Biologická Degradace Organických Barviv

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

BIOLOGICKÁ DEGRADACE ORGANICKÝCH BARVIV

Bakalářská práce

Martin Struk

Vedoucí práce: Brno 2016 doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Bibliografický záznam

Autor: Martin Struk Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Biologická degradace organických barviv

Studijní program: Experimentální biologie

Speciální biologie, zaměření Mikrobiologie a Studijní obor: molekulární biotechnologie

Vedoucí práce: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Akademický rok: 2015/2016

Počet stran: 66

Klíčová slova: Biodegradace, Organická barviva, Biosorpce, Houby, Bakterie, Řasy, Trifenylmethanová barviva, Bioremediace

Bibliografický záznam

Autor: Martin Struk Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie

Názov práce: Biologická degradácia organických farbív

Študijný program: Experimentálna biológia

Špeciálna biológia, zameranie Mikrobiológia a Študijný obor: molekulárna biotechnológia

Vedúci práce: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Akademický rok: 2015/2016

Počet strán: 66

Kľúčové slová: Biodegradácia, Organické farbivá, Biosorpcia, Huby, Baktérie, Riasy, Trifenylmetánové farbivá, Bioremedácia

Bibliographic Entry

Author Martin Struk Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Biological degradation of organic dyes

Degree programme: Experimental Biology

Special Biology, specialization Microbiology and Field of Study: Molecular Biotechnology

Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Academic Year: 2015/2016

Number of Pages: 66

Keywords: Biodegradation, Organic dyes, Biosorption, Fungi, Bacteria, Algae, Triphenylmethane dyes, Bioremediation

Abstrakt

Organické farbivá patria k najpoužívanejším chemikáliám v priemysle. Stúpa počet prípadov kedy je nimi znečistené životné prostredie. Pri odstraňovaní týchto farbív je dôležitá ich ekotoxikologická analýza. Doteraz používané fyzikálno-chemické metódy sú často neúčinné a niektoré organické farbivá nie je možné pomocou nich vôbec odstrániť. Do popredia sa preto dostáva výskum organizmov dekolorizujúcich, degradujúcich tieto farbivá. Cieľom tejto práce je podať prehľad doterajších poznatkov o možnostiach transformácie rôznymi organizmami a komerčne využívaných remediačných a bioremediačných technikách.

Abstrakt

Organická barviva patří k nejpoužívanějším chemikáliím v průmyslu. Stoupá počet případů, kdy je jimi znečištěno životní prostředí. Při odstraňování těchto barviv je důležitá jejich ekotoxikologická analýza. Dodnes používané fyzikálně-chemické metody jsou často neúčinné a některá organická barviva není možné s jejich pomocí vůbec odstranit. Do popředí se proto dostává výzkum dekolorizujících organismů, degradujících tyto barviva. Cílem této práce je podat přehled o dosavadních možnostech transformace různými organismy a komerčně využívaných v remediačních a bioremediačních technikách.

Abstract

Organic dyes are one of the most used industrial chemicals. The number of instances during which the dyes contaminate the environment is rising. During the process of removing the dyes from the environment, ecotoxicological analysis plays a crucial role. The physical-chemical processes being used so-far are often inefficient and incapable of removing certain organic dyes at all; therefore the research of organisms that are capable of the decolorization or degradation of dyes is taking a lead. This thesis reviews current research and literature on 1. the possibilities of the transformation of dyes by various microorganisms; and 2. comercially used remediation and bioremediation techniques.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěl poděkovat panu doc. RNDr. Miroslavu Němcovi, CSc. za cenné rady a připomínky, za vstřícnost, trpělivost a čas, který mi věnoval při vedení mé bakalářské práce.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 9. apríla 2016 ……………………………… Martin Struk

Obsah

Zoznam použitých skratiek ...... 11 Úvod ...... 12 1. Delenie organických farbív a ich charakteristika ...... 13 1.1. Reaktívne farbivá ...... 13 1.2. Kyslé farbivá ...... 13 1.2.1. Antrachinonové farbivá ...... 13 1.2.2. Azo farbivá ...... 14 1.2.3. Trifenylmetánové farbivá ...... 14 1.3. Bazické farbivá ...... 15 1.4. Priame farbivá ...... 15 1.5. Disperzné farbivá ...... 16 1.6. Moridlové farbivá ...... 17 1.7. Rozpustné farbivá ...... 17 1.8. Farbivá obsahujúce síru ...... 18 1.9. Kypové farbivá ...... 18 2. Metódy degradácie farbív ...... 19 2.1. Chemické metódy ...... 19 2.1.1. Oxidácia ...... 19 2.1.2. Ozonácia ...... 20 2.2. Fyzikálne metódy ...... 20 2.2.1. Adsorpcia ...... 20 2.2.2. Aktívne uhlie ...... 21 2.2.3. Rašelina ...... 21 2.2.4. Popolček ...... 21 2.2.5. Biosorbenty ...... 21 2.2.6. Polyméry ...... 22 2.2.7. Kremík ...... 23 2.3. Koagulácia ...... 23 2.4. Nanofiltrácia ...... 24 3. Toxicita ...... 25 3.1. Čo je toxicita ...... 25 3.2. Doba expozície a dávka toxikantu...... 25 3.3. Klasifiácia toxických látok ...... 25 3.4. Odhad rizika ...... 26 9

3.5. Ekotoxikologické biotesty ...... 26 3.6. Toxicita trifenylmetánových farbív ...... 28 4. Biodegradácia organických látok organizmami ...... 29 4.1. Baktérie ...... 30 4.1.1. Malachitová zeleň ...... 30 4.1.2. Kryštálová violeť ...... 32 4.1.3. Fuchsín ...... 34 4.1.4. Ostatne TFM farbivá ...... 34 4.2. Huby ...... 35 4.2.1. Malachitová zeleň ...... 37 4.2.2. Kryštálová violeť ...... 38 4.2.3. Ostatné TFM farbivá ...... 40 4.3. Kvasinky ...... 41 4.3.1. Adsorpcia a bioakumulácia ...... 42 4.3.2. Biodegradácia ...... 43 4.4. Riasy ...... 43 4.4.1. Biodegradácia ...... 43 4.4.2. Biosorpcia ...... 45 5. Komerčné metódy bioremedácie ...... 46 5.1. In situ metódy ...... 46 5.1.1. Prirodzená atenuácia ...... 47 5.1.2. Bioaugmentácia ...... 47 5.1.3. Biostimulácia ...... 47 5.1.4. Bioventing ...... 48 5.1.5. Biosparging ...... 49 5.1.6. Bioslurping ...... 50 5.2. Fytoremedácia ...... 50 5.3. Ex situ metódy ...... 51 5.3.1. Kompostovanie ...... 51 5.3.2. Landfarming (obrábanie pôdy) ...... 52 5.3.3. Biokopy ...... 52 5.3.4. Bioreaktor ...... 53 5.3.5. Vegetačná koreňová čistiareň ...... 53 6. Záver...... 54 7. Zoznam literatúry ...... 56

Zoznam použitých skratiek

BG brilliantová zeleň BSK biologická spotreba kyslíka CB metylová modrá CV kryštálová violeť DCIP 2,6-dichlorofenol-indofenol JS Jalshakti® LB Luria-Bertani MG malachitová zeleň MSM médium pre acidofilné mikroorganizmy (mineral salts medium) MV metylová violeť NAPL nevodná kvapalná fáza (non aqaeus phase liquid) PDB zemiakový agar s dextrózou (potato dextrose broth) QSAR kvantitativní popis vztahu štruktúra-aktivita zlúčenín (quantitative structure-activity relationships) RB Remazol black RB RGY Remazol golden yellow RNL RR Remazol red RR TFM trifenilmetánové YM yeast malt (druh média)

Úvod

Používanie farbív je takmer také staré ako ľudstvo samotné. Jedným z prvých organických farbív bolo indigo, ktorým sa farbilo oblečenie. S rozvojom priemyslu sa zvýšila aj spotreba farbív a objavil sa tak problém ako ich z prostredia odstrániť. Legislatíva týkajúca sa odstraňovania syntetických farbív sa dnes stáva prísnejšou nielen vo vyspelých, ale aj v rozvojových krajinách. Výrobcovia sú tak nútení skúmať nové a efektívnejšie spôsoby odstraňovania farbív. Doterajšie fyzikálne a chemické metódy sa ukázali nedostačujúce niekedy až neúčinné. To podnietilo rozvoj nových metód využívajúcich organizmy. Huby, baktérie či riasy sa vyskytujú všade okolo nás. Sú nenahraditeľnou súčasťou biosféry. Zúčastňujú sa na rozklade organického materiálu, pomáhajú rastlinám fixovať dusík a obohacujú pôdu o dôležité živiny. Väčšinou sa s nimi človek stretáva ako s pôvodcami chorôb, pri výrobe potravín alebo naopak ich kazení. Organizmy schopné dekolorizácie farbív zahŕňajú baktérie, huby, kvasinky, riasy ale aj vyššie rastliny. Obývajú rozličné prostredia a predovšetkým baktérie sú schopné sa prispôsobiť širokej škále podmienok. Boli nájdené druhy vyskytujúce sa v pôdach znečistených organickými farbivami alebo priamo v odpadovej vode z továrne a vyvinuli sa u nich mechanizmy umožňujúce prežitie v tomto prostredí alebo dokonca schopnosť využívať farbivá ako zdroj uhlíka a energie. Huby majú zas veľký potenciál vďaka výborným sorpčným schopnostiam a nešpecifickým enzýmom, ktoré sú schopné rozkladať aj organické farbivá. Výskum sa preto sústreďuje na nájdenie takýchto mikroorganizmov, poznanie „dekolorizačného“ mechanizmu a nakoniec ich praktické využitie. Získané poznatky je možné využiť na urýchlenie prirodzených degradačných procesov alebo vytvorenie nových postupov na odstránenie doteraz neodstrániteľných polutantov.

1. Delenie organických farbív a ich charakteristika

1.1. Reaktívne farbivá

Reaktívne farbivá sú najdôležitejšia trieda celulózových farbív. Sú to napr. Procion MX, Remazol (hodváb), Cibacron F, Sabracon F a iné. Používajú sa aj na farbenie proteínových vlákien (vlna a hodváb). Chemická štruktúra molekúl reaktívnych farbív pozostáva z troch častí: chromofór, most a reaktívna skupina či skupiny. S farbenými látkami vytvárajú kovalentnú väzbu (molekula farbiva sa naviaže na hydroxilovú skupinu vlákna). Vďaka tomu sú považované za jedny z najefektívnejších permanentných farbív (Lorimer a kol. 2001). Podľa funkčnej

Cibacron Blue F 3GA skupiny sa delia do troch skupín: monofunkčné, bifunkčné a polyfunkčné reaktívne farbivá. Na základe aplikačnej teploty ich tiež môžeme rozdeliť na reagujúce v studenej alebo teplej vode. Sú rozpustné vo vode a aplikujú sa vodným kúpeľom v neutrálnom alebo mierne kyslom prostredí (Reactive dyes 2009).

1.2. Kyslé farbivá

Kyslé farbivá sú skupinou farbív rozpustnou vo vode. Majú anionické vlastnosti. V praxi sa používajú na farbenie hodvábu, vlny, nylonu a modifikovaných akrylových vláken. Na vlákna sa viažu vodíkovými väzbami a Van der Waalsovými silami. Majú tri podskupiny: azo, trifenilmetánové a antrachinonové farbivá (Acid dyes 2010).

1.2.1. Antrachinonové farbivá

Sú druhou dôležitou skupinou farbív, hneď po azo farbivách. Je to z toho dôvodu, že sú nákladnejšie na použitie. Dá sa tiež syntetizovať len obmedzené množstvo druhov antrachinonových farieb. Veľmi dobre odolávajú Antrachinonové farbivá vyblednutiu na svetle. Ich farebná paleta zahŕňa svetlomodré až tyrkysové farby. Veľmi dobre sa dopĺňajú s azo farbivami a ich kombináciou vznikajú nové farebné odtiene (Gordon a Gregory 1987). 13

1.2.2. Azo farbivá

Charakteristickým znakom je prítomnosť jednej alebo viac azo skupín. Je to najvšestrannejšia a najväčšia skupina farbív. Na farbenie textilu, plastov, kože, kozmetiky a jedla sa používa viac ako 2000 rôznych azo farbív. Azo farbivá sú klasifikované podľa prítomnosti azo skupín pripojených na centrum: mono-, di-, tri-, tetra- atď. Azo skupiny sú väčšinou pripojené ku benzénovým či naftalénovým kruhom. Môžu však obsahovať aj Lithol Rubine BK aromatické heterocykly alebo alifatické skupiny. Farba závisí na počte azo skupín a vedľajšom reťazci (Anliker 1979; Chudgar 1985; Clarke a Anliker 1980; Reisch 1996; Zollinger 2003).

1.2.3. Trifenylmetánové farbivá

Trifenylmetánové farbivá sa často používajú v textilnom priemysle na farbenie nylonu, vlny, hodvábu a bavlny. Niektoré druhy sú v medicíne používane ako biologické značky (biological stains). Využívané sú aj v kožiarskom a papierenskom priemysle. Petrochemický priemysel farbí trifenylmetánovými farbivami plasty, rôzne laky, oleje a vosky. Netoxické druhy sa používajú v potravinách a kozmetických výrobkoch. Trifenylmetánové farbivá majú antiparazitické a antimykotické účinky. Kedysi sa používali na liečbu škrkavky (genciánová Malachitová zeleň violeť) a v potravinárskom priemysle (malachitová zeleň) sa nimi ošetrovali rastliny a hlavne rybie chovy. Toxikologické testy však preukázali, že mnohé z týchto farbív majú potenciálne karcinogénne, teratogénne, mutagénne a ďalšie nebezpečné vlastnosti. Ich používanie bolo preto zakázané vo viacerých štátoch (Srivasta a kol. 2004).

1.3. Bazické farbivá

Je to skupina farbív/solí zásaditých látok, zvyčajne chloridov. Po rozpustení, sa vo vode vytvárajú ióny s pozitívnym elektrickým nábojom. Sú priťahované k látkam s aniónovým charakterom a viažu sa na ne pomocou elektrostatických síl. Materiály, ktoré sa nimi farbia sú: vlna, hodváb a modifikované akrylové vlákna. Bavlnu a celulózu je možné farbiť tiež, vyžaduje si to však náročnú prípravu a prídavok ďalších chemikálii a moridiel. Kyselina octová sa pridáva do farbiaceho kúpeľa na zvýšenie priľnavosti farby ku farbenému materiálu. Zásaditými farbivami sa farbí aj papier. V biológii (histológii) sa používajú na Kryštálová violeť farbenie vzoriek tkanív (kryštálová violeť, safranín, bazický fuchsín, metylénová modrá a ďalšie). Nevýhodou je rýchle blednutie a strácanie farby pod vplyvom slnečného žiarenia. Výnimkou sú akrylové vlákna, ktoré si po zafarbení zachovávajú pôvodnú farbu omnoho dlhšie ako prírodné vlákna (Basic dyes 2010; Properties of Basic Dyes 2011; About basic dyes 2013).

1.4. Priame farbivá

Názov dostali na základe ich schopnosti viazať sa na farbený materiál bez asistencie iných chemických látok. Na základe chemického zloženia sú soľami sulfónových kyselín. Aplikujú sa vodným kúpeľom obsahujúcim elektrolyty ako napríklad chlorid sodný (NaCl)

alebo síran sodný (Na2SO4). Teplota kúpeľa je 79,4 – 93,3°C (About Direct Dyes 2005; Lorimer 2001).

Priame farbivá vykazujú Typické priame farbivo afinitu k širokému spektru materiálov, napr. vlna, bavlna, hodváb, papier. S materiálmi nevytvárajú pevné väzby, na celulózové vlákna sa viažu pomocou slabých fyzikálnych síl (vodíkové väzby a Van der Waalsove sily). Ich sila závisí od veľkosti molekuly farbiva. Čím väčšia molekula, tým silnejšia väzba. Táto vlastnosť priamych farbív sa nazýva substantivita. Výhodou priamych farbív je ich univerzálnosť, jednoduchosť aplikácie a nízka cena. Na druhej strane pri farbení konkrétnych materiálov existujú 15 alternatívy, ktoré ich vedia zafarbiť lepšie a kvalitnejšie (About Direct Dyes 2005; Direct dyes 2009).

1.5. Disperzné farbivá

Disperzné farbivá sú jedny z mála vo vode nerozpustných farbív. Je to kvôli nepolárnemu charakteru ich väzieb. Vyznačujú sa tiež malou molekulovou hmotnosťou. Z chemického hľadiska patrí viac ako polovica z nich medzi azo zlúčeniny, štvrtina medzi antrachinónové farby a zvyšok predstavujú metínové, nitro a naftochinónové farbivá (Disperse dyes 2010). Broadbent (2001) uvádza, že disperzné farbivá sa na základe výsledkov viacerých testov ich vlastností delia do troch skupín: E typ (nízko energetické), SE typ Disperse Yellow 26 (stredne energetické), S typ (vysoko energetické).

Tabuľka 1. Delenie disperzných farbív

Molekulová Rýchlosť Stálosť na Polarita hmotnosť farbenia vzduchu 1. E typ nízka malá vysoká nízka 2. SE typ stredná stredná stredná stredná 3. S typ veľká vysoká nízka vysoká

Disperzné farbivá sa používajú hlavne na farbenie polyesteru, ale tiež na celulózu, polyamid a akrylové vlákna. Spojenie medzi vláknom a molekulou farbiva je výsledok pôsobenia viacerých síl. Vodíkový atóm v molekule umožňuje vytvorenie vodíkového mostíka s atómom kyslíka a dusíka molekuly farbeného vlákna. Veľmi dôležité sú aj sily vznikajúce pri interakcii dipólov a taktiež Van der Waalsove sily (Disperse dyes 2010; History and Properties of Disperse Dyes 2012).

1.6. Moridlové farbivá

Farbivá vyžadujúce moridlá sú špeciálnou triedou kyslých farbív, majú hydroxylovú alebo karboxylovú skupinu a záporný náboj. Iné obsahujú zas aminoskupiny a ich celkový náboj je kladný. Farbí sa nimi vlna, hodváb a rôzne polyamidy (Mordant dyes 2011; Introduction and properties of mordant dyes 2011).

Moridlové farbivá sú tie farbivá, ktoré vyžadujú prídavok moridla, aby mohli zafarbiť materiál. Moridlo sa aplikuje na farbený materiál a až následne sa pridáva zvolené farbivo. Moridlá zahŕňajú látky ako napríklad kyselinu trieslovú, extrakt z kôry či kyselinu olejovú a stearovú. Patria k nim aj rôzne soli chrómu, hliníka, železa, medi a cínu. Metalické zlúčeniny sa ako moridlá používajú častejšie než kyseliny. Je dôležité zvoliť správny druh moridla Mordant Red 11 pre konkrétnu farbu, keďže moridlo ovplyvňuje výslednú farbu látky. Taktiež zlepšuje jej stálosť pri pôsobení vody a slnečného žiarenia (Mordant dyes 2011).

Molekula farbiva je s farbeným vláknom spojená silnou iónovou väzbou formovanou medzi aniónovými skupinami farbiva a amónnymi katiónmi vlákna. Chróm alebo iný kovový ión vystupujú ako most medzi molekulou farbiva a vláknom. To vytvára silné spojenia a zabezpečuje výbornú farebnú stálosť. Nevýhodou je dlhý farbiaci cyklus, problémy pri tvorení rôznych odtieňov, riziko chemického poškodenia vlákna a toxicita používaných látok, napr. chrómu (Mordant dyes 2011; Introduction and properties of mordant dyes 2011)

1.7. Rozpustné farbivá

Charakteristickou vlastnosťou tohto typu farbív je ich rozpustnosť v organických rozpúšťadlách. Patria sem aj azo farbivá, ktoré stratili schopnosť ionizácie. Väčšina farbív sú farebné aromatické zlúčeniny schopné sa ionizovať. Rozpustné farbivá sú výnimkou a nemajú túto Solvent Back 5 schopnosť. Cieľový materiál zafarbia tým, že sa v ňom rozpustia. Musí to byť lipid alebo nepolárne rozpúšťadlo, lebo vo vode sú nerozpustné. Preto sa používajú na farbenie organických rozpúšťadiel,

17 uhľovodíkových palív, voskov, plastov, mazadiel a iných nepolárnych zlúčenín (Solvent dyes 2011; Shore 2002).

1.8. Farbivá obsahujúce síru

Sírové farbivá sú najpoužívanejšie prostriedky na farbenie vlny a spotrebuje sa ich aj najväčšie množstvo. Sírové farbivá nemajú zatiaľ presne určenú chemickú štruktúru. Obsahujú síru ako súčasť chromoforovej skupiny a taktiež aj polysulfidové bočné reťazce. Sú vo

Pravdepodobná štruktúra vode nerozpustné a nemajú žiadnu afinitu k celulózovým farbiva Sulfur Black 1 materiálom. Je možné ich rozpustiť v slabo zásaditom roztoku sulfidu sodného alebo iného redukčného činidla. Následne formujú leuko formu (bezfarebná), ktorá sa už môže viazať na celulózové materiály ako je bavlna, jutovina a iné. Po pridaní oxidujúceho činidla (napr. atmosférický kyslík) sa menia znova na vo vode nerozpustné a získavajú späť svoju farbu (Sulfur dyes, 2010; Nagl 2000)

Ich celková farebná stálosť je veľmi dobrá, výnimkou je citlivosť na bielidlá s obsahom chlóru. Konvenčný proces farbenia sírovými farbivami predstavuje značnú environmentálnu záťaž, je to predovšetkým znečistená priemyselná voda. Z tohto dôvodu ustupuje ich používanie na Západe, avšak v Číne sa stále tešia veľkej popularite. Uplatnením moderných postupov a nahradením toxických oxidačných činidiel je možné túto záťaž znížiť (Sulfur dyes 2010; Nagl 2000).

1.9. Kypové farbivá

Kypové farbivá sú veľmi starou skupinou farbív známou už od stredoveku. Prvou z nich bolo indigo, ale dnes sa tam zaraďujú všetky farbivá využívajúce rovnakú metódu aplikácie. Ich nanášanie prebieha vo veľkých kadiach a nádobách. Najčastejším materiálom farbeným kypovými farbivami je bavlna, vlna a iné.

Kypové farbivá sú nerozpustné vo vode a nemajú žiadnu afinitu k bavlne. Po ich redukovaní ditioničitanom sodným na leukoformu sa vo vode Vat Yellow 4 rozpustia a získajú schopnosť viazať sa na celulózové materiály. Roztok musí byť slabo alkalický. Po pripojení/priľnutí molekúl farbiva na látku, 18 farbivo je kyslíkom oxidované späť na nerozpustnú formu. Niektoré z nich sa oxidujú vplyvom slnečného žiarenia namiesto kyslíka. Príkladom je už spomínané indigo. Ich stálosť je vynikajúca aj v porovnaní s ostatnými farbivami. Na druhej strane, šúchaním farbenej látky sa farba ošúchava a materiál tak stráca svoju farebnosť. Ďalšou chemickou úpravou sa tomu dá zabrániť (Epp 1995; All about vat dyes 2009)

2. Metódy degradácie farbív 2.1. Chemické metódy 2.1.1. Oxidácia Veľmi rozšírená metóda, hlavne kvôli jednoduchému použitiu. Využívajú sa látky tvoriace radikály - TiO2, H2O2 . Najčastejšie je ako oxidujúca látka používaný peroxid vodíka (H2O2). Hydroxylové radikály vznikajúce rozkladom H2O2 môžu okamžite reagovať s väčšinou organických substrátov (Slokar a Le Marechal 1998). Pôsobia na väzby v aromatickom kruhu molekúl farbív a štiepia ho (Raghavacharya 1997). Pre vykonanie reakcie je však nutný katalyzátor. Používajú sa predovšetkým železité (Fe3+) a železnaté (Fe2+) ióny, manganistan draselný, popolček či UV žiarenie (Baxendale a Wilson 1957; Zepp a Hoigne 1992; Chaudhuri a Sur 2000), alebo ich kombinácia. Radikálova reakcia využívajúca ako katalyzátor ióny železa sa nazýva fentonova reakcia (fentonovo činidlo):

2+ 3+ - Fe + H2O2 →Fe + ·OH + OH

3+ 2+ + Fe + H2O2 →Fe + ·OOH + H

Je vhodná na odstraňovanie ako rozpustných tak aj nerozpustných farbív a predovšetkým pre farbivá toxické a rezistentné ku biologickej degradácii (Slokar a Le Marechal 1998). Nevýhodou je produkcia odpadového kalu. Ten obsahuje koncentrované nečistoty a je nutné sa ho zbaviť. Kal sa spaľuje na výrobu energie alebo ukladá na skládke. Ako environmentálne prijateľnejšie riešenie sa ukazuje jeho uskladnenie. Účinok fentonovej reakcie závisí na druhu zrážania a spôsobe usadzovania zrazeniny, aj keď zásadité farbivá sa nezrážajú vôbec. Kyslé, priame, kypové, moridlové a reaktívne farbivá sa zvyčajne zrážajú, ale výsledná zrazenina má nízku kvalitu, dobre sa neusadzuje a výsledky sú priemerné (Raghavacharya 1997). Ultrafialové žiarenie vykazuje najlepšie výsledky pri degradácií kyslých, priamych, zásaditých a reaktívnych farbív, ale ukázalo sa ako neúčinné na kypové a disperzné farbivá. Neprodukuje tiež žiaden kal a zápach je minimálny (Yang a kol. 1998). Optimálne podmienky pre degradáciu sú teda iné pre každý typ farbiva. Je nutné preto pristúpiť ku kompromisu vhodnému pre všetky farbivá, aby sme ich mohli rozkladať 19 primeranou rýchlosťou (Tang a Chen 1996). Rozsah odfarbenia závisí od množstva reagujúcich činidiel, čím je množstvo reaktantov/činidiel väčšie, tým je aj vyšší stupeň odfarbenia (Kuo 1992).

2.1.2. Ozonácia Touto metódou je možné degradovať chlorované fenoly, pesticídy a aromatické uhľovodíky (Lin a Lin 1993; Xu a kol. 1999). Množstvo organických polutantov (merané nepriamo pomocou BSK), ktoré zostane po aplikácii ozónu je dostatočne nízke, aby odpadová voda mohla byť vypustená do riek (Xu a kol. 1999). Tento spôsob je najúčinnejší pri použití na molekuly viazané dvojitou väzbou. Spolu s fyzikálnymi metódami je ozonácia užitočná pri odstraňovaní chromofórových skupín. Aplikácia ozónu v plynnom skupenstve predstavuje značnú výhodu, keďže nezvyšuje celkové množstvo odpadovej vody a kalu. Na druhej strane, ozón vydrží v stabilnej forme len 20 minút. Táto doba môže byť ďalej znížená prítomnosťou farbív. Stabilita molekuly je tiež ovplyvňovaná hodnotou pH, obsahom solí a teplotou. Zásadité prostredie urýchľuje rozklad ozónu, preto je dôležité pozorne sledovať pH roztoku. Ozón je potom nutné kontinuálne dopĺňať, čo zvyšuje aj náklady. Výsledná cena celého procesu závisí na množstve ozónu a prostriedkov na reguláciu pH a teploty (Peralta-Zamora a kol. 1999; Slokar a Le Marechal 1998).

2.2. Fyzikálne metódy 2.2.1. Adsorpcia Adsorpcia je veľmi populárna metóda odstraňovania mnohých toxických látok z vody, vrátane farbív. Zlúčeniny príliš stabilné na odstránenie bežnými procesmi, či toxické produkty biodegradácie sú najčastejšie odstraňované práve touto metódou (Choy a kol. 1999). Dekolorizácia je v tomto prípade výsledok dvoch dejov: adsorpcie a iónovej výmeny (Slokar a Le Marechal 1998). Jej efektivita závisí od interakcie medzi sorbentom a farbivom, od povrchu sorbentu, veľkosti častíc, teploty, pH a doby pôsobenia. Dôležitým faktorom je aj potrebné množstvo a možnosť regenerácie adsorbentu. Toto všetko ovplyvňuje výslednú ekonomickú prijateľnosť adsorpčného materiálu. Materiály najvyužívanejšie ako sorbenty sú: aktívne uhlie, rašelina, popolček, biosorbenty (chitosan, riasy...) a adsorbenty na báze kremíka a polymérov (Kumar a kol. 1998; McKay a kol. 1999).

2.2.2. Aktívne uhlie Je to najpoužívanejší materiál pri odstraňovaní farbív z vody adsorpciou (Nassar a El-Geundi 1991). Veľmi efektívne adsorbuje zásadité, moridlové, kyslé farbivá a v menšej miere aj disperzné, priame, kypové, pigmentové a reaktívne farbivá. Účinnosť závisí od druhu uhlia a zloženia znečistenej vody. Pridaním veľkého množstva je možné znásobiť množstvo adsorbovanej látky, za cenu zvýšenia nákladov. Regenerácia alebo znovu použitie aktívneho uhlia je možné, ale dochádza ku klesaniu efektivity (o 10 - 12%) v každej nasledujúcej aplikácii (Raghavacharya 1997; Rao a kol. 1994).

2.2.3. Rašelina Štruktúra rašeliny je vhodná pre adsorpciu, i keď celkový povrch je menší ako má aktívne uhlie. Je cenovo prijateľnejšia v porovnaní s uhlím, hlavne v krajinách s prírodnými zásobami. Použitú rašelinu je možné spáliť a využiť na výrobu elektriny (Poots a McKay 1976).

2.2.4. Popolček Popolček je vedľajší produkt pri výrobe energie v uhoľných elektrárňach. Jeho efektivita pri adsorpcii sa líši v závislosti od druhu farbiva, pH a obsahu anorganických solí. Tepelnou, chemickou a sonochemickou úpravou sa zlepšia jeho adsorpčné vlastnosti pri odstraňovaní farbív z vodných roztokov. Pôsobením vysokej teploty vzrastie hodnota efektivity popolčeka. Pôsobenie kyselín vo všeobecnosti zvýši adsorpciu farbív popolčekom. Sonochemická úprava vykazuje lepšie výsledky ako konvenčná chemická úprava. Najlepšie výsledky však vykazuje mikrovlnná chemická úprava (Wang a kol. 2005b).

2.2.5. Biosorbenty Biosorbenty sa pomaly stávajú alternatívou k ostatným, bežne používaným sorbentom. Sľubným príkladom sú produkty na báze chitosanu. Chitosan vzniká deacetyláciou polysacharidu chitínu. Získava sa zo schránok a ulít morských kôrovcov napr. kreviet a krabov. Je netoxický a plne degradovateľný (Monteiro a Airoldi 1999; Lavertu a kol. 2003; Tangpasuthadol a kol. 2003). Jeho ďalšie užitočné vlastnosti sú tiež hydrofilicita a ľahká dostupnosť vo veľkom množstve. Na druhej strane, chitosan sa rozpúšťa v kyselinách a kyslých roztokoch. Tomu sa dá zabrániť jeho „zosieťovaním“ či pokrytím

21 vhodnými látkami napr. epichlórhydrínom, formaldehydom atď. Deriváty chitosanu ďalej rozširujú možnosti a variabilitu jeho použitia (Varma a kol. 2004; Wan Ngah a kol. 2011).

2.2.6. Polyméry Charreyre a kol. (1995) skúmali vlastnosti polystyrénového latexu s rôznou hustotou náboja. Pri malých koncentráciách adsorpcia závisela hlavne od elektrostatických interakcií medzi sulfátovými skupinami a zásaditým farbivom. Veľká koncentrácia farbiva naopak favorizuje hydrofóbne interakcie medzi polystyrénovým polymérom a molekulou farbiva. Zvýšenie hustoty povrchového náboja polyméru zosilňuje jeho väzbové schopnosti. Komerčne dostupný polymér Jalshakti® (JS) bol predmetom výskumu pre svoje zaujímavé vlastnosti. Vo vodnom prostredí je schopný až 50-krát zväčšiť svoj objem. To uľahčuje následné adsorbovanie farbív z odpadovej vody. Zdá sa, že bazicita, veľkosť molekúl a stereochémia ovplyvňujú adsorpciu na JS. Ploché molekuly zásaditého farbiva boli adsorbované lepšie ako kužeľovité/kónické molekuly trifenilmetánových farbív (Dhodapkar a kol. 2006). Hydrogély obsahujúce akrylamid kyseliny maleinovej s amino funkčnými skupinami sú relatívne novým typom sorbentu. Používajú sa na odstraňovanie zásaditých farbív. Sú citlivé na zmeny pH a teploty, najlepšie výsledky vykazovali v kyslom prostredí pri pH< 5 (Duran a kol. 1999). Výsledkom pokusu s indigo karmínom bola adsorpcia 70 - 80% farbiva. K extrakcii farbiva z vody dopomohli karboxylo- a aminoskupiny na hydrogéloch (Kaşgöz 2005). Beta-cyklodextrínove polyméry sú ďalším z používaných druhov polymérov. Výsledky experimentov preukázali vysokú adsorpčnú kapacitu. Mechanizmus je založený na fyzikálnej adsorpcii, vytváraní vodíkových väzieb medzi hydroxyalkylovými skupinami polyméru a farbiva. Dôležitú úlohu hrajú molekuly beta-cyklodextrínu. Spolu s molekulami farbiva vytvárajú inklúzne komplexy. Polyméry s ich vyšším obsahom vykazovali väčšiu adsorpčnú kapacitu (Crini 2003). Ďalším adsorbentom sú odpadové polyakrylonitrilové vlákna modifikované etyléndiaminom. Adsorpčné schopnosti sa líšia spôsobom pyrolýzy. Modifikované polyméry pripravené pyrolýzou, pri teplote do 300°C, mali lepšie adsorpčné schopnosti ako nemodifikované. Ak bola teplota vyššia ako 400°C, polyméry nevykazovali žiadne adsorpčné schopnosti. To bolo spôsobené stratou nitrilových a iných skupín počas procesu. Polyméry pyrolyzované pri teplote do 300°C vykazovali nárast adsorpcie takmer o 100% oproti nepyrolyzovaným polymérom. Teplom ošetrené akrylové vlákna nemajú pórovitú

štruktúru, preto sú ich adsorpčné schopnosti závislé od funkčných skupín (Simitzis a kol. 1995).

2.2.7. Kremík Kremíkový gél je vynikajúci adsorbent, avšak na odstraňovanie farbív z vody nepoužiteľný. Veľmi rýchlo je totiž znečistený časticami obsiahnutými vo vzduchu. Účinnosť je znížená a bráni tak komerčnému použitiu. Lepšie výsledky vykazujú adsorbenty na báze kremíka kombinujúce ho s inou látkou. Napríklad hybridný materiál pripravený kombináciou 3-merkaptopropyltrietoxysilánu a tetraetoxysilánu, s vysokou hustotou karboxylových skupín. Dôležitým väzbovým miestom je prítomný sírový atóm. To spolu z mezopórovou štruktúrou robí z tohto materiálu účinný adsorbent (Wu a kol. 2004; Yan a kol. 2006). Zdvojnásobenie počtu karboxylových skupín však nevedie k zvýšeniu účinnosti. Príčinou môže byť veľkosť molekúl farbív a ich stereochémia brániaca naviazaniu ďalších molekúl. Molekulová veľkosť farbív je dôležitý parameter, ovplyvňujúci výslednú efektivitu adsorpcie. Sorpčný materiál môže byť regenerovaný jednoduchým premytím v kyseline. Získa sa tak nielen adsorbovaná látka, ale aj materiál, ktorý je možno znovu použiť (Yan a kol. 2006; Saleem a kol. 1993; Ahmed a Ram 1992).

2.3. Koagulácia Koagulácia je destabilizácia elektrostatických interakcií, ktoré môžu existovať medzi molekulami hydrolyzovaných reaktívnych farbív a vodou. Dosiahne sa pridaním chemického reaktantu - koagulantu. V praxi sa používa hlavne FeCl3 alebo Locron. Koagulačný agens je zvyčajne syntetický polymér z lineárnou štruktúrou a vysokou molekulovou hmotnosťou. Musí byť pridávaný za pomalého miešania, aby nedošlo k „rozbitiu“ zhlukov počas ich tvorby (Allegre a kol. 2004). Výhodou procesu je dobrá eliminácia nerozpustných farbív. Na druhej strane nutnosť ďalšieho spracovania vzniknutého odpadového kalu navyšuje náklady. Na dosiahnutie vyššej efektivity pri odstraňovaní farbív a zníženie BSK sa využíva kombinácia dvoch metód: chemickej koagulácie a fentonovej reakcie, alebo ozonácie a chemickej koagulácie. Účinnosť chemického ošetrenia, ako je chemická koagulácia a fentonova reakcia, závisí od rozpustnosti farbív a ich chemickej štruktúry. Za optimálnych podmienok bolo získaných okolo 99% farbiva z odpadovej vody a došlo k zníženiu BSK o 90% (Kim a kol. 2004)

Voda často obsahuje aj nekoagulujúce farbivá. Viacstupňovým procesom sa najskôr odstránia tie, ktoré sú schopné koagulácie. Následne sa ozonáciou oxidujú nekoagulujúce látky, aby mohli byť odstránené koaguláciou (Hsu a kol. 1998).

2.4. Nanofiltrácia V posledných rokoch sa dostalo do popredia čistenie odpadovej vody pomocou filtrácie cez nanomembrány. Parametrami sa nachádzajú medzi membránami na ultrafiltráciu a membránami na reverznú osmózu. Na tok cez membránu vplývajú viaceré parametre, ako je napríklad hodnota pH, koncentrácia komponentov a rýchlosť prietoku (Xu a Spencer 1997). Boli vykonané experimenty s úpravou odpadovej vody pred samotnou filtráciou. Neutralizovanie kvapaliny pomocou HCl zvýšilo prietok a znížilo množstvo získanej soli (Koyuncu 2003a; Koyuncu a kol. 2003). Po okyslení roztoku kyselinou sírovou a HCl došlo k menšiemu znečisteniu membrány, stúplo množstvo získaného NaCl a došlo k odpudzovaniu farbív s väčšou molekulovou hmotnosťou (Koyuncu 2003b). Membrány sú citlivé na upchanie, ktoré znižuje prietok kvapaliny a vo výsledku aj ich účinnosť. Prítomnosť soli tiež bráni prietoku cez membránu (Akbari a kol. 2002). Ako odpoveď na tento problém boli preto vyvinuté membrány z iných materiálov. Vytvorené membrány mali nižšiu citlivosť na obsah NaCl ako konvenčne používané polyamidové membrány (Akbari a kol. 2006). Došlo tiež k spomaleniu ich upchávania (Akbari a kol. 2002). Na zvýšenie efektivity boli prijaté postupy využívajúce trojstupňovú separáciu pomocou nanomembrán. V prípade jednostupňového procesu bola postačujúca efektivita dosiahnutá neutralizáciou pH. „Biologicky ošetrené“ farbiace kúpele majú pri filtrácii ešte lepšie výsledky. Počas priamej filtrácie obyčajných farbiacich kúpeľov spôsobilo usadzovanie organického materiálu na membráne zníženie výkonu o 73%. „Biologicky ošetrené“ farbiace kúpele naopak vykazovali menej problémov s prietokom. Kvalita takto vyčistenej/prefiltrovanej vody dosahovala dostatočnú hodnotu, aby mohla byť znovu použitá ako priemyselná voda (Van der Bruggen a kol. 2001). Noël a kol. (2000) skúmali možnosť vylepšenia membrány pomocou elektrického poľa. V prípade membrány s elektrickým poľom ukazujú výsledky na jej lepšie opätovné spriechodnenie. Membrána bez elektrického poľa vykazovala len čiastočné spriechodnenie. Zdá sa, že elektrické pole ovplyvňuje častice zanášajúce membránu a odďaľuje formovanie ich vrstvy na nej.

3. Toxicita 3.1. Čo je toxicita Toxicita sa definuje ako schopnosť látky mať nežiadúci účinok na bunku, orgán, organizmus alebo ekosystém. Látky majúce tieto účinky sa nazývajú toxikanty. Výsledný účinok toxikantov a ich správanie závisí na viacerých faktoroch. Chemická a priestorová štruktúra, skupenstvo hustota, či je látka chemicky čistá alebo ide o zmes viacerých látok, rozpustnosť vo vode atď. Medzi najdôležitejšie vlastnosti patria polarita (ovplyvňuje pohyb látok) a u kovov forma, v ktorej sa vyskytujú. Pri hodnotení toxicity látky treba tiež dbať na dobu expozície organizmu, koncentráciu toxikantu a jeho dávku. Samotný organizmus má tiež svoj vplyv- jeho celkový fyziologický a zdravotný stav či rozdiely v citlivosti medzi taxonomickými skupinami (Anděl 2011; Fargašová 2008).

3.2. Doba expozície a dávka toxikantu

O osude organizmu vystaveného toxickej látke rozhoduje koncentrácia toxickej látky a taktiež doba expozície organizmu. V prípade krátkej doby pôsobenia látky je dôležitá dávka toxikantu. Ak je prekročená určitá hranica poškodenia (iná u každého organizmu a látky), ktoré organizmus nie je schopný zregenerovať, organizmus odumiera. Takáto dávka sa označuje ako terminálna. Pri nižšej dávke je zasiahnutá len časť tkaniva. Postihnutý organizmus je však schopný sa „uzdraviť“ a regenerovať poškodené oblasti. Dlhá doba vystavenia pôsobeniu toxikantu môže mať následky aj pri jeho nízkej dávke, neúčinnej pri krátkodobej expozícii. Organizmus sa buď adaptuje na prítomnosť toxikantu, alebo otrava prechádza do chronicity. Tá sa končí smrťou prípadne vážnym poškodením organizmu. V prípade, že látky ovplyvňujú genetický materiál bunky, označujú sa ako genotoxické. Účinok týchto látok sa môže prejaviť až po dlhšej dobe, niekedy až v ďalšej generácii. Pôsobenie týchto látok môže mať vážne dôsledky – zvýšenú početnosť mutácii (mutagény), vznik vývojových deformácii (teratogénny), alebo nádorových ochorení ak sú to karcinogény (Fargašová 2008).

3.3. Klasifiácia toxických látok

Podľa právnych predpisov Slovenskej republiky a Európskej únie sa nebezpečné látky klasifikujú na: toxické (T), vysoko toxické (T+), zdraviu škodlivé (Xn), dráždivé (Xi), žieravé (C). Bez špecifického označenia sú látky karcinogénne, mutagénne, senzibilizujúce a teratogénne.

3.4. Odhad rizika

Odhad miery rizika chemických látok pre jednotlivé zložky ekosystémov je postup, ktorý využíva syntézu všetkých dostupných údajov o chemickej látke pre určenie druhu a stupňa nebezpečnosti požitej chemickej látky pre jednotlivé skupiny organizmov alebo celé ekosystémy. Riziko je charakterizované ako pravdepodobnosť s akou je možné pozorovať nepriaznivý účinok toxínu potom ako je živý organizmus vystavený jeho účinku. Odhad miery rizika pozostáva zo štyroch krokov:

Prvým krokom je identifikácia nebezpečnosti. Zahŕňa popis možných nežiadúcich účinkov chemickej látky na vybraný rastlinný/živočíšny druh, spoločenstvo druhov, ekosystém alebo celý región. Predstavuje sústredenie všetkých dostupných dát o chemickej látke, vrátane toxikologických (Fargašová 2010).

Nasleduje analýza expozície a následkov t.j. vzťah dávka-odpoveď. Študuje sa vzťah medzi dávkou a mierou nepriaznivého účinku na organizmus. Rovnako sa študuje vzťah medzi množstvom látky v životnom prostredí a mierou nežiadúceho účinku na prostredie. Odhady sa upravujú modifikátormi, ktoré vyjadrujú neistotu vznikajúcu pri extrapolácii výsledkov z testov (Fargašová 2009).

Tretím krokom je určenie expozície. Cieľom je predpovedanie alebo stanovenie priestorovej a časovej distribúcie polutantu a jeho súčasný výskyt alebo kontakt so záujmovou ekologickou zložkou (Fargašová 2010).

Záverečným krokom je hodnotenie rizika. Prebieha určenie pravdepodobnosti objavenia sa nepriaznivých účinkov ako výsledok expozície polutantu. Charakterizácia rizík obsahuje aj analýzu a sumarizáciu neistôt identifikovaných v priebehu všetkých častí hodnotenia rizík a podporné informácie vo forme diskusie o závažnosti dôkazov (Fargašová 2010).

3.5. Ekotoxikologické biotesty

Biotesty sú jednou zo základných metód posudzovania toxicity. Nevyznačujú sa vysokou presnosťou ani citlivosťou. Využívajú sa preto skôr na rýchle posúdenie analyzovanej látky a jej možného vplyvu na životné prostredie. Nevýhodou biotestov je, že odpoveď živého organizmu je študovaná v zjednodušených laboratórnych podmienkach. Správanie sa látky a jej účinok sa môže preto i značne líšiť od reakcie v komplexnom prirodzenom prostredí, ktoré zahŕňa väčšie množstvo pôsobiacich faktorov. Preto sa takéto

26 odhady upravujú modifikátormi, ktoré vyjadrujú túto neistotu vznikajúcu pri extrapolácii výsledkov z biotestov:

푁푂퐴퐸퐿(퐿푂퐴퐸퐿) 푅푓퐷 = 푈퐹×푀퐹

RfD- referenčná dávka, UF- faktor neistoty, MF- modifikačný faktor, LOAEL- najnižšia úroveň pozorovaného nepriaznivého účinku, NOAEL- úroveň žiadnych pozorovaných nepriaznivých účinkov

Štandardizáciu laboratórnych testov majú na starosti viaceré medzinárodné organizácie. Predovšetkým sú to: OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), ISO (The International Organization for Standardization), WHO (World Health Organization) alebo U.S. EPA (United States Environmental Protection Agency). Výhodou týchto laboratórnych testov je výborná reprodukovateľnosť a možnosť rutinného spracovávania veľkého množstva vzoriek. Štandardizovaný je celý postup- od testovanej látky a jej formy aplikácie, cez charakter testovacieho organizmu až po dobu trvania testu a štatistické vyhodnotenie. Medzi testovacie organizmy patrí napr. myš laboratórna (Mus musculus var. alba), dážďovka hnojná (Eisenia fetida), dafnia veľká (Daphnia magna) alebo baktérie Vibrio fischeri (Fargašová 2009).

Na dosiahnutie čo najlepšieho výsledku je potrebné sa priblížiť čo najviac reálnym podmienkam. Prvým krokom je vykonanie viacerých samostatných testov na rôznych organizmoch. Tie sú vyberané tak, aby čo najlepšie reprezentovali zloženie ekosystému a potravinového reťazca. Takéto sady sa označujú batérie testov (Anděl 2011).

Ešte väčšie priblíženie k realite možno dosiahnuť testovaním látok na mikrokozmoch. Sú to malé, uzavreté modelové ekosystémy. Predstavuje ich buď akvárium s vodou a typickými rastlinami a živočíchmi, alebo vzorky pôdy odobratej z terénu. Výhodou je práca s čiastočne reálnym prostredím a jednoduchá príprava. Na druhej strane klesá stupeň štandardizácie testu (Anděl 2011).

Špecifickou metódou je transplantačný pokus. Organizmus vypestovaný v laboratóriu je prenesený do prírody na miesto predpokladanej expozície toxickou látkou. Tam je ponechaný určitý čas. Potom sa prenesie späť a v laboratóriu sa zisťujú prípadné zmeny (biochemická, morfologické a fyziologické). Príkladom je vystavenie rastlín v kvetináčoch automobilovému smogu pri cestách (Anděl 2011).

Testovanie účinkov toxikantov môže prebiehať aj priamo v prostredí (pokusné polia a vodné nádrže). Tieto systémy predstavujú najkomplexnejšie prostredie na experimenty s toxikantami. Nevýhodou je prakticky nulová možnosť štandardizácie (Anděl 2011).

Ďalšou metódou sú terénne štúdie, ktoré už pracujú s reálnymi ekosystémami. Zameriavajú sa na štúdium reálnych kontaminácii prostredia a preto ich nemožno realizovať ako cielené pokusy. Sú dva základné typy: hodnotenie bezprostredného vplyvu polutantu na danú oblasť a hodnotenie vplyvu polutantu po kontaminácii, ku ktorej došlo v minulosti. Takto získané dáta sa použijú napr. pri sanácii znečistenej oblasti (Anděl 2011).

Ako alternatíva k biotestom na zvieratách a iných živých organizmoch bola vyvinutá metóda QSAR. Využíva vzťah medzi štruktúrou látky, priestorovým usporiadaním, väzbovými vlastnosťami a jej toxicitou. Získané dáta sa následne analyzujú pomocou matematických a štatistických modelov. Porovnávajú sa s podobnými látkami, čím väčší je súbor dát, tým je lepšie odvodenie modelu/rovnice. Výsledkom je predpokladaná toxicita analyzovanej látky alebo látok (Anděl 2011, Tichý 2008).

3.6. Toxicita trifenylmetánových farbív

Trifenylmetánové farby sú široko rozšírené farbivá v priemysle (textilný, kožiarsky, potravinársky). V minulosti boli často používané priamo v potravinárstve, ale dnes trifenylmetánové farby používané nie sú, pretože boli označené ako toxické látky.

Konkrétnym príkladom je malachitová zeleň. Táto farba je známa svojimi antiparazitickými a mykocídnymi účinkami. Pre tieto vlastnosti sa používa(la) vo vodných kultúrach na ošetrenie rýb a v potravinárstve či farmácii na dezinfekciu (Culp a Beland 1996). Zabraňuje hubovým i prvokovým infekciám a ďalším chorobám spôsobovaným hlístovcami (Nematoda). Správy a hlásenia o jej toxicite a nežiaducich účinkoch vyvolali v minulosti polemiku, či je dobré ju aj naďalej používať. Toxicita farbiva rastie s jeho stúpajúcou koncentráciou a dobou jeho pôsobenia na organizmus. Účinky sú akútne aj chronické. Malachitová zeleň má karcinogénne, mutagénne, teratogénne vlastnosti, spôsobuje poškodenie chromozómov a respiračného systému. Histopatologické efekty zahŕňajú poškodenie tkanív viacerých orgánov. U rýb došlo po ich vystavení malachitovej zeleni k výraznej zmene biochemického zloženia ich krvi. Reziduá farbiva malachitovej zelene sa našli vo svaloch, pečeni, krvnom sére, obličkách a ikrách rýb (Srivastava a kol. 2004).

Na niektorých druhoch cicavcov boli tiež pozorované toxické účinky malachitovej zelene: poškodenie orgánov (pečeň, obličky, slezina, srdce...) mutagenita, karcinogenita a poruchy vývoja plodu. Sú opodstatnené predpoklady o jej negatívnych účinkoch aj na ľudí (Srivastava a kol. 2004). Na základe týchto dát bola malachitová zeleň zaradená americkou US Food and Drug Administration a ďalšími štátmi na zoznam zakázaných látok používaných v potravinárstve a jej dovtedajšie používanie bolo zakázané. Napriek tomu sa v niektorých krajinách sveta používa doteraz (Chang a kol. 2001).

Rovnaké alebo podobné účinky vykazujú aj ďalšie trifenylmetánové farbivá. Kryštálová violeť, používaná v textilnom priemysle a bakteriológii (Grammovo farbenie) je v podstate „mitotický jed“, potenciálny karcinogén pre ryby a má tiež mutagénne účinky (Au a kol. 1978; Fan a kol. 2009). Rovnako aj metylová violeť ktorou sa kedysi značkovalo mäso (Thomas a Macphee 1984). Victoria a metylénová modrá (používané ako antiseptiká) majú takisto aj mutagénne účinky (Chung a kol. 1981; Epe a kol. 1993). Oplatowska a kol. (2011) preukázali prenos briliantovej zelene, tejto potenciálne karcinogénnej farby, cez pokožku a to už po krátkom kontakte (30s). Jej používanie na farbenie papierových utierok preto môže predstavovať isté riziko pre človeka. V potravinárstve sa do týchto utierok balia ryby a farbivo sa tak dostáva do rybích tkanív. Koncentrácia farbiva prítomného v odobratých vzorkách z takto balených rýb boli podobné hodnotám u rýb z chovov kontaminovaných briliantovou zeleňou.

4. Biodegradácia organických látok organizmami

Organické farbivá sú dôležitou súčasťou viacerých priemyselných odvetví (textilný, potravinársky, kožiarsky priemysel, výroba plastov...). Ich odstraňovanie pomocou štandardných chemických a fyzikálnych metód je obvykle nákladné a málo účinné. Veľa z farbív prechádza štandardným procesom čistenia bez zmeny. U niektorých síce dochádza k ich rozkladu, ale výsledný produkt je často rovnako a niekedy i viac toxický (malachitová zeleň sa mení na leukomalachitovú zeleň). Odstraňovanie adsorpciou býva tiež nákladné a adsorbent s farbivom je nutné bezpečne uskladniť. Preto sa pozornosť upriamila na možnosti biodegradácie pomocou organizmov. Cieľom je nájsť vhodné druhy, schopné transformovať farbivá na netoxické látky pri čo najnižších nákladoch.

4.1. Baktérie Baktérie, tak ako aj iné mikroorganizmy vrátane húb a rias predstavujú alternatívu k bežným postupom na odstraňovanie farbív. Majú niekoľko výhod napr. oproti hubám je degradácia farbív baktériami o niečo rýchlejšia (Kalyani a kol. 2009). Veľká pozornosť sa venuje výskumu biodegradácie priemyselne najpoužívanejších azo farbív. Baktérie sú schopné dosiahnuť vysoký stupeň dekolorizácie a môžu byť aplikované na široké spektrum farbív. Proces nie je finančne nákladný a produkcia odpadu je minimálna (Verma a Madamwar 2003). Vo väčšine prípadov baktérie odstraňujú farbivá pomocou degradácie. Najčastejšie sú to rôzne typy reduktáz, napr. azoreduktáza, DCIP reduktáza. Rozklad môže prebiehať aeróbne aj anaeróbne. Z anaeróbnych podmienok dochádza ku rozštiepeniu azo skupiny azoreduktázami a následnému odfarbeniu roztoku. Vzniknuté produkty však môžu mať potenciálne nežiadúce účinky (Chung a kol. 2008). Riešením je najprv azo farbivá degradovať anaeróbnymi baktériami a škodlivé produkty (aromatické amíny), ktoré pri tom vzniknú rozložiť pomocou aeróbnych baktérii. (Oxspring a kol. 1996; O’Neill a kol. 2000). Ďalšou skupinou sú trifenylmetánové farbivá. Používanie týchto farbív v potravinárstve predstavuje zvýšené riziko pre človeka. V niektorých prípadoch sa ukázali ako potenciálne nebezpečné pre človeka a zvieratá. 4.1.1. Malachitová zeleň Malachitová zeleň je jedným z trifenylmetánových farbív, v minulosti často používaná v potravinárstve. V prírode sa veľmi ťažko rozkladá a vytvára tak dlhodobú záťaž pre životné prostredie. Pre nedostatočnú efektivitu jej odstránenia použitím konvenčných metód sa výskum zameral na organizmy (baktérie, huby, riasy...) schopné ju in vitro odstrániť (Azmi a kol. 1998). Ich efektivita a rýchlosť procesu sa líši podmienkami (obsah/prítomnosť kyslíka, teplota...) a druhom samotným. Kocuria rosea bola pri koncentrácii farbiva 50 mg/L a statickej kultivácii schopná po piatich hodinách dosiahnuť 100% odfarbenie roztoku. Naopak v submerzných kultúrach nedošlo k žiadnemu odfarbeniu. Možným dôvodom je kompetícia kyslíka a molekuly farbiva o elektróny pri lepšom prestupe vzduchu. So stúpajúcou koncentráciou farbiva sa rýchlosť odfarbenia znižovala. Enzýmová analýza naznačila účasť reduktáz v procese dekolorizácie. Najviac sa podieľala DCIP a MG reduktáza. Lakáza, tyrozináza a lignín peroxidáza vykazovali nízku aktivitu. Ich podiel na reakcii bol teda minimálny (Parshetti a kol. 2006).

Podobne sa správa aj baktéria Kurthia sp. Pri nízkych koncentráciách (1 - 10 µM) degradovala 96% farbiva v roztoku. So stúpajúcou koncentráciou sa aktivita buniek znižovala až došlo k úplnému zastaveniu dekolorizácie pri hodnote 20 µM (Sani a Banerjee 1999).

Naopak Pseudomonas otitidis WL-13 nestrácala rýchlosť a schopnosť dekolorizácie aj pri vyšších koncentráciách (500 µmol/L). V jej prípade reakcia prebehla v statickej aj submerznej kultúre. V teplotnom rozmedzí 35 - 40oC adsorbovala kultúra baktérie P. otitidis WL-13 farbivo najlepšie. Pri takmer polovičnej teplote (20 - 25oC) sa aj rýchlosť reakcie znížila na polovicu (Wu a kol. 2009).

Aj degradačné schopnosti Bacillus cereus záviseli v značnej miere na teplote. Optimálna teplota pre degradáciu MG bola 30 až 37oC a neutrálne pH (7). V submerznej kultúre boli degradačné schopnosti B. cereus významne inhibované. V anaeróbnych a mikroaerofilných podmienkach bola miera dekolorizácie vysoká a významne sa nelíšila v obidvoch prípadoch. Zdroj uhlíka nemal v prípade B. cereus veľký vplyv na jeho schopnosť dekolorizácie. Všetky tieto faktory pôsobili na mieru a rýchlosť odfarbenie MG. Bacillus cereus za 4 hod. odfarbil roztok s počiatočnou koncentráciou malachitovej zelene 55 mM. Odstránených bolo 95 - 98% farbiva obsiahnutého v roztoku (Deng a kol. 2008).

Degradačnými schopnosťami sa vyznačuje aj baktéria Schewanella decolorationis NTOU 1. Za anaeróbnych podmienok S. decolorationis odfarbila malachitovú zeleň, metylovú violeť a kryštálovú violeť. Efektivita bola vysoká a baktéria to dokázala bez lag fázy. Rastúca koncentrácia všetkých troch farbív urýchľovala proces dekolorizácie, minimálne do hodnoty 1500 mg/L (Chen a kol. 2010).

Pre dosiahnutie čo najlepších výsledkov skúmal Chen a kol. (2010) toxicitu MG a produktov po jej degradácii. Toxikologický test na myšacích bunkách naznačil toxicitu malachitovej zelene (koncentrácia 100 mg/L). Toxicita roztoku nepatrne poklesla po dekolorizácii S. decolorans NTOU1- produkty sa ukázali menej toxické ako východiskové látky. Predlženie degradácie roztoku obsahujúceho produkty dekolorizácie však vyústilo do nárastu toxicity roztoku. Táto skutočnosť je veľmi dôležitá, pretože niektoré štúdie ukázali premenu malachitovej zelene na rovnako toxickú leukomalachitovú zeleň (Burchmore a Wilkinson 1993).

4.1.2. Kryštálová violeť

Kryštálová violeť (CV) je na rozdiel od ostatných trifenilmetanovych farbív častejšie používaná v bakteriológii ako v priemysle (textilný, potravinársky). Je zložkou Grammovho farbenia baktérii a pre svoje antibakteriálne vlastnosti sa používa v medicíne (Maley a Arbiser 2013). Dnes sa pre podozrenia z karcinogenity a ďalších nežiaducich vlastnosti od jej používania ustupuje. Ťažko sa rozkladá v prírode a ako iné trifenilmetánové farbivá, odoláva čisteniu v čističkách odpadových vôd. Aj tu je riešením izolácia a použitie mikroorganizmov schopných rozložiť kryštálovú violeť. Veľkú úlohu hrá nielen druh organizmu, ale aj podmienky celého procesu degradácie (Reyns a kol. 2014).

Agrobacterium radiobacter dekolorizuje CV pri statickej kultivácii. Pri koncentrácii 10 mg/L bola kryštáľová violeť kompletne degradovaná za 8 hodín. Stúpajúca koncentrácia farbiva predlžila čas jeho degradácie bakteriálnou kultúrou. Napríklad pri koncentrácii 100 mg/L, potrebovala baktéria na 100% odfarbenie roztoku až 86 hodín. Vhodne zvolené médium významne skrátilo čas degradácie. Najlepšie výsledky dosiahlo médium obsahujúce

1% kvasničného extraktu a 0.1% NH4Cl. Kryštálová violeť bola v tomto médiu úplne dekolorizovaná za 5 hodín. Pre komerčné využitie je dôležité aj to, koľkokrát sa môže jedna kultúra opakovane použiť. Maximálny počet opakovaných použití jednej kultúry bolo sedemkrát, potom už došlo k zníženiu jej dekolorizačných schopností. Na procese degradácie kryštálovej violete sa najviac podieľali enzýmy lakáza a aminopyrín N- demetyláza (Parshetti a kol. 2011).

Anaeróbne podmienky vyhovovali baktérii Schewanelle decolorans NTOU1. Efektivita dekolorizácie bola vysoká (298 mg/L za hodinu) a baktéria to dokázala bez lag fázy. Ani rastúca koncentrácia nerobila baktérii žiaden problém, proces dekolorizácie prebiehal až do koncentrácie 1500 mg/L. Najlepšie výsledky boli dosiahnuté pri teplote 30 - 40oC a v rozmedzí pH 8 - 9. Chen a kol. (2008) vykonali toxikologický test na myšacích bunkách a baktérii E. coli, ktorý preukázal toxicitu CV (použitá koncentrácia roztoku farbiva bola 100 mg/l). Po dekolorizácii S. decolorans NTOU1 toxicita roztoku významne poklesla. Možno sa teda domnievať, že baktéria je schopná detoxikovať CV (Chen a kol. 2010; Chen a kol. 2008).

V niektorých prípadoch má na schopnosť dekolorizácie veľký vplyv médium a aditívne zdroje uhlíka. Pozorovať to možno u Sphingomonas paucimobilis. Baktéria bola kultivovaná submerzne na MSM (mineral salts medium). Ak bolo farbivo jediným zdrojom uhlíka, jeho dekolorizácia bola nízka. Pri nízkej počiatočnej koncentrácii farbiva (2,5 mg/L) 32 sa ho odstránilo len 55%. So stúpajúcou počiatočnou koncentráciou farbiva klesá dekolorizačná schopnosť baktérie. Tomu je možné zabrániť použitím vhodného dodatočného zdroja uhlíka. Kvasnicový extrakt ako zdroj uhlíka skrátil dobu odfarbenia z približne 24 na 10 hodín. Glukóza naopak umožnila dosiahnuť vysokú efektivitu degradácie (78%) aj pri vysokých koncentráciách (50 mg/L). Vo výsledku glukóza zlepšila dekolorizačné schopnosti pri vysokých koncentráciách, zatiaľ čo extrakt z kvasníc zvýšil rýchlosť odfarbenia (Cheriaa a Bakhrouf 2009) Ak bolo farbivo jediným zdrojom uhlíka, rovnako pomaly ho dekolorizovala aj Pseudomonas putida. Rozloženie 60 µM kryštálovej violete prebehlo v rámci jedného týždňa. Na konci bolo z roztoku dekolorizovaných 78% farbiva. V rozmedzí pH 6 - 7,5 dosahovala najlepšie výsledky s minimálnymi rozdielmi (Chen a kol. 2007). Bacillus subtilis takisto rozkladá kryštálovú violeť (37oC, pH =7), kompletná dekolorizácia nastáva po 24 hod. (Yatome a kol. 1991). Rozloženie v obidvoch prípadoch prebehlo za účasti enzýmov. U P. putida bola zaznamenaná zvýšená aktivita MG a DCIP reduktáz. Na druhej strane v prípade B. subtilis neboli doposiaľ popísané enzýmy podieľajúce sa na degradácii CV. U Pseudomonas putida sú vzniknuté produkty výsledkom demetylácie CV. Iný druh rodu Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa je toho rovnako schopný. Maximálna hodnota dekolorizácie bola dosiahnutá v roztoku s koncentráciou farbiva 15 mg/L. U obidvoch druhov bola stúpajúca počiatočná koncentrácia limitujúcim faktorom. Pridaním iónov železa Fe3+ a kadmia Cd2+ bola rýchlosť degradácie mierne zvýšená. Produkty, ktoré vznikli počas rozkladu kryštálovej violete baktériou a tiež konečné produkty sa nepreukázali ako toxické (El-Naggar a kol. 2004).

Dekolorizačné schopnosti baktérie Kurthia sp. sú veľmi široké a okrem kryštálovej violete je schopná úspešne degradovať aj ďalšie trifenilmetábové farbivá (MG, BG a iné). Pri počiatočnej koncentrácii 10 µM bolo dekolorizovaných 96% kryštálovej violete. Ešte pri dvojnásobnej koncentrácii vykazovala po 30 minútach 86 % odfarbenie roztoku, ale nad hodnotou 50 µM sa dekolorizácia úplne zastavila. Analýza buniek po dekolorizácii odhalila, že proces prebiehal degradáciou a nie adsorpciou keďže neboli prítomné žiadne zafarbené bunky (Sani a Banerjee 1999).

Aktinobaktéria Nocardia corallina a Nocardia globerula sú schopné rozkladať kryštálovú violeť. Výskum sa sústredil najviac na druh N. corallina. Podmienky najviac vyhovujúce boli: nízka koncentrácia farbiva (5 µmol), skorá log fáza a LB kultivačné médium. Ako produkt degradácie bol identifikovaný Michlerov ketón (Yatome a kol. 1993).

4.1.3. Fuchsín

Fuchsín je vďaka svojej chemickej štruktúre jedným z ťažšie degradovateľných trifenilmetánových farbív. Pravdepodobnou príčinou sú tri aminoskupiny v molekule fuchsínu. Schopnosť rozkladať fuchsín bola zistená u aktinobaktérie Nocardia corallina (Yatome a kol. 1993).

Citrobacter sp. dekolorizoval fuchsín menej efektívne ako iné farbivá. Množstvo 30 µM farbiva v roztoku bolo hranicou efektívnej dekolorizácie. Vyššie koncentrácie fuchsínu už inhibovali celý proces degradácie (An a kol. 2002).

Fuchsín Joshi a Mhatre (2015) izolovali kmeň baktérie Enterococcus sp. s potenciálnymi degredačnými schopnosťami. Tento kmeň bol schopný degradovať roztok malachitovej zelene a roztok karbolfuchsínu (vzniká zmiešaním fuchsínu a fenolu). Enterococcus sp. odstránil 92% karbolfuchsínu do 24 hod. (koncentrácia roztoku bola 0,02 g/L). Optimálne podmienky boli teplota 37 a neutrálne pH (pH=7). Fytotoxický test roztoku po jeho biodegradácii preukázal veľmi nízku až žiadnu toxicitu.

4.1.4. Ostatne TFM farbivá

Sani a Banerjee (1999) zahrnuli do svoje práce o Kurthia sp. aj trifenilmetánové farbivá, ktorých degradácia bola skúmaná inými autormi menej často. Briliantová zeleň sa používa k farbeniu hodvábu a vlny. Mechanizmus jej rozkladu je podobný ako u malachitovej zelene. Dekolorizovaný baktériou Kurthia sp. je aj parafuchsín. Do koncentrácie 30 µM prebiehala dekolorizácia bez problémov, vyššia koncentrácia inhibovala bunečnú aktivitu. Odfarbenie etylovej violete je náročné pre mikroorganizmy. Pravdepodobnou príčinou je Brilliantová zeleň štruktúra samotného farbiva, ktoré má dietylové postranné reťazce miesto dimetylových. Preto aj roztok s nízkym obsahom etylovej violete (1 µM) bol baktériou Kurthia sp dekolorizovaný len o 36%. Ďalším možným dôvodom nízkej efektivity dekolorizácie je aj vyššia toxicita etylovej violete v porovnaní s inými trifenilmetánovými farbivami. Toxicita bola skúmaná na základe počtu životaschopných buniek po dekolorizácii. U etylovej violete zostalo len 11 živých buniek na ml (Sani a Banerjee 1999). Yatome a kol. (1993) zistili rozklad etylovej violete baktériou Nocardia corallina.

4.2. Huby Zatiaľ čo u baktérii prevláda odstraňovanie farbív z prostredia pomocou degradácie, huby využívajú obidva spôsoby- biosorpciu i biodegradáciu. Ak sa molekuly látky na bunkovú membránu viažu za aktívnej účasti bunky samotnej, ide o bioakumuláciu. Biosorpcia je na druhej strane proces, prebiehajúci bez zapojenia metabolickej energie bunky a môže sa uskutočniť aj u mŕtvych buniek. Za schopnosť húb viazať na povrch bunky molekuly farbiva sú zodpovedné amino, thiolové, karboxylové a fosfátové skupiny prítomné v ich bunkovej stene (Bayramoğlu a kol. 2006). Biosorpcia je rýchly proces a často prebehne v priebehu niekoľkých hodín (Mou a kol. 1991). Doteraz nebol nájdený všeobecne prijateľný model opisujúci adsorpciu hubovou biomasou. Najčastejšie sa preto používa jeden z dvojice modelov: Langmuirova izoterma alebo Freundlichova izoterma.

Langmuirov model pracuje s predpokladom, že všetky adsorpčné miesta sú rovnocenné a adsorbujú len jednu molekulu látky. Povrch je energeticky homogénny. Adsorbované molekuly vytvárajú monovrstvu a vzájomne sa neovplyvňujú.

Freundlichov model je založený na vzťahu medzi koncentráciou roztoku na povrchu adsorbentu a koncentráciou roztoku, v ktorom je adsorbent položený . Kvôli empirickému odvodeniu, má užšiu platnosť ako Langmuirov model.

Vo všeobecnosti je rozsah biosorpcie u živých buniek limitovaný, je to menej ako 50% (Knapp a kol. 1995). Podobne aj Benito a kol (1997), študujúci adsorbciu farbív hubou Trametes versicolor, zaznamenal len 5 - 10% podiel biosorpcie na odstránení farbiva. Rovnako nízke hodnoty boli pozorované aj u ďalších druhov húb. Aspergillus niger dosiahol 10 - 25% (Miranda a kol. 1996) a podiel odstránenia farbiva adsorpciu bol u Sagenomella stratispora len 12% (Boussaid 1995).

Mechanizmom odstraňovania farbiva je u mŕtvych buniek biosorpcia založená na fyzikálno-chemických interakciách (iónová výmena, adsorpcia...). Porovnanie adsorpčných schopností živých a mŕtvych buniek prináša rozličné výsledky, pravdepodobne následkom rôznej štruktúry farbív. Autoklávované bunky P. chrysosporium dokázali odstrániť o 20% väčšie množstvo farbiva Kongo červeň ako živé bunky (Tatarko a Bumpus, 1998). Minimálny rozdiel v schopnosti adsorbovať farbivo medzi živými a autoklávovanými bunkami pozoroval Mou a kol. (1991) pri hube Myrothecium verrucaria. Rozsiahlejšie pozorovanie vykonal Polman a Breckenridge (1996), ktorí použili 28 rôznych mikroorganizmov (baktérie, huby, kvasinky, riasy). Ukázalo sa, že reaktívne farbivo

Reaktívna čierna 5 bolo lepšie odstránené mŕtvymi bunkami. Naopak, živé bunky efektívnejšie dekolorizovali roztok farbiva Reaktívna modrá 19.

Problémom pri odstraňovaní trifenilmetánových farbív pomocou húb sú fungicídne vlastnosti niektorých farbív (napr. MG). Mŕtve bunky sú preto ideálnym riešením. Okrem iného nevyžadujú stály príjem živín a môžu byť regenerované a následne znova použité (Prigione a kol. 2008). Na ich regeneráciu pred ďalším použitím sa môže použiť organické rozpúšťadlo (metanol, etanol) alebo surfaktan (Tween) alebo roztok NaOH. Výhodné je ich taktiež imobilizovať, a to je možné urobiť dvoma spôsobmi. Bunky sú buď ukotvené v pórovom/vláknitom materiáli, alebo sú naviazané na povrchu nosiča adhéziou alebo chemickou väzbou (Couto a TocaHerrera 2007).

Účinnosť a priebeh biosorpcie môže ovplyvniť viacero faktorov. Hodnota pH ovplyvňuje povrchový náboj adsorbentu a tým aj adsorpciu farbív pomocou ich nabitých skupín. Napríklad zníženie pH zvýši adsorpčnú kapacitu kyslých farbív, zvýšenie naopak pomôže adsorpcii zásaditých farbív (Fu a Viraraghavan. 2002). Teplota taktiež vplýva na adsorpčné schopnosti a adsorpčnú kapacitu hubovej biomasy. Štúdie zaznamenali zvýšenie adsorpčnej kapacity spolu so zvýšením teploty (Annadurai a kol. 1999; Zeroual a kol. 2006). Bayramoğlu a kol. (2007) pozorovali zvýšenie biosorpcie u druhu Trametes versicolor (trúdnikovité), keď sa teplota zvýšila z 5 na 35°C (platí pre živé i mŕtve bunky). Mierne odlišné výsledky naopak získal Iqbal a Saeed (2007), ktorí pozorovali zvýšenie adsorpčnej kapacity do teploty 30°C a následný pokles pri ďalšom navýšení teploty na 50°C.

V roztoku môžu byť prítomné aj rôzne nečistoty v podobe iónov solí kyslých, zásaditých či kovových iónov. Existuje len veľmi málo štúdii zaoberajúcich sa týmto problémom. Maurya a kol. (2006) zaznamenali pokles biosorpcie so zvýšením iónovej sily roztoku. Pridané Na+ ióny pravdepodobne súperili s rovnako nabitými iónmi farbiva o rovnaké väzobné miesta. V procese dekolorizácie hrá počiatočná koncentrácia dôležitú úlohu. Jej zvýšenie zrýchlilo adsorpciu molekúl farbiva, ale znížilo sa percento odstráneného farbiva. Dôvodom môže byť rýchla saturácia všetkých dostupných väzobných miest na povrchu biosorbentu (Maurya a kol. 2006; Kumari a Abraham 2007).

Ďalšie zvýšenie adsorpčnej kapacity sa dá docieliť „predúpravou“ hubovej biomasy. Sú to rozličné fyzikálne alebo chemické spôsoby, napr. sušenie, autoklávovanie, použite organických (formaldehyd) alebo anorganických (NaOH, H2SO4, CaCl2...) látok. Tepelná „predúprava“ biomasy huby Trametes versicolor zvýšila jej adsorpciu farbiva priama modrá z 101,1 mg/g na 153 mg/g (Aksu 2005). V prípade trifenilmetánových farbív bola biosorpcia 36

Rhizopus stolonifer zlepšená predchádzajúcou úpravou pomocou NaOH. Dôsledkom bolo odstránenie proteínov a glukánov z bunkovej steny a tým pádom zvýšenie percentuálneho obsahu chitínu v nej, ako uvádza Zeroual a kol. (2006).

4.2.1. Malachitová zeleň

Na odstránenie malachitovej zelene je možné použiť nielen baktérie, ale aj iné organizmy, napríklad huby. Coriolopsis sp. je menej známy druh patriaci medzi huby bielej hniloby a dekolorizujúci malachitovú zeleň. Za 9 dní rozložila 52% farbiva s počiatočnou koncentráciou 100 mg/L čo je dosť málo v porovnaní s ostatnými farbivami. Kryštálovej violete zostalo v roztoku po 7 dňoch 5% a metylovej violete 3% a množstvo metylovej modrej v roztoku bolo po 24 hodinách 9%. Farbivá boli odstránené primárne adsorpciou, výsledky spektrofotometrie naznačili tiež určitú účasť enzýmov (NADH-DCIP reduktáza, lignín peroxidáza a lakáza). Rýchlosť a celková efektivita bola závislá na koncentrácii farbiva, vyššia počiatočná koncentrácia mala negatívny efekt. Prítomnosť kyslíka mala rozdielny vplyv v závislosti na konkrétnom farbive. Aeróbne podmienky viedli k odstráneniu väčšieho množstva kryštálovej violete, metylovej violete a metylovej modrej. Zvýšila sa aj rýchlosť dekolorizácie, adsorpcia prebehla za 1 - 7 dní v porovnaní s 13 dňami pri absencii kyslíka. Možno sa teda domnievať, že dekolorizácia CV, MV a CB je aj výsledkom činnosti enzýmov ako je lignín peroxidáza. Naopak malachytovú zeleň odstránila Coriolopsis sp. efektívnejšie za anoxických podmienok. To naznačuje prítomnosť reduktívnych enzýmov napr, NADH-DCIP reduktázy. Použitím väčšieho množstva biomasy (8 g biomasy na 100 ml roztoku) sa dosiahlo zvýšenie rýchlosti dekolorizácie (Chen a Ting 2015a).

Veľkú úlohu pri degradácii hrá toxicita farbív. Lepšia odolnosť voči danému farbivu znamená aj vyššiu efektivitu dekolorizácie. Malachitová zeleň a kryštálová violeť sú zo spomenutých farbív najtoxickejšie, CB naopak najmenej. Na dosiahnutie čo najvyššej dekolorizačnej efektivity a vylepšenie celého procesu sa skúmal vplyv viacerých faktorov (podmienky kultivácie, použité množstvo biomasy...). S prihliadnutím na finančné náklady je najvýhodnejšie použiť 2 - 4 g biomasy Penicillium simplicissimum. Hodnoty dekolorizácie pri tomto množstve sú dostatočné (40 - 90%). Vyššia koncentrácia farbiva (nad 50 mg/L) inhibovala bunkovú aktivitu alebo bunky priamo usmrtila (200 mg/L). Okrem CB, všetky ostatné farbivá boli lepšie odfarbované v anaeróbnom prostredí. Preukázaná bola prítomnosť enzýmov lignín peroxidáza a NADH-DCIP reduktáza (Chen a Ting, 2015b).

Rast na médiu s obsahom MG predstavuje pre huby problém. Dôvodom horšieho rastu na médiu s MG, sú fungicídne vlastnosti farbiva. Kang a kol. (2014) uskutočnili rozsiahlu štúdiu na 12 druhoch a 52 rôznych kmeňoch húb. Z nich len tri druhy (Pycnoporus coccineus, Coriolus versicolor a Lentinula edodes) vykazovali dostatočný rast na médiu s CV a takisto len tieto tri druhy rástli v prítomnosti MG. Mycélium sa kultivovalo 5 dni (25°C). Potom sa homogenizovalo a znova kultivovalo v PDB médiu. Pre experiment s dekolorizaciou MG sa 10 ml kultúry dalo do 90 ml vody a pridalo sa 3 mg MG farbiva. Zmes sa kultivovala za trepania pri 25°C. Dekolorizovať MG boli schopné len druhy (P. coccineus, L. edodes, G. lucidum) a aj to len niektoré ich kmene ( P. coccineus IUM0032, L. edodes IUM1426 alebo G. lucidum IUM1727). Tieto kmene nerástli na miskách obsahujúcich MG, boli však schopné ju degradovať. Enzýmy podieľajúce sa na dekolorizácii MG sa ukázali rozdielne v závislosti na druhu organizmu. Ganoderma lucidum využíva hlavne lakázu, zatiaľ čo napr. P. chrysosporium lignín peroxidázu. Trametes versicolor a Fome lignosus sú rovnako schopné dekolorizácie malachitovej zelene. Najefektívnejší bol z nich Trametes versicolor. Čas pridania farbiva do kultúry výrazne ovplyvnil dekolorizáciu u F. lignosus. Dospelo sa k záveru, že je efektívnejšie pridať farbivá po 5 dňoch kultivácie, keď sa nahromadí dostatočné množstvo enzýmov (Liu a kol. 2004).

4.2.2. Kryštálová violeť

Kang a kol. (2014) vo svojej rozsiahlej štúdii ( 12 druhov a 52 rôznych kmeňoch húb) zistili, že zo všetkých skúmaných druhov len Pycnoporus coccineus, Coriolus versicolor a Lentinula edodes vykazovali dostatočný rast na médiu s CV a boli ju schopné odstrániť.

Coriolopsis sp. ( huba bielej hniloby) rozložila 95% kryštálovej violete za 7 dní. Farbivo bolo odstránené primárne adsorpciou, výsledky spektrofotometrie naznačili tiež určitú účasť enzýmov (NADH-DCIP reduktáza, lignín peroxidáza a lakáza). Rýchlosť a celková efektivita bola závislá na koncentrácii farbiva. Vyššia počiatočná koncentrácia mala negatívny efekt. Aeróbne podmienky viedli k odstráneniu väčšieho množstva farbiva. Zvýšila sa aj rýchlosť dekolorizácie, adsorpcia prebehla za 1 - 7 dní v porovnaní s 13 dňami pri absencii kyslíka. Možno sa teda domnievať, že dekolorizácia CV je aj výsledkom činnosti enzýmov ako je lignín peroxidáza. Zvýšenie rýchlosti dekolorizácie bolo taktiež dosiahnuté použitím väčšieho množstva biomasy. Optimálne množstvo je 8 g biomasy na 100 ml roztoku (Chen a Ting 2015a).

Penicillium simplicissimus bol izolovaný ako kontaminant z odpadovej vody. Dovtedy bolo známe, že rozkladá azo a phtalocyaninové farbivá, ale Chen a Ting (2015b) vo svojej práci uvádzajú, že je schopná odfarbovať aj trifenilmetánové farbivá. Najlepšie dekolorizuje CB, nasleduje MV, CV a MG. Prítomnosť metylových skupín u posledných troch menovaných farbív môže byť príčinou ich pomalého rozkladu. Na dosiahnutie čo najvyššej dekolorizačnej efektivity a vylepšenie celého procesu sa skúmal vplyv viacerých faktorov (podmienky kultivácie, použité množstvo biomasy...). Najlepší pomer cena-výkon bol dosiahnutý s použitím 2 - 4 g biomasy P. simplicissimum. Dekolorizácia prebehla na uspokojivej úrovni, odstránených bolo 40 - 90% farbiva. Koncentrácia farbiva nad 50 mg/L inhibovala bunkovú aktivitu, pri hodnote 200 mg/L bunky priamo usmrtila . Okrem CB, všetky ostatné farbivá boli lepšie odfarbované v anaeróbnom prostredí. Bola zistená prítomnosť enzýmov lignín peroxidáza a NADH-DCIP reduktáza (Chen a ting 2015b).

Huba Phanerochaete chrysosporium dekolorizovala kryštálovú violeť. Okrem lignolitického systému, ktorý degradoval farbivá, bola potvrdená aj možnosť ich adsorpcie na živé bunky. Tá však tvorí menšie percento z celkovej dekolorizácie. U kryštálovej violete sú produkty degradácie neznáme bezfarebné látky (Bumpus a Brock 1988).

Ďalšími hubami dekolorizujúcich kryštálovú violeť sú Trametes versicolor a Fome lignosus. Čas kedy bolo farbivo pridané do kultúry bol rozhodujúci, obzvlášť v prípade F.lignosus. Pridanie farbiva krátko po začatí kultivácie ovplyvnilo akumuláciu extracelulárnych enzýmov a predĺžilo tak čas dekolorizácie. Preto je výhodnejšie pridať farbivo neskôr, po 5 dňoch kultivácie, keď sa nahromadí dostatočné množstvo enzýmov. Aktivita enzýmov lignín peroxidáza alebo veratryl alkohol oxidáza nebola detegovaná počas dekolorizácie kryštálovej violete. Celková aktivita ostatných enzýmov (lakáza, mangán dependentná peroxidáza, polyvalentná peroxidáza) bola nižšia u F. lignosus ako u T.versicolor. Rovnako aj dekolorizačné schopnosti F. lignosus boli nižšie (Liu a kol. 2004).

4.2.3. Ostatné TFM farbivá

Penicillium ochrochloron MTCC517 je využívaný na extrakciu kovov z vodných roztokov (biolúhovanie), hlavne medi. Shedbalkar a kol. (2008) preto preskúmali jeho dekolorizačné schopnosti. Po degradácii, ktorá trvala 2,5 hodiny pri teplote 25°C a pH 6,5 zostali v roztoku prítomné 4% farbiva metylovej modrej (odstránilo sa 93%). Podmienky kultivácie boli statické, pretože prítomnosť veľkého množstva kyslíka by inhibovalo dekolorizačnú aktivitu. Kyslík je v kompetícii s funkčnými skupinami ako akceptor elektrónov pri oxidácii redukovanej látky napr. NADH (Chen a kol. 2003) Na samotnom procese dekolorizácie sa tiež podieľalo niekoľko enzýmov (lignin peroxidáza, lakáza, trozináza, aminopyrin–N-demetyláza, mangán reduktáza). Najvyššia aktivita bola zaznamenaná u enzýmov lignín peroxidáza, tyrozináza a aminopyrín-N-demetyláza. Konečnými produktami degradácie tohto farbiva boli sulfonamid a trifenylmetán. Testy na fytotoxicitu a mikrobiálnu toxicitu naznačili jej zníženie u týchto produktov v porovnaní s pôvodným farbivom (Shedbalkar a kol. 2008).

Coriolopsis sp. rozložila 91% metylovej modrej za jeden deň, primárny mechanizmus bola adsorbcia, ale účastnili sa aj enzýmy (NADH-DCIP reduktáza, lignín peroxidáza a lakáza). Rýchlosť a celková efektivita bola závislá na koncentrácii farbiva, vyššia počiatočná koncentrácia mala negatívny efekt. Aeróbne podmienky viedli k odstráneniu väčšieho množstva farbiva. Zvýšila sa aj rýchlosť dekolorizácie, adsorpcia prebehla za 1 - 7 dní v porovnaní s 13 dňami pri absencii kyslíka. Určitú úlohu mala pravdepodobne pri dekolorizácii aj činnosť enzýmov, napr. lignín peroxidáza (Chen a Ting 2015a).

Väčšina štúdii týkajúcich sa húb bielej hniloby sa prevažne venovala druhom Coriolus sp. a Phanerochaete sp. Dôvodom sú lignín modifikujúce enzýmy, napr. mangán dependentná peroxidáza, ligniperoxidáza a lakáza. Okrem degradácie lignínu, sú tieto enzýmy schopné degradovať aj farbivá, vrátane trifenilmetánových (Kaushik a Malik 2009). Ďalej sa dajú použiť na likvidáciu vyradenej munície a odpadu vznikajúceho pri jej výrobe, pesticídov či syntetických polymérov (Pointing 2000).

Bumpus a Brock (1988) vykonali prvé experimenty s Phanerochaete chrysosporium, ktorá bola schopná degradovať kryštálovú violeť. Okrem lignolitického systému, ktorý rozkladal farbivá, bola potvrdená aj možnosť ich adsorpcie na živé bunky. Tá však tvorí menšie percento z celkovej dekolorizácie. Lignolitický systém P. chrysosporium je nešpecifický a umožňuje tak rozklad TFM farbív z rozdielnou chemickou štruktúrou. 40

Farbivá briliantová zeleň, malachitová zeleň, etylová violeť majú vo svojej štruktúre N- alkylovú skupinu. Naopak parafuchsín, kresolová červeň a bromfenolová modrá alkylové skupiny nemajú. Oxidácia TFM farbív teda môže prebiehať viacerými spôsobmi. Zásluhu na tom má enzým lignín peroxidáza. Komplexnosť chemickej štruktúry ovplyvňuje rýchlosť degradácie farbiva (Haemmerli a kol. 1986; Hammel a kol. 1986; Paszczyński a kol. 1986; Bumpus a Brock 1988). Rôzne trifenilmetánové farbivá dekolorizujú aj Trametes versicolor a Fome lignosus. Obidva druhy odfarbili farbivá Coomassie briliantovú modrú G250, kryštálovú violeť, kresolovú červeň a malachitovú zeleň (Liu a kol. 2004).

Schopnosti dekolorizácie TFM farbiva kresolovej červene preskúmal Nor a kol. (2015) na 35 rôznych izolátoch. Najlepšie výsledky dosiahol izolát M06 identifikovaný ako Trichoderma harzianum M06. Použité boli dva spôsoby kultivácie - statická a submerzná. Práve submerzná kultúra, T. harzianum M06, degradovala 88% kresolovej červene v roztoku. Statické podmienky neboli ideálne, bolo degradovaných len 40% farbiva. Okrem kyslíka vplývalo na dekolorizáciu aj pH, salinita média či prítomnosť Tween 80. Najefektívnejšie bolo farbivo degradované pri pH 3, vo všeobecnosti je optimálna hodnota pH 4 - 5,5. Tieto výsledky korešpondujú s predchádzajúcimi zisteniami (Kapoor a kol. 1999; Toh a kol. 2003). Po pokusoch s rôznou koncentráciou soli, bola zvolená hodnota 100 g/L, pri ktorej dosiahla dekolorizácia maximum. Efektivitu dekolorizácie pozitívne ovplyvnil aj nízky obsah Tween 80 v médiu (0,1 ml na 100 ml média). Enzýmy prítomné v kultúre boli lignín peroxidáza, lakáza a mangán peroxidáza. Po dekolorizácii boli detegované aj enzýmy1,2-dioxygenáza a 2,3-dioxygenáza. Keďže T. harzianum je huba bielej hniloby, dôležitú úlohu počas dekolorizácie zohrala lakáza a peroxidáza (Nor a kol. 2015).

4.3. Kvasinky Kvasinky majú v porovnaní s hubami a baktériami niektoré zaujímavé vlastnosti. Sú ľahko a lacno dostupným zdrojom biomasy. Rastú rýchlejšie ako vláknité huby a tak ako oni, tolerujú nepriaznivé podmienky. Kvasinky sú schopné sa adaptovať a rásť v rôznych extrémnych podmienkach- pH, teplota, prítomnosť živín a vysoké koncentrácie polutantov (Dönmez 2002; Malik 2004; Wang a Hu. 2008; Aksu 2003; Aksu a Dönmez 2005; Aksu a Dönmez 2003). Pri porovnaní s hubami a baktériami majú určité výhody. Kvasinky rastú rovnako rýchlo ako baktérie a navyše sú aj schopné odolať nepriaznivým podmienkam prostredia (Yu a Wen 2005).

4.3.1. Adsorpcia a bioakumulácia Kvasinky boli najprv študované hlavne kvôli ich biosorpčným schopnostiam. Aksu a Dönmez (2003) realizovali rozsiahlu štúdiu zahŕňajúcu rôzne druhy vysušených kvasiniek (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces marxianus, Candida sp., C. tropicalis, C. lipolytica, C. utilis, C. quilliermendii a C. membranaefaciens). Boli zvolené čo najoptimálnejšie podmienky, vplyv malo pH (optimum pH=2) a koncentrácia farbiva. Použité reaktívne farbivo Remazol Blue (antrachinonové farbivo) adsorbovali všetky druhy kvasiniek s porovnateľnými výsledkami pri jeho počiatočnej koncentrácii 100 mg/L. Výsledky sa začali líšiť so stúpajúcou koncentráciu farbiva, najviac pri jeho koncentrácii 400mg/L. Najvyššiu adsorpčnú kapacitu dosiahla Candida lipolytica. Vplyv teploty na efektivitu adsorpcie pozoroval Kumari a Abraham (2007). Teplota 20°C inhibovala adsorpciu u S. cerevisiae, optimálnejšou sa ukázala byť teplota 30°C. Pri tejto teplote zostalo po adsorpcii v roztoku okolo 9 - 17% zvyškového farbiva. Okrem adsorpcie sú živé bunky S. cerevisiae schopné aj bioakumulácie farbív. Nízke pH (3 - 5) a nízka koncentrácia farbiva boli najvhodnejšie podmienky. Pri týchto podmienkach boli úspešne odstránene reaktívne farbivá (Remazol Blue, Remazol Black B a Remazol Red RB) ako uvádza Aksu (2003). Veľmi podobné výsledky dosiahli Charumathi a Das (2010). Použili niekoľko syntetických farbív vrátane dvoch trifenilmetánových – Acid Blue 93 a Basic Violet 3. Použitým organizmom bola kvasinka Candida tropicalis. Maximálne hodnoty bioakumulácie boli dosiahnuté pri pH 3 (Acid Blue 93) a pH 5 (Basic violet 3). Dôsledkom zvýšenej počiatočnej koncentráci farbiva bolo predĺženie lag fázy a zníženie množstva akumulovaného farbiva. Väčšie množstvo extraktu z vylisovanej cukrovej trstiny v médiu pri konštantnej koncentrácii farbiva viedlo k lepšiemu rastu aj kumulácii farbiva (Charumathi a Das 2010). Zaujímavý bol experiment, ktorý podnikli Šafařík a kol. (2002) s modifikovanými kvasinkami S. cerevisiae. Tie boli modifikované pomocou ferofluidu a následné usmrtené teplom. Použité boli okrem iného tri trifenilmetánové farbivá (anilínová modrá, kryštálová violeť, malachitová zeleň). Pre všetky farbivá bola pozorovaná vysoká adsorpčná kapacita. Modifikované kvasinky navyše reagujú na magnetické pole a umožňujú tak efektívnu separáciu biomasy, ktorá je nasýtená farbivom.

4.3.2. Biodegradácia Biodegradácia trifenilmetánových farbív je u kvasiniek menej častá. Jadhav a Govindwar (2006) skúmali degradačné schopnosti S. cerevisiae MTCC 463. So štyroch skúmaných farbív (malachitová zeleň, metylová modrá, metylová violeť a kryštálová violeť) bola jedine malachitová zeleň odstránená degradáciou. Na začiatku prevládala dekolorizácia pomocou biosorpcie, po 7 hodinách však došlo k degradácii a odstránených bolo okolo 85% MG z média. Tento čas sa skrátil na 4 hodiny ak bolo použité médium obohatené 5% glukózy a kultivácia prebehla v aeróbnych podmienkach a za izbovej teploty. Prítomných bolo niekoľko z enzýmov, prominentnú úlohu hrali NADH-DCIP a MG reduktáza. Ostatné farbivá boli odstránené biosorpciou (67 - 88%). Hodnoty sa líšili na základe druhu farbiva, napr. biosorpcia CB nastala až po 27 hodinách, pravdepodobne kvôli chemickým zmenám média spôsobených prítomnou kvasinkou a vedúcim k zmene pH. Malachitovú zeleň rozložila aj kvasinka Galactomyces geotrichum MTCC 1360. Dekolorizácia prebehla za 18 hodín a odstránených bolo 97% farbiva z roztoku. Kultivovaná bola pri 30°C na YM médiu a za stáleho trepania (Jadhav a kol. 2008).

4.4. Riasy Riasy sú fotosyntetické organizmy obývajúce takmer všetky oblasti sveta. Dekolorizujú množstvo organických farbív a to buď biosorpcoiou či degradáciou. Dekolorizácia je viazaná na druh riasy a typ farbiva, konkrétne jeho molekulovú štruktúru.

4.4.1. Biodegradácia Bolo zistené, že Chlorella pyrenoidosa, Chlorella vulgaris a Oscillateria tenuis dekolorizovali a degradovali vyše 30 rôznych azo zlúčenín (Yan a Pan 2004). Riasy sú aj dobrými biosorbentami. Ich bunková stena obsahuje rozličné funkčné skupiny umožňujúce naviazať široké množstvo chemických látok, napr. amino, karboxylové, sulfátové a fosfátové skupiny či proteíny (Volesky a Holan 1995). Biodegradácii farbív (konkrétne azo) sa venovali El-Sheekh a kol. (2009). Skúmali 6 druhov zelených a modrozelených rias Chlorella vulgaris, Lyngbya lagerlerimi, Nostoc lincki, Oscillatoria rubescens, Elkatothrix viridis a Volvox aureus. Všetky dokázali rozložiť testované azo farbivá pri izbovej teplote (25°C). Výsledky sa líšili podľa druhu riasy, chemickej štruktúry farbiva, ale aj štádia rastu. Chlorella vulgaris degradovala po siedmich dňoch kultivácie 78,3% farbiva v médiu. Za ďalšie dva dni stúplo toto množstvo o 13%. Jej biosorpčné vlastnosti potvrdzuje aj štúdia, ktorú vykonal Lim a kol. (2010). Na testovanie

43 jej adsorpčných schopností v reálnych podmienkach použili odpadovú vodu z textilnej fabriky a všetko prebehlo na jednorázovej kultúre v HRAP (High Rate Algae Ponds).

Väčšina štúdii zameraných na trifenilmetánové farbivá sa venuje odstráneniu malachitovej zelene. Vo všetkých hrali významnú úlohu faktory ovplyvňujúce celý proces a to hlavne teplota, pH, koncentrácia farbiva a počiatočné množstvo biomasy. Khataee a kol. (2010) sledovali v rozmedzí teplôt 5 - 45°C hodnoty dekolorizácie u troch druhov rias: Euglena sp, Chlorella sp. a Cosmarium sp. Efektivita dekolorizácie stúpala spoločne s teplotou. Taký istý experiment uskutočnil aj Khataee a kol. (2011) s riasou Vaucheria sp. Dospeli k rovnakým výsledkom a usúdili, že použitý druh riasy je schopný sa aklimatizovať v širokom teplotnom rozmedzí. Veľmi podobný trend je prítomný aj pri hodnote pH roztoku. Cosmarium sp. dosiahla maximálnej dekolorizácie 92,2% pri pH=9 (Daneshvar a kol. 2007). Rovnako sa správala aj Euglena sp. spoločne s Chlorella sp., ktorých degradačná efektivita stúpala pri zvyšovaní pH z 4 na 8 (Khataee a kol. 2010). Identickú tendenciu mali hodnoty riasy Vaucheria sp. namerané v intervale pH 1,5 - 7. Táto závislosť u viacerých druhov rias môže byť vysvetlená na základe nulového náboja biomasy. Náboj sa teda mení na pozitívny v kyslom a na negatívny v zásaditom roztoku. Malachitová zeleň je kladne nabitá a to je dôvod prečo preferuje zásaditejší roztok. Farbivo je tak lepšie adsorbované na povrch biomasy (Khataee a kol. 2011). Vysoká počiatočná koncentrácia farbiva pozitívne ovplyvnila dekolorizáciu u rias Pitophora sp., Euglena sp, Chlorella sp. a Cosmarium sp. Zvýšilo sa množstvo odstráneného farbiva a zároveň stúpla aj efektivita (Kumar a kol. 2006; Khataee a kol. 2010). K čiastočne opačným výsledkom dospel Khataee a kol. (2011). Experimenty s riasou Vaucheria sp. síce preukázali zvýšenie množstva odstráneného farbiva, ale zaznamenali aj pokles celkovej efektivity dekolorizácie. Vaucheria sp. dosiahla svoje maximum odfarbenia roztoku pri množstve biomasy 6 g na 250 ml roztoku. Khataee a kol. (2010) experimentovali aj s opakovaným použitím rovnakej dávky rias. Koncentrácia MG bola 10 mg/L a množstvo roztoku 100ml. Po každom behu dekolorizácie bolo pridaných 10 mg/L MG aby boli zachované pôvodné podmienky. Kultúra Cosmarium sp. dokázala aj po 5 opakovaných pridaniach dosiahnuť odstránenie okolo 90% percent farbiva z roztoku. Z toho je zrejmé, že dekolorizácia farbiva bola dosiahnutá vďaka jeho degradácii použitými riasami.

4.4.2. Biosorpcia Schopnosť biosorpcie sa skúmala u riasy C. vulgaris. Ako testovacie farbivá boli zvolené tri najpoužívanejšie reaktívne farbivá (Remazol Black RB, Remazol Red RR a Remazol Golden Yellow RNL). Ich chemická štruktúra hrala dôležitú úlohu pri určovaní optimálnej teploty. Biosorpcia RB stúpala so stúpajúcou teplotou (optimum 35°C). Naopak RR a RGY sa adsorbovali lepšie pri nižších teplotách (okolo 25°C). Hodnota pH bola pre všetky farbivá rovnaká a to 2. Biosorpčná kapacita bola pri stálej teplote priamo úmerná počiatočnej koncentrácii farbiva. Celý proces prebiehal veľmi rýchlo a rovnováhu systém dosiahol po 0,5 - 4 hodinách (Aksu a Tezer 2005). Na hodnote pH bola závislá efektivita biosorpcie riasy Pithophora sp. Prudký pokles bol zaznamenaný pri pH nižšom alebo vyššom ako 6, táto hodnota teda bola určená ako optimálna pre dekolorizáciu (Kumar a kol. 2006). Viaceré druhy rias majú ako spoločný znak optimálnu teplotu okolo 30°C pri ktorej u nich prebieha biosorpcia najlepšie. Do tejto „skupiny“ patrí zelená makroskopická riasa Caulerpas calpelliformis. Na rozdiel od iných druhov rias, u C. scalpelliformis efektivita biosorpcie katiónového farbiva (Sandocryl golden yellow C-2G) stúpala spoločne s pH (Aravindhan a kol. 2007). Široko rozšírenou a teda dobre dostupnou je makroskopická vodná riasa Azolla rongpong. Vyznačuje sa rýchlym rastom a pevnou štruktúrou a predstavuje tak ideálny biosorbent. Rovnako aj riasa Azolla filiculoides. Optimálnym pH bolo 2,5 - 3 a teplota 30°C. U obidvoch druhov bola v stĺpcovom reaktore skúmaná adsorpcia farbiva (AG3). V stĺpcovom reaktore hrá významnú úlohu výška stĺpca a prietok. Najlepšie sa farbivo viazalo na bunky pri nízkom prietoku. Tieto podmienky vedú ku zvýšeniu koncentrácie prítomného farbiva spolu s predĺžením doby kontaktu buniek a farbiva (Padmesh a kol. 2005; Padmesh a kol. 2006). Invazívne druhy morských rias prinášajú niekoľko problémov, jedným je aj ako spracovať vzniknutú biomasu. A práve potenciálne biosorpčné vlastnosti môžu priniesť riešenie. Cengiz a Cavas (2008) sa preto pokúsili preukázať biosorpčné schopnosti invazívnej stredomorskej riasy Caulerpa racemosa var. cylindracea. Má značnú adsorpčnú kapacitu a aj rýchlosť dosiahnutia adsorpčnej rovnováhy (30 min). Maximálne hodnoty boli dosiahnuté pri vyššom pH (7 - 11) a nižšej teplote (18°C) aj keď niektoré štúdie dospeli k opačným výsledkom (Doan a kol. 2004; Bhattacharyya a Sharma 2005; Wang a kol. 2005a).

5. Komerčné metódy bioremedácie

Znečistenie životného prostredia predstavuje stále rastúci problém dnešnej doby. Najčastejšie používané metódy odstraňovania polutantov sú tzv. konvenčné metódy (filtrácia, usadzovanie, chemická koagulácia...). Do popredia sa však dostávajú nové alternatívy, predovšetkým bioremediačné techniky využívajúce rôzne druhy organizmov. Najpoužívanejšími skupinami sú mikroorganizmy – baktérie a mikroskopické vláknité huby a kvasinky, mikroskopické riasy a vyššie rastliny. Nové biologické metódy ponúkajú množstvo výhod: nízke vstupné a prevádzkové náklady, možnosť selektívneho odstraňovania kontaminantov, možnosť efektívnej eliminácie kontaminantov pri ich nízkej koncentrácii, nepredstavujú závažnú hrozbu pre životné prostredie, pretože pri procesoch uskutočňovaných organizmami obvykle nevznikajú nebezpečné reziduá, sú „priateľské“ k prostrediu a prírode, sú vysoko efektívne, využívajú odpadový materiál (odpadová biomasa), často je možné použitý biomateriál recyklovať a opätovne použiť (Frankovská a kol. 2010).

Najpoužívanejšie rozdelenie metód bioremediácie je na in situ ( „na mieste kontaminácie“) a ex situ („mimo miesta kontamminácie“). Medzi in situ metódy patrí napríklad monitorovaná atenuácia, bioaugmentácia, biostimulácia alebo fytoremedácia (Laitinen 2006). Ex situ metódy zahŕňajú okrem iných aj kompostovanie, landfarming alebo použitie bioreaktorov (Wainwright 1999).

Konvenčné aj bioremediačné metódy majú svoje výhody aj nevýhody. Vo výsledku však nie sú kategoriálne lepšie jedny či druhé. Bioremediačné metódy majú perspektívu v budúcnosti, hlavne kvôli ich cene a nízkej záťaži na životné prostredie.

5.1. In situ metódy

Tieto metódy sú často používané na miestach, ktoré sú ťažko dostupné. Oblasti pod budovami a komunikáciami, v blízkosti káblov, kanalizácie a potrubí, alebo vo veľkých hĺbkach. Techniky však nie sú bez problémov. Pred začatím je potrebný podrobný prieskum sanovanej lokality a ten si vyžaduje nemalé zdroje. Problémom je aj variabilná dĺžka trvania celého procesu, keďže nie je možné zachovať konštantné podmienky. Odstraňovanie nakoniec prebieha mesiace až roky (Laitinen 2006). Degradáciu zabezpečujú predovšetkým autochtónne organizmy prítomne v pôde (Frankovská a kol. 2010; Fuentes a kol. 2002).

5.1.1. Prirodzená atenuácia

Predstavuje metódu využívajúcu prirodzene prebiehajúce fyzikálne, chemické a biologické procesy. Tie vedú k zníženiu obsahu znečisťujúcej látky v prostredí. Človek do týchto procesov nijako nezasahuje. Vďaka tomu sú nízke náklady a nenarušenie miesta sanácie veľkou výhodou. Predovšetkým ide o biodegradáciu, disperziu, riedenie, sorpciu, chemickú alebo biologickú stabilizácia a iné. Sanačné ciele by mali byť dosiahnuté maximálne za dobu jednej generácie alebo do 30 rokov. Dôležitým prvkom je monitoring počas celej doby dekontaminácie, kvôli možnému vzniku nežiadúcich produktov. Metóda sa preto nazýva aj monitorovaná prirodzená atenuácia (Frankovská a kol. 2010). Ako uvádza Fuentes a kol. (2002), prirodzená atenuácia sa používa na odstránenie prchavých a poloprchavých látok, PCB, palív, výbušnín a pesticídov.

5.1.2. Bioaugmentácia

Ak prirodzene sa vyskytujúce organizmy nestačia na odstránenie kontaminácie, je možné pridať organizmy do pôdy dodatočne. Väčšinou sa jedná o selektované organizmy vopred pripravené v laboratóriu a prispôsobené na odstraňovanie daného kontaminantu. Jednoduchším variantom je odobratie autochtónnych mikroorganizmov z miesta kontaminácie, ich namnoženie v laboratóriu a spätná inokulácia do kontaminovanej oblasti (Vogel 1999). Najväčším problémom je ich inokulácia do pôdy. Pre organizmy to predstavuje určitý šok, musia sa prispôsobiť novým podmienkam (pH, množstvo živín, vlhkosť, teplota...). Množstvo preživších organizmov ďalej znižuje kompetícia s prítomnými druhmi. Na odstránenie týchto problémov sú preto využívané pevné nosiče, napr. alginát (Braud a kol. 2009). Jednou z možností je použitie „aktivovanej pôdy“. Jedná sa o pôdu obsahujúcu požadované množstvo a druh mikroorganizmov, ktorá sa potom zapracuje do postihnutej oblasti (Frankovská a kol. 2010).

5.1.3. Biostimulácia

Biostimulácia poskytuje živiny a vhodné fyzikálno-chemické prostredie pre rast mikrobiálnej populácie. Používané postupy zahŕňajú vháňanie živín v plynnej forme (kyslík, metán...), injektáž roztoku so živinami (napr. roztok dusičnanov alebo peroxidu vodíka), úprava pH, vlhkosti a iné. Biostimulácia je veľmi zložitá v zeminách s nízkou priepustnosťou. Použitie injektáže kyslíka alebo živín môže zvýšiť biologickú aktivitu v blízkosti injektážnych vrtov. Injektované látky na druhej strane môžu ostať len v blízkom okolí vrtu a výsledný efekt biostimulácie je tak veľmi malý. Najčastejšie je kyslík dodávaný

47 do pôdy pomocou jednej z troch metód: bioventing, biosparging a bioslurping (Frankovská a kol. 2010; Kensa 2011).

5.1.4. Bioventing

Princípom je vháňanie vzduchu pomocou kompresorov do podpovrchovej nesaturovanej zóny (zóna do ktorej nezasahuje podzemná voda). Vyššie množstvo kyslíka akceleruje degradačné procesy a rast mikroorganizmov. Rovnaký efekt možno dosiahnuť aj opačne, odsávaním vzduchu z pôdy vývevami.

Obr. 1 Bioventing (ENVISAN-GEM 2010, upravené)

Využívajú sa na to bioventingové vrty, v prípade odsávania plynov z pôdy sú prítomne aj filtračné stanice na čistenie odsávaného vzduchu. Množstvo vháňaného vzduchu/kyslíka je limitované, dodáva sa len množstvo nevyhnutné na priebeh degradačných procesov. Zabráni sa tým vzniku škodlivých prchavých látok (Kensa 2011). Výhodami bioventingu sú nízke náklady, nenáročne vybavenie. Faktory ako štruktúra pôdy, jej vlhkosť a viskozita významne ovplyvňujú celý proces čistenia, jeho dĺžku a efektivitu (Frankovská a kol. 2010; Laitinen, 2006).

5.1.5. Biosparging

V prípade, že znečistenie dosiahlo hranicu podzemnej vody, vhodnou metódou je biosparging. Ide o metódu vháňania vzduchu/kyslíka do saturovanej zóny (podzemná voda) za účelom zvýšenia aeróbnej biodegradácie organických látok. V prípade prítomnosti prchavých látok je vhodné zaviesť aj vrty na ich odsávanie a použiť sanačné stanice na čistenie vzduchu. Okrem kyslíka sa môžu dodávať aj iné plyny, napr. metán a bután pri rozklade chlórovaných etylénov (Frankovská a kol. 2010). Laitinen (2006) uvádza, že táto metóda dosahuje lepšie výsledky pri odstraňovaní kontaminantov (napr. ropných uhľovodíkov) ako použitie iba aerácie.

Obr. 2 Biosparging (New Mexico Environment Department 2003, upravené)

5.1.6. Bioslurping

Bioslurping je kombináciou vákuovej extrakcie a bioventingu. Uplatňuje sa pri odstraňovaní kontaminantov ľahších ako voda (ropné uhľovodíky- benzín, nafta...). Prebieha súčasne čistenie podzemnej vody a pásma zeminy nad ňou. Vákuová pumpa odsáva zo saturovanej zóny (pásmo podzemnej vody) NAPL, pôdne plyny a podzemnú vodu. Táto emulzia sa po odsatí ďalej dočisťuje. Súčasne sa vháňa vzduch do saturovanej zóny a podporuje tak biodegradáciu plynných látok zachytených v pôde v (Gidarakos a kol. 2007).

Obr. 3 Bioslurping (Frankovská a kol. 2010, upravené)

5.2. Fytoremedácia

Fytoremedácia predstavuje využitie zelených rastlín a s nimi asociovaných mikroorganizmov a agronomických techník pre odstránenie alebo transformáciu znečisťujúcich látok v prostredí. Náklady na jej použitie sú nízke a túto metódu je možné použiť in situ aj ex situ. Odstránenie škodlivých látok pomocou rastlín prebieha jedným zo štyroch spôsobov: extrakcia, degradácia, stimulácia a volatilizácia.

Fytoextrakcia, ktorá využíva schopnosť rastlín prijímať, translokovať a akumulovať znečisťujúce látky (hlavne ióny kovov) prijaté z vonkajšieho prostredia a koncentrovať ich v častiach koreňov a nadzemných stoniek, ktoré možno zberať (Frankovská a kol. 2010).

Používajú sa predovšetkým tzv. „hyperakumulátory“- rastliny schopné akumulácie 10 – 500 krát väčšieho množstva toxických látok ako iné rastliny (Wainwright 1999).

Pri fytodegradácii dochádza k transformácii alebo rozloženiu toxických látok (organické látky) pomocou rastlinných enzýmov. Prítomnosť rastlín môže mať aj stimulačné účinky na pôdne mikroorganizmy a prispievať k ich väčšej efektivite pri rozklade polutantu. Odstraňovanie polutantov pomocou volatilizácie začína prijímaním znečisťujúcich látok koreňmi. Potom sú transportované do nadzemných častí rastliny, kde prebieha ich biotransformácia do prchavej formy a ich následná volatilizácia (Frankovská a kol. 2010).

5.3. Ex situ metódy

Metódy ex situ predstavujú spôsoby odstraňovania kontaminantov mimo pôvodného miesta znečistenia. Preprava znečisteného materiálu ale zvyšuje náklady a náročnosť celého procesu. Na druhej strane odstraňovanie nebezpečných látok je viac kontrolovateľné, prebieha rýchlejšie a s väčšou účinnosťou.

5.3.1. Kompostovanie

Kompostovanie je použiteľné nielen na odstraňovanie a spracovávanie organického odpadu, ale aj na čistenie kontaminovanej pôdy. Kontaminovaná zemina je premiešaná s pevným organickým materiálom slúžiacim ako zdroj živín pre mikroorganizmy. Materiál je navŕšený do hromád a prebieha jeho prevzdušňovanie mechanicky alebo sústavou trubiek napojených na kompresor (Frankovská a kol. 2010). Na zachovanie optimálnych podmienok a vysokej biodegradačnej aktivity mikroorganizmov je nutné udržiavať množstvo uhlíka a dusíka v pomere 25 - 30:1 (Wainwright 1999).

Obr. 4 Kompostovanie (Composting in LEED v4, 2014) 51

5.3.2. Landfarming (obrábanie pôdy)

Pri tejto technológii je kontaminovaná zemina poľnohospodársky obrábaná a cieľom je stimulovať mikroorganizmy v nej prítomné. Pôda sa hnojí, zavlažuje a prevzdušňuje preorávaním alebo obracaním. Kontaminovaná obrábaná zemina je od ostatnej zeminy oddelená nepriepustnou izolačnou fóliou s drenážnym systémom (odvádzanie prebytočnej kontaminovanej vody). V prípade uvoľňovania plynov sa landfarming vykonáva v krytej hale alebo pod fóliou s odsávaním a čistením vzduchu (Frankovská a kol. 2010; Kensa 2011).

Obr. 5 Landfarming (Landfarming 2012, upravené)

5.3.3. Biokopy

Biokopy sú kombináciou landfarmingu a kompostovania. Vysoké kopy zeminy sú uzatvorené, obohatené o živiny a prevzdušňované systémom rúr. Oproti kompostovaniu a landfarmingu je využívaná menšia plocha a unikajúce plyny sú lepšie zachytávané a čistené. Metoda sa využíva na degradáciu ropných uhľovodíkov (Kensa 2011).

5.3.4. Bioreaktor

Znečistená voda/materiál sa privádza do bioreaktora, kde nastáva biologická a biochemická degradácia alebo transformácia znečisťujúcej látky prostredníctvom mikroorganizmov pri optimalizovaných podmienkach (Frankovská a kol. 2010). Chen a kol. (2014) použili na odstránenie etylovej violete z odpadnej vody bioreaktor obsahujúci imobilizované baktérie Bdellovibrio bacteriovorus, Ralstonia pickettii, Stenotrophomonas maltophilia, a Comamonas sp.

5.3.5. Vegetačná koreňová čistiareň

Cieľom je napodobiť prirodzené čistiace procesy (biologické a geochemické) vodného ekosystému. Pomocou rôznych druhov vodných rastlín (emerzné, submerzné alebo plávajúce) a živočíchov sa napodobí prírodná mokraď. K čisteniu odpadovej vody dochádza počas jej prečerpávania cez nádrž s umelou mokraďou. Hlavnou nevýhodou tejto metódy je jej takmer nulová účinnosť v zimnom období (Frankovská a kol. 2010).

Obr. 6 Vegetačná koreňová čistiareň (Koreňové Čističky Odpadových Vôd 2013)

6. Záver

Organické farbivá sú v dnešnej dobe neoddeliteľnou súčasťou takmer každého významného odvetvia priemyslu. Najpoužívanejšími sú azo farbivá, trifenylmetánové a ďalšie. Množstvo organických farbív, ktoré sa takto ročne spotrebuje presahuje 10 000 ton. Objem odpadovej vody znečistenej týmito farbivami je ešte väčší. Organické farbivá predstavujú riziko pre ľudské zdravie a životné prostredie. Viaceré z nich sú preukázateľne toxické pre vodné živočíchy, rastliny a aj človeka. Je preto dôležité mať metódy na ich odstránenie. Konvenčné metódy čistenia sú v mnohých prípadoch neúčinné a organické farbivá nimi prejdú bezo zmeny. Predovšetkým ide o rôzne fyzikálno-chemické metódy. Ich hlavnou nevýhodou je nízka efektivita, sú finančne nákladné alebo odstraňujú iba úzku skupinu látok. Vhodnou alternatívou je preto použitie organizmov (baktérie, huby riasy, vyššie rastliny...) schopných odstrániť organické látky. Každý organizmus má inú toleranciu voči rôznym polutantom a takisto ich odstraňuje s rozdielnou efektivitou. Dôležitú úlohu hrá teplota, pH, kultivačné podmienky a koncentrácia farbiva. Mikroorganizmy majú enzýmy, ktoré síce primárne katalyzujú iné reakcie, ale vďaka ich nízkej špecifite dokážu rozkladať i farbivá. Rovnako je farbivo využívané niektorými organizmami ako substrát. Zložité organické látky sú v mnohostupňovom procese degradácie rozkladané na jednoduchšie, prípadne sú plne mineralizované až na anorganické látky ako je voda, oxid uhličitý atď. Iné druhy zasa využívajú schopnosť adsorpcie, napr. huby a morské riasy. Akumulovaním veľkého množstva takýchto látok vo svojich orgánoch sa vyznačujú hlavne vyššie rastliny. Použitie niektorej s bioremediačných techník predchádza množstvo krokov. Jedným z prvých je určenie toxicity polutantu. Pomocou biotestov sa skúma napríklad doba pôsobenia alebo poškodenie, ktoré látka spôsobila organizmu. Existuje množstvo rôznych druhov biotestov líšiacich sa stupňom štandardizácie, podobnosti s prirodzenými podmienkami alebo použitými organizmami. Dôkladný prieskum kontaminovanej oblasti a charakterizácia znečisťujúcej látky sú potrebné pre zvolenie správneho postupu. Cieľom in situ bioremediačných techník je podporiť aktivitu mikroorganizmov prítomných v mieste znečistenia. Upravuje sa predovšetkým množstvo prítomného kyslíka, ale môžu sa dodatočne dodávať aj živiny či ďalšie mikroorganizmy. Ex situ techniky využívajú rovnaký princíp a keďže prebiehajú v kontrolovaných podmienkach, sú v niektorých prípadoch účinnejšie.

Hľadanie nových druhov organizmov alebo objavovanie dekolorizačných schopností u tých už známych je dôležité pre neustále zlepšovanie bioremediačných postupov. Vďaka tomu bude raz možné odstrániť aj látky doteraz považované za permanentné znečistenie.

7. Zoznam literatúry

AHMED, M.N. a R.N. RAM. 1992. Removal of basic dye from waste-water using silica as adsorbent. Environmental Pollution. 77: 79-86 AKBARI, A., J.C. REMIGY a P. APTEL. 2002. Treatment of textile dye effluent using a polyamide-based nanofiltration membrane. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification. 41: 601-609 AKBARI, A., S. DESCLAUX, J.C. ROUCH, P. APTEL a J.C. REMIGY. 2006. New UV- photografted nanofiltration membranes for the treatment of colored textile dye effluents. Journal of Membrane Science. 286: 342-350 AKSU, Z. 2003. Reactive dye bioaccumulation by Saccharomyces cerevisiae. Process Biochemistry. 38: 1437-1444 AKSU, Zümriye. 2005. Application of biosorption for the removal of organic pollutants: a review. Process Biochemistry. 40: 997-1026 AKSU, Zümriye a Gönül DÖNMEZ. 2003. A comparative study on the biosorption characteristics of some yeasts for Remazol Blue reactive dye. Chemosphere. 50: 1075-1083 AKSU, Zümriye a Gönül DÖNMEZ. 2005. Combined effects of molasses sucrose and reactive dye on the growth and dye bioaccumulation properties of Candida tropicalis. Process Biochemistry. 40: 2443-2454 AKSU, Zümriye a Sevilay TEZER. 2005. Biosorption of reactive dyes on the green alga Chlorella vulgaris. Process Biochemistry. 40: 1347-1361 ALLEGRE, C., M. MAISSEU, F. CHARBIT a P. MOULIN. 2004. Coagulation–flocculation– decantation of dye house effluents: concentrated effluents. Journal of Hazardous Materials. 116: 57-64 AN, Sun-Young, Sang-Ki MIN, In-Ho CHA, Yong-Lark CHOI, Young-Su CHO, Cherol-Ho KIM a Young-Choon LEE. 2002. Decolorization of triphenylmethane and azo dyes by Citrobacter sp. Biotechnology Letters. 24: 1037-1040 ANDĚL, Petr. 2011. Ekotoxikologie, bioindikace a biomonitoring. Evernia, Liberec ANLIKER, R. 1979. Ecotoxicology of dyestuffs—A joint effort by industry. Ecotoxicology and Environmental Safety. 3: 59-74 ANNADURAI, G., M. CHELLAPANDIAN a M.R.V. KRISHNAN. 1999. Adsorption of reactive dye on chitin. Environmental Monitoring and Assessment. 59: 111-119 ARAVINDHAN, Rathinam, Jonnalagadda Raghava RAO a Balachandran Unni NAIR. 2007. Removal of basic yellow dye from aqueous solution by sorption on green alga Caulerpa scalpelliformis. Journal of Hazardous Materials. 142: 68-76 AU, William, S. PATHAK, Cheryl J. COLLIE a T.C. HSU. 1978. Cytogenetic toxicity of gentian violet and crystal violet on mammalian cells in vitro. Mutation Research/Genetic Toxicology. 58: 269-276 AZMI, W., R.K. SANI a U.C. BANERJEE. 1998. Biodegradation of triphenylmethane dyes. Enzyme and Microbial Technology. 22: 185-191

BAXENDALE, J. H. a J. A. WILSON. 1957. The photolysis of hydrogen peroxide at high light intensities. Transactions of the Faraday Society. 53: 344 BAYRAMOĞLU, Gülay, Gökce ÇELIK a M. Yakup ARICA. 2006. Biosorption of Reactive Blue 4 dye by native and treated fungus Phanerocheate chrysosporium: Batch and continuous flow system studies: Batch and continuous flow system studies. Journal of Hazardous Materials. 137: 1689-1697 BENITO, G.González, M.Peña MIRANDA a D.Rodríguez DE LOS SANTOS. 1997. Decolorization of wastewater from an alcoholic fermentation process with Trametes versicolor. Bioresource Technology. 61: 33-37 BHATTACHARYYA, K a A SHARMA. 2005. Kinetics and thermodynamics of Methylene Blue adsorption on Neem leaf powder. Dyes and Pigments. 65: 51-59 BOUSSAID, Abdellatif. 1995. Pulp-mill effluent color removal using Sagenomella striatispora. Oregon (USA). Dizertačná práca. Oregon State University. 80 s. BRAUD, Armelle, Karine JÉZÉQUEL, Stéphane BAZOT a Thierry LEBEAU. 2009. Enhanced phytoextraction of an agricultural Cr- and Pb-contaminated soil by bioaugmentation with siderophore-producing bacteria. Chemosphere. 74: 280-286 BROADBENT, Arthur D. 2001. Basic principles of textile coloration. Society of Dyers and Colorists. Bradford BUMPUS, J. A. a B. J. BROCK. 1988. Biodegradation of crystal violet by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology. 54: 1143-1150 BURCHMORE, S. a M. WILKINSON. 1993. Proposed environmental quality standards for malachite green in water (DWE 9026). In: Department of the Environment, Report no. 3167/2. Marlow CENGIZ, Sevilay a Levent CAVAS. 2008. Removal of methylene blue by invasive marine seaweed: Caulerpa racemosa var. cylindracea. Bioresource Technology. 99: 2357-2363 CLARKE, A. a R. ANLIKER. 1980. Organic dyes and pigments. HUTZINGER, Otto (ed.). The handbook of environmental chemistry. 181–215. Springer-Verlag, Berlin COUTO, Susana Rodríguez a José L. TOCA-HERRERA. 2007. Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnology Advances. 25: 558-569 CRINI, Grégorio. 2003. Studies on adsorption of dyes on beta-cyclodextrin polymer. Bioresource Technology. 90: 193-198 CULP, Sandra a Frederick BELAND. 1996. Malachite Green: A Toxicological Review. International Journal of Toxicology. 15: 219-238 DANESHVAR, N., M. AYAZLOO, A.R. KHATAEE a M. POURHASSAN. 2007. Biological decolorization of dye solution containing Malachite Green by microalgae Cosmarium sp. Bioresource Technology. 98: 1176-1182 DENG, Daiyong, Jun GUO, Guoqu ZENG a Guoping SUN. 2008. Decolorization of anthraquinone, triphenylmethane and azo dyes by a new isolated Bacillus cereus strain DC11. International Biodeterioration & Biodegradation. 62: 263-269 DHODAPKAR, Rita, N.N. RAO, S.P. PANDE a S.N. KAUL. 2006. Removal of basic dyes from aqueous medium using a novel polymer: Jalshakti. Bioresource Technology. 97: 877-885

DOAN, M. 2004. Kinetics and mechanism of removal of methylene blue by adsorption onto perlite. Journal of Hazardous Materials. 109: 141-148 DÖNMEZ, Gönül. 2002. Bioaccumulation of the reactive textile dyes by Candida tropicalis growing in molasses medium. Enzyme and Microbial Technology. 30: 363-366 DURAN, Sibel, Dilek ŞOLPAN a Olgun GÜVEN. 1999. Synthesis and characterization of acrylamide–acrylic acid hydrogels and adsorption of some textile dyes. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 151: 196- 199 EL-NAGGAR, Manal A., Samy A. EL-AASAR a Khlood I. BARAKAT. 2004. Bioremediation of crystal violet using air bubble bioreactor packed with Pseudomonas aeruginosa. Water Research. 38: 4313-4322 EL-SHEEKH, Mostafa M., M.M. GHARIEB a G.W. ABOU-EL-SOUOD. 2009. Biodegradation of dyes by some green algae and cyanobacteria. International Biodeterioration & Biodegradation. 63: 699-704 EPE, Bernd, Michael PFLAUM a Serge BOITEUX. 1993. DNA damage induced by photosensitizers in cellular and cell-free systems. Mutation Research/Genetic Toxicology. 299: 135-145 EPP, Dianne N. 1995. A World of Color: Investigating the Chemistry of Vat Dyes. Journal of Chemical Education. 72: 726 FAN, Huan-Jung, Shiuh-Tsuen HUANG, Wen-Hsin CHUNG, Jeng-Lyan JAN, Wan-Yu LIN a Chiing-Chang CHEN. 2009. Degradation pathways of crystal violet by Fenton and Fenton-like systems: Condition optimization and intermediate separation and identification. Journal of Hazardous Materials. 171: 1032-1044 FARGAŠOVÁ, Agáta. 2008. Environmentálna toxikológia a všeobecná ekotoxikológia. Orman, Bratislava FARGAŠOVÁ, Agáta. 2009. Ekotoxikologické biotesty. Perfekt, Bratislava FARGAŠOVÁ, Agáta. 2010. Environmental risk assessment. In: Fargasova, A., Jambrich, M., Koprda, V. a Melnik, M. Proceedings of the 30 Scientific symposium of industrial toxicology 2010, 376. Slovenska spolocnost priemyselnej chemie, Slovakia FRANKOVSKÁ Jana, SLANINKA Igor, KORDÍK Jozef, JURKOVIČ Ľubomír, GREIF Vladimír, ŠOTTNÍK Peter, DANANAJ Ivan, MIKITA Slavomír, DERCOVÁ Katarína, JÁNOVÁ Vlasta. 2010. Atlas sanačných metód environmentálnych záťaží. Bratislava FU, Yuzhu a T. VIRARAGHAVAN. 2002. Removal of Congo Red from an aqueous solution by fungus Aspergillus niger. Advances in Environmental Research. 7: 239-247 FUENTES, A., C. BUITRAGO, A. LODOLO a S. MIERTUS. 2002. Survey of Soil Remediation Technology. ICS publications. GIDARAKOS, E. a M. AIVALIOTI. 2007. Large scale and long term application of bioslurping: The case of a Greek petroleum refinery site. Journal of Hazardous Materials. 149: 574-581 GORDON, P.F. a P. GREGORY. 1987. Organic Chemistry in Colour. Springer, Berlin HAEMMERLI, Stephan D., M.S. LEISOLA, Dominique SANGLARD a Armin FIECHTER. 1986. Oxidation of benzo (a) pyrene by extracellular ligninases of Phanerochaete chrysosporium. Veratryl alcohol and stability of ligninase. Journal of Biological Chemistry. 261: 6900-6903 58

HAMMEL, Kenneth E., B. KALYANARAMAN a T. Kent KIRK. 1986. Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons and dibenzo [p]-dioxins by Phanerochaete chrysosporium ligninase. Journal of Biological Chemistry. 261: 16948-16952 HSU, Yung-Chien, Chao-Hsi YEN a Hsing-Chao HUANG. 1998. Multistage treatment of high strength dye wastewater by coagulation and ozonation. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 71: 71-76 CHANG, CF, CH YANG, YO SHU, TI CHEN, MS SHU a IC LIAO. 2001. Effects of temperature, salinity and chemical drugs on the in vitro propagation of the Dinoflagellate parasite, Amylodinium ocellatum. Asian Fish Soc. 31 CHARREYRE, Marie-Thérèse, Ping ZHANG, Mitchell A. WINNIK, Christian PICHOT a Christian GRAILLAT. 1995. Adsorption of Rhodamine 6G onto Polystyrene Latex Particles with Sulfate Groups at the Surface. Journal of Colloid and Interface Science. 170: 374-382 CHARUMATHI, D. a Nilanjana DAS. 2010. Bioaccumulation of synthetic dyes by Candida tropicalis growing in sugarcane bagasse extract medium. Advances in Biological Research. 4: 233- 240 CHAUDHURI, Swades K.; Sur. 2000. OXIDATIVE DECOLORIZATION OF REACTIVE DYE SOLUTION USING FLY ASH AS CATALYST. Journal of Environmental Engineering. 126: 583- 594 CHEN, C.-H., C.-F. CHANG a S.-M. LIU. 2010. Partial degradation mechanisms of malachite green and methyl violet B by Shewanella decolorationis NTOU1 under anaerobic conditions. Journal of Hazardous Materials. 177: 281-289 CHEN, Chih-Hung, Chin-Feng CHANG, Chuan-Hsin HO, Tsai-Ling TSAI a Shiu-Mei LIU. 2008. Biodegradation of crystal violet by a Shewanella sp. NTOU1. Chemosphere. 72: 1712-1720 CHEN, Chiing-Chang, Hung-Ju LIAO, Chiu-Yu CHENG, Chia-Yuen YEN a Ying-Chien CHUNG. 2007. Biodegradation of crystal violet by Pseudomonas putida. Biotechnology letters. 29: 391-396 CHEN, Chih-Yu, Shao-Hsiung YEN a Ying-Chien CHUNG. 2014. Combination of photoreactor and packed bed bioreactor for the removal of ethyl violet from wastewater. Chemosphere. 117: 494-501 CHEN, Kuo-Cheng, Jane-Yii WU, Dar-Jen LIOU a Sz-Chwun John HWANG. 2003. Decolorization of the textile dyes by newly isolated bacterial strains. Journal of Biotechnology. 101: 57-68 CHEN, Si Hui a Adeline Su YIEN TING. 2015a. Biodecolorization and biodegradation potential of recalcitrant triphenylmethane dyes by Coriolopsis sp. isolated from compost. Journal of Environmental Management. 150: 274-280 CHEN, Si Hui a Adeline Su YIEN TING. 2015b. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103: 1-7 CHERIAA, J. a A. BAKHROUF. 2009. Triphenylmethanes, malachite green and crystal violet dyes decolourisation by Sphingomonas paucimobilis. Annals of Microbiology. 59: 57-61 CHOY, Keith K.H., Gordon MCKAY a John F. PORTER. 1999. Sorption of acid dyes from effluents using activated carbon. Resources, Conservation and Recycling. 27: 57-71

CHUDGAR, Rasik J., John OAKES. 2000. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, Hoboken CHUNG, K. T., G. E. FULK a A. W. ANDREWS. 1981. Mutagenicity testing of some commonly used dyes. Applied and Environmental Microbiology. 42: 641-648 CHUNG, King-Thorn, S. Edward STEVENS a Carl E. CERNIGLIA. 2008. The Reduction of Azo Dyes by the Intestinal Microflora. Critical Reviews in Microbiology. 18: 175-190 IQBAL, Muhammad a Asma SAEED. 2007. Biosorption of reactive dye by loofa sponge- immobilized fungal biomass of Phanerochaete chrysosporium. Process Biochemistry. 42: 1160- 1164 JADHAV, J. P. a S. P. GOVINDWAR. 2006. Biotransformation of malachite green by Saccharomyces cerevisiae MTCC 463. Yeast. 23: 315-323 JADHAV, S.U., S.D. KALME a S.P. GOVINDWAR. 2008. Biodegradation of Methyl red by Galactomyces geotrichum MTCC 1360. International Biodeterioration & Biodegradation. 62: 135- 142 JOSHI, Pradnya A a Kirti J MHATRE. 2015. Microbial efficiency to degrade Carbol fuchsin and Malachite green dyes. Advances in Applied Science Research. 6: 85-88 KALYANI, Dayanad C., Amar A. TELKE, Sanjay P. GOVINDWAR a Jyoti P. JADHAV. 2009. Biodegradation and Detoxification of Reactive Textile Dye by Isolated IPseudomonas/I sp. SUK1. Water Environment Research. 81: 298-307 KANG, Hyeon Woo, Yun Hui YANG, Sang Woo KIM, Soonok KIM a Hyeon-Su RO. 2014. Decolorization of triphenylmethane dyes by wild mushrooms. Biotechnology and bioprocess engineering. 19: 519-525 KAPOOR, Anoop, T. VIRARAGHAVAN a D.Roy CULLIMORE. 1999. Removal of heavy metals using the fungus Aspergillus niger. Bioresource Technology. 70: 95-104 KAŞGÖZ, Hasine. 2005. Aminofunctionalized acrylamide–maleic acid hydrogels: Adsorption of indigo carmine. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 266: 44-50 KAUSHIK, P a A MALIK. 2009. Fungal dye decolourization: Recent advances and future potential. Environment International. 35: 127-141 KENSA, MV. 2011. Bioremediation: an overview. J. Ind. Pollut. Control. 27: 161-168 KHATAEE, A.R., M. ZAREI, G. DEHGHAN, E. EBADI a M. POURHASSAN. 2011. Biotreatment of a triphenylmethane dye solution using a Xanthophyta alga: Modeling of key factors by neural network. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 42: 380-386 KHATAEE, Ali R., Mahmoud ZAREI a Minoo POURHASSAN. 2010. Bioremediation of Malachite Green from Contaminated Water by Three Microalgae: Neural Network Modeling. CLEAN- Soil, Air, Water. 38: 96–103 KIM, Tak-Hyun, Chulhwan PARK, Jeongmok YANG a Sangyong KIM. 2004. Comparison of disperse and reactive dye removals by chemical coagulation and Fenton oxidation. Journal of Hazardous Materials. 112: 95-103 KNAPP, J.S., P.S. NEWBY a L.P. REECE. 1995. Decolorization of dyes by wood-rotting basidiomycete fungi. Enzyme and Microbial Technology. 17: 664-668.

KOYUNCU, Ismail. 2003a. Direct filtration of Procion dye bath wastewaters by nanofiltration membranes: flux and removal characteristics. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 78: 1219-1224 KOYUNCU, Ismail. 2003b. Influence of dyes, salts and auxiliary chemicals on the nanofiltration of reactive dye baths: experimental observations and model verification. Desalination. 154: 79-88 KOYUNCU, Ismail, Dincer TOPACIK a Ebubekir YUKSEL. 2003. Comparative Evaluation of the Results for the Synthetic and Actual Reactive Dye Bath Effluent Treatment by Nanofiltration Membranes. Journal of Environmental Science and Health, Part A. 38: 2209-2218 KUMAR, K. Vasanth, V. RAMAMURTHI a S. SIVANESAN. 2006. Biosorption of malachite green, a cationic dye onto Pithophora sp., a fresh water algae. Dyes and Pigments. 69: 102-107 KUMAR, M.N.V.R.;Sridhari. 1998. Trends in color removal from textile mill effluents. Colourage. 45: 25 - 34 KUMARI, K. a T. ABRAHAM. 2007. Biosorption of anionic textile dyes by nonviable biomass of fungi and yeast. Bioresource Technology. 98: 1704-1710 KUO, W.G. 1992. Decolorizing dye wastewater with Fenton's reagent. Water Research. 26: 881- 886 LAITINEN, Jarno. 2006. In-situ soil and groundwater bioremediation techniques and applications. Diplomová práca. Tampere Polytechnic. Tampere. 84 s. LAVERTU, M., Z. XIA, A.N. SERREQI, M. BERRADA, A. RODRIGUES, D. WANG, M.D. BUSCHMANN a Ajay GUPTA. 2003. A validated 1H NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 32: 1149- 1158 LIM, Sing-Lai, Wan-Loy CHU a Siew-Moi PHANG. 2010. Use of Chlorella vulgaris for bioremediation of textile wastewater. Bioresource Technology. 101: 7314-7322 LIN, Sheng H. a Chi M. LIN. 1993. Treatment of textile waste effluents by ozonation and chemical coagulation. Water Research. 27: 1743-1748 LIU, Weixiao, Yapeng CHAO, Xiuqing YANG, Hongbo BAO a Shijun QIAN. 2004. Biodecolorization of azo, anthraquinonic and triphenylmethane dyes by white-rot fungi and a laccase-secreting engineered strain. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 31: 127-132 LORIMER, J.P., T.J. MASON, M. PLATTES, S.S. PHULL a D.J. WALTON. 2001. Degradation of dye effluent. Pure and applied chemistry. 73: 1957-1968 MALEY, Alexander M a Jack L ARBISER. 2013. Gentian Violet: A 19(th) Century Drug Re- Emerges in the 21(st) Century: A 19(th) Century Drug Re-Emerges in the 21(st) Century. Experimental dermatology. 22: 775-780 MALIK, Anushree. 2004. Metal bioremediation through growing cells. Environment International. 30: 261-278 MAURYA, Nityanand Singh, Atul Kumar MITTAL, Peter CORNEL a Elmar ROTHER. 2006. Biosorption of dyes using dead macro fungi: Effect of dye structure, ionic strength and pH. Bioresource Technology. 97: 512-521 MCKAY, G., J. F. PORTER a G. R. PRASAD. 1999. The Removal of Dye Colours from Aqueous Solutions by Adsorption on Low-cost Materials. Water, Air, and Soil Pollution. 114: 423-438 61

MIRANDA, M.Peña, G.González BENITO, N.San CRISTOBAL a C.Heras NIETO. 1996. Color elimination from molasses wastewater by Aspergillus niger. Bioresource Technology. 57: 229-235. MONTEIRO, Oyrton A.C. a Claudio AIROLDI. 1999. Some Thermodynamic Data on Copper– Chitin and Copper–Chitosan Biopolymer Interactions. Journal of Colloid and Interface Science. 212: 212-219 MOU, Duen-Gang, Kim Kee LIM a Hwei Ping SHEN. 1991. Microbial agents for decolorization of dye wastewater. Biotechnology Advances. 9: 613-622 NAGL, Gert. 2000. Sulfur Dyes. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim NASSAR, Mamdouh M. a Mohammad S. EL-GEUNDI. 1991. Comparative cost of colour removal from textile effluents using natural adsorbents. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 50: 257-264 NOËL, Isabelle M., Rémi LEBRUN a Christian R. BOUCHARD. 2000. Electro-nanofiltration of a textile direct dye solution. Desalination. 129: 125-136 NOR, Nurafifah Mohd, Tony HADIBARATA, Meor Mohd Fikri Ahmad ZUBIR, Zainab Mat LAZIM, Liyana Amalina ADNAN a Mohamad Ali FULAZZAKY. 2015. Mechanism of triphenylmethane Cresol Red degradation by Trichoderma harzianum M06. Bioprocess and Biosystems Engineering. 38: 2167-2175 O'NEILL, C., A. LOPEZ, S. ESTEVES, F. R. HAWKES, D. L. HAWKES a S. WILCOX. 2000. Azo-dye degradation in an anaerobic-aerobic treatment system operating on simulated textile effluent. Applied Microbiology and Biotechnology. 53: 249-254 OPLATOWSKA, Michalina, Ryan F. DONNELLY, Rita J. MAJITHIYA, D. GLENN KENNEDY a Christopher T. ELLIOTT. 2011. The potential for human exposure, direct and indirect, to the suspected carcinogenic triphenylmethane dye Brilliant Green from green paper towels. Food and Chemical Toxicology. 49: 1870-1876 OXSPRING, Darren A., Geoff MCMULLAN, W. Franklyn SMYTH a Roger MARCHANT. 1996. Decolourisation and metabolism of the reactive textile dye, Remazol Black B, by an immobilized microbial consortium. Biotechnology Letters. 18: 527-530 PADMESH, T.V.N., K. VIJAYARAGHAVAN, G. SEKARAN a M. VELAN. 2006. Application of Azolla rongpong on biosorption of acid red 88, acid green 3, acid orange 7 and acid blue 15 from synthetic solutions. Chemical Engineering Journal. 122: 55-63 PADMESH, T.V.N., K. VIJAYARAGHAVAN, G. SEKARAN a M. VELAN. 2005. Batch and column studies on biosorption of acid dyes on fresh water macro alga Azolla filiculoides. Journal of Hazardous Materials. 125: 121-129 PARSHETTI, G.K., S.G. PARSHETTI, A.A. TELKE, D.C. KALYANI, R.A. DOONG a S.P. GOVINDWAR. 2011. Biodegradation of Crystal Violet by Agrobacterium radiobacter. Journal of Environmental Sciences. 23: 1384-1393. PARSHETTI, Ganesh, Satish KALME, Ganesh SARATALE a Sanjay GOVINDWAR. 2006. Biodegradation of Malachite Green by Kocuria rosea MTCC 1532. Acta Chimica Slovenica. 53: 492-498 PASZCZYŃSKI, Andrzej, Van-Ba HUYNH a Ronald CRAWFORD. 1986. Comparison of ligninase-I and peroxidase-M2 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Archives of Biochemistry and Biophysics. 244: 750-765

PERALTA-ZAMORA, Patricio, Airton KUNZ, Sandra Games DE MORAES, Ronaldo PELEGRINI, Patricia DE CAMPOS MOLEIRO, Juan REYES a Nelson DURAN. 1999. Degradation of reactive dyes I. A comparative study of ozonation, enzymatic and photochemical processes. Chemosphere. 38: 835-852 POINTING, S.B., V.V.C. BUCHER a L.L.P. VRIJMOED. 2000. Dye decolorization by sub- tropical basidiomycetous fungi and the effect of metals on decolorizing ability. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16: 199-205 POLMAN, Kevin a Cynthia R. BRECKENRIDGE. 1996. Biomass-Mediated Binding and Recovery of Textile Dyes from Waste Effluents. Textile Chemist & Colorist. 28: 31-35 POOTS, V.J.P., G. MCKAY a J.J. HEALY. 1976. The removal of acid dye from effluent using natural adsorbents—I peat. Water Research. 10: 1061-1066 PRIGIONE, Valeria, Giovanna Cristina VARESE, Leonardo CASIERI a Valeria Filipello MARCHISIO. 2008. Biosorption of simulated dyed effluents by inactivated fungal biomasses. Bioresource Technology. 99: 3559-3567 RAGHAVACHARYA, C. 1997. Colour removal from industrial effluents: a comparative review of available technologies. Chemical engineering world. Jasubhai. 32: 53-54 RAO, K.C.L.N., K. KRISHNAIAH a ASHUTOSH. 1994. Colour removal from a dyestuff industry effluent using activated carbon. Indian Journal of Chemical Technology. 1: 13-19 REISCH, MARC S. 1996. Asian Textile Dye Makers Are A Growing Power In Changing Market. Chemical & Engineering News. 74: 10-12 REYNS, Tim, Claude BELPAIRE, Caroline GEERAERTS a Joris VAN LOCO. 2014. Multi-dye residue analysis of triarylmethane, xanthene, phenothiazine and phenoxazine dyes in fish tissues by ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 953-954: 92-101 SAFARIK, I., L. PTACKOVA a M. SAFARIKOVA. 2002. Adsorption of dyes on magnetically labeled baker’s yeast cells. Eur. Cells Mater. 3: 52-55 SALEEM, M., M. AFZAL, A. HAMEED a F. MAHMOOD. 1993. Adsorption studies of cationic dyes on silica gel from aqueous solution. Sci. Int. 5: 323–330 SANI, Rajesh Kumar a Uttam Chand BANERJEE. 1999. Decolorization of triphenylmethane dyes and textile and dye-stuff effluent by Kurthia sp. Enzyme and Microbial Technology. 24: 433-437 SHEDBALKAR, Utkarsha, Rhishikesh DHANVE a Jyoti JADHAV. 2008. Biodegradation of triphenylmethane dye cotton blue by Penicillium ochrochloron MTCC 517. Journal of Hazardous Materials. 157: 472-479 SHORE, John. 2002. Colorants and auxiliaries: organic chemistry and application properteis. Society of Dyers and Colourists. Bradford SIMITZIS, Johannis, Ekaterina TERLEMESIAN a Ivan MLADENOV. 1995. Utilization of waste PAN fibers as adsorbents by chemical and thermal modification. European Polymer Journal. 31: 1261-1267 SLOKAR, Y.M. a A. MAJCEN LE MARECHAL. 1998. Methods of decoloration of textile wastewaters. Dyes and Pigments. 37: 335-356 SRIVASTAVA, Shivaji, Ranjana SINHA a D. ROY. 2004. Toxicological effects of malachite green. Aquatic Toxicology. 66: 319-329 63

TANG, Walter Z. a Rena Z. CHEN. 1996. Decolorization kinetics and mechanisms of commercial dyes by H2O2/iron powder system. Chemosphere. 32: 947-958 TANGPASUTHADOL, Varawut, Noppong PONGCHAISIRIKUL a Vipavee P. HOVEN. 2003. Surface modification of chitosan films. Carbohydrate Research. 338: 937-942 TATARKO, Matthew a John A. BUMPUS. 1998. Biodegradation of Congo Red by Phanerochaete chrysosporium. Water Research. 32: 1713-1717 THOMAS, Susan M. a Donald G. MACPHEE. 1984. Crystal violet: a direct-acting frameshift mutagen whose mutagenicity is enhanced by mammalian metabolism. Mutation Research Letters. 140: 165-167 TICHÝ, Miloň. 2008. Predikční toxikologie. Státní zdravotní ústav. http://www.szu.cz/tema/pracovni-prostredi/predikcni-toxikologie TOH, Yi-Chin, Jocelyn Jia Lin YEN, Jeffrey Philip OBBARD a Yen-Peng TING. 2003. Decolourisation of azo dyes by white-rot fungi (WRF) isolated in Singapore. Enzyme and Microbial Technology. 33: 569-575 VAN DER BRUGGEN, B., I. DE VREESE a C. VANDECASTEELE. 2001. Water Reclamation in the Textile Industry: Nanofiltration of Dye Baths for Wool Dyeing. Industrial & Engineering Chemistry Research. 40: 3973-3978 VARMA, A.J., S.V. DESHPANDE a J.F. KENNEDY. 2004. Metal complexation by chitosan and its derivatives: a review. Carbohydrate Polymers 55: 77-93 VERMA, Pradeep a Datta MADAMWAR. 2003. Decolourization of synthetic dyes by a newly isolated strain of Serratia marcescens. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19: 615- 618 VOGEL, Timothy M. 1996. Bioaugmentation as a soil bioremediation approach. Current Opinion in Biotechnology. 7: 311-316 VOLESKY, B. a Z. R. HOLAN. 1995. Biosorption of heavy metals. Biotechnology Progress. 11: 235-250 WAINWRIGHT, M. 2012. An Introduction to Environmental Biotechnology. Springer, US WAN NGAH, W.S., L.C. TEONG a M.A.K.M. HANAFIAH. 2011. Adsorption of dyes and heavy metal ions by chitosan composites: A review. Carbohydrate Polymers. 83: 1446-1456 WANG, Bao-E. a Yong-You HU. 2008. Bioaccumulation versus adsorption of reactive dye by immobilized growing Aspergillus fumigatus beads. Journal of Hazardous Materials. 157: 1-7 WANG, Shaobin, Lin LI, Hongwei WU a Z.H. ZHU. 2005a. Unburned carbon as a low-cost adsorbent for treatment of methylene blue-containing wastewater. Journal of Colloid and Interface Science. 292: 336-343 WANG, Shaobin, Y. BOYJOO a A. CHOUEIB. 2005b. A comparative study of dye removal using fly ash treated by different methods. Chemosphere. 60: 1401-1407 WU, Jing, Byung-Gil JUNG, Kyoung-Sook KIM, Young-Choon LEE a Nak-Chang SUNG. 2009. Isolation and characterization of Pseudomonas otitidis WL-13 and its capacity to decolorize triphenylmethane dyes. Journal of Environmental Sciences. 21: 960-964 WU, Zhijian, Hyeonwoo JOO, Ik-Sung AHN, Seungjoo HAAM, Jung-Hyun KIM a Kangtaek LEE. 2004. Organic dye adsorption on mesoporous hybrid gels. Chemical Engineering Journal. 102: 277-282 64

XU, Xianting a H.Garth SPENCER. 1997. Dye-salt separations by nanofiltration using weak acid polyelectrolyte membranes. Desalination. 114: 129-137 XU, YAZHEN, RÉMI E. LEBRUN, PIERRE-JEAN GALLO a PIERRE BLOND. 1999. Treatment of Textile Dye Plant Effluent by Nanofiltration Membrane. Separation Science and Technology. 34: 2501-2519 YAN, Hai a Gang PAN. 2004. Increase in biodegradation of dimethyl phthalate by Closterium lunula using inorganic carbon. Chemosphere. 55: 1281-1285 YAN, Zheng, Shengyang TAO, Jinxiang YIN a Guangtao LI. 2006. Mesoporous silicas functionalized with a high density of carboxylate groups as efficient absorbents for the removal of basic dyestuffs. Journal of Materials Chemistry. 16: 2347-2353 YANG, Yiqi, II WYATT, David TRAVIS a Michael BAHORSKY. 1998. Decolorization of Dyes Using UV/H2O2 Photochemical Oxidation. Textile Chemist & Colorist. 30: 27 YATOME, C., T. OGAWA a M. MATSUI. 1991. Degradation of crystal violet by Bacillus subtilis. Journal of Environmental Science & Health Part A. Taylor & Francis. 26: 75-87 YATOME, Chizuko, Shigeyuki YAMADA, Toshihiko OGAWA a Masaki MATSUI. 1993. Degradation of crystal violet by Nocardia corallina. Applied Microbiology and Biotechnology. 38: 65-569 YU, Zhisheng a Xianghua WEN. 2005. Screening and identification of yeasts for decolorizing synthetic dyes in industrial wastewater. International Biodeterioration & Biodegradation. 56: 109- 114 ZEPP, Richard G., Bruce C. FAUST a Juerg HOIGNE. 1992. Hydroxyl radical formation in aqueous reactions (pH 3-8) of iron(II) with hydrogen peroxide: the photo-Fenton reaction. Environmental Science & Technology. 26: 313-319 ZEROUAL, Y., B.S. KIM, C.S. KIM, M. BLAGHEN a K.M. LEE. 2006. Biosorption of bromophenol blue from aqueous solutions by Rhizopus stolonifer biomass. Water, air, and soil pollution. 177: 135-146 ZOLLINGER, Heinrich. 2003. Color chemistry: syntheses, properties, and applications of organic dyes and pigments. Wiley-VCH, Weinheim

Webové stránky All about vat dyes. 2009. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2009/12/all-about-vat-dyes.html, 2016-04-21

About basic dyes. 2013. All About Hand Dyeing [online]. http://www.pburch.net/dyeing/basic_dyes.shtml, 2016-04-21 About Direct Dyes. 2005. All About Hand Dyeing [online]. http://www.pburch.net/dyeing/directdye.shtml, 2016-04-21 Acid dyes. 2010. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/acid-dyes.html, 2016-04-21

Basic dyes. 2010. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/basic-dyes.html, 2016-04-21

Composting in LEED v4. 2014. Bisagni Environmental Enterprise [online]. http://www.bee-inc.com/blog/composting-in-leed-v4, 2016-04-23

Direct dyes. 2009. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2009/12/direct-dyes.html, 2016-04-21

Disperse dyes. 2010. Dyeingworld [online]. [cit.]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/disperse-dyes.html, 2016-04-21 ENVISAN-GEM [online]. 2010. http://www.envisan.cz, 2016-04-23

History and Properties of Disperse Dyes. 2012. TextileLearner [online]. http://textilelearner.blogspot.cz/2012/01/disperse-dye-history-of-disperse-dye.html, 2016-04-21 Introduction and properties of mordant dyes. 2011. TextileLearner [online]. http://textilelearner.blogspot.cz/2011/03/defination-properties-working-procedure_4365.html, 2016-04-21 Koreňové Čističky Odpadových Vôd. 2013. Korenové čističky [online]. http://www.korenovecisticky.sk/kcov, 2016-04-23 Landfarming. 2012. Federal Remediation Technologies Roundtable [online]. https://frtr.gov/matrix2/section4/D01-4-12.html, 2016-04-23 Mordant dyes. 2011. JAGSON COLORCHEM Ltd. [online]. http://www.jagson.com/mordant-dyes.php, 2016-04-21

New Mexico Environment Department [online]. 2003. New Mexico (USA) www.env.nm.gov, 2016-04-23

Properties of Basic Dyes. 2011. TextileLearner [online]. http://textilelearner.blogspot.cz/2011/03/defination-properties-working-procedure_7918.html, 2016-04-21

Reactive dyes. 2009. Dyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2009/12/reactive-dyes.html, 2016-04-21.

Solvent dyes. 2011. JAGSON COLORCHEM Ltd. [online]. http://www.jagson.com/solvent-dyes.php, 2016-04-21

Sulfur dyes. 2010. Ddyeingworld [online]. http://dyeingworld1.blogspot.cz/2010/01/sulfur-dyes.html, 2016-04-21