UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

LUIZ HENRIQUE GONÇALVES DE REZENDE

DANO FOLIAR AFETA A INTERAÇÃO ENTRE TRICHOGONIOPSIS ADENANTHA (ASTERACEAE) E SEUS VISITANTES FLORAIS?

CAMPINAS 2017 LUIZ HENRIQUE GONÇALVES DE REZENDE

DANO FOLIAR AFETA A INTERAÇÃO ENTRE TRICHOGONIOPSIS ADENANTHA (ASTERACEAE) E SEUS VISITANTES FLORAIS?

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ecologia.

Este arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pelo aluno Luiz Henrique Gonçalves de Rezende e orientada pelo Prof. Dr. Martín Francisco Pareja Piaggio.

Orientador: Prof. Dr. Martín Francisco Pareja Piaggio

CAMPINAS 2017

Campinas, 12 de julho de 2017.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Martín Francisco Pareja Piaggio

Prof. Dr. Thomas Michael Lewinsohn

Prof. Dr. Vinícius Lourenço Garcia de Brito

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

Aos meus queridos avós Euronias e Enelzita Rezende Dirty Paws

Jumping up and down the floor My head is an animal And once there was an animal It had a son that mowed the lawn The son was an ok guy They had a pet dragonfly The dragonfly it ran away But it came back with a story to say

Her dirty paws and furry coat She ran down the forest slope The forest of talking trees They used to sing about the birds and the bees

The bees had declared a war The sky wasn't big enough for them all The birds, they got help from below From dirty paws and the creatures of snow

And for a while things were cold They were scared down in their holes

The forest that once was green Was colored black by those killing machines But she and her furry friends Took down the queen bee and her men And that's how the story goes The story of the beast with those four dirty paws

Of Monsters and Men

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus por me trazer até aqui e colocar diante de mim cada experiência que vivi como a oportunidade de crescer. Por vários momentos revistei minhas crenças e tive convicção que não estava sozinho nessa jornada. Ela inclui amigos e familiares que acreditaram no meu sonho e proporcionaram todas as condições para que eu viesse para a Unicamp e permanecesse em Campinas para estudar. Deixo o meu mais sincero agradecimento aos meus queridos avós Euronias e Enelzita Rezende, minha mãe Odilia e meu padrasto Aldo, minhas tias Kelly, Lúcia, Maria Helena, Eura, e tio Pedro. Ao meu primo Juninho, agradeço o apoio incondicional. Aos meus amigos Emerson, Cristiane, Tamara, e Hauanny, agradeço pelo companheirismo e amor.

Aos professores Gustavo Romero e Martín Pareja, sou imensamente grato por me receberem na Unicamp e por confiarem que eu poderia conduzir este trabalho. Ambos me guiaram até aqui. Ao professor Martín Pareja, faço um agradecimento mais que especial. Martín foi o meu orientador ao longo do mestrado e a pessoa com quem exercitei pensar com leveza crítica a ecologia, a ciência, e tantos outros aspectos da vida. Cada parágrafo desse trabalho é fruto dos nossos diálogos únicos e memoráveis. Posso dizer que o Prof. Martín me inspira como pesquisador e também como pessoa. Agradeço de coração por orientar meu trabalho.

As ideias apresentadas neste trabalho foram construídas também com a convivência com os amigos no laboratório, especialmente Rodolfo (Rudolf), João (Jonnas) e Gabriela Gomes (Gabi), que várias vezes deram sentido a tudo isso. À Gabi sou muito grato por todo o apoio em campo e pelo carinho que me ofereceu. Agradeço também a amizade de Camila Leal e João Robazzi, desde que comecei o mestrado. Com eles, discuti as análises e teorias ecológicas que enriqueceram este trabalho. Nesse sentido, agradeço também aos colegas Leonardo Ré Jorge pela ajuda fundamental com as análises e aspectos teóricos, e também a tod@s os colegas do laboratório da Profa. Marlies Sazima na Unicamp, que me ajudaram muito com discussões sobre métodos e ecologia da polinização. Particularmente com relação às análises de voláteis, agradeço ao Prof. Ladaslav Sodek por disponibilizar o equipamento de cromatografia e espectrometria, e ao colega Carlos Eduardo Pereira Nunes (Coquinho) pela ajuda no manuseio do equipamento e realização das análises com SPME. Ao meu querido André Martinez, devo várias ideias apresentadas aqui, principalmente no Capítulo 1. Sou muito grato por seu auxílio e companheirismo durante o período de análise e escrita. Agradeço tod@s @s professores e pesquisadores que avaliaram este trabalho ao longo do seu desenvolvimento e finalização. Especificamente, agradeço ao Prof. André Freitas e Dr. Sebastian Sendoya, que integraram o Comitê de Acompanhamento. As orientações recebidas pelo Comitê foram fundamentais. Aos Profs. André Freitas, João Vasconcellos-Neto, Viviane Ferro, e ao amigo João Robazzi sou grato pela ajuda na identificação dos visitantes florais. Aos membros da pré-banca, Prof. João Vasconcellos-Neto e Drs. Carlos Eduardo Pereira Nunes e Mônica Becker, eu agradeço pelos comentários e avaliações que certamente contribuíram para melhoria do trabalho.

Por fim, eu agradeço aos funcionários do Instituto de Biologia da Unicamp, especialmente da secretaria de pós-graduação, que ajudaram com questões burocráticas ao longo do mestrado. Faço um carinhoso agradecimento ao Ricardinho e todo o pessoal que cuida da limpeza do laboratório. Tivemos momentos muito divertidos de conversa, risadas e café que fizeram parte da minha experiência. Agradeço a tod@s da equipe da Estação Ecológica Serra do Japi, em especial o Sr. Lauro, que proporcionaram as condições necessárias para que eu realizasse todo o trabalho de campo. Ao CNPq e a CAPES, sou grato pela bolsa de estudos concedida.

RESUMO

Herbivoria e polinização podem se influenciar quando ocorrem na mesma planta. O dano foliar pode modificar atributos da planta importantes para sua interação com visitantes florais, como o número de flores, além dos seus recursos e sinais atrativos. Pouco se sabe sobre os mecanismos e as consequências ecológicas dos efeitos dos herbívoros sobre os visitantes florais, especialmente para plantas que interagem com uma comunidade diversa de visitantes florais. Nesse trabalho, o objetivo principal foi avaliar se o dano foliar afeta a interação de Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae) e os seus visitantes florais. No primeiro capítulo, realizamos um estudo observacional em campo para identificar esses visitantes e avaliar se estes são afetados pela intensidade de herbivoria foliar. Foram registradas 35 morfoespécies de visitante florais, dentre as quais Lepidoptera foi o táxon mais frequente. Para Lepidoptera não houve efeito do dano. Já Hymenoptera foi o táxon mais afetado pela herbivoria foliar, de modo que capítulos de plantas mais danificadas receberam menos visitantes e pousos. Esse efeito foi atenuado em plantas maiores, com ramos reprodutivos altos, e mais capítulos receptivos. O efeito foi positivo para capítulos menores. Sugerimos que haja um trade-off entre o tamanho dos capítulos e sua atratividade em plantas mais danificadas. No segundo capítulo, exploramos um mecanismo específico para o efeito do dano nos visitantes florais. Testamos se diferentes níveis de dano foliar mecânico nos ramos modifica o perfil de compostos voláteis nestes ramos e a interação dos capítulos com visitantes florais logo após o dano e 24h depois. Em campo, o dano moderado (25-50% da área foliar removida) diminuiu rapidamente o número de visitantes e pousos, o que também foi observado 24h depois. As aproximações aos capítulos aumentaram 24h depois em ramos com 25% de dano comparado ao controle e outros níveis de dano. Com relação aos compostos voláteis, detectamos 48 terpenos, um benzenóide, e um composto alifático. Não detectamos compostos florais específicos. O dano com 50% da área foliar removida não mudou o total de voláteis emitidos, mas a emissão de alguns compostos diminuiu minutos após o dano e aumentou 24h depois. Propomos uma relação de causa e efeito entre essas mudanças nos voláteis e os efeitos do dano nos visitantes florais. Esses resultados contribuem com conhecimentos sobre como a herbivoria foliar afeta a interação de plantas com seus visitantes florais, bem como, sobre os mecanismos de efeitos indiretos em comunidades.

PALAVRAS-CHAVE: efeitos indiretos, mediação por atributos, repostas induzidas

ABSTRACT

Herbivory and pollination can affect each other when occurring on the same plant. Leaf damage can modify plant traits that are important for flower visitors, such as the number of flowers, besides its rewards and signals. Little is known about the mechanisms and ecological consequences of leaf damage for plants interacting with a diverse community of flower visitors. In this study, the main goal was to assess if leaf damage can affect the interaction between Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae) and its several taxa of floral visitors. In the first chapter, an observational field study was carried out to identify these floral visitors and assess whether they are affected by the intensity of foliar damage by herbivores. Thirty-six morphospecies of floral visitors were recorded, and Lepidoptera was the most frequent taxon. Lepidoptera was not affected by leaf damage. Hymenoptera was the most affected by damage, so that capitula from severe damaged plants received fewer visitors and landings. This effect was attenuated on larger plants with higher reproductive branches and greater number of receptive capitula, and the effect was positive for smaller capitula. We suggest that there is a trade-off between capitulum size and attractiveness in plants with more leaf damage. In the second chapter, we explored a mechanistic pathway for the effect of leaf damage on floral visitors. We tested whether different levels of mechanical leaf damage to the branches modified the profile of volatile compounds and the interaction of floral visitors with the capitula minutes after damage and 24h later. In the field, moderate damage (25-50% of leaf area removed) decreased the number of visitors and landings shortly after damage and 24h later. The approaches to the capitula increased 24h after damage in the branches with 25% of damage compared to control and other levels of damage. We detected 48 volatile terpenes, one benzenoid, and one aliphatic compound in the branches. We did not detect specific floral compounds. Removal of 50% of the leaf area did not change the total amount of volatiles emitted, but the emission of some compounds decreased right after damage and increased 24h later. We argued that there is a cause-effect relationship between these changes in volatile profile and the effects of damage on floral visitors. These results improve the knowledge about how foliar herbivory can affect the interaction between plants and floral visitors, as well as about mechanisms of indirect ecological effects in communities.

KEYWORDS: indirect effects, trait-mediated effects, induced responses

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL: O potencial das plantas para mediar a interação entre herbivoria e polinização através de efeitos ecológicos indiretos ...... 14

Natureza dos efeitos ecológicos indiretos ...... 15

O potencial das plantas para mediar efeitos indiretos ...... 17

Ligações entre herbivoria e polinização ...... 18

Contato físico e/ou visual ...... 21

Competição por recursos florais ...... 22

Sobrecompensação da herbivoria ...... 22

Custo de alocação de recursos ...... 22

Crosstalk de vias bioquímicas ...... 23

Pleiotropismo ...... 24

Lacunas no conhecimento ...... 24

CAPÍTULO 1: Herbivoria foliar e padrões de visitação floral em capítulos de Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae) ...... 27

Resumo ...... 27

Introdução ...... 28

Materiais e métodos ...... 30

Área e sistema de estudo ...... 30

Coleta dos dados ...... 31

Análise dos dados ...... 32

Resultados ...... 34

Visitantes florais ...... 34

Padrões e intensidade de herbivoria foliar ...... 36

Dano foliar e visitantes florais ...... 39

Discussão ...... 47

Interação com visitantes florais ...... 47 Efeitos da herbivoria foliar sobre os visitantes florais ...... 49

Conclusões ...... 54

CAPÍTULO 2: Efeito do dano foliar na emissão de voláteis e taxas de visitação floral em Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae) ...... 55

Resumo ...... 55

Introdução ...... 56

Material e métodos ...... 58

Área e sistema de estudo ...... 58

Experimento em Campo ...... 58

Experimento em casa de vegetação ...... 59

Coleta e caracterização dos voláteis ...... 60

Análise dos dados ...... 61

Resultados ...... 62

Dano foliar e visitantes florais ...... 62

Perfil de compostos voláteis ...... 66

Discussão ...... 69

Conclusões ...... 72

CONCLUSÃO GERAL ...... 74

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 78

APÊNDICES ...... 91

Apêndice 1: matriz de correlação entre as variáveis dos modelos ...... 91

Apêndice 2: atividade dos visitantes florais ao longo do dia ...... 92

Apêndice 3: lista de espécies/ morfoespécies de visitantes florais ...... 93

Apêndice 4: registro fotográfico dos visitantes florais ...... 95

Apêndice 5: herbivoria foliar e escala de dano...... 97

Apêndice 6: altura do ramo e visitas por Lepidoptera ...... 99

Apêndice 7: registro fotográfico dos métodos de coleta de COVs ...... 100 Apêndice 8: dano foliar e efeito do número de folhas no ramo ...... 101

Apêndice 9: efeito do dano foliar por grupo taxonômico de visitante floral ...... 103

Apêndice 10: cromatogramas ...... 104

Apêndice 11: análise de componentes principais (PCA)...... 105

ANEXOS ...... 107

Anexo 1: Declaração de bioética e biossegurança ...... 107

Anexo 2: Declaração de direitos autorais ...... 108

14

INTRODUÇÃO GERAL

O potencial das plantas para mediar a interação entre herbivoria e polinização através de efeitos ecológicos indiretos

Em ecologia de comunidades, uma forma clássica e intuitiva de compreender como os organismos se relacionam é reduzi-los a pares de indivíduos em interação direta. (Krebs, 2009; Begon et al., 2007). O enfoque nesse tipo de interação teve muita influência sobre a construção da teoria ecológica e fomentou um viés trófico na compreensão das relações entre os organismos. Nas duas últimas décadas, entretanto, tem-se percebido que considerar somente interações ecológicas diretas para avaliar a dinâmica e a estrutura das comunidades é algo simplista. Cada interação direta, seja ela trófica ou não, tem potencial para afetar indiretamente outros organismos na comunidade, bem como as interações que eles desenvolvem (Stanton, 2003; Ohgushi et al., 2007; Schmitz, 2009). Nesse sentido, efeitos ecológicos indiretos são uma propriedade emergente das comunidades, algo que conecta os organismos por ligações não tróficas e evidencia que as interações entre eles não acontecem de forma isolada, mas são influenciadas por outras interações que ocorrem na comunidade (Strauss, 1991).

As interações entre herbívoros e plantas representam um contexto propício para que efeitos ecológicos indiretos aconteçam, uma vez que a herbivoria pode induzir mudanças em atributos da planta que são relevantes para a sua interação com outros organismos (Denno et al., 1995; Ohgushi et al., 2007; Heil, 2011). As plantas interagem com uma miríade de organismos antagonistas e mutualistas, que estão acima e abaixo do solo, e o fazem ao longo de todas as fases do seu desenvolvimento (Schoonhoven et al., 2005). Quais dessas interações serão indiretamente afetadas pela herbivoria é, em parte, uma questão de como a planta responde ao dano: de forma local ou sistêmica; com respostas específicas ou generalizadas; e com efeitos a curto ou a longo prazo (Karban & Baldwin, 1997; Boege & Marquis, 2005). Em plantas cuja resposta aconteça de forma sistêmica, generalizada e a longo prazo, os efeitos indiretos terão maior potencial para influenciar uma variedade de interações (Ohgushi et al., 2007). Em alguns casos, novas interações se estabelecem, como a que se desenvolve entre a planta e os parasitoides/predadores dos seus herbívoros após o dano (Price et al., 1980).

Apesar de muito frequentes, a maior parte dos efeitos ecológicos indiretos mediados por plantas é pouco explorada na literatura. Uma exceção é o efeito da herbivoria sobre a polinização (Strauss et al., 1996; Bronstein et al., 2007; Adler, 2008). De forma geral, os 15

herbívoros tendem a influenciar negativamente a polinização e a reprodução das plantas. Isso acontece diretamente pelo consumo de flores e sementes, e indiretamente através de mudanças no comportamento de visitantes florais causadas pelo comprometimento dos recursos alocados para a reprodução (Adler & Irwin, 2005; Lucas-Barbosa et al., 2011; Mothershead & Marquis, 2000). Os mecanismos subjacentes a esses efeitos podem ser complexos e envolver desde trade- offs causados por uma demanda conflitante de recursos para que a planta invista em defesa e reprodução (Irwin et al., 2004; Kessler & Halitschke, 2009), até influências da herbivoria sobre a fisiologia e expressão gênica das plantas (Johnson et al., 2015). Esses mecanismos serão discutidos em detalhe nas seções seguintes, mas antes algumas considerações serão feitas sobre o conceito e a mecânica dos efeitos ecológicos indiretos.

Natureza dos efeitos ecológicos indiretos

Um efeito ecológico indireto acontece quando o impacto de um primeiro organismo sobre um segundo organismo é mediado por um terceiro organismo ou fator ambiental intermediário, que age como um transmissor deste efeito (Strauss, 1991; Wootton, 1994; Abrams et al., 1996). Essa é uma definição simples, cujo desenvolvimento teórico ainda é controverso, pois não há um consenso sobre a natureza dos agentes intermediários (i. e. se são somente bióticos, ou abióticos também), e sobre quais circunstâncias o impacto de um organismo sobre o outro deve ser considerado (i. e. se é ou não recíproco) (Wootton, 1994; Abrams et al., 1996; Schmitz, 2009). Diante dessas inconsistências conceituais, há o risco de subestimar a influência dos fatores abióticos na modulação de uma rede de interações, e de superestimar o impacto do efeito de um organismo sobre outro, uma vez que um efeito pode não significar uma interação de fato quando não é recíproco (Ohgushi et al., 2007).

Apesar das controvérsias, a mediação é o processo fundamental para identificar e interpretar a dinâmica dos efeitos ecológicos indiretos (Wootton, 1994). Através dela, é possível reconhecer os mecanismos através dos quais a transferência de efeitos acontece. Para entender a mediação, podemos pensar em um sistema típico com no mínimo três elementos (ver Figura 1): há um indivíduo iniciador, que age diretamente sobre um fator intermediário (i. e. mediador), impactando-o, e este influencia os outros componentes do sistema com os quais também interage diretamente (i. e. receptores). O efeito inicial pode mudar de direção e intensidade quando é mediado, e isto depende de como o mediador responde ao impacto do iniciador (Wootton, 1994; Abrams et al., 1996). 16

Figura 1: Representação de uma comunidade em que os organismos se relacionam tanto de forma direta (seta cheia), quanto indireta (seta tracejada). Apesar dos organismos 1 e 3 não se relacionarem diretamente, ambos compartilham uma interação direta com o organismo 2 e/ou estão sobre a influência de um mesmo fator ambiental. Isso possibilita a ligação indireta entre ambos, que acontece quando algum deles modifica esse fator ambiental comum ou afeta a densidade ou atributos do organismo 2.

Em casos em que o agente mediador é um fator abiótico (e.g. água) o efeito indireto é geralmente simples, e envolve mudanças no ambiente (e.g. aumento da turbidez da água pela atividade de forrageio de um peixe, o que afeta outros organismos que não são suas presas) (Schmitz, 2009). Por outro lado, quando o mediador é outro organismo, os efeitos indiretos são mais complexos e envolvem mudanças na densidade ou atributos fenotípicos e comportamentais do mediador (Wootton, 1994; Abrams et al., 1996). Efeitos indiretos mediados pela densidade acontecem quando o organismo iniciador modifica o número de indivíduos e a densidade populacional do organismo mediador (Abrams, 1995; Abrams et al., 1996). Esse efeito requer que o fator intermediário seja sempre outro organismo, e é o tipo de efeito indireto mais conhecido e estudado, provavelmente porque mudanças de densidade são rapidamente percebidas e facilmente medidas. As cascatas tróficas são exemplos clássicos desse efeito detectado em comunidades em que há controle top-down ou bottom-up (Holt & Lawton, 1994; Schmitz et al., 2004; Kagata & Ohgushi, 2006). A própria competição por exploração de recursos é um tipo de interação indireta, onde um organismo afeta negativamente o outro por alterações da quantidade e/ou a qualidade do recurso que compartilham (Denno et al., 1995; Gotelli, 2009).

Nos casos em que há mudanças em atributos do mediador, elas podem ser alterações fisiológicas, morfológicas e comportamentais que terão efeito sobre os outros organismos com os quais o mediador interage na comunidade (Abrams et al., 1996; Werner & Peacor, 2003, Kersch-Becker & Lewinsohn, 2012). Tais efeitos geralmente são menos intuitivos e difíceis de detectar comparados às mudanças de densidade, especialmente porque a alteração de um atributo pode acontecer a longo prazo, estar sujeita a variação intraespecífica no fenótipo do organismo mediador, ou estar encoberta por mudanças simultâneas de densidade (Ohgushi et 17

al., 2007). Um exemplo é quando o dano por herbívoros afeta atributos da planta importantes para interação com outros organismos. Essas modificações e seus efeitos ecológicos dependem do tempo de resposta e da induzibilidade da planta (i. e. capacidade de produzir respostas à herbivoria induzidas após o dano), que são atributos que podem variar entre indivíduos na população (Karban & Baldwin, 1997). A herbivoria é capaz de alterar atributos morfológicos e fisiológicos das plantas que continuam interagindo com outros organismos (Karban & Baldwin 1997; Schoonhoven et al., 2005; Walters, 2011). De fato, muitos estudos que buscam detectar efeitos ecológicos indiretos são feitos com plantas, dada a facilidade em detectar mudanças fenotípicas nestes organismos sésseis.

O potencial das plantas para mediar efeitos indiretos

Praticamente qualquer indivíduo que esteja inserido em uma comunidade e interaja com outros organismos tem o potencial para mediar ou ser afetado por efeitos ecológicos indiretos. Para as plantas, esse potencial é mais evidente porque elas (1) conectam muitas interações ao longo de sua história de vida; (2) geralmente não são consumidas por inteiro pelos herbívoros (Ohgushi et al., 2007); e (3) são a base da maioria dos ecossistemas. No primeiro ponto, está implícito o fato de que as plantas desenvolvem interações ecológicas variadas com diferentes organismos, inclusive com outras plantas. Aparentemente, essas interações estão separadas no espaço quando ocorrem em órgãos diferentes, acima e abaixo do solo (e. g. raízes, folhas, flores) (Poveda et al., 2003; Krupnick et al., 1999; Heil, 2011); e no tempo, quando ocorrem em diferentes momentos da sua ontogenia (Boege & Marquis, 2005). Entretanto, grande parte delas acontece por exploração de recursos, particularmente por herbivoria, de modo que a planta representa uma fonte comum e estruturalmente diversa de recursos para uma parte considerável dos organismos com o quais ela interage. Isso por si só gera o potencial para que tais interações sejam conectadas por efeitos ecológicos indiretos (Denno et al., 1995; Denno & Kaplan, 2007). Esses efeitos estão intimamente ligados a como as plantas respondem à herbivoria, o que leva ao segundo ponto destacado.

Os herbívoros pastadores, particularmente os insetos, representam grande parte dos organismos que consomem as plantas (Schoonhoven et al., 2005). Segundo a definição proposta por Crawley (1993) e Begon et al. (2007), os herbívoros danificam os tecidos da planta sem consumi-la por inteiro, e isto permite que ela continue no sistema e interaja com outros organismos. Tais interações, simultâneas ou subsequentes à herbivoria, serão indiretamente afetadas se o dano modificar a densidade da população ou atributos das plantas importantes 18

para que elas ocorram (Ohgushi et al., 2007). As mudanças de densidade devem ser analisadas em uma perspectiva diferente, uma vez que não é trivial determinar o que seja um indivíduo discreto em populações de plantas. Uma alternativa é considerar a biomassa como uma medida de densidade. Neste sentido, os herbívoros são capazes de alterar drasticamente a densidade das plantas que consomem, e desencadear efeitos indiretos diversos para outros herbívoros e demais organismos que interagem com elas (Denno & Kaplan, 2007). As mudanças de atributos, por sua vez, são mais exploradas em estudos experimentais que mostram, que o dano pode induzir mudanças no perfil de compostos primários (i. e. status nutritivo) ou secundários (i. e. palatabilidade, digestibilidade, toxicidade) da planta e dificultar ou facilitar o dano por outros herbívoros (Denno & Kaplan, 2007; Johnson et al., 2015). Essas mudanças podem afetar também interações mutualísticas desenvolvidas pela planta, com a interação com polinizadores (Ohgushi et al., 2007; Heil, 2011).

No contexto específico da interação com polinizadores, o impacto da herbivoria na sobrevivência da planta é somado ao efeito sobre a sua reprodução, ou seja, é o caso em que ambos componentes da aptidão da planta são influenciados (Bronstein et al., 2007). O tema recebeu bastante atenção na literatura referente aos efeitos ecológicos indiretos, provavelmente pela importância da polinização para reprodução de muitas angiospermas (ver levantamento de Ollerton et al., 2011). Isso levou ao desenvolvimento de hipóteses ecológicas e evolutivas para entender como a herbivoria e a polinização se desenvolveram enquanto pressões seletivas aparentemente opostas sobre atributos da planta (Armbruster et al., 1997; Schiestl, 2015). Especificamente, as perguntas sobre esse tema têm sido feitas com relação a quais mecanismos explicam o efeito da herbivoria sobre a polinização, se este efeito é sempre negativo como parece ser, e se há casos em que ele pode ser recíproco (Willmer, 2011; Bronstein et al., 2007; Adler, 2008).

Ligações entre herbivoria e polinização

De modo geral, a herbivoria afeta negativamente a reprodução das plantas, exceto em casos em que há compensação ou sobrecompensação do dano com a produção de mais flores (Paige & Whitham, 1987). Isto acontece porque o dano afeta a quantidade de flores produzidas pela planta, seja pelo consumo destas flores ou por demanda de recursos para defesa que seriam investidos em reprodução (Bertness et al., 1987; Kessler & Halitschke, 2009); ou porque o dano afeta o comportamento dos polinizadores quando altera atributos de atratividade floral (Lucas- Barbosa et al., 2015). Um mecanismo pode levar ao outro, e tratá-los separadamente muitas 19

vezes pode ser algo inviável ou mesmo artificial. O primeiro deles, ou seja, a diminuição no número de flores, é um dos efeitos mais citados na literatura (Bronstein et al., 2007). Entretanto, para plantas que necessitam de agentes bióticos para troca de pólen, espera-se que efeitos no comportamento de polinizadores constituam grande parcela do impacto da herbivoria em sua reprodução.

Ao estudarmos a relação entre herbivoria e polinização, um dos primeiros aspectos a ser considerado é que ambas categorias de interação ecológica não são excludentes. Isso significa que alguns polinizadores são herbívoros a medida em que consomem matéria orgânica vegetal, como o néctar e pólen produzidos pelas flores (Willmer, 2011; Rech et al., 2014). Nesse sentido, a polinização se refere ao papel funcional desses herbívoros, e a sua evolução enquanto mutualismo se deu através de mecanismos de exploração mútua, mantidos por um equilíbrio entre perdas e ganhos de aptidão para as plantas e para os polinizadores (Foster & Wenseleers, 2006). Em alguns casos, a polinização evoluiu como uma interação especializada, em que os herbívoros só consomem os recursos produzidos para maximizar o transporte de pólen (Willmer, 2011). Em outros, os custos da herbivoria se mantêm altos, como quando visitantes florais ovipositam nas flores ao mesmo tempo que as polinizam; ou quando o mesmo herbívoro consome as folhas da planta enquanto larva, e poliniza as flores quando adulto (Pellmyr, 2003; Adler & Bronstein, 2004). Essa perspectiva evidencia ligações ecológicas e evolutivas entre a herbivoria e a polinização, pois sugere que polinizadores também estão sujeitos às respostas da planta a herbivoria, e que herbívoros podem ter efeito sobre atributos florais.

Dentre todos os atributos modificados pela herbivoria, é possível destacar aqueles relacionados à atratividade da flor aos visitantes florais, tais como a quantidade, tamanho das flores, a cor, e a fragrância (display ou exibição floral); bem como, os que servem de recurso, como o néctar e pólen (Bronstein et al., 2007). No caso específico da atratividade, a herbivoria afeta negativamente elementos do display floral, de modo que plantas mais danificadas produzem menos flores (Karban & Strauss, 1993; Primack et al., 1994), e flores relativamente menores (Mothershead & Marquis, 2000). A cor, por sua vez, é um atributo mais conservado, mas a sua intensidade pode ser afetada por vias de interação entre a produção de pigmentos e compostos de defesa na planta (ver detalhes adiante). Por fim, a fragrância floral é entendida como uma mistura de alguns compostos orgânicos voláteis (COVs), cuja produção também pode ser afetada pela herbivoria, e isto varia de acordo com o modo de alimentação e especificidade de dieta dos herbívoros (Effmert et al., 2008; Theis et al., 2009; Kessler & Halitschke, 2009; Pareja et al., 2012). 20

Com relação aos recursos florais, a herbivoria leva a um decréscimo na quantidade e na qualidade do néctar (Adler & Irwin, 2005; Adler et al., 2006). A queda na qualidade pode acontecer sem efeito na quantidade, e ser devido à baixa concentração de açúcares (Aizen & Raffaele, 1996) ou à presença de compostos deterrentes para vários herbívoros, como os alcalóides (e. g. nicotina, ver Adler et al., 2006). Esses compostos podem chegar ao néctar através de transporte ativo, o que indica uma pressão seletiva favorável ao néctar tóxico; ou transporte passivo, que sugere um efeito indireto da herbivoria. Já para o pólen, o efeito da herbivoria também é geralmente negativo, uma vez que as plantas danificadas produzem flores com menor quantidade de pólen (Quesada et al., 1995), ou com grãos menores e de pior desempenho na formação do tudo polínico (Aizen & Raffaele, 1996).

Apesar do efeito evidente da herbivoria sobre atributos florais, os mecanismos pelos quais os herbívoros afetam o comportamento dos polinizadores são variados e envolvem não só efeitos indiretos, mas também diretos (ver Figura 2). Os efeitos diretos se referem basicamente à presença e o contato com herbívoros nas flores (McCall & Irwin, 2006; Cardel & Koptur, 2010). Já os indiretos, acontecem principalmente por mudanças que a herbivoria causa nos atributos florais, mas também através de competição por recursos. A mudança de atributos está relacionada com as respostas de sobrecompensação do dano, alocação diferencial de recursos, e mecanismos mais finos, subjacentes à produção de compostos que funcionam para defesa contra herbívoros e atratividade de polinizadores (Johnson et al., 2015). Tais mecanismos incluem a comunicação cruzada entre diferentes vias bioquímicas (i. e. crosstalk) e pleiotropismo. Cada um deles será explorado com mais detalhes a seguir.

21

Figura 2: Representação dos mecanismos através dos quais a herbivoria afeta a polinização. Isso pode acontecer por efeitos diretos, que envolvem o contato do visitante floral com os herbívoros nas flores; e por efeitos indiretos, que envolvem o consumo de recursos florais por herbívoros que não polinizam as flores, além de respostas fisiológicas/genéticas da planta quando danificada. Em última instância, a herbivoria leva a consequências indiretas para os atributos florais (recursos e atratividade), que afetam a interação da planta com os visitantes florais e a polinização.

Contato físico e/ou visual

O contato direto de visitantes florais com herbívoros que estejam sobre as flores tende a diminuir a quantidade de aproximações, pousos, e tempo de visita nestas flores (McCall & Irwin, 2006; Cardel & Koptur, 2010). A hipótese para isso é a de que os visitantes florais podem associar a presença do herbívoro com a má qualidade dos recursos na flor, com a competição por estes recursos, e com o maior risco de predação (Dukas & Morse, 2003). Esse efeito também ocorre quando os próprios predadores desses visitantes florais estão sobre as flores, como evidenciado na literatura para aranhas da família Thomisidae que são conhecidas por seus hábitos de caçar sobre as flores, camuflando-se nelas em alguns casos (Morse & Fritz, 1982; Romero & Vasconcellos-Neto, 2004; Romero et al., 2008). Essa possibilidade é sugerida com base nas habilidades cognitivas de muitos insetos polinizadores, particularmente abelhas, em associar sinais florais com a presença e qualidade de recursos na flor (Willmer, 2011). Assim como acontece com a presença do herbívoro, o efeito visual do dano pode alterar o comportamento dos visitantes florais, mas isto é menos considerado na literatura, como sugerido por Bronstein et al. (2007). 22

Competição por recursos florais

Certamente a competição por néctar, pólen e outros recursos nas flores, como óleos essenciais, é um fator importante para determinar o comportamento de visitantes florais e potenciais polinizadores. A presença de outros visitantes consumindo os recursos pode diminuir a chance de visita por outros indivíduos por obstruir o acesso a esses recursos (competição por interferência) (Lohman et al., 1996), além de afetá-los indiretamente por esgotar estes recursos (competição por exploração) (Willmer, 2011; Temeles et al., 2016). O resultado geralmente é a diminuição do número de pousos e menos tempo de visita que, para a planta, pode significar menor taxa de polinização (Mitchell et al., 2009). Os efeitos do consumo são ainda mais negativos para a planta se foram causados por herbívoros que não a polinizam, como é o caso dos ladrões de néctar (mas veja Richardson, 2004).

Sobrecompensação da herbivoria

Uma forma das plantas responderem à herbivoria é aumentando a produção de ramos vegetativos e reprodutivos de forma que os efeitos negativos sejam diluídos pela quantidade de folhas e flores disponíveis (Karban & Baldwin, 1997). Mais flores significa mais recursos para os visitantes florais, e um provável benefício para a reprodução das plantas. Esse efeito foi encontrado por Paige & Whitham (1987) para Ipomopsis aggregata, embora seja controverso, já que parece improvável que exista pressão seletiva para atração de herbívoros que tragam esse benefício. De qualquer modo, a sobrecompensação do dano já foi registrada em outros sistemas (Lennartsson et al., 1998; Paige et al., 2001) e os efeitos para a polinização devem ser considerados de acordo com outros aspectos, como o momento em que o dano foi feito na planta, e a disponibilidade de recursos para que ela invista na produção de um maior número de ramos.

Custo de alocação de recursos

Dentre os mecanismos de efeito indireto ligados às respostas da planta à herbivoria, o custo de alocação é o mais estudado. Ao longo do seu desenvolvimento, as plantas estão sujeitas a momentos de abundância e escassez de recursos que devem ser investidos em seus processos fisiológicos básicos, além da produção e manutenção de defesas contra herbívoros e tolerância a outros estresses bióticos e abióticos (Karban & Baldwin, 1997). Além disso, recursos também devem ser mobilizados para a reprodução, através da produção de flores e da manutenção das sementes em desenvolvimento. Para plantas que necessitam atrair polinizadores, isto também 23

inclui investir na atratividade da flor. No contexto em que os recursos são limitantes, o investimento em defesa frente à demanda de recursos para a reprodução pode comprometer a interação da planta com polinizadores, seja pela produção de menos flores, e/ou de flores menos atrativas e com menos recursos (Irwin et al., 2004; Kessler & Halitschke, 2009). Se isso de fato acontecer, e o efeito for negativo para a planta, podemos interpretar que houve um custo ecológico das defesas (Karban & Baldwin, 1997; Agrawal & Karban, 1999).

Investir ou não os recursos limitantes em defesa ou reprodução é uma questão que depende também de outros fatores externos como, por exemplo, a pressão de competição, e as dinâmicas das comunidades de herbívoros e polinizadores (Junker et al., 2013). O contexto fica mais complexo quando consideramos que a pressão de competição pode não ser somente pelos recursos escassos no solo (e.g. água e nutrientes), mas também por polinizadores, como mostrado por Levin & Anderson (1970). Diante disso, surgem as mais variadas estratégias das plantas para sobreviver à herbivoria e se reproduzir, tais como investir mais em defesas induzidas, que possuem menor custo de alocação e custo ecológico comparado às constitutivas (Karban & Baldwin, 1997), ou alterar elementos de sua fenologia para garantir que as flores estejam expostas nos momentos que há maior probabilidade de visita e polinização (Freeman et al., 2003).

Crosstalk de vias bioquímicas

Defesas e atratividade floral podem estar associadas de outras formas, em que sejam menos sujeitas a fatores exógenos como a disponibilidade de recursos. Uma possibilidade ainda pouco explorada na literatura é a existência de comunicação cruzada ou crosstalk entre vias bioquímicas que produzem compostos químicos de defesa e atratividade floral (e. g. pigmentos de cor e fragrância) (ver Pareja et al., 2012). Nesse caso, tais rotas podem compartilhar enzimas ou substratos de modo que a produção de um composto afete a produção do outro (Bostock, 2005). Um exemplo disso é o que acontece com compostos fenólicos: a via bioquímica que dá origem as antocianinas (flavonoides que conferem cor a flores e frutos) produz como compostos intermediários a naringenina, 3-OH flavanona, e o flavano-3,4-diol, que são requeridos para a síntese de compostos de defesa em vias transversais (flavonas, flavonols e taninos, respectivamente) (Fineblum & Rausher, 1997; Schoonhoven et al., 2005). Portanto, é possível dizer que os sistemas químicos de defesa e atratividade da planta interagem de modo que a produção de compostos de defesa após o dano pode comprometer a produção de compostos de atratividade na flor e vise versa. 24

Pleiotropismo

A relevância das interações entre sistemas químicos de defesa e atratividade é reforçada se ambos os sistemas são controlados por genes que expressam só um ou outro atributo, ou seja, que atuam só sobre a produção de compostos defensivos ou atrativos. Entretanto, há casos que um mesmo gene pode controlar a expressão desses dois atributos, o que é chamado de pleiotropismo (Agren et al., 2013; Simms & Bucher, 1996; Irwin et al., 2003). Isso acontece, por exemplo, quando um gene codifica certa enzima que atua logo no início de uma via bioquímica que produz tanto compostos de defesa quanto de atratividade (Johnson et al., 2015). A atividade normal ou mesmo uma mutação nesse gene pleiotrópico afetará a produção dos dois tipos de compostos e, assim, terá influência sobre ambos atributos da planta que têm funções ecológicas diferentes. O pleiotropismo é um mecanismo importante para entender o quanto um atributo da planta está vulnerável a mutações que alterem sua função ecológica, e como esses diferentes atributos variam de forma interdependente. Isso reforça a ideia de que não faz mais sentido buscar entender os atributos da planta ligados à defesa contra herbívoros e atratividade de polinizadores isoladamente.

Os mecanismos descritos até aqui são trabalhados como hipóteses gerais na literatura cujo teste não é trivial, pois requer análises fisiológicas e genéticas das respostas das plantas a herbivoria, somadas a experimentos realizados em campo para avaliar seus efeitos ecológicos. Estudos sobre esse tema têm contribuído para um avanço significativo da ecologia evolutiva de interações e corroborado a importância dos efeitos ecológicos indiretos em comunidades. Com esse avanço, novas questões emergem ao mesmo tempo que questões antigas são retomadas sob nova perspectiva. Nesse sentido, a interação entre herbivoria e polinização é um campo ainda muito fértil.

Lacunas no conhecimento

Apesar de grande parte dos estudos mostrarem um efeito majoritariamente negativo da herbivoria para a polinização, esta não deve ser uma generalização. Os polinizadores em uma comunidade certamente variam em seus requerimentos de recurso (Junker et al., 2013) e respondem de forma diferente aos sinais de atratividade floral que podem ter sido modificados pelo dano. Além disso, as espécies de polinizadores variam também em sua efetividade de polinização (Castro et al., 2013), o que torna ainda mais incertas as consequências dos efeitos indiretos da herbivoria para a reprodução da planta. O que pouco se considera é a possibilidade de uma mudança na comunidade ou turnover entre os polinizadores sensíveis às alterações nos 25

sinais e recursos das flores, mas que não diferem em sua efetividade de polinização. Nesse sentido, haverá uma mudança na comunidade de visitantes florais que interagem com a planta, mas não necessariamente nas taxas de polinização. Resultados assim são menos prováveis de serem encontrados em trabalhos que avaliam essa questão em plantas com sistemas de polinização especializados. Portanto, é importante que novos estudos explorem essas questões em plantas que interajam com uma maior diversidade de polinizadores e possuam um sistema polinização generalizado.

Outra questão pertinente é o caráter fitocêntrico dos estudos já feitos, em que há forte ênfase na aptidão da planta (particularmente, em sua produção de sementes) na interpretação dos efeitos da herbivoria na polinização (Bronstein et al., 2007). Há outras vertentes dessa relação que podem ser, e inclusive já estão sendo discutidas para avançar o conhecimento ecológico. Um exemplo é o foco no comportamento do polinizador que, por si só é fonte de informações sobre como os diferentes tipos de recurso são usados. Esse tipo de informação é muito útil para gerar hipóteses sobre a habilidade do visitante floral em associar sinais de atratividade com a presença e qualidade destes recursos nas flores (Wright & Schiestl, 2009).

No que diz respeito aos mecanismos, o foco dos trabalhos na literatura tem sido em como a herbivoria modifica atributos florais importantes para a interação da planta com polinizadores. Tais atributos incluem, principalmente, o número de flores e sua morfologia, além dos efeitos na quantidade e qualidade dos recursos que elas produzem. Uma abordagem ainda pouco explorada considerara os efeitos da herbivoria sobre o contexto químicos em que as flores são apresentadas aos polinizadores. Mecanismos pospostos incluem efeitos do dano floral e foliar sobre a síntese e emissão de compostos orgânicos voláteis (COVs) pelas flores (Zangerl & Berenbaum 2009, Pareja et al. 2012, Kessler & Halitschke, 2009, Cozzolino et al. 2015), além do efeito de COVs vegetativos emitidos após o dano próximo às flores (Kessler & Halitschke, 2009). Apesar dessa abordagem ser relativamente recente, a ideia de que COVs vegetativos podem ser importantes para interação da planta com polinizadores já foi constatada a quase três décadas atrás por Beker et al. (1989). Esses efeitos da herbivoria tendem a influenciar o comportamento de polinizadores que usam sinais químicos para localizar as flores, sendo assim mais suscetíveis a alterações nestes sinais.

Por fim, a comunidade de herbívoros da planta e os padrões de herbivoria também devem ser avaliados com mais detalhe. Em ambiente natural, as plantas estão sujeitas ao ataque de herbívoros que variam de extremamente polífagos a estritamente monófagos (Schoonhoven et 26

al., 2005). Essa variação pode levar a efeitos diferenciais da herbivoria sobre os atributos florais e comportamento dos polinizadores. Como base para os estudos experimentais, dados de história natural são indispensáveis. A partir deles, estabelecemos um panorama amplo das relações ecológicas que existem no sistema de estudo e abrimos caminho para que hipóteses gerais sejam testadas.

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CAPÍTULO 1

Herbivoria foliar e padrões de visitação floral em capítulos de Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae)

Luiz H. G. REZENDE, Gustavo Q. ROMERO, Martín PAREJA

Resumo

A herbivoria foliar pode alterar indiretamente características das plantas importantes para sua interação com visitantes florais e potenciais polinizadores. Essas alterações dependem de como a planta reponde ao dano, de modo que podem ocorrer tanto por um trade-off na alocação de recursos para defesa e para reprodução, quanto por efeitos pleiotrópicos na produção de compostos para defesa e para atratividade floral. Pouco se sabe sobre como a intensidade de dano foliar modula esses efeitos em ambiente natural, e quais são as consequências ecológicas deste dano para plantas que interagem com diversos táxons de visitantes florais. Neste trabalho, o objetivo foi avaliar a intensidade de herbivoria foliar do arbusto Trichogoniopsis adenantha em campo, e investigar seu efeito sobre o número de visitantes, pousos e tempo de visita para as diferentes ordens de visitantes florais desta planta. Não constatamos efeito do dano foliar na visitação por Lepidoptera. Para Diptera encontramos efeito negativo do dano foliar, de modo que capítulos de plantas com mais folhas danificadas foram menos visitados. Hymenoptera foi o táxon mais afetado pelo dano foliar. Plantas mais danificadas receberam menos visitantes e pousos, mas este efeito foi atenuado em ramos mais altos, com mais capítulos receptivos e mais flores receptivas por capítulo. Quando há muitas folhas danificadas na planta, capítulos menores tendem a receber mais visitantes e pousos por Hymenoptera, comparado aos maiores que recebem menos visitantes e pousos. O tempo de visitação, em contrapartida, não foi afetado pelo dano foliar em nenhuma das três ordens. Sugerimos que o tamanho da planta e os sinais visuais do display floral contribuam para que o impacto negativo do dano nas folhas seja menos acentuado. No contexto de dano foliar mais intenso, sugerimos que haja um trade-off entre tamanho e atratividade dos capítulos, possivelmente relacionado ao maior custo para manter a atratividade de capítulos maiores, que possuem mais flores.

Palavras-chave: intensidade de dano, atratividade floral, inflorescências 28

Introdução

Herbívoros e polinizadores podem potencialmente interagir direta ou indiretamente quando utilizam a mesma planta (Lehtilä & Strauss, 1997; Krupnick et al., 1999; Herrera, 2000; Kessler et al., 2010). A interação em via direta envolve o contato físico ou visual do visitante floral com o herbívoro nas flores (McCall & Irwin, 2006; Cardel & Koptur, 2010). Já a indireta, ocorre quando a herbivoria modifica atributos florais como os s/inais atrativos e a qualidade e quantidade dos recursos oferecidos pelas flores, de modo que plantas mais danificadas tendem a produzir flores menores e em menor quantidade (Mothershead & Marquis, 2000), com pólen e néctar de baixa qualidade (Quesada et al., 1995; Adler & Irwin, 2005), e com a fragrância modificada por alterações no padrão de produção de compostos orgânicos voláteis (COVs) (Effmert et al., 2008; Lucas–Barbosa et al., 2011; Pareja et al., 2012). O tamanho e a arquitetura da planta também são atributos que podem ser modificados pela herbivoria (Martinsen et al., 2000), e podem contribuir para a interação com visitantes florais, particularmente o tamanho da planta (Klinkhamer et al., 1989; Mitchell, 1994).

Os efeitos da herbivoria sobre a interação entre plantas e visitantes florais ocorrem por consequências diferenciais do dano nas flores e nas folhas, de modo que estes efeitos podem ser aditivos ou sinérgicos (Bronstein et al., 2007). A herbivoria floral pode alterar diretamente a quantidade, tamanho, e forma das flores, afetando atributos que compõem o display atrativo destas flores (Willmer, 2011; Antiqueira et al., 2016). Desta forma, há o comprometimento da atratividade floral aos visitantes e potenciais polinizadores, bem como, uma redução do número de flores disponíveis para a polinização (McCall & Irwin, 2006; Cardel & Koptur, 2010). A herbivoria foliar, por sua vez, tem efeitos indiretos e menos intuitivos sobre os atributos florais. Esses efeitos estão relacionados às respostas induzidas da planta após o dano, que comprometem a atratividade da flor (e. g. sinais e recursos) através de diversos mecanismos, tais como a alocação diferencial de recursos e o pleiotropismo na síntese de compostos de defesa contra os herbívoros e compostos que atraem visitantes florais (Adler et al., 2008; Pareja et al., 2012).

Comparado à florivoria, os efeitos da herbivoria foliar sobre a interação entre planta e polinizadores são menos estudados. O mecanismo mais explorado nesse sentido é a alocação diferencial de recursos, que estabelece que o investimento da planta em defesas compromete o seu investimento em reprodução e gera um custo ecológico para a planta em relação à sua interação com visitantes florais e polinização (Karban & Baldwin, 1997; Agrawal & Karban, 29

1999). Visitantes florais sensíveis podem mudar de comportamento em reposta a herbivoria foliar, o que pode resultar na desistência do pouso na flor ou um menor tempo de visita (Lehtilä & Strauss, 1997; Kessler et al., 2011; Lucas-Barbosa et al., 2015). A intensidade (i. e. efeito forte ou fraco) e direção (i. e. efeito positivo, negativo ou neutro) desses efeitos são parâmetros fortemente relacionadas com o momento em que o dano ocorreu nas folhas (i. e antes ou depois da produção de flores), além de estarem relacionados com a intensidade do dano foliar ao longo do desenvolvimento da planta, e com a disponibilidade de recursos no ambiente (Bronstein et al., 2007).

Evidências na literatura apontam para o efeito negativo da herbivoria foliar para a atração de visitantes florais e polinização de plantas (Strauss, 1997; Bronstein et al., 2007; Adler et al., 2008). Isso não deve ser entendido como uma generalização, pois os efeitos indiretos da herbivoria podem afetar de forma diferente os táxons de visitantes. Esses táxons tendem a variar em como percebem e respondem aos sinais e recursos florais modificados pelo dano, além de variarem em sua efetividade de polinização (Castro et al., 2013; Junker et al., 2013). Portanto, os atributos da planta afetados pelo dano foliar podem não ser relevantes para alguns táxons de visitantes florais, ou afetar aqueles menos eficientes em polinizá-la. Tais efeitos mais complexos são esperados para plantas com um sistema de polinização mais generalizado, ou seja, em que os recursos oferecidos pelas flores são variados e há maior diversidade de visitantes florais (Padysáková et al., 2013; Lemaitre et al., 2014).

Por fim, o efeito indireto negativo, positivo ou neutro da herbivoria foliar sobre a interação da planta com os visitantes florais pode também variar em função da escala de dano na planta (Avila-Sakar & Stephenson, 2006). Isso porque a resposta da planta à herbivoria pode acontecer de forma sistêmica ou local (Karban & Baldwin, 1997), e as consequências para os outros órgãos, como as flores, estão sujeitas a quão próximo este órgão está do local danificado (Schoonhoven, 2005). Desta forma, a herbivoria em folhas de um ramo reprodutivo teriam um efeito local intensificado sobre os atributos florais, comparada à herbivoria foliar nos demais ramos vegetativos da planta.

A espécie Trichogoniopsis adenantha (DC.) R. M. King & H. Rob. (Asteraceae) representa um bom sistema para que esse tipo de estudo seja realizado, já que é uma planta tropical de floração perene que interage com vários táxons de visitantes florais, além de ser danificada por herbívoros de diferentes guildas (Romero & Vasconcellos-Neto, 2005). Estudos anteriores indicam que a produção de sementes nessa planta é negativamente afetada pela 30

herbivoria nos capítulos, e que parte disto acontece devido à efeitos indiretos do dano na atratividade dos capítulos aos visitantes florais (Almeida, 1997; Romero & Vasconcellos-Neto, 2005; Salomão et al., 2006). Até o momento, nada se sabe sobre os efeitos indiretos da herbivoria foliar para a atratividade dos capítulos, e sobre como este efeito varia para os diferentes grupos taxonômicos de visitantes florais que interagem com essa planta.

Neste trabalho, o objetivo geral é testar a hipótese de que a herbivoria foliar afeta a interação entre T. adenantha e os seus visitantes florais. Especificamente, propomos as seguintes questões: (1) quais herbívoros e visitantes florais interagem com T. adenantha?; (2) o dano foliar afeta o número e comportamento dos visitantes florais?; (3) caso exista, esse efeito varia com a escala na qual é medido o dano (ramo reprodutivo e planta inteira) e com o grupo taxonômico de visitante floral?

Materiais e métodos

Área e sistema de estudo

O trabalho de campo foi realizado na Reserva Ecológica da Serra do Japi, Jundiaí, SP (23º11’S e 46º52’W), durante o período de dezembro de 2015 a maio de 2016. A altitude na Serra do Japi varia de 700 a 1.300 m, e a altitude no local específico onde foi realizado o trabalho, Trilha da Biquinha, varia de 950 a 1.000 m (Pinto, 1992). O clima é sazonal com duas estações bem definidas: uma fria e seca entre os meses de maio e agosto, com temperaturas médias mensais entre 11.8 °C e 15.3°C e pluviosidade inferior a 41 mm ao mês; e outra quente e úmida entre novembro e abril, com temperaturas médias mensais entre 18.4°C e 22.2º C e pluviosidade superior a 250 mm ao mês (Pinto, 1992). A vegetação da serra é caracterizada por uma floresta mesófila semidecídua com o estrato arbóreo variando de 10 a 15 m de altura (Leitão Filho, 1992). A Reserva é impactada por sua proximidade com as cidades à sua volta e por atividades de ecoturismo, o que estimula a abertura de clareiras favoráveis à propagação de plantas de borda como acontece para T. adenantha, sistema investigado neste trabalho.

T. adenantha é uma espécie de arbusto semidecíduo cujo gênero é brasileiro, que ocorre não só nas margens de florestas da Serra do Japi, mas em outras regiões do sudeste do Brasil. Essa planta possui até 1.90 m de comprimento e uma grande proporção de ramos reprodutivos com capítulos em diferentes fases de desenvolvimento. A sua floração é perene com pico na estação chuvosa (Romero & Vasconcellos-Neto, 2005). As flores apresentam baixo nível de autocompatibilidade e, portanto, necessitam da interação com visitantes florais para a 31

polinização (Romero; L.H.G. Rezende, observação pessoal). Com relação à herbivoria, suas folhas e capítulos apresentam marcas frequentes de dano por herbívoros de diferentes guildas (Almeida, 1997; Gomes, 2014; Romero & Vasconcellos-Neto, 2005).

Coleta dos dados

Para testar se a herbivoria foliar afeta a interação entre T. adenantha e os visitantes florais, foram coletados dados de visitantes florais, padrões e intensidade de herbivoria foliar, e atributos da planta. Para isso, um único indivíduo de T. adenantha, com ao menos um ramo reprodutivo com capítulos em antese, foi definido como a unidade amostral independente em que os dados foram coletados. Ao todo, foram amostrados 89 indivíduos em seis meses, aproximadamente 15 por mês. Em cada mês foi realizada coleta intensiva de dados (explicados a seguir com mais detalhe), em que, no máximo, cinco indivíduos foram amostrados por dia, um em cada horário previamente definido: 08:00, 10:00, 12:00, 14:00 e 16:00 h. Toda a amostragem foi feita ao longo da Trilha da Biquinha, onde ocorrem indivíduos de T. adenantha vivendo em manchas ou isolados. Para garantir amostras aleatórias, indivíduos encontrados na trilha foram marcados e sorteados em cada dia de coleta. Cada indivíduo foi amostrado somente uma vez.

Visitantes florais

Estes dados são a variável resposta nas análises e foram obtidos por observação em campo e coleta de espécimes de visitantes florais. Para cada indivíduo de T. adenantha amostrado foi selecionado um ramo focal com ao menos um capítulo em fase de antese ou pré-dispersão (capítulos receptivos), de acordo com a descrição feita por Romero & Vasconcellos-Neto (2005). Os capítulos em pré-dispersão foram incluídos por ainda apresentarem flores receptivas e receberem visita (L.H.G., Rezende, observação pessoal). Cada ramo foi observado por uma hora sem pausas, durante a qual foi registrado o número de visitantes florais, o número de pousos nos capítulos receptivos, e o tempo de visita para cada um deles. O tempo de visita foi medido pelo número de segundos após o pouso no capítulo. Neste trabalho, consideramos visitante floral o inseto que pousou pelo menos uma vez no capítulo. O seu comportamento foi considerado um pouso quando tocou em um dos capítulos por pelo menos 1 segundo.

Foram realizadas coletas paralelas de visitantes florais em outros indivíduos de T. adenantha que não estavam inclusos na amostragem, com o objetivo de amostrar de forma mais 32

abrangente a comunidade de visitantes florais. Os visitantes observados foram fotografados e coletados quando possível para a identificação em laboratório.

Padrões e intensidade de herbivoria foliar

Esses dados representam a principal variável preditora nas análises, particularmente a intensidade de herbivoria. Os padrões de herbivoria foliar foram avaliados pelo registro das marcas de dano nas folhas e por coleta de herbívoros sobre as folhas, caule, e capítulos do ramo focal. A intensidade de herbivoria foi estimada por uma quantificação simples que consistiu apenas em calcular a porcentagem de folhas danificadas em relação ao total de folhas analisadas com base na presença ou ausência de marcadas de dano nas folhas (i. e. não considerou área foliar consumida). Essa quantificação foi feita para as diferentes guildas de herbívoros e para duas escalas: ramo reprodutivo e planta como um todo. Para herbivoria na escala do ramo, a estimativa foi calculada para o mesmo ramo em que foram coletados os dados de visitantes florais, e todas as suas folhas foram avaliadas. Já para a herbivoria na escala da planta, a estimativa foi calculada através da análise de 30 folhas sorteadas de outros ramos do indivíduo amostrado. Em ambos casos, foram avaliadas somente folhas expandidas, independentemente de suas dimensões.

Atributos da planta

Foram medidos atributos da planta que podem estar relacionados à atratividade aos visitantes florais para usar como covariáveis nas análises. Para cada planta amostrada foi registrado o número de ramos reprodutivos, a altura do ramo focal em relação ao solo, o número de capítulos receptivos neste ramo, o tamanho destes capítulos e o número de flores receptivas que possuíam no momento da observação. Para obter as duas últimas medidas, os capítulos receptivos do ramo focal foram coletados e foi calculada a média do seu comprimento (do ápice da corola até a base do receptáculo), diâmetro (medido no centro do comprimento do capítulo) e média de flores receptivas. Flores receptivas foram todas aquelas que estavam em antese, com a corola e estames túrgidos e de coloração lilás (ver descrição de Romero & Vasconcellos-Neto, 2005).

Análise dos dados

Os dados referentes à comunidade de visitantes florais e aos padrões de herbivoria foram analisados de forma descritiva pela estimativa da riqueza e abundância de espécies de visitante florais, e descrição de tipos (guildas) de marca de dano nas folhas amostrado. Para as 33

estimativas de herbivoria, foi feito um teste de normalidade de Shapiro-Wilk para verificar o padrão de distribuição do dano nas escalas do ramo e da planta. Para avaliar a correlação entre a intensidade de herbivoria foliar em ambas escalas, foi feita correlação simples com o coeficiente Pearson (r).

Para avaliar se a intensidade do herbivoria foliar ou os atributos da planta afetam o número e o comportamento dos visitantes florais, foram construídos modelos lineares generalizados (GLM em inglês) para cada uma das seguintes variáveis respostas: total de visitantes florais, total de pousos, e tempo de visita. Para as duas primeiras variáveis, que possuem dados de contagem, os modelos foram ajustados com a distribuição de erros Poisson e ligação com logarítmo. Especificamente para os dados de tempo de visita, esse ajuste foi feito com distribuição de erros Gaussiana e ligação com identidade. Todos os modelos foram construídos com o mesmo conjunto de variável preditora (porcentagem de folhas danificadas) e covariáveis de acordo com o representado por:

VAR ~ PD*(NCR + DCP + CCP + FCP + NRR + ALT) + INT onde VAR é variável resposta; PD a porcentagem de folhas danificadas; NCR o número de capítulos receptivos no ramo focal; DCP o diâmetro médio desses capítulos; CCP o comprimento médio desses capítulos; FCP a média de flores receptivas por capítulo; NRR o número de ramos reprodutivos na planta; ALT a altura do ramo focal; INT o intervalo do dia. O símbolo ~ significa modelar, e * significa interação.

Inicialmente, o modelo foi usado para testar se o efeito da intensidade de herbivoria nos visitantes florais varia com a escala em que ela foi estimada na planta. Para isso, a variável PD foi ajustada para gerar duas classes de modelos: aqueles em que a intensidade de herbivoria foi estimada na escala do ramo (PDR) e aqueles em que ela foi estimada na escala da planta (PDP). Isso foi feito para o total de visitantes e de pousos, e os modelos foram comparados com o critério de informação de Akaike (AIC em inglês). A estimativa de dano que gerou modelos com menores valores de AIC foi considerada mais adequada e selecionada para avaliar a influência do dano em cada grupo taxonômico específico de visitante floral.

Em todos os casos, os modelos foram simplificados até que fosse obtido o modelo mínimo adequado. A simplificação foi conduzida passo a passo, testando incialmente a significância estatística de cada interação e depois a significância de cada efeito principal usando a estatística χ2 da diferença no desvio residual para comparar modelos com e sem a variável ou interação 34

analisada. Nos casos em que o intervalo do dia foi uma variável significativa no modelo mínimo, foi feita uma análise gráfica descritiva dos seus padrões. Especificamente para Diptera, grupo para o qual houve poucos dados de visita, foi feito um único modelo com distribuição de erros Binomial para avaliar o efeito da intensidade de herbivoria sobre a chance de visita nos capítulos. Tal modelo foi feito desconsiderando a influência do intervalo do dia.

Em todos os modelos, quando a interação entre varáveis preditoras foi significativa, a análise gráfica foi feita usando categorias dessas variáveis para facilitar a interpretação. Os valores de cada variável preditora foram agrupados em duas categorias que continham aproximadamente o mesmo número de observações. O valor de corte para cada uma delas está apresentado nos respectivos gráficos. A intensidade de herbivoria foi sempre tratada nas seguintes categorias: porcentagem de folhas danificadas ≤ 50% e > 50%.

A validação de todos os modelos foi feita considerando a matriz de correlação das variáveis preditoras feita com o r de Pearson (Apêndice 1), e também por análises gráficas e diagnósticos de sob e sobredispersão dos dados. Quando necessário, foram feitos ajustes para adequar a distribuição de erro (e.g. Poisson para Quasi-Poisson). Todas as análises foram feitas no ambiente estatístico R (R Core Team 2016).

Resultados

Visitantes florais

Do total de 89 plantas amostradas, 46% (41 indivíduos) receberam ao menos uma visita e 54% (48) não foram visitadas durante o período de observação. Para aquelas que foram visitadas, a maior parte recebeu entre uma e três visitas. A proporção de plantas visitadas teve um pico ao meio dia, mas o padrão ao longo do dia variou com o táxon de visitante floral (Figura 1). Registramos as ordens Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. A maior parte das plantas foi visitada por Lepidoptera durante os intervalos de meio dia e fim da tarde. Diptera foi o grupo menos ativo, estando praticamente ausente no início e fim do dia. O mesmo padrão foi registrado para o número de visitantes florais e de pousos nos capítulos (ver Apêndice 2).

Com relação à riqueza e abundância da comunidade, foram registradas 19 espécies de visitantes florais (Tabela 1). Lepidoptera foi a ordem com o maior número de espécies (10) e de indivíduos (53). As espécies mais abundantes foram Aeria olena e Pseudoscada erruca (Nymphalidae), registradas em 12 e nove plantas, respectivamente. Hymenoptera foi o segundo grupo mais rico em espécies, com destaque para o gênero Trigona (Apidae), registrado em 35

quatro plantas. A riqueza de espécies está subestimada neste trabalho, pois não foi possível coletar grande parte dos visitantes florais observados sobre os capítulos. Apesar disso, as amostragens paralelas de visitantes florais resultaram no acréscimo de 17 espécies, 12 da ordem Lepidoptera e cinco da ordem Diptera. Com isso, registramos 35 espécies/ morfoespécies e seis famílias de visitantes florais interagindo com T. adenantha em ambiente natural (lista completa no Apêndice 3 e fotos no Apêndice 4).

O número de pousos não variou entre os diferentes grupos de visitantes florais, e se manteve alto para as espécies mais frequentes, principalmente da ordem Lepidoptera. Já com relação ao tempo de visita, as espécies de Lepidoptera também gastaram mais tempo visitando os capítulos comparada aos táxons das outras ordens (ver Tabela 1).

Figura 1. Proporção (média ± erro padrão) de indivíduos de T. adenantha cujos capítulos receberam visitas por diferentes grupos taxonômicos de visitantes florais ao longo do dia. Os dados se referem a um total de 89 plantas em que um único ramo focal foi observado por 60 min na Serra do Japi.

36

Tabela 1. Caracterização da comunidade de visitantes florais observados nos capítulos de T. adenantha na Serra do Japi. Os dados se referem a 89 plantas em que um ramo focal foi observado por 60 min. O tempo de visita está representado como a média ± erro padrão do tempo de manipulação do capítulo por indivíduos de cada espécie/morfoespécie. N se refere ao número de indivíduos observados pousando ou somente se aproximando dos capítulos.

Visitantes florais observados para T. adenantha Táxon Plantas N Pousos Tempo de visita (seg.) DIPTERA Allograpta sp. 1 1 1 28.00 Dip. sp1 1 1 1 3.00 Dip. sp2 1 1 1 2.00 Dip. sp3 1 1 1 300.00 Dip. NC* 15 23 5 4.74 ± 4.11 HYMENOPTERA Halictidae sp. 1 1 1 42.00 Opius sp. 1 1 1 3.00 Plebeia droryana Friese, 1900 2 2 4 45.00 ± 40.00 Pseudaugochlora sp. 1 1 1 5.00 Trigona sp. 4 6 7 29.17 ± 13.09 Hym. NC* 16 31 29 10.69 ± 3.56 LEPIDOPTERA Aeria olena Weymer, 1875 12 17 18 205.00 ± 69.89 Episcada clausina striposis Haensch, 1909 2 2 2 80.00 ± 70.00 Eumenogaster sp. 1 1 1 10.00 Heterosais edessa Hewitson, 1855 1 1 1 120.00 Hypoleria adasa Hewitson, 1854 1 1 1 250.00 Ithomia agnosia Hewitson, 1852 1 1 1 1621.00 Nyridela acroxantha Perty, 1833 1 1 1 110.00 Pseudoscada erruca Hewitson, 1855 9 9 9 134.00 ± 58.76 Rhynchopyga sp. 1 1 1 110.00 Sphecopsyche melissa Dognin, 1898 2 2 2 122.00 ± 117.00 Lep. NC* 11 17 11 5.94 ± 1.78

* NC significa indivíduos não coletados.

Padrões e intensidade de herbivoria foliar

Em nenhuma das plantas analisadas foi registrada intensidade de dano menor que 10%. Esse padrão foi encontrado tanto para o ramo focal, em que a porcentagem de folhas danificadas não apresentou uma distribuição normal (Shapiro-Wilk: SW-W = 0.95; p < 0.01); quanto para as folhas dos demais ramos da planta, em que a distribuição normal foi constatada (SW-W = 37

0.98; p > 0.1). A intensidade de herbivoria estimada no ramo foi positivamente correlacionada com aquela estimada para a planta como um todo (r = 0.46, p < 0.001) (ver gráficos no Apêndice 5).

Com relação ao tipo de dano, as marcas nas folhas foram atribuídas a quatro guildas de herbívoros: picadores-sugadores, mastigadores, minadores e raspadores (Figura 2). O mais frequente em ambas escalas de análise foi o dano por picador-sugador, seguido pelo dano por mastigador (Figura 3). As marcas deixadas por herbívoros raspadores foram as menos frequentes. Na maior parte das folhas houve dano múltiplo, em que a mesma folha possuía marcas de dano por diferentes guildas. Não foi possível relacionar o tipo de dano com a espécie de herbívoro, embora o dano feito por picador-sugador possa ser atribuído principalmente à espécie Macrolophus aragarcanus (Miridae) (observação pessoal).

A) B) C)

Figura 2. Marcas distinguíveis de herbivoria em folhas de T. adenantha na Serra do Japi. A) dano feito por picador- sugador. B) dano feito por mastigador. C) dano feito por minador. Fonte: arquivo pessoal.

Para os herbívoros amostrados sobre os ramos reprodutivos, foram registradas 12 morfoespécies distribuídas entre as ordens Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Lepidoptera e Thysanoptera (Tabela 2). A maior riqueza foi encontrada nos capítulos, sobre os quais foram registrados herbívoros exófagos, como coleópteros e lagartas de Lepidoptera que consomem estigmas e outras partes externas do capítulo; e herbívoros endófagos, como as espécies Melanagromyza neotropica (Agromyzidae) e Trupanea sp. (Tephritidae), que se desenvolvem no interior dos capítulos. Os herbívoros mais frequentes foram uma espécie não identificada de Thysanoptera que vive dentro dos capítulos, e a espécie de mirídeo M. aragarcanus, encontrada principalmente sobre as folhas. 38

A)

B)

Figura 3. Intensidade de herbivoria foliar em T. adenantha por guilda de herbívoros, estimada como a porcentagem de folhas danificadas. Medida estimada na escala A) do ramo e B) da planta, em 89 indivíduos na Serra do Japi. Nos boxplots, os retângulos são os percentis de 25% e 75%, e a linha interna representa a mediana. As barras incidam a amplitude máxima e mínima dos valores ponderada pelos percentis. 39

Tabela 2. Número de cada morfoespécie de herbívoro encontrada sobre os ramos reprodutivos de T. adenantha. Os dados se referem a amostragem de um único ramo de 89 indivíduos na Serra do Japi. O valor fora dos parênteses se refere a abundância de cada táxon, e o valor dentro deles indica o número de plantas em que este táxon foi registrado. Herbívoros sobre os ramos reprodutivos de T. adenantha

Táxon Caule Folha Capítulo COLEOPTERA - 1 (1) 12 (7) Elytrosphaera xanthopyga Stal, 1858 - 1 (1) - Chrysomelidae sp1 - - 5 (2) Chrysomelidae sp2 - - 3 (2) Chrysomelidae sp3 - - 4 (3) DIPTERA - - 25 (13) Melanagromyza neotropica Spencer, 1963 - - 8 (8) Trupanea sp. - - 2 (2) Cecidomyiidae sp. - - 15 (6) HEMIPTERA 19 (14) 29 (15) 8 (6) Macrolophus aragarcanus 19 (14) 27 (14) 8 (6) Hemi. sp. - 2 (2) - LEPIDOPTERA - - 15 (12) Geometridae sp. - - 13 (11) Pyralidae sp. - - 2 (1) THYSANOPTERA - - 72 (27) Thys. sp. - - 72 (27)

Dano foliar e visitantes florais

Escala de dano

O efeito da intensidade herbivoria sobre o número de visitantes florais e pousos nos capítulos foi constatado para herbivoria estimada na escala da planta, mas não na escala do ramo. Para os modelos com herbivoria no ramo, somente o intervalo do dia teve efeito sobre o número de visitantes e pousos (Tabela 3). Porém, para os modelos ajustados com a herbivoria na escala da planta, o número de pousos foi afetado pelo dano foliar (Tabela 4). Esse efeito foi condicionado pelo comprimento dos capítulos e pela sua média de flores receptivas, de modo que capítulos maiores tiveram menos pousos em plantas mais danificadas, comparados aos capítulos da mesma faixa de tamanho em plantas com menos dano foliar (Figura 4A). Para capítulos menores, o efeito do dano foi positivo, pois houve um incremento no número de pousos. Já com relação à média de flores receptivas por capítulo, aqueles capítulos com mais flores sempre recebem mais pousos. Entretanto, com o aumento na intensidade de dano foliar, esses capítulos têm uma redução mais acentuada no número de pousos, em comparação à 40

redução que foi constatada para os capítulos com menos flores receptivas (Figura 4B). A altura do ramo reprodutivo influenciou os pousos nos capítulos independentemente da intensidade de herbivoria nas folhas, de modo que capítulos de ramos mais altos receberam mais pousos (Figura 5).

Tanto para a herbivoria estimada na escala do ramo, como na escala da planta, a quantidade e comportamento dos visitantes florais foram afetadas pelo intervalo do dia. Especificamente, os intervalos de início e fim da manhã foram os que tiveram menos atividade de visitantes comparado aos demais. No Apêndice 2 estão listados gráficos em que foi feita a análise descritiva desta variável com mais detalhe.

Tabela 3. Modelos feitos para avaliar o efeito da intensidade de dano foliar na escala do ramo sobre o número visitantes florais e de pousos nos capítulos de T. adenantha. Resultados obtidos por teste χ² na mudança no desvio residual entre modelos na simplificação.

Efeito da herbivoria foliar na escala do ramo Variável resposta Preditores no modelo mínimo χ² GL P Nº de visitantes* Intervalo do dia 32.211 4 < 0.001 Nº de pousos* Intervalo do dia 40.294 4 < 0.001

GL indica graus de liberdade; * ajuste com distribuição Quasipoisson e ligação log.

Tabela 4. Modelos feitos para avaliar o efeito da intensidade de dano foliar na escala da planta sobre o número de visitantes florais e de pousos nos capítulos de T. adenantha. Resultados obtidos por teste χ² na mudança no desvio residual entre modelos na simplificação.

Efeito da herbivoria foliar na escala da planta Variável resposta Preditores no modelo mínimo χ² GL P Nº de visitantes* Intervalo do dia 56.013 4 < 0.001 Nº de pousos* Intervalo do dia 51.463 4 < 0.001 Altura do ramo 8.533 1 0.003 Dano foliar × Comprimento dos capítulos 4.422 1 0.035 Dano foliar × Média de flores receptivas 5.620 1 0.017

GL indica graus de liberdade; × indica interação; * ajuste do modelo com distribuição Poisson e ligação log.

41

A) B)

Figura 4. Efeito no número de pousos em capítulos de T. adenantha de A) interação entre a intensidade de dano foliar e o comprimento dos capítulos, e B) interação entre intensidade de dano foliar e média de flores receptivas por capítulos. Os valores correspondem a amostragem de um ramo reprodutivo de 89 indivíduos na Serra do Japi. As barras representam o erro padrão para a média calculada.

Figura 5. Relação entre a altura dos ramos reprodutivos e o número de pousos recebidos pelos capítulos de T. adenantha. Cada ponto representa uma das 89 plantas amostradas na Serra do Japi, das quais essas medidas foram obtidas. A linha cheia indica o ajuste de tendência do modelo e as duas linhas tracejadas delimitam o intervalo de confiança de 95%. 42

Seleção de modelos para análise dos grupos taxonômicos

A seleção de modelos baseada no critério de informação de Akaike (AIC) mostrou que os modelos ajustados com a intensidade de herbivoria estimada na escala do ramo e da planta são diferentes (delta de AIC > 2), e aqueles em que a de herbivoria foi estimada na escala da planta são mais adequados para testar o efeito do dano sobre os visitantes florais, já que possuem menor valor de AIC (Tabela 5). Portanto, essa estimativa será usada adiante para avaliar o efeito da intensidade de herbivoria foliar em cada ordem de visitante floral.

Tabela 5. Quadro comparativo de modelos ajustados com a intensidade de herbivoria foliar estimada na escala do ramo e da planta. Essas estimativas são variáveis preditoras do efeito da herbivoria no número de visitantes e pousos por diferentes táxons nos capítulos de T. adenantha. Os modelos estão comparados com o critério de informação de Akaike (AIC). Valores em negrito indicam o delta de AIC que, quando maior que 2, indica que os modelos comparados são diferentes. Constatada a diferença, modelos com AIC menor possuem maior poder de explicação.

Táxon Preditor no modelo AIC Nº de Visitantes Nº de Pousos Diptera Dano foliar na planta 68.52 62.19 Dano foliar no ramo 73.81 68.41 Delta AIC 5.29 6.22 Hymenoptera Dano foliar na planta 138.01 133.26 Dano foliar no ramo 150.17 148.96 Delta AIC 12.16 15.70 Lepidoptera Dano foliar na planta 158.45 161.45 Dano foliar no ramo 160.94 164.22 Delta AIC 2.19 2.77

Efeito do dano para Lepidoptera

Para a ordem Lepidoptera não foi encontrado efeito do dano foliar sobre o número de visitantes ou de pousos nos capítulos. Essas variáveis foram influenciadas pela altura do ramo reprodutivo e pelo intervalo do dia (Tabela 6) (Apêndice 2). Com relação à altura do ramo, o efeito é semelhante ao da comunidade de visitantes como um todo: ramos mais altos tendem a receber um número maior de visitantes, o que também acontece para o número de pousos (Apêndice 6). O tempo de visita não foi afetado pela intensidade de herbivoria foliar ou qualquer outro atributo da planta. 43

Tabela 6. Modelos feitos para avaliar o efeito da intensidade de herbivoria de foliar no número de visitantes e de pousos, e no tempo de visita por lepidópteros em capítulos de T. adenantha. Resultados obtidos por teste χ² na mudança no desvio residual entre modelos na simplificação.

Efeito do dano foliar nas visitas por Lepidoptera Variável resposta Preditores no modelo mínimo χ² GL P Nº de visitantes* Intervalo do dia 39.288 4 < 0.001 Altura do ramo 7.492 1 0.006 Nº de pousos** Intervalo do dia 35.240 4 < 0.001 Altura do ramo 10.431 1 0.001

GL indica graus de liberdade; * ajuste do modelo com distribuição Quasipoisson e ligação log; ** ajuste com Poisson e ligação log.

Efeito do dano para Hymenoptera

Hymenoptera foi a ordem de visitante floral mais influenciada pela intensidade de herbivoria nas folhas. Os números de visitantes e de pousos nos capítulos foram afetados pelo dano de forma condicionada à altura do ramo, número de capítulos receptivos que o ramo possui, pelo tamanho destes capítulos, e por sua média de flores receptivas (Tabela 7). O intervalo do dia também influenciou as visitas e pousos por himenópteros (Apêndice 2). O tempo de visita não foi afetado pelo dano nas folhas ou qualquer outro atributo da planta analisado.

Tabela 7. Modelos feitos para avaliar o efeito da intensidade de herbivoria foliar no número de visitantes e pousos, e tempo de visita por himenópteros nos capítulos de T. adenantha. Resultados obtidos por teste χ² na mudança no desvio residual entre modelos na simplificação.

Efeito do dano foliar nas visitas por Hymenoptera Variável resposta Preditores no modelo mínimo χ² GL P Nº de visitantes* Intervalo do dia 20.671 4 < 0.001 Dano foliar × Nº de capítulos 11.051 1 < 0.001 Dano foliar × Comprimento dos capítulos 6.837 1 0.008 Dano foliar × Nº de flores receptivas 6.543 1 0.010 Nº de pousos* Intervalo do dia 21.382 4 < 0.001 Dano foliar × Altura do ramo reprodutivo 5.987 1 0.014 Dano foliar × Diâmetro dos capítulos 5.928 1 0.015 Dano foliar × Nº de flores receptivas 7.813 1 0.005

GL indica graus de liberdade; × indica interação; * ajuste com distribuição Poisson e ligação log.

Particularmente para o número de visitantes, o efeito do dano foi condicionado pelo número e comprimento dos capítulos, bem como, pela sua média de flores receptivas. O 44

aumento na intensidade de herbivoria teve efeito negativo sobre o número de visitantes em ramos com menos capítulos receptivos, e um efeito positivo sobre os ramos com mais capítulos receptivos (Figura 6A). Já para o comprimento destes capítulos, o efeito do dano foi negativo para capítulos maiores, com uma redução no número de visitas em plantas com maior intensidade de dano. Esse efeito foi consideravelmente positivo para capítulos menores, que receberam mais visitantes em plantas com mais folhas danificadas (Figura 6B). Os capítulos com mais flores receptivas tendem a receber menos visitantes com o aumento da intensidade de dano, e os capítulos com menos flores receptivas tendem a receber mais visitantes, de modo que o efeito de ter mais ou menos flores é nulo para as plantas com muitas folhas danificadas (Figura 6C).

Os pousos foram afetados por interações da intensidade de herbivoria com a altura do ramo reprodutivo, o diâmetro dos capítulos receptivos e a média de flores receptivas nestes capítulos. O dano afetou negativamente o número de pousos em capítulos de ramos altos e baixos, mas o efeito foi maior para ramos baixos comparado à redução para ramos mais altos (Figura 7A). Com relação ao diâmetro dos capítulos, constatou-se o mesmo efeito visto para o número de visitantes em relação ao comprimento: com o aumento da intensidade de herbivoria, os capítulos com maior diâmetro receberam consideravelmente menos pousos, e capítulos menores receberam mais pousos (Figura 7B). Capítulos com mais flores receptivas recebem mais pousos. Porém, em plantas mais danificadas, esses capítulos têm uma redução acentuada no número de pousos comparados aqueles capítulos com menos flores receptivas (Figura 7C).

45

A) B)

C)

Figura 6. Efeito no número de visitantes nos capítulos de T. adenantha de A) interação entre a intensidade de dano foliar e o número de capítulos receptivos no ramo, B) interação entre intensidade de dano foliar e comprimento médio dos capítulos receptivos, e C) interação entre intensidade de dano foliar e a média de flores receptivas por capítulo. Os valores correspondem a amostragem de um único ramo reprodutivo de 89 indivíduos na Serra do Japi. As barras representam o erro padrão para a média calculada. 46

A) B)

C)

Figura 7. Efeito no número de pousos nos capítulos de T. adenantha de A) interação entre a intensidade de dano foliar e altura do ramo reprodutivo, B) interação entre intensidade de dano foliar e diâmetro médio dos capítulos receptivos, e C) interação entre intensidade de dano foliar e média de flores receptivas por capítulo. Os valores correspondem a amostragem de um único ramo reprodutivo de 89 indivíduos na Serra do Japi. As barras representam o erro padrão para a média calculada. 47

Efeito do dano para Diptera

O dano foliar afetou negativamente a interação de dípteros com os capítulos de T. adenantha (χ² = 5.13, GL = 1, P = 0.023). De acordo com o modelo binomial, as visitas ocorrem em maior proporção em plantas em que a intensidade de herbivoria é menor (i. e. até 50% das folhas danificadas), comparada às plantas mais danificadas (Figura 8). Não foi encontrado efeito do dano para o tempo de visita.

Figura 8. Relação entre a intensidade de herbivoria foliar e a ocorrência de visitas por Diptera nos capítulos de T. adenantha. Dados obtidos de 89 indivíduos amostrados na Serra do Japi. A linha cheia indica o ajuste de tendência do modelo e as duas linhas tracejadas delimitam o intervalo de confiança de 95%.

Discussão

Interação com visitantes florais

Os capítulos de Asteraceae de modo geral recebem grande diversidade de visitantes florais, o que inclui polinizadores, herbívoros não polinizadores e até mesmo predadores e parasitóides de endófagos (Almeida et al., 2006; Monge & Semir, 2012). Isso acontece porque esses capítulos representam uma fonte conspícua de recursos na vegetação, onde é possível encontrar alimento e abrigo, e até parceiros para a reprodução (Monge & Semir, 2012). Portanto, esperávamos de fato encontrar uma grande diversidade de visitantes florais interagindo com capítulos de T. adenantha, alguns deles potenciais polinizadores. Registramos 35 espécies/morfoespécies de visitantes florais entre as ordens Lepidoptera, Hymenoptera e 48

Diptera. Porém, não sabemos qual a contribuição relativa de cada um desses táxons para a polinização dessa planta, mas esses grupos taxonômicos são os mais importantes para a polinização de espécies de Asteraceae de modo geral (Mani & Saravanan 1999). Outros estudos já conduzidos com T. adenantha na Serra do Japi corroboram nossos resultados com relação a riqueza de seus visitantes florais (Romero & Vasconcellos-Neto, 2005; Salomão et al., 2006; Grisolia, 2014). Este estudo contribuiu com a identificação mais apurada desses indivíduos, o que gerou 24 novos registros de interação em relação ao divulgado nos trabalhos anteriores (Apêndice 3). Duas espécies de Lepidoptera, Mechanitis polymnia (Haensch, 1905) e Epityches eupompe (Geyer, 1832), já registradas visitando capítulos de T. adenantha, não foram encontradas na nossa amostragem.

Para avaliar se T. adenantha é de fato uma planta generalista em termos da interação com polinizadores, é preciso checar outros vários aspectos da sua biologia reprodutiva e o contexto da comunidade de visitantes florais (Ollerton et al., 2007). De outra forma, podemos avaliar o padrão de atividade dos tóxons de visitantes ao longo do dia e buscar por especificidades. Para T. adenantha, foi observado que os capítulos são visitados ao longo de todo o dia. Comparados à Diptera, as ordens Lepidoptera e Hymenoptera foram as mais ativas. Apesar de Lepidoptera ser sempre o táxon mais ativo, houve uma queda de atividade desse grupo no início da tarde e aumento no fim da tarde. Somente neste momento, Hymenoptera é o grupo mais representativo dentre os visitantes, enquanto Lepidoptera está ausente. Em outro estudo realizado com T. adenantha na Serra do Japi, também entre abril e maio, foi encontrado o mesmo padrão de atividade ao longo do dia para os respectivos grupos de visitantes florais (Grisólia, 2014).

A maior parte das espécies de Lepidoptera registradas neste estudo são borboletas da família Nymphalidae (38 % do total de espécies), dentro da qual quase todas pertencem à tribo Ithomiini (apenas duas pertencem à tribo Danaini). A outra parcela é composta por mariposas diurnas da família Erebidae, todas da tribo Arctiini. Isso significa que há certo grau de especialização entre os visitantes florais T. adenantha, pelo menos considerando Lepidoptera. Isso pode ser reflexo de uma restrição fenotípica da planta, já que seu néctar possui níveis de alcaloides pirrolizidínicos (PAs) tóxicos para aqueles visitantes que não conseguem metabolizá-los (Trigo, 1996). Espécies de Arctiini e Danaini, e especialmente as borboletas Ithomiini, são capazes não só de lidar com esses compostos, mas de usá-los como recurso para a proteção contra predadores e síntese de feromônios sexuais (Brown, 1984; Trigo, 1996, 2008). Isso pode explicar, em parte, o maior número de visitantes e o maior tempo de visita por 49

Lepidoptera encontrado em nosso estudo. Para essas espécies, T. adenantha pode representar uma fonte não só de néctar, como também de alcaloides.

Os resultados indicam que Lepidoptera é um táxon representativo nas interações de T. adenantha com seus visitantes florais, em termos de riqueza de espécies, abundância e atividade ao longo do dia. Isto, somado ao fato de que sua interação com a planta é mais especializada em termos do uso do recurso, sugere que esse grupo deve ser relevante em termos de efetividade de polinização comparado aos demais. Essa suposição precisa ser vista com ressalvas, pois ainda não sabemos a que medida os demais táxons de visitantes florais (i. e. Hymenoptera e Diptera) também usam néctar como recurso, e se podem metabolizar alcalóides nesse processo; ou mesmo se o pólen geralmente mais consumido por eles também possui compostos secundários tóxicos.

Trabalhos anteriores mostraram que algumas espécies das tribos Ithomiini, Danaini e Arctiini na Serra do Japi são polinizadoras efetivas de, pelo menos, uma espécie de Asteraceae (Eupatorium xestolepis B. L. Robinson) (Pliske, 1975), e uma espécie de orquídea (Epidendrum paniculatum Ruiz & Pavón) (Pansarin, 2003). Especificamente, os polinizadores avaliados no estudo de Pansarin (2003) incluem as espécies Episcada carcinia, E. clausina, Hypothyris ninonia e Placidula euryanassa, que foram registradas visitando T. adenantha. Se esse for o caso, e esses táxons também forem polinizadores efetivos de T. adenantha, é razoável esperar que Lepidoptera responda diferencialmente às mudanças que acontecem nos atributos florais, particularmente aquelas causadas pela herbivoria.

Efeitos da herbivoria foliar sobre os visitantes florais

A época de pico dos visitantes florais e herbívoros nos capítulos é também o pico dos herbívoros associados às folhas de T. adenantha (ver Romero & Vasconcellos-Neto 2005). A maior abundância de herbívoros pode significar mais eventos de dano nas folhas, que podem levar a algum efeito sobre a atratividade dos capítulos aos visitantes florais. Se tais efeitos estiverem relacionados à demanda conflitante de recursos para reprodução e defesa, eles podem ser amenizados pela alta disponibilidade de recursos na época em que foi realizado o trabalho (estação chuvosa). Entretanto, ainda assim, a mobilização de defesas pode afetar os capítulos por outras vias que não a alocação diferencial de recursos (e. g. por efeitos pleiotrópicos na produção de compostos de defesa). Essas possibilidades estão intimamente relacionadas ao padrão de herbivoria enfrentado pela planta, uma vez que as plantas respondem de forma diferente ao dano de acordo com o tipo e a intensidade deste dano (Karban & Baldwin, 1997; 50

Walters, 2011). Particularmente, as folhas de T. adenantha são danificadas por herbívoros de várias guildas, apesar da marca de dano mais frequente ser atribuída a um picador-sugador. Os danos por mastigadores são geralmente causados por lagartas das famílias Geometridae e Pyralidae (Lepidoptera), por besouros da família Chrysomelidae, e por Orthoptera (Romero et al., 2008), o que foi corroborado neste trabalho.

A intensidade de herbivoria nas folhas afetou diferencialmente a interação entre T. adenantha e seus visitantes florais. Esse efeito variou de acordo com o táxon de visitante e foi condicionado a diferentes atributos da planta, como a altura do ramo, o número de capítulos receptivos, o tamanho desses capítulos, e a sua média de flores receptivas. Na literatura, há evidências de que o dano foliar modifica o tamanho e o número das flores produzidas pela planta, com efeitos ecológicos sobre a sua interação com visitantes florais (Karban & Strauss, 1993; Mothershead & Marquis, 2000). Entretanto, grande parte desses resultados foi obtida através de experimentos em que a herbivoria foi controlada. Poucos avaliaram a mesma questão através da quantificação do dano em ambiente natural, como foi conduzido nesse trabalho (mas ver Kessler et al., 2011). Apesar da quantificação do dano feita em campo limitar as conclusões, uma vez que não sabemos em que momento o dano foi feito (i. e. antes ou depois da produção dos capítulos), a sua aplicação produz resultados em panorama mais amplo, em que se considera a real intensidade de herbivoria com a qual a planta lida enquanto interage com os visitantes florais.

O tamanho dos capítulos e a sua média de flores receptivas foram as variáveis que mais condicionaram o efeito da intensidade de herbivoria sobre os visitantes florais de T. adenantha. Quando toda a comunidade foi avaliada, o dano afetou a quantidade de pousos nos capítulos de modo que, com o aumento da intensidade de dano, os capítulos maiores receberam menos pousos e os menores receberam mais. Esse resultado, de modo geral, é o oposto do que se esperaria para a influência do tamanho das flores sobre a atratividade de visitantes florais. Flores e inflorescências maiores incrementam o sinal visual emitido para o visitante floral, e tendem a ser mais atrativas para eles (Conner & Rush, 1996; Parachnowitsch & Kessler, 2010; Morales et al., 2013). Entretanto, no contexto de dano foliar intenso, isso parece não acontecer para os capítulos de T. adenantha.

Uma das hipóteses para isso é que, para plantas mais danificadas, exista um trade-off entre o tamanho e a atratividade dos capítulos. Isso pode ocorrer via diminuição da atratividade dos capítulos maiores, ou por um incremento da atratividade dos capítulos menores. Essa 51

mudança na atratividade poderia acontecer através da produção de mais ou menos recursos (i. e. néctar e pólen), além de efeitos na sua qualidade; e/ou através do comprometimento ou incremento de sinais florais (i. e. cor, fragrância). Independente do mecanismo, tanto a produção de recursos, quanto de sinais florais, consome recursos da planta. Como já foi avaliado em outros sistemas, capítulos maiores possuem mais flores e, portanto, requerem uma demanda maior de recursos da planta para mantê-los atrativos, seja através da reposição de recursos, ou da manutenção dos sinais de atratividade (Galen et al., 1999; Obeso, 2002; Willmer, 2011). No contexto de muito dano foliar na planta, a demanda de recursos para a defesa pode comprometer o investimento nesses capítulos com maior custo de manutenção. Como consequência, eles se tornarão menos atrativos e receberão menos pousos (e.g. se produzem menos néctar). Isso ocasionalmente pode levar a um aumento relativo no número de pousos em capítulos menores, simplesmente porque os visitantes deixaram de visitar capítulos maiores.

Por outro lado, pode ser vantajoso para a planta, nesse mesmo contexto de dano, garantir que pelo menos uma pequena parcela das suas flores seja polinizada. Sugerimos que investir na atratividade de capítulos menores, com menos flores e menos custos para mantê-las, pode funcionar nesse sentido. Capítulos com mais flores receptivas tendem a receber mais pousos comparados àqueles com menos flores. Porém, o efeito negativo do dano é mais acentuado justamente para os capítulos que possuem mais flores receptivas (ver Figura 5B). Isso sugere que ter mais flores receptivas (i. e. em antese) não favorece os capítulos quando as plantas estão com muito dano nas folhas, provavelmente porque flores receptivas exigem mais recursos para mantê-las atrativas no contexto em que esses recursos também devem ser mobilizados para defesa, como discutido também por Kessler & Halitschke (2009).

Alternativamente, o mesmo resultado pode ser explicado por efeitos pleiotrópicos das respostas da planta a herbivoria. A biossíntese de compostos de defesa pode alterar a biossíntese de compostos de atratividade ou de recursos florais se ambos compartilham enzimas ou compostos intermediários (Pareja et al., 2012; Bostock, 2005). Justamente por possuir mais flores, os capítulos maiores estarão mais sujeitos a eventos pleiotrópicos comparados aos capítulos menores. Isso só faz sentido se, em capítulos com mais flores, houver maior turnover de recursos e maior produção destes recursos e de sinais florais dinâmicos, como acontece para o néctar e os COVs (Willmer, 2011; Schiestl et al., 2014). Para T. adenantha, as hipóteses de trade-off e pleiotropismo são igualmente possíveis, já que existe uma correlação positiva entre o tamanho dos capítulos e o total de flores, além do fato de que as plantas com maior porcentagem de folhas danificadas tendem a produzir menos capítulos no ramo e capítulos 52

menores em diâmetro (ver Apêndice 1). Esse efeito negativo na quantidade e tamanho das flores também foi constatado em outros sistemas por Karban & Strauss (1993), Primack et al. (1994), e Mothershead & Marquis (2000).

Para Lepidoptera não houve efeito do dano, e a altura dos ramos reprodutivos foi o atributo da planta que mais influenciou o número de visitantes e pousos nos capítulos. Capítulos de ramos mais altos receberam mais visitantes e pousos, e isto pode ser um indicativo indireto do efeito do tamanho da planta sobre a atratividade dos capítulos para esse táxon. A altura dos ramos de T. adenantha está positivamente correlacionada com o número de ramos reprodutivos que a planta possui (ver Apêndice 1). Plantas maiores e com mais ramos reprodutivos tendem a ser mais atrativas aos visitantes florais pois podem amplificar o display floral, particularmente o sinal visual emitido pelas flores em conjunto (Willmer, 2011). A influência positiva do tamanho da planta já foi registrada em outros sistemas (e. g. Klinkhamer et al., 1989; Mitchell, 1994). Para Hymenoptera também foi constatado efeito da altura do ramo, porém condicionado os efeitos do dano foliar, o que reforça a hipótese de que a influência da altura do ramo é algo mais geral para os visitantes florais, e que provavelmente está relacionado à amplificação do display dos capítulos em plantas maiores.

Hymenoptera foi o táxon para o qual foram detectados mais efeitos do dano foliar. Todos esses efeitos foram condicionados a atributos da planta, especificamente o tamanho dos capítulos e sua média de flores receptivas. Ambos números de visitantes e de pousos foram afetados, porém com algumas diferenças que nos leva a sugerir que o efeito do dano para este táxon varia de acordo com dois momentos do forrageamento: a atração dos visitantes até os capítulos e a concretização do pouso. No primeiro momento, em que se considera somente o número de visitantes que chegam aos capítulos, o efeito negativo do dano foliar é atenuado pelo número de capítulos receptivos no ramo. Com o aumento da intensidade de dano, ramos com mais capítulos receptivos recebem mais visitantes, e os com menos capítulos recebem menos visitantes (ver Figura 6A). Isso pode ser entendido como um efeito positivo ter mais capítulos receptivos no ramo que amplificam o display floral e atraem mais visitantes, mesmo quando a planta está mais danificada. Isso também pode estar relacionado com o tamanho desses capítulos, já que plantas com mais folhas danificadas produzem capítulos menores, que podem ser mais atrativos de acordo com os mecanismos de trade-off e pleiotropismo sugeridos acima.

Com relação ao segundo momento do forrageio, aquele em que o pouso acontece, o que condicionou o efeito do dano foliar foi a altura do ramo, o tamanho dos capítulos e o número 53

de flores receptivas. Sugerimos novamente que a altura do ramo represente o efeito do tamanho da planta e amplificação do display visual dos capítulos, que atenua o efeito negativo da intensidade de dano. O tamanho dos capítulos tem um forte efeito sobre o número de pousos que também pode estar relacionado ao trade-off de atratividade e tamanho. Esse efeito é mais acentuado para os pousos comparado ao encontrado para o número de visitantes, embora se refiram a medidas diferentes de tamanho (comprimento e diâmetro, respectivamente). O efeito mais forte para pousos faz sentido se consideramos que a decisão de pousar ou não na flor é feita com critério pelo visitante floral, que considera aspectos mais finos da disponibilidade e qualidade de recursos (ver Srinivasan, 2010). O dano foliar pode alterar esses recursos nos capítulos (Quesada et al., 1995; Aizen & Raffaele, 1996; Adler & Irwin, 2005), além de afetar sinais florais que informam sobre a quantidade e qualidade destes recursos na flor (Effmert et al., 2008; Theis et al., 2009). O tempo de visita, entretanto, não foi influenciado pelo dano foliar em nenhum táxon, o que indica que os efeitos do dano devem acontecer de fato sobre decisão de pouso e não da permanência no capítulo.

Abelhas representam aproximadamente 80% dos táxons de Hymenoptera que foram registrados interagindo com os capítulos de T. adenantha. Esses insetos são conhecidos na literatura por suas especificidades na interação com as flores que visitam (Srinivasan, 2010). São capazes de reconhecer mudanças causadas pela herbivoria no tamanho das flores, na quantidade/qualidade do pólen e no perfil de COVs (Detzel & Wink, 1993; Lehtila & Strauss, 1997; Kessler & Halitschke, 2009; Theis et al., 2009). Os resultados obtidos neste trabalho podem ser relacionados à sensibilidade das abelhas em perceber mudanças nas flores. Esse efeito ainda pode ser potencializado, já que muitas espécies de abelhas têm a capacidade de comunicar aos indivíduos coespecíficos a sua percepção sobre a qualidade da flor com a qual interage. Em um estudo sobre risco de predação nos capítulos de T. adenantha, Grisólia (2014) constatou que foi justamente Hymenoptera, maior parte abelhas, o táxon que mais e respondeu a presença de aranhas predadoras nos capítulos. Esse estudo não necessariamente corrobora nossos resultados, mas traz mais evidências de que, dentre os táxons de visitantes florais de T. adenantha, Hymenoptera é o mais sensível a alterações nos capítulos.

Por fim, Diptera é grupo menos frequente de visitantes florais que interagem com T. adenantha. Devido ao baixo número de registros para essa ordem, não foi possível analisar os efeitos da herbivoria para a quantidade de pousos. A principal análise foi a de ocorrência ou não de visitas. Plantas com mais folhas danificadas têm menos chance de receber visita por Diptera comparadas àquelas com menos folhas danificadas. Os sirfídeos são as moscas mais 54

representativas nesse grupo, e elas geralmente não são influenciados pelo dano nas plantas (Willmer, 2011). Em contrapartida, são particularmente sensíveis a alterações em atributos que compõem a atratividade floral, principalmente número o tamanho das flores (Conner & Rush, 1996), o que pode ter acontecido no caso de T. adenantha.

Conclusões

Nesse trabalho, nós constatamos que T. adenantha interage com diversos táxons de visitantes florais, dos quais Lepidoptera é o mais frequente. A intensidade de herbivoria foliar de fato tem efeito sobre a interação dessa planta com os seus visitantes florais. Esse efeito só ocorre para o dano estimado na escala da planta inteira, e não só do ramo, e varia de acordo com o táxon de visitante floral. Para Lepidoptera não houve influência do dano e Hymenoptera foi o táxon mais afetado. Plantas com mais folhas danificadas tendem a receber menos visitantes e pousos em seus capítulos. Esse efeito parece ser atenuado para plantas maiores, com ramos mais altos, e mais capítulos receptivos nos ramos. O mesmo acontece para os capítulos com uma maior média de flores receptivas, embora mais flores receptivas possam significar maior custo para a planta mantê-las atrativas em contexto de muito dano. Novos estudos deverão focar nos mecanismos pelos quais o dano foliar influencia a atratividade dos capítulos, abordando hipóteses de que o dano pode levar à produção de capítulos menores e com menos flores, ou mudar a qualidade dos recursos e sinais florais. Também deverá ser estudada a importância da interação com cada táxon de visitantes para a polinização dessa planta, determinando sua efetividade de polinização, e se os polinizadores mais efetivos são os mesmos afetados pelo dano. Estudos assim são de grande relevância para avançar no conhecimento sobre a interação entre herbivoria e polinização e sobre os efeitos ecológicos indiretos em comunidades.

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CAPÍTULO 2

Efeito do dano foliar na emissão de voláteis e taxas de visitação floral em Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae)

Luiz H. G. REZENDE, Gustavo Q. ROMERO, Martín PAREJA

Resumo

Visitantes florais comumente usam sinais químicos emitidos pelas flores para encontrá-las, particularmente os sinais constituídos por compostos orgânicos voláteis (COVs) que compõem o aroma das flores. O dano nas folhas pode afetar esses sinais e comprometer a atratividade floral, o que acontece quando COVs vegetativos são emitidos após o dano próximo às flores e modificam o contexto químico em que são apresentadas e percebidas pelos visitantes. Neste estudo, testamos se diferentes níveis de dano mecânico nas folhas dos ramos reprodutivos de Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae) afetam o perfil de COVs nesses ramos e a interação dos capítulos com visitantes florais, e se isto varia com o tempo após o dano. Em campo, um ramo reprodutivo por planta foi submetido ao dano em todas as folhas (0%, 25%, 50% ou 75% da área foliar removida), e a visitação aos capítulos foi observada 2min e 24h após o dano. Dano mecânico com 50% de área foliar removida foi feito em ramos reprodutivos de plantas cultivadas em casa de vegetação, e os COVs destes ramos foram coletados 2min e 24h após a manipulação. O dano foliar moderado (25-50%) levou à rápida redução nas taxas de visita, que ainda foi detectada 24h depois. Em ramos com 25% de dano houve um aumento no número de aproximações aos capítulos 24h depois. Já para a análise dos voláteis, foram detectados 48 terpenos, um benzenóide, e um composto alifático. Não houve mudança na quantidade total de COVs emitidos, apesar da emissão de certos compostos ter mudado 2min e 24h após o dano. Alguns compostos foram emitidos somente após o dano e outros cessaram a missão. É provável que haja relação de causa e efeito entre as mudanças nos COVs e a atividade de visitantes se os compostos com mudança na emissão forem atrativos ou repelentes para eles. Sugerimos que voláteis vegetativos são importantes para a interação com visitantes florais nesse sistema, pois não foram detectados compostos florais específicos.

Palavras-chave: dano foliar mecânico, compostos orgânicos voláteis, headspace floral 56

Introdução

Visitantes florais conseguem encontrar as flores de uma planta através da sua cor e dos sinais químicos emitidos por elas. Especificamente, esses sinais são constituídos por uma mistura de compostos orgânicos voláteis (COVs) produzidos pelo metabolismo secundário das plantas, que formam a fragrância floral. Nesse sentido, COVs são semioquímicos importantes no display floral, que informam aos potenciais polinizadores sobre a disponibilidade de flores receptivas, bem como, sobre a quantidade e qualidade dos recursos que estas flores possuem (Bruce & Pickett, 2011; Kessler et al., 2008; Raguso, 2008). Visitantes florais que não necessariamente polinizam as flores, mas que consomem seus recursos, também podem usar os COVs para localizá-las. Portanto, estes sinais tendem a ser específicos em composição e padrões de emissão para maximizar a interação com visitantes florais que beneficiem a planta (Byers & Schiestl, 2015; Kessler et al., 2008). Mudanças no perfil qualitativo (identidade de compostos) ou quantitativo (quantidade relativa de compostos) dos COVs podem comprometer a atratividade floral e alterar o resultado dessa interação, o que também dependerá da resposta diferencial da comunidade de visitantes florais (Wright & Schiestl, 2009; Kessler et al., 2010).

Assim como vários outros atributos florais, os COVs podem ser modificados pela herbivoria (Kessler et al.,2011; Lucas-Barbosa et al., 2011; Pareja et al., 2012; Schiestl et al., 2014). Isso pode acontecer como consequência do baixo investimento da planta na atratividade das flores diante da demanda de recursos para a defesa (Karban & Baldwin, 1997; Bronstein et al., 2007). Outros mecanismos incluem os efeitos pleiotrópicos da síntese de compostos de defesa que podem alterar a produção dos COVs na flor (Pareja et al. 2012), além da influência dos COVs foliares emitidos após o dano próximo às flores (Kessler & Halitschke, 2009; Schuman et al., 2016). Especificamente, o efeito dos COVs vegetativos na atratividade floral é algo ainda pouco explorado na literatura. A hipótese geral é que o dano foliar afete a emissão de voláteis no ambiente próximo às flores (i. e. headspace floral), e isto modifique o contexto químico em que as flores são apresentadas aos visitantes florais. Isso tende a influenciar o comportamento dos visitantes florais que usam os sinais químicos para localizar as flores, sendo assim mais suscetíveis a alterações nestes sinais.

A emissão de COVs em resposta à herbivoria é algo que ocorre em várias espécies de planta, inclusive quando considerado somente o dano mecânico (Baldwin, 2010; Beck et al., 2008). Assim como acontece para voláteis florais, a emissão de voláteis vegetativos pode ser adaptativa para a planta por conter compostos repelentes aos herbívoros, e que podem ser 57

usados por inimigos naturais para localizá-los na planta (Dicke & Baldwin, 2010). Esses COVs podem ser produzidos e armazenados em estruturas especializadas da planta, como tricomas glandulares, ou ser produzidos por indução após o dano e liberados posteriormente (ver Widhalm et al., 2015). Portanto, a emissão desses compostos é algo dinâmico que varia de segundos até dias após o dano (Schaub et al., 2010; Schuman et al., 2016). O padrão de emissão dos COVs após o dano pode variar também de acordo com a guilda do herbívoro, sua especificidade de dieta, e com a quantidade de dano que é feito na planta (Mithofer & Boland, 2008; Blue et al., 2015; Copolovivi et al., 2011).

Dessa maneira, é plausível que a emissão de COVs vegetativos após o dano nas folhas dos ramos reprodutivos modifique a atratividade das flores e o comportamento dos visitantes florais, e que estes efeitos também estejam sujeitos às variações na quantidade e no tempo após o dano nas folhas. De fato, poucos estudos têm investigado a importância COVs vegetativos na interação das plantas com os visitantes florais. Os estudos com essa abordagem geralmente focam na importância de compostos que podem ser emitidos tanto pelas folhas quanto pelas flores (Willmer, 2011, Raguso, 2008).

Neste trabalho, testamos a hipótese de que o dano mecânico nas folhas dos ramos reprodutivos de Trichogoniopsis adenantha (DC.) R. M. King & H. Rob. (Asteraceae) afeta o perfil de COVs nestes ramos e a interação dos seus capítulos com os visitantes florais. Esta é uma planta quimicamente conspícua, pois possui tricomas glandulares por toda a superfície do caule, folhas e capítulos (Romero et al., 2008). O dano mecânico pode facilmente quebrar os tricomas, liberando COVs no headspace floral dos capítulos. Sabe-se que esses tricomas funcionam como defesa direta contra pequenos herbívoros, e medeiam o mutualismo de T. adenantha com aranhas (Romero et al., 2008). Entretanto, os COVs desses tricomas não foram descritos, assim como não se sabe se os capítulos produzem voláteis florais. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil de COVs liberados pelos ramos reprodutivos desta planta, e responder especificamente as seguintes perguntas: (1) o dano mecânico nas folhas afeta o perfil de voláteis nos ramos reprodutivos da planta e a sua interação com visitantes florais? (2) esse efeito varia com a quantidade de área foliar removida e com o tempo após o dano? 58

Material e métodos

Área e sistema de estudo

T. adenantha é um arbusto semidecíduo que pode chegar a 1.90 m, e que ocorre em margens de florestas no sudeste do Brasil. Sua floração acontece ao longo de todo o ano e as flores possuem um baixo nível de autocompatibilidade, requerendo assim a interação com visitantes florais para sua polinização (G. Q. Romero, L.H.G. Rezende, observação pessoal). Indivíduos dessa planta possuem ramos com aproximadamente seis capítulos em diferentes fases de desenvolvimento, que vão desde botões até a fase de dispersão dos aquênios (Romero & Vasconcellos-Neto, 2005). Cada capítulo possui em média 36 flores com antese dissincrônica e centrípeta. Pouco se sabe sobre a biologia de polinização de T. adenantha, entretanto, já foram registradas 35 espécies/ morfoespécies de visitantes florais que incluem as ordens Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera (Romero & Vasconcellos-Neto, 2005; Capítulo 1)

O experimento em campo foi realizado entre fevereiro e maio de 2016, época em que há o pico de floração de T. adenantha, com indivíduos encontrados na Serra do Japi - Trilha da Biquinha, uma região de Mata Atlântica localizada em Jundiaí – SP (23º11’S e 46º52’W). O experimento em casa de vegetação para a coleta de voláteis foi realizado com mudas obtidas na Serra do Japi entre fevereiro e junho de 2016. O cultivo das mudas e coleta de COVs aconteceu nas instalações do Instituto de Biologia da UNICAMP.

Experimento em Campo

Este experimento testou se a interação entre T. adenantha e seus visitantes florais é afetada pelo dano foliar mecânico, e se este efeito varia com a quantidade de área foliar removida e o tempo após o dano. Para isso, em campo, foram selecionados 24 indivíduos de T. adenantha com ao menos um ramo reprodutivo com capítulos em antese, conforme características descritas por Romero e Vasconcellos-Neto (2005). Um único ramo focal por planta foi sorteado para a aplicação dos tratamentos experimentais e observação dos visitantes florais.

No início do experimento, cada ramo focal foi aleatoriamente designado a um dos seguintes tratamentos: (a) 0% de área foliar removida (controle); (b) 25%; (c) 50%; e (d) 75%. O dano mecânico foi feito com tesoura higienizada em todas as folhas expandidas do ramo, ou seja, quando designada ao tratamento 50%, significou que removemos 50% da área foliar de 59

cada folha do ramo. O comprimento total do limbo foliar foi usado como referência para a área foliar removida (i. e. na remoção de 50% foi considerado a metade do comprimento do limbo).

Para o registro de visitantes florais, cada ramo foi submetido a três observações: (1) controle, realizada antes da manipulação nas folhas do ramo, afim de registrar a taxa basal de visitantes florais; (2) dois minutos após manipulação; (3) 24h após a manipulação. Cada observação foi feita por 30 min, durante os quais foram registrados os números de visitantes, aproximações e pousos nos capítulos. O comportamento foi considerado uma aproximação quando o inseto se movimentou em direção ao capítulo sem tocá-lo, e pouso quando o tocou por mais de um segundo. Foi considerado visitante o inseto que pousou pelo menos uma vez em algum capítulo do ramo observado. Adicionalmente, para cada ramo focal, foram registrados os números de folhas e de capítulos receptivos. Os capítulos receptivos foram coletados para o registro do número de flores em antese.

Usamos somente um ramo por planta, portanto cada ramo representou uma unidade amostral independente. O conjunto dos quatro tratamentos de dano representou um bloco do experimento. Cada bloco foi replicado seis vezes, e cada uma das réplicas foi feita ao longo de um dia em intervalos sorteados no período de 8:00 às 17:00 h.

Experimento em casa de vegetação

Este experimento testou se o perfil de voláteis no headspace floral é afetado pelo dano mecânico nas folhas dos ramos reprodutivos de T. adenantha, e se este efeito varia com a porcentagem de área foliar removida e o tempo após o dano. Para isso, mudas de T. adenantha jovens em estágio vegetativo foram coletadas em campo e cultivadas em casa de vegetação até atingirem a fase reprodutiva e produzirem o primeiro ramo com capítulos em antese. Cada muda foi plantada em um vaso plástico com volume de 2.6 L preenchido com mistura de terra vegetal e substrato na proporção 2:1. A terra utilizada (marca Floreira) possuía 20% de matéria orgânica, de 1.5 a 3% de nitrogênio, 0.5 a 1% de potássio e pH entre 7 e 8. Já o substrato, possuía em sua constituição turfa, casca de pinus, vermiculita, carvão vegetal e matéria orgânica. As plantas foram regadas uma vez a cada dois dias com aproximadamente a mesma quantidade de água. Durante o cultivo, as condições de humidade e temperatura não foram controladas.

Do total de indivíduos reprodutivos na casa de vegetação, três foram sorteados e submetidos a um dos seguintes tratamentos: (a) 50% da área foliar removida 24h antes da coleta 60

de COVs; (b) 50% da área foliar removida 2min antes da coleta de COVs; e (c) 0% de área foliar removida (controle). O dano foi feito em um ramo reprodutivo sorteado por indivíduo, com uma tesoura higienizada e em aproximadamente dez folhas expandidas. O comprimento do limbo foliar foi usado como referência para a remoção da área foliar como feito no experimento anterior. O conjunto dos três tratamentos constituiu um bloco submetido à coleta de voláteis em laboratório. Foram feitas cinco réplicas de cada bloco.

Coleta e caracterização dos voláteis

A coleta dos compostos voláteis foi conduzida por 12h em um sistema de aeração dinâmica como descrito por Millar & Haynes (1998) (foto no Apêndice 7). Os vasos com os indivíduos de T. adenantha foram levados ao laboratório e cada ramo reprodutivo foi colocado no interior de uma câmara de vidro de volume 0.38 L e fundo aberto. O fundo da câmara foi fechado com papel alumínio para minimizar a contaminação por voláteis vindos do solo. Cada câmara possuía duas entradas que foram usadas para estabelecer um fluxo de ar da seguinte maneira: em uma entrada foi instalada uma mangueira de teflon que introduziu na câmara ar purificado com carvão ativado a um fluxo de 1 L/min; na outra entrada, uma segunda mangueira foi instalada para sugar esse ar a um fluxo de 0.75 L/min. Esse fluxo de entrada e saída de ar foi estabelecido por duas bombas de vácuo e pressão (Millipore). Na saída da câmara, na ponta da mangueira, o ar sugado passou por um pequeno tubo de vidro contendo 100 mg do adsorvente HayeSep Q (80/100, Supelco), que coletou os compostos. Após as 12h de aeração, o tubo foi retirado da câmara e o adsorvente foi eluído com 2 ml de diclorometano (Synth).

Foram adicionados ao extrato 5 μL de uma solução de 100 ng/μL de dodecano em diclorometano para funcionar como padrão interno. Os extratos foram concentrados até 50 μL com um fluxo de ar purificado, de modo que a concentração final do padrão interno se manteve em 10 ng/μL. Posteriormente, os frascos de vidro com extratos foram vedados com fita veda rosca e mantidos a -20°C até o seu uso nas análises.

A coleta de COVs por microextração em fase sólida (SPME em inglês) foi usada como um método complementar à aeração dinâmica (foto no Apêndice 7). Nesse método, os ramos de cada tratamento foram envolvidos por um saco de poliéster (41 x 33 cm) fechado nas pontas por um feixe de plástico. Os ramos foram mantidos ensacados por uma hora para que o ar no interior fosse concentrado com os compostos voláteis liberados pela planta. Após esse tempo, o saco foi perfurado com uma agulha e, por este furo, foi colocada a ponta de uma seringa com a fibra do polímero polidimetilsiloxano (100 μm, Supelco), que coletou os compostos. A fibra 61

foi imediatamente acoplada ao cromatógrafo. Esse método também foi usado para coleta de COVs florais, em que somente os capítulos foram individualizados no ramo com saco de poliéster (5 x 5 cm) para poder identificar os COVs liberados pelas flores.

A caracterização dos compostos foi conduzida através de análise dos extratos em cromatografia gasosa (CG), e CG acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Foram injetados em modo splitless 2 μL de cada extrato no cromatógrafo (2010A, Shimadzu, Tokyo, Japan), com coluna Rtx – 5MS (30 m de comprimento; 0.32 mm de diâmetro interno; 0.25 μm de espessura do filme, Restek) e hélio como gás carreador. O extrato foi injetado com o forno a temperatura inicial de 50 °C mantida por 3 min. Posteriormente, a temperatura foi ajustada para 150 °C a uma taxa de 5 °C min-1 e mantida por 0.10 min; e novamente ajustada para 250 °C a uma taxa de 10 °C min-1, mantida por 5 min. O espectro de massas foi obtido por impacto de elétrons a 70 eV. Os compostos foram identificados de forma tentativa com o Índice de Kovats (KI em inglês), calculado a partir de injeção prévia no CG-EM de uma série de alcanos (C8-C20) no mesmo método usado para os extratos. Tanto o KI quanto o espectro de massas foram utilizados para comparar os picos obtidos na análise com aqueles registrados na biblioteca instalada no CG-EM, e também online, na biblioteca do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia dos Estados Unidos (NIST, USA) (Linstrom & Mallard, 2011).

Análise dos dados

Para testar o efeito da intensidade do dano foliar no número de visitantes florais, e de aproximações e pousos nos capítulos foram utilizados modelos lineares generalizados (GLMs em inglês). O número de folhas e de flores em antese por capítulo foram incluídos como covariáveis. Para controlar o efeito da atratividade natural dos ramos (i. e. da taxa basal de visitas), a variável resposta foi a diferença entre a observação após os tratamentos e aquela feita no mesmo ramo antes da manipulação. Isso foi feito para as observações realizadas em 2min e 24h após a manipulação. Todos esses modelos foram analisados por simplificação passo a passo para avaliar a importância de cada variável e interação entre variáveis e estabelecer o modelo mínimo adequado. Todos os modelos foram feitos com a distribuição de erros Gaussiana e link identidade. Quando o efeito do dano foliar foi significativo, foram feitos modelos para cada nível de dano comparando com o controle.

O perfil de COVs foi analisado de forma descritiva para caracterizar os compostos presentes nas amostras. Para verificar se esse perfil foi afetado pelo dano foliar, foi feita uma análise de componentes principais (PCA em inglês) em que foi avaliado o padrão de 62

dissimilaridade entre os tratamentos com base em seus perfis de voláteis. Para lidar com a constant sum constraint (CSC), que é algo típico em dados de composição, os valores correspondentes à quantidade de cada composto na amostra foram transformados com a função clr (centered log-ratio) como sugerido por Aitchison (1986), e mais recentemente por Brückener & Heethoff (2016). Essa função padroniza os valores de proporção pelo seu total e os convertem para uma escala log de acordo com a fórmula:

푥1 (푥1) = ln 푁 ( √푥1 … 푥푁)

Onde x1 representa a proporção do composto 1 em relação ao total de COVs, e N indica o total de compostos detectados na amostra.

A significância estatística do padrão de agrupamento encontrada na PCA foi testada por meio de uma PERMANOVA (matriz de distância Bray Curtis, 10.000 permutações) e foi feito PERMIDISP para verificar o efeito da dispersão dos dados. Os loadings obtidos com a PCA para cada composto foram analisados por meio do biplot, e seu valor ao longo das PCs foi usado para avaliar quais compostos influenciaram a dissimilaridade entre tratamentos. A quantidade total de COVs emitidos por tratamento foi comparada através uma ANOVA. As análises foram feitas no ambiente estatístico R (R Core Team, 2016).

Resultados

Dano foliar e visitantes florais

Ao todo, foram amostrados 24 ramos reprodutivos com uma média ± erro padrão de 19.3 ± 1.5 folhas e 2.5 ± 0.3 capítulos receptivos. Desse total, 42% (10) receberam pelo menos uma visita (pouso) ao longo dos três intervalos de observação. Dois minutos após o dano, o número de visitante florais e de pousos nos capítulos foi afetado em relação ao controle, porém não houve efeito sobre o total de aproximações (Tabela 1). Ramos com 25% e 50% da área foliar removida receberam um menor número de visitantes e de pousos quando comparado a ramos sem dano. Em ramos com 75% da área foliar removida por folha, o número de visitantes e pousos foi intermediário entre o tratamento de 0% e aqueles com 25% ou 50% de dano foliar (Figura 1). Especificamente para o número de visitantes, a análise feita para cada nível de dano mostrou que o efeito negativo do dano foi significativo somente para tratamentos com 50% da área foliar removida (P = 0.022). Já para o número de pousos, o efeito foi significativo para 63

ambos tratamentos de 25% (P = 0.032) e 50 % (P = 0.025). Essas comparações foram feitas com o controle, 0% de dano.

Com relação as observações feitas 24h depois, somente o número de aproximações foi afetado pela área foliar removida, mas este efeito foi condicionado ao número de flores receptivas nos capítulos (Tabela 2). O número de aproximações aos capítulos é maior em ramos com 25% de dano, e se mantém semelhante ao controle nos tratamentos com 50% e 75% de dano (Figura 1). A comparação do nível de 25% com o controle não detectou significância estatística, já que a interação mascara o efeito principal do fator dano.

Tanto para os modelos construídos para observações feitas 2min, quanto 24h após o dano, o número de folhas no ramo influenciou o número de visitantes e pousos recebidos pelos capítulos (ver Tabelas 1 e 2). Para as observações feitas 24h depois, essa foi a única variável que afetou o número de visitantes e pousos. De forma geral, os ramos com mais folhas e, portanto, com mais folhas danificadas, receberam menos visitantes e pousos em seus capítulos (Apêndice 8).

Com relação aos táxons específicos de visitantes florais, foram registradas as ordens Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Lepidoptera foi o táxon mais frequente, embora não tenha sido registrado em ramos danificados observados 2min após o dano. O número de aproximações e pousos, e a razão entre eles (representando a proporção de aproximações que resultam em pouso), diminuiu para Lepidoptera em ramos observados 24h após o dano. Já para Hymenoptera, a maior parte dos indivíduos registrados foi de parasitoides. Esse táxon foi mais afetado pelo dano 24h depois, quando houve aumento no número de visitantes, aproximações e pousos. O mesmo foi constatado para Diptera, particularmente no número de aproximações.

Essa descrição por táxons representa o panorama observado para todos os níveis de área foliar removida. Entretanto, Lepidoptera esteve particularmente ausente em ramos com 25% de dano e, para Hymenoptera, não houve registro em ramos com 50% de dano. Diptera foi o único grupo com aproximações registradas em todos os tratamentos de dano, com destaque para os ramos em que o dano foi de 25% (Apêndice 9).

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Tabela 1. Modelos feitos para avaliar o efeito a curto prazo (2min depois) do dano foliar mecânico sobre o número visitantes florais e pousos nos capítulos de T. adenantha. Os resultados foram obtidos por teste F na comparação de modelos na simplificação. Atividade de visitantes florais 2min após o dano

Variável resposta Preditores no modelo mínimo F GL P Nº de visitantes* Nº de folhas no ramo 7.497 1 0.014 Dano foliar 4.257 3 0.019 Nº de pousos* Nº de folhas no ramo 10.985 1 0.004

Dano foliar 4.553 3 0.015

GL significa graus de liberdade; * indica ajuste com distribuição Gaussiana e ligação log.

Tabela 2. Modelos feitos para avaliar o efeito a longo prazo (24h depois) do dano foliar mecânico sobre o número visitantes florais, aproximações e pousos nos capítulos de T. adenantha. Os resultados foram obtidos por teste F na comparação de modelos na simplificação. Atividade de visitantes florais 24h após o dano

Variável resposta Preditores no modelo mínimo F GL P Nº de visitantes* Nº de folhas no ramo 4.979 1 0.036 Nº de aproximações* Dano foliar × Flores receptivas 5.730 3 0.008 Nº de pousos* Nº de folhas no ramo 8.351 1 0.009

GL significa graus de liberdade; * indica ajuste com distribuição Gaussiana e ligação log.

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A) B)

C)

Figura 1. Efeito do dano foliar mecânico sobre a visitação floral em ramos reprodutivos de T. adenantha na Serra do Japi. O eixo y em todos os gráficos representa a diferença entre observações de visitantes florais feitas após a manipulação (2min e 24h após) e a taxa basal (visitação observada antes da manipulação) para diferentes níveis de dano foliar no ramo (% área foliar removida). A) número de aproximações; B) número de pousos; e C) número de visitantes florais observados nos capítulos. Foram amostradas seis plantas por tratamento. As barras representam o erro padrão para as médias calculadas. 66

Perfil de compostos voláteis

Detectamos cinquenta compostos voláteis nos ramos reprodutivos de T. adenantha, majoritariamente terpenos (monoterpenos, sesquiterpenos e homoterpenos), além de um benzenóide (Salicilato de metila) e um composto alifático (Undecano) (Tabela 3). Deste total, cinco monoterpenos e 14 sesquiterpenos não foram identificados. Para ramos sem dano, em média ± erro padrão foram detectados 748.45 ± 271.37 ng de COVs após 12h de coleta. Os mais abundantes foram os sesquiterpenos Germacreno D e Cariofileno, e o monoterpeno α- Tujeno. Nos ramos amostrados havia em média 2.53 ± 0.32 capítulos receptivos, mas não foi identificado nenhum composto floral específico.

Tabela 3. Compostos orgânicos voláteis detectados nos ramos reprodutivos de T. adenantha sem dano, e com dano foliar mecânico feito 2min e 24h antes da coleta. O dano foi feito pela remoção de 50% da área foliar em cinco réplicas por tratamento (quatro para o controle, que teve uma réplica removia por erro na amostragem). Todos os ramos foram submetidos a 12h de coleta por aeração dinâmica. Os valores fora dos parênteses indicam a quantidade média ± erro padrão detectada por composto. Os valores entre parênteses representam o número de réplicas em que cada composto foi detectado. Para cada composto é apresentado o valor calculado do Índice de Kovats (KI em inglês). Composto KI Quantidade (ng) detectada em 12h de coleta

Sem dano 2min após o dano 24h após o dano Tricicleno 925.91 33.35 ± 7.19 (4) 36.63 ± 14.30 (5) 37.65 ± 11.10 (5) α-Tujeno 933.61 64.82 ± 14.07 (4) 55.14 ± 22.09 (5) 83.68 ± 26.92 (5) α-Pineno 938.15 56.18 ± 12.73 (4) 43.64 ± 14.91 (5) 84.85 ± 28.31 (5) monoterpeno ni 1* 945.08 17.87 ± 2.69 (4) 16.15 ± 5.01 (5) 24.94 ± 7.30 (5) monoterpeno ni 2* 948.70 - 1.78 ± 1.09 (2) - monoterpeno ni 3* 952.79 - 0.68 ± 0.68 (1) - Sabineno 976.41 3.42 ± 0.93 (4) 4.52 ± 1.91 (5) 5.33 ± 1.82 (5) β-Pineno 977.93 11.90 ± 2.52 (4) 10.21 ± 4.09 (5) 16.21 ± 5.60 (5) (L) β-Pineno 980.88 15.84 ± 4.76 (4) 11.94 ± 5.50 (4) 23.60 ± 8.83 (4) β-Mirceno 991.99 4.33 ± 2.40 (4) 3.37 ± 2.83 (3) 11.58 ± 4.86 (5) α-Felandreno 1002.78 23.08 ± 22.42 (2) 0.94 ± 0.94 (1) 2.13 ± 1.55 (2) Limoneno 1033.03 4.87 ± 1.63 (4) 4.72 ± 2.04 (5) 6.95 ± 1.88 (5) Trans-β-Ocimeno 1041.70 0.57 ± 0.57 (1) 0.71 ± 0.71 (1) 3.34 ± 1.37 (4) Cis-β-Ocimeno 1053.41 0.10 ± 0.10 (1) 4.66 ± 4.66 (1) 18.74 ± 6.48 (4) monoterpeno ni 4 1058.04 7.40 ± 4.51 (4) 0.50 ± 0.27 (3) - γ-Terpineno 1064.14 5.10 ± 1.82 (3) 4.93 ± 3.67 (3) 12.22 ± 4.27 (4) Undecano 1099.18 0.37 ± 0.37 (1) 2.52 ± 1.87 (3) 6.02 ± 2.04 (5) DMNT** 1114.34 0.51 ± 0.29 (2) 1.03 ± 0.75 (2) 2.82 ± 1.26 (4) monoterpeno ni 5* 1127.12 - 4.39 ± 1.33 (4) 7.56 ± 3.00 (4) Salicilato de metila 1251.96 2.41 ± 1.28 (3) 5.36 ± 1.51 (4) 13.63 ± 1.19 (5) 67

sesquiterpeno ni 1* 1297.31 0.13 ± 0.13 (1) 0.18 ± 0.18 (1) 0.30 ± 0.30 (1) sesquiterpeno ni 2* 1297.67 - 0.05 ± 0.05 (1) 0.52 ± 0.32 (2) sesquiterpeno ni 3* 1306.82 0.30 ± 0.30 (1) 0.12 ± 0.12 (1) 1.12 ± 0.88 (2) γ-Elemeno 1318.39 10.91 ± 3.92 (4) 6.12 ± 3.14 (4) 15.64 ± 7.91 (5) δ-Elemeno 1330.11 2.32 ± 1.36 (2) 2.76 ± 1.33 (4) 6.76 ± 2.11 (5) α-Cubebeno 1356.68 0.43 ± 0.40 (2) - 0.47 ± 0.20 (3) Copaeno 1365.70 18.85 ± 8.92 (4) 14.10 ± 8.58 (5) 26.15 ± 0.91 (5) β-Elemeno 1380.74 31.84 ± 18.28 (3) 20.64 ± 8.64 (5) 35.66 ± 6.51 (5) sesquiterpeno ni 4* 1396.65 3.64 ± 3.51 (2) - - Cariofileno 1416.05 63.63 ± 39.60 (4) 32.86 ± 11.23 (5) 72.78 ± 24.47 (5) α-Bergamoteno 1426.58 40.26 ± 33.22 (2) 21.10 ± 7.59 (5) 35.57 ± 8.94 (5) sesquiterpeno ni 5* 1433.12 3.45 ± 2.02 (2) - - Aromadendreno 1442.48 4.45 ± 3.12 (2) 2.69 ± 0.99 (4) 3.50 ± 1.07 (4) Humuleno 1454.88 13.30 ± 8.64 (4) 7.03 ± 2.38 (5) 13.71 ± 2.64 (5) Aloaromadendreno 1463.73 5.93 ± 4.43 (2) 4.79 ± 2.14 (4) 5.21 ± 1.77 (4) sesquiterpeno ni 6* 1467.18 0.12 ± 0.12 (1) - - γ-Muuroleno 1478.49 5.94 ± 3.49 (2) 5.94 ± 1.45 (5) 7.13 ± 0.91 (5) Germacreno D 1483.80 150.81 ± 74.22 (4) 65.24 ± 19.89 (5) 120.00 ± 23.03 (5) Biciclogermacreno 1499.00 49.20 ± 19.37 (4) 37.78 ± 16.32 (5) 65.13 ± 19.54 (5) sesquiterpeno ni 7* 1519.83 3.84 ± 3.84 (1) 0.78 ± 0.78 (1) 1.03 ± 1.03 (1) δ-Cadineno 1525.97 25.76 ± 12.28 (4) 26.24 ± 15.27 (5) 34.43 ± 7.08 (5) sesquiterpeno ni 8* 1548.18 - - 1.32 ± 1.11 (2) Nerolidol 1558.84 1.38 ± 1.38 (1) - 1.09 ± 1.09 (1) sesquiterpeno ni 9* 1569.15 2.12 ± 2.12 (1) - 7.41 ± 2.56 (5) TMTT*** 1577.33 20.89 ± 16.90 (3) 5.44 ± 1.99 (5) 13.82 ± 5.08 (4) sesquiterpeno ni 10* 1593.43 1.65 ± 1.65 (1) 7.76 ± 5.63 (2) 2.05 ± 1.55 (2) sesquiterpeno ni 11* 1602.35 25.69 ± 15.64 (3) 7.23 ± 3.89 (3) 7.73 ± 3.74 (3) sesquiterpeno ni 12* 1613.90 3.64 ± 3.05 (2) - - sesquiterpeno ni 13* 1625.08 - - 11.69 ± 11.69 (1) sesquiterpeno ni 14* 1640.20 5.86 ± 3.49 (2) - 2.52 ± 1.54 (2) Total 748.45 ± 271.37 482.72 ± 174.13 854.00 ± 170.17

*ni não identificado; **4,8-Dimetil-1,3,7-nonatrieno (DMNT); ***(E,E)-4,8,12-Trimetiltrideca-1,3,7,11-tetraeno (TMTT); o sinal - indica que o composto não foi detectado.

A remoção de 50% da área foliar não teve efeito sobre a quantidade total de COVs emitidos nos ramos após o dano (F = 2.81; GL = 2; P = 0.12), mas houveram mudanças no perfil quantitativo e qualitativo de alguns compostos. Parte disso é visto na análise de PCA, que mostrou uma tendência de agrupamento dos tratamentos no eixo vertical (PC2), que separa ramos sem dano foliar e aqueles danificados 24h antes da coleta dos compostos (Figura 2). Os 68

dois eixos da PCA explicam 45% da dissimilaridade no perfil de compostos entre tratamentos. A PERMANOVA indicou diferença estatística significativa entre os grupos obtidos com a PCA (F = 1.81; R² = 0.25; P = 0.03), e o PERMIDISP mostrou que este resultado não foi devido a dispersão dos dados (F = 2.65; P = 0.11).

Onze compostos tiveram loadings altos no PC2, indicando um efeito na separação dos tratamentos (Tabela 4, alguns representados na Figura 2). Particularmente, para os compostos Humuleno e TMTT há uma diminuição na emissão 2min após o dano e um aumento 24h depois. Entretanto, esse aumento não deixou a quantidade emitida desses compostos acima daquela detectada para ramos sem dano. Para o Cis-β-Ocimeno, e de forma menos evidente para o Sabineno, houve um aumento na quantidade emitida e de réplicas em que estes compostos foram detectados 24h após o dano. Particularmente, os monoterpenos β-Mirceno e γ-Terpineno são mais representativos em ramos com 24h de dano, o que é confirmado por sua alta de emissão nestes ramos (Tabelas 3). Humuleno e TMTT aparentemente não se relacionam a determinado grupo, mas sim a transição entre eles no gradiente de dissimilaridade (consultar também cromatogramas no Apêndice 10). Os loadings para todos os compostos podem ser consultados no Apêndice 11.

Figura 2. Biplot da análise de componentes principais (PCA) que mostra o padrão de dissimilaridade no perfil de voláteis entre ramos reprodutivos de T. adenantha sem dano, e com dano foliar feito a 2min e 24h antes da coleta. Para os ramos sem dano, uma réplica com erro foi retirada da análise. As setas indicam os compostos mais influentes nesse padrão e a sua direção sugere a qual grupo eles estão mais relacionados 69

Tabela 4. Relação de compostos voláteis detectados nos ramos reprodutivos de T. adenantha importantes para o padrão de dissimilaridade encontrado na análise de PCA. Essa importância relativa foi determinada pela seleção dos compostos com maiores loadings, positivos e negativos, dos dois eixos mais explicativos da PCA, PC1 e PC2. O aumento (+) ou diminuição (-) na emissão dos compostos é informado para ramos em que o dano foliar mecânico foi feito a 2min ou 24h antes da coleta dos compostos. Foram consideradas mudanças na quantidade média emitida e no número de réplicas que emitiu cada composto.

loadings da PCA Emissão comparada ao controle

Composto PC1 PC2 2min após o dano 24h após o dano α-Felandreno 0.513 0.422 - - Tricicleno 0.458 0.111 + + Sabineno 0.447 -0.103 + + Cis-β-Ocimeno 0.413 -0.721 + + β-Mirceno 0.298 -0.925 - + Undecano 0.250 -0.392 + + sesquiterpeno ni 4* 0.184 0.523 - - sesquiterpeno ni 2** -0.148 0.422 + + Humuleno -0.416 -0.064 - + δ-Cadineno -0.525 -0.208 + + TMTT*** -0.910 -0.079 - +

* composto só foi detectado em ramos sem dano; ** composto só foi detectado e em ramos com dano; *** abreviação de (E,E)-4,8,12-Trimetiltrideca-1,3,7,11-tetraeno (TMTT).

A mudança qualitativa no perfil de COVs aconteceu considerando que 6 compostos não identificados só foram detectados em ramos com dano, dois deles são monoterpenos encontrados somente em ramos danificados 2min antes da coleta. Entretanto, para esses ramos danificados a 2min antes da coleta, alguns compostos não foram detectados, como o Nerolidol e o α-Cubebeno. Já para ramos sem dano foliar, dois sesquiterpenos também não identificados foram exclusivos.

Discussão

No experimento feito em campo, obtivemos praticamente a mesma taxa de visita (41% de 24 ramos amostrados) registrada no estudo anterior que observou visitas aos ramos reprodutivos de T. adenantha na Serra do Japi (ver Capítulo 1). Esses dados se referem às observações feitas em um único ramo reprodutivo por planta e, portanto, a taxa de visita para a planta como um todo deve ser mais expressiva. Com relação à comunidade de visitantes florais, foram registradas as ordens Lepidoptera, Hymenoptera, e Diptera, em ordem de abundância. O 70

mesmo foi encontrado por todos os trabalhos que analisaram a comunidade de visitantes florais associados a T. adenantha na Serra do Japi (Romero & Vasconcellos-Neto, 2005; Salomão, 2006; Grisolia, 2014). Não foi feita a identificação de espécimes a nível taxonômico mais baixo.

Como foi mostrado por L.H.G. Rezende, Romero, G. Q. & M. Pareja no Capítulo 1, os visitantes florais respondem diferencialmente ao dano por herbívoros nas folhas de T. adenantha, particularmente Hymenoptera e Diptera. Neste estudo, em contrapartida, vimos que Lepidoptera não ocorre em nenhum dos ramos observados 2min após o dano, e em nenhum ramo em que o dano foi de 25%. Hymenoptera e Diptera, por sua vez, foram táxons que mais contribuíram para o aumento de aproximações aos capítulos observados 24h após o dano, particularmente himenópteros parasitóides. Isso pode significar rejeição por esses visitantes florais, cujas aproximações não se concretizaram em pousos. De forma geral, esses resultados indicam que Lepidoptera responde mais rapidamente às mudanças instantâneas causadas no ramo após o dano, e que para Hymenoptera e Diptera o efeito é tardio. Hipotetizamos que tais efeitos estejam relacionados com alterações que o dano foliar causa no perfil local de COVs sobre os capítulos no ramo, já que os voláteis representam um atributo dinâmico da planta que pode mudar rapidamente em resposta ao dano (Loughrin et al., 1994; Baldwin, 2010).

Há uma queda no número de visitantes e pousos nos capítulos imediatamente após o dano. Esse efeito é significativo para ramos em que a porcentagem de dano foi pequena e moderada (25% e 50%) em comparação a ramos sem dano. Esses resultados podem ser melhor relacionados com os resultados obtidos das amostras de COVs, que foram feitas considerando justamente 50% de dano. Para os COVs, também há queda na emissão de alguns compostos imediatamente após o dano. Isso não aconteceu para todos os ramos ou compostos. Para alguns deles, porém, essa diminuição é mais facilmente percebida, como para os terpenos Humuleno, α-Felandreno, Germacreno D, e TMTT. Para α-Cubebeno e Nerolidol, o mesmo pode ter acontecido, considerando que a emissão logo após o dano (2min após) foi tão baixa que não foi detectada. Essa queda pode ser explicada por duas razões: (1) após o dano há menor quantidade de área foliar (50% a menos) disponível para emitir COVs, sejam eles emitidos pelos tricomas ou não; e (2) uma das primeiras respostas dessa planta ao dano pode ser a de cessar a comunicação com o meio externo, tornando-se momentaneamente hermética para evitar perdas pela exposição das partes danificadas. Esse mecanismo acontece pelo rápido fechamento de estômatos e de canais nas membranas celulares, que são vias importantes para emissão de voláteis que não estão sequestrados nos tricomas (Baldwin, 2010; Blande & Glinwood, 2016). 71

A queda no número de visitas aos capítulos pode estar relacionada ao baixo nível de emissão de COVs logo depois do dano, uma vez que é menos provável que os visitantes florais tenham deixado de visitar os capítulos por efeito visual do dano foliar (Bronstein et al., 2007). Tal efeito atribuído aos COVs é possível se os voláteis liberados no ramo forem naturalmente atrativos para visitantes florais, ou se pelo menos alguns compostos com queda na emissão tiverem esta função. Alternativamente, compostos repelentes aos visitantes florais podem ter sido emitidos. Ambas hipóteses são possíveis. Apesar de nenhum dos compostos detectados nas amostras serem exclusivos das flores, é possível que partes vegetativas emitam os mesmos compostos geralmente encontrados em flores e, portanto, funcionem como fontes alternativas de COVs para atrair visitantes (Caissard et al., 2004). Atributos visuais dos capítulos, como seu tamanho e cor das flores, podem estar funcionando em sinergismo com os COVs produzidos e liberados pelos tricomas sobre as folhas, caule e brácteas para atrair visitantes florais. Se esse for o caso, esperamos que o perfil de COVs naturalmente produzidos nos ramos reprodutivos seja qualitativa e/ou quantitativamente diferente do perfil emitido nos ramos vegetativos, além de ter sua emissão sincronizada com a antese das flores (ou maior proporção de capítulos em antese no ramo). A emissão diferencial de COVs em ramos vegetativos e reprodutivos é algo raramente explorado na literatura, mas o controle ontogenético da produção de voláteis que diferencia estes ramos é algo já sugerido por Diezel et al. (2011), Kessler et al. (2011), e Schuman et al. (2016).

De acordo com Willmer (2011), voláteis vegetativos que funcionam para a atração de visitantes florais é algo relativamente comum em plantas. Isso pode resultar, inclusive, em uma relação mais específica, em que somente as folhas produzam COVs atrativos aos visitantes florais (ver Dufay et al., 2003). Flores generalistas, como parece ser o caso para T. adenantha, geralmente emitem COVs com composição varável, incluindo três classes de compostos: terpenos, benzenóides e compostos alifáticos (Dobson, 2006). Todos estão representados nos COVs coletados de T. adenantha. Esses compostos podem de fato estar armazenados nos tricomas glandulares que cobrem todo o ramo e funcionar para manter a conspicuidade química da planta para organismos com os quais ela interage, incluindo os visitantes florais.

Com relação a hipótese de que COVs repelentes aos visitantes florais são emitidos após o dano, isto também pode ter acontecido, uma vez que, para muitas plantas, os COVs liberados após o dano são de fato repelentes e funcionam como um mecanismo de defesa direta e indireta contra herbívoros (Dudareva et al., 2006; Dicke & Baldwin, 2010). Os compostos com incremento na emissão após o dano foram o trans-β-Ocimeno, Salicilato de metila e DMNT. 72

Esses compostos são conhecidos por serem induzidos após o dano por herbívoros e geralmente estão relacionados com mecanismos de defesa das plantas, tais como, repelência, deterrência e atração de parasitóides (Loughrin et al.,1994; Schaub et al., 2010; Copolovivi et al., 2011). Não se sabe se, para T. adenantha, tais compostos podem funcionar como defesa. Para os visitantes florais, a presença desses compostos no headspace floral poderia comunicar repelência, ou significar algo novo e incomum que tende a ser evitado (i. e. neobofia) (Kessler et al., 2011). Adicionalmente, quando esses compostos são emitidos em maior quantidade, podem sobrepor e mascarar compostos que de fato são atrativos para os visitantes florais (Kessler & Halitschke, 2009).

A ideia de que alterações no perfil de voláteis funcionam como um mecanismo pelo qual o dano afeta a interação da planta com seus visitantes florais é ainda mais fortalecida pelo fato da quantidade de folhas danificadas no ramo afetar negativamente o número de visitantes e pousos que os capítulos recebem. Mais folhas no ramo significa mais fontes de COVs vegetativos, estejam estas folhas diminuindo a emissão de compostos atrativos ou emitindo compostos repelentes para os visitantes florais após o dano.

Por fim, é necessário salientar algumas limitações ao comparar os resultados de ambos experimentos realizados. Primeiro, as plantas amostradas chegaram a fase reprodutiva em contextos diferentes (i. e. em ambiente natural e casa de vegetação). Isso certamente tem efeitos sobre a expressão de atributos florais e produção dos COVs, além de influenciar como a planta responderá ao dano. Segundo, devemos sempre considerar o contexto em que os COVs foram avaliados em relação a como eles são percebidos pelos visitantes florais em ambiente natural. Em campo, os COVs emitidos com ou sem o efeito do dano estão em meio a outros COVs, vindos de ramos da própria planta ou de outras plantas que, por sua vez, podem estar danificadas ou não. O terceiro e último ponto se refere à amostragem, já que foi conduzida a coleta de COVs somente em ramos com 50% da área foliar removida. A resposta diferencial dos visitantes florais, em contrapartida, foi evidenciada também para plantas com 25% e 75% de dano. A coleta e caracterização do perfil de COVs nestas condições é necessária para melhor avaliar as hipóteses propostas neste trabalho.

Conclusões

A interação das plantas com visitantes florais é mediada por vários atributos florais e da planta como um todo que estão sujeitos a efeitos diretos e indiretos da herbivoria. Neste trabalho sugerimos que efeitos indiretos podem acontecer por mudanças que o dano foliar causa no perfil 73

de compostos voláteis presentes nos ramos reprodutivos do arbusto T. adenantha. O dano mecânico nas folhas desta planta tende a influenciar a dinâmica de emissão de alguns compostos logo após o dano e 24h depois. Para o mesmo tipo de dano mecânico, mudanças foram vistas na atividade de visitantes florais em campo, de modo que há um efeito negativo sobre o número de visitantes e pousos, principalmente minutos após o dano. Hipotetizamos que a influência negativa do dano nos visitantes florais está relacionada ao seu efeito sobre a emissão de voláteis no headspace floral, particularmente se compostos com mudanças na emissão forem atrativos ou repelentes para os visitantes florais. Isso é possível de acontecer para T. adenantha, já que esta planta aparentemente não possui compostos florais específicos e a sua conspicuidade química é garantida pelos tricomas glandulares presentes em todas as folhas e também sobre seus capítulos. Novos estudos devem ser feitos para avaliar como certos compostos liberados nos ramos de T. adenantha, cuja emissão é afetada pelo dano nas folhas, são percebidos e influenciam o comportamento dos visitantes florais.

74

CONCLUSÃO GERAL

A questão ecológica investigada neste trabalho foi se o dano causado por herbívoros nas folhas pode afetar a interação da planta com os seus visitantes florais. Para responder essa questão é preciso recorrer aos conhecimentos produzidos em, no mínimo, duas áreas que por muito tempo foram estudadas isoladamente: a ecologia e evolução da polinização e das defesas em plantas. Neste trabalho, esses conhecimentos foram considerados sob a perspectiva dos efeitos ecológicos indiretos, tendo como pressuposto o potencial para que herbívoros e visitantes florais interajam quando utilizam a mesma planta como fonte de recursos. A literatura produzida sobre o tema é relativamente recente, mas já evidencia que o dano nas folhas afeta diversos atributos florais que são importantes para que a planta atraia e mantenha a interação com visitantes florais e potenciais polinizadores. Para a maioria dos casos o efeito é negativo, pois o dano compromete o display e os recursos dessas flores. As lacunas no conhecimento envolvem os mecanismos mais finos pelos quais esses efeitos acontecem, além de como os visitantes florais respondem a eles, uma vez que esta resposta varia conforme seus requerimentos de recurso e sensibilidade aos atributos florais que forem modificados pelo dano. Plantas que interagem com diversos táxons de visitantes florais oferecem a oportunidade de diminuir essas lacunas.

Investigamos a questão proposta para a espécie de arbusto tropical Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae). Este é espécie que habita margens de florestas na região sudeste do Brasil e interage com várias guildas de herbívoros e grupos taxonômicos de visitantes florais. Foram usadas ambas abordagens observacional e experimental com elementos de história natural para contextualizar as interações ecológicas que essa planta desenvolve na Serra do Japi. Apesar de T. adenantha florescer o ano todo, há um pico de floração na estação chuvosa (fevereiro a maio), período em que desenvolve interações simultâneas com outros organismos que também estão em pico de atividade, tais como: visitantes florais, herbívoros de folha e de capítulo, e predadores e parasitóides dos seus herbívoros. Isso por si só gera o contexto favorável para que efeitos ecológicos indiretos atuem sobre a dinâmica dessas interações, particularmente entre herbívoros e visitantes forais. Já se sabe que florivoria reduz o número de sementes produzidas por essa planta e compromete o display visual dos capítulos. Nenhuma informação estava disponível sobre o efeito da herbivoria foliar sobre a atratividade dos capítulos nesse sistema. 75

O dano nas folhas causado por herbívoros de fato afeta a interação de T. adenantha com seus visitantes florais. Isso foi observado com uma quantificação simples do dano em ambiente natural, o que sugere que o efeito é expressivo na planta. Esse efeito varia com o grupo taxonômico de visitante floral e leva a consequências ecológicas variadas. Hymenoptera, que foi o táxon mais afetado, pode ser o grupo em que os indivíduos são os polinizadores efetivos de T. adenantha, o que levaria a um custo indireto da herbivoria para a polinização. Entretanto, se esse táxon for menos efetivo em polinizá-la, ou mesmo trazer custos ao consumir recursos e ocupar os capítulos deixando-os indisponíveis para visitantes mais efetivos, os custos do dano podem ser, em parte, compensados. Em última análise, efeitos indiretos do dano nas folhas podem promover um turnover na comunidade de visitantes florais que variam em sua efetividade de polinização e, assim, relativizar os custos ecológicos para a reprodução da planta.

Identificamos 35 espécies e morfoespécies de visitantes florais para T. adenantha. Grande parte pertence a uma única tribo de borboletas (Ithomiini) conhecida por espécies que desenvolvem uma relação especializada com as flores que interagem. Elas consomem néctar tóxico, sequestram os compostos, e os utilizam na síntese de feromônios. Néctar tóxico já foi encontrado para T. adenantha e, justamente para essas borboletas, não foi detectado efeito do dano foliar para a interação com os capítulos. Novas hipóteses podem ser elaboradas sobre a relação do dano foliar e a presença de compostos tóxicos no néctar, que pode ter colaborado para a evolução dessa interação. Nossos dados, e os demais dados publicados sobre a comunidade de visitantes florais dessa planta, dão suporte a ideia de que indivíduos de Lepidoptera desempenham papel importe na polinização T. adenantha, pois mostram que a interação com este grupo é frequente ao longo do dia, e que indivíduos passam mais tempo manipulando os capítulos. Se esse for o caso, os efeitos negativos do dano teriam pouco ou nenhum impacto sobre a polinização dessa planta, já que as visitas por Lepidoptera não são afetadas pelo dano.

Capítulos de plantas mais danificadas recebem menos visitantes e pousos, mas isto é atenuado para plantas maiores, com mais ramos reprodutivos e mais capítulos receptivos nestes ramos. Isso provavelmente está relacionado à importância que o display floral tem para a atração de visitantes florais nesse sistema. Ter mais capítulos receptivos possibilita que sinais atrativos (visuais, voláteis etc.) sejam amplificados e atraiam mais visitantes, mesmo que tais capítulos estejam com qualidade e quantidade de recursos comprometidas pelo dano foliar. Isso é plausível se não houver uma associação honesta entre o sinal emitido e a presença/qualidade de recursos, ou se tal associação só for percebida a curta distância pelo visitante floral. Essa 76

percepção pode acontecer com o tamanho dos capítulos, já que os pousos são muito influenciados por um trade-off que detectamos entre o diâmetro desses capítulos e sua atratividade. Aqueles capítulos maiores, com mais flores receptivas que demandam manutenção da atratividade, tendem a ser mais custosos para a planta quando a demanda de recursos também existe para defesa. Tais capítulos recebem menos pousos em plantas com muito dano. Estudos específicos precisam ser feitos sobre como os recursos florais são influenciados nesse contexto, e como a sua dinâmica está relacionada a quantidade de flores disponíveis por capítulo. Curiosamente, o dano perece não influenciar a manipulação dos capítulos, já que não encontramos efeito sobre o tempo de visita para nenhum dos táxons avaliados.

Exploramos com mais detalhe um dos mecanismos pelos quais o dano pode afetar a interação entre T. adenantha e seus visitantes florais: a alteração do perfil de compostos voláteis liberados no ramo reprodutivo. Essa é uma hipótese interessante, pois considera a influência de voláteis vegetativos liberados após o dano sobre o contexto químico em que os capítulos são apresentados, algo que é raro na literatura sobre o tema. Constatamos que o dano foliar de fato modifica a emissão de alguns compostos e o perfil qualitativo dos voláteis, e isso varia de acordo com o momento em que o dano foi feito. Minutos após o dano, há uma diminuição na emissão de alguns compostos e, em campo, observamos uma queda no número de visitantes e pousos também nesse momento. Após 24 horas, há um aumento na emissão desses compostos e de outros que foram produzidos após o dano. Em campo, o efeito 24h depois acontece sobre o número de aproximações aos capítulos por himenópteros parasitóides. Há um aumento dessas aproximações.

Compostos que tiveram queda na emissão podem ser atrativos aos visitantes florais, ou compostos repelentes podem ter sido emitidos após o dano. Não detectamos compostos florais específicos, de modo que os capítulos emitem um perfil de compostos muito similar aquele emitido pelas partes vegetativas do ramo. Nesse sentido, sugerimos que voláteis vegetativos são importantes para a interação de T. adenantha com visitantes florais. Esses compostos voláteis provavelmente são emitidos pelos tricomas glandulares que cobrem a superfície das suas folhas, brácteas, e as corolas das flores. Esses tricomas devem compartilhar uma base bioquímica que permita produzir um perfil de compostos similar em órgãos diferentes da planta. Nesse sentido, novas questões emergem sobre a sua presença e função nas flores. Se voláteis liberados pelos tricomas forem funcionais para atrair visitantes florais e, consequentemente, polinização da planta, esperamos que haja uma sincronia entre sua emissão e a fenologia dos 77

capítulos, ou mesmo que o padrão de emissão nos ramos reprodutivos seja diferente daquele encontrado em ramos vegetativos.

Para concluir, tanto a amostragem da herbivoria em campo, quanto os experimentos conduzidos com dano mecânico mostram que a herbivoria nas folhas de fato pode afetar a interação de T. adenantha com seus visitantes florais. Esse efeito é complexo, pois está condicionado a outros atributos da planta e varia entre os táxons de visitantes florais. Os compostos voláteis emitidos nos ramos são importantes para essa interação e são afetados pelo dano, causando mudanças na atratividade dos capítulos. A maior contribuição desses resultados é o fato de estabelecerem um panorama para novas hipóteses serem elaboradas e generalizadas para outros sistemas. Estudos assim colaboram não só para entender a ecologia de determinada espécie, mas são importantes para fundamentar ideias que integrem áreas do conhecimento ecológico e avancem no estudo das interações.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abrams, P. A., Menge, B. A., Mittelbach, G. G., Spiller, D. A., Yodzis, P. 1996. The role of indirect effects in food webs. In Polis, G.A., and Winemiller, K.O. eds. Food webs: integration of patterns and dynamics. Springer US, 371–395.

Adler, L. S., Bronstein, J. L. 2004. Attracting antagonists: does floral nectar increase leaf herbivory? Ecology 85, 1519–1526.

Adler, L. S., Irwin, R. E. 2005. Ecological costs and benefits of defenses in nectar. Ecology 86, 2968–2978.

Adler, L. S. 2008. Selection by pollinators and herbivores on attraction and defense. In Tilmon, K. ed. Specialization, speciation, and radiation: The Evolutionary Biology of Herbivores Insects. University of California Press, 162–173.

Adler, L. S., Wink, M., Distl, M., Lentz, A. J. 2006. Leaf herbivory and nutrients increase nectar alkaloids. Ecology Letters 9, 960–967.

Agrawal, A. A., R. Karban. 1999. Why induced defenses may be favored over constitutive strategies in plants. In R. Tollrian, C. D. Harvell. eds. The Ecology and Evolution of Inducible Defenses. Princeton University Press, Princeton, 5–61.

Agren, J., Hellstrom, F., Torang, P., Ehrlen, J. 2013. Mutualists and antagonists drive among- population variation in selection and evolution of floral display in a perennial herb. Proceedings of the National Academy of Sciences 110, 18202–18207.

Aitchison, J. 1986. The statistical analysis of compositional data. Chapman & Hall, London. 516 pp.

Aizen, M. A., Raffaele, E. 1996. Nectar production and pollination in Alstroemeria aurea: responses to level and pattern of flowering shoot defoliation. Oikos 76, 312–322.

Almeida, A. M., Fonseca, C. R., Prado, P. I., Almeida-Neto, M., Diniz, S., Kubota, U., Braun, M. R., Raimundo, R. L., Anjos, L. A., Mendonça, T. G. others. 2006. Assemblages of endophagous insects on Asteraceae in São Paulo Cerrados. Neotropical Entomology 35, 458– 468. 79

Almeida, A. M. 1997. Padrões de co-ocorrência em insetos endófagos associados a capítulos de Trichogoniopsis adenantha (DC) (Asteracea). 124 f. Tese (Mestrado em Ciências Biológicas, área de Ecologia). Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas.

Antiqueira, P. A. P., Romero, G. Q. 2016. Floral asymmetry and predation risk modify pollinator behavior, but only predation risk decreases plant fitness. Oecologia 181, 475–485.

Avila‐Sakar, G., Stephenson, A. G. 2006. Effects of the spatial pattern of leaf damage on growth and reproduction: whole plants. International Journal of Plant Sciences 167, 1021–1028.

Armbruster, W. S., Howard, J. J., Clausen, T. P., Debevec, E. M., Loquvam, J. C., Matsuki, M., Cerendolo, B., Andel, F. 1997. Do biochemical expectation link evolution of plant defense and pollination systems? Historical hypotheses and experimental tests with Dalechampia vines. The American Naturalist 149, 461–484.

Baldwin, I. T. 2010. Plant volatiles. Current Biology 20, 392–397.

Beck, J. J., Higbee, B. S., Merrill, G. B., Roitman, J. N. 2008. Comparison of volatile emissions from undamaged and mechanically damaged almonds. Journal of the Science of Food and Agriculture 88, 1363–1368.

Begon M., Harpper, J. L., Townsend, C. R. 2007. Ecologia: de indivíduos a ecossistemas. Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Artmed 4 ed, 752 pp.

Beker, R., Dafni, A., Eisikowitch, D., Ravid, U. 1989. Volatiles of two chemotypes of Majorana syriaca L.(Labiatae) as olfactory cues for the honeybee. Oecologia 79, 446–451.

Bertness, M. D., Wise, C., Ellison, A. M. 1987. Consumer pressure and seed set in a salt marsh perennial plant community. Oecologia 71, 190–200.

Blande, J. D., Glinwood, R. eds. 2016. Deciphering chemical language of plant communication: signaling and communication in plants. Springer International Publishing, Cham. 326 pp.

Blue, E., Kay, J., Younginger, B. S., Ballhorn, D. J. 2015. Differential effects of type and quantity of leaf damage on growth, reproduction and defence of lima bean (Phaseolus lunatus L.). Plant Biology 17, 712–719. 80

Boege, K., Marquis, R. J. 2005. Facing herbivory as you grow up: the ontogeny of resistance in plants. Trends in Ecology & Evolution 20, 441–448.

Bostock, R. M. 2005. Signal crosstalk and induced resistance: straddling the line between cost and benefit. Annual Review of Phytopathology 43, 545–580.

Bronstein, J. D., Huxman, T. E., Davidowitz, G. 2007. Plant-mediated effects linking herbivory and pollination. In Ohgushi, T., Craig, T. P., Price, P. W. eds. Ecological communities plant mediation in indirect interaction webs. Cambridge University Press, 75–103.

Brown Jr, K. S. 1984. Adult-obtained pyrrolizidine alkaloids defend Ithomiine butterflies against a spider predator. Nature 309, 707–709.

Brown Jr, K. S. 1985. Chemical ecology of dehydropyrrolizidine alkaloids in adult Ithomiine (Lepidoptera: Nymphalidae). Revista Brasileira de Biologia 44, 435–460.

Bruce, T. J. A., Pickett, J. A. 2011. Perception of plant volatile blends by herbivorous insects – finding the right mix. Phytochemistry 72, 1605–1611.

Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. 2005. Insect host location: a volatile situation. Trends in Plant Science 10, 269–274.

Brückner, A., Heethoff, M., 2016. A chemo-ecologists’ practical guide to compositional data analysis. Chemoecology 27, 33–46.

Byers, K. J., Schiestl, F. P. 2015. How to get the best deal. eLife 4., 1–3.

Caissard, J.-C., Meekijjironenroj, A., Baudino, S., Anstett, M.-C. 2004. Localization of production and emission of pollinator attractant on whole leaves of Chamaerops humilis (Arecaceae). American Journal of Botany 91, 1190–1199.

Cardel, Y. J., Koptur, S. 2010. Effects of florivory on the pollination of flowers: an experimental field study with a perennial plant. International Journal of Plant Sciences 171, 283–292.

Castro, S., Loureiro, J., Ferrero, V., Silveira, P., Navarro, L. 2013. So many visitors and so few pollinators: variation in insect frequency and effectiveness governs the reproductive success of an endemic milkwort. Plant Ecology 214, 1233–1245. 81

Conner, J. K., Rush, S. 1996. Effects of flower size and number on pollinator visitation to wild radish, Raphanus raphanistrum. Oecologia 105, 509–516.

Copolovici, L., Kännaste, A., Remmel, T., Vislap, V., Niinemets, Ü. 2011. Volatile emissions from Alnus glutionosa induced by herbivory are quantitatively related to the extent of damage. Journal of Chemical Ecology 37, 18–28.

Cozzolino, S., Fineschi, S., Litto, M., Scopece, G., Trunschke, J., Schiestl, F. P. 2015. Herbivory increases fruit set in Silene latifolia: a consequence of induced pollinator-attracting floral volatiles? Journal of Chemical Ecology 41, 622–630.

Crawley, M. J. Herbivory: the dynamics of animal-plant intercations. Oxford, UK. Blackwell Scientific Publications, 437 pp.

Denno, R. F., McClure, M. S., Ott, J. R. 1995. Interspecific interactions in phytophagous insects: competition reexamined and resurrected. Annual Review of Entomology 40, 297–331.

Denno, R. F., Kaplan, I. 2007. Plant-mediated interactions in herbivorous insects: mechanisms, symmetry, and challenging the paradigms of competition past. In Ohgushi, T., Craig, T. P., Price, P. W. eds. Ecological communities plant mediation in indirect interaction webs. Cambridge University Press, 19–50.

Detzel, A., Wink, M. 1993. Attraction, deterrence and intoxication of bees (Apis mellifera) by plant allelochemicals. Chemoecology 4, 8–18.

Dicke, M., Baldwin, I. T., 2010. The evolutionary context for herbivore-induced plant volatiles: beyond the “cry for help”. Trends in Plant Science 15, 167–175.

Diezel, C., Allmann, S., Baldwin, I. T. 2011. Mechanisms of optimal defense patterns in Nicotiana attenuata: flowering attenuates herbivory-elicited ethylene and jasmonate signaling. Journal of Integrative Plant Biology 53, 971–983.

Dobson, H. E. M. 2006. Relationship between floral fragrance composition and type of pollinator. In Dudareva, N., Pichersky, E. eds. Biology of floral scent. Taylor & Francis, 147– 198.

Dudareva, N., Negre, F., Nagegowda, D. A., Orlova, I. 2006. Plant volatiles: recent advances and future perspectives. Critical Reviews in Plant Sciences 25, 417–440. 82

Dufaÿ, M., Hossaert-McKey, M., Anstett, M. C. 2003. When leaves act like flowers: how dwarf palms attract their pollinators. Ecology letters 6, 28–34.

Dukas, R., Morse, D. H. 2003. Crab spiders affect flower visitation by bees. Oikos 101, 157– 163.

Effmert, U., Dinse, C., Piechulla, B. 2008. Influence of green leaf herbivory by Manduca sexta on floral volatile emission by Nicotiana suaveolens. Plant Physiology 146, 1996–2007.

Fineblum, W. L., Rausher, M. D. 1997. Do floral pigmentation genes also influence resistance to enemies? The W locus in Ipomoea purpurea. Ecology 78, 1646–1654.

Foster, K. R., Wenseleers, T. 2006. A general model for the evolution of mutualisms. Journal of Evolutionary Biology 19, 1283–1293.

Freeman, R. S., Brody, A. K., Neefus, C. D. 2003. Flowering phenology and compensation for herbivory in Ipomopsis aggregata. Oecologia 136, 394–401.

Galen, C., Sherry, R. A., Carroll, A. B. 1999. Are flowers physiological sinks or faucets? Costs and correlates of water use by flowers of Polemonium viscosum. Oecologia, 118, 461–470.

Gomes, G. C. 2014. Estudo das interações tritróficas no sistema Trichogoniopsis adenantha (DC) (Asteraceae), seus herbívoros endófagos e parasitoides associados. 102 f. Tese (Mestrado em Ecologia). Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP. Campinas, São Paulo.

Gotelli, N. J. 2009. Ecologia. Londrina, Paraná. Planta 4 ed. 288 pp.

Grisolia, B. B. 2014. Efeitos indiretos das aranhas Peucetia spp. (Oxyopidae) e Misumenops argenteus (Thomisidae) no sucesso reprodutivo de Trichogoniopsis adenantha (DC) (Asteraceae) e no comportamento das guildas associadas à planta. 97 f. Tese (Mestrado em Ciências Biológicas). Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP. Rio Claro, São Paulo.

Heil, M. 2011. Plant-mediated interactions between above- and below-ground communities at multiple trophic levels. Journal of Ecology 99, 3–6. 83

Herrera, C. M. 2000. Measuring the effects of pollinators and herbivores: evidence for non- additivity in a perennial herb. Ecology 81, 2170–2176.

Holt, R., Lawton, J. H. 1994. The ecological consequences of shared natural enemies. Annual Review of Ecology and Systematics 25, 495–520.

Irwin, R. E., Strauss, S. Y., Storz, S., Emerson, A., Guibert, G. 2003. The role of herbivores in the maintenance of a flower color polymorphism in wild radish. Ecology 84, 1733–1743.

Irwin, R. E., Adler, L. S., Brody, A. K. 2004. The dual role of floral traits: pollinator attraction and plant defense. Ecology 85, 1503–1511.

Johnson, M. T. J., Campbell, S. A., Barrett, S. C. H. 2015. Evolutionary interactions between plant reproduction and defense against herbivores. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 46, 191–213.

Junker, R. R., Blüthgen, N., Brehm, T., Binkenstein, J., Paulus, J., Martin Schaefer, H., Stang, M. 2013. Specialization on traits as basis for the niche-breadth of flower visitors and as structuring mechanism of ecological networks. Functional Ecology 27, 329–341.

Kagata, H., Ohgushi, T. 2006. Bottom-up trophic cascades and material transfer in terrestrial food webs. Ecological Research 21, 26–34.

Karban, R., Baldwin, I. T. 1997. Induced responses to herbivory. University of Chicago Press, Chicago. 330 pp.

Karban, R., Strauss, S. Y. 1993. Effects of herbivores on growth and reproduction of their perennial host, Erigeron Glaucus. Ecology 74, 39–46.

Kersch-Becker, M. F., Lewinsohn, T. M. 2012. Bottom-up multitrophic effects in resprouting plants. Ecology 93, 9–16.

Kessler, D., Gase, K., Baldwin, I. T. 2008. Field experiments with transformed plants reveal the sense of floral scents. Science 29, 1200–1202.

Kessler, A., Halitschke, R. 2009. Testing the potential for conflicting selection on floral chemical traits by pollinators and herbivores: predictions and case study. Functional Ecology 23, 901–912. 84

Kessler, D., Diezel, C., Baldwin, I. T. 2010. Changing pollinators as a means of escaping herbivores. Current Biology 20, 237–242.

Kessler, A., Halitschke, R., Poveda, K. 2011. Herbivory-mediated pollinator limitation: negative impacts of induced volatiles on plant-pollinator interactions. Ecology 92, 1769–1780.

Klinkhamer, P. G. L., de Jong, T. J., de Bruyn, G.-J. 1989. Plant size and pollinator visitation in Cynoglossum Officinale. Oikos 54, 201.

Krebs, C. J. 2009. Ecology. The experimental analysis of distribution and abundance. Collins, New York Benjamin Cummings 6 ed. 655 pp.

Krupnick, G. A., Weis, A. E., Campbell, D. R. 1999. The consequences of floral herbivory for pollinator service to Isomeris arborea. Ecology 80, 125–134.

Lehtilä, K., Strauss, S. Y. 1997. Leaf damage by herbivores affects attractiveness to pollinators in wild radish, Raphanus raphanistrum. Oecologia 111, 396–403.

Leitão Filho, H. F. 1992. A flora arbórea da Serra do Japi. In História natural da Serra do Japi: Ecologia e preservação de uma área florestal no sudeste do Brasil. Morellato, L. P. C. org. Editora da Unicamp, Campinas, 40–62.

Lemaitre, A. B., Pinto, C. F., Niemeyer, H. M. 2014. Generalized pollination system: Are floral traits adapted to different pollinators? Arthropod-Plant Interactions 8, 261–272.

Lennartsson, T., Nilsson, P., Tuomi, J. 1998. Induction of overcompensation in the field gentian, Gentianella campestris. Ecology 79, 1061–1072.

Levin, D. A., Anderson, W. W. 1970. Competition for pollinators between simultaneously flowering species. The American Naturalist 104, 455–467.

Linstrom, P. J., Mallard, W. G. 2011. NIST Chemistry WebBook – National Institute of Standards and Technology.

Lohman, D. J., Zangerl, A. R., Berenbaum, M. R. 1996. Impact of floral herbivory by parsnip webworm (Oecophoridae: Depressaria pastinacella Duponchel) on pollination and fitness of wild parsnip (Apiaceae: Pastinaca sativa L.). American Midland Naturalist 136, 407–412. 85

Loughrin, J. H., Manukian, A. R. A., Heath, R. R., Turlings, T. C., Tumlinson, J. H. 1994. Diurnal cycle of emission of induced volatile terpenoids by herbivore-injured cotton plant. Proceedings of the National Academy of Sciences 91, 11836–11840.

Lucas-Barbosa, D., van Loon, J. J. A., Dicke, M. 2011. The effects of herbivore-induced plant volatiles on interactions between plants and flower-visiting insects. Phytochemistry 72, 1647– 1654.

Lucas-Barbosa, D., Sun, P., Hakman, A., van Beek, T. A., van Loon, J. J. A., Dicke, M., 2015. Visual and odour cues: plant responses to pollination and herbivory affect the behaviour of flower visitors. Functional Ecology 30, 431–441.

Mani, M. S., Saravanan, J. M. 1999. Pollination ecology and evolution in Compositae (Asteraceae). Enfield, Science Publishers, 166 pp.

McCall, A. C., Irwin, R. E. 2006. Florivory: the intersection of pollination and herbivory. Ecology Letters 9, 1351–1365.

Millar, J. G., Haynes, K. F. 1998. Methods in chemical ecology. Vol 1 chemical methods. Massachusetts, United States of America. Chapman & Hall. 390 pp.

Mitchell, R. J. 1994. Effects of floral traits, pollinator visitation, and plant size on Ipomopsis aggregata fruit production. The American Naturalist 143, 870–889.

Mitchell, R. J., Flanagan, J. R., Brown, J. B., Waser, N. M., Karron, J. D. 2009. New frontiers in competition for pollination. Annals of Botany 103, 1403–1413.

Mithofer, A., Boland, W., 2008. Recognition of herbivory-associated molecular patterns. Plant Physiology 146, 825–831.

Monge, M. and Semir, J. 2012. A família Asteraceae na Serra do Japi. In Novos olhares, novos saberes sobre a Serra do Japi: Ecos de sua biodiversidade. Vasconcellos-Neto, J., Poli, P. R., Penteado-Dias, A. M. orgs. Editora CRV, 221–250.

Morales, C. L., Traveset, A., Harder, L. D. 2013. Sterile flowers increase pollinator attraction and promote female success in the mediterranean herb Leopoldia comosa. Annals of Botany 111, 103–111. 86

Morse, D. H., Fritz, R. S. 1982. Experimental and observational studies of patch choice at different scales by the crab spider Misumena Vatia. Ecology 63: 172–182.

Mothershead, K., Marquis, R. J. 2000. Fitness impacts of herbivory through indirect effects on plant-pollinator interactions in Oenothera macrocarpa. Ecology 81, 30–40.

Obeso, J. R. 2002. The costs of reproduction in plants. New Phytologist 155, 321–348.

Ohgushi, T., Craig, T. P., Price, P. W. 2007. Ecological communities: plant mediation in indirect interaction webs. Cambridge, UK; Cambridge University Press, 444 pp.

Ollerton, J., Killick, A., Lamborn, E., Watts, S., Whiston, M, 2007. Multiple meanings and modes: on the many ways to be a generalist flower. Taxon 56, 717–728.

Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. 2011. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos 120, 321–326.

Padyšáková, E., Bartoš, M., Tropek, R., Janeček, Š. 2013. Generalization versus specialization in pollination systems: visitors, thieves, and pollinators of Hypoestes aristata (Acanthaceae). PLoS ONE 8, e59299, 1–8.

Paige, K. N., Whitham, T. G. 1987. Overcompensation in the response to mammalian herbivory: the advantage of being eaten. The American Naturalist 129, 407–416.

Paige, K., Williams, B., Hickox, T. 2001. Overcompensation through the paternal component of fitness in Ipomopsis arizonica. Oecologia 128, 72–76.

Pansarin, E. R. 2003. Biologia reprodutiva e polinização em Epidendrum paniculatum Ruiz & Pavón (Orchidaceae). Revista Brasileira de Botânica 26, 203–211.

Parachnowitsch, A. L., Kessler, A. 2010. Pollinators exert natural selection on flower size and floral display in Penstemon digitalis. New Phytologist 188, 393–402.

Pareja, M., Qvarfordt, E., Webster, B., Mayon, P., Pickett, J., Birkett, M., Glinwood, R. 2012. Herbivory by a phloem-feeding insect inhibits floral volatile production. PLoS ONE 7, e31971, 1–11.

Pellmyr, O. 2003. Yuccas, yucca moths, and coevolution: a review. Annals of the Missouri Botanical Garden 35–55. 87

Pinto, H. S. 1992. Clima na Serra do Japi. In História natural da Serra do Japi: ecologia e preservação de uma área florestal no sudeste do Brasil. Morellato, L. P. C. org. Editora da Unicamp, Campinas, 30–38.

Pliske, T. E. 1975. Pollination of pyrrolizidine alkaloid-containing plants by male Lepidoptera. Environ Entomology 4 (3), 474-479.

Poveda, K., Steffan-Dewenter, I., Scheu, S., Tscharntke, T. 2003. Effects of below- and above- ground herbivores on plant growth, flower visitation and seed set. Oecologia 135, 601–605.

Price, P. W., Bouton, C. E., Gross, P., McPheron, B. A., Thompson, J. N., Weis, A. E. 1980. Interactions among three trophic levels: influence of plants on interactions between insect herbivores and natural enemies. Annual Review of Ecology and Systematics 11, 41–65.

Primack, R. B., Miao, S. L., Becker, K. R. 1994. Costs of reproduction in the pink Lady’s slipper orchid (Cypripedium acaule): defoliation, increased fruit production, and fire. American Journal of Botany 81 1083–1090.

Quesada, M., Bollman, K., Stephenson, A. G. 1995. Leaf damage decreases pollen production and hinders pollen performance in Cucurbita Texana. Ecology 76, 437–443.

Raguso, R. A. 2008. Wake up and smell the roses: The ecology and evolution of floral scent. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 39, 549–569.

Rech, A. D., Agostini, K., Oliveira, P. E., Machado, I. C. 2014. Biologia da Polinização. Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. Editora Projeto Cultural. 524 pp.

Richardson, S. C. 2004. Are nectar-robbers mutualists or antagonists? Oecologia 139, 246 – 254.

Romero, G. Q., Vasconcellos-Neto, J. 2004. Beneficial effects of flower-dwelling predators on their host plant. Ecology 85, 446–457.

Romero, G. Q., Vasconcelos Neto, J. 2005. Flowering phenology, seed set and arthropod guilds in Trichogoniopsis adenantha (DC) (Asteraceae) in south-east Brazil. Brazilian Journal of Botany 28, 171–178. 88

Romero, G. Q., Souza, J. C., Vasconcellos-Neto, J. 2008. Anti-herbivore protection by mutualistic spiders and the role of glandular trichomes. Ecology 89, 3105–3115.

Salomão, A. T., Martins, L. F., Ribeiro, R. da S., Romero, G. Q. 2006. Effects of patch size and floral herbivory on seed set in Trichogoniopsis adenantha (Asteraceae) in southeastern Brazil. Short Communications. Biotropica 38, 272–275.

Schaub, A., Blande, J. D., Graus, M., Oksanen, E., Holopainen, J. K., Hansel, A. 2010. Real- time monitoring of herbivore induced volatile emissions in the field. Physiologia Plantarum 138, 123–133.

Schiestl, F. P., Kirk, H., Bigler, L., Cozzolino, S., Desurmont, G. A. 2014. Herbivory and floral signaling: phenotypic plasticity and tradeoffs between reproduction and indirect defense. New Phytologist 203, 257–266.

Schiestl, F. P. 2015. Ecology and evolution of floral volatile-mediated information transfer in plants. New Phytologist 206, 571–57.

Schmitz, O. J., Krivan, V., Ovadia, O. 2004. Trophic cascades: the primacy of trait-mediated indirect interactions. Ecology Letters 7, 153–163.

Schmitz, O. J. 2009. Indirect effects in communities and ecosystems: the role of trophic and nontrophic interactions. In Levin. ed. The Pinceton Guide to Ecology. Princeton University Press, New Jersey, 298–295.

Schoonhoven L. M, van Loon J. J. A, Dicke, M. 2005. Insect-Plant Biology. Oxford. University Press. 421 pp.

Schuman, M. C., Allmann, S., Baldwin, I. T. 2016. Plant defense phenotypes determine the consequences of volatile emission for individuals and neighbors. Elife 4, e04490, 1–43.

Simms E. L, Bucher M. A. 1996. Pleiotropic effects of flower-color intensity on herbivore performance on Ipomoea purpurea. Evolution 50, 957.

Srinivasan, M. V. 2010. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annual Review of Entomology 55, 267–284. 89

Stanton, M. L. 2003. Interacting guilds: moving beyond the pairwise perspective on mutualisms. The American Naturalist 162, 10–23.

Strauss, S. Y. 1991. Indirect effects in community ecology: their definition, study and importance. Trends in Ecology and Evolution 6, 206–2010.

Strauss, S. Y., Conner, J. K., Rush, S. L. 1996. Foliar herbivory affects floral characters and plant attractiveness to pollinators: implications for male and female plant fitness. American Naturalist 147, 1098–1107.

Strauss, S. Y. 1997. Floral characters link herbivores, pollinators, and plant fitness. Ecology 78, 1640.

Temeles, E. J., Newman, J. T., Newman, J. H., Cho, S. Y., Mazzotta, A. R., Kress, W. J., 2016. Pollinator competition as a driver of floral divergence: an experimental test. PLOS ONE 11, e0146431.

Theis, N., Kesler, K., Adler, L. S. 2009. Leaf herbivory increases floral fragrance in male but not female Cucurbita pepo subsp. texana (Cucurbitaceae) flowers. American Journal of Botany 96, 897–903.

Trigo, J. R., Brown Jr. K. S., Henrique, S. A. Barata, L. E. S. 1996. Qualitative patterns of pyrrolizidine alkaloids in Ithomiinae butterflies. Biochemical Systematics and Ecology, Vol. 24, 181–188.

Trigo, J. R. 2008. Chemical ecology of Ithomiine butterflies. In Epifano, F. ed. Current Trends in Phytochemistry, 141–165.

Walters, D. R. 2011. Plant defense: warding off attack by pathogens, herbivores, and parasitic plants. UK: Wiley-Blackwell. 236 pp.

Werner, E. E., Peacor, S. D. 2003. A review of trait-mediated indirect interactions in ecological communities. Ecology 84, 1083–1100.

Willmer, P. 2011. Pollination and floral ecology. Princeton, New Jersey. Princeton University Press. 778 pp. 90

Wootton, J. T. 1994. The nature and consequences of indirect effects in ecological communities. Annual Review of Ecology and Systematics 25, 443–466.

Wright, G. A., Schiestl, F. P. 2009. The evolution of floral scent: the influence of olfactory learning by insect pollinators on the honest signalling of floral rewards. Functional Ecology 23, 841–851.

Zangerl, A. R., Berenbaum, M. R. 2009. Effects of florivory on floral volatile emissions and pollination success in the wild parsnip. Arthropod-Plant Interactions 3, 181–191.

91

APÊNDICES

Apêndice 1: matriz de correlação entre as variáveis dos modelos

Descrição: Resultados dos testes de correlação de Pearson entre as variáveis usadas nos modelos que testaram o efeito da herbivoria foliar no número de visitantes florais e pousos nos capítulos de T. adenantha na Serra do Japi. Os valores acima da divisão na matriz (-) representam o coeficiente de Pearson (r), e os abaixo indicam o valor de P para a significância estatística (P < 0.05).

Variáveis preditoras usadas nos modelos NRR ALT NCR DCP CCP FCP PDR PDP NRR - 0.424 0.024 0.070 0.032 0.018 -0.059 0.036 ALT 0.000* - -0.021 0.029 0.149 -0.056 -0.011 -0.023 NCR 0.826 0.843 - 0.092 0.184 0.118 -0.248 -0.217 DCP 0.517 0.787 0.394 - 0.190 0.217 -0.201 -0.311 CCP 0.768 0.162 0.084 0.074 - 0.242 -0.072 0.036 FCP 0.868 0.578 0.272 0.049* 0.023* - -0.042 0.097 PDR 0.578 0.916 0.019* 0.059 0.505 0.698 - 0.457 PDP 0.739 0.833 0.041* 0.003* 0.734 0.364 0.000* -

* indica correlação significativa entre as variáveis. Embora algumas delas sejam correlacionadas, o seu uso nos modelos foi possível por teste de validação. PDR e PDP não foram usadas como preditoras no mesmo modelo.

Legenda:

NRR – número de ramos reprodutivos na planta; ALT – altura do ramo focal; NCR – número de capítulos receptivos no ramo; DCP – diâmetro médio dos capítulos receptivos; CCP – comprimento médio dos capítulos receptivos; FCP – média de flores receptivas por capítulo; PDR – porcentagem de folhas danificadas no ramo; PDP – porcentagem de folhas danificadas na planta;

Outras correlações: Diâmetro e comprimento dos capítulos: r = 0.2, P = 0.07 Nº de flores e diâmetro dos capítulos: r = 0.5, P < 0.001 Nº de flores e comprimento dos capítulos: r = 0.4, P < 0.001 Nº de capítulos e diâmetro dos capítulos: r = 0.3, P < 0.01 Nº de capítulos e comprimento dos capítulos: r = 0.1, P < 0.27 92

Apêndice 2: atividade dos visitantes florais ao longo do dia

A)

B)

Descrição: Padrão de atividade ao longo do dia dos diferentes táxons de visitantes florais de T. adenantha. Tanto para A) o número de visitantes, quanto para B) o número de pousos, Lepidoptera aparece com o táxon mais ativo, principalmente nos intervalos de meio dia e fim da tarde. Este grupo só está ausente no intervalo de início da tarde, quando Hymenoptera é mais comum. Diptera é o táxon menos ativo, estando praticamente ausente nos intervalos de início e fim do dia. Os dados se referem a amostragem de um único ramo focal em 89 plantas na Serra do Japi. 93

Apêndice 3: lista de espécies/ morfoespécies de visitantes florais

Descrição: Espécies e morfoespécies de visitantes florais observados para T. adenantha na Serra do Japi. A amostragem foi feita no período chuvoso, entre novembro de 2015 e maio de 2016. Neste conjunto estão inclusos registros feitos por observação ativa de ramos focais da planta e também observações ocasionais. Ao todo foram registradas 35 espécies/morfoespécies distribuídas em seis famílias e três ordens.

Táxon Mês de observação Dez Jan Fev Mar Abr Mai DIPTERA SYRPHIDAE Allograpta sp.* X Dip. sp1 X Dip. sp2 X Dip. sp3 X HYMENOPTERA APIDAE Bombus brasiliensis Lepeletier, 1836* Osiris sp.* X Plebeia droryana Friese, 1900* X X Schwarziana quadripunctata Lepeletier, 1836* X Trigona sp. X X X BRACONIDAE Opius sp. X HALICTIDAE Pseudaugochlora sp.* X Halictidae sp1 X Halictidae sp2 X LEPIDOPTERA EREBIDAE Antichloris eriphia Fabricius, 1777* X Diptilon gladia Jones, 1914* X X Eumenogaster sp.* X X X Loxophlebia diaphana Sepp, 1848* X Nyridela acroxantha Perty, 1833* X Rhynchopyga sp.* X Sphecopsyche melissa Dognin, 1898* X X NYMPHALIDAE Aeria olena Weymer, 1875 X X X X X X Danaus gilippus (Cramer, 1776)* X Episcada carcinia Schaus, 1902 X X X Episcada clausina striposis Haensch, 1909* X X X Heterosais edessa Hewitson, 1855* X Hypoleria adasa Hewitson, 1854* X X X 94

Hypothyris euclea laphria Doubleday, 1847* X X Hypothyris euclea nina Haensch, 1905* X Hypothyris ninonia daeta Boisduval, 1836* X X X Ithomia agnosia Hewitson, 1852* X X Lycorea halia cleobaea (Godart, 1819)* X Mechanitis lysimnia Fabricius, 1793 X Placidula euryanassa Felder & Felder, 1860* X Pseudoscada erruca Hewitson, 1855 X X X X X Pteronymia carlia Schaus, 1902*

* Novo registro de interação. Dip significa morfoespécie de Diptera não identificada. Hym morfoespécie de Hymenoptera não identificada.

95

Apêndice 4: registro fotográfico dos visitantes florais

1. Trigona sp. 2. Halictidae sp. 3. Apidae sp.

4. Diptilon gladia 5. Eumenogaster sp. 6. Loxophlebia diaphana

7. Nyridela acroxantha 8. Sphecopsyche melissa 9. Aeria olena

96

10. Danaus gilippus 11. Heterosais edessa 12. Hypoleria adasa

13. Hypothyris euclea laphria 14. Hypothyris ninonia daeta 15. Ithomia agnosia

16. Mechanitis lysimnia 17. Pseudoscada erruca

Descrição: Fotografias de algumas espécies e morfoespécies de visitantes florais que interagem com T. adenantha na Serra do Japi. Estão inclusos registros feitos por observação ativa de ramos focais da planta e também observações ocasionais. Ao todo estão registradas duas famílias de Hymnoptera, Apidae (1 e 3) e Halictidae (2); e duas famílias de Lepidoptera, Erebidae (mariposas 4 a 8) e Nymphalidae (borboletas 9 a 17). Aeria olena e Pseudoscada erruca são as espécies mais frequentes. Fonte: arquivo pessoal. 97

Apêndice 5: herbivoria foliar e escala de dano

A)

B)

98

C)

110

100 r=0.456, p<0.05

90

80

70

60

50

(escala do ramo) (escala 40

30

20

Porcentagem de folhas danificadas (%) danificadas folhas de Porcentagem

10

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Porcentagem de folhas danificadas (%)

(escala da planta)

Descrição: Distribuição do dano foliar em indivíduos de T. adenantha amostrados na Serra do Japi. A herbivoria foi estimada pela porcentagem de folhas danificadas em relação ao total de folhas analisadas, e foi avaliada nas escalas A) do ramo e B) da planta. Na escala do ramo, o dano não tem uma distribuição normal de acordo com teste de Shapiro-Wilk (SW-W). Na escala da planta, essa distribuição é normal. Apesar disso, essas estimativas são positivamente correlacionadas C). No gráfico de dispersão, cada ponto representa uma das 89 plantas para as quais ambas estimativas de dano foram obtidas.

99

Apêndice 6: altura do ramo e visitas por Lepidoptera

A)

B)

Descrição: Relação entre a altura dos ramos reprodutivos e A) o número de visitantes e de B) pousos por lepidópteros nos capítulos de T. adenantha. Cada ponto representa uma das 89 plantas amostradas na Serra do Japi, das quais essas medidas foram obtidas. As linhas cheias indicam o ajuste de tendência do modelo e as linhas tracejadas delimitam o intervalo de confiança de 95%. 100

Apêndice 7: registro fotográfico dos métodos de coleta de COVs

1. Mudas em casa de vegetação 2. Aeração dinâmica 3. Microextração em fase sólida

Descrição: Métodos de coleta de COVs em ramos reprodutivos de T. adenantha. A foto 1 mostra as mudas coletadas na Serra do Japi e mantidas em casa de vegetação até produzirem ramos com capítulos em antese. As fotos 2 e 3 mostram os dois métodos utilizados para a coleta dos COVs em laboratório: o método de aeração dinâmica, em que o ramo é colocado em uma câmara de vidro na qual é criado um fluxo de ar. Ar purificado entra na câmara pela mangueira branca de teflon e é sugado por outra mangueira acoplada a câmara com o todo de vidro contendo o polímero que coleta os compostos. O método de microextração em fase sólida, por sua vez, consiste em ensacar o ramo da planta com um saco de poliéster até que os COVs concentrem e, posteriormente, expor dentro do saco uma fibra com polímero adsorvente. No primeiro caso, após a coleta o polímero é eluído em solvente para obter a amostra/extrato. No segundo, a fibra é acoplada imediatamente no cromatógrafo para as análises. Fonte: arquivo pessoal.

101

Apêndice 8: dano foliar e efeito do número de folhas no ramo

A)

B)

102

C)

D)

Descrição: Relação entre o número de folhas danificadas no ramo reprodutivo e o número de visitantes florais e de pousos recebidos pelos capítulos de T. adenantha na Serra do Japi. Os dados se referem a ramos observados por 30 min em dois intervalos: um a 2min (A, B) após as folhas serem danificadas, e outro 24h depois (C, D). Em cada gráfico o eixo y representa a diferença entre observações feitas no ramo danificado e no mesmo ramo sem dano (taxa basal de visitas) para cada intervalo. Os pontos representam cada ramo em que essas medidas foram obtidas; a linha cheia representa o ajuste do modelo; e as linhas pontilhadas indicam o intervalo de confiança de 95%. Foi sempre amostrado um ramo por planta. 103

Apêndice 9: efeito do dano foliar por grupo taxonômico de visitante floral

Descrição: Atividade dos diferentes táxons de visitantes florais observados em ramos reprodutivos de T. adenantha sem manipulação, e o mesmo ramo submetido ao dano foliar e posteriormente observado em dois intervalos: 2min, e 24h após o dano. Cada observação durou 30min e foi conduzida em um único ramo focal por planta. Foram observados ramos sem dano, e ramos em que houve a remoção mecânica de 25%, 50%, e 75% da área foliar. Os valores fora dos parênteses indicam o número de visitante florais observados. Os valores entre parênteses a esquerda indicam o número de aproximações, e a direita o número de pousos para cada uma das três ordens de visitantes florais registradas.

Táxon Taxa basal 0 % de área foliar removida 2min depois 24h depois Diptera 0 (10 - 0) - 0 (1 - 0) Hymenoptera - - 0 (2 - 0) Lepidoptera - 3 (6 - 3) 1 (5 - 1) Total 0 (10 - 0) 3 (6 - 3) 1 (8 - 1)

Táxon Taxa basal 25 % de área foliar removida 2min depois 24h depois Diptera 0 (1 - 0) 0 (3 - 0) 1 (16 - 1) Hymenoptera - - 0 (1 - 0) Lepidoptera 2 (2 - 2) - - Total 2 (3 - 2) 0 (3 - 0) 1 (17 - 1)

Táxon Taxa basal 50 % de área foliar removida 2min depois 24h depois Diptera - 0 (3 - 0) 0 (7 - 0) Hymenoptera - - - Lepidoptera 2 (4 - 3) - 1 (2 - 1) Total 2 (4 - 3) 0 (3 - 0) 1 (9 - 1)

Táxon Taxa basal 75 % de área foliar removida 2min depois 24h depois Diptera 0 (4 - 0) 0 (2 - 0) 0 (2 - 0) Hymenoptera - - 2 (7 - 2) Lepidoptera - - 0 (1 - 0) Total 0 (4 - 0) 0 (2 - 0) 2 (10 - 2) 104

Apêndice 10: cromatogramas

Descrição: Perfil de compostos orgânicos voláteis presentes nos ramos reprodutivos de T. adenantha sem dano foliar, e com folhas danificadas a 2min e a 24h antes da coleta dos compostos. Os tratamentos foram feitos com a remoção de 50 % da área foliar. Estes cromatogramas correspondem a coleta de voláteis em um único ramo por tratamento, feita através de microextração em fase sólida (SPME). Observa-se uma diminuição na emissão de alguns compostos 2min após o dano, e um aumento 24h depois. Estão destacados: β-Mirceno (1); Ocimeno (2); γ-Terpineno (3); Salicilato de metila (4); α-Bergamoteno (5); Humuleno (6); Germacreno D (7); δ-Cadineno (8); TMTT (9). 105

Apêndice 11: análise de componentes principais (PCA)

Descrição: Loadings de cada composto obtidos por uma PCA feita para avaliar a dissimilaridade no perfil de voláteis entre ramos T. adenantha sem dano, e aqueles com dano foliar mecânico feito a 2min e a 24h antes da coleta. Esses valores podem ser considerados um indicativo de quais compostos foram mais relevantes para a dissimilaridade entre tratamentos encontrada na análise. O valor junto ao título da PC indica a porcentagem cumulativa de explicação da análise. Foram selecionadas PCs que explicassem juntas mais de 70% do padrão de dissimilaridade encontrado.

Composto Loadings obtidos na PCA PC1 25% PC2 45% PC3 57% PC4 65% PC5 73% Tricicleno 0.457734 0.11114 0.007746 -0.154472 -0.0146681 α-Tujeno 0.377128 0.06660 -0.032720 -0.101900 0.0549754 α-Pineno 0.348753 0.07097 -0.010553 -0.069693 0.0888699 monoterpeno ni 1* 0.317270 0.13833 0.072908 -0.073350 0.0424643 monoterpeno ni 2* -0.005518 0.06591 -0.002728 -0.070571 -0.0392958 monoterpeno ni 3* 0.033754 0.02135 -0.037660 0.006427 0.0043223 Sabineno 0.446742 -0.10317 -0.070130 -0.220062 0.0283091 β-Pineno 0.367018 0.03757 -0.007293 -0.087862 0.0428298 (L) β-Pineno 0.350620 0.01071 -0.058971 -0.083436 0.1435904 β-Mirceno 0.291734 -0.92452 -0.535986 -0.125326 0.1690910 α-Felandreno 0.513480 0.42212 -0.405378 0.353961 -0.2340303 Limoneno 0.402433 0.05084 -0.032018 -0.264893 0.0765609 Trans-β-Ocimeno 0.075227 0.17469 0.107667 -0.178217 -0.0452929 Cis-β-Ocimeno 0.413199 -0.72139 0.428624 0.273201 0.0771188 monoterpeno ni 4* 0.063357 -0.22764 -0.237106 0.336589 -0.1948043 γ-Terpineno 0.268025 -0.23863 0.050757 0.009008 0.0604258 Undecano 0.249771 -0.39254 0.397818 -0.107668 -0.4295089 DMNT** 0.107002 -0.31170 0.314623 0.105079 -0.2610547 monoterpeno ni 5* -0.084900 0.09559 0.099614 -0.155042 -0.0728611 Salicilato de metila 0.073950 0.07777 0.249655 -0.224093 0.1291504 sesquiterpeno ni 1* 0.166935 0.23510 0.096680 -0.000998 0.3267317 sesquiterpeno ni 2* -0.148497 0.42222 -0.060397 -0.114334 -0.2891388 sesquiterpeno ni 3* -0.055170 0.42103 -0.029048 -0.019163 -0.0003842 γ-Elemeno -0.212410 -0.10683 -0.214238 0.461102 0.0301898 δ-Elemeno -0.127678 0.04985 -0.012101 0.280889 0.0701691 α-Cubebeno -0.071304 0.05761 -0.442192 -0.068990 0.1157046 Copaeno -0.228875 -0.25252 0.182300 0.300907 -0.0695431 β-Elemeno -0.375744 -0.21442 -0.223051 -0.026230 0.1314546 sesquiterpeno ni 4* 0.184270 0.52266 0.529333 0.214099 0.2751654 Cariofileno -0.159201 0.03232 0.045331 -0.019371 0.1567283 106

α-Bergamoteno -0.401613 -0.17522 -0.131664 -0.149625 0.1999385 sesquiterpeno ni 5* 0.104262 0.20871 0.120374 0.162037 -0.0571175 Aromadendreno -0.225717 0.21614 0.006997 -0.037940 -0.1692742 Humuleno -0.416327 -0.06352 0.030975 -0.118346 0.1699845 Aloaromadendreno -0.280953 0.12208 -0.027867 0.049255 -0.0666851 sesquiterpeno ni 6* -0.219187 -0.11406 0.160064 -0.149140 0.1657709 γ-Muuroleno -0.186851 0.05240 0.042592 -0.083600 -0.2042256 Germacreno D -0.234377 -0.07416 -0.123446 0.019458 0.0404133 Biciclogermacreno -0.188352 -0.06943 0.081482 0.189432 0.0344809 sesquiterpeno ni 7* 0.001780 0.05313 -0.057596 0.022606 0.0150361 δ-Cadineno -0.525370 -0.20801 0.403500 -0.017680 0.0140870 sesquiterpeno ni 8* -0.113234 0.17782 -0.145988 0.055487 -0.0506300 Nerolidol 0.082969 -0.02511 0.032138 0.074911 -0.0284580 sesquiterpeno ni 9* -0.212326 0.16796 -0.115350 0.051788 -0.0333264 TMTT*** -0.909777 -0.07890 0.026053 -0.089332 0.0254889 sesquiterpeno ni 10* -0.076648 0.14412 -0.056016 -0.067276 -0.0330672 sesquiterpeno ni 11* -0.243043 -0.13793 -0.105134 -0.345052 -0.4677747 sesquiterpeno ni 12* 0.026563 -0.01435 -0.055260 0.004933 -0.0016640 sesquiterpeno ni 13* -0.164415 0.13337 -0.095944 0.108695 0.2237467 sesquiterpeno ni 14* 0.143958 0.09364 -0.161252 0.144477 -0.1498871

*ni não identificado. **4,8-Dimetil-1,3,7-nonatrieno (DMNT). ***(E,E)-4,8,12-Trimetiltrideca-1,3,7,11-tetraeno (TMTT).

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ANEXOS

Anexo 1: Declaração de bioética e biossegurança

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Anexo 2: Declaração de direitos autorais