Thèse Présentée Pour L'obtention Du Diplôme De

N° d’ordre: 28/2017- C/ S.B

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene USTHB/Alger Faculté des Sciences Biologiques

Thèse

Présentée pour l’obtention du diplôme de: Doctorat 3ème cycle En: Sciences Biologiques Option: Génétique, Physiologie Moléculaire et Microbiologie des plantes

Par: Melle SAAD Somia

Thème

Analyse de la diversité chimique par les composés phénoliques,

Marrubium deserti De Noé. Etude ethnobotanique et propriétés

médicinales

Soutenu publiquement le: 27/04/2017, devant le jury composé de:

M. AMIROUCHE Rachid Professeur à l’USTHB Président

Mme OUAFI Saida Professeur à l’USTHB Directrice de thèse

Mme CHABANE Djamila Professeur à l’USTHB Examinatrice

Mme BELKEBIR Aicha Professeur à l’USTHB Examinatrice

M. BAALI-CHERIF Djamel Professeur à l’ENSAA Examinateur

M. ARAB Karim Professeur à l’UMBB Examinateur

Remerciements

Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués au sein du Laboratoire de Recherche sur les Zones Arides (LRZA), de la Faculté des Sciences Biologiques (FSB), de l’Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene (USTHB), Bab Ezzouar, Alger.

En premier lieu, je remercie Dieu le Tout Puissant de m’avoir donné le courage et la santé pour achever ce travail.

L’encadrement scientifique de ce travail a été assuré par Mme OUAFI Saida, professeur à la FSB/USTHB. Je tiens vivement à lui exprimer ma profonde reconnaissance de m’avoir accueillie dans son équipe avec gentillesse, et bienveillance, pour sa disponibilité, sa patience, sa compréhension, ses qualités humaines et l’intérêt qu’elle a porté à mon sujet de recherche. Je la remercie pour la confiance qu’elle m’a témoignée, pour son soutien permanent et son dynamisme qui m’ont permis d’avancer dans mes recherches.

Je remercie également Monsieur AMIROUCHE Rachid, professeur à la FSB/USTHB, pour l’honneur qu’il nous fait en acceptant de présider le jury de cette thèse et pour avoir ouvert notre formation doctorale. Ses grandes compétences et sa longue expérience dans le domaine de la recherche scientifique permettront assurément d’enrichir et d’améliorer ce travail. Veuillez trouver ici, Monsieur, le témoignage de mon profond respect.

Je tiens à affirmer ma gratitude à Mme Chabane Djamila, professeur à la FSB/USTHB, en sa qualité de membre de notre équipe de recherche, connue pour sa rigueur scientifique, son humilité, et ses qualités humaines, d’avoir suivie et accepté d’examiner ce travail. Veuillez accepter chère professeur, mes sentiments sincères de reconnaissance.

Je remercie aussi, Monsieur BAALI-CHERIF Djamel, professeur à l’Ecole Nationale Supérieure Agronomique (ENSAA), pour avoir accepté d’examiner et d’honorer de sa présence effective le jury de cette thèse.

Mes vifs remerciements également s’adresse à Madame BELKEBIR Aicha, professeur à la FSB/USTHB et à Monsieur ARAB Karim, professeur à l’Université M'Hamed Bougara de Boumerdès (UMBB), Boumerdès, pour avoir acceptés d’examiner ce travail. Vos remarques et critiques renforceront certainement la valeur de cette thèse. Veuillez accepter chers professeurs mes sentiments de gratitude.

J’adresse mes sincères remerciements à Madame BOUGUEDOURA Nadia, professeur à l’USTHB et Directrice du laboratoire de recherche sur les zones arides (LRZA) pour ses encouragements et sa compréhension durant la réalisation de ce travail.

Je n’oublie pas mes camarades doctorants de l’équipe du LRZA, MEGUELLATI Hassina, SAHAR Djamila, MOUHOUB Faiza, BOUGUEMRA Selma, BELHADI Fairouz, SELMANI Cherifa, ROUANE Asma, HARCHAOUI Lilya, BENAZI Lila, SEGHERI Mohammed et Redouane qui m’ont encouragé pendant les moments les plus difficiles, leur aide et leur bonne humeur a contribué à créer une ambiance de travail agréable. Je leurs adresse ici toute ma reconnaissance et mes sincères amitiés. Je leurs souhaite une bonne chance pour la suite de leurs travaux.

Je tiens à remercier le personnel de notre laboratoire (LRZA) en particulier; Karima, Neila, Karima, Nabila et Kheira pour leur aide précieuse.

Je tiens également à remercier M. ABDELLAOUI S. directeur de la station de l’INRF de Tamanrasset.

Enfin, que toutes les personnes qui ont contribué de prés ou de loin à la réalisation de ce travail, trouvent ici ma sincère reconnaissance et mes remerciements.

Dédicace

Avec mes sentiments de gratitude les plus profonds, Je dédie ce modeste travail:

A mes très chers parents, pour leur soutien inconditionnel tout au long de mes études et pour la confiance qu’ils m’ont toujours témoignée. A mes grandes mères A mes chers frères et sœurs; Sofiane, Walid, Ahmed Yazid, Marwa, Chaima et Anfel. A mes cousines et cousins en particulier, ma cousine Zeineb A mes tantes et mes oncles.

Merci à Hanane; «mon âme sœur»; pour son amitié, son réconfort moral, sa disponibilité, son soutien dans les moments difficiles et pour tout ce qu’elle m’a appris. Grace à toi, ces six années m’ont paru un peu moins long, je te souhaite que du bonheur.

A Nadjette, je t’exprime mes plus sincères remerciements pour le temps que tu m’as consacré malgré tes diverses occupations; tu as toujours été disponible pour partager avec moi ton expérience, tes encouragements, ton aide et enfin ta gentillesse au quotidien, merci pour ton amitié. Sois assurée de ma profonde gratitude. A vrai dire, je ne sais pas comment te remercier Nedjma pour ton amitié, j’en suis très honorée.

Un mot particulier à ma chère Asma. Merci pour ta patience et ta présence. Tu es une précieuse amie.

Un merci spécial à Kherfi Hamza qu’il trouve ici l’expression de ma plus profonde gratitude. J’adresse aussi, un merci particulier à Zaineb et Aicha pour leur amitié, leurs encagements, leur sympathie et leur bonne humeur. Je garde un excellent souvenir et j’espère vous en avoir laissé de bons.

A tous ceux qui m’aiment

Résumé Ce travail consiste à documenter les utilisations traditionnelles d’une plante médicinale Algérienne; Marrubium deserti De Noé, à extraire et à identifier les composés phénoliques contenus dans sa partie aérienne récolté de deux régions; une semi aride (Biskra) et l’autre aride (Tamanrasset); à évaluer sa toxicité et ses activités biologiques. Une enquête ethnobotanique auprès de la population locale de Biskra a montré que cette plante est utilisée dans le traitement de plusieurs maladies (fièvre, pathologies digestives, algies diverses…etc.). Les analyses quantitatives des phénols totaux et différentes fractions polyphénoliques (les flavones- flavonols, les aglycones libres, les anthocyanes, les C-glycosides et les hétérosides flavoniques) et l’infusé de la partie aérienne recueillie des deux régions révèlent la présence de quantités moyennement importante. Les résultats de la recherche de la diversité chimique par ACP et CAH montrent une forte variabilité intra-spécifique entre les individus de M. deserti De Noé. Les analyses qualitatives par CLHP ont permis de révéler et identifier trois flavonols (quercétine, kaempférol et isorhamnétine), deux flavones (lutéoline et apigénine), une flavanone (hespéridine), deux acides hydroxybenzoïques (acide iso-vanillique et acide syringique), trois acides hydroxycinnamiques (acide caféique, acide férulique et acide trans- cinnamique), un aldéhyde aromatique (vanilline), six C-glycosides (orientine, iso-orientine, vitexine, iso-vitexine, naringénine-6-C-glucoside et naringénine di-C-glucoside et trois O- glycosides (rutine, cynaroside et monoside de kaempférol). L’étude de la toxicité aiguë de M. deserti De Noé par voie orale chez les souris montre une DL50 supérieure à 11000 mg/kg pour l’infusé et supérieure à 500 mg/kg de p.c. pour les trois extraits polyphénoliques (ExEth, ExButOH et ExHét), toutefois l'étude de la toxicité subaiguë de l’infusé chez les rats a révélée des perturbations dans la croissance corporel, dans les poids des organes et dans quelques paramètres hématologiques et biochimiques liés aux fonctions hépatique et rénale. L’étude biologique a montré que l’infusé et les trois extraits polyphénoliques possèdent des effets anti-inflammatoire, analgésique (périphérique et centrale) et antipyrétique. Ces résultats confirment et valident l’indication thérapeutique traditionnelle auprès de la population locale de la partie aérienne de M. deserti De Noé.

Mots clés: Marrubium deserti De Noé, Biskra, Tamanrasset, infusé, polyphénols, CLHP, toxicité, anti-inflammatoire, analgésique, antipyrétique.

Liste des figures

Figure 01: Carte de répartition géographique mondiale de la famille des Lamiaceae 4 Figure 02: Caractéristiques morphologiques de la famille des Lamiaceae 5 Figure 03: Caractéristiques morphologiques de Marrubium vulgare 7 Figure 04: Grandes lignes de la biosynthèse des principaux groupes des composés 15 phénoliques Figure 05: Structure de base d’un flavonoïde 19 Figure 06: Structure de flavones flavonols 20 Figure 07: Structure de flavanone et dihydroflavonls 20 Figure 08: Structure de flavan-3-ols et favan-3,4-diols 21 Figure 09: Structure d’anthocyanidines 21 Figure 10: Structure chimique de chalcones et aurones 22 Figure 11: Structure chimique d’isoflavones 22 Figure 12: Grandes lignes de la biosynthèse de quelques classes de flavonoïdes 24 Figure 13: Exemple des tanins hydrolysables et tanins condensés 25 Figure 14: Principaux monomères constituant la lignine 26 Figure 15: Situation géographique des deux régions d’études Biskra et Tamanrasset 29 Figure 16: Vue externe des zones de récolte de M. deserti De Noé 31 Figure 17: Localisation géographique des communes (strates) de l’enquête 32 ethnobotanique réalisée dans la wilaya de Biskra Figure 18: Protocole expérimental d’extraction, de dosage et d’identification 36 des aglycones flavoniques de M. deserti De Noé Figure 19: Protocole expérimental d’extraction, de dosage et d’identification 38 des aglycones libres de M. deserti De Noé Figure 20: Protocole expérimental d’extraction, de dosage et d’identification 39 des hétérosides flavoniques de M. deserti De Noé Figure 21: Aspect morphologique de M. deserti De Noé 55 Figure 22: Place de la phytothérapie dans la wilaya de Biskra 56 Figure 23: Répartition de la population questionnée selon le sexe 56 Figure 24: Répartition de l’utilisation de M. deserti De Noé selon les tranches d’âge 57 Figure 25: Fréquences des différentes périodes de cueillette de M. deserti De Noé 58 Figure 26: Répartition des différentes parties utilisées de M. deserti De Noé dans la 59 wilaya de Biskra Figure 27: Répartition des différentes maladies traitées par M. deserti De Noé 60 Figure 28: Répartition des différents modes de préparation de M. deserti De Noé 60 dans la wilaya de Biskra Figure 29: Répartition des utilisateurs de M. deserti De Noé selon la dose utilisée 61 Figure 30: Répartition des utilisateurs de M. deserti De Noé selon le mode 61 d’administration Figure 31: Répartition des durées d'utilisation de remèdes à base de M. deserti De 62 Noé Figure 32: Répartition de la posologie de remèdes à base de M. deserti De Noé 63 Figure 33: Répartition de l'état d'utilisation de M. deserti De Noé pour la 63 préparation des remèdes Figure 34: Répartition de l’utilisation seule ou mixte avec d’autre plante de M. 64 deserti De Noé Figure 35: Rendement des extractions de l’infusé et divers extraits polyphénoliques 67 de M. deserti De Noé de Biskra et Tamanrasset Figure 36: Histogramme des teneurs des polyphénols totaux des M. deserti De Noé 68 Figure 37: Histogrammes des teneurs en différentes composés phénoliques des 71 individus de M. deserti De Noé en fonction des stations de Biskra et Tamanrasset Figure 38: Dendrogramme résultant de la CAH pour les 30 individus de la station 73 de Biskra Figure 39: Dendrogramme résultant de la CAH pour les 30 individus de la station 74 de Tamanrasset Figure 40: Projection des variables étudiées sur les axes d’ACP dans la station de 75 Biskra Figure 41: Projection des 30 individus de la station de Biskra sur les axes de l'ACP 76 Figure 42: Projection des variables étudiées sur les axes d’ACP dans la station de 78 Tamanrasset Figure 43: Projection des 30 individus de la station de Tamanrasset sur les axes de 78 l'ACP Figure 44: Schéma du chromatogramme monodimensionnel sur CCM de 80 polyamide des aglycones flavoniques obtenus par fractionnement de l’ExEth de M. deserti De Noé Figure 45: Schéma du chromatogramme bidimensionnel sur CCM de polyamide 81 des C glycosides flavoniques obtenus par fractionnement de l’ExButOH de M. deserti De Noé Figure 46: Chromatogramme de CLHP d’ExEth de M. deserti De Noé représentant 83 les aglycones flavoniques, détectés à 365 nm en mode gradient d'élution Figure 47: Chromatogramme de CLHP d’ExEth de M. deserti De Noé représentant 84 les acides phénoliques, détectés à 260 nm en mode gradient d'élution Figure 48: Chromatogramme de CLHP d’ExAgL de M. deserti De Noé 85 représentant les aglycones libres, détectés à 365 nm en mode gradient d'élution Figure 49: Chromatogramme CLHP de l’ExButOH de M. deserti De Noé 86 représentant les C-glycosides, détectés à 365 nm en mode gradient d'élution Figure 50: Profil chromatographique des hétérosides flavoniques (ExHét) de M. 87 deserti De Noé détectés par CLHP à 365 nm en mode gradient d'élution Figure 51: Histogramme des évaluations de poids corporel des rats en fonction du 90 temps de différentes doses de l’infusé de M. deserti De Noé administré par voie orale Figure 52: Les variations du poids corporel des rats durant les 28 jours du 91 traitement subaiguë par l'infusé de M. deserti De Noé Figure 53: Pourcentages d’inhibition de l’œdème des souris traités avec l’infusé et 97 les extraits polyphénoliques de parties aériennes de M. deserti De Noé comparable, à celle de l'AAS Figure 54: Pourcentages d'augmentations du temps de réactions des parties 102 aériennes de M. deserti De Noé comparé au paracétamol en utilisant le test de la plaque chauffante

Liste des tableaux

Tableau 01: Composés isolés des quelques espèces de Marrubium 8 Tableau 02: Effets pharmacologiques des espèces de Marrubium 9 Tableau 03: Principales classes de composés phénoliques 16 Tableau 04: Principaux acides hydroxybenzoïques 17 Tableau 05: Principaux acides hydroxycinnamiques 18 Tableau 06: Principaux types de coumarines 18 Tableau 07: Résultats des réactions de caractérisations de M. deserti De Noé 65 Tableau 08: Teneur en polyphénols totaux de la plante M. deserti De Noé 68 Tableau 09: Teneurs absolues en différents composés phénoliques de M. 69 deserti De Noé Tableau 10: Corrélations entre les variables polyphénoliques étudiés pour la 75 station de Biskra Tableau 11: Corrélations entre les variables polyphénoliques étudiés pour la 77 station de Tamanrasset Tableau 12: Caractéristiques chromatographiques des composés de l'ExEth des 81 parties aériennes de M. deserti De Noé identifiés par CCM monodimensionnelle Tableau 13: Résultats de la séparation par CCM bidimensionnelle de 82 l’ExButOH des parties aériennes de M. deserti De Noé Tableau 14: Caractéristiques chromatographiques des flavones-flavonols de 83 l'ExEth identifiés par CLHP à 365 nm Tableau 15: Caractéristiques chromatographiques des acides phénoliques de 84 l'ExEth identifiés par CLHP à 260 nm Tableau 16: Caractéristiques chromatographiques des aglycones libres de 85 l'ExAgL de M. deserti De Noé identifiés par CLHP à 365 nm Tableau 17: Teneurs absolues des aglycones obtenus après hydrolyse dans 86 l’ExEth et sans hydrolyse dans l’ExAgL de M. deserti De Noé révélées identifiées par CLHP à 365 nm Tableau 18: Caractéristiques chromatographiques des C-glycosides de 87 l'ExButOH de M. deserti De Noé identifiés par CLHP à 365 nm Tableau 19: Caractéristiques chromatographiques des hétérosides flavoniques 88 de l’ExHét de M. deserti De Noé identifiés par CLHP à 365 nm Tableau 20: Poids relatifs de certains organes chez les rats ayant reçu l’infusé 92 de M. deserti De Noé Tableau 21: Effets subaigües de l’infusé de M. deserti De Noé sur quelques 93 paramètres hématologiques Tableau 22: Effets du traitement subchronique sur quelques paramètres 95 biochimiques des rats traités par l'infusé de M. deserti De Noé Tableau 23: Effets d’infusé, des différentes extraits phénoliques de M. deserti 96 De Noé et d’AAS sur l’œdème induit par carragénine à 1% Tableau 24: Effet analgésique d’infusé et des extraits phénoliques des parties 99 aériennes de M. deserti De Noé sur les contractions abdominales induites chez la souris par l’injection de l’acide acétique à 0.6% Tableau 25: Effets du paracétamol, de l’infusé et des extraits phénoliques sur 100 l'essai de la plaque chauffante induit la douleur chez les souris Tableau 26: Effets antalgique d’infusé, des extraits phénoliques de M. deserti 103 De Noé et du paracétamol sur la douleur (temps de léchage) induite chez les souris par l’injection de la solution de formol Tableau 27: Effets antipyrétiques d’infusé, des extraits phénoliques de M. 105 deserti De Noé et du paracétamol sur l’hyperthermique induite chez la rats par l’injection de la levure de bière

Liste des abréviations al: Collaborateur AAS: Acide acétylsalicylique ACN: Acétonitrile C: Carbone CAH: Classification ascendante hiérarchique CCM: Chromatographie sur couche mince ACP: Analyses en composantes principales

AlCl3: Chlorure d’aluminium CLHP: Chromatographie liquide à haute performance cm: Centimètre CoA: Coenzyme A CP: Chromatographie sur papier °: Degré °C: Degré Celsius µl: Microlitre µm: Micromètre

DL50: Dose létale 50 DO: Densité optique DPPH: 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl EAG: Equivalent d’acide gallique ExAgL: Extrait aglycones libres ExButOH: Extrait butanolique ExEth: Extrait éthérée ExHét: Extrait hétérosides flavoniques

FeCl3: Chlorure ferrique g: Gramme h: Heure

H2SO4: Acide sulfurique HAc: Acide acétique HCL: Acide chlorydrique J: Jour Kg: Kilogramme Km: Kilomètre Km2 : Kilomètre carré KOH: Hydroxyde de potassium M: Masse m: Mètre Mg: Magnésium mg: Milligramme min: Minute ml: Millilitre mm: Millimètre mm3: Millimètre cube MS: Matière sèche

Na2CO3: Carbonate de sodium NaCl: Chlorure de sodium

NH4OH: Ammoniaque nm: Nanomètre OH: Hydroxyle p.c.: Poids corporel Rdt: Rendement Rf: Facteur de rétention s: Seconde UV: Ultraviolet v: Volume

Table de matières Introduction 1 Chapitre I: Rappels bibliographiques

1.1 Généralités sur la famille des Lamiaceae 3 1.1.1 Répartition géographique 4 1.1.2 Caractéristiques botaniques 4 1.1.3 Intérêt de la famille des Lamiaceae 6 1.2 Généralités sur le genre Marrubium 6 1.2.1 Répartition géographique 6 1.2.2 Caractéristique botanique du genre Marrubium 7 1.2.3 Travaux antérieurs sur le genre Marrubium 7 1.3 Présentation sur Marrubium deserti De Noé 10 1.3.1 Position systématique 10 1.3.2 Etymologie et nomenclature 10 1.3.3 Répartition géographique 10 1.3.4 Description morphologique 11 1.3.5 Usages médicinales 11 1.3.6 Travaux antérieurs sur Marrubium deserti De Noé 11 2. Les composés phénoliques 13 2.1 Définition et structure chimique 13 2.2 Biosynthèse des composés phénoliques 14 2.2.1 Voie du shikimate 14 2.2.2 Voie de polyacétate 16 2.3 Classification des composés phénoliques 16 2.3.1 Acides phénoliques simples 17 2.3.2 Coumarines 18 2.3.3 Flavonoïdes 18 2.3.3.1 Structures chimiques et classification 19 2.3.3.2 Biosynthèse des flavonoïdes 22 2.3.4 Tannins 25 2.3.4.1 Tannins hydrolysables 25 2.3.4.2 Tannins condensés 25 2.3.5 Lignines 26 2.4 Rôles physiologiques et biologiques des composés phénoliques 27 2.5 Intérêt thérapeutique des composés phénoliques 27

Chapitre II: Matériels et Méthodes

1. Présentation des régions d’étude 29 2. Données écologiques des zones de prélèvement 30 2.1 Wilaya de Biskra 30 2.2 Wilaya de Tamanrasset 30 3. Matériels 31 3.1 Matériel végétal 31 3.2 Matériel animal 32 4. Méthodes d’études 32 4.1 Etude ethnobotanique 32 4.2 Etude phytochimique de M. deserti De Noé 33 4.2.1 Tests phytochimiques préliminaires (screening chimique) 33 4.2.2 Méthodes d’extraction des composés phénoliques 35 4.2.2.1 Extraction des aglycones flavoniques 35 4.2.2.2 Extraction des aglycones libres 37 4.2.2.3 Extraction des hétérosides flavoniques 37 4.2.2.4 Calcul du rendement des extractions 40 4.2.3 Analyses quantitative et qualitative des polyphénols de Marrubium deserti De Noé40 4.2.3.1 Analyses quantitative 40 4.2.3.1.1 Dosage des polyphénols totaux 40 4.2.3.1.2 Dosage de différentes fractions des composés phénoliques 40 4.2.3.1.3 Analyse statistique des données 42 4.2.3.2 Analyse qualitative 42 4.2.3.2.1 Chromatographie sur couche mince 42 4.2.3.2.2 Chromatographie sur papier 43 4.2.3.2.3 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) 43 4.3 Etude des activités biologiques de M. deserti De Noé 45 4.3.1 Tests toxicologiques 45 4.3.1.1 Etude de la toxicité aiguë de l’infusé et des extraits phénoliques de M. deserti De Noé chez les souris 45 4.3.1.2 Etude de la toxicité subaiguë de l’infusé de M. deserti De Noé chez les rats 46 4.3.2 Activité anti-inflammatoire de M. deserti De Noé chez les souris 47 4.3.3 Activité antalgique de M. deserti De Noé chez les souris 49 4.3.3.1 Test du writhing 49 4.3.3.2 Test de la plaque chauffante 49 4.3.3.3 Test au formol 50 4.3.4 Activité antipyrétique de M. deserti De Noé chez les rats 51 4.5 Analyse statistique des résultats 53

Chapitre III: Résultats et Discussions 1. Présentation de M. deserti De Noé 54 2. Etude ethnobotanique 56 2.1 Choix entre la phytothérapie et la médecine moderne 56 2.2 Utilisation de M. deserti De Noé selon le sexe 56 2.3 Utilisation de M. deserti De Noé selon l’âge 57 2.4 Utilisation de M. deserti De Noé dans les soins des maladies 58 2.4.1 Période de cueillette 58 2.4.2 Parties utilisées 58 2.4.3 Type des maladies traitées par M. deserti De Noé 59 2.4.4 Mode de préparation 60 2.4.5 Dose utilisée 61 2.4.6 Mode d’administration utilisée 61 2.4.7 Posologie, fréquence et durée d’utilisation 62 2.4.8 Etat d'utilisation et caractéristiques des recettes recensées 63 2.4.9 La toxicité de M. deserti De Noé 64 3. Etude phytochimique de M. deserti De Noé 65 3.1 Screening chimique 65 3.2 Extraction des composés phénoliques 66 3.2.1 Rendement des extractions 66 3.3 Analyses quantitatives et qualitatives des polyphénols de M. deserti De Noé 67 3.3.1 Analyses quantitatives par spectrophotométrie UV-visible 67 3.3.1.1 Dosage des polyphénols totaux 67 3.3.1.2 Dosage des différentes fractions des composés phénoliques 69 3.3.1.3 Analyse de la biodiversité de M. deserti De Noé de la région de Biskra et Tamanrasset par rapport aux variables chimiques mesurées 70 3.3.2 Analyses qualitatives des composés phénoliques par chromatographies 80 3.3.2.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) 80 3.3.2.2 Chromatographie sur papier (CP) 82 3.3.2.3 Chromatographie Haute Performance (CLHP) 82 4. Recherche des activité biologiques de M. deserti De Noé 89 4.1 Tests toxicologiques 89 4.1.1 Etude de la toxicité aiguë chez les souris 89 4.1.2 Etude de la toxicité subaiguë de l’infusé de M. deserti De Noé chez les rats 89 4.2 Activité anti-inflammatoire de M. deserti De Noé chez les souris 96 4.3 Activité antalgique de M. deserti De Noé chez les souris 99 4.3.1 Test du writhing 99 4.3.2 Test de la plaque chauffante 100 4.3.3 Test au formol 103 4.4 Activité antipyrétique de M. deserti De Noé chez les rats 105 Conclusion et perspectives 108 Références bibliographiques 110 Annexes

Introduction

Malgré l’important développement de l’industrie pharmaceutique qui a permis à la médecine moderne de traiter un grand nombre de maladies souvent mortelles, environ 80% de la population mondiale profite des apports de la médecine traditionnelle à base de plantes reconnaissant ainsi les savoirs empiriques de nos ancêtres (EL Rhaffari et Zaid, 2002). Au Maghreb, la phytothérapie est utilisée depuis toujours en médecine traditionnelle. Les pharmacopées régionales s’inspirent principalement de la médecine arabe classique et de l’expérience des populations locales en matière de soins. Elles reflètent à la fois l’histoire des Maghrébins et les spécificités de leur environnement naturel. Aujourd’hui les plantes jouent encore un rôle très important dans les traditions médicales et la vie des habitants de cette région du monde, mais les règles de leur utilisation manquent parfois de rigueur et ne tiennent pas compte des nouvelles exigences des techniques thérapeutiques modernes pour vérifier leurs suretés et leurs efficacités (Bellakhdar, 2006). Parmi ces pays, l'Algérie est connue pour la diversité de sa végétation vu sa position biogéographique privilégiée et son étendu entre la Méditerranée et l'Afrique sub-saharienne. En effet, le territoire Algérien couvre d’importantes ressources végétales réparties sur les côtes, les plaines, les montagnes, la steppe, le Sahara et autour des points d’eau. Ces ressources naturelles sont importantes pour l’économie Algérienne et pour le maintien de l’équilibre écologique. La zone Saharienne présente une flore spécifique, caractérisée par une importante diversité floristique, qui renferme de nombreuses espèces endémiques qui sont hautement adaptées au climat de cette zone. Elles renferment un large éventail de composés et d'éléments phytochimiques d'un intérêt grandissant d’où la nécessité et l'importance des recherches dans ce domaine (Ozenda ,1977; Duraffourd et al., 1997). Parmi ces éléments phytochimiques, les composés phénoliques représentent l’un des groupes de métabolites secondaires les plus répandus dans la nature et les plus importants du fait qu’ils aient une faible toxicité et de nombreuses propriétés biologiques, notamment thérapeutiques, pharmaceutiques, cosmétologiques et alimentaires (Balasundram et al., 2006). L’ethnobotanique et l’ethnopharmacologie ont pour but de recenser les plantes médicinales réputées actives afin d’entreprendre la recherche moderne, de préciser leurs propriétés et valider leurs usages. Les travaux de recherche, guidés par les utilisations vernaculaires, ont pour double but de constater le bien-fondé de l’usage d’une plante donnée en démontrant les effets biologiques par des techniques pharmacologiques et d’orienter les travaux ultérieurs vers l’identification des principes actifs de cette plante. Cette approche permet de sélectionner des plantes potentiellement actives et d’augmenter significativement le nombre de découvertes de nouveaux principes actifs (Bourobou, 2004).

Dans ce sens, notre travail s'inscrit dans les programmes de recherche développés par le laboratoire de recherche sur les zones arides (LRZA) qui porte sur l'étude ethnobotanique, phytochimique et biologique de plantes médicinales appartenant à notre flore Saharienne. Dans notre cas, nous nous sommes intéressés à une espèce endémique algérienne de la famille de Lamiaceae, Marrubium deserti De Noé récoltée dans les régions de Biskra et de Tamanrasset. Peu d’études concernant cette plante qui présente plusieurs applications en médecine traditionnelle sont publiées.

Introduction

Le manuscrit s’articule autour des trois chapitres;  Le premier chapitre englobe deux parties, la 1ère portera sur les rappels bibliographiques exhaustifs sur la plante sélectionnée (sa description botanique, sa systématique, ses utilisations thérapeutiques ainsi que tous les travaux antérieurs réalisés sur cette espèce). L’autre partie est consacrée à une étude bibliographique des composés phénoliques, leurs structures, leurs classifications, leur biosynthèse et quelques activités biologiques attribuées aux différentes familles de ces composés.  Le deuxième chapitre illustre le matériel et les méthodes utilisés dans les différentes recherches phytochimiques et biologiques.  Le troisième chapitre sera consacré à la présentation des résultats de l’étude ethnobotanique, l’extraction et le dosage des composés phénoliques et l’étude biologique in vivo des activités anti-inflammatoire, antalgique et antipyrétique des différents extraits préparés à partir de notre plante et leurs discussions.  Enfin, une conclusion générale et les perspectives envisageables pour des travaux ultérieurs.

Rappels bibliographiques

Les organismes vivants sont capables de produire des substances naturelles que l’homme exploite pour diverses raisons. Les plantes sont à elles seules, une source immense de molécules chimiques complexes utilisées dans les fragrances, l’agroalimentaire et l’industrie pharmaceutique (Bahorun, 1997). La plupart de ces plantes possèdent d’extraordinaires vertus thérapeutiques et sont utilisées dans le traitement de plusieurs maladies (Svoboda et Svoboda, 2000). De nos jours, nous comprenons de plus en plus, que les principes actifs des plantes médicinales sont souvent liés aux produits du métabolisme secondaire dont leurs propriétés sont actuellement pour un bon nombre reconnues et répertoriées et mises à profit dans la médecine traditionnelle et la médecine allopathique moderne (Bourgaud et al., 2001).

Dans le monde, on estime que les principes actifs provenant des végétaux représentent environ 25% des médicaments prescrits. Soit un total de 120 composés d’origine naturel provenant de 90 plantes différentes. En Afrique, plus de 80% de la population ont recours aux drogues formés essentiellement de matières végétales, et près de 6377 espèces de plantes sont utilisées (Diallo, 2005).

La pharmacopée algérienne est qualifiée de traditionnelle parce qu’elle n'est pas écrite et s'est perpétuée jusqu'a présent de génération en génération, chez les guérisseurs et les herboristes uniquement par la transmission orale des connaissances et la pratique de l'art médical. Aujourd’hui, le savoir des tradipraticiens est de moins en moins transmis et tend à disparaitre. Pour parvenir à une amélioration de ces connaissances, beaucoup de travaux de recherches restent à entreprendre pour démontrer l'intérêt thérapeutique de ces plantes, leurs principes actifs, leur mode d'action et même leur probable toxicité (Boudjelal, 2013).

1.1 Généralités sur la famille des Lamiaceae

Les Lamiaceae anciennement appelés Labiatae (Labiées) représentent une importante famille d’angiospermes dicotylédones, qui comprend 236 genres et environ 6900 à 7200 espèces (Dinc et al., 2009). Les plus importants genres sont Salvia (900), Scutellaria (360), coleus (325), Plectranthus (300), Hyptis (280), Teucrium (250), Thymus (220) et Nepeta (200) (Raja, 2012 ; Venkateshappa et Sreenath, 2013).

Les plantes appartenant à cette famille présentent une très large gamme de métabolites secondaires notamment: les alcaloïdes, les terpénoïdes, les composés phénoliques, les flavonoïdes et les iridoïdes glycosylés (Valant-Vetschera et al., 2003; Hajhashemi et al., 2003; Gabrieli et al., 2005; Hilan et al., 2006; Yemoa et al., 2008). Certains terpénoïdes de courte chaîne et des huiles essentielles sont responsables de l'odeur et le goût de ces plantes (Harborne et al., 1986; Naghibi et al., 2005).

Rappels bibliographiques

1.1.1 Répartition géographique

La famille des Lamiaceae présente une distribution cosmopolite, elle est répandue dans les zones tropicales et tempérées du monde et rare dans les régions arctiques et en haute montagne (Dupont et Guignard, 2007; Dinc et al., 2009). La plus grande diversité est rencontrée dans le bassin méditerranéen, l'Asie centrale, le continent américain, les iles du pacifique, l'Afrique équatoriale et la Chine (Figure 1) (Walker et al., 2004; Naghibi et al., 2005).

En Algérie, selon Quezel et Santa (1963), cette famille comprend 28 genres et 146 espèces. Les Lamiaceae ne se rencontrent guère dans la région présaharienne et dans l’étage supérieur du Hoggar, sauf les trois espèces Marrubium deserti, Salvia aegyptica et Teucrium polium sont largement répandues dans ces régions (Ozenda, 1977).

Figure 1: Carte de répartition géographique mondiale de la famille des Lamiaceae (en rouge) (Pirani et Prado, 2012)

1.1.2 Caractéristiques botaniques

1.1.2.1 Appareil végétatif

Les espèces appartenant à cette famille sont des herbacées, arbustes, sous-arbrisseaux, rarement arbres, parfois des plantes grimpantes, à poils sécréteurs, en général aromatiques à essence dont l'odeur se dégage par un simple contact. Leurs tiges sont quadrangulaires et leurs feuilles sont simples parfois composées, opposées sans stipules (Figure 2A, K). Elles sont constellées de glandes épidermiques riches en huiles essentielles (Paccalet, 1981; Gaussen et al., 1982; Spichiger et al., 2004; Ozenda, 2006).

Rappels bibliographiques

1.1.2.2 Appareil reproducteur

Les inflorescences des Lamiaceae sont situées à l'aisselle des feuilles supérieures. Elles sont généralement formées par de faux verticilles axillaires ou glomérules qui proviennent de la réunion de 2 cymes bipares. Les fleurs sont généralement hermaphrodites ou unisexuées, accompagnées de bractéoles. Elles ont évolué vers l’adaptation à la pollinisation par les insectes (entomophilie). Le calice est gamosépale persistant, parfois bilabié formé de 5 sépales. La corolle est gamopétale et zygomorphe. Elle comprend un tube plus ou moins long, droit ou incurvé, souvent poilu. Le limbe est bilabié, partagé en 5 lobes (2 pour la lèvre supérieure et 3 pour la lèvre inférieure) (Figure 2B, C et L). Les étamines sont didynames au nombre de quatre: 2 grandes et 2 petites (sauf pour le genre Mentha qui en compte 5) (Figure 2D-G et M-N). Le gynécée est formé de 2 carpelles formant un ovaire biloculaire reposant sur un disque glanduleux et possédant 2 ovules par loge. Chaque loge se subdivise par une fausse cloison en 2 logettes uniovulées. Les ovules sont anatropes ascendants à raphé interne; le fruit est un tétrakène formé de 4 nucules secs enveloppés par le calice (Figure 2H-J) (Quezel et Santa, 1963; Li et Hedge, 1994; Raja, 2012).

Figure 2: Caractéristiques morphologiques de la famille des Lamiaceae (Judd et al., 2002) (A-J) Salvia urticifolia: (A) plante fleurie, noter les cymes réduites formant une inflorescences pseudoverticilles (×5); (B) fleur, vue latérale (×5); (C) coupe longitudinale de la fleur (×5); (D) étamines, vue latérale, montrant une moitié fertile et une moitié stérile (×5); (E) étamines, vue adaxiale (×5); (F) étamines vues du dessus et du coté abaxial (×5); (G) staminode (×15); (H) gynécée, noter le style gynobasique, l’ovaire lobé et le disque nectarifère (×5); (I) nucule (×10); (J) embryon (×10). (K-O) Salvia lyrata: (K) feuille basilaire (×1); (L) coupe longitudinale de la fleur (×5); (M) étamines fertiles les deux moitiés produisant du pollen (×10); (N) sommet du style, à branches inégales (à fort grossissement); (O) coupe longitudinale du calice avec 2 (des 4) nucules presque murs (×10)

Rappels bibliographiques

1.1.3 Intérêt de la famille des Lamiaceae

De nombreuses espèces de cette famille sont utilisées dans l’industrie, l’agroalimentaire, la parfumerie et la phytothérapie. - En industrie: les espèces de Tectona sont utilisées dans l'industrie du bois où elles produisent un bois précieux et imputrescible recommandé pour la fabrication des ponts de bateaux, de meubles de jardin …etc. En plus, l’effet inhibiteur des huiles essentielles de quelques espèces de cette famille sur le développement bactérien et fongique laisse entrevoir des perspectives d’application dans les domaines de l’industrie alimentaire et pharmaceutique (Dupont et Guignard, 2007). - En agroalimentaire: de nombreuses espèces de cette famille sont l'une des principales sources culinaire du monde entier. Les espèces de Mentha, Thymus, Salvia, Origanum, Coleus et Ocimum sont utilisées comme légumes et arômes alimentaires, ainsi que les tubercules de quelques espèces de Stachys sont comestibles (Judd et al., 2002). - En parfumerie: beaucoup d’espèces sont utilisées en parfumerie pour leurs essences aromatiques volatiles tel que Lavandula angustifolia, Pogostemon patchouly, Melissa officinalis et Rosmarinus officinalis …etc. (Spichiger et al., 2004). - En phytothérapie: plusieurs espèces de cette famille sont utilisées dans la médecine traditionnelle et moderne en raison de leurs propriétées phytothérapeutiques et leur richesse en éléments actifs particulièrement les huiles essentielles comme Lavandula, Teucrium, Thymus et Salvia (Paccalet, 1981; Gaussen et al., 1982; Naghibi et al., 2005). - L’étude de Akriti et Pawar (2011) montre que l’extrait aqueux de la partie aérienne d’Ajuga bracteosa wall ex. Benth présente une activité diurétique et analgésique. - L’huile essentielle obtenue à partir des feuilles de Lavandula angustifolia Mill. présente des propriétés anti-inflammatoire et analgésique (Hajhashemi et al, 2003). - Les huiles essentielles obtenues à partir des parties aériennes de Thymus capitatus et Thymus bleicherianus présentent une bonne activité antimicrobienne (Amarti et al., 2008). -L’huile essentielle extraite à partir des feuilles et des fleurs de Rosmarinus officinalis ont des propriétés cardiotonique, diurétique et antiseptique (Gaussen et al., 1982). - L’extrait aqueux et éthanolique des parties aériennes de Zhumeria majdae montre une activité significative antinociceptive et anti-inflammatoire (Hosseinzadeh et al., 2002). - Les recherches sur Salvia officinalis L. montrent que les extraits aqueux et méthanolique ont des propriétés antioxydante et antidiabétique (Lima et al., 2007).

1.2 Généralités sur le genre Marrubium

Le genre Marrubium qui appartient à la famille des Lamiaceae comporte environ 97 espèces (Popoola et al., 2013). Selon Quezel et Santa (1963), en Algérie, il en existe sept espèces ; M. vulgare L., M. supinum L., M. peregrinum L., M. alysson L., M. alyssoides Pomel, M. willkommii Magn. (M. supinum X M. vulgare) et M. deserti De Noé. Cependant Ozenda (1991) ne mentionne qu’une seule espèce; M. deserti De Noé qui fait l’objet de notre étude. 1.2.1 Répartition géographique Les espèces du genre Marrubium sont répandues principalement le long de la Méditerranée, les zones tempérées du continent Eurasien (Herrera-Arellano et al., 2004; Meyre-Silva et al., 2005; Rigano et al., 2007) et quelques pays d’Amérique latine (Dendougui

Rappels bibliographiques et al., 2011). Plusieurs espèces de Marrubium sont trouvées dans un terrain des régions arides d’Egypte, de la Jordanie, d’Iraq, de la Mexique et de l’Algérie,...etc. (Caliş et al., 1992; Hatam et al., 1995; Al-Bakri et Afifi, 2007).

1.2.2 Caractéristiques botanique du genre Marrubium Les espèces de ce genre sont des plantes vivaces, blanche-cotonneuses, tomenteuses et laineuses, à feuilles crénelées, dentelées à nervure en réseau. Les fleurs sont blanches ou roses pâles, petites, disposées en verticilles axillaires (Figure 3A). Le calice est tubuleux à 10 ou 20 dents (plus rarement de 5) (Figure 3E, F). La corolle à un tube inclus, une lèvre supérieure dressée, terminée par deux lobes et une lèvre inferieure à trois lobes étales dont le médian est plus grand (Figure 3B). Les quatre étamines sont courtes et de même longueur et sont renfermées dans le tube de la corolle. Leurs anthères sont opposées bout à bout et toutes fertiles (Figure 3C). Le fruit est tétrakène, à ses quatre parties arrondies au sommet (Figure 3J) (Quezel et Santa, 1963).

Figure 3 : Caractéristiques morphologiques du Marrubium vulgare (Wiki média, 2015) (A): fleur, (B): corolle en coupe longitudinale, (C): étamines, (D): pollen, (E): calice, (F): coupe longitudinale du calice, (G): gynécée, (H): partie inférieur du gynécée, (I): gynécée en coupe transversale, (J): fruits

1.2.3 Travaux antérieurs sur le genre Marrubium

1.2.3.1 Etudes phytochimiques

Les études phytochimiques effectuées sur les espèces du genre Marrubium ont démontré la présence de différentes classes de composés tels que les polyphénols (en particulier; les flavonoïdes, les phénylpropanoïdes et les acides phénoliques), certains polymères, les stérols comme β-sitostérol, les diterpènes, les sesquiterpènes et les triterpènes (El Bardai et al., 2003; Hennebelle et al., 2007; Rigano et al., 2007; Karioti et al., 2007;

Rappels bibliographiques

Sarikurkcu et al., 2008; Dendougui et al., 2011). Le tableau 1 montre quelques principes actifs isolés à partir des espèces de Marrubium:

Tableau 1: Composés isolés de quelques espèces de Marrubium Espèce Principe actif isolé Références - Labdanes diterpèniques: velutine A, 15-epi- M. cyleneum velutine A, velutine B, 15-epi-velutine B, velutine Karioti et al., 2005 C, cyllenine A et 15-epi-cyllenine A - Flavonoïde acétylé: chrysoériol-7-O-(3",6"-di- M. velutinum Karioti et al., 2003 O-E-p-coumaroyl)-β-D glucopyranoside - Phénylpropanoïdes: alyssonoside, verbascoside, M. alysson leucosceptoside A, martynoside, forsythoside B et Caliş et al., 1992 leucosceptoside B - Labdanes diterpèniques: marrubinone A et Iida et al., 1995 marrubinone B M. astracanicum - Sesquiterpènes: β−caryophyllène (21.2%) et Javidnia et al., 2007 valéranone (5.4%) - Labdane diterpèniques: polyodonine - Flavonoïde: apigénine-7-O-[β-D-(6-O-p- M. polydon Hatam et al., 1995 coumaroyl)-glucopyranosyl] et apigénine-7-O-[β- O-(3,6-di-O-p-coumaroyl)-glucopyranosyl] - Phényléthanoïdes: marruboside - Phénylpropanoïdes: actéoside, forsythoside B, Sehpaz et al., 2002a,b arenarioside et ballotetroside M. vulgare - Phénylpropanoïdes: eugénol (50%) Belhattab et Larous, - Monoterpène: carvacrol (36.28%) et β- 2006; Said-Al Ahl et phellandrène (15.49%) al., 2015 - Sesquiterpènes: β-bisabolène (29%) - Labdanes diterpèniques: 13S-preperegrinine, 3a- hydroxymarrubiin, 9a, 13R-15,16-bisepoxy-15b- Argyropoulou et al., methoxy-3-oxo-labdan-6b et 19-olide et 15- 2009 methoxyvelutine C M. thessalum - Flavonoïdes: ladanéine - Sesquiterpènes: caryophyllène oxyde (21.7%), β-caryophyllène (17.6%), germacrène D (15.3%), Argyropoulou et β-bisabolène (12.6%) et trans-β-farnésène (8.1%) Skaltsa, 2012 - Flavonoïdes: ladanéine, 5,7,4'- M. peregrinum trimethylscutellaréine et 5,6,7,4’- Alkhatib et al., 2010 tétraméthoxyflavone - Sesquiterpènes: bicyclogermacrène (26.3%), M. parviﬂorum germacrène D (21.5%) et β-caryophyllène Khanavi et al., 2005 (15.6%) M. bourgaei Sesquiterpènes: β-caryophyllène (23.2%), (Z)-β- Boiss. ssp. farnésène (13.5%) et germacrène D (10.3%) Demirci et al., 2004 caricum - Labdanes diterpèniques: marrubiine Tajbakhsh et al.,2008 M. anisodon - Sesquiterpènes: germacrène D (44.2%) et β- Çitoǧlu et Aksit, caryophyllène (10.4%) 2002

Rappels bibliographiques

1.2.3.2 Etudes pharmacologiques

Les espèces du genre Marrubium sont largement utilisées en médecine traditionnelle dans plusieurs pays pour le traitement de nombreuses affections. En effet, plusieurs recherches scientifiques ont démontré leurs intérêts pharmacologiques (Tableau 2).

Tableau 2: Effets pharmacologiques des espèces de Marrubium

Espèce Extrait étudié Activité Références pharmacologique M. vulgare Extrait Hépatoprotectrice El Bardai et al., 2003; éthanolique, Antioxydante Herrera-Arellano et al., 2004; extrait d'éther de Antibactérienne Meyre-Silva et al., 2005; pétrole et les Analgésique Masoodi et al., 2008; huiles essentielles Antidiabétique Kadri et al., 2011; Vasorelaxante Boutlelis Djahra et al., 2012; Rashid et al., 2014; Bokaeian et al., 2014; Elmhdwi, 2014 M. crassidens Extrait Antiproliférative méthanolique Antioxydante Hamedeyazdan et al., 2014 M. alysson Extrait Anti-inflammatoire méthanolique, Antioxydante Edziri et al., 2007; hexanique Cytotoxique Edziri et al., 2011; chloroformique et Antivirale Essawy et al., 2014 butanolique Antibactérienne M. parviflorum Extrait Analgésique hydroalcoolique Anti-inflammatoire Khanavi et al., 2012

M. globosum Extrait Antioxydante subsp. globosum méthanolique et les huiles Sarikurkcu et al., 2008 essentielles

Rappels bibliographiques

1.3 Présentation du Marrubium deserti De Noé

1.3.1 Position systématique

Nous avons adopté la systématique phylogénétique APG III (Angiosperm Phylogeny Group, 2009);

Règne Plantae Embranchement Spermaphytes Sous embranchement Angiosperme Classe Eudicotylédones Sous classe Astéridées Ordre Lamiales Famille Lamiaceae Genre Marrubium Espèce Marrubium deserti De Noé

1.3.2 Etymologie et nomenclature Le nom Marrubium dérive du mot hébreu marrob: Mar qui signifie sève amère (jus amer) et deserti du désert (IUCN, 2005). Marrubium deserti est connue sous différents synonymes: Sideritis deserti de Noé (1855) et Maropsis deserti (de Noé) Pomel (1874) (Greuter et Raus, 1998). - Nom scientifique: Marrubium deserti De Noé (Ozenda, 1977). - Français: marrube du désert - Anglais: desert horehound

- Nom vernaculaire: différentes nomenclatures ont été attribuées à l’espèce Marrubium deserti De Noé dont:  Djaida, djaada deux appellations utilisées à El-Goléa, Béni abbés, et Ouargla (Algérie) (Quezel et Santa, 1963; Maiza et al., 1993; Sahki et Sahki, 2004);  Kayatite elsahra (Hiliss, 2005);  Al-jaâda, mahzouma (IUCN, 2005);  Es samra et el beida (Baumer et Zeraïa, 1999);  Merriouet saharaui (Boudjelal et al., 2013).  Tamahaq: Telheret et Aberkekou (Sahki et Sahki, 2004; IUCN, 2005). 1.3.3 Répartition géographique Marrubium deserti De Noé est une espèce endémique commune de tout le Sahara septentrional et central (Quezel et Santa, 1963; Ozenda, 1977). Cette plante pousse dans les lits sablonneux et pierreux des oueds de l'étage tropical et de l'étage méditerranéen inferieur et aussi s’élevant dans les pâturages secs (Maire, 1993; Sahki et Sahki, 2004; Benhammou et al., 2009). Elle se développe dans un climat aride, avec des précipitations annuelles de 100 mm (IUCN, 2005).

Rappels bibliographiques

1.3.4 Description morphologique

1.3.4.1 Appareil végétatif Marrubium deserti De Noé est un arbrisseau ou arbuste vivace qui atteint jusqu'à 20 à 30 cm de hauteur. Les tiges sont très rameuses, couvertes des poils laineux blanchâtres. Les feuilles sont petites en coin à base et portant quelques dents de forme variable au sommet, opposées, blanchâtres, et à pilosité opprimée très courte (Sahki et Sahki, 2004; IUCN, 2005; Benhammou et al., 2009).

1.3.4.2 Appareil reproducteur L'inflorescence est en forme de couronne autour de la tige. Les fleurs sont roses carmin ou rose pâle, groupées en glomérules à l'aisselle des paires de feuilles. Les pétales sont petits (1cm) et de couleur violette pâle. Le calice est vert clair, tubuleux, celui-ci s’accroissant considérablement par sa partie supérieure en formant autour du fruit une auréole membraneuse, de 4-6 mm à tube rétréci à son sommet. La floraison est au printemps (mars- avril). Les épis sont grêles, lâches, interrompus, larges de 12-15 mm (Quezel et Santa, 1963; Ozenda, 1977).

1.3.5 Usages médicinales

L’espèce Marrubium deserti De Noé est largement utilisée en médecine traditionnelle en Algérie. La décoction de feuilles et de jeunes bourgeons de la plante est utilisée contre les troubles digestifs, les coliques, les diarrhées, les parasitoses intestinales, les maladies respiratoires, les tachycardies, le diabète et les dysménorrhées (Maiza et al., 1993; Ould El Hadj et al., 2003; Sahki et Sahki, 2004; Boudjelal et al., 2013). L’infusé de feuilles est prescrit également comme remède antifébrile et calmant pour les bébés (IUCN, 2005). En plus, l’infusé des parties aériennes de cette plante est utilisé comme remède anti- inflammatoire (Saad et al., 2016). En usage externe, M. deserti De Noé est employée dans le traitement des réactions allergiques ainsi que pour soigner les piqures de scorpions (Maiza et al., 1993; Zaabat et al., 2010).

En médecine traditionnelle marocaine, M. deserti De Noé est employée pour traiter la grippe. Elle est mélangée avec l’oignon pour traiter des furoncles (IUCN, 2005).

1.3.6 Travaux antérieurs sur Marrubium deserti De Noé

1.3.6 1 Etudes phytochimiques

Selon Zaabet et al. (2011), l'analyse phytochimique de l’extrait dichlorométhane des parties aériennes de M. deserti De Noé, a mené à l'isolement des dérivés terpénoïdes parmi lesquels, cinq sont connus (cyllenine A, 15-epi-cyllenine A, marrubiine, marrulactone et marrulibacétal) et deux type labdane diterpénique sont nouvellement découvert appelés marrulibacétal A et desertine. Cinq flavonoïdes sont isolés des phases acétate d’éthyle et butanolique de M. deserti De Noé: l’apigénine-7-O-glucoside, l’apigénine-7-O-[6’’-E-p-O- coumaryl] D-glucopyranoside, l’apigénine-7-O-néohesperidoside, l’apigénine-7-O- glucuronide, et l’apigénine ainsi que deux phényléthanoïdes (actéoside et forsythoside B).

Dendougui et al. en 2011, ont montré la présence d’un nouveau labdane diterpène; le 6- déhydroxy-19-acétyl-marrubénol, et trois autres diterpènes; 19-acétyl-marrubénol, 6-acétyl- marrubénol et 16-epoxy-9-hydroxylabda-13(16), 14-diene, isolés de l’extrait chloroformique

Rappels bibliographiques des parties aériennes de M. deserti De Noé. Trois stérols; β-sitostérol, stigmastérol et β- sitostérol 3-O-glucoside, ont également été isolés à partir de cette plante. Une étude sur les huiles essentielles du M. deserti De Noé a été effectuée à Ouargla, a abouti à l’identification de 27 composés constituant (62.91%), dont les majoritaires sont: le δ- cadinène (17.63%), germacrène D (7.01%), triméthylpentadéca-2-one (4.61%) et 9-méthyl- undécène (4.17%) (Chebrouk et al., 2011). L’analyse de l'huile essentielle de la partie aérienne de M. deserti De Noé effectué par Laouer et al. (2009) montre la présence de germacrène D (45.7%) comme composant principal.

1.3.6 2 Etudes pharmacologiques

Peu de travaux qui traite des activités pharmacologiques de M. deserti De Noé ont été réalisés dont la plupart sont focalisés sur les activités antimicrobienne et antioxydante. Des études réalisées sur les huiles essentielles, les extraits méthanolique et dichlorométhane des parties aérienne du M. deserti De Noé, montrent que ces huiles et ces extraits ont une puissante activité antimicrobienne contre diverses souches bactériennes; Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella typhi et fongiques; Candida albicans, Aspergillus niger, Penicillium digitatum. L’évaluation de l’activité antioxydante effectué par le test du DPPH et du blanchiment du β- carotène montre que cette plante présente des propriétés antioxydantes (Laouer et al., 2009; Benhammou et al., 2009; Ghedadba et al., 2015).

Edziri et al. (2012), ont rapporté l’activité antivirale et antioxydante de l’extrait éther de pétrole, acétate éthyl, chloroformique, butanolique et méthanolique de M. deserti De Noé collecté en Tunisie.

Zaabet et al. (2011), ont montré la présence des activités antigénotoxique et génotoxique des extraits dichlorométhane et méthanolique de M. deserti De Noé.

Rappels bibliographiques

2. Les composés phénoliques

Les métabolites primaires et secondaires sont des molécules issues du métabolisme des végétaux ou des animaux (Richter, 1993). Les métabolites primaires sont caractérisés par leur caractère nécessaire et vital à la vie de la cellule ou de l'organisme, ils sont représentés par les glucides, les lipides et les acides aminés (Nabors, 2008). Les plantes produisent un nombre important de molécules dites métabolites secondaires qui ne sont pas, par définition, vitaux pour la cellule ou l’organisme, mais ils sont essentiels dans l'interaction de la plante avec son environnement (Slade et al., 2005). Ils sont d’une variété structurale extraordinaire et représentés par un nombre assez important. Les plantes qui poussent dans les régions arides et semi-arides sont de bonnes sources pour la production de divers types de métabolites secondaires qui les rendent résistants aux diverses pénuries environnementales tel que le stress hydrique, la salinité et les pathogènes (Meena et Patri, 2008). Les métabolites secondaires sont répartis en trois grandes familles chimiques; les composés terpéniques, les composés azotés ou alcaloïdes et les composés phénoliques (Meyer et al., 2008).

Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux composés phénoliques. Ces composés représentent l’un des groupes les plus importants du fait qu’ils ont une faible toxicité et de nombreux avantages biologiques, notamment thérapeutique, pharmaceutique, cosmétologique et alimentaire (Havsteen, 2002). 2.1 Définition et structure chimique L’appellation «polyphénols» ou «composés phénoliques» regroupe un ensemble de substances aux structures variées, dont plus de 8000 molécules ont été isolées et identifiées (Hennebelle et al., 2004). Selon leurs caractéristiques structurales, ils sont divisés en une dizaine de classes chimiques qui présentent toutes un point commun: la présence dans leur structure d’au moins un cycle aromatique à six carbones. Ce dernier est porteur d’un nombre variable de fonctions hydroxyles (OH), qui peuvent être également estérifiées, éthérifiées et liées à des sucres sous forme d’hétérosides (Raven et al., 2000; Bahorun, 1997; Marouf et Reynaud, 2007). Ils sont également des substances carbonées cycliques dont leurs structures contiennent exclusivement du carbone, de l'hydrogène, de l’oxygène et ne contiennent pas d'azote (Richter, 1993; Nabors, 2008). Ces composés phénoliques peuvent être des molécules simples, comme les acides phénoliques, ou des composés hautement polymérisés comme les tanins condensés (Lugasi et al., 2003). Dans la nature, les principaux composés phénoliques ne se trouvent pas à l'état libre mais sous forme d'esters ou d’hétérosides (Ribereau-Gayon, 1968). Leur répartition qualitative et quantitative est différente selon les espèces, les tissus et les stades physiologiques (Macheix, 1996). La solubilité de ces composés dépend de leur nature chimique, qui varie de composés simples à fortement polymérisés. Par conséquent, il est très difficile de développer un procédé d'extraction approprié de tous les composés phénoliques de la plante (Mohammedi, 2013).

Les polyphénols sont présents dans les racines, les tiges, les fleurs et les feuilles de tous les végétaux (Middleton et al., 2000). Dans les aliments, les fruits et les légumes sont les principales sources des ces composés (Aherne et O'Brien, 2002; Brat et al., 2006). Les plantes médicinales peuvent aussi contenir les polyphénols tel que les acides phénoliques, les coumarines, les flavonoïdes, les stilbènes, les tannins, les lignanes et les lignines (Cieslik et al., 2006; Djeridane et al., 2006). La teneur en composés phénoliques des aliments d’origine

Rappels bibliographiques végétale est fortement influencée par plusieurs facteurs tels que la variation du stade de croissance, le degré de maturité, la saison et le climat (Lugasi et al., 2003; Manach et al., 2004; Naczk et Shahidi, 2006).

2.2 Biosynthèse des composés phénoliques Les composés phénoliques sont issus de deux grandes voies métaboliques: la voie du shikimate et la voie de polyacétate (Harborne, 1989). 2.2.1 Voie du shikimate La biosynthèse de nombreux composés phénoliques débute à partir des acides aminés aromatiques, la phénylalanine et la tyrosine (Figure 4). La désamination oxydative de la phénylalanine en acide cinnamique et de la tyrosine en acide p-coumarique est catalysée par des enzymes spécifiques: Phénylalanine Ammonia-Lyase (PAL) et la Tyrosine Ammonia- Lyase (TAL) respectivement. L’activité et la synthèse de la PAL subis un contrôle exercé par de multiples facteurs: la lumière, la température et l’éthylène. L’addition d’un groupement OH en C-4 du noyau aromatique de l’acide cinnamique par la Cinnamate 4- Hydroxylase permet également de former l’acide p-coumarique. Sous l’action de la 4- Coumarate CoA Ligase, l’acide p-coumarique peut former le p-coumaroyl-CoA, précurseur de tous les phénylpropanoïdes (C6-C3) ainsi que de nombreux acides phénoliques (dérivés d’acides benzoïques) (Richter, 1993; Hopkins, 2003; Walker, 2010; Verdu, 2013).

Rappels bibliographiques

Phosphoénol Pyruvate Dérivés des acides Erythrose 4-Phosphate hydroxycinnamiques (p-coumaroylglucose, acide féruloylquinique...) Protéines Voie de l'acide shikimique

Phénylalanine Acide chorismique Tyrosine TR

PAL TAL

Phénylpropanoïdes: Acides Lignanes hydroxycinnamiques Acides de la série (coumarique, caféique, férulique, sinapique) benzoïque et leurs esters (p-hydroxybenzoïque, avec le Coenzyme A (CoA) salicylique, gallique...)

p-coumaroyl-CoA CCR, CAD (C6-C3)

Manolignols Tannins 3 malonyl (alcools p-coumarylique, hydrolysables CHS coniférylique et sinapylique) CoA (3 x C3) CHI

Eroxydases Laccases

(4 CoA + 3 Co2) Coumarines Co2 (coumarines simples, furanocoumarines, Lignines coumarines prénylées)

Flavonoïdes en C15 (C6-C3-C6): chalcones, flavanones, flavonols, Stilbènes anthocyanes, flavanes..... (resvératrol) Tannins condensés Isoflavonoïdes

Figure 4: Grandes lignes de la biosynthèse des principaux groupes des composés phénoliques (voie mixte) (Macheix et al., 2005) PAL: Phénylalanine Ammonia Lyase, TAL: Tyrosine Ammonia Lyase, CCR: Cinnamate CoA Réductase, CAD: Cinnamyl Alcool Déshydrogénase, CHS: Chalcone Synthase, CHI: Chalcone flavanone Isomérase, TR: Transférase

Rappels bibliographiques

2.2.2 Voie de polyacétate Les noyaux aromatiques sont aussi formés par condensation répétée d’unités d’acétates. Cette voie consiste en la polymérisation d’unités acétates activées sous la forme de malonyl-CoA suivie par des cyclisations et une étape souvent spontanée d’aromatisation du noyau phénolique (Figure 4). Cette voie d’élaboration concerne principalement certaines quinones et des acétophénones (Richter, 1993; Walker, 2010).

2.3 Classification des composés phénoliques Les composés phénoliques peuvent être regroupés en de nombreuses classes (Tableau 3), qui se différencient d’abord par la complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très polymérisées), ensuite par le degré de modifications de ce squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation, de méthylation …etc.), enfin par les liaisons possibles de ces molécules de base avec d’autres molécules (glucides, lipides et protéines) (Macheix et al., 2005). Tableau 3: Classes de composés phénoliques (Goodwin et Mercer, 1990)

Nombre de carbone Squelette carboné Classe Structure de base

6 C6 Phénols simples

Acides 7 C -C 6 1 hydroxybenzoïques

8 C6-C2 Acides phénylacétiques

Acides hydroxycinnamiques 9 C6-C3 Coumarines

10 C6-C4 Naphtoquinones

Xanthones

13 C6-C1-C6

Stilbènes 14 C6-C2-C6

Flavonoïdes 15 C6-C3-C6

18 (C6-C3)2 Lignanes Lignines (C6-C3)n N Tanins condensés (C6-C3-C6)n

Rappels bibliographiques

On distingue ainsi une dizaine de grandes classes de composés regroupant des formes simples (phénols simples, acides hydroxybenzoïques, acides hydroxycinnamiques, coumarines, stilbènes, flavonoïdes, lignanes … etc.) et des phénols condensés issus de la polymérisation des lignanes ou de certains flavonoïdes (tanins) (Goodwin et Mercer, 1990; Bohorun, 1997; Meyer et al., 2008).

2.3.1 Acides phénoliques simples Les acides phénoliques font partie des formes les plus simples des composés phénoliques et se séparent en deux grands groupes distincts qui sont les acides hydroxybenzoïques et les acides hydroxycinnamiques. 2.3.1.1 Acides hydroxybenzoïques Les acides hydroxybenzoïques qui sont des dérivés de l'acide benzoïque, sont largement répandus sous forme d'esters ou de glucosides (Guignard, 2000; Macheix et al., 2005). Ils rentrent dans la structure des tannins hydrosolubles. Ils se trouvent en général en faible quantité dans les végétaux à l’exception de certains fruits rouge (fraise, cerise et mûre …etc.) et le thé (Manach et al., 2004). Ils sont souvent libérés après hydrolyse alcaline du matériel végétal (Ribereau-Gayon, 1968). Les acides hydroxybenzoïques les plus abondants sont répertoriés dans le tableau ci-dessous. Tableau 4: Principaux acides hydroxybenzoïques (Manach et al., 2004; Tsao, 2010)

Structure R1 R2 R3 R4 Acides phénoliques

H H H H Acide benzoïque H H OH H Acide p-hydroxybenzoïque H OH OH H Acide protocatéchique H OCH3 OH H Acide vanillique H OH OH OH Acide gallique H OCH3 OH OCH3 Acide syringique OH H H H Acide salicylique OH H H OH Acide gentisique

2.3.1.2 Acides hydroxycinnamiques

Les acides hydroxycinnamiques ont une structure de base en C6-C3 dérivée de l’acide cinnamique (Tableau 5). Ils sont plus communs que les acides hydroxybenzoïques. Ces acides sont rarement trouvés sous forme libre, ils se trouvent dans une gamme très étendue des formes estérifiées (Ribereau-Gayon, 1968; Goodwin et Mercer, 1990). Certains acides hydroxycinnamiques peuvent être liés à des macromolécules non phénoliques (Macheix et al., 2005). Ces acides sont retrouvés dans toutes les parties des fruits et des légumes, quoique les concentrations les plus élevées soient observées dans la partie externe du fruit mûr (Manach et al., 2004). L’acide caféique est généralement l'acide phénolique le plus abondant, représente entre 75 à 100% de tous les teneurs en acide hydroxycinnamique de la plupart des fruits. L'acide férulique est trouvé dans les graines de céréales, principalement dans les parties externes (Scalbert et Williamson, 2000).

Rappels bibliographiques

Tableau 5: Principaux acides hydroxycinnamiques (Goodwin et Mercer, 1990; Macheix et al., 2005)

Structure R1 R2 R3 Acides phénoliques H H H Acide cinnamique H OH H Acide p-coumarique OH OH H Acide caféique OCH3 OH H Acide férulique OCH3 OH OCH3 Acide sinapique

2.3.2 Coumarines

Les coumarines qui sont aussi en C6-C3, appartiennent au groupe de composés largement répondues connus par des benzo-α-pyrone (les lactones), issues de la formation d'un cycle fermé à partir de l'acide hydroxycinnamique. Elles donnent une odeur caractéristique semblable à celle du foin fraîchement fauché. Les coumarines sont très répandues chez les dicotylédones, notamment dans les racines et les écorces; avec plus de 800 composés répertoriées. Elles se trouvent soit à l’état libre ou bien combiné avec des sucres comme les hétérosides et les glycosides. Dans la cellule, les coumarines sont principalement présentes sous forme glycosylée. Cette glycosylation serait une forme de stockage qui permet d’éviter les effets toxiques des coumarines (Guignard, 2000; Hopkins, 2003; Paume, 2009; Cheynier et al., 2013). Les coumarines les plus fréquemment rencontrées sont citées dans le Tableau 6.

Tableau 6: Principaux types de coumarines (Richter, 1993; Hopkins, 2003)

Structure R R Coumarines 6 7 H OH Ombelliférone OH OH Aesculétine

OCH3 OH Scopolétine ou Scopolétol

2.3.3 Flavonoïdes Le terme flavonoïdes (du latin flavus = jaune) désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols. Ce sont des pigments quasiment universels des végétaux, avec plus de 5000 structures décrites. Ils sont en partie responsables des colorations jaune, orange, et rouge de différents organes végétaux (Goodwin et Mercer, 1990; Hollman et al., 1996; Hollman et Katan, 1997; Janićijević et al., 2007). Ces divers composés se rencontrent à la fois sous la forme libre ou sous la forme de glycosides (Narayana et al., 2001; Proestos et Komaitis, 2013).

Les flavonoïdes sont surtout abondants et diversifiés chez toutes les plantes supérieures, où ils peuvent être présents dans divers organes: racines, tiges, bois, feuilles, fleurs et fruits avec une teneur maximale dans les organes jeunes (feuilles et boutons floraux) (Harborne, 1977; Marouf et Reynaud, 2007; Sharma et al., 2008).

Rappels bibliographiques

2.3.3.1 Structures chimiques et classification

Les flavonoïdes présentent un squelette de base à 15 atomes de carbone, avec deux cycles benzéniques (A) et (B) à six atomes de carbones (C6) qui sont reliés entre eux par une chaîne en C3 qui forme un hétérocycle central, appelé cycle (C) (Figure 5) (Cowan, 1999; Middleton et al., 2000; Dai et Mumper, 2010).

Figure 5: Structure de base d’un flavonoïde (Balasundram et al., 2006) Dans les plantes, les flavonoïdes sont relativement résistants à la chaleur, l'oxygène, la sécheresse et l'acidité modérée et ils peuvent être modifiés par la lumière (Kühnau, 1976). La nature chimique des flavonoïdes dépend de leur classe structurale, du degré d'hydroxylation et de méthoxylation, du degré de polymérisation, des substitutions et des conjugaisons sur le cycle C (Cook et Samman, 1996; Atmani et al., 2009). En se basant sur le degré d’oxydation du noyau central, les flavonoïdes peuvent être divisés en différentes classes: flavones, flavonols, flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols, flavan- 3,4-diols, anthocyanidines, isoflavones, chalcones, dihydrochalcones et aurones (Goodwin et Mercer, 1990; Janićijević et al., 2007).

2.3.3.1.1 Flavones et flavonols

Ces molécules sont les plus nombreuses des flavonoïdes. Le cycle A est dans près de 90% des cas, substitué par deux hydroxyles phénoliques en C-5 et C-7. Ces hydroxyles peuvent être libres ou éthérifiés, l’un d’entre eux peut s’engager dans une liaison hétérosidique (Figure 6). D’autre part, le cycle B est substitué dans 80% des cas en C-4’, peut être 3’, 4’-disubstitué ou moins fréquemment 3’,4’,5’-trisubstitué; ces substituants peuvent être des groupes OH ou méthoxyles (OCH3). Les autres positions (C-2’ et C-6’) ne sont qu’exceptionnellement substituées. Les flavonols se distinguent des flavones par la présence d’un groupement OH en position C- 3. La distribution de ces flavones, flavonols et de leurs hétérosides est universelle, mais certains schémas de substitution sont restreints à des familles ou des groupes de familles, d’où leur intérêt en chimiotaxonomie. Ainsi, les flavonoïdes 6-O- substitués sont fréquents chez les Lamiaceae, les Rutaceae et les Astéraceae, et les flavonols 2’-O- substitués chez les Lamiaceae et les Solanaceae (Anderson et Markham, 2006; Bruneton, 2009; Touafek, 2010).

Rappels bibliographiques

Figure 6: Structure de flavones et flavonols (Bruneton, 2009; Dai et Mumper, 2010)

2.3.3.1.2 Flavanones et dihydroflavonols

Les flavanones et les dihydroflavonols sont caractérisés par l’absence de la double liaison en C-2 et C-3 et par la présence d’un carbone asymétrique en C-2 (Figure 7). Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par l’hydroxylation de la position C-3. Cette classe de flavonoïdes semble un peu moins fréquente que son homologue insaturé regroupant les flavones et flavonols (Slade et al., 2005; Bruneton, 2009).

Figure 7: Structure de flavanones et dihydroflavonols (Slade et al., 2005; Trabelsi et al., 2011)

2.3.3.1.3 Flavan-3-ols et flavan-3,4-diols

Ces deux classes de molécules sont toujours hydroxylées en C-3 et se caractérisent par l’absence du groupe carbonyle en C-4 (Figure 8). Les flavan-3-ols (appelés aussi les catéchines) possèdent deux atomes asymétriques en C-2 et C-3. Chaque composé peut alors exister sous forme de quatre stéréoisomères optiquement actifs: (+)-épicatéchine, (-)- catéchine, (-)-épicatéchine et (+)-catéchine. Ces deux derniers sont les formes les plus répandues. Les catéchines n’existent pas dans la nature sous forme d’hétérosides (Ribereau- Gayon, 1968). Les flavan-3,4-diols (ou leucoanthocyanidines) se distinguent des catéchines par la présence du OH en C-4. Ils possèdent trois atomes de carbones asymétriques, et peuvent théoriquement, exister sous forme de huit stéréoisomères optiquement actifs, mais ces entités n’ont pas pu être isolées à l’état individuel stable (Tsao, 2010). Les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols sont souvent à l’origine des polymères flavoniques appelés proanthocyanidols ou tannins condensés (Bruneton, 1999).

Rappels bibliographiques

Figure 8: Structure de flavan-3-ols et favan-3,4-diols (Tsao, 2010)

2.3.3.1.4 Anthocyanidines Les anthocyanidines (Figure 9) sont des dérivés du phényl-2 benzopyrylium ou flavylium; le cation flavylium est un ion oxonium, dans lequel l’atome d’oxygène est tétravalent et chargé positivement (Ribereau-Gayon, 1968). Ils sont les aglycones des anthocyanes (glucosides). Ces dernières sont les pigments vacuolaires rouges ou bleus de tous les végétaux (Marouf et Reynaud, 2007). Contrairement aux anthocyanes sous forme aglycone qui sont rarement rencontrés dans la plante, les hétérosides des cyanidine, pelargonidine et delphinidine sont les plus fréquents (Hopkins, 2003). Ils sont chimiquement stables dans des solutions acides (Tsao, 2010). Les anthocyanidines se distinguent les un des autres principalement par l’arrangement des substitutions sur le cycle B. Lorsque le nombre de substitution augmente dans ces aglycones, la coloration bleue devient plus intense, alors que la méthylation des groupes hydroxyles conduit à une couleur rouge. La liaison avec les unités glucidiques a lieu préférentiellement au niveau du groupe hydroxyle de la position C-3 (Richter, 1993; Hopkins, 2003; Marouf et Reynaud, 2007).

Figure 9: Structure d’anthocyanidines (Manach et al., 2004) 2.3.3.1.5 Chalcones et aurones Les chalcones sont différentes des autres types de flavonoïdes par l'ouverture du noyau pyranique central, elles sont constituées par deux unités aromatiques reliées par une chaîne tricarbonée, cétonique et insaturée (Figure 10). Le noyau B est fréquemment non substitué, alors que les substitutions sur le cycle A sont le plus souvent identiques à celles des autres flavonoïdes. Les aurones sont caractérisées par une structure de 2-benzylidène coumaranone (Figure 10) (Bruneton, 1999; Atmani et al., 2009).

Rappels bibliographiques

Figure 10: Structure chimique de chalcones et aurones (Bruneton, 1999; Middleton et al., 2000) 2.3.3.1.6 Isoflavones Les iso-flavonoïdes sont moins répandues chez les végétaux. Ces composés très actifs se trouvent essentiellement chez les légumineuses. Les isoflavones sont considérées comme des dérivés des flavones, elles représentent une sous-classe importante et très distinctive des flavonoïdes. Contrairement à la plupart des autres flavonoïdes, les isoflavones sont caractérisées par la présence d’un cycle B fixé à C-3 plutôt que la position C-2 (Figure 11) (Wang et Murphy, 1994; Mazur et al., 1998).

Figure 11: Structure chimique d’isoflavones (Moon et al., 2006)

2.3.3.2 Biosynthèse des flavonoïdes Depuis plusieurs décennies, l’analyse et la compréhension du métabolisme phénolique, plus particulièrement celui des flavonoïdes, constituent un réel défi pour un grand nombre d’équipes scientifiques (Anderson et Markham, 2006). Toutes les étapes de la biosynthèse des flavonoïdes ne sont pas encore clairement élucidées (Macheix et al., 2005). Grâce à des réactions enzymatiques, un grand nombre de sous-classes de flavonoïdes deviennent des intermédiaires (Isorez, 2007). Le cycle A est formé à partir de trois molécules de malonyl-coenzyme A (malonyl-CoA). Les cycles B et C proviennent du métabolisme du glucose dont c’est le cas du cycle A, mais par la voie du shikimate via la phénylalanine qui est convertie en ρ-coumarate puis en ρ-coumaroyl- CoA (Ribereau-Gayon, 1968; Judd et al., 2002). Le ρ-coumaroyl CoA et les 3 malonyl CoA se condensent en une seule étape pour former une chalcone; la 4,2’,4’,6’-

Rappels bibliographiques tétrahydroxychalcone (Figure 12). Cette chalcone est métabolisée sous l'action de la chalcone isomérase en flavanone: naringénine. C'est sur cette dernière qu'agit ensuite la flavone synthase ou la (2S)-flavanone-3-hydroxylase pour former la flavone apigénine ou le dihydroflavonol: (2R, 3R)-dihydrokaempférol respectivement. Les deux enzymes citées fonctionnent différemment; la première introduit la double liaison entre les carbones C-2 et C- 3, tandis que la deuxième catalyse l’hydroxylation du carbone C-3. Le dihydroflavonol, en présence de la flavonol synthase ou la dihydroflavonol-4-réductase, se métabolise en flavonol: kaempférol ou en flavan-3,4-diol: leucoanthocyanidol, respectivement. Ce dernier semble être le précurseur des flavan-3-ols et anthocyanidols. Cependant, les étapes ultimes de leur formation ne sont pas encore élucidées. Le pélargonidol, sous l'action de la 3-O- glycosyltransférase, se transforme en anthocyanoside: pélargonidol-3-glucoside (Goodwin et Mercer, 1990; Hopkins, 2003; Macheix et al., 2005; Anderson et Markham, 2006).

Rappels bibliographiques

Hydrate de carbone

Phénylalanine 4-Coumaroyl -CoA Acétyl CoA

MalonylCoA

Chalcone synthétase Chalcone synthétase + réductase

4,2’,4’,6’-tétrahydroxychalcone 4,2’,4’-trihydroxychalcone

Flavanone 5-désoxyflavanone

ISOFLAVONE

FLAVONE

Dihydroflavonol

Dihydroflavonol réductase

Flavonol synthétase FLAVONOL 3,4 dihydroflavane 3-hydroxyflavane PROANTHOCYANIDINES CATECHOLS

ANTHOCYANES TANINS CONDENSES

Figure 12: Grandes lignes de la biosynthèse de quelques classes de flavonoïdes (Bruneton, 1999; Macheix et al., 2005)

Rappels bibliographiques

2.3.4 Tannins Les tannins sont des composés phénoliques polymériques, ayant une masse moléculaire comprise entre 500 et 3000 Dalton. Ils ont la capacité de se combiner et de précipiter la gélatine et d’autres protéines. Ces combinaisons varient d’une protéine à une autre selon les degrés d’affinités (Pereira et al., 2009; Cheynier et al., 2013). Cette propriété (parfois appelée l'astringence) est la raison pour leur usage dans le tannage des peaux d’animaux. Les tannins sont très abondants chez les angiospermes et les gymnospermes. Ils peuvent s'accumuler en grands nombres (souvent plus de 10% du poids sec) en particulier dans les organes ou tissus dans divers parties de la plante: écorce, bois, feuilles, fruits ou racines (Scalbert, 1991; Cowan, 1999; Raven et al., 2000). On distingue habituellement, chez les végétaux supérieurs, deux groupes de tannins qui diffèrent par leur structure aussi bien que par leur origine biogénétique; les tannins hydrolysables et les tannins condensés (Figure 13) (Bruneton, 2009; Cheynier et al., 2013). 2.3.4.1 Tannins hydrolysables Les tannins hydrolysables sont des oligo- ou des polyesters d’un sucre (généralement le glucose) et d’un nombre variable de molécules d’acides phénoliques qui sont soit l’acide gallique dans le cas des gallotannins soit l’acide hexahydroxydiphénique (HHDP) et ses dérivés d’oxydation dans le cas des tannins classiquement dénommés ellagitannins (Goodwin et Mercer, 1990; Scalbert, 1991; Bruneton, 2009; Dai et Mumper, 2010). Comme leur nom l’indique, ces composés peuvent être dégradés par hydrolyse chimique (alcaline ou acide) ou enzymatique en fragments simples (acides phénols et sucres) (Ribereau-Gayon, 1968; Macheix et al., 2005).

2.3.4.2 Tannins condensés Les tannins condensés s’appellent aussi tannins catéchiques. Ce sont des composés phénoliques hétérogènes: dimères, oligomères ou polymères flavaniques, constitués d’unité de flavan-3-ols liées entre elles par des liaisons C-C (Cowan, 1999; Bruneton, 2009). Ils sont résistants à l’hydrolyse et seules les attaques chimiques fortes permettent leurs dégradations. Ainsi, par traitement acide à chaud, ils se transforment en pigments rouges et pour cette raison, les formes dimères et oligomères sont dénommées «proanthocyanidines» (Macheix et al., 2005).

Figure 13: Exemple des tanins hydrolysables et tanins condensés (Cowan, 1999)

Rappels bibliographiques

Ils sont trouvés naturellement dans la graine de raisin, l'écorce de malt, le jus de pomme, les baies, l'écorce de pin, le chocolat, le sorgho, la fraise et le thé (Hopkins, 2003; Khoddami et al., 2013).

2.3.5 Lignines Le mot lignine est dérivé en latin de lignum signifiant "bois". Les lignines résultent de la polymérisation tridimensionnelle de trois molécules phénoliques de base dénommées monolignols qui sont les alcools p-coumarylique, coniférylique et sinapylique. Les alcools sont oxydés en radicaux libres par une enzyme ubiquiste chez les plantes; la peroxydase. Les radicaux libres réagissent ensuite spontanément et au hasard pour former la lignine (Figure 14) (Hopkins, 2003; Macheix et al., 2005; Nabors, 2008).

Acide p-coumarique Acide férulique Acide sinapique

Formation enzymatique des monolignols

Alcool p-coumarylique Alcool coniférylique Alcool sinapylique

Polymérisation des monolignols sous l'action des peroxydases et /ou des Laccases

LIGNINE

Figure 14: Principaux monomères constituant la lignine (Macheix et al., 2005) 26

Rappels bibliographiques

La lignine est un très grand polymère, insoluble dans l'eau et dans la plupart des solvants organiques, il est donc impossible de l'extraire sans lui faire subir d'importantes dégradations (Hopkins, 2003). A l'échelle du globe, la lignine représente une biomasse considérable (15 à 35% du bois) produite annuellement par les végétaux (la deuxième après la cellulose). En outre, la composition monomérique des lignines varie beaucoup suivant les espèces, les organes et les tissus (Raven et al., 2000). La lignine est localisée dans les parois cellulaires et plus spécialement dans les parois secondaires des éléments conducteurs, contribuant à la résistance mécanique et à la rigidité des tiges lignifiées (Marouf et Reynaud, 2007).

2.4 Rôles physiologiques et biologiques des composés phénoliques Le rôle des composés phénoliques est maintenant reconnu dans différents aspects de la vie de la plante. En effet, ces composés peuvent intervenir; - dans certains aspects de la physiologie de la plante (lignification, régulation de la croissance ... etc.); - dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique (relations avec les bactéries, les champignons, les insectes, résistance aux UV), soit directement dans la nature soit lors de la conservation après récolte de certains végétaux (Bahorun, 1997; Hutzler et al., 1998; Guignard, 2000; Harborne et Williams, 2000; Iserin, 2001; Judd et al., 2002; Hopkins, 2003; Macheix et al., 2005; Atmani et al., 2009).

2.5 Intérêts thérapeutiques des composés phénoliques La principale caractéristique des polyphénols est qu’ils sont des agents antioxydants très puissants. En effet, ils présentent la capacité d’inhiber les radicaux libres due à leur aptitude à céder des atomes d’hydrogènes ou à complexer les cations métalliques. Cette capacité est strictement dépendante de leur structure (Harborne et Williams, 2000; Gupta et al., 2010). Les propriétés antioxydantes des composés phénoliques montrent des effets bénéfiques contre beaucoup de maladies affectant l’organisme humain (Atmani et al., 2009; Khaki et al., 2009). Ces propriétés antioxydantes intéressent particulièrement deux domaines: l’hygiène alimentaire et la phytothérapie (Leong et Shui, 2002; Tapas et al., 2008). D’après les multiples études attestant de l’impact positif de la consommation de polyphénols sur la santé et la prévention des maladies, les industriels commercialisent maintenant des aliments enrichis en polyphénols ou des suppléments alimentaires (Balasundram et al., 2006). Dans l’industrie cosmétique, les composés phénoliques trouvent leur application pratique en luttant contre la production des radicaux libres néfastes pour la santé. En phytothérapie, même si certaines indications sont communes à plusieurs classes (les propriétés vasculoprotectrices, sont par exemple aussi bien attribuées aux flavonoïdes qu’aux anthocyanes, tanins et autres coumarines), chaque classe chimique semble être utilisée pour des bénéfices spécifiques (Hennebelle et al., 2004). En ce qui concerne les acides phénoliques, ces composés ont été étudiés pour leurs propriétés notamment contre les dommages oxydatifs conduisant à diverses maladies dégénératives (Saxena et al., 2012). Ces acides phénoliques influencent l'expression et l'activité des enzymes impliquées dans la production de médiateurs de l'inflammation des voies considérées comme étant importantes dans le développement de troubles du tube digestif, y compris le cancer du côlon (Russell et Duthie, 2011). Ils sont considérés comme responsables de l’activité cholérétique de l’artichaut (Cynara scolymus L.) et les propriétés antipyrétiques et anti-inflammatoires des dérivés salicylés (acides hydroxybenzoïques)

Rappels bibliographiques

(Hennebelle et al., 2004). L’acide caféique, l'un des acides cinnamiques les plus importants, est connu pour bloquer sélectivement la biosynthèse de leucotriènes qui sont impliqués dans les maladies immunitaires, de l'asthme et des réactions allergiques (Robbins, 2003). Il est également très efficace contre les virus, les bactéries et les champignons (Cowan, 1999). Les coumarines sont utilisées pour leurs propriétés vasculoprotectrice, neurosédative, diurétique, stomachique et carminative (Hennebelle et al., 2004), anti-œdémateuse (Paume, 2009), anti-inflammatoire, analgésique (Kalkhambkar et al., 2008), immunostimulante, tranquillisante et bénéfique en cas d’affection cutanée (Iserin, 2001). Elle peut aussi avoir des effets antiviraux et antimicrobiens. Les coumarines sont connues pour être toxiques, et sont donc traitées avec prudence par la communauté médicale (Cowan, 1999). De nos jours, les propriétés des flavonoïdes sont largement étudiées par les chercheurs dans le domaine médical, où on leur reconnaît des activités antivirale, antibactérienne, antifongique (Harborne et Williams, 2000; Taguri et al., 2004; Cushnie et Lamb, 2005), anti- inflammatoire (Kim et al., 2004), antiallergique, antihépatotoxique (Di Carlo et al., 1999), anticancéreuse (Depeint et al., 2002; Messai, 2011), antiradicalaire, antioxydantes et antidiabétiques (Meschino, 2006; Khaki et al., 2009; Akroum et al., 2009). Les flavonoïdes jouent un rôle important dans les activités immunitaires, l'expression génique, la circulation sanguine, la fonction hépatique, les activités enzymatiques, l'agrégation des plaquettes et le métabolisme du collagène, des phospholipides, du cholestérol et de l'histamine (Hertog et al., 1993; Narayana et al., 2001; Agrawal, 2011). L’utilité médicinale des tannins est leur pouvoir astringent qui permet de coaguler les albumines des muqueuses et des tissus en créant une couche isolante et protectrice pour réduire l’irritabilité, la douleur et arrêter les petits saignements. En usage externe, on l’emploie pour soigner les hémorroïdes, les engelures et les inflammations de la cavité buccale (Laffitte, 1999). Les tannins auraient des propriétés antioxydante, antimicrobienne, antidiarrhéique (Messai, 2011), vasculoprotectrice et cicatrisante (Hennebelle et al., 2004). Le potentiel anticancéreux et antimutagène de tanins peut être lié à leur propriété antioxydante (Ozcan et al., 2014). En usage interne à trop forte dose, ils deviennent dangereux (arrêt des sécrétions digestives, constipation opiniâtre, hémolyse, hématurie et lésions rénales) (Paume, 2009). Cependant, des études récentes indiquent que les tanins ont divers effets nuisibles, ils tendent à réduire la prise alimentaire, le taux de croissance, l'efficacité alimentaire, l’énergie métabolisable nette et la digestibilité des protéines chez les animaux de laboratoire (Chung et al., 1998). Par conséquent, les aliments riches en tannins tels que la noix d’arec et les tisanes sont considérés de faible valeur nutritive (Ozcan et al., 2014).

Matériels et méthodes

Matériel et méthodes

1. Présentation des zones d’études Biskra et Tamanrasset représentent deux situations géographiques particulières avec des conditions climatiques distinctes caractérisées par la présence de M. deserti De Noé.

Le choix des deux zones permet de réaliser une étude comparative par rapport au lieu de récolte et du climat qui pourraient différencier la composition chimique en composés phénoliques de notre plante (chémotype).

Figure 15: Position géographique des deux régions d’études Biskra et Tamanrasset (d- maps.com)

Matériels et méthodes

2. Données écologiques des zones de prélèvement

2.1. Wilaya de Biskra La wilaya de Biskra qui présente une superficie de 21671 Km², est située à l’Est de l'Algérie, aux portes du Sahara Algérien. Elle est limitée au Nord par les wilayas de Batna et M'Sila, au Sud par les wilayas de Ouargla et El-Oued, à l'Est par la wilaya de Khenchela et à l'Ouest par la wilaya de Djelfa (ANDI, 2013) (Figure 15). La température moyenne annuelle de la région de Biskra est de 24.4°C pour la période 2000- 2013. Le mois de janvier est le plus froid avec une température moyenne des minima de l’ordre de 11.1°C, tandis que, le mois de juillet est le plus chaud avec une température moyenne des maxima de l’ordre de 34.7°C. De 2000 à 2013, la précipitation annuelle enregistrée est de 123.6 mm à Biskra, dont les maximums des pluies sont enregistrés dans le mois d’octobre, alors que les mois de février, mai, juillet, septembre, et novembre n’ont enregistrée que de faibles quantités. Elle se situe à l’étage bioclimatique aride inférieur ou saharien à hiver chaud par rapport au climagramme d’Emberger.

Selon les données (ANAT, 2003), Biskra renferme des sols calci-magnésiques par leur richesse en carbonates de calcium, en magnésium ou en sulfate de calcium et avec une structure bien développée. L’essentiel du paysage végétal du territoire est constitué par des formations steppiques naturelles et des oasis.

2.2 Wilaya de Tamanrasset La wilaya de Tamanrasset qui présente une superficie de 558 310 km2, est située au Sahara Algérien entre le 5°53’ Est de longitude et 22°79’ Nord de latitude, à 2000 km de la capitale de Alger, à une altitude de 1450 m. Elle est limitée au Nord par les wilayas de Ghardaïa et Ouargla, à l’Est par la wilaya d’Illizi, à l’Ouest par la wilaya de Adrar et au Sud par les républiques du Niger et du Mali (ANIRF, 2011; ANDI, 2013; Ramdane et al., 2015) (Figure 15). La wilaya de Tamanrasset est subdivisée en deux régions géographiques, le Tademaït-Tidikelt et l'Ahaggar à climat «tropical peu méditerranéen», les températures maximales moyennes ont leurs plus fortes valeurs de juin à août, avec un maximum en juillet (30°C), tandis que les plus faibles valeurs se produisent en janvier et en décembre, avec 13°C et 14.7°C respectivement, la précipitation annuelle est de 50 mm dont les maximums des pluies sont enregistrés dans le mois d’aout et d’octobre, alors que les autres mois ne reçoivent que de faibles quantités.

Tamanrasset se situe dans l’étage bioclimatique saharien à hiver chauds avec des sols minéraux bruts d’érosion ou d’ablation sur roche dure, formés sur des marnes et les argiles salées et /ou gypseuses, à horizons de surfaces compactes ou pulvérulents. La végétation est très hétérogène (végétation des basses et moyennes altitudes, des moyennes et des hautes montagnes.

Matériels et méthodes

3. Matériels

3.1 Matériel végétal Le prélèvement du Marrubium deserti De Noé a été effectué dans la station d’Ain Zaatout située au nord de la ville de Biskra et à la station d’Afilal située au nord de la ville de Tamanrasset (Figure 16).

Des plantes entières au stade adulte (tiges, feuilles et fleurs) ont été récoltées en période de floraison (Avril 2012 à Ain Zaatout- mars 2013 à Afilal) à raison de 30 individus.

L'espèce végétale a été identifiée en se basant sur la flore de Quezel et Santa (1963) et selon la validation de l'institut national de recherche forestière (INRF) de Tamanrasset. Le matériel végétal est ensuite séché à l’ombre, à l’abri de l’humidité et à une température ambiante, puis conservé dans des sacs en papier. Au laboratoire, les parties aériennes des plantes récoltées ont été coupées en petits morceaux, puis broyées en poudre très fine à l’aide d’un moulin électrique.

Station Ain Zaatout, Biskra

Station Afilal, Tamanrasset

Figure 16: Vue externe des zones de récolte de M. deserti De Noé

Matériels et méthodes

3.2 Matériel animal Les animaux (414 souris et 78 rats) utilisés au cours de nos expériences sont des rats (Rattus norvegicus) de variété Wistar (160-250g) et des souris albinos (Mus musculus) (20±5g). Ces animaux comportent les deux sexes, ont été fournis par l'Institut Pasteur d'Algérie (Centre d’élevage, Kouba, Alger). Ils ont été acclimatés aux conditions de l’animalerie du centre de recherche et développement (CRD, Saidal) pendant une semaine avant d’être soumis aux différentes procédures expérimentales. Pendant cette période, les animaux ont eu un accès libre à l’eau et à la nourriture (croquettes fourni par l’Office National de l’Aliment de Bétail (ONAB), Bejaia). Ils ont été gardés et maintenus à température constante (24±2 °C) et soumis à un cycle de lumière/ obscurité de 12 h/ 12. 4. Méthodes d’études 4.1 Etude ethnobotanique Celle-ci a été réalisée dans la wilaya de Biskra par une enquête effectuée en 2013 et 2014 afin de connaître les différentes utilisations médicinales traditionnelles de Marrubium deserti De Noé par la population sur place. Au cours du sondage, nous avons réalisé cette étude dans cinq strates (communes) déterminées au cours différents prélèvements selon la technique d’échantillonnage «stratifié probabiliste» de Kahouadji (1986) (Figure 17).

Figure 17: Localisation géographique des communes (strates) de l’enquête ethnobotanique réalisée dans la wilaya de Biskra

Matériels et méthodes

Un échantillonnage aléatoire simple de 27 personnes pour chacune de ces cinq strates a été enquêté à l'aide des fiches questionnaires à raison de 135 personnes interviewées au total (Annexe 1). L’ensemble des données relatives aux informateurs (âge, sexe et résidence) et à la plante (partie utilisée, son mode de préparation, la période de sa cueillette) ainsi que le type de maladies traitées, fréquence d'utilisation, les voies d'administration ont été rassemblées et traitées à l’EXCEL 2007.

4.2 Etude phytochimique de M. deserti De Noé

Cette étude phytochimique a été initiée par un screening chimique pour la détermination des différentes classes chimiques, suivi par une extraction sélective des familles prépondérantes notamment les composés phénoliques, avec une caractérisation quantitative (contenu en polyphénols et des différentes fractions de composes phénoliques) et une caractérisation qualitative (par CCM, CP et CLHP).

4.2.1 Tests phytochimiques préliminaires (screening chimique)

Dans le but de rechercher les différentes classes des substances secondaires présentées dans les parties aériennes de M. deserti De Noé, nous avons effectué un screening phytochimique par la mise en place d’un ensemble de réactions de caractérisation de différents composés chimiques à savoir: les flavonoïdes, les tanins, les alcaloïdes, les anthocyanes, les leuco-anthocyanes, les terpènoïdes, les lipoïdes, les caroténoïdes, les quinones, les saponosides et les coumarines.

4.2.1.1 Réactions de caractérisation

Afin d’avoir une idée sur la composition chimique de la poudre de M. deserti De Noé et de son infusé, nous avons eu recours aux techniques décrites par Harborne (1998), Bruneton (1999), Sawadogo et al. (2006) et Siddiqui et al. (2009).

L'infusé à 5% a été préparé selon la méthode traditionnelle; où la poudre est mise dans de l’eau physiologique (NaCl, 0.9%) bouillante et laissée refroidir pendant 15 min à une température ambiante.

4.2.1.1.1 Recherche des flavonoïdes

En présence de flavonoïdes, on note l’apparition d’une coloration rouge orangé après l’ajout de 5 ml d'acide chlorhydrique (HCl), 1 ml d’alcool isoamylique et un copeau de magnésium (Mg) à 5 ml de l’infusé de M. deserti De Noé (Siddiqui et al., 2009).

4.2.1.1.2 Recherche des tannins

Deux méthodes sont utilisées pour la détection de la présence de tanins galliques et catéchiques (Harborne, 1998). Après l’ajout de 1 ml d'une solution de 1% de chlorure ferrique (FeCl3) en goutte à goutte à 5 ml de notre infusé, on note l'apparition d'une coloration bleu noirâtre ce qui indique la présence des tanins galliques. L’apparition d’une coloration rouge après l’ajout de 7 ml du réactif de Stiasny (30% formol + HCl concentré, 3/1; v/v) à 15 ml de notre infusé indique la présence des tanins catéchiques.

Matériels et méthodes

4.2.1.1.3 Recherche des alcaloïdes

Une quantité de 5 g de poudre humectés avec l’ammoniaque (NH4OH) (1/2; v/v) sont macérés dans 50 ml d’un mélange d’éther diéthylique et de chloroforme (1/3; v/v) pendant 24 h. Après filtration, la solution obtenue est épuisé par l’HCl à 2 N, puis quelques gouttes du réactif de Mayer sont ajoutées. L’apparition d’un précipité blanc indique la présence des alcaloïdes (Siddiqui et al. 2009).

4.2.1.1.4 Recherche des anthocyanes Le virage de la couleur vers le rouge après ajout de quelques gouttes d’HCl à 5 ml de l’infusé indiquent la présence d’anthocyanes (Bruneton, 1999). 4.2.1.1.5 Recherche des leuco-anthocyanes La présence des leuco-anthocyanes est révélée par l'apparition d'une couleur rouge après chauffage au bain marie de 2 g de poudre macérées dans 20 ml d’un mélange de propanol/ HCl (v/v) pendant quelques minutes (Bruneton, 1999). 4.2.1.1.6 Recherche des terpènoïdes L’observation d’une coloration brune rougeâtre sur l’interface du filtrat (1 ml récupérée après filtration de 2 g de poudre macérée dans 10 ml de méthanol) et 1 ml d’H2SO4 + 0.5 ml d’acide anhydride indique l’existence des terpènoides (Harborne, 1998). 4.2.1.1.7 Recherche des lipoïdes Le filtrat récupéré après macération de 2 g de poudre dans 15 ml d’éther de pétrole pendant 30 min est évaporé sur une plaque chauffante jusqu’à l’obtention d’un résidu huileux. L’apparition d’une coloration verte ou violète après l’ajout de quelques gouttes d’H2SO4 indique la présence de lipoïdes (Bruneton, 1999).

4.2.1.1.8 Recherche des caroténoïdes La réaction qui se développe en présence de caroténoïdes après l’addition de 3 ml d’HCl et 3 ml d’H2SO4 à 5 ml de l’infusé donne une coloration verte devenant bleue par la suite (Bruneton, 1999). 4.2.1.1.9 Recherche des quinones combinées

Après filtration de 2 g de poudre additionné de 15 ml d’H2SO4 (2 N) et portée à reflux pendant 2h, la solution obtenue est épuisée par 20 ml de chloroforme. Cette solution chloroformique est évaporée à sec, puis épuisée par la NH4OH (1/2; v/v). L’apparition d’une coloration rouge indique la présence des quinones combinées (Bruneton, 1999). 4.2.1.1.10 Recherche des saponosides La présence des saponosides est détectée par la formation d’un précipité blanc après l’ajout de quelques gouttes d’acétate de plomb (Pb(C2H3O2)2) à 2 ml d’infusé (Bruneton, 1999). 4.2.1.1.11 Recherche des coumarines Après ébullition et filtration de 2 g de poudre dans 20 ml d’éthanol, à 5 ml du filtrat on ajoute 10 gouttes d’une solution alcoolique de KOH à 10% et quelques gouttes d’HCl à 10%. La formation d’un trouble indique la présence des coumarines (Bruneton, 1999).

Matériels et méthodes

4.2.2 Méthodes d’extraction des composés phénoliques Après sa récolte et son nettoyage, le matériel végétal est séché puis grossièrement fragmenté à l’aide d’un sécateur. Les fragments ainsi obtenus sont finement broyés et homogénéisés à l’aide d’un broyeur (Moulinex). La poudre, une fois récupérée, fait l’objet d’une extraction afin de récupérer et d’isoler les composés bioactifs en utilisant des solvants sélectifs (Stalikas, 2007; Handa et al., 2008). L’objectif de l’extraction est de libérer les composés phénoliques présents dans des structures vacuolaires par rupture du tissu végétal (Stalikas, 2007). La solubilité des composés phénoliques dépend de leur nature chimique dans la plante, ainsi que la polarité des solvants utilisés. Par conséquent, il n'y a pas de procédure d'extraction universelle appropriée pour l'extraction de tous les composés phénoliques des plantes (Dai et Mumper, 2010). Afin de pouvoir isoler les composés phénoliques dans notre plante, nous avons utilisé trois méthodes d’extractions, afin d’extraire les aglycones flavoniques, les aglycones libres et les hétérosides flavoniques.

4.2.2.1 Extraction des aglycones flavoniques La technique utilisée a été mise au point par Lebreton et al. en 1967, à partir du schéma initial de Bate-Smith et al. (1954), modifiée par Ouafi en 2007 (Figure 18). Les principales étapes du protocole consistent: - Une hydrolyse acide à chaud qui permet la transformation des pro-anthocyanes en anthocyanes et la libération des aglycones de flavonoïdes de leurs formes O-glucosides. 1 g de poudre végétale a été ajouté à 80 ml de HCl (2N à froid), puis portés au bain marie bouillant pendant 40 min avec insufflation d'air et une agitation régulière toutes les 10 min. Après refroidissement et filtration, la solution acide est transférée dans une ampoule à décanter.

- L’extraction se réalise comme suit:

Une première fraction est récupérée après extraction des aglycones flavoniques (flavones- flavonols) et des acides phénoliques présents dans l’hydrolysat acide. Les extraits obtenus après l’ajout de 25 ml et 50 ml d’éther diéthylique respectivement sont réunis et évaporés sous hotte ventilée. Le reste subit une deuxième extraction par 50 ml de n-butanol qui entraîne les anthocyanes colorés en rouge et les C-glycosides, à la fin, l’extrait est évaporé à sec sous hotte ventilée. Les résidus secs résultant de l’extraction par l’éther diéthylique (ExEth) et le n-butanol (ExButOH) sont récupérés chacun dans 5 ml de méthanol pur qui conserve les composés actifs. Ces extraits sont mis au frais dans l’attente d’une étude ultérieure.

Matériels et méthodes

Hydrolyse acide de 1g de poudre dans 80 ml d’HCl (2N) au bain marie à 40 °C pendant 40 min

Refroidissement et filtration

Deux extractions à l’éther diéthylique 25 ml et 50ml dans une ampoule à décanter

Hypophase acide (C-glycosides et anthocyanes) Epiphase éthérée (flavone- flavonols et acides phénoliques)

Extraction avec 50 ml de n- Butanol, récupération Evaporation à sec et récupération du résidu sec du résidu sec dans 5ml de méthanol pur dans 5 ml de méthanol pur

ExButOH ExEth

Analyse

Qualitative Quantitative

CP CLHP CCM Dosage spectrophotométrique d’ExEth à 430 nm et d’ExButOH à 520 nm et 340 nm

Figure 18: Protocole expérimental d’extraction, de dosage et d’identification des aglycones flavoniques, des anthocyanes et C-glycosides de M. deserti De Noé selon Lebreton et al. (1967) modifié par Ouafi (2007) ExEth: extrait éthérée, ExButOH: extrait n-Butanolique, CLHP: chromatographie liquide à haute performance, CCM: chromatographie sur couche mince, CP: chromatographie sur papier

Matériels et méthodes

4.2.2.2 Extraction des aglycones libres La méthode d’extraction utilisée dans notre étude a été mise au point par Ouafi (2007). L’extraction des aglycones libres consiste en une macération de 1 g de poudre végétale dans 30 ml d’éther diéthylique pendant 30 min. Après filtration, la phase éthérée contenant les aglycones libres est récupérée et évaporée à sec (Figure 19). Le résidu sec de l’extrait contenant les aglycones libres (ExAgL) est repris avec 5 ml de méthanol puis conservé au frais pour une analyse ultérieure.

4.2.2.3 Extraction des hétérosides flavoniques Cette méthode a été mise au point par Harborne en 1973. L’extraction des hétérosides flavoniques consiste en une macération à froid de 1 g de poudre dans 100 ml d’une solution hydroalcoolique (70 : 30; éthanol/ eau). Cette macération qui dure 48h est suivie d’une évaporation à sec à l’aide d’un rotavapor (Heidolph, Allemagne). Le résidu est récupéré dans 100 ml d’eau distillée bouillante. Après refroidissement de la solution aqueuse, on lui ajoute 50 ml de n-butanol afin d’extraire les hétérosides flavoniques (O-glycosides et C-glycosides) contenus dans la poudre. Le résidu sec de l’extrait hydroalcoolique (ExHét) contenant les hétérosides flavoniques est récupéré dans 5 ml de méthanol (Figure 20).

Matériels et méthodes

1g de poudre végétale dans 30 ml d’éther diéthylique

Macération pendant 30 min

Filtration

Phase éthérée (aglycones libres)

Evaporation à sec et récupération dans 5 ml de méthanol pur

ExAgL

Analyses

Qualitative Quantitative

CLHP Dosage spéctrophotométrique d’ExAgL à 430 nm à 430 nm

Figure 19: Protocole expérimental d’extraction, de dosage et d’identification des aglycones libres de M. deserti De Noé (Ouafi, 2007) ExAgL: extrait aglycones libres, CLHP: chromatographie liquide à haute performance

Matériels et méthodes

Macération de 1 g de matériel végétal dans une solution hydrooalcolique (70:30)

pendant 48 h

Evaporation à sec dans un rotavapor

Récupération dans 100 ml d’eau distillée bouillante

Refroidissement

Extraction par 50 ml de n-butanol

Hypophase à éliminer Epiphase butanolique (C-glycosides et O-glycosides)

Evaporation à sec et récupération dans 5 ml de méthanol pur

ExHét

Analyses

Qualitative Quantitative

CLHP Dosage spéctrophotométrique d’ExHét à 430 nm

Figure 20: Protocole expérimental d’extraction, de dosage et d’identification des hétérosides flavoniques de M. deserti De Noé (Harborne, 1973) ExHét: extrait hétérosides flavoniques, CLHP: chromatographie liquide à haute performance

Matériels et méthodes

4.2.2.4 Calcul du rendement des extractions Le rendement en extrait sec est le rapport entre le poids de l'extrait sec et le poids du matériel végétal utilisé pour l’extraction en gramme (Carré, 1953). Nous avons utilisé l’équation suivante pour déterminer les rendements de l’infusé et les trois fractions des différents composés phénoliques:

Rdt: Rendement exprimé en %. M: Masse en g de l’extrait sec résultant. M0 : Masse en g du matériel végétal initial sec (1g). 4.2.3 Analyses quantitatives et qualitatives des polyphénols de M. deserti De Noé 4.2.3.1 Analyses quantitatives La spectrophotométrie est l'une des techniques les plus fréquemment employées dans des analyses pharmaceutiques. C’est une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l’absorbance ou la densité optique (DO) d’un composé chimique donné en solution. La lecture en lumière UV-visible des extraits polyphénoliques est tout d’abord une méthode globale fiable et rapide (Jay-Allemand et al., 1987).

4.2.3.1.1 Dosage des polyphénols totaux

Le dosage des polyphénols totaux par la méthode du Folin-Ciocalteu décrite par Singleton et Rossi en 1965. Depuis, son utilisation s'est largement répandue pour caractériser les extraits végétaux. Le réactif de Folin Ciocalteu est un acide de couleur jaune constitué par un mélange d'acide phosphotungstique (H3PW12O40) et d'acide phosphomolybdique (H3PMo12O40). Il est réduit lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène (Ribéreau-Gayon, 1968). L’intensité de la couleur est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux (Boizot et Charpentier, 2006).

De chaque extrait; infusé, ExEth, ExButOH, ExAgL et ExHét (chacun 3 répétitions), 200 μl ont été mélangés avec 1 ml de réactif de Folin Ciocalteu dilué 10 fois dans l’eau distillée. Après 5 min, 800 μl de carbonate de sodium (Na2CO3) à 7.5% sont ajoutés. Les polyphénols totaux sont déterminés après 30 min d'incubation du mélange réactionnel à température ambiante par mesure de l'absorbance à 765 nm (Spectrophotometre UV/visible, cecil, CE2021, 2000 séries). Une courbe d'étalonnage standard de l’acide gallique a été utilisée afin de quantifier les polyphénols totaux. Les résultats sont exprimés en mg d’équivalent acide gallique par g de la matière sèche.

4.2.3.1.2 Dosage des différentes fractions des composés phénoliques

Nous avons dosé pour 30 individus de M. deserti De Noé de chaque région (Biskra et Tamanrasset), cinq fractions de composés phénoliques (flavones-flavonols, aglycones libres, anthocyanes, C-glycosides et hétérosides flavoniques).

Matériels et méthodes

4.2.3.1.2.1 Dosage des aglycones flavoniques (flavones-flavonols) et des aglycones libres

Les dosages des flavones- flavonols et des aglycones libres sont effectués en se basant sur les propriétés chélatantes de chlorure d’aluminium AlCl3, qui forme un complexe jaune avec les flavonoïdes (Lauranson, 1999). A 1 ml de l’ExEth (contenant les flavones-flavonols) ou l’ExAgL (contenant les aglycones libres) sont ajoutés 4 ml d’AlCl3 à 1% (m/ v) en solution dans le méthanol. Après un repos de 10 min, l’absorbance est lue à 430 nm. L’absorbance du pic différentiel contre un blanc ne contenant pas d’AlCl3 est proportionnelle à la concentration de l’échantillon en aglycones (Jay et al., 1975). La teneur en aglycones exprimée en équivalent de quercétine (en mg/g) est calculée selon la formule suivante;

Taglycones: teneur en aglycones (en % ou en mg/g). ΔDO: densité optique du pic différentiel

(DO AlCl3 - DO méthanol) à 430 nm. -2 Taglycones =1,3. 10 ΔDO. V. d / p V: volume de la solution méthanolique d’aglycones (5 ml).

d: facteur de dilution. p: poids sec du matériel végétal (1 g).

4.2.3.1.2.2 Dosage des anthocyanes En raison de l’instabilité chimique des anthocyanes surtout à la lumière, ils doivent être traités rapidement. La lecture des anthocyanes se fait en utilisant la spectrophotométrie UV-visible à 520 nm. A 1 ml de l’ExButOH (contenant les anthocyanes et le C-glycosides) sont ajoutés 4 ml de méthanol (Lebreton et al. 1967; Porter, 2001). La teneur en pro- anthocyanes totaux exprimée en mg/g d’équivalent de procyanidine est calculée grâce à la formule suivante;

Tanthocyanes: teneur en anthocyanes (en % ou en mg/g). DO: densité optique à 520 nm -2 V: volume de la solution méthanolique Tanthocyanes = 5,2. 10 DO.V. (d / p) l’ExButOH (5 ml). d: facteur de dilution. p: poids sec du matériel végétal (1 g).

4.2.3.1.2.3 Dosage des C-glycosides

La lecture des C-glycosides se fait en utilisant la spectrophotométrie UV-visible à 340 nm. A 1 ml de l’ExButOH sont ajoutés 4 ml de méthanol. La teneur absolue en C-glycosides est exprimée en mg/g d’équivalent d’orientine est calculée par la formule suivante (Ouabonzi, 1981): TC-glycosides: teneur en C-glucosides (en % ou en mg/g). -2 DO: densité optique à 340 nm. TC-glycosides = 2,5. 10 DO.V. d / p V: volume de la solution méthanolique l’ExButOH (5 ml). d: facteur de dilution.

p: poids sec du matériel végétal (1 g).

Matériels et méthodes

4.2.3.1.2.4 Dosage des hétérosides flavoniques Comme pour les flavones-flavonols, le dosage différentiel des hétérosides flavoniques fait intervenir les propriétés chélatantes de solution méthanolique d’AlCl3 à 1%. Parallèlement, une courbe étalon est établie à partir d’une gamme de concentrations d’une solution mère de rutine dans le méthanol à 8 ‰. La teneur absolue en hétérosides flavoniques est exprimée en mg de rutine/ g de matière végétale sèche (Ouafi, 2007; Barris et al., 2015).

4.2.3.1.3 Analyse statistique des données Les teneurs absolues déterminées par le dosage spectrophotomètrique sont traitées pour une évaluation de la diversité intra-spécifique de M. deserti De Noé de la région de Biskra et Tamanrasset. La mise en œuvre de ce traitement s'est faite à partir du logiciel STATISTICA Software 6.0. Les analyses de données ont été effectuées en utilisant des Classifications Ascendantes Hiérarchiques (CAH) et par des Analyses en Composantes Principales (ACP). Ceci nous permettra d’avoir une idée sur la distribution des individus d’après leur composition polyphénolique et d’apprécier la diversité chimique au sein de la région. 4.2.3.2 Analyse qualitative La chromatographie est une méthode physique de séparation de mélanges en leurs constituants; elle est basée sur les différences d’affinité des substances à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile. Cette technique est donc la conséquence d'un processus complexe d'interactions favorables ou défavorables entre le produit et les deux phases (Kamoun, 1997). Afin de séparer et identifier les composés phénoliques présents dans notre plante, nous avons utilisé trois techniques: chromatographie sur papier (CP), chromatographie sur couche mince (CCM) et chromatographie liquide à haute performance (CLHP). 4.2.3.2.1 Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique rapide, simple et peu coûteuse dont le principe est basé sur le phénomène d'adsorption (Braithwaite et Smith, 1999); la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon est déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.

Pour caractériser les deux extraits ExEth et ExButOH des parties aériennes de M. deserti De Noé, des CCM monodimensionnelle et bidimensionnelle ont été utilisées respectivement.

4.2.3.2.1.1 CCM monodimensionnelle Pour l’analyse l’ExEth contenant les aglycones flavoniques (flavones- flavonols), nous avons utilisé la CCM monodimensionnelle, qui est développée dans une seule direction.

Des plaques pour CCM à base de polyamide DC11 monté sur une plaque d’aluminium du commerce ont été utilisées. Les témoins ou standards (quercétine et lutéoline) et l’ExEth concentrés sont déposés (10μl). La chromatographie est développée dans une cuve de

Matériels et méthodes migration préalablement saturée par une phase mobile constituée de: benzène/ méthanol/ méthyl éthyl cétone (40/30/30: v/v/v). Cette migration dure 30 min en moyenne puis la plaque est séchée sous hotte ventilée.

4.2.3.2.1.2 CCM bidimensionnelle La CCM bidimensionnelle est utilisée pour la séparation et l’identification des C- glycosides contenus dans l’ExButOH. La plaque subit deux migrations successives: - une première migration dite de dimension organique dans le solvant suivant: benzène/ méthanol/ méthyl éthyl cétone (40/30/30 : v/v/v), qui se fait selon le poids moléculaire de l’aglycone hétérosidique. - une deuxième migration dite de dimension aqueuse dans un solvant composé: méthyl éthyl cétone/ eau/ acétylacétone/ méthanol/ n-butanol (10/45/15/5/quelques gouttes; v/v/v/v). Dans cette 2ème migration, c’est le nombre de sucre (oses) qui détermine la vitesse de migration.

Après séchage des plaques, la révélation du chromatogramme CCM repose sur leur fluorescence (couleur) sous lumière ultraviolette (UV) à 365 nm et leur rapport frontal (ou facteur de rétention, Rf). Le Rf est la distance parcourue par le composé (d) sur la distance parcourue par le front du solvant (D). Ce rapport demeure plus ou moins constant dans les mêmes conditions expérimentales (Plummer, 1989).

Les rapports frontaux sont calculés et comparés à ceux des témoins permettant ainsi l’identification des constituants d’extrait dans les mêmes conditions chromatographiques.

4.2.3.2.2 Chromatographie sur papier

La chromatographie sur papier (CP), Elle s’agit de la méthode chromatographique la plus ancienne, elle est employée principalement pour analyser les composés très polaires (Khoddami et al., 2013). Leur principe repose sur des phénomènes de partage. Elle permet la mise en évidence des anthocyanes à partir d’un ExButOH obtenu par hydrolyse acide du matériel végétal (Ribereau-Gayon, 1968). Le dépôt de 10µl de l’ExButOH sur papier Whatman N°1 aux dimensions 59 × 46 cm, permet leur séparation par migration descendante qui dure 16h dans une cuve à atmosphère saturé en solvant Forestal composé par: l’acide acétique, l’eau distillée et l’HCl concentré (30/10/3 : v/v/v) (Martin-Tanguy et al., 1976). Après séchage de la feuille, la détermination de la couleur des tâches examinée en lumière visible et du Rf permet d’identifier les anthocyanes.

4.2.3.2.3 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

La CLHP est sans doute la technique d’analyse et de caractérisation des extraits polyphénoliques la plus utilisée (Gomez-Caravaca et al., 2006), car elle présente une haute résolution, une reproductibilité élevée, et une durée d'analyse relativement courte (Wollgast et Anklam, 2000). Cette méthode permet la séparation et le dosage de quantités infimes de composés phénoliques. Cette capacité est directement liée à la faible dimension de la colonne et à la fine granulométrie de la phase stationnaire (Hostettman et al., 1998).

Matériels et méthodes

Les séparations sont basées sur les polarités respectives des phases stationnaires utilisées, du solvant d’élution et des composés phénoliques concernés, effectuées soit sur phase normale (la phase stationnaire est polaire), soit sur phase inverse (la phase stationnaire est apolaire) (Naczk et Shahidi, 2006). L’échantillon à analyser est déposé au sommet de la colonne et la phase mobile sous pression fait migrer les différents constituants de l’échantillon et ceci d’autant plus rapidement que leur affinité suivant un gradient de solvant. Les composés phénoliques sont détectés en utilisant des détecteurs UV- visible, UV à barrette de diode (DAD) et de fluorescences UV (Schoefs, 2004). Les extraits obtenus sont analysés à l’aide d’un appareil de CLHP (Agilent 1100) couplé à un détecteur UV à barrettes de diodes (DAD), avec une colonne Hypersil BDS- C18 (5 µm, 250 x 4.6 mm). La température à été maintenue à 30 °C et le volume d'injecteur choisi était 20μl. La phase mobile est constituée de deux solvants: acide acétique (HAc) à 0.2% (A) et l'acétonitrile (ACN) (B), le débit est fixé à 1.5 ml/min. Les conditions chromatographiques consistent en un gradient linéaire HAc 0.2%/ ACN pendant 30 min, en commençant par 95% de (A) et en terminant par 100% du (B). Aucune longueur d’onde ne peut à elle seule permettre la détection de toutes les différentes classes des composés phénoliques puisqu’elles présentent des maxima d’absorption à différentes longueurs d’ondes. En conséquence, le détecteur UV à DAD est réglé sur les signaux entre 250 nm et 520 nm.

L'injection des témoins disponibles a été réalisée dans les mêmes conditions que les extraits. L’identification de chaque composé est établie en comparant les temps de rétention des pics dans l’échantillon avec ceux obtenus par l’injection des témoins (standards).

Matériels et méthodes

4.3 Etude des activités biologiques de M. deserti De Noé

4.3.1 Tests toxicologiques Pour qu’une drogue végétale possédant des effets pharmacologiques puisse éventuellement être utilisée comme médicament, il est d’abord nécessaire que l’activité apparaisse à des doses pour lesquelles la toxicité est négligeable (Rosidah et al., 2009). Donc, les tests de toxicité accompagnent les essais d’activités biologiques au cours de la sélection de nouvelles molécules car dans certains cas l’absorption d'une substance a pour effet de perturber le métabolisme des êtres vivants, provoquant des troubles physiologiques et pouvant aller jusqu’à la mort des individus exposés (Viala et Botta, 2007). D’autre part, l’indice thérapeutique de la substance doit être déterminé pour spécifier la dose maximum pouvant être administré sans produire d’effets toxiques (Ogbonnia et al., 2008; Sofowora, 2010). Ces tests de toxicité sont effectués sur des animaux de laboratoire (rats ou souris) (Kola et Landis, 2004). La pharmacopée traditionnelle Algérienne regorge d'une multitude de recettes à base de plantes pour prévenir, guérir, soulager ou améliorer le bien-être de l'homme. L'augmentation du nombre d'utilisateurs qui s'oppose à la rareté des preuves scientifiques sur l'innocuité des plantes médicinales soulève des préoccupations au sujet de la toxicité et des effets néfastes de ces remèdes (Saad et al., 2006). Dans ce contexte, l’objectif de ce travail est d’étudier la toxicité aiguë de l’infusé et des trois extraits phénoliques et aussi la toxicité subaiguë de l’infusé des parties aériennes de M. deserti De Noé chez les souris et les rats.

4.3.1.1 Etude de la toxicité aiguë de l’infusé et des extraits phénoliques de M. deserti De Noé chez les souris L’étude de la toxicité aiguë est une analyse qualitative et quantitative de l’altération irréversible des fonctions vitales après administration unique d’une substance dans un délai de quelques minutes à quelques jours (2 semaines) (Ruckebusch, 1981). C’est le premier test qu’un toxicologiste effectue sur un nouveau composé destiné à être utilisé comme médicament (Déciga-Campos et al., 2007). Le but de ce test est de permettre de déterminer et d’apprécier les niveaux de dose qui peuvent engendrer la mort de l’animal de laboratoire, de connaître les symptômes de l’intoxication aiguë ainsi que les circonstances de la mort.

La toxicité est évaluée en déterminant la dose létale 50 (DL50) c’est-à-dire, la dose unique qui provoque la mort de 50% des animaux traités. Les animaux de chaque lot reçoivent la même dose du produit. L’observation des effets toxiques du produit sur les animaux ainsi que le nombre de mortalité, se fait tous les jours qui suivent l’administration des produits.

4.3.1.1.1 Protocole expérimental Pour étudier la toxicité aiguë, le protocole expérimental utilisé est celui décrit dans la ligne directrice code 423 (OCDE, 2001), avec de légères modifications. Les animaux ont été maintenus à jeun 18 h avant le début de l’expérimentation. Les souris ont été reparties au hasard en 15 lots de 10 souris (5 mâles et 5 femelles). Elles sont pesées et marquées juste avant l’administration. Un lot est utilisé comme témoin et les autres lots sont traités chacun, pour une fois, par différentes doses de l'infusé et des extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé par la voie orale à l’aide d’une sonde gastrique. La concentration est fonction du poids des souris, du volume à injecter et de la dose (Djyh et al., 2010). L'infusé a été administrée avec des doses croissantes de 300, 2000, 5000, 8000 et 11000 mg/ kg de poids

Matériels et méthodes corporel (p.c.), tandis que l’ExEth (contenant les flavones- flavonols et les acides phénols), l’ExButOH (contenant les C-glycosides et les anthocyanes) et l’ExHét (contenant les hétérosides flvoniques), solubilisés dans une solution physiologique (NaCl, 0.9%), ont été administrés chacun aux doses de 50, 100 et 500 mg/kg de p.c. Le lot témoin a reçu uniquement de l’eau physiologique par la même voie. Les doses croissantes sont administrées sous un volume de 0.5 ml pour 20 g de p.c. des souris. Après l’administration de ces produits, les souris ont été d’abord mis en observation en permanence pendant 4 h avant de leur donner à manger et à boire, avec prise de notes sur les signes de toxicité apparents et sur les cas de morts immédiates. Pour le reste de la période de l'expérience, les souris sont surveillées quotidiennement pour signaler s’il y a eu des morts ou des changements dans l'alimentation et la consommation d'eau ou encore des signes comportementaux ou cliniques supplémentaires de toxicité tel que; hyperactivité, ataxie, tremblements, convulsions, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. La période d'observation était de 14 jours pour permettre d’enregistrer les effets tardifs y compris la mortalité totale finale (Sim et al., 2010).

4.3.1.2 Etude de la toxicité subaiguë de l’infusé de M. deserti De Noé chez les rats La toxicité subaiguë (ou subchronique) peut se définir comme la toxicité provoquée chez des animaux expérimentaux par une exposition répétée du produit étudié durant une période choisie. Ces études de toxicité subaiguë permettent de reconnaitre les principaux sites et éventuellement les mécanismes d'action du toxique ainsi que de déterminer la dose ne produisant pas d'effets toxiques (Diezi, 1989). 4.3.1.2.1 Protocole expérimental La toxicité subaiguë a été déterminée selon le protocole expérimental décrit par Hussain et al. (2012). Cette étude a été réalisée par gavage sur des rats, qui ont été répartis au hasard dans des cages en 4 lots de 6 dont 3 mâles et 3 femelles par lot. L'utilisation des deux sexes est importante pour rendre compte de l'influence éventuelle des hormones sexuelles sur la réponse. Le lot 1 correspondant au lot témoin, a reçu de l’eau physiologique, tandis que les 3 autres lots ont reçu respectivement par voie orale 250, 500 et 1000 mg/ kg de p.c. l’infusé de M. deserti De Noé pendant 28 jours. Le volume de solution administré quotidiennement en une seule prise a été de 1 ml/ 100 g de p.c. Les rats reçoivent quotidiennement de l'eau du robinet ad libitum et la nourriture pendant toute la période de l'essai. Ils ont été pesés et observés quotidiennement pour noter tous les changements physiologiques et/ou comportementaux. A la fin du traitement, tous les animaux sont mis à jeun. Le lendemain, après leurs sacrifices sous anesthésie par l'éther diéthylique, les prélèvements sanguins sont effectués au niveau du sinus rétro orbitaire à l’aide des tubes capillaire à hématocrite en verre, puis réparti dans un tube sec contenant l’héparine et un tube contenant l’anticoagulant éthylène diamine tétra acétique acide (EDTA), afin de doser respectivement les paramètres hématologiques et biochimiques.

4.3.1.2.1.1 Analyses hématologiques Pour l’hématologie, les analyses ont été réalisées par un appareil automatique de type SysMex K21 au niveau du laboratoire d’analyses médicales de Alger. Les échantillons de sang prélevés dans les tubes contenant un anticoagulant (EDTA) ont été immédiatement utilisés pour déterminer les taux de globules rouges (GR), globules blancs (GB), hémoglobine (HGB), hématocrite (HCT), volume globulaire moyen (VGM), teneur corpusculaire moyenne en

Matériels et méthodes hémoglobine (TCMH), concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) et plaquettes (PLT).

4.3.1.2.1.2 Analyses biochimiques Les échantillons de sang dans les tubes secs ont été centrifugés à 3000 tours/ min pendant 5 min. Les analyses biochimiques ont été réalisées au niveau d’un laboratoire d’analyses médicales à Alger à l'aide d'un appareil automatique de type Biosystems A15. Cet appareil permet le dosage du glucose, de la créatinine, des triglycérides, des cholestérols et la mesure des activités catalytiques des enzymes telles que l’alanine aminotransférase (ALT ou TGP), l’aspartate amino-transférase (AST ou TGO). 4.3.2 Activité anti-inflammatoire de M. deserti De Noé chez les souris L’inflammation est cliniquement définie comme un processus physiopathologique caractérisé par la rougeur, l’œdème, la fièvre, la douleur et la perte de fonction (Hunskaar et Hole, 1987; Kim et al., 2004). La survenue de l’inflammation a des origines multiples parmi lesquelles figurent les infections (bactériennes, virales et parasitaires…), les agents physiques (le traumatisme, la chaleur, le froid, les radiations ionisantes, l’électricité…) et les agents chimiques (acide, base, venin, toxines divers…). Tout organisme normal peut alors souffrir de l’inflammation (Gbenou et al., 2011). Les anti-inflammatoires sont des médicaments capables de diminuer ou de supprimer les réactions inflammatoires. Le traitement actuel de l’inflammation fait appel aux anti- inflammatoires stéroïdiens (AIS) et non stéroïdiens (AINS) (Li et al., 2003; Dugowson et Gnanashanmugam, 2006). Ces médicaments bien qu’étant efficaces présentent le plus souvent des effets indésirables à long terme tels que les ulcères gastro-intestinaux et l’insuffisance rénale (Perini et al., 2004). Aujourd’hui c’est un fait remarquable que les substances anti- inflammatoires d’origine végétale présentent un intérêt grandissant car elles offrent des avantages par rapport aux anti-inflammatoires classiques, comme par exemple l’inexistence des effets secondaires (Calixto et al., 2000; Raquibul Hasan et al., 2009; Rashid et al., 2014). Dans ce contexte s’inscrit cette partie du présent travail, dont l’objectif essentiel consiste à étudier et à vérifier l’activité anti-inflammatoire de M. deserti De Noé attribuée par l’étude ethnobotanique. L'évaluation de l'activité anti-inflammatoire de l’infusé et les extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé a été menée par la méthode de stimuli chimiques qui induit un œdème de la patte chez les animaux. L’œdème peut être provoqué par plusieurs agents phlogogènes; formol, ovalbumine, kaolin, carragénine…etc. Cette dernière a été utilisée pour induire l’inflammation dans cette étude. Il est maintenant bien établi que la carragénine peut induire une réaction inflammatoire intense sur plusieurs sites anatomiques chez les rats et les souris (Calhoun et al., 1987).

4.3.2.1 Principe L’injection de la carragénine sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure de la souris entraîne l’apparition d’un œdème. L’intensité de cet œdème, qui atteint son maximum de développement en 4h, est évaluée grâce à l’augmentation du poids de la patte (par rapport au poids initial). L’administration préventive par voie orale d’un produit anti-inflammatoire réduit de façon significative le développement de l’œdème. 4.3.2.2 Protocole expérimental L’étude expérimentale de l’activité anti-inflammatoire a été réalisée selon la méthode de Winter et al. (1962) et Levy (1969). Les souris mâles répartis en 11 lots de 6, sont mises à 47

Matériels et méthodes jeun 16h avant l’expérimentation. Pour le lot témoin, les souris ont reçu la solution véhicule (eau physiologique). Pour le lot de référence, les souris ont été traitées par l’acide acétylsalicylique (AAS) à raison de 50 mg/kg de p.c. Néanmoins, pour les lots des essais, l’infusé aux différentes doses (250, 500 et 1000 mg/kg de p.c.), l’ExEth (contenant les flavones-flavonols et les acides phénoliques), l’ExButOH (contenant les anthocyanes et les C- glycoside) et l’ExHét (contenant les hétérosides flavoniques) chacun aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c., dans une solution physiologique, ont été administré aux souris par voie orale. L’administration de la solution véhicule, du médicament anti-inflammatoire (AAS), de l’infusé et des trois extraits polyphénoliques à tester se fait à raison de 1 ml/ 20 g de p.c. Une heure après les traitements, l'inflammation aiguë a été produite en injectant 0.05 ml d’une solution à 1 % de carragénine (dans la solution physiologique à 0.9 %) à toutes les souris des différents lots d’expérimentation sous l’aponévrose plantaire de la patte postérieure gauche (Winter et al., 1962). Après 3 h, les animaux sont rapidement sacrifiés en employant l'éther diéthylique. Les deux pattes postérieures sont très rapidement coupées au niveau de la tarso- articulation et pesées à l’aide une balance analytique (Levy, 1969).

4.3.2.3 Evaluation de l’activité anti-inflammatoire Nous avons calculé pour chaque souris, l’augmentation du poids de la patte enflée (patte postérieure gauche), qui a reçu la carragénine par rapport au poids de la patte saine (patte postérieure droite) selon la formule: poids patte gauche (PPG) - poids patte droite (PPD). Nous avons calculé pour chaque groupe la moyenne (M) et la déviation standard (DS). L'évolution de l'œdème (% d'œdème) est donnée par la mesure de la moyenne des deux pattes pour chaque groupe selon la formule suivante:

Les pourcentages d’inhibitions de l’inflammation pour chaque groupe traité par les différentes doses de l’infusé, les extraits et le médicament de référence, ont été calculés en comparant la moyenne de l’augmentation de l’inflammation avec celle du groupe témoin traité par l’eau physiologique. Les pourcentages d'inhibitions de l'inflammation ou œdème (% inhibition) ont été calculés selon la formule suivante:

4.3.3 Activité antalgique de M. deserti De Noé chez les souris

La douleur est l'un des problèmes de santé les plus importants en raison de sa prévalence et du handicap qu'elle peut induire. Elle définie selon l’association international de l’étude de la douleur (International Association for the Study of Pain, IASP) comme « une expérience sensorielle et émotive désagréable liée aux dommages de tissu ou décrite en termes d'un tel dommage » (Prabhu et al., 2011; Drabu et al., 2012).

De plus, l’efficacité des traitements reste très controversée. Ceci est dû notamment aux effets indésirables des médicaments (accoutumance, tolérance, constipation et nausée), à leur inefficacité sur certains patients mais aussi à la durée moyenne avant de trouver un traitement adéquat. Au niveau mondial, la découverte de nouveaux antalgiques est devenue une priorité pour nombre de sociétés pharmaceutiques (Meher et al., 2011).

Matériels et méthodes

Cette démarche est à l’origine de cette partie du présent travail qui tente d’évaluer l’activité antalgique de l’infusé et des extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé. L’effet analgésique de cette plante a été étudié chez les souris, au moyen de modèles expérimentaux in vivo induisant une douleur à l’aide de stimuli chimique (test du writhing et test au formaldéhyde) et thermique (test de la plaque chauffante).

4.3.3.1 Test du writhing Le test du writhing (ou test de torsion) est un test utilisé pour étudier l’effet analgésique périphérique d’une substance.

4.3.3.1.1 Principe

L’injection intra-péritonéale d’acide acétique à 0.6% chez la souris provoque un syndrome douloureux qui se manifeste par des mouvements de torsion de l’abdomen avec étirement des pattes postérieures (crampes), qui peuvent être réduites par un produit antalgique.

4.3.3.1.2 Protocole expérimental La méthode utilisée est celle décrite par Koster et al. (1959) et Collier et al. (1968) avec une légère modification (Sawadogo et al., 2006; Das et al., 2013). Les souris ont été maintenues à jeun pendant 16h avant le début de l’expérience. Des lots de 6 souris ont été utilisés. Le lot témoin a reçu de l’eau physiologique (0.5 ml/ 20 g), par contre les autres lots ont reçu l’infusé aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c., l’ExEth, l’ExButOH et l’ExHét chacun aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c. et le paracétamol comme un référence (100 mg/kg de p.c.) par voie orale. Trente minutes après l’administration des extraits, les animaux ont reçu par voie intra-péritonéale l’acide acétique dans l’eau physiologique (0.6% : v/v) à la dose de 10 ml/kg de p.c. Cinq minutes après l’injection de l’acide acétique, le nombre de crampes a été compté chez chaque souris durant15 min.

4.3.3.1.3 Evaluation de l’activité antalgique périphérique

L’activité antalgique est exprimée en pourcentage d’inhibition de la douleur ou pourcentage de protection pour chaque groupe traité par les différentes doses de l’extrait, le paracétamol et par l’eau physiologique. Les moyennes des groupes traités par les extraits et le paracétamol ont été comparées avec celle du groupe témoin, traité par l’eau physiologique. Le pourcentage de protection est calculé selon la formule suivante:

Dont We est la moyenne du nombre de crampes des souris du lot essai (traité) et Wt représente la moyenne du nombre de crampes des souris du lot témoin.

4.3.3.2 Test de la plaque chauffante Le test de la plaque chauffante (en anglais: hot plate test) est un test qui permet d’évaluer les propriétés analgésiques centrale d’extrait ou de molécules.

Matériels et méthodes

4.3.3.2.1 Principe Ce test est basé sur une plaque métallique chauffante sur laquelle repose un cylindre en verre sans fond. Le test consiste à placer l’animal dans le cylindre, à même la plaque chauffante pendant une période de temps (en s). La variable mesuré dans ce test est la latence du premier saut réalisé par l’animal. 4.3.3.2.2 Protocole expérimental La méthode utilisée est celle décrite par Lanhers et al. (1992) et Ojewole (2005). Nous avons travaillé sur 11 lots de 6 souris, qui ont été maintenus à jeun pendant 18 h avant le début de l’expérience. La température de la plaque a été maintenue à 55±0.5 °C. Avant l’administration de véhicule, le produit de référence ou les produits à tester, les souris de chaque groupe ont été placées sur la plaque afin d'obtenir sa réponse au stimulus de douleur induite par la chaleur électrique en mesurant le temps de réaction de chaque souris. La moyenne de cette détermination constitue le temps de réaction initial avant le traitement de chaque groupe de souris. L’infusé à la dose de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c., l’ExEth, l’ExButOH et l’ExHét aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c. pour chaque extrait et le paracétamol à la dose de 100 mg/kg de p.c. ont été administré par gavage gastrique. Le lot témoin a reçu l’eau physiologique (0.5ml/ 20g, oralement). Trente minutes après les traitements, nous avons laissé tomber doucement les souris sur la plaque chaude entourée d’un cylindre de rétention. Le chronomètre est déclenché dès que les pattes de la souris touchent la plaque. Le temps de réaction correspond à l’intervalle entre le moment où la souris atteint la plaque chauffante et le moment où elle se lèche les pattes, ou bien celui où elle saute hors du cylindre. Les autres mouvements sont ignorés. Nous avons donc noté le temps de réaction de chaque souris à 30, 60, 120, 180 et 240 min après l’administration de l’infusé, les extraits polyphénoliques, le médicament de référence et l’eau physiologique. Le temps de réaction est mesuré pendant une durée de 30 secondes maximum, un temps limite pour éviter d’endommager les tissus par la trop longue permanence sur la plaque chaude.

4.3.3.2.3 Evaluation de l’activité antalgique centrale Nous avons premièrement calculé le temps de réaction en secondes, exprimé en moyenne ± DS pour chaque groupe, ensuite nous avons comparé les temps de réaction des animaux traités à ceux des souris ayant reçu uniquement de l'eau physiologique. Le pourcentage d’augmentation du temps de réaction a été calculé selon la formule suivante:

% Augmentation = 100

Dont Ta est la moyenne des temps de réaction après administration des traitements et Tb est la moyenne des temps de réaction avant administration des traitements. 4.3.3.3 Test au formol

Afin d'essayer de déterminer si l'infusé et les extraits phénoliques de M. deserti De Noé ont atténués le périphérique ou central, ou les deux niveaux de nociception et de confirmer les premiers criblages (test du writhing et test de la plaque chaude), un autre test nociceptif chimique, test au formol (en anglais: formalin test), a été réalisée. Ce test est un modèle de douleur continue, y compris l'inflammation périphérique et la sensibilisation centrale. Simple à mettre en œuvre, il constitue un moyen privilégie d’évalue l’activité antalgique (Prabhu et al., 2011).

Matériels et méthodes

Le test au formol est l’un des test de nociception les plus prédictifs pour la recherche de nouvelles extraits ou molécules susceptibles de devenir un médicament (Le Bars et al., 2001). A l’origine, ce test avait pour objectif d’évaluer l’activité analgésique de l’extrait ou molécules anti-inflammatoires chez les animaux présentant une inflammation au niveau de la patte postérieure (Randall et Selitto, 1957).

4.3.3.3.1 Principe

L’injection sous-cutanée ou intra-plantaire de la solution de formol chez les souris déclenche une réaction comportementale biphasique qui comporte une phase précoce, survenant dans les 5 min suivant l’injection puis à la suite d’une période de repos, une phase tardive culminant 15 à 30 min plus tard. Pour les deux phases, la vigueur de ces comportements est dépendante de la concentration de formol administrée. On mesure le temps que passe l’animal à se lécher et se mordiller la patte. 4.3.3.3.2 Protocole expérimental

Les méthodes d’Ullah et al. (2014) et Adedapo et al. (2014) ont été utilisées pour déterminer l’effet analgésique de l’infusé et les extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé. Dans cette expérience, la douleur a été induite par le formol. Les animaux ont été maintenus à jeun la veille du test. Les souris ont été divisées en 11 groupes de 6 souris, administrés oralement soit avec le véhicule (eau physiologique, 0.5ml/ 20g de p.c.), le paracétamol (100 mg/kg p.c.), l’infusé (250, 500 et 1000mg/ kg p.c.) ou avec les extrait phénoliques (l’ExEth, l’ExButOH et l’ExHét) à raison de 100 et 300 mg/kg p.c. pour chacun. Trente minutes après ce traitement, 50µl d'une solution de formol (0.6% : v/v) nouvellement préparée ont été injectés par voie sous-cutanée sous la surface plantaire de la patte postérieure droite de chaque souris. Immédiatement après l’injection de la solution de formol, le temps de léchage de la patte injectée a été compté pendant les premières cinq minutes, puis entre 15-30 min.

4.3.3.3.3 Evaluation de l’activité antalgique Le temps (en s) passé en léchage de la patte injectée a été pris comme un indicateur de la réponse à la douleur. L’effet antalgique a été déterminé en deux phases. La première phase a été enregistrée au cours des 5 premières min, tandis que la phase tardive a été enregistrée au cours des 15 à 30 dernières min après l'injection de formol. Le pourcentage d’inhibition du léchage pour les deux phases a été calculé à partir de la formule suivante:

Où Do est le temps (en s) de léchage des souris du lot témoin et Dt est le temps (en s) de léchage des souris traitées avec l’infusé, les extraits et la substance de référence.

4.3.4 Activité antipyrétique de M. deserti De Noé chez les rats La fièvre est un phénomène pathologique qui résulte d’un dérèglement du système thermorégulateur, et elle se définit par une élévation de la température central normale du corps humain (37°C le matin et 37.5°C le soir) (Vasundra et Divya, 2013). Une fièvre au-delà de 40°C est considérée comme un risque de santé majeur immédiat. Le terme hyperpyrexia décrit des états d’augmentation extrême de la température corporelle (> 41.5°C). De pareilles températures ne sont atteintes que rarement, souvent elles sont plutôt liées à des maladies du

Matériels et méthodes système nerveux central (hémorragies) qu’a des infections. En fait, cette définition est variable, car il existe des variations individuelles et des facteurs physiologiques qui influencent la température telle que l’activité musculaire, la digestion et le cycle menstruel (Gilman, 1996). La fièvre chez l’homme est un système de défense naturel déclenché suivant les circonstances par l’organisme lui-même (Schorderet, 1998). Dans la plupart des cas, elle est provoquée suite la pénétration dans l’organisme des agents pathogènes (appelé pyrogènes) telle que les agents infectieux (virus, bactéries, champignons…etc.), les corps étrangers (les allergènes, les greffes, cellules cancéreuses…etc.). Par ailleurs, la fièvre peut être observée dans le cas d’altération d’un organe ou d’un tissu (infarctus…etc.) (Cohen, 1986; Bagepalli Srinivas et al., 2010). Un antipyrétique est un médicament utilisé dans le traitement de la fièvre. De nombreuses molécules ont des effets antipyrétiques parmi lesquelles le paracétamol, les AINS. Les antipyrétiques n’ont qu’un effet symptomatique. Ils diminuent la température du corps enfiévré. Ils sont à distinguer des hypothermisants capables d’abaisser la température normale (Cohen, 1986).

Nous avons entrepris l’étude de propriétés pharmacologiques de l’infusé et les extraits phénoliques de M. deserti De Noé, pour apporter une base scientifique à l’utilisation traditionnelle de cette plante. L’objectif de cette partie est de vérifier si l’utilisation de cette plante comme antipyrétique est justifiée. 4.3.4.1 Principe L’administration d’une solution de la levure de bière par voie sous-cutanée chez les rats entraine une pyrexie, qui peut être réduite par un produit antipyrétique. La température corporel de l’animal est mesurée à chaque heure pendant au moins 4h afin de déterminer sa variation. L’activité antipyrétique d’une substance s’étudie en cherchant dans quelle mesure son administration est susceptible d’abaisser la fièvre. 4.3.4.2 Protocole expérimental La méthode utilisée est celle décrite par Fadeyi et al. (2004). La fièvre (pyrexie) a été induite chez les rat mâle en injectant par voie sous-cutanée, sauf le lot témoin normothermique, une suspension aqueuse de la levure de bière à 20% dans l’eau physiologique à la dose de 10 ml/kg de p.c. dans la région dorso-latérale. La température rectale initiale de chaque rat a été notée 19h avant l'injection de la levure de bière en utilisant un thermomètre (Hartmann, Allemagne). Ensuite, les animaux sont privés de la nourriture et l’eau reste fournie pendant toute la durée des expériences. Dix-neuf heures après l'injection de la levure, la température rectale de chaque rat a été encore enregistrée pour déterminer la réponse pyrétique à la levure. Seuls les rats qui ont montré une élévation de température d’au moins 0.5 °C sont utilisés pour la suite de l’expérience. Les rats ont été divisés en huit groupes de six. C'est ainsi que nous avons administré les substances à étudier par voie orale à l’aide d’une sonde gastrique dans différents lots.  Lot 1 (lot témoin): les rats recevant de l’eau physiologique à la dose de 1 ml/ 100g de p.c.  Lot 2: les rats sont traités par le paracétamol à 100 mg/kg de p.c. C’est le lot de référence.

Matériels et méthodes

 Lot 3, 4 et 5: les rats sont traités par l’infusé des parties aériennes de M. deserti De Noé aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. respectivement.  Lot 6, 7 et 8: les rats sont traités par l’ExEth, l’ExButOH et l’ExHét des parties aériennes de M. deserti De Noé à raison de 100 mg/kg de p.c. pour chacun.

A coté de ces lots, nous avons un lot témoin normothermique (Lot 9), qui a reçu seulement l’eau physiologique. Après l’administration des produits à tester, les températures rectales des animaux sont ére ème ème ème mesurées à la 1 , 2 , 3 et 4 h suivant l’administration de ces produits (soient T1, T2, T3 et T4 respectivement). 4.5 Analyse statistique L’analyse statistique des résultats obtenus a été réalisée par le logiciel STATISTICA Software 6.0, représentés sous forme de moyenne ± déviation standard (DS) et analysés par ANOVA (analyse de variance) un facteur suivi du test de Tukey pour les comparaisons multiples et la détermination des taux de signification. Les différences sont considérées significatives à P<0.05.

Résultats et discussions

1. Présentation de M. deserti De Noé Des nombreuses prospections réalisées à Biskra et à Tamanrasset, nous avons noté quelques aspects morphologiques de plante en question ainsi que de sa répartition dans la zone de son prélèvement;

M. deserti De Noé, montre une bonne association avec d’autres plantes herbacées, ce qui met en considération le cortège floristique environnant à cette espèce végétale. Parmi Les espèces végétales trouvées autour de M. deserti De Noé, nous avons reconnues Zilla spinosa, Teucrium polium et Cassia lanceolata.

Sur le terrain, M. deserti De Noé montre un aspect herbacé, de taille moyenne de 20 à 30 cm. Ses feuilles sont petites, de couleur vert blanchâtres, à disposition alternes opposées à des bords dentelées, très poilues (aspect cotonneux). Les tiges sont droites nombreuses, couvertes de poils blancs donnant à la plante un aspect laineux. Les fleurs mauves dégageant une forte odeur et sont généralement réunies en glomérules compactes espacées sur la tige (Figure 21).

La comparaison de la distribution de cette plante dans les deux zones (Ain Zaatout à Biskra et Afilal à Tamanrasset), nous avons noté une forte distribution de M. deserti De Noé à Ain Zaatout (Biskra) par rapport à Afilal (Tamanrasset) (Figure 21).

Résultats et discussions

0.5 cm 0.5cm

Jeune plante de M. deserti De Noé (Ain Apparei l végétatif de M. deserti De Noé Zaatout, Biskra)

1cm 0.2 cm

Aspect de la racine de M. deserti Fleurs de M. deserti De Noé

1cm 1cm

Association de M. deserti De Noé avec Distribution de M. deserti De Noé d’autres plantes Figure 21: Aspect morphologique de M. deserti De Noé (photos prises par Saad, 2017)

Résultats et discussions

2. Etude ethnobotanique L’enquête menée auprès de la population comportant 135 personnes interrogées de la wilaya de Biskra par rapport à plusieurs données à savoir:

2.1. Choix entre la phytothérapie et la médecine moderne Les résultats de l’enquête ethnobotanique ont révélé 3 groupes (Figure 22), qui sont  97 personnes ont recours à la phytothérapie seule;  14 personnes ont recours à la médecine moderne seule;  24 personnes ont recours à la phytothérapie et à la médecine moderne à la fois.

Figure 22: Place de la phytothérapie dans la wilaya de Biskra Les personnes qui pratiquent la phytothérapie sont en nombre de 121 (89.63%) dont la plupart sont des villageois. Le choix de la phytothérapie par la population locale est lié le plus souvent à l’enclavement des zones rurales, l’inexistence ou la rareté des infrastructures sanitaires, le coût élevé des médicaments, ainsi que la modestie des revenus de ces populations (Guedje et al., 2010). 2.2 Utilisation de M. deserti De Noé selon le sexe

Au niveau de la zone d’étude, les deux sexes pratiquent la médecine traditionnelle, avec une légère prédominance des femmes qui sont les plus questionnées avec une proportion de 53%, alors que les hommes représentent 47% seulement (Figure 23).

Résultats et discussions

Figure 23: Répartition de la population questionnée selon le sexe

Les femmes et les hommes se chargent équitablement de la collecte des plantes médicinales, avec la participation de l’homme surtout dans les zones réputées dangereuses. Les femmes s’occupent majoritairement du séchage, le stockage et la préparation des recettes pour les soins des membres de la famille (Mehdioui et Kahouadji, 2007). En effet, les femmes sont d’une part les plus détentrices du savoir phytothérapique traditionnel part leur responsabilité en tant que mères, qui donnent les premiers soins en particulier pour leurs enfants (Bakiri et al., 2016).

2.3 Utilisation de M. deserti De Noé selon l’âge La population étudiée se compose de 135 personnes avec des âges allant de 20 à 100 ans et en moyenne d’âge d’environ 48 ans. L’utilisation de M. deserti De Noé dans la wilaya de Biskra est répandue chez toutes les tranches d’âge avec une prédominance chez les personnes âgées de [41 à 60] ans avec une proportion de 48.15%. Les tranches d’âge de [61 à 90] ans, [20 à 30] ans et [31 à 40] ans, viennent ensuite avec des proportions de 29.63%, 11.85% et 8.89% respectivement. Enfin, les personnes de plus de 90 ans représentent une proportion réduite de 1.48% (Figure 24).

Figure 24: Répartition de l’utilisation de M. deserti De Noé selon les tranches d’âge

Résultats et discussions

Les résultats obtenus confirment que les personnes âgées connaissent et utilisent la phytothérapie traditionnelle notamment M. deserti De Noé. On note aussi un manque de connaissances des vertus de notre plante par la population jeune et une méfiance de certaines personnes qui ont tendance à ne plus trop croire en cette médecine traditionnelle. En effet, les personnes âgées sont sensées fournir et transmettre leurs savoirs faire vers les nouvelles générations du fait qu’elles détiennent une bonne partie du savoir ancestral (Lakouéténé et al., 2009).

2.4 Utilisation de M. deserti De Noé dans les soins des maladies 2.4.1 Période de cueillette La cueillette des plantes médicinales dépend des parties qui seront utilisées pour préparer le traitement. Cependant, la teneur en constituants biologiquement actifs varie selon le stade de développement de ces plantes (OMSG, 2003). La figure 25 illustre la fréquence des différentes périodes de cueillette de M. deserti De Noé par la population locale de la wilaya de Biskra. La récolte de cette plante se fait généralement au printemps (57.72%), mais peut avoir lieu tout au long de l’année (20.13%), l’été (16.78%), l'hiver (3.36%) et enfin l'automne (2.1%).

Figure 25 : Fréquences des différentes périodes de cueillette de M. deserti De Noé D'après Chevallier (2001), la récolte des parties cibles se fait quand ils sont en plein maturité car elles contiennent une teneur très élevée en composants actifs. Ainsi les feuilles sont récoltées au printemps ou en été et l'écorce est généralement prélevée au printemps ou en automne. 2.4.2 Parties utilisées L’enquête ethnobotanique a révélé que les feuilles sont les parties la plus utilisées dans cette zone avec un pourcentage de 51.35%, suivie par la partie aérienne (20.27%), la plante entière (16.89%), les fleurs (6.08%) et les tiges (5.41 %) respectivement (Figure 26).

Résultats et discussions

Figure 26: Répartition des différentes parties utilisées de M. deserti De Noé dans la wilaya de Biskra

Nos résultats concordent avec ceux de Mesfin et al. (2013), Shosan et al. (2014) et Hammadi et al. (2015) qui ont rapporté que les feuilles sont les plus utilisées dans les recettes médicinales. Cela est peut être expliqué par l’aisance, la rapidité de leur récolte, et du fait qu’elles sont le siège du stockage des métabolites secondaires responsables des propriétés biologiques de la plante (Ould El Hadj et al., 2003). Néanmoins, la cueillette de ces organes se fait anarchiquement par les utilisateurs locaux qui ont tendance à arracher la plante entière au lieu de s’intéresser uniquement à la partie souhaitée et par conséquent cette pratique peut contribuer à la dégradation des écosystèmes et des ressources naturelles de la région étudiée.

2.4.3 Type de maladies traitées par M. deserti De Noé Ce travail réalisé au niveau de la wilaya de Biskra, nous a permis de répertorier un certain nombre de pathologies traitées par notre plante (Figure 27). Les résultats obtenus montrent que cette plante est utilisée dans le traitement de la fièvre (27.61%), les pathologies digestives (16.50%), des algies diverses (13.47%) et le diabète (12.12%). Le reste des maladies (affection rhumatismal, pathologies respiratoires, blessures, dermatoses, hémorroïdes, pathologies gynécologiques, cancers, diminuer le poids et pathologies du foie) représentent des faibles pourcentages.

Résultats et discussions

Figure 27: Répartition des différentes maladies traitées par M. deserti De Noé

2.4.4 Mode de préparation Plusieurs modes de préparation sont employés par la population locale à savoir l’infusion, la décoction, la poudre, la lotion, la macération, la pommade et l’inhalation pour l’administration des principes actifs. L’infusion (33.16%) et la décoction (25.91%) sont les modes de préparation les plus fréquemment utilisés dans la wilaya de Biskra (Figure 28). Elles sont suivies de la préparation en poudre (13.99%), la lotion (10.88%), la macération (7.77%), la pommade (6.74%) et enfin l’inhalation (1.55%).

Figure 28: Répartition des différents modes de préparation de M. deserti De Noé dans la wilaya de Biskra

L'infusion, la macération et la décoction constituent les principaux modes de préparation des remèdes à partir des plantes dans la thérapeutique traditionnelle (Ould El Hadj et al., 2003). Ces préparations dépendront des principes actifs ciblés. Selon Chehma et Djebbar (2008) et Salhi et al. (2010), l'infusion et la décoction sont les modes de préparation qui permettent de recueillir le maximum de principes actifs

Résultats et discussions

2.4.5 Dose utilisée Une forte proportion de la population de la wilaya de Biskra utilise M. deserti De Noé avec des doses non précises (75%). Alors que 25% seulement de cette population l’utilise avec des doses bien précises (Figure 29).

Figure 29: Répartition des utilisateurs de M. deserti De Noé selon la dose utilisée La dose reste encore aléatoire ce qui se manifeste par des effets néfastes sur la santé car il se dit «aucune substance n’est poison elle-même, c’est la dose qui fait le poison».

2.4.6 Mode d’administration utilisée Cette étude montre que les remèdes préparés à partir de M. deserti De Noé sont pris par voie orale à raison de 54.41%. 10.29% des préparations sont utilisées par application topique sur la peau, alors que 35.29% de la population utilisent les deux modes d’administrations (Figure 30). Ces remèdes sont utilisés dilués dans l'eau, le lait, le miel ou l’huile d’olive.

Figure 30: Répartition des utilisateurs de M. deserti De Noé selon le mode d’administration

Les remèdes administrés par voie orale sont en général sous forme d’infusé, décocté, poudre ou macérât, ce qui peut être expliqué par la fréquence du traitement de l’infection de l'appareil

Résultats et discussions digestif. L’inhalation, la lotion, la pommade, le cataplasme-compresse, la friction, le massage, les bains de bouche et gargarisme sont les principaux usages externes pratiqués par la population locale. La fréquence importante d'utilisation de ces derniers est en accord avec l'importance des usages populaires liés au traitement de la fièvre, les pathologies respiratoires et les soins de la peau.

2.4.7 Posologie, fréquence et durée d’utilisation Chaque remède est préconisé pour une durée et une posologie bien définie. L'augmentation ou la diminution de cette durée peut diminuer l'efficacité du remède ou encore conduire à des effets secondaires (Bourobou, 2004). La figure 31 montre les différentes durées d’utilisation des remèdes à base de M. deserti De Noé chez la population locale de la wilaya de Biskra.

Figure 31: Répartition des durées d'utilisation de remèdes à base de M. deserti De Noé

Les résultats obtenus montrent que les durées ou les fréquences d’utilisation de M. deserti De Noé sont variables selon les maladies traitées, avec une légère prédominance de l'utilisation jusqu'à la guérison (25.74%), alors que l’utilisation pendant deux semaines, une semaine et moins d’une semaine représentent des proportions de 25%, 23.53% et 20.59% respectivement (Figure 31). Par opposition, nous avons constaté que la durée d’utilisation d’un mois est moins fréquente (5.15%).

Par ailleurs, M. deserti De Noé est le plus souvent utilisé une fois par jour avec 58%, suivie par deux fois par jour en proportion de 36% et enfin une proportion réduite de 6% pour trois fois par jour (Figure 32). Selon Teklehaymanot et Giday (2007), la fréquence du traitement dépend du type de la maladie et sa gravité. Les mesures utilisées pour déterminer la posologie ne sont pas standardisées et dépendent de l'âge, l'apparence physique du patient, le diagnostic et l'expérience individuelle (Addis et al., 2001; Teklehaymanot, 2009).

Résultats et discussions

Figure 32: Répartition de la posologie de remèdes à base de M. deserti De Noé 2.4.8 Etat d'utilisation et caractéristiques des recettes recensées

Les plantes médicinales sont utilisables soit à l’état frais soit à l’état sec après diverses opérations de dessiccation et de conservation. Les résultats de l’enquête ethnobotanique montrent que 41.91% de la population de Biskra utilisent M. deserti De Noé à l'état sec et que 19.85% l’utilisent à l’état frais. Alors que 38.24% de la population utilisent cette plante à l’état sec et frais à la fois (Figure 33).

Figure 33: Répartition de l'état d'utilisation de M. deserti De Noé pour la préparation des remèdes

Le séchage naturel est un mode de conservation efficace en évitant la contamination de la plante cible, il permet d'augmenter sa durée de vie, de diminuer son poids afin de faciliter son transport (Bourkhiss et al., 2009).

Dans les recettes recensées à partir de l’enquête ethnobotanique, M. deserti De Noé est préparée seule (58.82% des cas) ou combinée à d'autres ingrédients (41.18% des cas). Les recettes combinées peuvent renfermer des ingrédients de nature végétale comme l’armoise blanche (chih), la menthe (nenae), la rue (fidjel), le romarin (iklil), le henné (hénna), la

Résultats et discussions germandrée (khayatta) ou le genévrier (arar), l'huile d'olive et le sucre ou des ingrédients de source animale comme le miel et le lait…etc. (Figure 34).

Figure 34: Répartition de l’utilisation seule ou mixte avec d’autre plante de M. deserti De Noé

2.4.9 La toxicité de M. deserti De Noé

La plupart des effets nocifs reliés à l’utilisation des plantes médicinales sont rapportés non pas à la plante elle-même, mais à une erreur d'identification, à une contamination involontaire (par une autre plante, par des métaux lourds, par des micro-organismes pathogènes ou par des résidus agrochimiques), au non respect de la dose adéquate ou à une interaction avec d’autres principes actifs. L'effet nocif des remèdes à base de plante peut aussi dépendre des facteurs liés aux consommateurs, tels que l'âge, la génétique et les maladies concomitantes (Zeggwagh et al., 2013).

La majorité des personnes questionnées (97%) ont motionnées la non toxicité de notre plante à l'exception d'une minorité qui ont rapporté d'éventuels risques d’intoxication qui se manifeste par des vertiges, des nausées, des vomissements et des diarrhées, ainsi que l'interdiction de son utilisation pour la femme enceinte.

Résultats et discussions

3. Etude phytochimique de M. deserti De Noé

3.1 Screening chimique Le screening chimique de la poudre de M. deserti De Noé ou de son infusé a révélé la présence de certains groupes chimiques représentés dans le tableau 7.

Tableau 7: Résultats des réactions de caractérisations de M. deserti De Noé

Screening chimique Les composés chimiques recherchés Station de Ain Zaatout Station de Afilal (Biskra) (Tamanrasset) Flavonoïdes + + +

Tannins + + + + + +

Alcaloïdes + + + + Anthocyanes + +

Leuco-anthocyanes ± ±

Terpénoïdes + + + + Lipoïdes - -

Caroténoïdes - -

Quinones combinées - -

Saponosides + + + + + +

Coumarines + + + + + + (-) Absence de la substance recherchée dans la poudre, (±) plus ou moins présence de la substance recherchée dans la poudre, (+) présence de la substance recherchée dans la poudre, (+ +), abondance de la substance recherchée dans la poudre, (+ + +) la substance recherchée dans la poudre est très abondante.

Les résultats du screening phytochimique réalisé sur la poudre de M. deserti De Noé met en évidence la présence des composés chimiques qui possèdent des activités biologiques intéressantes. Il s’agit entre autre des substances polyphénoliques (flavonoïdes, tannins, anthocyanes, coumarines, saponosides), des alcaloïdes et des terpènoïdes. On note également l’absence des caroténoïdes, des quinones combinées et des lipoïdes dans la partie aérienne de M. deserti De Noé récoltée au niveau de Ain Zaatout et Afilal. Ces résultats concordent avec les études des Ghedadba et al. en 2015 et Ghedadba et Hambaba en 2016 qui ont travaillé sur les feuilles de M. deserti De Noé. Les composés phénoliques (flavonoides et tannins) sont connus pour avoir de nombreuses propriétés thérapeutiques à savoir: antivieillissement, anti-carcinogène, anti-inflammatoire, antioxydant, antimicrobienne, antiviral, anti-tumoral, antiseptique, antidiabétique et protège contre les maladies cardiovasculaire et respiratoires (Harborne et Williams, 2000; Bouchet et al., 2000; Narayana et al., 2001; Seyoum et al., 2006; Benhabyles et al., 2016).

Résultats et discussions

Nos résultats montrent une forte abondance des alcaloïdes dans les parties aériennes de Ain Zaatout qui présente des activités anti-spasmodique, anti-rhumatismal, analgésique et anticancéreuse. Leurs effets laxatif est aussi révélé (Zirihi et al., 2005; Zirihi et al., 2007; N’Guessan et al., 2009). Les terpénoides connus par leurs propriétés antibactérienne et cardiotonique sont très abondants dans la station de Afilal. M. deserti De Noé est très riche en saponosides qui ont des propriétés analgésiques, anti- inflammatoires et anti-œdémateuse (Roux et Catier, 2007). Les coumarines présentent des propriétés antipyrétique, analgésique, sédative, anti- œdémateuse et anti-convulsivante sont à leurs tour très abondantes (Mpondo et al., 2015).

La présence de ces composés biologiquement actifs au niveau des parties aériennes de M. deserti De Noé explique leur utilisation par les populations dans le traitement de diverses maladies.

3.2 Extraction des composés phénoliques L’extraction des composés phénoliques à partir des parties aériennes de M. deserti De Noé recueillie des stations de Ain Zaatout et de Afilal a été réalisée. Cette extraction a été effectuée en deux principaux étapes, la première est une extraction par hydrolyse acide à chaud pour obtenir les extraits contenant les aglycones flavoniques. La deuxième est une extraction par macération à froid dans un mélange hydroalcoolique éthanol/ eau (7/3: v/v) pour obtenir l’extrait contenant les hétérosides flavoniques ou par l’éther diéthylique pour obtenir l’extrait contenant les aglycones libres. Cette série d’extraction permet d’obtenir quatre extraits phénoliques; l’extrait éther diéthylique (ExEth) contenant les flavones-flavonols et les acides phénoliques, l’extrait n- butanolique (ExButOH) contenant les anthocyanes et C-glycosides, l’extrait hydroalcoolique (ExHét) contenant les hétérosides flavoniques (O et C-glycosides) et enfin l’extrait des aglycones libre (ExAgL), en plus de l’infusé qui est préparé selon la méthode traditionnelle.

3.2.1 Rendement des extractions L’extraction des composés phénoliques de M. deserti De Noé, nous permet de déterminer les rendements de leur infusé et leurs extraits polyphénoliques. Les rendements obtenus, exprimés par rapport à la masse des parties aériennes sèches de départ, sont présentés dans de la figure 35. D’une manière générale, il n’y a pas de différence significative (p>0.05) entre les rendements d’extraction des différents extraits dans les deux régions de récoltes, à l’exception du cas de l’ExHét et l’ExAgL où les rendements significatifs (p<0.05) les plus importants sont enregistrés dans les parties aériennes de la station de Afilal par rapport à la station de Ain Zaatout.

Les résultats obtenus montrent que parmi les différents extraits de la partie aérienne de M. deserti De Noé de la station de Ain Zaatout, le rendement le plus élevé est noté dans l’infusé (12.74 %), suivi par l’ExButOH (6.4 %), l’ExEth (4.9 %), l’ExHét (2.03%) puis l’ExAgL qui montre un rendement le plus faible dans les deux stations de récoltes (0.8 %). Par ailleurs, l’ExButOH et l’infusé ont été obtenus avec des rendements similaires (10.58 % et 10.56 %), suivis par l’ExHét (9.09 %), l’ExEth (4.2 %) puis l’ExAgL (2.51 %) pour la deuxième station Afilal.

Résultats et discussions

Figure 35: Rendement des extractions de l’infusé et divers extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé de Biskra et Tamanrasset Les moyennes dans chaque colonne suivies par une lettre différente sont significativement différentes (p<0.05), Rdt: rendement, ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique, ExAgL: extrait aglycones libres On constate que les rendements de l’extrait contenant les hétérosides flavoniques et de l’extrait contenant les aglycones libres sont significativement variables malgré que la technique d’extraction est la même; cette variabilité est due probablement à la variation des facteurs suivants: le stade de croissance, les conditions pédoclimatiques, la période de récolte, le temps de récolte, séchage…etc. (Ghedadba et al., 2014). Toutefois, il est difficile de comparer ces résultats avec ceux de la bibliographie, car le rendement n’est que relatif et semble être lié à l’origine géographique et à la durée de stockage de la récolte et aussi aux méthodes d’extraction appliquées (Pouzet et al. 2002).

3.3 Analyses quantitatives et qualitatives des polyphénols de M. deserti De Noé 3.3.1 Analyses quantitatives par spectrophotométrie UV-visible 3.3.1.1 Dosage des polyphénols totaux Les analyses quantitatives des polyphénols totaux sont déterminées à partir de l’équation de la régression linéaire de la courbe d’étalonnage (y= 2.916 x, R2= 1) exprimée en mg d’équivalent d’acide gallique par gramme de la matière sèche (mg EAG/g MS) (Annexe 2). Les résultats obtenus pour les teneurs en polyphénols totaux contenus dans l’infusé et les extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé dans les deux régions de récolte sont rapportés dans le tableau 8. Toutes les valeurs des teneurs en polyphénols de l’infusé et des différents extraits polyphénoliques sont dans l’intervalle de 30.4±0.8mg jusqu’à 0.29±0.2mg EAG/g MS.

Résultats et discussions

Tableau 8: Teneur en polyphénols totaux de la plante M. deserti De Noé

Teneur en polyphénols Extraits (mg EAG/g MS)

Biskra Tamanrasset a b Infusé 13.09 ± 1.9 9.55 ± 0.6 ExEth 2.34 ± 1.4c 2.25 ± 1.1c ExButOH 30.4 ± 0.8d 24.03 ± 0.09e f f ExHét 12.5 ± 1.3 14.77 ± 2.9 ExAgL 0.29 ± 0.2g 1.47 ± 0.3h

Les valeurs présentées: moyenne ± DS, chaque mesure est répétée 3 fois, les moyennes entre les colonnes suivies par une lettre différente sont significativement différentes (p<0.05), ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique, ExAgL: extrait d’aglycones libres

Pour mieux caractériser les différences quantitatives existant entre ces extraits, les données de ce tableau ont été représentées sous forme d’histogramme (Figure 36).

La quantification des polyphénols totaux au spectrophotomètre a montré que la différence entre les teneurs de l’infusé, d’ExButOH et d’ExAgL des parties aériennes de Ain Zaatout et ceux de Afilal est significative (p<0.05), à l’exception de l’ExEth et ExHét où la différence n’est pas significative (p>0.05). En effet, les extraits des parties aériennes de M. deserti De Noé de Ain Zaatout présentent des teneurs nettement plus élevées que celles de Afilal. Cette étude a montré que la localisation géographique avait peu d’influence sur la quantité de polyphénols totaux présents dans la plante.

Figure 36: Histogramme des teneurs des polyphénols totaux des M. deserti De Noé Les moyennes entre les colonnes suivies par une lettre différente sont significativement différentes (p<0.05), ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique, ExAgL: extrait d’aglycones libres

Cette présentation montre également que l’extrait ExButOH de M. deserti De Noé de la région de Biskra et Tamanrasset est le plus riche en polyphénols (30.4±0.8 et 24.03±0.09mg EAG/g MS respectivement), suivi par l’infusé (13.09±1.9 et 9.55±0.6 mg EAG/g MS respectivement) et enfin l’ExHét est de l’ordre de 12.5±1.3 et 14.77±2.9 mg EAG/g MS

Résultats et discussions respectivement. Par contre le contenu phénolique le plus faible est enregistré pour l’ExEth et l’ExAgL. Tout le contenu phénolique dans les extraits du M. deserti dépend du type d’extrait, c'est-à-dire la polarité du solvant utilisé dans l’extraction dont la solubilité élevée des phénols dans les solvants polaires donne une concentration élevée de ces composés (Stanković, 2011). Une étude réalisée par Benhammou et al. (2009), sur M. desserti De Noé de la région de Naâma, montre que la teneur des phénols totaux dans leurs feuilles est de l’ordre de 235.1±6.1 mg EAG/g MS et de 30.8±6.7 mg EAG/g MS pour l’extrait méthanolique et l’extrait aqueux respectivement, et dans leurs tiges, elle varie entre 133.7±27.3 mg EAG/g MS pour l’extrait méthanolique et 20.1 ± 2.6 mg EAG/ g MS pour l’extrait aqueux. Ce taux est élevée ne présente aucun similitude avec nos résultats. Cette différence pourrait être liée au dosage du réactif de Folin-Ciocalteu, aux facteurs biogénétiques et environnementaux, à la méthode d’extraction et au type de spectrophotomètre utilisé (Lee et al., 2003; Miliauskas et al., 2004; Ebrahimi et al., 2008).

3.3.1.2 Dosage de différentes fractions des composés phénoliques

L’étude quantitative des différents composés phénoliques (flavones- flavonols, aglycones libres, anthocyanidines, C-glycosides et hétérosides flavoniques) est réalisée par dosage spectrophotométrique UV-visible de 30 individus de M. deserti De Noé de Biskra et Tamanrasset. Les résultats du dosage des différents composés phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé au niveau de nos deux stations sont représentés dans le tableau 9. Tableau 9: Teneurs absolues en différents composés phénoliques de M. deserti De Noé

Composés Teneurs absolues phénoliques Biskra (Ain Zaatout) Tamanrasset (Afilal) Flavones-flavonols 0.1074 ± 0.02a mg/ g MS 0.1251 ± 0.02b mg/ g MS (CV: 21.29 %) (CV: 18.81 %) Aglycones libres 0.1257 ± 0.03c mg/ g MS 0.1289 ± 0.02c mg/ g MS (CV: 28.03 %) (CV: 20.01 %) Anthocyanidines 0.5687 ± 0.09d mg/ g MS 0.5164 ± 0.06d mg/ g MS (CV: 15.97 %) (CV: 12.90 %) C-glycosides 1.4281 ± 0.3e mg/ g MS 1.5183 ± 0.297e mg/ g MS (CV: 22.58 %) (CV: 19.56 %) Hétérosides 10.7634 ± 2.5f mg Rutine/ g MS 14.5374 ± 3.3g mg Rutine/g MS flavoniques (CV: 23.95 %) (CV: 22.93 %) Les valeurs sont présentées : moyenne ± DS, n=30, la moyenne entre les colonnes suivie par une lettre différente est significativement différente (p<0.05), CV (%): coefficient de variation, MS: matière sèche

Le dosage des différentes fractions des composés phénoliques de M. deserti De Noé a révélé que les teneurs absolues en aglycones libres (0.1257±0.03 et 0.1289±0.02 mg/g MS respectivement), en anthocyanidines (0.5687±0.09 et 0.5164±0.06 mg/g MS respectivement) et en C-glycosides (1.4281±0.3 et 1.5183±0.297 mg/g MS respectivement) sont similaires (p>0.05) pour les deux stations étudiée; Ain Zaatout et Afilal. Cependant, la différence entre les moyennes des hétérosides et des flavones-flavonols pour les deux stations est significative (p<0.05). Il ressort que les teneurs en hétérosides flavoniques et en flavones-flavonols (14.5374±3.3 mg Rutine/g MS et 0.1251±0.02 mg/g MS respectivement) des parties aériennes des individus de Tamanrasset sont plus élevées que celles obtenues chez les individus de Biskra (10.7634±2.5 mg Rutine/g MS et 0.1074±0.02 mg/g MS respectivement).

Résultats et discussions

Aucun résultat du dosage des flavones- flavonols, des aglycones libres, des anthocyanes, des C-glycosides ou des hétérosides flavoniques n’a été rapporté par d’autres auteurs sur M. deserti De Noé à notre connaissance pour pouvoir comparer nos résultats. Au vue du tableau 9, nous notons également que les coefficients de variation mettent en exergue l'existence d'une grande variabilité au niveau de la plupart des composés phénoliques dénotant de l'hétérogénéité de nos individus au sein des stations de récoltes. 3.3.1.3 Analyse de la diversité de M. deserti De Noé de la région de Biskra et Tamanrasset par rapport aux variables chimiques mesurées Nous avons effectué une analyse statistique sur les 30 individus récoltés de M. deserti De Noé pour chaque région d’étude (Biskra et Tamanrasset). Notre objectif est de pouvoir montrer par cette analyse statistique, si tous les individus d’une même population ou de population d’origine géographique différente sont semblables ou différents par rapport à cinq variables; flavones- flavonols, aglycones libres, anthocyanes, C-glycosides et hétérosides flavoniques. L’analyse statistique des individus des deux régions en fonction des différents composés phénoliques est représentée sous forme des histogrammes (Figure 37).

Résultats et discussions

Figure 37: Histogrammes des teneurs en différents composés phénoliques des individus de M. deserti De Noé en fonction des stations étudiés de Biskra et Tamanrasset

Résultats et discussions

Au vue de ces histogrammes, nous pouvons relever que les individus de M. deserti De Noé de Biskra et Tamanrasset, constituent des groupes hétérogènes pour les teneurs en anthocyanes, en C-glycosides et en hétérosides flavoniques. Par contre, les individus de la station de Biskra présentent une certaine homogénéité pour les teneurs en aglycones libres et en flavones- flavonols avec un groupe majoritaire de 21 individus pour le premier et deux groupes de 12 et 15 individus pour le second. En effet, les teneurs en flavones- flavonols dans les parties aériennes de M. deserti De Noé varient entre 0.05 et 0.15 mg/ g MS pour 90% des individus de Biskra et 80% pour les individus de Tamanrasset. 70% des individus de Biskra ont des teneurs en aglycones libres qui varient entre 0.1 et 0.2 mg/ g MS. En revanche, ces teneurs au nivaux de la station de Tamanrasset sont très variées (7 colonnes), où 53.33% des individus présentent des valeurs entre 0.1 et 0.12 mg/ g MS, 20% présentent des teneurs entre 0.12 et 0.14 mg/ g MS et 16.66% des individus présentent des teneurs entre 0.16 et 0.17 mg/ g MS. Ceci dénote d’une hétérogénéité des individus de Tamanrasset en ces composés. La plupart des individus (80%) de Biskra ont des teneurs en anthocyanes comprises entre 0.45 et 0.70 mg/ g MS. Par contre chez les individus de Tamanrasset, on trouve que ces teneurs varient entre 0.36 et 0.48 mg/ g MS pour 36.66% des individus et entre 0.50 et 0.64 mg/ g MS pour la majorité des individus (63.33%). Dix huit individus (60%) de la station de Biskra ont des teneurs en C-glycosides qui varient entre 1 et 1.6 mg/ g MS, par comparaison avec treize individus qui représentent 43.33% des individus de Tamanrasset. Néanmoins, le grand nombre d’individus qui contient des teneurs élevés en C-glycosides (comprises entre 1.6 et 2.2 mg/ g MS) est enregistré pour les individus de Tamanrasset avec un pourcentage de 50% par comparaison avec 26% seulement pour les individus de la station des Biskra. Les teneurs en hétérosides flavoniques varient entre 7 et 15 mg Rutine/ g MS pour 96% pour les individus de Biskra et 60% pour les individus de Tamanrasset, les 40% des individus qui restent ont des teneurs plus élevées comprises entre 16 et 21 mg Rutine/ g MS. Nous pouvons déduire à partir de ces résultats que les individus de la station de Tamanrasset montrent une très forte hétérogénéité, c'est-à-dire une grande variabilité intra- spécifique pour les différents composés phénoliques étudiés.

Résultats et discussions

3.3.1.3.1 Classification ascendante hiérarchique (CAH)

La CAH est une méthode de classification qui permet de mettre en évidence un regroupement «naturel» d’un ensemble d’individus décrits par des caractéristiques (les variables). C’est le premier traitement statistique appliqué. L’objectif est de constituer des classes regroupant les objets (individus) les plus semblables. Une matrice de distance entre les individus est calculée, les individus les plus proches sont regroupés et une nouvelle matrice de distance est calculée. Le processus est répété jusqu’à ce que tous les objets ne forment qu’une classe. Le résultat se présente sous forme d’un dendrogramme dont chaque nœud représente une classe. Le dendrogramme, pour les 30 individus de la station de Biskra, obtenu à l’aide du logiciel STATISTICA est présenté dans la figure 38.

Figure 38: Dendrogramme résultant de la CAH pour les 30 individus de la station de Biskra

Ce dendrogramme montre que les individus étudiés de la station de Biskra (Ain Zaatout) se répartissent selon les coupures de Ward en deux classes. La première classe (en vert) est la classe principale, elle contient 18 individus. Elle est cependant divisée en 2 sous-classes (1a et 1b). La seconde classe (en rouge) contient 12 individus. Elle est divisée en 3 sous-classes (2a, 2b et 2c). Pour la station de Tamanrasset, le dendrogramme obtenu à l’aide du logiciel STATISTICA est présenté dans la figure 39.

Résultats et discussions

Figure 39: Dendrogramme résultant de la CAH pour les 30 individus de la station de Tamanrasset

Les résultats de la CHA montrent que les individus de la station de Tamanrasset (le site de Afilal) se répartissent selon les coupures de Ward en trois classes. La première classe (en jaune) est la classe principale, elle contient 17 individus. La seconde classe (en bleu) contient 7 individus. Enfin la troisième classe (en vert) est constituée de 6 individus. Ces trois classes peuvent chacune être divisées en 2 sous-classes. A partir des dendrogrammes des deux stations et selon les coupures de Ward, il se confirme que les individus de Afilal sont plus hétérogènes vis-à-vis des composés phénoliques que ceux de la station de Biskra. La CAH permet d’obtenir des informations sur les différences éventuelles existantes entre les individus, cependant elle n’explique pas pourquoi les individus sont différents. Il n’est donc pas possible d’identifier les classes les plus riches en flavones- flavonols par exemple. Afin d’approfondir l’étude de la matrice et d’expliquer les observations obtenues avec la CAH, un second traitement statistique a été utilisé, l’analyse en composante principale. 3.3.1.3.2 Analyse en composantes principales (ACP) L’analyse en composantes principales (ACP) est une méthode descriptive multidimensionnelle. C’est le second traitement statistique appliqué. Elle permet entre autre de visualiser la répartition des individus et des variables dans le nouvel espace formé par les composantes principales. Les quatre graphiques (Figure 40, 41, 42 et 43) obtenus à l’aide du logiciel STATISTICA permettent de déterminer la corrélation entre les individus et les variables (flavones- flavonols, aglycones libres, anthocyanes, C-glycosides et hétérosides flavoniques) pour chaque station d’étude.

Résultats et discussions

L'interprétation statistique à partir de la matrice de corrélation (obtenue par l'ACP) a montré que plusieurs variables sont corrélés positivement entre elles dans les deux stations d’étude (Tableau 10 et Tableau 11).

Tableau 10: Corrélations entre les variables polyphénoliques étudiées pour la station de Biskra

Flavones- Aglycones Anthocyanes C-glycosides Hétérosides flavonols libres flavoniques Flavones - flavonols 1 0.20 0.04 0.16 0.15 Aglycones libres 0.20 1 0.12 -0.15 0.10 Anthocyanes 0.04 0.12 1 -0.23 0.06 C-glycosides 0.16 -0.15 -0.23 1 -0.09 Hétérosides flavoniques 0.15 0.10 0.06 -0.09 1

Pour la station de Biskra, les flavones- flavonols sont corrélées positivement avec les aglycones libres (R= 0.20), les anthocyanes (R= 0.04), les C-glycosides (R= 0.16) et avec les hétérosides flavoniques (R= 0.5). Ce qui indique que ces fractions polyphénoliques sont sur la même voie métabolique de synthèse que les flavones- flavonols. Cependant, on relève l’existence d’une corrélation négative qui lié les C-glycosides avec respectivement les aglycones libres (R= - 0.15), les anthocyanes (R= - 0.23) et les hétérosides flavoniques (R= -0.09). Ce qui implique que les C-glycosides ne seraient pas sur la même voie métabolique que ces composés mais sur une voie antagoniste. C'est-à-dire il y aurait une compétition dans l’utilisation des précurseurs pour la synthèse de l’un ou les autres composés.

Nous avons représenté, sous forme de graphiques, la projection des variables et des individus par ACP avec la matrice d’origine selon les deux premières composantes principales (F1 et F2) qui expliquent 52.65% de la variance totale.

La projection des variables sur les axes de l’ACP schématise la corrélation entre les variables étudiées de la station de Biskra qui est représentée dans la figure 40.

Figure 40: Projection des variables étudiées sur les axes de l’ACP dans la station de Biskra

Résultats et discussions

La projection des variables nous schématise bien les corrélations qui existent entre elles. En effet, celles qui corrélées positivement se trouvent dans le même axe, celles corrélées négativement sont opposées par rapport à l’axe. La projection des 30 individus de la station de Biskra en fonction des 5 variables (Figure 41); flavones- flavonols, aglycones libres, anthocyanes, C-glycosides et hétérosides flavoniques, montre que ces dernières sont des variables de dispersion car les individus se disposent de façon aléatoire sur une grande aire selon les axes de l’ACP. Elle serait due à la forte variabilité infra-spécifique en ces composés signalés précédemment. Les deux classes principales obtenues par la CAH ont été identifiées sur la. Elles sont toutes bien séparées sur le graphique des individus, les deux traitements sont donc en accord l’un avec l’autre.

Figure 41: Projection des 30 individus de la station de Biskra sur les axes de l'ACP

En comparant les graphiques des individus et celui des variables, il est possible d’expliquer les différences existantes entre ces différentes classes. En effet, plus un individu corrèle avec une variable, plus il va être proche dans une même zone du graphique. A l’inverse plus un individu est loin d’une variable, moins il est corrélé. Ici les cinq variables correspondent aux six différents composés phénoliques. Un individu contenant en majorité les flavones- flavonols par exemple, sera situé dans la même zone du graphique que la variable flavones- flavonols. La première classe (en verre) contient 18 individus. Elle est divisée en 2 sous-classes d’après la figure 38, cette classe se situe entre -2 et 2.5 sur la première composante (F1) et entre -2 et 2 sur la seconde composante (F2). C’est ainsi corrèle plus avec C-glycosides (la plupart des individus) mais peu avec les anthocyanes (quelques individus). Au sein de cette même classe, la plupart des individus de la sous-classe 1a se trouve à l’opposé de toutes les variables elle ne corrèle donc avec aucune de ces variables. Ces individus ne sont donc peu ou pas riches en ces composés phénoliques. La sous classe 1b corrèle fortement avec les anthocyanes et les C-glycosides.

Résultats et discussions

La deuxième classe (en rouge) est composée de 12 individus. Elle est divisée en 3 sous- classes d’après la figure 38, cette classe se situe entre -1 et 2 sur la première composante (F1) et entre -3 et 1 sur la seconde composante (F2). Ainsi la classe corrèle plus avec les aglycones libres, les flavones- flavonols et les hétérosides flavoniques. Elle corrèle également avec les anthocyanes et assez peu avec les C-glycosides. Au sein de cette classe, la sous classe 2a corrèle avec les aglycones libres, les flavones- flavonols, les hétérosides flavoniques et les anthocyanes, en revanche elle ne corrèle pas ou très peu avec les C-glycosides. La sous classe 2b corrèle plus fortement avec les anthocyanes. Enfin, l’individu 28 qui représente la 3ème sous classe 2c, se détache des autres individus de la seconde classe. Il corrèle encore plus fortement avec les aglycones libre et les hétérosides flavoniques, il possède donc globalement le même profil que les autres populations de la classe mais avec des proportions plus importantes en ces deux classes de composés phénoliques.

Tableau 11: Corrélations entre les variables polyphénoliques étudiées pour la station de Tamanrasset Flavones- Aglycones Anthocyanes C-glycosides Hétérosides flavonols libres flavoniques Flavones- flavonols 1 -0.29 -0.05 0.07 -0.06 Aglycones libres -0.29 1 0.14 -0.29 0.02 Anthocyanes -0.05 0.14 1 -0.05 0.03 C-glycosides 0.07 -0.29 -0.05 1 0.26 Hétérosides flavoniques -0.06 0.02 0.03 0.26 1

Pour la station de Tamanrasset, les hétérosides flavoniques sont corrélées positivement avec les aglycones libres (R= 0.26), les anthocyanes (R= 0.03) et les C-glycosides (R= 0.02). Alors que les flavones- flavonols sont corrélées positivement avec les C-glycosides (R= 0.07) uniquement. Ce qui indique que ces quatre fractions de composés phénoliques sont sur la même voie métabolique. Donc, il n’existe pas de compétition dans les éléments précurseurs entre les quatre fractions polyphénoliques dans la voie de biosynthèse. Cependant, il ya une corrélation négative qui lié les flavones- flavonols, les aglycones libres (R= 0.26), les anthocyanes et les hétérosides flavoniques. Ce qui implique que ces trois fractions phénoliques ne sont pas sur la même voie métabolique que les flavones- flavonols. C'est-à-dire il y a une compétition dans l’utilisation des précurseurs pour la synthèse de l’un ou l’autre composé (Tableau 11). La projection des variables sur les axes de l’ACP schématise la corrélation entre ces 5 variables dans la station de Tamanrasset représente dans la figure 42.

Résultats et discussions

Figure 42: Projection des variables étudiées sur les axes d’ACP dans la station de Tamanrasset Avec la projection des variables sur les axes de l’ACP. On pourrait assimiler le schéma obtenu à celui représentant aux les voies métaboliques des composés phénoliques étudiés. La projection des 30 individus de la station de Tamanrasset en fonction des différentes variables: les flavones- flavonols, les aglycones libres, les anthocyanes, les C-glycosides et les hétérosides flavoniques (Figure 43), montre que les individus se disposent de façon aléatoire (nuage dispersé) sur l'axe de l'ACP ce qui indique la présence d'une forte variabilité au sein de la population analysée. Les trois classes principales obtenues précédemment par la CAH ont été identifiées sur cette même figure. Elles sont toutes bien séparées sur le graphique des individus, les deux traitements sont donc en accord l’un avec l’autre.

Figure 43: Projection des 30 individus de la station de Tamanrasset sur les axes de l'ACP

Résultats et discussions

En comparant le graphique des individus et celui des variables, il est possible d’expliquer les différences existantes entre ces différentes classes. La première classe (en jaune) contient 17 individus. Elle est divisée en 2 sous-classes d’après la figure 39. Cette classe se situe entre -2.5 et 1.5 sur la première composante (F1) et entre -3 et 1 sur la seconde composante (F2). C’est ainsi la classe qui corrèle le plus avec les C- glycosides et les hétérosides. Elle corrèle également avec les flavones- flavonols et assez peu avec les anthocyanes et les aglycones libres. Au sein de cette classe, la sous-classe 1d corrèle fortement avec les flavones- flavonols. Elle corrèle également faiblement avec les aglycones libres et les anthocyanes. La sous classe 1e corrèle fortement avec les C-glycosides et les hétérosides flavoniques. La deuxième classe est composée de 7 individus. Elle est divisée en 2 sous-classes d’après la figure 39. Cette classe se situe entre -2.5 et 2 sur la première composante (F1) et entre -1.5 et 0 sur la seconde composante (F2). C’est ainsi la classe qui corrèle fortement avec les C- glycosides et les hétérosides flavoniques.

Enfin, la troisième classe contient 6 individus. Elle se trouve à l’opposé de toutes les variables, se situe entre 1 et 2 sur la première composante (F1) et entre -1 et 1 sur la seconde composante (F2). Elle ne corrèle donc avec aucune de ces variables. Ces individus possèdent donc très peu de ces composés phénoliques, à l’exception de l’individu 28 qui corrèle fortement avec les flavones-flavonols.

Résultats et discussions

3.3.2 Analyses qualitatives des composés phénoliques par chromatographies

3.3.2.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) 3.3.2.1.1 Identification des aglycones flavoniques par CCM monodimensionnelle Pour une caractérisation partielle de l’ExEth (fraction flavones- flavonols et les acides phénoliques) des parties aériennes de M. deserti De Noé, une CCM monodimensionnelle a été réalisée. Le système de solvant utilisé (benzène/ méthanol/ méthyle éthyle cétone; 40/30/30: v/v/v), la phase stationnaire le polyamide DC11 monté sur plaque d’aluminium du commerce, ont permis d’obtenir une très bonne séparation chromatographique en utilisant deux standards qui sont la quercétine et la lutéoline. L’observation des plaques sous lumière UV à 365 nm nous a permis de mettre en évidence la présence de 05 tâches aussi bien pour l’ExEth de Ain Zaatout que pour l’ExEth de Afilal (Figure 44), de fluorescences différentes à des distances variables (Rf).

Nous avons reproduit le chromatogramme monodimensionnel des aglycones flavoniques à partir d’un calque de la plaque afin de mieux observer le sens et le niveau de migration des composés. Ces spots sont identifiés par comparaison des Rf et des fluorescences sous UV à ceux des témoins utilisés dans les mêmes conditions expérimentales et à ceux de la bibliographie (Lebreton, 1967; Ouafi, 2007).

Figure 44: Schéma du chromatogramme monodimensionnel sur CCM de polyamide des aglycones flavoniques obtenus par fractionnement de l’ExEth (contenant les flavones- flavonols et les acides phénoliques) de M. deserti De Noé

Résultats et discussions

En effet, nous pouvons déduire qu’il n’existe pas de différence qualitative entre les individus des deux stations avec les résultats de la CCM. C’est pour cette raison que dans cette partie nous allons traiter directement l’espèce M. deserti De Noé. Les résultats de la chromatographie sur CCM monodimensionnelle de l’ExEth sont résumés dans le tableau 12, avec les caractéristiques chromatographiques des composés isolés à savoir les facteurs de rétentions (Rf), leurs fluorescences aux UV à 365 nm. Tableau 12: Caractéristiques chromatographiques des composés de l'ExEth des parties aériennes de M. deserti De Noé identifiés par CCM monodimensionnelle

Tâches Fluorescence UV Rf Composés correspondant 1 Jaune 0.24 Quercétine 2 violet 0.31 Lutéoline 3 Jaune 0.36 Isorhamnétine 4 Violet clair 0.59 Tricine 5 Violet 0.81 Apigénine 6 Rouge orange 0.90 Chlorophylles a et b A partir du tableau 12, nous notons la présence de trois flavones (violette), de deux flavonols (jaune) et les chlorophylles a et b dans l’ExEth. Les flavones sont représentées par l’apigénine, la lutéoline et la tricine tandis que les flavonols sont représentés par la quercétine et l’isorhamnétine. 3.3.2.1.2 Identification des C-glycosides par CCM bidimensionnelle

L'étude qualitative des C-glycosides se fait par fractionnement de l’ExButOH (fraction des anthocyanes et C-glycosides) des parties aériennes de M. deserti De Noé sur CCM de polyamide grâce à la migration ascendante de deux solvants. Un premier solvant organique qui fait migrer les substances selon le squelette flavonique et un deuxième solvant aqueux qui fait migrer les substances selon le nombre de sucres greffés sur le squelette flavonique. L’observation des chromatogrammes sous UV à 365 nm a révélé la présence de 04 tâches (Figure 45). Par comparaison avec les Rf des témoins et ceux de standards (Ouafi, 2007), nous avons pu identifier ces dernières.

Figure 45: Schéma du chromatogramme bidimensionnel sur CCM de polyamide des C glycosides flavoniques obtenus par fractionnement de l’ExButOH de M. deserti De Noé

Résultats et discussions

Les caractéristiques chromatographiques des C-glycosides flavoniques contenues dans l’ExButOH obtenus par CCM bidimensionnelle sont mentionnés dans le tableau 13. Tableau 13: Résultats de la séparation par CCM bidimensionnelle de l’ExButOH des parties aériennes de M. deserti De Noé

Tâches Fluorescence UV Rf1 Rf2 Composés correspondants 1 Violet 0.52 0.30 Di-C-apigénine (dioside d’apigénine) 2 Violet 0.49 0.35 Di-C- lutéoline (dioside de lutéoline) 3 Violet 0.52 0.69 Mono-C-apigénine (vitexine) 4 Violet 0.49 0.70 Mono-C-lutéoline (orientine)

Rf1 : rapport frontal de la migration organique; Rf2 : rapport frontal de la migration aqueuse

Le chromatogramme des C-glycosides flavoniques de M. deserti De Noé a montré la présence de quatre C-glycosides: deux diosides et deux monosides. Ces représentent les formes C- glycosidiques de la lutéoline et de l’apigénine. Ceci à été révélé par la migration dans le solvant organique de leurs génine. Dans le solvant aqueux les composés migrent en fonction de leur poids moléculaire. C’est ce qui explique que les monosides migrent plus vite que les diosides.

3.3.2.2 Chromatographie sur papier (CP)

3.3.2.2.1 Identification des anthocyanes Le fractionnement de l’ExButOH de M. deserti De Noé sur papier Whatman N°1 en présence du solvant Forestal et la révélation des chromatogrammes au Visible a fait apparaitre une seule tâche de couleur rouge pâle. Le rapport frontal calculé est de 0.60. Selon Harborne (1993) et le témoin utilisé, ses caractéristiques sont ceux de la cyanidine.

3.3.2.3 Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) L’analyse qualitative des extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé en CLHP permet l’identification précise et une bonne séparation de ses substances. Les extraits polyphénoliques et les substances étalons (standards) ont été analysés en CLHP dans les mêmes conditions expérimentales. L’identification des aglycones flavoniques (flavones-flavonols), des acides phénoliques, des aglycones libres, des C-glycosides et des hétérosides favoniques a été réalisée par la comparaison de leurs temps de rétention avec celui des substances de référence correspondantes (standards) (Annexe 3).

3.3.2.3.1 Identification des flavones-flavonols et des acides phénols L'analyse qualitative par CLHP de l'ExEth de M. deserti De Noé contenant les aglycones flavoniques et les acides phénols après hydrolyse acide à 365 nm en mode gradient d'élution, nous a permis de révéler et d'identifier les aglycones flavoniques sur le profil CLHP obtenu (Figure 46).

Résultats et discussions

Figure 46: Chromatogramme de CLHP d’ExEth de M. deserti De Noé représentant les aglycones flavoniques, détectés à 365 nm en mode gradient d'élution

La comparaison des temps de rétention enregistrés dans le chromatogramme d’ExEth avec ceux des standards disponibles, injectés dans le même temps et les mêmes conditions, a permis d’identifier trois flavonols; quercétine, kaempférol et isorhamnétine, qui sont présents à une teneur relative totale de 17.569%, deux flavones; lutéoline et apigénine avec une teneur relative totale de 15.59% et une flavanone; hespéridine à une teneur relative totale de 1.20% (Tableau 14). Tableau 14: Caractéristiques chromatographiques des flavones-flavonols de l'ExEth identifiés par CLHP à 365 nm Pic Temps de rétention (min) Composé identifié Teneurs relatives (%) 1 12.487 Quercétine 2.687

2 12.869 Lutéoline 5.241 3 13.519 Kaempférol 11.640 4 14.524 Apigénine 10.352 5 14.819 Isorhamnétine 3.242 6 15.119 Hespéridine 1.207

D’après ces résultats, nous constatons que la plante M. deserti De Noé est à dominance flavonols que flavones. Le changement de la longueur d'onde à 260 nm (longueur d’onde caractéristique des acides phénoliques), nous a permis d'avoir un nouveau profil CLHP pour le même extrait (Figure 47).

Résultats et discussions

Figure 47: Chromatogramme de CLHP d’ExEth de M. deserti De Noé représentant les acides phénoliques, détectés à 260 nm en mode gradient d'élution

La comparaison des temps de rétention des pics avec ceux des standards, nous a permis de détecter la présence de 05 acides phénoliques; deux acides hydroxybenzoïques (acide iso- vanillique et acide syringique) et trois acides hydroxycinnamiques (acide caféique, acide férulique et acide trans-cinnamique) et un aldéhyde aromatique; la vanilline (4-hydroxy-3- méthoxybenzaldéhyde) qui permet entre autre de produire l’acide vanillique. Leurs caractéristiques chromatographiques sont regroupées dans le tableau (15). Tableau 15: Caractéristiques chromatographiques des acides phénoliques de l'ExEth identifiés par CLHP à 260 nm

Pic Temps de Rétention (min) Composé identifié Teneurs relatives (%) 1 7.122 Acide caféique 3.071 2 7.300 Acide iso-vanillique 1.254 3 8.732 Vanilline 0.503 4 9.343 Acide férulique 1.804 5 9.644 Acide syringique 2.689 6 13.894 Acide trans-cinnamique 1.989

D’après ces résultats, nous concluons que M. deserti De Noé présente une légère dominance d’acides phénoliques de la série cinnamique avec une teneur relative totale de 6.86% et 3.94% pour les acides de la série benzoïque. 3.3.2.3.2 Identification des aglycone libres

L'analyse qualitative de l’ExAgL contenant les aglycones libres par CLHP à la longueur d'onde 365 nm nous a permis d'obtenir le profil représenté dans la figure 48.

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Figure 48: Chromatogramme de CLHP d’ExAgL de M. deserti De Noé représentant les aglycones libres, détectés à 365 nm en mode gradient d'élution La comparaison des temps de rétention avec ceux des standards permet l’identification de 06 composés flavoniques (Tableau 16);  Trois flavonols: quercétine, kaempférol et isorhamnétine.  Deux flavones: lutéoline et apigénine.  Une flavanone: hespéridine. Tableau 16: Caractéristiques chromatographiques des aglycones libres de l'ExAgL de M. deserti De Noé identifiés par CLHP à 365 nm

Pic Temps de rétention (min) Composé identifié Teneurs relatives (%) 1 12.576 Quercétine 0.464 2 12.788 Lutéoline 1.778 3 13.437 Kaempférol 2.144 4 14.443 Apigénine 3.133 5 14.726 Isorhamnétine 1.017 6 15.524 Hespéridine 2.448

A partir des données du tableau, nous pouvons déduire que les flavones sont dominants à l'état libre avec une somme des teneurs relatives totale égale à 4.91% par rapport à celle des flavonols libres avec 3.62%. Nous remarquons que les six composés présents dans l’ExEth après hydrolyse sont aussi présents dans l’ExAgL obtenu sans hydrolyse, ce qui signifie qu’ils existent dans cette plante à l’état libre et O-glycosides avec une légère prédominance de l’état combiné (glycosylé) (Tableau 17).

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Tableau 17: Teneurs absolues des aglycones obtenus après hydrolyse dans l’ExEth et sans hydrolyse dans l’ExAgL de M. deserti De Noé révélées identifiées par CLHP à 365 nm

Teneurs relatives (%) Composé identifié Après hydrolyse Sans hydrolyse Quercétine 2.687 0.464 Lutéoline 5.241 1.778

Kaempférol 11.640 2.144

Apigénine 10.352 3.133 Isorhamnétine 3.242 1.017 Hespéridine 1.207 2.448

En effet, les teneurs relatives sont plus élevées sur le profil des aglycones après hydrolyse à l’exception de l’hespéridine ou la teneur est plus élevée sur le profil sans hydrolyse (aglycones libres).

3.3.2.3.3 Identification de C-glycosides

Le passage en CLHP de l’ExButOH contenant les C-glycosides à 365 nm, nous a permis d’obtenir le profil illustré dans la figure 49.

Figure 49: Chromatogramme CLHP de l’ExButOH de M. deserti De Noé représentant les C- glycosides, détectés à 365 nm en mode gradient d'élution Le profil fait apparaître 06 pics correspondants à des C-glycoflavonoides, dont les caractéristiques chromatographiques sont résumées dans le tableau 18.

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Tableau 18: Caractéristiques chromatographiques des C-glycosides de l'ExButOH de M. deserti De Noé identifiés par CLHP à 365 nm

Pics Temps de rétention (min) Composés identifié Teneurs relatives (%) 1 10.731 Naringénine-6-C-glucoside 4.635 2 11.077 Naringénine di-C-glucoside 3.786 3 14.406 Orientine (lutéoline-8-C-glucoside) 1.382 4 14.682 Iso-orientine (lutéoline-6-C-glucoside) 1.233 5 17.675 Vitexine (apéginine-8-C-glucoside) 1.216 6 17.881 Iso-vitexine (apéginine-6-C-glucoside) 0.429

Les formes glycosidiques conjuguées ayant résistées à l’hydrolyse acide se trouvent dans l’ExButOH. La comparaison des temps de rétention avec ceux des standards permet l’identification de 06 C-glycosides. A partir du tableau 19, nous pouvons dire que les C- glycosides identifiés ont pour génine des flavones et flavanones. Ce sont donc des C- glycoflavones et C- glycoflavanones, dont nous en avons identifiés:  Deux flavones mono-C-glycosylés et leurs isomères: orientine et iso-orientine, vitexine et iso-vitexine. La première molécule est un C-glucoside de lutéoline et l’apigénine pour la seconde.  Deux flavanones: naringénine-6-C-glucoside (mono-C-glycosylés) et naringénine di- C-glucoside (di-C-glycosylés).

3.3.2.3.4 Identification des hétérosides flavoniques

Le passage en CLHP de l'ExHét contenant les hétérosides flavoniques à 365 nm dans le mode gradient d'élution nous a permis d'obtenir le profil représenté dans la figure 50.

Figure 50: Profil chromatographique des hétérosides flavoniques (ExHét) de M. deserti De Noé détectés par CLHP à 365 nm en mode gradient d'élution

Les caractéristiques chromatographiques des hétérosides flavoniques révélés sur le profil sont résumées dans le tableau 19.

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Tableau 19: Caractéristiques chromatographiques des hétérosides flavoniques de l’ExHét de M. deserti De Noé identifiés par CLHP à 365 nm

Pics Temps de rétention (min) Composés identifié Teneurs relatives (%) 1 8.440 Rutine 1.099 2 9.075 Cynaroside (gluco 7-lutéoline) 1.807 3 10.318 Naringénine-6-C-glucoside 3.986 4 11.575 Naringénine di-C-glucoside 1.794 5 13.786 Monoside de kaempférol 2.267 6 14.405 Orientine 3.289 7 14.692 Iso-orientine 1.643 8 17.696 Vitexine 4.143 9 17.897 Iso-vitexine 1.537

La comparaison des temps de rétention avec ceux des standards disponibles permet l’identification de 9 hétérosides:  Six C-glycosides: naringénine-6-C-glucoside, naringénine di-C-glucoside, orientine, iso-orientine, vitexine et iso-vitexine.  Trois O-glycosides: rutine, cynaroside (gluco 7-lutéoline) et le monoside de kaempférol. Pour conclure, il en ressort que la CLHP à révélé la présence d’une flavanone (hespéridine), deux acides phénols de la série benzoïque (acide iso-vanillique et acide syringique), trois acides phénols de la série cinnamique (acide caféique, acide férulique et acide trans-cinnamique), un aldéhyde aromatique (vanilline), quatre C-glycosides (naringénine-6-glucoside, naringénine di-C-glucoside, iso-orientine et iso-vitexine) et trois O- glycosides (rutine, cynaroside et monoside de kaempférol) non révélés par la CCM. Nous avons remarqué que certains composés détectés par la CCM ne l’ont pas été par la CLHP c’est le cas de la tricine. En effet, nous avons injecté la tricine en CLHP et son pic ne correspondt à aucun composé du profil des aglycones flavoniques. Le spot révélé pourrait être celui d’une flavanone entre autre l’hespéridine. Nous pouvons conclure que les deux techniques chromatographiques sont complémentaires mais la CLHP reste la plus fiable. En comparant les résultats obtenus dans notre présent travail avec ceux de la bibliographie, nous constatons que cette étude confirme la présence de l’apigénine, la quercétine, le kaempférol, la rutine et l’acide trans-cinnamique ainsi l’absence de l’acide gallique, l’acide 4-hydroxybenzoïque et le 4-méthyl-catéchol, déjà identifiés par Zaabet et al. (2011) par CLHP et Ghedadba et al. (2015) par CCM, avec en plus la mise en évidence pour la première fois de la présence d’aglycones libres à l’état natif chez M. deserti De Noé.

En plus, 15 nouveaux métabolites dans la plante ont été révélés pour la première fois: lutéoline, isorhamnétine, hespéridine, vanilline, acide iso-vanillique, acide syringique, acide caféique, acide férulique, naringénine 6-glucoside, naringénine di-C-glucoside, cynaroside, orientine, vitexine et leurs isomères (iso-orientine et iso-vitexine).

En conclusion, notre plante est très riche en composés phénoliques. En effet nous avons détecté un grand nombre de composés appartenant à différentes classes: des flavones- flavonols (libres et combinés à des sucres), des hétérosides flavoniques natifs en majorité des C-glycosides et des acides phénols (Annexe 4).

Résultats et discussions

4. Recherche des activités biologiques de M. deserti De Noé

4.1 Tests toxicologiques

4.1.1 Etude de la toxicité aiguë chez les souris

L’étude de la toxicité aiguë de l’infusé à des doses croissantes de 300 à 11000 mg/ kg de p.c. et des trois extraits polyphénoliques; ExEth (fraction flavones- flavonols et les acides phénols), ExButOH (fraction anthocyanes et C-glycosides) et ExHét (fraction hétérosides flavoniques), à des doses croissantes de 50 à 500 mg/kg de p.c. des parties aériennes de M. deserti De Noé par voie orale ne montre aucun changement significatif dans le comportement, la respiration, les effets cutanés, les réponses du système nerveux sensoriels et les effets gastro-intestinaux chez les souris mâles et femelles. Au bout de 14 jours, aucune mort n’a été enregistrée chez les différents lots traités par l’infusé et les trois extraits polyphénoliques, ce qui n’a pas permis la détermination de la DL50. Cette dernière est donc supérieure à 11000 mg/ kg de p.c. pour l’infusé, et supérieure à 500 mg/ kg de p.c. pour les différents extraits polyphénoliques.

En toxicologie, il est connu qu’une substance pharmacodynamique dont la DL50 est inférieure à 5 mg/ kg de p.c. est ultra toxique. Celle présentant une DL50 comprise entre 5 et 50 mg/kg de p.c. est une substance extrêmement toxique, celle dont la DL50 dans l’intervalle de 50 et 500 mg/kg de p.c. est considérée comme très toxique et celle dont la DL50 se situe dans l’intervalle 500 à 5000 mg/kg de p.c. est modérément toxique. La substance ayant une DL50 se situant entre 5000 et 15000 mg/kg de p.c. est légèrement toxique et enfin celle dont la DL50 est supérieure à 15000 mg/ kg de p.c. est dite non toxique (Diezi, 1989). Selon cette classification, l’infusé de M. deserti De Noé administré par voie orale est légèrement toxique. Cependant, les trois extraits polyphénoliques administrés par la même voie sont modérément toxique. Ce résultat est semblable à celui de Ghedadba et Hambaba (2016), qui ont montre que la LD50 de l’extrait méthanolique des feuilles de M. deserti De Noé est supérieure à 5000 mg/ kg de p.c. 4.1.2 Etude de la toxicité subaiguë de l’infusé de M. deserti De Noé chez les rats

4.1.2.1 Effets sur les signes généraux L'étude de la toxicité subaiguë de l’infusé de M. deserti De Noé chez les rats mâles et femelles avec des doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. n’a montré aucun changement au niveau de la nature des selles, des urines, des modifications de l’aspect général des rats (pilosité, peau, état des yeux, des oreilles et de la bouche) par rapport aux rats témoins. Les animaux n’ont pas fait de diarrhée, ni d’hématurie, ni de mouvements non coordonnées, ni de détresse respiratoire durant la période d’étude. Egalement, aucun mort n'a été signalé pendant toute la durée du traitement pour les deux sexes.

Résultats et discussions

4.1.2.2 Effets sur l’évaluation pondérale

Afin de déterminer l’influence de notre infusé sur le poids corporel et la croissance des rats, nous avons suivi l’évolution du poids corporel, des rats témoins et traités pour les deux sexes, périodiquement tout au long de l’expérimentation (Figure 51).

Figure 51: Histogramme des évaluations de poids corporel des rats en fonction du temps de différentes doses de l’infusé de M. deserti De Noé administré par voie orale. A: Rats mâles témoins et traités, B: Rats femelles témoins et traités Les valeurs sont des moyennes ± DS, n=6 (3 mâles et 3 femelles), ns: non significatif, *p<0.05; **p<0.01 et ***p<0.001 comparé au groupe de témoin Il ressort de cette figure que, à toutes les doses étudiées, l’infusé a modifié de façon significative (p<0.05) l’évolution de la masse corporelle des rats en fonction du temps pour les deux sexes par rapport aux témoins. Les variations du poids corporel des animaux mâles et femelles après 28 jours de traitement avec l’infusé de M. deserti De Noé, sont reportés dans la figure 52. Ces variations par rapport au 1er jour sont exprimées en % et calculées selon la formule suivante: er Variation du poids corporel (%) = (PJ – PJ1) x 100/ PJ1, dont: PJ1 : poids corporel au 1 jour et PJ : poids corporel au jour J.

Résultats et discussions

A B

Figure 52: Les variations du poids corporel des rats durant les 28 jours du traitement subaiguë par l'infusé de M. deserti De Noé A: Rats mâles témoins et traités, B: Rats femelles témoins et traités Les valeurs sont des moyennes ± DS, n=6 (3 mâles et 3 femelles)

D’après les résultats obtenus, nous avons enregistré un gain régulier significatif (p<0.001 par rapport au J1) du poids corporel des rats mâles témoins de l’ordre de 28.6% au J28. Un gain irrégulier (p<0.001) du poids corporel est noté chez les rats femelles témoins avec un maximum au J24 de l’ordre de 9.72% par rapport au J1. Cependant, l’administration orale de l’infusé de M. deserti De Noé à des doses faibles de 250 et 500 mg/kg p.c. pendant 28 jour à permis de révéler des augmentations significatifs (p<0.001) au niveau du poids plus importantes que celle d’une dose supérieure de 1000 mg/kg p.c. chez les rats mâles. Par contre, cette dernière dose produit une augmentation significative (p<0.001) plus importante du poids par rapport aux faibles doses (250 et 500 mg/kg p.c.) chez les rats femelles par comparaison au J1. En général, les pourcentages des augmentations par rapport au 1er jour étaient minimales au première semaine pour les trois doses administrées 250, 500 et 1000 mg/kg p.c.; de 3.2 %, 4.04 % et 4.25 % chez les rats mâles (Figure 52A) et de 2.66%, 0.28% et 0.99% chez les rats femelles (Figure 52B) respectivement, alors qu'ils ont atteints son maximum dans cette expérience durant la dernière semaine, prenant les valeurs de 18.79%, 18.19% et 10.85% chez les mâles et de 13.32%, 7.28% et 16.85% chez les femelles. Par contre, nous avons enregistré un arrêt de croissance chez les rats soumis à une injection de la dose 1000 mg/kg p.c. pour les rats mâles par 0% au J4 et à une injection de la dose 500 mg/kg p.c. pour les rats femelles par -0,34 % et -0.5 % au J4 et J20 respectivement. Le changement du poids corporel est utilisé comme un indicateur des effets indésirables des composés chimiques (Hilaly et al., 2004). Cette hausse du poids chez les rats mâles ou femelles pourrait être liée à une stimulation de l’appétit des animaux par l’infusé, et qui aurait pour conséquence une augmentation de leur consommation de nourriture, mais aussi par les possibilités d’interactions dose/absorption et par l’augmentation de la quantité de nourriture absorbée. L’augmentation du poids corporel au cours des 28 jours de traitement quotidien suggère que l'administration répété par voie orale de l’infusé de M. deserti De Noé a des effets sur la croissance du poids des rats mâles et femelles. Des analyses complémentaires doivent être effectuées.

Résultats et discussions

4.1.2.3 Effets sur les poids relatifs des différents organes L’observation macroscopique des organes internes des rats ayant reçu l’infusé de M. deserti De Noé à la fin de la période d’observation a révélé qu’il n’y a pas de changements dans la forme et la taille. Le poids relatif des organes (poids de l’organe/ poids du rat × 100) indique l’évolution pondérale de l’organe par rapport à l’organisme. Le tableau 20 rapporte les poids relatifs des organes (reins, poumons, cœur et foie) prélevés après administration de l’infusé de M. deserti De Noé pendant 4 semaines chez les rats mâles et femelles.

Tableau 20: Poids relatifs de certains organes chez les rats ayant reçu l’infusé de M. deserti De Noé Poids relatifs (g/kg de p.c.) Groupes Reins Poumons Cœur Foie Rats mâles Témoin 0.59 ± 0.07 0.75 ± 0.1 0.34 ± 0.06 4.73 ± 0.6 ns ns ns ns 250 mg/kg 0.68 ± 0.05 0.73 ± 0.07 0.34 ± 0.05 4.85 ± 0.1 Infusé * ns ns ns 500 mg/kg 0.76 ± 0.07 0.72 ± 0.04 0.35 ± 0.02 3.93 ± 0.1 1000 mg/kg 0.71 ± 0.02ns 0.80 ± 0.07ns 0.32 ± 0.01ns 4.61 ± 0.1ns Rats Femelles Témoin 0.68 ± 0.05 1.07 ± 0.1 0.31 ± 0.04 4.12 ± 0.1 ns ns ns ** 250 mg/kg 0.61 ± 0.03 0.92 ± 0.08 0.26±0.01 3.27 ± 0.2 Infusé ns * ns ** 500 mg/kg 0.64 ± 0.03 0.78 ± 0.6 0.33 ± 0.015 3.48 ± 0.05 ns ** ns * 1000 mg/kg 0.59 ± 0.004 0.60 ± 0.003 0.32 ± 0.001 3.59 ± 0.1 Les valeurs sont présentés moyenne ± DS, n=6 (3 mâles et 3 femelles), ns: non significative, *p<0.05 et **p<0.01 par rapport au témoin Au vue de ce tableau, les poids relatifs du foie, cœur et poumons n’ont pas été significativement (p>0.05) modifiés par rapport au groupe témoin pour les rats mâles. Néanmoins, Il a été observé chez ces rats mâles traités par l’infusé à la dose de 500 mg/kg de p.c. une augmentation significative (p<0.05) du poids relatif des reins. Par ailleurs, l’évaluation des poids relatifs des reins et du cœur n’a révélé aucune différence significative (p>0.05) entre les groupes témoins et traitées chez les rats femelles. Cependant, l’administration de l’infusé par voie orale aux doses de 500 et 1000 mg/kg p.c. a provoqué une diminution significative (p<0.05 et p<0.001 respectivement) du poids relatif des poumons en fonction de la dose administrée, ainsi on a observé une réduction significative (p<0.05) dans la masse relative du foie pour les trois doses administrées (250, 500 et 1000 mg/kg) chez les femelles. Ces résultats suggèrent que l'infusé de M. deserti De Noé a des effets sur les organes mesurés. Généralement, le changement du poids des organes internes est un indice de toxicité après l'exposition à une substance toxique (Raza et al., 2002; Teo et al., 2002). L'augmentation du poids des reins chez les rats mâles peut être liée à une congestion par réservation du sang dans les reins (Rasekh et al., 2008). Ces résultats nécessitent cependant, des analyses plus approfondies pour connaître l'effet de l’infusé sur ces organes.

Résultats et discussions

4.1.2.4 Effets sur les paramètres hématologiques

Le tableau 21 présente les valeurs hématologiques des rats mâles et femelles traités pendant 4 semaines par l’infusé de M. deserti De Noé. Il en ressort que les paramètres des GB, HGB, HCT et TGMH chez les deux sexes, VGM et CCMH chez les rats mâles et GR chez les rats femelles n’ont pas significativement (p>0.05) variés par rapport aux rats témoins quelque soit la dose administrée. Cependant, le taux des GR et des PLT chez les rats mâles traités à la dose de 500 mg/kg a augmenté significativement (p<0.05) par rapport aux rats témoins. Néanmoins, le taux de ce dernier a significativement (p<0.001) diminué en fonction des dose administrées chez les rats femelles. Une diminution significative (p<0.05) des VGM est signalé à la dose de 500 mg/kg de p.c., mais à la dose supérieure (1000 mg/kg de p.c.) ce paramètre a augmenté significativement (p<0.001). La CCMH a diminuée significativement (p<0.001) à la dose de 1000 mg/ kg de p.c.

Tableau 21: Effets subaigües de l’infusé de M. deserti De Noé sur quelques paramètres hématologiques

GB GR HGB HCT VGM TGMH CCMH PLT Groupes Rats mâles Témoin 7.96 6.30 13.07 39.07 61.9 20.7 33.47 752.6 ± 0.9 ± 0.4 ± 1.3 ± 4.3 ± 3.6 ± 1.04 ± 0.2 ± 35.5 250 mg/kg 9.40 6.51 13.03 39.83 61.50 20.03 32.57 666.3 ns ns ns ns ns ns ns ns ± 1.5 ± 0.02 ± 0.9 ± 3.1 ± 4.1 ± 1.4 ± 0.6 ± 31.7 500 mg/kg 9.43 7.08 13.9 43.27 61.1 19.6 32.1 942 Infusé ± 3.4ns ± 0.2* ± 1.05ns ± 1.2ns ± 1.1ns ± 1.04ns ± 1.5ns ± 94.1* 1000 mg/kg 5.58 6.52 14.16 40.5 62.13 21.7 34.9 857.6 ± 0.3ns ± 0.1ns ± 1.1ns ± 3.06ns ± 3.8ns ± 1.3ns ± 0.5ns ± 13.3ns Rats femelles Témoin 5.63 7.03 12.9 39.83 56.63 18.33 32.4 1055 ± 0.7 ± 0.5 ± 1.01 ± 3.5 ± 0.8 ± 0.1 ± 0.3 ± 41.6 250 mg/kg 7.03 6.65 12.1 37.5 55.03 18.33 32.3 819.5 ± 0.1ns ± 0.1ns ± 0.09ns ± 0.5ns ± 0.1ns ± 0.3ns ± 0.3ns ± 5.09*** 500 mg/kg 6.3 7.19 ± 12.83 ± 38.86 ± 54.03 ± 17.86 ± 33.03 ± 801.3 ± Infusé ± 4.2ns 0.5ns 0.8ns 2.6ns 0.2* 0.3ns 0.3ns 67.6*** 1000 mg/kg 7.75 ± 7.13 ± 12.1 ± 43.53 ± 71.9 ± 18.96 ± 26.4 ± 648.3 ± 0.3ns 0.8ns 0.2ns 1.7ns 1.5*** 0.2ns 0.3*** 10.4*** Les données sont exprimées par moyenne ± SD, n=6 (3 mâles et 3 femelles), ns: non significative, *p<0.05 et ***p<0.001 par rapport au témoin, GB: globules blancs (x103/mm3), GR: globules rouges (x106/mm3), HGB:

hémoglobine (g/dl), HCT: hématocrite (%), VGM: volume globulaire moyen (fL/cell), TCMH: teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (pg/cell), CCMH: concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (%), PLT: plaquettes (x103/mm3)

Le système hématopoïétique est une des cibles les plus sensibles aux composés toxiques et un indice important de l'état physiologique et pathologique de l'homme et de l'animal (Mukinda et Syce, 2007). Les changements dans ce système ont une plus grande valeur prédictive pour la toxicité humaine, lorsque les données sont déduites des études réalisées sur des animaux (Olson et al., 2000). Dans notre étude, l’augmentation du taux des GR chez les rats mâles traités avec l’infusé de M. deserti De Noé serait bénéfique dans la prévention de l’anémie (Sanogo et al., 2008). L’augmentation ou la diminution du taux des PLT des rats mâles ou femelles traités par

Résultats et discussions rapport aux témoins indique que l’infusé a un effet sur la production des plaquettes. Cet effet est parmi les preuves d'effets toxiques sur l'hématopoïèse. En outre, avec une diminution du nombre des PLT, il y a un risque accru de saignements (Slichter, 2004). Néanmoins, la baisse et la hausse du VGM, chez les rats femelles traitées par l’infusé à la dose de 500 et 1000mg/kg de p.c. respectivement, émet la possibilité d'un changement dans la taille des globules rouges, mais on ne peut pas considérer ce résultats sans recourir à d'autres analyses (Beck, 2009). Enfin, une CCMH en baisse chez les rats femelles traitées par l’infusé à la dose de 1000mg/ kg de p.c. évoque une anémie hypochrome liée à une perturbation du métabolisme du fer. 4.1.2.5 Effets sur les paramètres biochimiques Le foie est la première cible de la toxicité et le premier organe exposé à tout ce qui est absorbé dans l'intestin grêle; il métabolise les substances étrangères à des composés qui peuvent être hépatotoxiques (Rhiouani et al., 2008). Il travaille en association avec les reins pour supprimer les substances toxiques du sang (Tulsawani, 2010). Une étude de la fonction hépatique et rénale peut donc s'avérer utile pour évaluer les effets toxiques des plantes médicinales. Le tableau 22 présenté l’évolution de quelques paramètres biochimiques sériques (AST, ALT, créatinine, cholestérol, triglycérides et glycémie) chez des rats traités par l’infusé de M. deserti De Noé. Nos résultats montrent que l’administration de l’infusé aux rats mâles et femelles pendant 4 semaines ne provoque pas de variations significatives (p>0.05) des taux en AST, en cholestérol total, en triglycérides et en glycémie comparés aux témoins. Notre infusé a été aussi sans effet sur les taux de ALT et de créatinine chez les rats mâles.

L’ALT est une enzyme cytosolique secrétée dans les cellules hépatiques d’où elle est libérée dans le sang en cas de nécrose cellulaire hépatique (Kaneko et al., 1997; Dufour et al., 2000). C’est une enzyme spécifique au foie, ce qui en fait un important indicateur très sensible de l’hépatotoxicité (Al- Habori et al., 2002). Leur augmentation reflète une lésion cellulaire; en particulier au niveau hépatique, cardiaque, rénal ou musculaire (Pratt et Kaplan, 2000; Sanogo et al., 2008). Dans notre étude, l’infusé M. deserti De Noé a provoqué une augmentation significative (p<0.05) du taux d’ALT dans le sang à la dose de 250 mg/kg de p.c. chez les rats femelles. De même, il a baissé significativement (p<0.001) à la dose de 500 mg/kg de p.c. chez le même groupe comparés aux témoins. Ces résultats rejoignent ceux de Ghedadba et Hambaba (2016) qui notent une diminution significative d’ALT chez les rats administrés une fois par l’extrait méthanolique des feuilles de M. deserti De Noé et analysés après 14 jours de l’administration de cet extrait. Nos résultats montrent que l’infusé pourrait avoir un effet hépatoprotecteur chez les rats femelles à la dose de 500 mg/kg de p.c. Par ailleurs, la créatinine constitue un excellent marqueur de la fonction rénale, l’augmentation ou la diminution reflète un dysfonctionnement rénal (Sirwal et al., 2004). Ce taux ne varie pas et reste significativement (p<0.05) stable chez les rats femelles recevant l’infusé de M. deserti De Noé quelque soit la dose administrée, marquant une fonction rénale normale.

Résultats et discussions

Tableau 22: Effets du traitement subchronique sur quelques paramètres biochimiques des rats traités par l'infusé de M. deserti De Noé Infusé Témoin 250 mg/kg 500 mg/kg 1000 mg/kg Rats mâles ALT 85 ± 12.16 109 ± 9.53ns 56.66 ± 7.7ns 79.33 ± 13.4ns AST 133 ± 28.1 148 ± 31.4ns 141.66 ± 11.01ns 130.33 ± 3.51ns Créat 6.79 ± 1.04 5.7 ± 0.3ns 7.11 ± 1.1ns 6.74 ± 0.7ns Chol 0.39 ± 0.1 0.57 ± 0.06ns 0.53 ± 0.06ns 0.48 ± 0.07ns TG 0.63 ± 0.8 0.54 ± 0.1ns 0.5 ± 0.07ns 0.63 ± 0.1ns Glyc 1.29 ± 0.5 1.04 ± 0.06ns 0.74 ± 0.1ns 0.68 ± 0.1ns Rats femelles ALT 91.66 ± 1.1 102.33 ± 4.9* 63.33 ±4.5*** 87 ± 2.6ns AST 159.66 ± 2.5 164.66 ±19ns 161.66 ± 1.1ns 152 ± 1.7ns Créat 7.83 ± 0.2 7.03 ± 0.05** 6.06 ± 0.1*** 7.1 ± 0.09** Chol 0.71 ± 0.1 0.75 ± 0.005ns 0.75 ± 0.07ns 0.56 ± 0.01ns TG 0.78 ± 0.1 0.68 ± 0.2ns 0.65 ± 0.1ns 1.003 ± 0.025ns Glyc 0.94 ± 0.2 1.2 ± 0.3ns 0.84 ± 0.02ns 0.42 ± 0.02ns Les données sont exprimées par moyenne ± DS, n=3 (3 mâles et 3 femelles), ns: non significative, *p<0.05 **p<0.01 et ***p<0.001 par rapport au témoin, ALT: alanine aminotransférase (UI/l), AST: aspartate aminotransférase (UI/l), Créat: Créatinine (mg/l), Chol: Cholestérol (g/l), TG: triglycéride (g/l), Glyc: glycémie (g/l)

Au regard donc des résultats obtenus, nous pouvons déduire que notre produit s’est avéré non toxique pour la majorité des paramètres testés, donc n’a pas d’influence sur la qualité et la fonction sanguine, ni sur les organes vitaux comme le foie et les reins.

Résultats et discussions

4.2 Activité anti-inflammatoire de M. deserti De Noé chez les souris

M. deserti De Noé est une plante utilisée par la population locale de Biskra pour traiter l’inflammation. Cette étude a pour but d’évaluer au laboratoire l’activité anti-inflammatoire des parties aériennes de M. deserti De Noé. Les expériences ont été réalisées sur le modèle de l’œdème aiguë de la patte de souris induit par la carragénine à 1%. La réponse inflammatoire induite par la carragénine a été décrite chez les rats en 1962 par Winter et al. et par Levy en 1969 chez les souris. C’est le modèle expérimental standard pour l’étude de l’inflammation aiguë (Magaji et al, 2008; Patel et al., 2010). Nous avons testé sur ce modèle l’infusé aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. et trois extraits polyphénoliques; ExEth, ExButOH et ExHét chacun aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c. en administration par voie orale. Les résultats obtenus ont été comparés à celle de l'acide acétylsalicylique (AAS) comme un anti-inflammatoire non stéroïdiens et à celui du témoin. Après administration orale de l’eau physiologique, la carragénine entraîne une augmentation remarquable du poids de la patte des souris témoins de 26% à 3h. L’administration orale de l’AAS à la dose de 50 mg/kg de p.c. prévient de façon non significative (p>0.05) l’augmentation du poids de la patte de souris de 17.66% par comparaison au témoin. Cependant, l’administration orale de l’infusé de M. deserti De Noé aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. prévient de façon significative (p<0.05) l’œdème de la patte de souris au bout de 3h (% œdème respectifs de 23.08%, 20.6% et 14.55%). Des résultats similaires de l’infusé à la dose de 500 mg/kg ont été obtenus avec l’ExEth à la dose de 100 mg/kg de p.c. (% œdème est de 20.98%). L’ExButOH à la dose de 300 mg/kg de p.c. des parties aériennes de M. deserti De Noé est plus efficace que l’infusé et l’ExEth tendis que l’ExHét à la dose de 100 mg/kg de p.c. est le moins efficace dans la prévention de l’œdème aiguë de la patte de souris (25.23%) (Tableau 23).

Tableau 23: Effets de l’infusé, des différents extraits phénoliques de M. deserti De Noé et d’AAS sur l’œdème induit par la carragénine à 1 %

Dose (mg/kg Traitement M (PPG) (g) M (PPD) (g) % Œdème de p.c.) Témoin - 0.1096 ± 0.129 0.087 ± 0.005 26.00 AAS 50 0.1059 ± 0.012ns 0.0904 ± 0.01ns 17.66 250 0.1381 ± 0.03* 0.1122 ± 0.021** 23.08 Infusé 500 0.1656 ± 0.01*** 0.1373 ± 0.009***$ 20.60 1000 0.1527 ± 0.001***$ 0.1333 ± 0.013***$ 14.55 100 0.1453 ± 0.019*$ 0.1201 ± 0.011***$ 20.98 ExEth 300 0.1254 ± 0.012ns 0.1088 ± 0.013ns 15.25 100 0.148 ± 0.01***$ 0.124 ± 0.007***$ 19.35 ExButOH 300 0.1335 ± 0.011ns 0.1196 ± 0.009***$ 11.62 100 0.1588 ± 0.023***$ 0.1268 ± 0.011***$ 25.23 ExHét 300 0.1549 ± 0.010***$ 0.1302 ± 0.016***$ 18.97 Les valeurs exprimées en moyenne ± DS, n= 6, ns: non significative, *P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001 comparé au témoin, $: p<0.05 comparé au référence (AAS). Le pourcentage de l’œdème est calculé en utilisant la formule suivante: % Œdème = [M(PPG) Ŕ M(PPD)/ M(PPD)] x 100. AAS: acide acétylsalicylique, M(PPG): moyenne de poids de la patte gauche, M(PPD): moyenne de poids de la patte droite, ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique

Résultats et discussions

Dans cette étude, les résultats obtenus à l'issu des tests anti-inflammatoires montrent que l’infusé et les trois extraits polyphénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé, inhibent de manière dose-dépendante la formation d’œdème dans la 3ème h après l'injection de la carragénine, présentant ainsi un effet anti-inflammatoire contre l'inflammation aiguë. Il a été montré que l’infusé de cette plante aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. a entraîné une inhibition de l’œdème respectivement de 11.22%, 20.73% et 44.03%. L’ExEth aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c. montre respectivement un pourcentage d’inhibition de 19.3% et 41.34%. Le pourcentage d’inhibition maximal de l’œdème a été de 55.3% avec l’ExButOH à la dose de 300 mg/kg de p.c. tandis que le pourcentage d’inhibition minimal a été 2.96% avec l’ExHét à la dose de 100 mg/kg de p.c. Par contre le pourcentage d’inhibition de l’AAS à la dose de 50 mg/kg de p.c. a été de 32.08 %. L’infusé à 1000 mg/kg de p.c., l’ExButOH et l’ExEth à 300 mg/kg de p.c. ont des pouvoirs anti-inflammatoires supérieur à celui de l’AAS (Figure 53). Comparativement à l’étude faite par Ghedadba et Hambaba en 2016 sur l’extrait méthanolique des feuilles de M. deserti De Noé, le pourcentage d’inhibition a été de 86.4% à la dose de 200 mg/kg de p.c. Nos résultats donnent des pourcentages d’inhibition moins que ceux rapportés par Ghedadba et Hambaba.

Figure 53: Pourcentages d’inhibition de l’œdème des souris traités avec l’infusé et les extraits polyphénoliques de parties aériennes de M. deserti De Noé comparable, à celle de l'AAS n=6 pour chaque groupe; % inhibition= [(% œdème groupe témoin - % œdème groupe traité)/ œdème groupe témoin] x 100, AAS: acide acétylsalicylique, ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique L’essai le plus largement utilisé pour évaluer l’activité d’un nouvel agent anti-inflammatoire est sa capacité à réduire l’œdème local induit dans la patte de souris par l’injection d’un agent irritant (Ait El Cadi et al., 2012).

La carragénine est un mucopolysaccharide sulfaté provenant d’une Rhodophyceae, elle provoque la libération de plusieurs médiateurs chimiques qui sont responsables du processus inflammatoire (Soro et al., 2015). Le développement de l’œdème dans la patte de souris après

Résultats et discussions l’injection de la carragénine a été décrit comme événement biphasique. La phase initiale, observée autour de la 1ère h, est attribuée à la libération de l’histamine et de la sérotonine. La deuxième, phase de gonflement, est due à la libération de prostaglandines principalement, de protéases et de lysosomes de la 2ème à la 3ème h après injection de la carragéenine (Brooks et Day, 1991; Morris, 2003). Cette deuxième phase de l’œdème est sensible aux agents AIS et AINS (Soro et al., 2015).

Les effets de l’infusé et des trois extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé étant observés à la 3ème h d’expérimentation au moment de la libération de prostaglandines dans le site inflammatoire. Nos résultats nous feraient penser que cet infusé et ces extraits des parties aériennes de M. deserti De Noé inhiberaient de médiateurs de l’inflammation surtout la production des prostaglandines comme l’AAS utilisés comme médicament de référence dans nos tests.

Résultats et discussions

4.3 Activité antalgique de M. deserti De Noé chez les souris

4.3.1 Test du writhing Le tableau 24 représente les effets de l’infusé, des extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé et du paracétamol sur le nombre de contorsions (crampes) provoquées par l’injection de l’acide acétique. Tableau 24: Effet analgésique de l’infusé et des extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé sur les contractions abdominales induites chez la souris par l’injection de l’acide acétique à 0.6%

Groupes Dose (mg/kg de p.c.) Nombre de contorsions % Protection Témoin 57 ± 1.7$ - Paracétamol 100 29 ± 1.4*** 49.12 250 41 ± 2.2***$ 28.07 Infusé 500 33 ± 2***$ 42.10 1000 29 ± 1.7*** 49.12 100 32 ± 1.4*** 43.86 ExEth 300 21 ± 1.2***$ 63.16 100 38 ± 1.7***$ 33.33 ExButOH 300 28 ± 1.4*** 50.88 100 40 ± 1.4***$ 29.82 ExHét 300 29 ± 1.4***$ 49.12 Les valeurs sont exprimées en moyenne ± DS, n=6, ***p< 0.001 comparées au témoin, $: p<0.05 comparées à la référence (paracétamol), % protection = [(1-moyenne du nombre de crampes du lot traité/ moyenne du nombre de crampes du lot témoin] x100, ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique Après injection de l’acide acétique au lot témoin de souris, on décompte 57±1.7 crampes abdominales au bout de 15 min. En présence de l’infusé, des trois extraits phénoliques de M. deserti De Noé aux différentes doses et du paracétamol, le nombre de crampes abdominales diminuent significativement (p<0.001) par rapport au lot témoin. Ces réductions du nombre de crampes abdominales ont été dose-dépendante pour tout les extraits. A la dose de 1000 mg/kg de p.c. de l’infusé et 300 mg/kg de p.c. de ExHét prévient significativement (p<0.001) l’apparition de la douleur de façons identique au paracétamol, administré à la dose de 100 mg/kg de p.c. (%protection= 49.12%) comparé au groupe témoin. En plus, l’action analgésique de l’infusé à la dose de 500 mg/kg de p.c. est presque similaire à celle de l’ExEth à la dose de 100 mg/kg de p.c. (42.10% et 43.86% respectivement). La forte réduction (ou protection) a été observée à 63.16% pour l’ExEth et à 50.88% pour l’ExBtOH chacun à la dose de 300 mg/kg de p.c., qui ont eu des effets supérieurs au le paracétamol. Néanmoins, l’infusé à la dose de 250 mg/kg, l’ExButOH et l’ExHét chacun à la dose 100 mg/kg ont donné des effets analgésiques moindre (28.07%, 33.33% et 29.82% respectivement). L’acide acétique met en jeu les mécanismes périphériques de la douleur (Collier et al., 1968; Hasan et al., 2010 ). Il induit la libération de nombreux médiateurs chimiques impliqués dans la douleur tels que l’histamine, les prostaglandines (PGE2α, PGF2α), la sérotonine et la bradykinine. Ces médiateurs ont été mis en évidence en proportions élevées dans les exsudats

Résultats et discussions

péritonéaux de rongeurs après injection d’acide acétique (Kouakou et al., 2010). Le paracétamol agirait sur les mécanismes de la douleur en intervenant dans la biosynthèse de prostaglandines (Vane et Ferreira, 1979). Ainsi, l’infusé et les trois extraits phénoliques (ExEth, ExButOH et ExHét) des parties aériennes de M. deserti De Noé aux différentes doses qui présentent des effets analgésiques significatifs, pourraient avoir un effet inhibiteur sur la libération des médiateurs impliqués dans la douleur périphérique probablement par inhibition de l’activité ou de la synthèse des prostaglandines.

4.3.2 Test de la plaque chauffante

Les effets de l’infusé, des extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé et du paracétamol sur le test de la plaque chauffante chez les souris sont présentés dans le tableau 25. Tableau 25: Effets du paracétamol, de l’infusé et des extraits phénoliques sur la douleur induite par l'essai de la plaque chauffante chez les souris

Dose Avant Après administration (mg/ Groupes administration Temps de réaction (s) kg de p.c.) 0 min 30 min 60 min 120 min 180 min 240 min 7.55 ± 4.85 ± 5.43 ± 3.53 ± 3.93 ± Témoin - 9.26 ± 1.03 0.5$ 0.8$ 1.03$ 0.53$ 0.5$ 16.02 ± 17.63 ± 20.44 ± 19.95 ± 20.06 ± Paracétamol 100 7.84 ±0.9 1.7*** 1.2*** 1.3*** 0.7*** 0.6*** 14.51 ± 11.44 ± 10.61 ± 9.12 ± 8.70 ± 250 8.42 ± 0.3 0.7*** 1.2***$ 1.1***$ 0.8***$ 0.6***$ 14.60 ± 12.62 ± 14.68 ± 13.16 ± 10.29 ± Infusé 500 9.16 ± 0.9 1.04*** 0.8***$ 0.8***$ 0.7***$ 0.3***$ 9.35 ± 18.21 ± 16.85 ± 19.06 ± 18.26 ± 1000 7.96 ± 1.2 0.7$ 0.6*** 0.5***$ 1.6*** 1.07*** 15.08 ± 15.46 ± 11.71 ± 12.85 ± 12.87 ± 100 9.62 ± 0.8 0.9*** 0.6***$ 0.6***$ 0.7***$ 0.6***$ ExEth 19.14 ± 16.11 ± 14.88 ± 15.33 ± 13.33 ± 300 10.49 ± 1.4 0.9***$ 0.5*** 0.4***$ 0.4***$ 0.6***$ 12.84 13.2 ± 12.58 ± 10.10 ± 9.89 ± 100 9.76 ± 0.8 ±1.08***$ 0.6***$ 0.2***$ 0.6***$ 1.1***$ ExButOH 15.80 ± 16.90 ± 14.94 ± 12.69 ± 13.66 ± 300 10.67 ± 0.2 0.9*** 0.2*** 0.9***$ 0.3***$ 0.8***$ 12.48 ± 12.33 ± 12.61 ± 19.24 ± 15.79 ± 100 7.59 ± 0.8 0.5***$ 1.4***$ 1.8***$ 0.8*** 2.3***$ ExHét 15.76 ± 19.17 ± 14.04 ± 20.03 ± 21.96 ± 300 8.1 ± 0.8 1.1*** 1.04*** 0.4***$ 2.9*** 1.5*** Les valeurs sont exprimées en moyenne ± DS, n=6, ***p< 0.001 comparées au témoin, $p<0.05 comparées à la référence (paracétamol), ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique

100

Résultats et discussions

Les résultats obtenus montrent que le temps de réaction vis-à-vis de la chaleur chez les souris témoins a été diminué de 3.93±0.5 s à 240 min. Lorsqu’on compare les différents lots au groupe témoin on observe que 30 min après administration des produits, les temps de réactions des animaux des lots recevant l’infusé et les trois extraits phénoliques ainsi que celui des animaux du lot recevant du paracétamol sont significativement supérieurs (p<0.001) au temps de réaction dans le lot témoin.

Le traitement du paracétamol à la dose de 100 mg/kg de p.c. a augmenté significativement (p<0.001) le temps de réaction contre la douleur stimuli induit par la chaleur chez les souris de 51.06%, 55.52%, 61.63%, 60.7% et 60.9% respectivement à 30, 60, 120, 180 et 240 min après son administration. En présence de l’infusé des parties aériennes de M. deserti De Noé, le temps de réaction vis-à-vis de la douleur induite par la chaleur a été également augmenté significativement (p<0.001) de manière dose-dépendante par rapport au lot témoin, jusqu’à atteindre le maximum au bout de 30 min (14.51±0.7 s), de 120 min (14.68±0.8 s) et de 180 min (19.06±1.6 s) respectivement pour les doses 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. (Tableau 26). Ceci correspond à des pourcentages d’augmentations des temps de réactions de 41.94%, 37.57% et 58.21% respectivement pour ces doses (250, 500 et 1000 mg/kg de p.c.) (Figure 54A).

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Résultats et discussions

Figure 54: Pourcentages d'augmentations du temps de réactions des parties aériennes de M. deserti De Noé comparés au paracétamol en utilisant le test de la plaque chauffante A: pourcentages d'augmentations du temps de réaction de l’infusé aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c., B: pourcentages d'augmentations du temps de réactions des extraits phénoliques à la dose de 100 mg/kg de p.c., C: pourcentages d'augmentations du temps de réactions des extraits phénoliques à la dose de 300 mg/kg de p.c. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± DS, n=6, ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n- butanolique, ExHét: extrait hétérosidique, % Augmentation= [(moyenne des temps de réaction après traitements - moyenne des temps de réaction avant traitements)/ moyenne de temps des réaction après traitements] x 100

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Résultats et discussions

Cependant, il a été montré que l’ExHét de M. deserti De Noé à la dose de 300 mg/kg de p.c. manifeste une activité antalgique significative (p<0.001) qui conduit à une forte augmentation du temps de réaction contre la douleur provoqué par la chaleur (63.11% à 240 min), il est ainsi meilleur que le paracétamol (Figure 54C). A la dose de 100 mg/kg, le pourcentage d’augmentation du temps de réaction de cet extrait est presque semblable avec le paracétamol à 180 min de 60.52% et 60.7% respectivement (Figure 54B). Le gavage des souris avec l’ExEth et l’ExButOH de M. deserti De Noé aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c. inhibe également la douleur induite par la chaleur dès la 30ème min mais à des dégrées plus faibles que l’ExHét et l’infusé. En ce qui concerne la composante centrale de l’activité analgésique, les différentes doses de l’infusé et les trois extraits phénoliques (ExEth, ExButOH et ExHét) des parties aériennes de M. deserti De Noé administrées par gavage inhibent la douleur induite par la chaleur de la plaque chauffante chez les souris. La méthode de la plaque chauffante permet d’identifier les analgésiques centraux (Le Bars, 2001). Les travaux de Chang et Lewis (1989), et Sayyah et al. (2004) ont démontrés que les stimuli thermiques sont sélectivement inhibés par les analgésiques centraux et non les analgésiques périphériques. C'est un fait établi que n'importe quel agent qui cause une prolongation de la latence en utilisant le test de la plaque chauffante doit agir centralement (Sabina et al., 2009). Les extrait phénoliques et l’infusé ont montré des différences significatives par rapport au témoin aux différentes doses, nous pouvons dire que notre extraits polyphénoliques et l’infusé possèderaient des activités analgésiques centraux. 4.3.3 Test au formol

Les résultats de ce test montrent que la douleur induite par l’injection de la solution de formol a été inhibée par le paracétamol, l’infusé et les trois extraits phénoliques de M. deserti De Noé (Tableau 26).

Tableau 26: Effets antalgique de l’infusé, des extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé et du paracétamol sur la douleur (temps de léchage) induite chez les souris par injection de la solution de formol

Dose (mg/kg phase 1 (0-5 % inhibition phase 2 (15-30 % inhibition Groupes de p.c.) min) (s) min) (s) Témoin 114.76 ± 8.1$ - 196.74 ± 19.9$ - Paracétamol 100 46.87 ± 4.57*** 59.15 % 47.03 ±7.5*** 76.09 % 250 63.40 ± 10,6***$ 44.75 % 161.35 ± 20.1***§ 17.98 % Infusé 500 60.92 ± 3.6***$ 46.91 % 83.23 ± 4.2***§ 57.69 % 1000 40.86 ± 3.4*** 64.39 % 57.53 ± 4.01*** 70.75 % 100 92.54 ± 3.8***$ 19.36 % 108.09 ± 1.8***§ 45.05 % ExEth 300 51.93 ± 2.07*** 54.74 % 65.81 ± 3.09***§ 66.54 % 100 95.85 ± 13.3***$ 16.47 % 112.21 ± 5.3***§ 42.96 % ExButOH 300 79.07 ± 1.8***$ 31.09 % 92.55 ± 3.49***§ 52.95 % 100 57.26 ± 1.4*** 50.1 % 114.06 ± 3.28***§ 42.02 % ExHét 300 35.31 ± 5.4*** 69.23 % 94.33 ± 3.19***$ 52.05 % Les valeurs sont exprimées en moyenne ± DS, n=6, ***p<0.001 comparées au témoin, $: p<0.05 comparées à la référence (paracétamol), ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique

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Résultats et discussions

A la première phase (0-5 min), l’infusé des parties aériennes de M. deserti De Noé a inhibé significativement (p<0.001) de façon dose-dépendante la douleur provoquée par le formol aux doses de 250, 500 et 1000 mg/kg de p.c. respectivement de l’ordre de 44.75%, 46.91% et 64.39%, ce dernier pourcentage est cependant plus important que le paracétamol à la dose de 100 mg/kg de p.c. (59.15%). Par ailleurs, aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c., l’ExEth également a présenté une inhibition significative (p<0.001) de 19.36% et de 54.74% respectivement par rapport au témoin. En plus, la forte inhibition vis-à-vis de la douleur provoquée par le formol a été observée de 63.23% pour l’ExHét à la dose de 300 mg/kg de p.c. et même supérieure à celui du paracétamol. Néanmoins, aux mêmes doses, l’ExButOH a présenté une inhibition qui est cependant faible par rapport à l’infusé et les autres extraits phénoliques. D’autre part, à la deuxième phase (15-30 min), les effets inhibiteurs de l’infusé et des trois extraits des parties aériennes de M. deserti De Noé ont été significativement (p<0.001) remarquables aux différentes doses. Le paracétamol, l’infusé et l’ExEth aux doses de 100, 1000 et 300 mg/kg de p.c. ont présentés les plus fortes inhibitions de la douleur de 76.09%, 70.75% et 66.54% respectivement. Par contre, L’ExButOH et l’ExHét aux doses de 100 et 300 mg/kg de p.c. ont présentés sensiblement le même pouvoir inhibiteur de la douleur.

L'injection de la solution de formol dans la patte des souris déclenche des comportements nociceptifs spontanés constitués de tressaillement, léchage et/ ou morsure de la patte injectée (Prabhu et al., 2011). Ce test provoque une réponse biphasique. La première phase, classée comme une douleur neurogène, est une réponse aiguë observée immédiatement après l'injection de la solution de formol et caractérisée par la stimulation des fibres C et la libération de la substance P et la bradykinine. La seconde phase est due à la douleur inflammatoire locale causée par la production de la sérotonine, l’histamine et les prostaglandines (Hunskaar et Hole, 1987; Wheeler-Aceto et Cowan, 1991). La présente étude a montrée que l’infusé et les trois extraits phénoliques des parties aériennes de M. deserti De Noé ont inhibés les deux phases provoquées par l’injection de la solution de formol. Cela suggère que ces extraits pourraient réduire la production des différents médiateurs chimiques intervenants dans les deux phases.

Cependant, le fait que l'infusé et les extraits phénoliques de cette plante aux différentes doses testées ont produit une activité analgésique chez tous les modèles nociceptifs indique qu'ils possèdent à la fois des effets antinociceptifs centraux et périphériques. Ces propriétés antalgiques des parties aériennes de M. deserti De Noé peuvent êtres justifiées par la présence des mêmes constituants responsables de l’activité anti-inflammatoire.

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Résultats et discussions

4.4 Activité antipyrétique de M. deserti De Noé chez les rats

Le tableau 27 montre l’effet antipyrétique des parties aériennes de M. deserti De Noé sur l’hyperthermique induite par l’injection d’une solution de la levure de bière (20%). Ce tableau indique que l’injection de la suspension de la levure de bière a provoqué une élévation de température rectale après 19h dans les différents lots constitués. Chez le témoin normothermique (administré par l’eau physiologique) aucune augmentation de la température rectale n’est notée, sa température reste relativement constante pendant la durée de cette expérience.

Tableau 27: Effets antipyrétiques de l’infusé, des extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé et du paracétamol sur l’hyperthermique induite chez les rats par injection de la levure de bière

Avant Doses Après traitement (°C) Groupes (mg/kg traitement (°C) de p.c.) Ti T0 1h 2h 3h 4h Témoin 36.95 37.00 ± 37.08 ± 37.01 ± 37.1 ± - 36.9 ± 0.2 normothermique ± 0.2 0.1 0.4 0.2 0.1 38.16 ± 38.23± 38.46 ± 38.61 ± Témoin 36.93 38.08 ± - 0.3 0.3$ 0.2$ 0.3$ hyperthermique ± 0.1 0.1 (+ 0.08) (+ 0.15) (+ 0.38) (+ 0.53) 37.58 ± 37.1± 37.31 ± 36.98 ± 37.48 38.46 ± Paracétamol 100 0.3ns 0.4*** 0.3*** 0.3*** ± 0.3 0.3 (- 0.88) (- 1.36) (- 1.16) (- 1.56) 37.55 ± 37.33 ± 36.93 ± 36.68 ± 37.1 ± 38.66 ± 250 0.3ns 0.5* 0.6*** 0.5*** 0.1 0.2 (- 1.11) (- 1.36) (- 1.76) (- 1.98) 37.93 ± 37.55 ± 36.96 ± 36.85 ± 36.6 ± 38.2 ± Infusé 500 0.3ns 0.4ns 0.5*** 0.3*** 0.3 0.2 (- 0.27) (- 0.65) (- 1.24) (- 1.35) 38.05 ± 38.1 ± 37.46 ± 37.48 ± 36.68 38.33 ± 1000 0.4ns 0.4$ 0.3*** 0.4*** ± 0.3 0.2 (- 0.28) (- 0.23) (- 0.87) (- 0.85) 38.05 ± 37.63 ± 37.45 ± 37.33 ± 37.1 ± 38.2 ± ExEth 0.3ns 0.3ns 0.5*** 0.4*** 0.2 0.2 (- 0.15) (- 0.57) (- 0.75) (- 0.87) 37.91 ± 38.01 ± 38.2 ± 38.25 ± 37.00 38.4 ± ExButOH 100 0.3ns 0.5$ 0.4$ 0.6$ ± 0.2 0.5 (- 0.49) (- 0.39) (- 0.2) (- 0.15) 37.71 ± 37.6 ± 37.48 ± 37.4 ± 36.86 38.25 ± ExHét 0.3ns 0.6ns 0.6*** 0.3*** ± 0.6 0.1 (- 0.54) (- 0.65) (- 0.77) (- 0.85) Chaque valeur représente la moyenne ± DS (variation de la température provoquée en °C), n=6 pour chaque groupe, ns: non significatif, *p<0.05, ***p<0.001 comparées au témoin, $p<0.05 comparée à la référence (paracétamol), ExEth: extrait éther diéthylique, ExButOH: extrait n-butanolique, ExHét: extrait hétérosidique

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Résultats et discussions

En effet, chez les rats du groupe témoin hyperthermique, nous notons une augmentation de la température rectale jusqu’à la 4ème h de l’ordre de 38.61±0.3 °C. Par contre, le paracétamol dosé à 100 mg/kg de p.c. utilisé comme produit de référence a réduit la température rectale des rats de façon significative (p<0.001) par rapport au témoin hyperthermique jusqu’à la fin de l’expérience. L’administration orale de l’infusé et des trois extraits polyphénoliques de M. deserti De Noé a également réduit l’élévation de la température de manière significative. Nous notons qu’à la fin de l’expérience l’effet antipyrétique obtenu est assez significatif (p<0.001) et qu’il y a presque un retour à la température d’avant induction. L’infusé de M. deserti De Noé aux doses de 250 et 500 mg/kg de p.c. possède une activité antipyrétique plus importante que celle du paracétamol, elle a entrainé une baisse significative de la température rectale des rats dès la 2ème h pour la dose 250 mg/kg, soit de 1.36 °C, 1.76 °C et 1.98 °C respectivement pour la 2ème, 3ème et 4ème h, et dès la 3ème h pour la dose 500 mg/kg, soit de 1.24 °C et 1.35 °C respectivement pour la 3ème et 4ème h de traitement. En effet, à la dose de 1000 mg/kg de p.c. l’activité antipyrétique est faible avec une baisse de température peu importante par rapport aux autres doses. Ces résultats suggéreraient que la dose de 250 mg/kg de p.c. de l’infusé de M. deserti De Noé serait la dose optimale. La baisse de la température rectale induite par l’ExEth et l’ExHét à 100 mg/kg de p.c. est semblable à celle de l’infusé à 1000 mg/kg de p.c. En effet, à ces doses, l’activité de ces extraits se manifeste avec la même intensité à la 4ème h après le traitement des rats. L’ExButOH à la dose de 100 mg/kg de p.c. n’a pratiquement pas d’activité antipyrétique avec une baisse de température très faible de 0.15 °C à la 4ème h. Ce travail confirme donc l’activité antipyrétique empiriquement attribuée aux parties aériennes de M. deserti De Noé. Il ressort aussi de ces résultats que l’ExEth et l’ExHét à la dose de 100 mg/kg de p.c. possèdent une activité antipyrétique. Il est bien connu que l’hyperthermie induite par l’injection de la levure est liée à la libération des cytokines qui ayant atteint les vaisseaux sanguins stimulent la biosynthèse des prostaglandines (PGE2) aux environ du centre hypothalamique thermorégulateur (Al-Ghamdi, 2001; Zakaria et al., 2008). L’infusé, l’ExEth et l’ExHét ont réduit l’hyperthermie provoquée par l’injection de la levure de bière. L’effet antipyrétique de ces extraits pourrait être dû à la réduction de la libération des cytokines et de la biosynthèse des prostaglandines. Cette activité pourrait être due à la présence de composés phénoliques particulièrement les flavonoïdes mis en évidence par nos investigations phytochimiques (Xiong et al., 2016).

Dans ce travail, la plante étudiée Marrubium deserti De Noé est largement utilisée dans le traitement de nombreuses affections comme la fièvre, les maladies inflammatoires et les douleurs. La partie aérienne reste la partie de la plante la plus utilisée, ce qui pose le problème de la survie et de l’exploitation durable de l’espèce. Cette présente étude tente de trouver une alternative à l’utilisation de la partie aérienne en médecine traditionnelle Algérienne. L’activité anti-inflammatoire a été évaluée sur un modèle d’œdème induit par la carragénine sur la patte des souris. L’activité analgésique a été quant à elle, évaluée sur trois modèles de douleur en utilisant le test du writhing, le test de la plaque chauffante et le test au formol sur les souris. L’activité antipyrétique a été évaluée sur la pyrexie induite par la levure chez les rats. Nos résultats montrent que la partie aérienne de cette plante est douée de propriétés anti- inflammatoire, analgésique et antipyrétique. Ces efficacités médicinales importante de l’infusé et des différents extraits polyphénoliques (ExEth, ExButOH et ExHét) de M. deserti De Noé pourrait être liée a leurs profils chimiques, particulièrement à la présence de

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Résultats et discussions composés phénoliques dans ceux-ci (Kim et al., 2004; Narayana et al., 2001). Parmi ces composés se trouvent les flavonoïdes qui sont capables d’inhiber plusieurs enzymes intervenant dans la zone inflammatoire (Oweyele et al., 2005). En effet, plusieurs études ont rapporté que la quercétine, l'apigénine, l’isorhamnétine, l’hespéridine et la naringénine qui sont révélées dans l’ExEth des parties aériennes de M. deserti De Noé, exerce des effets anti-inflammatoires et antinociceptives (Hämäläinen et al., 2007; Mafuvadze et al., 2011; Eldahshan et Azab, 2012; Kaidama et Gacche, 2015; Xiong et al., 2016). De plus, beaucoup de travaux ont décrit également l’activité anti-inflammatoire des acides phénols tels que l’acide caféique, férulique, syringique, trans-cinnamique et iso-vanillique (Fernández et al., 1998; Shin et al., 2004; Zhu et al., 2016). Nous pouvons dire que ces acides phénols et ces aglycones flavoniques de l’ExEth sont responsables des propriété anti-inflammatoire, antalgique et peut être même antipyrétique. En outre, la CCM et CLHP d’ExButOH de M. deserti De Noé a révélée la présence de la cyanidine et l’iso-orientine qui sont connues pour leurs propriétés anti-inflammatoire et antalgique (Rouibi et al., 2012; Atta et al., 2013). L’étude de Rosa et al. (2016) montre que la vitexine qui est également révélée dans l’ExButOH, inhibe la migration des neutrophiles et la libération des médiateurs pro-inflammatoires contribue à leur activité anti-inflammatoire. Ceci peut expliquer l’effet de l’ExButOH de M. deserti De Noé contre l’inflammation et les douleurs. Par contre, nos résultats montrent aussi que l’ExButOH n’a pratiquement pas d’activité antipyrétique. Ceci peut suggérer que les composés révélés et identifiés dans cet extrait n’ont aucun effet sur la fièvre. Guardia et al. (2001) ont étudié l’activité anti-inflammatoire de la rutine chez des rats en utilisant le modèle d'inflammation aiguë et chronique. L'administration intrapéritonéale de rutine a inhibé les phases aiguë et chronique de ce modèle expérimental d'inflammation. Ceci peut suggère que la rutine est responsable de l’activité anti-inflammatoire de l’ExHét de M. deserti De Noé.

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Conclusion et perspectives

Les travaux de cette thèse s’articulent autour de la valorisation d’une plante endémique du Sud de l’Algérie; Marrubium deserti De Noé, utilisée en médecine traditionnelle et de vérifier les hypothétiques corrélations entre les activités de cette plante et son contenu en composés phénoliques. Cette étude a consisté à étudier les composés phénoliques de la partie aérienne de M. deserti De Noé, à les identifier et à évaluer leurs différentes activités en se basant sur les résultats de l’enquête ethnobotanique. L’enquête ethnobotanique réalisée dans les cinq communes de la wilaya de Biskra à l’aide d’un questionnaire a révélé que la population locale utilise cette plante dans le traitement de la fièvre (27.61%), des pathologies digestives (16.50%) et des algies diverses (13.47%). Au cours de cette investigation, l'administration orale est apparu la voie d’administration la plus dominante (54.41%) alors que le mode de préparation le plus utilisé est l’infusion (33.16%). Les parties aériennes et plus précisément les feuilles (51.35%) sont les plus utilisées pour la préparation de remèdes.

Pour l’étude phytochimique, nous avons au préalable effectué un criblage préliminaire des différentes familles de métabolites secondaires de M. deserti De Noé recueillis à Biskra (Ain Zaatout) et Tamanrasset (Afilal). En effet, le screening phytochimique de la partie aérienne a montré la présence des substances polyphénoliques (flavonoïdes, tannins, saponosides et coumarines), des alcaloïdes et des terpènoïdes.

Afin d’extraire les composés phénoliques contenus dans la plante étudiée, trois différentes méthodes utilisant plusieurs solvants ont été effectuées. Cette série d’extraction a permis d’obtenir quatre extraits phénoliques; l’extrait éther diéthylique (ExEth) contenant les flavones-flavonols et les acides phénoliques, l’extrait n-butanolique (ExButOH) contenant les anthocyanes et C-glycosides, l’extrait hydroalcoolique (ExHét) contenant les hétérosides flavoniques et enfin l’extrait des aglycones libre (ExAgL). En plus, nous avons préparé l’infusé de la partie aérienne de cette plante selon la méthode traditionnelle en se basant sur notre étude ethnobotanique afin de vérifier son innocuité, ses propriétés thérapeutiques à partir de l’infusé et des extraits polyphénoliques.

Les analyses quantitatives du contenu des phénols totaux par la méthode de Folin Ciocalteu révèlent la présence de quantités moyennement importantes. Cette analyse a montré que l’extrait ExButOH est le plus riche en polyphénols totaux de 30.4±0.8 et 24.03±0.09 mg EAG/g MS au niveau de Biskra et Tamanrasset respectivement. De même nous avons dosé les différentes fractions en composés phénoliques qui nous mènent à conclure que les teneurs absolues en aglycones libres, en anthocyanes et en C-glycosides sont similaires au niveau des deux stations de récoltes (p>0.05). Pour les teneurs en flavones-flavonols et en hétérosides flavoniques, les valeurs les plus élevées sont observées avec la partie aérienne récoltée à Tamanrasset.

Les résultats de l’analyse statistique des variables phénoliques ont montré l’hétérogénéité des individus de cette plante au niveau des deux stations étudiées par rapport aux teneurs en flavones-flavonols, en anthocyanes, en C-glycosides et en hétérosides flavoniques et une bonne homogénéité en aglycones libres. Les analyses qualitatives par CLHP ont permis de révéler et identifier trois flavonols (quercétine, kaempférol et isorhamnétine), deux flavones (lutéoline et apigénine), une flavanone (hespéridine), deux acides hydroxybenzoïques (acide iso-vanillique et acide syringique), trois acides hydroxycinnamiques (acide caféique, acide férulique et acide trans- cinnamique), un aldéhyde aromatique (vanilline), six C-glycosides (orientine, iso-orientine,

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Conclusion et perspectives vitexine, iso-vitexine, naringénine-6-C-glucoside et naringénine di-C-glucoside et trois O- glycosides (rutine, cynaroside et monoside de kaempférol). Du point de vue pharmacologique, nous avons procédé à la recherche de la toxicité et des activités pharmacologiques anti-inflammatoire, antalgique et antipyrétique de l’infusé et des trois extraits polyphénoliques (ExEth, ExButOH et ExHét) de la partie aérienne de M. deserti De Noé. L’étude de la toxicité aiguë de la partie aérienne de M. deserti De Noé par voie orale montre chez les souris une DL50 supérieure à 11000 mg/kg pour l’infusé et supérieure à 500 mg/kg de p.c. pour les trois extraits polyphénoliques. Toutefois la toxicité subaiguë montre que l'infusé de cette plante agit sur la croissance corporelle des rats mâles et femelles, sur les poids des organes et perturbe quelques paramètres hématologiques et biochimiques liés aux fonctions hépatique et rénale. L’administration par voie orale de l’infusé et des trois extraits polyphénoliques aux différentes doses montre des effets anti-inflammatoires, analgésiques (périphérique et centrale) et antipyrétiques, qui sont du temps et la dose dépendant. Nos résultats confirment et valident l’indication thérapeutique traditionnelle auprès de la population locale de la partie aérienne de M. deserti De Noé.

Le présent travail nous a permis de contribuer à l’amélioration de nos connaissances sur M. deserti De Noé par l’étude phytochimique et les activités biologiques. Cette étude nécessite d’être complétée par un certain nombre de travaux. Ainsi, on propose: d’étudier la relation structure-activité qui permettra de corréler les résultats de ces tests biologiques avec des structures bien précises. de Poursuivre l’étude phytochimique et continuer la recherche sur l’espèce étudiée afin d’isoler, de purifier et d’identifier d’autres métabolites secondaires contenus dans cette plante. de Tester la toxicité et les activités biologiques des autres modes de préparations tels que la décoction et la macération. d’essayer d’évaluer et vérifier les autres activités biologiques recensées dans l’enquête ethnobotanique; l’activité antidiabétique, cicatrisante… etc.

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Annexe 1

Fiche questionnaire

Informateur – Age: ……………………………… – Sexe: Masculin □ Féminin □ – Adresse: ……………………………… – Préférez vous: Phytothérapie □ Médicine moderne □ La plante: Marrubium deserti De Noé – Connaissez vous cette plante: Oui □ Non □ – La meilleure période de sa cueillette: Printemps □ Eté □ automne□ Hiver □ Toute l’année□ – Parties utilisées: Tiges □ Fleurs □ Fruits □ Graine □ Ecorce □ Feuilles □ Plante entière □ – Quelles type de maladies traite cette plante ? Pathologies digestives □ Pathologies respiratoires □ Fièvre □ Rhumatisme □ Diabète □ Autre maladies □ – Mode de préparation: Poudre □ Infusion □ Décoction □ Macération □ Inhalation □ Pommade □ Lotion □ Autres □ – Dose utilisée: Dose précise □ Dose non précise □ – Mode d’administration: Voie orale □ Application externe □ Voie orale et application externe □ – Posologie (nombre de prise par jour): 1fois/jour □ 2fois/jour □ 3fois/jour □ Autres □ – Durée d’utilisation (durée de traitement): Moins d’une semaine □ Une semaine □ Deux semaines □ Un mois □ Jusqu’à la guérison □ – Etat d’utilisation: Sec □ Frais □ Sec et frais □ – Utilisation: Seule □ Mixte □ – Effets secondaires: ...... – Toxicité: ...... – Précautions d’emploi: ...……………………………………………………………………..

Annexe 2

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

-0,1 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Absorbance (765 nm) (765 Absorbance

Acide gallique (mg/ ml)

Courbe d’étalonnage de l’acide gallique pour le dosage des polyphénols totaux

Annexe 3

Chromatogrammes de CLHP des standards 1: Quercétine, 2: Lutéoline, 3: Apigénine, 4: Isorhamnétine, 5: Hespéridine, 6: Naringénine-6-C-glucoside, 7: Rutine, 8: Cynaroside, 9: Orientine, 10: Vitexine, 11: Kaempférol, 12: Acide férulique, 13: Acide caféique, 14: Vanilline, 15: Acide syringique, 16: Acide iso-vanillique, 17: Acide trans-cinnamique Annexe 4 :

Rutine Cynaroside

Naringénine 6-C-glucoside Quercétine

Lutéoline Kaempférol

Orientine Iso-orientine

Vitexine Iso-vitexine

Apigénine Isorhamnétine

Hespéridine Acide caféique

Acide iso-vanillique Vanilline

Acide férulique Acide syringique

Acide trans-cinnamique Structures chimiques des différents composés révélés et identifiés dans les extraits de M. deserti De Noé par CLHP

Abstract

This work consists on documenting the traditional uses of an Algerian medicinal plant; Marrubium deserti De Noé, to extract and identify the phenolic compounds contained in its aerial part collected from two different areas, a semi arid region (Biskra) and an arid region (Tamanrasset), also to assess its toxicity and to evaluate its biological activities. An ethnobotanical study by the local population of Biskra showed that this plant is used in the treatment of the several diseases (fever, digestive pathologies and pain). Quantitative analysis of the total phenols and the various polyphenolic fractions such as flavones-flavonols, free aglycones, anthocyanes, C-glycosides and heterosides flavonic reveal the presence of moderately large quantities in the different extracts and the infusion aerial part collected from the two areas. The results of the chemical diversity research by PCA and AHC show a strong intra-specific variability of Marrubium deserti De Noé. Qualitative analysis by HPLC revealed and identified three flavonols (quercetin, kaempferol and isorhamnetine), two flavones (luteolin and apigenin), one flavanone (hesperidin), two hydroxybenzoic acids (iso-vanillic acid and syringic acid), three hydroxycinnamic acids (caffeic acid, ferulic acid and trans- Cinnamic), an aromatic aldehyde (vanillin), six C-glycosides (oriental, iso- orientin, vitexin, iso-vitexin, naringenin-6-C-glucoside and naringénine di-C-glucoside) and three O-glycosides (rutin, cynaroside and kaempferol monoside). The acute toxicity study of M. deserti De Noé, orally in mice, shows a LD50 greater than 11000 mg/kg for the infusion and greater than 500 mg/kg b.w. for the three polyphenolic extracts (ExEth, ExButOH and ExHét). However, the study of subacute toxicity in rats revealed disturbances in the body growth, in organ weights and in some haematological and biochemical parameters related to liver function. The biological study showed that the infusion and the three polyphenolic extracts have anti-inflammatory, analgesic (peripheral and central) and antipyretic activities. Our results confirm and validate the traditional therapeutic indication with the local population of the aerial part of M. deserti De Noé.

Keywords: Marrubium deserti De Noé, Biskra, Tamanrasset, infusion, polyphenols, HPLC, toxicity, anti- inflammatory, analgesic, antipyretic.

الملخص

انغزع يٍ ْذِ انذراسح ْٕ ذٕشٛق االسرخذاياخ انرقهٛذٚح انطثٛح نُثرح ذًُٕ فٙ انظحزاء انعشائزٚح، Marrubium deserti De Noé اسرخالص ٔذحذٚذ انًزكثاخ انفُٕٛنٛح انًٕظٕدج فٙ ظشئٓا انعهٕ٘ انذ٘ اقرطف يٍ يُطقرٍٛ يخرهفرٍٛ; يُطقح شثّ ظافح (تسكزج) ٔاألخزٖ ظافح (ذًُزاسد)، أؼٚا ذقٛٛى سًٛرٓا ٔ دراسح خظائظٓا انثٕٛنٕظٛح. انثحس االسرقظائٙ االشَُٕثاذٙ نذٖ انسكاٌ انًحهٍٛٛ فٙ يُطقح تسكزج كشف أٌ ْذِ انُثرح ذسرخذو نعالض عذج أيزاع كانحًٗ، أيزاع انعٓاس انؼٓى ٘ٔ اٜالو. اظٓز انرحهٛم انكًٙ نهثٕنٛفُٕٛل انكهٙ ٔيخرهف األَٕاع انفُٕٛنٛٛح ) glycosides et les hétérosides flavoniques( عٍ ٔظٕد كًٛاخ يعرثزج فٙ انرٛشاٌ ٔ يخرهف انًسرخهظاخ نهعشء انعهٕ٘ فٙ كهرا يُطقرٙ انقطف. انرحهٛم انُٕعٙ تاسرعًالCLHP كشف عٍ ٔظٕد شالز يزكثاخ فالفٌٕ )quercétine, kaempférol isorhamnétine ) ، يزكثٍٛ فالفٌٕ (apigénine ٔ lutéoline) ، يزكة فالفٌُٕ (hespéridine) ، خًسح أحًاع فالفَٕٛح ) acide férulique، acide caféique ،syringique, acide iso-vanillique ،acide trans-cinnamique) ، يزكة vanilline ، سرح C-glycosides )naringénine di-C-glucoside،orientine, iso-orientine, vitexine, iso-vitexine, naringénine-6-C-glucoside ( ٔشالشح -O monoside de kaempférol ، cynaroside ،rutine( glycosides( . انذراسح انسًٛح انحادج نٓذِ انُثرح تُٛد أٌ DL50 اكثز يٍ 11000 يهغ / كغ يٍ ٔسٌ انعسى تانُسثح نهرٛشاٌ ٔاكثز يٍ 500يهغ / كغ تانُسثح نهًسرخهظاخ انفُٕٛنٛح انصالز (ExEth, ExButOH et ExHét) . كشفد أؼٚا انذراسح انسًٛح ذحد انحادج اػطزاتاخ فٙ ٔسٌ انعسى ٔ األعؼاء انذاخهٛح ٔ فٙ تعغ ذحانٛم انذو انًرعهقح تانكثذ ٔٔظائف انكهٗ. أظٓزخ انذراسح انثٕٛنٕظٛح أٌ ذٛشاٌ ْذِ انُثرح ٔيسرخهظاذٓا انفُٕٛنٛح انصالشح ًٚرهكٌٕ يفعٕل يؼاد نالنى، نهٕظع ٔخافغ نهحزارج. ْذِ انُرائط ذؤكذ طحح انعالظاخ انرقهٛذٚح نهسكاٌ انًحهٍٛ ٔذصثد انخظائض انطثٛح نهعشء انعهٕ٘ نٓذِ انُثرح. كلمات المفتاح : Marrubium deserti De Noé، تسكزج ، ذًُزاسد، ذٛشاٌ، تٕنثفُٕٛل، HPLC، انسًٛح، يؼاد االنرٓاب، يؼاد اٜالو، خافغ انحزارج.