Nyctalus Lasiopterus, Nyctalus Aviator, Depredación, Paseriformes, Dieta, Migración, Generalista, Plumas, Excrementos

Nyctalus lasiopterus, Nyctalus aviator, depredación, paseriformes, dieta, migración, generalista, plumas, excrementos,

amplificación.

David Pastor Beviá

Universitat d’Alacant Universidad de Alicante

Ecología tró ca del nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus), un murciélago depredador de aves

David Pastor Beviá David Pastor Beviá

Escola de Doctorat Tesis doctoral Escuela de Doctorado ED|UA Alicante, mayo 2017 edua.ua.es Tesis doctoral Alicante, mayo 2017

Departamento de Ecología

Facultad de Ciencias

Ecología trófica del nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus), un murciélago depredador de aves

David Pastor Beviá

Tesis presentada para aspirar al grado de DOCTOR POR LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE

DOCTORADO EN ANÁLISIS Y GESTIÓN DE ECOSISTEMAS

Dirigida por: Carlos Ibáñez Ulargui, Javier Juste Ballesta

Tutor académico: Germán López Iborra

Parte de esta tesis ha sido financiada por el Ministerio de Industria, Comercio y Competitividad a través de los proyectos CGL 2009‐12393 y CGL2012‐38610.

A mi familia

Índice

SECCIÓN INICIAL ………………………………………………………………………………………………………. 7

Síntesis …………………………………………………………………………………………………………………….. 9

Introducción General ………………………………………………………………………………………………. 19

SEGUNDA SECCIÓN …………………………………………………………………………………………………. 31

Artículos publicados ………………………………………………………………………………………………... 33

Chapter 1: A molecular approach to the study of avian DNA in bat faeces ………………. 35

Chapter 2: Concealed by darkness: interactions between predatory bats and nocturnally migrating songbirds illuminated by DNA sequencing…………………………….. 37

TERCERA SECCIÓN …………………………………………………………………………………………………… 39

Artículos no publicados …………………………………………………………………………………………… 41

Chapter 3: Bird species in the diet of the birdlike noctule Nyctalus aviator …………….. 43

Chapter 4: Does bat predation have an impact of migration behavior and demography of songbirds? ……………………………………………………………………………………… 59

CUARTA SECCIÓN ……………………………………………………………………………………………………. 81

Conclusiones generales ………………………………………………………………………………………….. 83

Agradecimientos …………………………………………………………………………………………………….. 89

6 SECCIÓN INICIAL

8 SÍNTESIS

Las aves y los murciélagos son los 2 únicos grupos vertebrados capaces de realizar un vuelo activo. Teniendo esta característica en común, sería esperable que presentaran numerosas interacciones entre miembros de ambos grupos. Esto no es así principalmente a la segregación temporal que presentan, siendo las aves principalmente diurnas, a excepción de algunos grupos como las rapaces nocturnas o los chotacabras y los murciélagos principalmente nocturnos. Entre las interacciones que se pueden dar entre aves y murciélagos, la depredación es, probablemente, la más importante, siendo un factor determinante en la segregación temporal de ambos grupos, así como en su comportamiento. Esta interacción es, aunque bidireccional, asimétrica, conociéndose muchos más casos de aves que depredan sobre murciélagos que al revés, restringiéndose a unas pocas especies de murciélagos que consumen aves en mayor o menor medida, siendo todas de regiones tropicales a excepción de 3 murciélagos insectívoros que, ocasionalmente, complementan su dieta con la ingesta de aves y que se encuentran en regiones templadas. Este es el caso de Nyctalus lasiopterus principalmente en Europa aunque también presente en el norte de África y Oriente Próximo, Ia io en el sudeste asiático, y Nyctalus aviator en el noreste asiático. En esta tesis centraremos la atención sobre la dieta aviar, la selección de presas y los métodos de caza de las 2 especies del género Nyctalus.

El nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus) es el murciélago más grande y raro de Europa, con longitud de antebrazo de 62‐69 mm y un peso de 47‐76 gr y distribución discontinua y fragmentada. Es una especie arborícola, refugiándose en oquedades presentes en los troncos de los árboles Este murciélago presenta unas alas largas y estrechas, propias de las especies de murciélagos con una baja maniobrabilidad en vuelo que buscan alimento en espacios abiertos, lo cual le permite detectar e interceptar a sus presas en vuelo. Además de las características morfológicas, su ecolocación también refleja la adaptación a la búsqueda de presas grandes en este tipo de ambientes, al emitir llamadas de larga duración (12.3 ± 3.1 ms) y baja frecuencia

9 (18.8 ±1.5 kHz), especialmente adecuadas para largas distancias de detección, observándose una relación en la adaptación a este tipo de caza tanto morfológica como fisiológicamente. Se alimenta principalmente de insectos, aunque se descubrieron plumas en sus excrementos durante primavera y otoño, coincidiendo con las campañas migratorias de las aves. Mediante un estudio de la composición isotópica de la sangre de este murciélago se reveló que se producía un cambio en dicha composición durante la primavera y el otoño (más similar a la composición isotópica de las muestras de pájaros que a las muestras de insectos), coincidiendo con los periodos en los cuales las plumas aparecen en los excrementos y con el periodo migratorio de las aves. Dicho estudio solventó la duda de que el nóctulo grande depreda activamente sobre pequeños pájaros durante sus migraciones y esas plumas que aparecen en gran proporción en los excrementos no son ingeridas por error confundiéndolas con insectos al encontrarlas flotando en el aire.

La especie Nyctalus aviator, con distribución en el este de China, la península de Corea, Japón y posiblemente el este de Rusia es una especie muy parecida al nóctulo grande, considerándose como la misma especie hasta que, atendiendo a diferencias en caracteres morfológicos, fueron separadas en 2 especies diferentes. Es ligeramente más pequeño que Nyctalus lasiopterus, con una longitud de antebrazo de 59‐65 mm y con una morfología alar y ecolocación muy similar al nóctulo grande, siendo también un excelente cazador en espacios abiertos. Utiliza también huecos en árboles para refugiarse durante el día y basa su alimentación en artrópodos que intercepta durante el vuelo. También como en el caso del nóctulo grande, se encontraron plumas dentro de sus excrementos en primavera, finales de verano y otoño, coincidiendo con la época de migración de aves.

Es difícil observar los eventos de caza de los depredadores sobre las presas, por lo que las dietas han sido tradicionalmente estudiadas mediante metodologías como la identificación morfológica de restos de las presas encontrados en los excrementos o regurgitados del depredador, aunque en ocasiones es difícil encontrar restos identificables. Por ello, actualmente las técnicas moleculares basadas en la identificación de las presas consumidas a partir de la extracción, amplificación y secuenciación su ADN contenido en los excrementos del depredador han ido cobrando

10 fuerza. No obstante, estas técnicas presentan sus desventajas. Debido a la naturaleza de la materia prima, las muestras suelen estar bastante contaminadas y contener inhibidores de la amplificación mediante PCR y mezcla de material genético tanto del depredador y de las presas consumidas como otros organismos tales como bacterias, parásitos, etc. Se utiliza principalmente ADN mitocondrial tal como los genes del citocromo b o de la subunidad I de la citocromo oxidasa (COI) debido a la alta tasa de mutación que presenta, permitiendo identificar secuencias de organismos filogenéticamente muy próximos mediante la ayuda de bases de datos en las que se almacenan secuencias ya identificadas, como la de Barcode of Life Data System (BOLD).

Los objetivos principales de esta tesis son el desarrollo de una metodología de extracción y amplificación del ADN de las presas que consumen los murciélagos depredadores de pájaros a partir de sus excrementos para poder identificar las especies de aves que depredan, determinar si son especies generalistas o especialistas en la selección de presas, dilucidar la forma en la que capturan y consumen las aves que detectan e interceptan y predecir el impacto que puede tener esta depredación en el caso del nóctulo grande sobre las poblaciones de paseriformes migradores.

El primer paso es desarrollar una metodología que incluya un método de preservación de excrementos de murciélago que permita una óptima conservación del ADN para una posterior extracción del material genético total, amplificación del ADN de los pájaros consumidos contenidos en el excremento y su posterior secuenciación. Toda esta metodología es desarrollada en el Capítulo 1, en el cual se evalúan 2 métodos de conservación de excrementos de nóctulo grande con plumas en su interior (congelación y secado), la eficiencia de 2 métodos de extracción, utilizando un kit de extracción de Qiagen que utiliza un lavado, y un protocolo modificado que usa tiocianato de guanidinio (GuSCN) aplicado después de la previa congelación y pulverización de las muestras, y el éxito de amplificación de ADN de pájaro de 5 pares de cebadores de ADN, uno generalista de vertebrados y otro generalista de aves, ya existentes en la bibliografía, y 3 de nuevo diseño (2 para citocromo b y 1 para COI). Estos 3 pares de cebadores nuevos se diseñaron a partir de una selección de 81 secuencias de citocromo b y 77 secuencias de COI procedentes de 86 pájaros que

11 fueran presas potenciales por tamaño del nóctulo grande en la Península Ibérica, existentes en la base de datos de GenBank y BOLD Systems. Todas estas secuencias fueron alineadas y localizadas regiones conservadas entre ellas. Una vez detectadas estas regiones comunes, se diseñaron los pares de cebadores complementarios a estas regiones para conseguir su amplificación y posterior secuenciación. Los resultados de las amplificaciones mostraron que el método de conservación no influye en el éxito de extracción de ADN, ya que el raquis de las plumas confiere una estructura de protección frente a agentes degradantes externos. Aun así, el método de extracción mediante lavado resultó ser más efectivo aplicando previamente la conservación mediante congelación que con el secado. Si se utiliza el método de extracción mediante pulverización, la forma de conservación de los excrementos no influye en el resultado, al romperse el raquis de las plumas y liberar al medio ADN de mayor calidad que el presente fuera del raquis. Los cebadores generalistas de vertebrados y aves mostraron una baja eficiencia en la detección de ADN de ave en el interior de excrementos de murciélago con respecto a los cebadores de nuevo diseño, probablemente debido a su mayor tamaño y baja especificidad. Así pues, los 3 pares de cebadores diseñados para regiones de citocromo b y COI muestran una resolución similar en la amplificación de ADN. Por tanto, la combinación que ofrece un mayor éxito en la extracción y amplificación de ADN aviar contenido en excrementos de murciélago resultó ser la extracción mediante pulverización y la utilización de uno de los 3 pares de cebadores diseñados, llegando al 100% de efectividad en la amplificación si se utilizan al menos 2 de los 3 pares.

Una vez desarrollada una metodología de conservación de excrementos y extracción y amplificación del ADN de las presas, el siguiente paso es aplicarla para conocer la composición de especies de pájaros de las que se alimenta el nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus) y Nyctalus aviator, saber si son generalistas o especialistas en la selección de sus presas, si discrimina entre tamaños de presa y si las caza durante sus vuelos en el aire o en el interior de refugios. Para ello, el Capítulo 2 se centra en el estudio trófico de Nyctalus lasiopterus, donde se analizaron un total de 226 excrementos con plumas en su interior recogidos entre 1998 y 2009 mediante la introducción del murciélago en una bolsa de tela y posterior recogida tras el transcurso

12 de unas horas (metodología llevada a cabo en La Rioja (115 excrementos) y Sevilla (39 excrementos), con un total de 154 excrementos), o bien entre 2003 y 2010 mediante la recogida debajo de refugios (palmas de Washingtonia filifera en Sevilla (32 excrementos) y cajas refugio en el Parque Nacional de Doñana (40 excrementos), con un total de 72 excrementos). Los excrementos fueron congelados a ‐20 °C o secados en el interior de bolsas de papel a temperatura ambiente. El método de extracción utilizado fue la modificación del protocolo con tiocianato de guanidinio y pulverización previa por ser el método más eficaz, al romper la estructura protectora del raquis y se utilizaron los 3 pares de cebadores de nuevo diseño, al presentar un mayor éxito de amplificación. Los resultados fueron de un 95% de éxito en la amplificación de ADN de pájaro y más de un 98% de semejanza en todos los casos con respecto a la base de datos de BOLD. Se identificaron un total de 31 especies de paseriformes consumidas pertenecientes a 8 especies de familias diferentes. La mayor parte de estas especies son migradoras nocturnas, por lo que Nyctalus lasiopterus captura a los pájaros durante sus vuelos nocturnos, en su mayoría durante la migración de sus presas. En la composición de especies depredadas se observa la ausencia de especies que frecuentemente utilizan cajas nido o agujeros en los árboles para nidificar o refugiarse. Las especies encontradas en la dieta que sí pueden hacerlo solo los utilizan en época de cría, durante la primavera o a principios de verano, cuando el nóctulo grande todavía no depreda pájaros. Por tanto, y de acuerdo con las características ecomorfológicas del nóctulo grande, los resultados obtenidos refuerzan la hipótesis de que la búsqueda, captura y presumiblemente ingesta de pájaros se realizaría en el aire y no en reposo. La alta diversidad de especies consumidas sugiere que el nóctulo grande se comporta como un depredador generalista, ajustando la depredación a la disponibilidad de especies. También refuerza este resultado el hecho de que la composición de la dieta a lo largo de la migración postnupcial coincida con la fenología general de la migración durante el mismo período de tiempo, empezando en agosto con migrantes transaharianos exclusivamente y acabando en noviembre con mayoría de migrantes parciales y/o especies sedentarias con movimientos nocturnos de dispersión. Todas las presas están comprendidas entre el rango de 5 a 25 gramos. La poca disponibilidad de especies con un peso mayor de 25 gramos en las 3 familias de pájaros que migran mayoritariamente de noche y que componen la mayor parte de la

13 dieta de este murciélago puede sugerir que este límite de tamaño pueda ser debido más por la baja disponibilidad de presas mayores que por limitaciones de tamaño. Se pone de manifiesto que esta especie de murciélago selecciona positivamente tamaños medios de pájaros (10‐15 gramos), posiblemente porque representan el balance coste/beneficio más conveniente en términos de energía y evitación de riesgos. Los pájaros más pequeños han de ser más difíciles de detectar y, por consiguiente, recibirían menos ataques, mientras que los pájaros con tamaño superior a 15 gramos serían más fáciles de detectar, pero también presentan un mayor riesgo de defensa. Así pues, los pájaros consumidos representan entre un 10% y un 50% de la masa corporal del nóctulo grande, excediendo ampliamente el umbral del 5% en relación con la habilidad de vuelo de murciélagos que cazan volando. Este umbral del 5% probablemente será válido para especies que cazan insectos en el aire, pero no para este tipo de murciélagos que pueden, además, cazar pájaros a elevadas altitudes, sugiriendo que otras especies de murciélagos de menor tamaño puedan ser también capaces de depredar sobre pequeños paseriformes. Por último, la estrategia de caza generalista del nóctulo grande no sugiere una selección de presas por características sensoriales particulares tales como coloración del plumaje, emisión de cantos durante el vuelo o comportamientos específicos de vuelos de las presas, pero es cierto que un pequeño número de especies son depredadas por encima de su disponibilidad, debido probablemente al comportamiento recientemente descubierto en el cual algunas especies migradoras nocturnas realizan cortos desplazamientos no relacionados con la migración. En el Capítulo 3, el foco de atención se centra en la otra especie del género estudiado: Nyctalus aviator. Para ello, el primer paso fue recoger y analizar un total de 115 excrementos con presencia de plumas en su interior en 3 refugios diferentes, localizados todos en Japón (Asahikawa, Hakodate y Kumagaya) entre 2000 y 2011. Las muestras fueron almacenadas en seco y se procesaron siguiendo la misma metodología aplicada en el estudio de la dieta del nóctulo grande. Los resultados fueron de un 86% de éxito en la amplificación de ADN de pájaro y al menos un 99% de semejanza en todos los casos con respecto a la base de datos de BOLD. Se identificaron un total de 15 especies de paseriformes de 7 familias diferentes. El número de familias representadas en la dieta es parecido a la cantidad de la dieta del nóctulo grande (7

14 frente a 8), pero el número de especies es sensiblemente menor (15 frente a 31), debido posiblemente al muestreo menos exhaustivo en cuanto al menor número de localizaciones, duración en el tiempo y muestras analizadas. La mayoría de las especies consumidas son migradoras, con un rango de peso de 6‐15 gamos, sugiriendo que se trata de un depredador generalista de pájaros migradores durante la noche. De todas las especies consumidas, 5 utilizan cajas nido o agujeros en árboles en época de cría, de las cuales solo 2 fueron encontradas en el periodo en el que coincide la migración con la cría, siendo muy difícil saber si las consume en vuelo o en los refugios, pero la proporción de especies migradoras durante la noche que aparece en la dieta es muy extensa, apoyando fuertemente que esta especie consume a sus presas durante el vuelo. El tamaño más pequeño de este murciélago, que explicaría el menor tamaño medio de las presas consumidas, y la posición marginal de Japón en las rutas migratorias de paseriformes podrían jutificar la menor proporción de plumas encontradas en los excrementos de Nyctalus aviator en comparación con Nyctalus lasiopterus en la Península Ibérica. En el Capítulo 4 se realiza una revisión bibliográfica con la finalidad de recopilar los datos que se tienen de la depredación de aves del nóctulo grande para posteriormente estimar el impacto de la depredación de este murciélago sobe las poblaciones de paseriformes migratorios y discutir el papel que tiene esta depredación como un factor de selección en el comportamiento migratorio de las aves. Revisando la literatura es un hecho probado que nunca se han registrado eventos de caza de especies del género Nyctalus mientras no están volando. Las características ecomorfológicas de estas especies muestran una adaptación a la caza en vuelo en espacios abiertos. Tampoco se han encontrado restos de pájaros en los refugios revisados del nóctulo grande. Esta especie solo se alimenta de pájaros coincidiendo con las migraciones pre y postnupciales de primavera y otoño, y las especies que consume son principalmente migratorias nocturnas y que migran a una altura de al menos 700 metros sobre la superficie terrestre. Esta altura es perfectamente abarcable por el nóctulo grande, al registrarse vuelos con radar por encima de 1000 metros sobre la superficie terrestre. Por ello, se puede deducir que el nóctulo grande intercepta y consume a los pájaros en vuelo a elevadas altitudes, pero nunca cerca del suelo o en refugios. La interceptación, manipulación e ingesta de presas tan grandes

15 en vuelo, llegando a superar en algunas especies de pájaro el 50% del peso corporal del murciélago, presenta serias limitaciones para el correcto funcionamiento del vuelo. El nóctulo grande presenta una gran plasticidad a la hora de aumentar la carga corporal durante el vuelo. Así lo demuestra durante la gestación, donde el peso puede aumentar hasta un 50%, durante la lactancia, donde pueden transportar a las crías de un refugio a otro cuando éstas ya suponen el 70% del peso de un adulto y después de la ingesta de alimento, pudiendo aumentar su peso hasta un 40% sin que la capacidad de vuelo se vea comprometida. Aun así, el ejercicio del vuelo puede verse reducido durante la manipulación de las presas. Por esto, se sugiere que el nóctulo grande interceptaría a los pájaros a grandes altitudes para que la pérdida de altitud durante la manipulación no arriesgara su integridad física a causa de un choque contra el suelo. Durante dicha manipulación, ingeriría solo partes blandas del cuerpo del pájaro tales como los músculos pectorales o vísceras, hipótesis soportada por la ausencia de huesos en los miles de excrementos analizados y los trozos de músculos sin huesos encontrados en el interior del estómago de un individuo muerto. Mediante el pesado de la masa muscular pectoral de 51 pájaros pertenecientes a 24 especies presas del nóctulo grande se obtuvo una regresión lineal que correlaciona el peso de los pájaros y el peso de su masa pectoral. Sabiendo que el peso medio de 232 especies de 31 especies presa del nóctulo grande es de 12.64 gr, con masa pectoral en la regresión lineal de 1.9 gr y que la tasa metabólica de campo estimada para esta especie de murciélago es de 110.2 kJ por día, cada murciélago debería consumir por noche al menos 12 pájaros para satisfacer sus requerimientos energéticos, asumiendo que solo se alimente de masa pectoral y teniendo en cuenta que cuando consume pájaros en los excrementos nunca se encuentran restos de insectos, alimentándose solo de éstos. Se estimó que el número de días en los que un murciélago puede depredar sobre pájaros teniendo en cuenta los meses del año cuando se producen las migraciones pre y postnupciales y el porcentaje de actividad media dependiendo de condiciones climáticas es de 144 días, y la proporción de murciélagos consumiendo pájaros durante esa época es de un 34%. La población mínima de nóctulo grande en la Península Ibérica es de al menos 15900 individuos, teniendo en cuenta los datos de censos de estudios regionales previos. Al utilizar todos estos datos y aproximaciones, se puede estimar el número de paseriformes depredados por la población de nóctulo grande en

16 la Península Ibérica en un año en 9.3 millones de pájaros. La proporción de paseriformes consumidos en un año por el nóctulo grande en la Península Ibérica es del 0.2% con respecto al total de paseriformes que cruzan durante la migración de otoño este territorio, pudiendo parecer insignificante, pero la mortalidad puede no afectar al riesgo de depredación que percibe la presa. El número de pájaros estimados que consume el nóctulo grande por año es parecido al impacto que produce el halcón de Eleonor, pero en este caso sí que se conoce la influencia que produce esta depredación en el comportamiento de las aves presa. Una de las posibles estrategias antidepredación que ha podido desarrollar los paseriformes migrantes nocturnos europeos es dejar de emitir cantos mientras vuelan, característica que sí se presenta en sus parientes americanos en ausencia de un depredador nocturno de estas características. Esta hipótesis puede ser apoyada por la evidencia de que, mediante ecolocación, el nóctulo grande explora una distancia de 29‐38 metros, mientras que la audición de vocalizaciones aumenta a un rango de detección de 300 metros, además de no ser unidireccional. Además, los zorzales, que no forman parte de la dieta de este murciélago, emiten sonidos mientras migran de noche, al igual que sus parientes americanos.

Sintetizando de forma general, esta tesis ha permitido poner a punto una metodología de extracción y amplificación de ADN de pájaros a partir de excrementos de murciélago, sentando las bases moleculares para poder arrojar un halo de luz sobre la composición aviar de las dietas, método de caza empleado y selección de las presas de 2 de las 3 especies de murciélagos del Paleártico que complementan su dieta insectívora consumiendo aves durante los desplazamientos migratorios nocturnos de paserifomes.

18 INTRODUCCIÓN GENERAL

El estudio y entendimiento de los flujos de energía es una cuestión fundamental en ecología (Montoya & Solé, 2002). Las interacciones depredador‐presa han capturado la atención de investigadores a lo largo del tiempo debido a los importantes efectos que tienen dichas interacciones en las dinámicas poblacionales, tanto de los depredadores como de las presas, así como en el funcionamiento del ecosistema completo (Lima, 1998). La selección de una presa en particular es una compleja decisión que resulta de la interacción de factores como el tamaño de la presa, la densidad poblacional y la disponibilidad (Griffiths, 1975; Symondson, 2002).

Las aves (clase Aves) y los murciélagos (orden Chiroptera) son los dos únicos grupos de vertebrados con capacidad para realizar un vuelo activo. Sería esperable que, teniendo esta característica en común y siendo ambos grupos muy diversificados, existieran numerosas interacciones de distinta naturaleza entre miembros de ambos grupos. Sin embargo, esto no es así debido a la segregación temporal de la actividad, siendo las aves predominantemente diurnas y los murciélagos nocturnos. Esta segregación temporal no es simétrica. Así pues, mientras que todos los murciélagos son nocturnos, en el caso de las aves hay algunos grupos que se apartan del patrón de actividad diurno y ocupan el mismo nicho temporal que los murciélagos, como las rapaces nocturnas y los chotacabras. Dentro de las distintas interacciones entre aves y murciélagos, la depredación es, probablemente, la más importante debido a las importantes consecuencias que ha podido tener en el desarrollo del comportamiento y evolución de ambos grupos (Lima & O’Keefe 2013). Como ocurre con la segregación temporal, las relaciones depredador‐presa que se dan entre ambos grupos, aunque bidireccionales, son de naturaleza asimétrica. Aunque los murciélagos no son presas exclusivas y carecen de depredadores especializados en su consumo, se conocen muchas especies de aves que depredan sobre gran cantidad de especies de murciélagos de forma ocasional y, por el contrario,

19 se conocen muy pocas especies de murciélagos que depredan ocasionalmente sobre aves. De hecho, la depredación de murciélagos por las aves ha recibido bastante atención desde hace tiempo, teniendo importantes consecuencias sobre la evolución y el comportamiento de los murciélagos. Así pues, es bastante posible que esté entre las principales causas de su nocturnidad, pero también afecta a la selección de refugios, la hora de emergencia de éstos, la evitación de la luz de la luna, etc. (Lima & O’Keefe 2013, Mikula et al. 2016).

Por el contrario, la depredación de murciélagos sobre aves se limita a apenas unas pocas especies de murciélagos. Éstos presentan una gran variedad de dietas, pudiéndose alimentar según la especie de murciélago, de insectos, vertebrados, frutas, néctar, polen e incluso sangre. En las regiones templadas, los murciélagos consumen principalmente insectos, y el estudio de sus dietas se ha basado en la identificación morfológica de restos de sus presas presentes en los excrementos (principalmente restos de cutículas de artrópodos), resultantes de la masticación de las presas. Estos fragmentos normalmente no permiten la identificación taxonómica más allá del nivel de Orden, con lo que la resolución de los estudios de dieta es bastante escaso (Whitaker et al., 2009; Zeale et al., 2011). Las técnicas moleculares empleadas en los estudios de dieta han permitido incrementar la resolución de la identificación de presas en las dietas de los murciélagos hasta el nivel de especie (Zeale et al., 2011). Las especies de murciélagos que depredan vertebrados también consumen insectos en mayor o menor medida (Norberg & Fenton 1988). Estas especies carnívoras se encuentran en las regiones tropicales, mientras que en las regiones templadas, los murciélagos son principalmente insectívoros. No obstante, existen 3 de estas especies insectívoras no tropicales que suplementan su dieta de artrópodos con la ingesta de pequeños pájaros en momentos puntuales del año, coincidiendo con los movimientos migratorios nocturnos de ciertas especies. Este es el caso de Nyctalus lasiopterus principalmente en Europa aunque también presente en el norte de África y Oriente Próximo, Ia io en el sudeste asiático, y Nyctalus aviator en el noreste asiático (Thabah et al. 2007, Ibáñez et al. 2001, Fukui et al. 2011). En esta tesis centraremos la atención sobre la dieta aviar, la selección de presas y los métodos de caza de las 2 especies del género Nyctalus.

20 El nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus) es el murciélago más grande de Europa, con longitud de antebrazo de 62‐69 mm y un peso de 47‐76 gr (Macdonald & Barrett, 1993; Schober & Grimmberger, 1993) y el más raro de Europa por su distribución discontinua y fragmentada a pesar de extenderse desde Portugal a Turquía y desde el norte de Francia hasta Marruecos. En España se encuentran las principales poblaciones de la especie, aunque con distribución muy fragmentada, considerándose como especie vulnerable en el Catálogo Nacional de Especies Amenazadas (2011). Es una especie arborícola, utilizando como refugios grietas del tronco, oquedades producidas por ramas partidas, límites de descorche en alcornoques o agujeros producidos por pícidos, por lo que su distribución está ligada a la presencia de masas forestales que cuentan con pies viejos que les ofrecen posibles guaridas. Este murciélago presenta unas alas largas y estrechas, propias de las especies de murciélagos con una baja maniobrabilidad en vuelo que buscan alimento en espacios abiertos, al contrario que las especies que cazan en ambientes cerrados (Aldridge & Rautenbach, 1987, Norberg & Rayner, 1987), lo que le permite capturar a sus presas en vuelo durante los desplazamientos. Además de las características morfológicas, su ecolocación también refleja la adaptación a la búsqueda de presas grandes en este tipo de ambientes, al emitir llamadas de larga duración (12.3 ± 3.1 ms) y baja frecuencia (18.8 ±1.5 kHz), especialmente adecuadas para largas distancias de detección, permitiendo reconocer presas a unos 30 metros de distancia (Estók & Siemers, 2009). Por tanto, se observa una relación entre la morfología y la ecolocación, demostrándose una adaptación para la búsqueda y detección de presas en espacios abiertos (Norberg & Rayner, 1987, Ibáñez et al., 2001). Se alimenta principalmente de insectos tales como ortópteros, coleópteros, lepidópteros, dípteros, homópteros y neurópteros (Smirnov & Vekhnik, 2013). No obstante, se descubrió la presencia de plumas en los excrementos de este murciélago y se predijo que los pájaros eran cazados en vuelo mientras migraban durante la noche (Dondini & Vergari, 2000, Ibáñez et al., 2001). El hallazgo de la depredación de pájaros por un murciélago insectívoro durante la época migratoria genera una cierta controversia porque los murciélagos cazadores aéreos que capturan sus presas en vuelo consumen presas que no alcanzan el 5% de su masa corporal (Fenton 1990) y, en

21 este caso, los pájaros superan ampliamente este límite (dependiendo de la especie, podrían alcanzar al menos el 20 o 30 % de la masa corporal del murciélago). Resulta difícil de entender que un murciélago pueda matar y consumir en vuelo una presa de estas características, por lo que este descubrimiento fue puesto en duda, argumentándose que sería más probable que el murciélago confundiera las plumas que flotaban en el aire durante las épocas de migración con posibles presas, al no aparecer huesos en los excrementos, a diferencia de partes no digeribles del exoesqueleto de los artrópodos de los que se alimenta. Una vez en la boca, sería más fácil para el nóctulo tragarse la pluma interceptada por error que rechazarla (Bontadina & Arlettaz, 2003). Sin embargo, cuando se encuentran plumas en los excrementos del nóctulo grande, nunca representan menos del 80% del excremento, por lo que una ingesta tan elevada no puede ser debida exclusivamente a la captura por error de plumas sueltas en el aire (Ibáñez et al., 2003). En 2007 esta estrategia fue confirmada al observarse un cambio en la composición isotópica de la sangre del nóctulo grande durante la primavera y el otoño (más similar a la composición isotópica de las muestras de pájaros que a las muestras de insectos), coincidiendo con los periodos en los cuales las plumas aparecen en los excrementos y con el periodo migratorio de las aves. Por tanto, se confirmó que este murciélago depreda sobre paseriformes durante sus desplazamientos nocturnos (Popa‐Lisseanu et al. 2007). Los desplazamientos migratorios de los paseriformes entre el Paleártico y Africa movilizan miles de millones de pájaros que se desplazan por rutas establecidas (Hahn et al. 2009), suponiendo un recurso trófico de enorme magnitud disponible durante varios meses al año. El nóctulo grande caza habitualmente a una altura por encima de los 400 m sobre el nivel del suelo, llegando hasta los 1.700 m (Popa‐Lisseanu, 2007), coincidiendo con la altura a que estas aves realizan sus migraciones. La migración nocturna de paseriformes se produce en un rango variable de altitudes, aunque normalmente ocurre a más de 700 metros de altitud (Burderer, 1997). Es en esta altitud donde el nóctulo grande establecería contacto con los paseriformes migratorios. Al capturar a su presa a elevada altitud, el murciélago dispondría del tiempo suficiente para poder alimentarse de las partes blandas del pájaro (como los músculos pectorales y las vísceras) y desechar las partes duras, pudiendo perder

22 altitud mientras lo está manipulando sin riesgo de colisión contra el suelo. Es por esto que no se encontrarían huesos en los excrementos (Ibáñez et al. 2003).

La especie Nyctalus aviator, con distribución en el este de China, la península de Corea, Japón y posiblemente el este de Rusia (Fukui et al., 2013) es una especie muy parecida al nóctulo grande. De hecho, fue considerada como subespecie del nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus aviator) hasta que, atendiendo a diferencias en caracteres morfológicos, fueron separadas en 2 especies diferentes (Maeda 1974). Así pues, Nyctalus aviator es ligeramente más pequeño que Nyctalus lasiopterus, con una longitud de antebrazo de 59‐65 mm (Fukui 2009) y con una morfología alar y ecolocación muy similar al nóctulo grande, siendo también un excelente cazador en espacios abiertos. Utiliza también huecos en árboles para refugiarse durante el día y basa su alimentación en artrópodos que intercepta durante el vuelo (Maeda 1974). También como en el caso del nóctulo grande, se encontraron plumas dentro de sus excrementos en primavera, finales de verano y otoño, coincidiendo con la época de migración de aves (Fukui et al. 2013).

En muchas ocasiones es difícil observar los eventos de caza de los depredadores en el campo, con lo que las dietas han de ser estudiadas mediante otras metodologías. Tradicionalmente se utilizaba la identificación morfológica de los restos encontrados en los excrementos del depredador, pero en ocasiones es una tarea complicada debido al masticado y digerido de los restos de la presa. Es por esto que, actualmente, las técnicas moleculares y, particularmente, técnicas basadas en amplificación de ADN mediante PCR (Polimerase Chain Reaction) han probado ser altamente efectivas en el estudio de dietas, desplazando otras metodologías (Symondson, 2002).

Aunque la detección y amplificación de ADN no es una tarea fácil debido a la propia degradación del material genético en el proceso digestivo y su mezcla con contaminantes, ADN procedentes de otros organismos e inhibidores de la amplificación, mediante un adecuado protocolo de extracción del material genético presente en las muestras y un diseño de cebadores específicos, se permite amplificar solo las secuencias del ADN de interés (King et al., 2008). Gracias a esto, es posible

23 identificar las presas a través de materiales tales como excrementos, contenidos estomacales o regurgitados (Zeale et al., 2011). Esta metodología ha revolucionado el estudio de la dieta en multitud de especies, utilizando principalmente el ADN mitocondrial debido a la alta tasa de mutación que presenta, lo cual facilita la discriminación entre especies cercanas (Brown et al., 1979) y a que es mucho más abundante y fácil de obtener que el ADN nuclear. Por esto, se secuencia parcial o completamente genes como el citocromo b o la subunidad I de la citocromo oxidasa (COI). Este último gen está siendo ampliamente utilizado debido a su utilidad en el Barcode for Life Consortium (Tobe et al., 2010), una iniciativa internacional dedicada a apoyar el desarrollo del “código de barras de ADN” (DNA barcoding) como herramienta estándar global para la identificación de especies. El DNA barcoding emplea diversidad de secuencias de regiones genéticas cortas y estandarizadas para permitir la identificación de especies. Pero de nada serviría si la secuenciación de esas regiones no se guardara para futuras comparaciones. Esto es lo que proporciona el Barcode of Life Data System (BOLD), una base de datos y aplicación bioinformática integrada encargada de almacenar una librería de secuencias (Ratnasingham & Hebert, 2007). Si se desea conocer la procedencia de un material genético, bastará con amplificar un fragmento de esas secuencias altamente utilizadas e introducirla en la aplicación, que comparará con las secuencias de su base de datos y mostrará, mediante porcentajes de coincidencia, qué especies son las genéticamente más próximas a la muestra inicial.

24 Los objetivos específicos son:

En el capítulo 1 1) poner a prueba diferentes métodos de conservación de excrementos y determinar si la vía de conservación y el tiempo de almacenamiento influyen en la conservación del ADN, 2) desarrollar un protocolo efectivo para la extracción de ADN a través de excrementos de murciélago, 3) identificar fragmentos diagnósticos de ADN mitocondrial que amplifiquen solo ADN de ave, discriminando entre otros materiales genéticos presentes en los excrementos de murciélago y permitiendo la identificación de las presas hasta el nivel de especie.

En el capítulo 2 1) establecer la composición de especies y amplitud de la dieta carnívora del nóctulo grande, 2) resolver la cuestión sobre si esta especie caza a sus presas en el aire o las captura en refugios, 3) determinar un nuevo umbral de tamaño de presas para los murciélagos cazadores aéreos, 4) probar si el nóctulo grande selecciona a sus presas en base a su tamaño.

En el capítulo 3 1) averiguar la composición de especies de las que se alimenta Nyctalus aviator siguiendo el mismo procedimiento metodológico que en el estudio de la dieta del nóctulo grande, 2) verificar si esta especie también depreda sobre paseriformes que migran durante la noche, 3) conocer si depreda a las especies de pájaro en el aire o en refugios, 4) testar la hipótesis de que el tamaño más pequeño de Nyctalus aviator puede explicar la menor proporción de aves en su dieta.

En el capítulo 4 1) revisar la literatura para describir la depredación de aves migratorias por murciélagos, 2) estimar el impacto de la depredación del nóctulo grande sobe las poblaciones de paseriformes migratorios, 2) discutir la depredación del nóctulo grande como un factor de selección en el comportamiento migratorio de las aves.

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30 SEGUNDA SECCIÓN

32 TRABAJOS PUBLICADOS

34 CHAPTER 1

A molecular approach to the study of avian DNA in bat faeces

Acta Chiropterologica, 16(2): 451–460, 2014

doi: http://dx.doi.org/10.3161/150811014X687378

36 CHAPTER 2

Concealed by darkness: interactions between predatory bats and nocturnally migrating songbirds illuminated by DNA sequencing

Molecular Ecology (2016) 25, 5254–5263

doi: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mec.13831/full

Tercera SECCIÓN

TRABAJOS NO PUBLICADOS

CHAPTER 3

Bird species in the diet of the birdlike noctule Nyctalus aviator

Introduction

Bats show a wide variety of diets that range from arthropods, vertebrates, fruits, nectar and pollen, to leaves and even blood (Altringham 2011). Carnivorous bats sum up little more than 10 species in the world, and their distribution is mostly restricted to the tropics (Norberg & Fenton 1988; Freeman 1988). In temperate regions, bats are mainly insectivorous and they are major consumers of nocturnal insects (Agosta 2002). Three temperate bat species, however, have been found to prey on migrating songbirds (Dondini & Vergari 2000; Ibáñez et al. 2001; Thabah et al. 2007; Fukui et al. 2013). Of these, Nyctalus lasiopterus, the greater noctule, which lives in the Palaeartic region, has been the most studied so far. Recently, 31 bird species belonging to 8 different families have been identified as prey through DNA sequencing of feather remains in feces, the vast majority of these species being nocturnal migrants (Ibáñez et al. 2016). These results supported the hypothesis that the bats are generalist predators and capture songbirds in open flight, as they would do with insects (Ibáñez et al. 2001, 2003, 2016). The birdlike noctule (Nyctalus aviator), distributed through northeastern Asia, has also been found to consume birds during bird migration periods (Fukui et al. 2013). It is closely related to the European greater noctule bat, strongly resembling it morphologically and in its echolocation. Each of them is the largest aerial‐hawking bat (that is, hunting its prey on the wing) in its distribution range, and they both typically roost in tree cavities, also occupying artificial bird nest boxes (Ibáñez et al. 2004, Maeda 1974, Fukui 2009). In fact, the birdlike noctule was considered a subspecies of N. lasiopterus (N. l. aviator) until Maeda (1983) gave it species status based on morphological differences, mainly the slightly smaller size of N. aviator. The two species are also very similar genetically, with only a 4% difference in ND1, and there is some disagreement to whether species status of the birdlike noctule should be revised (Simmons 2005, Salgueiro et al. 2007). It is this similarity which led to the suspicion that the birdlike noctule might also prey on birds and to its confirmation by examination of food remains in feces (Fukui et al. 2013). The birdlike noctules studied by Fukui et al. (2013) in Japan showed a lower ratio of birds to insect remains in fecal pellets, however, than the greater noctule bats

44 studied in the Iberian Peninsula by Ibáñez et al. (2001). To explain this difference, Fukui et al. (2013) suggested that the smaller size of N. aviator might reduce its range of available prey relative to its somewhat larger relative. In this study we investigated the diet of the birdlike noctule through DNA amplification of bird remains found in bat feces and sequencing, following the same procedures published in Ibáñez et al. (2016). Our goal was to verify that N. aviator preys on nocturnally migratory species, as its European relative N. lasiopterus, and to gain insights into its hunting strategy (e.g. on the wing vs. from nest boxes). We also tested the hypothesis by Fukui et al. (2015) that the smaller size ofN. aviator relative to N. lasiopterus may explain the smaller proportion of birds in the former's diet.

Material and Methods

Study sites and faeces collection Fecal sampling was performed at 3 roosting sites of N. aviator in Japan located in Asahikawa (Hokkaido Island, northern Japan: 438460N, 1428260E), Hakodate (Hokkaido Island: 418530N, 1408380E), and Kumagaya (Honshu Island, central Japan: 368090N, 1398200E) in 2010 and 2011 as it was described in Fukui et al. 2013. A tray was set under each roost and left there for periods of 10‐13 days, after which all feces were collected and investigated for the presence of feathers, and the tray was put back in place (Fukui et al. 2013). For DNA analysis, only faecal pellets containing feathers were selected (N = 115). Samples were kept dry until being processed in 2011‐ 2012.

DNA extraction, PCR amplification and sequencing, and prey quantification Total DNA was extracted in a sterile DNA laboratory (LEM‐EBD), starting from 0.01 to 0.05 g of faecal pellet unit, using a modified guanidinium thiocyanate (GuSCN) method by Rohland & Hofreiter (2007). Accordingly, each faecal pellet unit was pulverized using steel balls after a liquid nitrogen immersion and washed several times with ethanol, dried and resuspended with water (Pastor‐Beviá et al. 2014). Three mitochondrial fragments were amplified from avian DNA using different combinations

45 of primer sets: two fragments (160 and 380 bp) of the cytochrome b gene (Cytb) using the primer sets CytbSPrey (FW/RW) and CytbLPrey (FW/RW), respectively, and one fragment (380 bp) of the cytochrome oxidase gene subunit I (COI) using primer sets COIPrey (FW/RW) (Pastor‐Beviá et al. 2014). Amplification products were sequenced in an ABI 3100 automated sequencer (PE Biosystems, Warrington, UK) following manufacturer’s protocols. Obtained sequences were checked visually with Sequencher v. 4.9 (Gene Codes Corp, MI, USA). Double peak patterns in the inspection of electropherograms suggested the co‐amplification of different sequences in one amplification product in which the sequences could be ascribed unambiguously to two different bird species. The obtained sequences were compared to available sequences in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) using the BLAST tool, and species identification was based on a >98% of similitude threshold.

Dietary niche breadth, prey characteristics and prey choice Taxonomic arrangement, migratory behaviour (by categories of long‐distance migrant, partial migrant and sedentary) and information regarding the use of hollows and nest boxes for each bird species identified were obtained from Del Hoyo et al. (2005–2011) and Brazil (2007), whereas information on migration patterns (primarily diurnal vs. nocturnal) was obtained from Newton (2008). When migratory strategies vary geographically within a species, we focused on populations of Japan and nearby territories. Prey size was estimated by the middle value of the body mass range given by Del Hoyo et al. (2005‐2011) for each species. In recent years, several studies on passerine bird phylogeny using molecular markers have significantly changed the traditional taxonomic arrangement of bird families in Del Hoyo et al. (2005‐2011). We used nevertheless the traditional classification for ease of comparison with the diet of N. lasiopterus (Ibáñez et al. 2016). At the species or subspecies level, however, we did use the most recent nomenclature because it allows a clearer understanding of the origin and status of the birds consumed. These diversions from the species names recognized in Del Hoyo et al (2005 – 2011) are the following: Ficedula narcissina, which now excludes chinese F. elisae populations (Dong et al 2015); Cettia diphonecantans, excluding continental populations now ascribed to C. diphone borealis (Alström et al 2011a); Phylloscopus examinandus, now differentiated from the rest of

46 the P. borealis complex and restricted to Hokkaido, Sakhalin, Kuril Islands and south of Kamchatka (Alström et al 2011b). To quantify prey consumption and compare it to the results obtained by Ibáñez et al. (2016) for N. lasiopterus, we took two different approaches. In the first approach, we counted as one individual prey or “prey item” the bird species identified in each individual fecal pellet (“single pellet approach”). In the second approach, we combined the species identified in all fecal pellets for one sampling date and night, and considered each of them a “prey item” (“combined sample approach”). The first approach has the handicap that we cannot discern between feces collected the same day at the same roost that contain DNA from different birds of the same species vs. from the same bird. By considering each pellet a different “prey item” we are creating a bias towards those prey species that result in more defecation at the roost, either the ones that have been consumed last before the bat returned to the roost, or those that are larger or contain larger edible parts. With the “combined sample approach” we are over representing rare species (e.g. those that have been captured only once on a given night/site) relative to common species (e.g. several individuals of the same species captured on a given night/site), since all identified species of a combined sample are counted only once. In Ibáñez et al. (2016) these biases were avoided by sampling only one pellet per site and night, so that both approaches (“single pellet” and “combined sample”) would deal identical results. We performed unpaired two‐ sampled t‐tests to compare the mean body mass of prey consumed by N. aviator and N. lasiopterus, using both approaches, the “single pellet” and the “combined sample” approach. To render body mass data of prey of both bat species comparable, we recalculated body mass of prey of N. lasiopterus (dataset in Ibáñez et al. 2016) using the same method as in this study for N. aviator (middle value of the range in Del Hoyo et al. 2005‐2011). Although we are aware that comparison between both datasets (collected by Fukui et al. 2013 and Ibáñez et al. 2016) is not perfect due to sampling differences, coincidence of results between the two different approaches would give robustness to the conclusions.

Results

Of the 115 scats analyzed, 99 amplified bird (98 with one bird species and one with two bird species), and 18 yielded unsuccessful results (ruined during extraction, not amplified, etc). Bird DNA amplification success was therefore 86%. To quantify prey consumed by N. aviator, sample size was N=100 for the “single pellet” approach, and N=41 for the “combined sample” approach (resulting from 20 sampling events). All bird DNA sequences had at least 99% coincidence with GenBank. We identified 15 bird species belonging to 7 different families (Certhiidae, Troglodytidae, Muscicapidae, Turdidae, Sylviidae, Regulidae and Emberizidae). The most represented bird family in the diet by far was Sylviidae, with 7 species, and accounting for 60% of prey consumed (“single pellet” approach) or, alternatively, 51% of prey consumed (“combined sample” approach). The second most represented family was Muscicapidae, with 2 species and representing 22% or 24% of prey consumed (“single pellet” and “combined sample” approach respectively), followed by Emberizidae (2 species, 4% of prey – “single pellet” approach, 5% of prey – “combined sample” approach). The remaining bird families were only represented by one species that appeared in 1‐3 samples (Table 1). The three species that appeared most (Cettia diphone, Phylloscopus examinandus and Ficedula narcissina) represented 58% and 45% of prey (“single pellet” and “combined sample” approach respectively). Together with the next three most represented species (Urosphena squamiceps, Troglodytes troglodytes and Muscicapa dauurica) percentage reached 81 (“single pellet”) and 61 % (“combined simple” approach). Five species appeared only in one combined sample, and three species appeared only in one pellet each (Table 1). Regarding migratory behavior, nine species are long‐distance migrants (61% of prey), five make, or may make, short‐distance migrations (37% of prey), and only one species (Certhia familiaris) that appeared only once is sedentary (previous figures are given for the “combined sample” approach) (Table 1). All species that perform long‐ or short‐scale movements do them typically at night except Emberizidae.

Two thirds of the prey species identified do not nest or roost in hollow trees, while one third do use them (Table 1). Mean body‐mass of the 15 species consumed is13.4 ± 5.47 g being the grey bunting (Emberiza variabilis) the biggest species with 25.4 ± 4.55 gr, and the goldcrest (Regulus regulus subsp. japonensis) the smallest, with 6 ± 1 gr. (Table 1). Two thirds of the species consumed have a body mass under 15 g and only three species are over 20g. Mean body mass of prey was 12.13 ± 4.0 g using the “single pellet” approach (N = 100), and 12.4 ± 3.9 g using the “combined sample” approach (N = 41), with around 70% of prey within the 5‐15 g range for both approaches. In both cases, difference with body mass of prey of N. lasiopterus (14.4 ± 4.4 g) was statistically significant (“single pellet” approach: t = 4.38, p < 00001; “combined sample” approach: t = 2.81, p = 0.0027).

Discussion

Bat hunting strategy: aerial predators of migratory birds vs. nest predators Fourteen out of fifteen prey species perform migratory movements to some degree, and all of them belong to families of nocturnal migrants except the two representatives of Emberizidae (Tabla1). There is no information about migration time of E. fucata y E. variabilis. Newton (2008) considers Emberizidae as mainly diurnal migrants, but E. hortulana in Europe migrates at night, and in fact, Del Hoyo et al (2005‐2011) considers Emberizidae as a family of both nocturnal and diurnal migrants. The species that most appeared both in individual feces and in combined samples was Cettia diphone, occurring in Japan and recently separated from continental Cettia canturians. The latter is considered a long‐scale migratory species, while Cettia diphone seems to perform shorter movements but with great variation in migratory behavior. Populations breeding in Sakhalin and Hokkaido spend the winter at Honshu, while populations breeding in Honshu are considered sedentary or perform altitudinal migrations. Five prey species of N. aviator use hollows in trees to breed, including Certhia familiaris, the only sedentary species identified. Of these, Troglodytes troglodytes and Ficedula narcissina were repeateadly found in feces in May‐June. Since there may be

49 overlap between migration and breeding in this period, we cannot tell whether the birds were captured in the air during migration or inside nest boxes. Overall, the proportion of nocturnal migrants among bird prey of N. aviator was very large, even slightly more than for N. lasiopterus in Iberia. This strongly points to aerial hunting of nocturnally flying birds.

Dietary niche breath The number of bird families represented in feces of N. aviator was very similar to that in N. lasiopterus (7 vs. 8 respectively), with four families shared by the two bat species. Families that contributed most to the diet were the same in both bats (Sylviidae, Muscicapidae and, by much lesser degree, Turdidae). Non‐shared families are present in both study regions and have less significance, either because they have few members in the Palaeartic (Trogloditidae) or because they are primarily diurnal migrants (Alaudidae, Certhiidae, Emberizidae, Fringillidae, Hirundinidae, Motacillidae). Like N. lasiopterus, N. aviator seems to be a generalist predator, probably adjusting consumption to availability. The diet of N. lasiopterus was however more diverse than that of N. aviator regarding number of species (31 vs. 15). One reason may be that the number of samples analyzed was larger for N. lasiopterus and encompassed a larger time and spatial frame. Another possible reason may be that fewer songbirds migrate at night through Japan than through Iberia, although there is limited available information on the subject. It is especially striking that bats in Iberia include 8 species of the genus Sylvia in its diet, while there are none in Japanese bats.

Prey size window Size range of prey of N. aviator was very similar to N. lasiopterus (6 to 25 g body mass in the former vs. 6 to 27 g in the latter, using body mass data by Del Hoyo et al. 2005‐ 2011). The difference in mean body mass of prey for both species was significant, with N. aviator preying on average on slightly smaller prey (ca. 2 g). This difference is consistent with the hypothesis by Fukui et al. (2013) that the smaller size of N. aviatormay account for the smaller proportion of feathers found in its feces relative to N. lasiopterus.

However, we suggest that another reason why N. aviator does not rely as much as N. lasiopterus on bird prey may be the relatively marginal position of Japan in the East Asian‐Australasian migratory flyway for songbirds, which means that migrating birds are not such an abundant resource. In fact, a significant proportion of species consumed by N. aviator are almost endemic of the Japan Sea islands, while nocturnally migratory species with large continental populations barely fly over Japan (Yong et al. 2015). Iberia, in contrast, is located right in the middle of one the main migratory routes between Eurasia and Africa. We predict that N. aviator populations of Korean and China, embedded in the center of the East Asian‐Australasian flyway, will consume a larger proportion of birds than Japanese populations.

Conclusions

The birdlike noctule (Nyctalus aviator) preys at least on 15 species of Passeriformes belonging to 7 different families during postnuptial migration. Most of the species consumed are migratory, with a body mass ranging between 6 and 25 g, suggesting that the bat is a generalist predator of nocturnally migrating songbirds. The bat’s smaller size, Japan’s marginal position in the songbirds’ migratory pathway, or both facts, may explain the lower proportion of feathers found in feces of N. aviator relative to N. lasiopterus in Iberia.

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Table 1.Characteristics of the bird species identified in faeces of Nyctalus aviator. n: number of prey items, defined as the number of faecal pellets in which the species was identified. Migration category: 1: long‐distance migrant; 2: partial migrant; 3: largely sedentary (Del Hoyo et al. 2005–2011). Migration time: 1 = primarily by day; 2 = primarily by night (Newton 2008).

Scientific name n (faeces) n (samples) Migration category Migration time Hollows use Body mass

Certhiidae

Certhia familiaris 5 1 3 yes 8.9

Regulidae

Regulus regulus 8 2 2 + 3 (11) 2 no 6

Sylviidae

Locustella ochotensis 1 1 1 2 no 21

Locustella pleskei 1 1 1 2 no? 20

Phylloscopus examinandus 13 5 1 2 no 11.25

Phylloscopus borealoides 2 2 1 2 no 10.7

Phylloscopus coronatus 2 2 1 2 no 9.25

Cettia diphone 24 7 2 + 3 2 no 15.75

Urosphena squameiceps 11 3 1 2 no 9

Turdidae

Tarsiger cyanurus 2 2 1 + 2 + 3 2 yes 14

Emberizidae

Emberiza fucata 1 1 2 (1) 1 no 17.5

Emberiza variabilis 3 1 1 1 no 25.45

Troglodytidae

Troglodytes troglodytes 7 4 3 (+ 2) (1) 2 yes 9

Muscicapidae

Ficedula narcissina 15 7 1 2 yes 11.5

Muscicapa dauurica 5 3 1 2 yes? 11.9

Table 2. Prey distribution throughout the year.

Species May June August September October December TOTAL

n % n % n % n % n % n % n % Certhia familiaris subsp. familiaris 4 10 14 4.2 Cettia diphone subsp. canturians 3 33.3 13 32.5 7 53.8 23 26 Emberiza fucata 1 7.7 1 1

Emberiza variabilis 3 7.5 3 3.1

Ficedula narcissina 9 75 1 10 2 5 3 23.1 15 14.6

Locustella ochotensis 1 11.1 1 1

Locustella pleskei 1 11.1 1 1

Muscicapa dauurica 3 30 2 5 5 4.2 Phylloscopus borealis subsp. examinandus 2 22.2 1 10 3 13.5

Phylloscopus borealoides 1 11.1 1 100 2 2.1

Phylloscopus coronatus 1 8.3 1 10 2 2.1

Regulus regulus subsp. japonensis 8 20 8 8.3

Tarsiger cyanurus 2 5 2 2.1

Troglodytes troglodytes 2 16.7 1 11.1 2 15.4 5 5.2

Urosphena squameiceps 4 40 6 15 10 11.5

TOTAL (individuals) 12 9 1 10 40 13 45 TOTAL (species) 3 6 1 5 8 4 15

Shannon diversity 0.722 1.676 1.419 1.8456 1.155

Equitability 0.657 0.935 0.882 0.888 0.833

CHAPTER 4

Does bat predation have an impact on migratory behavior and demography of songbirds?

Abstract

Predation is significantly shaping the evolution of avian migration and nocturnal migration has been suggested also as an antipredatory strategy against diurnally active raptors. Recently, nocturnal predation by bats on migrating song birds has been described, but its impact on bird behavior and demography is still unclear. So far three bat species have been identified as aerial, open space predators on migrants, all of which are Old World species. We describe the bats’ hunting strategy and estimate the magnitude of bat predation on birds based on literature information and some additional data. Hereby, we focus on the Iberian population of the Giant Noctule, Nyctalus lasiopterus, a European species with a highly disjunct distribution, for which the largest data set exists. Deducing from the data, we argue that bats catch and ingest bird prey exclusively on the wing at high altitudes, but not during bird stop‐overs. Bird prey species are mostly nocturnally migrating species, the size of which may exceed 50% of bat body mass. Evidence suggests that bats only consume the birds’ most accessible and nutritious body parts, i.e. their chest muscles. Based on calculations of daily energy requirements and food consumption we estimate that during bird migration each bat feeds on 12 birds per night, i.e. ca. 1700 birds per year. Evaluating published and unpublished data we expect the minimum size of the Iberian population of N. lasiopterus to be ca. 15,900 individuals. Consequently, approximately 9.3 million birds fall prey to bats on the Iberian Peninsula alone each year. We argue that bat predation needs to be acknowledged in future studies of the evolutionary ecology of bird migration. In fact, historically most likely larger bat populations before the massive habitat conversions in Europe during the past decades may have had an even larger impact on bird prey species, the effect of which may still be visible in bird behavior, such as the lack of nocturnal flight calls.

Introduction

Predation has been identified a mayor factor shaping the evolution of avian migration. The main predators on migrating birds are raptors, among which falcons and accipiters, species that hunt in the open air space during the day, are most important (Ydenberg et al., 2007). Most falconids and partly accipiters are also migrants (Newton, 2008) and some show extreme specializations for predation on migrating birds. For example, the mediterrenean Eleonora’s falcon (Falco eleonorae), has shifted its breeding period, i.e. the time when being most dependent on high prey densities, to the peak of bird migration in August and September (Walter, 1979). Therefore, areas of high predation pressure on migrants are dynamic in time and space along the birds’ migration routes. This observation has led to the hypothesis of “predator landscapes”, which predicts that safety influences the migrants’ choice of routes, stop‐over sites, fueling considerations as well as the timing and location of feather moult (Butler et al., 2003; Ydenberg et al., 2007). The reaction to predation on avian migration has been evidenced, for example, by changes of migration behavior of the western sandpipers (Calidris mauri) in response to recovering populations their predator, the peregrine falcon (Falco peregrinus). Sandpipers on migration routes along which falcon predation increased reduced time at stop‐over sites and consequently had lower body mass compared to those sandpipers along routes that were not affected by increased predation (Ydenberg et al., 2004). Moreover, some differences of migration behavior between Old and New World populations could be explained by taking into account safety during migration. For example, New World migrant songbirds generally do not molt in winter (Rohwer et al., 2005), while winter molt is common among Old World songbird species that migrate along the Western European – African flyway. This major difference could be explained by the presence of autumn breeding predators at the mediterrenean cross over sites, the Eleonora’s and Sooty Falcon, a threat that does not exist along the Transamerican Flyway (Svensson and Hedenström, 1999; Ydenberg et al., 2007). By skipping summer molt and evolving a post‐migration molt, migrants are not only advantaged in flight when passing through an area of increased predation risk, but they may also advance the time of their mediterranean crossing before the peak predation pressure during the falcon’s

61 breeding (Svensson and Hedenström, 1999; Sillett and Holmes 2002; Ydenberg et al., 2007). Similarly, nocturnal migration in song birds has been assumed to have evolved, among others, as an antipredator strategy. By flying during the night, birds not only maximize foraging time during the day or reduce evaporative waterloss, but also evade diurnal predators, such as falcons (Alerstam, 2009; 2011).

So far, three bat species have been identified as nocturnal predators on migrating song birds: the Giant Noctule with a highly disjunct European distribution (Ibáñez et al., 2001), the Great Evening bat (Ia io, Tabah et al., 2007) and the Birdlike Noctule (Nyctalus aviator, Fukui et al., 2013) both distributed in East Asia. These bats are insectivores for most of their annual life cycle, but include birds into their diet during the time of the birds’ migration. The Giant Noctule, for example, preys on birds during both the birds’ spring and autumn migration when the majority of its food consists of birds (Ibáñez et al., 2001; Popa‐Lisseanu et al., 2008; Ibáñez et al., 2016). However, possibly due to the novelty of this finding or the bats’ cryptic, nocturnal lifestyle, the impact of bat predation on bird populations and their migratory behavior has not been studied so far. There are few other bat species that prey on birds, such as Linnaeus’ False Vampire, Vampyrum spectrum and Chrotopterus auritus, the Wooly False Vampire (Navarro and Wilson, 1982; Medellin, 1989). These tropical species, however, are gleaners and most likely perch hunters with a more generalist diet that catch their prey from the substrate. In the following we will only refer to the three aerial hawking bat species mentioned above.

We reviewed the literature to first, describe the bats’ predation on migratory birds and second, to estimate the impact of bat predation on migratory bird populations. Finally, we discuss bat predation as a selection factor on the birds’ migratory behavior. The focus of this review is on the Giant Noctule, N. lasiopterus, as of all bird feeding bats this species has been studied in most detail. Additionally, we included some unpublished data on this species into this review.

Hunting strategy and prey manipulation during bird predation Due to the bats’ exclusively nocturnal activity and characteristics of hunting activity, no observations of bats hunting birds are available. However, all evidence leads to the only conclusion that bats are hunting migrating birds and ingesting their prey on the wing while flying at high altitudes. First, all species of the phylogenetic group the three bird feeding bat species belong to, the Vespertilioninii (genus Nyctalus) and Nycticeiini/Eptesicini (genus Ia) (Roehrs et al., 2010) catch and consume their prey on the wing. Perch hunting or the feeding while perching has never been reported for any of these groups of species. Second, echolocation and wing morphology of the bird feeding bats are adapted to aerial hawking and hunting in open air space. The bats’ low wing aspect ratio and wing load as well as the low frequency echolocation allow for fast, but straight flight and long range prey detection with low resolution (Ibáñez et al., 2001; Holderied and von Helversen, 2003; Thabah et al., 2007), characteristics that are disadvantageous for catching prey in clutter or gleaning from substrate. Third, despite extensive telemetry studies of the movements of the Giant Noctule no indication of perching or use of night or feeding roosts has been reported (Popa‐Lisseanu et al., 2009). Also the observation of hundreds of its roosts over extended periods including weekly feces collections at roosts over more than four years, no remains of bird prey have ever been found in or around roosts (Ibáñez et al., 2001; Popa‐Lisseanu et al., 2008). Fourth, birds occur in the diet of the Giant Noctule only during the time of avian migration in spring and autumn and prey are principally only those bird species that migrate during the night and at altitudes of at least 700 m over ground (Bruderer, 1997; Ibáñez et al., 2016). Indeed, the Giant Noctule only starts its nocturnal activity during a time when migrating birds already set‐off for their nightly flights and bats regularly fly above 1000 m over ground as evidenced by radar observations (Popa‐Lisseanu and Ibáñez, 2007). From these observations it can be deduced that birds are hunted and ingested on the wing at high altitudes, but never near the ground, e.g. during dusk or dawn when they arrive at or leave their stop‐over sites. Previously, it has been criticised that capture, manipulation and consumption of large prey items such as birds during flight presents insurmountable problems for aerial hawking bats (Bontadina and Arlettaz, 2003). Moreover, the idea exists that

63 because of mechanical limitations of flight, insectivorous, aerial hawking bats are limited to small prey that does not exceed 5% of their body mass (Fenton, 1990). However, various facts support our hypothesis that the bats do prey and consume birds on the wing. In fact, the body mass of bird prey species in the diet of the Giant Noctule, such as the nightingale (Luscinia megarhynchos), may exceed 50% of the bats’ mass (Ibáñez et al., 2016). Thus, at least for bird feeding bats the postulated mass threshold for prey items does not hold. Moreover, bats in general and particularly the Giant Noctule show an enourmous plasticity of carrying capacity and wing load. For example, during gestation the body mass of female bats increases up to 50% until parturition (Racey and Speakman, 1987). During lactation nursing females often transfer their pups between roosts up until the time the pups have grown to 70% of adult body mass (O’Mara et al., 2016). This behaviour is common in species with fission‐fusion behaviour, such as the Giant Noctule (Popa‐Lisseanu et al., 2008). Moreover, frugivorous bat species, such as Artibeus literatus or A. jamaicensis rarely feed in the fruiting food plants and thus have been reported regularly transporting food items as heavy as their own body mass (Duque‐Márquez and Muñoz‐Romo, 2015). Furthermore, particularly aerial hawking bat species, such as the Common Noctule (N. noctula), seasonally may gain up to 30% of body mass witin two weeks, due to prehibernatory and premigratory fattening (O’Mara et al., 2016). During this period Common Noctules have been found to consume 30% of their body mass in insects during short foraging times of 40‐50 minutes (O’Mara et al., 2016). Similarly, Kunz et al. (1995) found in lactating Tadarida brasiliensis a pre‐ and postfeeding body mass difference of 20‐25%. For the Giant Noctule, Ibáñez et al. (2003) ascertained a body mass increase of 20% between spring and autumn and a 40% increase for individuals after feeding with no apparent effect on the bats’ flying capacity (Ibáñez et al., 2003). Yet we assume that despite the potential capability of carrying large prey items, bats nevertheless may be impeded in flight when manipulating prey as large as birds. Therefore, we suggest that bats are in fact required to prey at high altitudes to prevent the risk of crashing during prey manipulation and ingestion. Additionally, we propose that the bats only ingest the birds’ most accessible and nutritious body parts, which are the chest muscles, to reduce feeding time and maximize feeding efficiency. This hypothesis is supported by the observation that in thousands of fecal samples of

Giant Noctules from Spain bone material has never been found (Ibáñez et al., 2003; unpublished data). Also the analysis of stomach contents of a Giant Noctule that died accidentally during nightly capture revealed 11.3 g of food items that consisted of six pieces of muscle meat, each of which with ca. 0.1 g (up to 0.4 g) each. The rest were smaller pieces of (digested?) meat, feathers and gastric acids, but no bones or viscera. Indeed, other insectivorous aerial hawking bats, e.g. T. brasiliensis, clip inedible body parts, like wings, heads or legs, and ingest only the nutrient rich abdomen of large moth and beetles, thereby increasing feeding effciency (Kunz et al., 1995).

The magnitude of bat predation on migrating birds on the Iberian Pensinsula

To gauge the impact of bat predation on migrating birds we formulated an exemplary calculation for the Giant Noctule in Spain. First, we estimated the field metabolic rate (FMR) of the Giant Noctule, i.e. the sum of daily energy expenditures of bats in the field, with the regression function ‐1 logeFMR(kJ d =1.87+0.732 loge Mb (g) as provided by Speakman and Thomas (2003). This function was derived from FMR measurements of various bat species measured with the doubly labelled water method. With the mean body mass of of Giant Noctules of 47.9 g (Ibáñez et al., 2001) the function held a FMR of 110.2 kJ day‐1. Furthermore we assumed that bats preying on birds do not include any other types of prey, such as insects, into their diet. This assumption is supported by the observation by Ibáñez et al. (2001; 2003) and Fukui et al. (2013) who never found insect material in feces with feathers, i.e. bats preying on birds did not include insects into their diets. To obtain the mean chest muscle mass of bird prey species, we measured the weight of the pectoral muscles of 51 birds of 24 prey species of the the Giant Noctule (Table 1). All birds were either road kills or died during ringing campaigns in Andalusia between 2000 and 2012. We calculated a regression function of chest muscle mass over body mass (chest muscle mass (g) = 0.1785 Mb bird (g) – 0.3273, Fig. 1). Hence, the FMR rate of Giant Noctules could be fuelled by ingesting 21.95 g of chest muscles, when assuming their nutritional value to be similar to that of raw chicken breast (5.02 kJ g‐1, USDA, 2016). The mean body mass of 232 birds of 31 prey species in the diet of the Giant Noctule has been found to be 12.64 g (Ibáñez et al., 2016), which, following our regression,

65 relates to a mean chest muscle mass of 1.9 g. This mean takes already into account the prey size preference of the Giant Noctule for medium sized prey species as identified by Ibáñez et al. (2016). Assuming Giant Noctules ingest only chest muscles to fuel their energy expenditures they would need to prey on at least 12 birds per night.

Table 1. Body mass and chest muscle mass of small migrant bird species on the Iberian Peninsula

Species n Body mass (g) Chest muscle mass (g) Alauda sp. 1 27,6 2,8 Alauda arvensis 1 34 7,4 Calidris minuta 1 14,6 2,8 Carduelis chloris 5 21,1 3,5 Cettia cetti 1 8,2 0,7 Cisticola juncidis 2 5,8 0,8 Erithacus rubecula 1 14,3 1,4 Galerida sp. 1 29,2 3,6 Hippolais polyglotta 1 5,4 1,3 Lanius senator 1 27,7 4,4 Loxia curvirostra 1 11,5 0,7 Luscinia svecica 1 15,2 1,8 Miliaria calandra 1 41,1 8,2 Motacilla flava 2 11,2 2,0 Passer hispaniolensis 2 23,1 3,1 Phoenicurus ochruros 1 13,2 2,2 Phylloscopus collybita 13 5,8 0,7 Phylloscopus sp. 1 5,9 0,8 Phylloscopus trochillus 2 6 0,6 Regulus regulus 1 4 0,2 Saxicola torquata 3 12,7 2,1 Serinus serinus 2 10,3 2,1 Strilda astrild 2 7,5 1 Sylvia atricapilla 1 14,1 2,9 Sylvia cantillans 2 8,3 1,1 Sylvia melanocephala 1 9,1 1,2

4 Chest muscle mass (g) mass muscle Chest

0 0 1020304050 Body mass (g) Figure 1. Linear regression of chest muscle mass over body mass of 51 individuals of 25 bird species. Regression function: chest muscle mass (g) = 0.1785 Mb bird (g) – 0.3273.

To estimate the annual number of birds that fall prey to Giant Noctules on the Iberian Peninsula, we obtained first the number of days bats prey on birds per year, second, the proportion of the bat population that actually preys on birds and lastly, we estimated the Iberian bat population. Ibáñez et al. (2001) found bats to include birds into their diet during eight months of the year, between March and May and between July and November. However, previous telemetry studies (Popa‐Lisseanu et al., 2009) showed that during early August and late October Giant Noctules were only active during on average ca. 60% of the time (n = 50 nights) due to climatical reasons, such as rain and cold. If during spring migration bats are active to a similar degree, the annual number of days bats are preying on birds would be 144 days. The mean monthly proportion of the bat population that Ibáñez et al. (2001) found preying on birds during avian migration was 34%.

Finally, to estimate the minimum size of the Iberian population of the Giant Noctule we used data from previous studies from different regions as given on table 2 and depicted on figure 2. The highly disjunct distribution of the Giant Noctule on the Iberian Peninsula is well supported by data from various regional studies (Agirre‐Mendi &Ezquerro 1991; Aihartza 2004; Alcalde & Escala 1999; Alcalde et al 2008, 2013; Almenar & Alcocer 2000; Camprodón & Guixé 2013; Flaquer et al 2010; González‐ Álvarez & Rodríguez‐Muñoz 1995; Gutiérrez 2002; Hermida et al 2012; Ibáñez et al 2001, 2009, 2012; Juste 2007; Lisón et al 2010; Paz et al 2012; Popa‐Lisseanu et al 2008). For some areas relatively reliable population estimates exist. For the Alcornocales Natural Park, Ibáñez et al. (in preparation) ascertained during a four year telemetry study a mean density of 3.8 – 7.8 Giant Noctules km‐2. The Alcornocales Natural Park mostly consists of a natural vegetation of Mediterranean oak forest (Ojeda et al., 2000). For three other Iberian forest areas (1. Sierras de Cazorla, Segura, Las Villas, Castril y Calar Mundo, 2. Sierras de Guadarrama y Gredos, 3. Sierras de Demanda, Urbión y Cameros) with well studied bat populations we assumed a similar minium density of Giant Noctules of 3.8 bats km‐1 and estimated the size of continuous habitat, comparable to that in Alcornocales Natural Park, for each forest area to be at around 100,000 ha although their total areas varied between 168,000 and 250,000 ha. Then we extrapolated the size of their bat populations assuming the minimum density of 3.8 bats km‐1 (Table 2). Additionally, we included into our calculation the precise estimates for the Giant Noctule colonies of Seville (n = 500, Popa‐Lisseanu et al., 2008) and Jerez de la Frontera (n = 200, Juste, 2007). When not taking into account any sub‐ populations in the Pyrenees, Cantabrian Mountains and Portugal, the Iberian population of Giant Noctules consists of at least 15,900 individuals (Table 2).

To obtain the annual number of birds captured by Giant Noctules on the Iberian Pensinsula each year we assumed, as calculated before, that 34% of the bat population, i.e. 5406 bats consume 12 birds per night over 144 days each year. This results in a total of 9.3 million birds that fall prey to bats on the Iberian Peninsula each year.

Figure 2. Distribution and population size of the Giant Noctule, N. lasiopterus, on the Iberian Peninsula. Locations with numbers are described in Table 2. Red are locations with high densities of Giant Noctules, blue with sporadic captures and yellow with individual dead at wind farms

Table 2. Population estimations of N. lasiopterus for specific, well studied localities on the Iberian Peninsula

Location N° Population location size (individuals)

Parque Natural 1 3800 Alcornocales

Sierras de Cazorla, 2 3800 Segura, Las Villas, Castril y Calar Mundo Sierras de 3 3800 Guadarrama y Gredos

Sierras de 4 3800 Demanda, Urbión y Cameros Parque Maria 5 500 Luísa, Seville, Andalusia Zoo, Jerez de la 6 200 Frontera, Andalusia

The impact of bat predation on bird behaviour, migration and demography

About 2100 million song birds, most of which are passerines (Hahn et al., 2009), have been estimated crossing the Mediterranean towards Africa in autumn each year. A large proportion of those use the western flyway passing over the Iberian Peninsula. Compared to this vast number, the total of birds that may fall prey to Giant Noctules, ca. 0.2%, may appear insignificant at first. Contrary to bat predation, the impact of falcon predation on migrating birds and their behaviour has been long acknowledged, although the total of birds that fall prey to falcons is also negligible. For example, the Eleonora’s falcon, F. eleonorae, is a specialized predator on migrating birds that has even shifted its breeding to the peak of autumn migration between August and September to profit from the high prey density when its own energy requirements are highest. This species has a Mediterranean distribution that is overlapping with that of

70 the Giant Noctule as well as its range of bird prey species, although falcons may include some larger bird species into their diet (Walter, 1979; De León et al., 2007). With a mean consumption of three birds per day during the period of three months of autum bird migration between August and November(Spina et al 1988, De León et al 2007), the entire population of Eleonora’s falcon consisting of ca. 13,500 breeding pairs (Dimalexis et al 2008) may therefore, consume 7.3 million birds per year. This is about as much as the bird casualties by Giant Noctules on the Iberian Peninsula alone. However, while the influence of falcon predation on the migrants’ behaviour has long been recognized (Svensson and Hedenström, 1999; Ydenberg et al., 2007), the influence of bat predation on birds remains unaccounted for in any models of bird migration and optimization studies (Alerstam 2009, 2011).

Indeed, the mortality due to predation itself and its effect on bird fitness unlikely is a principal factor influencing avian migration, but the danger as perceived by migrants (Lank and Ydenberg, 2003, Lind and Cresswell, 2005, Cresswell and Whitfield, 2008). In this context, Ydenberg et al. (2007) highlighted that it is mostly unclear whether a low mortality results from a low predation or from efficient antipredatory behavior. Even when the actual mortality due to predation is low its non‐lethal effects on prey species may significantly affect their behavior, fitness, population dynamics and evolution (Cresswell and Whitfield, 2008). In fact, non‐lethal effects of predation may influence prey species as much or even stronger than lethal effects (Preisser et al., 2005). Thus mortality may not reflect the predation risk as perceived by prey.

The most likely, because ecologically the cheapest antipredatory strategy in migrant birds might be the avoidance of areas or times of high predation, by either adapting migration flyways or times. Any antipredation strategy however, is mostly a trade‐off with concomitant costs, such as decreased food intake or increased flight costs (Lima, 1998; Cresswell and Whitfield, 2008). If avoidance is not possible, other responses to evade predation, such as flocking or escape maneuvers could evolve in birds (e.g. Cresswell, 1993, 1994; Whitfield, 2003). Alternatively, within a tradeoff scenario in certain situations risking predation may even be a strategy that provides the highest fitness outcome, as it has been found the case for starving redshanks

71 exploiting profitable food patches under high predation risk (Cresswell and Whitfield, 2008).

Nocturnal migration has been argued to be partly an antipredation strategy for avoiding diurnal predators (Alerstam 2009, 2011), which fully ignores the threat by nocturnal predation by bats. In other bat prey species than birds, antipredation strategies are common. For example, in at least four insect orders tympanal organs have evolved independently that allow for the detection of bat ultrasounds to engage in evasive movements (Miller and Surlykke, 2001; Svensson et al., 2002). Moreover, prey of other carnivorous bats evolved highly complex behaviours to escape bat predation. The most popular example may be the arms race between frogs and the frog feeding bat (Trachops cirrhosis), with sophisticated adaptations of frog calling behavior (Tuttle and Ryan, 1982; Tuttle et al., 1982; Page and Ryan, 2005). Walter (1979) deduced antipredation strategies of European migrants in response to falcon predation by comparison with American migrants that are not subjected to similar threats of convergently evolved, autumn breeding raptors along their flyways. In this context, a most striking difference between European and American nocturnally migrating song birds is the apparent absence of flight calls in European species (Farnsworth, 2005). These songs are believed to promote cohesion of groups of migrants during nocturnal flight and stimulate migratory restlessness (Zugunruhe) in conspecifics (Farnsworth, 2005). We argue that the potentially high threat of nocturnal bat predation may have selected for mute nocturnal migration in European song birds, while American species, in absence of bat predation retained this behaviour. Further evidence supporting this hypothesis may be the fact that the air space within which bats could detect bird prey on their vocalizations would be by 492 times increased compared to when using echolocation alone. The maximum detection range by echolocation for prey bird species is ca. 29‐38 m (Holderied and von Helversen, 2003; Estók & Siemers 2009), while the detection of birds on their flight calls may be around 300 m (Evans and Mellinger, 1999; Farnsworth et al 2004). Additionally, the disadvantage of the echolocation’s directionality during prey search would be overcome by locating birds on their flight calls that could be detected equally from all directions. Interestingly, thrushes that are not in the diet of Giant Noctules, do emit

72 flight calls, similar to New World species (Farnsworth 2005, Hüppop et al 2006, Ibáñez et al., 2016).

Summarizing, the evidence for a significant impact of bat predation on bird behaviour, migration and demography is compelling. We propose that the historic bat predation may have had an even larger magnitude. During the past decades disadvantageous habitat conversion in the Mediterranean, such as the large scale loss of old forests and wetland habitats as well as the use of insecticides may have led to a significant decrease of population size of the Giant Noctule, through the loss of tree roosts and insect food resources. Thus, previously bat predation may have been an even larger danger for migrating birds, with effects that may still be seen in their behaviour today.

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cuarta SECCIÓN

CONCLUSIONES GENERALES

1) El raquis de las plumas confiere una estructura de protección al ADN incluido en su interior, protegiéndolo de la degradación frente a la acción de los ácidos gástricos del depredador, los agentes externos y la acción de organismos, siendo el método de extracción de ADN mediante pulverización más efectivo que el método mediante lavado al fragmentar el raquis y liberar más fácilmente el material genético.

2) Los cebadores generalistas de vertebrados y aves muestran una baja eficiencia en la detección de ADN de ave en el interior de excrementos de murciélago con respecto a los cebadores diseñados, probablemente debido a su mayor tamaño y baja especificidad. Los 3 pares de cebadores diseñados para regiones de citocromo b y COI muestran una resolución similar en la amplificación de ADN. Por tanto, la combinación que ofrece un mayor éxito en la extracción y amplificación de ADN aviar contenido en excrementos de murciélago ha resultado ser la extracción mediante pulverización y la utilización de uno de los 3 pares de cebadores diseñados, llegando al 100% de efectividad en la amplificación si se utilizan al menos 2 de los 3 pares.

3) El nóctulo grande (Nyctalus lasiopterus) depreda al menos 31 especies de pájaros pertenecientes a 8 familias diferentes, la mayor parte migradoras nocturnas, indicando que esta especie de murciélago captura a los pájaros durante sus vuelos nocturnos, en su mayoría durante la migración de las presas. En la composición de especies depredadas se observa la ausencia de especies que frecuentemente utilizan cajas nido o agujeros en los árboles para nidificar o refugiarse. Las especies encontradas en la dieta que sí pueden hacerlo solo los utilizan en época de cría, durante la primavera o a principios de verano, cuando el nóctulo grande todavía no depreda pájaros.Por tanto, y de acuerdo con las características ecomorfológicas del nóctulo grande, los

resultados obtenidos refuerzan la hipótesis de que la búsqueda, captura y presumiblemente ingesta de pájaros se realizaría en el aire y no en reposo.

4) La alta diversidad de especies consumidas sugiere que el nóctulo grande se comporta como un depredador generalista, ajustando la depredación a la disponibilidad de especies.

5) El nóctulo grande consume presas comprendidas entre el rango de 5 a 25 gramos. La poca disponibilidad de especies con un peso mayor de 25 gramos en las 3 familias de pájaros que migran mayoritariamente de noche y que componen la mayor parte de la dieta de este murciélago puede sugerir que este límite de tamaño pueda ser debido más por la baja disponibilidad de presas mayores que por limitaciones de tamaño. Los pájaros consumidos representan entre un 10% y un 50% de la masa corporal del nóctulo grande, excediendo ampliamente el umbral del 5% en relación con la habilidad de vuelo de murciélagos que cazan volando. Este umbral del 5% probablemente será válido para especies que cazan insectos en el aire, pero no para este tipo de murciélagos que pueden, además, cazar pájaros a elevadas altitudes, sugiriendo que otras especies de murciélagos de menor tamaño puedan ser también capaces de depredar sobre pequeños paseriformes.

6) El nóctulo grande selecciona positivamente tamaños medios de pájaros (10‐15 gramos), posiblemente porque representan el balance coste/beneficio más conveniente en términos de energía y evitación de riesgos. Los pájaros más pequeños han de ser más difíciles de detectar y, por consiguiente, recibirían menos ataques, mientras que los pájaros con tamaño superior a 15 gramos serían más fáciles de detectar, pero también presentan un mayor riesgo de defensa.

7) La estrategia de caza generalista del nóctulo grande no sugiere una selección de presas por características sensoriales particulares tales como coloración del plumaje, emisión de cantos durante el vuelo o comportamientos específicos de vuelos de las presas, pero es cierto que un pequeño número de especies son depredadas por encima de su disponibilidad, debido probablemente al comportamiento recientemente descubierto en el cual algunas especies

migradoras nocturnas realizan cortos desplazamientos durante la noche no relacionados con la migración.

8) Nyctalus aviator depreda sobre 15 especies de paseriformes de 7 familias diferentes durante la migración postnupcial. El número de familias representadas en la dieta es parecido a la cantidad de la dieta del nóctulo grande pero el número de especies es sensiblemente menor, debido posiblemente al muestreo menos exhaustivo en cuanto al menor número de localizaciones, duración en el tiempo y muestras analizadas. La mayoría de las especies consumidas son migradoras, con un rango de peso de 6‐15 gamos, sugiriendo que se trata de un depredador generalista de pájaros migradores durante la noche.

9) De todas las especies consumidas por Nyctalus aviator, 5 utilizan cajas nido o agujeros en árboles en época de cría, de las cuales solo 2 fueron encontradas en el periodo en el que coincide la migración con la cría, siendo muy difícil saber si las consume en vuelo o en los refugios, pero la proporción de especies migradoras durante la noche que aparece en la dieta es muy extensa, apoyando fuertemente que esta especie consume a sus presas durante el vuelo.

10) El tamaño más pequeño de este murciélago, que explicaría el menor tamaño medio de las presas consumidas, y la posición marginal de Japón en las rutas migratorias de paseriformes podrían justificar la menor proporción de plumas encontradas en los excrementos de Nyctalus aviator en comparación con Nyctalus lasiopterus en la Península Ibérica.

11) Nunca se han registrado eventos de caza de especies del género Nyctalus mientras no están volando. Las características ecomorfológicas de estas especies muestran una adaptación a la caza en vuelo en espacios abiertos. Nunca se han encontrado restos de pájaros en los refugios revisados del nóctulo grande. Esta especie solo se alimenta de pájaros coincidiendo con las migraciones pre y postnupciales de primavera y otoño, y las especies que consume son principalmente migratorias nocturnas y que migran a una altura de al menos 700 metros sobre la superficie terrestre. Esta altura es

perfectamente abarcable por el nóctulo grande, al registrarse vuelos con radar por encima de 1000 metros sobre la superficie terrestre. Por ello, se puede deducir que el nóctulo grande intercepta y consume a los pájaros en vuelo a elevadas altitudes, pero nunca cerca del suelo o en refugios.

12) La interceptación, manipulación e ingesta de presas tan grandes en vuelo, llegando a superar en algunas especies de pájaro el 50% del peso corporal del murciélago, presenta serias limitaciones para el correcto funcionamiento del vuelo. El nóctulo grande presenta una gran plasticidad a la hora de aumentar la carga corporal durante el vuelo. Así lo demuestra durante la gestación, durante la lactancia y después de la ingesta de alimento. Aun así, el ejercicio del vuelo puede verse reducido durante la manipulación de las presas. Por esto, se sugiere que el nóctulo grande interceptaría a los pájaros a grandes altitudes para que la pérdida de altitud durante la manipulación no arriesgara su integridad física a causa de un choque contra el suelo. Durante dicha manipulación, ingeriría solo partes blandas del cuerpo del pájaro tales como los músculos pectorales o vísceras, hipótesis soportada por la ausencia de huesos en los miles de excrementos analizados y los trozos de músculos sin huesos encontrados en el interior del estómago de un individuo muerto.

13) Mediante el pesado de la masa muscular pectoral de 51 pájaros pertenecientes a 24 especies presas del nóctulo grande se obtuvo una regresión lineal que correlaciona el peso de los pájaros y el peso de su masa pectoral. Sabiendo que el peso medio de 232 especies de 31 especies presa del nóctulo grande es de 12.64 gr, con masa pectoral en la regresión lineal de 1.9 gr y que la tasa metabólica de campo estimada para esta especie de murciélago es de 110.2 kJ por día, cada murciélago debería consumir por noche al menos 12 pájaros para satisfacer sus requerimientos energéticos, asumiendo que solo se alimente de masa pectoral y teniendo en cuenta que cuando consume pájaros en los excrementos nunca se encuentran restos de insectos, alimentándose solo de éstos.

14) Se estimó que el número de días en los que un murciélago puede depredar sobre pájaros teniendo en cuenta los meses del año cuando se producen las

migraciones pre y postnupciales y el porcentaje de actividad media dependiendo de condiciones climáticas es de 144 días, y la proporción de murciélagos consumiendo pájaros durante esa época es de un 34%. La población mínima de nóctulo grande en la Península Ibérica es de al menos 15900 individuos, teniendo en cuenta los datos de censos de estudios regionales previos. Al utilizar todos estos datos y aproximaciones, se puede estimar el número de paseriformes depredados por la población de nóctulo grande en la Península Ibérica en un año en 9.3 millones de pájaros.

15) La proporción de paseriformes consumidos en un año por el nóctulo grande en la Península Ibérica es del 0.2% con respecto al total de paseriformes que cruzan durante la migración de otoño este territorio, pudiendo parecer insignificante, pero la mortalidad puede no afectar al riesgo de depredación que percibe la presa. El número de pájaros estimados que consume el nóctulo grande por año es parecido al impacto que produce el halcón de Eleonor, pero en este caso sí que se conoce la influencia que produce esta depredación en el comportamiento de las aves presa. Una de las posibles estrategias antidepredación que ha podido desarrollar los paseriformes migrantes nocturnos europeos es dejar de emitir cantos mientras vuelan, característica que sí se presenta en sus parientes americanos en ausencia de un depredador nocturno de estas características. Esta hipótesis puede ser apoyada por la evidencia de que, mediante ecolocación, el nóctulo grande explora una distancia de 29‐38 metros, mientras que la audición de vocalizaciones aumenta a un rango de detección de 300 metros, además de no ser unidireccional. Además, los zorzales, que no forman parte de la dieta de este murciélago, emiten sonidos mientras migran de noche, al igual que sus parientes americanos.

AGRADECIMIENTOS

Quiero empezar esta sección de agradecimientos con la parte formal. Agradecer al Consejos Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) por la financiación en forma de beca JAE Predoc, a la Estación Biológica de Doñana (EBD) por el apoyo científico y el uso de las instalaciones, especialmente al Laboratorio de Ecología Molecular, donde se han realizado todas las labores y técnicas moleculares de esta tesis y al Laboratorio de Ecología Acuática, por permitirme invadir su espacio pesando excrementos de murciélago en sus balanzas de precisión.

Tengo que dar las gracias a mis directores de tesis, Carlos y Javier, por la infinita cantidad de consejos e ideas aportadas a lo largo de todos estos años, así como el apoyo recibido. Sin su gran ayuda todo hubiese sido mucho más complicado. Además, tengo que agradecer el gran sentido del humor que comparten, haciendo ciertas labores tediosas un poco más llevaderas.

Al grupo de murciélagos de la EBD, en el que me he sentido todo este tiempo como uno más. A Irene Salicini por su apoyo al llegar el nuevo y sus útiles consejos, a Carlos Ruiz por el apoyo logístico y técnico, a Chufi, el McGiver del grupo con soluciones para todo (increíble cómo puede salir del paso ante una situación complicada con recursos limitados. Chapó), a Ana Popa por las ayudas en la fase de escritura y a Juan Quetglas, Detlev y Felipe porque sin su ayuda en el trabajo de campo, muchos murciélagos seguirían volando sin ser encontrados. Especial mención a Juanele, que empezó siendo el técnico de laboratorio del grupo de murciélagos que me instruía en las artes oscuras de extracción, amplificación y secuenciación de ADN sin tener ni la más mínima idea (salvo por unas cuantas nociones básicas en los laboratorios carrera, en las cuales intentaba escaquearme porque a mí me gusta el barro y la bota, lo de la bata y la pipeta lo vamos viendo…) y acabó siendo un amigo incondicional, tanto dentro de la EBD como fuera, curtidos juntos en batallitas y visados. Gracias por compartir tantos conocimientos y “trucos de magia”, gracias por tu paciencia, gracias por tu apoyo, comprensión y consejos en los momentos duros y, sobre todo, gracias por tu amistad. Nos vamos viendo por Sevilla, Darth Vader.

I would like to thank to Dr. Lukas Jenni and the Schweizerische Vogelwarte because of the help recording nocturnal flight calls of birds during my stay in Switzerland and the bird banding teams of Col de Bretolet and Col de Jaman, specially to David Progin for the advices and consideration about where to put the michros, and Mathieu Bally (my swiss brother) for all the laughs and good moments spent with him.

Gracias al colectivo de becarios de la EBD por hacer de la hora de la comida un lugar de tertulia de temas algunas veces surrealistas y por esas “actividades extraescolares” que tanto se agradecen para desconectar. Especial mención a Violeta y a Álex Bertó, que estuvieron ahí en el inicio complicado que tuve, cuando todavía extrañas mucho lo tuyo. No quiero ni puedo olvidarme de Lidia, esa chica que conocí en una celebración de tesis haciendo de barman al otro lado de la barra y le adivinaba los éxitos de la radio como si tuviera enchufe en ella. Gracias por dejarme tu casa como si fuera la mía allá en Madrid y sabes que aquí en la terreta o donde esté, siempre vas a tener la mía. Y a Álvaro Ramos, que pese a no pertenecer a este colectivo, también fue pieza clave en mis inicios con esas charlas comprensivas.

Y ahora llega el turno de un grupo de amigos muy especial. Muchas gracias a Bellas, Juanjo, Sebas, Sergio, Buga, Mancha, Edu y Sendra, el Cabildo, por todos esos momentos vividos y los que nos quedan, porque empezasteis siendo conocidos, los amigos de un buen amigo, y ahora simplemente sois mis amigos de Sevilla, como se os conoce aquí en mi tierra. Porque una amistad no la concibo si no es para toda la vida. Orgullo de, pese a ser el“extranjero” del grupo, ser uno más de esta familia. Gracias por todo, chicos.Estará leyendo esto y con el ansia de no haberlo incluido en el apartado anterior, pero es que Chuso se merece especial mención. Te conocí con la invención del wolfote y la consecuente risotada y aquí estamos, 5 años después, como si no hubiese pasado el tiempo pero con montones de situaciones desternillantes, absurdas y surrealistas compartidas. Porque si ya de por sí te considero un amigo fundamental, el recordar todo lo que hemos vivido hace que esta amistad sea más especial si cabe. Muchas gracias por todo, compare.

Gracias también a mis grupos de amigos de Alicante, al Equipo, todos muy diferentes pero muy bien cementados a lo largo de los años, a OTM, que se encargaron de que mi vuelta a Alicante fuese como si no me hubiese ido nunca (de eso muy buena parte de la culpa la tiene Flo, con sus grandes dotes sociales y su “sobre la marcha”) y, en especial, a Vicente, mi compi de vida desde los 9 años, mi hermano. Muchas gracias por tus 9 visitas a Sevilla, estableciendo todo un récord y superando a las anteriores con la siguiente, porque cuando te ibas ya estaba deseando que volvieses y enseñarte más cosas de mi segunda casa.

Quiero darle también las gracias a Sonia por sus ánimos y su buen rollo en esta parte final de tesis tan estresante. Has sido un soplo de aire fresco que me ha ayudado a ponerle el broche final a este libro.

Y por último, acordarme de mi familia. Como en los platos, lo que más me gusta lo dejo para el final. Porque son ellos los que han hecho que yo sea así y ahora mismo esté aquí, escribiendo estas líneas de agradecimiento después de una tesis realizada (casi nada). Porque gracias a ellos, esta familia ya tiene el primer doctor, honor que llevaré con mucho orgullo.

No quiero concluir sin decir: gracias Nerea por ayudarme a montar el puzzle de la tesis, gracias mamá por apoyarme siempre. Gracias papá por ser mi primera guía de animales, la más importante, la que me marcó de por vida.

Muchas gracias a todos/as

David Pastor Beviá