Universidad Central Del Ecuador Facultad De

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CARRERA DE QUIMICA FARMACEUTICA

Influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante

Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de Química Farmacéutica

Autora:

German Mena Dayra Gabriela

Tutora:

MSc. Dayana Paulina Borja Espín

DMQ, Junio 2019 DERECHOS DE AUTOR

Yo, German Mena Dayra Gabriela en calidad de autor y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: Influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante, modalidad presencial, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a mi favor todos los derechos de autor sobre esta obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando la Universidad de toda responsabilidad.

Quito, 7 de Junio del 2019

German Mena Dayra Gabriela 0503244287 [email protected]

CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, Dra. Dayana Borja Espín en calidad de tutora del trabajo de investigación titulado “Influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de T. multiflora y A. arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante”, elaborado por la señorita estudiante Dayra Gabriela German Mena, de la carrera de Química Farmacéutica, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, consideró que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y epistemológico, así como las páginas preliminares, por lo que APRUEBO, a fin que sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 10 días del mes de Abril de 2109.

Firma de tutora

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MSc. Dayana Paulina Borja Espín

C.I. 1710993849

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CONSTANCIA DE APROBACION DEL TRABAJO FINAL POR TRIBUNAL

El tribunal constituido por Dra. Dayana Borja, Dra. Gabriela Leal y Dr. Wilmer Narváez, luego de revisar el trabajo de investigación titulado “Influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de T. multiflora y A. arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante”, previo a la obtención del título (o grado académico) de Químico Farmacéutico presentado por la estudiante Dayra Gabriela German Mena, APRUEBA el trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman

Firma del profesor Firma del profesor

MSc. Dayana Borja Dr. Wilmer Narváez

C.I. 1710993849 C.I. 1102325055

Firma del profesor

Dra. Gabriela Leal

C.I. 1757190630

LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN

La presente investigación se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

Dedicatoria

A Dios.

Por ser mi fortaleza para no rendirme, por el pilar fundamental en mi vida, el motor que con su infinito amor ha sabido guiarme y me ha permitido llegar hasta estas instancias de mi vida.

A mi madre Amada y a mi padre José.

Por haberme apoyado, por sus consejos, por su motivación, por cuidarme, por protegerme, por saber guiarme, por los valores inculcados, gracias por hacer de mi la mujer de bien que soy hoy en día, sobre todo a mi mamita por demostrarme siempre tener valentía y coraje para salir adelante a pesar de todos los obstáculos y adversidades que puedan presentarse.

A mis ángeles en cielo.

En mi mente y en mi corazón sé que han estado, están y estarán por la eternidad, su compañía en cada paso que doy es esencial, sé que no me dejarán nunca, me protegerán y cuidaran de mí y de los que amo desde cualquier lugar donde se encuentren, los amo y los amaré siempre.

A mis familiares.

A mis seres queridos que han estado presentes siempre y se han convertido parte fundamental de mi crecimiento personal.

A mis amigos.

Amigos y amigas con los que hemos compartido momentos increíbles, que han sido un apoyo durante todo este camino de formación profesional, que a pesar del tiempo, de los obstáculos, adversidades continuamos siendo amigas y amigos, espero que el futuro este lleno de éxitos y triunfos pero sobre todo podamos seguir juntos.

¡Gracias a todos ustedes!

Agradecimiento

En primer lugar agradezco a Dios por estar siempre en mi vida, por su amparo y protección, por no dejarme sola, por cuidar de mi familia y por su infinito amor.

A mis Padres, José y Amadita por ser mi modelo a seguir, por permanecer juntos en los buenos y malos momentos, por ser mi apoyo incondicional y constante, por su tiempo, por su dedicación, un agradecimiento especial a mi madre porque sin ella y todo el esfuerzo que ha hecho no seriamos personas de bien tanto mi hermano como mi persona, tampoco estaríamos alcanzando todo lo que nos hemos propuesto, ella es nuestra bendición más grande y lo será por siempre.

A mis ángeles en el cielo Papito Carlos y Mamita Carmen por ser esa compañía incondicional en todo momento, por ser parte de mi vida, por inculcarme valores y ese gran amor a Dios y a mi familia, aunque no estén en persona, estoy segura que desde donde se encuentren ellos nos están dando sus bendiciones, los amo y los amare siempre.

A mis amigos y amigas, los mismos que con sus palabras y frases motivadoras, su ayuda, día a día me motivaron y me motivan a luchar hasta alcanzar mis sueños, por brindarme su valiosa amistad.

A la Universidad Central del Ecuador por abrirme sus puertas, a mis queridos profesores que me han transmitido los conocimientos y la sabiduría necesarias para mi formación profesional. Agradezco de manera muy especial a la MSc. Dayana Borja por su esfuerzo, dedicación, contribución y apoyo incondicional para la realización de esta tesis y en las aulas como mi maestra.

vii

Índice de Contenidos

Índice de Contenidos ...... viii Indice de Imágenes ...... xi Índice de Tablas ...... xii Indice de Gráficos ...... xviii Indice de Anexos ...... xix Resumen ...... xx Abstract ……………………………………………………………………………..xxi Capítulo I ...... 3 1. El Problema ...... 3 1.1 Planteamiento del problema ...... 3 1.2 Formulación del problema ...... 5 1.3 Preguntas directrices ...... 5 1.4.1 Objetivo General...... 6 1.4.2 Objetivos específicos...... 6 1.5 Justificación ...... 6 Capitulo II ...... 10 2. Marco Teórico ...... 10 2.1. Antecedentes ...... 10 2.2. Fundamento teórico ...... 16 2.2.1 Familia Asterácea...... 16 2.2.2 Ambrosia arborescens ...... 17 2.2.2.1 Características ...... 17 2.2.2.2 Morfología ...... 18 2.2.2.3 Taxonomía ...... 19 2.2.2.4 Propiedades y usos ...... 21 2.2.2.5 Composición y principios activos...... 22 2.2.3 Tagetes multiflora...... 23 2.2.3.1 Características ...... 23 2.2.3.2 Morfología ...... 23 2.2.3.3 Taxonomía...... 24 2.2.3.4 Propiedades y usos...... 25

viii

2.2.3.5 Composición y principios activos...... 28 2.2.4 Metabolismo en plantas...... 28 2.2.4.1 Metabolitos Secundarios ...... 29 2.2.4.1.1 Alcaloides ...... 30 2.2.4.1.1.1 Estructura ...... 31 2.2.4.1.1.2 Biosíntesis ...... 31 2.2.4.1.1.2.1 Biosíntesis de alcaloides tropánicos y nicotínicos ...... 32 2.2.4.1.1.2.2 Biosíntesis de alcaloides de bencilisoquinolina ...... 33 2.2.4.1.1.2.3 Biosíntesis de alcaloides indólicos terpénicos ...... 33 2.2.4.1.1.3 Clasificación según su origen biosintético ...... 33 2.2.4.1.1.4 Usos ...... 35 2.2.4.1.1.4.1 Los alcaloides pueden usarse como medicinas ...... 36 2.2.4.1.1.4.2 Los alcaloides usados como narcóticos ...... 36 2.2.4.1.1.4.3 Los alcaloides pueden usarse como pesticidas y repelentes ...... 36 2.2.4.1.1.4.4 Los alcaloides pueden usarse en la investigación científica ...... 37 2.2.5 Control de calidad de la droga ...... 37 2.2.5.1 Cenizas ...... 38 2.2.5.1.1 Cenizas Solubles en agua ...... 38 2.2.5.1.2 Cenizas Ácido – Insolubles ...... 38 2.2.5.2 Humedad ...... 39 2.2.5.3 Material Extraíble (Extracto total y de cada fracción) ...... 39 2.2.6 Extractos ...... 39 2.2.6.1 Extractos Fluidos ...... 40 2.2.6.2 Extractos Secos ...... 40 2.2.6.3 Extracto Blando ...... 40 2.2.7 Extracción ...... 41 2.2.7.1 Tipos de Extracción ...... 41 2.2.7.1.1 Reflujo ...... 41 2.2.7.1.2 Maceración ...... 41 2.2.7.1.3 Extracción específica de alcaloides ...... 42 2.2.7.1.3.1 Extracción en medio alcalina ...... 42 2.2.7.1.3.2 Extracción en medio ácido ...... 43 2.2.8 Métodos de Análisis ...... 43 2.2.8.1 Análisis cromatográfico: Cromatografía en capa fina ...... 43 ix

2.2.8.2 Métodos Espectrofotométricos ...... 44 2.2.8.2.1 Determinación cuantitativa de alcaloides ...... 44 2.2.8.2.2 Espectrometría Ultravioleta ...... 45 2.2.8.2.3 Actividad antioxidante ...... 45 2.3 Marco Legal ...... 47 2.4 Hipótesis ...... 49 2.4.1 Hipótesis de trabajo ...... 49 2.4.2 Hipótesis nula ...... 49 2.5 Conceptualización de las variables ...... 50 Capítulo III ...... 51 3. Marco metodológico ...... 51 3.1 Diseño de la Investigación ...... 51 3.2 Población y Muestra ...... 52 3.3 Métodos y Materiales ...... 52 3.3.1 Métodos ...... 52 3.3.2 Materiales ...... 53 3.4 Diseño Experimental ...... 56 3.5 Operacionalización de las variables ...... 59 3.6 Técnicas ...... 60 3.6.1 Recolección e identificación del material vegetal ...... 60 3.6.2 Control de Calidad del Materia Vegetal ...... 60 3.6.2.1 Determinación del material extraíble ...... 60 3.6.3 Limpieza y desinfección del material vegetal ...... 61 3.6.4 Extracción y aislamiento de los componentes alcaloideos ...... 61 3.6.4.1 Extracción a partir del material vegetal ...... 61 3.6.4.2 Procedimiento general para obtener alcaloides extraídos de la planta a partir del material crudo de la planta (Fraccionamiento de los extractos vegetales totales)……………………………………………………………………………..63 3.6.4.3 Aislamiento de compuestos alcaloideos...... 64 3.6.4.3.1 Preparación de curva de calibración de bismuto...... 64 3.6.4.3.2 Método espectrofotométrico para la cuantificación de alcaloides...... 64 3.6.4.3.2.1 Preparación de soluciones ...... 64 3.6.4.3.2.2 Reacción del extracto con el reactivo DR y formación del complejo coloreado bismuto-tioúrea ...... 65

3.6.4.3.3 Identificación de alcaloides por capa fina (TLC) ...... 66 3.6.4.3.4 Determinación de la actividad antioxidante ...... 67 3.6.4.3.4.1 Preparación del reactivo DPPH ...... 67 3.6.4.3.4.2 Preparación del reactivo Trolox ...... 67 3.6.4.3.4.3 Preparación de las muestras ...... 67 Capítulo IV ...... 69 4 Análisis y Discusión de Resultados ...... 69 4.1 Identificación de las plantas ...... 69 4.2 Material extraño ...... 69 4.3 Determinación de cenizas totales ...... 71 4.4 Determinación del porcentaje de material extraíble ...... 73 4.5 Identificación de alcaloides por capa fina (TLC) ...... 77 4.6 Cuantificación de alcaloides y compuestos nitrogenados en extractos totales y fracciones ...... 81 4.6.1 Curva de calibración de bismuto...... 81 4.7 Evaluación de la actividad antioxidante método DPPH...... 105 Capítulo V ...... 130 5 Conclusiones y Recomendaciones ...... 130 5.1 Conclusiones ...... 130 5.2 Recomendaciones ...... 132 6 Bibliografía ...... 134 7 Anexos ...... 146 Anexo A. Árbol de problemas ...... 146 Anexo B. Categorización de Variables ...... 147 Anexo C. Certificado de identificación de las especies vegetales Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora ...... 148 Anexo D. Fotografías del trabajo experimental………………………………149-157 Anexo E. Certificado Analítico de DPPH ...... 158 Anexo F. Certificado Analítico de Trolox ...... 159

Indice de Imágenes

Imagen N°1. Especie Ambrosia arborescens Miller (altamisa)……………………....20

Imagen N°2. Especie Ambrosia artemisiifolia……………………..……………….....20

Imagen N°3. Especie Tagetes multiflora…………………………………………..….25

Imagen N°4. Especie Tagetes multiflora………………………………………..…….25

Imagen N°5. Procedimiento general para obtener alcaloides de extractos de material vegetal crudo……………………………………………..………………………….….63

Índice de Tablas Tabla N°1. Taxonomía de Ambrosia arborescens…………………………………...….26

Tabla N°2. Taxonomía de Tagetes multiflora…………………………………..…..…..30

Tabla N°3. Materiales de oficina……………………………………………….……....53

Tabla N°4. Material de Laboratorio…………………………………..………………...54

Tabla N°5. Equipos……………………………………………..……………………....54

Tabla N°6. Reactivos……………………………………………………….…………..55

Tabla N°7. Diseño para la cuantificación de alcaloides en extractos y fracciones para tallos de Ambrosia arborescens………………………………………………………...57

Tabla N°8. Diseño para la evaluación antioxidante en extractos y fracciones…………..58

Tabla N°9. Etapa I – Etapa II……………………………………………………..…….59

Tabla N°10. Etapa III………..………………………………………………….………59

Tabla N°11. Volúmenes para el método del radical DPPH – Trolox……………………68

Tabla N°12. Material extraño de Ambrosia arborescens……………………………...... 69

Tabla N°13. Material extraño de Tagetes multiflora…………………………..…….....70

Tabla N°14. Resultados de cenizas totales para hojas de Ambrosia arborescens…….....71

Tabla N°15. Resultados cenizas totales tallos de Ambrosia arborescens………..…...... 71

Tabla N°16. Resultados cenizas totales hojas de Tagetes multiflora………………..….72

Tabla N°17. Resultados cenizas totales tallos de Tagetes multiflora…………………..72

Tabla N°18. Resultados de material extraíble para Extractos………………………….73

xii

Tabla N°19. Resultados de material extraíble para la Fracción 1……………………...... 74

Tabla N°20. Resultados de material extraíble para la Fracción 2…………………...... 75

Tabla N°21. Resultados de material extraíble para la Fracción 3…………………...... 76

Tabla N°22. Valores de Rf para los extractos de Ambrosia arborescens……………...... 77

Tabla N°23. Valores de Rf para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens……………...... 77

Tabla N°24. Valores de Rf para los extractos de Tagetes multiflora…………….……..78

Tabla N°25. Valores de Rf para la Fracción 1 de Tagetes multiflora…………………..79

Tabla N°26. Datos obtenidos para la curva de calibración de bismuto……………….....82

TablaN°27. Datos experimentales de las Absorbancias de los extractos y fracciones para Ambrosia arborescens…………….………………..…………………………………..83

Tabla N°28. Datos experimentales de las Absorbancias de los extractos y fracciones para Tagetes multiflora………………………………………………….……………………83

Tabla N°29. Concentración de extractos y fracciones para Tagetes multiflora………….84

Tabla N°30. Concentración de extractos y fracciones para Ambrosia arborescens…...... 84

Tabla N°31. Resultados de Concentración (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) para Extractos totales……………………………………………………………..……….....85

Tabla N°32. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………...... 86

Tabla N°33. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………………..……...87

xiii

Tabla N°35. Estadísticas en grupo para los métodos de extracción en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………..…..88

Tabla N°36. Prueba T para muestras independientes para los métodos de extracción en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………..……...89

Tabla N°37. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………..……………...………90

Tabla N°38. Prueba T para muestras independientes para las partes de la planta en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………………..………..90

Tabla N°39. Resultados de Concentración (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) para Fracción 1………………………………………………..……………………………..91

Tabla N°40. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………………………………………………………….92

Tabla N°41. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………………...... 93

Tabla N°42. Prueba T para muestras independientes para las especies vegetales en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………...94

Tabla N°43. Resultados de Concentración (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para Fracción 2……………………………………………………………...…….95

Tabla N°44. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco en la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………………………....96

xiv

Tabla N°45. Estadísticas en grupo para los métodos de extracción en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………97

Tabla N°47. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……….98

Tabla N°49. Resultados de Concentración (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para Fracción 3………………………………………………………….………100

Tabla N°50. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………….……….101

Tabla N°51. Estadísticas en grupo para los métodos de extracción en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco) en la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………..102

Tabla N°52. Prueba T para muestras independientes para los métodos de extracción en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados/g extracto seco) en la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………………………………………………………...102

Tabla N°53. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados/g extracto seco) en la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………...103

Tabla N°54. Prueba T para muestras independientes para las partes de la planta en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados/g extracto seco) en la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……..…104 xv

Tabla N°55. Datos obtenidos para la curva de calibración para la actividad antioxidante……………………………………………...……..…………………...... 105

Tabla N°56. Datos de Absorbancias para Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Ambrosia arborescens………………………………………….....…..106

Tabla N°57. Datos de Absorbancias para Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Tagetes multiflora…………………………………………………….107

Tabla N°58. Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Ambrosia arborescens……………………………………………………………..………...…...107

Tabla N°59. Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Tagetes multiflora………………………………………………………………….………...... 108

Tabla N°60. Resultados del Porcentaje de Inhibición % para Extractos…………….....108

Tabla N°61. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………..109

Tabla N°62. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora….110

Tabla N°63. Prueba T para muestras independientes entre las especies vegetales con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………………..……………111

Tabla N°64. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora….112

Tabla N°66. Resultados del Porcentaje de Inhibición % para Fracción 1……………...113

Tabla N°67. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………...……..114

xvi

Tabla N°68. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora….115

Tabla N°69. Prueba T para muestras independientes entre las especies vegetales con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………….………………….116

Tabla N°70. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora….117

Tabla N°71. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………………………………………………………...117

Tabla N°72. Resultados del Porcentaje (%) de Inhibición para Fracción 2……………118

Tabla N°73. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………..………….119

Tabla N°74. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora….120

Tabla N°75. Prueba T para muestras independientes entre las especies vegetales con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………………………..……121

Tabla N°76. Estadísticas en grupo para el método de extracción en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………………………………………………………...122

Tabla N°78. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………………………………...……123

xvii

Tabla N°79. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………………………………………………………...... 124

Tabla N°80. Resultados de Porcentaje (%) de Inhibición para Fracción 3…………....125

Tabla N°81. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………126

Tabla N°82. Estadísticas en grupo para el método de extracción en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…..………………………………………………………………………….127

Tabla N°83. Prueba T para muestras independientes entre los métodos de extracción con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………………………..……127

Tabla N°84. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora….128

Tabla N°85. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………………..…………………….129

Indice de Gráficos

Gráfica N°1: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para los extractos totales entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………….....73

Gráfica N°2: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para la fracción 1 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………..………..74

Gráfica N°3: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para la fracción 2 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………….…….….……..75

Gráfica N°4: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para la fracción 3 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………..………….……..76

Gráfica N°5: Curva de calibración de Bismuto……………………..…………….…….82 xviii

Gráfica N°6: Comparación de la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……..85

Gráfica N°7: Comparación de la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……….92

Gráfica N°8: Comparación de la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………………………………...... 95

Gráfica N°9: Comparación de la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………….....………..100

Gráfica N°10: Curva de calibración del Trolox…………………………..……………105

Gráfica N°11: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora……………………………..………….....109

Gráfica N°12: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………….……………….114

Gráfica N°13: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………..……………….119

Gráfica N°14: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora…………………………………..……….125

Indice de Anexos

Anexo A. Árbol de problemas…………………………………………………...…….146

Anexo B. Categorización de Variables……………………………………………...…147

Anexo C. Certificado de identificación de las especies vegetales Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora………………………………………………………………..…....148

Anexo D. Fotografías del trabajo experimental…………………………….……149-157

Anexo E. Certificado Analítico de DPPH………………………………………..…....158

Anexo F. Certificado Analítico de Trolox…………………………………..………....159

xix

Tema: Influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante

Autor: Dayra Gabriela German Mena

Tutor: MSc. Dayana Paulina Borja Espín

Resumen El propósito del presente trabajo de investigación fue determinar la influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante, las dos especies utilizadas pertenecen la familia Asteraceae. El desarrollo del trabajo se llevó a cabo en tres etapas, en la primera se realizó el control de calidad del material vegetal, en la segunda etapa se llevó a cabo el fraccionamiento de los extractos totales y la cuantificación de alcaloides y compuestos nitrogenados mediante la reacción de precipitación con el reactivo de Dragendorff. Para extractos totales el método de extracción que permitió obtener mayor concentración de alcaloides tanto para Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, es el método de reflujo en las hojas, obteniéndose 0,60 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco y 0,76 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco respectivamente, para la fracción 1 es maceración en tallos obteniéndose 0,34 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco y reflujo en hojas dando un valor de 0,28 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco, para la fracción 2 maceración en tallos y hojas con la concentración más alta de componentes nitrogenados y la fracción 3, el método de extracción con la concentración más alta de compuestos nitrogenados es la maceración en hojas tanto para Ambrosia arborescens y para Tagetes multiflora, en esta misma etapa se realizó TLC empleando las fases móviles Benceno: Etanol (45:5) y Benceno: Metanol (9:1), donde los Rf fueron de 0,78 y 0,88 para los extractos y fracción 1. En la tercera etapa se determinó la actividad antioxidante mediante el método del radical DPPH utilizando como estándar de referencia Trolox, concluyendo que el extracto total de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, método de extracción reflujo tiene el mayor porcentaje de inhibición en hojas y tallos siendo de 100,36% y 96,75% respectivamente.

Palabras clave: ALCALOIDES, COMPUESTOS NITROGENADOS, AMBROSIA ARBORESCENS, TAGETES MULTIFLORA, PORCENTAJE DE INHIBICIÓN.

Autor: Dayra Gabriela German Mena

Tutor: MSc. Dayana Paulina Borja Espín

Abstract The purpose of this research work was to determine the influence of the plant material used (leaves and stems) of Tagetes multiflora and Ambrosia arborescens and the extraction method, in the quantification of alkaloids for the evaluation of the antioxidant effect, the two species used are the Asteraceae family. The development of the work was carried out in three stages, in the first stage the quality control of the plant material was carried out, in the second stage the fractionation of the total extracts and the quantification of alkaloids and nitrogen compounds through the reaction were carried out. of precipitation with Dragendorff's reagent. For total extracts the method of extraction that allowed to obtain higher concentration of alkaloids for both Ambrosia arborescens and Tagetes multiflora, is the method of reflux in the leaves, obtaining 0,60 mg of Alkaloids (Bi) / g of dry extract and 0,76 mg of Alkaloids (Bi) / g of dry extract respectively, for fraction 1 is maceration in stems obtaining 0,34 mg of Alkaloids (Bi) / g of dry extract and reflux in leaves giving a value of 0,28 mg of Alkaloids (Bi) / g dry extract, for fraction 2 maceration in stems and leaves with the highest concentration of nitrogen components and fraction 3, the extraction method with the highest concentration of nitrogen compounds is the maceration in leaves for both Ambrosia arborescens and for Tagetes multiflora, in this same stage TLC was performed using the mobile phases Benzene: Ethanol (45: 5) and Benzene: Methanol (9: 1), where the Rf were 0,78 and 0,88 for the extracts and fraction 1. In the third stage, the antioxidant activity was determined by the DPPH radical method using Trolox as a reference standard, concluding that the total extract of Ambrosia arborescens and Tagetes multiflora, the reflux extraction method, has the highest percentage of inhibition in leaves and stems. 100.36% and 96.75% respectively.

Key words: ALKALOIDS, NITROGEN COMPOUNDS, AMBROSIA ARBORESCENS, TAGETES MULTIFLORA, PERCENTAGE OF INHIBITION.

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INTRODUCCIÓN

En la presente investigación se analizará la influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para la evaluación del efecto antioxidante

La actividad antioxidante es la capacidad de una sustancia para inhibir la degradación oxidativa, de tal manera que un antioxidante actúa, principalmente, gracias a su capacidad para reaccionar con radicales libres y, por lo tanto, recibe el nombre de antioxidante terminador de cadena. Es necesario distinguir también entre actividad estabilizadora de radicales libres o antiradicalaria (en inglés, scavenger) y actividad antioxidante. La primera está determinada completamente por la reactividad de un antioxidante frente a radicales libres, lo cual puede ser caracterizado por la velocidad de esa reacción. Por su parte, la segunda mide la capacidad para retardar la degradación oxidativa. Por lo tanto, una alta actividad anti-radicalaria no siempre correlaciona con una alta actividad antioxidante; en particular, algunos compuestos fenólicos sintéticos presentan alta reactividad frente a radicales libres, pero muestran moderada actividad antioxidante. De hecho, no existen métodos mundialmente unificados para medir capacidad antioxidante, en parte, debido a la disparidad de condiciones en las cuales se desarrollan estas metodologías, además de la complejidad de los sistemas y de la diversidad de matrices que necesitan ser evaluadas.

(Londoño, 2016)

Esta investigación consta de cinco capítulos que son los siguientes:

Capítulo I: Este capítulo contiene la problemática de la investigación enfocada en el planteamiento del problema, la misma que nos lleva a realizar ésta investigación; la formulación del problema, las preguntas directrices, objetivos, la justificación correspondiente, misma que hace referencia a estudios relacionados acerca de las especies vegetales empleada como son Ambrosia arboreces y Tagetes multiflora.

Capítulo II: Este capítulo nos presenta el marco teórico, encontramos en primer lugar los antecedentes de investigaciones relacionadas con el tema de estudio, se trata de estudios realizados con anterioridad relacionados con las especies a analizar y que nos

1 sirve como referente para el estudio que llevaremos a cabo, seguidamente encontramos el fundamento teórico donde se sustentó dicho trabajo, el marco legal, se expone además la hipótesis nula, hipótesis de trabajo y la conceptualización de variables del trabajo para cada etapa.

Capitulo III: En este capítulo encontramos el marco metodológico, se detalla el diseño de la investigación que se utilizará, además se describe la población y muestra, métodos o técnicas, materiales y reactivos que se emplearán durante la experimentación, el diseño experimental, en donde se describe las diferentes etapas a llevarse a cabo en la parte experimental, encontramos además la respectiva operacionalización de variables con sus dimensiones e indicadores, las mismas que se presentan en una matriz.

Capítulo IV: Análisis y Discusión de resultados, en este se presentan los resultados obtenidos tras la realización del trabajo de investigación, se realiza el respectivo análisis e interpretación de todos los resultados obtenidos y se fundamentan con tablas y gráficos respectivos.

Capítulo V: Conclusiones y Recomendaciones, en este capítulo se presentan las respectivas conclusiones a partir de los resultados obtenidos tomando en cuenta los objetivos inicialmente planteados en el presente trabajo de investigación y de igual manera establecer las respectivas sugerencias o recomendaciones para la implementación de dicha investigación.

Capítulo I

1. El Problema

1.1 Planteamiento del problema

Las comunidades indígenas poseen un profundo conocimiento de su ambiente (Martínez, 2006), saben los numerosos usos que se le pueden dar a las plantas y estos se constituyen en un conocimiento que se transmite en forma oral de generación en generación (Pérez Irais Cosme, 2008) y son una base importante para la conservación de la biodiversidad global así como parte de su uso sustentable. (Magaña & Colaboradores, 2010)

Las plantas medicinales tienen una contribución importante en el sistema de salud de comunidades locales, ya que son usadas de manera frecuente por la mayoría de las poblaciones rurales, es importante mencionar que muchas de las especies de plantas medicinales que utilizan los habitantes de diferentes zonas, crecen de manera silvestre y han sido aprovechadas por su gente con la finalidad de solucionar problemas médicos. Muchas personas en la actualidad han tenido experiencia con las recetas de sus antepasados para dolores de cabeza, malestares, irregularidad menstrual, náuseas, hemorragias nasales, dolor de hombros y otros síntomas. (Magaña & colaboradores, 1996)

En ese sentido el interés por la investigación y comercialización de la flora medicinal se incrementa continuamente tanto por el aumento y la revitalización del consumo actual como por el patentado de extractos vegetales. (Magaña & colaboradores, 1996). Un gran número de contribuciones sobre el reporte de extractos y/o sustancias validadas por sus propiedades antioxidantes se ha incrementado significativamente en los últimos años. (Suhaj, 2006)

La prolongada exposición a oxidantes exógenos y/o a metabolitos endógenos en el cuerpo pueden producir especies reactivas de oxígeno (ROS) (Carocho & Ferreira, 2013), las mismas que están relacionadas con estrés oxidativo y estos a su vez con enfermedades crónicas que producen un desbalance entre los niveles prooxidantes

/antioxidantes en el organismo, responsables de contrarrestar los efectos perjudiciales para la salud. (Urquizo, 2016).

Cuando un exceso de radicales libres se forma, puede causar la destrucción de enzimas tales como superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx), y catalasa, generando efectos letales en las células por la oxidación de lípidos, proteínas, DNA y enzimas; ocasionando reacciones en cadena que perpetúa la creación de más radicales libres aumentando el daño de tejidos desencadenando diversas enfermedades. (Krishnaiah, Sarbatly, & Nithyanandam, 2011)

Los compuestos antioxidantes tienen la capacidad de inhibir o interrumpir las reacciones de transformación que causan daños a las biomoléculas. En los últimos años los antioxidantes naturales provenientes de plantas (por ejemplo, ácido ascórbico (vitamina C), α-Tocoferol (vitamina E), glutationa, carotenoides, alcaloides y flavonoides), han sido frecuentemente usados en diferentes campos de la industria farmacéutica, alimentos y en medicina. (Karre, Lopez, & Getty, 2013)

Muchos de estos antioxidantes naturales presentan una actividad comparable con antioxidantes sintéticos de mayor uso comercial como el 2-terbutil-hidroxitolueno (BHT) y el 2-terbutil-hidroxianisol (BHA); los cuales sin embargo, pese a sus propiedades antioxidantes presentan la desventaja de tener efectos toxicológicos. (Koheil, Hussein, Othman, & El-Haddad, 2011)

El estudio de nuevos y efectivos antioxidantes puede ser de gran beneficio en la mejora de la calidad de vida mediante la prevención y aparición de enfermedades degenerativas. Además, de presentar un sustancial ahorro en el costo de los servicios de atención de la salud. Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de sustancias y/o especies vegetales validadas por poseer propiedades antioxidantes, son pocos los estudios complementarios y los recursos que se destinan en la investigación, ya que sólo unas pocas especies se utilizan como suplementos antioxidantes o alimentarios. (Suhaj, 2006)

En la mayoría de los casos, la actividad antioxidante de estas plantas se debe principalmente a la presencia de compuestos fenólicos y otros tales como alcaloides y flavonoides, los cuales son potentes secuestradores de especies reactivas de oxígeno y además son capaces de inhibir a enzimas productoras de radicales libres. (Alam, Bristi, & Rafiquzzaman, 2013)

El presente estudio busca determinar la influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides para evaluación de del efecto antioxidante de las dos especies de la familia Asteraceae, para ello se vinculó con los estudios de dichas especies ya existentes hasta el momento, y se aportó con la experimentación que se realizó en el laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas, para posteriormente evaluar la actividad antioxidante de cada uno de los extractos y fracciones obtenidos de dichas especies vegetales.

1.2 Formulación del problema

El presente trabajo pretende responder a la siguiente cuestión: ¿Cómo influye el material vegetal utilizado (hojas y tallos) de T. multiflora y A. arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides en los extractos y fracciones obtenidas a partir de las dos especies para la evaluación del efecto antioxidante?

1.3 Preguntas directrices

 ¿Cuáles son los usos tradicionales y metabolitos más representativos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora?

 ¿Cuál proceso de extracción permite obtener mayor cantidad de alcaloides en las especies vegetales empleadas?

 ¿Cuál de las dos estructuras (tallos u hojas) presenta mayor cantidad de alcaloides en la especie Ambrosia arborescens y en la especie Tagetes multiflora?

 ¿Cómo influye el método de extracción y la parte de la planta empleada en el porcentaje (%) en de inhibición para extractos y fracciones?

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo General.

Determinar la influencia del material vegetal utilizado (hojas y tallos) de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens y el método de extracción, en la cuantificación de alcaloides en las fracciones obtenidas a partir de las dos especies para la evaluación del efecto antioxidante

1.4.2 Objetivos específicos.

 Investigar los usos tradicionales y metabolitos más representativos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

 Definir cuál es el método de extracción en el que encontramos mayor cantidad de alcaloides de las especies vegetales empleadas.

 Establecer cuál de las dos estructuras (tallos u hojas) presenta la mayor cantidad de alcaloides en la especie Ambrosia arborescens y en la especie Tagetes multiflora.

 Evaluar como el método de extracción y la parte de la planta influye en el porcentaje (%) de inhibición. en extractos (alcaloideos) y fracciones

1.5 Justificación

El Ecuador es un país que se caracteriza por su gran riqueza tanto en fauna como en flora. Sin embargo no siempre se ha sabido aprovechar todas las bondades que nos brinda la naturaleza en beneficio de nosotros mismos y del medio ambiente, los aborígenes de todo el mundo han vivido milenariamente en una dependencia absoluta de su vegetación y tienen un conocimiento increíblemente extenso de las propiedades de sus plantas. (Lock De Ugaz, 1987)

Las plantas superiores producen y acumulan una diversidad de sustancias, que pueden ser extraídas en cantidades suficientes y ser aprovechadas por el hombre, estás son producto del metabolismo secundario, los llamados metabolitos que tienen una gama de usos en la agricultura, en la medicina, farmacéutica, industria alimenticia, entre otras. (Saltos, 2008)

Por el potencial que representan estos metabolitos, las investigaciones no solo se han dirigido a la elucidación de estructuras químicas y evaluación de su actividad biológica mediante bioensayos, sino hacia la obtención por cultivo in vitro. Se ha escogido dos plantas de la familia Asteraceae, conocidas por nuestros pobladores con el nombre de marco y tinzto, debido a que se trata de plantas que se encuentran en diferentes regiones de nuestro país, y se conoce de ciertas propiedades que les han sido atribuidas por parte de nativos o indígenas, sin embargo, hasta ahora no se habían llevado a cabo estudios fitoquímicos profundos que permitieran un aprovechamiento total de las plantas. (Saltos, 2008)

La planta Ambrosia artemisifolia, perteneciente a la familia Asteraceae, se utiliza para desinflamar, previene el paludismo, es antihelmíntico, acción citotóxica de los extractos alcohólicos, demostrándose además que posee actividad antibacteriana, antiespasmódico y regula la menstruación. (Echavarría, 2016)

T. multiflora tiene varios beneficios médicos como remedio para resfriados, inflamaciones respiratorias, problema estomacal, antiespasmódico, antiparasitario, antiséptico, insecticida y sedante. También tiene un efecto curativo en heridas, cortes, callos y juanetes. Sin embargo, tales prácticas se basan en gran medida en el folclore y el tren de la medicina tradicional en lugar de la investigación basada en la evidencia. (Koheil et al., 2011)

Algunos investigadores sugieren que dos tercios de las especies de plantas del mundo tienen valor medicinal; en particular, muchas plantas medicinales tienen un gran potencial antioxidante. Los compuestos antioxidantes reducen el estrés oxidativo en las células y, tienen la capacidad de inhibir o interrumpir las reacciones de transformación que causan daños a las biomoléculas (Karre et al., 2013), por lo tanto, son útiles en el tratamiento de muchas enfermedades humanas, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades inflamatorias, existe un amplio potencial

7 antioxidante de los extractos de tallos, raíces, corteza, hojas, frutos y semillas de varias especies medicinales importantes. (Krishnaiah et al., 2011)

El estudio fitoquímico de una planta nos permite aislar e identificar los principios activos de la misma con importante actividad biológica, tal es el caso de las plantas medicinales. (Saltos, 2008)

El primer paso a seguir en un estudio fitoquímico es la selección de la muestra a ser empleada para la obtención del extracto vegetal, el mismo que contiene los metabolitos secundarios, teniendo en cuenta que estos son los principales responsables de la acción terapéutica de las especies vegetales, es importante el estudio de su composición y distribución en la planta (Guauque, Castaño, & Gómez, 2010)

Se reporta la presencia de alcaloides, taninos, glucósidos cardiotónicos, cumarinas, auronas, esteroides, saponinas y lactonas sesquiterpénicas como las principales responsables de su acción terapéutica en las hojas de A. peruviana. (Guauque et al., 2010). Análisis fitoquímicos del extracto de las partes aéreas de Ambrosia arborescens manifiestan la presencia de aminoácidos libres, alcaloides, antraquinonas, azúcares reductores, flavonoides, taninos. (Castillo, 2017).

Tagetes multiflora (T. minuta) es una planta vertical de caléndula en la familia de las girasoles (Asteraceae) (Koheil et al., 2011). La especie Tagetes originalmente se usó como fuente de aceite esencial (extraído de hojas, tallos y flores) notándose la presencia de triterpenos, esteroides y en extractos alcohólicos y acuosos de hojas y tallos, alcaloides cuaternarios, óxidos de aminas libres, cumarinas y fenoles en el extracto acuoso de hojas encontramos en mayor cantidad flavonoides azúcares reductores y mucílagos, en menor cantidad en hojas y raíces. (Barrera & colaboradores, 2009)

Además en estudios fitoquímicos existen diferentes formas de extraer (métodos de extracción) los compuestos bioactivos de las plantas, para seleccionar alguna técnica es necesario tener en cuenta que los compuestos pueden degradarse con la temperatura u oxidarse en presencia de oxígeno y luz, estas técnicas emplean varios tipos de solventes dependiendo de la polaridad de los metabolitos a extraer. La muestra a ser analizada (partes de las especies vegetales) y el método de extracción utilizado, pueden influir en la composición del extracto y fracciones, por ende en su capacidad antioxidante, por ese motivo es importante establecer un método de extracción con un solvente óptimo y

8 seleccionar adecuadamente la parte de la especie vegetal que nos permita la detección del metabolito de interés. (Urquizo, 2016).

Los avances en las evaluaciones químicas y farmacológicas del aceite esencial de T. multiflora se han producido en los últimos años; sin embargo, varias características útiles de esta planta (por ejemplo, los mecanismos que subyacen a sus efectos antioxidantes y antiinflamatorios) han permanecido desconocidas. Los macrófagos juegan un papel fundamental en las respuestas inflamatorias. (Koheil et al., 2011)

El presente proyecto de investigación tiene como propósito, servir de referente en el estudio tanto de cuantificación de metabolitos (alcaloides) como en lo relacionado a la actividad antioxidante, especialmente por el insuficiente conocimiento que tiene la sociedad no solo ecuatoriana sino de otros países sobre las propiedades que presentan plantas nativas, especialmente en relación de las dos especies en estudio tanto Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora.

Las plantas se han empleado a lo largo de la historia por sus propiedades medicinales, esta clase de uso se ha centrado a menudo en la salud humana, pero también han sido y siguen siendo, aplicados en la práctica en la salud animal y vegetal, investigaciones realizadas sobre extractos o relacionados a los mismos toma otra connotación al momento en que esta se complementa con la protección contra los radicales libres ya que evidencia fundamental y valiosa (estudios realizados/bibliografía) señala que el reino vegetal es rico en antioxidantes que pueden ser o ya son de gran importancia en la prevención de padecimientos lo que resulta de gran beneficio para mejorar la calidad de vida de las personas.

Es importante entonces hacer estudios o investigaciones de este tipo, con la finalidad de conocer más a fondo características en general como composición química, los principios activos de las plantas ya que esto hace posible también una aplicación como medicina tradicional libre de riesgos, donde el paciente y su bienestar son primero, a partir de los resultados obtenidos en esta investigación podremos servir como referente para otras investigaciones a realizarse en el futuro, ya que al centrarnos tan solo en una pequeña parte de la composición de dichas especies en estudio aún nos queda un mundo completamente desconocido relacionado a otros metabolitos o actividades de las mismas, resulta fundamental tomar en cuenta además los posibles usos que se podría dar a las mismas obteniendo así beneficios no solo para la salud sino económicas. 9

Capitulo II

2. Marco Teórico

2.1. Antecedentes

Según, García Carlos en su trabajo titulado: LA FAMILIA ASTERACEAE EN EL PARQUE NACIONAL LOS MÁRMOLES, HIDALGO, MÉXICO, señala que: “La familia Asteraceae o Compositae, constituye el grupo vegetal más diverso de plantas vasculares sobre el planeta; su distribución es prácticamente cosmopolita y es una de las familias más comunes en la mayor parte de los hábitats. Asteraceae representa un conjunto natural, con un número elevado de especies y amplia variación en cuanto a formas de vida, estructura floral, mecanismos de polinización y dispersión de semillas. Sus miembros son fácilmente reconocidos por sus inflorescencias dispuestas en capítulos, sus flores gamopétalas y por lo general pentámeras, cáliz modificado en un vilano, estambres singenésicos y el ovario ínfero bicarpelar que deriva en una cipsela.” (García, 2014)

La riqueza de la familia a nivel mundial se estima entre 1,500 y 1,700 géneros y entre 24,000 y 30,000 especies con centros de diversificación importantes en la región del Mediterráneo en el Viejo Mundo, la región del Cabo en África, Australia, México y la Cordillera de los Andes en Sudamérica. En el caso particular en américa del sur, mencionan la existencia de 361 géneros y 3,012 especies; es decir la concentración más cuantiosa de este grupo de plantas de todos los países del mundo. (García, 2014)

Los andes se encuentran dentro de la región neo tropical, caracterizada por la presencia de una serie de hábitats, notables por la variedad de medios naturales con un rico mosaico de climas, que han hecho de América del Sur un lugar privilegiado para la diversidad de plantas y animales. (Romo, 2010)

El Ecuador posee una gran diversidad biológica y es considerado uno de los 17 países megadiversos del mundo (Jørgensen & S. León-Yánez, 1999), ésta gran biodiversidad se debe a la posición geográfica y la presencia de la cordillera de los Andes que determinan la existencia de una enorme variedad de bosques húmedos en la Amazonia, ecosistemas secos en el sur del país cálidas playas del Pacífico, y las nieves eternas de los volcanes (Vallejo Páez, 2007). Gracias a esto contamos con una extensa

10 variabilidad de plantas entre las que se incluyen medicinales nativas e introducidas; que son valiosos materiales para la industria farmacéutica. (Buitrón, 1999)

En el país se determinó la existencia de 5 172 plantas útiles, de las cuales 3 118 son utilizadas de forma medicinal. Las plantas de la Sierra son las más conocidas y demandadas; un ejemplo de esto es el mercado de Ambato donde se acopian, distribuyen y comercializan 245 plantas medicinales que corresponde a especies nativas de los Andes Suramericanos. (Buitrón, 1999)

Las investigaciones señaladas a continuación hacen referencia a estudios realizados sobre los métodos de extracción, identificación de metabolitos secundarios de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, así como también sobre estudios acerca de su actividad antioxidante. (Vera, 2008)

El género Ambrosia posee una gran plasticidad fisiológica, misma que le permite adaptarse a prácticamente cualquier condición ambiental, todas las especies de este género están caracterizadas por tener un alto contenido de lactonas sesquiterpénicas y otros componentes, las cuales poseen actividad antibacterial, citotóxica y antifúngica (Parkhomenko et al., 2006). Dicha plasticidad puede explicarse, por lo menos en parte, por los metabolitos secundarios producidos por las especies de este género. (Vera, 2008)

A.arborecens Milller es un arbusto que crece en el Ecuador. Infusiones hechas a partir de las hojas de esta planta son utilizadas en la medicina popular ecuatoriana y contra insectos. De acuerdo a la investigación bibliográfica realizada previamente, existen muchas publicaciones acerca del género Ambrosia, sin embargo ningún reporte específico de esta planta en particular, esta es la razón por la cual fue escogida para llevar a cabo un estudio químico y biológico. (Guauque et al., 2010)

Según, Guauque María del Pilar, es su trabajo titulado como Detección de metabolitos secundarios en Ambrosia peruviana Willd y determinación de la actividad antibacteriana y antihelmíntica, esta señala que “Ambrosia peruviana Willd, conocida como Altamisa, pertenece a la familia Asteraceae, orden Asterales, ha sido reportada por la medicina tradicional con potencial antibacteriano, antiparasitario, emoliente, emenagogo, analgésico, entre otros. En el departamento de Antioquia en Colombia se ha usado la planta tradicionalmente en infusiones o bebidas para tratar infecciones, artritis, cólicos y regular el ciclo menstrual. Se identificó la presencia de alcaloides, glucósidos

11 cardiotónicos, quinonas, flavonoides, carbohidratos, taninos y saponinas. La concentración letal media para el extracto etanólico seco fue 64,2 μg/ml, mientras que para el extracto acuoso fue de 840,4 μg/ml. Los extractos no presentaron actividad antibacteriana”. (Guauque et al., 2010)

La tamización fitoquímica concuerda con lo reportado previamente, especialmente en lo que se refiere a alcaloides, glucósidos cardiotónicos, taninos y saponinas. Sobresale la presencia de lactonas sesquiterpénicas, lo que está de acuerdo con trabajos reportados previamente. Estos compuestos han sido ampliamente identificados y elucidados como componentes importantes de A. peruviana. (Guauque et al., 2010)

Debido a que se registra una concentración diez veces superior de CL50 en el extracto acuoso, con respecto al mismo parámetro evaluado para el extracto etanólico de A.peruviana sobre Artemia salina, se proponen los metabolitos no comunes a los dos extractos evaluados (alcaloides y saponinas) como principales responsables de la actividad citotóxica de A. peruviana. (Satou et al., 2005)

La fracción que contiene alcaloides (tipo indol) presenta el mejor comportamiento frente a los parásitos adultos. Es conocido que alcaloides como la Spiganthina de tipo rianodina pueden interaccionar con el canal Ca+2, al unir rianodina en lugar de glutamato para formar una unión irreversible que permite la contracción sostenida de los músculos esqueléticos y la parálisis característica., los alcaloides de tipo β-carbolina son nematocidas y poseen baja citotoxicidad, lo que los constituye en posibles fármacos. (Satou et al., 2005)

Dosis altas en la infusión o la decocción pueden producir nausea, vómito, diarrea y efecto depresivo del sistema nervioso central. Contiene Pseudogunianolido: Peruvinina Psilostachyina C., además contiene Alcaloides, Esteroles, Flavonoides y Taninos en cantidades moderadas, en cantidades escasas tenemos 12 Saponinas; no presenta Cumarinas, Cardiotónicos, Sesquiterpenoquinonas, Aceites fijos y esenciales. (Hinojosa & Moreno, 2013)

Según, Delfino, S. (2005), en su trabajo titulado como EFECTO DE TAGETES SPP. SOBRE DOS ÁFIDOS PLAGAS DE LACTUCA SATIVA (L.), señala que “Gran variedad de reportes en cuanto a otras especies del género Ambrosia presentan una amplia gama de sesquiterpenos estructuralmente correlacionados, además de otros metabolitos a

12 los cuales se les ha comprobado la actividad antioxidante en Ambrosia artemisiifolia L., antiepiléptica en Ambrosia paniculata Michx, antimicrobiana en A. artemisiifolia y Ambrosia trifida L. En cuanto al potencial biológico de extractos y componentes de A. peruviana, mediante pruebas in vitro se ha evaluado la acción citotóxica, antiviral, antibacteriana, antihelmíntica, antimicótica, además del efecto alelopático e inhibitorio de la germinación de esporas de Cladosporium herbarium (Pers.)” (Delfino, 2005)

Según, Barrera Roca, L. (2009) en su trabajo titulado como CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y TAMIZAJE FITOQUÍMICO DE LA ESPECIE Tagetes erecta Lin, este señala que “La presencia de diferentes familias de compuestos detectadas en el tamizaje fitoquímico de los extractos alcohólico y acuoso. Se detectaron alcaloides en los extractos de la flor, las hojas, las raíces y de los tallos con ambos solventes. En el caso del extracto acuoso se indica la presencia de alcaloides cuaternarios y óxidos de aminas libres. La reacción de Lieberman-Burchardt para triterpenos y esteroides con núcleos de androstano insaturado en el anillo B y con dobles enlaces en los carbonos 5 y 6, por las coloraciones oscuras, evidencia cantidades importantes de esos compuestos. Las reacciones transitan por el color azul-verde para esteroides, y púrpura para los triterpenos. A los triterpenos y esteroides se les atribuyen propiedades de contribuir a la protección de los tejidos pulmonares, y de activar los sistemas detoxificantes”. (Roca et al., 2009)

Las plantas del género Tagetes (Familia Asteraceae), conocidas comúnmente como clavelón, maravilla, ruda o estragón, tienen una distribución mundial y comprenden aproximadamente 60 especies, siendo las más comunes T. minuta, T. erecta, T. patula, T. tenuifolia y T. lucida (Vasudevan, Kashyap, & Sharma, 1997). Por las características de sus flores tienen usos ornamentales, por su olor anisado sirven como especies en las comidas. En la medicina folklórica, infusiones y extractos se utilizan como antihelmínticos, antiespasmódicos, diuréticos, antidepresivos, antimaláricos y antiinflamatorios. (De las Heras et al., 1998)

En conjunto, los estudios mostraron el potencial de Tagetes spp. como alternativas a una amplia variedad de las drogas Los múltiples usos alternativos de Tagetes spp. resultó en el agotamiento de las fuentes naturales debido a su extractos y metabolitos específicos tienen una demanda tan alta. Así, el cultivo necesita cultivo sistemático en zonas agroclimáticas tropicales, subtropicales y templadas en todo el mundo (Khalil et

13 al., 2012), evidenciando que la mayoría de los Tagetes spp. podrían cultivarse en condiciones ambientales diferentes de los tipos del género. (Marotti, Piccaglia, Biavati, & Marotti, 2004)

Tradicionalmente, diferentes partes de algunas especies de etiquetas se utilizan como remedios para tratar diferentes tipos de salud. Problemas en todo el mundo. En Bangladesh, las hojas de T. patula se aplica en forúnculos y carbuncos. Se utiliza contra los problemas renales, dolores musculares y pilas. Su jugo se prescribe para el dolor de oído y oftalmia (Rahman, 2013). En Pakistán, tanto las hojas como las flores se recolectan y se usan como antipiréticos (Parvaiz, 2014).

Se registra otros usos para T. filifolia en México, donde el tribu Pima prescribe una taza de té. Preparado con sus ramas para el dolor de estómago (Moreno-Salazar, Robles-Zepeda, & Johnson, 2008) ,en Argentina, donde se recomienda para Heridas infectadas (Svetaz, y otros, 2010). Las heridas y las llagas también se curan con las decocciones de hojas y flores o infusiones. de T. multiflora (Alonso & Desmarchelier, 2005), mientras que en Kenia (Njoroge & Bussmann, 2007) se utiliza una aplicación tópica de su savia. (Rahman et al., 2016)

En Argentina, Bolivia, Brasil, Paraguay, y Perú, las infusiones y decocciones de T. multiflora son consideradas como digestivos, aperitivos, colagogos, carminativos, sedantes gástricos, antidiarreicos y vermífugos. Se administran contra los alimentos. Envenenamiento como antiparasitarios y para curar dispepsia, gastritis, cólico intestinal y flatulencia, mientras que se recomiendan las hojas masticadas para eliminar el mal aliento. La decocción de la hoja se prepara como un expectorante o un antiabortivo, y también se utiliza para reducir la secreción de leche. La infusión regula el flujo menstrual y se utiliza para lavados vaginales en casos de enfermedades infectadas. Toda la planta es un febrífugo y diurético (Alonso & Desmarchelier, 2005).

Las infusiones de hojas y flores de T. multiflora ahora están incorporadas en el hogar. Medicamentos de los descendientes de inmigrantes polacos en Argentina como profilaxis después del parto (Kujawska & Hilgert, 2014), (Ijaz et al., 2016) documentan nuevos usos paquistaníes de hojas de T. minuta contra la tos y trastornos estomacales. Además, su uso contra la tos de los niños (tres cucharaditas de decocción tres veces) por día durante una semana) y el dolor de cabeza está arraigado en el sur de Uganda tanto en el nuevo como en el viejo mundo. (Karimian, Kavoosi, & Amirghofran, 2014) 14

Las especies de Tagetes originalmente se usaron como una fuente de aceite esencial (extraído de hojas, tallos y flores) para el sabor en las industrias alimentarias. Los polvos y extractos son ricos en el carotenoide amarillo anaranjado y se usan como colorante alimentario aderezos productos de panadería, confitería, lácteos, helados, yogur, etc. Jugo de cítricos, mostaza y como colorante en alimentos para aves. (Karimian et al., 2014)

Según, Parastoo, K., Gholamreza, K. and Zahra, A., (2014) en su trabajo titulado como Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Tagetes minuta essential oil in activated macrophages, este señala que “Suico o Huacatay también se usa ampliamente con fines medicinales como condimento y té de hierbas en una amplia variedad de campos en su región nativa y como un popular recurso popular tradicional y en la terapia complementaria y médica. (Karimian et al., 2014)

T. minuta tiene varios beneficios médicos como remedios para resfriados, inflamaciones respiratorias, problemas estomacales, antiespasmódicos, antiparasitarios, antisépticos, insecticidas y sedantes. Se utiliza para infecciones de pecho, tos y catarro, dilata los bronquios, facilita el flujo de moco y desaloja la congestión y puede usarse en casos de infecciones de la piel. También tiene un efecto curativo en heridas, cortes, callos y juanetes. Sin embargo, tales prácticas se basan en gran medida en el folclore y la formación de la medicina tradicional en lugar de en la investigación basada en la evidencia”. (Karimian et al., 2014)

Tagetes multiflora Kunth, es una especie vegetal que crece generalmente en zonas andinas y es conocida como “chinche”. Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar las actividades antimicrobiana, antioxidante y citotoxicidad de los extractos etanólico y acuoso de Tagetes multiflora Kunth. La actividad antioxidante se evaluó por el método de DPPH y la actividad citotóxica se evaluó mediante el bioensayo de citotoxicidad en Artemia salina (CYTED). El extracto etanólico presentó un IC50 de 60,93 µg/mL + 0,40; y el extracto acuoso 40,42 µg/mL + 0,24. El extracto etanólico presentó un CL50 de 35,568 µg/mL y el extracto acuoso 386,048 µg/mL. (Villafuerte, 2017)

2.2. Fundamento teórico

2.2.1 Familia Asterácea.

Las Asteráceas incluyen gran cantidad de especies útiles (medicinales, agrícolas, industriales, etc.). Algunas han sido domesticadas y cultivadas desde la Antigüedad y otras conforman vastas extensiones de vegetación natural, determinando la fisonomía de numerosos paisajes. Su uso etnobotánico ha ayudado a sustentar numerosos pueblos. Hoy, unos 40 géneros de Asteráceas son relevantes en alimentación humana y animal, fuentes de aceites fijos, aceites esenciales, forraje, miel y polen, edulcorantes, especias, colorantes, insecticidas, caucho, madera, leña o celulosa. Otras son importantes malezas y/o plantas tóxicas para el hombre y el ganado, algunas causan alergia y otras resultan ornamentales. En terapéutica son usados gran número de metabolitos secundarios sintetizados por Asteráceas. (Vitto & Petenatti, 2001)

La Familia de plantas Asteraceae corresponde al Orden Asterales, Suborden Asteridae, y está caracterizada por sus inflorescencias racimosas en capítulos, con flores individuales epíginas rodeadas de 1-varias hileras de brácteas involucrales, sobre el receptáculo común en que remata el escapo o rama florífera. Por dicho carácter es considerada un grupo natural y uniforme, altamente evolucionado, y recibe el nombre alternativo Compositae. (Vitto & Petenatti, 2001)

Los crisantemos, margaritas, dalias, girasoles, cardos, la achicoria y la lechuga son algunos de los representantes de la familia Asteraceae, Compositae, o asteráceas o compuestas en un lenguaje coloquial. Las asteráceas comprenden más de 1700 géneros y unas 24.000-30.000 especies distribuidas por todo el Introducción mundo, excepto en la Antártida, que incluyen desde pequeñas hierbas de 1 cm de altura hasta árboles de más de 30 m. Las asteráceas se reconocen por su estructura reproductiva, el capítulo donde las flores se disponen en forma sésil sobre un receptáculo ensanchado. (Katinas, 2007)

El conocimiento bioquímico del grupo ha aportado datos relevantes a la taxonomía y ha explicado o facilitado el empleo de las mismas en las actividades económicas. Ya Hegnauer (1964) estableció los caracteres fitoquímicos generales, sustentados y ampliados por Harborne (1977), Mabry & Bohlmann (1977), Seaman

(1982), Bohm & Stuessy (2001) y Aniszewski (2007). En general, el grupo está caracterizado por la presencia de ácidos iso- y clorogénico, isoflavonoides, lactonas sesquiterpénicas, alcoholes triterpénicos pentacíclicos, aceites esenciales (con predominio de terpenoides), alcaloides (especialmente pirrolizidínicos) y diversos derivados acetilénicos, mientras que carece de taninos verdaderos y de iridoides (Bohlmann, Burkhardt, & Zdero, 1987). La acumulación de ciertos metabolitos primarios y secundarios determina la utilidad o aplicación de las plantas.

La síntesis de glúcidos en último término conduce a la formación de fructanos del tipo inulina (Hegnauer., 1964) acumulados en órganos subterráneos (Krebs, 2001) y semillas; son la principal reserva hidrocarbonada, de gran digestibilidad y reemplazan el almidón. La síntesis de ciclitoles también caracteriza a las Asteráceas, especialmente L- inositol y su isómero esciloinositol (PLOUVIER, 1963).

Los metabolitos secundarios aislados de Asteráceas son muy variados. Algunos flavonoides y aceites volátiles (con di- y triterpenos) son comunes a casi todas las especies y 2 grupos de sustancias son “marcadores quimiotaxonómicos” de la Familia: las lactonas sesquiterpénicas y los compuestos. En general estas plantas carecen de alcaloides, salvo los de núcleo pirrolizidínicos. Finalmente, es llamativa la ausencia de iridoides, aminoácidos no proteicos y taninos verdaderos. (Vitto & Petenatti, 2001)

2.2.2 Ambrosia arborescens

2.2.2.1 Características

 Las especies de Ambrosia son hierbas o arbustos poco altos, aunque en alguna especie alcanzan los 4 m.

 Tienen tallos erectos e híspidos, que se presentan en matas densas de hasta medio metro de diámetro, con ramificaciones basales.

 La raíz tiende a ser cónica y profunda, dificultando la erradicación; algunas son rizomáticas.

 Las hojas son bipinatífidas, lobuladas, con pecíolos alados, verde grisáceo a plateadas por haz y envés, opuestas en la base y alternas en las ramas altas. 17

 Las plantas son monoicas, produciendo inflorescencias en forma de espiga apoyada en brácteas fusionadas para las flores masculinas, de color verde amarillento, forma discoidal y unos 3 mm de diámetro.

 Las flores femeninas son de color blanquecino, simples, axilares, ubicadas más abajo que las masculinas en el tallo; carecen de papo.

 La fertilización se produce por el viento, difundiéndose los granos de polen —de los que una única planta puede producir hasta 1.000 millones en una temporada— sobre todo en la estación húmeda y a mediados de verano.

 El fruto es un aqueno recubierto de espinas, de forma ovoide, que contiene una única semilla pequeña de color pardo y forma de punta de flecha.

(Saltos, 2008)

2.2.2.2 Morfología

 Arbustos, sufrútices o hierbas; toda la planta con glándulas, aromática.

 Hojas alternas, pinnatidisectas y flores masculinas y femeninas en cabezuelas separadas a menudo en la misma planta.

 Cabezuelas masculinas en espigas o racimos terminales; involucro cupuliforme, brácteas lateralmente connatas; receptáculo con páleas.

 Flores masculinas modificadas, cáliz o vilano ausente, corola hialina, campanulada, 5-lobulada; estambres 5 alternado con los lóbulos de la corola; pistilodio reducido.

 Cabezuelas femeninas en grupos axilares en las hojas y sosteniendo los racimos masculinos; brácteas unidas y formando un receptáculo en forma de vaso; ápices de las brácteas espiniscentes, brácteas arregladas en varias formas o dispersas en el involucro durante la fructificación; páleas ausentes; una a pocas flores. Flores femeninas reducidas, perianto ausente, androceo ausente; ovario maduro obovado, estilo corto, estigma lobulado, superficies estigmáticas papilosas, exertas a través

de los ápices espinosos del involucro. Aquenios prismáticos, con pelos uniseriados, formando complejos con el involucro.

(Saltos, 2008)

 Es un arbusto de 1.5 - 2.5 m de altura, perenne, color verde cenizo, poco lignificado y glabro (sin pelos).

 Hojas: Simples, alternas, irregularmente divididas y pubescentes (bellosos) en ambas caras; color verde cenizo; ovaladas a redondo-ovales en su contorno t.otal; profundamente bipinnatisectas, provistas de estípulas foliáceo - sectadas de hasta 4 cm de longitud y de 2 - 4 mm de diámetro; pubescentes.

 Flores: Capítulos en racimos terminales numerosos, homógamos; los capítulos de flores masculinas dispuestas en las zonas apicales del racimo y con involucro de brácteas soldadas de unos 2 - 3 mm de longitud y las anteras levemente vigorosas, los capítulos de las flores femeninas en la parte basal de de 0.5 cm de longitud, con brácteas irregulares libres de 2-3 mm de longitud.

 Frutos: Son aquenios, glabros, de 0.5- 1 cm de longitud, con estilos persistentes.

(Cayán, 2009)

2.2.2.3 Taxonomía

Tabla N°1. Taxonomía de Ambrosia arborescens

Reino Plantae

Subreino Traqueofita/ Traqueobionta

Phylum/División Magnoliophyta

Sudivision Angiospermae

Clase Magnoliopsida (Dicotiledoneas)

Subclase Asteridae

Superorden Asteranae

Orden Asterales

Familia Asteraceae

Subfamilia: Asteroideae

Tribu Heliantheae

Genero Ambrosia

Especie Ambrosia arborescens

(Hernández, 2007)

Imagen N° 1: Especie Ambrosia Imagen N° 2: Especie Ambrosia

arborescens (altamisa). artemisiifolia

(Descourtilz M. E., 1821) (Kops, 1898)

2.2.2.4 Propiedades y usos

2.2.2.4.1 Medicinal

Usaban las hojas soasadas en cocimiento o ungüento graso como antiinflamatorio y antirreumático, en el tratamiento de calambres y aire, el jugo de las ramas para el tratamiento de las hemorroides, para dolores de estómago, para desinflamar los pies para el arrebato y como antiséptico. En los pueblos y caseríos aledaños a la sierra del Perú toda la planta es utilizada (hojas, tallos, raíces, semillas y flores), para el alivio de numerosas enfermedades. Se le utiliza como antitusígeno, antidiarreico y carminativo, para curar la tos bronquitis y asma; además, para preparar insecticidas, fumigaciones o sahumerios. Sus hojas secas y molidas se 3 dejan macerar en agua para usarlas como insecticida. (Terrones, 2014)

2.2.2.4.1.1 Cocimiento

Se recomiendan los baños con el cocimiento de las hojas y las fracciones de la tintura del marco para los dolores de tipo reumático. Las hojas previamente calentadas sobre brasas o el fuego, se usan en fricciones para aliviar dolores del reumatismo, los calambres y golpes de aire. El cocimiento de la raíz del marco actúa contra la epilepsia o “tuku uso”, los espasmos y la hidropesía. El cocimiento de las hojas en una botella de agua se usa en baños para aliviar el escozor y el ardor que provoca la alergia, la erisipela, y otras enfermedades de la piel. (Hinojosa & Moreno, 2013)

2.2.2.4.1.2 Cataplasma

Las hojas se usan para propiciar la labor de parto y aliviar los dolores en el parto y postparto, se emplean en bebida, emplastos para aumentar el flujo menstrual, dolor de 21 hígado, evitan la formación de lesiones internas producidas por golpes, llagas ulcerosas, verrugas, regular la presión arterial y combate la formación de abscesos. La planta macerada se usa como: antimicótico, anestésico, para el sarampión tratar granos, sarpullidos, caries, hemorroides y sarna, en Ecuador se le atribuyen efectos emenagogos, así como antisépticos y antiparasitarios intestinales. (Ayala Valarezo & Vásquez Villarreal, 2014)

2.2.2.4.2 Tóxico para otros microorganismos:

Insecticida y bactericida, esta última sobre todo frente a Sthaphylococcus aureus y sobre Candida albicans y más hongos de tipo patógeno gracias a la presencia de flavonoides y fenoles y sus derivados mencionados anteriormente. In vitro se ha encontrado que sus compuestos poseen actividad antibacteriana contra Bacillus subtilis, Micrococcus Oxford, Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis. (De la Torre, 2008)

Puede producir dermatitis de contacto. Controla plagas del tomate y del camote; es necesario hacer pruebas con esta especie vegetal para comprobar su eficacia. Las hojas y ramas se usan como insecticidas, para eliminar principalmente pulgas, piojos, moscos y chinches. (De la Torre, 2008)

2.2.2.4.3 Ambiental:

La planta se aprovecha en sistemas agroforestales, como cerca viva.

2.2.2.5 Composición y principios activos.

Mediante la tamización fitoquímica de A. peruviana, se determinó que la especie posee alcaloides, flavonoides, quinonas, taninos, saponinas, cumarinas, lactonas terpénicas, glucósidos cardiotónicos y carbohidratos. No posee cumarinas volátiles, leucoantocianidinas, nafto antraquinonas. Siguiendo el fraccionamiento preliminar planteado por Sanabria, se logró la separación de las fases de alcaloides y acuosa. Debido a que el procedimiento de extracción de la fase de alcaloides es específico para estos metabolitos, sólo se sometió a las pruebas de identificación de alcaloides, lo cual dio como resultado la presencia abundante (+++) del metabolito en los tres ensayos (Dragendorff, Mayer y Bouchardart). (Guauque et al., 2010)

2.2.3 Tagetes multiflora.

2.2.3.1 Características

Hierba anual poco ramificada en la parte superior. Hojas opuestas o alternas, pinatisectas, de 1 a 4 cm de largo. Flores interiores infundibuliformes, hermafroditas. Flores exteriores tubulosas, femeninas. Inflorescencia en capítulo con brácteas soldadas en un tubo de color morado oscuro. Frutos secos, negros, con una semilla en su interior. Ambiente primario: Altiplano, Desierto costero, Precordillera. (Herreros & Kuzmicic, 2015)

2.2.3.2 Morfología

Hierbas anuales, de 4-20cm de alto, con tallos ramificados, divaricados, ascendentes o erectos, laxamente hojosos, glabros. Hojas opuestas, cortamente pecioladas; láminas de contorno elíptico, de 1-3 x 0,6-2cm, con 2-4 pares de segmentos generalmente, u obovados, de 3-10cm x cada una. 1,5mm, margen aserrado, glabros, con glándulas oleíferas circulares. (Charles & Heiser, 1962)

Capítulos heterógamos, radiados, isomorfos, numerosos, dispuestas en cimas laxas, pedúnculos de 5-15mm de largo. Involucro cilíndrico, de 9-11(-20) x 3-4mm; filarias 5, lineares o angostamente oblongos, rojizo violáceos, glabros soldados entre sí, con el ápice libre, agudo, de 0,7mm de largo, glabros en el margen, con glándulas oleíferas lineales. (Aagesen, Deginami, Nomdedeu, & Zanotti, 2013)

Flores dimorfas, las del margen 3-5, pistiladas, con corola ligulada, de 4,4-6mm de largo, amarilla, pubescente, lígula orbicular, cada una. 0,8 x 1 mm, entero; flores del centro 6-10, con corola tubulosa, de 4-6mm de largo, amarilla, pubescente, 5-lobada, lóbulos cada una 0,5mm de largo. Aquenios linear, de 4-7 x cada una 0,9 mm, negros, pubescentes. Papus formado por 5-12 páleas libres, fácilmente caducas, 3-5aristiformes o algunas más anchas, de 5-7mm de largo, margen fimbriado y las restantes escuamiformes, más cortas, cada una 0,5 mm de largo. (Aagesen et al., 2013)

2.2.3.3 Taxonomía.

Tabla N°2. Taxonomía de Tagetes multiflora

Reino Plantae

Subreino/Filo Traqueofita/Traqueobionta

Phylum/División Magnoliophyta

Subdivisión/Subfilo Angiospermae

Clase Equisetopsida / Magnoliopsida

Subclase Magnoliidae

Superorden Asteranae

Orden Asterales

Familia Asteraceae

Subfamilia: Asteroideae

Tribu Tageteae

Genero Tagetes L.

Especie Tagetes multiflora K

(Hernández, 2007)

Imagen N°3. Especie Tagetes multiflora Kunth. Imagen N°4. Especie Tagetes multiflora Kunth. (Charles B. Heiser, Jr, 1962) (Neher, 1963)

2.2.3.4 Propiedades y usos.

2.2.3.4.1 Medicinal

Los Tagetes multiflora poseen propiedades digestivas se emplean en malestares de la vesícula y la bilis, dolores estomacales, carminativo (gases), como purgante, parar la hinchazón, ayuda al tacto urinario sobretodo en el mal de orina. (Zolla, 2009)

2.2.3.4.2 Cocimiento

El tzinso también puede ser usado como pesticida (nematicida). Se le atribuyen propiedades medicinales como carminativo y antiabortivo. La infusión de sus hojas se usa para aliviar los dolores gástricos y la decocción de sus flores y hojas frescas para aliviar los catarros y bronquitis. De sus hojas se extrae un aceite esencial utilizado en perfumería. (Soule, 1993)

2.2.3.4.3 Cataplasma

Las hojas recalentadas sobre las brasas se aplican como cataplasma para deshinchar contusiones, las hojas trituradas y aplicadas sobre las superficies inflamadas o ulceradas ejercen efecto antiséptico y antiinflamatorio, en cataplasma es remedio para dolor de espalda, gota, tortícolis y contusiones, además de aplicarse como cataplasma las hojas, incienso y grasa. (Hinojosa & Moreno, 2013)

2.2.3.4.4 Gastronómico

Se usa en la gastronomía peruana como condimento en la preparación de comidas, tales como anticucho, guisos y asados. Para la preparación de una salsa de huacatay se emplean únicamente las hojas frescas, arrancadas a mano y sin tallos. Las hojas pueden ser molidas en mortero o batán o licuadas con aceite, ají y otros ingredientes para formar una masa similar al pesto, o preparada con queso fresco, leche y nueces. (Cutti, 1999)

Uso comestible como condimento en la elaboración de comidas por su sabor picante. (Zolla, 2009)

2.2.3.4.5 Tóxico para otros microorganismos

Los aceites esenciales de hojas de Schinus molle y Tagetes multiflora podrían ser utilizados en el control de Pediculus humanus capitis. El huacatay también puede ser usado como pesticida (nematicida). Se le atribuyen propiedades medicinales como digestivo, carminativo y antiabortivo. La infusión de sus hojas se usa para aliviar los dolores gástricos y la decocción de sus flores y hojas frescas para aliviar los catarros y bronquitis. De sus hojas se extrae un aceite esencial utilizado en perfumería y aromaterapia. (Gútierrez, 2009)

Las plantas presentan una gran variedad de metabolitos secundarios, como por ejemplo taninos, alcaloides, terpenoides, y flavonoides, que presentan propiedades antimicrobianas in vitro. Los fenoles simples y ácidos fenólicos son los bioactivos más simples, sus estructuras consisten en un solo anillo fenólico sustituido. El ácido cinámico y cafeico son representantes 15 comunes de un amplio grupo de compuestos de derivados de fenilpropano que presentan el estado de oxidación más alto, las hierbas comunes como el estragón y el tomillo contienen ácido cafeico, que es eficaz contra los virus, bacterias y hongos. Catecol y pirogalol ambos son fenoles hidroxilados, que han demostrado ser tóxicos para los microorganismos, el primero presenta dos grupos -OH y el segundo tiene tres. (Villafuerte, 2017)

Los mecanismos responsables de la toxicidad fenólica a microorganismos, incluyen la inhibición de la enzima betaglucano - sintasa por los compuestos oxidados, posiblemente a través de la reacción con grupos sulfhidrilo o a través de interacciones no específicas con proteínas. Los aceites esenciales son a menudo citados como antimicrobianos, un ejemplo es el eugenol, representante característico que se encuentra en el aceite de clavo. Este es considerado como un bacteriostático contra los hongos y las bacterias. (Villafuerte, 2017)

El extracto clorofórmico 0,125g/L de esta planta demuestra actividad con Candida albicans, actividad antiespasmódica, antiviral contra virus de Ranikhet, actividad insecticida contra Musca doméstica y Tribolium castaneum, actividad antimicrobiana contra Bacillus subtilis y actividad de feromonas para Aspiculurus tetráptera, Dacus dorsalis. (Gupta, 1995)

2.2.3.5 Composición y principios activos.

Investigaciones recientes han demostrado la presencia de cuatro lactonas sesquiterpénicas en las hojas: damsina, coronofilina, psilostaquina, y psilostaquina C. El aceite esencial es rico en monoterpenos y sesquiterpenos oxigenados y algunos hidrocarburos sesquiterpénicas. Los componentes más abundantes son el isoborneol, curcumeno, cadimeno, corotol y fameseno. (Hinojosa & Moreno, 2013)

Contiene Pseudogunianolido: Peruvinina Psilostachyina C., además contiene Alcaloides, Esteroles, Flavonoides y Taninos en cantidades moderadas, en cantidades escasas tenemos 12 Saponinas; no presenta Cumarinas, Cardiotónicos, Sesquiterpenoquinonas, Aceites fijos y esenciales. (Hinojosa & Moreno, 2013)

Un estudio de aceites esenciales de Tagetes multiflora K, por (CG/EM), se identificó los siguientes componentes: Z beta Ocimeno (29,25%), E beta Ocimeno 14 (23,45%), Limoneno (12%), E Ocimenona (11,85%), Z Ocimenona (5,28%), alfa Terpineno (2,92%), Z Tagetona (1,75%) al 86%. (Villafuerte, 2017)

Además, en otro estudio realizado también en los aceites esenciales de Tagetes multiflora Kunth se reportó como componentes mayoritarios: (Z) Tagetona (47%), (E) Ocimenona (17%), (Z) Beta Ocimeno (13%), y Dihidrotagetona (8%). (Pichette et al., 2005)

Hasta la fecha, dos alcaloides se encuentran en este género Tagetes L, en Tagetes patula, Jafrine es un inestable inherente y alcaloide tetrahidro beta carbolina estructuralmente nuevo en Tagetes erecta. Liu, Su y Wang (2007) informaron que alcaloides con diferente polaridad efectivamente existían en el raíces de T. erecta. Sin embargo, los componentes químicos no han sido investigados, y la investigación adicional es necesaria. (Li-wei, Juan, Huan-yang, & Yan-ping, 2012)

2.2.4 Metabolismo en plantas.

El metabolismo de las plantas se define como el complejo de eventos físicos y químicos de la fotosíntesis, la respiración y la síntesis y degradación de compuestos 28 orgánicos. La fotosíntesis produce los sustratos para la respiración y los compuestos orgánicos de partida utilizados como bloques de construcción para la biosíntesis posterior de ácidos nucleicos, aminoácidos y proteínas, carbohidratos y ácidos orgánicos, lípidos y productos naturales. El metabolismo secundario de la planta produce productos que ayudan en el crecimiento y desarrollo de las plantas, pero no se requieren para que la planta sobreviva. (Dhekney, 2018)

El metabolismo secundario facilita el metabolismo primario en las plantas. Este metabolismo primario consiste en reacciones químicas que permiten que la planta viva. Para que las plantas se mantengan saludables, el metabolismo secundario desempeña un papel primordial para que todos los sistemas de las plantas funcionen correctamente. Un papel común de los metabolitos secundarios en las plantas son los mecanismos de defensa. Se usan para combatir herbívoros, plagas y patógenos. Los metabolitos secundarios se utilizan en la actividad anti-alimentación, la toxicidad o que actúan como precursores de los sistemas de defensa física. El metabolismo primario en una planta comprende todas las vías metabólicas que son esenciales para la supervivencia de la planta. (Dhekney, 2018)

Los metabolitos primarios son compuestos que están directamente involucrados en el crecimiento y desarrollo de una planta, mientras que los metabolitos secundarios son compuestos producidos en otras vías metabólicas que, aunque importantes, no son esenciales para el funcionamiento de la planta. Sin embargo, los metabolitos secundarios de las plantas son útiles a largo plazo, a menudo con fines de defensa, y le dan a las plantas características como el color. Los metabolitos secundarios de la planta también se utilizan en la señalización y regulación de las vías metabólicas primarias. Las hormonas vegetales, que son metabolitos secundarios, se usan a menudo para regular la actividad metabólica dentro de las células y supervisar el desarrollo general de la planta. (Dhekney, 2018)

2.2.4.1 Metabolitos Secundarios

Las plantas producen una amplia gama de compuestos orgánicos que no están involucrados en el metabolismo primario, es decir, que no poseen roles reconocidos en los procesos de asimilación, respiración, transporte y diferenciación y que también 29 difieren de los metabolitos primarios, por tener una distribución restringida en el reino vegetal, lo que significa que un producto secundario en particular, el metabolito secundario, generalmente se halla solo en una especie o en un grupo de especies taxonómicamente relacionadas. (Sierra & colaboradores, 2004)

A través del tiempo, el hombre ha hecho uso de los metabolitos secundarios con diversos propósitos, entre los que pueden mencionarse el uso como saborizantes, colorantes, fragancias, insecticidas, drogas medicinales y adictivas, y cosméticos. Los metabolitos secundarios que contienen nitrógeno incluyen a los alcaloides, aminoácidos, aminas, glucósidos cianogénicos y glucosinolatos. Los no nitrogenados se dividen en terpenoides, poliacetilenos, policétidos y fenilpropanoides.

(Sierra & colaboradores, 2004)

2.2.4.1.1 Alcaloides

“Un compuesto orgánico de origen natural (generalmente vegetal), nitrogenado (N se encuentra generalmente intracíclico), derivados generalmente de aminoácidos, carácter más o menos básico, distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas y que responden a reacciones comunes de precipitación. (Acosta, 2008)

Los alcaloides son moléculas que contienen átomos de N y C en su estructura molecular, la cual generalmente forma anillos complejos. El término alcaloide, que fue propuesto por primera vez por el farmacéutico W. Meissner en 1819, significa “similar al álcali”. La palabra álcali se refiere a la capacidad de una molécula para absorber iones de hidrógeno (protones) provenientes de un ácido, se encuentran como moléculas individuales, por lo que son pequeñas y pueden absorber iones de hidrógeno, convirtiéndolos en una base. (Briceño, n.d.)

Los alcaloides son un grupo de moléculas con una incidencia relativamente grande en la naturaleza en todo el mundo. Son sustancias químicas y biomoléculas

Los alcaloides son producidos por algunos seres vivos, particularmente por las plantas. Sin embargo, no está clara la función que cumplen estas moléculas en los vegetales. Independientemente de su papel en las plantas, muchos alcaloides tienen usos

30 en medicina para los humanos. Los analgésicos derivados de la planta de la adormidera, como la morfina, existen desde 1805. Otro ejemplo es la quinina antipalúdica, que ha sido utilizada por las tribus del Amazonas por más de 400 años. (Briceño, n.d.)

2.2.4.1.1.1 Estructura

Las estructuras químicas de los alcaloides son extremadamente variables. Generalmente, un alcaloide contiene al menos un átomo de nitrógeno en una estructura de tipo amina; es decir, una derivada de amoníaco reemplazando átomos de hidrógeno con grupos hidrógeno-carbono llamados hidrocarburos.

Este u otro átomo de nitrógeno puede ser activo como una base en reacciones ácido-base. El nombre alcaloide se aplicó originalmente a estas sustancias porque, al igual que los álcalis inorgánicos, reaccionan con los ácidos para formar sales.

La mayoría de los alcaloides tienen uno o más de sus átomos de nitrógeno como parte de un anillo de átomos, frecuentemente llamado sistema cíclico.

(Briceño, n.d.)

2.2.4.1.1.2 Biosíntesis

Los aminoácidos como precursores de los alcaloides, sufren una serie de transformaciones típicas que pueden resumirse como:

1. Formación de bases de Schiff ( genera enlaces C triple enlace N)

2. Condensación de Mannich (genera enlaces C-C-N), una variante de esta reacción es la de Pictet - Spengler, que forma heterociclos.

3. Isomerización

4. Hidrogenación del grupo imino y deshidrogenacion del grupo amino

5. Oxidación a carbinolaminas o a amidas

6. Acoplamiento oxidativo C-C Y C-O

(Marcano & Hasegawa, 2002)

Le siguen además reacciones de condensación aldólica de Claisen y de Michael que conducen a la formación del esqueleto de carbono o parte de él. La reacción de trasnominación de los aminoácidos precursores procuran parte del esqueleto, la coenzima responsable se presenta en sus dos formas activas: fosfato de piridoxal y piridoxamina, una segunda manera de transformación de alfa aminoácidos a alfa cetoácidos lo constituye la deshidrogenación seguida por hidrólisis del grupo imino y el sistema enzimático responsable es la flavina-adenina dinucléotico: FAD. También pueden ocurrir desaminaciones no oxidativas, tal es el caso de la transformación de la fenilalanina en ácido cinámico. (Marcano & Hasegawa, 2002)

2.2.4.1.1.2.1 Biosíntesis de alcaloides tropánicos y nicotínicos

En este grupo de alcaloides la biosíntesis se realiza a partir de los compuestos L- Arginina y Ornitina. Estos sufren un proceso de descarboxilación mediado por sus respectivas enzimas: arginina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa. (Briceño, n.d.)

El producto de estas reacciones son moléculas de putrecina. Luego de otros pasos, que incluyen la transferencia de grupos metilo, se producen los derivados nicotínicos (como la nicotina) y tropánicos (como la atropina y la escopolamina). (Briceño, n.d.)

2.2.4.1.1.2.2 Biosíntesis de alcaloides de bencilisoquinolina

La biosíntesis de ABI puede agruparse artificialmente en tres intervalos a) la producción del precursor central de todos los ABI, S-norcoclaurina, desde dos moléculas de L-tirosina, b) la transformación de S-norcoclaurina a S-reticulina, el intermediario principal de diversificación de la ruta y c) las rutas de diversificación que dan origen a los diferentes tipos de ABI. Las dos primeras partes que forman el núcleo de la biosíntesis están bastante bien caracterizadas a nivel proteómico y genómico, sin embargo, hay 4 enzimas que aún no han sido aisladas y/o caracterizadas de plantas productoras de ABI aunque se ha reconocido su actividad catalítica. Dependiendo de la ruta de diversificación se necesitan entre diez y veinte enzimas para obtener un alcaloide como producto final. (De la Cruz, 2012)

2.2.4.1.1.2.3 Biosíntesis de alcaloides indólicos terpénicos

Se sintetiza a partir de dos rutas: una que parte del L-triptófano y otra a partir del geraniol. Los productos de estas rutas son la triptamina y la secolaganina, estas moléculas son el sustrato de la enzima estrectosidina sintasa, que cataliza la síntesis de la estrictosidina. A partir de la estrectosidina se producen los distintos alcaloides indólicos terpénicos, como la ajmalicina, la catarantina, la serpentina y la vinblastina. (Briceño, n.d.)

2.2.4.1.1.3 Clasificación según su origen biosintético

Debido a su diversidad y complejidad estructural, los alcaloides pueden clasificarse de diferentes maneras: 33

De acuerdo a las características de esta definición, algunos autores han dividido a los alcaloides en cuatro clases.

Alcaloides Verdaderos cumplen estrictamente con las características de la definición de alcaloide: son formados a partir de aminoácidos, tienen siempre un nitrógeno intracíclico, son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal.

Protoalcaloides son aminas simples con nitrógeno extracíclico, de carácter básico y son productos del metabolismo de los aminoácidos.

Pseudoalcaloides presentan algunas de las características de la definición de alcaloide, pero no son derivados de aminoácidos.

(Acosta, 2008)

Alcaloides imperfectos son derivados de bases púricas, no precipitan con los reactivos específicos para alcaloides. No son alcaloides los aminoácidos, las betalaínas, los péptidos, los amino azúcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases como la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los alquil aminas de bajo peso molecular, su estado natural, los alcaloides son esencialmente sustancias presentes en todos los órganos de la planta, pueden encontrarse mayoritariamente en hojas (cocaína, nicotina, pilocarpina), en flores (escopolamina, atropina), en frutos (alcaloides del opio), en semilla (piperina, arecolina), en corteza (quinina), en la raíz (emetina). (Acosta, 2008)

Oros métodos de clasificación de los alcaloides incluyen:

Con base en su acción farmacológica: los alcaloides tienen acciones farmacológicas muy diversas, se sabe que son adrenérgicos, antibióticos, venenos, estimulantes, diuréticos y muchos otros. Sin embargo, las moléculas estructuralmente diversas pueden mostrar acciones farmacológicas similares, mientras que en ciertos casos la actividad podría ser idéntica para una estructura específica. Por lo tanto, es muy difícil clasificarlos sobre la única base de la acción farmacológica. (Mehta, 2012)

Según su taxonomía: según la fuente biológica de la que se obtienen, pero estas generalizaciones no funcionan con mayor frecuencia. Basado en su origen biosintético: origen biosintético aquí significa de qué bloque químico fundamental se derivan estos alcaloides. El origen biosintético de la clasificación es beneficioso en una clasificación más ordenada, sin embargo, a menudo se desconoce cómo la mayoría de los alcaloides son sintetizados por las plantas. (Mehta, 2012)

2.2.4.1.1.4 Usos

Los alcaloides poseen múltiples usos, tanto en la naturaleza como en la sociedad. En medicina, el uso de alcaloides se basa en efectos fisiológicos que causan en el cuerpo, lo cual es una medida de la toxicidad del compuesto, algunos alcaloides son útiles cuando se usan en las dosis correctas, estos tienen la capacidad estructural de interactuar con los sistemas biológicos y afectar directamente la fisiología de un organismo. Esta propiedad puede parecer peligrosa, pero el uso de alcaloides de manera controlada es de gran utilidad. (Zajari, 2010)

Aunque su biogénesis y metabolismo han sido estudiados en muchos casos, la función de los alcaloides es todavía vaga y no es realmente entendida por el químico. Existen algunas funciones propuestas de los alcaloides en el metabolismo de las plantas, el catabolismo o la planta.

Fisiología como se enumera a continuación:

 Como producto final del metabolismo o productos de desecho.

 Como reservorio de almacenamiento de nitrógeno para la síntesis de proteínas.

 Como agente protector de las plantas contra el ataque de los depredadores (parásitos o herbívoros).

 Como plantas estimulantes y reguladoras en actividades como el crecimiento, el metabolismo y la reproducción.

 Como agente de desintoxicación, que hace que ciertas sustancias sean inofensivas, la acumulación de los cuales podría causar daños a la planta.

(Zajari, 2010)

2.2.4.1.1.4.1 Los alcaloides pueden usarse como medicinas

Los alcaloides son muy usados en farmacología y en medicina8analgésico, hipnótico, anestésico, tranqulizanres, entre otros), algunos alcaloides presentan actividad farmacológica muy significativa. Estos efectos fisiológicos los hacen valiosos como medicinas para curar algunos trastornos graves. (Pacheco, 2012)

2.2.4.1.1.4.2 Los alcaloides usados como narcóticos

Muchas sustancias psicotrópicas, que actúan sobre el sistema nervioso central, son alcaloides. Estos narcóticos se han utilizado desde la Antigüedad como instrumentos para la excitación mental y la euforia, aunque se consideran dañinos según la medicina moderna. (Briceño, n.d.)

2.2.4.1.1.4.3 Los alcaloides pueden usarse como pesticidas y repelentes

La mayoría de los pesticidas y repelentes naturales se derivan de plantas, donde ejercen su función como parte del sistema de defensa propio de la planta contra los

36 insectos, hongos o bacterias que las afectan. Estos compuestos son generalmente alcaloides. Como se mencionó anteriormente, estos alcaloides son tóxicos por naturaleza, aunque esta propiedad depende en gran medida de la concentración. (Briceño, n.d.)

2.2.4.1.1.4.4 Los alcaloides pueden usarse en la investigación científica

Debido a sus efectos específicos sobre el cuerpo, los alcaloides son muy empleados en los estudios científicos. Por ejemplo, el alcaloide atropina puede causar la dilatación de la pupila. Entonces, para evaluar si una nueva sustancia tiene efectos similares o efectos opuestos, se compara con el efecto de la atropina. Algunos alcaloides son estudiados con gran interés debido a sus propiedades antitumorales, como la vinblastina y la vincristina. Otros alcaloides importantes en la investigación científica incluyen la quinina, la codeína, la nicotina, la morfina, la escopolamina y la reserpina, entre otros. (Briceño, n.d.)

2.2.5 Control de calidad de la droga

El control de calidad es un proceso que implica el estudio físico-químico de la droga cruda que va desde la selección, manejo de la materia vegetal hasta la seguridad, eficacia y estabilidad del producto terminado. La calidad es un requisito primordial aplicado a varios productos utilizados en la vida cotidiana de las personas, pero su importancia crece cuando se trata de medicamentos y en especial si estos son provenientes de plantas medicinales, ya que pueden contener uno o más principios activos responsables del efecto terapéutico lo que además dificulta la aplicación de métodos de control de calidad. (Acosta, 1996)

El control de calidad de la materia vegetal es un aspecto de mucha importancia pues nos garantizara su identidad, inocuidad, pureza, contenido de principios activos, así como también su efectividad y estabilidad. El control de calidad se realiza bajo parámetros previamente establecidos mediante pruebas analíticas y biológicas y deben estar reguladas por organismos competentes. (Acosta, 1996) 37

2.2.5.1 Cenizas

Las cenizas se refieren a los residuos inorgánicos que permanecen después de la ignición u oxidación completa de la materia orgánica. El conocimiento básico de las características de varios procedimientos para la determinación de cenizas es muy necesario para la obtención de procedimientos confiables. (Soto, 2005)

Tres principales tipos de determinación de cenizas existen: 1) Calcinación por secado el cuál funciona para la mayoría de los alimentos. 2) Calcinación por vía húmeda u oxidación húmeda, este es para muestras con alto contenido de grasas (carne y productos cárnicos), como una preparación para el análisis mineral y 3) Calcinación de plasma a baja temperatura, también llamado calcinación a bajas temperaturas, el cuál funciona para muestras que contienen elementos volátiles, muestra secas no requieren una preparación, mientras que muestras frescas necesitan ser secados antes de calcinarse. Por otro lado el contenido de cenizas puede ser expresado tanto en base húmeda o base seca. (Soto, 2005)

2.2.5.1.1 Cenizas Solubles en agua

Son calculadas por diferencia en peso entre las cenizas totales y el residuo remanente después del tratamiento de las cenizas totales con agua. Cuando los valores obtenidos para las cenizas totales son elevados (>5%), es necesario conocer si las mismas están compuestas por metales pesados, lo cual se determina mediante los ensayos de cenizas insolubles, y su este resultado es elevado hay que someter la droga a otro análisis antes de aprobar su uso. (Soto, 2005)

2.2.5.1.2 Cenizas Ácido – Insolubles

Las cenizas ácido-insolubles son los residuos después de la ebullición de las cenizas totales con ácido clorhídrico diluido. Esta determinación mide la presencia de sílice, especialmente de arena y tierra silícea. (Soto, 2005)

2.2.5.2 Humedad

Un exceso de agua en una droga puede provocar el crecimiento microbiano, la presencia de hongos o insectos y el deterioro, seguido de la hidrolisis de los principios activos. Este ensayo es especialmente importante para drogas que absorben humedad fácilmente o se deterioran rápidamente en presencia de agua. (Peralta, Maldonado, & Centeno, 2007)

Los límites de agua establecidos en la farmacopea para las drogas, oscila entre un 8 y 14% con pocas excepciones, correspondiendo los valores más altos con la humedad de cortezas, tallos y raíces. La humedad residual o límite para la cantidad de agua, puede ser establecida mediante tres métodos: método gravimétrico (desecación), método azeotrópico (destilación con tolueno) y método volumétrico (Karl Fischer). El primero, técnicamente es el más simple y rápido, no es aplicable cuando la droga contiene sustancias volátiles. Los demás métodos requieren equipamientos especiales y comprenden técnicas más complejas. (Peralta et al., 2007)

2.2.5.3 Material Extraíble (Extracto total y de cada fracción)

Este método determina la cantidad de constituyentes extraídos con disolventes a partir de una cantidad dada de material de la planta medicinal. Se emplea para materiales los cuales no existen todavía ensayos biológicos o químicos adecuados. (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013)

2.2.6 Extractos

Son preparaciones concentradas de droga de origen vegetal o animal obtenidas mediante la remoción de los componentes activos de las drogas respectivas con menstruos

39 apropiados. La evaporación de todo o casi todo el solvente y el ajuste de las masas o polvos residuales para que cumplan las normas prescriptas. (Carrión & García, 2010)

2.2.6.1 Extractos Fluidos

Los extractos fluidos son extractos de drogas que con la concentración prescrita de etanol, están preparados de forma que una parte de droga corresponde a una parte o dos partes del extracto fluido; teniendo en cuenta que 85 partes de droga seca corresponden a 100 partes de planta fresca. Por lo general los extractos fluidos se obtienen por percolación. (Carrión & García, 2010)

2.2.6.2 Extractos Secos

Los extractos secos son aquellos que tienen una consistencia seca y son fácilmente pulverizables, se obtienen por evaporación del disolvente y desecación del residuo. Los extractos secos no deben presentar un contenido de humedad mayor del 5% Presentan una concentración muy superior de principio activo que la droga original, son preparados bastante estables (aunque en ocasiones resultan higroscópicos) y de fácil manipulación; como líquido extractor se utiliza alcohol de diversa concentración y agua. Actualmente es posible obtener extractos secos nebulizados que son más estables que los tradicionales, por ser menos higroscópicos. (Carrión & García, 2010)

2.2.6.3 Extracto Blando

Poseen una concentración de principio activo superior a la de la droga* original y tienen consistencia semisólida. El disolvente suele ser agua o mezclas hidroalcohólicas. Los extractos blandos son poco estables y resultan difíciles de manipular; por lo que no se utilizan. (Carrión & García, 2010)

2.2.7 Extracción

2.2.7.1 Tipos de Extracción

2.2.7.1.1 Reflujo

El reflujo es un técnica que nos permite calentar una reacción con una temperatura mayor a la temperatura ambiente pero manteniendo constante el volumen de la reacción. Este proceso permite que no se produzca pérdida alguna del disolvente, ya que evita que este cuando se evapora salga a la atmósfera, cuando se calienta el matraz, el aumento de la temperatura hace que el disolvente se evapore pero estos se condensan y bajan nuevamente al matraz, esto establece un sistema continuo de reflujo en el cual se mantiene un volumen constante del disolvente. (Molineros, 2015)

2.2.7.1.2 Maceración

La droga se pone en contacto con el solvente en un recipiente de cierre perfecto a temperatura ambiente. Se deben realizar agitaciones frecuentes a lo largo de varios días, tratando de influenciar el gradiente de concentración. Al principio de la extracción este gradiente está en su punto máximo, con el correr de los días a pesar de la agitación, va disminuyendo. Como norma se macera la droga por 7 días con agitación frecuente y protegido de la luz solar. Si el menstruo es agua, no sobrepasar las 48 horas para evitar fermentación y formación de mohos. Se separa el extracto del residuo por medio de un colado o prensado, se lava el residuo con el líquido de extracción. La maceración es útil cuando los principios son fácilmente solubles en frío y cuando la acción de la temperatura los altera. (Sierra & colaboradores, 2004)

 La maceración puede ser SIMPLE o fraccionada. Para el primero de los casos se utiliza una sola alícuota del menstruo y una vez cumplido el lapso indicado se

procede a exprimir el residuo, lavado del mismo y filtrado de la solución extractiva obtenida a fin de clarificarla. (Sierra & colaboradores, 2004)

 En la maceración FRACCIONADA el volumen total de menstruo a utilizar es fraccionado en alícuotas, y se procede como en la maceración simple pero con lapsos de tiempos menores para cada uno de los pasos. Esta variante permite una mejor extracción de los principios solubles dado que se establecen mayor cantidad de equilibrios. Una vez realizadas todas las extracciones, se juntan las alícuotas de solución extractiva obtenidas y se filtran con el fin de clarificarlas. (Sierra & colaboradores, 2004)

 También puede realizarse una maceración COMPUESTA: poniendo en contacto el material en forma sucesiva con distintos solventes. (Sierra & colaboradores, 2004)

2.2.7.1.3 Extracción específica de alcaloides

La extracción de alcaloides se basa, por regla general en el hecho de que se encuentra en la planta en estado de sales o de combinaciones solubles que posee carácter básico y que las bases y sus sales poseen distintas solubilidades en disolventes orgánicos y agua respectivamente, en función de su pH . La extracción propiamente dicha consiste en utilizar dos métodos: extracción en medio alcalino (por disolvente) y extracción en medio ácido (con agua, una solución alcohólica o hidroalcohólica). (Barahona & Guevara, 2007)

2.2.7.1.3.1 Extracción en medio alcalina

1. La droga pulverizada se mezcla con una solución acuosa alcalina que desplaza los alcaloides de sus combinaciones salinas y las bases así liberadas se extraen 42 seguidamente con un disolvente orgánico que puede ser clorado, benceno, éter dietílico,etc.

2. El disolvente orgánico que contiene disuelto los alcaloides bases se separa y si es necesario se concentran destilando a presión reducida.

3. Los alcaloides en forma de sales se solubilizan en la fase acuosa, mientras que las otras moléculas e impurezas permanecen en solución en la fase orgánica.

4. Las soluciones acuosas de las sales de alcaloides reunidas son lavadas con un disolvente apolar, se alcalinizan, esto con ayuda de una ampolla de decantación o con aparatos más o menos complejos.

5. El disolvente orgánico que contiene los alcaloides base se decanta, se suprimen las trazas de agua por deshidratación y se evapora al vacío. Obteniéndose un residuo de alcaloides totales (A.T). (Barahona & Guevara, 2007)

2.2.7.1.3.2 Extracción en medio ácido

Se pueden presentar dos casos: 1. En el primer caso la droga pulverizada se extrae directamente con una solución acuosa ácida. 2. En segundo caso se utilizan soluciones alcohólicas o hidroalcohólicas ácidas (de ácido tartárico por ejemplo) para la extracción. En este caso hay que concentrar los líquidos extractivos por destilación a vacío para eliminar el alcohol. (Barahona & Guevara, 2007)

2.2.8 Métodos de Análisis

2.2.8.1 Análisis cromatográfico: Cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina (en inglés Thin Layer Chromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Química Orgánica. Entre otras cosas permite:

 Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación.

 Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia.

 Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado.

La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente. (Areal & Bessa, 2015)

2.2.8.2 Métodos Espectrofotométricos

2.2.8.2.1 Determinación cuantitativa de alcaloides

En este método los alcaloides presentes en extractos de plantas se precipitan usando el reactivo de Dragendorff (DR). Este método se basa en la formación de un complejo bismuto unido al alcaloide, se desprende el bismuto del alcaloide con sulfuro disódico y luego el bismuto es lixiviado usando ácido nítrico y se hace reaccionar luego con tioúrea, para producir un complejo de color amarillo que puede ser cuantificado espectrofotométricamente en la región visible a 435 nm. Las medidas espectrofotométricas se basan en la Ley de Lambert-Beer. El método es rápido, fácil y simple. Con este método se cuantifican los alcaloides muy básicos y moderadamente básicos y los denominados pseudoalcaloides por su carácter acido (Arango, 2008),

44 excepto los alcaloides purina que no forman precipitados con el reactivo DR. (Sreevidya & Mehrotra, 2003)

(Rojas, Jaramillo, & Lemus, 2015)

2.2.8.2.2 Espectrometría Ultravioleta

Según Skoog, D.A.: “El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones electrónicas entre los diferentes niveles energéticos en ciertos grupos o átomos de la molécula y no caracterizan a la molécula como entidad”. En contraste la absorción de energía en la región Infrarroja estimulan la molécula completa y causa cambios vibracionales y rotacionales en esta lo cual caracteriza la entidad estructural de dicha molécula. Los grupos de átomos que dan origen a la absorción en el UV cercano o UV de cuarzo, se conocen como grupos cromóforos. La mayoría de los grupos insaturados y heteroatómicos que tienen pares de electrones no compartidos, son cromóforos potenciales y estos grupos son la base de la elucidación de grupos estructurales en las moléculas activas en el UV cercano. (Skoog, D.A.; Leary J.J., Holler F. Jame, 1998)

2.2.8.2.3 Actividad antioxidante

El estudio de la capacidad antioxidante de las plantas medicinales y alimenticias ha crecido en las últimas décadas ya que un número importante de productos obtenidos de éstas, como los aceites esenciales, alcaloides y los polifenoles, poseen efectos antioxidantes los cuales son evidenciados mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo asociadas a cada uno de ellos. Los antioxidantes son compuestos que pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhabilitando la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres. Podemos distinguir dos categorías: sintéticos y naturales. Los primeros son compuestos de estructuras fenólicas con varios grados de sustitución alquílica, mientras que los segundos pueden ser: compuestos fenólicos (tocoferoles, flavonoides y ácidos fenólicos), compuestos nitrogenados

(alcaloides, derivados de la clorofila, aminoácidos y aminas) o carotenoides. (Pastene, 2009)

Por otra parte los radicales libres se definen como cualquier especie química capaz de existir de forma independiente y que presenta uno o más electrones desapareados en su estructura, por lo tanto son altamente reactivos; también son conocidos como especies reactivas del oxígeno y especies reactivas del nitrógeno, (ROS y RNS, respectivamente por sus siglas en inglés). A bajas concentraciones son necesarios para el buen funcionamiento celular pueden actuar como segundos mensajeros estimulando la proliferación celular y/o actuando como mediadores para la activación de las células, sin embargo, un exceso de los mismos puede acumularse hasta niveles tóxicos dando como resultado que se produzcan diversas acciones sobre el metabolismo primario, que pueden producir daño oxidativo de macromoléculas biológicas como el DNA, lípidos, carbohidratos y proteínas. (Agudo, 2002)

Mecanismo de acción de los antioxidantes:

 Previniendo la formación de ROS, interceptando el ataque de ROS. Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas menos reactivas.

 Facilitando la reparación del daño causado por ROS.

 Manteniendo un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.

 Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de ROS.

(Agudo, 2002)

DPPH

Actualmente existen diversos métodos para determinar la actividad antioxidante, los cuales se basan en su capacidad para captar radicales libres. Entre ellos se pueden mencionar el uso del DPPH, ABTS, la reacción con el óxido nitroso (test NO), DMPD, generación de radicales peroxilo, superóxido e hidroxilo, y otros. (Leos & García, 2016)

Determinación de la Actividad antioxidante por el método DPPH

El fundamento del método desarrollado por Brand-Willams et al., DPPH, consiste en que este radical tiene un electrón desapareado y es de color azul-violeta, decolorándose hacia amarillo pálido por la reacción de la presencia de una sustancia antioxidante, siendo medida espectrofotométricamente a 517 nm. Por diferencia de absorbancia se determina el porcentaje de captación de radical libre DPPH a una concentración de 20 mg/L. (Leos & García, 2016)

2.3 Marco Legal

Existen artículos vigentes en la Constitución del País que controlan tanto el acceso de las personas a la salud, acceso a medicamento y de igual manera artículos que promueven el control de especies vegetales para que estas no desaparezcan.

Art. 363.- El Estado será responsable de:

Garantizar la disponibilidad y acceso a medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover la producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las necesidades epidemiológicas de la población. En el acceso a medicamentos, los intereses de la salud pública prevalecerán sobre los económicos y comerciales.

Garantizar las prácticas de salud ancestral y alternativa mediante el reconocimiento, respeto y promoción del uso de sus conocimientos, medicinas e instrumentos.

Art. 1.- La presente Ley tiene como finalidad regular las acciones que permitan efectivizar el derecho universal a la salud consagrado en la Constitución Política de la República y la ley. Se rige por los principios de equidad, integralidad, solidaridad, universalidad, irrenunciabilidad, indivisibilidad, participación, pluralidad, calidad y eficiencia; con enfoque de derechos, intercultural, de género, generacional y bioético.

Art. 14.- Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el buen vivir, sumak kawsay.

Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de los ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales degradados.

Que, el artículo 259 de la Ley Ibídem, correspondiente a definiciones, menciona: "Producto natural procesado de uso medicinal.- Es el producto medicinal terminado y etiquetado, cuyos ingredientes activos están formados por cualquier parte de los recursos naturales de uso medicinal o sus combinaciones, como droga cruda, extracto o en una forma farmacéutica reconocida, que se utiliza con fines terapéuticos"

Capitulo II

DE LAS DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Art. 3.- Definiciones.- Para efectos de la presente Normativa Técnica Sanitaria se considerarán las siguientes definiciones y abreviaturas:

Actividad terapéutica.- Se refiere a la prevención, el diagnóstico y el tratamiento satisfactorio de enfermedades físicas y mentales, el alivio de los síntomas de las enfermedades y la modificación o regulación beneficiosa del estado físico y mental del organismo.

Droga cruda.- Material proveniente del recurso natural de uso medicinal, que no ha sufrido trasformaciones químicas; sólo procesos físicos (lavado, secado o molienda).

Extracto Estandarizado.- Producto que se obtiene del recurso natural de uso medicinal por la acción de un disolvente de acuerdo a los métodos de extracción reconocidos o estandarizados, y que expresan concentración definida del o los principio/s activos o marcador/es.

2.4 Hipótesis

2.4.1 Hipótesis de trabajo

2.4.2 Hipótesis nula

Etapa 1 y Etapa 2

Hi: La concentración de alcaloides determinada (mg de Alcaloide (Bi)/g extracto seco) en los extractos y fracciones se ve influenciada por el método de extracción y la parte de la planta empleados para la experimentación.

Ho: La concentración de alcaloides determinada (mg de Alcaloide (Bi)/g extracto seco) en los extractos y fracciones no se ve influenciada por el método de extracción y la parte de la planta empleados para la experimentación.

Etapa 3

La actividad antioxidante (porcentaje de inhibición) se ve influenciada por el método de extracción y partes de la planta empleados para obtener los diferentes extractos y las fracciones correspondientes a partir de las especies Ambrosia arborescens y de Tagetes multiflora.

La actividad antioxidante (porcentaje de inhibición) no se ve influenciada por el método de extracción y partes de la planta empleados para obtener los diferentes extractos y las fracciones correspondientes a partir de las especies Ambrosia arborescens y de Tagetes multiflora.

2.5 Conceptualización de las variables

Sistema de variables

Etapa I – Etapa II

Variable dependiente Variable independiente

Especies vegetales:

Concentración de alcaloides (mg de Ambrosia arborescens y Tagetes Alcaloide unido a Bismuto (Bi)/gramos multiflora de extracto seco. Partes aéreas empleadas:

Tallos y Hojas

Métodos de extracción utilizados: Maceración y reflujo

Etapa III

Variable dependiente Variable independiente

Especies vegetales:

Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Porcentaje de Inhibición del radical DPPH de los extractos totales y Partes aéreas empleadas: fracciones. Tallos y Hojas

Métodos de extracción utilizados: Maceración y reflujo

Capítulo III

3. Marco metodológico

3.1 Diseño de la Investigación

Esta investigación tiene un enfoque o paradigma cuantitativo el mismo que tiene como finalidad la de determinar la influencia del material vegetal (tallos y hojas) y el método de extracción (maceración y hojas) en la cuantificación de alcaloides para evaluación de la actividad antioxidante, para ello se obtuvieron inicialmente extractos totales y posteriormente a estos sometió a un proceso de partición hasta que se consiguieron fracciones, posteriormente esto nos permitió determinar una concentración (cantidad) de alcaloides tanto en extractos como en fracciones a través de una reacción de precipitación con el reactivo de Dragendorff, se analizó dichas concentraciones obtenidas de las dos especies vegetales perteneciente a la familia Asterácea para evaluar la capacidad antioxidante de las mismas, para ello se llevó a cabo el método de DPPH con estándar de referencia Trolox, los resultados obtenidos nos permitieron establecer en cuál de los extractos o fracciones se presentó una mayor actividad antioxidante.

Esta investigación abarca el nivel explicativo, el cual permitirá determinar cada uno de los parámetros que nos permitan evidenciar cómo influye el método de extracción empleado y la parte de la planta (tallos y hojas) en la concentración de alcaloides (cantidad) presente en los extractos totales y fracciones además de la evaluación de la capacidad antioxidante para las dos especies vegetales Ambrosia arborescens como Tagetes multiflora. El estudio se llevó a cabo mediante experimentación en el laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador para la identificación, control de calidad de las ambas especies, obtención de los extractos y posterior fraccionamiento de las muestras, cuantificación de alcaloides en extractos totales y fracciones, dicha investigación culminó con la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos totales y fracciones obtenidos de cada una de las especies en estudio, determinando así cuales extractos o fracciones presentan mayor cantidad de alcaloides y actividad antioxidante.

Los tipos de investigación que comprenderá nuestro estudio son observacional, bibliográfica y experimental. Dentro de la investigación realizó una recopilación de datos en el laboratorio donde se desarrolló la parte experimental de nuestro estudio, para ello se utilizó un cuaderno de laboratorio. Por el lugar donde se llevó a cabo esta la investigación se trata de una investigación de laboratorio, esto nos ofrecerá un referente para el respectivo análisis de las variables tanto dependientes como independientes.

3.2 Población y Muestra

En la presente investigación se describió como muestra población a las especies vegetales Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, y como muestra se empleó las partes aéreas: hojas y tallos de las especies antes mencionadas pertenecientes a la familia Asterácea, las mismas que fueron recolectadas al sur de la ciudad de Latacunga, en un terreno de propiedad familiar en el mes de Julio del 2018,dicha investigación se llevó a cabo en el laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

3.3 Métodos y Materiales

3.3.1 Métodos

El presente trabajo de investigación consta de tres etapas, en la primera etapa se realizó un análisis de las especies vegetales dentro de lo cual se ejecutó un control de calidad de las dos especies vegetales dichos controles son: selección y limpieza, secado de la muestra, molienda de la muestra seca, cenizas totales, contenido de humedad y material extraíble.

En la etapa II se procedió a obtener los extractos de cada una de las partes aéreas de las especies vegetales en estudio empleando diferentes métodos (maceración y reflujo), posteriormente se llevó a cabo el fraccionamiento de dichos extractos, para lo cual se 52 empleó un procedimiento general para obtener alcaloides de extractos de material vegetal crudo descrito en (Sarker, Latif, & Gray, Natural Products Isolation, 2008).

Posteriormente, se realizó la cuantificación de las fracciones obtenidas de cada especie vegetal en mg de Alcaloide (unidos a Bismuto) por g de extracto seco; esto nos permitió determinar cuál de los extractos o fracciones presentaban mayor concentración de alcaloides y para comprobar dichos resultados se procedió a realizar cromatografía en capa fina con cada una de las muestras (extractos y fracciones) obtenidos.

Finalmente, en la tercera etapa se evaluó la actividad antioxidante que presentaban tanto los extractos como las diferentes fracciones de cada una de las especies vegetales en estudio, para lo cual se tomó como estándar de referencia el Trolox.

3.3.2 Materiales

Los materiales, reactivos y equipos que se emplearon fueron los siguientes que se utilizarán para la presente investigación son los siguientes:

Tabla N°3. Materiales de oficina

Materiales

Holas y tallos de la especie Cuaderno de 100 hojas Papel absorbente Ambrosia arborences cuadriculado, espiral

Holas y tallos de la especie Marcador de punta fina Pañuelos de papel Kleenex Tagetes multiflora negro

Mandil Papel film Papel aluminio

Guantes Papel filtro Esferos

Papel empaque Papel comercio Masking/ Cinta adhesiva

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Tabla N°4. Material de Laboratorio

Instrumentos/Material de laboratorio

Frascos graduados de Pipetas volumétricas de Desecador vidrios (200mL) 1mL, 2mL, 5mL

Vial de color ámbar Tubos de ensayo Gradillas

Matraz Erlenmeyer 100mL, Placas de sílica gel Pera de succión 250mL

Matraz Erlenmeyer 100mL, Vidrios reloj Espátula 250mL

Balones aforados de 10mL, Crisoles de porcelana Envases ámbar 20mL, 100mL, 500mL y 1L

Embudos de separación Cajas Petri Pinza para crisoles

Embudos Vasos de precipitación de 500mL

Pipetas graduadas de 2mL, 5mL y 10mL

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Tabla N°5. Equipos EQUIPOS MARCA MODELO

Estufa Thelco 22AF5

Mufla Thelco 31477-225C

Centrifuga Itettich- ROTOFIX II 111750

Vortex VORTEX GENIE-2

Balanza analítica Mettler Toledo AL204

Cocinetas Umco JX-1010B

Espectrofotómetro UV. Fisher Scientific SP2100VVPC

Rotavapor Buchi R-205

Cámara reveladora de Cole-Parmer 9818- placas cromatográficas.

Micropipetas Capp Bravo B1000-1

Lector de placas Synergy H1TM

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Tabla N°6. Reactivos

REACTIVOS MARCA LOTE

Etanol 96% Merck KGaA K48162383630

Tioúrea

Subnitrato de bismuto May & Baker LTD 31646 Dagenham Englamd

Sulfato de sodio J.T Baker 3891-01

Ácido acético glacial Merck K340227663

Sulfuro de amonio

Yoduro de potasio Quimed 901099

Ácido Nítrico concentrado - -

Ácido tartárico

Acetato de etilo Merck 7380220

Carbonato de sodio Sigma Chemical Company 29C-0225

Cloroformo Merck KGaA K47932745627

DPPH Sigma-Aldrich STBG1245V

Trolox Sigma-Aldrich BCBR7575V

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3.4 Diseño Experimental

Etapa I

Primero se realizó el respectivo control de calidad de cada una de las especies vegetales utilizadas en el presente estudio se basó en la farmacopea herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.

Etapa II

El modelo estadístico que se empleara en el siguiente trabajo de investigación es el Diseño Completamente al Azar (DCA) el mismo que para su resolución utilizara el Análisis de Varianza ANOVA, dicho análisis nos permitió determinar en qué extracto o fracción obtenidas de las muestras vegetales en estudio obtenidas inicialmente, se encuentra la mayor cantidad de alcaloides.

Diseño para cada uno de los extractos y fracciones

Tabla N°7. Diseño para la cuantificación de alcaloides en extractos y fracciones para tallos de Ambrosia arborescens

Realizado por: German Dayra

Para: Ambrosia arborescens (hojas) y Tagetes multiflora (tallos y hojas), se procederá de la forma antes señalada, las respectivas codificaciones corresponden a iniciales de la especie, A para Ambrosia arborescens o T para Tagetes multiflora, seguido de E para señalar que corresponde a extractos o F para fracción, los números junto a cada E corresponden al número de repetición realizada y en el caso de aquellos que acompañan a F señalan si se trata de fracción 1, fracción 2 o fracción 3 cabe mencionar q junto a estos encontramos el número de repetición realizada, después se coloca la letra correspondiente a la parte de planta, T en el caso de tallos y H para hojas, finalmente la letra M (maceración) o R(reflujo) que señala la técnica de extracción empleada.

Etapa III

Evaluación de la actividad antioxidante

Para la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos y fracciones obtenidas de las especies analizadas, se llevó a cabo el método del radical DPPH (2,2- difenil-1-picril hidrazilo), dicho método nos permitió evaluar el porcentaje de inhibición que presentaban tanto extracto como fracciones obtenidas. 57

Para la llevar a cabo dicho procedimiento se empleó el estándar de Trolox, el mismo que tuvo una concentración de 100ppm y DPPH 200ppm, la lectura se realizó en el espectrofotómetro UV-VISIBLE a una longitud de 517nm.

Diseño para la evaluación de la actividad antioxidante.

Tabla N°8. Diseño para la evaluación antioxidante en extractos y fracciones

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Para: Ambrosia arborescens (Hojas), Ambrosia arborescens (Tallos), Tagetes multiflora (Tallos) y Tagetes multiflora (Hojas), se procederá de la forma antes señalada obteniendo, se colocó en los micropocillos en el orden señalado así, desde la fila A hasta la D, las muestras pertenecientes a Ambrosia arborescens y desde la fila E hasta la fila H los pertenecientes a la segunda especie Tagetes multiflora. Para las columnas: 1-3: Extractos, 4-6: Fracción 1, 7-9: Fracción 2 y 10-12: Fracción 3, cabe recalcar que la codificación incluye a iniciales de la especie A para Ambrosia arborescens o T para Tagetes multiflora, seguido de M (maceración) o R(reflujo) que señala la técnica de extracción, después la letra correspondiente a la parte de planta empleada T en el caso de tallos y H para hojas, finalmente ET para señalar que corresponde a extractos o F para fracción, los números junto a cada E corresponden al número de repetición realizada y en el caso de aquellos que acompañan a F señalan si se trata de fracción 1, fracción 2 o fracción 3 también como en el caso anterior encontramos el número de repetición junto a estos. 58

3.5 Operacionalización de las variables

Tabla N°9. Etapa I – Etapa II

Variables Dimensiones Indicadores

Partes aéreas: Hojas y tallos

Maceración y Reflujo Cantidad (Concentración) de alcaloides presentes en cada uno de los Método de fraccionamiento extractos y fracciones obtenidos por encontrado en (Sarker, Natural dichos métodos. Products Isolation, 2006)

Partes la de planta Método extracción

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Tabla N°10. Etapa III

Variables Dimensiones Indicadores

Estándar de Referencia -Inhibición de la actividad de los radicales (TROLOX) libres. (Porcentaje)

DPPH - Concentración del radical libre.

Absorbancia

oncentración alcaloides de

C Realizado por: German Dayra

3.6 Técnicas

3.6.1 Recolección e identificación del material vegetal

Las especies de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora fueron recolectadas en el al sur de la ciudad de Latacunga, en un terreno de propiedad familiar en el mes de Julio del 2018, las partes aéreas que se van a utilizar de las especies antes mencionadas para la presente investigación son: hojas y tallos.

Para la correspondiente identificación taxonómica de cada una de las especies vegetales se llevó un ejemplar completo de cada una de ellas al Herbario Alfredo Paredes de la Universidad Central del Ecuador.

3.6.2 Control de Calidad del Materia Vegetal

Previo a la utilización del material vegetal se realizó el siguiente control.

 MGA-FH 0030. Materia Extraña.

 MGA-FH 0060 Determinación de cenizas totales.

Dichos procedimientos se encuentran detallados en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.

3.6.2.1 Determinación del material extraíble

Pesar un vidrio reloj, anotar el peso del mismo (peso inicial), posteriormente tarar la balanza y colocar sobre el vidrio reloj 0,5ml del extracto vegetal y de las diferentes fracciones posteriormente colocar durante un día en la estufa el vidrio reloj con la

60 muestra. Transcurrido el tiempo retirar de la estufa y pesar nuevamente (peso final), registrar el peso, restar el peso inicial del peso final y determinar el material extraíble.

3.6.3 Limpieza y desinfección del material vegetal

Para efectuar la limpieza y desinfección de cada una de las especies vegetales se lavó con abundante agua la misma que contenía una mínima cantidad de cloro al 5% para de esta manera eliminar la presencia de tierra tanto en las hojas como en tallos, retirada el agua en exceso las muestras fueron secadas al ambiente a una temperatura de 37 °C por un tiempo de 7 días.

Una vez que tanto las hojas como los tallos se secaron se procedió a disminuir el tamaño de partícula para ellos se empleó un molino casero para disminuir el tamaño de partícula, posteriormente se utilizó un tamiz de 2,0mm para lograr tener una muestra con un tamaño homogéneo de partícula, una vez realizado todo el proceso se guardó las muestras en frascos para su posterior utilización.

3.6.4 Extracción y aislamiento de los componentes alcaloideos

3.6.4.1 Extracción a partir del material vegetal

Para obtener los distintos extractos totales de las especies vegetales se utilizará las partes aéreas (hojas y tallos) tanto de la Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, dichas partes aéreas serán sometidas a una previa deshidratación a temperatura ambiente 37 °C por 7 días.

3.6.4.1.1 Extracción por el método de maceración

Se utilizó 30g aproximadamente de muestra pulverizada de cada especie vegetal las mismas que fueron colocadas en frascos de vidrio de capacidad de 250mL, recubiertos con papel aluminio y posteriormente se adicionaron 200 ml de etanol de 96° G.L. el mismo que fue empleado como solvente durante la maceración tanto para las hojas como los tallos de las dos especies vegetales. El tiempo de maceración fue de 7 días; cabe recalcar que existió agitación diariamente de forma manual una vez al día. Transcurrido dicho tiempo, se procedió a filtrar cada una de las muestras, después se concentró hasta evaporar todo el solvente de las muestras usando como equipo el rotavapor BUCHI Heating Bath B-490 a 35°C y 90 rpm hasta obtener los respectivos extractos etanólicos, dichos extractos se almacenaron en viales con tapón de color ámbar 40mL.

3.6.4.1.2 Extracción por el método de reflujo

Se utilizó 100g aproximadamente de muestra pulverizada de cada especie vegetal las mismas que fueron colocadas en matraz balón de fondo redondo con esmerilado de capacidad 1000mL, se añadió 300mL de etanol 96° G.L , posteriormente se procedió a armar el equipo de reflujo, se llevó a cabo el proceso durante un tiempo de aproximado de 3 horas. Transcurrido dicho tiempo, se concentró cada uno de los extractos obtenidos del procedimiento anterior hasta evaporar todo el contenido de etanol usando como equipo el rotavapor BUCHI Heating Bath B-490 a 35°C y 90 rpm hasta obtener los respectivos extractos etanólicos, dichos extractos se almacenaron en viales con tapón de color ámbar 40mL.

3.6.4.2 Procedimiento general para obtener alcaloides extraídos de la planta a partir del material crudo de la planta (Fraccionamiento de los extractos vegetales totales).

Los alcaloides que contienen aminas básicas se pueden extraer selectivamente usando una versión modificada del clásico método de "agitación ácido-base".

Imagen N°5. Procedimiento general para obtener alcaloides de extractos de material vegetal crudo (Sarker, Natural Products Isolation, 2006)

Para ello inicialmente se preparó 1L de dos buffer, una de ácido tartárico de pH 5 y otra de Na2CO3 a un pH de 11, para comprobar que ambas buffer se encuentran a dicho pH se empleó el potenciómetro Mettler Toledo del Laboratorio de Tecnología Farmacéutica de la Facultad de Ciencias Químicas y una solución acetato de etilo recientemente pre saturado con agua, a 40 ml de acetato de etilo agregar 10 ml de agua; agitar durante 3 minutos y dejar reposar.

Posteriormente en un embudo de separación se colocó 2mL del extracto total obtenido con anterioridad, a este se añadió 2 mL de la buffer de ácido tartárico y 2mL de

63 la solución de acetato de etilo, se esperó aproximadamente 5 minutos hasta lograr ver dos fases en el embudo, la fase de ácida acuosa (fase de abajo) que se transfirió a otro embudo de separación para posterior tratamiento y la primera partición con acetato de etilo (fase superior), esta última se la almacenó en un vial color ámbar. (Fracción 1)

A la fase acuosa ácida que se colocó en otro embudo de separación, se añadió 2mL de buffer de Na2CO3 a un pH de 11 y 2mL de la solución de acetato de etilo, se esperó aproximadamente 5 minutos hasta lograr ver dos fases en el embudo, la fase de extracto acuoso (fase de abajo – Fracción 2) y la segunda partición con acetato de etilo (fase superior – Fracción 3), las dos fases se almacenaron por separado en viales de color ámbar. Obteniéndose así tres fracciones distintas de cada uno de los extractos totales inicialmente obtenidos.

3.6.4.3 Aislamiento de compuestos alcaloideos.

3.6.4.3.1 Preparación de curva de calibración de bismuto.

A partir de la solución madre de nitrato de bismuto estándar (0,081 mg/mL), se procede a preparan diferentes estándares de concentraciones: 0,0162 mg/mL, 0,0243 mg/mL, 0,0324 mg/mL, 0,405 mg/mL, 0,0486 mg/mL, 0,0567 mg/mL, 0,0648 mg/mL y 0,0729 mg/mL.

3.6.4.3.2 Método espectrofotométrico para la cuantificación de alcaloides.

3.6.4.3.2.1 Preparación de soluciones

a) Solución de Dragendorff:

Se prepara mediante la mezcla de:

a.1) Se pesa 850 mg de Subnitrato de bismuto, se añade 40 mL de agua destilada y 10 mL de ácido acético.

a.2) Pesar 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada.

Al momento de usar mezclar 5mL de cada una de las soluciones (a.1 y a.2) en un matraz volumétrico de 100mL más 20mL de ácido acético glacial, llevarlo al aforo con agua y mezclar para su uso.

b) Solución de nitrato de bismuto:

La solución madre de nitrato de bismuto estándar (0,081 mg/mL) se prepara disolviendo 8,05 mg de Subnitrato de bismuto (peso corregido con la pureza del compuesto) en 5mL de ácido nítrico concentrado y diluyendo a 100 mL con agua destilada.

c) Tioúrea al 3%:

Se prepara por dilución de 3 g en 100 mL de agua destilada.

d) Sulfuro de disódico al 1%:

Se prepara mediante la disolución de 1,56 g en 100 mL de agua destilada.

e) Solución de HCl al 7,4%:

10 mL de HCl al 37% en 50 mL de agua destilada.

3.6.4.3.2.2 Reacción del extracto con el reactivo DR y formación del complejo coloreado bismuto-tioúrea

Se toman 1mL de cada extracto vegetal y fracciones obtenidas a partir del procedimiento general para obtener alcaloides de extractos de material vegetal crudo, se transfiere a un balón volumétrico de 10mL y se afora con agua destilada (solución madre de cada una de las muestras).

Se toman 1mL de cada una de las soluciones madre antes preparadas de las distintas muestras, las mismas que deben estar a un pH de 2-2,5, para ello los ajustamos añadiendo 2ml de HCl al 7,4%. A la solución anterior se le añade 2mL de solución DR, se centrifugan y se obtienen diferentes precipitados, durante 15 minutos. Se adiciona 1mL más de solución de DR y se vuelve a centrifugar. Después de la centrifugación, el sobrenadante se decanta cuidadosamente por completo. El precipitado se lava con alcohol y se centrifuga nuevamente y el sobrenadante se decanta cuidadosamente. El precipitado obtenido se trata con 2 mL de solución de sulfuro de sodio (también se puede usar sulfuro de amonio) y se obtiene un precipitado negro marrón. Se adicionan 2 gotas más de sulfuro de sodio (se desecha el líquido).

El precipitado negro marrón presente en el tubo se disuelve en 2 mL de HNO3 concentrado, con calentamiento si es necesario. De esta solución se toma 1mL y se mezcla con 5mL de solución de tioúrea y el compuesto coloreado formado se mide espectrofotométricamente a 435 nm.

3.6.4.3.3 Identificación de alcaloides por capa fina (TLC)

Inicialmente se pasó por metanol cada una de las placas para retirar cualquier tipo de interferencia al momento de llevar a cabo la corrida. Para ello se añadió 50mL de MeOH en las cámaras para cromatografía, posteriormente se colocó las placas de silica gel, se dejó recorrer el solvente por una hora aproximadamente, después se pasó a cada una de las placas a la estufa a una temperatura de 100 °C durante una hora, transcurrido el tiempo se las saco y se procedió a utilizarlas.

Se realizó cromatografía en capa fina de cada uno de los extractos totales y fracciones obtenidas de las dos especies vegetales, para esto se sembró en banda colocando 3μL aproximadamente de cada uno de los extractos obtenidos y fracciones, para ello se empleó dos placas por cada tratamiento, en la primera se sembró los 3 extractos totales y las tres fracciones 1 de dichos extractos, en la segunda placa se sembró las fracciones 2 y fracciones 3.

La cámara para la cromatografía herméticamente cerrada fue saturada por el lapso de 30 minutos con la fase móvil Benceno: Etanol (45:5) y Benceno: Metanol (9:1). Se colocaron cada una de las placas en la cámara cromatográfica, se esperó a que el solvente recorra la placa hasta una distancia de 2 cm de la parte superior de la placa. Se procedió a retirar las placas y se colocaron en la campana durante un corto tiempo con la finalidad de que se secara la fase móvil. Con la finalidad de poder identificar las manchas se procedió a revelar en el UV y de esta manera se midieron las distancias recorridas para sacar los correspondientes RF

3.6.4.3.4 Determinación de la actividad antioxidante

3.6.4.3.4.1 Preparación del reactivo DPPH

Se preparó una solución 2mM de DPPH en metanol (se pesa 2mg de DPPH y se afora a 10 ml con metanol en la oscuridad), se coloca en un frasco ámbar y se mantiene en refrigeración hasta el momento del ensayo.

3.6.4.3.4.2 Preparación del reactivo Trolox

Se preparó una solución 10mM de Trolox en metanol (se pesa 1mg de Trolox y se afora a 10 ml con metanol).

3.6.4.3.4.3 Preparación de las muestras

Inicialmente como las distintas muestras a analizar presentaron una concentración de alcaloides alta y en ensayos previos con estas pues se determinó que presentan una actividad antioxidante muy grande al ser empleadas de forma directa en el ensayo, 67 entonces se procedió a tomar 20 μL del extracto total del material vegetal así como cada una de sus fracciones y se diluyó con 180 μL de metanol.

Se preparó la placa de 96 pocillos con la solución de Trolox y la muestra de los extractos a analizar, de acuerdo con las siguientes tablas:

Tabla N°11. Volúmenes para el método del radical DPPH – Trolox

Micropocillos Trolox DPPH Metanol (uL) (uL) (uL)

B1 4 60 136

B2 8 60 132

B3 12 60 128

B4 16 60 124

B5 20 60 120

B6 24 60 116

B7 28 60 112

Realizado por: German Dayra

Cabe recalcar que cada una de las diferentes muestras se colocó en la placa en orden, tomando en cuenta tanto las letras en cada fila y los números de cada columna con la finalidad de evitar confusiones.

Colocar la placa que contiene cada una de las muestras en agitación (200rpm) durante 30 minutos a temperatura ambiente (protegidos de la luz). Leer la placa con las muestras a una longitud de onda de 517nm utilizando el programa Gen5TM.

Capítulo IV

4 Análisis y Discusión de Resultados

4.1 Identificación de las plantas

La identificación de la planta se realizó en el Herbario “Alfredo Paredes” QAP de la Universidad Central del Ecuador, se corroboró que las plantas pertenecen a las especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, cuyo certificado se adjunta en el anexo C.

4.2 Material extraño

Para la identificación de materia extraña en cada una de las especies vegetales utilizadas se lo realizó de forma visual y los resultados obtenidos se obtuvieron los siguientes datos:

Tabla N°12. Material extraño de Ambrosia arborescens

Especies Método de Parte de Peso Peso Material % Materia vegetales extracción planta inicial (g) final (g) extraño extraña (g)

Hojas 100,00 99,953 0,047 4,7%

Ambrosia Reflujo Tallos 100,00 99,957 0,043 4,3% arborescens Hojas 30,00 29,960 0,043 4,0%

Maceración Tallos 30,00 29,965 0,035 3,5%

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°13. Material extraño de Tagetes multiflora

Especies Método de Parte de Peso Peso Material % Materia vegetales extracción planta inicial (g) final (g) extraño extraña (g)

Hojas 100,00 99,944 0,056 5,6%

Tagetes Reflujo Tallos 100,00 99,950 0,050 5,0% multiflora Hojas 30,00 29,955 0,055 4,5%

Maceración Tallos 30,00 29,955 0,035 4,5%

Elaborado por: German Dayra

Las especies vegetales presentan con frecuencia ciertas impurezas, se considera materia extraña a cualquier organismo, parte o producto de un organismo no comprendido en la definición o en la descripción; o residuos minerales, como por ej., tierra, piedras, arena o polvo (Farmacopea Argentina, 2013). Como se puede observar en la Tabla No 12 y en la Tabla No 13 se da a conocer los respectivos porcentajes (%) de material extraño para la especie Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora respectivamente, de acuerdo con los parámetros señalados por Métodos de control de calidad para materiales herbales de la OMS (WHO - Standardization Parameters, 2002) que determinan de forma general que para hojas no debe exceder el 5-6 % de material extraño y para tallos el 8%, comparando nuestros datos con estos podemos establecer que son aceptables en todos los casos. Los datos obtenidos pueden ser el resultado de una contaminación física del material vegetal, debido al proceso de recolección realizado, en el caso de la primera especie este proceso se lleva a cabo con mayor facilidad debido a que la planta es grande, sus hojas y tallos son de tamaño considerables lo que nos permite detectar con mayor facilidad materia extraña, en cambio para la especie Tagetes multiflora, la planta es de menor tamaño, las hojas son muy frágiles lo que exige una recolección más cautelosa ya que podemos ocasionar daños a la muestra y no resulta fácil determinar a simple vista agentes extraños.

4.3 Determinación de cenizas totales 푚 − 푚 % 푐푒푛푖푧푎푠 푡표푡푎푙푒푠 = ( 3 1) 푥 100 푚2 Donde:

m1=masa en gramos del crisol vacío. m2=masa en gramos de la muestra. m3= masa en gramos del crisol con las cenizas.

Tabla N°14. Resultados de cenizas totales para hojas de Ambrosia arborescens

Repeticiones m1 (g) m2 (g) m3 (g) % cenizas %promedio de cenizas totales

1 33,289 2,0020 33,4132 6,2037

2 35,445 2,0026 35,5692 6,2019 6,2031

3 34,360 2,0021 34,4842 6,2034

Realizado por: German Dayra

Tabla N°15. Resultados cenizas totales tallos de Ambrosia arborescens

Repeticiones m1 (g) m2 (g) m3 (g) % cenizas %promedio de cenizas totales

1 31,7177 2,0014 31,8530 6,7603

2 19,9588 2,0003 20,0941 6,7640 6,7617

3 31,8899 2,0012 32,0252 6,7609

Realizado por: German Dayra

Tabla N°16. Resultados cenizas totales hojas de Tagetes multiflora

Repeticiones m1 (g) m2 (g) m3 (g) % cenizas %promedio de cenizas totales

1 34,2558 2,0009 34,3411 4,2631

2 37,2189 2,0005 37,3042 4,2639 4,2639 3 35,661 2,0002 35,7463 4,2646

Realizado por: German Dayra.

Tabla N°17. Resultados cenizas totales tallos de Tagetes multiflora

Repeticiones m1 (g) m2 (g) m3 (g) % cenizas %promedio de cenizas totales

1 34,3652 2,003 34,4605 4,7579

2 34,3421 2,0035 34,4274 4,2575 4,6507 3 34,3337 2,0034 34,4326 4,9366

Realizado por: German Dayra

En las tabla N°14, N°15, N°16 y N°17, podemos observar los porcentajes (%) promedios de cenizas totales para hojas de Ambrosia arborescens, siendo este de 6,2032%, para tallos de Ambrosia arborescens, de 6,7617%, para hojas de Tagetes multiflora, siendo de 4,2639% y para tallos de Tagetes multiflora, de 6,6532%, según los parámetros estandarizados señalados para cenizas totales según los Métodos de control de calidad para materiales herbales de la OMS (WHO - Standardization Parameters, 2002) nos indica que este parámetro no debe exceder el 12% tomando este como referente los valores obtenidos son aceptables en todos los casos, las cenizas totales representan el porcentaje de residuo inorgánico o de otras impurezas que presenta el material vegetal, el mismo que queda después de quemar toda la materia orgánica, es probable que las diferentes muestras analizadas presenten contaminación en mayor o menor grado con

72 tierra, sílice, metales pesados o agentes extraños, explicando así la variación de porcentajes de cenizas en cuanto a tallos y hojas para las dos especies.

4.4 Determinación del porcentaje de material extraíble

Tabla N°18. Resultados de material extraíble para Extractos

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (g) (g) Ambrosia arborescens 0,31 0,29 Maceración 0,34 0,32 Reflujo 0,29 0,25 Tagetes multiflora 0,28 0,31 Maceración 0,36 0,35 Reflujo 0,21 0,27 Total general 0,30 0,30 Realizado por: German Dayra

Material Extraíble de Extractos Totales 0,40 0,36 0,34 0,35 0,35 0,32 0,29 0,30 0,25 0,27 0,25 0,21 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Maceración Reflujo Maceración Reflujo Ambrosia arborescens Tagetes multiflora Hojas Tallos

Gráfica N°1: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para los extractos totales entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Realizado por: German Dayra

Como podemos observar en la TablaN°18 y en el Gráfico N°1, los resultados de material extraíble para los extractos totales de las especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, este método determina la cantidad de compuestos extraídos con disolventes a partir de una cantidad dada de material vegetal (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013), en el caso de la especie Ambrosia arborescens existe una cantidad de constituyentes mayor en hojas con los dos métodos de extracción, en el caso de la otra especie Tagetes multiflora, la cantidad de constituyentes es mayor para hojas con el método de extracción maceración y tallos con el método de reflujo. Sin embargo, no se tienen datos de referencia con los cuales se pueda establecer una comparación.

Tabla N°19. Resultados de material extraíble para la Fracción 1

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (g) (g) Ambrosia arborescens 0,37 0,33 Maceración 0,37 0,35 Reflujo 0,36 0,31 Tagetes multiflora 0,30 0,15 Maceración 0,35 0,21 Reflujo 0,24 0,09 Total general 0,33 0,24 Elaborado por: German Dayra

Material Extraíble de Fracción 1

0,40 0,37 0,35 0,36 0,35 0,35 0,31 0,30 0,24 0,25 0,21 0,20 0,15 0,09 0,10 0,05 0,00 Maceración Reflujo Reflujo Maceración Ambrosia arborescens Tagetes multiflora

Hojas Tallos

Gráfica N°2: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para la fracción 1 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra 74

Como podemos observar en la TablaN°19 y en el Gráfico N°2, los resultados de material extraíble para la fracción 1 de las especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, este método determina la cantidad compuestos extraídos con disolventes a partir de una cantidad dada de material vegetal (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013), en el caso de las dos especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora la mayor cantidad de componentes activos las encontramos en hojas con los métodos de extracción maceración y reflujo, sin embargo, no se tienen datos de referencia con los cuales se pueda establecer una comparación.

Tabla N°20. Resultados de material extraíble para la Fracción 2

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (g) (g) Ambrosia arborescens 0,45 0,46 Maceración 0,45 0,48 Reflujo 0,44 0,45 Tagetes multiflora 0,46 0,36 Maceración 0,47 0,31 Reflujo 0,45 0,41 Total general 0,45 0,41 Elaborado por: German Dayra

Material Extraíble de Fracción 2 0,48 0,47 0,50 0,45 0,44 0,45 0,45 0,45 0,41 0,40 0,35 0,31 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Maceración Reflujo Maceración Reflujo Ambrosia arborescens Tagetes multiflora Hojas Tallos

Gráfica N°3: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para la fracción 2 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Como podemos observar en la Tabla N°20 y en el Gráfico N°3, los resultados de material extraíble para la fracción 2 de las especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, este método determina la cantidad de componentes solubles en el solvente de extracción a partir de una cantidad dada de material vegetal (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013), en el caso de la especie Ambrosia arborescens en los tallos con los métodos de extracción maceración y reflujo, existe una cantidad de constituyentes mayor, en el caso de la otra especie Tagetes multiflora, la cantidad de constituyentes es mayor para hojas con los dos métodos de extracción. Sin embargo, no se tienen datos de referencia con los cuales se pueda establecer una comparación.

Tabla N°21. Resultados de material extraíble para la Fracción 3

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (g) (g) Ambrosia arborescens 0,38 0,28 Maceración 0,41 0,27 Reflujo 0,35 0,28 Tagetes multiflora 0,37 0,18 Reflujo 0,36 0,25 Maceración 0,38 0,11 Total general 0,38 0,23 Elaborado por: German Dayra

Material Extraíble de Fracción 3

0,45 0,41 0,40 0,38 0,35 0,36 0,35 0,30 0,27 0,28 0,25 0,25 0,20 Hojas

0,15 0,11 Tallos 0,10 0,05 0,00 Maceración Reflujo Reflujo Maceración Ambrosia arborescens Tagetes multiflora

Gráfica N°4: Comparación de las masas obtenidas de material extraíble para la fracción 3 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra 76

Como podemos observar en la Tabla N°21 y en el Gráfico N°4, los resultados de material extraíble para la fracción 3 de las especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, este método determina la cantidad de compuestos solubles en el solvente de extracción a partir de una cantidad dada de material vegetal (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013), en el caso de las dos especies Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora la mayor cantidad de componentes las encontramos en hojas con los métodos de extracción maceración y reflujo, sin embargo, no se tienen datos de referencia con los cuales se pueda establecer una comparación.

4.5 Identificación de alcaloides por capa fina (TLC)

Tabla N°22. Valores de Rf para los extractos de Ambrosia arborescens

Especie vegetal Muestras Rf Compuesto identificado Extracto 1 0,78 Tallos Maceración Extracto 2 0,77 Ambrosia Extracto 3 0,78 Alcaloide arborescens Extracto 1 0,78 Tallos Reflujo Extracto 2 0,79 Extracto 3 0,78 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°23. Valores de Rf para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens

Especie vegetal Muestras Rf Compuesto identificado Extracto 1 0,78 Tallos Maceración Extracto 2 0,78 Ambrosia Extracto 3 0,77 Alcaloide arborescens Extracto 1 0,78 Tallos Reflujo Extracto 2 0,78 Extracto 3 0,79 Elaborado por: German Dayra

Para llevar a cabo la respectiva cromatografía en capa fina se ensayaron varios solventes realizando varias mezclas proporcionales, resultando ser buen eluyente la mezcla de benceno: etanol (45:5).

Como podemos observar en la Tabla N°22 y la Tabla N°23 los respectivos Rf para los extractos y la fracción 1 de la especie vegetal Ambrosia arborescens, según estudios bibliográficos encontrados en (Morales & Romero, 2009) que señalan la presencia de alcaloides pirrolizidínicos en extractos obtenidos a partir de especies del género Ambrosia, dicho estudio da un Rf de 0,78 con manchas de color azul violeta al ser expuestas las placas con las muestras respectivas al UV, en nuestro caso los Rf resultan ser iguales en algunas muestras y en otras similares al encontrado en la referencia y las manchas que se observan al UV muestran dichos colores, evidenciando así la presencia de alcaloides pirrolizidínicos tanto en extractos como en la fracción 1. (Ver Anexo D)

Cabe indicar que para la fracción 2 y fracción 3 para la especie vegetal Ambrosia arborescens, la mezcla de benceno: etanol en relación 45:5 no mostro resultados positivos, es decir; no se obtuvieron valores de Rf y las placas al ser expuestas al UV muestran manchas de otros colores diferentes a los señalados con anterioridad, por lo que podría tratarse de otros tipos de componentes.

Tabla N°24. Valores de Rf para los extractos de Tagetes multiflora

Especie vegetal Muestras Rf Compuesto identificado

Extracto 1 0,88

Tallos Maceración Extracto 2 0,87

Tagetes Extracto 3 0,88 Alcaloide multiflora Extracto 1 0,89

Tallos Reflujo Extracto 2 0,88

Extracto 3 0,88

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°25. Valores de Rf para la Fracción 1 de Tagetes multiflora

Especie vegetal Muestras Rf Compuesto identificado

Extracto 1 0,88

Tallos Maceración Extracto 2 0,88

Tagetes Extracto 3 0,87 Alcaloide multiflora Extracto 1 0,89

Tallos Reflujo Extracto 2 0,88

Extracto 3 0,87

Elaborado por: German Dayra

Para realizar la respectiva cromatografía en capa fina se probaron varios solventes con los mismos que se realizaron mezclas proporcionales, resultando ser buen eluyente la mezcla de benceno: metanol en relación 9:1.

Como podemos observar en la Tabla N°24 y la Tabla N°25 los respectivos Rf para los extractos y la fracción 1 de la especie vegetal Tagetes multiflora, según estudios bibliográficos encontrados en (Jimenez, 2002) que señalan la presencia de alcaloides en fracciones obtenidas a partir de especies del género Tagetes (no especificado el alcaloide del cual se trata), dicho estudio da un Rf de 0,88 con bandas de color verde fosforescente al ser expuestas las placas con las muestras respectivas al UV-VISIBLE, en nuestro caso los Rf resultan ser similares al encontrado en la referencia y las bandas que se observan al UV muestran dichos colores, evidenciando así la presencia de alcaloides tanto en extractos como en la fracción 1. (Ver Anexo D)

Cabe indicar que para la fracción 2 y fracción 3 de dicha especie vegetal, la mezcla de benceno: metanol en relación 9:1 no mostro resultados positivos, es decir; no se obtuvieron valores de Rf y las placas al ser expuestas al UV muestran manchas de otros colores mas no de los indicados por lo que podría tratarse de otros tipo de componentes.

La cromatografía de capa fina, o TLC, es un método para analizar mezclas mediante la separación de los compuestos presente en ella, verificar la identidad de los 79 compuestos, y la pureza de los mismos (Fiaz & Qazi, 2010). Al obtener los resultados antes mencionados podemos determinar a través de CCF que en los extractos totales y la fracción 1, los compuestos encontrados si se tratan de alcaloides sin embargo para la fracción 2 y la fracción 3 se trataría de otros compuestos nitrogenados.

Lo anteriormente mencionado se complementa con la realización de reacciones de precipitación, estas reacciones generales de precipitación se basan en el hecho de que los alcaloides forman combinaciones con metales y metaloides: bismuto, mercurio y yodo. En la práctica, lo que se usa es una solución que contiene yodo y yoduro, o una solución que contiene yoduro de potasio y cloruro mercúrico, conocido como reactivo de Mayer, o un reactivo que contiene nitrato de bismuto y yoduro de potasio, mejor conocido como el reactivo de Dragendorff. (Hegazy, 2017)

El reactivo de Dragendorff y sus modificaciones con frecuencia se consideran específicos de los compuestos alcaloidales y en menor grado para aminas terciarias, aunque está bien documentado que una serie de otros compuestos nitrogenados producirán reacciones falsas positivas con complejos reactivos de sal de metal como el de Dragendorff. Farnsworth (Anderson, Doggett, & Ross, 1977) rechaza la suposición indiscriminada de que el efecto positivo de Dragendorff significa alcaloide positivo y aboga por el uso de reactivos de detección de alcaloide en screening fitoquímicos solo después de la extracción específica para dichos compuestos. (Hegazy, 2017)

Varios constituyentes de las plantas reaccionan con Dragendorff de una manera típica de los alcaloides, los falsos alcaloides o compuestos oxigenados no nitrogenados son una variedad de componentes que dan reacciones de falsos positivos con este reactivo, las más frecuentes se han atribuido a la presencia de proteínas que precipitan en la adición de reactivos que contienen metales pesados, se incluyen en esta categoría de falsos alcaloides la ptomaína, ciertos glucósidos, carbohidratos, aminoácidos, compuesto de amonio cuaternario como la betaína, colina, purinas, aminas metiladas, taninos, aceites volátiles, algunos flavonoides, esteroles, triterpenos, hidroxiflavonas, lignanos, sales de amonio, compuestos como aminas primarias y secundarias también pueden detectarse con este reactivo pero deben estar en concentraciones muy altas, entre otros. (Halytskyi, 2011)

Durante la extracción de material vegetal, es importante minimizar la interferencia de los compuestos que pueden generar inconvenientes en la determinación y análisis de

80 los compuestos objeto de estudio, en este caso los compuestos antes mencionados pueden ocasionar problemas durante la selección de alcaloides especialmente cuando no se ha llevado a cabo suficientes pasos de purificación durante el proceso de partición o fraccionamiento del material crudo como tal o a partir de los extractos totales, la eliminación completa de estos constituyentes no se puede lograr a través del paso de purificación de una partición requerido en muchos procedimientos de detección de metabolitos reportados. Además, se pueden detectar cantidades significativas de dichos constituyentes (no alcaloidales) incluso después de una purificación adicional. (Habib, 1980)

De acuerdo a lo mencionado anteriormente podemos indicar que el método empleado para obtener las diferentes fracciones a partir de los extractos totales no nos dio los resultados esperados, los compuestos alcaloides están presentes en los extractos totales y el caso de las fracciones estos compuestos quedaron retenidos en la primera fase de la partición, es decir, en la fracción 1 confirmando su presencia mediante CCF respectivamente. Mientras que para las fracciones 2 y 3 al tener otro tipo de resultados en CCF diferentes a los señalados en la bibliografía y a los de la fracción 1 y extractos totales, podemos señalar en estas existe la presencia de otros compuestos nitrogenados, como se encuentra detallado en el procedimiento de fraccionamiento, en la fracción 2 están presentes también aminas cuaternarias o compuestos N-óxidos y en la tercera fracción encontramos aminas primarias, secundarias y terciarias, estos componentes forman parte del amplio grupo de compuestos que dan reacciones falso-positivas con el reactivo de Dragendorff, así para el proceso de cuantificación que se llevó a cabo más adelante para los extractos y la fracción 1 determinaremos la concentración de alcaloides expresados en mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco y para la fracción 2 y 3 en mg Componentes Nitrogenados (Bi) /g extracto seco por lo antes mencionado.

4.6 Cuantificación de alcaloides y compuestos nitrogenados en extractos totales y fracciones

4.6.1 Curva de calibración de bismuto. A partir de la curva de calibración que se presenta a continuación se llegó a obtener una ecuación, la misma que nos permitió encontrar las respectivas concentraciones de 81 alcaloides y compuestos nitrogenados presentes tanto en extractos totales como en cada una de las fracciones, dicha concentración tomando en cuenta el procedimiento antes mencionado fue expresa en mg de Alcaloide unido a bismuto/g de extracto seco y mg de Compuesto nitrogenado unido a bismuto/g extracto seco.

Tabla N°26. Datos obtenidos para la curva de calibración de bismuto

Concentración Absorbancia (mg/ml) (517nm) 0 0 0,0081 0,008 0,0162 0,024 0,0243 0,040 0,0324 0,056 0,0405 0,081 0,0486 0,097 0,0567 0,125 0,0648 0,133 0,0729 0,155 Elaborado por: German Dayra

Curva de calibración Concentración (mg/ml) Bi vs Absorbancia

0,18 0,16

0,14 0,12

0,1 0,08 0,06 y = 2,3169x - 0,0139 Absorbancia R² = 0,9947 0,04 0,02 0 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 Concentración (mg/ml)

Gráfica N°5: Curva de calibración de Bismuto

Elaborado por: German Dayra

TablaN°27. Datos experimentales de las Absorbancias de los extractos y fracciones para Ambrosia arborescens Absorbancia

Método de Sarker PARTE DE

de de F1 F2 F3 ESPECIES LA MÉTODO DE Extractos

VEGETALES PLANTA EXTRACCION N°

repetición

1 0,058 0,039 0,055 0,029 Maceración 2 0,061 0,043 0,060 0,036 3 0,057 0,044 0,059 0,038 Tallos 1 0,049 0,027 0,050 0,031

Reflujo 2 0,053 0,030 0,054 0,033 Ambrosia 3 0,051 0,029 0,053 0,032 arborescens 1 0,040 0,035 0,039 0,049 Maceración 2 0,046 0,038 0,044 0,051 3 0,044 0,034 0,043 0,052 Hojas 1 0,063 0,028 0,051 0,045 Reflujo 2 0,064 0,031 0,050 0,048 3 0,068 0,035 0,052 0,035 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°28. Datos experimentales de las Absorbancias de los extractos y fracciones para Tagetes multiflora Absorbancia

Método de Sarker PARTE DE F1 F2 F3 ESPECIES LA MÉTODO DE Extracto VEGETALES PLANTA EXTRACCION N° de

repetición s

1 0,034 0,021 0,039 0,030 Maceración 2 0,032 0,017 0,040 0,027 3 0,035 0,024 0,037 0,029 Tallos 1 0,020 0,016 0,041 0,021

Reflujo 2 0,022 0,014 0,039 0,020 Tagetes 3 0,021 0,011 0,038 0,015 multiflora 1 0,035 0,021 0,083 0,068 Maceración 2 0,046 0,033 0,074 0,063 3 0,036 0,039 0,079 0,066 Hojas 1 0,061 0,049 0,043 0,029 Reflujo 2 0,057 0,033 0,052 0,024 3 0,058 0,034 0,042 0,030 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°29. Concentración de extractos y fracciones para Tagetes multiflora Concentración de Alcaloides y compuestos nitrogenados (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) PARTE (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco)

ESPECIES DE LA MÉTODO DE Concentración de Fracciones

VEGETALES PLANTA EXTRACCION Extractos

1 2 3

N° de

repetición

Fracción

Fracción Fracción

1 0,3251 0,2275 0,2642 0,2950 Maceración 2 0,2634 0,2071 0,2699 0,2819 3 0,3032 0,2537 0,2496 0,3190 Tallos 1 0,2836 0,2077 0,2893 0,2493

Reflujo 2 0,2320 0,1999 0,2798 0,2497 Tagetes 3 0,3674 0,1756 0,2728 0,2289 multiflora 1 0,2471 0,1758 0,4463 0,4470 Maceración 2 0,3802 0,2463 0,4062 0,4204 3 0,3419 0,2630 0,4263 0,4337 Hojas 1 0,6625 0,3319 0,2836 0,2417 Reflujo 2 0,8139 0,2549 0,3174 0,2113 3 0,7917 0,2565 0,2646 0,2435 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°30. Concentración de extractos y fracciones para Ambrosia arborescens

Concentración de Alcaloides y compuestos nitrogenados (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) ESPECIES PARTE DE MÉTODO DE Concentración de Fracciones

VEGETALES LA EXTRACCION PLANTA Extractos

N° de

1 2 3

repetición

Fracción Fracción Fracción 1 0,4989 0,3309 0,3239 0,2326 Maceración 2 0,4973 0,3498 0,3329 0,2601 3 0,5930 0,3520 0,3211 0,2593 Tallos 1 0,5065 0,3033 0,3039 0,2707

Reflujo 2 0,6170 0,3237 0,3311 0,2650 Ambrosia 3 0,5670 0,3167 0,3282 0,2684 arborescens 1 0,3546 0,2586 0,2589 0,3750 Maceración 2 0,3621 0,2686 0,2853 0,3827 Hojas 3 0,3675 0,2509 0,2569 0,3950 1 0,5626 0,2519 0,3169 0,3550 Reflujo 2 0,6026 0,2644 0,3127 0,3736 3 0,6245 0,2822 0,3174 0,2956 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°31. Resultados de Concentración (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) para Extractos totales

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos Ambrosia arborescens 0,48 0,55 Maceración 0,36 0,53 Reflujo 0,60 0,56 Tagetes multiflora 0,54 0,30 Maceración 0,32 0,30 Reflujo 0,76 0,29 Total general 0,51 0,42 Elaborado por: German Dayra

Concentración de Extractos 0,76 0,80 0,70 0,60 0,56 0,60 0,53 0,50 0,40 0,36 0,29 0,32 0,30 0,30

0,20 Concentración Concentración 0,10 0,00 Reflujo Maceracion Reflujo Maceracion seco) extracto (Bi)/g Alcaloide (mg Ambrosia arborescens Tagetes multiflora

Muestras Hojas Tallos

Gráfica N°6: Comparación de la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°32. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Origen Suma de gl Media cuadrados cuadrática F Prob > F Modelo corregido 0,6121 7 0,0874 29,004 0,0000 Especie 0,0543 1 0,0543 18,020 0,0006* Método 0,1831 1 0,1831 60,748 0,0000* Parte de Planta 0,0465 1 0,0465 15,428 0,0012* Especie * Método 0,0097 1 0,0097 3,228 0,0913 Especie * Parte de Planta 0,1455 1 0,1454 48,249 0,0000 Método * Parte de Planta 0,1523 1 0,1523 50,515 0,0000 Especie * Método * Parte de 0,0206 1 0,0206 6,838 0,0188 Planta Error 0,048 16 0,0030 Total corregido 0,660 23 0,0287 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°32, se observa que los factores principales, es decir que el factor Especie, el factor Método y el factor Parte de Planta interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, lo que indica que los tres factores antes mencionados influyen o tienen un efecto significativo en la concentración de alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco) para los extractos en las dos especies, debido a que su valor Prob≤0,05.

Con la finalidad de determinar como la concentración de alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco) en los extractos obtenidos se ve influenciada por los factores antes descritos se lleva a cabo una prueba T para muestras independientes con un nivel del 95,0 % el cual compara las medias de dichos factores.

Especie/Código N Media Desviación estándar Ambrosia 12 0,5128 0,1012 Concentración arborescens extractos Tagetes 12 0,4177 0,2118 multiflora Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°33, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar para las dos especies vegetales, para Ambrosia arborescens, la concentración promedio de alcaloides en los extractos es de 0,5128 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,1012 y la concentración de alcaloides en los extractos promedio para Tagetes multiflora es de 0,4177 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,2118, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media, en cuanto a la comparación de medias no existe diferencia entre estas, por lo cual la concentración de alcaloides en los extractos no dependerá de las especies vegetales empleadas.

Tabla N°34. Prueba T para muestras independientes para las especies vegetales en relación a la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) en los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. T gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas 1,404 22 0,174 0,0952 0,0678 -0,0454 0,2357 iguales 0,028

No se

asumen

de de extractos varianzas 1,404 15,770 0,180 0,0952 0,0678 -0,0487 0,2390 Concentración iguales Elaborado por: German Dayra 87

En la tabla N°34, podemos observar la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, señalando las dos posibles situaciones en relación a la varianza, la primera es que sean iguales y la otra es que estas sean diferentes. En nuestro caso su valor p (también conocido como significación estadística) toma el valor 0,028, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas la prueba indica que no se cumple en los factores analizados (especies vegetales).

La prueba T para muestras independientes indica que se acepta que no existe diferencia en las concentraciones de alcaloides de los extractos entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora (t=1,404, gl=15,770, significancia (bilateral)=0,180), pero además nos da el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la misma estará comprendida entre los valores -0,0487 y 0,2390, dado que la diferencia entre las dos medias es de 0,0952 y este valor se encuentra dentro del intervalo de confianza, también nos permite aceptar que no se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre las dos muestras en lo referente a su media.

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Maceración 12 0,3779 0,1027 extractos Reflujo 12 0,5526 0,1812 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°35, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre los métodos de extracción maceración y reflujo, para maceración la concentración en de alcaloides en los extractos promedio es de 0,3779 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,1027 y la concentración de alcaloides en los extractos promedio para reflujo es de 0,5526 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,1812, en los dos casos los datos de desviación estándar nos

88 señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias existe diferencia entre estas, por lo que la concentración de alcaloides en los extractos dependerá de los métodos de extracción empleadas.

Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la t gl (bil) medias error diferencia estándar Sig. Inf Sup Se asumen varianzas iguales 0,118 -2,906 22 0,008 -0,1747 0,0601 -0,2994 -0,0500

No se asumen -2,906 17,403 0,010 -0,1747 0,0601 -0,3013 -0,4808

de de extractos varianzas Concentración iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°36, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis el valor p es de 0,118, siendo este valor de p mayor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que si cumple para los métodos de extracción.

La prueba T para muestras independientes señala que si existe diferencia en las concentraciones de alcaloides para los extractos entre los métodos de extracción maceración y reflujo extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes métodos de extracción maceración y reflujo (t=-2,906 gl=22, significancia (bilateral)=0,008), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores -0,2994 y -0,0500, dado que la diferencia entre las dos medias es de -0,1747, dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que las medias de los dos métodos señalados con anterioridad son estadísticamente diferentes. 89

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Tallos 12 0,4212 0,1394 extractos Hojas 12 0,5092 0,1907 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°37, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de planta empleadas tallos y hojas, para tallos la concentración en de alcaloides en los extractos promedio es de 0,4212 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,1394 y la concentración de alcaloides en los extractos promedio para reflujo es de 0,5092 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,1907, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias no existe diferencia entre estas, por lo que la concentración de alcaloides en los extractos no dependerá de las partes de la planta utilizadas.

Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas -1,291 22 0,210 -0,0880 0,6819 -0,2295 0,0534 iguales 0,126

No se extractos asumen -1,291 20,151 0,211 -0,0880 0,6819 -0,2302 0,0541

de de varianzas

Concentración iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°38, tenemos inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, para nuestro análisis su valor p es de 0,126, siendo este valor de p mayor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que si cumple para las dos partes de planta (tallos y hojas).

La prueba T para muestras independientes señala que no existe diferencia en las concentraciones de alcaloides de los extractos entre las partes de las plantas empleadas tallos y hojas de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos de dos diferentes partes de planta (t=-1,291 gl=22, significancia (bilateral)=0,210), también hallamos el intervalo de confianza, el mismo que comprende la diferencias de medias, este indica que la diferencia estará entre los valores -0,2295 y 0,0534, dado que la diferencia entre las dos medias es de -0,0880, dicho valor si se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite reconocer que las medias para las partes de planta son estadísticamente iguales.

Tabla N°39. Resultados de Concentración (mg Alcaloide (Bi)/g. extracto seco) para Fracción 1

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) Ambrosia arborescens 0,26 0,33 Maceración 0,26 0,34 Reflujo 0,27 0,31 Tagetes multiflora 0,25 0,21 Maceración 0,23 0,23 Reflujo 0,28 0,19 Total general 0,26 0,27 Elaborado por: German Dayra

Concentración de Fracción 1 0,40 0,34 0,35 0,31 0,28 0,30 0,26 0,27 0,25 0,23 0,23 0,19 0,20 0,15 0,10

Concentración Concentración 0,05 0,00 Maceracion Reflujo Reflujo Maceracion

(mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) extracto (Bi)/g Alcaloide (mg Ambrosia arborescens Tagetes multiflora Muestras Hojas Tallos

Gráfica N°7: Comparación de la Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°40. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Origen Suma de gl Media F cuadrados cuadrática Prob > F Modelo corregido 0,04986 7 0,0071 10,44 0,0001 Especie 0,0236 1 0,0236 34,64 0,0000* Método 9,9715e-06 1 9,9715e-06 0,01 0,9053 Parte de Planta 0,0009 1 0,0009 1,25 0,2803 Especie * Método 0,0006 1 0,0006 0,91 0,3546 Especie * Parte de Planta 0,0180 1 0,0180 26,35 0,0001 Método * Parte de Planta 0,0058 1 0,0058 8,48 0,0102 Especie * Método * Parte 0,0010 1 0,0010 1,45 0,2463 de Planta Error 0,0109 16 0,0007 Total corregido 0,0608 23 0,0026 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°40, se observa que los factores principales: factor Especie, interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, lo que indica que este factor antes mencionado influyen o tienen un efecto significativo en la concentración de alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco) para la fracción 1, debido a que su valor Prob≤0,05.

Con la finalidad de determinar como la concentración de alcaloides (mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco) en la fracción 1 obtenidos se ve influenciada por el factor especie se lleva a cabo una prueba T para muestras independientes con un nivel del 95,0 % el cual compara las medias de dicho factor.

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Ambrosia arborescens 12 0,2961 0,0379 fracción 1 Tagetes multiflora 12 0,2333 0,0440 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°41, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar para las dos especies vegetales, para Ambrosia arborescens, la concentración promedio de alcaloides en los extractos es de 0,2961 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0379 y la concentración de alcaloides en los extractos promedio para Tagetes multiflora es de 0,2333 mg Alcaloide (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0440, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media, en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo cual la concentración de alcaloides en los extractos dependerá de las especies vegetales empleadas

Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. T gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas 3,741 22 0,001 0,0628 0,0168 0,0280 0,0975 iguales 0,901

No se

fracción fracción 1 asumen 3,741 21,527 0,001 0,0628 0,0168 0,0279 0,0976 de de varianzas Concentración iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°42, tenemos inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, señalando las dos posibles situaciones en relación a la varianza, la primera es que sean iguales y la otra es que estas seas diferentes, su valor p es de 0,901, siendo este valor de p mayor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas la prueba indica que si se cumple en los factores analizados (especies vegetales).

La prueba T para muestras independientes señala que se acepta que si existe una diferencia en las concentraciones de alcaloides de la fracción 1 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora (t=3,741, gl=22, significancia (bilateral)=0,01), pero además nos da el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, la misma que estará comprendida entre los valores 0,0280 y 0,0975, dado que la diferencia entre las dos medias es de 0,0628 y este valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, nos permite aceptar que las medias son estadísticamente diferentes.

Tabla N°43. Resultados de Concentración (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para Fracción 2

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) Ambrosia arborescens 0,29 0,32 Maceración 0,27 0,33 Reflujo 0,32 0,32 Tagetes multiflora 0,36 0,27 Maceración 0,43 0,26 Reflujo 0,29 0,28 Total general 0,32 0,30 Elaborado por: German Dayra

Concentración de Fracción 2 0,45 0,43 0,40

0,35 0,32 0,32 0,33 0,29 0,28 0,30 0,26 0,27 0,25

0,20 0,15

Concentración Concentración 0,10 0,05 0,00

(mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco extracto (Bi)/g Alcaloide (mg Maceracion Reflujo Reflujo Maceracion

Tagetes multiflora Ambrosia arborescens Muestras Hojas Tallos

Gráfica N°8: Comparación de la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°44. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Suma de gl Media Origen cuadrados cuadrática F Prob > F Modelo corregido 0,0584 7 0,0083 36,76 0,0000 Especie 0,0003 1 0,0003 1,20 0,2904 Método 0,0021 1 0,0021 9,18 0,0080* Parte de Planta 0,0044 1 0,0044 19,45 0,0004* Especie * Método 0,0098 1 0,0098 43,38 0,0000 Especie * Parte de Planta 0,0211 1 0,0211 93,01 0,0000 Método * Parte de Planta 0,0040 1 0,0040 17,72 0,0007 Especie * Método * Parte de 0,0166 1 0,0166 73,37 0,0000 Planta Error 0,0036 16 0,0002 Total corregido 0,0620 23 0,0027 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°44, se puede analizar que los factores principales: factor Método, y factor Parte de Planta, interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, dicho de otra manera que estos dos factores influyen o tienen un efecto significativo en la concentración de compuestos nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para la fracción 2, debido a que su valor Prob≤0,05.

Con la finalidad de determinar como la concentración de compuestos nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco) en la fracción 2 obtenidos se ve influenciada por los factores antes mencionados se lleva a cabo una prueba T para muestras independientes con un nivel del 95,0 %, el cual compara las medias de dicho factor.

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Maceración 12 0,3201 0,0703 fracción 2 Reflujo 12 0,3015 0,0225 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°45, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre los métodos de extracción maceración y reflujo, para maceración la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 2 promedio es de 0,3201 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0703 y la concentración de compuestos nitrogenados promedio en la fracción 2 para reflujo es de 0,3015 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0225, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias no existe diferencia entre estas, por lo que la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 2 no dependerá de los métodos de extracción empleados.

Tabla N°46. Prueba T para muestras independientes para los métodos de extracción en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen

varianzas 0,874 22 0,391 0,0186 0,0213 -0,0256 0,0623 iguales 0,005

No se asumen 0,874 13,239 0,391 0,0186 0,0213 -0,0273 0,0646 fracción fracción 2 varianzas Concentración iguales Elaborado por: German Dayra 97

En la tabla N°46, tenemos inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis su valor p es de 0,005, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no cumple para los métodos de extracción en la fracción 2.

La prueba T para muestras independientes indica que no existe diferencia en las concentraciones de compuestos nitrogenados de la fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes métodos de extracción maceración y reflujo (t=0,874 gl=13,239, significancia (bilateral)=0,391), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores -0,0273 y 0,0646, la diferencia entre las dos medias es de 0,0186, dicho valor si se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que las medias en los dos métodos señalados con anterioridad son estadísticamente iguales.

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Tallos 12 0,2972 0,0298 fracción 2 Hojas 12 0,3244 0,0659 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°47, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de la planta tallos y hojas, para tallos la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 2 promedio es de 0,2972 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0298 y la concentración de compuestos nitrogenados promedio en la fracción 2 para hojas es de 0,3244 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0659, en los dos

98 casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias no existe diferencia entre estas, por lo que la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 2 no dependerá de los de la parte de la planta utilizados.

Tabla N°48. Prueba T para muestras independientes para las partes de la planta en relación a la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen

varianzas -1,298 22 0,208 -0,0271 0,0209 -0,0704 0,0162 iguales 0,047

No se -1,298 15,316 0,213 -0,0271 0,0209 -0,0716 0,0173 asumen fracción fracción 2 varianzas Concentración iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°48, se presenta la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, su valor p es de ,047 este valor es menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no cumple para las dos partes de planta (tallos y hojas) en la fracción 2.

La prueba T para muestras independientes señala que no existe diferencia en las concentraciones de compuestos nitrogenados entre las partes de la planta tallos y hojas de la fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos de dos diferentes partes de planta (t=-1,298, gl=15,316, significancia (bilateral)=0,213), encontramos además el intervalo de confianza, el mismo que comprende la diferencias de medias, esta indica que la diferencia estará entre los valores -0,0716 y 0,0173, dado que la diferencia entre las dos medias es de -0,0271, dicho valor si se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite reconocer que las medias para las partes de planta no son estadísticamente diferentes. 99

Tabla N°49. Resultados de Concentración (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para Fracción 3

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) Ambrosia arborescens 0,36 0,26 Maceración 0,38 0,25 Reflujo 0,34 0,27 Tagetes multiflora 0,33 0,27 Maceración 0,43 0,30 Reflujo 0,23 0,24 Total general 0,35 0,26 Elaborado por: German Dayra

Concentración de Fracción 3 0,50 0,43 0,45 0,38 0,40 0,34 0,35 0,30 0,30 0,25 0,27 0,23 0,24 0,25 0,20 0,15 Concentración Concentración 0,10 0,05 0,00

(mg Alcaloide (Bi)/g extracto seco extracto (Bi)/g Alcaloide (mg Maceracion Reflujo Maceracion Reflujo Ambrosia arborescens Tagetes multiflora Muestras Hojas Tallos

Gráfica N°9: Comparación de la Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

100

Tabla N°50. Análisis de varianza ANOVA de Concentración de Compuestos Nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/g extracto seco) en la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Suma de gl Media Origen cuadrados cuadrática F Prob > F Modelo corregido 0,1131 7 0,0162 42,87 0,0000 Especie 0,0005 1 0,0005 1,37 0,2583 Método 0,0300 1 0,0300 79,70 0,0000* Parte de Planta 0,0412 1 0,0412 109,41 0,0000* Especie * Método 0,0202 1 0,0202 53,56 0,0000 Especie * Parte de Planta 0,0025 1 0,0025 6,74 0,0195 Método * Parte de Planta 0,0159 1 0,0159 42,11 0,0000 Especie * Método * Parte de 0,0027 1 0,0027 7,23 0,0161 Planta Error 0,0060 16 0,0004 Total corregido 0,1191 23 0,0052 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°50, se puede analizar que el factor Método y factor Parte de Planta, interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, dicho de otra manera, estos dos factores influyen o tienen un efecto significativo en la concentración de compuestos nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco) para la fracción 3, debido a que su valor Prob≤0,05.

Con la finalidad de determinar como la concentración de compuestos nitrogenados (mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco en la fracción 3 obtenidos se ve influenciada por los factores antes mencionados se lleva a cabo una prueba T para muestras independientes con un nivel del 95,0 %, el cual compara las medias de dicho factor.

101

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Maceración 12 0,3418 0,0757 fracción 3 Reflujo 12 0,2711 0,0487 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°51, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre los métodos de extracción maceración y reflujo, para maceración la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 3 promedio es de 0,3418 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0757 y la concentración de compuestos nitrogenados promedio en la fracción 3 para reflujo es de 0,2711 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0487, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo que la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 3 dependerá de los métodos de extracción empleados.

varianzas 2,723 22 0,012 0,0707 0,0260 0,0169 0,1246

iguales 0,017

No se asumen 2,723 18,776 0,014 0,0707 0,0260 0,0163 0,1252 fracción fracción 3 varianzas Concentración iguales Elaborado por: German Dayra 102

Como podemos observar en la tabla N°52, la Prueba de Levene de igualdad de varianzas se muestra inicialmente, en nuestro análisis el valor de p es de 0,017, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no cumple para los métodos de extracción en la fracción 3.

La prueba T para muestras independientes indica que existe diferencia en las concentraciones de compuestos nitrogenados de la fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes métodos de extracción maceración y reflujo (t=2,723 gl=18,776, significancia (bilateral)=0,14), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores 0,0163 y 0,1252, la diferencia entre las dos medias es de 0,0707, dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, por lo que se acepta que las medias en los dos métodos señalados con anterioridad son estadísticamente diferentes.

Especie/Código N Media Desviación estándar Concentración Tallos 12 0,2650 0,0253 fracción 3 Hojas 12 0,3479 0,0803 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°53, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de la planta tallos y hojas, para tallos la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 3 promedio es de 0,2650 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0253 y la concentración de compuestos nitrogenados promedio en la

103 fracción 3 para hojas es de 0,3479 mg Compuestos Nitrogenados (Bi)/ g extracto seco, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 0,0803, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo que la concentración de compuestos nitrogenados en la fracción 3 dependerá de las partes de la planta utilizadas.

iguales 0,001

No se asumen -3,412 13,164 0,005 -0,0829 0,243 -0,1353 -0,0305 fracción fracción 3 varianzas Concentración iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°54, se presenta inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, para nuestro análisis el valor p es de ,001 este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no cumple para las dos partes de planta (tallos y hojas) para la fracción 3.

La prueba T para muestras independientes señala que si existe diferencia en las concentraciones de compuestos nitrogenados de la fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos de dos diferentes partes de planta (t=-3,412, gl=13,164, significancia (bilateral)=0,05), encontramos además el intervalo de confianza, el mismo 104 que comprende la diferencias de medias, el mismo que nos indica que la diferencia estará entre los valores -0,1353 y -0,0305, dado que la diferencia entre las dos medias es de - 0,0829, dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite determinar que las medias para las partes de planta son estadísticamente diferentes.

4.7 Evaluación de la actividad antioxidante método DPPH.

Para la evaluación de la actividad antioxidante se utilizó el método DPPH utilizando como estándar de referencia el Trolox y el solvente empleado fue el metanol.

Tabla N°55. Datos obtenidos para la curva de calibración para la actividad antioxidante

Micropocillos Trolox Concentración %IC (uL) Trolox (ppm) B1 4 2 11,310 B2 8 4 23,982 B3 12 6 40,271 B4 16 8 50,792 B5 20 10 69,683 B6 24 12 89,932 B7 28 14 90,045 Elaborado por: German Dayra

Se realizó la curva de calibración obteniéndose un buen coeficiente de correlación R2 0,9904 como se observa en el (grafico 10).

%IC vs Concentración (ppm) 120,000 100,000 y = 7,0986x - 3,072 R² = 0,9801 80,000

60,000 %IC 40,000 20,000

0,000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Concentracion Trolox (ppm)

Gráfica N°10: Curva de calibración del Trolox 105

Con los resultados obtenidos en la Tabla N°55 se realizó el cálculo del porcentaje de inhibición mediante la ecuación.

ퟏ − (푨 − 푨 ) % 풅풆 풊풏풉풊풃풊풄풊ó풏 풅풆풍 풓풂풅풊풄풂풍 푫푷푷푯 = ( 풎 풃 ) 풙 ퟏퟎퟎ 푨푷푹

Donde:

Am= Absorbancia de la muestra (extracto/fracción + DPPH +metanol)

Ab= Absorbancia del blanco de la muestra (extracto/fracción + metanol)

APR = Absorbancia del patrón de referencia (DPPH + metanol)

Tabla N°56. Datos de Absorbancias para Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Ambrosia arborescens

Absorbancia Absorbancia de Absorbancia Fracciones ESPECIES PARTE MÉTODO DE de Extractos VEGETALES DE LA EXTRACCION

N° de

PLANTA 1 2 3

repetición

Fracción Fracción Fracción 1 0,420 0,663 0,726 0,730 Maceración 2 0,338 0,698 0,691 0,766 3 0,299 0,608 0,726 0,739 Tallos 1 0,486 0,500 0,674 0,644

Reflujo 2 0,398 0,461 0,637 0,551 Ambrosia 3 0,327 0,523 0,656 0,660 arborescens 1 0,278 0,602 0,779 0,736 Maceración 2 0,275 0,431 0,781 0,751 3 0,165 0,618 0,783 0,690 Hojas 1 0,152 0,492 0,723 0,712 Reflujo 2 0,010 0,479 0,717 0,695 3 0,148 0,486 0,680 0,664 Elaborado por: German Dayra

106

Tabla N°57. Datos de Absorbancias para Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Tagetes multiflora

Absorbancia Absorbancia de Absorbancia Fracciones ESPECIES PARTE MÉTODO DE de Extractos VEGETALES DE LA EXTRACCION

N° de

PLANTA 1 2 3

repetición

Fracción Fracción Fracción 1 0,100 0,340 0,810 0,772 Maceración 2 0,153 0,430 0,810 0,789 3 0,139 0,385 0,817 0,781 Tallos 1 0,077 0,335 0,759 0,535

Reflujo 2 0,100 0,492 0,733 0,586 Tagetes 3 0,091 0,414 0,784 0,485 multiflora 1 0,108 0,110 0,752 0,665 Maceración 2 0,148 0,191 0,746 0,708 3 0,132 0,102 0,740 0,708 Hojas 1 0,101 0,113 0,793 0,771 Reflujo 2 0,239 0,140 0,795 0,783 3 0,191 0,165 0,791 0,794 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°58. Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Ambrosia arborescens

% de Inhibición % Inhibición de Fracciones

% ESPECIES PARTE MÉTODO DE Inhibición

VEGETALES DE LA EXTRACCION

N° de de 1 2 3

PLANTA repetición

Extractos Fracción Fracción Fracción 1 57,1429 27,7381 19,0476 18,810 Maceración 2 65,7143 24,2857 22,7381 14,048 3 70,7143 32,9762 19,0476 17,262 Tallos 1 47,2619 44,1667 26,6667 30,476

Reflujo 2 58,4524 50,8333 29,7619 39,286 Ambrosia arborescens 3 68,6905 43,3333 27,5000 26,310 1 73,9286 34,1667 12,5000 17,381 Maceración 2 74,2857 54,5238 12,2619 16,190 3 88,2143 31,0714 13,0952 23,690 Hojas 1 101,7857 47,9762 19,4048 20,357 Reflujo 2 106,6786 47,9762 21,9048 22,500 3 92,6190 47,1429 25,3571 27,857 Elaborado por: German Dayra

107

Tabla N°59. Porcentaje de Inhibición de extractos y fracciones para Tagetes multiflora

% de Inhibición % Inhibición de Fracciones

% ESPECIES PARTE MÉTODO DE Inhibición

VEGETALES DE LA EXTRACCION

N° de de 1 2 3

PLANTA repetición

Extractos Fracción Fracción Fracción 1 98,5714 64,6429 9,7619 12,976 Maceración 2 88,6905 54,4048 9,7619 11,310 3 102,3810 59,4048 9,0476 13,690 Tallos 1 98,2143 65,2381 16,5476 42,619

Reflujo 2 94,7619 46,6667 20,1190 36,071 Tagetes 3 97,2619 56,7857 15,2381 47,619 multiflora 1 95,8333 95,1190 19,5238 25,833 Maceración 2 90,7143 95,8333 16,9048 20,476 3 92,9762 95,7143 17,1429 20,476 Hojas 1 100,4762 93,0952 12,2619 15,714 Reflujo 2 90,9524 92,3810 17,5000 8,333 3 87,0238 88,4524 11,0714 10,476 Elaborado por: German Dayra

Tabla N°60. Resultados del Porcentaje de Inhibición % para Extractos

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (Porcentaje de Inhibición %) Ambrosia arborescens 89,59 61,33 Maceración 78,81 64,52 Reflujo 100,36 58,13 Tagetes multiflora 93,00 96,65 Maceración 93,17 96,55 Reflujo 92,82 96,75 Total general 91,29 78,99 Elaborado por: German Dayra

108

Porcentaje (%) de Inhibición de Extractos 120,00 96,55 96,75 100,36 100,00 93,17 92,82 78,81 80,00 64,52 58,13 60,00

40,00 % Inhibición % de 20,00

0,00 Maceracion Reflujo Reflujo Maceracion Tagetes multiflora Ambrosia arborescens Muestras Hojas Tallos

Gráfica N°11: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°61. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Origen Suma de gl Media F cuadrados cuadrática Prob > F Modelo corregido 5443,1720 7 777,5960 16,08 0,0000 Especie 2249,8069 1 2249,8069 46,53 0,0000* Método 84,4962 1 84,4196 1,75 0,2050 Parte de Planta 908,1209 1 908,1209 18,78 0,0005* Especie * Método 88,0298 1 88,0298 1,82 0,1960 Especie * Parte de Planta 1527,0606 1 1527,0606 31,58 0,0000 Método * Parte de Planta 281,2252 1 281,2252 5,82 0,0232 Especie * Método * Parte de 304,5090 1 304,5090 6,30 0,0188 Planta Error 773,6575 16 48,3536 Total corregido 6216,8295 23 270,2969 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

109

Como podemos analizar en la tabla N°61, que los factores principales, es decir que el factor Especie y el factor Parte de Planta interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, lo que indica que los dos factores antes mencionados influyen o tienen un efecto significativo en Porcentaje de Inhibición para los extractos en las dos especies, debido a que su valor Prob≤0,05.

Con la finalidad de determinar como el Porcentaje (%) de Inhibición de los extractos obtenidos se ve influenciada por los factores antes descritos se llevaron a cabo pruebas T para muestras independientes con un nivel del 95,0 % el cual compara las medias de dichos factores

Tabla N°62. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje Ambrosia 12 75,46% 18,37 (%) de arborescens Inhibición de Tagetes 12 94,82% 4,82 los Extractos multiflora Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°62, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar para las dos especies vegetales, para Ambrosia arborescens, el porcentaje (%) de inhibición promedio en los extractos para Ambrosia arborescens es de 75,46 %, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 18,37 y el porcentaje (%) de inhibición promedio en los extractos para Tagetes multiflora es 94,82 %, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 4,82 en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media, en cuanto a la comparación de medias si existe

110

diferencia entre estas, por lo cual el porcentaje (%) de inhibición en los extractos dependerá de las especies vegetales empleadas

Tabla N°63. Prueba T para muestras independientes entre las especies vegetales con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

iguales 0,002

No se

extractos asumen -3,532 12,51 0,004 -19,3641 5,4821 -31,2551 -7,4731 % Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra

Si analizamos la tabla N°63, podemos observar inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro caso su valor p es de 0,002, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas la prueba indica que no se cumple en las factores analizados (especies vegetales) para el porcentaje (%) de inhibición de los extractos.

La prueba T para muestras independientes indica que existe diferencia en cuanto al porcentaje (%) de Inhibición de los extractos entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora (t=-3,532, gl=12,51, significancia (bilateral)=0,004), pero además nos da el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la misma estará comprendida entre los valores -31,2551 y -7,4731, dado que la diferencia entre las dos medias es de -19,3641, este valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, lo que nos permite aceptar que en las medias del porcentaje de inhibición de las dos especies, si se han encontrado diferencias estadísticamente significativas referente a su media. 111

Tabla N°64. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje Tallos 12 78,98 19,62 (%) de Inhibición de Hojas 12 91,29 9,89 los Extractos Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°64, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de la planta tallos y hojas, para tallos el porcentaje de inhibición promedio para los extractos es de 78,98%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 19,62 y el porcentaje de inhibición promedio para los extractos en hojas es de 91,29%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 9,89, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias no existe diferencia entre estas, por lo que el porcentaje de inhibición en la fracción 3 no dependerá de las partes de la planta utilizadas.

Tabla N°65. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas -1,940 22 0,065 -12,3026 6,3417 -25,4545 0,8494

iguales 0,001

No se

extractos asumen -1,940 16,249 0,070 -12,3026 6,3417 -25,7296 1,1245

% Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra

112

En la tabla N°65, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis su valor p es de 0,001, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no se cumple para las partes de la planta.

La prueba T para muestras independientes señala que no existe diferencia en el porcentaje (%) de inhibición de los extractos de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes partes de planta tallos y hojas (t=-2,940 gl=16,249, significancia (bilateral)=0,070), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores -25,7296 y -1,1245, dado que la diferencia entre las dos medias es de - 12,3026 dicho valor si se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que las medias del porcentaje (%) de inhibición para tallos y hojas no son estadísticamente diferentes.

Tabla N°66. Resultados del Porcentaje de Inhibición % para Fracción 1

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (Porcentaje de Inhibición %) Ambrosia arborescens 43,81 37,22 Maceración 39,92 28,33 Reflujo 47,70 46,11 Tagetes multiflora 93,43 57,86 Maceración 95,56 59,48 Reflujo 91,31 56,23 Total general 68,62 47,54 Elaborado por: German Dayra

113

Porcentaje (%) de Inhibición de Fracción 1 120,00 95,56 100,00 91,31

80,00 59,48 56,23 60,00 47,7046,11 39,92

40,00 28,33 % Inhibición % de 20,00

0,00 Maceracion Reflujo Reflujo Maceracion Tagetes multiflora Ambrosia arborescens Hojas Tallos Muestras

Gráfica N°12: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°67. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Origen Suma de gl Media F Prob > F cuadrados cuadrática Modelo corregido 11939,0113 7 1705,57304 42.95 0,0000 Especie 7404,26686 1 7404,26686 186.46 0,0000* Método 122,251077 1 122,251077 3.08 0,0985 Parte de Planta 2666,53959 1 2666,53959 67.15 0,0000* Especie * Método 409,751199 1 409,751199 10.32 0,0054 Especie * Parte de Planta 1260,46436 1 1260,46436 31.74 0,0000 Método * Parte de Planta 45,3095949 1 45,3095949 1.14 0,3013 Especie * Método * Parte 30,4285905 1 30,4285905 0.77 0,3943 de Planta Error 635,345888 16 39,709118 Total corregido 12574,3572 23 546,711181 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

114

Como podemos analizar en la tabla N°67, que los factores principales, es decir que el factor Especie y el factor Parte de Planta interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, lo que indica que los dos factores antes mencionados influyen o tienen un efecto significativo en Porcentaje de Inhibición para la Fracción 1 en las dos especies, debido a que su valor Prob≤0,05.

Tabla N°68. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje Ambrosia 12 40,52% 9,96 (%) de arborescens Inhibición Tagetes 12 75,64% 19,25 Fracción 1 multiflora Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°68, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar para las dos especies vegetales, para Ambrosia arborescens, el porcentaje (%) de inhibición promedio de la fracción 1 para Ambrosia arborescens es de 40,52 %, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 9,96 y el porcentaje (%) de inhibición promedio de la fracción 1 para Tagetes multiflora es 75,64%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 19,25 en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media, en cuanto a la comparación de medias si existe

115

diferencia entre estas, por lo cual el porcentaje (%) de inhibición en los extractos dependerá de las especies vegetales empleadas.

Tabla N°69. Prueba T para muestras independientes entre las especies vegetales con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas -5,613 22 0,000 -35,1290 6,2583 -48,1081 -22,1500 iguales ,000

No se

Inhibición

asumen fracción fracción 1 -5,613 16,49 0,000 -35,1290 6,2583 -48,3637 -21,8943 % varianzas iguales Elaborado por: German Dayra

Si analizamos la tabla N°69, observamos inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas en nuestro caso su valor p es de 0,000, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas la prueba indica que no se cumple en las factores analizados (especies vegetales).

La prueba T para muestras independientes indica que se acepta que existe diferencia en cuanto al porcentaje (%) de Inhibición de la fracción 1 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora (t=-5,613, gl=16,498, significancia (bilateral)=0,000), pero además nos da el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la misma estará comprendida entre los valores -48,3637 y -21,8943, dado que la diferencia entre las dos medias es de -35,1290, este valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, lo que nos permite aceptar que las medias del porcentaje de inhibición para las dos especies en el caso de la fracción 1, no son estadísticamente iguales, es decir; si se han encontrado diferencias estadísticamente significativas referente a su media.

116

Tabla N°70. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje (%) de Tallos 12 47,54 13,70 Inhibición Fracción 1 Hojas 12 68,62 26,70 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°70, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de la planta tallos y hojas, para tallos el porcentaje de inhibición promedio en la fracción 1 es de 47,54%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 13,70 y el porcentaje de inhibición en la fracción 1 promedio para hojas es de 68,62%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 26,70, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo que el porcentaje de inhibición en la fracción 1 dependerá de las partes de la planta utilizadas.

Tabla N°71. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

iguales 0,000

No se asumen -2,433 16,416 0,027 -21,0813 8,6637 -39,4097 -2,7530

fracción fracción 1

% Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra 117

En la tabla N°71, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, donde su valor p es de 0,000, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no se cumple para las partes de la planta.

La prueba T para muestras independientes señala que existe diferencia en el porcentaje (%) de inhibición de la fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes partes de planta tallos y hojas (t=-2,433 gl=16,416, significancia (bilateral)=0,027), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores -39,4097 y -2,7530 dado que la diferencia entre las dos medias es de – 21,0813 dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que se han encontrado diferencias estadísticamente significativas referente a su media.

Tabla N°72. Resultados del Porcentaje (%) de Inhibición para Fracción 2

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (Porcentaje de Inhibición %) Ambrosia arborescens 17,42 24,13 Maceración 12,62 20,28 Reflujo 22,22 27,98 Tagetes multiflora 15,73 13,41 Maceración 17,86 9,52 Reflujo 13,61 17,30 Total general 16,58 18,77 Elaborado por: German Dayra

118

Porcentaje (%) de Inhibición de Fracción 2 30,00 27,98

25,00 22,22 20,28 20,00 17,30 17,86

15,00 12,62 13,61 9,52

10,00 % Inhibición % de 5,00

0,00 Reflujo Maceracion Reflujo Maceracion Ambrosia arborescens Tagetes multiflora Hojas Tallos Muestras

Gráfica N°13: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

Tabla N°73. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Origen Suma de gl Media F Prob > F cuadrados cuadrática Modelo corregido 726,7757 7 103,8251 22,71 0,0000 Especie 230,6695 1 230,6695 50,46 0,0000* Método 162,7604 1 162,7604 35,61 0,0000* Parte de Planta 28,8413 1 28,8413 6,31 0,0231* Especie * Método 71,1032 1 71,1032 15,55 0,0012 Especie * Parte de Planta 122,2512 1 122,2512 26,74 0,0001 Método * Parte de Planta 38,3982 1 38,3982 8,40 0,0105 Especie * Método * Parte de 72,7519 1 72,7519 15,92 0,0011 Planta Error 73,1387 16 4,5712 Total corregido 799,9144 23 34,7789 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

119

Como podemos analizar en la tabla N°73, que los factores principales, es decir que el factor Especie, el factor Método de Extracción y el factor Parte de Planta interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, lo que indica que los tres factores antes mencionados influyen o tienen un efecto significativo en Porcentaje de Inhibición para la fracción 2 en las dos especies, debido a que su valor Prob≤0,05.

Tabla N°74. Estadísticas en grupo para las especies vegetales en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje Ambrosia 12 20,77 % 5,99 (%) de arborescens Inhibición de Tagetes 12 14,57 % 3,98 Fracción 2 multiflora Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°74, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar para las dos especies vegetales, para Ambrosia arborescens, el porcentaje (%) de inhibición promedio en la fracción 2 para Ambrosia arborescens es de 20,77 %, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 5,99 y el porcentaje (%) de inhibición promedio en la fracción 2 para Tagetes multiflora es 14,57 %, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 3,98 en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media, en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo cual el porcentaje (%) de inhibición en la fracción 2 dependerá de las especies vegetales empleadas.

120

Tabla N°75. Prueba T para muestras independientes entre las especies vegetales con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas 2,986 22 0,007 6,2004 2,0766 1,8937 10,5071 iguales 0,0187

No se

asumen fracción fracción 2 2,986 19,14 0,008 6,2004 2,0766 1,8561 10,5447 % Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra

Analizando la tabla N°75, observamos inicialmente la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, señalando las dos posibles situaciones en relación a la varianza, la primera es que sean iguales y la otra es que estas seas diferentes. En nuestro caso el valor p es igual a 0,0187, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas la prueba indica que no se cumple en los factores analizados (especies vegetales).

La prueba T para muestras independientes indica que se acepta que si existe diferencia en cuanto al porcentaje (%) de Inhibición de la fracción 2 entre Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora (t=2,986, gl=19,14, significancia (bilateral)=0,008), pero además nos da el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la misma estará comprendida entre los valores 1,8561 y 10,5447, dado que la diferencia entre las dos medias es de 6,2004, este valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, lo que nos permite aceptar que para las medias del porcentaje de inhibición para las dos especies, se han encontrado diferencias estadísticamente significativas.

121

Tabla N°76. Estadísticas en grupo para el método de extracción en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje Maceración 12 15,06 4,56 (%) de Inhibición de Reflujo 12 20,28 6,09 Fracción 2

Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°76, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre los métodos de extracción maceración y reflujo, para maceración el porcentaje de inhibición en la fracción 2 promedio es de 15,07 %, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 4,56 y el porcentaje de inhibición en la fracción 2 para hojas es de 20,28%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 6,09, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo que el porcentaje de inhibición en la fracción 2 si dependerá del método de extracción empleado.

Tabla N°77.Prueba T para muestras independientes entre los métodos de extracción con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la t gl (bil) medias error diferencia estándar Sig. Inf Sup Se asumen varianzas -2,371 22 0,027 -5,2083 2,1970 -9,7647 -0,6520

iguales 0,372

No se asumen -2,371 20,387 0,028 -5,2083 2,1970 -9,7857 -0,6310

fracción fracción 2

% Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra 122

En la tabla N°77, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis el estadístico el valor p es de 0,372, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que se cumple para el método de extracción.

La prueba T para muestras independientes señala que existe diferencia en el porcentaje (%) de inhibición de la fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir del método de extracción reflujo y el método de extracción maceración (t=-2,371 gl=20,387, significancia (bilateral)=0,027), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores –9,7647 y -0,6520 dado que la diferencia entre las dos medias es de –5,2083 dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que las medias si son estadísticamente diferentes.

Tabla N°78. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje (%) de Tallos 12 18,77 7,08 Inhibición de Fracción 2 Hojas 12 16,58 4,47 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°78, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de la planta tallos y hojas, para tallos el porcentaje de inhibición en la fracción 2 promedio es de 18,77%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 7,08 y el porcentaje de inhibición en la fracción 2 para hojas es de 16,58%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 4,47 en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias existe diferencia entre estas, por lo que el porcentaje de inhibición en la fracción 2 dependerá de las partes de la planta utilizadas. 123

Tabla N°79. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 2 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

iguales 0,000

No se

Inhibición asumen -2,433 16,416 0,027 -21,0813 8,6637 -39,4097 -2,7530

fracción fracción 2

% varianzas iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°79, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis el valor p es de 0,000, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no se cumple para las partes de la planta.

La prueba T para muestras independientes señala que si existe diferencia en el porcentaje (%) de inhibición de la fracción 1 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes partes de planta tallos y hojas (t=-2,433 gl=16,416, significancia (bilateral)=0,027), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores -39,4097 y -2,7530 dado que la diferencia entre las dos medias es de – 21,0813 dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que para las medias del porcentaje (%) de inhibición para tallos y hojas se han encontrado diferencias estadísticamente significativas.

124

Tabla N°80. Resultados de Porcentaje (%) de Inhibición para Fracción 3

Especie/Método Promedio Hojas Promedio Tallos (Porcentaje de Inhibición %) Ambrosia arborescens 21,33 24,37 Maceración 19,09 16,71 Reflujo 23,57 32,02 Tagetes multiflora 16,88 27,38 Maceración 22,26 12,66 Reflujo 11,51 42,10 Total general 19,11 25,87 Elaborado por: German Dayra

Porcentaje (%) de Inhibición Fracción 3 45,00 42,10 40,00 35,00 32,02 30,00 23,57 25,00 22,26 19,09 20,00 16,71 15,00 11,51 12,66 % Inhibición % de 10,00 5,00 0,00 Reflujo Maceracion Reflujo Maceracion Ambrosia arborescens Tagetes multiflora Hojas Tallos Muestras

Gráfica N°14: Comparación del Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Elaborado por: German Dayra

125

Tabla N°81. Análisis de varianza ANOVA de Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Origen Suma de gl Media F Prob > F cuadrados cuadrática Modelo corregido 2217,2369 7 316,7481 18,10 0,0000 Especie 3,0611 1 3,0611 0,17 0,6813 Método 555,6124 1 555,6124 31,75 0,0000* Parte de Planta 274,6606 1 274,6606 15,70 0,0011* Especie * Método 0,4629 1 0,4629 0,03 0,8728 Especie * Parte de Planta 83,4854 1 83,4854 4,77 0,0442 Método * Parte de Planta 976,5879 1 976,5879 55,81 0,0000 Especie * Método * Parte de 323,3666 1 323,3666 18,48 0,0006 Planta Error 279,9513 16 17,4970 Total corregido 2497,1881 23 108,5734 *factor significativo Elaborado por: German Dayra

Como podemos analizar en la tabla N°81, que los factores principales, es decir que el factor Método de Extracción y el factor Parte de Planta interfieren en nuestro modelo al 95 % de confiabilidad, lo que indica que los dos factores antes mencionados influyen o tienen un efecto significativo en Porcentaje de Inhibición para la fracción 3 en las dos especies, debido a que su valor Prob≤0,05.

126

Tabla N°82. Estadísticas en grupo para el método de extracción en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje (%) de Maceración 12 17,68 4,41 Inhibición de Fracción 3 Reflujo 12 27,30 12,53

Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°82, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre los métodos de extracción maceración y reflujo, para maceración el porcentaje (%) de inhibición promedio es de 17,68%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 4,41 y el porcentaje (%) de inhibición promedio en la fracción 3 para reflujo es de 27,30%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 12,53, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de medias si existe diferencia entre estas, por lo que el porcentaje (%) de inhibición en la fracción 3 dependerá de los métodos de extracción empleados.

Tabla N°83. Prueba T para muestras independientes entre los métodos de extracción con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Prueba de Levene de igualdad de Prueba T para igualdad de medias varianzas 95% de intervalo de Sig. Dif. de Dif. del confianza de la Sig. t gl (bil) medias error diferencia estándar Inf Sup Se asumen varianzas -2,509 22 0,020 -9,6230 3,8352 -17,5768 -1,6693 0,005 iguales

No se asumen -2,509 13,682 0,025 -9,6230 3,8352 -17,8667 -1,3793

fracción fracción 3

% Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra 127

En la tabla N°83, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis el valor p es de 0,005, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no se cumple para el método de extracción.

La prueba T para muestras independientes señala que existe diferencia en el porcentaje (%) de inhibición de la fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir del método de extracción reflujo y el método de extracción maceración (t=-2,509 gl=13,682, significancia (bilateral)=0,025), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores -17,8667 y -1,3793 dado que la diferencia entre las dos medias es de -9,6230 dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que las medias del porcentaje (%) de inhibición para maceración y reflujo si son estadísticamente diferentes.

Tabla N°84. Estadísticas en grupo para las partes de la planta en relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

Especie/Código N Media Desviación estándar Porcentaje (%) de Tallos 12 25,87 12,97 Inhibición de Hojas 12 19,11 5,82 Fracción 3 Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°84, se presenta la comparación de las medias y de la desviación estándar entre las partes de la planta tallos y hojas, para tallos el porcentaje de inhibición en la fracción 3 promedio es de 25,87%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 12,97 y el porcentaje de inhibición en la fracción 3 para hojas es de 19,11%, con la predisposición de los datos a variar por debajo o por encima de 5,82, en los dos casos los datos de desviación estándar nos señalan que los datos de concentración no están dispersos en relación a su media y en cuanto a la comparación de 128 medias no existe diferencia entre estas, por lo que el porcentaje de inhibición en la fracción 3 no dependerá de las partes de la planta utilizadas.

Tabla N°85. Prueba T para muestras independientes entre las partes de planta con relación al Porcentaje (%) de Inhibición para la Fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

iguales 0,002

No se asumen 1,649 15,266 0,120 6,7659 4,1033 -1,9669 15,4987

fracción fracción 3

% Inhibición varianzas iguales Elaborado por: German Dayra

En la tabla N°85, inicialmente tenemos la Prueba de Levene de igualdad de varianzas, en nuestro análisis el valor p es de 0,002, siendo este valor de p menor que 0,05, asumiendo este supuesto de homogeneidad de varianzas, esta prueba indica que no se cumple para las partes de la planta.

La prueba T para muestras independientes señala que no existe diferencia en el porcentaje (%) de inhibición de la fracción 3 de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora obtenidos a partir de dos diferentes partes de planta tallos y hojas (t=1,649 gl=15,266, significancia (bilateral)=0,120), también encontramos el intervalo de confianza que comprende la diferencias de medias, esta señala que la diferencia estará entre los valores --1,966923 y 15,498669 dado que la diferencia entre las dos medias es de 6,765873 dicho valor no se encuentra dentro del intervalo de confianza, esto nos permite aceptar que las medias del porcentaje (%) de inhibición para tallos y hojas si son estadísticamente diferentes.

129

Capítulo V

5 Conclusiones y Recomendaciones

5.1 Conclusiones

A través de la revisión bibliográfica logramos adquirir conocimientos más profundos acerca de características morfológicas, principales usos tradicionales, composición química y entre otros aspectos de las especies vegetales empleadas para la experimentación, lo que facilitó de cierta forma nuestro estudio.

Mediante el estudio farmacognósico realizado a la materia prima se determinó parámetros de control de calidad de las especies vegetales, en el caso del parámetro de materia extraña Ambrosia arborescens, método de reflujo, para la parte de hojas se obtuvo un 4,7% y para tallos 4,3%, para el método de maceración para hojas es de 4,0% y para tallos es de 3,5%, para la especie Tagetes multiflora, método de reflujo, para la parte de hojas se obtuvo un 5,6% y para tallos 5,0%, para el método de maceración para hojas es de 4,5% y para tallos es de 4,5%, en el caso del parámetro cenizas totales los valores arrojaron como resultado un valor de 6,20% para hojas y 6,76% para tallos de Ambrosia arborescens en el caso de la otra especie fue de 4,26% para hojas y 4,65% para tallos dichos resultados al ser comparados con los parámetros establecidos por los Métodos de control de calidad para materiales herbales de la OMS (WHO - Standardization Parameters, 2002) cumplen con los criterios de aceptación.

Mediante TLC se pudo identificar alcaloides tanto en los extractos y la fracción 1 al dar Rf similares a los encontrados en la bibliografía y para la fracción 2 y fracción 3 se trataría de compuestos nitrogenados, resultados obtenidos debido al aplicar el método de fraccionamiento señalado en Sarker de forma general.

Para el caso de extractos totales, el método de extracción más eficiente para Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, es el reflujo efectuado en las hojas obteniendo la mayor concentración de alcaloides, así para la primera especie es de 0,60 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco y para la segunda 0,76 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco.

130

En el caso de la fracción 1, el método de extracción más eficiente es maceración realizado en tallos obteniéndose la concentración más alta de alcaloides para Ambrosia arborescens siendo esta de 0,34 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco y para Tagetes multiflora, el método de extracción más eficiente es el reflujo en hojas, con la concentración de alcaloides más alta de 0,28 mg de Alcaloides (Bi)/ g de extracto seco.

En relación a la fracción 2, para Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora el método de extracción maceración, para la primera especie llevado a cabo en tallos presentando así la concentración más alta de componentes nitrogenados, de 0,33 mg de Componentes Nitrogenados (Bi)/ g de extracto seco y para la especie Tagetes multiflora dicho método en hojas mostrando la mayor concentración de compuestos nitrogenados de 0,43 Componentes Nitrogenados (Bi)/ g de extracto seco

En relación a la fracción 3, el método de extracción presentando la concentración más alta de componentes nitrogenados es la maceración en hojas tanto para Ambrosia arborescens y para Tagetes multiflora, de 0,38 mg de Componentes Nitrogenados (Bi)/ g de extracto seco y de 0,43 mg Componentes Nitrogenados (Bi)/ g de extracto seco, respectivamente para cada especie.

Mediante la cuantificación de alcaloides y compuestos nitrogenados expresados en mg de Alcaloides (Bi)/gramos de extracto seco y mg de Compuestos Nitrogenados (Bi)/gramos de extracto seco, con su respectivo análisis de datos con ANOVA se concluye que los factores especie vegetal, método de extracción y parte de la planta se constituyen en significativos, es decir influyen en la concentración de alcaloides hallada de los extractos totales, en el caso de la fracción 1 únicamente el factor especie influye sobre la concentración de alcaloides, mientras para la fracción 2 y para la fracción 3, los factores que influyen sobre la concentración de compuestos nitrogenados encontrada en estas, son el método de extracción y parte de la planta.

Mediante la cuantificación de porcentaje (%) de inhibición y su respectivo análisis de datos con ANOVA se concluye que los factores especie vegetal y parte de la planta se constituyen en significativos, es decir influyen en el porcentaje de inhibición de los extractos, los factores especie vegetal y parte de la planta influyen en el porcentaje de inhibición en la fracción 1, mientras que para la fracción 2, intervienen sobre el porcentaje de inhibición los tres factores que son la especie vegetal, método de extracción y parte de

131 la planta, finalmente en la fracción 3 influyen el método de extracción y la parte de la planta.

Para el caso de extractos totales, el porcentaje de inhibición mayor para Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora, lo encontramos con el método de extracción reflujo efectuado en las hojas para la primera especie y para tallos en la segunda especie obteniendo así un porcentaje de 100,36% Ambrosia arborescens para y de 96.75% para Tagetes multiflora .

En el caso de la fracción 1, el método de extracción reflujo realizado en hojas obtuvo el porcentaje (%) de inhibición mayor que fue de 47,70% para Ambrosia arborescens y para Tagetes multiflora, el método de extracción maceración en hojas, con el porcentaje (%) de inhibición más alto de 95,56%.

En relación a la fracción 2, para Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora el método de extracción reflujo en tallos y el método de extracción maceración en hojas, presentan el porcentaje (%) de inhibición mayor siendo de 27,98% y 17,865 respectivamente.

En relación a la fracción 3, el método de extracción que presentó porcentaje (%) de inhibición mayor es reflujo en tallos para Ambrosia arborescens y para Tagetes multiflora, siendo de 32,02% y 42,10%, respectivamente para cada especie.

5.2 Recomendaciones

Se recomienda inicialmente que en un trabajo de este tipo se debe procurar tener el material vegetal suficiente o extra en el caso de necesitarse más del requerido para pruebas o análisis adicionales, a nuestra disposición para no tener que vernos limitados al uso de cierta cantidad durante el transcurso de tiempo del análisis (parte experimental).

Se debe tomar en cuenta sobre todo poner en práctica las precauciones y recomendaciones para el manejo de los equipos y aparatos del laboratorio así como el trabajo que se efectué en el laboratorio con el fin de evitar accidentes que puedan tener

132 repercusión en la salud de la persona, así como de sus compañeros y en los resultados del trabajo experimental realizado.

En cuanto al campo de estudio en plantas nativas se debería hacer énfasis para el análisis de las mismas, enfocarse en estudios ya realizados con el fin de mejorar los mismo o hacer nuevos que nos brinden mejores conocimientos sobre el estudio fitoquímico completo de una especie vegetal en particular.

Emplear reactivos que se encuentren en buen estado, cantidades determinadas en las técnicas, así como materiales y equipos en buen estado pueden contribuir en gran medida a la obtención de datos sin una fuente de variación grande.

Experimentar con métodos analíticos para metabolitos específicos encontrados en la bibliografía puede ser beneficiosos o a su vez pueden causar inconvenientes debido a que su realización se hace bajo ciertos parámetros y está enfocada para muestras específicas, al momento de realizarlo en nuestros análisis o estudios nos puede llevar a obtener resultados diferentes a los deseados, pero pueden servir como referente para posteriores estudios con el fin de mejorar los mismos.

133

6 Bibliografía

Aagesen, L., Deginami, N. B., Nomdedeu, S., & Zanotti, C. A. (2013). Flora Argentina. Retrieved February 24, 2019, from floraargentina website: http://www.floraargentina.edu.ar/detalleespecie.asp?forma=&variedad=&subespec ie=&especie=multiflora&espcod=17817&genero=Tagetes&autor=69&deDonde=0 &letra=Tagetes#uno

Acosta. (1996). Control de calidad de drogas vegetales: lavado y desinfección de Artemisia annua L. y Tagetes lucida Cav. In Revista Cubana de Plantas Medicinales (Vol. 17). Retrieved from http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-47962012000100011

Acosta, J. (2008). ALCALOIDES Y COMPUESTOS NITROGENADOS. Retrieved from http://www.innovacion.gob.sv/inventa/attachments/article/856/alcaloides.pdf

Agudo, L. (2002). TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS. Retrieved from https://www.academia.edu/13924487/Técnicas_para_la_determinación_de_compu estos_antioxidante_en_alimentos._Laura_Agudo_Medina_ISSN_1989- 9041_Autodidacta

Alam, M. N., Bristi, N. J., & Rafiquzzaman, M. (2013). Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal, 21(2), 143–152. https://doi.org/10.1016/J.JSPS.2012.05.002

Alonso, J., & Desmarchelier, C. (2005). (PDF) Plantas Medicinales Autóctonas de la Argentina - Bases Científicas para su Aplicación en Atención Primaria de la Salud. ResearchGate. Retrieved from https://www.researchgate.net/publication/299371108_Plantas_Medicinales_Autoct onas_de_la_Argentina_- _Bases_Cientificas_para_su_Aplicacion_en_Atencion_Primaria_de_la_Salud

Anderson, L., Doggett, N., & Ross, M. (1977). THE NON–SPECIFICITY OF DRAGENDORFF’S REAGENT IN THIN LAYER CHROMATOGRAPHY. Planta Medica, 32(06), 125–129. https://doi.org/10.1055/s-0028-1097570

134

Areal, & Bessa. (2015). La Cromotografia de capa fina y sus aplicaciones a l campo textil. Retrieved from https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099/5544/Article02.pdf

Ayala Valarezo, S. E., & Vásquez Villarreal, T. A. (2014). Evaluación de la actividad antifúngica in vitro del marco (Ambrosia arborescens Mill.) y matico (Aristeguietia glutinosa Lam.) sobre hongos patógenos causantes de la dermatomicosis. Retrieved from https://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:l60pezEf8ZoJ:https://dsp ace.ups.edu.ec/handle/123456789/7303%3Fmode%3Dfull+&cd=1&hl=es- 419&ct=clnk&gl=ec

Barahona, E., & Guevara, B. (2007). DETERMINACION DE ALCALOIDES ESTEROIDALES EN EXTRACTO ALCOHOLICO DEL FRUTO DEL Solanum mammosum (chichigua) POR CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA. Retrieved from http://ri.ues.edu.sv/id/eprint/4567/1/Barahona Avalos, Elena Patricia.PDF

Barrera, & colaboradores. (2009). CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y TAMIZAJE FITOQUÍMICO DE LA ESPECIE Tagetes erecta Lin. Retrieved from http://www.redalyc.org/pdf/4435/443543717002.pdf

Bohlmann, Burkhardt, & Zdero. (1987). Naturally occuring Acetylenes. ScienceDirect, 547. Retrieved from http://garfield.library.upenn.edu/classics1987/A1987K475300001.pdf

Briceño, K. (n.d.). Alcaloides: Estructura, Biosíntesis, Clasificación y Usos - Lifeder. Retrieved July 28, 2018, from lifeder website: https://www.lifeder.com/alcaloides/

Buitrón, X. (1999). ECUADOR:USO Y COMERCIO DE PLANTAS MEDICINALES, SITUACION ACTUAL Y ASPECTOS IMPORTANTES PARA SU CONSERVACION (TRAFFIC International, Ed.). Retrieved from https://www.traffic.org/site/assets/files/9729/ecuador-uso-y-comercio-de-plantas- medicinales.pdf

Carocho, M., & Ferreira, I. C. F. R. (2013). A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food and Chemical Toxicology, 51, 15–25.

135

https://doi.org/10.1016/j.fct.2012.09.021

Castillo, E. (2017). Evaluación de la actividad antioxidante, antiinflamatoria y citotóxica in vitro de los extractos vegetales de Marco (Ambrosia arborescens) y Quishuar (Buddleja incana), obtenidos mediante secado por aspersión. Retrieved from http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/26010/1/BQ 128.pdf

Carrion & Garcia (2010). PREPARACIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES,Universidad de Cuenca,Facultad de Ciencias Quimicas 2010 . Cuenca, Azuay, Ecuador.

Cayán, A. (2009). Artemisia absinthium Linneo (ajenjo), Ambrosia arborescens Miller (altamisa) y Nicotiana undulata Ruiz & Pavón (qamasairi), en larvas de Eurysacca quinoae Povolny (q’hona q’hona). Retrieved from http://repositorio.unap.edu.pe/bitstream/handle/UNAP/599/EPG198-00220- 01.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Charles, & Heiser. (1962). Flora del Noroeste dé México Detailed Collection Record Information. Retrieved February 22, 2019, from herbanwmex website: http://herbanwmex.net/portal/collections/individual/index.php?occid=17022432

Cutti, G. (1999). Huacatay. Retrieved July 27, 2018, from es.scribd website: https://es.scribd.com/document/363993875/Historia

De la Cruz, I. y colaboradores. (2012). Disponible en línea en: www.javeriana (Vol. 17). Retrieved from www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum

De la Torre, L. y colaboradores. (2008). Enciclopedia de las plantas útiles del Ecuador. Retrieved from http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:El61mY2F5SMJ:repositor io.educacionsuperior.gob.ec/handle/28000/4395+&cd=2&hl=es- 419&ct=clnk&gl=ec

De las Heras, B., Slowing, K., Benedı́, J., Carretero, E., Ortega, T., Toledo, C., … Chiriboga, X. (1998). Antiinflammatory and antioxidant activity of plants used in traditional medicine in Ecuador. Journal of Ethnopharmacology, 61(2), 161–166. https://doi.org/10.1016/S0378-8741(98)00029-4

136

Delfino, S. R. S. (2005). EFECTO DE TAGETES SPP. SOBRE DOS ÁFIDOS PLAGAS DE LACTUCA SATIVA (L.). Ciencias Agrarias, XXXVII(1), 55–59. Retrieved from http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=382838550005

Dhekney, S. A. (2018). Journal of plant physiology et pathology. Retrieved from https://www.scitechnol.com/plant/plant-metabolism.php

Echavarría, A. (2016). Evaluación de la capacidad antioxidante y metabolitos secundarios de extractos de dieciséis plantas medicinales. ResearchGate, 9(20), 29–35. Retrieved from https://www.researchgate.net/publication/294581438_fileCUsersmarthaDownloads 3646-9853-1-SM201pdf

Farmacopea Argentina (Vol. 1). (2013). Argentina: ANMAT. Recuperado el 29 de Marzo de 2019, de http://www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/flip_pages/Farmacopea_Vol_I/files/assets/ basic-html/page298.html

Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. (2013). México: Comision Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Recuperado el 31 de Marzo de 2019, de https://www.zaragoza.unam.mx/portal/wp- content/Portal2015/Licenciaturas/qfb/tesis/tesis_ortega_huerta.pdf

Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (Segunda ed.). (2013). México: Publicaciones e Impresiones de Calidad, S.A de C.V. Recuperado el 4 de Octubre de 2018

Fiaz, & Qazi. (2010). Thin Layer Chromatography. Retrieved from https://people.chem.umass.edu/samal/269/tlc.pdf

García, C. y colaboradores. (2014). LA FAMILIA ASTERACEAE EN EL PARQUE NACIONAL LOS MÁRMOLES, HIDALGO, MÉXICO. Redalyc, 106, 97–116. Retrieved from http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57429297005

Guauque, M. del P., Castaño, J. C., & Gómez, M. (2010). Detección de metabolitos secundarios en Ambrosia peruviana Willd y determinación de la actividad antibacteriana y antihelmíntica. Infectio, 14(3), 186–194. https://doi.org/10.1016/S0123-9392(10)70110-7 137

Gupta, M. P. (1995). ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA TESIS DE GRADO PREVIA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE BIOQUÍMICO FARMACEÚTICO PRESENTADO POR (Convenio Andrés Bello, Ed.). Retrieved from http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/2467/1/56T00361.pdf

Gútierrez, M. M. y colaboradores. (2009). Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle (Anacardiaceae) y Tagetes terniflora (Asteraceae) sobre adultos de Pediculus humanus capitis(Insecta; Anoplura; Pediculidae). Redalyc, 176–179. Retrieved from http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=85611774012

Habib, A.-A. M. (1980). False-Positive Alkaloid Reactions. Journal of Pharmaceutical Sciences, 69(1), 37–43. https://doi.org/10.1002/jps.2600690111

Hegazy, M. (2017). Pharmacognosy & Herbal Medicine. Retrieved March 1, 2019, from https://cognosy4all.blogspot.com/

Hegnauer., R. (1964). Chemotaxonomie der Pflanzen, 3, Dicotyledoneae, Part I (Chemical Series, 18). Wiley Online Library, 743. Recuperado el 28 de Febrero de 2019, de https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ange.19650771683#

Hernández, J. (2007). COL000074998 - Ambrosia arborescens Mill. Retrieved May 28, 2019, from http://www.biovirtual.unal.edu.co/es/colecciones/detail/28463/

Herreros, & Kuzmicic. (2015). Ficha de Especie. Retrieved February 25, 2019, from gep.uchile.cl website: http://www.gep.uchile.cl/Biodiversidad/fichas_especies/plantae/herbaceas/Tagetes _multiflora/index.html

Hinojosa, R., & Moreno, M. (2013). Evaluación del marco (Ambrosia arborescens) en el tratamiento contra garrapatas (Ixodes ricinus)en cuyes(Cavia cobayo). Retrieved from http://repositorio.udea.edu.pe/bitstream/handle/123456789/18/Evaluación del marco %28Ambrosia arborescens%29 en el tratamiento contra garrapatas %28Ixodes ricinus%29 en cuyes %28Cavia cobayo%29.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Ijaz, F., Iqbal, Z., Rahman, I. U., Alam, J., Khan, S. M., Shah, G. M., … Afzal, A. (2016). Investigation of traditional medicinal floral knowledge of Sarban Hills, Abbottabad, 138

KP, Pakistan. Journal of Ethnopharmacology, 179, 208–233. https://doi.org/10.1016/j.jep.2015.12.050

Jimenez, G. (2002). IDENTIFICACION DE COMPUESTOS ACTIVOS EN DOS ESPECIES DE Tagete» (Compotóae) CON TOXICIDAD PARA LARVAS DE Aede* aegyptí L. Retrieved from http://eprints.uanl.mx/1140/1/1080124421.PDF.pdf

Jørgensen, P. M., & S. León-Yánez. (1999). MBG: Research: Ecuador: Catalogue of the Vascular Plants of Ecuador. Retrieved May 28, 2019, from http://www.mobot.org/mobot/research/ecuador/citar_catalogo.shtml

Karimian, P., Kavoosi, G., & Amirghofran, Z. (2014). Anti-oxidative and antiinflammatory effects of Tagetes minuta essential oil in activated macrophages. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 4(3), 219–227. https://doi.org/10.1016/S2221-1691(14)60235-5

Karre, L., Lopez, K., & Getty, K. J. K. (2013). Natural antioxidants in meat and poultry products. Meat Science, 94(2), 220–227. https://doi.org/10.1016/J.MEATSCI.2013.01.007

Katinas, L. y colaboradores. (2007). Panorama de la familia Asteraceae (= Compositae) en la. Retrieved from http://www.scielo.org.ar/pdf/bsab/v42n1-2/v42n1-2a14.pdf

Khalil, M., Raila, J., Ali, M., Islam, K. M. S., Schenk, R., Krause, J.-P., … Rawel, H. (2012). Stability and bioavailability of lutein ester supplements from Tagetes flower prepared under food processing conditions. Journal of Functional Foods, 4(3), 602– 610. https://doi.org/10.1016/j.jff.2012.03.006

Koheil, M. A., Hussein, M. A., Othman, S. M., & El-Haddad, A. (2011). Anti- inflammatory and antioxidant activities of Moringa peregrina Seeds. Free Radicals and Antioxidants, 1(2), 49–61. https://doi.org/10.5530/AX.2011.2.10

Krebs, H. . (2001). Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Toxicon, 39(2– 3), 429. https://doi.org/10.1016/S0041-0101(00)00142-2

Krishnaiah, D., Sarbatly, R., & Nithyanandam, R. (2011). A review of the antioxidant potential of medicinal plant species. Food and Bioproducts Processing, 89(3), 217– 233. https://doi.org/10.1016/J.FBP.2010.04.008

139

Kujawska, M., & Hilgert, N. I. (2014). Phytotherapy of Polish migrants in Misiones, Argentina: Legacy and acquired plant species. Journal of Ethnopharmacology, 153(3), 810–830. https://doi.org/10.1016/j.jep.2014.03.044

Leos, C., & García, D. (2016). OmniaScience Books. Retrieved October 5, 2018, from omniascience website: https://www.omniascience.com/books/

Li-wei, X., Juan, C., Huan-yang, Q., & Yan-ping, S. (2012). Phytochemicals and Their Biological Activities of Plants in Tagetes L. Chinese Herbal Medicines, 4(2), 103– 117. https://doi.org/10.3969/j.issn.1674-6384.2012.02.004

Lock De Ugaz, O. (1987). PRODUCTOS NATURALES: IMPORTANCIA Y PERSPECTIVAS. Retrieved from http://revistas.pucp.edu.pe/index.php/quimica/article/viewFile/16441/16824

Magaña, A., & colaboradores. (1996). Polibotánica. In Polibotánica. Retrieved from http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_abstract&pid=S1405- 27682010000100011&lng=es&nrm=iso

Magaña, A., & Colaboradores. (2010). EL USO DE LAS PLANTAS MEDICINALES EN LAS COMUNIDADES MAYA-CHONTALES DE NACAJUCA, TABASCO, MÉXICO (Vol. 29). Retrieved from México website: https://www.redalyc.org/pdf/621/62112471011.pdf

Marcano, D., & Hasegawa, M. (2002). Fitoquimica Organica - Google Libros. Retrieved from https://books.google.com.ec/books?id=hPkjgPwXD- QC&pg=PA380&lpg=PA380&dq=biosintesis+de+alcaloides&source=bl&ots=N9 P9rcWfjH&sig=ACfU3U0ai3K_qSi- 8pj5thwe_5mYTRJHBg&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwiRlpz7gMfhAhVHnlkKH VIoAnM4ChDoATADegQICRAB#v=onepage&q=biosintesis de

Marotti, M., Piccaglia, R., Biavati, B., & Marotti, I. (2004). Characterization and Yield Evaluation of Essential Oils from Different Tagetes Species. Journal of Essential Oil Research, 16(5), 440–444. https://doi.org/10.1080/10412905.2004.9698767

Martínez, M. (2006). Análisis cuantitativo del conocimiento tradicional de las plantas medicinales en San Rafael, Coxcatlán, Valle de Tehuacán-Cuicatlán, Puebla, México. In Acta botánica mexicana. Retrieved from 140

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187- 71512006000200002

Mehta, S. (2012). Classification of Alkaloids | Notes | PharmaXChange.info. Retrieved February 28, 2019, from pharmaxchange.info website: https://pharmaxchange.info/2012/07/classification-of-alkaloids/

Molineros, N. (16 de Enero de 2015). academia edu. Recuperado el 28 de Febrero de 2019, de academia edu: https://www.academia.edu/10237966/Pr%C3%A1ctica_de_Destilaci%C3%B3n_a _reflujo

Morales, & Romero. (2009). ESTUDIO FITOQUIMICO PRELIMINAR DEL FRUTO DE LA ESPECIE VEGETAL Cyphomandra betacea (TOMATE DE PALO) E IDENTIFICACION DE ALCALOIDES ESTEROIDALES. Retrieved from http://ri.ues.edu.sv/id/eprint/2821/1/16100669.pdf

Moreno-Salazar, S. F., Robles-Zepeda, R. E., & Johnson, D. E. (2008). Plant folk medicines for gastrointestinal disorders among the main tribes of Sonora, Mexico. Fitoterapia, 79(2), 132–141. https://doi.org/10.1016/J.FITOTE.2007.07.009

Neher, R. T. (6 de Septiembre de 1963). herbanwmex.net. Recuperado el 22 de Febrero de 2019, de herbanwmex.net: http://herbanwmex.net/portal/collections/individual/index.php?occid=17022170

Njoroge, G. N., & Bussmann, R. W. (2007). Ethnotherapeautic management of skin diseases among the Kikuyus of Central Kenya. Journal of Ethnopharmacology, 111(2), 303–307. https://doi.org/10.1016/j.jep.2006.11.025

Pacheco, R. (2012). LOS ALCALOIDES. Retrieved from http://dspace.ucacue.edu.ec/bitstream/reducacue/5294/4/Los Alcaloides.pdf

Parkhomenko, A. Y., Oganesyan, E. T., Andreeva, O. A., Dorkina, E. G., Paukova, E. O., & Agadzhanyan, Z. S. (2006). Pharmacologically active substances from Ambrosia artemisiifolia. Part 2. Pharmaceutical Chemistry Journal, 40(11), 627–632. https://doi.org/10.1007/s11094-006-0208-2

141

Parvaiz, M. (2014). Ethnobotanical studies on plant resources of Mangowal, District Gujrat, Punjab, Pakistan. Avicenna Journal of Phytomedicine, 4(5), 364–370. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25386399

Pastene, E. R. (2009). Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante. Redalyc, 449-455. Recuperado el 5 de Octubre de 2018, de http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=85617461001

Peralta, F., Maldonado, E., & Centeno, M. (2007). MANUAL DE PRÁCTICAS DE LOS LABORATORIOS DE ALIMENTOS. Retrieved from http://www.archivos.ujat.mx/2015/div_rios/MP-DAMR-LBR-R01.pdf

Pérez Irais Cosme. (2008). EL USO DE LAS PLANTAS MEDICINALES. Retrieved from https://cdigital.uv.mx/bitstream/handle/123456789/8921/tra6_p23-26_2010- 0.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Pichette, A., Garneau, F.-X., Collin, G., Jean, F.-I., Gagnon, H., & Arze, J. B. L. (2005). Essential Oils from Bolivia. IV. Compositae: Tagetes aff. maxima Kuntze and Tagetes multiflora H.B.K. Journal of Essential Oil Research, 17(1), 27–28. https://doi.org/10.1080/10412905.2005.9698820

PLOUVIER, V. (1963). Distribution of aliphatic polyols and cyclitols. London/New York: Academic Press. Recuperado el 28 de Febrero de 2019, de https://www.mendoza.conicet.gov.ar/portal//multequina/indice/pdf/18/18_8.pdf

Rahman. (2013). An ethnobotanical investigation on Asteraceae family at Rajshahi, Bangladesh. ResearchGate, 133–141. Retrieved from http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:E5z_unU5a9kJ:apexjourn al.org/jbamsr/archive/2013/May/fulltext/Rahman.pdf+&cd=1&hl=es- 419&ct=clnk&gl=ec

Rahman, I. U., Ijaz, F., Iqbal, Z., Afzal, A., Ali, N., Afzal, M., … Asif, M. (2016). A novel survey of the ethno medicinal knowledge of dental problems in Manoor Valley (Northern Himalaya), Pakistan. Journal of Ethnopharmacology, 194, 877–894. https://doi.org/10.1016/j.jep.2016.10.068

Roca, L. B., Guzmán, B. H., Botta Gómez, A. M., Sosa, E. H., González Pérez, M., & Navarro, B. A. (2009). CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y TAMIZAJE FITOQUÍMICO 142

DE LA ESPECIE Tagetes erecta Lin. Retrieved from http://www.redalyc.org/pdf/4435/443543717002.pdf

Rojas, L., Jaramillo, C., & Lemus, M. (2015). Métodos Analíticos para la Determinación de Metabolitos Secundarios de Plantas (UTMACH; UTMACH, Ed.). Retrieved from http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:EJnr1IRVqRgJ:repositori o.utmachala.edu.ec/bitstream/48000/6653/1/20%2520METODOS%2520ANALITI COS%2520PARA%2520LA%2520DETERMINACION%2520DE%2520METAB OLITOS%2520SECUNDARIOS%2520DE%2520PLANTAS.pdf+&cd=1&hl=es

Romo, D. (2010). Estudio del Uso de las Plantas Medicinales y su Conservación en la Cooperatativa Cotopilaló, Razuyacu-Corazón y la interacción con los Shamanes de la Unión de Organizaciones Campesinas del Norte de Cotopaxi “UNOCANC”. Retrieved from http://repositorio.usfq.edu.ec/bitstream/23000/937/1/95172.pdf

Saltos. (2008). http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/820/1/T-ESPE-019541.pdf - Buscar con Google. Retrieved July 26, 2017, from repositorio.espe.edu.ec website: https://www.google.com/search?rlz=1C1CHBD_esEC843EC843&ei=0bfsXNam M- ef_Qbu5pWACQ&q=http%3A%2F%2Frepositorio.espe.edu.ec%2Fbitstream%2F 21000%2F820%2F1%2FT-ESPE- 019541.pdf&oq=http%3A%2F%2Frepositorio.espe.edu.ec%2Fbitstream%2F2100 0%2F820%2F1%2FT-ESPE-019541

Satou, T., Horiuchi, A., Akao, N., Koike, K., Fujita, K., & Nikaido, T. (2005). Toxocara canis: Search for a potential drug amongst β-carboline alkaloids—in vitro and mouse studies. Experimental Parasitology, 110(2), 134–139. https://doi.org/10.1016/J.EXPPARA.2005.02.006

Skoog, D.A.; Leary J.J., Holler F. Jame. (1998). fcq.uach.mx. Recuperado el 5 de Octubre de 2018, de fcq.uach.mx: http://fcq.uach.mx/index.php/docencia/columna- 2/material-de-estudio/category/15-analisis-instrumental?download=53:lectura6

Soto, M. (2005). Control de Calidad de Drogas Vegetales Por Q.F. Marilú R. Soto Vás.. |authorSTREAM. Retrieved October 5, 2018, from authorstream website: http://www.authorstream.com/Presentation/marilusoto-1180661-control-de- 143

calidad-drogas-vegetales-por-q-f-maril-r-soto-v-squez/

Soule, J. (1993). Tagetes minuta: A Potential New Herb from South America. Retrieved February 24, 2019, from hort.purdue.edu website: https://hort.purdue.edu/newcrop/proceedings1993/V2-649.html

Sreevidya, N., & Mehrotra, S. (2003). Spectrophotometric Method for Estimation of Alkaloids Precipitable with Dragendorff’s Reagent in Plant Materials. In 1124 SREEVIDYA & MEHROTRA: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL (Vol. 86). Retrieved from https://pdfs.semanticscholar.org/367a/d7b79c4a41d2e43405ba37ed9cef6dffff31.pd f

Suhaj, M. (2006). Spice antioxidants isolation and their antiradical activity: a review. Journal of Food Composition and Analysis, 19(6–7), 531–537. https://doi.org/10.1016/J.JFCA.2004.11.005

Terrones, T. (2014). CARACTERIZATION OF A SPIRONOLACTONE SESQUITERPENE á-METILENICA FROM Ambrosia arborescens Miller AND EVALUATION OF THEIR BIOLOGICAL ACTIVITY IN Tripanosoma cruzi. In Rev Soc Quím Perú (Vol. 80). Retrieved from http://www.scielo.org.pe/pdf/rsqp/v80n2/a06v80n2.pdf

Urquizo, L. (2016). INFLUENCIA DE LOS SOLVENTES Y LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA ESPECIE “Disterigma alaternoides (Kunth) Nied.” PLANTA NATIVA DEL ECUADOR. Retrieved from http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/15012/1/T-UCE-0008-QF047- 2018.pdf

Vallejo Páez, S. y colaboradores. (2007). El agro y vida rural en Ecuador: comportamiento 2000-2007 y perspectivas 2008 (EC.Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA) sp., Ed.). Retrieved from http://opackoha.iica.int/cgi-bin/koha/opac-detail.pl?biblionumber=32929

Vasudevan, P., Kashyap, S., & Sharma, S. (1997). Tagetes: A multipurpose plant. Bioresource Technology, 62(1–2), 29–35. https://doi.org/10.1016/S0960-

144

8524(97)00101-6

Vera, M. B. (2008). ESUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO ESTUDIO FITOQUÍMICO DE UNA PLANTA DE LA FLORA DEL ECUADOR: Ambrosia arborescens PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA. Retrieved from http://repositorio.espe.edu.ec/xmlui/bitstream/handle/21000/820/T-ESPE- 019541.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Villafuerte, D. B. (2017). Evaluación de la actividad antimicrobiana, antioxidante y citotoxicidad de los extractos etanólico y acuoso de Tagetes multifl. Retrieved from http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:f1jiA66ehRAJ:cybertesis. unmsm.edu.pe/bitstream/handle/cybertesis/7372/Velasquez_vd.pdf%3Fsequence% 3D1%26isAllowed%3Dy+&cd=1&hl=es-419&ct=clnk&gl=ec

Vitto, L. A. Del, & Petenatti, Y. E. M. (2001). ASTERÁCEAS DE IMPORTANCIA ECONÓMICA Y AMBIENTAL. PRIMERA PARTE. SINOPSIS MORFOLÓGICA Y TAXONÓMICA, IMPORTANCIA ECOLÓGICA Y PLANTAS DE INTERÉS INDUSTRIAL. In MULTEQUINA (Vol. 18). Retrieved from https://www.mendoza.conicet.gov.ar/portal//multequina/indice/pdf/18/18_8.pdf

WHO - Standardization Parameters. (2002). Who monographs on selected medicinal plants (Vol. 2). Ginebra: WHO Graphics. Recuperado el 31 de Marzo de 2019, de https://books.google.com.ec/books?id=qWP4aGwXAQC&pg=PA201&lpg=PA20 1&dq=total+ash+in+plants+farmacopeia&source=bl&ots=RLv2C__tij&sig=ACfU 3U1vvfpdtosvFBEfMPr8j3MPW84FA&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwixyY6h2b_ hAhVxxFkKHYXoBngQ6AEwA3oECAkQAQ#v=onepage&q=total%20ash%

Zajari. (2010). CHAPTER 2 2. GENERAL CHEMICAL ASPECTS OF ALKALOIDS 2.1. General. Retrieved from http://studentsrepo.um.edu.my/1521/3/CH_2.pdf

Zolla, C. (2009). Medina Tradicional Mexicana. Retrieved February 24, 2019, from medicinatradicionalmexicana.unam.mx website: http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php

145

Concentración de alcaloide que puede ser igual o Problemas en la salud de diferente en cada uno de las personas al darle un uso 7 Anexos los extractos obtenidos. inadecuado a la planta. Anexo A. Árbol de problemas

Desinterés de instituciones Problemas al momento de Mal uso o investigativas así como de investigadores en analizar realizar los diferentes aprovechamiento ineficaz Disminución en especies vegetales que análisis de los compuestos de las virtudes presentadas investigaciones de este encontramos en nuestro presentes en las especies por productos de origen tipo. país. vegetales. vegetal en el país.

Falta de estudios relacionados a dichas Desconocimiento y falta de Falta de interés Desconocimiento sobre los especies pertenecientes a la familia interés por parte de la población investigativo acerca de metabolitos principales Asterácea. relacionado a conocer la plantas nativas de presentes en ambas especies. Carencia de estudios relacionados a actividad farmacológica de nuestro país. través de los años de dichas especies dichas especies. vegetales así como de bibliografía Falta de estudios y análisis actualizada que cuente con datos relacionados a métodos de especiales q aporten a futuras Carencia de recursos extracción, capacidad antioxidante investigaciones. Fomentar en las personas el económicos que permitan manejo adecuado (usos) de las fomentar y apoyar este tipo de e importancia de los radicales libres 146 investigaciones en el metabolismo celular. plantas con las que cuentan en su entorno. Anexo B. Categorización de Variables

Extractos de Tagetes multiflora y Ambrosia arborescens

Cantidad de alcaloides (concentración de

alcaloides) presentes en extractos totales y

fracciones

Métodos de extracción Partes de la planta: -Maceración -Hojas -Reflujo -Tallos

Capacidad

antioxidante

Absorbancia de Concentración de extractos totales y radicales libres fracciones

Inhibición de la Antioxidantes actividad de radicales libres (porcentaje)

147

Anexo C. Certificado de identificación de las especies vegetales Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

148

Anexo D. Fotografías del trabajo experimental

Secado de muestras Molienda de muestras

Hojas molidas de Tagetes multiflora Hojas molidas de Ambrosia arborences

Pesada de hojas molidas de Tagetes multiflora Pesada de hojas molidas de Ambrosia arborences 149

Cenizas Totales y Material Extraño

Incineración de muestras Desecador con muestras

Mufla con muestras Estufa con muestras para material extraíble

Muestras listas para pesar en la estufa- Material extraíble 150

Proceso de Extracción

Muestras pesadas para maceración Maceración de muestras

Preparación de muestras para proceso de reflujo Proceso de Reflujo

Filtración de muestras sometidas a maceración y reflujo.

151

Fraccionamiento

Concentración de las muestras en rotavapor Método de Fraccionamiento de Sarker

Método de Fraccionamiento de Sarker para obtener las fracciones 1, 2 y 3

Concentración de las fracciones Extractos, Fracción 1, Fracción 2 y Fracción

152

Cuantificación de alcaloides

Dilución inicial de las muestras (1/10) Preparación de Reactivo de Dragendorff

Adición de Dragendorff a las muestras

153

Centrifugación de las muestras Precipitación con Dragendorff

Adición de Na2S Adición de Ácido Nítrico concentrado

Preparación de los estándares para la curva de calibración de Bi

Cuantificación de extractos y fracciones de Ambrosia arborescens y Tagetes multiflora

154

Cromatografía en Capa fina

Cámara cromatográfica con mezcla de solventes Secado de placas al ambiente

Cámara UV-VISIBLE Placa Extractos y Fracción 1 de Tagetes multiflora

Placa Extractos y Fracción 1 de Tagetes Multiflora Placa Extractos y Fracción 1 de Ambrosia arborescens

155

Capacidad antioxidante

Pesada del estándar de referencia Trolox Muestras pesadas de Trolox y DPPH

Adición de solvente (metanol) Preparación de estándares para curva de calibración de Trolox

156

Preparación de curva de calibración en microposillos

Ensayos en microposillos con extractos y fracciones de Ambrosia arborences y Tagetes multiflora

Tiempo de espera en la oscuridad de la placa con muestras

DPPH empleado para el análisis Almacenamiento de reactivos

157

Anexo E. Certificado Analítico de DPPH

158

Anexo F. Certificado Analítico de Trolox

159