Degradace Korostanových Barviv Mikroorganizmy

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

DEGRADACE KOROSTANOVÝCH BARVIV MIKROORGANIZMY

Diplomová práce

Martin Struk

Vedoucí práce: Brno 2018 doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Bibliografický záznam

Autor: Martin Struk Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Degradace korostanových barviv mikroorganizmy

Studijní program: Experimentální biologie

Speciální biologie, zaměření Mikrobiologie a Studijní obor: molekulární biotechnologie

Vedoucí práce: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Akademický rok: 2017/2018

Počet stran: 96

Klíčová slova: Dekolorizace, Azo barviva, Rostoucí buňky, Nerostoucí buňky, Bakterie, Korostanová barviva, Kultivace

Bibliografický záznam

Autor: Martin Struk Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie

Názov práce: Degradácia korostanových farbív mikroorganizmami

Študijný program: Experimentálna biológia

Špeciálna biológia, zameranie Mikrobiológia a Študijný obor: molekulárna biotechnológia

Vedúci práce: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Akademický rok: 2017/2018

Počet strán: 96

Kľúčové slová: Dekolorizácia, Azo farbivá, Rastúce bunky, Nerastúce bunky, Baktérie, Korostanové farbivá farbivá, Kultivácia

Bibliographic Entry

Author Martin Struk Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Microbial degradation of korostan dyes

Degree programme: Experimental Biology

Special Biology, specialization Microbiology and Field of Study: Molecular Biotechnology

Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Academic Year: 2017/2018

Number of Pages: 96

Keywords: Decolorization, Azo dyes, Viable cells, Non-growing cells, Bacteria, Korostan dyes, Cultivation

Abstrakt

Azo farbivá sú priemyselne najpoužívanejšie syntetické farbivá. Textilný a kožiarsky priemysel je najväčším producentom odpadovej vody s ich obsahom. Konvenčné fyzikálno- chemické spôsoby ich čistenia sú nedostatočné a pozornosť sa preto zameriava na využitie mikroorganizmov. Mnohé z nich sú schopné odstrániť azo farbivá absorpciou alebo degradáciou. Efektivita celého procesu je ovplyvnená rôznymi faktormi prostredia. Cieľom predkladanej diplomovej práce je skúmanie a sledovanie dekolorizačných schopností vybraných kmeňov baktérii a kvasiniek na azo farbive Korostanová modrá BS. Sledovaný bol vplyv počiatočnej koncentrácie, teploty, spôsobu kultivácie, použitého na rastúcich bunkách a vplyv teploty, pH na nerastúcich bunkách. Abstrakt

Azobarviva jsou průmyslově nejpoužívanější syntetická barviva. Textilní a kožedělný průmysl je největším producentem odpadní vody s jejich obsahem. Konvenční fyzikálně-chemické způsoby jejich čištění jsou nedostatečné a pozornost se proto zaměřuje na využití mikroorganismů. Mnohé z nich jsou schopny odstranit azobarviva absorpcí nebo degradací. Efektivita celého procesu je ovlivněna různými faktory prostředí. Cílem předkládané diplomové práce bylo studium dekolorizačných schopností vybraných kmenů bakterií a kvasinek na azo barvivu Korostanová modř BS. Sledovaný byl vliv počáteční koncentrace, teploty, způsobu kultivace, použitého na rostoucích buňkách a vliv teploty, pH na nerostoucích buňkách. Abstract

Azo dyes are the most used synthetic dyes in industry. Textile and leather factories are the largest producers of wastewater containing these dyes. Conventional physico- chemical methods for their purification are inadequate; and attention is therefore drawn to the use of microorganisms. Many of them are able to remove azo dyes by absorption or degradation. The efficiency of the whole process is influenced by various environmental factors. The aim of this diploma thesis is to study the decolorization capabilities of selected bacteria and yeast strains on the azo dye Korostan Blue BS. The effect of the initial concentration, temperature, and cultivation method used on growing cells was monitored; as well as the effects of temperature and pH on non-growing cells.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěl poděkovat panu doc. RNDr. Miroslavu Němcovi, CSc. za cenné rady a připomínky, za vstřícnost, trpělivost a čas, který mi věnoval při vedení mé diplomové práce. Dále děkuji všem zaměstnancům Oddělení mikrobiologie a molekulární biotechnologie za pomoc a příjemné pracovní prostředí.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 8. mája 2018 ……………………………… Martin Struk

Obsah

Zoznam použitých skratiek ...... 11 1. Úvod ...... 12 2. Delenie organických farbív a ich charakteristika ...... 13 2.1. Azo farbivá ...... 13 2.2. Reaktívne farbivá ...... 14 2.3. Kyslé farbivá...... 15 2.4. Bazické (katiónové) farbivá...... 15 2.5. Priame farbivá...... 16 2.6. Disperzné farbivá ...... 16 2.7. Moridlové farbivá ...... 17 2.8. Rozpustné farbivá ...... 18 2.9. Farbivá obsahujúce síru ...... 18 2.10. Kypové farbivá ...... 19 3. Toxicita ...... 20 3.1. Čo je toxicita ...... 20 3.2. Odhad rizika ...... 21 3.3. Ekotoxikologické biotesty ...... 21 3.4. Toxicita azo farbív ...... 23 4. Dekolorizácia organických látok organizmami ...... 25 4.1. Baktérie ...... 25 4.2. Huby ...... 30 4.3. Kvasinky ...... 35 4.3.1. Adsorpcia a bioakumulácia ...... 35 4.3.2. Degradácia ...... 36 4.4. Riasy a cyanobaktérie ...... 37 4.4.1. Biodegradácia ...... 37 4.4.2. Biosorpcia ...... 39 5. Cieľ práce ...... 41 6. Materiál a metódy ...... 42 6.1. Materiál ...... 42 6.1.1. Použité mikroorganizmy ...... 42 6.1.2. Kultivačné pôdy ...... 42 6.1.3. Chemikálie a roztoky ...... 44

6.1.4. Prístroje a počítačové programy ...... 44 6.2. Metódy ...... 45 6.2.1. Príprava roztokov azo farbív ...... 45 6.2.2. Uchovávanie kultúr ...... 45 6.2.3. Príprava 24 hodinových kultúr ...... 45 6.2.4. Výpočet množstva dekolorizovaného farbiva ...... 45 6.2.5. Výpočet sušiny ...... 46 6.2.6. Dekolorizácie korostanovej modrej rastúcimi bunkami ...... 46 6.2.7. Sledovanie dekolorizácie korostanovej modrej nerastúcimi bunkami ...... 46 7. Výsledky ...... 48 7.1. Dekolorizácia farbiva korostanová modrá rastúcimi bunkami ...... 48 7.1.1. Dekolorizácia farbiva KM mikroorganizmami pri 30 °C ...... 48 7.1.2. Vplyv zloženia média na dekolorizáciu KM vybranými mikroorganizmami ...... 51 7.1.3. Vplyv teploty na dekolorizáciu farbiva KM mikroorganizmami ...... 55 7.1.4. Vplyv spôsobu kultivácie na dekolorizáciu farbiva KM mikroorganizmami ...... 61 7.1.5. Vplyv koncentrácie farbiva na jeho dekolorizáciu mikroorganizmami ...... 63 7.2. Dekolorizácia korostanovej modrej nerastúcimi bunkami ...... 66 7.2.1. Dekolorizácia korostanovej modrej nerastúcimi bunkami pri 35 °C ...... 67 7.2.2. Vplyv teploty na dekolorizáciu korostanovej modrej nerastúcimi bunkami ...... 69 7.2.3. Vplyv hodnoty pH na dekolorizáciu korostanovej modrej nerastúcimi bunkami 75 8. Diskusia ...... 81 9. Záver ...... 85 10. Zoznam literatúry ...... 86

Zoznam použitých skratiek

A+B Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia Arth Arthrobacter crystallopoietes B. cer 24 Bacillus cereus CCM 24 B. cer 98 Bacillus cereus CCM 98 B. cer R Bacillus cereus R B. subt D Bacillus subtilis D BHI Brain Heart Infusion DCIP 2,6-dichlorofenol-indofenol Geo Geotrichum candidum KM Korostanová modrá BS ME Malt extract MiP mangán-independentná peroxidáza MnP mangán peroxidáza MPA mäsopeptónový agar MPB mäsopeptónový bujón NADPH nikotínadeníndinukleotidfosfát PCR-DGGE Polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis PS 284 Pseudomonas pictorum CCM 284 PS 4307 Pseudomonas sp. CCM 4307 RGY remazol golden yellow RO Remazol orange RR Remazol red SLB sladinový bujón Yarr Yarrowia lipolytica YM Yeast malt

1. Úvod Farbivá sprevádzali ľudstvo od nepamäti. Na začiatku to boli predovšetkým prírodné farbivá, napríklad indigo. S postupom času a rozvojom priemyslu, hlavne počas priemyselnej revolúcie, boli vytlačené syntetickými farbivami a dominantné miesto zaujali azo farbivá.

Azo farbivá sú najvyužívanejšou skupinou syntetických farbív. Ich ročná spotreba je približne 10 000 t, čo sa odráža aj v množstve vzniknutej odpadovej vody. Jej čistenie bežnými prostriedkami je nedostačujúce a viaceré azo farbivá prechádzajú týmito procesmi bezo zmeny. To vytvára veľkú záťaž na životné prostredie a ohrozuje nielen rôzne druhy živočíchov ale i ľudí. Z týchto dôvodov bola sprísnená legislatíva týkajúca sa odstraňovania syntetických farbív. Výrobcovia tak boli prinútení skúmať a hľadať účinnejšie metódy na ich odstránenie. Sľubné výsledky sa ukazujú v prípade použitia mikroorganizmov ako nástroja na dekolorizáciu farbivami znečistených vôd, ale aj pôdy (O'Neill a kol., 2000).

Mikroorganizmy sú všadeprítomné a schopné rásť v najrôznejších podmienkach. Mnohé z nich úspešne odolávajú nepriaznivým faktorom prostredia ako napríklad vysoké či nízke pH a teplota, nedostatok živín alebo prítomnosť toxických látok. Huby, riasy a baktérie sa prispôsobili aj prítomnosti syntetických farbív vo svojom okolí. Niektoré druhy dokonca získali schopnosť využívať farbivá ako zdroj uhlíka a premieňať ich na energiu. Baktérie, vďaka ich enzymatickému vybaveniu, vedia účinne dekolorizovať, prípadne i degradovať aj tie farbivá, ktoré sú ťažko odstrániteľné konvenčnými metódami. Odstránenie farbív z prostredia je možné i bez priameho kontaktu látky s rastúcim organizmom, ide o metódu využívajúcu veľké sorpčné kapacity povrchu organizmu – biosorbenta. Príkladom môžu byť mikromycéty alebo riasy. Ide o veľmi lacný zdroj biomasy – mikromycéty ako odpad pri výrobe, rovnako ako riasy.

Prekážkou pre účinné použitie mikroorganizmov, u ktorých boli detegované dekolorizačné a degradačné schopnosti, je často nedostatok informácii o vplyve rozličných faktorov prostredia na proces odstránenia farbiva. Poznanie optimálnej teploty, koncentrácie farbiva či pH je dôležité pre úspešnú aplikáciu organizmu do praxe a stáva sa tak cieľom výskumu v mnohých krajinách.

2. Delenie organických farbív a ich charakteristika 2.1. Azo farbivá Azo farbivá sú priemyselne najpoužívanejšou skupinou syntetických farbív. Ročne sa vyprodukuje približne 900 000 ton farbív (Carmen a Daniel, 2012) a viac ako 70 % z nich patrí do azo skupiny (Balapure a kol., 2015). Azo farbivá sa vyskytujú takmer v každej skupine farbív rozdelených podľa spôsobu ich aplikácie (Obr. 1.).

Obr. 1. Distribúcia syntetických farbív medzi ich aplikačnými skupinami (Shore, 2002; upravené).

Základom štruktúry týchto farbív je jedna alebo viac azo skupín. Podľa počtu azo skupín pripojených na centrum sa delia na: mono-, di-, tri-, tetra- atď. Aspoň jeden uhlík azo skupiny je súčasťou aromatického kruhu napr. benzénový či naftalénový. V prípade monoazo farbív, ak farbivo vo svojej štruktúre obsahuje len aromatické radikály (napr. benzén, naftalén), sa nazýva karbocyklické. Ak ich obsahuje viac, patrí medzi heterocyklické azo farbivá Lithol Rubine BK (Gregory, 2000; Hunger a kol., 2000).

Karbocyklické azo farbivá sa využívajú hlavne na farbenie polyesteru, celulózy, nylónu či kože. Ich odtiene zahŕňajú zelenú, červenú, žltú a modrú. Sú založené výlučne na benzéne a derivátoch naftalénu. Výhodou karbocyklických azo farbív je nízka cena a dobrá celková stálosť. Na druhej strane ich odtiene sú málo žiarivé (Gregory, 2000; Hunger a kol., 2000).

Výsledkom snahy spojiť výbornú žiarivosť a stálosť antrachinónových farbív s nízkou cenou a farbiacou silou azo farbív sú heterocyklické azo farbivá. Delia sa na dve skupiny: prvá má vo svojej štruktúre indol, pyrazol alebo pyridón, druhá skupina obsahuje síru a to samostatne alebo v kombinácii s dusíkom (Hunger a kol., 2000).

Metalizované azo farbivá majú vo svojej štruktúre aspoň jeden atóm kovu. Najčastejšie je to meď, chróm alebo kobalt. Metalizácia bola pôvodne používaná počas morenia na lepšiu fixáciu farbiva. Dnes sa bežne používa na zlepšenie niektorých vlastností farbív, napr. stálosť na slnku. Tieto zlepšenia sú však na úkor iných kvalít farbiva, napr. žiarivosť takto upravených farbív je horšia. Azo farbivá sú všetky takmer bez výnimky produktom diazotácie primárneho aromatického amínu. V podstate je to reakcia primárneho aromatického amínu a zmesi dusitanu s anorganickou kyselinou. Ďalším krokom je kopulácia vzniknutej diazónovej soli s nukleofilným partnerom. Diazónová soľ je veľmi slabý elektrofil a preto reaguje len so silným elektrodonorom, napr. amino a hydroxy zlúčeninou (Gregory, 2000; Hunger a kol., 2000).

2.2. Reaktívne farbivá Reaktívne farbivá sú trieda farbív určená primárne na farbenie celulózových vlákien. Patria do nej, napr. Remazol, Cibacron F alebo Sabracon F. Používajú sa aj na farbenie proteínových vlákien (vlna, hodváb alebo koža na rukavice). Molekulu reaktívnych farbív tvoria tri časti: chromofór, most a reaktívna skupina. Trendom posledných rokov sú farbivá s dvomi a viac reaktívnymi skupinami. Sú síce drahšie Reactive Red 22 na výrobu, ale za to efektívnejšie pri farbení a majú tak nižšie straty (Shore, 2002). Molekula farbiva sa naviaže na hydroxilovu skupinu vlákna a vytvorí kovalentnú väzbu s farbenou látkou. Podľa funkčnej skupiny sa delia do troch skupín: monofunkčné, bifunkčné a polyfunkčné reaktívne farbivá. Vyznačujú sa rozpustnosťou vo vode. Aplikácia prebieha vo vodnom kúpeli s neutrálnym alebo mierne

14 kyslým pH. Podľa teploty pri aplikácii sa môžu rozdeliť na tie, ktoré reagujú v studenej a tie ktore reagujú teplej vode. (Reactive dyes, 2009).

2.3. Kyslé farbivá Kyslé farbivá sú skupinou farbív rozpustnou vo vode. Majú anionické vlastnosti. V praxi sa používajú na farbenie hodvábu, vlny, nylonu a modifikovaných akrylových vláken. Na vlákna sa viažu Van der Waalsovými silami, vodíkovými a iónovými väzbami. Väčšina z nich patrí z chemického hľadiska medzi azo (takmer 80 %), trifenilmetánové a antrachinonové farbivá. Klasicky sa delia podľa ich vlastností pri farbení, hlavne pH (Tabuľka 1.) (Acid dyes, 2010).

Tabuľka 1. Druhy kyslých farbív.

Stredná až dobrá stálosť vo vode. Zlá stálosť na svetle u niektorých Neutrálne bledých odtieňov. Aplikácia pri neutrálnom/ veľmi slabo kyslom pH. Slabo kyslé Stredná až zlá stálosť na svetle. Limitované zlou stálosťou vo vode. Veľmi dobre produkujú rôzne farebné Silno kyslé odtiene. Aplikácia v silne kyslom prostredí.

2.4. Bazické (katiónové) farbivá Je to skupina farbív, ktoré vo vode vytvárajú po rozpustení ióny s kladným elektrickým nábojom. Vyznačujú sa afinitou pre látky s aniónovým charakterom a viažu sa na ne pomocou elektrostatických síl. Farbí sa nimi vlna, hodváb a predovšetkým modifikované akrilové vlákna. Bavlnu a celulózu je možné farbiť tiež, je však nutná príprava a prídavok ďalších chemikálii a moridiel. Na zvýšenie priľnavosti farby ku materiálu sa pridáva do farbiaceho kúpeľa kyselina octová. Zásaditými farbivami sa farbí aj papier. Sú dôležité v biológii Kryštálová violeť (histológii) pretože sa používajú na farbenie vzoriek tkanív (kryštálová violeť, safranín, bazický fuchsín, metylénová modrá a ďalšie). Prírodné vlákna, farbené týmito farbivami, rýchlo blednú a strácajú farbu pod vplyvom slnečného žiarenia. Naopak, akrylové vlákna si po zafarbení zachovávajú pôvodnú farbu omnoho dlhšie ako tie prírodné. Je to vďaka ich

15 hydrofóbnemu charakteru obmedzujúcemu prístup vody a kyslíka (Basic dyes, 2010; Properties of Basic Dyes, 2011; About basic dyes, 2013; Broadbent, 2001).

2.5. Priame farbivá Priame farbivá sa definujú ako aniónové farbivá s preferenciou viazať sa na celulózové vlákna a sú aplikované vo vodnom kúpeli obsahujúcom elektrolyt (Shore, 2002).

Ide napríklad o chlorid sodný (NaCL) alebo síran sodný (Na2SO4). Teplota kúpeľa je 79,4 – 93,3 °C (About Direct Dyes, 2005; Lorimer 2001). Existuje široké spektrum materiálov, na ktoré sa viažu priame farbivá, napr. vlna, bavlna, hodváb,

Typické priame farbivo papier. Pri naviazaní nevytvárajú pevné väzby, na celulózové vlákna sa viažu pomocou slabých fyzikálnych síl (vodíkové väzby, dipóly a Van der Waalsove sily). Ich sila je ovplyvňovaná veľkosťou molekuly farbiva, čím väčšia molekula, tým silnejšia väzba. Táto vlastnosť priamych farbív sa označuje ako substantivita. Približne 70 % všetkých priamych farbív je tvorených azo farbivami s diazo-/polyazo štruktúrou (Shore, 2002). Medzi výhody priamych farbív patrí ich univerzálnosť, jednoduchosť aplikácie a nízka cena. Na druhej strane pri farbení konkrétnych materiálov existujú alternatívy, schopné farbiť lepšie a kvalitnejšie (About Direct Dyes, 2005; Direct dyes, 2009).

2.6. Disperzné farbivá Disperzné farbivá patria do skupiny farbív vo vode nerozpustných. Sú neionogénne, bez ionizujúcej skupiny. Ich molekulová hmotnosť je nízka. Z hľadiska chemickej štruktúry sa viac ako polovica z nich zaraďuje medzi azo zlúčeniny, štvrtina medzi antrachinónové farby a zvyšok predstavujú metínové, nitro a naftochinónové farbivá. Broadbent (2001) uvádza, že disperzné farbivá pre polyester môžu byť na základe výsledkov viacerých testov ich vlastností rozdelené do troch skupín: E typ (nízko energetické), SE typ (stredne energetické), S typ Disperse Yellow 26 (vysoko energetické).

Tabuľka 2. Delenie disperzných farbív.

Molekulová Rýchlosť Stálosť na Polarita hmotnosť farbenia vzduchu 1. E typ nízka malá vysoká nízka 2. SE typ stredná stredná stredná stredná 3. S typ veľká vysoká nízka vysoká

Disperznými farbivami sa farbí predovšetkým polyester, ale tiež celulóza, polyamid a akrylové vlákna. Spojenie medzi vláknom a molekulou farbiva je výsledok pôsobenia viacerých síl a prebieha vo vodnom kúpeli obsahujúcom disperzné činidlo. Molekula farbiva sa presunie z vody do amorfnej časti vlákna. Vodíkový atóm v molekule umožňuje vytvorenie vodíkového mostíka medzi atómom kyslíka a dusíka molekuly farbeného vlákna. Veľmi dôležité sú aj sily vznikajúce pri interakcii dipólov a taktiež Van der Waalsove sily (Disperse dyes, 2010; History and Properties of Disperse Dyes, 2012). Vďaka ich hydrofóbnosti je možné farbiť látky aj parami vznikajúcimi pri zahrievaní roztoku farbiva (Shore, 2002).

2.7. Moridlové farbivá Moridlové farbivá sú tie farbivá, ktoré vyžadujú prídavok moridla, aby mohli zafarbiť materiál. Je to látka, zvyčajne metalická zlúčenina, ktorá po aplikácii vytvorí so substrátom a farbivom komplex. Ten sa na substrát viaže pevnejšie než samotné farbivo (Shore, 2002).

Najprv sa na farbený materiál aplikuje moridlo a až následne sa pridáva zvolené farbivo. Medzi moridlá patria látky ako napríklad kyselina trieslová, extrakt z kôry alebo kyselina olejová Mordant Red 11 a stearová. Patria k nim aj rôzne soli chrómu, hliníka, železa, medi a cínu. Metalické zlúčeniny sa ako moridlá používajú najčastejšie. Moridlo ovplyvňuje výslednú farbu látky, preto je dôležité zvoliť vhodné moridlo pre konkrétnu farbu. Taktiež zlepšuje stálosť farbenej látky pri pôsobení vody a slnečného žiarenia (Mordant dyes, 2011).

Silná iónová väzba spája molekulu farbiva s farbeným vláknom. Je formovaná medzi aniónovými skupinami farbiva a amónnymi katiónmi vlákna. Kovový ión (napr. chróm) vystupuje ako most medzi molekulou farbiva a vláknom. Je vytvorené silné spojenie 17 a zabezpečuje výbornú farebnú stálosť. Nevýhodou je dlhý farbiaci cyklus, problémy pri tvorení rôznych odtieňov, riziko chemického poškodenia vlákna a toxicita používaných látok, napr. chrómu (Mordant dyes, 2011; Introduction and properties of mordant dyes, 2011).

2.8. Rozpustné farbivá Charakteristické pre tento typ farbív je ich rozpustnosť v organických rozpúšťadlách. Podľa Colour Index tvoria nesulfónové azo zlúčeniny viac ako polovicu všetkých rozpustných farbív (Shore, 2002). Cieľový Solvent Back 5 materiál zafarbia tým, že sa v ňom rozpustia. Sú nerozpustné vo vode – používajú sa na farbenie organických rozpúšťadiel, uhľovodíkových palív, voskov, plastov, mazadiel a iných nepolárnych zlúčenín (Solvent dyes, 2011; Shore, 2002).

2.9. Farbivá obsahujúce síru Farbivá s obsahom síry sú najpoužívanejšie farbivá, ktorými sa farbí vlna. Ich chemická štruktúra zatiaľ nie je presne určená. V ich chromofórovej skupine sa nachádza síra a polysulfidové bočné reťazce. Sú vo vode nerozpustné, bez afinity ku celulózovým materiálom.

Pravdepodobná štruktúra V slabo zásaditom roztoku sulfidu sodného alebo iného farbiva Sulfur Black 1 redukčného činidla je možné ich rozpustiť a následne vytvárajú bezfarebnú leuko formu. Tá sa už môže viazať na celulózové materiály ako je bavlna, jutovina a iné. Pridaním oxidujúceho činidla (napr. atmosférický kyslík) sa menia znova na vo vode nerozpustné a získavajú späť svoju farbu (Sulfur dyes, 2010; Nagl, 2000)

Celková farebná stálosť je veľmi dobrá, výnimkou je citlivosť na bielidlá obsahujúce chlór. Konvenčný proces farbenia sírovými farbivami predstavuje značnú environmentálnu záťaž, predovšetkým znečistená priemyselná voda. Odpadová voda obsahuje sulfidy, thiosulfáty a zvyšky nenaviazaného farbiva. Môže poškodzovať kanalizáciu (korózia) a čističky vôd (Shore, 2002). Na Západe ustupuje používanie sírových farbív, avšak v Číne sú stále veľmi rozšírené (Sulfur dyes, 2010; Nagl, 2000). Pokrok v syntéze týchto farbív priniesol zníženie obsahu ťažkých kovov, halogénovaných organických zlúčenín (AOX) či karcinogénnych arylamínov. Nové aplikačné postupy zahŕňajú napr. aplikáciu farbiva

18 v atmosfére dusíka. Uplatnením týchto postupov je možné znížiť environmentálnu záťaž sírových farbív (Shore, 2002).

2.10. Kypové farbivá Kypové farbivá sú skupinou farbív obsahujúcich dve alebo viac keto skupín. Prvou z nich bolo indigo, známe už od staroveku, ale dnes sa tam zaraďujú všetky farbivá využívajúce rovnakú metódu aplikácie. Až 80 % všetkých kypových farbív tvoria antrachinónove farbivá (Shore, 2002).

farbiaci celulóza kúpeľ

Obr. 2. Schéma aplikácie: A) redukcia a rozpustenie, B) absorpcia celulózou, C) reoxidácia, D) naviazanie na ďalšie molekuly farbiva vo vlákne (Shore, 2002; upravené).

Aplikácia tradične prebieha vo veľkých kadiach a nádobách. Kypovými farbivami sa najčastejšie farbí vlna, bavlna a iné materiály. Kypové farbivá sú nerozpustné vo vode a nemajú žiadnu afinitu k celulóze. Aby boli schopné viazať sa, musia byť redukované ditioničitanom sodným na leuko formu. Následne sa rozpustia vo vode a môžu sa viazať na celulózové materiály. Roztok musí byť slabo alkalický. Po pripojení/priľnutí molekúl farbiva na látku, je farbivo kyslíkom oxidované späť na nerozpustnú formu (Obr. 2.). Niektoré z farbív sa namiesto kyslíka oxidujú vplyvom slnečného žiarenia, napr. indigo. V porovnaní s ostatnými farbivami je ich stálosť vynikajúca. Na druhej strane, šúchaním farbenej látky dochádza ku ošúchavaniu farby a strate farebnosti materiálu. Chemickou úpravou tkaniny sa tomu dá predísť (Epp, 1995; All about vat dyes, 2009).

3. Toxicita 3.1. Čo je toxicita Toxicita sa definuje ako schopnosť látky mať nežiadúci účinok na bunku, orgán, organizmus alebo ekosystém. Chemické látky s takýmito účinkami sa preto nazývajú toxikanty. Správanie toxikantov spoločne s ich výsledným účinkom je ovplyvnené viacerými faktormi. Polarita (vplýva na pohyb látok) a forma výskytu u kovov patria medzi najdôležitejšie vlastnosti. Ďalej je to napríklad priestorová a chemická štruktúra, hustota, skupenstvo, rozpustnosť vo vode, či je látka chemicky čistá alebo ide o zmes viacerých látok. Dôležitú rolu tiež zohráva doba vystavenia organizmu toxickej látke, jej koncentrácia a taktiež dávka. Nezanedbateľný vplyv má aj samotný organizmus – fyziologický stav, rozdiely medzi taxonomickými skupinami (Anděl, 2011; Fargašová, 2008).

Koncentrácia toxickej látky a taktiež doba expozície organizmu rozhoduje o osude organizmu vystaveného toxickej látke. V prípade krátkej doby pôsobenia látky je dôležitá dávka toxikantu. Po prekročení určitej hranice poškodenia tkaniva (iná u každého organizmu a látky), ktoré organizmus už nie je schopný zregenerovať, organizmus odumiera (Fargašová, 2008).

Základným údajom o akútnej toxicite je smrteľná dávka (LD – ang. lethal dose), alebo smrteľná koncentrácia ak ide o plynné látky (LC – ang. lethal concentration). Na charakterizáciu účinku sa najčastejšie používa LD50. Je to dávka, pri ktorej zahynie 50 % pokusných zvierat. Obdobne to platí aj pre LC50. Ďalej sa používajú údaje NOAEL (úroveň žiadnych pozorovaných nepriaznivých účinkov) a LOAEL (najnižšia úroveň pozorovaného nepriaznivého účinku) (Horák a kol., 2004).

Ak je dávka toxikantu nízka a zasiahnutá je len časť tkaniva, organizmus je schopný regenerovať poškodené oblasti a nakoniec sa uzdraviť. Pri dlhodobom vystavení pôsobeniu toxickej látky, môže mať aj jej nízka koncentrácia nepriaznivé účinky. Dochádza buď ku prechodu otravy do chronicity, alebo sa organizmus adaptuje na jej prítomnosť. Chronická otrava máva zväčša vážne, niekedy až smrteľné následky. Látky, ktoré svojím pôsobením ovplyvňujú genetický materiál bunky, sú označované ako genotoxické. Účinok týchto látok sa môže prejaviť až po dlhšej dobe, niekedy až v ďalšej generácii. Dôsledky pôsobenia, neraz vážne, sú zvýšenie počtu mutácii (mutagény), nádorových ochorení (karcinogény) alebo deformácie pri vývoji (teratogény) (Fargašová, 2008).

3.2. Odhad rizika Mnoho chemických látok predstavuje riziko pre ekosystém ak sa do neho dostanú. Na odhadnutie miery tohto rizika a výsledného stupňa nebezpečnosti sa využívajú všetky údaje dostupné pre danú chemickú látku. Rizikovosť látky je pravdepodobnosť s akou je možné pozorovať nepriaznivý účinok po vystavení organizmu danej látke. Právne predpisy Slovenskej republiky a Európskej únie klasifikujú nebezpečné látky na: toxické (T), vysoko toxické (T+), zdraviu škodlivé (Xn), dráždivé (Xi), žieravé (C). Látky karcinogénne, mutagénne, senzibilizujúce a teratogénne sú bez špecifického označenia. Postup odhadu miery rizika má štyri kroky:

Po prvé je to identifikácia nebezpečnosti. Popisujú sa možné nežiadúce účinky chemickej látky na vybraný rastlinný alebo živočíšny druh, spoločenstvo druhov, ekosystém alebo celý región. Zhromaždia sa všetky dostupné dáta o chemickej látke (Fargašová 2010).

Ďalším krokom je analyzovanie expozície a následkov t.j. vzťah dávka – odpoveď. Skúma sa vzťah medzi mierou nepriaznivého účinku na organizmus/prostredie a dávkou chemickej látky/výskytom v prostredí (Fargašová, 2009).

Určenie expozície je predposledným krokom odhadu rizika. Cieľom je predpovedanie alebo stanovenie priestorovej a časovej distribúcie polutantu a jeho súčasný výskyt alebo kontakt so záujmovou ekologickou zložkou (Fargašová, 2010).

Na základe informácii získaných v predchádzajúcich krokoch sa vypracuje hodnotenie rizika pre skúmanú látku. Určí sa pravdepodobnosť objavenia sa nepriaznivých účinkov po vystavení organizmu polutantu. Zosumarizujú sa tiež všetky neistoty identifikované v predchádzajúcich krokoch a následne sa analyzujú (Fargašová, 2010).

3.3. Ekotoxikologické biotesty Medzi základné metódy na posudzovanie toxicity patria biotesty. Ich cieľom je rýchle posúdenie toxicity a vplyvu na životné prostredie pre danú látku. Odpoveď živého organizmu je študovaná v zjednodušených laboratórnych podmienkach. To spoločne s nižšou citlivosťou a presnosťou predstavuje istú nevýhodu. Látka sa inak správa a účinkuje v prirodzenom prostredí, ktoré je komplikovanejšie a zahŕňa viac faktorov pôsobiacich na skúmanú látku a organizmus.

Aby sa výsledky čo najviac priblížili realite, upravujú sa odhady modifikátormi. Tie vyjadrujú neistotu vznikajúcu pri extrapolácii výsledkov: 푁푂퐴퐸퐿(퐿푂퐴퐸퐿) 푅푓퐷 = 푈퐹×푀퐹

RfD – referenčná dávka, UF – faktor neistoty, MF – modifikačný faktor, LOAEL – najnižšia úroveň pozorovaného nepriaznivého účinku, NOAEL – úroveň žiadnych pozorovaných nepriaznivých účinkov

Štandardizáciu laboratórnych testov majú na starosti viaceré medzinárodné organizácie. Predovšetkým sú to: OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), ISO (The International Organization for Standardization), WHO (World Health Organization) alebo U.S. EPA (Unated States Environmental Protection Agency). Celý postup laboratórneho testovania ja štandardizovaný – od testovanej látky a jej formy aplikácie, druhu a charakteru testovacieho organizmu až po dobu trvania samotného testu a jeho následného vyhodnotenia pomocou štatistiky. Jedny z najčastejšie používaných testovacích organizmov sú myš laboratórna (Mus musculus var. alba), dážďovka hnojná (Eisenia fetida), dafnia veľká (Daphnia magna) alebo baktérie Vibrio fischeri (Fargašová, 2009).

Cieľom všetkých testov je čo najvernejšie nasimulovať reálne podmienky. Na začiatku sa použijú tzv. batérie testov. Ide o testy vykonané na viacerých modelových organizmoch. Ich výber by mal čo najlepšie reprezentovať zloženie ekosystému a potravinového reťazca (Anděl, 2011).

Snahy čo najvernejšie sa priblížiť reálnym podmienkam viedli ku vytvoreniu malých, uzavretých, modelových ekosystémov. Tieto systémy sa nazývajú mikrokozmy. Jedná sa o nádobu naplnenú vodou s typickými rastlinami a živočíchmi alebo vzorkami pôdy odobratej z terénu. Nevýhodou je nízka úroveň štandardizácie testu. Na druhej strane, príprava testu je jednoduchá a miera neistoty je znížená blízkosťou reálnym podmienkam (Anděl, 2011).

Ďalšou z používaných metód je transplantačný pokus. V laboratóriu sa pripraví organizmus a následne prenesie do prostredia na miesto, kde je vystavený toxickej látke. Po určitom čase sa prenesie späť a zisťujú sa možné zmeny – morfologické, biochemické a fyziologické. Príkladom je vystavenie rastlín v kvetináčoch automobilovému smogu pri cestách (Anděl, 2011).

Výskum a testovanie toxických látok sa môže realizovať aj v prostredí, napr. na pokusných poliach, vo vodných nádržiach. Jedná sa o najkomplexnejšie prostredie na experimenty s toxickými látkami. Štandardizácia je v prípade týchto testov takmer nulová (Anděl, 2011).

Ak sa pri skúmaní pracuje s reálnymi ekosystémami, ide o terénne štúdie. Sústreďujú sa na reálne prípady kontaminácie prostredia. Z tohto dôvodu ich nemožno realizovať cielene. Delia sa na dva typy:

- hodnotenie bezprostredného vplyvu polutantu na danú oblasť

- hodnotenie vplyvu polutantu po kontaminácii, ku ktorej došlo v minulosti

Údaje získané pri terénnych štúdiách sa dajú použiť pri sanácii danej znečistenej oblasti alebo pri hodnotení a sanácii podobnej kontaminácie prostredia (Anděl, 2011).

Poslednou metódou, ktorá bude spomenutá, je metóda QSAR. Je založená na vzťahu medzi štruktúrou látky, priestorovým usporiadaním, väzbovými vlastnosťami a jej toxicitou. Pomocou matematických a štatistických modelov sa dáta analyzujú a porovnávajú s databázou už známych látok. Pre čo najlepšie odvodenie modelu/rovnice je potrebný čo najobsiahlejší súbor dát. Nakoniec je zo všetkých dát vytvorená predpokladaná toxicita analyzovanej látky alebo látok (Anděl, 2011).

3.4. Toxicita azo farbív V priemyselnej výrobe sú azo farbivá najpoužívanejšou skupinou syntetických farbív a odhaduje sa, že tvoria až 17 – 20 % priemyselného odpadu (Kant, 2012). Priamo do prostredia sa môže dostávať až takmer 50 % z celkovej produkcie farbív a to ako odpadová voda alebo únikom počas procesu farbenia (Carmen a Daniel, 2012). Toxicita a vplyv azo farbív na životné prostredie je preto stredobodom pozornosti mnohých štúdii.

-1 Podľa kritérií EU je akútna toxicita azo farbív nízka, LD50 je 250 – 2000 mg·kg váhy (Clarke a Anliker, 1980). Zásadité, kyslé a priame azo farbivá sú radené medzi toxické až veľmi toxické pre vodné živočíchy a rastliny. Reaktívne azo farbivá sú však na druhej strane toxické len pri veľmi vysokej koncentrácii (>100 mg·l-1) a nepovažujú sa tak za toxické pre vodné organizmy (Novotný a kol., 2006).

Toxický efekt tartrazinu a carmoisinu, farbív používaných v potravinárstve, bol preskúmaný Aminom a kol. (2010). Pri pokusoch na potkanoch boli pozorované zmeny na biochemických ukazovateľoch dôležitých orgánov, napr. pečeni a obličkách a to pri vysokých a aj nízkych dávkach. Riziko pre organizmus je vyššie pri väčších dávkach aj kvôli tvorbe voľných radikálov a následnému oxidatívnemu stresu.

Ako zistil Oliveira (2005), azo farbivá môžu mať aj mutagénne účinky. Metabolická aktivácia farbív spúšťa tvorbu voľných radikálov a následné poškodenie DNA (Mansour a kol., 2009; Carmen a Daniela, 2012), vytvorenie DNA aduktov (Kojima a kol., 1994), chromozómové aberácie (Prasad a kol., 2013) a tvorbu mikrojadier (An a kol., 2007). Azo farbivo BDCP (black dye commercial product) bolo testované na meristematických bunkách Allium cepa a spôsobilo chromozómové aberácie, usmrtenie buniek a ovplyvnilo počet jadier a mikrojadier. Chromozómy sa tiež stali náchylnejšími na zlomy, potvrdzujúc tak aneugenické vlastnosti BDCP (Ventura-Camargo a kol., 2011).

Pri pokusoch na potkanoch bol zistený teratogénny efekt a poškodenie reprodukčných orgánov. Prenatálne vystavenie myší a potkanov farbivu Congo Red trvalo znížilo množstvo zárodočných buniek (Gray a Ostby, 1993). Podobne, farbivá Acid Red 97 a Bismarck Brown Y prispeli k zvýšeniu vývojových defektov u žiab počas embryogenézy a larválneho štádia (Soriano a kol., 2014).

Mutagenicita bola u niektorých azo farbív zistená, len keď došlo ku redukcii azo väzby. Takto vytvorené aromatické amíny sú vždy nebezpečnejšie ako pôvodné látky, z ktorých vznikli (Plumb a kol., 2001; Yoo a kol., 2001). Požitie azo farbív, napr. Anilínovej žltej, môže u ľudí viesť k vytvorenie aromatických amínov. Zásluhu na to má črevná mikroflóra a azoreduktázy v pečeni. Karcinogénne vlastnosti sú vykazované niektorými z týchto amínov (Jen-Kun a Yan-Hwa, 1973). Bola zaznamenaná rakovina močového mechúra, sarkóm sleziny či hepatocelulárny karcinóm (Chequer a kol., 2009; Nony a kol., 1980; Patterson a Butler, 1982; Percy a kol., 1989; Rafii a kol., 1997).

Bae a Freeman (2007) zistili, že prítomnosť kovov napr. chróm, železo, med, kobalt alebo nikel, používaných pri výrobe niektorých druhov azo farbív, zvyšuje toxické účinky. Snaha o redukciu toxicity chlorináciou sa ukázala ako neúčinná. Následné testovanie toxicity na Daphnia similis viedlo k zisteniu, že síce bola dosiahnutá nižšia genotoxicita, ale akútna toxicita naopak výrazne stúpla (Ferraz a kol., 2011).

4. Dekolorizácia organických látok organizmami Organické farbivá sa využívajú vo viacerých priemyselných odvetviach, napr. textilnom, potravinárskom, kožiarskom priemysle alebo pri výrobe plastov. Štandardné chemické a fyzikálne metódy, používané na ich odstránenie, sú zvyčajne málo účinné a nákladné. Jedným z možných riešení je využitie organizmov na dekolorizáciu organických farbív. Cieľom je nájsť vhodné postupy využívajúce mikroorganizmy, schopné transformovať farbivá na netoxické látky pri čo najnižších nákladoch.

4.1. Baktérie Alternatívou k bežným postupom na odstraňovanie farbív sú metódy využívajúce baktérie a iné mikroorganizmy (huby, riasy). Ich použitie je niekedy výhodnejšie, napr. rýchlejšia degradácia farbív baktériami v porovnaní s hubami (Kalyani a kol., 2009). Priemyselne najpoužívanejšími sú azo farbivá a venuje sa im tak veľká pozornosť pri výskume biodegradácie. Baktérie sú schopné dosiahnuť vysoký stupeň dekolorizácie a môžu byť aplikované na široké spektrum farbív. Produkcia odpadu aj finančné náklady sú pri tomto procese minimálne (Verma a Madamwar, 2003).

Azo farbivo Amíny

Chromofór Redoxný Redoxný mediátor Oxi mediátor Red

Azoreduktáza

Zdroj Produkt uhlíka oxidácie (e- donor) Dehydrogenáza

Bakteriálna bunka

Obr. 3. Navrhovaný mechanizmus degradácie azo farbív azoreduktázou (Keck a kol. 1997, upravené).

Vo väčšine prípadov dochádza pri použití baktérii k odstráneniu farbív pomocou degradácie. Podieľajú sa na tom enzýmy, najčastejšie rôzne typy reduktáz, napr. azoreduktáza, DCIP reduktáza. Rozklad prebieha aeróbne alebo aj anaeróbne. V anaeróbnych podmienkach je rozštiepená azo skupina azoreduktázami a následne dochádza k odfarbeniu roztoku (Obr. 3.). Vzniknuté produkty však môžu mať potenciálne nežiadúce účinky (Chung a kol., 2008). Riešením je dvojstupňové odstránenie: najprv azo farbivá degradovať anaeróbnymi baktériami a škodlivé produkty (aromatické amíny), ktoré pri tom vzniknú rozložiť pomocou aeróbnych baktérii. (Oxspring a kol., 1996; O´Neill a kol., 2000).

Rajee a Paterson (2011) vyizolovali niekoľko kmeňov baktérii z pôdy a sedimentu kontaminovaných farbivom Orange MR. Bakteriálne konzorcium zahŕňalo druhy Proteus sp., Aeromonas sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp. a Micrococcus sp. Z týchto organizmov bol Micrococcus sp. identifikovaný ako najvhodnejší kandidát na degradáciu. Azo farbivo Orange MR degradoval až do koncentrácie 900 ppm. Optimálne podmienky boli pri pH= 6, teplote 35 °C. Baktéria tiež bola schopná využiť farbivo ako zdroj uhlíka a dusíka.

Bakteriálna degradácia býva ovplyvnená rôznymi faktormi, čomu sa venovali Ola a kol. (2010). Vo svojej práci sa zamerali na vplyv rôznych zdrojov uhlíka a dusíka v médiu. Baktérie boli izolované z odpadovej vody z textilnej fabriky. V počiatočných testoch dosiahol najlepšie výsledky pri odstraňovaní farbív Bacillus cereus a preto bol použitý v ďalších testoch. Skúmali sa rôzne kombinácie zdroja dusíka (peptón, NH4NO3 a kvasničný extrakt) a uhlíka (glukóza, sukróza a laktóza). Zvolené boli dve azo farbivá na testovanie – Cibacron Black PSG a Cibacron Red P4B. V prípade Cibacron Red P4B odstránil Bacillus cereus 81 % farbiva pri použití média obsahujúceho NH4NO3 a sukrózu. Použitie peptónu ako zdroja dusíka alebo kvasnicového extraktu prinieslo menej optimálne výsledky. Naopak kombinácia kvasnicového extraktu a laktózy sa ukázala ako najoptimálnejšia pri degradácii farbiva Cibacron Black PSG. Degradovaných bolo 75 %.

K opačným záverom došiel Modi a kol. (2010). Najvhodnejším zdrojom dusíka bol v tomto prípade peptón. Z viacerých izolátov, získaných z továrne na výrobu farbív, bol Bacillus cereus najlepší. Odstránil 97 % sulfónových azo farbív. Optimálne pH bolo medzi 6 – 7,5. Redukcia azo farbív závisí na prítomnosti substrátu ako elektrón donora. Najvyššie hodnoty sa dosiahli pri použití maltózy a tiež aj sukrózy.

Veľmi dobré výsledky dosiahol Jadhav a kol. (2011) s baktériou Pseudomonas aeruginosa. Až 97 % farbiva Remazol Red (RR) bolo degradovaných za 20 min pri teplote 40 °C pomocou „predkultivovanej“ kultúry (odobraná po 22 hod v log fáze). Koncentrácia farbiva bola 50 mg·l-1, pH= 7 a kultivácia prebehla za statických podmienok. Médium obsahovalo 5 g·l-1 kvasinkového extraktu a 5 g·l-1 NaCl. V prípade realizácie kultivácie submerzne, bez zmeny ostatných parametrov, sa zvýšila rýchlosť rastu, ale ku dekolorizácii nedošlo ani po 24 hodinách. Ak stúpla koncentrácia farbiva, kultúra bola schopná ho odstrániť až do množstva 250 mg·l-1, rýchlosť degradácie bola nepriamo úmerná koncentrácii RR. Na procese degradácie farbiva sa podieľalo viacero intracelulárnych enzýmov – lakáza, veratryl alkohol oxidáza a NADPH-DCIP reduktáza.

Iným prípadom použitia Pseudomonas aeruginosa bola štúdia skúmajúca odstránenie azo farbiva Remazol Orange (RO) a odpadovej vody z textilnej fabriky. Dekolorizácia prebehla v médiu s koncentráciou RO 50 mg·l-1 za statických podmienok. Po jednom dni bolo odstránených 90 % farbiva. Je predpoklad, že nízky obsah kyslíka je nutný pre efektívnu dekolorizáciu. So stúpajúcou koncentráciou nebolo pozorované žiadne zníženie efektivity degradácie až do 200 mg·l-1. Ako pravdepodobne konečné produkty degradácie RO boli určené alkény, aldehydy, alkýny a benzoová kyselina (Obr. 4.).

4- metylmetanilová kyselina 4-aminobenzoová kyselina

kyselina benzoová

Obr. 4. Predpokladaný mechanizmus degradácie Remazol Orange (Sarayu a Sandhya, 2010; upravené).

V prípade experimentov, skúmajúcich dekolorizáciu odpadovej vody P. aeruginosa, sa použila sterilná (prefiltrovaná – bez prítomnosti iných baktérii v médiu) a nesterilná odpadová voda. Dosiahnuté bolo odstránenie 76 % (nesterilná voda) a 62 % farbiva (sterilná voda). Ukázalo sa, že prítomnosť ďalších kultúr v médiu, v prípade nesterilnej odpadovej vody, zvyšuje efektivitu degradácie (Sarayu a Sandhya, 2010).

Pan a kol. (2011) skúmali možnosti dekolorizácie azo farbív kožnou mikroflórou. Staphylococcus aureus je súčasťou normálnej kožnej mikroflóry a preto bol využitý ako modelový organizmus. Azo farbivá môžeme nájsť aj v kozmetických prípravkoch. V experimente boli použité Orange II a Sudan III a kultivačné médium BHI. Zvolené boli tri koncentrácie pre obe farbivá – 6, 18 a 36 µg·ml-1 a kultivácia bola vykonaná za statických podmienok. Degradácia bola najlepšia pri najnižšej koncentrácii, odstránilo sa 76 % Orange II a až 98 % Sudan III počas 48 hodinovej kultivácie. Vyššie koncentrácie spôsobili zníženie dekolorizácie. Rast buniek pri vyššej koncentrácii (36 µg·ml-1) bol negatívne ovplyvnený len pri farbive Sudan III. Spoločný produkt degradácie oboch farbív bol 1-amino-2-naftol, majúci negatívny efekt na rast buniek.

Schopnosť rozkladať azo farbivá bola zistená aj u baktérie Geobacillus stearothermophilus. Pri tomto experimente bolo použité farbivo Orange II. Kultivácia sa uskutočnila pri 50 °C a vyhodnotila sa po 24 h. Bol zaznamenávaný vplyv druhu média (Luria Bertani a kvasinkový bujón), koncentrácie farbiva (0,025 a 0,05 mM) a podmienok kultivácie (staticky a submerzne). Na základe výsledkov boli najvhodnejšie podmienky jednoznačne pri submerznej kultivácii na Luria Bertani médiu. Degradácia farbiva teda závisí hlavne na type média a obsahu kyslíka. Predpokladá sa, že neprítomnosť glukózy v kvasinkovom médiu je dôvodom horších výsledkov (Evangelista-Barreto a kol., 2009).

Výskyt azo farbív Sudan, nepovolených na použitie v potravinárstve, v rôznych pokrmoch, vyvolal potrebu po podrobnejšom preskúmaní ich metabolizácie črevnou mikroflórou. V tomto experimente boli použité azo farbivá Sudan I – IV predstavujúce skupinu v tukoch rozpustných farbív. Podľa International Agency for Research on Cancer (IARC) sú klasifikované ako karcinogény tretieho stupňa (Chen a kol., 2009). Vybrané boli baktérie Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus fermentum, ktoré sú bežnou súčasťou mikroflóry čreva a z laktobacilov tam prevládajú (Vélez a kol., 2007). Kultivácia prebehla anaeróbne v deMann-Rogosa-Sharpe bujóne pri teplote 37 °C. V médiách bola koncentrácia monoazo farbív Sudan I and II 5 µg·ml-1 a polyazo farbív Sudan III a IV 1,5 µg·ml-1. Po odobratí vzoriek sa zistilo, že baktérie L. acidophilus a L. fermentum odstránili 100 % farbív 28

Sudan III a IV. Na druhej strane, v prípade farbiva Sudan I a II nebola zaznamenaná žiadna degradácia a to ani po znížení ich koncentrácie na 1,5 µg·ml-1. Metabolit vzniknutý po degradácii farbiva Sudan III bol identifikový ako anilín a v prípade farbiva Sudan IV to bol 2-metylanilín. Anilín je toxická a karcinogénna látka a 2-metylanilín je ďalej metabolizovaný in vivo na dalšie látky, niektoré genotoxické (Bomhard a Herbold, 2008; Rubino a kol., 1982; Vélez a kol., 2007).

Efektívny spôsob odstránenia azo farbív je kombinácia anaeróbneho a aeróbneho systému. Na dekolorizáciu a mineralizáciu bol použitý kontinuálny dvojstupňový systém s kultúrou imobilizovanou na granulovanom aktivovanom uhlíku (GAC). Médium malo definované zloženie. Celkovo sa podarilo odstrániť 83 % farbiva pri optimálnych -1 podmienkach – pH= 7, retenčnom čase 70 h a Cglukóza= 2000 mg·l . Pre porovnanie bola uskutočnená aj statická kultivácia. Tá bola viac ovplyvnená zmenou pH, pri hodnotách 5 (imhibícia reakcie) a 9 (výrazný pokles množstva biomasy) bola efektivita dekolorizácie veľmi malá. Markantný bol aj negatívny vplyv kyslíka. Odstránenie farbiva bolo takmer nepozorovateľné pri kultivácii v aeróbnom reaktore. Príčinou, ako uvádzajú autori, je pravdepodobne súperenie o elektróny, keďže kyslík je veľmi silný elektrónakceptor. Pre následnú mineralizáciu farbiva je však prítomnosť kyslíka nutná (Lin a kol., 2010).

Aj keď sú jednotlivé druhy mikroorganizmov schopné rozložiť azo farbivá, produktami sú často aromatické amíny alebo iné ťažko rozložiteľné metabolity. Kompletná degradácia je možná, ak sa do procesu zapojí viacero enzymatických reakcií, naznačujúc tak dôležitosť zmiešaných mikrobiálnych kultúr (Waghmode a kol., 2011a; Ayed a kol., 2011; Phugare a kol., 2011; Asgher a kol., 2007; Joshi a kol., 2010). Práve degradačné schopnosti takéhoto mikrobiálneho spoločenstva skúmali Lin a kol. (2010). Zmiešaná kultúra pozostávala zo zástupcov rodov Pseudomonas, Arthrobacter a Rhizobium. Degradovaným farbivom bolo Acid Orange 7. Kultivácia bola uskutočnená v jednorázovom a kontinuálnom viacstupňovom reaktore. V obidvoch prípadoch došlo ku dekolorizácii farbiva, ale lepšie výsledky boli dosiahnuté vo viacstupňovom reaktore. Rovnako, jedine tu bol odstránený toxický medziprodukt 1-amino-2-naftol.

Novým biotechnologickým procesom používaným pri čistení odpadovej vody je aeróbna granulácia. Je to metóda, pri ktorej sa dynamicky selektuje bakteriálna populácia na základe environmentálnych podmienok vytvorených v reaktore. Má tri fázy: aklimatizačná, maturačná a granulačná. Granule s vhodnou veľkosťou sa v reaktore objavili po 20 dňoch kultivácie. Na otestovanie dekolorizačných schopností bakteriálnej populácie 29 bolo do reaktoru pridané farbivo Reactive blue 59 (Kolekar a kol., 2012). Predchádzajúca štúdia ukázala, že membránový reaktor môže degradovať azo farbivo (Reactive black 5) za 4 hodiny pri rýchlosti dekolorizácie 375 mg·l-1 (You a kol., 2010). V tomto experimente bola dosiahnutá kompletná dekolorizácia fabiva Reactive blue 59 v rozmedzí 8 – 10 hodín pri rýchlosti 416 mg·l-1. To je výrazne vyššie ako v predchádzajúcich prípadoch. Produkty vzniknuté po degradácii sa v testoch na dážďovkách nepreukázali ako toxické v porovnaní s farbivom na začiatku. Mikrobiálna komunita granúl bola analyzovaná na PCR-DGGE. Podľa výsledkov bola značne diverzifikovaná, prítomní boli zástupcovia alfa-, beta- a gamaproteobaktérií (Kolekar a kol., 2012).

Pri použití bioreaktorov na odstránenie farbiva hrá dôležitú úlohu aj použitie nosiča. Forss a Welander (2011) použili ako nosič drevené pelety zo smreku obyčajného (Picea abies). Na základe predchádzajúcich experimentov bola ako vhodný nástroj na degradáciu zvolená mikroflóra z lesných porastov (Forss a Welander, 2009). Celý pokus prebehol v bioreaktore s tromi časťami. Dve nádrže mali anaeróbne prostredie zatiaľ čo tretia aeróbne. Použité boli azo farbivá Reactive Black 5 a Reactive Red 2. Do reaktoru boli privádzané v koncentrácii 200 mg·l-1. Retenčný čas bol približne 4 dni a 20 hodín pre každú nádrž. Dekolorizácia prebehla primárne v nádrži jedna, nádrž dva vykázala iba drobné zlepšenie dekolorizácie. Odstránených bolo 86 – 90 % farbiva. V poslednej nádrži následne prebehla jeho mineralizácia pod detekčný limit. Výhodou celého procesu je jednoduchosť a nízka cena nosiča a odolnosť celého systému voči kontaminácii mikroorganizmami nedegradujúcimi farbivo (Forss a Welander, 2011).

4.2. Huby V porovnaní s baktériami, u ktorých prevláda degradácia ako spôsob odstraňovania farbív z prostredia, sú huby známe tým, že používajú obidva spôsoby – degradáciu aj biosorpciu. Biosorpcia sa dá definovať ako proces realizujúci sa bez zapojenia metabolickej energie bunky a môže sa tak uskutočniť aj u mŕtvych buniek. Opačným spôsobom je bioakumulácia. Bunka aktívne viaže molekuly látky na svoju bunkovú stenu. Schopnosť húb viazať molekuly farbiva na povrch bunky je spôsobená prítomnosťou amino, thiolových, karboxylových a fosfátových skupín. Tie sú prítomné v bunkovej stene húb (Bayramoglu a kol., 2006). Biosorpcia je rýchly proces a často prebehne v priebehu niekoľkých minút až hodín (Mou a kol., 1991). Zatiaľ nie je známy uspokojivý model, ktorý by opisoval adsorbciu hubovou biomasou. Najčastejšie sa preto používa jeden z dvojice modelov: Langmuirova izoterma alebo Freundlichova izoterma.

Langmuirov model pracuje s predpokladom, že všetky adsorpčné miesta sú rovnocenné a adsorbujú len jednu molekulu látky. Povrch je energeticky homogénny. Adsorbované molekuly vytvárajú monovrstvu a vzájomne sa neovplyvňujú.

Freundlichov model je založený na vzťahu medzi koncentráciou roztoku na povrchu adsorbentu a koncentráciou roztoku, v ktorom je adsorbent položený. Je odvodený empiricky a má užšiu platnosť ako Langmuirov model.

Rozsah biosorpcie je vo všeobecnosti limitovaný u živých buniek, je to menej ako 50 % (Knapp a kol., 1995). Rovnako aj Benito a kol (1997), študujúci adsorbciu farbív hubou Trametes versicolor, uvádza len 5 – 10 % podiel biosorpcie na odstránení farbiva. Podobne nízke hodnoty boli pozorované aj u ďalších druhov húb. Aspergillus niger dosiahol 10 – 25 % (Miranda a kol., 1996) a množstvo odstráneného farbiva adsorpciou bolo u Sagenomella stratispora len 12 % (Boussaid, 1995).

U mŕtvych buniek je spôsobom odstraňovania farbiva biosorpcia, založená na fyzikálno-chemických interakciách (iónová výmena, adsorpcia...). Vykonané porovnania adsorpčných schopností mŕtvych a živých buniek priniesli rozličné výsledky. Príčinou je pravdepodobne rôzna štruktúra jednotlivých farbív. Autoklávovaná biomasa huby Phanerochaete chrysosporium dokázala odstrániť o 20 % väčšie množstvo farbiva Kongo červeň ako živé bunky (Tatarko a Bumpus, 1998). Naopak, minimálny rozdiel v efektivite adsorpcie farbiva medzi živou a autoklávovanou biomasou pozoroval Mou a kol. (1991). Polman a Breckenridge (1996) uskutočnili rozsiahly výskum, ktorý zahŕňal 28 rôznych mikroorganizmov (baktérie, huby, kvasinky, riasy). Ukázalo sa, že reaktívne farbivo Reactive black 5 bolo lepšie odstránené mŕtvymi bunkami. Živé bunky naopak úspešnejšie dekolorizovali roztok farbiva Reactive blue 19. Je teda zrejmé, že v prípade rýchlosti odstraňovania farbiva bude hrať veľmi dôležitú úlohu i jej chemická štruktúra.

Problémom pri použití živých buniek je negatívny vplyv toxického prostredia odpadových vôd na ich rast. Taktiež môžu niektoré druhy okrem iného produkovať aj toxíny (Aksu, 2005). Ideálnym riešením sú preto mŕtve bunky. Nevyžadujú stály príjem živín a po ich regenerácii je možné ich použiť opakovane (i v niekoľkých cykloch) (Prigione a kol., 2008). Regenerácia pred ďalším použitím sa vykonáva pomocou organického rozpúšťadla (metanol, etanol) alebo surfaktanu (Tween, roztok NaOH). Výhodné je ich taktiež imobilizovať, čo je možné to urobiť dvoma spôsobmi. Prvým je ukotviť bunky do pórového/vláknitého materiálu. Druhým spôsobom je naviazať ich na povrch nosiča adhéziou alebo chemickou väzbou (Couto a Toca-Herrera, 2007). 31

Priebeh a účinnosť biosorpcie závisí od niekoľkých faktorov. Hodnota pH ovplyvňuje povrchový náboj adsorbentu a tým aj adsorpciu farbív pomocou ich nabitých skupín. Napríklad zvýšenie pH zvýši adsorpčnú kapacitu zásaditých farbív, zníženie naopak pomôže adsorpcii kyslých farbív (Fu a Viraraghavan, 2002). Na adsorpčné schopnosti a adsorpčnú kapacitu hubovej biomasy taktiež vplýva aj teplota. Štúdie zaznamenali zvýšenie adsorpčnej kapacity priamo úmerne so zvýšením teploty (Annadurai a kol., 1999; Zeroual a kol., 2006). U huby Trametes versicolor (trúdnikovité) bolo pozorované zvýšenie biosorpcie keď sa teplota zvýšila z 5 na 35 °C. To platí pre živé i mŕtve bunky (Bayramoglu a kol., 2006). Trochu odlišné výsledky získali Iqbal a Saeed (2007), ktorí pozorovali zvýšenie adsorpčnej kapacity do teploty 30 °C a následný pokles pri ďalšom navýšení teploty na 50 °C.

V roztoku môžu byť prítomné aj rôzne nečistoty v podobe iónov solí kyslých, zásaditých či kovových iónov. Veľmi málo existujúcich štúdii sa zaoberá týmto problémom. Maurya a kol. (2006) zaznamenali pokles biosorpcie spoločne so zvýšením iónovej sily roztoku. Pridané Na+ ióny pravdepodobne súperili s rovnako nabitými iónmi farbiva o rovnaké väzobné miesta. Rovnako počiatočná koncentrácia farbiva hrá v procese dekolorizácie dôležitú úlohu. Jej zvýšenie zrýchlilo adsorpciu molekúl farbiva, ale znížilo sa celkové percento odstráneného farbiva. Príčinou môže byť saturácia všetkých dostupných väzobných miest na povrchu biosorbentu (Maurya a kol., 2006; Kumari a Abraham, 2007).

Adsorpčnú kapacitu je možné ešte ďalej zvýšiť „predúpravou“ hubovej biomasy. Pod tento spôsob patria rozličné fyzikálne alebo chemické spôsoby, napr. sušenie, autoklávovanie a použite organických (formaldehyd) alebo anorganických (NaOH, H2SO4,

CaCL2...) látok. Tepelnou „predúpravou“ biomasy huby Trametes versicolor sa zvýšila jej adsorpcia farbiva Direct Blue 1 z 101,1 mg·g-1 na 153 mg·g-1 (Aksu, 2005). Biosorpcia Rhizopus stolonifer sa v prípade trifenilmetánových farbív zlepšila po úprave pomocou NaOH. Došlo pri nej ku odstráneniu proteínov a glukánov z bunkovej steny a následkom tejto „predúpravy“ bolo zvýšenie percentuálneho obsahu chitínu v nej, ako uvádza Zeroual a kol. (2006). Rozsiahly repertoár vzoriek použili vo svojej štúdii Laxminarayana a kol. (2010). Zvolených bolo trinásť druhov húb najčastejšie sa vyskytujúcich v pôdach kontaminovaných odpadovou vodou obsahujúcou farbivá. Po 21 dňoch boli vyhodnotené výsledky. Približne 80 % farbiva Scarlet red odstránili najlepšie Aspergillus niger a Trichoderma viride. Ostatné huby sa pohybovali v rozmedzí 50 – 65 %. Trichoderma viride sa s hodnotou 90 %

32 umiestnila na prvom mieste pri dekolorizácii farbiva Fast greenish blue. Podobne úspešné boli aj huby Curvularia lunata, Mucor mucedo a Penicillium nutatum (80 – 90 %). Hodnoty dekolorizácie pre farbivo Brilliant blue boli pre všetky organizmy viac ako 70 %. Na procese degradácie sa podieľali viaceré enzýmy: k-amyláza, proteáza a kataláza. Ich produkcia sa líšila v závislosti od druhu či kmeňa organizmu a pravdepodobne aj farbiva.

Častým objektom štúdií je huba bielej hniloby Phanerochaete chrysosporium. Pozornosť si vyslúžila svojím účinným systémom extracelulárnych lignolitických enzýmov schopných rozkladať viaceré toxické polutanty. Pre správnu a optimálnu produkciu enzýmov je nutná koncentrácia glukózy 10 g·l-1. Rýchlosť degradácie farbiva Direct Red-80 bola priamo úmerná koncentrácii glukózy, ak zostala koncentrácia farbiva konštantná. Zvýšenie počiatočnej koncentrácie farbiva naopak viedlo k poklesu. Aby bol lepšie pochopený rast biomasy a enzymatická aktivita, bol vypracovaný matematický model s cieľom predpovedať správanie huby (Sen a kol., 2012; Mode, 2011). V rámci tejto štúdie model úspešne predpovedal dôsledky zmeny rôznych parametrov (koncentrácia farbiva, glukózy, množstvo vyprodukovaných enzýmov). Je možné uvažovať o jeho použití aj pre iné toxické látky alebo príbuzné huby (Sen a kol., 2012).

Medzi huby bielej hniloby patrí aj Bjerkandera adusta. Skúmaný bol jej potenciál pri dekolorizácii a detoxifikácii farbivami znečistenej odpadovej vody. Na dosiahnutie podmienok čo najvernejších realite boli pripravené štyri vzorky simulujúce rôzne typy odpadových vôd. Ich zloženie (pH, obsah NaCL, aditív a koncentrácia farbiva) sa malo čo najviac priblížiť odpadovej vode produkovanej pri farbení vlny (W1), bavlny (W2, W3) a kože (W4). Výsledky preukázali značnú výdrž a prispôsobivosť Bjerkandera adusta. Rástla dobre v rozmedzí pH 5 až 10, koncentrácii soli až do 70 g·l-1 a zniesla prítomnosť 13 rôznych druhov farbív s maximálnou koncentráciou 5000 ppm. Dekolorizácia bola efektívna vo všetkých vzorkách a v niektorých dosiahla až 90 %. Rapídny úbytok farbiva v prvých momentoch je výsledok adsorpcie (potvrdené pokusom z mŕtvou biomasou). Nasleduje degradácia farbiva pomocou enzýmov – prítomné boli peroxidázy (MnP a MiP). Ich produkcia bola markantne ovplyvňovaná podmienkami prostredia. Vykonala sa aj dekolorizácia skutočnej textilnej odpadovej vody a výsledky sa porovnali s bežne používanou metódou ozonácie. V tomto prípade bolo zásluhou hubovej biomasy odstránených 40 %, ale ozonácia zredukovala obsah farbiva o 63 %. Z produktov vzniknutých pri degradácii jednotlivých vzoriek boli následne detoxifikované len vzorky W1

33 a W2. Napriek odfarbeniu veľkého množstva farbiva, toxicita produktov u vzoriek W3 a W4 bola nadlimitná (Anastasi a kol., 2011).

Produkciu enzýmov a tým aj dekolorizačné schopnosti je možné ovplyvniť pridaním určitých aditív, napr. Tween 80. Ten v prípade imobilizovanej kultúry zvýšil množstvo dekolorizovaného farbiva o 10 %. Zvýšilo sa množstvo enzýmu mangán peroxidázy, aj keď sa tým nezlepšila dekolorizácia farbiva Astrazon Red FBL. Experiment prebehol v bioreaktore a kultúra huby Phanerochaete chrysosporium bola imobilizovaná na nosiči (Kissiris). Degradačné schopnosti kultúry zostali zachované aj po jej opakovanom použití (Sedighi a kol., 2009).

Hlavným nedostatkom používania húb v tekutých kultúrach je nutnosť stále udržiavať vhodné podmienky, aby bola zabezpečená produkcia enzýmov. Tím je limitované ich použitie vo väčšom, priemyselnom meradle. Nový prístup, sľubujúci odstránenie tohto obmedzenia, je použitie lyofilizovaného mycélia. V tejto štúdii bola použitá huba Trametes versicolor. Najprv bola kultivovaná na slame a neskôr v sladinovom médiu. Počas stacionárnej fázy bola kultúra odobraná a lyofilizovaná. Samotný experiment zahŕňal použitie lyofilizovaného mycélia (koncentrácia 6 g·l-1) a azo farbiva Indigo carmine (koncentrácia 100 – 4000 mg·l-1). Množstvo odstráneného farbiva klesalo so stúpajúcou koncentráciou – z 99 % pri 100 mg·l-1 za 1 hodinu až na 40 % pri koncentrácii 4000 mg·l-1 po 120 hodinách. Ako produkt biodegradácie bola detegovaná 5-isatinsulfonová kyselina. Prítomné enzýmy podieľajúce sa na degradácii boli lakázy. Lyofilizát bol neskôr vhodne uskladnený a po roku znovu otestovaný. Nedošlo ku výraznému zníženiu jeho efektivity dekolorizáce, čo ešte viac zvyšuje jeho možnosti využitia (Cano a kol., 2011).

Lyofilizovanému mycéliu, tentokrát použitému ako adsorbent, sa venovali Erden a kol. (2011). Lyofilizát bol vytvorený z mycélia huby Trametes versicolor kultivovanej na sladinovom médiu. Skúmal sa vplyv rôznych podmienok – pH, teplota, koncentrácia biomasy a čas adsorpčnej rovnováhy. Adsorpčná rovnováha sa ustanoví, ked množstvo práve adsorbovanej látky je rovné množstvu práve desorbovanej látky. Vykonané bolo aj porovnanie s bežne používanými adsorbentmi – aktívnym uhlím a polymérovou živicou (Amberlite XAD-7). Výsledky boli dosiahnuté pri počiatočnej koncentrácii farbiva 100 mg·l-1. Nastavené boli optimálne hodnoty koncentrácie biomasy (1,2 mg·l-1) a času dosiahnutia adsorpčnej rovnováhy (2 h). Vplyv pH na adsorpciu lyofilizátu bol značný, pri pH vyššom ako 3 (optimum) došlo k jej významnému poklesu. Ideálna teplota bola 26 °C, vyššie hodnoty opäť negatívne ovplyvnili adsorpciu. Príčinou je pravdepodobne deaktivácia 34 alebo deštrukcia aktívnych miest na povrchu biosorbentu. Pri porovnaní s bežnými adsorbentmi dosiahol lyofilizát výborné výsledky. Jeho adsorpčné maximum bolo 62,62 mg·g-1, aktívne uhlie malo 31,77 mg·g-1 a polymérová živica len 4,69 mg·g-1. Podľa štúdie kinetiky sa reakcia riadi modelom Langmuirovej izotermy (Erden a kol., 2011).

Imobilizáciou mikroorganizmu na vhodný nosič je zvyčajne možné zvýšiť jeho efektívnosť pri dekolorizácii. To však nielen zvyšuje cenu „predúpravy“ hubovej biomasy, ale ovplyvňuje aj kinetiku adsorpcie (Aksu, 2005; Crini, 2006). Niektoré druhy húb, medzi nimi Trichoderma sp, sú schopné „self-immobilization“ a vytvárajú tak pelety. Pri ich použití dochádzalo k dobrej sedimentácii a minimálnemu upchávaniu bioreaktoru, uľahčujúc tak separáciu biomasy bez ďalších nákladov. V pokusnom bioreaktore bolo pomocou tejto metódy odstránených 100 % azo farbiva Acid Brilliant Red B v troch po sebe nasledujúcich dávkach rovnakej alebo inej koncentrácie (Xin a kol., 2012).

4.3. Kvasinky V porovnaní s hubami a baktériami majú kvasinky niektoré výhody. Sú ľahko a lacno dostupným zdrojom biomasy. Podobne ako vláknité huby tolerujú nepriaznivé podmienky, ale rastú rýchlejšie ako oni. Kvasinky sa dokážu adaptovať a rozmnožovať v rôznych extrémnych podmienkach, či je to pH, teplota, prítomnosť živín alebo vysoké koncentrácie polutantov (Dönmez, 2002; Malik, 2004; Wang a Hu, 2008; Aksu, 2003; Aksu a Dönmez, 2005; Aksu a Dönmez, 2003).

4.3.1. Adsorpcia a bioakumulácia Biosorpčné schopnosti kvasiniek boli hlavným dôvodom, prečo sa začalo s ich skúmaním pri odstraňovaní farbív. Náhľad do tejto problematiky nám môže priniesť rozsiahla štúdia, ktorú realizovali Aksu a Dönmez (2003). Skúma schopnosti adsorpcie u rôznych druhov vysušených kvasiniek – Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces marxianus, Candida sp., C. tropicalis, C. lipolytica, C. utilis, Candida quilliermendii a Candida membranaefaciens. Experiment prebehol pri čo najoptimálnejších podmienkach. Na adsorpciu malo účinok pH (optimum pH= 2) a koncentrácia farbiva. Pri počiatočnej koncentrácii 100 mg·l-1 bolo reaktívne farbivo Remazol Blue (antrachinónové farbivo) adsorbované všetkými druhmi kvasiniek. A dosiahnuté výsledky boli porovnateľné. So stúpajúcou koncentráciu farbiva sa začali objavovať odlišnosti, najviac pri koncentrácii 400 mg·l-1. Zo všetkých druhov kvasiniek mala Candida lipolytica najväčšiu adsorpčnú kapacitu. Skúmaniu vplyvu teploty na adsorpciu sa venovali Kumari a Abraham (2007). Nižšia teplota 20 °C inhibovala adsorpciu 35 u S. cerevisiae, optimálnejšie hodnoty boli dosiahnuté po jej zvýšení na 30 °C, kedy bolo adsorbovaných 83 – 91 % farbiva z roztoku. Okrem adsorpcie sú živé bunky S. cerevisiae schopné aj bioakumulácie farbív. Najoptimálnejšie podmienky predstavuje nízke pH (3 – 5) a nízka koncentrácia farbiva. Pri splnení týchto podmienok došlo k úspešnému odstráneniu reaktívnych farbív (Remazol Blue, Remazol Black B a Remazol Red RB), ako uvádza Aksu (2003). Kvasinku Candida tropicalis a rozsah jej bioakumulačných schopností skúmali aj Charumathi a Das (2010). Vo svojej práci sa zamerali na účinky koncentrácie farbiva, hodnoty pH a vplyv prídavku extraktu z cukrovej trstiny. Výsledky boli získané zo submerznej kultivácie pri 28 °C. Z nich vyplynulo, že pri konštantnej koncentrácii farbiva sa množstvo biomasy a akumulovaného farbiva zvyšuje priamo úmerne s obsahom extraktu z cukrovej trstiny. Naopak, pri stálej hodnote extraktu, malo zvýšenie koncentrácie farbiva negatívny efekt na rast a množstvo odstráneného farbiva. Hodnota optimálneho pH bola iná pre každé farbivo – pH= 3 pre Acid Blue 93, Direct Red 28 a pH= 5 pre Basic Violet 3. Podobné výsledky boli získané aj počas ďalšej štúdie venujúcej sa kvasinke Candida tropicalis. Testovali aj účinky prítomnosti kovov (olovo a kadmium) a ich adsorbcia z média. Znova bol použitý extrakt z cukrovej trstiny ako lacný zdroj uhlíka. Výsledky vplyvu pH na absorbciu kovov boli porovnateľné, efektivita bioakumulácie sa zvyšovala až do pH= 4. Táto hodnota bola vyhodnotená ako optimum pri tomto spôsobe kultivácie. Pre systém kov-farbivo bolo optimálne pH= 5. Obsah kovu v médiu bol 2 mg·l-1. V prítomnosti olova odstránila kvasinka 49,5 % farbiva Basic Violet 3 z roztoku. Pridanie kadmia významne znížilo efektivitu bioakumulácie a to na 16 % odstráneného farbiva (Das a kol., 2011).

4.3.2. Degradácia Odpadové vody z tovární obsahujú veľmi zriedka len jeden druh farbiva. Najčastejšie je to zmes rôznych farbív a chemikálií používaných pri procese farbenia látok alebo výroby farieb. Waghmode a kol. (2011b) práve preto nechali kvasinku Galactomyces geotrichum MTCC 1360 dekolorizovať roztok viacerých farbív (Remazol red, Golden yellow HER, Rubine GFL, Scarlet RR, Methyl red, Brown 3 REL, Brilliant blue). Každé farbivo bolo prítomné v zmesi v rovnakom množstve (10 mg·l-1). Kvasinka bola kultivovaná v ME médiu, staticky a aj submerzne (120 rpm), pri teplote 30 °C. Po 24 h bola do média pridaná zmes farbív, ktorá mala koncentráciu 70 mg·l-1. Výsledky po ďalších 24 h ukázali, že pri submerznej kultivácii bolo odstránené takmer dvakrát väčšie množstvo farbiva (88 %) ako počas statickej kultivácie (49 %). Pridanie rôznych kovových solí (CaCl2, ZnSO4, FeCl3,

MgCl2, a CuSO4), s koncentráciou 0,5 mM, do média inhibovalo odstránenie farbiva, ale úplne ho nezastavilo. Podľa druhu pridanej soli sa množstvo odstránenej látky pohybovalo od 48 % do 77 %. Výrazný vplyv malo pridanie rôznych zdrojov dusíka a uhlíka. Kontrolné Bushnell Haas médium (BHM) malo veľmi nízku hodnotu dekolorizácie, len 19 %. Pridanými látkami boli napríklad glukóza, sladinový extrakt či ryžové otruby. Najlepšie výsledky sa dosiahli prídavkom glukózy (83 %) a sladinového extraktu (52 %). Rolu pri degradácii majú enzýmy tyrosináza, NADH-DCIP reduktáza a lakáza. Zároveň došlo aj ku biotransformácii farbív, výsledné produkty sa v testoch ukázali byť menej toxické ako východzie látky.

4.4. Riasy a cyanobaktérie Riasy spoločne so cyanobaktériami sú fotosyntetické organizmy obývajúce takmer všetky oblasti sveta. Dekolorizujú veľa druhov organických farbív. Deje sa to buď biosorpciou alebo degradáciou. Proces je viazaný na druh riasy a typ farbiva, predovšetkým na jeho molekulovú štruktúru.

4.4.1. Biodegradácia Chlorella pyrenoidosa, Chlorella vulgaris a Oscillateria tenuis úspešne dekolorizovali a degradovali viac než 30 rôznych azo zlúčenín (Yan a Pan, 2004). Riasy možno využiť aj ako efektívny biosorbent. Rôzne funkčné skupiny, nachádzajúce sa v ich bunkovej stene, umožňujú naviazať rozsiahle množstvo chemických látok, napr. amino, karboxylové, sulfátové a fosfátové skupiny či proteíny (Volesky a Holan, 1995).

Biodegradáciu azo farbív rozličnými druhmi rias skúmali El-Sheekh a kol. (2009). Sledovali 6 druhov zelených a modrozelených rias Chlorella vulgaris, Lyngbya lagerlerimi, Nostoc lincki, Oscillatoria rubescens, Elkatothrix viridis a Volvox aureus. Všetky boli schopné rozložiť testované azo farbivá pri izbovej teplote (25 °C). Výsledky sa líšili podľa druhu riasy, chemickej štruktúry farbiva, ale aj štádia rastu. Chlorella vulgaris potrebovala sedem dní na degradáciu farbiva v médiu. Odstránila 78,3 % látky. Za ďalšie dva dni zvýšila toto množstvo o 13 %. Okrem degradácie môže byť C. vulgaris použitá aj ako adsorbent (Lim a kol., 2010). Na otestovanie jej adsorpčných schopností v reálnych podmienkach využili odpadovú vodu z textilnej fabriky a všetko prebehlo na jednorázovej kultúre v HRAP (High Rate Algae Ponds). Pri tejto metóde sú riasy umiestnené v nádrži pripomínajúcej závodný okruh a ich pohyb v nej sa dosahuje pomocou lopatkového kola.

Cyanobaktérie sú všadeprítomné, avšak ich rola v ekosystéme, predovšetkým rozklad odolných látok (napr. azo farbivá), je málo známa (Semple, 1999). Predchádzajúce štúdie dokázali, že cyanobaktérie sú schopné rozkladať látky ako napríklad ampicilín (Prabaharan a kol., 1994), fenoly (Shashirekha a kol., 1997) či detergenty s obsahom SDS (Uma a kol., 2009) a využívať ich ako zdroj dusíka. Na základe týchto dát boli preto preskúmané či sú schopné sa rovnako správať aj v prítomnosti azo farbív. Otestovaných bolo 10 rôznych druhov cyanobaktérií, medzi nimi vynikala Oscillatoria curviceps BDU92191. Pri všetkých testovaných počiatočných koncentráciách (200 – 500 mg·l-1) degradovala 98 % farbiva C.I. Acid Black 1 obsiahnutého v roztoku. Prítomné enzýmy, azoreduktáza, polyfenol oxidáza a lakáza, sa podieľali na degradácii. Farbivo bolo nakoniec mineralizované na CO2 a NH3. Oscillatoria curviceps bola okrem jeho odstránenia schopná využiť farbivo aj ako zdroj dusíka v oligotrofnom prostredí, detegované boli nitrit reduktázy a glutamín syntetázy (Priya a kol., 2011).

Parikh a Madamwar (2005) pre svoju štúdiu izolovali 14 druhov cyanobaktérií. Na začiatku boli kultivované pri koncentrácii farbiva 50 mg·l-1. Napriek tomu, že väčšina izolátov rástla dobre v prítomnosti farbiva, len 5 kultúr odstránilo 70 – 90 % a z nich len Phormidium ceylanicum, Gloeocapsa pleurocapsoides a Chroococcus minutus boli schopné rýchlej degradácie roztoku s koncentráciou 100 mg·l-1. Zvlášť náročná bola dekolorizácia farbiva Amido Black 10B. Jedine Chroococcus minutus ho dokázala odstrániť (55 % za 26 dní). Zaznamenaný bol negatívny vplyv prítomnosti farbív na obsah chlorofylu a. Zhoršené prenikanie slnečného žiarenia znížilo tempo fotosyntézy a následne aj rýchlosť rastu.

Ďalšou riasou, ktorá má potenciál pri odstraňovaní azo farbív je Spirogyra. Testovacia vzorka bola získaná z jazera a okamžite použitá. Rýchlosť odstraňovania bola spočiatku pomalá, riasa potrebovala 12 h na aklimatizáciu v prostredí s farbivom. Neskôr, po 72 h, sa rýchlosť rapídne zvýšila a zostala konštantná až do konca experimentu. Pri nižšej koncentrácii 25 mg·l-1 bolo množstvo odstráneného farbiva väčšie (92 %) ako pri koncentrácii 100 mg·l-1. Množstvo dekolorizovaného farbiva sa vtedy znížilo na 70 %. Hodnotený bol tiež vplyv množstva biomasy na rýchlosť procesu. Adsorpcia sa zvýšila o 10% za každých ďalších 0,5 g biomasy. Celkovo sa na odstránení farbiva podieľala riasa biosorpciou, biokonverziou a biokoaguláciou (Venkata Mohan a kol., 2002).

4.4.2. Biosorpcia Biosorpčné schopnosti sa skúmali u riasy Chlorella vulgaris. Na testovanie boli použité tri najpoužívanejšie reaktívne farbivá – Remazol Black RB, Remazol Red RR a Remazol Golden Yellow RNL. Chemická štruktúra farbív hrala dôležitú úlohu pri určovaní optimálnej teploty. Biosorpcia RB mala stúpajúcu tendenciu spoločne s rastúcou teplotou do optima 35 °C. Naopak pri odstraňovaní RR a RGY sa dosahovali lepšie hodnoty pri nižších teplotách okolo 25 °C. Hodnota pH bola konštantná vo všetkých experimentoch a pre všetky použité farbivá (pH = 2). Pri stálej teplote bol zaznamenaný rast biosorpčnej kapacity, ak došlo k zvýšeniu počiatočnej koncentrácie farbiva. Rovnováhu systém dosiahol už po 0,5 – 4 hodinách, keďže celý proces prebehol veľmi rýchlo (Aksu a Tezer, 2005).

Závislosť biosorpcie na hodnote pH bol pozorovaný u riasy Pithophora sp. Ak bolo pH nižšie alebo vyššie ako 6, nastal prudký pokles v množstve adsorbovaného farbiva Malachitovej zelenej. Z týchto dôvodov bola hodnota pH= 6 vybraná ako optimálna pre dekolorizáciu (Kumar a kol., 2006). Na rozdiel od iných druhov rias, napr. u Caulerpa scalpelliformis malo zvyšovanie pH pozitívny vplyv na efektivitu biosorpcie katiónového farbiva (Sandocryl golden yellow C-2G) (Aravindhan a kol., 2007).

Všadeprítomné a dobre dostupné sú makroskopické vodné riasy Azolla rongpong a Azolla filiculoides. Predstavujú ideálny biosorbent – rastú rýchlo a majú pevnú štruktúru. Optimálnym pH bolo 2,5 – 3 a teplota 30 °C. U obidvoch druhov bola v stĺpcovom reaktore skúmaná adsorpcia farbiva (Acid green 3). V tomto type reaktora je dôležitá výška stĺpca a prietok. Farbivo sa najviac viazalo na bunky ak bol prietok nízky. Pomalé prúdenie síce zabezpečuje predĺženú dobu kontaktu buniek s farbivom, ale na druhej strane sa výrazne zvyšuje lokálna koncentrácia farbiva, čo môže viesť ku spomaleniu celého procesu (Padmesh a kol., 2005; Padmesh a kol., 2006).

Invazívne druhy morských rias prinášajú niekoľko problémov, jedným je aj ako spracovať biomasu po ich odstránení z pobrežných vôd. Riešenie sa môže skrývať v ich následnom využití ako biosorbenty. Cengiz a Cavas (2008) sa preto pokúsili preukázať biosorpčné schopnosti invazívnej stredomorskej riasy Caulerpa racemosa var. cylindracea. Maximálne hodnoty adsorpčnej kapacity boli dosiahnuté pri vyššom pH (7 – 11) a nižšej teplote (18 °C) aj keď niektoré štúdie dospeli k opačným výsledkom (Doan a kol., 2004; Bhattacharyya a Sharma, 2005; Wang a kol., 2005).

Uvedený prehlaď naznačuje, že mikroorganizmy majú veľkú schopnosť odstraňovať (biosorbciou, bioakumuláciou alebo biodegradáciou) organické látky z prostredia, i keď niektoré z nich sa vyznačujú značnou toxicitou. Nevýhodou biologických systémov však je, že nie sú univerzálne. A že v podstate každý organizmus „dokáže“ odstraňovať iba určité látky a naviac len za určitých podmienok. Je však nutné mať na pamäti, že intermediát, alebo metabolit vznikajúci pri procese odstraňovania látky môže byť toxickejší než pôvodná látka.

5. Cieľ práce Cieľom tejto práce je:

• posúdiť dekolorizačné schopnosti vybraných kmeňov mikroorganizmov; • sledovať vplyv teploty, média, spôsobu kultivácie a počiatočnej koncentrácie farbiva na množstvo odstráneného farbiva rastúcimi bunkami; • sledovať vplyv teploty a pH na dekolorizáciu nerastúcimi bunkami.

6. Materiál a metódy 6.1. Materiál 6.1.1. Použité mikroorganizmy Dekolorizácia azo farbív bola študovaná na 7 bakteriálnych kmeňoch, 2 kmeňoch kvasiniek a jednej zmiešanej kultúre. Použité kmene boli získané z České zbierky mikroorganizmov (CCM) a zbierky oddelenia mikrobiológie ÚEB Prírodovedeckej fakulty Brno.

Baktérie: Arthrobacter crystallopoietes Bacillus cereus CCM 24 Bacillus cereus CCM 98 Bacillus cereus R Bacillus subtilis D Pseudomonas pictorum CCM 284 Pseudomonas sp. CCM 4307

Kvasinky: Geotrichum candidum Yarrowia lipolytica

Zmiešané kultúry: Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia

6.1.2. Kultivačné pôdy Mäsopeptónový agar (MPA) na uchovávanie baktérií rodu Arthrobacter, Bacillus, zmiešanej kultúry a kvasiniek: 10 g peptón (HiMedia, Indie) 10 g hovädzí extrakt (HiMedia, Indie) 5 g NaCl 20 g agar 1000 ml destilovaná voda Sterilizácia bola vykonaná v autokláve (121 °C, 30 min). pH upravené na 7,2 ± 0,2.

Agar pre uchovávanie pseudomonád: 38 g Pseudomonas agar (HiMedia, Indie) 10 ml glycerol 1000 ml destilovaná voda Sterilizácia bola vykonaná v autokláve (121 °C, 30 min). Výsledné pH 7,0 ± 0,2.

Mäsopeptónový bujón (MPB) pre kultiváciu baktérií rodov Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas: 10 g peptón (HiMedia, Indie) 10 g hovädzí extrakt (HiMedia, Indie) 5 g NaCl 1000 ml destilovaná voda Sterilizácia bola vykonaná v autokláve (121 °C, 30 min). Pokiaľ nie uvedené inak, bolo pH upravené na 7,2 ± 0,2.

Sladinový bujón (SLB) pre kultiváciu kvasiniek: 20 g sladinový extrakt (HiMedia, Indie) 1000 ml destilovaná voda Sterilizácia bola vykonaná v autokláve (121 °C, 30 min). Pokiaľ nie uvedené inak, bolo výsledné pH 5,4 ± 0,2.

A+B bujón pro kultiváciu zmiešanej kultúry A. sulphureus + B. cepacia: 20 g peptón (HiMedia, Indie)

6,3 g Na2HPO4 ·12 H2O

1,52 g KH2PO4

0,5 g (NH4)2SO4

0,2 g MgSO4 · 7 H2O

0,038 g CaCl2 1000 ml destilovaná voda Sterilizácia bola vykonaná v autokláve (121 °C, 30 min). pH upravené na 6,7 ± 0,2.

6.1.3. Chemikálie a roztoky

HCl – kyselina chlorovodíková, 0,2M roztok NaOH – hydroxid sodný, 1M roztok NaCl – chlorid sodný (PENTA, ČR) Glycerol

Na2HPO4 ·12 H2O – dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného (Lachema, ČR)

KH2PO4 – dihydrogenfosforečnan draselný (Lachema, ČR)

(NH4)2SO4 – síran amónny (Lachema, ČR)

MgSO4 · 7H2O – heptahydrát síranu horečnatého (Lachema, ČR)

CaCl2 – chlorid vápenatý (Lachema, ČR) Korostanová modrá BS (Synthesia, ČR)

Tris-HCL pufor (0,2 m; pH 7,2) 24,2 g tris(hydroxymetyl)aminometánu

1000 ml destilovaná H2O pH upravené pomocou 0,2 M HCL

6.1.4. Prístroje a počítačové programy

Analytické váhy BBL-32 (Boeco, Německo) Autokláv 3870 ELVC (Tuttnauer, Holandsko) Autokláv stolný Classic Media (Prestige Medical, Velká Británie) Automatická mikropipeta 200-1000 μl Automatická mikropipeta 10-100 μl Lambda (Corning, USA) Centrifuga Universal 320R (Hettich, Německo) Filtr striekačkový 0,45 μm, PES (VWR International, USA) Flowbox HERAsafe KS (Thermo Scientific, Německo) pHmetr Cyberscan pH 510 (Thermo Scientific, USA) Spektrofotometer Cary 100 UV-Vis (Varian Inc., USA) Termostat BT 120 (Labo-MS, ČR) Váhy EMB 2000-2V (Kern, Německo) Vortex MPS-1 (Biosan, Lotyšsko)

6.2. Metódy 6.2.1. Príprava roztokov azo farbív Dekolorizačné schopnosti mikroorganizmov boli testované na farbive korostanová modrá (KM). Zásobný roztok mal koncentráciu 5 mg·ml-1. Roztok bol uchovávaný pri izbovej teplote na tmavom mieste. V experimentoch bol použitý roztok azo farbív s príslušnou koncentráciou 50; 100; 300 mg·ml-1, pripravený vždy pred daným experimentom. Sterilizácia sa vykonala sterilnými striekačkovými filtrami (0,45 μm, PES, VWR International).

6.2.2. Uchovávanie kultúr Všetky kultúry boli uchovávané v chladničke pri + 4 °C v skúmavkách obsahujúcich príslušné pevné médium (viď kapitola 6.1.2.). Aby bola zaistená životaschopnosť, boli preočkovávané v mesačných intervaloch.

6.2.3. Príprava 24 hodinových kultúr Pripravených bolo 50 ml sterilného MPA bujónu v 100ml Erlenmeyerovej banke a zaočkované daným kmeňom a kultivované v termostate pri 30 °C po dobu 24 h.

6.2.4. Výpočet množstva dekolorizovaného farbiva Množstvo farbiva odstráneného mikroorganizmami sa vypočítalo na základe rozdielov absorbancie vzoriek podľa vzorca:

퐴 푚푛표ž푠푡푣표 표푑푠푡푟á푛푒푛éℎ표 푓푎푟푏𝑖푣푎 (%) = (1 − 푥) × 100 퐴0

Vysvetlivky: A0 – absorbancia v čase 0 min; Ax – absorbancia v čase x min.

6.2.5. Výpočet sušiny Do vopred vysušených a zvážených váženiek, dvoch pre každý testovaný kmeň, sa napipetoval 1 ml bunkovej suspenzie. Váženky sa potom umiestnili do sušiarne na 24 h pri teplote 110 °C. Po vybratí zo sušiarne sa nechali vychladnúť v exsikátore a následne sa zvážili na analytických váhach. Výsledná hmotnosť sušiny bola vypočítaná zo vzťahu:

푉 −V 푉 −푉 푆 = 푠 − 푝 (mg·ml-1) 2 2

Vysvetlivky: VS – hmotnosť váženky s 2 ml bakteriálnej suspenzie; V – hmotnosť použitej váženky; Vp – hmotnosť váženky s 2 ml fosfátového pufra; S – hmotnosť bakteriálnej sušiny v mg·ml-1 bakteriálnej suspenzie.

6.2.6. Dekolorizácia korostanovej modrej rastúcimi bunkami 1. Bolo pripravené médium (MPB) podľa návodu (viď 5.1.2.). 2. Z predtým pripravených 24 h – kultúr bolo do 250 ml Erlenmeyerovej banky obsahujúcej 100 ml MPB pipetovaných 1 ml inokula a 1ml farbiva – výsledná koncentrácia bola 50 mg·l-1. 3. Pripravená bola negatívna kontrola, ktorá obsahovala len médium a farbivo. 4. Kultivácia prebiehala staticky alebo submerzne pri rôznych teplotách. 5. Vždy po 24 h boli odobrané 3 ml, scentrifugované (10 min, 5000 rpm) a bol odliaty supernatant. 6. Meranie adsorbancie supernatantu bolo vykonané na spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 595nm a v intervale 280 – 650 nm.

6.2.7. Sledovanie dekolorizácie korostanovej modrej nerastúcimi bunkami 1. Z 24 h – kultúry bolo pipetovaných 1 ml inokula do predom pripraveného média (MPB) s objemom 1 l. 2. Submerzná kultivácia trvala podľa potreby 48 – 72 h pri 30 °C. 3. Kultúra bola centrifugovaná 10 min pri 10 000 rpm. Supernatant bol vyliaty a biomasa bola dvakrát premytá destilovanou vodou a následne scentrifugovaná (10 min, 5000 rpm) 4. Premytá biomasa bola rozsuspendovaná v 30 ml Tris-HCl pufra, pH= 7,2; 0,2M. 5. Odobrané boli 2 ml suspenzie na stanovenie bakteriálnej sušiny.

6. Do 100 ml banky bolo pridaných 20 ml 0,2M Tris-HCl pufra s príslušnou hodnotou pH, 10 ml rozsuspendovanej kultúry a 0,230 ml farbiva (výsledná koncentrácia – 50 mg·l-1). 7. Inkubácia bunkových suspenzií prebehla submerzne pri rôznych teplotách. 8. Vždy po 30, 60, 90, 120 a 150 min boli odobrané 3 ml, scentrifugované (10 min, 5000 rpm) a supernatant bol odliaty na následné meranie absorbancie. 9. Meranie adsorbancie bolo vykonané na spektrofotometre pri vlnovej dĺžke 595 nm.

7. Výsledky 7.1. Dekolorizácia farbiva korostanová modrá rastúcimi bunkami Odstránenie farbiva rastúcimi mikroorganizmami bolo skúmané na 3 vybraných kmeňoch baktérií, patriacich do rodov Pseudomonas, Bacillus a Arthrobacter, 2 kmeňoch kvasiniek rodu Geotrichum a Yarrowia a na jednej zmiešanej kultúre (Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia). Kultivácia mikroorganizmov v tejto sérii experimentov prebehla staticky v termostate pri 30 °C, okrem experimentu s vplyvom teploty na rýchlosť dekolorizácie a experimentu skúmajúceho vplyv spôsobu kultivácie. Kultivácia sa vykonala v Erlenmayerových bankách s objemom 250 ml obsahujúcich 100 ml príslušného média a farbivo sa pridávalo tak, aby výsledná koncentrácia bola 50, 100 a 300 mg·l-1. Dekolorizácia bola hodnotená ako zmena absorbancie supernatantu po odstránení buniek. Meranie bolo uskutočňované na spektrofotometri (Cary 100 UV-Vis) v 24 h intervaloch. Na základe získaných dát bola určená rýchlosť dekolorizácie jednotlivými mikroorganizmami.

7.1.1. Dekolorizácia farbiva KM mikroorganizmami pri 30 °C Mikroorganizmy, kvôli stanoveniu ich schopnosti odfarbovať roztok farbiva, boli kultivované staticky pri 30 °C po dobu 8 dní v MPB. Výsledná koncentrácia farbiva bola 50 mg·l-1. Množstvo odstráneného farbiva sa stanovovalo po 24 hodinách na základe výsledkov zmeny absorbancie vzorky. Priemerné hodnoty, získané z troch nezávislých opakovaní, sú uvedené v percentách v Tabuľke 3.

Tabuľka 3. Množstvo odstráneného farbiva KM vybranými mikroorganizmami. Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 120 144 168 192 B. cer 24 0% 58% 67% 71% - - 77% 81% 82% PS 4307 0% 54% 68% 71% - - 74% 68% 67% Geo 0% 1% 49% 62% - - 73% 75% 77% B. cer 98 0% 58% 67% 68% - - 80% 80% 80% PS 284 0% 20% 63% 65% - - 73% 73% 77% Yarr 0% 34% 55% 63% - - 72% 73% 73% A+B 0% 66% 69% 72% - - 87% 89% 92% Arth 0% 1% 25% 54% - - 65% 67% 69% B. subt D 0% 61% 69% 71% - - 84% 85% 86% B. cer R 0% 57% 68% 70% - - 74% 75% 74%

Z údajov uvedených v Tabuľke 3. a Obr. 5. je zrejmé, že B. cereus CCM 24 odstránil po 192 h kultivácie 82 % farbiva. Najväčšie množstvo, 58 %, bolo eliminované za prvých 24 h. S predlžujúcou sa dobou kultivácie sa rýchlosť postupne znižovala – za prvé 3 dni sa „odstránilo“ 71 %, zatiaľ čo za ďalších 5 dní len 11 %. Podobnú odpoveď je možné zistiť i u Bacillus cereus CCM 98. Maximálne množstvo KM, ktoré bol schopný dekolorizovať v tomto experimente, dosiahol po 144 hodinách. Za tento čas eliminoval 80 % azo farbiva. Ďalších 48 h kultivácie nezvýšilo toto množstvo. Bacillus subtilis D za dobu trvania experimentu, 192 hodín, odfarbil roztok o 86 %. V zhode s väčšinou ostatných kmeňov odstránil najviac farbiva počas prvých 72 h (71 %). Bacillus cereus R bol spomedzi všetkých kmeňov rodu Bacillus najhorší. Podľa výsledkov uvedených v Tabuľke 3., bol len priemerný v dekolorizácii KM – za 192 h odstránil 74 %. Podobne ako iné mikroorganizmy v tomto pokuse (Geotrichum candidum, Bacillus cereus CCM 98 a Yarrowia lipolytica), aj on dosiahol svoje maximum za 144 h.

Obr. 5 Množstvo eliminovaného farbiva KM z roztoku.

Z hodnôt získaných počas kultivácie je zrejmé, že Y. lipolytica mala „pomalý štart“ v porovnaní s väčšinou ostatných kmeňov (Tabuľka 3.). Prvé známky dekolorizácie sa objavili až na druhý deň. Rovnako ako ostatné kmene, odstránila väčšiu časť KM počas prvých 72 h. Spoločne s B. cereus CCM 98 svoje maximum dosiahla po 144 h, kedy ona eliminovala 72 % a B. cereus CCM 98 odstránil 80 % farbiva. Aj druhá kvasinka Geotrichum

49 candidum mala veľmi pomalý rozbeh ako je možné vidieť na Obr. 5. Prvé známky dekolorizácie boli zaznamenaní až o 48 h, čo je o 24 hodín neskôr ako u väčšiny ostatných kmeňov. S pokračujúcou dobou kultivácie sa však dekolorizačná aktivita postupne zvyšovala a po 192 hodinách odstránila kvasinka 77 % farbiva.

Pseudomonas sp CCM 4307 dosiahla „najhorší“ výsledok dekolorizácie zo všetkých skúmaných kmeňov. Za 192 h odstránila iba 67 % farbiva. Po 144 h síce odstránila 74 % KM, no za ďalšie dva dni sa však množstvo farbiva v roztoku mierne zvýšilo. V porovnaní s Pseudomonas sp CCM 4307 dosiahla Pseudomonas pictorum CCM 284 o čosi lepšie výsledky. Podobne ako G. candidum a A. crystallopoietes mala baktéria Pseudomonas pictorum CCM 284 pomalší rozbeh dekolorizácie – dekolorizovala 20 % KM počas prvého dňa kultivácie. Rýchlosť sa nakoniec zvýšila a za trvanie experimentu odstránila 77 %. To je o 10 % viac ako u predchádzajúcej pseudomonády.

Zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia dekolorizovala najväčšie množstvo farbiva zo všetkých testovaných kmeňov. Na konci 192 h kultivácie ostalo v roztoku len 8% korostanovej modrej. Jej počiatočná rýchlosť dekolorizácie bola najvyššia, keď viac ako dve tretiny azo farbiva „vyčistila“ už za 24 h.

Takmer úplným opakom bol Arthrobacter crystallopoietes. Odstránenie farbiva prebiehalo u neho najpomalšie a odstránil druhé najmenšie množstvo farbiva. Dekolorizačná aktivita začala o 48 hodín. Hodnoty namerané v tomto čase boli v porovnaní s Geotrichum candidum, druhým najpomalším mikroorganizmom, polovičné. Výsledky získané pri baktérii A. crystallopoietes naznačujú, že za 192 h odstránila toľko farbiva čo takmer všetky ostatné kmene za 48 h.

7.1.2. Vplyv zloženia média na dekolorizáciu KM vybranými mikroorganizmami Na porovnanie účinku rozdielneho zloženia média na dekolorizačné schopnosti boli vybrané kvasinky Geotrichum candidum, Yarrowia lipolytica a zmiešaná kultúra Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia. Kultivácia prebehla staticky pri 30 °C po dobu 8 dní, výsledná koncentrácia KM bola 50 mg·l-1. U kvasiniek bol ako alternatívne médium použitý Yeast malt bujón (YM) a u zmiešanej kultúry špeciálne médium (A+B médium). Množstvo odstráneného farbiva bolo určené podľa výsledkov merania absorbancie. Hodnoty z troch nezávislých opakovaní boli spriemerované, prevedené na percentá, zanesené do tabuľky (Tabuľka 5.) a porovnané s výsledkami predchádzajúceho pokusu (Tabuľka 4.).

Tabuľka 4. Množstvo odstráneného farbiva vybranými kmeňmi pri použití MPB.

Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 120 144 168 192 Geo 0% 1% 49% 62% - - 73% 75% 77% Yarr 0% 34% 55% 63% - - 72% 73% 73% A+B 0% 66% 69% 72% - - 87% 89% 92%

Tabuľka 5. Množstvo odstráneného farbiva vybranými kmeňmi pri použití alternatívnych médií. Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 120 144 168 192 Geo 0% 1% 15% 17% - - - 67% 72% Yarr 0% 6% 19% 43% - - - 57% 61% A+B 0% 64% 79% 86% - - - 93% 94%

Kultivácia na YM médiu nezlepšila v prípade kvasinky Geotrichum candidum jej schopnosť odstrániť farbivo z roztoku. Z priebehu grafu na Obr. 6. zaznamenávajúceho priebeh kultivácie možno vidieť, že počas prvých troch dní prebiehala eliminácia KM v YM médiu (odstránených 17 %) výrazne pomalšie ako v MPB (odstránených 62 %).

Obr. 6. Porovnanie množstva odstráneného farbiva kvasinkou Geotrichum candidum pri kultivácii na MPB a YM médiu.

Na konci kultivácie, po 192 h, bolo množstvo farbiva odstránené pri použití oboch médií porovnateľné, rozdiel medzi nimi bol len 5 %. Lepšie výsledky však stále boli dosiahnuté pri použití MPB (Obr. 7.).

Obr. 7. Porovnanie množstva eliminovaného farbiva kvasinkou Geotrichum candidum po 192 hodinách kultivácie na dvoch rôznych médiách.

Viditeľne znížené množstvo odstráneného farbiva bolo pozorované počas kultivácie kvasinky Yarrowia lipolytica na YM médiu. Množstvo dekolorizovanej KM bolo, pri použití YM média, za 72 h vyššie ako v prípade G. candidum (Obr. 8.).

Obr. 8. Porovnanie množstva odstránenej KM kvasinkou Yarrowia lipolytica pri kultivácii na MPB a YM médiu.

Počas ďalších 5 dní kultivácie množstvo dekolorizovaného farbiva stúplo. Stále to však bolo menej v porovnaní s kultiváciou na MPB médiu. Kvasinka v YM médiu odstránila za celý čas trvania experimentu (192 h) 61 % azo farbiva. To je o viac než 10 % menej ako pri raste na MPB (Obr. 9.).

Obr. 9. Porovnanie množstva eliminovaného farbiva kvasinkou Yarrowia lipolytica po 192 h kultivácie na dvoch rôznych médiách. 53

U zmiešanej kultúry Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia prinieslo použitie špeciálneho média (A+B médium) lepšie výsledky ako pri kultivácii na MPB. Na začiatku, po 24 h, boli hodnoty veľmi podobné pre obe médiá. S predlžujúcou sa dĺžkou kultivácie sa prejavil pozitívny vplyv špeciálneho A+B média a výsledky sa začali odlišovať. Dekolorizácia v ňom prebiehala rýchlejšie, viac než 80 % KM bolo odstránených už za prvých 72 h (Obr. 10.).

Obr. 10. Porovnanie množstva odstráneného farbiva zmiešanou kultúrou Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia pri kultivácii na MPB a A+B médiu.

Špeciálne médium prispelo aj ku celkovo väčšiemu množstvu odstráneného farbiva. Po 192 h a skončení pokusu zostalo v roztoku len 6 % farbiva. Pri porovnaní s MPB je to za rovnaký čas kultivácie len o 2 % percentá viac, čo je malý rozdiel (Obr. 11.).

Obr. 11. Porovnanie množstva eliminovanej KM kvasinkou Yarrowia lipolytica po 192 h kultivácie na dvoch rôznych médiách. 54

7.1.3. Vplyv teploty na dekolorizáciu farbiva KM mikroorganizmami V tomto experimente bol sledovaný účinok rozdielnych teplôt kultivácie na rýchlosť dekolorizácie KM. Zvolené boli tri teploty – 20, 25 a 35 °C. Na základe výsledkov z predchádzajúcich pokusov bola skrátená dĺžka trvania experimentu na 96 h. Mikroorganizmy boli tak ako predtým kultivované staticky a výsledná koncentrácia farbiva bola 50 mg·l-1. Vplyv teploty bol hodnotený na základe zmien absorbancie vzoriek a uvedený v percentách v príslušnej tabuľke.

Teplota 20 °C Teplota 20 °C výrazne vplývala na množstvo odstránenej KM mikroorganizmami. U väčšiny z nich bolo za prvých 24 h dekolorizované len malé množstvo farbiva (Tabuľka 6.). Najnižšie hodnoty boli namerané u Pseudomonas sp. CCM 4307, Pseudomonas pictorum CCM 284, Yarrowia lipolytica, Geotrichum candidum a Arthrobacter crystallopoietes. Množstvo eliminovaného farbiva sa u týchto kmeňov začalo pozvoľna zvyšovať po 48 hodinách kultivácie (Obr. 12.).

Tabuľka 6. Množstvo odstráneného farbiva vybranými kmeňmi kultivovanými pri 20 °C.

Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 B. cer 24 0% 41% 59% 61% 64% PS 4307 0% 4% 17% 42% 57% Geo 0% 15% 20% 30% 38% B. cer 98 0% 52% 63% 64% 67% PS 284 0% 4% 20% 46% 59% Yarr 0% 6% 21% 37% 51% A+B 0% 59% 63% 66% 67% Arth 0% 3% 22% 52% 61% B. subt D 0% 33% 58% 65% 66% B. cer R 0% 20% 59% 64% 65%

Baktériám rodu Bacillus, predovšetkým B. cereus CCM 24 a B. cereus CCM 98 robila teplota 20 °C menšie problémy.V porovnaní s ostatnými kmeňmi odstránili za 24 hodín viac než 40 % korostanovej modrej. Ešte lepšie výsledky dosiahla zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia, ktorá dekolorizovala za prvých 24 h takmer 60 % farbiva.

Aj keď na začiatku, po 24 hodinách, boli pozorovateľné výrazné rozdiely medzi jednotlivými kmeňmi, na konci pokusu sa tieto rozdiely zmenšili (Obr. 12.). Celkové množstvo odstránenej KM sa pohybovalo u väčšiny kmeňov medzi 51 % - 67 %. Výnimkou bola kvasinka G. candidum, ktorá dekolorizovala len 38 % farbiva.

Obr. 12. Množstvo eliminovaného farbiva KM z roztoku pri teplote 20 °C.

Teplota 25 °C U niektorých kmeňov bol po 24 h pozorovaný negatívny vplyv teploty 25 °C na množstvo dekolorizovanej KM. Obidve kvasinky, Geotrichum candidum a Yarrowia lipolytica, odstránili minimálne množstvo KM – 1 % a 5 %. Navyše, u A. crystallopoietes a Geotrichum candidum prebiehalo zvyšovanie množstva odstráneného farbiva len pomaly. Zmena nastala až po 72 hodinách kultivácie (Tabuľka 7.). Ostatné kmene odstránili viac než 50 % KM za kratší čas (48 hodín). Po ďalších 48 hodinách kultivácie však u nich tieto hodnoty stúpli len minimálne (Obr. 13.).

Tabuľka 7. Množstvo odstráneného farbiva vybranými kmeňmi kultivovanými pri 25 °C. Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 B. cer 24 0% 50% 61% 66% 68% PS 4307 0% 14% 57% 67% 68% Geo 0% 1% 10% 40% 56% B. cer 98 0% 60% 66% 68% 69% PS 284 0% 36% 62% 70% 70% Yarr 0% 13% 44% 59% 66% A+B 0% 64% 66% 71% 73% Arth 0% 5% 23% 55% 62% B. subt D 0% 61% 65% 68% 71% B. cer R 0% 56% 64% 67% 69%

Obr. 13. Množstvo eliminovaného farbiva KM z roztoku pri teplote 25 °C.

Najúspešnejšia zo všetkých bola zmiešaná kultúra Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia, ktorá po 96 h odstránila 73 % farbiva. V porovnaní so schopnosťou dekolorizovať pri 20 °C je to nárast o 6 %. Pseudomonas pictorum CCM 284 a Bacillus subtilis D boli ďalšie kmene, ktoré dekolorizovali 70 % a viac korostanovej modrej. Celkovo bolo možné u testovaných mikroroganizmov pozorovať nárast v množstve odstráneného farbiva pri porovnaní s teplotou 20 °C.

Teplota 35 °C Kultivácia pri 35 °C spôsobila nárast množstva eliminovaného farbiva u takmer všetkých vybraných kmeňov. Výnimkou je Arthrobacter crystallopoietes a hlavne Yarrowia lipolytica. Týmto organizmom teplota vôbec nevyhovovala a ich dekolorizačná aktivita bola minimálna (Tabuľka 8.). Okrem obidvoch zástupcov rodu Pseudomonas a kvasinky Geotrichum candidum, odstránili Bacillus cereus CCM 24, B. cereus CCM 98, B. cereus R a B. subtilis D viac ako 50 % farbiva už počas prvých 24 h. Spočiatku rýchla eliminácia KM sa s predlžujúcou sa dobou kultivácie spomalila (Obr. 14.). Množstvo farbiva v roztoku klesalo len o 2 – 8 % za deň.

Tabuľka 8. Množstvo odstráneného farbiva vybranými kmeňmi kultivovanými pri 35 °C. Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 B. cer 24 0% 53% 66% 70% 71% PS 4307 0% 40% 63% 65% 69% Geo 0% 2% 13% 62% 64% B. cer 98 0% 69% 70% 77% 80% PS 284 0% 39% 61% 63% 65% Yarr 0% 6% 7% 7% 7% A+B 0% 67% 71% 79% 86% Arth 0% 1% 8% 20% 38% B. subt D 0% 53% 69% 72% 74% B. cer R 0% 66% 70% 73% 75%

Obr. 14. Množstvo eliminovaného farbiva KM z roztoku pri teplote 35 °C.

Zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia aj pri teplote 35 °C potvrdila svoju dominanciu. Na konci experimentu odstránila po 96 h až 86 % KM. Tejto hodnote sa spomedzi ostatných kmeňov priblížil len B. cereus CCM 98 s rovnými 80 %. U ostatných zástupcov rodu Bacillus to bolo najviac 75 %. Pseudomonas pictorum CCM 284 a Pseudomonas sp. CCM 4307 dekolorizovali podobné množstvo farbiva, 65 % a 69 %.

Do Tabuľky 9. boli za účelom porovnania zaznamenané výsledky dekolorizácie po 72 hodinách z kultivácií pri štyroch rôznych teplotách – 20, 25, 30 a 35 °C.

Tabuľka 9. Množstvo odstráneného farbiva po 72 h pri rôznych teplotách. Teplota Kmene 20°C 25°C 30°C 35°C B. cer 24 61% 66% 71% 70% PS 4307 42% 67% 71% 65% Geo 30% 40% 62% 62% B. cer 98 64% 68% 68% 77% PS 284 46% 70% 65% 63% Yarr 37% 59% 63% 7% A+B 66% 71% 72% 79% Arth 52% 55% 54% 20% B. subt D 65% 68% 71% 72% B. cer R 64% 67% 70% 73%

Z nameraných hodnôt vyplýva, že so stúpajúcou teplotou rastie u viacerých kmeňov aj množstvo dekolorizovaného farbiva. Platí to pre rod Bacillus, kde bol v čase 72 h pozorovaný nárast pri 35 °C v priemere o 8 % v porovnaní s nižšími teplotami 20 a 25 °C. Výnimkou je Bacillus cereus CCM 24, ktorý po 72 hodinách naopak efektívnejšie eliminoval farbivo pri 30 °C a pri teplote 35 °C zaznamenal mierny pokles.

Zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia rovnako odstránila väčšie množstvo KM počas kultivácie pri 25 °C a 35 °C. Takmer 80 % farbiva bolo dekolorizovaných pri teplote 35 °C za 72 hodín. Opačný prípad bol Arthrobacter crystallopoietes, ktorý pri tejto teplote a za rovnaký čas zaznamenal prudký pokles o viac než 30 %. Jemu sa najlepšie darilo pri 25 °C – odstránil 55 % KM za 72 h.

Pseudomonas sp. CCM 4307 sa mierne líšila od P. pictorum CCM 284 vo svojej reakcii na zmenenú teplotu. Za 72 hodín odstránila najviac farbiva prvá menovaná pri 30 °C, zatiaľ čo druhá pri 25 °C. Najhoršie výsledky dosiahli spoločne pri teplote 20 °C.

Výrazné rozdiely v pôsobení teploty na proces dekolorizácie KM boli u kvasiniek Geotrichum candidum a Yarrowia lipolytica. Pozitívne na zvyšovanie teploty reagovala Geotrichum candidum. Pri 30 a 35 °C odstránila najväčšie množstvo KM a odlišnosti medzi týmito teplotami boli malé. Pre kvasinku Y. lipolytica mala kultivácia pri teplote 35 °C naopak veľmi negatívne dôsledky. V porovnaní so svojím maximom 63 %, dosiahnutým pri 30 °C, bolo pri zvýšení teploty o 5 °C dekolorizovaných len 7 % farbiva.

Celkovo sa pre väčšinu testovaných kmeňov ako najoptimálnejšie teploty ukázali 30 a 35 °C (Obr. 15.). Najväčšie rozdiely boli pozorované pri teplote 35 °C, preto pre nasledujúce pokusy bola napokon zvolená teplota 35 °C.

Obr. 15. Porovnanie vplyvu rôznej teploty na množstvo eliminovanej KM po 72 h. 60

7.1.4. Vplyv spôsobu kultivácie na dekolorizáciu farbiva KM mikroorganizmami Jedným z parametrov ovplyvňujúcich aktivitu mikrobiálnej kultúry je spôsob kultivácie. Všetky doterajšie pokusy prebehli pri statických podmienkach. Cieľom tohto experimentu bolo kultivovať vybrané kmene submerzne pri teplote 35 °C, koncentrácii farbiva 50 mg·l-1 a získané výsledky porovnať so statickou kultiváciou. Dekolorizácia bola hodnotená na základe zmien v absorbancii vzoriek testovaných kmeňov.

Tabuľka 10. Množstvo odstráneného farbiva pri submerznej kultivácii.

Doba kultivácie (hod) Kmene 0 24 48 72 96 B. cer 24 0% 67% 66% 66% 67% PS 4307 0% 22% 41% 58% 57% Geo 0% 20% 15% 32% 34% B. cer 98 0% 61% 65% 67% 66% PS 284 0% 59% 65% 62% 61% Yarr 0% 18% 22% 22% 21% A+B 0% 60% 65% 66% 66% Arth 0% 14% 64% 70% 70% B. subt D 0% 62% 65% 66% 66% B. cer R 0% 64% 66% 67% 65%

Submezná kultivácia pri teplote 35 °C spôsobila, že viacero kmeňov odstránilo viac než 60 % KM hneď v prvý deň (Tabuľka 10.) a počas nasledujúcich dní toto množstvo stúplo len nepatrne (Obr. 16.). Výnimku predstavovali Arthrobacter crystallopoietes, Geotrichum candidum a Pseudomonas sp. CCM 4307.

Obr. 16. Množstvo eliminovanej KM z roztoku počas submerznej kultivácie. 61

Arthrobacter crystallopoietes hranicu 60 % prekonal za 48 h a nakoniec odstránil najviac farbiva zo všetkých (70 %). Kvasinkám Geotrichum candidum a Yarrowia lipolytica podmienky nevyhovovali a za 96 hodín dekolorizovali iba 21 % a 34 % azo farbiva.

Obr. 17. Porovnanie množstva eliminovaného farbiva z roztoku pri statickej a submerznej kultivácii.

Celkové množstvo odstráneného farbiva na konci experimentu bolo prevažne nižšie pri submerznej ako statickej kultivácii (Tabuľka 11.). Jedine u kvasinky Yarrowia lipolytica, a baktérie Arthrobacter crystallopoietes boli pozorované lepšie výsledky (Obr. 17.).

Tabuľka 11. Množstvo odstránenej KM pri statickej a submerznej kultivácii po 24 a 96 h.

24 hod 96 hod Kmene Staticky Submerzne Staticky Submerzne B. cer 24 53% 67% 71% 67% PS 4307 40% 22% 69% 57% Geo 2% 20% 64% 34% B. cer 98 69% 61% 80% 66% PS 284 39% 59% 65% 61% Yarr 6% 18% 7% 21% A+B 67% 60% 86% 66% Arth 1% 14% 38% 70% B. subt D 53% 62% 74% 66% B. cer R 66% 64% 75% 65%

Yarrowia lipolytica kultivovaná submerzne dekolorizovala o 14 % viac farbiva než pri statickej kultivácii. Na konci pokusu, po 96 h, však bolo množstvo odstránenej KM stále nízke (21 %). Arthrobacter crystallopoietes dosiahol po 96 h nárast o 32 % v porovnaní so statickými podmienkami.

7.1.5. Vplyv koncentrácie farbiva na jeho dekolorizáciu mikroorganizmami Cieľom tohto pokusu bolo zistiť vplyv počiatočnej koncentrácie farbiva, čo je významný parameter ovplyvňujúci dekolorizáciu farbiva. Zvolené boli koncentrácie: 50, 100 a 300 mg·l-1. Kultivácia bola uskutočnená staticky, pri 35 °C. Výsledky v percentách, vypočítané na základe absorbancie, boli porovnané a zapísané do Tabuľky 12.

Tabuľka 12. Množstvo odstráneného farbiva pri rôznych počiatočných koncentráciách KM.

Počiatočná koncentrácia a doba kultivácie (hod) Kmene 300 mg/l 100 mg/l 50 mg/l 24 96 24 96 24 96 B. cer 24 15% 59% 60% 68% 53% 71% PS 4307 24% 44% 14% 48% 40% 69% Geo 35% 78% 0% 31% 2% 64% B. cer 98 10% 5% 63% 66% 69% 80% PS 284 39% 57% 57% 64% 39% 65% Yarr 9% 31% 14% 20% 6% 7% A+B 48% 58% 62% 68% 67% 86% Arth 9% 55% 2% 69% 1% 38% B. subt D 5% 4% 0% 66% 53% 74% B. cer R 13% 52% 61% 67% 66% 75%

Podľa očakávaní spôsobila najvyššia počiatočná koncentrácia 300 mg·l-1 výrazné zníženie v množstve odstráneného farbiva za prvých 24 hodín. Väčšina z testovaných kmeňov neodstránila viac než 15 % (Obr. 18.). Najúspešnejšia bola dekolorizácia u zmiešanej kultúry A. sulphureus + B. cepacia (48 %), nasledovanej Pseudomonas pictorum CCM 284 a kvasinkou Geotrichum candidum. Na konci experimentu, po 96 h, však v množstve odstráneného farbiva viedla G. candidum – dosiahla takmer 80 % (Obr. 18.). Druhým mikroorganizmom bol B. cereus CCM 24 (odstránil 59 %) a zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia.

Takmer nulové množstvo KM bolo dekolorizované baktériou B. subtilis D. Za 96 h, dobu trvania celého experimentu, to boli len 4 %. Takisto B. cereus CCM 98 odstránil za rovnaký čas iba malé množstvo farbiva (5 %).

Obr. 18. Porovnanie množstva eliminovaného farbiva z roztoku po 24 h pri rôznych počiatočných koncentráciách farbiva.

Zníženie počiatočnej koncentrácie KM z 300 na 100 mg·l-1 prinieslo zaujímavé výsledky. Geotrichum candidum, Arthrobacter crystallopoietes a B. subtilis D odstránili z roztoku počas prvého dňa malé až žiadne množstvo farbiva (Tabuľka 12.). Nízke množstvo dekolorizovaného farbiva bolo pozorované aj pri kvasinke Y. lipolitica a baktérii Pseudomonas sp. CCM 4307, obidve zhodne odstránili 14 %. Z grafu na Obr. 18. je možné vidieť, že po 24 hodinách od začiatku kultivácie dosiahli najvyššie hodnoty odstráneného azo farbiva kmene Bacillus cereus CCM 24, Bacillus cereus CCM 98, Bacillus cereus R, Pseudomonas pictorum CCM 284 a zmiešaná kultúra Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia. Pokračovanie kultivácie u nich nezvýšilo množstvo dekolorizovanej KM o veľa (Tabuľka 12.).

Až na kvasinky G. candidum a Y. lipolytica a baktériu Pseudomonas sp. CCM 4307, eliminovali všetky ostatné testované kmene po 96 h kultivácie viac než 60 % farbiva v roztoku. Najlepšie výsledky pri koncentrácii 100 mg·l-1 dosiahol Arthrobacter crystallopoietes, ktorý síce za prvých 24 h odstránil iba 2 %, ale po 96 h to bolo až 69 % korostanovej modrej.

Obr. 19. Porovnanie množstva eliminovaného farbiva z roztoku po 96 h pri rôznych počiatočných koncentráciách farbiva.

Porovnaním výsledkov získaných z kultivácií po 96 hodinách pri koncentráciách 50, 100 a 300 mg·l-1 bolo možné v grafe vidieť mierny rast množstva odstráneného farbiva spoločne s klesajúcou hodnotou koncentrácie (Obr. 19.). Neplatilo to však pre všetky testované kmene. U kvasinky Yersinia lipolytica bol trend presne opačný a Geotrichum candidum napríklad najviac vyhovovala koncentrácia 300 mg·l-1. Naproti tomu Arthrobacter crystallopoietes odstránil za 96 hodín pri počiatočnej koncentrácii 100 mg·l-1 o 30 % viac farbiva v porovnaní s koncentráciou 50 mg·l-1 a o 14 % väčšie množstvo než pri 300 mg·l-1.

7.2. Dekolorizácia korostanovej modrej nerastúcimi bunkami Séria experimentov s nerastúcimi bunkami mala za cieľ zistiť, ako sú schopné takéto bunky dekolorizovať farbivo korostanová modrá. Použité boli rovnaké kmene ako v predchádzajúcich experimentoch s rastúcou kultúrou. Mikroorganizmy v tejto batérii pokusov boli najprv inkubované submerzne počas 2 – 3 dní v MPB s celkovým objemom kultúry 1l pre každý kmeň. Následne „scentrifugovaná“ a premytá bunková biomasa bola rozpustená v 30 a neskôr 15 ml 0,2 mol tris pufru (pH=7,2).

Samotné experimenty s dekolorizáciou trvali 150 min a inkubácia sa vykonala za stáleho trepania v termostate pri 35 °C, s výnimkou experimentu s vplyvom teploty na rýchlosť dekolorizácie. Vykonané boli v Erlenmayerových bankách s objemom 100 ml, ktoré obsahovali 20 a 10 ml 0,2 M tris pufru (pH= 7,2). Do baniek sa následne pridalo 10 a 5 ml suspenzie buniek. Farbivo korostanová modrá bolo pridané do výslednej koncentrácie 50, 100 a 300 mg·l-1.

Enzymatické reakcie prebiehajú veľmi rýchlo a dekolorizácia farbiva začína už v momente jeho pridania ku bunkovej suspenzii. Preto vzorky odobraté v „čase 0 min“ vykazovali pokles v absorbancii, ak boli porovnané s absorbanciou farbiva bez pridaných buniek (skutočných 0 min). Z tohto dôvodu boli vo všetkých experimentoch vzorky odobraté tesne po pridaný farbiva označované ako čas 0* min. Dekolorizácia bola teda hodnotená ako zmena absorbancie supernatantu po odstránení buniek centrifugáciou v porovnaní s absorbanciou v čase 0 min. Merania absorbancie boli začaté v čase 0* min a potom v 30 min intervaloch na spektrofotometri (Cary 100 UV-Vis).

Kmene B. cer 98 Arth A+B B. cer R B. subt D Sušina (mg)/1 ml 9,00 11,50 12,15 13,95 18,78 Sušina (mg)/10 ml 90 115 121,5 139,5 187,75 %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min 0* 0,316% 0,230% 0,192% 0,150% 0,188% 30 0,593% 0,020% 0,321% 0,011% 0,379% 0,013% 0,262% 0,009% 0,308% 0,010% Doba 60 0,664% 0,011% 0,344% 0,006% 0,482% 0,008% 0,278% 0,005% 0,346% 0,006% kultivácie 90 0,671% 0,007% 0,337% 0,004% 0,497% 0,006% 0,278% 0,003% 0,344% 0,004% (hod) 120 0,663% 0,006% 0,386% 0,003% 0,474% 0,004% 0,269% 0,002% 0,339% 0,003% 150 0,647% 0,004% 0,396% 0,003% 0,465% 0,003% 0,270% 0,002% 0,325% 0,002%

Kmene Geo Yarr PS 284 PS4307 B. cer 24 Sušina (mg)/1 ml 12,90 12,10 12,30 12,65 16,00 Sušina (mg)/10 ml 129 121 123 126,5 160 %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min %/ mg %/mg/min 0* 0,304% 0,040% 0,102% 0,079% 0,097% 30 0,372% 0,012% 0,128% 0,004% 0,326% 0,011% 0,099% 0,003% 0,226% 0,008% Doba 60 0,397% 0,007% 0,127% 0,002% 0,367% 0,006% 0,074% 0,001% 0,291% 0,005% kultivácie 90 0,393% 0,004% 0,135% 0,002% 0,365% 0,004% 0,064% 0,001% 0,325% 0,004% (hod) 120 0,389% 0,003% 0,120% 0,001% 0,362% 0,003% 0,045% 0,000% 0,334% 0,003% 150 0,390% 0,003% 0,105% 0,001% 0,352% 0,002% 0,082% 0,001% 0,339% 0,002%

Tabuľka 13. Množstvo odstráneného farbiva nerastúcimi bunkami vybraných kmeňov. Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

7.2.1. Dekolorizácia korostanovej modrej nerastúcimi bunkami pri 35 °C Kvôli stanoveniu schopnosti odfarbovať roztok KM, bola suspenzia nerastúcich buniek inkubovaná staticky pri 35 °C po dobu 2,5 hodiny v 0,2 mol tris pufre (ph= 7,2). Erlenmayerova banka obsahovala 20 ml pufru a 10 ml bunkovej suspenzie. Výsledná koncentrácia farbiva bola 50 mg·l-1. Zmeny absorbancie vzorky sa zmerali na začiatku (v čase 0*) a každých 30 min. Na základe týchto výsledkov sa stanovilo množstvo odstráneného farbiva. Priemerné hodnoty, získané z troch nezávislých opakovaní, sú uvedené v percentách a prepočítané na 1 mg bakteriálnej sušiny (Tabuľka 13.).

Obr. 20. Množstvo korostanovej modrej odstránenej 1 mg sušiny za 1 min.

V Obrázku 20. možno vidieť klesajúci trend v množstve odstránenej KM na 1 mg bakteriálnej sušiny za 1 min. Najvyššia aktivita bola na začiatku po prvých 30 minútach. Najlepší z mikroorganizmov v tomto čase, ale aj celkovo, bol Bacillus cereus CCM 98. Nasledovala ho zmiešaná kultúra Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia a kvasinka Geotrichum candidum. Jej aktivita za prvú polhodinu predstihla inú kvasinku, Yarrowia lipolytica, o viac ako polovicu. Tento rozdiel sa však o ďalších 30 minút zmenšil. U oboch pseudomonád, Pseudomonas pictorum CCM 284 a Pseudomonas sp. CCM 4307, pretrvali veľké rozdiely počas celého experimentu. Na mg sušiny odstránila P. pictorum CCM 284 za 1 min trikrát väčšie množstvo KM v porovnaní s Pseudomonas sp. CCM 4307. S postupujúcou dobou trvania pokusu si P. pictorum CCM 284 stále zachovávala značný „náskok“ pred Pseudomonas sp. CCM 4307.

Zástupcovia rodu Bacillus sa podľa výsledkov z Tabuľky 13. zaradili niekde medzi najlepšie (Bacillus cereus CCM 98) a najhoršie testované kmene (Pseudomonas sp. CCM 4307).

Obr. 21. Množstvo odstránenej korostanovej modrej (na 1 mg sušiny). Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Po prepočítaní dekolorizovaného farbiva na miligram sušiny boli v čase 0* min zaznamenané zaujímavé výsledky (Obr. 21.). Podľa nich môžeme testované kmene rozdeliť v tomto čase do troch skupín. Prvá obsahuje Bacillus cereus CCM 98 spolu s Geotrichum candidum a oba kmene odstránili najviac farbiva po prepočte na miligram sušiny. Približne o tretinu menšie množstvo KM eliminovali baktérie Arthrobacter crystallopoietes, Bacillus cereus R, Bacillus subtilis D a zmiešaná kultúra A. sulphureus + B. cepacia. Poslednej skupine, zahŕňajúcej Yarrowia lipolytica, Pseudomonas pictorum CCM 284, Pseudomonas sp. CCM 4307 a Bacillus cereus 24, sa podarilo v čase 0* min odstrániť len o trochu viac než 0,1% KM na 1 mg suchej bakteriálnej hmoty. Ďalšie výsledky z pokračovania dekolorizácie ukazovali u väčšiny skúmaných kmeňov na spočiatku rastúce množstvo dekolorizovaného azo farbiva na 1 mg sušiny. Po 90 min bolo badať jeho mierny pokles. Najmenej farbiva odstránila Pseudomonas sp. CCM 4307. U nej s predlžovaním inkubácie množstvo eliminovaného farbiva stúpalo minimálne.

7.2.2. Vplyv teploty na dekolorizáciu korostanovej modrej nerastúcimi bunkami Porovnanie dekolorizačných schopností vybraných kmeňov v závislosti na rozdielnej teplote inkubácie bolo cieľom tejto skupiny experimentov. Statická inkubácia suspenzie nerastúcich buniek prebehla pri 25, 30 a 35 °C. Dĺžka inkubácie bola 2,5 hodiny. Do 100 ml Erlenmayerovej banky sa pridalo 10 ml pufru (0,2 mol tris pufor; ph= 7,2) a 5 ml bunkovej suspenzie. Počiatočná koncentrácia farbiva bola 50 mg·l-1. Na počiatku experimentu, v čase 0* min, a každých 30 min boli merané zmeny absorbancie vzoriek.

Teplota 25 °C

Obr. 22. Množstvo odstránenej korostanovej modrej pri 25 °C (na 1 mg sušiny za 1 min).

Bacillus cereus CCM 98 a B. cereus CCM 24 boli kmene, ktoré mali počas inkubácie pri teplote 25 °C najväčšiu dekolorizačnú aktivitu. Po 30 min od začatia inkubácie obidva odstránili 0,025 % korostanovej modrej na 1 mg sušiny za 1 min a Bacillus cereus CCM 98 túto hodnotu dokonca prekonal. Za ďalších 30 min už došlo k poklesu ich aktivity a ten pokračoval až do konca experimentu. Rovnako sa správali aj ostatné skúmané mikroorganizmy, ako je to zrejmé z Obrázka 22. Dekolorizačná aktivita Bacillus cereus R, Bacillus subtilis D, Geotrichum candidum a Pseudomonas pictorum CCM 284 bola v porovnaní s B. cereus CCM 98 a tiež B. cereus CCM 24 polovičná. Najviac táto teplota nevyhovovala baktérii Arthrobacter crystallopoietes a kvasinke Yarrowia lipolytica, namerané boli u nich len podpriemerné hodnoty.

Obr. 23. Množstvo odstránenej korostanovej modrej pri 25 °C (na 1 mg sušiny). Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Pozitívny účinok teploty 25 °C na dekolorizáciu korostanovej modrej môže byť videný na Obrázku 23. Väčšina z testovaných kmeňov tu prekonáva, alebo sa aspoň významne približuje ku odstráneniu 0,5 % KM na 1 mg sušiny. Zatiaľ čo najlepší z nich, Bacillus cereus CCM 98 a Bacillus cereus CCM 124, hravo prekonávajú 0,8 % na 1 mg bakteriálnej sušiny, Arthrobacter crystallopoietes a Yarrowia lipolytica sú schopné dekolorizovať iba malé množstvo farbiva. U takmer všetkých testovaných kmeňov dochádzalo počas inkubácie ku postupnému zvyšovaniu množstva odstráneného farbiva. Po 120 a 150 min však už u viacerých z nich nastávala stagnácia (napr. Bacillus subtilis D) alebo pokles (Arthrobacter crystallopoietes, Pseudomonas pictorum CCM 284).

Teplota 30 °C Teplota 30 °C vplývala na dekolorizačnú aktivitu väčšiny testovaných kmeňov pozitívne. Znova bol prítomný ostrý pokles medzi vzorkami odobranými v čase 30 a 60 min. Aktivita Arthrobacter crystallopoietes a Bacillus subtilis D dosiahla porovnateľné hodnty a bola najvyššia zo všetkých kmeňov (Obr. 24.).

Obr. 24. Množstvo odstránenej korostanovej modrej pri 30 °C (na 1 mg sušiny za 1 min).

Na druhej strane dekolorizačná aktivita kvasinky Yarrowia lipolytica bola najnižšia pri porovnaní s ostatnými mikroorganizmami testovanými v tomto experimente. Lepšie výsledky, v niektorých prípadoch aj trojnásobne, boli pozorované u kmeňa Pseudomonas sp. CCM 4307 a P. pictorum CCM 284, zmiešaná kultúra Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia, ale aj baktérie Bacillus cereus R, B. cereus CCM 24 či B. cereus CCM 98.

Obr. 25. Vplyv inkubácie pri 30 °C na množstvo odstránenej korostanovej modrej (prepočítané na 1 mg sušiny). Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Výraznejší vzrast a následný pokles množstva dekolorizovaného farbiva bol zaznamenaný počas inkubácie pri 30 °C u kmeňov Bacillus cereus CCM 98, Arthrobacter crystallopoietes, zmiešanej kultúry Arthrobacter + Burkholderia, P. pictorum CCM 284 a Pseudomonas sp. CCM 4307. „O prvenstvo“ v najväčšom množstve dekolorizovaného farbiva na 1 mg suchej biomasy sa delia A. crystallopoietes, B. subtilis D a Bacillus cereus CCM 24. V porovnaní s nimi odstránila za dobu inkubácie, 150 min, posledná Yarrowia lipolytica a Pseudomonas sp. CCM 430 približne o dve tretiny menej korostanovej modrej. U baktérií Bacillus cereus R a Bacillus cereus CCM 24 je pozorovateľné zníženie množstva odstránenej KM od 90 minúty (Obr. 25.).

Obrázok 26. zachytáva porovnanie vplyvu teploty na dekolorizačnú aktivitu testovaných mikroorganizmov. Pri teplote 35 °C bola najväčšia aktivita zaznamenaná u Bacillus cereus CCM 98. Na druhej strane, pre neho nebola táto teplota najoptimálnejšia a v porovnaní s nižšími teplotami, 30 a 25 °C, dosiahol horšie výsledky. Podobný účinok teploty 35 °C, nízka dekolorizačná aktivita, bol zaznamenaný aj pri ostatných skúmaných kmeňoch (Obr. 26.).

Obr. 26. Porovnanie rôznych teplôt inkubácie a ich vplyv na množstvo odstránenej korostanovej modrej (na 1 mg sušiny za 1 min).

Naopak viditeľne kladný efekt na aktivitu mala teplota 30 °C. Najväčšie množstvo dekolorizovanej KM na 1 mg suchej bakteriálnej hmoty za 1 min pri tejto teplote dosiahli kmene Arthrobacter crystallopoietes, Bacillus cereus R, Bacillus subtilis D, Yarrowia lipolytica a zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia. Najúspešnejším z nich bol Arthrobacter crystallopoides.

Teplota 25 °C vyhovovala najviac baktériám Bacillus cereus CCM 98, Geotrichum candidum, Pseudomonas pictorum CCM 284, Pseudomonas sp. CCM 4307 a Bacillus cereus CCM 24. Pri porovnaní so všetkými ostatnými teplotami a skúmanými kmeňmi dosiahol B. cereus CCM 98 práve pri 25 °C najvyššiu dekolorizačnú aktivitu. Tiež pri nej, spoločne s teplotou 30 °C, bol pozorovaný najstrmší pokles v dekolorizačnej aktivite u mikroorganizmov počas prvých 60 min inkubácie (Obr. 26.).

Obr. 27. Porovnanie rôznych teplôt inkubácie a ich vplyv na množstvo dekolorizovanej korostanovej modrej (na 1 mg sušiny). Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Množstvo odstráneného farbiva na miligram sušiny vzrástlo u majority testovaných kmeňov spoločne s ich inkubáciou pri nižších teplotách (Obr. 27.). Najviac kmeňov dosiahlo najlepšie výsledky pri 25 °C. Dominovali tu baktérie Bacillus cereus CCM 24 a Bacillus cereus CCM 98. Najmenej táto teplota vyhovovala druhu Arthrobacter crystallopoietes, ktorý bol úspešnejší pri 30 °C a odstránil vtedy takmer sedemnásobne viac KM v porovnaní s 25 °C. Zvýšenie teploty na 30 °C vyhovovalo okrem A. crystallopoietes aj zmiešanej kultúre Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia, Bacillus cereus R a B. subtilis D. Väčšina skúmaných mikroorganizmov dosiahla najhoršie výsledky pri teplote 35 °C a len málo z nich sa vtedy priblížilo ku dekolorizovaniu aspoň 0,5 % korostanovej modrej na miligram sušiny. Inkubácia pri 35 °C sa najnegatívnejšie prejavila u suspenzie buniek Pseudomonas sp. CCM 4307. Z Obrázku 21. tiež vyplýva, že počas inkubácie pri 25, 30 a 35 °C stúpalo spoločne s rastúcou dobou jej trvania aj percento dekolorizovaného farbiva pri polovici testovaných kmeňov. Pokles bol naopak zaznamenaný u Arthrobacter crystallopoietes pri 25 °C alebo Pseudomonas sp. CCM 4307 pri 35 °C. Stagnácia po počiatočnom vzostupe množstva odstráneného azo farbiva bola pozorovaná napríklad u Bacillus cereus R (30 a 35 °C), Pseudomonas pictorum CCM 284 (35 °C) či Geotrichum candidum (35 °C).

7.2.3. Vplyv hodnoty pH na dekolorizáciu korostanovej modrej nerastúcimi bunkami Posledná séria experimentov sa venovala vplyvu hodnoty pH na dekolorizačné schopnosti vybraných kmeňov. Inkubácia suspenzie nerastúcich buniek, s dĺžkou 2,5 hod, prebehla staticky pri 35 °C. Erlenmayerova banka obsahovala 10 ml 0,2 mol tris pufru s hodnotou pH= 7; 7,2 a 7,4. Ďalej bolo do nej pridaných 5 ml bunkovej suspenzie. Pred pridaním farbiva, ak to bolo nevyhnutné, sa pH upravilo na požadovanú hodnotu. Počiatočná koncentrácia farbiva bola 50 mg·l-1. Meranie absorbancie vzoriek testovaných kmeňov prebehlo na začiatku v čase 0* min a potom každých 30 min do skončenia experimentu. pH 7

Obr. 28. Inkubácia pri pH= 7 a jeho vplyv na množstvo dekolorizovanej korostanovej modrej (na 1 mg za 1 min).

Najnižším použitým pH pre dekolorizáciu farbiva počas inkubácie bolo 7. Na začiatku inkubácie po 30 minútach, boli viditeľné značné rozdiely medzi jednotlivými kmeňmi (Obr. 28.). Najvyššiu dekolorizačnú aktivitu tu dosiahol Bacillus cereus CCM 98. O niečo menšia aktivita bolo zaznamenaná u Bacillus cereus CCM 24 a aj u Geotrichum candidum. Množstvo dekolorizovaného farbiva, 0,0015 % na 1 mg za 1 min, prekročili okrem hore uvedených kmeňov aj Pseudomonas sp. CCM 4307, P. pictorum CCM 284 a Bacillus subtilis D.

Najmenšia aktivita bola prítomná u Arthrobacter crystallopoietes a Yarrowia lipolytica. Predlžovanie inkubácie spôsobilo pokles dekolorizačnej aktivity u všetkých kmeňov, v prípade zmiešanej kultúry Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia poklesla aktivita takmer na nulu (Obr. 28.). Rozdiely prítomné na začiatku, v čase 30 min, sa v niektorých prípadoch stratili či zmenšili. Príkladom sú obe pseudomonády, ktorých aktivita po 150 min bola veľmi podobná.

Obr. 29. Množstvo odstráneného farbiva pri pH= 7 (na 1 mg sušiny). Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Ako je zrejmé z Obrázku 29., celkové množstvo odstráneného farbiva rástlo spoločne s dĺžkou inkubácie u väčšiny testovaných kmeňov. Výnimkou bola jedine zmiešaná kultúra Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia, tá zaznamenala postupný pokles množstva dekolorizovanej KM. Spolu s Arthrobacter crystallopoietes a Yarrowia lipolytica odstránili najmenšie množstvo farbiva. Pri pH= 7 bol najlepší Bacillus cereus CCM 98 a eliminoval tak najviac KM zo všetkých kmeňov použitých v tomto experimente.

76 pH 7,4 Bacillus cereus CCM 24 a Bacillus cereus CCM 98 boli dva kmene baktérii, ktorým pH= 7,4 najviac vyhovovalo. Ich dekolorizačná aktivita prekonala hodnoty ostatných kmeňov a bola tak najvyššia. Iná skupina mikroorganizmov, zahŕňajúca zmiešanú kultúru Arthrobacter + Burkholderia, B. cereus R, B. subtilis D a Geotrichum candidum, tiež dosiahla pomerne vysoké hodnoty dekolorizačnej aktivity. Najmenej aktívne boli pri tomto pH baktérie Arthrobacter crystallopoietes, Pseudomonas sp. CCM 4307 a kvasinka Yarrowia lipolytica (Obr. 30.). Rozdiely medzi jednotlivými kmeňmi namerané v čase 30 min od štartu inkubácie pretrvali len s malými zmenami až do konca experimentu.

Obr. 30. Množstvo odstráneného farbiva pri pH= 7,4 (na 1 mg sušiny za 1 min).

Obr. 31. Množstvo odstráneného farbiva pri pH= 7,4 (na 1 mg sušiny) vybranými kmeňmi. Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Podobné závery vyplývajú aj z údajov, ktoré sú graficky znázornené na Obrázku 31. Množstvo dekolorizovanej korostanovej modrej na miligram sušiny bolo najväčšie pri Bacillus cereus CCM 24 a Bacillus cereus CCM 98. Pseudomonas sp. CCM 4307 prekonala 0,1 % KM na 1 mg sušiny a odstránila tak najmenej farbiva zo všetkých testovaných kmeňov. Veľmi podobné hodnoty dosiahla aj trojica kmeňov Bacillus cereus R, Bacillus subtilis D a Geotrichum candidum. Vo väčšine prípadov rástlo množstvo dekolorizovanej KM spoločne s dĺžkou inkubácie. Po 90 min, a u niektorých vzorkách po 120 min, nastal pokles (Yarrowia lipolytica) alebo spomalenie procesu dekolorizácie (Bacillus cereus CCM 24 či B. cereus CCM 98).

Obr. 32. Porovnanie rôznych hodnôt pH a ich vplyv na množstvo odstránenej KM (na 1 mg sušiny za 1 min).

Porovnanie vplyvu pH na dekolorizáciu KM je uvedené na Obrázku 32. Z hodnôt tu uvedených vyplýva, že najväčšia dekolorizačná aktivita buniek bola zaznamenaná pri pH 7. Z testovaných baktérii a kvasiniek vykazoval najvyššiu aktivitu pri odstraňovaní KM Bacillus cereus CCM 98. Vyššie hodnoty v porovnaní s pH 7,2 a 7,4 tu dosiahli aj Geotrichum candidum, Yarrowia lipolytica, Pseudomonas pictorum CCM 284, Pseudomonas sp. CCM 4307. Po 60 min inkubácie nastal prudký pokles v ich dekolorizačnej aktivite, približne na polovicu hodnoty z času 30 min. Ďalšie klesanie už bolo miernejšie a trvalo do konca experimentu. Rovnaký trend bolo možné pozorovať aj pri pH 7,4 u zmiešanej kultúry Arthrobacter + Burkholderia a kmeňov Bacillus cereus R, Bacillus subtilis D a Bacillus cereus CCM 24, ktoré pri tomto pH dosiahli svoju najvyššiu aktivitu. Jediným organizmom, ktorý dosiahol maximálnu aktivitu pri pH 7,2 bol Arthrobacter crystallopoietes. U všetkých ostatných mikroorganizmov toto pH spôsobilo pokles ich dekolorizačnej aktivity, napríklad u Pseudomonas sp. CCM 4307 alebo B. cereus CCM 24 bola až o tretinu menšia.

Obr. 33. Porovnanie rôznych hodnôt pH a ich vplyvu na množstvo dekolorizovanej korostanovej modrej (na 1 mg sušiny). Vysvetlivky: Čas 0* min: vzorky odobraté tesne po pridaní farbiva.

Vztiahnutie množstva dekolorizovanej KM na miligram sušiny umožnilo porovnanie množstva odstráneného farbiva medzi testovanými kmeňmi. Dobré výsledky dosiahli viaceré kmene pri pH 7,4. B. cereus CCM 24 pri ňom odstránil najviac KM v porovnaní z ostatnými kmeňmi, zmiešanou kultúrou Arthrobacter + Burkholderia, Bacillus cereus R a Bacillus subtilis D, pre ktoré bolo pH 7,4 tiež najideálnejšie. Zmiešaná kultúra tu ako jediná zaznamenala postupný pokles v množstve dekolorizovanej KM s predlžujúcou sa inkubáciou (Obr. 33.). Polovica z desiatich mikroorganizmov odstránila najviac KM pri najnižšom pH 7. Z nich bol B. cereus CCM 98 celkovo najúspešnejší, aj v porovnaní s ostatnými použitými mikroorganizmami pri všetkých skúmaných hodnotách pH. Dekolorizoval viac ako 1 % farbiva na 1 mg. Z odstupom ho nasledovali obe kvasinky (Yarrowia lipolytica s Geotrichum candidum) a tiež Pseudomonas sp. CCM 4307 a Pseudomonas pictorum CCM 284, ktoré tiež dosiahli svoje maximum práve pri tomto pH. Najmenej farbiva na miligram odstránili všetky kmene pri pH 7,2. Výnimkou bol jedine Arthrobacter crystallopoietes, ako je možné vidieť na Obrázku 33.

8. Diskusia Korostanové farbivá sú jednou zo skupín azo farbív. Majú široké zastúpenie vo viacerých druhoch priemyslu, predovšetkým kožiarskom a textilnom. Tieto odvetia vyprodukujú ročne tisíce ton odpadovej vody obsahujúcej azo farbivá. Mnohé z nich sú preukázateľne toxické pre vodné živočíchy, rastliny a aj človeka. Predstavujú tak riziko a ohrozujú ľudské zdravie spoločne so životným prostredím.

Konvenčné, fyzikálno-chemické, metódy čistenia sú v mnohých prípadoch neúčinné a azo farbivá sú nimi schopné prejsť bez väčších zmien. Vhodnou alternatívou je preto použitie mikroorganizmov schopných odstrániť tieto farbivá. Dôležitú úlohu hrajú rôzne faktory, napr. teplota, pH, kultivačné podmienky alebo koncentrácia farbiva. Nájdenie optimálnych podmienok môže preto poslúžiť zefektívneniu celého procesu dekolorizácie.

Kultivačné experimenty sú spôsobom ako sledovať vplyv rôznych faktorov na množstvo odstráneného farbiva mikrobiálnou kultúrou. Medzi ich výhody patrí jednoduchá realizácia a nenáročnosť na materiál a chemikálie. Na druhej strane trvanie samotnej kultivácie, niekedy aj niekoľko týždňov, je značnou nevýhodou. Takisto existuje aj riziko kontaminácie kultúry počas odberu vzoriek a tým tiež vznik chybných výsledkov.

Nerastúce bunky a experimenty s nimi sú alternatívou ku dlhotrvajúcim kultiváciám. Práve časová nenáročnosť a možnosť pracovať aj s menšími objemami, umožňuje spracovanie väčšieho množstva vzoriek naraz. Limitujúcim faktorom je nutnosť získať na začiatku dostatočné množstvo bunkovej suspenzie. Pri použití vzoriek s malým objemom (1 ml) môže tiež nedostatočné „sadanie“ niektorých kmeňov počas centrifugácie spôsobiť výrazné skreslenie výsledkov.

Prvá časť experimentálnej práce (Kapitola 7.1.) mala za cieľ preskúmať vplyv rôznych faktorov na dekolorizáciu korostanovej modrej rastúcimi bunkami. Použité boli 3 kmene baktérií, 2 kmene kvasiniek a jedna zmiešaná kultúra. Okrem experimentu s vplyvom teploty na rýchlosť dekolorizácie a experimentu skúmajúceho vplyv spôsobu kultivácie prebehla kultivácia v tejto sérii pokusov staticky v termostate pri 30 °C. Vo všetkých pokusoch bol ako médium použitý MPB, výnimkou bol experiment s vplyvom odlišného chemického zloženia médií. Dekolorizácia bola hodnotená ako zmena absorbancie supernatantu po odstránení buniek. Vzorky sa odoberali v 24 h intervaloch a ich absorbancia bola zmeraná spektrofotometricky. Na základe získaných dát bola určená rýchlosť dekolorizácie jednotlivými kmeňmi a tiež vplyv rôznych faktorov počas ich kultivácie.

Získané výsledky vo všeobecnosti ukazujú na väčšie množstvo dekolorizovaného farbiva počas statickej kultivácie pri jeho nižšej počiatočnej koncentrácii a vyššej teplote 35 °C.

V tejto časti práce boli skúmané teploty 20, 25, 30 a 35 °C. Najviac farbiva bolo odstráneného pri 30 a 35 °C. Dôležitá je kultivácia pri teplotnom optime pre daný kmeň. Množstvo odstránenej KM stúpa zvyčajne spoločne s teplotou až po dosiahnutií optimálnej teploty. Po jej prekročení nasleduje pokles dekolorizácie, ako uvádzajú niektoré práce (Chang a kol., 2001; Saratale a kol., 2009b). Munna a kol. (2016) uvádza vo svojej práci, že pri vyššej teplote, nad 33 °C, bol v ich experimentoch pozorovaný pomalší rast až lýza buniek. V predkladanej práci bol pokles, po prekročení teplotného optima, jasne viditeľný u kvasinky Yarrowia lipolytica. Dekolorizácia v jej prípade dosiahla maximum pri teplote 30 °C (63 %), naopak počas kultivácie pri teplote 35 °C kleslo množstvo odstráneného farbiva na 7 %. Rod Bacillus a zmiešaná kultúra dosiahli najvyššie hodnoty odstráneného farbiva pri najvyššej teplote 35 °C. Optimálna teplota pre Pseudomonas sp. CCM 4307 a Pseudomonas pictorum CCM 284 bola 30 a 25 °C. U Pseudomonas sp. CCM 4307 bol tiež zaznamenaný spätný nárast koncentrácie farbiva. Pravdepodobným dôvodom je spätná resorpcia malého množstva farbiva do roztoku, predtým naviazaného na bunkovú biomasu.

Porovnanie účinnosti dekolorizácie na rozdielnych médiách sa uskutočnilo u kvasiniek a zmiešanej kultúry Arthrobacter sulphureus + Burkholderia cepacia. V prípade kvasiniek neprinieslo použitie Yeast malt média lepšie výsledky, než kultivácia na MPB. K podobnému záveru dospeli i Saratale a kol. (2009a), ktorí zistili, že pridanie ďalších zdrojov uhlíka neprinieslo zvýšenie dekolorizácie. Dôvodom môže byť prednostná asimilácia pridaného uhlíka pred využitím farbiva ako jeho zdroja. Kvasinky môžu využívať farbivo aj ako jediný zdroj uhlíka, príkladom je Saccharomyces cerevisiae (Jadhav a Govindwar, 2006). Nevýrazný nárast v množstve dekolorizovanej KM bol pozorovaný pri porovnaní špeciálneho A+B média s MPB u zmiešanej kultúry Arthrobacter + Burkholderia. Celkovo sa ukázalo, že kultivácia na jednoduchom médiu (MPB) je pre účinnú dekolorizáciu dostatočná.

Submerzná kultivácia zlepšuje prístup k živinám a tým aj rast biomasy. Rovnako zvyšuje množstvo kyslíka v médiu. Ten môže dekolorizáciu ovplyvňovať negatívne, ale aj pozitívne. Enzymatická aktivita môže byť od jeho obsahu priamo závislá v prípade, že mechanizmus odstránenia farbiva je aeróbny (Olukanni a kol., 2009). Porovnanie submerznej a statickej kultivácie dopadlo v tejto práci v prospech statickej kultivácie. U väčšiny kmeňov bolo pozorované rýchlejšie odstránenie azo farbiva za prvých 24 h počas 82 submerznej kultivácie, ale na konci experimentu, po 96 h, boli lepšie výsledky zaznamenané pri statickej kultivácii. Obdobné výsledky, pri použití baktérie Shewanella oneidensis uvádza aj práca Wu a kol. (2009). Našli sa však aj kmene, ktorým viac vyhovovala submerzná kultivácia. Yarrowia lipolytica dekolorizovala o 14 % viac farbiva než pri statickej kultivácii. V porovnaní so statickými podmienkami, dosiahol Arthrobacter crystallopoietes po 96 h nárast o 32 % v množstve odstránenej KM.

Počiatočná koncentrácia farbiva patrí medzi významné faktory, ktoré môžu ovplyvniť množstvo odstráneného farbiva. Mierny rast množstva dekolorizovaného farbiva spoločne s klesajúcou hodnotou koncentrácie zachytávali výsledky získané z experimentov. Pri nich testované organizmy boli vystavené koncentráciám 50, 100 a 300 mg·l-1. Väčšina použitých kmeňov v tejto práci odstránila najviac KM pri najmenšej koncentrácii 50 mg·l-1. Negatívny účinok vyšších koncentrácii farbiva v roztoku dokazujú aj viaceré štúdie (Jadhav a kol., 2008; Sani a Banerjee, 1999; Saratale a kol., 2009b). Presne opačný trend bol u kvasinky Yersinia lipolytica. V jej prítomnosti dekolorizácia klesala spoločne s koncentráciou KM. Podobnú odpoveď zaznamenal tiež Chen a kol. (2010) pri kultivácii Shewanella decolorationis NTOU1, kedy s rastúcou koncentráciou všetkých troch použitých farbív sa zrýchľoval i proces dekolorizácie.

V našich experimentoch Geotrichum candidum najviac vyhovovala koncentrácia 300 mg·l-1. Naproti tomu Arthrobacter crystallopoietes zasa odstránil pri počiatočnej koncentrácii 100 mg·l-1 viac farbiva v porovnaní s koncentráciou 50 a 300 mg·l-1.

Druhá časť experimentálnej práce (Kapitola 7.2.) sa venuje dekolorizačným schopnostiam nerastúcich buniek. Testované boli rovnaké kmene ako v predchádzajúcej kapitole. Sledovaná a zaznamenaná bola dekolorizácia KM pri rôznej teplote a pH.

Vo všetkých experimentoch týkajúcich sa nerastúcich buniek bol zvlášť ku ich koncu pozorovaný pokles celkového množstva odstráneného farbiva. Pravdepodobne je to dôsledok spätnej resorpcie farbiva, ktoré bolo predtým naviazané na povrch bunky a uvoľnilo sa späť do roztoku.

Zvyšovanie teploty vedie vo všeobecnosti ku zrýchleniu enzymatickej reakcie. Po dosiahnutí maximálnej rýchlosti dochádza k jej poklesu a jedným z možných vysvetlení tohto poklesu môže byť denaturácia. Všeobecne platí, že každý enzým má svoju vlastnú optimálnu teplotu.

S týmto zistením súhlasia aj výsledky získané z inkubácia pri troch zvolených teplotách – 25, 30 a 35 °C. Ako najoptimálnejšie pre dekolorizáciu farbiva sa ukázali teploty 25 a 30 °C. Počet kmeňov, ktoré dosiahli najvyššiu dekolorizačnú aktivitu bol rovnaký pre obe teploty. Teplota 25 °C vyhovovala najviac baktériám Bacillus cereus CCM 98, Geotrichum candidum, Pseudomonas pictorum CCM 284, Pseudomonas sp. CCM 4307 a Bacillus cereus CCM 24. Naopak teplota 30 °C bola optimálna pre Arthrobacter crystallopoietes, Bacillus cereus R, Bacillus subtilis D, Yarrowia lipolytica a zmiešanú kultúru Arthrobacter + Burkholderia. Výsledky celkového množstva odstránenej KM na miligram sušiny sú pre testované kmene obdobné a skôr v prospech 25 °C. Nami získané výsledky sú v plnom súlade so závermi Ali (2010), ktorý porovnal vo svojej práci viacero štúdii a uvádza, že mikroorganizmy všeobecne degradujú azo farbivá najlepšie pri teplote 25 – 37 °C.

Možno ešte väčší vplyv ako teplota má na aktivitu enzýmov pH. Ovplyvňuje väzbu substrátu na enzým, ionizáciu substrátu či zmeny v samotnej štruktúre enzýmu. Väčšina z nich funguje len v úzkom rozmedzí. Optimálna hodnota pH je iná pre každý enzým. Aj prípadná adsorpcia na povrch buky je závislá na teplote, ale hlavne na pH. Podľa niektorých prác bolo vyššie množstvo odstráneného farbiva (Remazol Blue – reaktívne azo farbivo) pri nižšom pH možným dôsledkom elektrostatických interakcií medzi záporne nabitými aniónmi farbiva a kladne nabitým povrchom bunky. V prípade kvasiniek môže slúžiť vodíkový ión ako most medzi bunkovou stenou a molekulou farbiva (Banks a Parkinson, 1992; Fu and Viraraghavan, 2001).

Cieľom pokusov s nerastúcimi bunkami bolo posúdiť vplyv rozdielnych hodnôt pH na dekolorizáciu KM. Porovnávané boli výsledky dosiahnuté pri pH 7; 7,2 a 7,4. Pri testovaných kmeňov bola najvyššia dekolorizačná aktivita a množstvo odstráneného farbiva zaznamenané pri pH= 7 a 7,4. Jedine Arthrobacter crystallopoietes dosiahol dobré výsledky pri pH 7,2; pre ostatné skúmané mikroorganizmy bolo toto pH nevyhovujúce. Najvyššie hodnoty dekolorizácie zo všetkých skúmaných kmeňov v tomto experimente dosiahol Bacillus cereus CCM 98, optimálne pH bolo v jeho prípade 7. Modi a kol. (2010) vo svojej práci uvádzajú podobné výsledky. Nimi použitý Bacillus cereus mal optimálne pH v rozpätí 6 - 7,5.

9. Záver Cieľom predkladanej práce bolo posúdiť dekolorizačné schopnosti vybraných mikroorganizmov pri použití farbiva Korostanovej modrej BS za rôznych podmienok.

Na základe získaných výsledkov je možné uzavrieť :

• Pri experimentoch s rastúcimi bunkami sa odstránila väčšina testovaných mikroorganizmov za 192 h pri 30 °C viac ako 70 % farbiva. Najlepšie výsledky dosiahla zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia. • Najväčšia rýchlosť dekolorizácie bola vo všetkých experimentoch v priebehu prvých 24 hodín. • Za najoptimálnejšie podmienky pre dekolorizáciu KM rastúcimi bunkami možno považovať statickú kultiváciu, teplotu 35 °C, použitie jednoduchého média (MPB) a nižšiu počiatočnú koncentráciu 50 mg·l-1. • Najvyššia dekolorizačná aktivita, ale aj množstvo odstráneného farbiva na 1 mg sušiny, boli pozorované ak inkubácia nerastúcich buniek vybraných kmeňov prebehla pri pH= 7 a 7,4 a teplotách 25 a 30 °C. Najúspešnejším kmeňom bol Bacillus cereus CCM 98. • U všetkých testovaných kmeňov bola najvyššia dekolorizačná aktivita vo všetkých experimentoch s nerastúcimi bunkami počas prvých 30 min. • Teplota vplývala rozdielne na rastúce a nerastúce bunky. Rastúce preferovali vyššiu teplotu 35°C, naopak nerastúca kultúra dosiahla najlepšie výsledky pri 25 a 30 °C. • Pre úspešnú dekolorizáciu KM nerastúcimi bunkami je nutné inkubovať ich submerzne. Rastúce bunky naopak počas submerznej kultivácie zaznamenali zníženie množstva odstráneného farbiva. • Zmiešaná kultúra Arthrobacter + Burkholderia dosahovala najlepšie výsledky v experimentoch s rastúcimi bunkami, avšak pri použití jej nerastúcich buniek dosiahla skôr priemerné výsledky v porovnaní s ostatnými testovanými kmenmi. V experimentoch s nerastúcimi bunkami dosiahol najlepšie výsledky rod Bacillus a hlavne Bacillus cereus CCM 98.

10. Zoznam literatúry AKSU, Zümriye. 2003. Reactive dye bioaccumulation by Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry. 38: 1437-1444 AKSU, Zümriye. 2005. Application of biosorption for the removal of organic pollutants: a review. Process Biochemistry. 40: 997-1026 AKSU, Zümriye a Gönül DÖNMEZ. 2003. A comparative study on the biosorption characteristics of some yeasts for Remazol Blue reactive dye. Chemosphere. 50: 1075- 1083 AKSU, Zümriye a Gönül DÖNMEZ. 2005. Combined effects of molasses sucrose and reactive dye on the growth and dye bioaccumulation properties of Candida tropicalis. Process Biochemistry. 40: 2443-2454 AKSU, Zümriye a Sevilay TEZER. 2005. Biosorption of reactive dyes on the green alga Chlorella vulgaris. Process Biochemistry. 40: 1347-1361 ALI, Hazrat. 2010. Biodegradation of Synthetic Dyes A Review. Water, Air, & Soil Pollution. 213: 251-273 AMIN, K.A., H. ABDEL HAMEID a A.H. ABD ELSTTAR. 2010. Effect of food azo dyes tartrazine and carmoisine on biochemical parameters related to renal, hepatic function and oxidative stress biomarkers in young male rats. Food and Chemical Toxicology. 48: 2994-2999 AN, Yu, Liping JIANG, Jun CAO, Chengyan GENG a Laifu ZHONG. 2007. Sudan I induces genotoxic effects and oxidative DNA damage in HepG2 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 627: 164-170 ANASTASI, Antonella, Barbara PARATO, Federica SPINA, Valeria TIGINI, Valeria PRIGIONE a Giovanna Cristina VARESE. 2011. Decolourisation and detoxification in the fungal treatment of textile wastewaters from dyeing processes. New Biotechnology. 29: 38-45 ANDĚL, Petr. 2011. Ekotoxikologie, bioindikace a biomonitoring. Evernia, Liberec ANNADURAI, G., M. CHELLAPANDIAN a M.R.V. KRISHNAN. 1999. Adsorption of reactive dye on chitin. Environmental Monitoring and Assessment. 59: 111-119 PRASAD, A.S. A., V.S.V. SATYANARAYANA a K.V. BHASKARA RAO. 2013. Biotransformation of Direct Blue 1 by a moderately halophilic bacterium Marinobacter sp. strain HBRA and toxicity assessment of degraded metabolites. Journal of Hazardous Materials. 262: 674-684 ARAVINDHAN, Rathinam, Jonnalagadda Raghava RAO a Balachandran Unni NAIR. 2007. Removal of basic yellow dye from aqueous solution by sorption on green alga Caulerpa scalpelliformis. Journal of Hazardous Materials. 142: 68-76 ASGHER, Muhammad, H. N. BHATTI, S. A. H. SHAH, M. Javaid ASAD a R. L. LEGGE. 2007. Decolorization potential of mixed microbial consortia for reactive and disperse textile dyestuffs. Biodegradation. 18: 311-316 86

AYED, Lamia, Abdelkarim MAHDHI, Abdelkarim CHEREF a Amina BAKHROUF. 2011. Decolorization and degradation of azo dye Methyl Red by an isolated Sphingomonas paucimobilis: Biotoxicity and metabolites characterization. Desalination. 274: 272-277 BAE, Jin-Seok a Harold S. FREEMAN. 2007. Aquatic toxicity evaluation of copper- complexed direct dyes to the Daphnia magna. Dyes and Pigments. 73: 126-132 BANKS, C.J. a M.E. PARKINSON. 1992. The mechanism and application of fungal biosorption to colour removal from raw waters. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 2: 192-196 BALAPURE, Kshama, Nikhil BHATT a Datta MADAMWAR. 2015. Mineralization of reactive azo dyes present in simulated textile waste water using down flow microaerophilic fixed film bioreactor. Bioresource Technology. 175: 1-7 BAYRAMOĞLU, Gülay, Gökce ÇELIK a M. Yakup ARICA. 2006. Biosorption of Reactive Blue 4 dye by native and treated fungus Phanerocheate chrysosporium: Batch and continuous flow system studies: Batch and continuous flow system studies. Journal of Hazardous Materials. 137: 1689-1697 BENITO, G. González, M. Peña MIRANDA a D. Rodríguez DE LOS SANTOS. 1997. Decolorization of wastewater from an alcoholic fermentation process with Trametes versicolor. Bioresource Technology. 61: 33-37 BHATTACHARYYA, K. a A. SHARMA. 2005. Kinetics and thermodynamics of Methylene Blue adsorption on Neem leaf powder. Dyes and Pigments. 65: 51-59 BOMHARD, Ernst M. a Bernd A. HERBOLD. 2008. Genotoxic Activities of Aniline and its Metabolites and Their Relationship to the Carcinogenicity of Aniline in the Spleen of Rats. Critical Reviews in Toxicology. 35: 783-835 BOUSSAID, Abdellatif. 1995. Pulp-mill effluent color removal using Sagenomella striatispora. Dizertačná práca. Oregon State University, Oregon (USA). 80 s. BROADBENT, Arthur D. 2001. Basic principles of textile coloration. Society of Dyers and Colorists, West Yorkshire. CANO, Maribel, Myrna SOLIS, Joel DIAZ, Aida SOLIS, Octavio LOERA a Maura M TEUTLI. 2011. Biotransformation of indigo carmine to isatin sulfonic acid by lyophilized mycelia from Trametes versicolor. African Journal of Biotechnology. Academic Journals (Kenya), 10: 12224-12231 CARMEN, Zaharia a Suteu DANIEL. 2012. Textile Organic Dyes Characteristics, Polluting Effects and Separation/Elimination Procedures from Industrial Effluents – A Critical Overview. PUZYN, Tomasz, ed. Organic Pollutants Ten Years After the Stockholm Convention - Environmental and Analytical Update. InTech. 55-86 CENGIZ, Sevilay a Levent CAVAS. 2008. Removal of methylene blue by invasive marine seaweed: Caulerpa racemosa var. cylindracea. Bioresource Technology. 99: 2357-2363 CHUNG, King-Thorn, S. Edward STEVENS a Carl E. CERNIGLIA. 2008. The Reduction of Azo Dyes by the Intestinal Microflora. Critical Reviews in Microbiology. 18: 175-190

CLARKE, A. a R. ANLIKER. 1980. Organic dyes and pigments. HUTZINGER, Otto (ed.). The handbook of environmental chemistry. 181–215. Springer-Verlag, Berlin COUTO, Susana Rodríguez a José L. TOCA-HERRERA. 2007. Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology Advances. 25: 558-569 CRINI, G. 2006. Non-conventional low-cost adsorbents for dye removal: A review. Bioresource Technology. 97: 1061-1085 DAS, Devlina, D. CHARUMATHI a Nilanjana DAS. 2011. Bioaccumulation of the synthetic dye Basic Violet 3 and heavy metals in single and binary systems by Candida tropicalis grown in a sugarcane bagasse extract medium: Modelling optimal conditions using response surface methodology (RSM) and inhibition kinetics. Journal of Hazardous Materials. 186: 1541-1552 DOAN, M. 2004. Kinetics and mechanism of removal of methylene blue by adsorption onto perlite. Journal of Hazardous Materials. 109: 141-148 DÖNMEZ, Gönül. 2002. Bioaccumulation of the reactive textile dyes by Candida tropicalis growing in molasses medium. Enzyme and Microbial Technology. 30: 363-366 OLIVEIRA, D.P. 2005. Dyes as important class of environmental contaminants – a case study. Doctoral thesis. São Paulo University, São Paulo. 121 s EL-SHEEKH, Mostafa M., M.M. GHARIEB a G.W. ABOU-EL-SOUOD. 2009. Biodegradation of dyes by some green algae and cyanobacteria. International Biodeterioration & Biodegradation. 63: 699-704 EPP, Dianne N. 1995. A World of Color: Investigating the Chemistry of Vat Dyes. Journal of Chemical Education. 72: 726 ERDEN, Emre, Yasin KAYMAZ a Nurdan Kasikara PAZARLIOGLU. 2011. Biosorption kinetics of a direct azo dye Sirius Blue K-CFN by Trametes versicolor. Electronic Journal of Biotechnology. 14 EVANGELISTA-BARRETO, Norma S., Clarissa D. ALBUQUERQUE, Regine Helena S. F. VIEIRA a Galba M. CAMPOS-TAKAKI. 2009. Cometabolic Decolorization of the Reactive Azo Dye Orange II by Geobacillus stearothermophilus UCP 986. Textile Research Journal. 79: 1266-1273 FARGAŠOVÁ, Agáta. 2008. Environmentálna toxikológia a všeobecná ekotoxikológia. Orman, Bratislava FARGAŠOVÁ, Agáta. 2009. Ekotoxikologické biotesty. Perfekt, Bratislava FARGAŠOVÁ, Agáta. 2010. Environmental risk assessment. In: Proceedings of the 30 Scientific symposium of industrial toxicology 2010, 376 Slovenska spolocnost priemyselnej chemie, Slovakia

FERRAZ, E. R. A., G. A. UMBUZEIRO, G. DE-ALMEIDA, A. CALOTO-OLIVEIRA, F. M. D. CHEQUER, M. V. B. ZANONI, D. J. DORTA a D. P. OLIVEIRA. 2011. Differential toxicity of Disperse Red 1 and Disperse Red 13 in the Ames test, HepG2 cytotoxicity assay, and Daphnia acute toxicity test. Environmental Toxicology. 26: 489- 497 FORSS, Jörgen a Ulrika WELANDER. 2009. Decolourization of reactive azo dyes with microorganisms growing on soft wood chips. International Biodeterioration & Biodegradation. 63: 752-758 FORSS, Jörgen a Ulrika WELANDER. 2011. Biodegradation of azo and anthraquinone dyes in continuous systems. International Biodeterioration & Biodegradation. 65: 227-237 FU, Yuzhu a T. VIRARAGHAVAN. 2001. Fungal decolorization of dye wastewaters: a review. Bioresource Technology. 79: 251-262 FU, Yuzhu a T. VIRARAGHAVAN. 2002. Removal of Congo Red from an aqueous solution by fungus Aspergillus niger. Advances in Environmental Research. 7: 239-247 GRAY, L. EARL a JOSEPH S. OSTBY. 1993. The Effects of Prenatal Administration of Azo Dyes on Testicular Development in the Mouse: A Structure Activity Profile of Dyes Derived from Benzidine, Dimethylbenzidine, or Dimethoxybenzidine. Toxicological Sciences. 20: 177-183 GREGORY, Peter. 2000. Dyes and Dye Intermediates. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, Hoboken. 1-66 HORÁK, Josef, Igor LINHART a Petr KLUSOŇ. 2004. Úvod do toxikologie a ekologie pro chemiky. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha HUNGER, Klaus, Peter MISCHKE, Wolfgang RIEPER, Roderich RAUE, Klaus KUNDE a Aloys ENGEL. 2000. Azo Dyes. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, Weinheim CHANG, Jo-Shu, Chien CHOU a Shan-Yu CHEN. 2001. Decolorization of azo dyes with immobilized Pseudomonas luteola. Process Biochemistry. 36: 757-763 CHARUMATHI, D. a Nilanjana DAS. 2010. Bioaccumulation of synthetic dyes by Candida tropicalis growing in sugarcane bagasse extract medium. Advances in Biological Research. 4: 233-240 CHEN, Huizhong, Haiyan XU, Thomas M. HEINZE a Carl E. CERNIGLIA. 2009. Decolorization of water and oil-soluble azo dyes by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus fermentum. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 36: 1459- 1466 CHEN, C.-H., C.-F. CHANG a S.-M. LIU. 2010. Partial degradation mechanisms of malachite green and methyl violet B by Shewanella decolorationis NTOU1 under anaerobic conditions. Journal of Hazardous Materials. 177: 281-289

CHEQUER, Farah Maria Drumond, José Pedro Friedmann ANGELI, Elisa Raquel Anastácio FERRAZ, Marcela Stefanini TSUBOY, Juliana Cristina MARCARINI, Mário Sérgio MANTOVANI a Danielle Palma DE OLIVEIRA. 2009. The azo dyes Disperse Red 1 and Disperse Orange 1 increase the micronuclei frequencies in human lymphocytes and in HepG2 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 676: 83-86 IQBAL, Muhammad a Asma SAEED. 2007. Biosorption of reactive dye by loofa spongeimmobilized fungal biomass of Phanerochaete chrysosporium. Process Biochemistry. 42: 1160- 1164 JADHAV, J. P. a S. P. GOVINDWAR. 2006. Biotransformation of malachite green by Saccharomyces cerevisiae MTCC 463. Yeast. 23: 315-323 JADHAV, Sheetal U., Mital U. JADHAV, Anuradha N. KAGALKAR a Sanjay P. GOVINDWAR. 2008. Decolorization of Brilliant Blue G dye mediated by degradation of the microbial consortium of Galactomyces geotrichum and Bacillus sp. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers. 39: 563-570 JADHAV, Shekhar B., Swapnil S. PHUGARE, Pratibha S. PATIL a Jyoti P. JADHAV. 2011. Biochemical degradation pathway of textile dye Remazol red and subsequent toxicological evaluation by cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress studies. International Biodeterioration & Biodegradation. 65: 733-743 JEN-KUN, Lin a Wu YAN-HWA, 1973. Studies on the mechanism of methemoglobin formation induced by aminoazo compounds. Biochemical Pharmacology. 22: 1883-1891 JOSHI, Swati M., Shrirang A. INAMDAR, Amar A. TELKE, Dhawal P. TAMBOLI a Sanjay P. GOVINDWAR. 2010. Exploring the potential of natural bacterial consortium to degrade mixture of dyes and textile effluent. International Biodeterioration & Biodegradation. 64: 622-628 KALYANI, Dayanad C., Amar A. TELKE, Sanjay P. GOVINDWAR a Jyoti P. JADHAV. 2009. Biodegradation and Detoxification of Reactive Textile Dye by Isolated IPseudomonas/I sp. SUK1. Water Environment Research. 81: 298-307 KANT, Rita. 2012. Textile dyeing industry an environmental hazard. Natural Science. 04: 22-26 KECK, A., J. KLEIN, M. KUDLICH, A. STOLZ, H.-J. KNACKMUSS a R. MATTES. 1997. Reduction of azo dyes by redox mediators originating in the naphthalenesulfonic acid degradation pathway of Sphingomonas sp. strain BN6. Applied and Environmental Microbiology. 63: 3684-3690 KNAPP, J.S., P.S. NEWBY a L.P. REECE. 1995. Decolorization of dyes by wood-rotting basidiomycete fungi. Enzyme and Microbial Technology. 17: 664-668 KOJIMA, M., M. DEGAWA, Y. HASHIMOTO a M. TADA. 1994. The carcinogenicity of methoxyl derivatives of 4-aminoazobenzene: correlation between DNA adducts and genotoxicity.: correlation between DNA adducts and genotoxicity. Environmental Health Perspectives. 102: 191-194

KOLEKAR, Yogesh M., Harshal N. NEMADE, Vijay L. MARKAD, Sunil S. ADAV, Milind S. PATOLE a Kisan M. KODAM. 2012. Decolorization and biodegradation of azo dye, reactive blue 59 by aerobic granules. Bioresource Technology.104: 818-822 KUMAR, K. Vasanth, V. RAMAMURTHI a S. SIVANESAN. 2006. Biosorption of malachite green, a cationic dye onto Pithophora sp., a fresh water algae. Dyes and Pigments. 69: 102-107 KUMARI, K. a T. ABRAHAM. 2007. Biosorption of anionic textile dyes by nonviable biomass of fungi and yeast. Bioresource Technology. 98: 1704-1710 LAXMINARAYANA, E., M. Thirumala CHARY, M. Randheer KUMAR a M.A. SINGARA CHARYA. 2010. Decolourisation and biodegradation of sulphonated azo dyes by fungi to clean dye contaminated soil environments. Journal of Natural and Environmental Sciences. 1: 35-42 LIM, Sing-Lai, Wan-Loy CHU a Siew-Moi PHANG. 2010. Use of Chlorella vulgaris for bioremediation of textile wastewater. Bioresource Technology. 101: 7314-7322 LIN, Jun, Xingwang ZHANG, Zhongjian LI a Lecheng LEI. 2010. Biodegradation of Reactive blue 13 in a two-stage anaerobic/aerobic fluidized beds system with a Pseudomonas sp. isolate. Bioresource Technology. 101: 34-40 LORIMER, J.P., T.J. MASON, M. PLATTES, S.S. PHULL a D.J. WALTON. 2001. Degradation of dye effluent. Pure and applied chemistry. 73: 1957-1968 MALIK, Anushree. 2004. Metal bioremediation through growing cells. Environment International. 30: 261-278 MANSOUR, Hedi Ben, Daniel BARILLIER, David CORROLER, Kamel GHEDIRA, Leila CHEKIR-GHEDIRA a Ridha MOSRATI. 2009. In vitro study of dna damage induced by Acid orange 52 and its biodegradation derivatives. Environmental Toxicology and Chemistry. 28: 489 MAURYA, Nityanand Singh, Atul Kumar MITTAL, Peter CORNEL a Elmar ROTHER. 2006. Biosorption of dyes using dead macro fungi: Effect of dye structure, ionic strength and pH. Bioresource Technology. 97: 512-521 MIRANDA, M.Peña, G.González BENITO, N.San CRISTOBAL a C.Heras NIETO. 1996. Color elimination from molasses wastewater by Aspergillus niger. Bioresource Technology. 57: 229-235 MODE., Charles J., ed. 2011. Applications of Monte Carlo methods in biology, medicine and other fields of science. InTech, Rijeka MODI, H.A., Garima RAJPUT a Chetan AMBASANA. 2010. Decolorization of water soluble azo dyes by bacterial cultures, isolated from dye house effluent. Bioresource Technology . 101: 6580-6583 MOU, Duen-Gang, Kim Kee LIM a Hwei Ping SHEN. 1991. Microbial agents for decolorization of dye wastewater. Biotechnology Advances. 9: 613-622 MUNNA, Md Sakil, Zebunnesa ZEBA a Rashed NOOR. 2016. Influence of temperature on the growth of Pseudomonas putida. Stamford Journal of Microbiology. 5: 9- 12 91

NAGL, Gert, 2000. Sulfur Dyes. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Wiley- VCH Verlag GmbH & Co, Weinheim NONY, C. R., M. C. BOWMAN, T. CAIRNS, L. K. LOWRY a W. P. TOLO. 1980. Metabolism Studies of an Azo Dye and Pigment in the Hamster Based on Analysis of the Urine for Potentially Carcinogenic Aromatic Amine Metabolites. Journal of Analytical Toxicology. 4: 132-140 NOVOTNÝ, Čeněk, Nicolina DIAS, Anu KAPANEN, Kateřina MALACHOVÁ, Marta VÁNDROVCOVÁ, Merja ITÄVAARA a Nelson LIMA. 2006. Comparative use of bacterial, algal and protozoan tests to study toxicity of azo- and anthraquinone dyes. Chemosphere. 63: 1436-1442 OLA, O. I., AKINTOKUN, et al. 2010. Aerobic decolourization of two reactive azo dyes under varying carbon and nitrogen source by Bacillus cereus. African Journal of Biotechnology. 9: 672-677 OLUKANNI, O.D., A.A. OSUNTOKI a G.O. GBENLE. 2009. Decolourization of Azo Dyes by a Strain of Micrococcus Isolated from a Refuse Dump Soil. Biotechnology(Faisalabad). 8: 442-448 O'NEILL, C., A. LOPEZ, S. ESTEVES, F. R. HAWKES, D. L. HAWKES a S. WILCOX, 2000. Azo-dye degradation in an anaerobic-aerobic treatment system operating on simulated textile effluent. Applied Microbiology and Biotechnology. 53: 249-254 OXSPRING, Darren A., Geoff MCMULLAN, W. Franklyn SMYTH a Roger MARCHANT. 1996. Decolourisation and metabolism of the reactive textile dye, Remazol Black B, by an immobilized microbial consortium. Biotechnology Letters. 18: 527-530 PADMESH, T.V.N., K. VIJAYARAGHAVAN, G. SEKARAN a M. VELAN. 2005. Batch and column studies on biosorption of acid dyes on fresh water macro alga Azolla filiculoides. Journal of Hazardous Materials. 125: 121-129 PADMESH, T.V.N., K. VIJAYARAGHAVAN, G. SEKARAN a M. VELAN. 2006. Application of Azolla rongpong on biosorption of acid red 88, acid green 3, acid orange 7 and acid blue 15 from synthetic solutions. Chemical Engineering Journal. 122: 55-63 PAN, Hongmiao, Jinhui FENG, Carl E. CERNIGLIA a Huizhong CHEN. 2011. Effects of Orange II and Sudan III azo dyes and their metabolites on Staphylococcus aureus. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 38: 1729-1738 PARIKH, Amit a Datta MADAMWAR. 2005. Textile dye decolorization using cyanobacteria. Biotechnology Letters. 27: 323-326 PATTERSON, R.M. a J.S. BUTLER. 1982. Tartrazine-induced chromosomal aberrations in mammalian cells. Food and Chemical Toxicology. 20: 461-465 PERCY, Adrian J., Nel MOORE a James K. CHIPMAN. 1989. Formation of nuclear anomalies in rat intestine by benzidine and its biliary metabolites. Toxicology. 57: 217-223

PHUGARE, Swapnil S., Dayanand C. KALYANI, Asmita V. PATIL a Jyoti P. JADHAV. 2011. Textile dye degradation by bacterial consortium and subsequent toxicological analysis of dye and dye metabolites using cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress studies. Journal of Hazardous Materials. 186: 713-723 PLUMB, J. J., J. BELL a D. C. STUCKEY. 2001. Microbial Populations Associated with Treatment of an Industrial Dye Effluent in an Anaerobic Baffled Reactor. Applied and Environmental Microbiology. 67: 3226-3235 POLMAN, Kevin a Cynthia R. BRECKENRIDGE. 1996. Biomass-Mediated Binding and Recovery of Textile Dyes from Waste Effluents. Textile Chemist & Colorist. 28: 31-35 PRABAHARAN, D., M. SUMATHI a G. SUBRAMANIAN. 1994. Ability to use ampicillin as a nitrogen source by the marine cyanobacteriumPhormidium valderianum BDU 30501. Current Microbiology. 28: 315-320 PRIGIONE, Valeria, Giovanna Cristina VARESE, Leonardo CASIERI a Valeria Filipello MARCHISIO. 2008. Biosorption of simulated dyed effluents by inactivated fungal biomasses. Bioresource Technology. 99: 3559-3567 PRIYA, Balakrishnan, Lakshmanan UMA, Abdul Khaleel AHAMED, Gopalakrishnan SUBRAMANIAN a Dharmar PRABAHARAN. 2011. Ability to use the diazo dye, C.I. Acid Black 1 as a nitrogen source by the marine cyanobacterium Oscillatoria curviceps BDU92191. Bioresource Technology. 102: 7218-7223 RAFII, F., J.D. HALL a C.E. CERNIGLIA. 1997. Mutagenicity of azo dyes used in foods, drugs and cosmetics before and after reduction by Clostridium species from the human intestinal tract. Food and Chemical Toxicology. 35: 897-901 RAJEE, O. a Jamila PATTERSON. 2011. Decolorization of Azo Dye (Orange MR) by an Autochthonous Bacterium, Micrococcus sp. DBS 2. Indian Journal of Microbiology. 51: 159-163 RUBINO, Giovanni F., Giovanni SCANSETTI, Giorgio PIOLATTO a Enrico PIRA. 1982. The carcinogenic effect of aromatic amines: An epidemiological study on the role of o- toluidine and 4,4′-methylene bis (2-methylaniline) in inducing bladder cancer in man. Environmental Research. 27: 241-254 SANI, Rajesh Kumar a Uttam Chand BANERJEE. 1999. Decolorization of triphenylmethane dyes and textile and dye-stuff effluent by Kurthia sp. Enzyme and Microbial Technology. 24: 433-437 SARATALE, R.G., G.D. SARATALE, D.C. KALYANI, J.S. CHANG a S.P. GOVINDWAR. 2009a. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresource Technology. 100: 2493-2500 SARATALE, R.G., G.D. SARATALE, J.S. CHANG a S.P. GOVINDWAR. 2009b. Ecofriendly degradation of sulfonated diazo dye C.I. Reactive Green 19A using Micrococcus glutamicus NCIM-2168. Bioresource Technology. 100: 3897-3905

SARAYU, K. a S. SANDHYA, 2010. Aerobic Biodegradation Pathway for Remazol Orange by Pseudomonas aeruginosa. Applied Biochemistry and Biotechnology. 160: 1241- 1253 SEDIGHI, M., A. KARIMI a F. VAHABZADEH. 2009. Involvement of ligninolytic enzymes of Phanerochaete chrysosporium in treating the textile effluent containing Astrazon Red FBL in a packed-bed bioreactor. Journal of Hazardous Materials. 169: 88-93 SEMPLE, K. 1999. Biodegradation of aromatic compounds by microalgae. FEMS Microbiology Letters. 170: 291-300 SEN, K., Kannan PAKSHIRAJAN a S. B. SANTRA. 2012. Modeling the Biomass Growth and Enzyme Secretion by the White Rot Fungus Phanerochaete chrysosporium: a Stochastic-Based Approach. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167: 705-713 SHASHIREKHA, S., L. UMA a G. SUBRAMANIAN. 1997. Phenol degradation by the marine cyanobacterium Phormidium valderianum BDU 30501. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19: 130-133 SHORE, John. 2002. Colorants and auxiliaries: organic chemistry and application properties. Society of Dyers and Colourists. Bradford. SORIANO, Jeriel J., Justine MATHIEU-DENONCOURT, Grant NORMAN, Shane R. DE SOLLA a Valérie S. LANGLOIS. 2014. Toxicity of the azo dyes Acid Red 97 and Bismarck Brown Y to Western clawed frog (Silurana tropicalis). Environmental Science and Pollution Research. 21: 3582-3591 TATARKO, Matthew a John A. BUMPUS. 1998. Biodegradation of Congo Red by Phanerochaete chrysosporium. Water Research. 32: 1713-1717 UMA, L., D. PRABAHARAN, B. PRIYA a G. SUBRAMANIAN. 2009. Role of Cyanobacterial Oxidases in Bioremediation–An Overview. Algal Biology and Biotechnology, 251-261. I.K. International Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi VÉLEZ, Mónica Perea, Sigrid C.J. DE KEERSMAECKER a Jos VANDERLEYDEN. 2007. Adherence factors of Lactobacillus in the human gastrointestinal tract. FEMS Microbiology Letters. 276: 140-148 VENKATA MOHAN, S., N. CHANDRASEKHAR RAO, K. KRISHNA PRASAD a J. KARTHIKEYAN. 2002. Treatment of simulated Reactive Yellow 22 (Azo) dye effluents using Spirogyra species. Waste Management. 22: 575-582 VENTURA-CAMARGO, Bruna de Campos, Patrícia Pasquali PARISE MALTEMPI, Maria APARECIDA a Marin- MORALES. 2011. The use of the Cytogenetic to Identify Mechanisms of Action of an Azo Dye in Allium Cepa Meristematic Cells. Journal of Environmental & Analytical Toxicology. 1: 1-12 VERMA, Pradeep a Datta MADAMWAR. 2003. Decolourization of synthetic dyes by a newly isolated strain of Serratia marcescens. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19: 615-618 VOLESKY, B. a Z. R. HOLAN. 1995. Biosorption of heavy metals. Biotechnology Progress. 11: 235-250 94

WAGHMODE, Tatoba R., Mayur B. KURADE, Rahul V. KHANDARE a Sanjay P. GOVINDWAR. 2011a. A sequential aerobic/microaerophilic decolorization of sulfonated mono azo dye Golden Yellow HER by microbial consortium GG-BL. International Biodeterioration & Biodegradation. 65: 1024-1034 WAGHMODE, Tatoba R., Mayur B. KURADE a Sanjay P. GOVINDWAR. 2011b. Time dependent degradation of mixture of structurally different azo and non azo dyes by using Galactomyces geotrichum MTCC 1360. International Biodeterioration & Biodegradation. 65: 479-486 WANG, Shaobin, Lin LI, Hongwei WU a Z.H. ZHU. 2005. Unburned carbon as a low-cost adsorbent for treatment of methylene blue-containing wastewater. Journal of Colloid and Interface Science. 292: 336-343 WANG, Bao-E. a Yong-You HU. 2008. Bioaccumulation versus adsorption of reactive dye by immobilized growing Aspergillus fumigatus beads. Journal of Hazardous Materials. 157: 1-7 WU, Jing, Kyoung-Sook KIM, Nak-Chang SUNG, Cheorl-Ho KIM a Young-Choon LEE. 2009. Isolation and characterization of Shewanella oneidensis WL-7 capable of decolorizing azo dye Reactive Black 5. The Journal of General and Applied Microbiology. 55: 51-55 XIN, Baoping, Yunting XIA, Yang ZHANG, Hina ASLAM, Changhao LIU a Shi CHEN. 2012. A feasible method for growing fungal pellets in a column reactor inoculated with mycelium fragments and their application for dye bioaccumulation from aqueous solution. Bioresource Technology. 105: 100-105 YAN, Hai a Gang PAN. 2004. Increase in biodegradation of dimethyl phthalate by Closterium lunula using inorganic carbon. Chemosphere. 55: 1281-1285 YOO, E.S., J. LIBRA a L. ADRIAN. 2001. Mechanism of decolorization of azo dyes in anaerobic mixed culture. Journal of Environmental Engineering. 127: 844-849 YOU, Sheng-Jie, Rahul A. DAMODAR a Sheng-Chon HOU. 2010. Degradation of Reactive Black 5 dye using anaerobic/aerobic membrane bioreactor (MBR) and photochemical membrane reactor. Journal of Hazardous Materials. 177: 1112-1118 ZEROUAL, Y., BS KIM, C.S. KIM, M. BLAGHEN a K.M. LEE. 2006. Biosorption of bromophenol blue from aqueous solutions by Rhizopus stolonifer biomass. Water, air, and soil pollution. Springer, 177: 135-146 Webové stránky About basic dyes, 2013. All About Hand Dyeing [online]. http://www.pburch.net/dyeing/basic_dyes.shtml, 2018-04-21 About Direct Dyes, 2005. All About Hand Dyeing [online]. http://www.pburch.net/dyeing/directdye.shtml, 2018-04-21 Acid dyes, 2010. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/acid-dyes.html, 2018-04-21

All about vat dyes. 2009. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2009/12/all-about-vat-dyes.html, 2018-04-21 Basic dyes, 2010. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/basic-dyes.html, 2018-04-22 Direct dyes, 2009. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2009/12/direct-dyes.html, 2018-04-21 Disperse dyes, 2010. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/disperse-dyes.html, 2018-04-21 History and Properties of Disperse Dyes, 2012. TextileLearner [online]. http://textilelearner.blogspot.cz/2012/01/disperse-dye-history-of-disperse-dye.html, 2018-04-22 Introduction and properties of mordant dyes, 2011. TextileLearner [online]. http://textilelearner.blogspot.cz/2011/03/defination-properties-working- procedure_4365.html, 2018-04-22 Mordant dyes, 2011. JAGSON COLORCHEM Ltd. [online]. http://www.jagson.com/mordant-dyes.php, 2018-04-22 Properties of Basic Dyes, 2011. TextileLearner [online]. http://textilelearner.blogspot.cz/2011/03/defination-properties-working- procedure_7918.html, 2018-04-22 Reactive dyes, 2009. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2009/12/reactive-dyes.html, 2018-04-22 Solvent dyes, 2011. JAGSON COLORCHEM Ltd. [online]. http://www.jagson.com/solvent-dyes.php, 2018-04-22 Sulfur dyes, 2010. Ddyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/sulfur-dyes.html, 2018-04-21