Universidade Do Estado Do Rio De Janeiro Centro Biomédico Faculdade De Ciências Médicas

Universidade do Estado do Rio de Janeiro Centro Biomédico Faculdade de Ciências Médicas

Guilherme da Silva Lourenço Carvalho

Formação de biofilme por espécies de Stretptococcus

Rio de Janeiro 2012

Guilherme da Silva Lourenço Carvalho

Formação de biofilme por espécies de Streptococcus

Dissertação apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Microbiologia Médica Humana.

Orientadora: Profa. Dra. Vânia Lúcia Carreira Merquior Coorientadores: Prof. Dr. Rafael Silva Duarte Profa. Dra. Lúcia Teixeira Martins

Rio de Janeiro 2012

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CATALOGAÇÃO NA FONTE UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A

C331 Carvalho, Guilherme da Silva Lourenço.

Formação de biofilme por espécies de Streptococcus. / Guilherme da

Silva Lourenço Carvalho. - 2012.

79 f.

Orientadora: Vânia Lúcia Carreira Merquior.

Coorientadores: Rafael Silva Duarte. Lúcia Teixeira Martins.

Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado do Rio de Janeiro,

Faculdade de Ciências Médicas. Pós-graduação em Microbiologia.

1. Streptococcus. 2. Biofilmes. 3. Virulência. I. Merquior, Vânia

Lúcia Carreira II. Duarte, Rafael Silva III. Martins, Lúcia Teixeira. IV.

Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências Médicas. V. Título.

CDU 576.951.214

Bibliotecária: Ana Rachel Fonseca de Oliveira CRB7/6382

Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, desde que citada a fonte.

______Assinatura Data

Guilherme da Silva Lourenço Carvalho

Formação de biofilme porespécies de Streptococcus

Aprovada em 13 de fevereiro de 2012.

Orientadora: ______Profa. Dra. Vânia Lúcia Carreira Merquior Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes - UERJ

Coorientadores: ______Prof. Dr. Rafael Silva Duarte Universidade Federal do Rio de Janeiro ______Profa. Dra. Lúcia Teixeira Martins Universidade Federal do Rio de Janeiro

Banca Examinadora:

______Prof. Dr. João Ramos Costa Andrade Faculdade de Ciências Médicas - UERJ

______Prof. Dr. Sérgio Eduardo Longo Fracalanzza Universidade Federal do Rio de Janeiro

______Profª. Dra. Rachel Leite Ribeiro Centro Universitário Serra dos Órgãos

Rio de Janeiro 2012

DEDICATÓRIA

À minha mãe Cristina

AGRADECIMENTOS

À minha mãe Cristina, que me ensinou os primeiros passos da microbiologia e da vida. Pelo amor incondicional que só as mães possuem, pelas eternas batalhas pelos seus filhos, estando sempre ao meu lado quando caía. Pelo exemplo moral e profissional, endurecendo sem perder a ternura. Coração do meu céu, sua prole sobreviveu e espero um dia retribuir. Ao meu pai Thomaz e ao meu irmão Gustavo pelo apoio, ajuda, gargalhadas e brigas que nos fazem crescer. Aos meus avós, José e Olga Lourenço, pelo carinho, dedicação e valores passados. À minha orientadora Vânia Lúcia pela atenção e dedicação, pela amizade, pelos conselhos científicos e maternais, e por acreditar no meu potencial. Ao meu co-orientador Rafael Silva Duarte pelos conselhos, exemplo, pelo acolhimento em seu laboratório, por ter aberto importantes portas para a realização do trabalho e postura profissional admirável. À professora Lúcia Martins Teixeira pelo exemplo de dedicação e profissionalismo e seriedade, permitindo o desenvolvimento deste trabalho em seu laboratório. Aos companheiros de jornada diária do Laboratório de Apoio Biotecnológico, Andréia, Felipe, Filomena, Jaqueline, Natália, Aline, Sandrine, Tatiana, Luciana, Daniela, Daniele, Stephanie, Ana Carolina, Sabrina e Adriana pela ajuda, amizade e risadas nos momentos de cansaço. À Beatriz Monteiro por todos os ensinamentos, críticas, sugestões e soluções. Por ter sido meu braço esquerdo e direito. Pelo apoio incondicional, sempre acompanhado de um conselho sincero e maduro, permitindo não somente o desenvolvimento deste projeto, como a minha evolução profissional e pessoal. Pelas conversas malucas, brincadeiras, mas sempre com nosso compromisso de manter o FOCO. Por ser uma pessoa fantástica. Aos também companheiros de jornada do Laboratório de Micobactérias Marlei, Ana Carolina, Fábrice, Vinícius, Pedro, Marcus, Karen, Carol e Patrícia, pela amizade, risadas e momentos agradáveis que aliviam a tensão do cotidiano. Aos meus amigos de Graduação em Farmácia Patrícia, Fernando, Luzia, Mariana, Mazinho, Ricardo e demais que por circunstâncias da vida não convivem, agradeço o incentivo, apoio e carinho dispensados.

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À família que nos é permitida escolher. Ana Paula, Marcelo, Raquel, Felipe, Carol, Natália Brandão e Natália Souto, memórias incríveis de dias felizes e tristes, sempre contando com companheirismo e amizade de todos, levarei para o resto da Vida. A Henrique, Tânia e Nathalia Brazão pelo carinho, compreensão, amizade, acolhimento, apoio e incentivo. À família Miranda, Roseclere e Carlos Alberto, por sempre manterem as portas abertas, pela amizade e incentivo. A vovó Didi e toda a sua família, pela amizade, carinho e apoio por todos esses anos. A Celso Caheté e demais companheiros pelas conversas, ensinamentos e ajuda. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.

Francisco Cândido Xavier

RESUMO

CARVALHO, Guilherme da Silva Lourenço. Formação de biofilme por espécies de Streptococcus. 2012. 79f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2012.

O gênero Streptococcus compreende espécies clinicamente importantes que são responsáveis por uma grande variedade de pelo sucesso destes microrganismos na persistência de algumas infecções. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar a formação de biofilmes por 19 espécies do gênero associadas a infecções humanas e animais. Biofilmes foram formados nos meios BHI, THB e HIB e em diferentes concentrações de glicose ou de sacarose, e avaliados pelo método semiquantitativo do cristal violeta. A influência de ampicilina e de eritromicina sobre a atividade e biomassa dos biofilmes foi avaliada por de ensaios de viabilidade utilizando azul de Alamar e pelo método semiquantitativo do cristal violeta, respectivamente. A presença de DNA e proteínas na substância polimérica extracelular foi determinada em ensaios de destacamento, após tratamento com DNase ou proteinase K. A arquitetura dos biofilmes e a distribuição de células vivas e mortas foram observadas por microscopia ótica de luz e confocal de varredura a laser (MCVL). Todas as amostras foram produtoras de biofilmes. As espécies S. pyogenes e S. agalactiae foram fortes produtoras, de acordo com os padrões definidos (DO570nm > 1,0). Os valores de DO dos biofilmes formados em diferentes meios de cultura variaram de acordo com a espécie. A adição de açúcares, resultou no aumento da biomassa dos biofilmes. Porém, este aumento não foi proporcional a concentração. As concentrações mais favoráveis de glicose variaram entre as espécies. Entretanto, a maioria apresentou maior biomassa em 0,25% de glicose. Para a sacarose, os resultados não variaram muito nas diferentes concentrações testadas. A concentração inibitória do biofilme (CIB) para ampicilina e eritromicina atingiu valores superiores a 40.000 vezes se comparada a CIM de células em cultura. As espécies que apresentaram CIBs menores foram: S. suis, 80 µg/mL para ampicilina e eritromicina; S. porci 640 µg/mL apenas para ampicilina e S. pyogenes, 640 µg/mL apenas eritromicina. Entretanto, a maioria das espécies apresentou valores de biomassa semelhantes ao biofilme controle, na ausência de antimicrobianos. Os dados obtidos revelaram que tanto ampicilina quanto eritromicina quando em concentrações equivalentes a ½ da CIM induziram significativamente a formação de biofilme. O tratamento com proteinase K causou uma redução dos biofilmes da maioria das amostras. Porém, S. agalactiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. iniae, S. mutans, S. parauberis, S. porcinus e S. pyogenes foram as que apresentaram valores significativos (p<0,05) sugerindo a formação de estruturas ricas em proteínas. O tratamento com DNaseI resultou no destacamento dos biofilmes produzidos por S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. equi subsp equi, S. pyogenes e S. urinalis. Entretanto, considerando-se os dois controles utilizados nos testes apenas os resultados obtidos para as amostras de S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram resultados significativos (p<0,05). S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram imagens representativas de maior biomassa, onde foram observadas regiões compostas por filamentos longos, que a coloração utilizada demonstrou serem constituídos de DNA extracelular. A MCVL revelou variações na relação entre a quantidade de células vivas e mortas, sugerindo tempos de maturação espécie- específicos. Apesar de estudos adicionais serem necessários, os dados obtidos demonstraram características particulares de cada espécie mesmo filogeneticamente relacionadas.

Palavras-chave: Biofilme. Streptococcus. Virulência.

ABSTRACT

CARVALHO, Guilherme da Silva Lourenço. Biofilm formation in Streptococcus species. 2012. 79f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2012.

Streptococcus includes clinically important species that are responsible for a wide variety of infections in human and animals. The biofilms formation has been identified as responsible for the success on the persistence of these microorganisms in some infections. The aim of this study was to analyze the biofilm formation by 19 streptococcal species associated with human and animal infections. Biofilms formation was determined in BHI, THB and HIB and in the presence of glucose or sucrose (0,25% - 1,0%). The biofilms were evaluated by a semiquantitative method of crystal violet. The susceptibility to ampicillin and erythromycin were assessed by viability assays using Alamar blue and the semiquantitative method of crystal violet. The presence of DNA and proteins in the extracellular polymeric substance was determined by detachment assays, after treatment with DNaseI or proteinase K. The biofilms structural architecture and the distribution of live and dead cells were examined by optical microscopy and confocal laser scanning microscopy. All strains were biofilms producers. The species S. agalactiae and S. pyogenes were characterized as strong producers, according to the previous defined standards (DO570nm> 1.0). The biofilm formed in BHI and HIB by S. canis was significantly higher (p <0.05) than in THB. The addition of sugars, for most species, resulted in significant increase in biomass of biofilms (p <0.05). However, this increase was not proportional to the increase of concentration. The more favorable glucose concentrations varied between species, however, most had higher biomass in biofilms formed in HIB medium plus 0.25% glucose. In contrast to sucrose, the results of most of the samples were similar in different concentrations. For most samples, the biofilm inhibitory concentration (BIC) was found as > 640 mg / mL. The species showing lower BICs were: S. suis, 80 mg / mL of ampicillin or erythromycin, S. porci 640 g / mL of ampicillin and S. pyogenes, 640 mg / mL of erythromycin. Most species showed DO values similar to the control biofilm in the absence of antimicrobials. Our data revealed that both ampicillin and erythromycin in subMICs induced the formation of streptococcal biofilm significantly (p <0.05). Treatment with proteinase K caused the biomass reduction in most of most the strains. However, S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. iniae, S. mutans, S. parauberis, S. pyogenes and S. porcinus showed the significative values, suggesting the presence of protein- rich structures. S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. equi subsp equi, S. urinalis and S. pyogenes showed biofilm detachment due to DNaseI treatment, but only the species S. agalactiae and S. pyogenes showed significant values. S. agalactiae and S. pyogenes showed greater biomass in confocal and optical images, presenting long filaments of extracellular DNA. The CLSM also revealed variations in the relationship between the amount of dead and living cells, suggesting maturation times species-specific. Although additional studies are needed, the data showed particular characteristics on biofilm formation.

Keywords: Biofilm. Streptococcus. Virulence.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Relacionamento filogenético entre 55 espécies do gênero Streptococcus, baseado na análise da sequência do gene que codifica o rRNA 16S.(gene rrs)...... 18

Figura 2 – Esquema representativo da sequência temporal da formação de biofilmes por Streptococcus...... 25

Figura 3 - Árvore filogenética construída a partir da comparação das sequências do gene rrs, utilizando o método do neighbour-joining, demonstrando o relacionamento entre espécies de Streptococcus...... 42

Figura 4 - Formação de biofilmes por espécies de Streptococcus nos meios de cultura BHI e THB, HIB...... 43

Figura 5 – Biofilmes de Streptococcus formados durante 24 horas na presença de diferentes concentrações de glicose...... 44

Figura 6 - Biofilmes de Streptococcus formados durante 24 horas na presença de diferentes concentrações de sacarose...... 45

Figura 7 – Comparação da formação de biofilmes por espécies de Streptococcus nos meios de cultura BHI e HIB acrescido de 0,25% de glicose...... 46

Figura 8 - Correlação do ensaio de determinação da concentração inibitória (A-C), para ampicilina, com a quantificação da biomassa dos biofilmes de S. iniae (RS-22), S. parauberis (RS-32), S. porci (RS-37), S. equi subsp zooepidemicus (RS-26), S. phocae (RS-28), S. uberis (RS-34) e S. suis (RS-33)...... 50

Figura 9 - Correlação do ensaio de determinação da concentração inibitória (A-B), para eritromicina, com a quantificação da biomassa dos biofilmes de S. dysgalactiae subsp equisimilis (RS-31), S. suis (RS-33), S. canis (RS-35), S. pseudoporcinus (RS-36), S. porci (RS-37), S. porcorum (RS-39), S. pyogenes (RS-23) e S. equi subsp zooepidemicus (RS-26)...... 51

Figura 10 - Influência de concentrações subinibitórias de ampicilina e de eritromicina (1/2 da CIM) na formação de biofilmes de Streptococcus...... 52

Figura 11 - Influência do tratamento dos biofilmes de Streptococcus com proteinase K (A) e DNaseI (B)...... 53

Figura 12 - Imagens obtidas por microscopia ótica de luz dos biofilmes de Streptococcus formados sobre lamínulas de vidro durante 24 h e corados com cristal violeta...... 54

Figura 13 - Biofilme de Streptococcus pyogenes formado sobre lamínulas de vidro, em

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meio BHI, durante 24 h e corado com LIVE/DEAD BacLight kit (Molecular Probes Inc.)...... 56

Figura 14 - Microscopia confocal de varredura a laser dos biofilmes de S. phocae (A), (B) S. parauberis e (C) S. pyogenes...... 57

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Composição dos meios de cultura utilizados para formação de biofilmes de amostras de diferentes espécies de Streptococcus...... 34

Tabela 2 – Valor de p para comparação da ordem de utilização dos aparelhos...... 48

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AS – Ágar Sangue

ATCC – American Type Culture Collection

BHI – Brain Heart Infusion

CCA – Carbon Catabolite Activation

CCR – Carbon Catabolite Repression

CIB – Concentração Inibitória do Biofilme

CIM – Concentração Inibitória Mínima

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

CLSM – Microscopia Confocal de Varredura a Laser

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

DNAe – Ácido Desoxirribonucléico extracelular

DO – Densidade Ótica

EPS – Substância Polimérica Extracelular

FAD – Dinucleótido de Flavina e Adenina

FTS – Frutosiltransferase

GBP – Proteína Ligante de Glucana

GTF – Glicosiltransferase

HIB – Heart Infusion Broth

MEGA – Molecular Evolucionary Genetics Analysis

MHB – Müeller-Hinton Broth

NAD – Dinucleotídeo Nicotinamida-Adenina

PTS – Phosphoenolpyruvate – carbohydrate phosphotransferase system rRNA – Ácido ribonucléico ribossomal subCIM – Concentração Subinibitória

THB – Todd-Hewitt Broth

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO...... 15 1 OBJETIVOS...... 31 2 MATERIAIS E MÉTODOS...... 32 2.1 Amostras bacterianas...... 32 2.2 Avaliação do relacionamento filogenético das espécies em estudo...... 33 2.3 Quantificação da biomassa de biofilmes formados em diferentes meios de cultura: ensaio semiquantitativo do cristal violeta...... 33 2.4 Influência da presença de glicose e de sacarose na formação de biofilmes de Streptococcus ...... 35 2.5 Susceptibilidade de biofilmes de Streptococcus à ampicilina e à eritromicina...... 35 2.5.1 Determinação da concentração inibitória de ampicilina e de eritromicina em biofilmes de Streptococcus...... 36 2.5.1.1 Ensaio de redução do azul de Alamar ...... 36 2.5.1.2 Método do cristal violeta e correlação com o ensaio do azul de Alamar...... 37 2.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de ampicilina e de eritromicina em amostras de Streptococcus...... 38 2.6 Influência de concentrações subinibitórias (subCMIS) de ampicilina e de eritromicina na formação de biofilmes ...... 39 2.7 Avaliação comparativa da presença de proteinas e DNA na constituição da substância polimérica extracelular (matriz extracelular)...... 39 2.8 Avaliação da arquitetura de biofilmes de Streptococcus por técnicas de microscopia...... 40 2.8.1 Microscopia ótica de luz...... 40 2.8.2 Microscopia confocal de varredura a laser ...... 41 3 RESULTADOS...... 42 3.1 Avaliação do relacionamento filogenético das espécies estudadas ...... 42 3.2 Quantificação da biomassa de biofilmes formados em diferentes meios de cultura...... 42 3.3 Influência da presença de glicose e de sacarose na formação de

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biofilmes de Streptococcus...... 44 3.4 Determinação da susceptibilidade de células em cultura (CIM) e de biofilmes (BIC) por ampicilina e eritromicina ...... 47 3.5 Correlação do ensaio de determinação da CIB pela redução do azul de Alamar e quantificação da biomassa pelo método do Cristal Violeta...... 49 3.6 Influência da concentração subinibitórias de antimicrobiano na formação de biofilme...... 51 3.7 Avaliação comparativa da presença de proteínas e DNA na constituição da substância polimérica...... 52 3.8 Avaliação da arquitetura dos biofilmes de Streptococcus por técnicas de microscopia...... 54 4 DISCUSSÃO...... 58 CONCLUSÃO...... 68 REFERÊNCIAS...... 70

INTRODUÇÃO

Em 1874, o termo “estreptococos” foi utilizado por Billroth, para descrever micro- organismos isolados de feridas, que se apresentavam na forma de cocos arranjados em cadeias e aos pares (apud Hardie & Whiley, 1997). No final do século 19, a participação de cocos Gram- positivos nas doenças infecciosas humanas já estava bem estabelecida e Rosebach, em 1884, utilizou pela primeira vez o nome Streptococcus, de maneira genérica, para descrever bactérias isoladas de lesões supurativas, as quais nomeou de Streptococcus pyogenes (apud Colman, 1990). Os anos iniciais do século 20 foram marcados pelo intenso desenvolvimento de metodologias fundamentais à caracterização bacteriana, que tiveram grande impacto na classificação e entendimento da importância clínica e econômica do gênero Streptococcus, tais como: (i) a diferenciação baseada na atividade hemolítica em meio ágar adicionado de sangue, proposto por Shottmuler em 1903, que identifica os padrões de hemólise α (alfa ou parcial), β (beta ou total) e γ (gama ou não hemolítico) (apud Facklam, 2002); (ii) reações de fermentação de açúcares; e (iii) detecção, por testes sorológicos, de antígenos (carboidrato C) obtidos de extratos ácidos das células bacterianas (Hardie & Whiley, 1997). A classificação baseada nas características antigênicas do carboidrato C, presente na parede celular dos estreptococos, foi descrita por Rebecca Lancefield, em 1933. A princípio, o sucesso desta metodologia foi prontamente reconhecido, particularmente, por discriminar as amostras beta-hemolíticas envolvidas em infecções humanas. Nestes casos, a sorogrupagem apresentava considerável correlação com os resultados obtidos em testes bioquímicos, anteriormente propostos. Entretanto, a sua ampla utilização resultou na constatação de que algumas espécies fisiologicamente heterogêneas podiam apresentar o mesmo grupo antigênico, passando então a confundir a taxonomia dos Streptococcus (Hardie & Whiley, 1997). Em 1937, Sherman, reunindo os dados, até então conhecidos, de diferenciação por atividade hemolítica, grupos antigênicos do carboidrato C e testes fenotípicos, propôs a criação de quatro grupos, que foram denominados de: piogênico, viridans, láctico e enterococos. O grupo dos piogênicos incluía espécies com características beta-hemolíticas, apresentando os antígenos dos grupos A, B, C, E, F e G, comuns em infecções humanas e animais. O grupo viridans incluiu as espécies frequentemente isoladas da cavidade oral e trato intestinal, que além de não serem beta-hemolíticas, também apresentavam resultados negativos nos testes selecionados para caracterização dos grupos, tais como tolerância a altos valores de pH, concentrações elevadas de cloreto de sódio (6,5% de NaCl) e crescimento a

10ºC. O grupo láctico reuniu espécies comumente isoladas de produtos láticos, não associadas às infecções humanas, não beta-hemolíticas, incapazes de crescer a 45ºC e em meios contendo 6,5% de NaCl. Enquanto que, no grupo dos enterococos foram reunidas as amostras de origem fecal que apresentavam características marcadamente diferentes dos demais grupos, como crescimento em uma ampla faixa de temperatura (10°C a 45°C), em meio contendo 6,5% NaCl e em caldo com pH ajustado para 9,6, além da capacidade de resistir a temperatura de 60°C por 30 minutos. A partir de então, a classificação de Sherman passou a ser, então, a mais amplamente aceita para os estreptococos (apud Hardie & Whiley, 1997). Nas décadas posteriores (anos 50 e 60), a maioria dos estudos que acarretaram em sugestões e mudanças na estrutura taxonômica do gênero Streptococcus relacionavam-se a amostras pertencentes ao grupo viridans, principalmente aquelas isoladas da cavidade oral, (Colman & Williams, 1965; Coykendall, 1989). Entretanto, a inclusão de novas espécies e a heterogeneidade observada nas diferentes tentativas de arranjos propostos até então, permaneciam como motivadores de novos estudos taxonômicos. Com isso, na oitava edição do Manual Bergey, de 1974, a descrição de Deibel e Seeley reorganiza o gênero, mais uma vez, em quatro grupos I-IV, contendo 21 espécies. Os autores omitem a caracterização de Sherman, diante da descoberta de espécies que permeavam os grupos originalmente descritos por este autor (Whitworth, 1990; Hardie & Whiley, 1997). A partir da década de 80, com o desenvolvimento de novas técnicas, utilizando principalmente hibridação DNA/DNA, modificações taxonômicas significantes ocorreram, acarretando tanto a transferência de espécies reconhecidas para outros gêneros – como a criação de Enterococcus (Schleifer et al., 1984) e Lactococcus (Schleifer et al., 1985) – quanto na inclusão de novas espécies. O avanço das técnicas moleculares culminou com uma nova classificação, em 1995, sugerida por Kawamura e colaboradores. Estes autores, avaliando sequências do gene que codifica o rRNA 16S dividiram o gênero Streptococcus em 6 grupos principais: bovis, salivarius, mutans, mitis, anginosus ou milleri e piogênico. Em 2002, Facklam considerando que a taxonomia do gênero, apesar de refletir os avanços obtidos com as técnicas moleculares (como hidridização DNA-DNA, sequenciamento do gene que codifica 16S rRNA, entre outras), que proporcionaram delinear um painel do relacionamento filogenético entre as espécies, resultaram em numerosas e variadas alterações, que terminaram por complicar o reconhecimento das espécies pelos métodos utilizados nos laboratórios de rotina. As espécies de Streptococcus conhecidas até

então e o seu relacionamento filogenético definido pelo sequenciamento do gene que codifica 16S rRNA estão apresentados na Figura 1. Assim, considerando que o teste chave para agrupar os estreptococos seria a atividade hemolítica em ágar sangue, o autor (Facklam, 2002) separou o gênero em dois grandes grupos: os β-hemolíticos e os não β-hemolíticos. Ambos os grupos apresentavam subdivisões, definidas por características fenotípicas, ressaltando a necessidade de sua identificação e com a intenção de favorecer a classificação no diagnóstico clínico. No primeiro, agrupou as espécies beta-hemolíticas e, no segundo, alocou o Streptococcus pneumoniae, Streptococcus suis e os grupos bovis, salivarius, mutans, sanguinis, mitis e anginosus (não β-hemolíticos).

Figura 1 - Relacionamento filogenético entre 55 espécies do gênero Streptococcus, baseado na análise da sequência do gene que codifica o rRNA 16S (gene rrs)

Legenda: O dedrograma foi construído pelo método CLUSTAL, com auxílio do aplicativo DNASTAR. A barra numerada representa a distância entre pares de sequências. Em destaque, o ramo onde se localiza as espécies avaliadas neste estudo. Fonte: Adaptado de Facklam R., 2002.

Em 2006, em um trabalho de revisão, Köhler reúne os dados até então obtidos pelos diversos autores, reporta a importância do arranjo dos estreptococos em grupos filogenéticos, inclui espécies recém-descobertas e destaca a necessidade da utilização da metodologia de sequenciamento de genes alvo, particularmente o que codifica o rRNA 16S. Destacam-se, também, para caracterização do gênero, bem como na identificação de novas espécies, o

sequenciamento do gene responsável pela expressão de superóxido dismutase manganês- dependente (gene sodA) e daquele que codifica a subunidade B da RNA polimerase (gene rpoB), dentre outros (Poyart et al., 1998, 2002; Drancourt et al., 2004; Vela et al., 2011). A classificação das espécies no gênero permanece dinâmica e nestes últimos dez anos pode-se observar a inclusão de novas espécies, bem como a realocação de outras. Segundo a lista de espécies de procariotos disponibilizada por Euzéby (última atualização dezembro de 2011), o gênero Streptococcus é composto, atualmente, das seguintes espécies e subespécies: S. acidominimus, S. agalactiae, S. alactolyticus, S. anginosus, S. australis, S. bovis, S. caballi, S. canis, S. castoreus, S. constellatus subsp. constellatus, S. constellatus subsp. pharyngis, S. criceti, S. cristatus, S. dentapri, S. dentirousetti, S. devriesei, S. didelphis, S. downei, S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae, S. dysgalactiae subsp. equisimilis, S. entericus, S. equi subsp. equi, S. equi subsp. ruminatorum, S. equi subsp. zooepidemicus, S. equinus, S. ferus, S. gallinaceus, S. gallolyticus subsp. gallolyticus, S. gallolyticus subsp macedonicus, S. gallolyticus subsp. pasteurianus, S. gordonii, S. halichoeri, S. hyointestinalis, S. hyointestinalis, S. hyovaginalis, S. ictaluri, S. infantarius subsp. coli, S. infantarius subsp. infantarius, S. infantis, S. iniae, S. lactarius, S. lutetiensis, S. macacae, S. marimammalium, S. massiliensis, S. merionis, S. minor, S. mitis, S. mutans, S. oligofermentans, S. oralis, S. orisratti, S. orisuis, S. ovis, S. parasanguinis, S. parauberis, S. peroris, S. phocae, S. pleomorphus, S. pluranimalium, S. plurextorum, S. pneumoniae, S. porci, S. porcinus, S. porcorum, S. pseudopneumoniae, S. pseudoporcinus, S. pyogenes, S. ratti, S. rupicaprae, S. salivarius subsp. salivarius, S. salivarius subsp. thermophilus, S. sanguinis, S. sinensis, S. sobrinus, S. suis, S. thermophilus, S. thoraltensis, S. uberis, S. urinalis, S. ursoris, S. vestibularis. O gênero Streptococcus pertence à família Streptococacceae e se apresentam como células esféricas ou ovóides, Gram-positivas, medindo menos que 2µm de diâmetro, formando pares ou cadeias, que são melhores evidenciadas quando cultivadas em meio líquido. Não são células móveis, como também não formam esporos. São anaeróbios facultativos, com algumas espécies necessitando de CO2 adicional para crescimento (capnofílicas). Todos os componentes do gênero apresentam metabolismo fermentativo produzindo, predominantemente o ácido lático como produto final, sem formação de gás. Na quase totalidade, os membros do gênero não apresentam citocromos e são catalase negativa (Brandt & Spellerberg, 2009). As espécies do gênero são exigentes em termos nutricionais, tornando necessário o uso de meios de cultura complexos. Apresentam crescimento ótimo na temperatura de cerca de

37ºC, com algumas exceções. A parede celular é composta principalmente de peptideoglicana associada a uma variedade de carboidratos, ácido teicóico e antígenos protéicos de superfície. Açúcares aminados e glicosamina também estão sempre presentes na composição da peptideoglicana, enquanto galactosamina só constiui a parede celular de algumas espécies. São capazes de formar cápsulas de ácido hialurônico nas primeiras fases de crescimento, enquanto que uma cápsula polissacarídica é detectável na superfície dos pneumococos (Brandt & Spellerberg, 2009). Os micro-organismos pertencentes ao gênero podem ser isolados a partir de uma ampla diversidade de sítios anatômicos em animais homeotérmicos e em seres humanos, seja compondo a microbiota anfíbiôntica ou como agentes patogênicos. Três fatores são citados como os responsáveis pelo sucesso do gênero estar presente em diferentes hospedeiros: habilidade para aderir na maioria das superfícies presentes no meio ambiente; capacidade de utilizar rapidamente nutrientes presentes em um meio em constante mudança e capacidade de tolerar, resistir ou até mesmo destruir as defesas do hospedeiro. Várias espécies são capazes de expressar adesinas, que reconhecem componentes do soro, da matriz extracelular (como fibronectina e plasminogênio) e das células do hospedeiro, ou ainda, de outros micro- organismos. Essa característica facilita a sua presença nos mais diversos processos infecciosos como cárie, faringite, meningite, endocardite, gangrena, infecções nos tratos geniturinário e respiratório, septicemias e uma gama de infecções em animais. Apesar das infecções estreptocócicas não serem consideradas zoonóticas, a maioria das espécies demonstra maior especificidade por um determinado hospedeiro animal (Jenkinson & Lamont, 1997). Neste estudo, foram avaliadas 18 amostras representativas de diferentes espécies e subespécies de Streptococcus que apresentam estreito relacionamento filogenético, e compõem o grupo caracterizado como piogênico, segundo Facklam (2002) e Köhler (2006). Este inclui espécies isoladas de humanos, animais ou de ambos; corresponde, em maioria, a amostras β-hemolíticas em ágar sangue de carneiro e pertencentes a variados grupos de Lancefield. A seguir, há um resumo das suas principais características fisiológicas, virulência e participação em processos infecciosos. S. pyogenes, conhecido também como estreptococos do grupo A de Lancefield é um dos mais importantes patógenos no gênero e exclusivo de seres humanos. Entretanto, não é o único representante do gênero que expressa esse antígeno. É o agente etiológico de diversas infecções em humanos, com graus variados de severidade, porém, o trato respiratório superior (causando faringite estreptocócica) e a pele (causando impetigo) são os principais sítios de

infecção e de transmissão. Estão, portanto, associados tanto a infecções superficiais quanto profundas graves, particularmente devido à expressão de toxinas, superantígenos e mecanismos mediados pelo sistema imune do hospedeiro Algumas cepas têm emergido como causas graves de doenças invasivas, destacando-se a síndrome do choque tóxico estreptocócico e a fascite necrosante. Além disso, são importantes, também, devido à participação em complicações não supurativas, como a febre reumática e a glomerulonefrite decorrentes de episódios de faringite e/ou impetigo. Curiosamente, estes micro-organismos mantém-se sensíveis a penicilina, que permanece até hoje como droga de escolha no tratamento das infecções em pacientes não alérgicos (Cunningham, 2000). A proteína M é um importante fator de virulência nesta espécie. Presente também em outras espécies, esse antígeno de superfície permite uma evasão da fagocitose por células do hospedeiro. Essa molécula possui uma porção N terminal muito variável, caracterizando um tipo específico para cada antígeno (Steer et al., 2007). Esse fato foi explorado por Lancefield, ao utilizar antissoros diferentes para testar subtipos de S. pyogenes. Atualmente, os distintos tipos são classificados com base na proteína M através de estudos de genotipagem da porção terminal do gene correspondente (emm sequence typing). Além da proteína M, outro fator de virulência responsável pela evasão do sistema imune pela espécie é C5a peptidase, que inibe a lise mediada pelo complemento. Outros fatores de virulência são importantes para espécie como exoenzimas como DNase, hialuronidase, enzimas que degradam IgG, exotoxina pirogênica Spe A e C e estreptoquinase (Cunningham, 2000; McMillian et al., 2007; Steer et al., 2007). Outra espécie relevante é S. agalactiae, ou estreptococos do grupo B de Lancefield que foram, inicialmente, reconhecidos como patógenos importantes em mastite bovina. Causa sepse neonatal, tendo como principal fator de risco a colonização do trato genitourinário e gastrintestinal da gestante. É responsável, também, por doenças invasivas em adultos, geralmente associadas a infecções pós-parto ou em pacientes imunossuprimidos e portadores de doenças de base, como indivíduos soropositivos para o vírus da imunodeficiência humana – HIV, diabete, câncer, dentre outras (Skoff et al., 2009; Philpson et al., 1995). Como causador de mastite bovina, apresenta um impacto relevante na produção de leite, sendo capaz de sobreviver por longos períodos dentro da glândula mamária (Erskine & Eberhart, 1990; Erskine et al.,1996). A transmissão pode ocorrer de animal para animal, devido à falta de higiene do ordenhador, através das mãos e equipamentos contaminados (Keefe, 1997).

As subespécies S. dysgalactiae subsp dysgalactiae e S. dysgalactiae subsp equisimilis são geneticamente relacionadas, mas apresentam características diversas. O primeiro é um importante patógeno animal, pertencente ao grupo C de Lancefield. As amostras não são β- hemolíticas e expressam alguns fatores de virulência semelhantes a S. pyogenes, incluindo a proteína M (proteínas M-like). Enquanto que, o segundo pode expressar os antígenos dos grupos A, C, G e L de Lancefield. S. dysgalactiae subsp equisimilis é um patógeno humano, sendo as cepas que apresentam os antígenos C e G mais comumente isoladas de infecções, do que A e L. Também, apresentam fatores de virulência similares aos S. pyogenes, incluindo elevado grau de homologia em emm (gene que codifica a expressão da proteína M) (Facklam et al.,1999). Já o S. equi subsp equi e o S. equi subsp zooepidemicus, expressam o antígeno de grupo C de Lancefield. O primeiro é um patógeno animal, reconhecido agente de infecções do trato respiratório em equinos (garrotilho). O segundo é isolado de infecções humanas, mas também é causa frequente de mastite em bovinos. S. equi subsp zooepidemicus apresenta uma proteína de superfície característica (Szp), antigenicamente variável e estruturalmente semelhante à proteína M. No Brasil, esta subespécie foi associada a um surto de nefrite na cidade de Nova Serrana, MG (Balter et al., 2000). Uma espécie não muito comum em seres humanos, Streptococcus porcinus, foi recentemente diferenciada de Streptococcus pseudoporcinus (Bekal et al., 2006). A primeira está associada a infecções em porcos (abscessos, pneumonia e sepses); porém também é isolada do trato geniturinário de mulheres (Duarte et al., 2005) e já foi relacionada a casos de abortos espontâneos (Martin et al., 2004). S. porcinus pode expressar os antígenos dos grupos E, P, U e V e algumas cepas reagem com o preparado comercial para caracterização do grupo B por testes sorológicos. Diante da possibilidade da caracterização desta espécie ser confundida com S. agalactiae, acredita-se que a sua incidência ainda possa estar subestimada. S. pseudoporcinus já foi identificada em material clínico de origem humana e suína, que inicialmente haviam sido erroneamente identificadas como S. porcinus. A diferenciação entre as duas espécies é difícil, sendo o sequenciamento do gene que codifica o rRNA 16S uma ferramenta fundamental neste caso (Bekal et al., 2006). Outra espécie de interesse veterinário é S. iniae, que não expressa antígeno de grupo de Lancefield. Foram inicialmente isoladas de abscessos subcutâneos de golfinhos de água doce da Amazônia. Atualmente, é motivo de preocupação por ser responsável por surtos de doenças em piscicultura (principalmente, tilapicultura). As infecções por essa espécie chegam

a dizimar plantéis inteiros, acarretando em grande prejuízo econômico. Em humanos, os primeiros casos foram relacionados à celulite nas mãos de manipuladores relacionados ao trabalho em piscicultura ou comércio de peixes. Casos de artrites, meningites e endocardites em humanos, também, já foram relatados (Weinstein et al., 1997; Figueiredo & Leal, 2008). Outros dois micro-organismos estudados foram S. uberis e S. parauberis. O primeiro também tem importância destacada na epidemiologia da mastite bovina, causando infecções crônicas e persistentes (McDougall et al., 2004). Apesar das estratégias de prevenção, a mastite causada por S. uberis é de difícil controle (Leigh, 1999). Estudos já demonstraram que esta espécie é capaz de evadir do sistema imune. Almeida e Oliver (1993) demonstraram que 40% dos isolados de mastite bovina são hábeis em produzir uma cápsula de ácido hialurônico, e a expressão desta é aumentada na presença de lactose e caseína. Fang e colaboradores (2000) relataram que componentes do leite como lactoferrina também auxiliam no processo de aderência e invasão nas células hospedeiras. S. uberis também é capaz de sobreviver intracelularmente por longos períodos, proporcionando um microambiente adequado para a persistência da infecção (Tamilselvan et al., 2006). Três espécies são, primariamente, patógenos de suínos: S. suis, S. porci e S. porcorum. Entretanto, S. suis é um importante patógeno zoonótico causador de infecções severas em humanas como meningite, artrite e septicemia, que eventualmente podem levar a morte (Wang et al., 2011). Apresenta os antígenos R, S ou T de Lancefield. S. suis liga-se aos componentes da matriz extracelular, bem como a células epiteliais e endoteliais, contribuindo para sua disseminação e virulência (Charland et al., 2000; Benga et al., 2004; Esgleas et al., 2005). As duas outras espécies, descritas recentemente, são isoladas, exclusivamente, de porcos de criação e selvagens, e são geneticamente relacionadas à S. suis. A espécie S. porci apresenta o antígeno B de Lancefield, enquanto que S. porcorum pertence ao grupo (Vela et al., 2010; Vela et al., 2011). As espécies S. phocae e S. didelphis não foram isoladas de humanos. Amostras de S. phocae podem reagir com antissoros específicos para os grupos C e F de Lancefield ou serem “não grupáveis”; são patógenos reconhecidos em focas, cetáceos e peixes. A espécie S. didelphis não expressa antígenos de Lancefield e foi isolada como causa de lesões na pele, fígado, baço e pulmões de gambás. Esta espécie apresenta uma particularidade importante, pois apesar de pertencer ao gênero Streptococcus, é catalase positiva. Entretanto, esta propriedade é perdida por sucessivas passagens em meio de cultura (Rurangirwa et al., 2000).

O S. canis é isolado da pele, trato respiratório superior e genital em cães causando aborto séptico, vaginites, mastites, síndromes análogas ao choque tóxico e fascite necrosante; pode também ser responsável por mastite em bovinos (incluindo subclínica) e por artrite séptica e linfadenite em gatos (De Winter et al., 1999; Maggie et al., 2007, Lamm et al.; 2010). Já o S. urinalis, patógeno humano de ocorrência rara; foi isolado de infecção urinária em paciente do sexo feminino e bacteremia (Peltroche-Lacsahuanga et al., 2012). Para a maioria das espécies de Streptocococcus, a cronicidade das infecções, em humanos ou animais, leva a um pior prognóstico e a possibilidade de falhas terapêuticas. Infecções crônicas podem estar associadas à formação de biofilmes, tema motivador deste estudo. O sucesso no estabelecimento destas infecções é decorrente do ambiente que os biofilmes proporcionam, funcionando como um refúgio das células do hospedeiro e de antimicrobianos; atuando como um reservatório de micro-organismos altamente munidos de diversos mecanismos de virulência, sabidamente competentes a colaborar com o processo infeccioso. Dentre as espécies do gênero, Streptococcus mutans e Streptococcus pneumoniae são as que apresentam um maior número de trabalhos relacionados na literatura especializada. Enquanto que, para as demais os dados são raros ou inexistentes. Biofilmes são comunidades organizadas onde micro-organismos crescem e sobrevivem aderidos a superfícies ou interfaces, envolvidos por uma matriz construída de substâncias poliméricas extracelulares (Donlan, 2002). Inicialmente o termo “Biofilme” foi usado de maneira coloquial e só foi publicado cientificamente em 1977 por Harremoës, no artigo "Half-order reactions in biofilm and filter kinetics". A partir de então, começou-se a procura por uma melhor definição de características e propriedades dessas verdadeiras “sociedades microbiológicas”. Em 1978, Costerton e colaboradores conceituaram biofilmes como células isoladas e microcolônias embebidas em uma grande e hidratada matriz composta, predominantemente, de exopolímeros. Já em 1995, o mesmo grupo de pesquisadores estendeu este conceito, explicando os mecanismos pelo quais os micro-organismos aderem aos materiais bióticos e abióticos e os benefícios acumulados por este nicho, e demonstraram que a adesão desencadeia a expressão dos genes que controlam a produção de componentes bacterianos necessários para o processo como um todo, que seria regulado por genes específicos transcritos durante a adesão inicial da célula (Donlan & Consterton, 2002).

A formação do biofilme pode ser divido em etapas: adesão e interação célula a célula, formação de microcolônias, formação de um biofilme confluente e desenvolvimento de uma estrutura tridimensional (O’Toole et al., 2000), conforme exemplificado na Figura 2.

Figura 2 - Esquema representativo da sequência temporal da formação de biofilmes por Streptococcus

(A) (B) (C) (D)

Legenda: (A) Inicialmente, as células bacterianas se associam a superfície (colonizadores primários), utilizando interações de “longo alcance”, como pili, que, quando in vivo podem, inclusive, atravessar a camada de muco, presente na superfície de células eucarióticas. (B) Em seguida, interações mais fortes são estabelecidas, com a expressão de múltiplas adesinas, representadas como apêndices mais curtos. (C) A adaptação nutricional e ao ambiente, a expressão de moléculas sinalizadoras (representadas como estrelas), que acarretam o desencadeamento de mecanismos geneticamente regulados por Quorum sensing, e a produção de substância polimérica extracelular (EPS, matriz extracelular) determinam o acúmulo e aparecimento de agregados celulares. (4) A incorporação de outros micro-organismos, coagregação e sinalização, permitem o desenvolvimento de “comunidades” complexas, que contêm associações específicas com a rede metabólica, conferindo uma maior eficiência na utilização dos nutrientes e reduzindo a susceptibilidade aos antimicrobianos e às defesas do hospedeiro. Fonte: Adaptado de Nobbs, 2009.

Todo o processo é dirigido pelo fenômeno de quorum sensing, através da participação de moléculas sinalizadoras, que determinam a expressão gênica de acordo com a densidade populacional. A adesão inicial ocorre quando os colonizadores primários interagem com proteínas e outros compostos orgânicos através de ligações físico-químicas. A interação célula a célula e formação de microcolônias são etapas dependentes das condições ambientais, tais como temperatura, pH, níveis de oxigênio, hidrodinâmica, osmolaridade e a presença de determinados íons, nutrientes e fatores derivados do meio biótico. Esses fatores incidem nas vias de regulação dos elementos enzimáticos e estruturais que são necessários para a formação e dispersão, determinando o padrão comportamental de uma espécie bacteriana no desenvolvimento de seu biofilme (Costerton et al., 1987; Lappin-Scott & Bass, 2001; Dunne Jr, 2002; Goller & Romeo, 2008).

Na adesão inicial, as fímbrias e flagelos desempenham um importante papel, pois são capazes de romper a barreira eletrostática promovida pela hidrofobicidade da própria célula em contato com a superfície do substrato (Donlan, 2002). Estudos têm demonstrado que a maioria dos microrganismos adere mais rapidamente às superfícies hidrofóbicas, como plásticos, do que hidrofílicas, como vidro e metais (Goller & Romeo, 2008). Após o desenvolvimento em condições adequadas, os colonizadores primários passam a ser substrato para a aderência de secundários, saindo da condição de microcolônias para uma grande comunidade bacteriana. Durante esse processo, há um aumento na produção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) criando uma matriz em torno das células. Para garantir a circulação de nutrientes e demais moléculas necessárias para o desenvolvimento do biofilme, os grupos de células são separados por canais (Stewart & Franklin, 2008). Toda essa sequência garante que a comunidade esteja aderida irreversivelmente ao substrato, iniciando, logo em seguida, o processo de maturação do biofilme. Neste momento, há um aumento na densidade celular dos grupos formados, levando a uma maior complexidade. Essa expansão prossegue até alcançar um equilíbrio dinâmico, onde as células mais externas do biofilme se destacam, partindo para dar início a uma nova etapa de colonização (Marshal, 1992; Dunne Jr, 2002). O fluxo de fluídos externos ao biofilme, onde o substrato se encontra, pode promover esse destacamento, porém esse processo também pode ser realizado ativamente, através das enzimas secretadas pelas bactérias que quebram a matriz extracelular, liberando-as (Telgmann et al., 2004; Nadell et al., 2009). Foi observado que mutantes deficientes para produção de EPS não foram capazes de formar biofilme, revelando sua importância na adesão inicial e suporte estrutural para a comunidade (Nadell et al., 2009). As propriedades físicas e químicas das substâncias poliméricas extracelulares podem variar, é predominantemente aniônico, podem ser compostos por íons metálicos, cátions divalentes e outras macromoléculas como proteínas, DNA e lipídios (Briandet et al., 2001; Donlan, 2002; Dunne Jr, 2002; Ghigo, 2003). Todos os aspectos envolvidos na vida celular como propriedades fisiológicas, genéticas, interações físico-químicas irão influenciar no biofilme (Landini et al., 2010). Devido a grande densidade celular, notoriamente superior a uma cultura de células planctônicas, as células aderidas encontram limitações no aporte de oxigênio e nutrientes, e níveis elevados de metabólitos secundários e substâncias excretadas, acarretando na formação de subpopulações localizadas em diferentes regiões, apresentando expressões gênicas e condições fisiológicas e metabólicas diferentes (Sporman, 2008). No entanto, essa expressão

diferencial é causa, também, da própria heterogeneidade global, que é encontrada dentro do biofilme, no que tange ao gradiente químico de difusão em microescalas (Stewart & Franklin, 2008). As alterações que ocorrem nas células aderidas quando comparadas com as planctônicas passam por diversos aspectos como a expressão de pili e flagelos, produção de polissacarídeos e até mesmo na morfologia (Jefferson, 2004). Estas alterações, na expressão gênica das células do biofilme, levam a um perfil metabólico diferente das células não aderidas, fazendo com que seu crescimento seja mais lento (Donlan & Costerton, 2002; Anderl et al., 2003; Borriello et al., 2004; Anderson & O’Toole, 2008). Essa mudança no comportamento metabólico tem sido apontada como um mecanismo de escape aos agentes antimicrobianos, conferindo maior resistência. Um biofilme maduro pode tolerar concentrações 10-1000 vezes maiores que as necessárias para matar células planctônicas (Lewis, 2001). Uma gama de agentes antimicrobianos age em moléculas relacionadas a síntese, portanto o lento ou o não crescimento dessas células, as tornem menos susceptíveis a sua ação (Rani et al., 2007; HØiby et al., 2010). Além disso, a própria matriz extracelular funciona como uma barreira física, impedindo a difusão dos agentes, levando a concentrações inferiores as inibitórias no interior do biofilme e em alguns casos moléculas como DNA, polissacarídeos e proteínas interagem com o antimicrobiano, acarretando na diminuição de sua ação (Donlan & Costerton, 2002). O ambiente enclausurado do biofilme também propicia a aquisição de determinantes de resistência por facilitar os processos de transferências de genes, além de conferir uma maior resistência à fagocitose dificultando a ação de defesa pelo hospedeiro (Davey & O’Toole, 2000; Lewis, 2001). Membros do gênero Streptococcus são conhecidos por formarem biofilmes em diferentes sítios anatômicos como superfície do dente, válvulas cardíacas e amígdalas, além de dispositivos médicos implantados (Moscoso, García & López, 2006). Um formador já bem estudado é o Streptococcus mutans que consiste em um notável exemplo da formação de biofilme pela microbiota oral, sendo o principal agente etiológico da cárie dental, prevalente em 70-100% dos casos (Matsui & Cvitkovitch, 2010). Entretanto, a relação entre essa espécie e a cárie só foi estabelecida após diversos estudos in vitro que demonstraram um aumento estatisticamente significativo na contagem de células bacterianas em dentes preparados para o desenvolvimento das lesões. Após o reconhecimento dessa associação, décadas de pesquisa estiveram focadas não somente na identificação de fatores de virulência, mas também na compreensão de como são regulados no biofilme. Três fatores são fundamentais para o início e progressão da cárie: (i) habilidade para metabolizar carboidratos

da dieta e produzir ácido lático (acidogenicidade), (ii) habilidade para crescer e sobreviver em ambiente de baixo pH (aciduricidade) e (iii) capacidade de utilizar de açúcares da dieta para produzir polímeros e formar o biofilme (Senadheera & Cvitkovitch, 2008). A formação de biofilmes no dente é iniciada por interações específicas entre adesinas do S. mutans e receptores tanto do hospedeiro, como de outras bactérias que já revestiam a superfície do dente. Micro-organismos como Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis e Streptococcus sanguinis, servem como pioneiros que iniciam a formação do biofilme. Esses colonizadores primários possibilitam a adesão dos secundários, criando uma diversidade dentro da comunidade bacteriana (Kolenbrander, 2000; Kolenbrander et al., 2002; Rickard et al., 2003). S. mutans coloniza a superfície dental via mecanismos sacarose dependente e independente. Na presença deste açúcar, enzimas glicosiltransferase (GTF), codificadas pelos genes gtfB, C e D, produzem polímeros insolúveis em água, que juntamente com proteínas ligantes de glucana (GBPs), desempenham um papel chave na adesão e acúmulo do biofilme (Banas & Vickerman, 2003; Nobbs et al., 2009). O mecanismo independente de sacarose é mediado pela proteína associada à superfície, P1 (SpaP), que é uma adesina multifuncional que facilita a ligação do micro-organismo a componentes do esmalte bem como a colágeno e a outras proteínas do hospedeiro (Lemos et al., 2005). A espécie S. pneumoniae tem sido outro modelo dentro do gênero, onde os estudos em biofilmes têm sido mais concentrados. Recentemente, a formação de biofilme ganhou atenção por uma possível participação na adaptação a diferentes condições e na virulência desse micro-organismo. Diversos estudos têm associado alguns tipos de infecções como otite média e meningite, assim como a colonização da nasofaringe à capacidade de formar biofilme (Hall- Stoodley et al., 2006; O´Brien et al., 2009; Camilli et al., 2011). A presença dessas comunidades nos sítios de infecção causa desordem nos tecidos, porém a sua importância no processo infeccioso ainda é fonte de debates. Dois estudos recentes falharam ao tentar encontrar uma associação entre a habilidade de formar biofilme e infecções invasivas por pneumococos (Tapiainen et al., 2010). Além disso, um estudo utilizando modelo murino falhou ao demonstrar uma relação entre capacidade de causar bacteremia e formar um biofilme maduro (Lizcano et al. 2010). Em contrapartida, Trappeti e colaboradores (2011) demonstraram que durante o processo infeccioso, a formação da matriz extracelular aumenta a habilidade dos pneumococos causarem infecções invasivas. Estes autores, através de modelo in vivo e por

análise de microarranjos, observaram que amostras mutantes para genes relacionados à captação de colina e sistema de dois componentes ciaRH, não foram capazes de formar matriz extracelular assim como translocar para pulmões ou cérebro e, também, aderiram pobremente a células epiteliais alveolares humanas. Outra espécie associada à produção de biofilme e patogênica para o ser humano é S. pyogenes, sendo uma das primeiras observações realizadas por Akiyama e colaboradores (2003), em um estudo com amostras associadas a infecções da pele. Os autores observaram, através de microscopia confocal de varredura a laser, que as células bacterianas apresentavam-se organizadas nas lesões na forma de microcolônias, que pareciam estar envolvidas por uma matriz. Outros estudos revelaram características importantes como o papel do regulador de virulência, conhecido como Srv, e a presença de cisteína protease inibem a formação do biofilme (Doern et al., 2010). Um relato notável foi observação da expressão de pili e formação de microcolônias sob células epiteliais pulmonares, após a acidificação do meio, devido à fermentação de açúcares (Manetti et al., 2010). A formação de biofilme também pode ter um importante papel na patogenicidade de S. agalactiae (Kaur et al. 2009, Rinaudo et al., 2010). Contudo, os dados disponíveis na literatura são muito limitados. Pode-se destacar um estudo realizado na Índia onde amostras isoladas de mulheres grávidas assintomáticas foram melhores formadoras de biofilmes do que as sintomáticas (Kaur et al. 2009). Outros estudos revelam a importância do pili na aderência inicial do S. agalactiae para a formação do biofilme, principalmente o do tipo 2a (Rinaudo et al., 2010; Konto-Ghiorghi et al., 2009). Em relação as amostras de S. agalactiae envolvidas em casos de mastite bovina, considera-se que a cronicidade da infecção está diretamente relacionada a formação de biofilmes (Michie et al., 2003; Contreras & Rodríguez, 2011). A mastite causada por Streptococcus uberis, caracteristicamente crônica e persistente, é um processo relacionado a biofilmes (McDougall et al., 2004). Foi demonstrado recentemente que α- e β-caseína, componentes importantes do leite do hospedeiro, auxiliam no mesmo processo de formação de biofilmes. Assim, como a degradação da caseína, por serina proteases, também estimula a formação dessas estruturas (Varhimo et al., 2010). Além destes, já foi relatada a formação de biofilmes nas espécies S. sanguinis (Ge et al., 2008), S. gordonii (Silverman et al., 2010), S. parasanguinis (Liang et al., 2011) e S. suis (Wang et al., 2011). O paradigma do biofilme vem tomando espaço dentro do estudo da Microbiologia nos últimos anos, pois é cada vez mais notável e perceptível que as células bacterianas quando em

seu ambiente natural não estão dispostas, em maioria, na forma planctônica. Sendo assim, o estudo da dinâmica e relação das células sésseis com o hospedeiro demonstra ser mais próximo à realidade, do que em suas culturas puras. Diante do exposto, fica claro o papel de biofilmes na virulência de diferentes espécies bacterianas. Este é um importante fator para a permanência e sucesso da infecção, criando também um ambiente propício para a troca de material genético. Muito já é conhecido sobre este processo, porém em apenas poucas espécies do gênero Streptococcus, como S. mutans e S. pneumoniae. As informações sobre as demais, ainda são escassas ou até mesmo inexistentes. A importância do gênero em diversas patologias humanas e animais, bem como o caráter crônico de muitas dessas infecções, constituíram-se como agentes motivadores para a realização deste estudo.

1 OBJETIVOS

O sucesso de membros do gênero Streptococcus, no estabelecimento de diferentes infecções, possivelmente, é facilitado pela capacidade de formar biofilmes, que proporciona um refúgio do ambiente e funciona como um reservatório de células munidas de diversos mecanismos de virulência, sabidamente, competentes a colaborar com o processo infeccioso. Diante dessa estreita relação, este estudo se propôs a investigar, de forma comparativa, os aspectos relacionados à formação de biofilmes, por amostras de diferentes espécies de Streptococcus. Sendo assim, foram objetivos específicos:

a) Investigar a formação de biofilmes por amostras de referência de 18 espécies de Streptococcus, geneticamente relacionadas, pertencentes ao grupo dos piogênicos em sua maioria, incluindo patógenos exclusivamente para humanos, animais ou ambos; b) Analisar de forma comparativa a influência de diferentes concentrações de glicose e de sacarose no desenvolvimento de biofilmes nestas espécies; c) Comparar os valores de concentração mínima inibitória (CMI) com as concentração inibitória para os biofilmes, frente a ampicilina e a eritromicina, que correspondem a antimicrobianos comumente utilizados na terapia das infeções causadas por Streptococcus; d) Correlacionar os efeitos de inibição, redução ou acúmulo de biomassa em biofilmes cultivados na presença de doses subinibitórias de ampicilina ou de eritromicina; e) Analisar aspectos da arquitetura através de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) e microscopia óptica de luz; f) Comparar o comportamento das espécies selecionadas com os dados obtidos por Streptococcus mutans, um exímio produtor de biofilmes pertencente ao gênero.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Amostras bacterianas

Foram analisadas 19 espécies pertencentes ao gênero Streptococcus, sendo uma amostra bacteriana por espécie. Destas, 18 são representativas de um conjunto filogeneticamente mais relacionado, que alberga em maioria espécies β-hemolíticas e usualmente alocadas no grupo dos estreptococos piogênicos (Figura 1). Neste conjunto, estão incluídos patógenos essencialmente de humanos, animais ou ambos. A espécie restante, S. mutans, foi incluída para fins comparativos, pois por não apresentar extrema relação filogenética com os demais, é reconhecida como exímia produtora de biofilme, dentre as espécies do gênero. As espécies utilizadas neste estudo foram: S. porcinus (RS-21); S. iniae (RS- 22); S. pyogenes (RS-23) S. agalactiae (RS-24); S. equi subsp equi (RS-25); S. equi subsp zooepidemicus (RS-26); S. dysgalactiae subsp dysgalactiae (RS-27); S. phocae (RS-28); S. urinalis (RS-29); S didelphis (RS-30); S. dysgalactiae subsp equisimilis (RS-31); S. parauberis (RS-32); S. suis (RS-33); S. uberis (RS-34); S. canis (RS-35); S. pseudoporcinus (RS-36); S. porci (RS- 37); S. porcorum (RS-39); e S. mutans (RS-38). Nos parênteses estão as designações atribuídas às amostras deste estudo. As amostras utilizadas neste estudo integram a coleção de culturas do Laboratório de Apoio Biotecnológico, sob a coordenação da Prof.ª Lúcia Martins Teixeira, do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Todas são derivadas de amostras depositadas na ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA). As amostras se encontravam mantidas em solução de leite desnatado a 10% (Skim Milk, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, EUA) acrescido de 10% de glicerol e em nitrogênio líquido. Todas foram reativadas por semeadura em meio ágar sangue de carneiro – AS (Plast-Labor Ind. e Com. Materiais e Equipamentos de Laboratório, Rio de Janeiro, RJ), e incubação a 36°C±1°C em aerobiose ou em capnofilia (3 a 5% de CO2, pelo sistema da jarra com vela).

2.2 Avaliação do relacionamento filogenético das espécies em estudo

As sequências do gene que codifica o rRNA16S (gene rrs), das espécies que compõem este estudo, foram obtidas do GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) e alinhadas com auxílio do aplicativo DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, WI, EUA). Nesta análise, também foi incluída a sequência de Lactococcus lactis como o representante não relacionado (outgroup). Os arranjos observados com as 19 espécies de Streptococcus foram utilizados para fins comparativos, frente aos resultados obtidos nos diferentes aspectos analisados na formação de biofilmes.

2.3 Quantificação da biomassa de biofilmes formados em diferentes meios de cultura: ensaio Semiquantitativo do Cristal Violeta

A formação de biofilme foi realizada em placas de microtitulação com 96 poços, de poliestireno e fundo chato (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) de acordo com as recomendações de Teldolkar et al. (2004). A partir de um crescimento recente (36±1ºC por 18h – 24h) em ágar sangue de carneiro (Plast-Labor Ind. e Com., Rio de Janeiro) foi confeccionada uma suspensão apresentando turbidez equivalente à escala 0,5 da escala de McFarland nos meios THB, BHI ou HIB (Todd-Hewitt Broth, Brain Heart Infusion Broth ou Heart Infusion Broth, BD Diag. System, EUA). A composição dos meios de cultura utilizados está apresentada na Tabela 1.

Tabela 1 - Composição dos meios de cultura utilizados para formação de biofilmes de amostras de diferentes espécies de Streptococcus

Meios de Cultura2/g/L Composição1 BHI THB HIB Infusão de cérebro 7,7 - - Infusão de coração 9,8 3,1 10,0 Digesto péptico de tecido animal 6,0 - - Digesto pancreático de gelatina 14,5 - - Proteose peptona - 10,0 - Triptose - - 10,0 Glicose 2,03 2,0 - Cloreto de sódio 5,0 2,0 5,0 Fosfato monossódico - 0,4 - Fosfato dissódico 2,5 - - Carbonato de sódio - 2,5 - Legenda: 1, retirada dos rótulos dos frascos originais; BHI, Brain Heart Infusion; THB, Todd- Hewitt Broth; HIB, Heart Infusion Broth; 2todos os meios foram obtidos da BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, EUA; 3, quantidade presente no lote utilizado, apesar das formulações atuais da empresa indicarem a concentração de 3,0g/L.

A cada poço da placa de microtitulação, foram adicionados 200 µL das suspensões bacterianas padronizadas. As placas foram incubadas a 36°C±1°C, durante 24 h em atmosfera enriquecida com CO2 (capnofilia). Após o período de incubação, o meio de cultura contendo células planctônicas foi removido e os poços, contendo biofilmes aderidos, foram lavados com 100 µL de solução salina fisiológica (0,85% de NaCl, USB Corporation, Cleveland, OH, EUA) estéril. Os biofilmes foram fixados com 100 µL de metanol 99% por 15 min, em temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e 50µL de cristal violeta 0,2% (Merck, Nova Jersey, EUA) foram distribuídos em cada um dos poços. Após incubação por 15 min, em temperatura ambiente, o excesso de cristal violeta foi gentilmente removido com água destilada. O corante impregnado foi solubilizado com 150 µL de ácido acético a 15% (Quimibrás Ind. Química S.A., Rio de Janeiro, Brasil). A absorbância foi medida a λ570 nm em leitor de placas de microtitulação IMark (Microplate Absorbance Reader, Bio-Rad, Philadelphia, EUA). Como critério de análise, os resultados foram equivalentes à média das leituras de seis para cada oito

réplicas por amostra, não sendo utilizados no cálculo o maior e o menor valor de DO de cada ensaio. Todos os ensaios foram realizados em duplicata e as médias obtidas foram comparadas e os desvios padrão incluídos nos resultados. Os resultados obtidos foram utilizados nas avaliações comparativas da produção de biofilmes pelas espécies estudadas. Neste estudo, convencionou-se considerar como amostras fortemente produtoras de biofilmes, aquelas que apresentaram DO570nm ≥ 1,0. A significância dos resultados obtidos (p<0,05) foi determinada pela aplicação do teste T de Student, com auxílio do aplicativo Prism 5 for Windows (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA), na determinação comparativa entre os valores de densidade ótica de biofilmes formados nos diferentes meios de cultura.

2.4 Influência da presença de glicose e de sacarose na formação de biofilmes de Streptococcus

Para avaliar a influência de diferentes concentrações de açúcares, foram acrescidas quantidades de 0,25%, 0,5%, 0,75% ou 1,0% de glicose ou de sacarose a o meio HIB, cuja fórmula original não inclui açúcares (Tabela 1). A formação de biofilmes, durante 24 h a 36°C±1°C e sob agitação e em capnofilia, foi avaliada pela quantificação da biomassa pelo método do cristal violeta, conforme item 3, na presença das diferentes concentrações testadas para ambos os açúcares. Biofilmes produzidos no mesmo meio de cultura, porém sem a adição de açúcar, foram utilizados como controle dos testes. A significância dos resultados (p<0,05) relacionados às diferenças entre os valores de DO de biofilmes formados na presença e ausência de açúcares, foi determinada pelo teste T de Student, com auxílio do aplicativo Prism 5 for Windows (GraphPad Software Co.).

2.5 Susceptibilidade de biofilmes de Streptococcus à Ampicilina e à eritromicina

Foi avaliada a susceptibilidade à ampicilina e à eritromicina dos biofilmes formados pelas 19 espécies estudadas. Estes antimicrobianos, que agem na síntese da parede celular e na síntese proteica, respectivamente, foram selecionados porque são rotineiramente empregados no tratamento das infecções estreptocócicas, particularmente, àquelas causadas pelas espécies utilizadas neste estudo.

A determinação da susceptibilidade dos biofilmes aos antimicrobianos, não apresenta padronização específica, conforme utilizado em ensaios com células em cultura. Assim, neste estudo a metodologia escolhida avaliou da viabilidade dos biofilmes quantificada pela redução do azul de Alamar, um indicador de oxirredução, para a determinação da concentração inibitória nos biofilmes – CIB. Paralelamente, foi avaliado, pelo teste semiquantitativo do cristal violeta, a quantidade de biomassa presente, após a exposição dos biofilmes às diferentes concentrações dos antimicrobianos. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos nos testes de redução do azul de Alamar. Também, para fins comparativos, foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas – CIM, das células em cultura, pela metodologia de microdiluição em caldo.

2.5.1 Determinação da Concentração Inibitória de Ampicilina e de Eritromicina em Biofilmes de Streptococcus

2.5.1.1 Ensaio de Redução do Azul de Alamar

A determinação da CIB seguiu as recomendações de Pettit et al. (2005). Os ensaios foram realizados em placas de microtitulação de poliestireno com fundo chato. A cada um dos poços foram distribuídos 200 µL de uma suspensão bacteriana com turbidez equivalente a escala 0,5 de McFarland, confeccionada em meio BHI, provenientes de uma cultura recente em AS. As placas foram incubadas a 36°C±1°C e por 24 h e sob agitação, em uma atmosfera capnofílica. Após incubação, o meio de cultura foi removido e os biofilmes foram lavados gentilmente, por uma vez, com solução salina fisiológica (NaCl 0,85%). Sobre os biofilmes formados, foram adicionados 100 µL das soluções de ampicilina ou de eritromicina (Sigma- Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA), confeccionadas em caldo Müeller-Hinton (MHB, Müeller-Hinton Broth, BD Diag.) e previamente diluídas na razão dois. As concentrações testadas corresponderam ao intervalo entre 10 µg/mL e 640 µg/mL, para ambos os antimicrobianos. Após incubação a 36°C±1°C por 24 h, foram adicionados, a cada um dos

poços, 5µL de uma solução aquosa contendo 0,22% de azul de Alamar (Resazurin, Sigma- Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). As placas foram incubadas por 1 h a 36°C±1°C e, posteriormente, foi realizada a leitura da absorvância nos comprimentos de onda 570 nm e 600 nm em um leitor Spectra Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, Califórnia, EUA). Para todos os ensaios foram incluídos controles correspondentes a biofilmes cultivados nas mesmas condições dos testes, porém na ausência de antimicrobianos. Todos os ensaios foram realizados em duplicata. Foi considerada CIB os valores que apresentaram percentual de redução do Alamar menor ou igual a 50% em relação ao controle na ausência do antimicrobiano (100%).

O percentual de redução do azul de Alamar foi calculado usando a seguinte fórmula:

( ) ( )

Onde:

εox600 = 117216, coeficiente molar de extinção do azul de Alamar na forma oxidada;

εox570 = 80586, coeficiente molar de extinção do azul de Alamar na forma oxidada;

εred570 = 155677, coeficiente molar de extinção do azul de Alamar na forma reduzida;

εred600 = 14652, coeficiente molar de extinção do azul de Alamar na forma reduzida; A= absorvância nos poços testes; A´= absorvância nos poços controle (sem antimicrobiano),

λ1= 570 nm;

λ2= 600 nm.

2.5.1.2 Método do Cristal Violeta e correlação com o ensaio do Azul de Alamar

A quantificação da biomassa, pelo teste do cristal violeta, teve por objetivo avaliar a ação dos antimicrobianos de forma comparativa aos ensaios com azul de Alamar. Os biofilmes foram formados e submetidos a diferentes concentrações dos antimicrobianos, ampicilina e eritromicina, conforme descrito no item 5.1.1. Posteriormente, foram revelados pela metodologia semiquantitativa do cristal violeta, como descrito no item 3.

O coeficiente de correlação r de Pearson (α= 0,05) e regressão linear foram realizados, com auxílio do aplicativo Prism 5 for Windows (GraphPad Software Co.), para avaliar os resultados obtidos dos percentuais de redução do azul de Alamar em comparação com a biomassa de biofilmes expostos às mesmas concentrações dos antimicrobianos.

2.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de ampicilina e de eritromicina em amostras de Streptococcus

As CIMs foram determinadas por metodologia de microdiluição, que seguiu as recomendações de 2008, do então National Committee for Clinical and Laboratory Standards (NCCLS, atualmente reconhecido com Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) e foi interpretada de acordo com o documento M-100 do (CLSI, 2011). Para tal, foram preparadas soluções 10 vezes concentradas dos antimicrobianos ampicilina e eritromicina. Com essas soluções, foram feitas diluições duplas e seriadas, no meio MHB, para obtenção de concentrações finais na faixa de 0,016 µg/mL a 1,0 µg/mL. Alíquotas de 100µl de cada diluição foram distribuídas em placas de microtitulação de 96 poços e de fundo em “U” (Corning Inc.). Os inóculos constaram de suspensões bacterianas com turvação semelhante à escala 0,5 McFarland, em caldo Müeller-Hinton (MHB, Müeller-Hinton Broth, BD Diag.), diluídas 1/20 no mesmo meio de cultura. A partir desta suspensão foram distribuídos 10µL em cada poço da placa, previamente preenchido com 100µL das diluições dos antimicrobianos. As placas de microtitulação foram incubadas em a 36±1°C por 18h - 24 h, em ambiente capnofílico. Após o período de incubação a CIM foi considerada como a menor concentração do antimicrobiano (em µg/mL) onde não foi identificado, visualmente, crescimento bacteriano. A CIM também foi determinada pelo ensaio do azul de Alamar. Neste último caso, após a leitura visual dos resultados obtidos, foram adicionados 5 µL de azul de Alamar, em cada poço, e as placas foram, então, reincubadas por 1h. Após este período, o conteúdo dos poços foi removido e transferido para uma placa estéril e a leitura e análise dos resultados foi realizada de acordo com o item 5.1.1 (Pettit et al., 2005).

Os dados obtidos foram utilizados em análises comparativas com os valores de CIB e na determinação de concentrações subinibitórias dos antimicrobianos a serem empregadas nos ensaios descritos no próximo item (item 6).

2.6 Influência de Concentrações Subinibitórias (subCMIs) de ampicilina e de eritromicina na formação de biofilmes

Foi avaliada a influência de concentrações de ampicilina e de eritromicina correspondentes a ½ da CIM para cada uma das amostras em estudo, determinada no item 5.2. Os biofilmes foram formados em placas de microtitulação, de 96 poços, de fundo chato e de poliestireno. Para tal, foram distribuídos 200 µL de uma suspensão bacteriana com turbidez equivalente a escala 0,5 de McFarland (proveniente de cultivo recente em AS), confeccionada em meio BHI suplementado com ½ do valor da CIM. As placas foram incubadas a 36°C±1°C e por 24 h e sob agitação, em capnofilia. Após incubação, o meio de cultura, contendo células planctônicas, foi retirado e os biofilmes foram lavados uma vez. Em sequência, os biofilmes foram quantificados pelo método do cristal violeta, de acordo com o descrito no item 3. Como controles, foram cultivados biofilmes na ausência dos antimicrobianos. A significância dos resultados (p<0,05), referentes às comparações entre o cultivo na presença e na ausência e entre antimicrobianos diferentes, foi determinada pelo emprego do teste T de Student, com auxílio do aplicativo Prism 5 for Windows (GraphPad Software Co.).

2.7 Avaliação comparativa da presença de proteínas e DNA na constituição da substância polimérica extracelular (Matriz Extracelular).

A determinação da presença de DNA e proteínas na matriz extracelular foi realizada por ensaios de destacamento através do tratamento dos biofilmes de Streptococcus com enzimas específicas para degradação de DNA e de proteínas, como DNaseI e proteinase K, respectivamente. A metodologia empregada seguiu as recomendações de Fredheim et al. (2009).

Os biofilmes foram produzidos conforme descrito no item 3. Após uma etapa de lavagem (com solução salina fisiológica), foram tratados, durante 3 h a 36°C±1°C, com uma solução contendo 100U Kunits/mL de DNaseI, confeccionada em meio BHI suplementado com 2,5 mM MgCl2; e com uma solução de 0,1 mg/mL de proteinase K em tampão constituído de 20mM Tris-HCl (pH 7,0) adicionado de 100mM NaCl (ambos reagente obtidos da Sigma Co., EUA), em ensaios distintos. Como controles foram utilizados biofilmes incubados apenas com as soluções diluentes das enzimas (controle 1) e biofilmes não tratados, ou seja, reincubados por 3 h em meio BHI fresco (controle 2). Após o período de incubação, a biomassa aderida foi quantificada pela metodologia do cristal violeta, como descrito anteriormente (item 3). Os ensaios foram realizados em três fileiras paralelas (oito poços cada) – teste, controle 1 e controle 2, respectivamente. Para cada fileira o maior e o menor valor foram descartados e os resultados foram expressos com a média correspondente a DO, obtida com seis réplicas. Cada conjunto de experimentos foi repetido duas vezes. A significância dos resultados obtidos foi avaliada pela análise de variância monocaudal (ANOVA) com múltiplas comparações pelo teste de Tukey, determinadas com auxílio do aplicativo Prism 5 for Windows (GraphPad Software Inc). Os resultados foram considerados significativos quando p<0,05.

2.8 Avaliação da arquitetura de biofilmes de Streptococcus por técnicas de microscopia

2.8.1 Microscopia ótica de luz

Os biofilmes foram formados, em duplicata, sobre lamínulas de vidro estéreis com 13 mm de diâmetro (Kinteel Deckläser Glass, Alemanha), previamente depositadas, com auxílio de uma pinça estéril, em placas de cultura de células de 12 poços (TPP, Suíça). Para cada um dos poços, foram distribuídos 2 mL de uma cultura recente, diluída 1:4 em meio BHI, de cada amostra em estudo. Após incubação por 24 h a 36°C ± 1°C, em capnofilia, as lamínulas foram gentilmente lavadas com salina fisiológica estéril, fixadas com metanol 99% por 15 min e coradas com cristal violeta a 1%, por 15 min. Após secagem em

temperatura ambiente, as lamínulas foram montadas invertidas, sobre lâminas de vidro, com uma gota de Entellan (Merck, Alemanha). Após secagem por uma noite, os biofilmes foram visualizados em microscópio ótico de luz (Carl Zeiss; Göttigem, Alemanha), com uma objetiva de 40X. As imagens foram adquiridas com uma câmera digital AxioCam MR3 acoplada ao microscópio e com auxílio do aplicativo Axioplan (Carl Zeiss).

2.8.2 Microscopia confocal de varredura a Laser

Os biofilmes foram formados por 24 h 36°C ± 1°C, em atmosfera capnofílica, em sistemas comerciais que constam de câmaras próprias confeccionadas sobre de lâminas de vidro para microscopia (Chamber slide w/cover glass, NalgeNunc International, New York, EUA). Para cada câmara foi adicionado 1 mL de uma cultura recente em BHI, diluída 1:4 no mesmo meio. Após incubação, os biofilmes foram lavados gentilmente com água estéril e imediatamente corados com o LIVE/DEAD Baclight Bacterial Viability kit (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA). Este, permite a coloração de células vivas (em verde) e mortas (em vermelho), baseado na utilização concomitante de dois corantes fluorescentes – Syto 9 e iodeto de propídeo – ambos com afinidade pelo DNA, porém com atuações diversas dependendo da integridade da membrana celular. Para cada câmara foram distribuídos 200 µL de uma solução contendo 2 µL de uma mistura dos corantes (em quantidades sugeridas pelo fabricante) em 2 mL de água Milli-Q. Após incubação por 10 min em temperatura ambiente, protegido da luz, os biofilmes foram lavados em água para retirar o excesso do corante. As câmaras foram removidas, e as lâminas foram montadas pela deposição de lamínulas de vidro de 24x50 mm com 100 µL de antifade (Invitrogen, Molecular Probes). Os biofilmes foram visualizados por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM, confocal laser scanning microscopy) em microscópio modelo TCS- SP5 (Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL, EUA) com uma objetiva 63X/1.4. As imagens foram analisadas com o aplicativo ImageJ 1.45 (NIH, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA).

3 RESULTADOS

3.1 Avaliação do relacionamento filogenético das espécies estudadas

O relacionamento filogenético das amostras em estudo foi determinado pelas sequências do gene rrs (que codifica o rRNA 16S) depositadas no GenBank. A Figura 3 apresenta o arranjo obtido com aplicativo MEGA 4.1.

100 S. dysgalactiae subsp. equisimilis

73 S.dysgalactiae subsp dysgalactiae S.phocae 24 40 S.agalactiae S.iniae

47 95 S.parauberis

93 S. pseudoporcinus 40 S.porcinus 37 S.didelphis S.uberis 55 S.urinalis 41 S.canis 75 S.pyogenes 96 59 S. porci

76 S.suis 81 S. porcorum S.equi subsp equi 100 S. equi subsp. zooepidemicus S.mutans L.lactis subsp lactis

0.01 Legenda: Lactococcus lactis foi usado como representante não relacionado (outgroup). Os valores assinalados entre os pares representam os bootstraps, expressos em porcentagem. A barra demonstra 1% de divergência entre as sequências. Todas são derivadas de amostras ATCCT (American Type Culture Collection).

3.2 Quantificação da biomassa de biofilmes formados em diferentes meios de cultura

Todas as amostras foram capazes de formar biofilmes em BHI, THB e HIB (FIGURA 4), contudo apresentaram diferentes valores de biomassa, de acordo com os dados obtidos com a metodologia do cristal violeta. Apenas as espécies S. pyogenes e S. agalactiae foram

caracterizadas como fortes produtoras, de acordo com os padrões definidos (DO570nm > 1,0), em todos os meios de cultura testados.

Figura 4 - Formação de biofilmes(1) por espécies de Streptococcus nos meios de cultura BHI(2) e THB(3), HIB(4)

BHI THB HIB

570nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Legenda: 1- S. porcinus; 2- S. iniae; 3- S. pyogenes; 4- S. agalactiae; 5- S. equi subsp equi; 6- S. equi subsp. zooepidemicus; 7- S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae; 8- S. phocae; 9- S. urinalis; 10- S. didelphis; 11- S. dysgalactiae subsp. equisimilis; 12- S. parauberis; 13- S. suis; 14- S. uberis; 15- S. canis; 16- S. pseudoporcinus; 17- S. porci;18- S. mutans; 19- S. porcorum. (1) Biofilmes formados durante 24 h, em atmosfera capnofílica e sob suave agitação; (2) Brain Heart Infusion; (3) Todd-Hewitt Broth; (4) Heart Infusion Broth (ver Materiais e Métodos). Colunas representam as médias das DO para seis réplicas; barras representam desvio padrão; a linha tracejada marca o valor de DO570nm = 1,0 (valores maiores ou iguais a este caracterizam amostras fortes produtoras de biofilmes); o retângulo vermelho destaca o resultado obtido com a amostra da espécie S. mutans, utilizada para fins comparativos.

Os biofilmes formados em BHI e HIB por S. canis apresentaram valores significativamente mais elevados (p<0,05) do que em THB. S. porcinus, S. equi subsp equi, S. dysgalactiae subsp dysgalactiae, S. parauberis, S. mutans e S. porcorum obtiveram maiores valores de DO570nm em THB, quando comparados com BHI e HIB. Para S. iniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. phocae, S. urinalis, S. didelphis e S. dysgalactiae subsp equisimilis os maiores resultados de biomassa foram obtidos em BHI (p<0,05).

3.3 Influência da presença de glicose e de sacarose na formação de biofilmes de Streptococcus

A adição de açúcares, para maioria das espécies, resultou no aumento significativo da biomassa dos biofilmes (p<0,05). Porém, este aumento não foi proporcional ao aumento da concentração. As concentrações mais favoráveis de glicose variaram entre as espécies, entretanto, a maioria apresentou maior biomassa em biofilmes formados em meio HIB acrescido de 0,25% de glicose (Figura 5).

Figura 5 - Biofilmes de Streptococcus formados durante 24 horas na presença de diferentes concentrações de glicose

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

% de Glicose 0% 0,25% 0,5% 0,75% 1,0% Legenda: 1- S. porcinus; 2- S. iniae; 3- S. pyogenes; 4- S. agalactiae; 5- S. equi subsp equi; 6- S. equi subsp. zooepidemicus; 7- S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae; 8- S. phocae; 9- S. urinalis; 10- S. didelphis; 11- S. dysgalactiae subsp. equisimilis; 12- S. parauberis; 13- S. suis; 14- S. uberis; 15- S. canis; 16- S. pseudoporcinus; 17- S. porci; 18- S. mutans; 19- S. porcorum. Colunas representam as médias da DO para seis réplicas; barras representam desvio padrão.

Diferentemente para a sacarose, os resultados da maioria das amostras não variaram muito nas diferentes concentrações testadas (Figura 6).

Figura 6 - Biofilmes de Streptococcus formados durante 24 horas na presença de diferentes concentrações de sacarose

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

% de Sacarose 0% 0,25% 0,5% 0,75% 1,0%

Para S. mutans o aumento da biomassa em relação ao controle parece não depender da concentração, sugerindo que a presença de sacarose é um fator qualitativo para melhor formação do biofilme nessa espécie. Já para S. parauberis e S. pseudoporcinus o aumento do valor médio de absorvância foi diretamente proporcional ao aumento da concentração de sacarose. Para biofilmes formados por S. suis e S. uberis a presença de 0,5% ou 0,75% de

sacarose parece ser limitante para o sucesso da formação, apresentando redução na biomassa na presença de 1,0% do açúcar. Considerando-se que a adição de 0,25% de glicose ao meio HIB proporcionou quantitativa e qualitativamente melhores valores de DO, indicando maior favorecimento da formação de biofilmes pela maioria das amostras, foi realizada uma comparação entre este meio e o BHI, que apresenta concentração semelhante deste açúcar (2g/L) em sua formulação. A Figura 7 apresenta os resultados obtidos com esta análise.

Figura 7 - Comparação da formação de biofilmes(1) por espécies de Streptococcus nos meios de cultura BHI(2) e HIB(4) acrescido de 0,25% de glicose

BHI

HIB + 0,25% de Glicose

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Legenda: 1- S. porcinus; 2- S. iniae; 3- S. pyogenes; 4- S. agalactiae; 5- S. equi subsp equi; 6- S. equi subsp. zooepidemicus; 7- S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae; 8- S. phocae; 9- S. urinalis; 10- S. didelphis; 11- S. dysgalactiae subsp. equisimilis; 12- S. parauberis; 13- S. suis; 14- S. uberis; 15- S. canis; 16- S. pseudoporcinus; 17- S. porci; 18- S. mutans; 19- S. porcorum. (1) Biofilmes formados durante 24 h, em atmosfera capnofílica e sob suave agitação; (2) Brain Heart Infusion; (3) Heart Infusion Broth (ver Materiais e Métodos). Colunas representam as médias das DO para seis réplicas; barras representam desvio padrão; a linha tracejada marca o valor de DO570nm = 1,0 (valores maiores ou iguais a este caracterizam amostras fortes produtoras de biofilmes).

3.4 Determinação da susceptibilidade de Células em Cultura (CIM) e de biofilmes (CIB) para ampicilina e eritromicina

Os dados obtidos estão representados na Tabela 2. Os valores de CIM para as amostras em cultura foram obtidos pelo método de microdiluição em caldo. As concentrações variaram em uma escala de 0,015 µg/mL – 0,12 µg/mL para ampicilina e 0,03 µg/mL – 0,25 µg/mL para eritromicina. Os resultados obtidos pela leitura visual e ensaio da redução do azul de Alamar forma concordantes. Para determinar a concentração inibitória dos biofilmes (CIB) foi realizado um ensaio de viabilidade através oxirredução do azul de alamar, de biofilmes expostos a uma faixa de concentração de 10 µg/mL a 640 µg/mL de ampicilina ou eritromicina. Para os cálculos de determinação da CIB, biofilmes cultivados nas mesmas condições dos testes, porém na ausência de antimicrobianos foram considerados como 100% de redução do composto (azul de Alamar). Os valores de CIB, obtidos pelo ensaio de redução do azul de Alamar, foram extremamente elevados para ambos os antimicrobianos. Para a maioria das amostras, não foi possível observar 50% de redução do corante em nenhuma das concentrações testadas, sendo a CIB encontrada > 640 µg/mL. As únicas espécies cujos biofilmes apresentaram percentuais de redução ≤ 50%, em relação ao controle na ausência dos antimicrobianos, e respectivas CIBs, foram: S. suis, 80 µg/mL, o mesmo valor para ampicilina e eritromicina; S. porcorum, 80 µg/mL, apenas para ampicilina; S. porci, 640 µg/mL apenas para ampicilina; e S. pyogenes, 640 µg/mL apenas eritromicina. Os percentuais de aumento da CIB, em relação à CIM, que refletem as diferenças entre as concentrações necessárias para a inibição dos biofilmes, quando comparadas àquelas para as células em cultura, foram muito elevados, variando de 1.200 a mais de 40.000 vezes.

Tabela 2 - Valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM)1 e Concentração Inibitória de Biofilmes (CIB)2 de Espécies de Streptococcus

ANTIMICROBIANO3 AMOSTRA ESPÉCIES Nº AMPICILINA ERITROMICINA 4 4 CIM CIB % CIM CIB %

RS-21 S. porcinus 0,06 > 640 >10.000 0,12 > 640 >5.000

RS-22 S. iniae 0,12 > 640 >5.000 0,25 > 640 >5.000

RS-23 S. pyogenes 0,12 > 640 >10.000 0,12 640 5.000

RS-24 S. agalactiae 0,12 > 640 >5.000 0,12 > 640 >5.000

RS-25 S. equi subsp. equi 0,06 > 640 >10.000 0,06 > 640 >10.000

RS-26 S. equi subsp. zooepidemicus 0,03 > 640 >20.000 0,03 > 640 >20.000

RS-27 S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,12 > 640 >5.000

RS-28 S. phocae ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,12 > 640 >5.000

RS-29 S. urinalis 0,06 > 640 >10.000 0,06 > 640 >10.000

RS-30 S. didelphis ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,06 > 640 >10.000

RS-31 S. dysgalactiae subsp equisimilis 0,03 > 640 >20.000 0,12 > 640 >5.000

RS-32 S. parauberis ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,06 > 640 >10.000

RS-33 S. suis 0,03 80 2.500 0,06 80 1.200

RS-34 S. uberis 0,06 > 640 >10.000 0,06 > 640 >10.000

RS-35 S. canis ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,12 > 640 >5.000

RS-36 S. pseudoporcinus ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,12 > 640 >5.000

RS-37 S. porci 0,03 640 20.000 0,03 > 640 >20.000

RS-38 S. mutans ≤ 0,015 > 640 >40.000 0,06 > 640 >10.000

RS-39 S. porcorum ND 80 - ND > 640 -

1CIM, determinada pelo teste de microdiluição em caldo de acordo com as recomendações do NCCLS (2008); em µg/mL; 4percentual de aumento da CIB em relação a CIM; ND, Não determinado.

3.5 Correlação do ensaio de determinação da CIB pela redução do azul de Alamar e quantificação da biomassa pelo Método do Cristal Violeta

Para investigar a ação de diferentes concentrações de antimicrobianos na biomassa de biofilmes, formados durante 24h, um ensaio de quantificação pelo método do cristal violeta foi realizado após exposição dos biofilmes a altas concentrações de ampicilina ou eritromicina. A maioria das espécies apresentou valores de biomassa semelhantes ao biofilme controle, na ausência de antimicrobianos. As principais variações observadas, em relação aos controles na ausência dos antimicrobianos, representadas nas Figuras 8 e 9, foram: - Para ampicilina: (i) qualquer redução da atividade dos biofilmes (avaliada pelo ensaio do azul de

Alamar), manutenção dos valores de DO570nm (pelo método do cristal violeta) – evidenciado nas espécies S. iniae, S. parauberis, e S. porci e S. pyogenes; (ii) qualquer redução da atividade dos biofilmes e redução dos valores de biomassa – observado para S. suis; (iii) atividade dos biofilmes, expostos ao antimicrobiano, equivalente ao controle, na ausência de antimicrobiano, porém redução dos valores de biomassa – S. equi subsp zooepidemicus, S. phocae e S. uberis; (iv) atividade dos biofilmes, expostos ao antimicrobiano, equivalente ao controle, na ausência de antimicrobiano, porém aumento dos valores de biomassa – S. equi subsp equi. - Para eritromicina: (i) atividade dos biofilmes, expostos ao antimicrobiano, equivalente ao controle, na ausência de antimicrobiano, porém aumento dos valores de biomassa – S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. canis, S. suis, S. porci, S. porcorum e S. pseudoporcinus; (ii)qualquer redução da atividade dos biofilmes e redução dos valores de biomassa – observado para S. pyogenes e S. dysgalactiae subsp zooepidemicus. Para analisar a ação de diferentes concentrações de ampicilina e eritromicina na biomassa de forma comparativa aos ensaios com azul de Alamar, fez-se uma análise através do coeficiente de correlação r de Pearson (com α = 0,05) e regressão linear. Somente S. pyogenes apresentou correlação entre a atividade e a biomassa, frente a exposição à eritromicina (r = 0,95), ou seja, a redução da atividade dos biofilmes foi correlacionado à diminuição da biomassa. Para as demais espécies não foi observada correlação (para ampicilina -0,73 < r < -0,36; para eritromicina -0,0064 < r < 0,67).

Figura 8 - Correlação(1) do ensaio de determinação da concentração inibitória(2) (A-C), para ampicilina, com a quantificação da biomassa(3) dos biofilmes de S. iniae (RS-22), S. parauberis (RS-32), S. porci (RS-37), S. equi subsp zooepidemicus (RS-26), S. phocae (RS-28), S. uberis (RS-34) e S. suis (RS-33). (1) Correlação de Pearson; (2) determinada pelo ensaio do azul de Alamar; (3) determinada pelo método semiquantitativo do cristal violeta. Não houve correlação entre os testes para ampicilina. Em (D) os gráficos obtidos com a correlação de Pearson

(A) (B)

% de redução do azul de Alamar doazulde redução de % % de redução do azul de Alamar doazulde redução de %

RS-26 RS-28 RS-34

Alamar doazulde redução de % RS-33 (D)

Figura 9 - Correlação(1) do ensaio de determinação da concentração inibitória(2) (A-B), para eritromicina, com a quantificação da biomassa(3) dos biofilmes de S. dysgalactiae subsp equisimilis (RS-31), S. suis (RS-33), S. canis (RS-35), S. pseudoporcinus (RS-36), S. porci (RS-37), S. porcorum (RS-39), S. pyogenes (RS-23) e S. equi subsp zooepidemicus (RS-26). (1) correlação de Pearson; (2) determinada pelo ensaio do azul de Alamar; (3) determinada pelo método semiquantitativo do cristal violeta. Apenas para a amostra R-23, S pyogenes os dois métodos foram correlacionados. Em (C) os gráficos obtidos com a correlação de Pearson

(A) (C)

RS-31 RS-33

RS-35 RS-36

de redução % do azul de Alamar

RS-37 RS-39

micina micina µg/mL (B) eritro

RS-23 RS-26

% de redução % do azul de Alamar

micina micina µg/mL eritro

3.6 Influência de Concentrações Subinibitórias (sub-CIMs) de antimicrobianos na formação de biofilmes

Os dados obtidos revelaram que tanto ampicilina quanto eritromicina induziram significativamente (p<0,05) a formação de biofilme, para a maioria das espécies em estudo. Entretanto, biofilmes de S. iniae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. equi subsp. equi e S. phocae, apresentaram menores valores de DO570nm, refletindo menor biomassa quando o micro-organismo foi cultivado na presença de concentrações subinibitórias (equivalentes a ½ da CMI, conforme Materiais e Métodos) de ampicilina, quando comparado ao controle (cultivado na ausência de antimicrobiano). Enquanto que, para a amostra de S. suis não houve

diferença estatisticamente significativa na formação de biofilmes na presença e ausência de sub-CIMs de ampicilina; o mesmo foi observado para S. pyogenes em relação à eritromicina (p>0.05). Para S. pseudoporcinus não houve diferença, para ambos os antimicrobianos, entre a presença e ausência de concentrações subinibitórias (p>0.05). Os biofilmes formados por S. uberis e S. urinalis foram igualmente estimulados na presença de ambos os antimicrobianos.

Figura 10 - Influência de concentrações subinibitórias de ampicilina e de eritromicina (1/2 da CIM) na formação de biofilmes de Streptococcus(1). 1- S. porcinus; 2- S. iniae; 3- S. pyogenes; 4- S. agalactiae; 5- S. equi subsp equi; 6- S. equi subsp. zooepidemicus; 7- S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae; 8- S. phocae; 9- S. urinalis; 10- S. didelphis; 11- S. dysgalactiae subsp. equisimilis; 12- S. parauberis; 13- S. suis; 14- S. uberis; 15- S. canis; 16- S. pseudoporcinus; 17- S. porci; 18- S. mutans. (1) CONTROLE AMPICILINA ERITROMICINA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Nota: Neste estudo não foi incluída a amostra da espécie S. porcorum; CIM, concentração inibitória mínima.

3.7 Avaliação comparativa da presença de proteínas e DNA na constituição da substância polimérica extracelular (Matriz Extracelular)

O tratamento com proteinase K causou uma redução dos biofilmes da maioria das amostras. Porém, S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. iniae, S. mutans, S. parauberis, S. porcinus e S. pyogenes foram as que apresentaram valores significativos (p<0,05), para ambos os controles (1- apenas com o diluente da enzima versus biofilmes tratados com a enzima; 2- biofilmes não tratados), sugerindo a formação de estruturas ricas em proteínas (Figura11A). O tratamento com DNaseI resultou no destacamento dos biofilmes produzidos por S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. equi subsp equi, S. pyogenes e S. urinalis. Entretanto, considerando-se os dois controles utilizados nos testes apenas os resultados

obtidos para as amostras de S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram resultados significativos (p<0,05) (Figura 11 B).

Figura 11 - Influência do tratamento dos biofilmes de Streptococcus com proteinase K (A) e DNaseI (B)

* (A) *

* * * *

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

(B) ** ** tratado* * controle 1 Controle 2 1 2 3 4 5 6 7* 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

TRATADO CONTROLE 1 CONTROLE 2

tratado controle 1 Controle 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Legenda: 1- S. porcinus; 2- S. iniae; 3- S. pyogenes; 4- S. agalactiae; 5- S. equi subsp equi; 6- S. equi subsp. zooepidemicus; 7- S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae; 8- S. phocae; 9- S. urinalis; 10- S. didelphis; 11- S. dysgalactiae subsp. equisimilis; 12- S. parauberis; 13- S. suis; 14- S. uberis; 15- S. canis; 16- S. pseudoporcinus; 17- S. porci; 18- S. mutans; 19. S. porcorum. Controle 1, biofilme submetido ao diluente da enzima (Tris-HCL 20mM, pH 7,0 com NaCl 100mM, para proteinase K e BHI para DNaseI); controle 2, biofilme não tratado. Colunas representam as médias da DO para os seis poços. Diferenças estatisticamente significativa para um (*) ou ambos (**) controles utilizados (p<0.05). Barras representam desvio padrão.

3.8 Avaliação da arquitetura dos biofilmes de Streptococcus por técnicas de microscopia

Todas as amostras também foram capazes de formar biofilmes sobre lamínulas de vidro, apresentando aglomerados densos de células por todo substrato (Figura 12). Nos biofilmes formados por diferentes espécies foram observadas cadeias compostas de uma grande quantidade de cocos, sugerindo que esta seja a principal forma destes micro- organismos nos biofilmes (Figura 12C).

Figura 12 - Imagens obtidas por microscopia ótica de luz dos biofilmes de Streptococcus formados sobre lamínulas de vidro durante 24 h e corados com cristal violeta

(A) (B)

Legenda: (A), S. uberis; (B), S. mutans; (C-D), S. urinalis; em destaque cadeias compostas por várias células dentro do biofilme.

As preparações coradas com LIVE/DEAD BacLight e observadas por microscopia confocal demonstraram biofilmes amplamente distribuídos sobre o substrato (lamínulas de vidro). A coloração utilizada ressalta em verde (devido ao corante fluorescente SYTO 9) células bacterianas vivas, por interagir com DNA intracelular; e em vermelho (devido ao iodeto de propídeo), a presença de DNA extracelular (DNA-e) (Figuras 13 e 14). O tratamento das imagens sequenciais obtidas por CLSM (z-stacks) foi realizado no aplicativo ImageJ 1.45, que permitiu evidenciar o aspecto tridimensional e a distribuição dos biofilmes no substrato (Figura 13). Dentre as espécies avaliadas, S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram imagens representativas de maior biomassa, onde foram observadas regiões compostas por filamentos longos, que a coloração utilizada demonstrou serem constituídos de DNA-e (DNA extracelular). Esses filamentos, intensamente corados em vermelho, apresentaram-se distribuídos por todo biofilme, com inúmeras ramificações concentradas nas regiões de maior elevação, sugerindo uma participação importante na estabilidade dessas estruturas (Figura 13 B). A CLSM também revelou variações na estrutura dos biofilmes entre as espécies de Streptococcus, particularmente, na relação entre a quantidade de células vivas e mortas, sugerindo tempos de maturação espécie-específicos. Exemplos disto podem ser evidenciados na Figura 14, que demonstra os biofilmes de S. phocae, formados durante 24 h, apresentaram relativamente uma maior quantidade de células mortas (A); por outro lado, o contrário é válido para S. parauberis (B) que apresentou uma maior proporção de células vivas, porém, S. pyogenes parece ter uma equivalência entre células vivas e mortas (C).

Figura 13 - Biofilme de Streptococcus pyogenes formado sobre lamínulas de vidro, em meio BHI, durante 24 h e corado com LIVE/DEAD BacLight kit (Molecular Probes Inc.)

A (C)

(B)

(D)

Legenda: (A) Coloração com SYTO 9; (B) Coloração com iodeto de propídeo; (C) Sobreposição das imagens A e B obtidas com os filtros verde (excitação 488/emissão 500-550) e vermelho (excitação 543/emissão 620-700),; (D) Imagem tridimensional produzida após tratamento dos z-stacks.Imagens obtidas com objetiva de 63X. Setas brancas apontam os filamentos e ramificações constituídos de DNA extracelular.

Figura 14 - Microscopia confocal de varredura a laser dos biofilmes de S. phocae (A), (B) S. parauberis e (C) S. pyogenes

A B C

Fonte: Biofilmes com 24 h de formação em caldo BHI e corados com LIVE/DEAD BacLight kit. Sobreposição das imagens obtidas com os filtros verde (excitação 488/emissão 500-550) e vermelho (excitação 543/emissão 620-700), demonstrando as diferenças visuais da razão entre células vivas (verdes) e mortas (vermelhas) para biofilmes de espécies distintas com o mesmo tempo de formação. Objetiva de 63X.

4 DISCUSSÃO

O gênero Streptococcus compreende espécies clinicamente importantes que são responsáveis por uma grande variedade de infecções em humanos e animais. Tem sido alvo de muitas revisões taxonômicas e, atualmente, as espécies são filogeneticamente organizadas baseadas na homologia das sequências de genes estruturais como, por exemplo, o que codifica o rRNA 16S. Também, podem ser agrupadas, de acordo, principalmente, com similaridades fenotípicas, ou até mesmo com aspectos clínicos das doenças nas quais estão envolvidas, nos seguintes grupos: piogênicos, anginosus, mitis, mutans, salivarius e bovis (Lal, Verma & Lal, 2011). Como não foi possível encontrar na literatura arranjos provenientes de análises filogenéticas, que contemplassem todas as espécies envolvidas neste estudo, o primeiro objetivo foi atualizar, com dados disponíveis no GenBank, a análise presente no artigo de revisão de Facklam (2002). A escolha das espécies que compuseram este estudo foi baseada em habilidades que em conjunto determinam a peculiaridade do arranjo filogenético formado. Nos demais arranjos entre espécies de estreptococos, pode-se observar uma maior homogeneidade, muitas vezes atribuída à similaridades no comportamento fenotípico e/ou especificidade por um dado hospedeiro. No conjunto de espécies que compõem este estudo, apesar da maioria estar alocada no grupo dos piogênicos e ter atividade β-hemolítica frente a hemácias de carneiro, são muito heterogêneas quanto à virulência, tipo de infecções que promovem e hospedeiro que as albergam. Dentre os diversos atributos de virulência que estes micro-organismos expressam, a formação de biofilmes tem sido relacionada, principalmente, com o curso persistente de certas infecções estreptocócicas (Moscoso, García & Lópes, 2006). Entretanto, os dados disponíveis na literatura, sobre os aspectos relacionados à formação de biofilmes, ainda são escassos, ou até mesmo inexistentes para a grande maioria das espécies do gênero. Diante disso, este estudo se propôs a avaliar aspectos da formação e composição de biofilmes de 18 espécies filogeneticamente relacionadas e de S. mutans (para fins comparativos), bem como investigar a influência de antimicrobianos, rotineiramente utilizados no tratamento de infecções estreptocócicas, no desenvolvimento dos biofilmes destes micro-organismos.

Todas as espécies foram capazes de formar biofilmes nos diferentes meios de cultura testados (BHI, THB e HIB). Todos esses meios são complexos, ricos e, portanto, apropriados ao cultivo de micro-organismos fastidiosos, como os membros do gênero Streptococcus. Sabe-se que a disponibilidade nutricional pode acarretar em diferentes modificações fenotípicas e genotípicas de um biofilme (Stoodley et al., 2002), inclusive na quantidade da biomassa produzida. Nossos dados revelaram que, em geral, não foi observado um comportamento homogêneo, quanto à produção de biofilmes, ou seja, as condições ideais para a sua formação foi variável dependendo do meio e do micro-organismo. Entretanto, foi possível observar uma relativa preferência, de algumas espécies pelo meio THB, particularmente a espécie incluída neste estudo como um modelo de formação de biofilmes no gênero, S. mutans. Considerando-se as formulações de THB e BHI, pode-se observar, aparentemente, variações sutis que, per si, não justificariam as diferenças significativas na quantidade de biomassa produzida. Entretanto, Blehert et al. (2003) observaram que a presença de carbonato de cálcio no meio THB (e ausente em BHI e em HIB) atua nos mecanismos de regulação da produção de um autoindutor (AI2), envolvido nos fenômenos de quorum sensing e produção de biofilmes por Streptococcus gordonii, um patógeno da cavidade oral. Especula-se que tais mecanismos possam ser extrapolados para demais espécies de estreptococos, justificando, assim, os resultados obtidos neste estudo. Tem sido demonstrado que os microrganismos divergem na resposta à disponibilidade nutricional. Por exemplo, biofilmes de Aeromonas hydrophila e P. aeruginosa aumentam a dispersão em resposta à escassez nutricional (Sawyer & Hermanowicz, 2000). Além disso, biofilmes de P. fluorescens destacam quando há decréscimo nas concentrações de carbono orgânico dissolvido, glicose ou outros nutrientes (Delaquis et al., 1989; Delille et al., 2007). Em contraste, biofilmes de Acinetobacter tornam-se mais densos quando em estarvação (James et al., 1995). Diversos relatos presentes na literatura demonstram que o metabolismo de carboidratos regula a produção de biofilme de muitas espécies (McDougald et al., 2011). Nas bactérias, a geração de energia pela aquisição e consumo de carboidratos disponíveis no meio é altamente regulada. Assim, a disponibilidade de açúcares que podem ser metabolizados facilmente, como a glicose, ativa o catabolismo e suprime outras vias catabólicas desencadeando mecanismos diversos (Titgemeyer & Hillen, 2002). Estes fenômenos são chamados de ativação catabólica (CCA - Carbon Catabolite Activation) e repressão catabólica

(CCR- Carbon Catabolite Repression). E, já foi demonstrada, a ativação e repressão de genes envolvidos na virulência, particularmente, na formação de biofilmes, na presença de açúcares (Seshasayee et al., 2006). Há um ajuste fino da disponibilidade de nutrientes e expressão gênica, que pode desencadear melhores resultados na produção de biofilmes (Pillai et al., 2004; Duarte et al., 2008; Willenborg et al., 2011). Neste estudo, avaliamos a influência da presença de diferentes concentrações de glicose e sacarose no desenvolvimento dos biofilmes de Streptococcus. Os dados obtidos revelaram que a presença dos carboidratos para a maioria das espécies auxiliou na produção de biomassa. A adição de 0,25% de glicose foi, em geral, a concentração mais favorável ao desenvolvimento de maiores valores de DO570nm. Entretanto, para a espécie S. dysgalactiae subsp dysgalactiae, a produção de biofilmes foi menor em todas as concentrações de glicose testadas, quando comparado ao controle (meio HIB sem adição de açúcar). Já para sacarose, os resultados apresentaram valores similares para todas as concentrações testadas. Para algumas espécies, por exemplo, S. pseudoporcinus o aumento da biomassa foi proporcional ao aumento da concentração do açúcar. Já para S. mutans a presença do carboidrato parece ser um fator qualitativo, independente da concentração. S. suis e S. uberis obtiveram um decréscimo na biomassa na presença de 1% de sacarose, quando comparados a 0,5% e 0,75%, sugerindo que estas concentrações são limitantes para o desenvolvimento do biofilme, ou seja, possivelmente estas concentrações estão envolvidas nos processos de ativação e repressão catabólica, levando a produção de maiores biomassas. Ainda assim, deve-se considerar que a adição de 1% de sacarose, naturalmente levará à acidificação do meio, proveniente do metabolismo do açúcar, logo é possível que as espécies em questão não tolerem o estresse ácido, desencadeando o destacamento do biofilme. A participação da sacarose nos processos de formação de biofilmes já tem sido bem documentada (Leme et al., 2006; Duarte et al., 2008). Mecanismos de aderência dependentes de sacarose e mediados por enzimas extracelulares [glicosiltransferases (GTFs) e frutosiltransferases (FTFs)] e por proteínas ligadoras de glucana, tem seu papel bem descrito na virulência de S. mutans (Rölla et al., 1983; Kuramitsu, 1993, 2001; Steinberg, 2000; Banas & Vickerman, 2003; Bowen & Koo, 2011). Sabendo que BHI tem em sua composição 0,2% de glicose, comparamos as biomassas obtidas neste meio com as obtidas em HIB adicionado de 0,25% do mesmo carboidrato. Foi observado uma maior formação no HIB adicionado de glicose, fato notável, pois este meio é

reconhecidamente mais pobre que BHI. Talvez aí, uma pequena demonstração da importância da disponibilidade de açúcares para a formação de biofilmes por Stretptococcus. Possivelmente, diante dos dados obtidos neste estudo com os ensaios de formação de biofilmes na presença de diferentes concentrações dos açúcares, estaríamos observando o resultado de processos de estímulo e repressão catabólica (CCR e CCA). Sabe-se que, um dos mecanismos mais conhecidos é o mediado por proteínas presentes na superfície bacteriana

(phosphoenolpyruvate – carbohydrate phosphotransferase system - PTS), que participam sistema de fosfotransferases que percebem, quantitativa e qualitativamente, a presença de nutrientes no meio, acarretando em processos de ativação ou repressão de genes que, inclusive, estão envolvidos na patogenicidade do micro-organismo. O limiar desta percepção é variável de microrganismo para microrganismo e, totalmente, dependente das condições do meio (Görke & Stülke, 2008). No entanto, com os dados que obtivemos neste estudo, podemos apenas sugerir a ocorrência de um ou mais destes fenômenos. Consideramos a importância em relatar, que apesar de se tratarem de espécies estreitamente relacionadas, os processos metabólicos divergem a ponto de alterar aspectos intimamente relacionados à virulência, como a produção de biofilmes. Porém, estudos posteriores são necessários para que essas variações possam ser entendidas e, portanto, sugerirem aplicações práticas ao manejo das infecções causadas por estes micro-organismos. Está bem estabelecido, em ensaios de susceptibilidade, que células sésseis são capazes de tolerar níveis significativamente elevados de antimicrobianos em comparação com células planctônicas (Arciola, Campoccia & Montanaro, 2002; Monzón et al., 2002). Devido à natureza da estrutura do biofilme, às reduzidas taxas de crescimento e de respiração celular, assim como a proteção conferida pelos polímeros constituintes da matriz e a presença de células persistentes, os agentes químicos são ineficientes na eliminação das populações dentro do biofilme. Quando no estado séssil, as bactérias tornam-se 10-1.000 vezes menos susceptíveis a vários agentes antimicrobianos do que células planctônicas (Stewart & Costerton, 2001). Dada a importância clínica dos biofilmes, muitos métodos têm sido utilizados para avaliar a susceptibilidade destes à agentes antimicrobianos (Amorena et al., 1999; Baillie et al., 1999; Polonio et al., 2001; Ramage et al., 2001). Dentre estes, o método que emprega o indicador de oxirredução azul de Alamar foi, inicialmente, proposto para ensaios de susceptibilidade para microrganismos em cultura - células planctônicas (Collins et al., 1997) -

e em ensaios de citotoxicidade de células eucarióticas (Back et al., 1999). Mais recentemente, este ensaio, devido à sua praticidade e menor custo, tem sido proposto para a determinação da susceptibilidade de biofilmes à drogas antimicrobianas (Repp, Menor & Pettit, 2007; Femming et al., 2009; Pettit, Weber & Pettit, 2009). A atividade metabólica da célula resulta na redução química do azul de Alamar. A reação ocorre por ação de agentes redutores, componentes da cadeia respiratória, FMNH2,

FADH2, NADH, NADPH, e por citocromos. Em resposta à redução, a análise pode ser feita pela modificação da coloração de azul (estado oxidado) à rosa (estado reduzido) (Pettit, Weber & Pettit, 2009). Neste estudo foi avaliada a susceptibilidade para ampicilina e eritromicina, dos biofilmes formados por 19 espécies de Streptococcus, comparativamente com a determinação das concentrações inibitórias de células em cultura (planctônicas), por ensaios empregando o azul de Alamar. Ampicilina é um β-lactâmico que atua na síntese da parede celular, é um dos antimicrobianos de escolha para a profilaxia e tratamento das infecções estreptocócicas. Já os macrolídeos e as lincosaminas são segunda opção no tratamento e a alternativa em indivíduos alérgicos aos β-lactâmicos. Ambos atuam no ribossomo bacteriano, bloqueando a síntese protéica do microrganismo. A eritromicina, principal representante dos macrolídeos, é produzida pelo Streptomyces erythreus e impede os movimentos de translocação do ribossomo fixando-se à subunidade ribossomal 50S (CDC, 1996; De Mouy et al., 2001; González & Andreu, 2003). Nos ensaios empregando azul de Alamar, valores de CIMs e de CIBs foram definidos como a menor concentração do antimicrobiano que resultou em ≤ 50% na redução do composto. Para células planctônicas, os resultados observados foram concordantes com os valores obtidos por metodologia convencional de microdiluição e leitura visual, segundo as recomendações do CLSI. Em comparação aos resultados obtidos com células planctônicas, a ação dos antimicrobianos ampicilina e eritromicina nos biofilmes foi extremamente reduzida e dificilmente seria aplicável ao tratamento ou controle das estreptococcias, com participação de biofilmes. Estes dados corroboram o que já foi descrito na literatura para outros micro- organismos, demonstrando o aumento, em várias vezes, da resistência a aos antimicrobianos em relação aos biofilmes, quando comparados com células planctônicas (Pettit et al., 2005; Donlan & Costerton, 2002).

Os resultados obtidos para ambos antimicrobianos demonstraram comportamento inesperados como, por exemplo, o S. canis onde foi observado um aumento de biomassa e atividade celular semelhante ao controle quando exposto. Estudos já tem apontado uma relação entre a presença de antimicrobianos e a resposta ao estresse por produção de nucleotídeos modificados conhecidos como (p)ppGpp, assim como modificações na expressão de diversos genes, alguns até envolvidos na formação de biofilmes (Abranches et al., 2009; Hesketh et al., 2011). Sabe-se que este nucleotídeo modificado regula muitos processos fisiológicos, incluindo transcrição, tradução, replicação, virulência, diferenciação e latência através de diferentes vias ou mecanismos (Dalebroux et al., 2010; Potrykus & Cashel, 2008). Diante disso, é possível que em resposta ao estresse, de modo geral, as células constituintes do biofilme apresentem modificações metabólicas capazes de acarretar uma maior redução do azul de Alamar e que as concentrações desencadeadoras desta resposta variem de espécie para espécie. Contudo, mais investigações são necessárias para explicar este comportamento mediante as concentrações testadas. Esta possível modificação metabólica na presença de diferentes concentrações de ampicilina e eritromicina pode ser reforçada pelos resultados observados nos ensaios semelhantes revelados pelo método do cristal violeta. Nossos dados revelaram que para maioria das espécies não houve relação entre a biomassa e a concentração dos antimicrobianos. A biomassa dos biofilmes submetidos às diferentes concentrações assemelhou-se ao controle sem antimicrobiano, sugerindo que mesmo na presença de altas concentrações de antimicrobianos, houve manutenção de biofilme pré-formado. Para S. equi subsp. zooepidemicus o decréscimo da biomassa parece proporcional ao aumento das concentrações de ampicilina e eritromicina. Já para S. pyogenes resultado semelhante foi observado somente em biofilmes expostos a eritromicina, sugerindo que o antimicrobiano foi capaz de afetar a estrutura do biofilme provocando dispersão. Arthur Gardner, em 1940, relatou pela primeira vez a interferência de sub-CIMs de antimicrobianos nas funções bacterianas. Gardner mostrou que Clostridium perfringens formavam filamentos alongados e não segmentados na presença de sub-CIMs de penicilina (Gardner, 1940). Estudos subsequentes mostraram que sub-CIM de antimicrobianos, realmente, alteram a ultraestrutura e antigenicidade das bactérias, a aderência às células epiteliais, síntese e secreção de enzimas e toxinas, taxa de crescimento in vitro e in vivo e a indução de profagos (Washington, 1979; Lorian, 1993; Gerber et al., 2008; Deneve et al., 2009).

O primeiro estudo demonstrando que concentrações subinibitórias de antimicrobianos podem induzir a formação de biofilmes in vitro foi relatado por Gordon Christensen em 1988, um pioneiro nos estudos sobre biofilmes de Staphylococcus epidermidis, demonstrando um aumento de 65% na formação na presença de ¼ da CIM de rifampicina, nenhuma das amostras apresentou um aumento na formação em resposta a ¼ da CIM de outros oito antimicrobianos (Schadow, Simpson & Christensen, 1988). O entendimento desse processo tem ampla relevância, incluindo clínica, onde os micro-organismos invariavelmente estão submetidos a doses sub-inibitórias em diferentes etapas do tratamento com antimicrobianos, ou, até mesmo, devido a condutas inadequadas na dosagem e tempo de utilização da droga (Odenholt, 2001). Em adição, as células das regiões mais internas do biofilme podem estar expostas a sub-CIMs com elevada frequência, particularmente diante gradiente de difusão do antimicrobiano, através da matriz extracelular (Singh et al., 2010). Kaplan (2011) observou que o favorecimento da formação de biofilmes é variável tanto em relação à fração da CIM utilizada, quanto ao microrganismo testado. O autor ressaltou que, para a maioria dos antimicrobianos a indução máxima deve ocorrer próximo a ½ da CIM. A escolha das frações segue a mesma lógica das diluições para determinação da CIM, que na maioria das vezes segue a razão dois. Diante do exposto, investigamos o efeito de concentrações sub-CIM de ampicilina e eritromicina durante o desenvolvimento dos biofilmes. Os testes foram realizados na presença de ½ da CIM, baseado no maior acúmulo de dados na literatura que empregavam estes valores (Cerca et al., 2005). Em geral, foi observado um estímulo à produção de biofilmes, representado por um aumento de 3 a 5 vezes na biomassa, quando comparado ao controle na ausência de antimicrobianos. Resultados semelhantes foram demonstrados por Kaplan, Jabbouri e Sadovskaya (2011), que relataram um aumento de 10 vezes na formação de biofilmes de S. epidermidis na presença de sub-CIMs de vancomicina. Neste estudo, o cultivo na presença de eritromicina proporcionou os melhores resultados de indução para a maioria das amostras. Para ampicilina, espécies como S. iniae, S. pyogenes e S. agalactiae apresentaram uma biomassa menor que o controle (sem antimicrobiano), sugerindo que as sub-CIM de ampicilina utilizadas foram capazes de inibir significativamente (p<0,05) o processo de desenvolvimento dos biofilmes. Não se pode deixar de considerar que os valores correspondentes a ½ da CIM podem ter acarretado na redução da eficácia de células planctônicas, nos processos que antecedem a

formação do biofilme. Sendo assim, concentrações menores como, por exemplo, ¼ da CIM, devem ser analisadas em estudos posteriores, uma vez que os resultados observados não são suficientes para inferir se as doses subinibitórias de ampicilina são ativas na redução dos biofilmes destas espécies. A continuidade deste estudo é fundamental ao esclarecimento do fenômeno observado, pois já foi demonstrada a relação de sub-CIMs com a inibição da formação de biofilmes, sugerindo que para alguns microrganismos estas concentrações poderiam ser utilizadas como ferramentas para a prevenção da formação em dispositivos médicos (Kadry et al., 1999). Cerca e colaboradores (2005) observaram uma inibição de 40% na formação de biofilme de S. epidermidis na presença concomitante de sub-CIMs de dicloxacilina e vancomicina. Por outro lado, já foi observado, em estudos recentes, que a formação de biofilmes pode ser comprometida em valores menores de subCMIs e favorecida em doses mais elevadas, se comparados a um controle na ausência do antimicrobiano (Kaplan, 2011). Isto foi demonstrado em um estudo com S. epidermidis que exibiu máxima produção de biofilme em concentrações de ¾ da CIM de vancomicina (Kaplan, Jabbouri & Sadovskaya, 2011). Estes fenômenos podem ser explicados pelo fato de haver uma relação entre a dose – resposta de sub-CIM ideal para o estímulo da formação. A natureza da dose-resposta é bifásica e é caracterizada normalmente por baixas doses desencadeando um estímulo da formação e altas doses uma inibição. Sabe-se que a taxa de difusão dos antimicrobianos nos biofilmes é extremamente dependente da sua ligação aos constituintes da substância polimérica extracelular (matriz). A matriz desempenha um importante papel para o desenvolvimento de biofilmes. A distribuição dos seus componentes varia de um microrganismo para outro e é dependente das condições de crescimento, mas tipicamente compreende proteínas, polissacarídeos e DNA. Adicionalmente, a presença de DNAe e de proteínas participam ativamente da resistência, reduzindo a fluidez da matriz e atuando em ligações intercelulares, sendo, também, fundamental a estabilidade das estruturas tridimensionais (estruturas em “cogumelo”) (Stoodley et al., 2002). Portanto, o conhecimento da constituição da matriz extracelular, parece ser um passo importante na definição de estratégias de controle e prevenção da formação dessas estruturas (Watnick & Kolter, 2002; Berne et al., 2010). Em nosso estudo, o tratamento com DNaseI resultou no destacamento dos biofilmes produzidos por S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. equi subsp equi, S. pyogenes e S. urinalis. Entretanto, considerando-se os dois controles utilizados nos testes apenas os

resultados obtidos para as amostras de S. agalactiae e S. pyogenes apresentaram resultados significativos (p<0,05). Diante deste resultado e em paralelo ao observado na CLSM ratificamos que o DNA possui um papel estrutural, provavelmente de sustentação em biofilmes de S. pyogenes. S. iniae e S. pseudoporcinus obtiveram valores de DO, significativamente, mais elevados em relação aos controles quando tratados com DNaseI, sugerindo um favorecimento da formação na presença da enzima. Resultado semelhante foi obtido por Berne, Kysela e Brun (2010) ao observarem que biofilmes de Caulobacter crescentus tratados com DNaseI desenvolviam-se melhor que os não tratados. Os autores demonstram que DNAe promove a dispersão por inibição da incorporação de novas células dentro do biofilme. O tratamento com proteinase K causou uma redução dos biofilmes da maioria das amostras. Porém, S. agalatiae, S. dysgalactiae subsp equisimilis, S. iniae, S. mutans, S. parauberis, S. porcinus e S. pyogenes foram as que apresentaram valores significativos (p<0,05), para ambos os controles, sugerindo a formação de estruturas ricas em proteínas. Mesmo diante desses resultados deve-se considerar que a arquitetura dos biofilmes é heterogênea e sofre constantes mudanças acarretadas por processos externos e internos (Donlan, 2002). A fim de analisar comparativamente a morfologia dos biofilmes das espécies incluídas neste estudo, microscopia ótica de luz foi realizada com biofilmes formados por 24 h sobre lamínulas de vidro. Todas as amostras foram capazes de formar biofilmes sobre lamínulas de vidro, apresentando aglomerados densos de células por todo substrato. Para algumas espécies como S. urinalis foi possível observar longas cadeias entremeadas e constituintes das microcolônias, sugerindo modificações morfológicas no estado séssil. Sabe-se que células constituintes dos biofilmes são passíveis a diferentes modificações genotípicas e fenotípicas, decorrentes do microambiente regido pelo gradiente de nutrientes, pH e oxigênio (Bowden & Li, 1997; Goller & Romeo, 2008). Neste estudo também avaliamos por microscopia confocal de varredura a laser a distribuição de células vivas e mortas. As preparações coradas com LIVE/DEAD BacLight demonstraram biofilmes amplamente distribuídos sobre o substrato (lamínulas de vidro). S. pyogenes apresentaram imagens representativas de maior biomassa. Foram observadas regiões compostas por filamentos longos, que a coloração utilizada demonstrou serem constituídos de DNA extracelular (DNAe). DNAe desempenha diversas funções nos biofilmes. Estudos com Pseudomonas aeruginosa têm relatado a importância deste componente para a adesão inicial ao substrato e estabilidade estrutural do biofilme (Steinberger et al., 2002;

Whitchurch et al., 2002). Descrições similares têm sido feitas para outros microrganismos como estreptococos (Petersen et al., 2005) e Bacillus cereus (Vilain et al., 2009). Diante disso, os filamentos observados (assim como a disposição desses) nos biofilmes de S. pyogenes parecem indicar uma função estrutural. Através da CLSM também foi possível concluir que as diferentes espécies apresentam tempos de maturação espécie-específicos. Essa afirmativa, reside no fato de preparações coradas com LIVE/DEAD BacLight possuírem diferentes quantidades de células vivas e mortas. Biofilmes de S. phocae quando comparados aos biofilmes de S. parauberis, apresentaram maior quantidades de células mortas. O balanço entre viabilidade e mortalidade dentro de um biofilme é regido por diferentes microambientes e dependente das condições do meio (Stoodley et al., 2002). Apesar de ainda serem necessárias investigações adicionais, todos os aspectos de formação de biofilmes apresentados neste estudo acrescentam-se à literatura ao demonstrarem que mesmo filogeneticamente relacionadas estas espécies preservam características singulares no que tange o universo da formação de biofilmes.

CONCLUSÃO

Streptococcus destacam-se no cenário das infecções, principalmente, devido ao potencial de colonização e infecção. Esta versatilidade certamente está associada a um arsenal de fatores de virulência, os quais incluem adesinas, toxinas, proteases e outros, que estão distribuídos entre a maioria dos membros do gênero. Este estudo pretendeu contribuir com informações que auxiliem correlacionar os aspectos associados à formação de biofilmes ao sucesso de um grupo de espécies de Streptococcus filogeneticamente relacionadas. Este grupo envolve patógenos associados a diferentes infecções em hospedeiros diversos. A formação de biofilmes em condições nutricionais variadas, que foi representada em diferentes meios de cultura, sugeriu a plasticidade destes micro-organismos em manter ou mesmo favorecer a produção de biomassa. Esta conclusão poderia de alguma forma ser extrapolada para as diferentes situações encontradas in vivo. Neste estudo também foi demonstrado que espécies reconhecidamente susceptíveis a antimicrobianos, comumente empregados no tratamento das infecções estreptocócicas, apresentam concentrações inibitórias muito elevadas, quando no estado séssil. Apontando para uma maior reflexão da eficácia dos biofilmes na proteção contra os agentes antimicrobianos. Este fato chama atenção particularmente em espécies historicamente susceptíveis, como o caso de S. pyogenes. O conhecimento de que a exposição aos antimicrobianos favorece a pressão seletiva e determina a emergência de amostras resistentes, pode ser nestes casos aplicado de forma válida, conjugando os princípios da seleção natural a um “ambiente confinado”, como é o caso dos biofilmes. Além disso, os biofilmes conferem a soberania sobre as defesas do hospedeiro, proporcionando o benefício da persistência em uma “verdadeira fortaleza”. Entretanto, as observações decorrentes da ação de doses subinibitórias de antimicrobianos precisam ser melhor avaliadas em estudos futuros. Características mais uma vez espécie-específicas definiram comportamentos diferentes que ora apontam para uma ação de controle, ora para um incentivo a formação dessas estruturas, dependendo da espécie. Como foi possível evidenciar, apesar das espécies em questão estarem relacionadas filogeneticamente, conservam peculiaridades, no que tange a formação de biofilmes, que merece atenção destacada no estudo da Biologia destes micro-organismos.

Os resultados obtidos neste estudo enfatizam a necessidade de uma abordagem continuada dos aspectos envolvidos na formação de biofilmes, como importantes protagonistas do sucesso da colonização e infecção de Streptococcus em diferentes hospedeiros.

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