indica que as espécies de Mimusops colonizaram a América do Sul. Esta classe da América do Sul é composta por duas subclasses, sendo elas: classe de espécies amazônicas e classe de espécies da Mata Atlântica do litoral. As subsclasses são separadas geograficamente por biomas secos do Cerrado e da Caatinga, bem como as áreas de maior relevo do escudo brasileiro. Entre as classes amazônicas estão Mimusops balata, Mimusops huberi e Mimusops paraenses (ARMSTRONG et al., 2014; GRAHAM, 2009; GREGORY-WODZICKI, 2000). 42

Na literatura, espécies de Mimusops/Manilkara se destacam com atividades biológicas já identificadas como: Mimusops elengi L., Manilkara zapota L. e Mimusops hexandra Roxb. - Mimusops elengi L.: caracteriza-se por tornar-se uma grande árvore encontrada em toda a Índia. Essa espécie tem sido usada pelas comunidades indígenas como medicamento para o tratamento de várias doenças, tais como, doenças dentárias, queimadura, desordens uterinas, úlceras, doenças cardíacas, febre e também é utilizada como diurético, adstringente e afrodisíaco (KIRTIKAR, BASU, 1988; PURNIMA et al., 2010; YOGANARASHIMAN, 1996). Também tem sido utilizado como gastroprotetor, anti-hiperlipidêmico e anti-helmíntico (GHAISAS el al., 2008; MALI; MAHAJAN; MEHTA, 2007; PAYAL et al., 2003; PURNIMA et al., 2010). Segundo resultados obtidos por Purnima e colaboradores (2010), esta espécie possui atividade anti-inflamatória, analgésica e antipirética. - Manilkara zapota L.: o sapoti (Manilkara zapota (L.) von Royen) é uma fruta tropical muito saborosa e também a frutífera mais popular da família das sapotáceas. É amplamente encontrado por todo território brasileiro. No entanto, as condições ambientais mais favoráveis para o seu cultivo estão nas regiões Norte e Nordeste (LEDERMAN et al., 2001; MENDONÇA et al., 2007). Os extratos alcoólicos e aquosos de frutos verdes (FAYEK et al., 2013) e folhas (FAYEK et al., 2012) exibiram atividades antioxidante, antihiperglicêmica e hipocolesterolêmica. O extrato etanólico das folhas apresentou atividade antiartrítica (SINGH et al., 2011). Além disso, o extrato acetato de etila da casca do caule de M. zapota demonstrou atividade antitumoral significativa contra carcinoma de Ehrlich (OSMAN et al., 2011); o extrato etanólico da casca do caule demonstrou atividade antiproliferativa para as linhagens celulares HL-60, HT-29, A 549, A 431 e MCF-7 (AWASARE; BHUJBAL; NANDA, 2012). - Mimusops hexandra Roxb.: as folhas, cascas e frutos são usados popularmente para tratamento de febre, cólica, lepra, opacidade da córnea, úlceras, helmintíase, hiperdipsia, cefaléia, icterícia, dor de dente, diarréia, como aperitivo, purificador do sangue, tônico e adstringente (KUMAR; KAUR; ARORA, 2010; MISHRA; PAREEK, 2014; PULLAIAH, 2006; WARRIER et al., 1995). A casca do caule tem sido apontada com atividade gastroprotetora em diferentes modelos experimentais de úlceras gástricas (MODI et al., 2012; SHAH; GOSWAMI; 43

SANTANI, 2004). Na pesquisa de Kumar; Kaur; Arora (2010), o extrato metanólico das folhas de Mimusops hexandra exibiu atividade antioxidante.

3.7.2 Mimusops balata (abricó-da-praia) O abricó-da-Praia, família Sapotaceae, é uma árvore perene (Figura 1), nativa da América tropical (Guiana e, particularmente, Trinidad). Ela tem como sinônimos: Manilkara bidentata, Achras balata, Mimusops balata, Mimusops bidentata, Mimusops globosa, Mimusops surinamensis, Sapota mulleri. Manilkara é um nome local do sul indiano (costa do Malabar) relatado em 1683 por um botânico holandês, H.A. van Rheede (1637-1691) (ELAND, 2013). Esta planta é conhecida popularmente como Ausubo (Dominicana, Porto Rico), Balata vermelho (Francês Guianese), Balato (Esperanto), Bala, Chicozapote (Mexicana), maçaranduba (Brasileiro) (ELAND, 2013). A árvore ocorre geralmente no litoral por se adaptar bem aos solos arenosos e salinos. Ela mede de quatro a dez metros de altura, dependendo do ambiente em que se situa e possui tronco pardo escuro e copa piramidal (CARNEIRO et al., 2011; SIMÃO, 1998). As folhas são simples, dispostas em espiral, coriáceas, ovaladas e de cor verde brilhante com nervura central amarelada. Elas medem cerca de sete a treze centímetros de comprimento por três a cinco centímetros de largura. Suas flores são isoladas ou aos pares, axilares e pedunculadas, de cor branca e rosa (CARNEIRO et al., 2011; CRUZ, 1982). Os frutos são redondos com casca resistente e dura, coloração amarela, contendo polpa esbranquiçada, envolvendo uma ou duas sementes marrons. O consumo do fruto, com polpa de sabor adocicado, se limita ao estádio maduro, pois antes disso produz um látex branco e pegajoso (CARNEIRO et al., 2011; CORRÊA, 1984). A madeira é explorada comercialmente, a árvore possui um látex não elástico, que contribui para um revestimento de alta qualidade para bolas de golfe e é empregado na fabricação de solas e cintos. No passado, a madeira vermelha escura, dura e pesada tinha uma vasta gama de utilizações como construção de obras, barcos e piso, têxtil e equipamentos de fábrica (ELAND, 2013). Os produtos de Mimusops balata podem ser exsudato laticíferos como borrachas, gomas e resinas hidrossolúveis, óleos essenciais, ceras, frutos 44

comestíveis, marfim vegetal, fontes de fibras (celulose e lignina) e alcalóides (para fins medicinais e inseticidas) (WILLIAMS, 1961). Rhourri-Frih e colaboradores (2013) realizaram pesquisa sobre o abricó-da- praia. Três triterpenos (3β-O-acetil-α-amirina, 3β-O-trans cinamoil α-amirina e 3β-O- trans cinamoil lupeol) foram isolados inicialmente a partir da resina de Mimusops balata. De acordo com os resultados, a Mimusops balata diminuiu a produção de citocinas inflamatórias IL-1β e IL-8. Esta atividade demonstra o potencial de Mimusops balata como agente anti-inflamatório e anti-idade na indústria farmacêutica e cosmética. De modo geral, na literatura, são escassas as publicações de Mimusops balata demonstrando atividades terapêuticas.

Figura 1 – Foto de uma árvore de Mimusops balata (abricó-da-praia).

Fonte:

Assim, a pesquisa da presença de metabólitos secundários em vegetais é um campo promissor na busca de combinações funcionais, preventivas ou curativas em patologias presentes na população (LEMOS et al., 2012). Sendo a dor, úlcera e câncer patologias recorrentes, buscou-se a realização de testes experimentais preliminares explorando o potencial farmacológico da planta em estudo. 45

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Análise Fitoquímica

4.1.1 Materiais e reagentes O perfil cromatográfico por CCD dos extratos, frações e substâncias puras obtidas foi delineado por meio da utilização de placas de sílica gel 60 GF254 de 20µm de espessura preparadas sobre as folhas de alumínio da Merck. Distintos sistemas de eluentes foram usados de acordo com a polaridade das amostras. Posteriormente à eluição, as cromatoplacas foram visualizadas sob luz ultravioleta antes da revelação destrutiva da amostra com os reveladores específicos. Como reveladores (CCD) foram utilizados o Anisaldeído sulfúrico (identificação de terpenos e esteróides), Cloreto férrico (compostos fenólicos), Dragendorff (alcalóides) e Hidróxido de Potássio (cumarinas) (UGAZ, 1994). As cromatoplacas foram vaporizadas com o revelador selecionado e, no caso do Anisaldeído sulfúrico, foram aquecidas à temperatura aproximada de 105ºC. Nos procedimentos de cromatografia em coluna, foi utilizada como fase estacionária, sílica gel 60 (Merck) de granulometria 70-230 mesh (ɸ = 0,063 - 0,20mm). O diâmetro e altura das colunas foram determinados de acordo com a quantidade do material a ser cromatografado. A eluição foi realizada com solventes orgânicos em ordem crescente de polaridade. Os solventes usados foram hexano

(Hex), acetato de etila (AcOEt) e metanol (CH3OH) provenientes dos Laboratórios Dinâmica, Quimex ou Vetec. As frações obtidas foram reunidas de acordo com as semelhanças de fator de retenção (Rf) verificadas nas CCDs. Para análise de RMN de 1H e RMN de 13C foram utilizados solventes deuterados (acetona, clorofórmio e metanol), provenientes da Cambridge Isotope Laboratories Inc. Além disso, foram utilizados (para extração/partição) outros reagentes como acetona, clorofórmio, éter, metanol (CH3OH), diclorometano (DCM) e sulfato de sódio, advindos comercialmente dos Laboratórios Dinâmica, Quimex e Vetec.

4.1.2 Equipamentos Para visualização da fluorescência das substâncias rastreadas por CCD, foi .e 366nm) em câmara de UV-DIST 254 =ג) utilizada radiação ultravioleta Minerallight 46

Os espectros de RMN de 1H e RMN de 13C foram realizados em espectrômetro BRUCKER AC-300F (300 MHz); tendo como referência interna o tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram registrados em valores adimensionais δ (ppm). Os extratos foram concentrados em rotavapor TECNAL TE-2II com controle de temperatura, e pesados em balança analítica SHIMADZU LIBROR-AEG-220 e SHIMADZU LIBROR-EB-33OD.

4.1.3 Obtenção de extratos A coleta das partes da planta foi realizada em dois momentos: folhas e caule ocorreram dia 13/06/2013 e casca do fruto, polpa e semente no dia 20/08/2013, na Praia Brava - Itajaí, Santa Catarina. O material botânico foi identificado pelo Prof. Oscar Iza (UNIVALI) e o voucher foi depositado no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí) sob o n. VCFilho 157. A análise fitoquímica da planta escolhida, abricó-da-Praia ocorreu em etapas. Primeiramente, o material vegetal fresco (polpa, casca do fruto e semente com pesos de 280,76g, 276,79g e 240,00g, respectivamente) e seco (folhas e caule com 530,00g e 150,50g, respectivamente) foi previamente picado e triturado (semente), para a realização da extração com metanol. A maceração ocorreu por sete dias consecutivos. Em seguida, as soluções foram filtradas e o solvente evaporado, com exceção do extrato das sementes, o qual foi evaporado a 10% de seu volume inicial para, posteriormente, realizar-se a partição de líquido-líquido. Os extratos foram analisados por meio de CCD com os eluentes hexano:acetona (8:2) e clorofórmio:metanol (8:2), variando as concentrações. De acordo com as CCDs, foram realizadas colunas cromatográficas para isolamento de compostos das partes da planta escolhida. O extrato metanólico das sementes foi submetido a partição de líquido-líquido. A concentração desse extrato foi determinada por meio de amostras em duplicata, em vidros de relógios, tendo o rendimento de 9,7% - 23,50g em 100mL de extrato metanólico bruto. Para a partição líquido-líquido, foram utilizados 100mL do extrato metanólico bruto das sementes e água, 100mL do solvente clorofórmio e posteriormente 150mL acetato de etila. 47

A fração clorofórmio foi submetida à coluna cromatográfica aberta com hexano:acetato de etila para separação de compostos. Posteriormente, com a fração acetato de etila, foram realizadas CCDs e também uma nova coluna cromatográfica aberta com os eluentes clorofórmio:metanol. Foi também analisado o resíduo vegetal, que preciptou ao deixar o extrato das folhas do abricó-da-praia em repouso. Este resíduo foi submetido à coluna cromatográfica aberta, hexano:acetato de etila, para separação dos compostos.

4.1.4 Elucidação estrutural A substância proveniente da coluna foi submetida a elucidação da sua estrutura. Para elucidar e caracterizar quimicamente o composto purificado das sementes de Mimusops balata, a taxifolina, foram utilizadas técnicas espectroscópicas usuais como Ressonância Magnética Nuclear de próton (RMN-1H) e carbono 13 (RMN-13C) e Espectrometria de Massa (MS).

4.1.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Foi utilizado um cromatógrafo líquido Shimadzu modelo LC-20AT (Japão) equipado com uma bomba quaternária e detector de arranjo de fotodiodos modelo SPD-M20A, operando a 288 nm, e um injetor modelo SIL-20AHT com um loop de amostra injetada de 20 µl, em conjunto com uma coluna Luna C18 (Phenomenex, EUA) (150 mm x 4,6 mm ID), 3 µm de tamanho de partícula. A coluna foi condicionada a 40ºC, utilizando um forno modelo CTO-10ASvp. Utilizou-se o seguinte gradiente de eluição: fase móvel A - água ultrapura (80%), a fase móvel B - MeOH foi mantido constante a 2% e a fase móvel C - acetonitrila (18%) (grau HPLC). A separação foi realizada por meio da utilização de um gradiente que iniciou com 18% e foi até 90% da fase C em 17 min, e, em seguida, isocrático durante 7 min. A fase móvel foi então retornado à sua composição inicial em 5 min permanecendo durante 6 min. A taxa de fluxo foi de 0,6 mL/min. Este procedimento foi realizado pelo Professor MSc. Theodoro Marcel Wagner e colaboradores do laboratório 203 - Instrumentação analítica, vinculados ao NIQFAR/CCS/UNIVALI.

48

4.1.6 Cromatografia Gasosa – FID As análises foram realizadas pelo Professor MSc. Theodoro Marcel Wagner- UNIVALI. Para as análises foram adotadas as seguintes condições: cromatógrafo a gás HP 6890 equipado com uma coluna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm e filme de 0,25 μm de espessura), interfaciado com um detector seletivo de massas HP 5973 operando com energia de ionização de 70 eV. O gás de arraste utilizado foi o hélio, com uma vazão de 1 mL/ min, o volume de injeção foi de 1 μL de solução do óleo em diclorometano com uma taxa de divisor de fluxo de 1:100. A seguir, as Figuras 2, 3, 4, 5 e 6 exibem resumidamente os procedimentos realizados em laboratório com as partes de Mimusops balata:

Figura 2 – Organograma da análise fitoquímica das folhas de Mimusops balata (abricó-da-praia).

FOLHAS SECAS

530,00g

Maceração MeOH - 7 dias

Evaporação Resíduo do extrato: COLUNA ABERTA

Extrato Hexano:Acetato de metanólico – Etila

42,7g/8,0% CCD rendimento Fração 23 RMN CG

CCD Anisaldeído sulfúrico,

Cloreto férrico reativado, Dragendorff, Hidróxido Possível de potássio

identificação de compostos

49

Figura 3 – Organograma da análise fitoquímica do caule de Mimusops balata (abricó-da-praia).

CAULE SECO 150,50g

Maceração MeOH - 7 dias

Evaporação

Extrato metanólico –

6,90g/4,60% rendimento

Anisaldeído sulfúrico, Cloreto férrico reativado, CCD Dragendorff, Hidróxido

de potássio

Possível

identificação de compostos

50

Figura 4 – Organograma da análise fitoquímica da polpa do fruto de Mimusops balata (abricó-da-praia).

POLPA FRESCA

280,76g

Maceração MeOH - 7 dias

Evaporação

Extrato

metanólico - 19,36g/6,90% rendimento

Anisaldeído sulfúrico, Cloreto férrico reativado, CCD Dragendorff, Hidróxido

de potássio

Possível

identificação de compostos

51

Figura 5 – Organograma da análise fitoquímica das cascas do fruto de Mimusops balata (abricó-da-praia).

CASCAS FRESCAS

276,79g

Maceração MeOH - 7 dias

Evaporação

Extrato Coluna aberta metanólico - Hexano:Acetato 18,56g/6,70% de etila rendimento

CCD Anisaldeído sulfúrico,

Cloreto férrico reativado, Dragendorff, Hidróxido

Possível de potássio identificação

de compostos

52

Figura 6 – Organograma da análise fitoquímica das sementes do fruto de Mimusops balata (abricó-da-praia).

SEMENTES

FRESCAS 240,00g

Maceração MeOH - 7 dias

Evaporação

Extrato metanólico – 23,50g em 100mL/9,70%

Fração acetato Acetato de Coluna aberta Partição de etila etila (150mL) líquido-líquido (850,00mg) Clorofórmio:Metanol

Clorofórmio CCD – Frações 49-56 (100mL) Possível identificação de compostos RMN Fração CLAE clorofórmio (175,00mg)

Coluna aberta

Hexano:Acetato de etila 53

4.2 Análise Farmacológica Os experimentos farmacológicos envolvendo úlcera e nocicepção foram realizados em parceria com professores e acadêmicos vinculados ao NIQFAR/CCS/UNIVALI. Em tais experimentos, foram empregados diferentes modelos de úlcera e nocicepção (SOUZA et al., 2000, 2003, 2010). A avaliação da atividade antiproliferativa in vitro foi realizada no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Universidade de Campinas (UNICAMP) através da Rede Iberoamericana de Investigação em Câncer (RIBECANCER/CYTED/CNPq), sob a supervisão do Professor Dr. João Ernesto de Carvalho. Todos os experimentos foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), Itajaí, SC, Brasil, sob o número de certificado de aprovação 026/14 e foram realizadas em conformidade com as normas internacionais e as diretrizes éticas do bem-estar animal.

4.2.1 Avaliação da atividade antinociceptiva em modelo de dor aguda

Animais Foram utilizados camundongos Swiss, sendo os grupos determinados por sexo (somente machos ou somente fêmeas), pesando entre 25 a 35 gramas, aclimatados a temperatura de 22 ± 2°C com ciclo claro/escuro de 12 horas mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados com água e ração “ad libitum”. Os animais permaneceram no ambiente do teste pelo menos uma hora antes da realização dos experimentos para se adaptarem. Em todos os modelos, diferentes grupos de camundongos foram pré-tratados com os extratos 30 minutos antes da realização do teste, quando os compostos foram injetados via i.p, na dose de 10 mg/Kg e, uma hora antes quando injetados via oral, na dose de 50 mg/Kg. Os animais do grupo controle receberam somente solução salina.

Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético Após os tratamentos, foi aplicado intraperitonealmente (i.p.) ácido acético (0,6%), dissolvido em NaCl 0.9%, previamente tamponado em pH 7.4, numa dose de 0,15 mL/10 g de peso (SOUZA et al., 2003; 2010). As contorções foram quantificadas acumulativamente durante 20 minutos e o indicativo de antinocicepção 54

adotado foi a redução da resposta nociceptiva (contorção), em relação ao grupo controle.

4.2.2 Avaliação da atividade gastroprotetora

Indução de úlcera por etanol/HCl O experimento foi realizado de acordo com o método descrito por Schmeda- Hirschmann; Yesilada (2005). Depois de 12 horas de jejum, os camundongos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de seis animais cada. O primeiro grupo recebeu 0,5ml do veículo (solução aquosa de Tween 80 a 1%), e o segundo grupo foi tratado com carbenoxolona (200mg/kg). Os três grupos restantes receberam 30, 100 e 300mg/kg de extratos vegetais de Mimusops balata. Os mesmos procedimentos foram feitos para realização dos testes com os extratos metanólicos da casca do fruto, polpa do fruto e taxifolina isolada, porém com três grupos de seis animais para cada um dos materiais citados. Os tratamentos foram administrados por via oral por meio de sonda esofágica. Uma hora após o tratamento, todos os camundongos receberam 0,2mL de solução 0,3M de HCl em etanol 60% para induzir a úlcera gástrica. Uma hora depois, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e os estômagos foram removidos e abertos ao longo da curvatura maior. Os estômagos foram cuidadosamente lavados com água para remover o conteúdo gástrico e coágulos de sangue, para verificação posterior. As imagens obtidas foram analisadas por meio de software específico "EARP" (desenvolvido pelo Dr. Eros Comunello, Grupo de Pesquisa em Computação Aplicada da "Universidade do Vale do Itajaí") para medir a área (mm²) da lesão.

Determinação da secreção gástrica O ensaio foi realizado utilizando o método de Shay et al. (1945) com algumas modificações. Os animais foram divididos em três grupos com seis animais por grupo. Após 12h de jejum, os animais foram anestesiados com tiopental sódico (10mg/kg, ip), o abdômen foi aberto e realizado a ligadura de piloro. Imediatamente após a ligadura de piloro, os extratos metanólicos brutos das sementes de Mimusops balata foram administrados em doses de 300mg/kg. O omeprazol (30mg/kg) foi utilizado como controle positivo, e 0,5mL de veículo (solução aquosa de Tween 80 a 1%) foi administrado como controle negativo. Todas 55

as amostras foram administradas intraduodenalmente. Quatro horas mais tarde, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, abdômen foi aberto, e outra ligadura foi colocada na extremidade do esôfago. Os estômagos foram removidos, e os conteúdos gástricos, recolhidos e centrifugados a 3000rpm (8000 x g, 25°C, 10 min). A quantidade de ácido do suco gástrico (em mililitros) e os valores de pH foram determinados. A secreção ácida total no suco gástrico foi determinada no sobrenadante por volumes a titulação para pH 7,0, utilizando uma solução de NaOH 0,01 mol/L e fenolftaleína como indicador.

Indução de úlcera por anti-inflamatório não esteroidal (AINE) O experimento foi realizado de acordo com o método descrito por Rainsford (1980), com algumas modificações. Depois de 12 horas de jejum, os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos de seis animais cada. Ao primeiro grupo foi administrado 0,5ml de veículo (Solução aquosa de Tween 80 a 1%), e o segundo grupo foi carbenoxolona (200mg/kg). O grupo restante recebeu 300mg/kg de extrato metanólico das sementes de Mimusops balata. Todos os tratamentos foram administrados por via oral. Uma hora após o tratamento, todos os animais receberam indometacina (80mg/kg, via oral) para induzir úlcera gástrica. Seis horas após o tratamento com indometacina, os animais foram sacrificados e os seus estômagos foram removidos, e os conteúdos gástricos, recolhidos e centrifugados a 3000rpm (8000 x g, 25°C, 10 min).

Quantificação de grupos sulfidrílicos não protéicos (GSH) na região glandular gástrica Os estômagos dos animais experimentais previamente submetidos ao etanol foram utilizados para verificar o efeito protetor do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata na mucosa gástrica, por meio dos níveis de grupos sulfidrílicos não protéicos (GSH). Os níveis de GSH na mucosa gástrica foram determinados através do método de Sedlak; Lindsay (1968). A parte glandular da mucosa gástrica foi pesada e diluída em tampão fosfato de potássio 200mM (pH 6,5), no qual foi preparado um homogenato. Para realização do processo de desnaturação e precipitação das proteínas presentes no homogenato, 50μl deste homogenato foi acrescido a 40μl de ácido tricloroacético (ATC) 12%, agitados por 10 minutos e 56

centrifugados por 15 minutos a 900g. Alíquotas de 10μL do sobrenadante, ou de água destilada (para o branco) foram adicionadas em 290μL de tampão TRIS a 0,4M (pH 8,9) e foram colocadas em placa de 96 poços. A reação foi iniciada com a adição de 5 μL de DTNB (5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico) a 1mM, 5 minutos antes da leitura espectrofotométrica (415nm). Os procedimentos foram realizados a 4ºC e os valores individuais interpolados numa curva padrão de GSH e expressos em µg GSH/g tecido.

Quantificação dos níveis enzimáticos de mieloperoxidase (MPO) O princípio do método baseia-se na liberação de MPO para o tecido lesado (tecido total do estômago). O homogenato produzido com a parte ulcerada adicionado de tampão fosfato de potássio (200mM) pH 6,5 foi centrifugado a 9000g por 20 minutos. O precipitado adquirido foi ressuspendido com 1mL de tampão fosfato de potássio a 80 mM na presença de 0,5% de hexadeciltrimetilamônio (HTAB). Posteriormente a homogeinização as amostras foram centrifugadas a 11000g por 20 minutos a 4°C. Em placas de 96 poços foram adicionados em triplicada 30μL do sobrenadante de cada amostra em triplicata, ou água destilada nos poços usados como branco do ensaio, acrescidos de 220 μL de uma solução contendo: 100μL de tampão fosfato 80mM, 85μL de tampão fosfato 22mM e 15μL de H2O2 0,017%. A reação foi iniciada com a adição de 20μl de tetrametilbenzidina (TMB), um substrato enzimático que resulta em um produto colorido. Então, a amostra foi incubada por 3 minutos a 37ºC, e a reação foi cessada pela adição de 30μL de acetato de sódio a 1,46 M (pH = 3,0). A atividade enzimática foi determinada em espectofotômetro a 620nm. Os resultados foram expressos como unidade de densidade óptica (D.O)/mg de tecido/3 minutos.

Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) O total de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) na mucosa gástrica foi mensurado por meio do ensaio de oxidação de ferro II na presença de xilenol laranja (JIANG; WOOLLARD; WOLFF, 1991). Para isso, as áreas ulceradas foram homogeneizadas em metanol P.A (1:4) e centrifugadas por 20 minutos em 9000g (4ºC). O sobrenadante e o reativo foram adicionados em placas de 96 poços e incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. A leitura foi realizada em espectrofotômetro 57

com comprimento de onda de 560 nm. A concentração de LOOH foi determinada para cada 1g de tecido presente no homogenato.

4.2.3 Avaliação da atividade antiproliferativa in vitro: A atividade antiproliferativa foi avaliada em três linhagens de células neoplásicas humanas: U251 (glioma), MCF-7 (mama) e NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células). Para avaliação da atividade antiproliferativa foram utilizados os valores de TGI: Total Growth Inhibition – concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular. No primeiro dia de experimento, uma suspensão celular foi preparada com meio RPMI (meio de cultura Roswell Park Memorial Institute) com 5% de soro fetal bovino (SFB) e penicilina-estreptomicina (2mg/L) e ajustada em sua respectiva densidade de inoculação. Foram aplicados 100µL de suspensão celular em placas de 96 compartimentos, que foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de

5% de CO2 e ambiente úmido. Foi também preparada uma placa controle (placa T0), com todas as linhagens celulares utilizadas no experimento. Os extratos foram diluídos em solução estoque de dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck®) na concentração de 0,1g/mL. Para a adição à cultura de células, estas soluções foram diluídas em pelo menos 400 vezes de RPMI com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina (2mg/L), o que evita a toxicidade do DMSO. As amostras foram adicionadas nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250µg/mL, (100µL/compartimento) em triplicata, e a seguir incubadas por 48 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. Como controle positivo foi utilizado o quimioterápico doxorrubicina, nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250µg/mL (100µL/compartimento), em triplicata. No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle T0 foram fixadas com a adição de 50 µL/compartimento de ácido tricloroacético (TCA) a 50% (Sigma®) para determinação da quantidade de células presentes no momento em que as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal 0. Após 48 horas de tratamento, as células foram fixadas com a adição de 50µL de TCA a 50% e incubadas por uma hora a 4ºC. Em seguida, as placas foram submetidas a quatro lavagens consecutivas com água corrente para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários e, a seguir, mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa. Após a secagem, foram adicionados 58

50 µL/compartimento do corante protéico sulforrodamina B (SRB) (Sigma®) a 0,4% (peso/volume) dissolvido em ácido acético a 1% e, a seguir, as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. As placas foram então lavadas por quatro vezes consecutivas com solução de ácido acético 1% e, após secagem completa a temperatura ambiente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com 150 µL/compartimento de Trizma Base (10µM, pH 10,5) (Sigma®). A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em leitor de microplacas a 540nm (Molecular Devices®, modelo VersaMax).

4.2.4 Análise estatística Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média, que foi apresentado como média geométrica acompanhada de seu respectivo limite de confiança em nível de 95%, estimada a partir de experimentos individuais. As análises estatísticas dos resultados foram realizadas por meio de análise de variância seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnet ou Bonferroni, quando apropriado. Valores de p<0,05 ou menos foram considerados como indicativos de significância. Todas as análises foram realizadas através do programa Graphpad Instat e os gráficos do programa Excel.

59

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise fitoquímica Após seleção e coleta da planta em estudo, iniciaram-se a preparação de extratos. A Tabela 2 exibe a quantidade de material vegetal selecionado e o rendimento obtido.

Tabela 2 – Rendimento dos materiais vegetais de Mimusops balata no preparo de extratos metanólicos. MATERIAL VEGETAL Natural (g) Extrato (g) Rendimento (%) Folha 530,00 42,70 8,00 Caule 150,50 06,90 4,60 Polpa do fruto 280,76 19,36 6,90 Casca do fruto 276,79 18,56 6,70 Semente do fruto 240,00 23,50 9,70

A seguir, a Tabela 3 exibe a triagem fitoquímica realizada a partir dos extratos metanólicos brutos de Mimusops balata por meio das CCDs.

Tabela 3 – Resultados das Cromatografias de Camada Delgada dos extratos das partes de Mimusops balata conforme reveladores utilizados. REVELADORES MATERIAL VEGETAL Anisaldeído Cloreto férrico Dragendorff Hidróxido de Potássio sulfúrico (compostos (alcalóides) (cumarinas) (terpenos e fenólicos) esteróides) Folha +++ - - - Caule ++ + - - Polpa do fruto - - - - Casca do fruto +++ - - - Semente do fruto + +++ - + Nota: +++ forte / ++ moderado / + fraco / - ausente

5.1.1 Identificação de compostos isolados

Extrato metanólico bruto das sementes do fruto Com o extrato metanólico bruto das sementes do fruto, foi realizada a partição líquido-líquido, da qual obtiveram-se duas frações distintas: a fração clorofórmio, que resultou em 175mg e a fração acetato de etila, que resultou em 850mg. Desta última se obteve, por meio de coluna cromatográfica aberta, a separação do composto puro, identificado como taxifolina, (3',4'-di-hidroxifenil)-5,7-di-hidroxi-flavanon-3-ol, 60

com a quantidade de 90mg (frações 49-56, rendimento de 11% em relação à fração acetato de etila e 0,38% em relação ao extrato metanólico bruto das sementes), cuja estrutura molecular foi evidenciada por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono13 (RMN-1H e RMN-13C), Figuras 7, 8 e 9, e confirmada por CCD e CLAE, usando amostra autêntica de taxifolina (Figura 10).

61

Figura 7 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN-1H) da Taxifolina isolada das sementes de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD).

62

Figura 8 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-13C) da Taxifolina isolada das sementes de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD).

63

Figura 9 – Espectro expandido de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-13C) da Taxifolina isolada das sementes de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD).

64

Figura 10 – Cromatograma de CLAE. Sobreposição das amostras: (a) extrato metanólico da semente de Mimusops balata e (b) Taxifolina no comprimento de onda 288 nm.

A Tabela 4 exibe a comparação dos dados de RMN do composto isolado com a literatura.

Tabela 4 – Comparação da estrutura química da taxifolina conforme literatura*.

Taxifolina (CD3OD)* Composto 49-56 (CD3OD) 1H (500MHz) 13C (75MHz) 1H (300MHz) 13C (75MHz) 2 δ 4,92 (d, 1H, J=11,0) δ 85,09 δ 4,93 (d, 1H) δ 85,18 3 δ 4,50 (d, 1H, J=11,0) δ 73,64 δ 4,52 (d, 1H, J=11,4) δ 73,73 4 δ 198,37 δ 198,49 5 δ 164,27 δ 164,57 6 δ 5,91 (d, 1H, J=2,0) δ 97,29 δ 5,93 (d, 1H, J=2,1) δ 97,37 7 δ 168,72 δ 168,76 8 δ 5,89 (d, 1H, J=2,0) δ 96,27 δ 5,89 (d, 1H, J=2,1) δ 96,35 9 δ 164,47 δ 165,36 10 δ 101,79 δ 101,91 1’ δ 129,82 δ 129,92 2’ δ 6,97 (d, 1H, J=2,0) δ 115,85 δ 6,97 (d, 1H, J=1,5) δ 115,95 3’ δ 146,28 δ 146,37 4’ δ 147,11 δ 147,20 5’ δ 6,81 (d, 1H, J=8,0) δ 116,05 δ 6,81 (d, 1H, J=8,1) δ 116,16 6’ δ 6,86 (dd, 1H, J=2,0 e 8,0) δ 120,88 δ 6,86 (dd, 1H, J=1,8 e 8,1) δ 120,99 *Bahia; David; David (2010).

65

A taxifolina, um conhecido flavanonol, é o composto de maior abundância nas sementes do vegetal escolhido, o que despertou interesse em realizar os testes biológicos para verificação de potencial gastroprotetor, antinociceptivo e antiproliferativo de Mimusops balata.

Figura 11 – Estrutura química da taxifolina (3',4'-di-hidroxifenil)-5,7-di-hidroxi- flavanon-3-ol) ou dihidroquercetina, isolada das sementes de Mimusops balata.

5’ 6’ 4’

8 3’ 9 2

7 2’ 3 6 10 5 4

A estrutura da taxifolina (Figura 11) é semelhante à da catequina apresentando os mesmo grupos funcionais que lhe conferem características ácido- base nas condições experimentais descritas, apresentando um grupo carbonila na posição 4 (TEIXEIRA, 2001). A taxifolina foi isolada do extrato metanólico das sementes de Mimusops elengi L. por Sahu (1996). Além da taxifolina, nas sementes de Mimusops elengi L. constituem-se de quercitol, quercitina, β-sistosterol e α-espinaterol (GAMI; PATHAK; PARABIA, 2012; MISRA; MITRA, 1967). Um estudo comparativo entre os extratos de diferentes partes permitiu evidenciar que a taxifolina está restrita às sementes, não estando presente nas demais partes de Mimusops balata. É importante ressaltar o elevado rendimento da taxifolina nas sementes, podendo constituir-se de fonte de obtenção desta importante substância natural.

Utilização empírica e comercial da taxifolina A taxifolina é utilizada para tratar diversas doenças como a infecção do sistema urinário, complicações da diabetes, hipercolesterolemia, leptospirose, dermatite, brucelose, eczema, acne, disenteria bacteriana aguda, nefrite aguda e crônica, sífilis, artrite, foliculite, dor, aterosclerose, síndrome da fadiga crônica e 66

síndrome metabólica, oferece proteção contra doenças cardiovasculares e ajuda a saúde do sistema nervoso e é utilizada também como antiofídico. Várias plantas que contêm taxifolina são utilizadas na medicina tradicional e clínica, algumas são ingeridas na dieta humana e outras estão sendo estudadas para a sua utilização potencial no desenvolvimento de medicamentos. Vários cultivares de vinho foram analisados pelo seu conteúdo de taxifolina. A medicina tradicional chinesa utiliza taxifolina para tratar pacientes com AIDS e câncer. A taxifolina tem sido estudada devido as suas propriedades antioxidante, anti-inflamatória e analgésica, capacidade hepatoprotetora, entre outras. Além disso, a taxifolina é comercialmente disponível como um aditivo alimentar e é usada em óleos vegetais, leite em pó, em pastelaria e assim por diante. Pode-se exemplificar plantas como o pinheiro bravo (Pinus pinaster) – usado no tratamento de déficit de atenção e hiperatividade na Europa; katsura (Cercidiphyllum japonicum) – eficaz no crescimento do cabelo. (GUNDAMPATI; JAGANNADHAM, 2012; GUPTA et al., 1971; IRMANIDA; HARLINDA; TOHRU, 2010; LEE et al., 2007; YÁÑEZ et al., 2013).

Taxifolina: estudos biológicos prévios Segundo o estudo de Joo e colaboradores (2014) sobre flavonóides de Machilus japonica e seus efeitos inibitórios sobre a oxidação de LDL, a taxifolina, isolada do caule de Machilus japonica, exerceu atividade antioxidante e efeito inibidor sobre a oxidação do LDL, semelhante ao controle positivo. Os antioxidantes atuam doando átomos de hidrogênio para os radicais lipídicos. Antioxidantes possuem estruturas moleculares capazes de gerar radicais estáveis, tais como fenóis que podem interromper a reação em cadeia de oxidação. Na pesquisa de Lin e colaboradores (2014), sobre atividade antioxidante das folhas de espécies de Rhododendron nativas de Taiwan, demonstrou-se que a taxifolina era um dos compostos considerados importantes devido a sua atividade biológica, sendo um excelente antioxidante, por meio da eliminação do radical DDPH. De acordo com o estudo de Vieira-Júnior (2010), entre os constituintes químicos das folhas de Casearia gossypiosperma estão dois flavonóides: taxifolina e quercetina. A atividade anticolinesterásica apresentou resultados interessantes, sendo que a taxifolina apresentou percentual de inibição da enzima acetilcolinesterase de 76%. A taxifolina também exibiu atividade antifúngica frente às 67

cepas dos fitopatógenos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum. Um trabalho desenvolvido por Teixeira (2001), para elucidar as propriedades dos compostos fenólicos existentes na uva e no vinho (entre eles, a taxifolina), concluiu que os flavonóides e os ácidos cinâmicos, são antioxidantes. Isto pode ocorrer por via de dois mecanismos: por meio da capacidade de sequestrar radicais livres e/ou por meio da complexação de metais pró-oxidantes, como o cobre. Ainda, o estudo de Cechinel Filho e colaboradores (2000), avaliou, utilizando testes de formalina e contorções em camundongos, a atividade antinociceptiva e antiedematogênica de Hymeneae martiana e seus compostos isolados, a astilbina e taxifolina. Os resultados indicaram que a taxifolina exibiu ação antinociceptiva potente, por vias oral e intraperitoneal. Além disso, exibiu efeito antiedematogênico significativo, por meio da inibição da formação do edema da pata induzido por dextrano.

Extrato metanólico das folhas Além do isolamento e identificação da substância majoritária da semente, foi analisado o resíduo vegetal, obtido pela precipitação após repouso do extrato das folhas do abricó-da-Praia. O resíduo foi submetido à coluna cromatográfica aberta, hexano:acetato de etila, para separação de compostos. A fração 23 resultou 14mg e foi identificada como a α-amirina e β-amirina (~75:25%), (Figura 12). Os dados apresentados na Figura 13 (RMN1H) e Figura 14 (RMN13C) são compatíveis com a mistura de α e β-amirina e estão de acordo com os dados da literatura (DIAS; HAMERSKI; PINTO, 2011). Os espectros demonstrados nas figuras 13 (RMN-H) e 14 (RMN-13C) são compatíveis com as estruturas de α e β amirina, em comparação com os dados da literatura, destacando-se no espectros de 13C os sinais em 139.6 e 124.7 ppm característicos de α-amirina e 145 e 122 ppm característicos de β-amirina, referente aos carbonos olefínicos, C12 e C13 (DIAS; HAMERSKI; PINTO, 2011).

68

Figura 12 – Estruturas químicas de α-amirina e β-amirina.

(1) R = R2 = CH3, R1 = H 3α-hidroxiurs-12-eno (α-amirina)

(2) R = R1 = CH3, R2 = H 3β-hidroxiolean-12-eno (β-amirina) Fonte: Bandeira et al., 2007; Mahato; Kundu, 1994.

69

Figura 13 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN-1H) da mistura de α-amirina e β-amirina isolada do resíduo das folhas de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD).

70

Figura 14 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN-13C) da mistura de α-amirina e β-amirina isolada do resíduo das folhas de Mimusops balata em metanol deuterado (CD3OD).

71

A relação de aproximadamente 75% para 25% de α-amirina e β-amirina, respectivamente, foi confirmada pela Cromatografia Gasosa, cujo cromatograma (Figura 15) indica tal relação, com TR de 7,862 min para β-amirina e 8,133 min para α-amirina. A α-amirina foi isolada previamente da resina desta planta por Lawrie; McLean; Olubajo (1970).

Figura 15 – Cromatograma obtido por CG (FID) para a amostra 23.

72

5.2 Atividade Farmacológica

5.2.1 Atividade antinociceptiva A avaliação da atividade antinociceptiva da Mimusops balata foi realizada por meio do modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos. Foram administrados extratos brutos de diferentes partes da planta em estudo, por via oral (dose de 50mg/kg de peso corporal) e por via intraperitoneal (dose de 10mg/kg de peso corporal). A seguir, nas Tabelas 5 e 6 observam-se as porcentagens de inibição do processo nociceptivo induzido por ácido acético em relação às partes da planta em estudo.

Tabela 5 – Porcentagem de inibição de contorções abdominais em camundongos após a administração de extratos metanólicos brutos de Mimusops balata e Paracetamol por via intraperitoneal na dose de 10mg/kg. Material %inibição

Extrato MeoH - Folha 42,31 ± 4,143* Extrato MeoH - Casca do fruto 63,38 ±1,662**

Extrato MeoH - Polpa 53,86 ±1,358** Extrato MeoH - Semente 94,48 ±0,477**

Paracetamol (controle positivo) 38,00 ±1,000**

Veículo (controle negativo) 0,00

Observações: *p<0.05 / **p<0,01, grupo controle negativo = veículo: tween + solução salina ± EPM = Erro Padrão da Média

Pode-se observar que todos os extratos utilizados apresentaram resultados estatisticamente significativos, tendo destaque o extrato metanólico obtido da semente de Mimusops balata. Na administração intraperitoneal, todos os extratos brutos tiveram ação antinociceptiva mais eficaz quando comparados ao controle positivo (Paracetamol). Dentre os extratos administrados por via oral, o extrato da semente da planta em estudo superou a porcentagem de inibição de contorções abdominais quando comparado ao controle positivo.

73

Tabela 6 – Porcentagem de inibição de contorções abdominais em camundongos após a administração de extratos metanólicos brutos de Mimusops balata e Paracetamol por via oral na dose de 50mg/kg. Material %inibição Extrato MeoH - Folha 48,45 ± 4,326** Extrato MeoH - Casca do fruto 56,83 ±2,789** Extrato MeoH - Polpa 56,84 ±3,756** Extrato MeoH - Semente 74,00 ±3,911** Paracetamol (controle positivo) 59,03 ±1,727** Veículo (controle negativo) 0,00

Observações: **p<0,01, grupo controle negativo = veículo: tween + solução salina ± EPM = Erro Padrão da Média

Tanto por via intraperitoneal como via oral, as sementes demonstraram potencial mais promissor, possivelmente devido a presença da taxifolina que exibe importantes efeitos antinociceptivos, conforme indicado por Cechinel Filho e colaboradores (2000). Nos testes de contorção abdominal induzida por ácido acético, a dor, induzida pela aplicação de um agente irritante (ácido acético) na cavidade peritoneal do animal, gera episódios de contorção. A inibição do número destes movimentos, por analgésicos, é facilmente quantificável. Ainda, estes resultados sugerem a hipótese de participação dos extratos na inibição da síntese das prostaglandinas, uma vez que o mecanismo nociceptivo de contorções abdominais induzidas por ácido acético envolve o processo ou a liberação de metabólitos provenientes do ácido araquidônico via ciclooxigenase e a biossíntese de prostaglandinas (DUARTE; NAKAMURA; FERREIRA, 1988; MELO et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2009). Corroborando com a presente pesquisa, de Sehgal e colaboradores (2011), investigaram a atividade antipirética e analgésica do extrato metanólico das folhas de Mimusops elengi L., por via oral, em ratos. A triagem fitoquímica acusou a presença de flavonóides, alcalóides, taninos e esteroides. Observou-se que esta atividade foi obtida na dose de 200mg/kg. O extrato também demonstrou atividade significativa como antipirético. Ainda, Purnima e colaboradores (2010) observaram que os extratos etanólicos da casca de Mimusops elengi L. exibiram efeitos anti-inflamatório, analgésico e antipirético em ratos. O extrato da planta (200mg/kg, via oral) diminuiu 74

a contorção induzida por ácido acético, porém não aumentou o tempo de latência no teste da placa quente. O estudo de Nasrin; Dash; Saha (2011) reportaram atividades analgésicas e neurofarmacológicas da casca de Mimusops elengi L., em testes realizados em ratos. No teste de contorção induzida por ácido acético, o extrato, na dose de 400mg/kg, via oral, teve 65,48% de inibição de contorções em comparação com o grupo controle. Na pesquisa de Karmakar; Sultana; Biswa (2011), com as folhas de Mimusops elengi L., observou-se efeitos antioxidante, antinociceptivo e citotóxico em ratos. O extrato inibiu significativamente 45,61% e 63,85% as contorções em doses de 250mg/kg e 500mg/kg, respectivamente, quando administradas por via oral. Em que pese os prévios estudos com a Mimusops elengi L., os estudos apresentados nesta dissertação são descritos pela primeira vez para a Mimusops balata.

5.2.2 Atividade gastroprotetora

Modelo de úlcera gástrica induzida por etanol/HCl O fruto de Mimusops balata foi testado em camundongos a partir de três extratos metanólicos brutos: da casca, da polpa e das sementes. Os extratos da casca e polpa não apresentaram resultados estatisticamente neste modelo (Figuras 16 e 17). No entanto, o extrato metanólico bruto das sementes apresentou resultados positivos em relação à atividade gastroprotetora. Na dose de 300mg/kg observou-se acentuada diminuição na área lesada p<0,05 com atividade superior ao controle positivo carbenoxolona (Figuras 18 e 19).

75

Figura 16 – Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico da casca do fruto de Mimusops balata em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

40

) 2 30

20

10

Área Lesada (mm Lesada Área *** 0 Vei Cbn 30 100 300 M. balata (mg/kg, v.o) Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. ***p<0,001, quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

Figura 17 – Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico da polpa do fruto de Mimusops balata em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

60

) 2

40

20

Área Lesada (mm Lesada Área *** 0 Vei Cbn 30 100 300 M. balata (mg/kg, v.o) Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. ***p<0,001, quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

76

Nas Figuras 18 e 19 estão apresentados os resultados do extrato da semente de Mimusops balata. O extrato teve resultado estatisticamente significativo, na dose de 300mg/kg, reduzindo a área lesada (mm²) dos estômagos de camundongos, sendo mais eficaz que o controle positivo (carbenoxolona).

Figura 18 – Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

40

30

20

10

Área Lesada (mm²) Lesada Área * * 0 Vei Cbn ______30 100 300 M. balata (mg/kg, v.o) ______Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. *p<0,05, quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

Figura 19 – Fotos dos estômagos de camundongos submetidos aos efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata, no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

Veículo Carbenoxolona 30mg/kg 100mg/kg 300mg/kg Extrato das sementes de M. balata Etanol/HCl

77

Pode-se também observar nas Figuras 20 e 21, que no mesmo modelo utilizado, a taxifolina, na dose de 1,14mg/kg produziu um relevante efeito gastroprotetor quando comparado ao veículo, no que diz respeito à área lesada. Enfatiza-se que ainda não há estudos prévios sobre efeitos gastroprotetores da taxifolina.

Figura 20 – Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e taxifolina (T) isolada do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (1,14mg/kg) em camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

40

30

20 *

10

Área Lesada (mm²) Lesada Área *** 0 Vei Cbn T1,14 Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona. T1,14 = taxifolina na dose 1,14mg/kg.

Figura 21 – Fotos dos estômagos de camundongos submetidos aos efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e taxifolina (T) isolada do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (1,14mg/kg), no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

Veículo Carbenoxolona 1,14mg/kg Taxifolina Etanol/HCl

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Corroborando com os resultados obtidos, o estudo de Shah e colaboradores (2003) investigou o efeito do extrato da casca do caule de Mimusops elengi (família Sapotaceae) contra úlceras gástricas em camundongos. No modelo de úlcera gástrica induzida por etanol, o extrato mostrou redução nas úlceras. No modelo ligadura de piloro, a fração acetato de etila reduziu o índice de úlcera, a acidez total, o volume da secreção de ácido gástrico, a produção total de ácido e a atividade da pepsina quando comparado com o grupo controle. O estômago é o órgão do corpo humano que possui o ambiente mais peculiar devido a quantidade elevada de ácido clorídrico, que desempenha um papel de extrema relevância impedindo a entrada de muitos microrganismos, protegendo, assim, o organismo de agentes infecciosos. Em contrapartida, as mucosas estomacal e duodenal ficam vulneráveis à ação do ácido e da pepsina, responsáveis pelo início do processo de digestão (BIGHETTI; ANTÔNIO; CARVALHO, 2002; CALOU et al., 2014). Um fator agravante da ulceração é o etanol, que atua irritando a mucosa devido à capacidade de degradação da camada de muco e do bicarbonato, que protegem a mucosa contra o ácido clorídico e outros agentes agressores. O etanol age bloqueando a citoproteção gástrica por precipitação das proteínas, liberação de radicais livres e diminuição da concentração de compostos com sulfidrilas nas células da mucosa (OCHI et al., 2005; PACHECO et al., 2006; POSSENTI et al., 2011). Em condições normais, a mucosa dispõe de mecanismos que a defendem desses fatores endógenos e também de agentes agressivos exógenos como etanol, drogas anti-inflamatórias e estresse. A síntese de muco citoprotetor e bicarbonato formam uma barreira que neutraliza a ação do ácido sobre as células (ALLEN et al., 1993; CALOU et al., 2014). Em relação à produção de muco (Figura 22), os resultados obtidos demonstram que o tratamento com o extrato da semente de Mimusops balata, não alterou a produção de muco nos animais quando comparado com o controle positivo (carbenoxolona).

79

Figura 22 – Quantificação de muco (µg de Alcian Blue/g de tecido) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (30, 100 e 300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.

8000

** ** 6000

4000 Muco

2000

g de Alcian Blue/g de tecido) de Blue/g Alcian de g 0 

( Naive Vei Cbn 30 100 300 M. balata (mg/kg, v.o) Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. **p<0,01 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Naive = animais sem tratamento farmacológico. Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

A Figura 23 demonstra a quantificação dos niveis de GSH (µg/g de tecido) em estômagos de camundongos após o tratamento com o extrato da semente de Mimusops balata nas doses de 30, 100 e 300mg/kg, no modelo de etanol/HCL.

80

Figura 23 – Quantificação dos níveis de GSH (µg/g de tecido) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (30, 100 e 300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.

800

** 600 **

400

g/g tecido) g/g 

200 GSH GSH (

0 Naive Vei Cbn 30 100 300 M. balata (mg/kg, v.o) Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. **p<0,01 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Naive = animais sem tratamento farmacológico. Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

Os resultados indicam que somente a dose mais elevada (300mg/kg) do extrato das sementes de Mimusops balata produziu aumento dos níveis de GSH de forma significante (p<0,01). A mucosa gástrica apresenta altas concentrações de glutationa reduzida, substância sulfidrílica não proteica, tendo como função a citoproteção gástrica por impedir um aumento de permeabilidade vascular e, também, por impedir a ação nociva de radicais livres tóxicos para as células da mucosa (POSSENTI et al., 2011). O dano oxidativo tem um papel crítico no desenvolvimento ou retardo na cicatrização de úlceras gástricas. Terapias que aumentam as defesas antioxidantes da mucosa gástrica são consideradas benéficas no tratamento da patologia (KAPLAN et al., 2012). Um biomarcador importante de danos oxidativos é peroxidação lipídica que é um processo em que ácidos graxos de cadeia polinssaturadas são oxidados, incluindo aqueles que compõem a membrana celular ou organelas, devido à ação de radicais livres (DEMIRCAN et al., 2005). Assim, a atividade antioxidante intracelular é fundamental para a proteção celular em tecidos gástricos. A GSH e GR têm um papel proeminente na reparação 81

tecidual quando as espécies reativas de oxigênio (EROs) estão envolvidas (ARAÚJO et al., 2011; MORAIS et al., 2010). Um aumento nos níveis de GSH mostra um paralelo com o fenômeno de adaptação, quanto maior o nível de GSH, menor será o dano. A GSH e outros antioxidantes impedem danos nos tecidos, mantendo EROs em níveis fisiológicos (ARAÚJO et al., 2011; POLAT; SULEYMAN; ALP, 2010). A Figura 24 exibe a quantificação dos níveis de MPO (D.O/mg proteína/3 minutos) em estômagos de camundongos após o tratamento com o extrato da semente de Mimusops balata na dose de 300mg/kg, no modelo de etanol/HCL. Esta dose administrada produziu redução de MPO estatisticamente significativa quando comparada ao veículo.

Figura 24 – Quantificação dos níveis de MPO (D.O./mg proteína/ 3 minutos) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.

30

20

10

** * * 0

MPO (D.O/mg proteína/3 minutos) proteína/3 (D.O/mg MPO Naive Vei Cbn ______300 ______M. balata (mg/kg, v.o.) Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. *p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Naive = animais sem tratamento farmacológico. Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

A MPO é uma enzima existente nos leucócitos polimorfonucleares e catalisa a formação de ácido hipocloroso de peróxido de hidrogênio, o qual tem efeito tóxico. A produção excessiva de MPO e outros radicais reativos causam danos oxidativos, os 82

quais são representados pela medição dos níveis de peroxidação lipídica – uma razão importante para os danos da membrana celular (ARAÚJO et al., 2011; DURSUN et al., 2009). A Figura 25 demonstra a quantificação dos níveis de LOOH (mmol/mg de tecido) em estômagos de camundongos após o tratamento com o extrato da semente de Mimusops balata na dose de 300mg/kg, no modelo de etanol/HCL. O extrato administrado mostrou redução de LOOH quando comparado ao veículo.

Figura 25 – Quantificação dos níveis de LOOH (mmol/mg de tecido) após administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de camundongos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.

5

4

3 ***

LOOH 2

1 (mmol/mg de tecido) de (mmol/mg 0 Naive Vei Cbn 300 M. balata (mg/kg, v.o) Etanol/HCl

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Naive = animais sem tratamento farmacológico. Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

Em modelos de gastroproteção, a administração de indometacina ou etanol induz à atividade de espécies reativas derivadas de oxigênio (EROs) aumentada na mucosa gástrica, levando a um aumento da peroxidação lipídica (KUMAR et al., 2012; MILLER; HENAGAN, 1984). A redução no nível de LOOH pode ser atribuido à propriedade antioxidante que possui o extrato utilizado (KUMAR et al., 2012; KUMAR et al., 2008). De modo geral, quanto ao estresse oxidativo da mucosa, os dados aqui apresentados demostraram que o agente necrotizante etanol/HCl causou uma 83

diminuição dos níveis de GSH e um aumento do conteúdo de lipoperóxidos. Por outro lado, devido ao aumento da atividade de antioxidantes ou de eliminação de radicais livres, o tratamento com o extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) foi capaz de prevenir a depleção de GSH e a formação de lipoperóxidos. Estes resultados mostram claramente que a redução no dano oxidativo ocorreu devido ao efeito gastroprotetor das sementes do fruto Mimusops balata, como indicado para a casca do caule de Mimusops hexandra (MODI et al., 2012). Ainda, Santin e colaboradores (2013) mostraram que a migração de neutrófilos para o tecido do estômago tem um papel importante no dano causado por administração de etanol/HCl. Deste modo, a atividade de MPO é um parâmetro importante a ser avaliado, sendo utilizada como um marcador bioquímico para a infiltração de neutrófilos nos tecidos estudados (SOUZA et al., 2004). Como esperado, a administração de etanol/HCl levou a um aumento na atividade de MPO em tecido gástrico enquanto o tratamento com o extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) foi capaz de reduzir a atividade de MPO. Estes dados indicam que as sementes de Mimusops balata podem diminuir a gravidade da úlcera gástrica por meio da inibição do recrutamento de neutrófilos.

Modelo de determinação de secreção gástrica O ensaio de determinação de secreção gástrica é um processo classicamente utilizado para avaliar o efeito antissecretor dos produtos naturais. Na utilização deste modelo é possível ver alterações nos parâmetros de produção do ácido gástrico, tais como o volume, o pH e a acidez total. (BAGGIO et al., 2003; HUAMAN et al., 2013). De acordo com a Figura 26, o tratamento com extrato metanólico da semente de Mimusops balata, na dose de 300mg/kg, diminuiu significativamente o volume (ml) de suco gástrico em estômagos de ratos quando comparado ao veículo. O mesmo resultado foi obtido no grupo de animais tratados com omeprazol.

84

Figura 26 – Quantificação de volume (ml) de suco gástrico após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica.

10

8

6 **

4 ** Volume (ml) Volume 2

0 Vei Ome 300 M. balata (mg/kg, i.d)

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. **p<0,01 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Ome = omeprazol.

A principal função do estômago é a produção de ácido clorídrico (SCHUBERT; KAUNITZ, 2010). A ulceração gástrica produzida por ligação pilórica é causada pelo aumento da acumulação de ácido gástrico e da pepsina, levando a autodigestão da mucosa gástrica. Fatores defensivos como o muco e glicoproteínas (hexosaminas) são conhecidos por proteger as camadas submucosas da difusão de íons de hidrogênio (BELL et al., 1985; GOEL; BHATTACHARYA, 1991; KUMAR et al., 2012; WILLIAMS; TURNBERG, 1980). O ácido no estômago facilita a digestão de proteínas por conversão da proenzima pepsinogênio à enzima pepsina proteolítica ativa e, ainda, facilita a absorção de ferro, cálcio, vitamina B12 e certos fármacos bem como o previne o crescimento bacteriano e infecção entérica. A integridade da mucosa gástrica depende de um equilíbrio entre secreções agressivas: o ácido e pepsina, e defensivas: como o bicarbonato e mucina. Desta forma, a ulceração pode ocorrer quando os mecanismos de defesa da mucosa estão sobrecarregados (SCHUBERT; KAUNITZ, 2010). 85

Em relação ao pH estomacal dos animais, a Figura 27 demonstra que o extrato da semente de Mimusops balata, na dose de 300mg/kg, aumentou significativamente o pH em estômagos de ratos quando comparado ao veículo.

Figura 27 – Quantificação de pH após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica.

8 ***

6 ***

4 pH

2

0 Vei Ome 300 M. balata (mg/kg, i.d)

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Ome = omeprazol.

Os resultados obtidos na Figura 28 reforçam aqueles observados na Figura 24 quanto aos efeitos do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata sobre o pH e a acidez estomacal dos animais tratados com essa planta. Assim, a Figura 28 mostra a acidez (mEq [H+]) em estômagos de ratos a partir do tratamento antiulcerogênico do extrato da semente de Mimusops balata, no modelo de ligadura de piloro. Observa-se que o extrato na dose de 300mg/kg teve resultado estatisticamente significativo, diminuindo a acidez do estômago.

86

Figura 28 – Quantificação de acidez (mEq [H+]) após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica.

0.08

]) + 0.06

0.04 ***

0.02

Acidez (mEq [H (mEq Acidez ***

0.00 Vei Ome 300 M. balata (mg/kg, i.d)

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Ome = omeprazol.

As pepsinas são especialmente ativas em pH de 1,8 a 3,5. Em pH 5, são inativadas de forma reversível e, são irreversivelmente desnaturadas a pH 7. O ácido gástrico não proporciona somente um pH excelente para a atividade péptica, mas a própria pepsina desnatura a proteína dietética, tornando-a mais suscetível à hidrólise péptica. Desta forma, o ácido e a pepsina atuam em conjunto para promover a digestão da proteína na dieta (SCHUBERT; KAUNITZ, 2010). De acordo com estudos prévios, o papel do ácido e pepsina na gênese e perpetuação da lesão da mucosa continua a ser um aspecto unificador da patogênese da úlcera péptica (VAKIL, 2010). A Figura 29 exibe a atividade péptica em estômagos de ratos após o tratamento com o extrato da semente de Mimusops balata, na dose de 300mg/kg. Observa-se que o extrato exibiu redução da atividade péptica estatisticamente significativa quando comparado ao veículo.

87

Figura 29 – Efeitos da administração oral de omeprazol (30mg/kg) extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) na atividade péptica (µM de tirosina/4 horas) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica.

2.0

1.5 ** 1.0 ***

0.5 Atividade péptica Atividade

(uM de tirosina/4 horas) tirosina/4 (uM de 0.0 Vei Ome 300 M. balata (mg/kg, i.d.)

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Ome = omeprazol.

A Figura 30 mostra que a produção de muco não aumentou significativamente após a administração de 300mg/kg do extrato da semente de Mimusops balata.

Figura 30 – Quantificação de muco (µg de Alcian Blue/g de tecido) após administração oral de omeprazol (30mg/kg) e extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em estômagos de ratos submetidos ao modelo de determinação de secreção gástrica.

2000

1500

1000

Muco

500

g de Alcian Blue/g de tecido) de Blue/g Alcian de g 0



( Vei Ome 300 M. balata (mg/kg, i.d)

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. Vei = veículo. Ome = omeprazol. 88

Neste ensaio, o tratamento com o extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) diminuiu o volume e acidez total do suco gástrico, sendo os efeitos semelhantes aos observados em animais tratados com omeprazol, confirmando assim, a contribuição do efeito antissecretório na atividade gastroprotetora do extrato utilizado. Adicionalmente, o aumento de pH promovido pelo tratamento com o extrato foi capaz de diminuir a atividade da pepsina. Além disso, considerando que a administração do extrato foi por via intraduodenal, estes dados indicam que o extrato das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) é eficaz após a absorção, tem efeito sistêmico e sua atividade gastroprotetora não está relacionada a uma neutralização local do conteúdo gástrico ou uma barreira física contra agentes ulcerosos. Além das ações antissecretoras, a proteção gástrica promovida por produtos do extrato das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) pode estar associada com a manutenção da camada de muco da mucosa gástrica. O muco aderente à mucosa gástrica é formado por uma camada de glicoproteína disposta num gel insolúvel em água, sendo um fator importante para a proteção dos tecidos (ATUMA et al., 2001; VASCONCELOS et al., 2008). No entanto, a administração oral ou intraduodenal do extrato das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) não aumentou a produção de muco nos experimentos empregados. A produção de muco é mediada principalmente por PGE2 no estômago, desta forma, pode-se inferir que a gastroproteção exibida pelo extrato das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em modelo de úlcera gástrica induzida por etanol/HCl ou AINEs não é mediada por aumento da síntese de prostaglandinas. Os dados aqui obtidos corroboram com os estudos anteriormente relatados com efeitos antissecretores semelhantes ao extrato hidroalcoólico obtido a partir da casca do caule de Mimusops elengi (SHAH et al., 2003).

Modelo de úlcera gástrica induzida por AINES AINES como a indometacina inibem a síntese de prostaglandinas citoprotetoras, sintetizadas pela ação de COX-1 e COX-2 no tecido do estômago, resultando em ulceração. Além disso, também tem sido demonstrado que as EROs desempenham um importante papel na patogênese dos danos da mucosa, originadas pela indometacina (ARAÚJO et al., 2011; ODABASOGLU et al., 2006). 89

Nas Figuras 31 e 32 observa-se o efeito do extrato da semente de Mimusops balata sobre a área lesada dos estômagos dos ratos do experimento. Os resultados demonstram um relevante efeito redutor do extrato sobre a área lesada (p<0,001), com efeito bastante superior ao controle positivo carbenoxolona.

Figura 31 – Efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata (300mg/kg) em ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida por AINES (indometacina 80mg/kg).

20

15

10

5

Área Lesada (mm²) Lesada Área *** *** 0 Vei Cbn 300 M. balata (mg/kg, v.o) Indometacina (80mg/kg, v.o)

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da Média (EPM), com um grupo de seis animais. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle negativo (veículo). Vei = veículo. Cbn = carbenoxolona.

Este resultado somado aos demais apresentados neste estudo demonstram que o extrato obtido das sementes de Mimusops balata tem efeito citoprotetor contra diferentes agentes ulcerosos, e reforça o seu papel como agente gastroprotetor Verificou-se que a atividade gastroprotetora do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata são mediados por uma atividade antissecretora, pela redução de migração de neutrófilos e de dano oxidativo. Além disso, taxifolina, um flavonóide isolado a partir do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata, foi identificada como um composto que participa desses efeitos, porém, novos estudos devem ser realizados para verificar possíveis efeitos sinérgicos. Finalmente, os dados aqui apresentados permitem sugerir que a Mimusops balata pode ser um produto natural adequado para a prevenção e tratamento de 90

lesões gástricas. No entanto, novos experimentos são necessários para contribuir com mais evidências sobre atividade gastroprotetora de Mimusops balata.

Figura 32 – Fotos dos estômagos de camundongos submetidos aos efeitos da administração oral de carbenoxolona (200mg/kg) e diferentes doses (30, 100 e 300mg/kg) do extrato metanólico das sementes de Mimusops balata, no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.

Veículo Carbenoxolona 300mg/kg Extrato das sementes de M. balata Indometacina (80mg/kg)

5.2.3 Atividade antiproliferativa in vitro Em relação à atividade antiproliferativa, pode-se notar na Tabela 7 que a casca do fruto de Mimusops balata não apresentou atividade contra as linhagens estudadas, já o caule e as folhas apresentaram efeito citotóxico, com valores de TGI de 91,1µg/mL e 82,5µg/mL, respectivamente, contra a linhagem de glioma (U251). As folhas também apresentaram atividade antiproliferativa contra a linhagem de mama (MCF7), com valor de TGI de 108,8 µg/mL.

Tabela 7 – Atividade antiproliferativa do controle positivo doxorrubicina e dos extratos metanólicos brutos da casca, caule e folhas de Mimusops balata contra linhagens tumorais humanas. TGI (µg/mL) Material U251 MCF7 NCI-H460 Doxorrubicina 0,20 >25 0,48 Extrato MeoH - Casca >250 >250 >250 Extrato MeoH - Caule 91,1 200,3 185,7 Extrato MeoH - Folha 82,5 108,8 >250 Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma); MCF7 (mama); NCI-H460 (pulmão). Valores de TGI representam a concentração necessária (μg/mL) para inibir 100% da proliferação celular. Doses testadas: 0,25 - 250μg/mL.

91

As demais partes da planta estudada, como a semente e a polpa, não foram solúveis em DMSO, o que impediu a realização do teste de atividade antiproliferativa in vitro, cujos estudos serão realizados oportunamente. Em estudo sobre as folhas de sapotizeiro (Mimusops zapota) para explorar a atividade antitumoral do extrato de acetato de etila contra o carcinoma de ascite de Ehrlich. A atividade antitumoral foi avaliada em ratos, por meio de tratamento intraperitoneal. Os resultados nas doses de 100 e 200mg/kg ao dia mostraram um aumento significativo no tempo de sobrevida e diminuição da contagem de células tumorais. Além disso, o extrato também demonstrou uma redução de 70,8% na contagem de células tumorais, em comparação com o grupo controle não tratado (RASHID et al., 2014). Ainda, o extrato metanólico dos frutos de Mimusops zapota é apontado como agente antiproliferativo de células carcinogênicas, devido aos princípios ativos: metil 4-O-gálico-clorogenato e ácido 4-O-gálico-clorogênico e mais oito antioxidantes polifenólicos. Demonstraram atividade antiproliferativa interessante em linhas celulares de câncer do cólon, tendo como principal efeito ser antioxidante (FIGUEROA-HERNÁNDEZ et al., 2005; MA et al., 2003). De acordo com a pesquisa de Ganesh e colaboradores (2014), os extratos da casca e folhas de Mimusops elengi L. foram eficazes para a linhagem de câncer de colo de útero em humanos por ensaio MTT (in vitro). Constatou-se que estes resultados podem ser úteis para a prevenção e tratamento da doença do câncer do colo de útero humano. Assim, os resultados de outros estudos citados acima mostram que a Família Sapotaceae, Gênero Mimusops têm potencial antiproliferativo contra células carcinogênicas, o que levou a presente pesquisa a investigar esta ação em Mimusops balata. O estudo de Oi e colaboradores (2012), evidenciou que o tratamento tópico de taxifolina à pele suprimiu a incidência, volume e multiplicidade de tumores no modelo de carcinogênese de pele induzida por UV solar, sugerindo atividade quimiopreventiva desta substância. Zhang e colaboradores (2013) realizaram estudo experimental in vitro e sugeriram que a combinação de taxifolina com Andrographolide (Andro) produz eficaz atividade antiproliferativa de células carcinogênicas de próstata. 92

Além disso, a taxifolina mostrou potente inibição sobre a proliferação de células de câncer in vitro, dentre elas as carcinogênicas de colo de útero de humanos (ZHAI et al., 2011; ZHAI et al., 2012).

93

6 CONCLUSÕES

1 – As diferentes partes estudadas de Mimusops balata, caule, folha, casca, polpa e semente possuem ação antinociceptiva em camundongos. O extrato metanólico das sementes foi o mais eficaz e promissor, possivelmente devido a presença do flavonoide taxifolina. 2 – O extrato da semente de Mimusops balata demonstrou atividade gastroprotetora nos modelos utilizados sendo mediada por uma atividade antissecretora, pela redução de migração de neutrófilos e de dano oxidativo; sendo a taxifolina um dos principais compostos ativos, descrito neste estudo com tal potencial pela primeira vez. 3 – Não foram significativos os resultados da atividade antiproliferativa contra as células cancerígenas avaliadas; 4 – A taxifolina é um composto presente em quantidade significativa nas sementes e não foi identificada nas demais partes da planta em estudo, podendo as sementes se constituirem de fonte para a obtenção deste importante flavonóide. 5 – Sugere-se a continuidade dos estudos, tanto fitoquímicos como farmacológicos, na busca de novos agentes medicinais. Os estudos na literatura atual sobre este vegetal são praticamente inexistentes, o que instiga a exploração mais detalhada desta planta e seus princípios ativos.

94

95

REFERÊNCIAS

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