Universidade Federal Do Tocantins Toxicidade Dos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

TOXICIDADE DOS EXTRATOS BRUTO, ACETÁTICO E ALCALOÍDICO DAS FOLHAS DE Psychotria colorata EM RATAS WISTAR

Nahuria Rosa Karajá Javaé

Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutora, junto ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins.

Área de Concentração: Produção Animal

ARAGUAÍNA 2017

NAHURIA ROSA KARAJÁ JAVAÉ

Toxicidade dos extratos bruto, acetático e alcaloídico das folhas de Psychotria colorata em ratas Wistar

Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutora, junto ao Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins.

Área de Concentração: Produção Animal

Orientadora: Profª. Drª. Viviane Mayumi Maruo

Co-orientadora: Profª. Drª. Domenica Palomaris Mariano de Sousa

ARAGUAÍNA 2017

Dedico a Deus, minha família e ao meu povo - Povo Iny.

Agradecimentos

Agradeço a Deus pelo seu eterno e grandioso amor, amor esse que é a única explicação de sua graça e misericórdia nos mínimos detalhes da minha vida. À Capes e ao CNPq pelo auxílio financeiro à tese. A meus pais Idjarruri Karajá (para sempre em minha memória) e Adaís Rosa Karajá, pelo amor, dedicação, afeto, proteção, conselhos, cuidados sempre prontamente disponibilizados. Pais amados, muito obrigada. A meus irmãos Idjawala e Idjarrina pelo apoio. Em especial ao Idjawala, meu parceiro de guerra. A meus sobrinhos Narubia, Idjahiru, Idjarruri, Marisiru e Loiwá por sempre provocarem espontânea alegria da tia e tirarem em muitos momentos, como mágica, a tensão provocada pelo doutorado. À minha cunhada Hareidja pela cumplicidade e amizade. A meu amado marido, Viviano Iesoru Javaé Karajá (Vivi ou Wade) por seu companheirismo, compreensão e amizade, evidenciando seu amor nos momentos mais difíceis. Marido você é um companheirão! A meu povo – povo Iny. À minha orientadora Profª. Viviane por ter aceitado me orientar também em mais essa etapa. De maneira única ela me ensinou, aconselhou e possibilitou que eu adquirisse conhecimentos que levarei para o resto da vida. À equipe de pesquisa da qual eu fiz parte durante o doutorado, agradeço sinceramente. Às minhas colegas Fernanda, Benta e Nádia pela ajuda. Agradeço em especial a, agora professora, Laiane T. S. Moura por todo apoio e amizade. Às técnicas do laboratório Elis e Gil pelo acompanhamento diário. Agradeço também aos técnicos Liana e Adriano pelas valiosas contribuições. Aos alunos de Iniciação Científica Glads e Nayara em especial a Nayara pelo super auxílio no experimento. Aos Professores Paiva, Laiane, Alberto e Daiene por me darem a honra de comporem a minha banca na defesa da presente tese.

Ao Prof. Sandro pelo empréstimo do laboratório sempre que foi necessário e às suas alunas Bárbara e Vanessa pelo pronto atendimento ao longo desse período. Ao senhor Lourival, sua esposa Eva e ao senhor Miguel por possibilitar a coleta da planta. Aos parceiros Antônio Carlos, mais conhecido como ACM, Hélio e Josimar por sempre me ajudarem a resolver as intempéries que surgiram. A amiga Mayara que nunca mediu esforços para me ajudar. A Gil e seu esposo Zé Antônio, Perpétua e Tião por todo auxílio e amizade. À Profª. Isabel Auler (in memorian) por todo apoio e atenção prestados aos estudantes indígenas da UFT. As minhas irmãs em Cristo Wellany, Maiara, Idésia, Luana, Glenda, Camila, Raquel, Raquel gringa, Weyllla, Lourdes, Isadora, Iane, Haylla e Karine pelas muitas risadas nos poucos momentos de descontração. A dona Francisca pelos muitos anos de convivência. Ao pastor Marlécio e sua esposa Fernanda por terem me acompanhado e orado por mim e por minha família durante esse árduo período de doutoramento. Ao pastor Lemos e sua esposa Cidinha pelas orações das 5 da manhã. Aos guardas Valquírio, Zé, Eduardo e Rafael, e aos funcionários terceirizados pelas colaborações, em especial a Lena. A todos que direta e indiretamente tenham contribuído para execução desta pesquisa.

Obrigada!

SUMÁRIO

RESUMO...... 10 ABSTRACT...... 12 LISTA DE FIGURAS...... 14 LISTA DE QUADROS...... 18 LISTA DE TABELAS...... 19

CAPÍTULO I - Revisão de literatura

1 INTRODUÇÃO…………………………………….…...... 24 2 REVISÃO DE LITERATURA...... …...... …...... 26 2.1 Rubiaceae ...... 26 2.2 Gênero Psychotria...... 29 2.3 Psychotria colorata...... 30 2.4 Alcaloides...... 32 2.5 Compostos fenólicos...... 35 3 REFERÊNCIAS...... 39 OBJETIVOS...... 46 1. Objetivo geral...... 46 1.1 Objetivos específicos...... 46

CAPÍTULO II - Toxicidade do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata durante a organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar

RESUMO...... 48 ABSTRACT...... 49 1 INTRODUÇÃO……………………………...... 49 2 MATERIAL E MÉTODOS...... ….....…………………...... 51 2.1 Obtenção das folhas de P. colorata...... 51 2.2 Obtenção do extrato bruto (EB)...... 52 2.3 Animais...... 52 2.4 Administração do extrato bruto de P. colorata...... 52 2.5 Acasalamento e diagnóstico de prenhez...... 53 2.6 Estudo de toxicidade embrionária e fetal...... 53 2.7 Hemograma...... 53 2.8 Exames bioquímicos...... 54 2.9 Necropsia e avaliação anatomo-histopatológica...... 54 2.10 Análise estatística...... 55 3 RESULTADOS...... 55 3.1 Rendimento do extrato bruto...... 55 3.2 Consumo de ração, água, peso corporal e ganho de peso...... 55 3.3 Parâmetros hematológicos e bioquímicos...... 58 3.4 Peso relativo dos órgãos e avaliação anatomo-histopatológica.... 60 3.5 Parâmetros reprodutivos...... 62 4 DISCUSSÃO...... 64 5 REFERÊNCIAS...... 66

CAPÍTULO III – Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas Wistar

RESUMO...... 71 ABSTRACT...... 71 1 INTRODUÇÃO…………………………………...... 72 2 MATERIAL E MÉTODOS....…………………………...... 74 2.1 Obtenção das folhas de P. colorata...... 74 2.2 Obtenção do extrato acetático das folhas de P. colorata ...... 74 2.3 Análise fitoquímica...... 74 2.3.1 Teste de flavonoides...... 74 2.3.2 Quantificação de flavonoides totais...... 75 2.4 Animais...... 75 2.5 Administração do extrato acetático das folhas de P. colorata...... 76 2.6 Monitoração do ciclo estral...... 76 2.7 Avaliação da fertilidade...... 77 2.8 Hemograma...... 78 2.9 Exames bioquímicos...... 78 2.10 Necropsia e avaliação anatomo-histopatológica...... 78 2.11 Avaliação histomorfométrica da placenta...... 79 2.12 Análise estatística...... 79 3 RESULTADOS...... 81 Rendimento do extrato acetático, caracterização da presença 3.1 flavonoides e quantificação de flavonoides totais...... 81 3.2 Consumo de ração e água, peso corporal e ganho de peso...... 83 3.3 Parâmetros hematológicos e bioquímicos...... 88 3.4 Peso relativo e avaliação anatomo-histopatológica...... 90 3.5 Avaliação reprodutiva e análise histomorfométrica da placenta... 92 4 DISCUSSÃO...... 98 5 REFERÊNCIAS...... 102

CAPÍTULO IV – Efeitos da exposição ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e neurocomportamental da prole de ratas Wistar

RESUMO...... 109 ABSTRACT...... 110 1 INTRODUÇÃO…………………………………….……...... 111 2 MATERIAL E MÉTODOS...... …...... 113 2.1 Obtenção das folhas de P. colorata...... 113 2.2 Obtenção do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata...... 113

2.3 Animais...... 114 2.4 Administração do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata.. 115 2.5 Acasalamento e diagnóstico de prenhez...... 115 2.6 Avaliação dos parâmetros reprodutivos...... 115 2.7 Avaliação do comportamento maternal...... 116 2.7.1 Teste de observação...... 116 2.7.2 Teste de retirada...... 116 2.8 Atividade geral em campo aberto...... 117 2.9 Avaliação do desenvolvimento físico dos filhotes...... 118 2.10 Desenvolvimento neurocomportamental dos filhotes...... 118 2.11 Dosagem hormonal de ocitocina...... 119 2.12 Hemograma...... 119 2.13 Exames bioquímicos...... 120 2.14 Necropsia e avaliação anatomo-histopatológica...... 120 2.15 Análise estatística...... 121 2.16 Delineamento experimental...... 121 2.16.1 Efeitos da exposição perinatal ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e sensório-motor da prole de ratos...... 121 3 RESULTADOS...... 123 3.1 Efeitos da administração subcrônica do extrato alcaloídico de Psychotria colorata em ratas Wistar...... 123 3.1.1 Rendimento do extrato alcaloídico...... 123 3.1.2 Consumo de ração, água, peso corporal e ganho de peso...... 123 3.1.3 Hematologia, bioquímica sanguínea e ocitocina sérica ...... 128 3.1.4 Peso relativo e avaliação anotomo-histopatológica...... 131 3.1.5 Comportamento materno (Teste de retirada e teste de observação) e campo aberto...... 133 3.1.6 Parâmetros reprodutivos...... 139 3.2 Efeitos sobre filhotes machos de ratas Wistar tratadas com extrato alcaloídico de Psychotria colorata...... 141 3.2.1 Peso corporal e ganho de peso...... 141 3.2.2 Reflexo de endireitamento em superfície e geotaxia negativa.... 143 3.2.3 Desenvolvimento sensório-motor e desenvolvimento físico...... 145 Bioquímica sérica, peso relativo dos órgãos e avaliação 3.2.4 anatomo-histológica...... 147

3.3 Efeitos sobre filhotes fêmeas de ratas Wistar tratadas com extrato alcaloídico de Psychotria colorata...... 149 3.3.1 Peso corporal e ganho de peso...... 149 3.3.2 Reflexo de endireitamento em superfície e geotaxia negativa.... 151 3.3.3 Desenvolvimento sensório-motor e desenvolvimento físico...... 153 3.3.4 Bioquímica sérica, peso relativo dos órgãos e avaliação

anatomo-histopatológica...... 155 4 DISCUSSÃO...... 157 5 CONCLUSÃO...... 162 6 REFERÊNCIAS...... 163

RESUMO

Plantas do gênero Psychotria estão presentes em regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. Pecuaristas do estado do Tocantins relataram que P. colorata é abortiva para bovinos. Estudos prévios com a planta demonstraram toxicidade reprodutiva em ratas com aumento de perdas pré e pós-implantação, diminuição do tamanho da ninhada, número de fetos vivos e diminuição do número de fetos fêmeas. Assim, os objetivos do estudo foram avaliar os efeitos da administração do extrato bruto (EB) das folhas de P. colorata durante o período de organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar, refinar o estudo concentrando os compostos no extrato acetático (EAC) e realizar a caracterização da presença de flavonoides, quantificar os flavonóides totais e avaliar a toxicidade subcrônica e reprodutiva em ratas Wistar, além de, avaliar os efeitos do extrato alcaloídico (EAL) sobre ratas durante a gestação e lactação, e sobre o comportamento maternal e desenvolvimento da prole. A partir das folhas secas de P. colorata foram feitos os extratos, bruto, acetático e alcaloídico. Foi realizado teste qualitativo e quantitativo do extrato acetático para caracterização e quantificação de flavonoides totais. Todos os extratos foram testados para toxicidade geral e reprodutiva em ratas Wistar. Para cada experimento foram divididos os grupos com igual número de animais controle e tratado. O EB foi administrado a ratas prenhes por 15 dias na dose de 2085 mg.Kg-1 (n= 10), o EAC por 51 dias na dose de 721 mg.Kg-1 (n=16), e o EAL por 36 dias na dose de 238 mg.kg-1 (n=20). Para simular as condições naturais de intoxicação as doses corresponderam ao que seria consumido se a planta fosse a única fonte de alimento. Durante o período experimental foram monitorados diariamente os consumos de água e ração e peso corporal. Adicionalmente, foram realizados avaliação de parâmetros reprodutivos, hematológicos, bioquímicos, anatomo- histopatológicos e de peso relativo de órgãos. No experimento com EAL também foram realizados testes comportamento materno e de desenvolvimento físico e neurocomportamental de filhotes. A administração do EB às ratas provocou diminuição no consumo de ração no 16º dia de gestação. Na bioquímica sérica houve diminuição de ácido úrico, colesterol e triglicerídeos. Na análise fitoquímica do EAC foi detectado flavonoides e a quantificação de flavonoides totais foi de 4,53%. As fêmeas tratadas com EAC apresentaram aumento no consumo de ração antes e durante a gestação. Na análise hematológica foram observadas linfopenia, e monocitose. Ainda, as fêmeas tratadas com EAC apresentaram aumento no peso da placenta. A administração de EAL a ratas promoveu linfocitose e neutrofilia. Na bioquímica sérica houve aumento de ácido úrico e diminuição de proteína total. Na análise da atividade em campo aberto foi observado que as ratas tratadas com EAL apresentaram diminuição da atividade locomotora e aumento da imobilidade e a prole das ratas tratadas com EAL, na avaliação de desenvolvimento físico, mostraram maior latência para abertura dos olhos dos machos e erupção precoce dos dentes incisivos nas fêmeas quando comparado ao grupo controle. No desenvolvimento neurocomportamental, os filhotes machos apresentaram maior latência no reflexo de endireitamento em três dias e as fêmeas em um dia na prole de ratas que receberam EAL. Os demais parâmetros não foram afetados pela exposição ao EB, EAC e EAL. Conclui-se

11 que os extratos bruto, acetático e alcaloídico das folhas de P. colorata produziram toxicidade geral, reprodutiva e sobre desenvolvimento de filhotes de ratas tratadas.

Palavras-chave: alcaloides, flavonoides, reprodução, comportamento maternal, desenvolvimento de filhotes

ABSTRACT

Plants of the genus Psychotria are present in tropical and subtropical regions of the world. Cattle ranchers from the State of Tocantins reported that P. colorata is abortive for cattle. Previous studies with the plant demonstrated reproductive toxicity in rats with increased pre and post implantation losses, decreased litter size, number of live fetuses, and decreased numbers of female fetuses. The objective of this study was to evaluate the effects of crude extract (CE) administration of P. colorata leaves during the period of organogenesis and fetal development in Wistar rats, to refine the study by concentrating the compounds in the acetal extract (ACE) the characterization of the presence of flavonoids, quantification of total flavonoids, and evaluation of subchronic and reproductive toxicity in Wistar rats, as well as evaluation of the effects of alkaloid extract (ALE) on rats during gestation and lactation, and on maternal behavior and development of offspring. From the dried leaves of P. colorata the crude, acetatic and alkaloid extracts were made. A qualitative and quantitative assay was performed for the characterization and quantification of total flavonoids. All extracts were tested for general and reproductive toxicity in Wistar rats. For each experiment, the groups with equal numbers of control and treated animals were divided. CE was administered to pregnant rats for 15 days at the dose of 2085 mg.kg-1 (n = 10), the ACE for 51 days at the dose of 721 mg.kg-1 (n = 16), and the ALE at 36 Days at a dose of 238 mg.kg-1 (n = 20). To simulate the natural conditions of intoxication the doses corresponded to what would be consumed if the plant were the only source of food. During the experimental period, the water and feed intake and body weight were monitored daily. In addition, evaluation of reproductive, hematological, biochemical, anatomopathological and relative organ parameters were performed. In the experiment with ALE, tests were performed on maternal behavior and on the physical and neurobehavioral development of offspring. The administration of CE to rats caused a decrease in feed intake on the 16th day of gestation. In serum biochemistry there was a decrease in uric acid, cholesterol and triglycerides. In the phytochemical analysis of the EAC, flavonoids were detected and the quantification of total flavonoids was 4.53%. Females were treated with ACE showed an increase in feed intake before and during gestation. In the hematological analysis, lymphopenia, and monocytosis were observed. In addition, the females treated with ACE presented increase in placental weight. The administration of ALE to rats promoted lymphocytosis and neutrophilia. In serum biochemistry there was an increase in uric acid and a decrease in total protein. In the analysis of the activity in the open field, it was observed that the rats treated with ALE showed decreased locomotor activity and increased immobility, and the offspring treated with ALE in the evaluation of physical development showed higher latency for male eye opening and rash precocious incisor teeth in females when compared to the control group. In the neurobehavioral development, the male pups presented higher latency in the righting reflex in three days and the females in one day in the offspring of rats that received EAL. The other parameters were not affected by exposure to CE, ACE and ALE. It was concluded that the raw, acetal and alkaloid extracts of P. colorata leaves produced general, reproductive toxicity and on the development of treated rat offspring.

Keywords: alkaloids, flavonoids, reproduction, maternal behavior, development of offspring.

LISTA DE FIGURAS

Capítulo I - Revisão de literatura

Figura 1. Subfamílias e tribos da família Rubiaceae (BREMER, 2009). 27 Figura 2. Psychotria colorata...... 30 Figura 3. Alcaloides identificados nas folhas de P. colorata...... 31 Estrutura de flavonoides de espécies de Psychotrias Figura 4. (CALIXTO et al., 2016)...... 37

Capítulo II - Toxicidade do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata durante a organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar

Figura 1. Consumo de ração (em gramas) das ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrões. *p < 0,05, Teste t de Student...... 56 Figura 2. Consumo de água (em mL) das ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrões. p > 0,05. Teste de Student...... 56 Figura 3. Peso, em gramas, de ratas do grupo tratado com P. colorata e do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrões. p > 0,05, Teste t de Student...... 57 Figura 4. Ganho de peso (em gramas) de ratas entre o 6º e 20º dia de gestação, que receberam extrato bruto de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrões. p > 0,05, Teste t de Student...... 57

Capítulo III - Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas Wistar

Figura 1. Testes qualitativos para flavonoides. A) 1- Tubo de ensaio contendo solução do extrato bruto metanólico de P. colorata (EBM) sem adição de HCl e fita de magnésio; 2- Tubo de ensaio contendo o EBM com reação positiva para flavonoides; 3- Tubo de ensaio branco com água destilada. B) 1- Tubo de ensaio branco com água destilada; 2- Tubo de ensaio contendo o extrato acetático de P. colorata com reação positiva para flavonoides; 3- Tubo de ensaio com extrato acetático sem adição de HCl e fita de magnésio...... 82 Figura 2. Teor de flavonoides totais expresso como miligramas equivalente de rutina por grama de extrato...... 82

Figura 3. Consumo de ração (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrões. *p < 0,05, Teste t de Student...... 84 Figura 4. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05 Teste t de Student...... 84 Figura 5. Peso corporal (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05 Teste t de Student...... 85 Figura 6. Ganho de peso (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05 Teste t de Student...... 85 Figura 7. Consumo de ração (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. *p < 0,05 Teste t de Student...... 86 Figura 8. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05 Teste t de Student...... 86 Figura 9. Peso corporal (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05 Teste t de Student...... 87 Figura 10. Ganho de peso (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05 Teste t de Student...... 87 Figura 11. Avaliação histopatológica da placenta de ratas do grupo experimental tratadas com extrato acetático de P. colorata e do grupo controle. (A) Rata, placenta, identificação das camadas placentárias constituídas pela zona basal (ZB) e zona do labirinto (ZL), grupo controle, HE, 4X. (B) Rata, placenta, identificação das camadas placentárias constituídas pela zona basal (ZB) e zona do labirinto (ZL), grupo experimental, HE, 4X. (C) Rata, placenta, zona basal com a presença de células trofoblásticas gigantes (setas), grupo controle, HE, 40X. (D) Rata, placenta, zona basal com aumento da quantidade de células trofoblásticas gigantes (setas), grupo experimental, HE, 40X...... 96 Figura 12. Avaliação histopatológica da placenta de ratas do grupo experimental tratadas com extrato acetático de P. colorata e do grupo controle. (A) Rata, placenta, zona basal com a presença de células espongiotrofoblásticas (setas), grupo controle, HE, 40X. (B) Rata, placenta, zona basal com a presença de aumento de células espongiotrofoblásticas

(setas), grupo experimental, HE, 40X. (C) Rata, placenta, zona do labirinto com a presença de células trofoblásticas (setas), grupo controle, HE, 40X. (D) Rata, placenta, zona do labirinto com aumento da quantidade de células trofoblásticas (setas), grupo experimental, HE, 40X...... 97

Capítulo IV - Efeitos da exposição ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e neurocomportamental da prole de ratas Wistar

Figura 1. Fluxograma para obtenção do extrato alcaloídico de P. colorata (EAL)...... 114 Figura 2. Consumo de ração (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu, Tween 5% a partir do 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student ...... 124 Figura 3. Consumo de ração (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante a lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 124 Figura 4. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e os erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 125 Figura 5. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante a lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 125 Figura 6. Peso corporal (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 126 Figura 7. Peso corporal (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante a lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 126 Figura 8. Ganho de peso (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5%, entre o 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 127

Figura 9. Ganho de peso (em gramas) entre o 1º dia e o 21º dia de lactação, de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5%, a partir do 6º dia de gestação ao 21º dia de lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 127 Figura 10. Frequência de comportamento materno, durante o período da manhã, de mães amamentando em posição muito arqueada (A), pouco arqueada (B) e de lado ou de costas (C) de ratas lactantes que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05. Teste t de student...... 135 Figura 11. Frequência de comportamento, durante o período da manhã, de mãe em repouso, de ratas lactantes que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p<0,05, Teste t de student...... 136 Figura 12. Frequência de comportamento, durante o período da tarde, de mães em repouso de ratas lactantes que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p<0,05. Teste t de student...... 136 Figura 13. Peso corporal (em gramas) de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 142 Figura 14. Ganho de peso (em grama) de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 142 Figura 15. Peso corporal (em gramas) de filhotes fêmeas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 150 Figura 16. Ganho de peso (em grama) de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student...... 150

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Monitoramento das fases do ciclo estral de ratas controle (Tween 80 a 5%) durante 30 dias...... 94 Quadro 2. Monitoramento das fases do ciclo estral de ratas tratadas com P. colorata durante 30 dias...... 94

LISTA DE TABELAS

Capítulo I - Revisão de literatura

Tabela 1. Alguns compostos isolados da família Rubiaceae...... 28 Tabela 2. Plantas, alcaloides isolados e suas ações apresentados cronologicamente...... 33 Tabela 3. Flavonoides isolados em espécies de Psychotria...... 36

Capítulo II - Toxicidade do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata durante a organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar

Tabela 1. Hemograma de ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão...... 59 Tabela 2. Bioquímica sérica de ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão...... 59 Tabela 3. Peso relativo dos órgãos das ratas que receberam extrato bruto de P.colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão...... 61 Tabela 4. Parâmetros reprodutivos das ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão...... 63

Capítulo III - Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas Wistar

Tabela 1. Hemograma das ratas tratadas com extrato acetático de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5%, por no mínimo 51 dias. São apresentadas as médias e erros padrão...... 89 Tabela 2. Bioquímica sérica de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5%, por no mínimo 51 dias. São apresentadas as médias e erros padrão...... 89 Tabela 3. Peso relativo dos órgãos das ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5%, por no mínimo 51 dias. São apresentadas as médias e erros padrão...... 91 Tabela 4. Número de dias em cada fase do ciclo estral das ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante 30 dias. São apresentas as médias e erros padrão...... 93

Tabela 5. Avaliação de parâmetros reprodutivos de ratas Wistar tratadas com extrato acetático de P. Colorata e grupo controle que receberam Tween 5% por no mínimo 51 dias. As médias e erros padrão são apresentados...... 95 Tabela 6. Histomorfometria das zonas basal e labirinto de ratas Wistar tratadas com extrato acetático de P. Colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% por no mínimo 51 dias. As médias e erros padrão são apresentados...... 96

Capítulo IV - Efeitos da exposição ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e neurocomportamental da prole de ratas Wistar

Tabela 1. Hemograma de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 129 Tabela 2. Bioquímica sérica de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 129 Tabela 3. Concentração sérica de ocitocina de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 130 Tabela 4. Peso relativo dos órgãos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 132 Tabela 5. Latências em segundos do comportamento materno no teste de retirada, de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 134 Tabela 6. Efeitos da administração do extrato alcaloídico de Psychotria colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação, no período da manhã, sobre as atividades maternas e não maternas verificadas no teste de observação. São apresentadas as médias e erros padrão...... 137

Tabela 7. Efeitos da administração do extrato alcaloídico de Psychotria colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação, no período da tarde, sobre as atividades maternas e não maternas verificadas no teste de observação. São apresentadas as médias e erros padrão...... 137 Tabela 8. Atividade geral, avaliada no campo aberto no DPN 5, de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 138 Tabela 9. Parâmetros reprodutivos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 140 Tabela 10. Tempo em segundos para a realização do reflexo de endireitamento em superfície de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 144 Tabela 11. Tempo em segundos para a realização do reflexo de geotaxia negativa de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 144 Tabela 12. Desenvolvimento sensório-motor de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 146 Tabela 13. Parâmetros do desenvolvimento físico de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 146 Tabela 14. Bioquímica sérica de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 148 Tabela 15. Peso relativo dos órgãos de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 148

Tabela 16. Tempo em segundos para a realização do reflexo de endireitamento em superfície de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 152 Tabela 17. Tempo em segundos para a realização do reflexo de geotaxia negativa de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 152 Tabela 18. Desenvolvimento sensório-motor de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 154 Tabela 19. Parâmetros do desenvolvimento físico de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 154 Tabela 20. Bioquímica sérica de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 156 Tabela 21. Peso relativo dos órgãos de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão...... 156

CAPÍTULO I – Revisão de literatura

1 INTRODUÇÃO

A bovinocultura é a principal cadeia produtiva do Tocantins e a segunda maior atividade em exportação do estado, com um rebanho efetivo de 8,4 milhões de cabeças de gado em 2015. A pecuária de corte do estado destaca-se como importante atividade econômica, pela exportação de carne, couro e miúdos de bovinos para mais de 130 países (MAPA, 2015). A criação dos rebanhos bovinos no estado se faz de forma predominantemente extensiva. Nesse tipo de sistema de criação, os animais de produção estão expostos às plantas tóxicas, pois estas naturalmente se encontram nas pastagens (MACEDO et al., 2000). Em estudo de levantamento de plantas tóxicas, produtores de bovinos relataram que no estado do Tocantins, a ingestão de Psychotria colorata (Rubiaceae) está associada a abortamentos em vacas (COSTA et al., 2011). Assim, em estudos anteriores do nosso laboratório, com o intuito de melhor investigar o efeito da planta sobre a reprodução, foi realizada avaliação da toxicidade reprodutiva das folhas de P. colorada em ratas tratadas com inclusão da planta na ração a 5% durante a oogênese e gestação totalizando 51 dias. Foi observado aumento dos sítios de reabsorção, aumentos de perdas pré e pós-implantação, diminuição do tamanho da ninhada, diminuição do número de fetos vivos e do número de fetos fêmeas. Posteriormente, foi realizada a investigação do efeito do extrato bruto das folhas de P. colorata durante a implantação, isto é, do primeiro ao quinto dia de gestação, que não resultou em efeitos tóxicos sobre a reprodução (MOURA, 2013). A análise fitoquímica das flores e fohas de P. colorata revelou a presença de alcaloides pirrolidinoindolínicos incluindo a hodgkinsina, que apresentou atividade analgésica semelhante à morfina (AMADOR et al., 2000; VEROTTA et al., 2002). Além disso, em análises fitoquímicas por meio de testes qualitativos realizados em nosso laboratório, foram detectados alcaloides e compostos fenólicos (MATOS, 1997; MOURA, 2013). Mendonça e colaboradores (2015) identifcaram taninos, flavonas, flavonoides, xantonas, chalconas, flavonóis, leucoantocianinas, catequinas e flavononas nas folhas de P. colorata.

Compostos químicos como os flavonoides e alcaloides podem produzir toxicidade e afetar a reprodução resultando em abortamento, como os casos relatados em bovinos (COSTA et al., 2011) e os danos reprodutivos observados no estudo com a inclusão da planta na ração fornecida para ratas (MOURA, 2013). Compostos de ação semelhante aos opioides, quando administrados durante a gestação, podem atravessar a barreira placentária resultando atraso no desenvolvimento embrionáro (MEYER, 2014). A administração subcutânea de morfina a cada 6h durante a prenhez induziu aumento de aborto em coelhos (ROLOFF et al., 1975). Além das alterações reprodutivas, a P. colorata em estudo com camundongos tratados com extrato aquoso da planta por via intraperitoneal provocou ptose, tremores e convulsão em teste de toxicidade aguda (ELISABETSKY et al., 1995). Portanto, o objetivo do presente trabalho foi verificar o potencial dessa planta em causar danos ao funcionamento normal do organismo, sobre o sistema reprodutivo, comportamental, desenvolvimento embrionário e fetal de ratos.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Rubiaceae

A família Rubiaceae representa uma das famílias de plantas mais importantes nos ramos: econômico, ornamental e medicinal da flora brasileira (SOUZA; LORENZI, 2008). Possui distribuição cosmopolita e concentra-se nas regiões tropicais e subtropicais com aproximadamente 637 gêneros e 13000 espécies (BARREIRO, 1990; MARTINS; NUNEZ, 2015), presente em quase todas as formações naturais, como cerrado, caatinga, matas de altitude, tabuleiros, restingas, dunas e campos abertos, no entanto, com maior abrangência em florestas úmidas. Essa família é caracterizada pela produção de metabólitos bioativos com grande potencial farmacológico (SOUZA; LORENZI, 2008; MARTINS; NUNEZ, 2015). A classificação taxonômica da família Rubiaceae é complexa. Estudos recentes sugerem que essa família é dividida em três subfamílias: Rubioideae, Cinchonoideae e Ixoroideae. Em função da abundância de espécies, as subfamílias foram divididas em 43 tribos, isto é, um intermediário clado entre gênero e subfamília (BOLZANI et al., 2001; BREMER, 2009), que estão listados na Figura 1. A subfamília Rubioideae possui a maior diversidade química da família Rubiaceae. Entre as tribos descritas, as mais estudadas são: Naucleeae (44), Gardenieae (39), Psycotrieae (34), Spermacoceae (35), Rubieae (25) e Ophiorrhizeae (14). Em geral, as espécies com maior número de estudos fitoquímicos são do gênero Uncaria, Psychotria, Hedyotis, Ophiorrhiza, e Morinda (MARTINS; NUNEZ, 2015). As plantas da tribo Psychotrieae são as principais produtoras de alcaloides, uma vez que todos os estudos fitoquímicos com gêneros pertencentes a essa tribo, isto é, Camptotheca, Carapichea, Cephaelis, Chassalia, Margaritopsis, Palicourea e Psychotria, resultaram em isolamento de alcaloides (BAILLEUL; DELAVEAU; KOCH, 1980; NAHRSTEDT; ROCKENBACH; WRAY, 1995; DREWES et al., 1999; LUCIANO et al., 2004; CHEN et al., 2009).

Tribo 01. Chiococceae

Tribo 02. Cinchoneae

Tribo 03. Guettardeae Tribo 10. Alberteae Tribo 04. Hamelieae Tribo 11. Bertiereae Tribo 05. Hillieae Subfamília Tribo 12. Coffeeae Cinchonoideae Tribo 06. Hymenodictyeae Tribo 13. Condamineeae e Tribo 07. Isertieae Tribo 14. Cremasporeae Tribo 08. Naucleeae Tribo 15. Gardenieae Tribo 09. Rondeletieae Tribo 16. Ixoreae

Família Subfamília Tribo 17. Mussaendeae Rubiaceae Ixorideae Tribo 18. Octotropideae

Tribo 25. Anthospermeae Tribo 19. Pavetteae

Tribo 26. Argostemmateae Tribo 20. Posoquerieae

Tribo 27. Coussareeae Tribo 21. Retiniphylleae

Tribo 28. Craterispermeae Tribo 22. Sabiceeae

Tribo 29. Danaideae Tribo 23. Sipaneeae

Subfamília Tribo 30. Gaertnereae Tribo 24. Vanguerieae

Rubioideae Tribo 31. Knoxieae

Tribo 32. Lasiantheae

Tribo 33. Moriendeae

Tribo 34. Ophiorrhizeae

Tribo 35. Paederieae

Tribo 36. Psychotrieae

Tribo 37. Putorieae

Tribo 38. Rubieae

Tribo 39. Schradereae

Tribo 40. Spermacoceae

Tribo 41. Theligoneae

Tribo 42. Urophylleae

Figura 1. Subfamílias e tribos da família Rubiaceae (BREMER, 2009).

Dentre as substâncias presentes em plantas da família Rubiaceae, estão os: iridoides, alcaloides indólicos, antraquinonas, terpenoides (diterpenos e triterpenos), flavonoides e outros derivados fenólicos, com especial atenção a produção de alcaloides bioativos (MARTINS; NUNEZ, 2015). Alguns compostos isolados selecionados de espécies Rubiaceae estão apresentados na tabela 1.

Tabela 1. Alguns compostos isolados da família Rubiaceae. Gênero Classe Substância Alcaloide Emetina Lactona Ácido chelidônico Cephaelis Alcaloide Cefalina Alcaloide Psicotrina Alcaloide Quinina Triterpeno Ácido cinchólico Triterpeno Ácido quinóvico Cinchona Alcaloide Quinidina Alcaloide Cinchonina Alcaloide Cinchonidina Metilxantina Cafeína Diterpeno Cafestol Coffea Antraquinona Galiosina Antraquinona Copareolatina Antraquinona Munjistina Corynanthe Alcaloide Yoimbina Galium Iridoide Macedonina Genipa Monoterpeno Genipina Hedyotis Antraquinona Alizarina Alcaloide Quinidina Landerbergia Alcaloide Cinchonina Alcaloide Cinchonidina Morinda Antraquinona Alizarina

Tabela 1. Alguns compostos isolados da família Rubiaceae (continuação) Gênero Classe Substância Mussaenda Triterpeno Ácido arjunólico Oldenlandia Antraquinona Alizarina Psychotria Alcaloide Psychotrina Alcaloide Cefalina Relbunium Antraquinona Purpurina Remijia Alcaloide Quinidina Alcaloide Cinchonina Alcaloide Cinchonidina Rubia Antraquinona Purpurina Antraquinona Alizarina Fonte: MARTINS; NUNEZ (2015).

2.2 Gênero Psychotria

Psychotria é o maior gênero da família Rubiaceae com 1500 espécies, distribuídas em regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. Plantas desse gênero produzem compostos que agem no SNC, como a P. colorata, que possui atividade analgésica (AMADOR et al., 2000; VEROTTA et al., 2002). Seu efeito ocorre pela ligação dos alcaloides pirrolidinoindolínicos, presentes nas folhas e flores da planta, em receptores opioides e pelo antagonismo de receptores glutamatérgicos N-metil D-Aspartato (NMDA) (AMADOR et al., 2000; AMADOR et al., 2001; YANG, 2016). Psychotria viridis, uma das plantas que compõe a bebida ayahuasca, é outro exemplo de espécie desse gênero com ação sob SNC, pois em associação com Banisteriopsis caapi, espécie da família Malpighiaceae, promove efeitos alucinógenos pelo sinergismo que ocorre entre o alcaloide N,N-dimethyltryptamina (DMT) de P. viridis e os alcaloides indólicos β-carbolina harmina, harmalina e tetra-hidro-harmina presentes na casca de B. caapi (FREEDLAND; MANSBACH, 1999). Pelo menos, 41 espécies de Psychotria foram quimicamente investigadas e uma série de compostos, incluindo alcaloides, terpenoides, esteroides, compostos fenólicos e alifáticos foram isolados. Estudos

30 farmacológicos demonstraram que esses compostos e extratos do gênero Psychotria têm extensas atividades, tais como, antibacteriana (P. pilifera), anti- fúngica (P. spectabilis), anti-inflamatória (P. octosulcata), analgésica (P. colorata), citotóxica (P. spectabilis), antioxidante (P. umbellata) e antimutagênica (P. umbellata) (ELISABETSKY et al., 1995; BENEVIDES; YOUNG; BOLZANI, 2005; FRAGOSO et al., 2008; MARIYAMMAL; KAVIMANI, 2013 ; LIU et al., 2016).

2.3 Psychotria colorata

Psychotria colorata (Figura 2) é uma planta da família Rubiaceae, conhecida popularmente como “perpétua do mato” ou “repolho”. A planta é encontrada nas Guianas, Venezuela e no Brasil, presente nas regiões Norte, Nordeste e Centro Oeste do país (TAYLOR, CAMPOS; ZAPPI, 2007).

Figura 2. Psychotria colorata.

P. colorata é utilizada na medicina popular para tratar dores de ouvido e dores abdominais. Para o uso, as flores são divididas em pedaços, cobertas com folha de bananeira e aquecidas, em seguida, as flores são misturadas com leite, filtradas em coador de pano e aplicadas topicamente no ouvido. As raízes

31 e os frutos são submetidos à decocção e administrados por via oral (ELISABETSKY; CASTILHOS; 1990). O estudo fitoquímico do extrato de alcaloides totais obtidos a partir das flores e folhas de P. colorata, identificou a presença de alcaloides pirrolidinoindolínicos tais como hodgkinsina (Figura 3 A), quimonantina (Figura 3 B), quadrigemina C (Figura 3 C) e psicotridina (Figura 3 D) e dos alcaloides quinolínicos, calicantina (Figura 3 E) e isocalicantina (Figura 3 F) (ELISABETSKY, et al., 1995; VEROTTA et al., 1998). Além de alcaloides também foram detectadas a presença de compostos fenólicos: taninos, flavonas, flavonoides, xantonas, chalconas, flavonóis, leucoantocianinas, catequinas e flavononas nas folhas de P. colorata (MOURA, 2013; MENDONÇA, et al., 2015). O isolamento e identificação dos alcaloides de P. colorata foram realizados por meio de uma extração padrão para alcaloides com etapas de acidificação, partição com diclorometano ou clorofórmio e alcalinização com hidróxido de amônia ou de sódio e novo particionamento com diclorometano ou clorofórmio. A partir do fracionamento do extrato alcaloídico em Sephadex LH- 20, depois de eluídos em metanol os compostos foram isolados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC - High performance liquid cromatography). A elucidação das estruturas foi realizada por meio de ressonância magnética nuclear e espectrometria de massas termospray e electrospray (VEROTTA et al., 1998; VEROTTA et al., 1999).

A B

Hodgkinsina Quimonantina

Figura 3. Alcaloides identificados nas folhas de P. colorata.

C D

Quadrigemina C Psicotridina

E F

Calicantina Isocalicantina

Figura 3. Alcaloides identificados nas folhas de P. colorata (continuação).

2.4 Alcaloides

Segundo Simões e colaboradores (2007) a definição de alcaloides é difícil de ser estabelecida, pois existe uma ausência de separação precisa entre alcaloides propriamente ditos e aminas complexas de ocorrência natural. O conceito mais utilizado é o descrito por Pelletier (1988), o qual define alcaloide como uma substância orgânica cíclica, de caráter básico e origem natural (quase exclusivamente vegetal) cuja distribuição é limitada entre os organismos

33 vivos e contém em sua fórmula um nitrogênio em um estado de oxidação negativo. Os alcaloides possuem importantes atividades biológicas. Na tabela 2 são apresentados alguns alcaloides seguindo a cronologia da descoberta com suas respectivas ações.

Tabela 2. Plantas, alcaloides isolados e suas ações apresentados cronologicamente. Planta Alcaloide Ano Ação Papaver Morfina 1805 Hipnoanalgésicos Cinchona Quinina 1820 Antimaláricos Atropa Atropina 1833 Anticolinérgicos Physostigma Fisostigmina 1864 Anticolinesterásicos Pilocarpus Pilocarpina 1875 Colinérgicos Ephedra Efedrina 1887 Adrenérgicos Erithroxylum Cocaína 1895 Anestésicos locais Chondodendron Tubocurarina 1895 Bloqueadores neuromusculares Claviceps Ergotamina 1922 Bloqueadores adrenérgicos Rauwolfia Reserpina 1952 Neurolépticos Fonte: ROCHA; SILVA (1973).

O alcaloide hodgkinsina de P. colorata apresentou atividade semelhante à morfina (AMADOR et al., 2000; VEROTTA et al., 2002). A morfina é considerada como analgésico padrão a partir da qual todas as substâncias que apresentam acentuada ação analgésica, conhecidas como opioides, são comparadas a ela (MILONE, 2012). Estas substâncias podem ser derivadas de alcaloides naturais e semi-sintéticos do ópio, substitutos sintéticos ou agentes semelhantes aos opioides cujas ações são bloqueadas pelo antagonista não- seletivo naloxona e vários peptídeos endógenos (HARDMAN; LIMBIRD, 2005). Os receptores opioides são do tipo metabotrópicos pertencentes à superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) (LAGERSTROM; SCHIOTH, 2008). Esses receptores contém em sua estrutura uma proteína com porções extracelulares, que se liga a seus agonistas, e subunidades intracelulares, que são as responsáveis pelo tipo de resposta que a ativação

34 destes receptores desencadeará. A proteína G é composta de três subunidades, sendo elas α, β e γ e a subunidade α é ligada ao nucleotídeo difosfato de guanosina (GDP) (KATRITCH; CHEREZOV; STEVENS, 2013). A ligação de um agonista no receptor de membrana provoca alterações conformacionais no receptor e isso promove a troca do GDP para a guanosina trifosfato (GTP) na subunidade Gα que leva à dissociação das subunidades Gβγ. Assim, ambas as subunidades podem se associar com efetores em canais iônicos ou enzimáticos para modular suas funções biológicas (TEODOROV et al., 2008). Em receptores opioides a subunidade Gαi inibe a enzima adenilil-ciclase e consequentemente promove a redução da produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc). Portanto, a redução de AMPc leva a uma diminuição da liberação de neurotransmissores por reduzir a ativação da proteína quinase A (PKA) (AL-HASANI; BRUCHAS, 2011). A exposição a substâncias opioides durante a gestação pode resultar em complicações médicas em recém-nascidos, tais como: síndrome da morte súbita infantil, síndrome de abstinência neonatal, dificuldade respiratória, anomalias congênitas e alterações comportamentais (MEYER, 2014). Em estudo com ratas tratadas com morfina durante o período pós-parto foi observado inibição do comportamento maternal e estímulo das ratas à caça predatória e forrageamento (SUKIKARA et al., 2007) que pode ter ocorrido pela ativação opioidérgica da substância cinzenta periaquedutal lateral (PAGl), pois a ativação dessa área pode alterar as respostas motivacionais e permitir a expressão de outros comportamentos como de predação de insetos e comportamento defensivo à um predador vivo (COMOLI; RIBEIRO-BARBOSA; CANTERAS, 2003). Além disso, a infusão de sulfato de morfina na área pré- óptica medial (MPOA) resultou em diminuição do comportamento materno em ratas (MOURA et al., 2010). Adicionalmente, a morfina inibe a síntese de ocitocina em ratas (ZHEN- DONG et al., 2000). A ocitocina é sintetizada nos neurônios magnocelulares do núcleo paraventricular e supraóptico do hipotálamo. É transportada para a hipófise posterior onde é liberada para circulação periférica podendo agir na regulação de comportamentos como a amamentação e comportamento maternal (NAGASAWA et al., 2012). Por outro lado, a administração de sulfato

35 de morfina na área tegmental ventral melhorou o comportamento materno em ratas (NEUMANN et al., 2009). Os alcaloides hodgkinsina, quimonantina e psicotridina encontrados nas folhas de P. colorata também apresentaram atividade analgésica, de maneira dose-dependente no teste de dor induzida pela capsaicina (AMADOR et al., 2000 ; AMADOR et al., 2001; VEROTTA et al., 2002). Adicionalmente, a psicotridina apresentou efeito inibitório também dose- dependente na ligação [3H] MK-801, antagonista não competitivo de receptor NMDA, às membranas do córtex cerebral de camundongos, sendo este efeito uma evidência direta de participação do receptor NMDA no modo de ação da psicotridina (AMADOR et al., 2001). O MK801 possui efeito estimulatório sobre a atividade locomotora, sendo o efeito atenuado pela ação de agonistas de receptores dopaminérgicos D2/3 (COOK et al., 2004). Os receptores NMDA estão implicados na geração e manutenção de hipersensibilidade na medula espinhal e, os antagonistas desses receptores bloqueiam os estados de hiperalgesia induzidos por danos teciduais, inflamação e isquemia (WIESENFELD-HALLIN, 1998). O alcaloide quinolínico calicantina também foi identificado nas folhas de P. colorata (VEROTTA et al., 1998). Este alcaloide possui atividade convulsivante principalmente pela sua ação inibitória sobre a liberação do ácido gama-aminobutírico (GABA) no hipocampo e pós-sinapticamente, bloqueando a ação do GABA nos receptores GABA A (CHEBIB et al., 2003). O GABA é secretado pelos nervos terminais da medula espinhal, cerebelo, gânglios basais e várias áreas do córtex, se sua ação for prejudicada ou interrompida pode resultar em desordens convulsivas, tetânicas e espásticas (PETROFF, 2002).

2.5 Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são metabólitos secundários, encontrados nas plantas, que apresentam pelo menos um anel aromático, com no mínimo um hidrogênio substituído por um grupamento hidroxila. Esses compostos podem ser naturais ou sintéticos, nas formas livres ou complexadas com açúcares e

36 proteínas. Podem ser formados pela via metabólica do ácido chiquímico a partir de carboidratos, ou pela via do acetato-polimalato que se inicia com acetil- coenzima A e malonil-coenzima A. As substâncias fenólicas mais encontradas em plantas são: ácidos fenólicos, flavonóides e taninos (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007). Apesar do grande número de alcaloides isolados em plantas do gênero Psychotria (YANG et al., 2016), os compostos fenólicos merecem atenção pela potencial capacidade de alterar o funcionamento do organismo animal (GHISELLI; JARDIM, 2007). Pois, sabidamente dentre os compostos fenólicos estão os flavonoides que podem agir como fitoestrógenos e se ligar em receptores estrogênicos mimetizando a ação dos estrógenos endógenos (ARCHANA SHARMA; NEERUPMA DHIMAN, 2014). As análises de compostos fenólicos de P. colorata foram apenas qualitativas (MOURA 2013; MENDONÇA et al., 2015), entretanto, flavonoides foram isolados em outras espécies de Psychotria (Tabela 3 e Figura 4).

Tabela 3. Flavonoides isolados em espécies de Psychotria. Espécie Substância Quercetina P. spectabilis Quercetrina 6-hidroxi-luteolina-7-o-rutinosídeo P. rubra Luteolina-7-o-rutinosídeo Rutina Quercetina P. serpens Tamarixetina-3-o-rutinosídeo Kaempferol

Figura 4. Estrutura de flavonoides de espécies de Psychotrias (CALIXTO et al., 2016).

Os flavonoides que agem como fitoestrógenos podem estimular ou inibir receptores de estrógeno REα e REβ e desempenhar atividades semelhantes às dos hormônios estrogênicos naturais (SANIN; GÓMEZ; MORALES, 2010). Apesar da semelhança estrutural com o 17-β estradiol, os fitoestrógenos, dependendo da dose, não provocam apenas efeitos estrogênicos, mas também anti-estrogênicos (ARCHANA SHARMA; NEERUPMA DHIMAN, 2014). Os fitoestrógenos podem competir com os estrógenos endógenos, ao se ligar ao RE e bloquear sua ação (KURZER; XU, 1997). Em baixas concentrações os fitoestrógenos tendem a estimular a proliferação de linhagens celulares de câncer de mama humano MCF-7, enquanto que altas concentrações inibem a proliferação celular e exercem forte efeito citotóxico (HSIEH et al., 1998; CHOI; JUNG; KIM, 2014). Além disso, foi verificado que esses compostos podem promover atividade inibitória da enzima aromatase, que converte andrógenos em estrógenos, levando a redução na concentração de estrógeno endógeno (MEEUWEN et al., 2008). Os fitoestrógenos podem exercer influência onde existem RE, tanto em fêmeas como em machos (ROSSELLI et al., 2000). Em tecidos chamados clássicos há abundante presença de REα, isto é, no útero, glândula mamária, placenta, fígado, sistema nervoso central, sistema cardiovascular e osso e nos tecidos não clássicos os REα estão presentes em menor concentração. Os REβ são encontrados em quantidades significativamente maiores na próstata, ovários, testículos, glândula pineal, tireoide, paratireoide, adrenais, pâncreas,

38 vesículas biliares, pele, trato urinário, tecido linfoide, tecido eritroide, pulmão, epitélio intestinal e algumas partes do encéfalo como hipotálamo, cerebelo e bulbo olfatório (JACOB et al., 2001). Os receptores estrogênicos são membros da superfamília de receptores nucleares (WEIHUA et al., 2003). Esses modulam a transcrição por união específica do estrógeno a sequências do genoma. A ligação do RE com o estrógeno induz alterações na conformação do receptor, que permite ao mesmo tempo dissociar um co-repressor e ligar-se com um complexo co- ativador, assim promovendo atividade de transcrição de genes que contêm elementos responsivos ao estrógeno resultando em efeito no órgão específico (MANIATIS; REED, 2002; HEWITT; KORACH, 2003). Os fitoestrógenos podem provocar desenvolvimento incompleto da glândula mamária, edema vulvar, descarga de muco cervical, espessamento do útero e em animais com pré-disposição genética e/ou influencia do meio ambiente, podem resultar na formação de cistos ovarianos, ninfomania e anestro prolongado, abortamento e infertilidade (ADAMS, 1990; DABHADKAR; ZADE, 2012). Além disso, os fitoestrógenos podem atravessar a placenta e alcançar o feto e causar malformações (PINTO, 2004; SANIN; GÓMEZ; MORALES, 2010). Dessa forma, a administração das folhas de Psychotria colorata possui potencial para induzir toxicidade geral e reprodutiva, comportamental e no desenvolvimento embrionário e fetal de ratos, provavelmente pela ação dos metabólitos secundários presentes na planta, principalmente os alcaloides e compostos fenólicos.

4 REFERÊNCIAS

ADAMS, N.R. Permanent infertility in ewes exposed to plant oestrogens. Australian Veterinary Journal, v. 67, p. 197-201, 1990.

AL-HASANI, R.; BRUCHAS, M. R. Molecular Mechanisms of Opioid Receptor- Dependent Signaling and Behavior. Anesthesiology, v. 115, n. 6, p. 1363- 1381, 2011

AMADOR, T. A.; VEROTTA, L.; NUNES, D. S.; ELISABETSKY, E. Antinociceptive profile of Hodgkinsine, Planta Medica Letters,v. 66. p. 1–3, 2000.

AMADOR, T.A.; VEROTTA, L.; NUNES D.S.; ELISABETSKY, E. Involvement of NMDA receptors in the analgesic properties of psychotridine. Phytomedicine, v.8, p. 202-206, 2001.

ARCHANA SHARMA, J.; NEERUPMA DHIMAN, S. S. Health Benefits of Phytoestrogens. International Journal of Advanced Research, v. 2, n. 4, p. 1024-1030, 2014.

BAILLEUL, F.; DELAVEAU, P.; KOCH, M. Apodantheroside, an iridoid glucoside from Feretia apodanthera. Phytochemistry, v. 19, p. 2763-2764, 1980.

BARREIRO, E. J. Produtos naturais bioativos de origem vegetal e o desenvolvimento de fármacos. Química Nova, v. 13, p. 29-39, 1990.

BENEVIDES, P.J.C.; YOUNG, M.C.M.; BOLZANI, V.D. Biological activities of constituents from Psychotria spectabilis. Pharmaceutical Biology, v. 42, n.8, p. 565-569, 2005.

BOLZANI, V.D.S.; YOUNG, M.C.M.; FURLAN, M.; CAVALHEIRO, A.J.; ARAÚJO, A.R.; SILVA, D.H.S.; LOPED, M.N. Secondary metabolites from Brazilian Rubiaceae plant species: Chemotaxonomical and biological significance. Recent Research Developments in Phytochemistry, v. 5, p. 19- 31, 2001.

BREMER, B. A review of molecular phylogenetic studies of rubiaceae. Annals of the Missouri Botanical Garden, v. 96, p. 4-26, 2009.

CARVALHO, J. C. T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E. P. Compostos fenólicos simples e heterosídicos. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R.; Farmacognosia, da planta ao medicamento. 6ºed. Florianopolis: Editora da UFSC, 2007.

CALIXTO, N. O.; PINTO, M. E. F.; RAMALHO, S. D.; BURGER, M. C. M.; BOBEY, A. F.; YOUNG, M. C. M.; BOLZANI, V. S.; PINTO, A. C. The Genus Psychotria: Phytochemistry, Chemotaxonomy, Ethnopharmacology and Biological Properties. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 27, n. 8, p. 1355-1378, 2016.

CHEBIB, M.; DUKE, R. K.; DUKE, C. C.; KONNOR, M.; MEWETT, K. N.; JOHNSTON, G. A. R. Convulsant actions of calycanthine. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 190, p. 58-64, 2003.

CHEN, Q.C.; ZHANG, W.Y.; YOUN, U.J.; KIM, H.J.; LEE, I.S.; JUNG, H.J.; NA, M.K.; MIN, B.S.; BAE, K.H. Iridoid glycosides from Gardeniae Fructus for treatment of ankle sprain. Phytochemistry, v. 70, p.779-784, 2009.

CHOI, E. J.; JUNG, J. Y.; KIM, G. H. Genistein inhibits the proliferation and differentiation of MCF-7 and 3T3-L1 cells via the regulation of ERalpha expression and induction of apoptosis. Experimental and Therapeutic Medicine, v. 8, p. 454-458, 2014.

COMOLI, E.; RIBEIRO-BARBOSA, E. R.; CANTERAS, N. S. Predatory hunting and exposure to a live predator induce opposite patterns of Fos immunoreactivity in the PAG. Behavior Brain Research, v.138, p.17–28, 2003.

COOK, C. D.; NEWMAN, J. L.; WINFREE, J. C. Modulation of the locomotor activating effects of the noncompetitive NMDA receptor antagonist MK801 by dopamine D2/3 receptor agonists in mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 77, p. 309-318, 2004.

COSTA, A.M.D.; MARIANO-SOUZA, D.P.; CAVALCANTE, T, V., ARAÚJO, V. L.; RAMOS, A.T.; MARUO, V.M. Plantas tóxicas de interesse pecuário em região de ecótono Amazônia e Cerrado. Parte II: Araguaína, norte do Tocantins. Acta Veterinaria Brasilica, v.5, p.317-324, 2011.

DABHADKAR, D.; ZADE, V. Abortifaciet activity of Plumeria rubra (Linn) pod extract in female albino rats. Indian Journal of Experimental Biology, v.50, n.10, p.702-707, 2012.

DREWES, S.E.; HORN, M.M.; MUNRO, O.Q.; RAMESAR, N.; OCHSE, M.; BRINGMANN, G.; PETERS, K.; PETERS, E.M. Stereostructure, conformation and reactivity of P-and a-gardiol from Burchellia bubalina. Phytochemistry, v. 50, p. 387-394, 1999.

ELISABETSKY, E.; AMADOR, T.A.; ALBUQUERQUE, R.R.; NUNES, D.S.; CARVALHO, A.C.T. Analgesic activity of Psychotria colorata (Willd. Ex R. & S.) Muell.Arg. Alkaloids. Journal of Ethnopharmacology. V.48, p.77-83, 1995.

ELISABETSKY, E.; CASTILHOS, Z.C. Plants used as analgesic by Amazonian caboclos, as a basis for selecting plants for investigation. International Journal of Crude Drug Research, v. 28, p. 49-60, 1990.

FRAGOSO, V.; NASCIMENTO, N.C.; MOURA, D.; SILVA, A.C.R.; RICHTER, M.F.; SAFFI, J.; FETT-NETO, A.G. Antioxidant and antimutagenic properties of the monoterpene indole alkaloid psychollatine and the crude foliar extract of Psychotria umbellata Vell. Toxicology in vitro, v. 22, p. 559-566, 2008.

FREEDLAND, C.S.; MANSBACH, R.S. Behavioral profile of constituents in ayahuasca, an Amazonian psychoactive plant mixture. Drug and Alcohol Dependence, v. 54, p. 183–194, 1999.

GHISELLI, G.; JÁRDIM, W. F. J. Interferentes Endócrinos no Ambiente. Química Nova, v.30, n.3, 695-706, 2007.

HARDMAN, J. G. LIMBIRD, L. E.; As bases farmacológicas da terapêutica Goodman & Gilman, 10 ed. Rio de Janeiro: Mc Graw-Hill, p. 427-464, 2005.

HEWITT, S. C.; KORACH, K. S. Oestrogen receptor knockout mice: roles for estrogen receptors α and β in reproductive tissues. Reproduction, v. 125, p. 143-149, 2003.

HSIEH, C. Y.; SANTELL, R. C.; HASLAM, S. Z.; HELFERICH, W. G. Estrogenic effects of genistein on the growth of estrogen receptor-positive human breast cancer (MCF-7) cells in vitro and in vivo. Cancer Research, v. 58, p. 3833- 3838, 1998.

JACOB, D. A.; TEMPLE, J.L.; PATISAUL, H.B.; YOUNG, L.J.; RISSMAN, E.F. Coumestrol antagonizes neuroendocrine actions of estrogen via the estrogen receptor α. Experimental Biology and Medicine, v. 226, p. 301-306, 2001.

KATRITCH, V.; CHEREZOV, V.; STEVENS, R. C. Structure-Function of the G- protein-Coupled Receptor Superfamily. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 6, n. 53, p. 531-556, 2013.

KURZER, M. S.; XU, X. Dietary phytoestrogens. Annual Review of Nutrition, v. 17, p. 353-381, 1997.

LARGERSTROM, M. C.; SCHIOTH, H. B. Structural diversity of G protein- coupled receptors and significance for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery, v. 7, p. 339-357, 2008.

LIU, L.; SONG, C-H.; KHAN, A.; LI, X-N.; YANG, X-W.; CHENG, G-G.; LIU, Y- P.; LUO, X-D. A potent antibacterial índole alkaloid from Psychotria pilifera. Journal of Asian Natural Products Research, v. 18, n. 8, p. 798-803, 2016.

LUCIANO, J.H.S.; LIMA, M.A.S.; SOUZA, E.B.; SILVEIRA, E.R. Chemical constituents of Alibertia myrciifolia Spruce ex K. Schum. Biochemical Systematics and Ecology, v. 32, p. 1227-1229, 2004.

MACEDO, M. C. M.; RICHEL, A. N.; ZIMMER, A. H. Z. Degradação e alternativas de recuperação e renovação de pastagens. Campo Grande: EMBRAPA–MCNPGC, 2000. 4 p. (Comunicado Técnico 62).

MANIATIS, T.; REED, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature (London), v. 416, p. 499-506, 2002.

MAPA - MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. Dados de rebanho bovino e bubalino – 2015. http://www.agricultura.gov.br/.

MARIYAMMAL, R.; KAVIMANI, S. Anti-Inflamatory Activity of Methanol Extract of the Whole Planto f Psychotria octosulcata. W. A. Talbot. International Journal of Pharma Research & Review, v. 2, n. 11, p. 1-5, 2013.

MARTINS, D.; NUNEZ, C. V. Secondary metabolites from Rubiaceae species. Molecules, v. 20, p. 13422-13495, 2015.

MATOS, F.J.A. Introdução à Fitoquímica Experimental. Fortaleza: UFC Edições, 1997.

MEEUWEN, J. A.; NIJMEIJER, S.; MUTARAPAT, T.; RUCHIRAWAT, S.; JONG, P. C.; PIERSMA, A. H.; VAN DEN BERG, M. Aromatase inhibition by synthetic lactones and flavonoids in human placental microssomes and breast fibroblasts – A comparative study. Toxicology and Applied Pharmacology , v. 228, n. 3, p. 269-276, 2008.

MENDONÇA, A. C. A. M.; SILVA, M. A. P.; ANDRADE, A. O.; ALENCAR, S. R.; MACHADO, M. E. Prospecção fitoquímica de Psychotria colorata (Willd. Ex. R. & S.) Müll. Arg. e P. hoffmannseggiana (R. & S.) Müll. Arg. Caderno de Cultura e Ciência, v. 13, n. 2, p. 8-16, 2015.

MEYER, MARJORIE. The perils of opioid prescribing during pregnancy. Obstetrics & Gynecology Clinics of North America, v. 41, p. 297-306, 2014.

MILONE, M. C. Laboratory testing for prescription opioids. Journal of Medical Toxicology, v. 8, p. 408-416, 2012.

MOURA, L. M.; CANTERAS, N. S.; SUKIKARA, M. H.; FELICIO, L. F. Morphine infusions into the rostrolateral periaqueductal gray affect maternal behaviors. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 43, n. 9, p. 899- 905, 2010.

MOURA, L. T. S. Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata em ratos wistar. 89p. Tese (Doutorado em Ciência Animal Tropical) –Área de concentração: Produção animal. Departamento de Patologia animal, Universidade Federal do Tocantins, Araguaína, 2013.

NAGASAWA, M.; OKABE, S.; MOGI, K.; KIKUSUI, T."Oxytocin and Mutual Communication in Mother-Infant Bonding." Frontiers in Human Neuroscience, v. 6, n. 31, p. 1- 10, 2012.

NAHRSTEDT, A.; ROCKENBACH, J.; WRAY, V. Phenylpropanoid glycosides, a furanone glucoside and geniposidic acid from members of the rubiaceae. Phytochemistry, v. 39, p. 375-378, 1995.

NEUMANN, A.; HOEY, R. F.; DAIGLER, L. B.; THOMPSON, A. C. KRISTAL, M. B. Ingestion of Amniotic Fluid Enhances the Facilitative Effect of VTA Morphine on the Onset of Maternal Behavior in Virgin Rats. Brain Research, v. 1261, p. 29-36, 2009.

PELLETIER, S.W. Alkaloids Chemical and Biological Perspectives, New York, USA, Willey, 1988.

PETROFF, O. A. C. Book Review: GABA and Glutamate in the Human Brain. The Neuroscientist, v. 8, n. 6, p. 562-573, 2002.

PINTO, V. M. Avaliação toxicológica da preparação fitoterápica contendo Piper methysticum Forst., Piperaceae (kava kava ®) sobre o desenvolvimento pré-natal em ratos. 2004. 71p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rio grande do Sul, 2004.

RISH, R. K. Phytoestrogen in health and illness. Indian journal of pharmacology, v. 34, p. 311-320, 2002.

ROCHA SILVA, M. O. Fundamentos da farmacologia e suas aplicações à terapêutica. 3. ed. rev., São Paulo: EDART; Brasília: INL, v.1, 1973.

ROLOFF, D. W.; HOWATT, W. F.; KANTO JR, W. P.; BORKER JR, R. C. Morphine administration to pregnant rabbits: effect on fetal growth and lung development. Journal of Addictive Diseases, v. 2, n. 1-2, p. 369-379, 1975.

ROSSELLI, M.; REINHART, K.; IMTHURN, B.; KELLER, P. J.; DUBEY, R. K. Cellular and biochemical mechanisms by which environmental oestrogens influence reproductive function. Human Reproduction Update, v. 6, p. 332- 350, 2000.

SANIN, Y. Y. L.; GÓMEZ, M. T. G.; MORALES, A. M. T. Effectos de los fitoestrógenos em la repróducion animal. Revista Facultad Nacional de Agronomía, Medellín, v. 63, n. 2, p. 5555-5565, 2010.

SIMÕES, C. M. O; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETRVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis, 6. ed., Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2007.

SOUZA, V.C.; LORENZI, H. Botânica sistemática: Guia ilustrado para identificação de Fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II. 2 ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 704p. 2008.

SUKIKARA, M .H.; PLATERO, M. D.; CANTERAS, N. S.; FELICIO, L. F. Opiate regulation of behavioral selection during lactation. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 87, p. 315–320, 2007.

TAYLOR, C.M.; CAMPOS, M.T.V.A.; ZAPPI, D. Flora da reserva Ducke, Amazonas, Brasil: Rubiaceae. Rodriguésia, v. 58, p. 549-616. 2007.

TEODOROV, E.; TOMITA, A. T.; BANON, G. P. R.; GIL, I. G.; BERNARDI, M. M., FELÍCIO, L. F. Behavorial effects of acute stimulation of ƙ-opioid receptors during lactation. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 90, p. 534- 539, 2008.

VEROTTA, L.; PILATI, T.; TATÒ, M.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. Pyrrolidinoindoline alkaloids from Psychotria colorata. Journal of Natural Products, v.61, p.392-396, 1998.

VEROTTA, L.; PETERLONGO, F.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. High-performance liquid chromatography-diode array detection- tandem mass espectrometry analyses of the alkaloid extracts of Amazon Psychotria species. Journal of Chromatography, v. 41, p. 165-176, 1999.

VEROTTA, L.; ORSINI, F.; SBACCHI, M.; SCHEILDLER, M. A. AMADOR, T. A.; ELISABETSKY, E. Synthesis and Antinociceptive Activity of Chimonanthines and Pyrrolidinoindoline-Type Alkaloids. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.10, p. 2133–2142, 2002.

WEIHUA, Z.; ANDERSSON, S.; CHENG, G.; SIMPSON, E.R.; WARNER M.; GUSTAFSSON, J.A. Update on estrogen signaling. FEBS Letters, v. 546, p. 17-24, 2003.

WIESENFELD-HALLIN, Z. Combined opioid-NMDA antagonist therapies - What advantages do they offer for the control of pain syndromes?. Drugs, v. 55, n. 1, p. 1-4, 1998.

YANG, H.; ZHANG, H.; YANG, C.; CHEN, Y. Chemical constituents of Plants from the Genus Psychotria. Chemistry & Biodiversity, v. 13, p. 807-820, 2016.

ZHEN-DONG, Y.; JIANG-HONG, L.; CHAO-YOU, S.; CHENG-HAI, W.; CHANG-LIN, L. Chronic morphine treatment inhibits oxytocin synthesis in rats. Neuropharmacology, v. 11, n. 14, p. 3113-3116, 2000.

OBJETIVOS

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo geral

 Avaliar a toxicidade dos extratos bruto, acetático e alcaloídico das folhas de Psychotria colorata em ratas Wistar e na prole.

1.2 Objetivos específicos

 Obter os extratos bruto, acetático e alcaloídico de P. colorata a partir de folhas da planta, coletada no município de Carmolândia-TO.  Avaliar a toxicidade da administração do extrato bruto das folhas de P. colorata durante a organogênese e desenvolvimento fetal sobre as mães por meio de bioquímica sérica, hemograma, avaliação reprodutiva e exames anatomo-histopatológicos e sobre a prole, por meio de avaliação de parâmetros reprodutivos fetais.  Avaliar a toxicidade subcrônica do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas por meio de exames bioquímicos séricos, hemograma, observação clínica e exames anatomo-histopatológicos.  Avaliar a toxicidade reprodutiva do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas.  Avaliar os efeitos da administração do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata em ratas gestantes e lactantes por meio de bioquímica sérica, hemograma, dosagem sérica de ocitocina, observação clínica e exames anatomo-histopatológicos.  Avaliar os efeitos do extrato alcaloídico sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e sensório-motor da prole de ratos.

CAPÍTULO II – Toxicidade do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata durante a organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar

Toxicidade do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata durante a organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar

Toxicity of crude extract of leaves of Psychotria colorata during organogenesis and fetal development in Wistar rats

RESUMO

Plantas do gênero Psychotria estão presentes em regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. Produtores de bovinos do Estado do Tocantins relataram que Psychotria colorata é abortiva. Em estudo prévio com a P. colorata foi observado que a planta causou toxicidade em parâmetros reprodutivos nas ratas tratadas com perdas pré e pós-implantação e prejuízo sobre parâmetros fetais como diminuição do tamanho da ninhada e diminuição do número de fetos vivos. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos da administração do extrato bruto (EB) das folhas de P. colorata durante o período de organogênese e desenvolvimento fetal em ratas Wistar. As folhas foram secas, extraídas em etanol e rotaevaporadas para obtenção do EB. Ratas foram separadas de forma inteiramente casualizada em grupo experimental (n=10) tratadas com EB diluído em 5% de Tween 80 e grupo controle (n=10) que recebeu apenas o veículo. Os tratamentos foram administrados por gavagem do 6º dia de gestação (DG6) ao DG20. Para simular as condições naturais de intoxicação, a dose de EB de 2085 mg.Kg-1, correspondeu ao que seria consumido se a planta fosse a única fonte de alimento. Durante o período experimental foi monitorado diariamente o peso corporal e consumo de água e ração de todos os animais. Foram determinados os níveis séricos de alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, albumina, ácido úrico, colesterol, creatinina, fosfatase alcalina, proteína total, triglicerídeos, ureia, glicose, bilirrubina total, bilirrubina indireta e bilirrubina direta. Além disso, foi realizada avaliação da toxicidade reprodutiva e estudo anatomo- histopatológico. Houve diminuição no consumo de ração no 16º dia de gestação nas fêmeas do grupo experimental. A análise da bioquímica sanguínea revelou diminuição de ácido úrico, colesterol e triglicerídeos. Demais parâmetros de toxicidade geral não foram alterados pela exposição ao EB. Na avaliação reprodutiva houve diminuição de peso corporal dos fetos, peso dos fetos machos e fêmeas, e comprimento dos fetos fêmeas em relação à prole do grupo controle. As alterações produzidas pela administração do EB podem ter ocorrido por ação dos alcaloides pirrolidinoindolínicos e quinolínicos, e pelos compostos fenólicos da planta. Conclui-se que o extrato bruto provoca toxicidade materna e na prole.

Palavras-chave: Planta tóxica, reprodução, alcaloide, ratos.

ABSTRACT

Plants of the genus Psychotria are present in tropical and subtropical regions of the world. Cattle farmers from the state of Tocantins reported that Psychotria colorata is abortive. In a previous study with P. colorata, it was observed that the plant caused toxicity in reproductive parameters in the rats treated with pre- and post-implantation losses and impairment on fetal parameters such as litter size decrease and number of live fetuses. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of crude extract (CE) administration of P. colorata leaves during the period of organogenesis and fetal development in Wistar rats. The leaves were dried, percolated in ethanol and rotated under to obtain CE. Rats were divided in a completely randomized experimental group (n = 10) treated with CE diluted in 5% Tween 80 and control group (n = 10) that received only the vehicle. The treatments were administered by gavage from the 6th day of gestation (DG6) until to DG20. To simulate natural conditions of intoxication, the dose of CE 2085 mg.Kg-1, corresponded to what would be consumed if the plant was only source of food. During the experimental period body weight and water and feed intake of all animals were daily monitored. Serum levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, albumin, uric acid, cholesterol, creatinine, alkaline phosphatase, total protein, triglycerides, urea, glucose, total bilirubin, indirect bilirubin and direct bilirubin were determined. In addition, an evaluation of the reproductive toxicity and anatomo-histopathological study was carried out. There was a decrease in feed intake on the 16th day of gestation in the females of the experimental group. The analysis of blood biochemistry revealed a decrease in uric acid, cholesterol and triglycerides. Other parameters of general toxicity were not altered by exposure to CE. In the reproductive evaluation there was a decrease in the body weight of fetuses, weight of male and female fetuses, and length of female fetuses in relation to the offspring of the control group. The alterations produced by CE administration may have occurred due to the action of pyrrolidinoindoline and quinolinic alkaloids and phenolic compounds of the plant. In conclusion, the crude extract causes maternal toxicity and offspring.

Keywords: Toxic plant, reproduction, alkaloid, rats.

1 INTRODUÇÃO

O gênero Psychotria é o maior da família Rubiaceae com 1500 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo (YANG et al., 2016). No Brasil destaca-se a Psychotria colorata, conhecida popularmente como perpétua do mato, a qual tem suas flores e folhas utilizadas na medicina popular por caboclos da Amazônia como analgésico (ELISABETSKY; CASTILHOS, 1990).

Em estudos com roedores, a atividade analgésica foi confirmada e atribuída aos alcaloides pirrolidinoindolínicos, hodgkisnina, quimonantina e psicotridina identificados na planta, pela ligação em receptores opioides, reversível por naloxona em testes nociceptivos térmicos (AMADOR et al., 2000; VEROTTA et al., 1998; VEROTTA et al., 2002) e ao antagonismo de receptores glutamatérgicos N-Metil-D-Aspartato (NMDA) em testes não térmicos (AMADOR et al., 2001). Adicionalmente, foram identificados os alcaloides quinolínicos calicantina e isocalicantina com ação inibitória sobre a liberação do ácido gama-aminobutírico (GABA) (CHEBIB et al., 2003). Além de alcaloides, análises fitoquímicas posteriores das folhas de P. colorata revelaram a presença de compostos fenólicos, taninos, flavonas, flavonoides, xantonas, chalconas, flavonois, leucoantocianinas, catequinas e flavononas (MOURA et al., 2013; MENDONÇA et al., 2015). Pouco se sabe sobre a toxicidade de P. colorata. Em um levantamento de plantas tóxicas no Estado do Tocantins, pecuaristas relataram abortamentos em bovinos associado à ingestão dessa planta (COSTA et al., 2011). Em estudo de toxicidade subcrônica e reprodutiva das folhas de P. colorata a 5% na ração de ratos Wistar, por 60 dias, acasalados com ratas não tratadas, foi observado aumento de perdas pré-implantação e número de filhotes fêmeas e diminuição do número de filhotes machos, comprimento e peso fetais nos parâmetros reprodutivos, além de diminuição dos níveis séricos de colesterol e degeneração vacuolar dos hepatócitos dos ratos tratados (MARUO et al., 2011). Ratas tratadas também com inclusão de 5% da planta na ração, durante 51 dias, apresentaram aumento de colesterol e na análise de parâmetros reprodutivos, foi observado aumento dos sítios de reabsorção, aumento de perdas pré e pós-implantação, diminuição do tamanho da ninhada, diminuição do número de fetos vivos e número de fetos fêmeas (MOURA, 2013). Tais alterações foram associadas aos alcaloides pirrolidinoindolínicos presentes em P. Colorata, pois os alcaloides hodgkinsina e psicotridina apresentaram atividade semelhante à morfina (AMADOR et al., 2000; VEROTTA et al., 2002) e substâncias opioides podem comprometer a função reprodutiva normal (JALOWIEC et al., 1981; KROMER, 1988; MEERVELD et al., 2004; ÖRDÖG; VÉRTES; VÉRTES, 1992; OSZTER et al., 2000).

Alcaloides quinolínicos foram descritos por apresentarem atividade semelhante ao estrógeno in vitro (NAZRULLAEV; BESSONOVA; AKHMEDKHODZHAEVA, 2001). Fitoestrógenos e substâncias semelhantes à opioides quando administrados durante a gestação podem resultar em retardo do crescimento intra-uterino e abortamento (EL-NAHLA et al., 2014; MEYER, 2014; NARKOWICZ et al., 2013). Moura, 2013 ao investigar as alterações tóxicas sobre a reprodução de ratos com o extrato bruto da planta, administrado durante o período de implantação (DG 1 – DG 6) na dose de 772,6 mg.kg-1, não verificou alterações reprodutivas (MOURA, 2013). Isso sugere que os diferentes efeitos observados podem envolver diretamente a potência dos compostos ativos, que podem variar de acordo com a formulação da ração e do extrato administrado. Além disso, a ausência de efeitos deletérios sobre a reprodução no período de implantação pode estar relacionada ao menor período de tratamento e a dose de EB administrada (EL AGRAA; EL BADWI; ADAM, 2002). A administração de substâncias tóxicas às mães, após a implantação, durante a organogênese (7º-15º DG) e desenvolvimento fetal (16º-21ºDG), pode promover morte embrionária e/ou fetal, malformações viscerais e/ou esqueléticas, sítios de ossificação incompleta e diminuição de peso corporal fetal (WISE, 2016). Assim, o período de organogênese é o mais susceptível à teratogênese, e essa resposta é estabelecida pelo período no qual ocorre a exposição e a toxicidade do agente (BRENT et al., 1990). Desse modo, esse estudo foi realizado de forma a verificar se o extrato bruto das folhas P. colorata afeta o desenvolvimento embrionário e fetal quando administrado a ratas Wistar durante o período de organogênese até o final da gestação.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção das folhas de P. colorata

52 folhas foram pesadas, secas em estufa de ventilação forçada a 55ºC, pesadas novamente e mantidas em freezer à -20ºC até sua utilização.

2.2 Obtenção do extrato bruto (EB)

As folhas após secagem foram trituradas em liquidificador comercial com etanol 99,5% e percoladas por uma semana. Ao término desse período o material foi filtrado e rotaevaporado (rotaevaporador Fisatom®) sob pressão reduzida com temperatura controlada a 45oC para obtenção do extrato bruto (EB). O EB foi pesado em balança analítica para determinação do rendimento.

2.3 Animais

Foram utilizadas 20 ratas da linhagem Wistar, com aproximadamente 70 dias de idade, pesando entre 230 e 290 g, obtidas do biotério do Programa de Pós – Graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos (n = 10 grupo experimental e n = 10 grupo controle), alojados individualmente em caixas de polipropileno com tampas metálicas, medindo 40x50x20 cm. As caixas foram colocadas em sala climatizada, com temperatura controlada (20° a 24°C) e com iluminação artificial em um ciclo claro/escuro de 12 horas, com as luzes acesas às 6h00min e desligadas às 18h00min. Os animais receberam ração específica para animais de laboratório (Presence - Purina®) e água ad libitum. Foram avaliados diariamente o consumo de ração, água e peso corporal. O protocolo experimental foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA, da Universidade Federal do Tocantins sob o processo nº 23101.000666/2014-39.

2.4 Administração do extrato bruto de P. colorata

O EB de P. colorata foi administrado via oral, por meio de gavagem, para as fêmeas a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. A dose administrada do

53 extrato foi estabelecida considerando o consumo de ração, como se a planta fosse o único alimento para simular as condições naturais de intoxicação, e o rendimento da planta. Assim, a dose de EB correspondeu à 2085 mg.Kg-1. O volume médio ingerido foi de 2 mL por animal da solução com EB (0,3g de EB/1mL de Tween 5%, ou 300mg/mL de EB em Tween 5%). O grupo controle recebeu apenas o veículo Tween 80 a 5%.

2.5 Acasalamento e diagnóstico de prenhez

As ratas foram colocadas para acasalar no final da fase clara do dia, duas fêmeas para um macho por caixa. Na manhã do dia seguinte os machos foram retirados. As fêmeas foram submetidas a lavados vaginais para observação, em microscópio, do material obtido. Esse procedimento durou até a confirmação da prenhez pela presença de espermatozóides no lavado vaginal. O início da prenhez foi determinado como o dia de gestação zero (DG- 0). As fêmeas prenhes foram acondicionadas em gaiolas individuais.

2.6 Estudo de toxicidade embrionária e fetal

No DG20 as fêmeas foram anestesiadas com 10 mg de xilazina/kg associado a 90mg de cetamina/kg por via intraperitoneal para coleta de sangue e posteriormente submetidas a eutanásia para necropsia (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010), onde, foram removidos ovários e úteros para a avaliação de número de corpos lúteos, sítios de implantação, reabsorções, peso da placenta, fetos vivos, sexo, pesos fetais, tamanho da ninhada e comprimento dos fetos. A partir dos resultados foram determinadas as taxas de perda pré- implantação =((no de corpos lúteos- no de implantações) / no de corpos lúteos x 100) e perda pós-implantação =((node implantações - no de fetos vivos) / no de implantações x 100) (PARKER, 2006).

2.7 Hemograma

No final do experimento, no DG 20, amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal e transferidas para tubos com anticoagulante ácido

54 etilenodiaminotetracético (EDTA) para a contagem de glóbulos vermelhos, concentração de hemoglobina (HB), concentração de eritrócitos (HCT), volume corpuscular médio (VCM), hematócrito, hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM). Além disso, foram realizados esfregaços sanguíneos para contagem diferencial de leucócitos (LORENZI, 2006).

2.8 Exames bioquímicos

No final do experimento, no DG 20, as amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal, transferidos para tubos secos e centrifugadas para obtenção do soro. As amostras de soro foram colocadas em tubos modelo eppendorf e armazenadas em freezer a -20ºC até a utilização. Foram determinados os níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina, ácido úrico, colesterol, creatinina, fosfatase alcalina, proteína total, triglicerídeos, ureia, glicose e bilirrubina. Para as análises bioquímicas, foram utilizados conjuntos diagnóstico (“kit”) comercial da Labtest® em aparelho Biochrom asys UVM340® microplate reader.

2.9 Necropsia e avaliação anatomo-histopatológica

Após a eutanásia, a necropsia foi realizada para a inspeção visual dos órgãos e detecção de possíveis alterações macroscópicas. Em todas as fêmeas foram coletados e pesados para determinação do peso relativo os órgãos: pulmão, timo, coração, baço, fígado, adrenais, rins, encéfalo, placenta, útero e ovários. O útero e ovários foram utilizados para posterior avaliação de parâmetros reprodutivos. Além dos órgãos mencionados acima, que passaram por pesagem, foram coletados estômago, linfonodos, intestino delgado, intestino grosso. A fórmula usada para calcular o peso relativo foi a seguinte: Peso relativo do órgão = (peso do órgão / peso corporal) x 100 Todos os órgãos foram seccionados e retirados fragmentos para fixação em formalina tamponada, com troca do formol após 24h da realização da

55 necropsia. As amostras uma vez fixadas foram clivadas para processamento histopatológico, em seguida desidratadas com séries crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Fragmentos teciduais foram seccionados em micrótomo, com espessura de 5,0 µm e submetidos à coloração por hematoxilina-eosina, para observação em microscópio óptico.

2.10 Análise estatística

As médias foram comparadas pelo teste t de Student. Foi usado Teste Mann-Whitney para dados não paramétricos. As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Instat versão 3.02 e os gráficos foram confeccionados utilizando o programa GraphPad Prisma v 5.00. O nível de significância crítico para todas as análises estatísticas realizadas foi de p<0,05.

3 RESULTADOS

3.1 Rendimento do extrato bruto

Durante o processo de secagem houve redução de 80% do peso do material verde. O rendimento de 1000 g de material vegetal fresco foi de 30g de EB (3%).

3.2 Consumo de ração, água, peso corporal e ganho de peso

Houve diminuição no consumo de ração (Figura 1) do grupo experimental em relação ao controle no 16º dia de gestação (grupo controle (GC) = 24,41±0,75; grupo experimental (GE) = 22,1±0,53; p = 0,0179). Não foram observadas diferenças entre as ratas tratadas com EB de P. colorata quando comparadas com o grupo controle em relação ao consumo de água (Figura 2), peso corporal (Figura 3) e ganho de peso (Figura 4).

40 Controle 35 P. colorata

20 *

Consumo de ração (g) ração de Consumo 10

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias experimentais de administração de EB de P. colorata Figura 1. Consumo de ração (em gramas) pelas ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. *p < 0,05, Teste t de Student.

80 75 Controle 70 P. colorata 65 60 55 50 45 40 35 30 25

20 Consumo de água (mL) água de Consumo 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias de administração do EB de P. colorata Figura 2. Consumo de água (em mL) pelas ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste de Student.

450 Controle P. colorata 400

350

300

250

200

150 Peso corporal corporal (g) Peso

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias experimentais de administração de EB de P. colorata

Figura 3. Peso, em gramas, de ratas do grupo tratado com P. colorata e do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

100

50 Ganho de Peso (g) Peso de Ganho

0 Controle Experimental

Figura 4. Ganho de peso (em gramas) de ratas entre o 6º e 20º dia de gestação, que receberam extrato bruto de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% a partir do 6º dia até 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

3.3 Parâmetros hematológicos e bioquímicos

Nos parâmetros hematológicos, não foi observada diferença entre o grupo que recebeu EB de P. colorata e o grupo controle em nenhum dos parâmetros analisados (Tabela 1). Na bioquímica sanguínea houve diminuição de ácido úrico (GC = 1,15±0,10; GE = 0,48±0,70; p = 0,0010), colesterol (GC = 47,68±1,50; GE = 43,53±1,21; p = 0,0421) e triglicerídeos (GC = 82,34±3,29; GE = 69,32±3,63; p = 0,0166) dos animais tratados em relação ao grupo que recebeu apenas o Tween 5% (Tabela 2).

Tabela 1. Hemograma de ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=10) P. colorata (n=10) Eritrócitos (x 106/µL)a 8,10 ± 0,18 8,17 ± 0,19 Leucócitos (x 103/µL)a 6,60 ± 0,16 6,50 ± 0,15 HGB (g/dL)a 10,92 ± 0,37 10,72 ± 0,38 HCT (%)b 35,80 ± 0,44 36,75 ± 0,49 VCM (µm3)a 44,33 ± 0,91 46,88 ± 0,98 HCM (pg)a 13,57 ± 0,56 13,96 ± 0,65 CHCM (%)b 30,57 ± 0,99 29,22 ± 1,10 Linfócitos (%)b 74,80 ± 0,65 76,42 ± 0,71 NS (%)b 20,40 ± 0,82 18,33 ± 0,75 NB (%)b 1,90 ± 0,23 1,75 ± 0,28 Eosinófilos (%)b 1,20 ± 0,20 1,29 ± 0,18 Monócitos (%)b 2,30 ± 0,30 2,75 ± 0,48 a teste t de Student, b teste de Mann-Whitney, p > 0,05.

Tabela 2. Bioquímica sérica de ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=10) P. colorata (n=10) Ácido úrico (mg/dL) 1,15 ± 0,10 0,48 ± 0,70* Albumina (g/dL) 3,63 ± 0,17 3,33 ± 0,11 ALT (U/L) 60,46 ± 1,75 61,76 ± 2,90 AST (U/L) 137,56 ± 1,76 133,39 ± 1,88 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,06 ± 0,01 0,05 ± 0,01 Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,05 ± 0,01 0,04 ± 0,01 Bilirrubina total (mg/dL) 0,10 ± 0,02 0,09 ± 0,01 Colesterol (mg/dL) 47,68 ± 1,50 43,53 ± 1,21* Creatinina (mg/dL) 1,06 ± 0,08 0,92 ± 0,09 Fosfatase alcalina 101,46 ± 3,16 97,75 ± 3,77 Glicose (mg/dL) 86,72 ± 4,05 77,36 ± 4,02 Proteína total (g/dL) 4,71 ± 0,35 4,23 ± 0,37 Triglicerídeos (mg/dL) 82,34 ± 3,29 69,32 ± 3,63* Ureia (mg/dL) 52,77 ± 0,67 51,46 ± 0,90 *p < 0,05, Teste t de Student

3.4 Peso relativo dos órgãos e avaliação anotomo-histopatológica

Não houve alterações no peso relativo dos órgãos dos animais que receberam o extrato bruto de P. colorata em relação aos animais do grupo controle (Tabela 3). Na avaliação histopatológica do grupo tratado com EB de P. colorata não foram constatadas alterações estruturais dos tecidos avaliados, em relação ao grupo controle.

Tabela 3. Peso relativo dos órgãos das ratas que receberam extrato bruto de P.colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. Órgão Controle (n=10) P. colorata (n=10) Adrenais (%) 0,018 ± 0,001 0,018 ± 0,001 Baço (%) 0,257 ± 0,007 0,271 ± 0,009 Coração (%) 0,264 ± 0,004 0,274 ± 0,005 Encéfalo (%) 0,564 ± 0,007 0,558 ± 0,007 Fígado (%) 4,004 ± 0,050 4,012 ± 0,062 Pulmão (%) 0,579 ± 0,011 0,582 ± 0,012 Rins (%) 0,304 ± 0,004 0,306 ± 0,006 Timo (%) 0,138 ± 0,004 0,135 ± 0,004 p > 0,05, Teste de Mann-Whitney.

3.5 Parâmetros reprodutivos

Na avaliação reprodutiva houve comprometimento do desenvolvimento da prole das ratas tratadas com EB de P. colorata com diminuição do peso corporal dos fetos (GC = 3,53 ± 0,05; GE = 3,35 ± 0,05; p = 0,0202), diminuição do peso do fetos machos (GC = 3,62 ± 0,06; GE = 3,40 ± 0,06; p = 0,0194) e fêmeas (GC = 3,48 ± 0,05; 3,30 ± 0,05; p = 0,0202), diminuição do comprimento dos fetos (GC = 5,38 ± 0,04; GE = 5,21 ± 0,07; p = 0,0493) e comprimento dos fetos fêmeas (GC = 5,35 ± 0,04; GE = 5,13 ± 0,08; p = 0,0265) em relação ao grupo controle (Tabela 4).

Tabela 4. Parâmetros reprodutivos das ratas que receberam extrato bruto de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia até o 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle P. colorata Número de fêmeas prenhes 10 10 Peso 20° dia de gestação (g)a 326,9±8,56 333,5±4,33 Peso de útero gravídico (g)a 59,58±4,79 58,84±3,12 Número de corpos lúteosa 12,90±0,60 13,90±0,64 Número de implantaçõesa 12,20±0,63 12,90±0,59 Peso da placenta (g) a 0,58±0,02 0,57±0,02 Perda pré-implantação (%)b 5,43±2,32 6,57±3,12 Perda pós-implantação (%)b 5,63±2,11 7,62±2,30 Número de fetos mortos 0 1 (0/10) (1/10) Número de fetos vivosa 11,50±0,62 11,90±0,57 Número de reabsorçõesa 0,70±0,26 0,90±0,31 (4/10) (6/10) Parâmetros fetais Tamanho da ninhadaa 11,50±0,62 11,90±0,57 Fetos machosa 5,50±0,69 5,00±0,54 Fetos fêmeasa 6,00±0,60 7,00±0,0,58 Peso corporal dos fetosa 3,53±0,05 3,35±0,05* Fetos machosa 3,62±0,06 3,40±0,06* Fetos fêmeasa 3,48±0,05 3,30±0,05* Comprimento dos fetosa 5,38±0,04 5,21±0,07* Fetos machosa 5,42±0,06 5,23±0,08 Fetos fêmeasa 5,35±0,04 5,13±0,08* a teste t de Student, b teste de Mann-Whitney, * p<0,05. (nº de ninhadas afetadas/nº total de ninhadas)

4 DISCUSSÃO

No presente estudo, a administração do EB de P. colorata promoveu diminuição do consumo de ração no 16º dia de gestação, que corresponde ao início do período de desenvolvimento fetal (PARKER, 2006). Apesar da diminuição ter ocorrido nesse dia, esse resultado não afetou de forma negativa as mães tratadas com a planta, uma vez que não foi verificada diminuição no peso diário e ganho de peso em relação ao grupo controle. A avaliação da bioquímica sérica revelou diminuição dos níveis séricos de ácido úrico nas ratas que receberam o EB de P. colorata. O ácido úrico é o produto final da degradação metabólica de ribonucleotídeos purínicos endógenos e de purinas provenientes da dieta, os quais são degradados em hipoxantina por ação da enzima xantina oxidase, sendo em seguida reduzida a ácido úrico (FANG; ALDERMAN, 2000). É possível que o EB de P. colorata tenha inibido a atividade dessa enzima nas ratas tratadas, uma vez que tanto alcaloides como compostos fenólicos podem inibir a atividade da xantina oxidase (NGUYEN et al., 2004; LI et al., 2014). Além disso, houve diminuição sérica de colesterol e triglicerídeos nas ratas tratadas com a planta. O colesterol é sintetizado a partir da acetil-CoA no citosol e retículo endoplasmático das células nucleadas do organismo. Seu principal local de síntese é no fígado, sendo controlada pela enzima β-hidroxi- β-Metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase) que catalisa a redução de HMG-CoA em mevalonato. A inibição desta enzima reduz a secreção de lipoproteínas como a alipoproteína B, aumentando a síntese do receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) diminuindo os seus níveis no sangue (HWANG et al., 2016). O triglicerídeo é a principal forma de estocagem de gordura corporal, sintetizado principalmente no tecido adiposo, fígado, intestino delgado e na glândula mamária. O nível sérico de triglicerídeos em animais normais reflete o equilíbrio entre a absorção no intestino delgado, síntese/secreção nos hepatócitos e absorção no tecido adiposo (KWITEROVICH JR., 2000). Morinda citrifolia, planta da família Rubiaceae, promoveu ação antilipidêmica observada pela redução dos níveis de triglicerídeos e colesterol total (MANDUKHAIL; AZIZ; GILANI, 2010). Em estudos com Morus indica

(Mulberry) e Basella alba (Basellaceae), plantas que possuem alcaloides e compostos fenólicos na sua composição, foi verificado efeito inibitório da atividade da enzima HMG-CoA redutase com consequente ação antilipidêmica (PALVAI; UROOJ, 2014; BASKARAN et al., 2015). Dessa forma, os efeitos observados no presente estudo parecem indicar uma possível ação dos compostos de P. colorata como agentes antilipidêmicos. Em estudos anteriores em nosso laboratório, a administração das folhas de P. colorata secas na ração a 5% para ratos durante 51 dias produziu toxicidade reprodutiva com redução do número de filhotes (MOURA, 2013). De forma semelhante, neste estudo foi verificada redução do peso e comprimento dos filhotes. Alterações no desenvolvimento fetal com diminuição de peso e comprimento fetais já foram verificadas em ratas tratadas com os fitoestrógenos genisteína e daidzeína (EL-NAHLA et al., 2014). Adicionalmente, em estudos anteriores, substâncias opioides, como metadona, inibiram a proliferação celular uterina em ratas resultando em retardo do crescimento fetal (MEYER, 2014; NARKOWICZ et al., 2013). A ativação de receptores opioides nas vilosidades e veias placentárias leva a contração de vasos sanguineos promovendo um menor aporte circulatório, reduzindo assim a oxigenação e nutrição resultando em consequente retardo no crescimento e desenvolvimento fetal (FOWDEN, 2008; NIKNAM et al., 2013). Dessa forma é possível que os alcaloides de ação semelhante aos opioides ou os fitoestrógenos presentes na P. colorata tenham provocado os efeitos tóxicos sobre os fetos. Assim, conclui-se que a administração do EB das folhas de P. colorata durante o período de organogênese e desenvolvimento fetal resultou em efeitos tóxicos sobre parâmetros hematológicos e bioquímicos das mães tratadas e sobre o desenvolvimento fetal das proles.

5 REFERÊNCIAS

AMADOR, T. A.; VEROTTA, L.; NUNES, D. S.; ELISABETSKY, E. Antinociceptive profile of Hodgkinsine, Planta Medica Letters,v. 66. p. 1–3, 2000.

AMADOR, T.A.; VEROTTA, L.; NUNES D.S.; ELISABETSKY, E. Involvement of NMDA receptors in the analgesic properties of psychotridine. Phytomedicine, v.8, p. 202-206, 2001.

BASKARAN, G.; SALVAMANI, S.; AHMAD, S. A.; SHAHARUDDIN, N. A.; PATTIRAM, P. D.; SHUKOR, M. Y. HMG-CoA reductase inhibitory activity and phytocomponent investigation of Basella alba leaf extract as a treatment for hypercholesterolemia. Drug Desing, Development and Therapy, v. 9, p. 509- 517, 2015.

BRENT, R. L.; BECKMAN, D. A.; JENSEN, M.; KOSZALKA, T. R. Experimental yolk sac dysfunction as a model for studying nutritional disturbances in the embryo during early organogenesis. Teratology, v. 41, n. 4, p. 405-413, 1990.

CHEBIB, M.; DUKE, R. K.; DUKE, C. C.; KONNOR, M.; MEWETT, K. N.; JOHNSTON, G. A. R. Convulsant actions of calycanthine. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 190, p. 58-64, 2003.

EL AGRAA, S. E.; EL BADWI, S. M.; ADAM, S. E. Preliminary observations on experimental Ruta graveolens toxicosis in Nubian goats. Tropical Animal Health and Production, v. 34, n. 4, p. 271–281, 2002.

EL-NAHLA, A. M.; ABDOON, A. S.; ISMAIL, A. A.; ABDELRAZEK, H. M. A.; TAG, H. M.; MOUSTAFA, G. G. Teratogenic effects of dietary genistein and daidzein are mediated by over regulation of Oct-4 and down regulation of Cdx2 expression in post implantation albino rat embryos. International Journal of Chemical, Environmental & Biological Sciences, v. 2, n. 2, p. 129-135, 2014.

FANG, J.; ALDERMAN, M. H. Serum uric acid and cardiovascular mortality the NHAES I epidemiologic follow-up study, 1971-1992. National Health and Nutrition Examination Survey. The Journal of the American Medical Association. v. 283, n. 18, p. 2404-2410, 2000.

FOWDEN, A. L.; FORHEAD, A. J.; COAN, P. M.; BURTON, G. J. The placenta and intrauterine programming. Journal of Neuroendocrinology, v. 20, p. 439- 450, 2008.

HWANG, S.; HARTMAN, I. Z.; CALHOUN, L. N.; GARLAND, K.; YOUNG, G. A.; MITSCHE, M. A.; MCDONALD, J.; XU, F.; ENGELKING, L.; DEBOSE- BOYD, R. A. Contribution of Accelerated Degradation to Feedback Regulation of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase and Cholesterol Metabolism in the Liver. The Journal of Biological Chemistry, v. 291, n. 26, p. 13479-13494, 2016.

JALOWIEC, J. E; PANKSEPP, J.; ZOLOVICK, A. J.; NAJAM, N.; HERMAN, B. H. Opioid modulation of ingestive behavior. Pharmacology, Biochemical and Behavior, v. 15, p.. 477-484, 1981.

KROMER, W. Endogenous and exogenous opioids in the control of gastrointestinal motility and secretion. Pharmacological Reviews, v 40, p. 121- 62. 1988.

KWITEROVICH JR, P. O. The metabolic pathways of high-density lipoprotein, low-density lipoprotein, and triglycerides: a current review. The American Journal of Cardiology, v. 86, n. 12, p. 5-10, 2000.

LORENZI, T. F. Manual de Hematologia – Propedêutica e Clínica, 4th edition. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. 2006.

LI, S; LIU, C.; GUO, L.; ZHANG, Y; WANG, J.; MA, B.; WANG, Y; WANG, Y; REN, J; YANG, X; QIN, Y; TANG, Y. Ultrafiltration liquid chromatography combined with high-speed countercurrent chromatography for screening and isolating potential α-glucosidase and xanthine oxidase inhibitors from Cortex Phellodendri. Journal of Separation Science, v. 37, p. 2504-2512, 2014.

MANDUKHAIL, S. R.; AZIZ, N.; GILANI, A-H. Studies on antidyslipidemic effects of Morinda citrifolia (Noni) fruit, leaves and root extracts. Lipids in Health and Disease, v. 9, n. 88, p. 1-6, 2010.

MARUO, V. M.; LIMA, V. L.; SOUSA, L. T.; MARIANO-SOUZA, D. P.; RAMOS, A. T.; SPINOSA, H. S. Subchronic and reproductive toxicity of Pychotria colorata in male rats. In: 47th Congress of the European Societes of Toxicology (EUROTOX), 2011, Paris. Toxicology Letters. Kidlington: Elsevier. v. 205s. p. S251. 2011.

MEERVELD, B.G.V.; GARDNER, C.J.; LITTLE, P.J.; HICKS, G.A.; DEHAVEN- HUDKINS, D.L. Preclinical studies of opioids and opioid antagonists on gastrointestinal function. Neurogastroenterol and Motility, v.16, p. 46–53, 2004.

MEYER, MARJORIE. The perils of opioid prescribing during pregnancy. Obstetrics & Gynecology Clinics of North America, v. 41, p. 297-306, 2014.

NARKOWICZ, S.; PŁOTKA, J.; POLKOWSKA, Z.; BIZIUK, M.; NAMIEŚNIK, J. Prenatal exposure to substance of abuse: A worldwide problem. Environment International, v. 54, p.141–163, 2013.

NAZRULLAEV, S.S.; BESSONOVA, I.A.; AKHMEDKHODZAEVA, K.H.S. Estrogenic activity as a function of chemical structure in Haplophyllum quinoline alkaloids. Chemistry of Natural Compounds, v. 37: 551–555, 2001.

NGUYEN, M. T. T.; TEZUKA, Y.; TRAN, Q. L.; WATANABE, H.; KADOTA, S. Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of Vietnamese Medicinal Plants. Biological and Pharmaceutical Bulletin. v. 27, n. 9, p. 1414-1421, 2004.

NIKNAM, N. A.; AZARNIA, M.; BAHADORAN, H.; KAZEMI, M.; TEKIEH, E.; RANJBARAN, M.; SAHRAEI, H. Evaluating the Effects of Oral Morphine on Embryonic Development of Cerebellum in Wistar Rats. Basic and Clinical Neuroscience, v. 4, n. 2, p. 130-135, 2013.

ÖRDÖG, T.; VÉRTES, Z.S.; VÉRTES, M. Inhibition of oestradiol-induced DNA synthesis by opioid peptides in the rat uterus. Life Sciences, v. 51, p.1187–1196,1992.

OSZTER, A.; VÉRTES, S.; TÖRÖCSIK, B.; KÖRNYEI, J. L.; KOVÁCS, K.A.; VÉRTES, M. Antiestrogenic effect of opioid peptides in rat uterus. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, v. 74, p. 25–32, 2000.

PALVAI, V. R.; UROOJ, A. Inhibition of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase (Ex Vivo) by Morus indica (Mulberry). Chinese Journal of Biology, p. 1-5, 2014.

PARKER, R. M. Testing for reproductive toxicity. In: HOOD, R. D. (Ed.) Developmental and reproductive toxicology: a practical approach. Boca Raton: Taylor & Francis, cap. 10, p. 425-488, 2006.

SILVA, A. H.; NETO, A. X. P.; GUIMARAES, S. B.; Eletroacupuntura reduz a necessidade de doses adicionais de anestésicos em estudos experimentais. Acta Cirúrgica Brasileira, v.25, n.4, p. 381-384, 2010.

VEROTTA, L.; PILATI, T.; TATÒ, M.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. Pyrrolidinoindoline alkaloids from Psychotria colorata. Journal of Natural Products, v.61, p.392-396, 1998.

WISE, L. D. Numeric Estimates of Teratogenic Severity from Embryo-Fetal Developmental Toxicity Studies. Birth Defects Research (Part B), v. 107, p. 60-70, 2016.

YANG, H.; ZHANG, H.; YANG, C.; CHEN, Y. Chemical constituents of Plants from the Genus Psychotria. Chemistry & Biodiversity, v. 13, p. 807-820, 2016.

CAPÍTULO III – Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas Wistar

Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato acetático das folhas de P. colorata em ratas Wistar

Subchronic and reproductive toxicity of ethyl acetate of leaves of Psychotria colorata in Wistar rats

RESUMO

Psychotria colorata (Rubiaceae) é utilizada popularmente como analgésico, entretanto criadores de bovinos do Estado do Tocantins relatam que a planta é abortiva. Estudo prévio com a administração da planta na ração promoveu alterações reprodutivas, tais como, aumento de perdas pré e pós- implantação, diminuição do tamanho da ninhada e do número de fetos vivos. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a presença de flavonoides, quantificar os flavonoides totais do extrato acetático e avaliar a toxicidade subcrônica e reprodutiva da administração do extrato de acetático em ratas Wistar. As folhas foram coletadas no Tocantins, secas em estufa a 55ºC, extraídas em etanol e rotaevaporadas sob pressão reduzida para obtenção do extrato bruto, em seguida, procedeu-se ao particionamento com hexano e acetato de etila para obtenção do extrato acetático (EAC). Para a avaliação da toxicidade subcrônica e reprodutiva, fêmeas foram divididas de forma inteiramente casualizada em dois grupos (n=16), um experimental que recebeu EAC em solução de polissorbato 80 (Tween) a 5%, e um grupo controle que recebeu apenas o veículo. A dose administrada foi 721 mg.Kg-1 com consumo médio de 8,55 mg.Kg-1 de flavonoides por animal, simulando as condições naturais de intoxicação. As ratas foram tratadas por 30 dias antes do acasalamento, durante o período de coabitação e no período gestacional (GD20). Na análise fitoquímica foi detectado flavonoides no EAC e a quantificação de flavonoides totais foi de 4,53%. Durante o período experimental foram monitorados diariamente os consumos de água e ração e peso corporal de todos os animais. As fêmeas apresentaram aumento no consumo de ração antes e durante a gestação. Na análise hematológica foram observados linfopenia, e monocitose em ratas tratadas. Ainda, as fêmeas tratadas com EAC que coabitaram com machos não tratados apresentaram aumento no peso da placenta. Conclui-se que a presença de flavonoides no extrato acetático promoveu toxicidade em ratas e efeito deletério sobre a placenta de ratas.

Palavras-chave: intoxicação, reprodução, flavonoides, ratos.

ABSTRACT

Psychotria colorata (Rubiaceae) is used in popular medicine as analgesic, however cattle ranchers from the state of Tocantins reported that the plant is abortifacient. Previous study with the administration of the plant in the

72 diet promoted reproductive changes, such us, pre and post-implantation losses and impairment on fetal parameters such as litter size decrease and number of live fetuses. Thus, the objective of this work was to detect the presence of flavonoids, to quantify of the total flavonoids of the acetic extract and to evaluate the subchronic and reproductive toxicity of the administration of the ethyl acetate extract in Wistar rats. The leaves were collected in the Tocantins, dried in an oven at 55ºC, extracted in ethanol and rotated under reduced pressure to obtain the crude extract, then the extract obtained was partitioned with hexane and ethyl acetate to obtain the extract of Ethyl acetate (EAC). In order to evaluate subchronic and reproductive toxicity, females were divided in a completely randomized group into groups (n = 16), experimental group that received EAC in a solution of polysorbate 80 (Tween) at 5%, and the control group that received only the vehicle. The dose administered was 721 mg.Kg-1 with an average consumption of 8.55 mg.kg-1 of flavonoids per animal, simulating the natural conditions of intoxication. The rats were treated for 30 days prior to mating, during the cohabitation period and during the gestational period (GD20). Phytochemical analysis detected presence of flavonoids in the EAC and the quantification of total flavonoids was 4.53%. During the experimental period were monitored daily food and water consumption and body weight from all animals. The females showed an increase in feed intake before and during pregnancy. In hematological analysis were observed lymphopenia and monocytosis in treated rats. In addition, EAC treated females cohabiting with untreated males showed an increase in placental weight. It is concluded that the presence of flavonoids in the acetal extract may have caused toxicity in rats and deleterious effects on the placenta of rats.

Keywords: intoxication, reproduction, flavonoids, rats.

1 INTRODUÇÃO

Psychotria colorata é uma planta da família Rubiaceae, conhecida popularmente como perpétua do mato ou repollho (ELISABETSKY; CASTILHOS, 1990). Ocorre na forma de arbusto e está presente nas Guianas, Venezuela e no Brasil nas regiões Norte, Nordeste e Centro Oeste (TAYLOR, CAMPOS; ZAPPI, 2007). A planta é utilizada por caboclos da Amazônia no tratamento de diversos tipos de dores (ELISABETSKY; CASTILHOS, 1990). Entretanto, produtores relataram abortamento em bovinos associados ao consumo de P. colorata (COSTA et al., 2011). A composição química das folhas de P. colorata inclui alcaloides, pirrolidinoindolínicos incluindo a hodgkinsina e alcaloides quinolínicos, estando

73 a hodgkinsina envolvida com o efeito analgésico da planta (VEROTTA et al., 1998; VEROTTA et al., 1999; MOURA, 2013; MENDONÇA et al., 2015). Posteriormente, visando caracterizar outros compostos químicos presentes em extratos particionados das folhas de P. colorata, Moura (2013) observou a presença de compostos fenólicos no extrato de acetato de etila, tendo esse o maior rendimento. Além disso, taninos, flavonas, flavonoides, xantonas, chalconas, flavonóis, leucoantocianinas, catequinas e flavononas foram identificados nas folhas da planta (MENDONÇA et al., 2015). Em estudos de toxicidade subcrônica e reprodutiva em ratos com a inclusão das folhas de P. colorata na ração a 5% observou-se que fêmeas tratadas apresentaram aumento dos sítios de reabsorção, aumento de perdas pré e pós-implantação, diminuição do tamanho da ninhada, diminuição do número de fetos vivos e número de fetos fêmeas sendo os resultados atribuídos aos alcaloides pirrolidinoindolínicos presentes na planta (MOURA, 2013). No entanto, devido à presença de compostos fenólicos nas folhas da planta, é possível que esses também tenham sido responsáveis pelos efeitos deletérios sobre a reprodução das fêmeas no estudo supracitado (WHITTEN; PATISAUL; YOUNG, 2002; SANIN; GÓMEZ; MORALEZ, 2010). Os flavonoides são compostos fenólicos estudados por possuírem, dentre suas atividades, a capacidade de agir como fitoestrógeno, estimulando ou inibindo os receptores de estrógeno REα e REβ (SANIN; GÓMEZ; MORALES, 2010). Os REα são encontrados em diversos tecidos incluindo útero, glândula mamária e placenta, e os REβ podem ser encontrados na próstata, ovários e testículos (JACOB et al., 2001). Os fitoestrógenos podem promover desenvolvimento incompleto da glândula mamária, edema vulvar, descarga de muco cervical, espessamento do útero, abortamento e infertilidade, e em animais com pré-disposição genética e/ou influencia do meio ambiente podem desenvolver cistos ovarianos, ninfomania e anestro prolongado (ADAMS, 1990; DABHADKAR; ZADE, 2012), além disso, podem atravessar a placenta, alcançar o feto e causar malformações (PINTO, 2004; SANIN; GÓMEZ; MORALES, 2010). Em busca de compreender os efeitos tóxicos decorrentes da ingestão do extrato de acetato de etila das folhas de P. colorata, este estudo teve por

74 objetivo caracterizar, quantificar os flavonoides totais e avaliar a toxicidade subcrônica e reprodutiva em ratas Wistar.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção das folhas de P. colorata

As folhas de P. colorata foram coletadas no período de dezembro de 2014 a abril de 2015 no município de Carmolândia – Tocantins. Exsicatas da planta estão sob registro HTO 9763 no Herbário de Porto Nacional – UFT. As folhas foram pesadas, secas em estufa de ventilação forçada a 55ºC por um período de 72 horas ou até a obtenção de peso constante.

2.2 Obtenção dos extratos bruto e acetático das folhas de P. colorata

As folhas secas foram trituradas em liquidificador comercial (100g/400mL etanol 99,5%) e submetidas à percolação por 7 dias, em seguida, o material foi filtrado e rotaevaporado (rotaevaporador Fisatom® mod. 801) sob pressão reduzida com temperatura controlada à 45°C para obtenção do extrato bruto (EB). O EB foi ressuspendido em solução hidroalcoólica e particionado com hexano por três vezes. A fração hexânica foi desprezada e a fase hidroalcoólica particionada por mais três vezes com acetato de etila. A fração acetática obtida foi seca em rotaevaporador, dando origem ao extrato acetático (EAC).

2.3 Análise fitoquímica

2.3.1 Teste de Flavonoides

Para o teste de flavonoides folhas secas foram trituradas em liquidificador comercial (100g/400mL metanol) e submetidas à percolação por 7 dias, em seguida, o material foi filtrado e rotaevaporado (rotaevaporador Fisatom® mod. 801) sob pressão reduzida com temperatura controlada à 45°C

75 para obtenção do extrato bruto metanólico (EBM). Em tubo de ensaio com 1,5mL de metanol, 0,5mL de água destilada e 0,1g do EBM das folhas de P. colorata, foram adicionados 0,5 centímetro de magnésio em fita e 4 gotas de ácido clorídrico concentrado. O mesmo procedimento foi realizado com extrato acetático diluído em acetato de etila (MATOS, 1997).

2.3.2 Quantificação de flavonoides totais

A análise seguiu o ensaio colorimétrico descrito por Soares et al. (2014), adaptado. As reações foram realizadas em triplicata pela mistura de 0,5 g de extrato acetático, diluído em acetato de etila (1mg/mL) e padrão rutina (0,1mg/mL) com uma solução aquosa de 0,5 mL de ácido acético 60%, 2 mL de solução metanólica de piridina 20%, 1mL de cloreto de alumínio 5% e 6,0 mL de água deionizada. O branco foi constituído por todos os componentes da reação e água. As amostras foram homogeneizadas e mantidas por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. A absorbância da mistura foi medida a 420 nm em espectofotômetro. A curva de calibração foi preparada com uma solução padrão de rutina (alíquotas de 100, 300, 500, 700 e 900 μL) e todos os demais reagentes citados anteriormente, aferindo-se o volume final para 10 mL com água destilada. A partir da equação da reta obtida na curva do gráfico do padrão realizou-se o cálculo do teor de flavonoides totais, sendo os resultados expressos em miligramas equivalente de rutina por grama de extrato (mg ER/g).

2.4 Animais

O estudo foi realizado com 32 ratas Wistar, com 60 a 67 dias de idade, pesando entre 200 e 260g, obtidas do biotério do Programa de Pós – Graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Os animais foram divididos de forma inteiramente casualizada em grupos experimental e controle, mantidos individualmente em gaiolas de polietileno com tampas metálicas, medindo 40X50X20 cm, em ambiente climatizado com temperatura controlada (22±2°C) e com iluminação em ciclo

76 claro/escuro de 12 horas, com as luzes acesas às 6:00 horas e desligadas as 18:00 horas. Os animais receberam ração específica para animais de laboratório (Presence - Purina®) e água ad libitum. O protocolo experimental foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA, da Universidade Federal do Tocantins sob o processo nº 23101.000666/2014-39. O EAC foi dissolvido em solução aquosa de Twenn 80 a 5% (v/v) e administrado oralmente por meio de gavagem. O grupo controle recebeu apenas o veículo. Foram avaliados diariamente o consumo de ração, água e peso animal.

2.5 Administração do extrato acetático das folhas de P. colorata

As ratas foram distribuídas de forma inteiramente casualizada em grupos tratados com extrato acetático e controle, com 16 animais em cada grupo. A dose do extrato foi estabelecida considerando o consumo de ração, como se a planta fosse o único alimento, simulando assim as condições naturais de intoxicação, e o rendimento da planta, isto correspondeu a 721 mg.Kg-1 com consumo médio de 8,55 mg.Kg-1 de flavonoides por animal, sendo o volume médio ingerido de 2mL por animal da solução com EAC. O extrato acetático foi administrado por gavagem. As fêmeas foram tratadas por 30 dias antes da coabitação, durante a coabitação (período de até 15 dias) e no período gestacional (DG0-DG20).

2.6 Monitoração do ciclo estral

O ciclo estral foi monitorado fazendo-se observações microscópicas diárias do lavado vaginal. Os lavados foram realizados pela manhã, sendo obtidos pela introdução e aspiração de 0,5 ml de solução de cloreto de sódio a 0,9% na vagina, com o auxílio de uma pipeta automática com ponteiras plásticas descartáveis. O material obtido foi colocado em lâminas de vidro para observação sob o microscópio óptico e a fase do ciclo estral foi determinada pela citologia vaginal (PARKER, 2006).

As fases do ciclo foram determinadas citologicamente pelas seguintes características: predominância de células epiteliais nucleadas no proestro, maioria de células epiteliais cornificadas no estro, presença de células epiteliais nucleadas, cornificadas e leucócitos no metaestro e diestro com predominância de leucócitos. Após 30 dias de tratamento com extrato acetático e monitoramento diário do ciclo estral as ratas foram colocadas para acasalar no proestro, duas fêmeas para um macho por caixa, até a confirmação da prenhez que foi considerada pela presença de espermatozóides no lavado vaginal. O início da prenhez foi determinado como o dia de gestação zero (DG-0).

2.7 Avaliação da fertilidade

No período de coabitação, ao final da tarde os machos foram colocados para acasalar (um macho e duas fêmeas experimentais por caixa). Na manhã do dia seguinte, machos e fêmeas foram separados e foi realizado o lavado vaginal. O procedimento se repetiu até a confirmação da prenhez (DG0) com a presença de espermatozoides no lavado vaginal. No DG20 as fêmeas foram anestesiadas com 10 mg de xilazina/kg associado a 90 mg de cetamina/kg por via intraperitoneal para coleta de sangue e posteriormente eutanasiadas para necropsia (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010). Foram retirados os ovários e úteros para a avaliação de número de corpos lúteos, sítios de implantação, reabsorções, fetos vivos, fetos mortos, pesos fetais, comprimento dos fetos e peso de placenta. A partir dos resultados foram determinados os índices de fertilidade da fêmea (nº de fêmeas prenhes / nº de fêmeas que coabitaram) x 100, índice de gestação (nº de fêmeas com fetos vivos/nº de fêmeas com evidência de prenhez) x 100, taxa de implantação (nº de implantações/nº de corpos lúteos) x 100, perda pré- implantação ((no de corpos lúteos- no de implantações) / no de corpos lúteos) x 100, e perda pós-implantação ((no de implantações - no de fetos vivos)/no de implantações) x 100 (PARKER, 2006).

2.8 Hemograma

No final do experimento, no DG 20, amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal e transferidas para tubos com anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para a contagem de glóbulos vermelhos, concentração de hemoglobina (HB), concentração de eritrócitos (HCT), volume corpuscular médio (VCM), hematócrito, hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM). Além disso, foram realizados esfregaços sanguíneos para contagem diferencial de leucócitos (LORENZI, 2006).

2.9 Exames bioquímicos

No final do experimento, no DG 20, as amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal e centrifugadas para obtenção do soro. As amostras de soro foram colocadas em tubos tipo eppendorf e armazenadas em freezer a -20ºC até a utilização. Foram determinados os níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina, ácido úrico, colesterol, creatinina, fosfatase alcalina, proteína total, triglicerídeos, ureia, glicose e bilirrubina. Para as análises bioquímicas, foram utilizados conjuntos diagnóstico (“kit”) comercial da Labtest® pelo aparelho Biochrom asys UVM340® microplate reader.

2.10 Necropsia e avaliação anatomo-histopatológica

Após a eutanásia, foi realizada a necropsia para a inspeção visual dos órgãos e detecção de possíveis alterações. Em todos os animais foram coletados e pesados: pulmão, timo, coração, baço, fígado, adrenais, rins e encéfalo para determinação do peso relativo. Útero e ovários também foram pesados para posterior avaliação de parâmetros reprodutivos. Além dos órgãos mencionados acima, que passaram por pesagem, foram coletados estômago, linfonodos, intestino delgado e intestino grosso. A fórmula usada para calcular o peso relativo foi a seguinte:

Peso relativo do órgão = (peso do órgão / peso corporal) x 100 Todos os órgãos foram seccionados e retirados fragmentos para fixação em formalina tamponada, com troca do formol após 24h da realização da necropsia. As amostras uma vez fixadas foram clivadas para processamento histopatológico, em seguida desidratadas com séries crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Fragmentos teciduais foram seccionados em micrótomo, com espessura de 5,0μm e submetidos a subsequente coloração por hematoxilina-eosina, para posterior observação em microscópio óptico Leica DM500® (Leica Microsystems, Heerbrugg, Suíça).

2.11 Avaliação histomorfométrica da placenta

Foram capturadas imagens dos tecidos placentários de lâminas de 5 ratas de cada grupo com o uso do programa computacional LAS EZ® acoplado ao microscópio óptico Leica DM500® (Leica Microsystems, Heerbrugg, Suíça) em objetiva de 40x. A histomorfometria foi realizada em 10 campos, por tipo celular, na zona basal (células trofoblásticas gigantes e espongiotrofoblásticas) e na zona do labirinto (trofoblastos). Para evitar vícios de contagem sobre os campos em um mesmo corte, a leitura foi feita sempre num mesmo sentido, ou seja, da direita para esquerda. As medidas no disco placentário foram restritas à zona basal, caracterizada pela presença de células gigantes periféricas que fazem contato com pequenas células deciduais, e nas regiões mais profundas as células gigantes fazem contato com ninhos de células do espongiotrofoblasto. A zona do labirinto foi caracterizada pela presença de numerosas lacunas contendo vasos maternos e fetais com células trofoblásticas e mesenquimais revestindo os espaços preenchidos por sangue materno extravasado e sangue fetal nos capilares fetais.

2.12 Análise estatística

As médias dos grupos foram comparadas pelo teste de t de Student. Foi usado Teste Mann-Whitney para dados não paramétricos. As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPadInstat versão 3.02 e os

80 gráficos foram confeccionados utilizando o programa GraphPad Prisma v 5.00. O nível de significância crítico para todas as análises estatísticas realizadas foi de p < 0,05.

3 RESULTADOS

3.1 Rendimento do extrato acetático, caracterização da presença flavonoides e quantificação de flavonoides totais

A partir de 1 g de extrato bruto, o extrato acetático apresentou rendimento de 0,3 g (3%). A análise fitoquímica qualitativa revelou a presença de flavonoides no extrato metanólico e acetático de P. colorata (Figura 1). Na análise em espectrofotômetro, o teor de flavonoides totais expresso como miligramas equivalente de rutina por grama de extrato foi de 45,29 ± 2,41mg ER/g (y=0,0018x+0,3734, R2= 0,9134) (Figura 2).

A B

2,500

y = 0,0018x + 0,3734 2,000 R² = 0,9134

1,500

1,000

0,500 Absorbância nm em Absorbância

0,000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Concentração de rutina em µg/mL

Figura 2. Teor de flavonoides totais expresso como miligramas equivalente de rutina por grama de extrato.

3.2 Consumo de ração e água, peso corporal e ganho de peso

Houve aumento significativo no consumo de ração nos dias, 16 (grupo controle (GC) = 19,50 ± 0,38; grupo experimental (GE) = 20,93 ± 0,42; p = 0,0167), 17 (GC = 18,59 ± 0,42; GE = 20,61 ± 0,49; p = 0,0038), 22 (GC = 18,94 ± 0,55; GE = 20,49 ± 0,42; p = 0,0336), 25 (GC = 18,23 ± 0,34; GE = 19,53 ± 0,51; p = 0,0480) e 30 (GC = 18,20 ± 0,48; GE = 20,81 ± 0,57; p = 0,0017) (Figura 3). Não foram observadas alterações no consumo de água (Figura 4), peso corporal (Figura 5) e ganho de peso (Figura 6) dos animais tratados com EAC quando comparados com o grupo controle, durante os 30 dias de tratamento antes da coabitação. Durante a gestação foi observado aumento significativo no consumo de ração no 17º dia (GC = 22,39 ± 1,01; GE = 25,57 ± 0,94; p = 0,0315) nas ratas tratadas com EAC (Figura 7). O consumo de água, peso corporal e ganho de peso não foram afetados durante a gestação (Figuras 8, 9 e 10).

40 Controle 35 P. colorata

25 * * * 20 * *

Consumo de ração (g) ração de Consumo 10

0 0 5 10 15 20 25 30 Dias experimentais

Figura 3. Consumo de ração (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. *p < 0,05, Teste t de Student.

70 Controle 65 P. colorata 60 55 50 45 40 35 30 25 20

Consumo de água (mL) água de Consumo 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias experimentais

Figura 4. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

400 Controle 350 P. colorata

300

250

200

150 Peso corporal corporal (g) Peso

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias experimentais

Figura 5. Peso corporal (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

20 Ganho de Peso (g) Peso de Ganho

0 Controle Experimental

Figura 6. Ganho de peso (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante 30 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

40 Controle

35 P. colorata

30 * 25

Consumo de ração (g) ração de Consumo 10

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 7. Consumo de ração (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. *p < 0,05, Teste t de Student.

90 Controle 80 P. colorata

Consumo de água (mL) água de Consumo 20

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 8. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

450 Controle

400 P. colorata

350

300

250

200

150 Peso corporal corporal (g) Peso

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 9. Peso corporal (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

180 160 140 120 100 80 60 40

Ganho de Peso (g) Peso de Ganho 20 0 Controle Experimental

Figura 10. Ganho de peso (em grama) de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante a gestação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

3.3 Parâmetros hematológicos e bioquímicos

Nos parâmetros hematológicos observou-se diminuição de linfócitos (GC = 71,41 ± 0,66; GE = 68,41 ± 0,92; p = 0,0126) e aumento de monócitos (GC = 1,00 ± 0,28; GE = 2,94 ± 0,42; p = 0,0006) no grupo tratado com EAC em relação ao grupo controle Tween 5% (Tabela 1). À análise bioquímica, não evidenciou diferenças significativas em nenhum dos parâmetros avaliados, entre o grupo tratado e o controle (Tabela 2).

Tabela 1. Hemograma das ratas tratadas com extrato acetático de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5%, por no mínimo 51 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=16) P. colorata (n=16) Eritrócitos (x 106/µL)a 7,40 ± 0,27 7,20 ± 0,23 Leucócitos (x 103/µL)a 5,20 ± 0,35 4,90 ± 0,26 HGB (g/dL)a 9,04 ± 0,30 8,56 ± 0,43 HCT (%)b 35,82 ± 0,96 35,31 ± 1,08 VCM (µm3)a 48,68 ± 0,95 49,09 ± 0,86 HCM (pg)a 12,40 ± 0,45 11,84 ± 0,45 CHCM (%)b 25,52 ± 0,41 25,02 ± 0,72 Linfócitos (%)b 71,41 ± 0,66 68,41 ± 0,92* Neutrófilos (%)b 25,53 ± 0,77 25,65 ± 0,82 Eosinófilos (%)b 2,05 ± 0,42 3,12 ± 0,48 Monócitos (%)b 1,00 ± 0,28 2,94 ± 0,42* a teste t de Student, b teste de Mann-Whitney, p<0,05.

Tabela 2. Bioquímica sérica de ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5%, por no mínimo 51 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=16) P. colorata (n=16) Ácido úrico (mg/dL) 1,50 ± 0,10 1,59 ± 0,11 Albumina (g/dL) 3,29 ± 0,03 3,35 ± 0,03 ALT (U/L) 51,29 ± 1,28 52,08 ± 1,15 AST (U/L) 90,34 ± 1,63 95,49 ± 2,66 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,05 ± 0,00 0,05 ± 0,00 Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,03 ± 0,00 0,02 ± 0,00 Bilirrubina total (mg/dL) 0,07 ± 0,00 0,07 ± 0,00 Colesterol (mg/dL) 46,28 ± 2,00 50,48 ± 2,36 Creatinina (mg /dL) 0,88 ± 0,02 0,87 ± 0,04 Fosfatase alcalina (U/L) 97,46 ± 2,62 96,44 ± 2,89 Glicose (mg / dL) 63,65 ± 3,51 62,52 ± 3,74 Proteína total (g/dL) 4,14 ± 0,09 4,11 ± 0,12 Triglicerídeos (mg/dL) 83,53 ± 3,47 84,97 ± 3,58 Ureia (mg/dL) 43,10 ± 0,63 46,02 ± 0,51 p > 0,05, Teste de Student

3.4 Peso relativo e avaliação anatomo-histopatológica

Não houve diferença significativa no peso relativo dos órgãos dos animais que receberam o EAC em relação aos animais do grupo controle (Tabela 3). Na avaliação anatomo-histopatológica não foram observadas alterações estruturais dos tecidos avaliados do grupo experimental que recebeu extrato acetático de P. colorata em relação ao grupo controle.

Tabela 3. Peso relativo dos órgãos das ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5%, por no mínimo 51 dias. São apresentadas as médias e erros padrão. Órgão Controle (n=16) P. colorata (n=16) Adrenais (%) 0,013 ± 0,000 0,013 ± 0,000 Baço (%) 0,278 ± 0,010 0,276 ± 0,011 Coração (%) 0,276 ± 0,006 0,270 ± 0,020 Encéfalo (%) 0,560 ± 0,011 0,555 ± 0,020 Fígado (%) 3,972 ± 0,073 3,994 ± 0,075 Pulmão (%) 0,769 ± 0,018 0,781 ± 0,018 Rins (%) 0,309 ± 0,008 0,315 ± 0,008 Timo (%) 0,151 ± 0,005 0,148 ± 0,011 p > 0,05, Teste t de Student

3.5 Avaliação reprodutiva e análise histomorfométrica da placenta

Na avaliação reprodutiva, as fases do ciclo estral não foram afetadas pela ingestão de EAC (Tabela 4, Quadro 1 e Quadro 2), entretanto, foi observado aumento significativo do peso da placenta (GC = 0,62±0,02; GE = 0,68±0,01; p = 0,0219) das ratas tratadas com EAC (Tabela 5) e aumento de células trofoblásticas gigantes (GC = 42,70±1,97; GE = 59,54±2,07 ; p = 0,0011) e espongiotrofoblásticas (GC = 69,56±2,49; GE = 103,76±4,67 ; p = 0,0451) na zona basal e trofoblastos (GC = 62,83±2,85; GE = 89,71±4,21; p = 0,0472) na zona do labirinto (Tabela 6, Figuras 11 e 12), quando comparados ao grupo controle Tween 5%.

Tabela 4. Número de dias em cada fase do ciclo estral das ratas que receberam extrato acetático de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante 30 dias. São apresentas as médias e erros padrão. Fases do ciclo estral Controle (n=16) P. colorata (n=16) Pró-estro 6,56 ± 0,16 6,81 ± 0,14 Estro 5,31 ± 0,18 5,25 ± 0,17 Metaestro 6,94 ± 0,23 6,88 ± 0,24 Diestro 11,19 ± 0,31 11,06 ± 0,27 Intervalo entre ciclos 4,49 ± 0,07 4,50 ± 0,08 p > 0,05, Teste t de Student

Quadro 1. Monitoramento das fases do ciclo estral de ratas controle (Tween 80 a 5%) durante 30 dias. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 C1 M D P E M D P E M D D P E M D P E M D D P M D D P E M D D P C2 D D P E M D D P E M M D P E M D P E M D D P M D D P E M D E C3 M D D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D D P M D D P D C4 M D P E M D P E M D D P M D P E M D P E M D P M D P E M D P C5 D D P M D P E M D D P E M D D P E M D D P E E D D P E M D P C6 E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M M D P C7 P E M D P E M M D P M D D P M D D P E M D P E M D P M D D E C8 D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D C9 P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D C10 D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P M D C11 M P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D D P M D D C12 M D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P M D D P E M M C13 P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P E M D D P M D P E M C14 M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E C15 D D P E M D P E M D D P E M D P E M D D P M D D P E M M D P C16 M D D P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P M D D P E M M

Quadro 2. Monitoramento das fases do ciclo estral de ratas tratadas com P. colorata durante 30 dias. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 E1 M D D P E M D P M D P E M D D P E M D P M D D P E M D D P E E2 D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D D E3 P E M D P E M D P E M D D P M D P E M D D P E M D P M M D P E4 D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E E D P E5 P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E6 P E M D P E M D D P E M D P E M D D P M D D P E D M D P M D E7 M D D P E M D P E M D P E M D P E M D D P E D D P M D D P M E8 P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D E9 M D P E M D P M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P E E10 E M D P E M D D P E M M D P E M D D P E M D P E M D D P M M E11 E D D P M D P E M D D P E M D P E M D D P E M D P M D P E M E12 P E M D D P E M D P M D D P M D D P M D D P E M D D P E M D E13 D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D P E M D D P P M M D E14 D P E M D P E M D D P M D D P E M D P M D D P M D D P E M D E15 P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E16 M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P M M D

Tabela 5. Avaliação de parâmetros reprodutivos de ratas Wistar tratadas com extrato acetático de P. Colorata e grupo controle que receberam Tween 5% por no mínimo 51 dias. As médias e erros padrão são apresentados. Parâmetros Controle P. colorata Número de fêmeas prenhes 16(15) 16(13) Peso 20° dia de gestação (g)a 352,12±5,78 358,98±6,76 Peso de útero gravídico (g)a 67,40±2,53 60,82±3,86 Número de corpos lúteosa 13,07±0,40 14,00±0,48 Número de implantaçõesa 12,27±0,40 11,92±0,76 Peso da placenta (g)a 0,62±0,02 0,68±0,02* Perda pré-implantação (%)b 6,08±1,54 14,65±4,89 Perda pós-implantação (%)b 4,98±1,11 6,67±1,89 Número de fetos mortos 0 0 (0/15) (0/13)

Número de fetos vivosa 11,67±0,42 11,08±0,71 Número de reabsorçõesa 0,67±0,16 0,85±0,25 Parâmetros fetais Tamanho da ninhadaa 11,67±0,42 11,08±0,71 Número de fetos machosa 5,67±0,43 5,31±0,66 Número de fetos fêmeasa 6,00±0,39 5,77±0,61 Peso corporal dos fetos (g)a 3,59±0,05 3,55±0,15 Peso de fetos machos (g)a 3,67±0,06 3,69±0,18 Peso de fetos fêmeas (g)a 3,50±0,05 3,41±0,15 Comprimento dos fetos (cm)a 5,68±0,08 5,72±0,08 Comprimento de fetos machos (cm)a 5,73±0,09 5,78±0,09 Comprimento de fetos fêmeas (cm)a 5,63±0,09 5,66±0,08 a teste t de Student, b teste de Mann-Whitney, * p < 0,05. (nº de ninhadas afetadas/nº total de ninhadas)

Tabela 6. Número de células das zonas basal e zona do labirinto de ratas Wistar tratadas com extrato acetático de P. Colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% por no mínimo 51 dias. As médias e erros padrão são apresentados. Regiões da Tipos celulares Controle (n=5) P. colorata (n=5) placenta Zona Basal Células trofoblásticas 42,70 ± 1,97 59,54 ± 2,07* gigantes Espongiotrofoblasto 69,56 ± 2,49 103,76 ± 4,67*

Labirinto Trofoblastos 62,83 ± 2,85 89,71 ± 4,21* *p < 0,05, Teste t de Student.

C D

Figura 11. Avaliação histopatológica da placenta de ratas do grupo experimental tratadas com extrato acetático de P. colorata e do grupo controle. (A) Rata, placenta, identificação das camadas placentárias constituídas pela zona basal (ZB) e zona do labirinto (ZL), grupo controle, HE, 4X. (B) Rata, placenta, identificação das camadas placentárias constituídas pela zona basal (ZB) e zona do labirinto (ZL), grupo experimental, HE, 4X. (C) Rata, placenta, zona basal com a presença de células trofoblásticas gigantes (setas), grupo controle, HE, 40X. (D) Rata, placenta, zona basal com aumento da quantidade de células trofoblásticas gigantes (setas), grupo experimental, HE, 40X.

A B

C D

Figura 12. Avaliação histopatológica da placenta de ratas do grupo experimental tratadas com extrato acetático de P. colorata e do grupo controle. (A) Rata, placenta, zona basal com a presença de células espongiotrofoblásticas (setas), grupo controle, HE, 40X. (B) Rata, placenta, zona basal com a presença de aumento de células espongiotrofoblásticas (setas), grupo experimental, HE, 40X. (C) Rata, placenta, zona do labirinto com a presença de células trofoblásticas (setas), grupo controle, HE, 40X. (D) Rata, placenta, zona do labirinto com aumento da quantidade de células trofoblásticas (setas), grupo experimental, HE, 40X.

4 DISCUSSÃO

Compostos fenólicos, incluindo flavonoides, têm sido descritos em estudos de análise dos constituintes das folhas de plantas do gênero Psychotria incluindo P. carthagenensis, P. deflexa, P. leiocarpa, P. capilácea (FORMAGIO et al., 2014). A presença de flavonoides no extrato avaliado nesse estudo está de acordo com os resultados de Mendonça et al. (2015) em análise fitoquímica das folhas da P. colorata. Compostos fenólicos são metabólitos secundários amplamente distribuídos em plantas (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007). Essas biomoléculas agem como antioxidantes e podem exercer efeito protetor contra radicais livres (FORMAGIO et al., 2014). Os antioxidantes estão associados à prevenção de muitas doenças crônicas, como câncer, doenças cardiovasculares, aterosclerose, diabetes, asma, hepatite e artrite (MIDDLETON JR; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000). No entanto, alguns compostos fenólicos podem agir como fitoestrógenos em razão da semelhança estrutural com o estrógeno (VAYA; TAMIR, 2004) e promover efeitos deletérios no desenvolvimento e viabilidade da progênie por atravessar facilmente a placenta e alcançar os fetos (OMAR; EL-DIN; ABDELRAHMAN, 2016). O extrato acetático das folhas de P. colorata promoveu aumento no consumo de ração cinco dias antes do período gestacional e no 17º dia de gestação nas ratas tratadas em relação ao grupo controle. O décimo sétimo dia de gestação está na fase inicial do desenvolvimento fetal em ratas (PARKER, 2006). Nesse período a administração de substâncias pode ocasionar alterações de crescimento e maturação funcional (SEELY, 2017). O aumento do consumo de ração nas ratas tratadas pode ser atribuído ao efeito inibitório dos flavonoides presentes na planta sobre a secreção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (NEMATY et al., 2013). O TNF-α atua como uma citocina multifuncional, implicada na inflamação, apoptose, citotoxicidade e induz caquexia em ratos (OLIFF, 1987; DE SOUZA et al., 2005). Adicionalmente, o TNF-α exerce um potente efeito anorexígeno e pró-termogênico no hipotálamo de ratos por meio de mecanismos modulatórios da sinalização de insulina e leptina (ROMANATTO et al., 2007). Em estudo com extrato hidroalcoólico de Coriandrum sativum, planta que possui flavonoides, foi verificado que os animais tratados com as

99 doses de 100 e 150mg/kg apresentaram aumento de ingestão alimentar (NEMATY et al., 2013). Esse comportamento pode ser nocivo, pois é um dos fatores que contribui para o desenvolvimento de obesidade (WRIGHT; ARONNE, 2012) e a obesidade provoca prejuízos à saúde, tais como, dificuldades respiratórias, distúrbios do aparelho locomotor, dislipidemias, doenças cardiovasculares e diabetes não insulino-dependentes (BRAY, 2004). Assim, o aumento do consumo de ração observado no presente estudo, apesar de não ter alterado o peso das ratas tratadas, representa um possível efeito nocivo dos compostos ativos do extrato acetático de P. colorata sobre o comportamento ingestivo das ratas. Na avaliação hematológica houve diminuição de linfócitos e aumento de monócitos. Os estrógenos bem como seus receptores são importantes moduladores do sistema imune (CUNNINGHAM; GILKESON, 2011). Os linfócitos B e T expressam receptores de estrógeno α e β (REα e REβ) (PHIEL et al., 2005). O estrógeno regula negativamente os precursores de linfócitos na fase inicial da linfopoiese (KOURO et al., 2001). A linfopenia encontrada no presente trabalho também pode estar relacionada à ação de flavonoides, por um possível efeito inibitório da proliferação linfocítica (KONAN et al., 2012). Adicionalmente, esteroides promovem a redistribuição de linfócitos na circulação, contribuindo com a sua diminuição (BUSH, 2004). Monócitos também expressam os REα e REβ (HARKONEN; VAANANEN, 2006). Estas células de defesa são fagócitos chave que fornecem reconhecimento precoce de patógenos como parte do sistema imune inato (CUNNINGHAM; GILKESON, 2011). Evidências sugerem que o estrógeno tem efeitos sobre a função imunitária dos monócitos com estimulação da produção destas células na fase lútea (POLAN; LOUKIDES; HONIG, 1994). Além disso, a contínua administração esteroidal estimula os monócitos a sairem do compartimento marginal para a circulação resultando em monocitose (BUSH, 2004). Assim, os compostos presentes na planta podem ter estimulado a monocitose nas ratas tratadas com extrato acetático de P. colorata. No presente trabalho foi observado aumento do peso da placenta associado ao aumento significativo na quantidade de células do trofoblasto, espongiotrofoblasto e células trofoblásticas gigantes, nos animais tratados com extrato acetático (EAC).

100

A placenta é um órgão temporário de ligação entre a fêmea e o embrião em desenvolvimento ou feto, com funções de fixação do feto à parede uterina, trocas gasosas, fornecimento de nutrientes, remoção de produtos oriundos do desenvolvimento embrionário, barreira de proteção contra xenobióticos e produção de hormônios esteroides e citocinas (FURUKAWA; KURODA; SUGIYAMA, 2014). Agentes externos podem interferir com a função placentária em muitos níveis e promover desvio do desenvolvimento normal que pode constituir uma ameaça potencial à função placentária resultando em parto prematuro, má formação congênita ou aborto (MYLLYNEN et al., 2005). Ratos e camundongos possuem placenta do tipo discoidal e hemocorial (CARTER, 2007; FURUKAWA et al., 2011), composta por diferentes camadas: zona do labirinto, zona basal, decídua e glândula metrial (DAVIES; GLASSER, 1968; SOARES et al., 2012). A zona do labirinto possui camadas de trofoblastos separando o sangue materno dos vasos sanguíneos fetais (TAKATA; FUJIKURA; SHIN, 1997; ENDERS; BLANKENSHIP, 1999), a zona basal é composta por espongiotrofoblasto, células trofoblásticas gigantes e células contendo glicogênio. A porção materna é constituída pela decídua, onde há células deciduais do mesométrio, e glândula metrial, formada por células do estroma endometrial, trofoblastos, fibroblastos e células natural killers (FURUKAWA; KURODA; SUGIYAMA, 2014). As células trofoblásticas gigantes participam de uma série de processos essenciais para uma gestação bem sucedida, como, a implantação de blastocistos, remodelação das decíduas maternas e secreção de hormônios que regulam o desenvolvimento dos compartimentos fetais e materno da placenta (OGREN, 1988). Além disso, as células trofoblásticas gigantes controlam o fluxo sanguíneo materno (DONG et al., 2003) e seu potencial angiogênico é de fundamental importância para o sucesso da placentação (GAGIOTI et al., 2000; ABBOT; BUCKALEW, 2000). O estrógeno é conhecido como um inibidor do crescimento placentário e sua deficiência induz aumento de peso placentário (CSAPO et al., 1974; ICHIKAWA; TAMADA, 2016). Níveis de estrógenos diminuídos podem prejudicar o desenvolvimento e diferenciação de células trofoblásticas placentárias em ratas prenhes por reduzir o fluxo sanguíneo placentário (FENG et al., 2016; ICHIKAWA; TAMADA, 2016).

101

Os fitoestrógenos podem apresentar efeito estrogênico em baixas doses ou antiestrogênico em altas doses (AIYER et al., 2012; ARCHANA SHARMA; NEERUPMA DHIMAN, 2014). Além disso, os fitoestrógenos podem promover atividade inibitória da enzima aromatase que converte andrógenos em estrógenos levando a uma consequente redução na concentração de estrógeno (MEEUWEN et al., 2008). Nossos resultados sugerem que os flavonoides possam ter exercido efeito antiestrogênico, interferindo com o desenvolvimento da placenta das ratas tratadas com extrato acetático das folhas de P. colorata. Assim, conclui-se que os compostos ativos do extrato acetático das folhas P. colorata promoveram toxicidade geral e reprodutiva em ratas Wistar.

102

5 REFERÊNCIAS

ABBOT, B. D.; BUCKALEW, A. R. Placental defects in ARNT-knockout conceptus correlate with localized decreases in VEGFR2, Ang-1 and Tie-2. Developmental Dynamics, v. 219, p. 526-538, 2000.

ADAMS, N.R. Permanent infertility in ewes exposed to plant oestrogens. Australian Veterinary Journal, v. 67, p. 197-201, 1990.

AIYER, H. S.; WARRI, A. M.; WOOD, D. R.; HILAKIVI-CLARKE, L. CLARKE, R. Influence of Berry-Polyphenols on Receptor Signaling and Cell- Death Pathways: Implications for Breast Cancer Prevention. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, n. 23, p. 5693-5708, 2012.

ARCHANA SHARMA, J.; NEERUPMA DHIMAN, S. S. Health Benefits of Phytoestrogens. International Journal of Advanced Research, v. 2, n. 4, p. 1024- 1030, 2014.

BARTHOLOMEUSZ, R. K.; BRUCE, N. W.; LYNCH, A. M., Embryo survival, and fetal and placental growth following elevation of maternal estradiol blood concentrations in the rat. Biology of Reproduction, v. 61, p. 46-50, 1999.

BEUTLER, B.; CERAMI, A. Cachectin and tumour necrosis factor as two sides of the same biological coin. Nature, v. 320, n. 6063, 584-588, 1986.

BRAY, G. A.; Medical consequences of obesity. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 89, n. 6, p. 2583-2589, 2004.

BUSH, B. M; Interpretação de resultados laboratoriais para clínicos de pequenos animais. 1 ed. São Paulo: Roca, p. 117-128, 2004.

CARTER, A.M. Animal models of human placentation - a review. Placenta, v. 28, p. 41-47, 2007.

103

CUNNINGHAM, M.; GILKESON, G. Estrogen Receptors in Immunity and Autoimmunity. Clinical Reviews in Allergy & Immunology, v. 40, p. 66-73, 2011.

CSAPO, A.; DRAY, F.; ERDOS, T. Oestradiol 17: inhibitor of placental growth. Letter v. 2, p. 51-52, 1974.

DABHADKAR, D.; ZADE, V. Abortifaciet activity of Plumeria rubra (Linn) pod extract in female albino rats. Indian Journal of Experimental Biology, v.50, n.10, p.702- 707, 2012.

DAVIES, J.; GLASSER, S.R. Histological and fine structural observations on the placenta of the rat. Acta Anatomica (Basel), v. 69, p.542-608, 1968.

DE SOUZA, C. T.; ARAUJO, E. P.; BORDIN, S.; ASHIMINE, R.; ZOLLNER, R. L.; BOSCHERO, A. C.; SAAD, M. J.; VELLOSO, L. A. Consumption of a Fat-Rich Diet Activates a Proinflammatory Response and Induces Insulin Resistance in the Hypothalamus. Endocrinology, v. 146, n. 10, p. 4192-4199, 2005.

DONG, Y. L.; VEGIRAJU, S.; CHAUHAN, M.; YALLAMPALLI, C. Expression of calcitonin gene-related peptide receptor components, calcitonin receptor-like receptor and receptor activity modifying protein 1, in the rat placenta during pregnancy and their cellular localization. Molecular Human Reproduction, v. 9, p. 481-490, 2003.

DRUMMOND, E. M.; HARBOURNE, N.; MARETE, E.; MARTYN, D.; JACQUIER, J.; O’RIORDAN, D.; GIBNEY, E. R. Inhibition of proinflammatory biomarkers in thp1 macrophages by polyphenols derived from chamomile, meadowsweet and willow bark. Phytotherapy Research, v. 27, p. 588-594, 2012.

ENDERS, A.C.; BLANKENSHIP, T.N. Comparative placental structure. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 38, p.3-15, 1999.

104

FENG, Y.; ZHANG, P.; ZHANG, Z.; SHI, J.; JIAO, Z.; SHAO, B. Endocrine disrupting effects of triclosan on the placenta in pregnant rats. Plos One, v. 11, n. 5, p. 1-14, 2016.

FORMAGIO, A. S. N.; VOLOBUFF, C. R. F.; SANTIAGO, M.; CARDOSO, C. A. L.; VIEIRA, M. C.; PEREIRA, Z. V. Evaluation of antioxidant acitivity, total flavonoids, tannins and phenolic compounds in Psychotria leaf extracts. Antioxidants, v. 3, p. 745-757, 2014.

FURUKAWA, S.; HAYASHI, S.; USUDA, K.; ABE, M.; HAGIO, S.; OGAWA, I. Toxicological pathology in the rat placenta. Journal of Toxicologic Pathology, v. 24, p. 95–111, 2011.

FURUKAWA, S.; KURODA, Y.; SUGIYAMA, A. A Comparison of the Histological Structure of the Placenta in Experimental Animals. Journal of Toxicologic Pathology, v. 27, p. 11-18, 2014.

GAGIOTI, S.; SCAVONE, C.; BEVILACQUA, E. Participation of the mouse implanting trophoblast in nitric oxide production during pregnancy. Biology of Reproduction, v. 62, p. 260-268, 2000.

HARKONEN, P. L.; VAANANEN, H. K. Monocyte-macrophage system as a target for estrogen and selective estrogen receptor modulators. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 1089, p. 218-227, 2006.

ICHIKAWA, A.; TAMADA, H. Ketoconazole-induced estrogen deficiency causes transient decreasein placental blood flow associated with hypoxia and later placentalweight gain in rats. Reproductive Toxicology, v. 63, p. 62-69, 2016.

KONAN, N. A.; LINCOPAN, N.; DÍAZ, I. E.; DE FÁTIMA JACYSYN, J.; TIBA, M. M.; AMARANTE MENDES, J. G.; BACCHI, E. M.; SPIRA, B. Cytotoxicity of cashew flavonoids towards malignant cell lines. Experimental and Toxicologic Pathology, v. 64, p. 435-440, 2012.

KOURO, T.; MEDINA, K. L.; ORITANI, K.; KINCADE, P. W. Characteristics of early murine B-lymphocyte precursors and their direct sensitivity to negative regulators. Blood, v. 97, n. 9, p. 2708–2715, 2001.

105

LORENZI, T. F. Manual de Hematologia – Propedêutica e Clínica, 4th edition. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. 2006.

MATOS, F.J.A. Introdução à Fitoquímica Experimental. Fortaleza: UFC Edições, 1997.

MIDDLETON JR., E.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T. C. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacological reviews, v. 52, p. 673-751, 2000.

MOURA, L. T. S. Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato bruto das folhas de Psychotria colorata em ratos wistar. 89p. Tese (Doutorado em Ciência Animal Tropical) – Área de concentração: Produção animal. Departamento de Patologia animal, Universidade Federal do Tocantins, Araguaína, 2013.

MYLLYNEN, P.; PASANENA, M.; PELKONEN, O. Human placenta: a human organ for developmental toxicology research and biomonitoring. Placenta, v. 26, p. 361- 371, 2005.

NEMATY, M.; KAMGAR, M.; MOHAJERI, S. M. R.; ZADEH, S. A. T.; JOMEZADEH, M. R.; HASANI, O. A.; KAMALI, N.; VOJOUHI, S.; BAGHBAN, S.; AGHAEI, A.; SOUKHTANLOO, M.; HOSSEINI, M.; GHOLAMNEZHAD, Z.; RAKHSHANDEH, H.; NOROUZY, A.; HABIBOLLAH, E.; GHAYOUR-MOBARHAN, M.; PATTERSON, M. The effect of hydroalcoholic extract of Coriandrum sativum on rat appetite. Avicenna Journal of Phytomedicine, v. 3, n. 1., p. 91-97, 2013.

OGREN, L.; TALAMANTES, F. Prolactins of pregnancy and their cellular source. International Review of Cytology, v. 112, p. 1-65, 1988.

106

OLIFF, A.; DEFEO-JONES, D.; BOYER, M.; MARTINEZ, D.; KIEFER, D.; VUOCOLO, G.; WOLF, A.; SOCHER, S. H. Tumors secreting human TNF/cachectin induce cachexia in mice. Cell Press, v. 50, n. 4, p. 555-563, 1987.

OMAR, A. R.; EL-DIN, E. Y. S.; ABDELRAHMAN, H. A. Implications arising from the use of Cymbopogen proximus; proximal on placenta of pregnant Albino rats. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 59, p. 1-8, 2016.

PARKER, R. M. Testing for reproductive toxicity. In: HOOD, R. D. (Ed.) Developmental and reproductive toxicology: a practical approach. Boca Raton: Taylor & Francis, cap. 10, p. 425 – 488, 2006.

PHIEL, K. L.; HENDERSON, R. A.; ADELMAN, S. J.; ELLOSO, M. M. Differential estrogen receptor gene expression in human peripheral blood mononuclear cell populations. Immunology Letters, v. 97, n. 1, p. 107-113, 2005.

PINTO, V. M. Avaliação toxicológica da preparação fitoterápica contendo Piper methysticum Forst., Piperaceae (kava kava ®) sobre o desenvolvimento pré- natal em ratos. 2004. 71p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rio grande do Sul, 2004.

POLAN, M. L.; LOUKIDES, J. A.; HONIG, J. Interleukin-1 in human ovarian cells and in peripheral blood monocytes increases during the luteal phase: evidence for a midcycle surge in the human. American Journal of Obstetrics & Gynecology, v. 170, n. 4, p. 1000–1006, 1994.

ROBY, K. F.; SOARES, M. J. Trophoblast t cell differentiation and organization: Role of fetal and ovarian signals. Placenta, v. 14, p. 529-545, 1993.

ROMANATTO, T.; CESQUINI, M.; AMARAL, M. E. ROMAN, E. A.; MORAES, J. C.; TORSONI, M. A.; CRUZ-NETO, A. P. VELLOSO, L. A. TNF-a acts in the hypothalamus inhibiting food intake and increasing the respiratory quotient-Effects on leptin and insulin signaling pathways. Peptides, v. 28, p. 1050-1058, 2007.

SANIN, Y. Y. L.; GÓMEZ, M. T. G.; MORALES, A. M. T. Effectos de los fitoestrógenos em la repróducion animal. Revista Facultad Nacional de Agronomía, Medellín, v. 63, n. 2, p. 5555-5565, 2010.

SEELY, J. C. A brief review of kidney development, maturation, developmental abnormalities, and drug toxicity: juvenile animal relevancy. Journal of Toxicologic Pathology, v. 30, p. 125-133, 2017.

107

SOARES, I. M.; BASTOS, E. G. P.; PEIXOTO-SOBRINHO, T. J. S.; ALVIM, T. C.; SILVEIRA, M. A.; AGUIAR, R. W. S.; ASCÊNCIO, S. D. Conteúdo fenólico e atividade antioxidante de diferentes cultivares de Ipomoea batatas (L.) lam. obtidas por melhoramento genético para produção industrial de etanol. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 35, p. 479-488, 2014.

SOARES, M. J.; CHAKRABORTY, D.; KARIM RUMI, M.A.; KONNO, T.; RENAUD, S.J. Rat placentation: an experimental model for investigating the hemochorial maternal-fetal interface. Placenta, v. 33, p. 233-243, 2012.

TAKATA, K.; FUJIKURA, K.; SHIN, B. Ultrastructure of the rodent placental labyrinth: a site of barrier and transport. Journal of Reproduction and Development, v. 43, p. 13-24, 1997.

TAYLOR, C.M.; CAMPOS, M.T.V.A.; ZAPPI, D. Flora da reserva Ducke, Amazonas, Brasil: Rubiaceae. Rodriguésia, v. 58, p. 549-616. 2007.

VAYA, J.; TAMIR, S. The relation between the chemical structure of flavonoids and their estrogen-like activities. Current Medicinal Chemistry, v. 11, p. 1333-1343, 2004.

VEROTTA, L.; PILATI, T.; TATÒ, M.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. Pyrrolidinoindoline alkaloids from Psychotria colorata. Journal of Natural Products, v. 61, p. 392-396, 1998.

VEROTTA, L.; PETERLONGO, F.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. High-performance liquid chromatography-diode array detection-tandem mass espectrometry analyses of the alkaloid extracts of Amazon Psychotria species. Journal of Chromatography, v. 41, p. 165-176, 1999.

WHITTEN, P. L.; PATISAUL, H. B.; YOUNG, L. J. Neurobehavioral actions of coumestrol and related isoflavonoids in rodents. Neurotoxicology and Teratology, v. 24, n. 1, p. 47-54, 2002.

WRIGHT, S. M.; ARONNE, L. J. Causes of obesity. Abdominal Radiology, v. 37, n. 5, p. 730-732, 2012.

108

CAPÍTULO IV – Efeitos da exposição peri e pós-natal ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e neurocomportamental da prole de ratas

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Efeitos da exposição peri e pós-natal ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e neurocomportamental da prole de ratas

Effects of exposure peri and postnatal to alkaloid extract from Psychotria colorata leaves on maternal behavior, physical and neurobehavioral development of offspring of rats

RESUMO

Psychotria colorata, planta da família Rubiaceae, conhecida popularmente como perpétua do mato é encontrada na região Norte, Nordeste e Centro Oeste do Brasil, e é utilizada por caboclos da Amazônia para tratamento de dores abdominais e de ouvido. A atividade analgésica foi atribuída aos alcaloides pirrolidinoindolínicos, existentes na planta, como agonista de receptores opioides e antagonista de receptores N-Metil-D-Aspartato (NMDA). Pecuaristas relataram abortamento em bovinos após ingestão da planta. Em estudo com a inclusão das folhas na ração de ratos foi observado toxicidade sistêmica e reprodutiva. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos do extrato alcaloídico sobre ratas durante a gestação e lactação, e sobre o comportamento maternal e desenvolvimento da prole. As folhas da planta foram coletadas no norte do Tocantins, secas em estufa a 55ºC, umedecidas em solução de hidróxido de amônio 6N, extraídas em etanol absoluto, com uso de aparelho soxhlet e rotaevaporadas sob pressão reduzida, sendo o extrato bruto obtido submetido à marcha analítica de alcaloides para obtenção do extrato alcaloídico de P. colorata (EAL). Ratas foram divididas de forma inteiramente casualizada em grupos, experimental (n=20) tratadas com EAL de P. colorata em solução de Tween a 5% e controle (n=20) que recebeu apenas o veículo. A dose administrada correspondeu à que seria ingerida se a planta fosse o único alimento, simulando as condições naturais de intoxicação que correspondeu a 238 mg.kg-1. As fêmeas foram tratadas do 6º dia de gestação (DG 6) ao 21º dia de lactação (DL 21). Durante o período experimental foram diariamente monitorados os consumos de água e ração e o peso corporal. Adicionalmente, foram realizados testes de observação e teste de retirada para avaliação do comportamento materno e teste do campo aberto para avaliar a frequência locomotora. Um casal de filhotes de cada ninhada foi observado quanto aos seguintes parâmetros de desenvolvimento físico: aparecimento de pelagem, revestimento preliminar de pelos, desdobramento de orelha, erupção dos dentes incisivos, abertura de olhos e canal auditivo. Os seguintes testes reflexológicos foram avaliados: reflexo de preensão palmar, auditivo, andar adulto, reflexo de endireitamento em superfície e geotaxia negativa. Além disso, nos filhotes foi avaliada a bioquímica sérica, peso relativo dos órgãos, peso corporal e ganho de peso. Na hematologia foi observado linfocitose e neutrofilia. Na bioquímica sérica houve aumento de ácido úrico e diminuição de proteína total. Na análise do campo aberto foi observado diminuição da atividade locomotora e aumento da imobilidade nas ratas tratadas. No teste de observação as mães tratadas com EAL ficaram mais tempo em posição de amamentação pouco

110 arqueada e em repouso quando comparado ao grupo controle. Os demais parâmetros não foram alterados. No desenvolvimento físico da prole, foi observado maior latência para abertura dos olhos nos machos e nas fêmeas houve erupção dos dentes incisivos mais precocemente quando comparado ao grupo controle. Os filhotes machos de mães tratadas apresentaram latência significativamente maior no reflexo de endireitamento nos dias pós-natal (DPN) 3, 6 e 7 e as fêmeas no DPN 5 quando comparado ao grupo controle. Não houve alteração nos demais parâmetros avaliados. Conclui-se que o consumo subcrônico de EAL produz toxicidade em ratas e pode promover atrasos de desenvolvimento sensório motor na prole de ratas tratadas.

Palavras-chave: alcaloides, comportamento materno, desenvolvimento filhotes.

ABSTRACT

Psychotria colorata, plant of the Rubiaceae family, is popularly known as “perpetua do mato”, found in the North, Northeast and Central West regions of Brazil, and used by Amazonian caboclos for the treatment of abdominal and ear pain. The analgesic activity was attributed to the pyrrolidinoindolinic alkaloids, identified in the plant, in opioid receptors and to the antagonism of N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) receptors. Cattle ranchers reported abortion in cattle after ingestion of the plant. In the study with the inclusion of the leaves in the diet of rats systemic and reproductive toxicity was observed. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of alkaloid extract on rats during gestation and lactation, and on maternal behavior and offspring development. The leaves of the plant, were collected in the north of Tocantins, dried in an oven at 55°C, moistened with ammonium hydroxide 6N solution, extracted in ethanol in a Soxhlet apparatus and dried under reduced pressure and the crude extract obtained submitted to the analytical march of alkaloids to obtain the alkaloid extract of P. colorata (ALE). Females rats were divided randomly into groups, experimental (n=20) treated with ALE in a 5% Tween solution and control (n = 20) that received only the vehicle. The dose administered corresponded to an exclusive consumption of the plant, to simulate natural conditions of intoxication that corresponded to 238 mg.kg-1. Females were treated from the 6th day of gestation (GD 6) up to the 21st day of lactation (LD 21). During the experimental period, water and feed intake and body weight were monitored daily. In addition, observation and retrieval tests were performed to assess maternal behavior and open field test to evaluate the locomotor frequency. A pair of pups from each litter was observed for the following parameters of physical development: hair growth, pinna detachment, eruption of incisor teeth, eye opening and auditive channel opening. The following reflex tests were assessed: palmar grasp reflex, auditory startle reflex, adult gait, surface righting reflex, and negative geotaxis. Additionally, the pups were evaluated for serum biochemistry, relative body weight, body weight and weight gain. No significant differences were observed in water and feed intake, body weight and relative body weight in rats treated with ALE compared to control group. Hematology showed lymphocytosis and neutrophilia. In serum biochemistry there was an increase in uric acid and a decrease in total protein in experimental group. In the open field analysis, decreased locomotor activity and increased immobility were observed in the treated rats. There were no differences between the

111 groups regarding maternal behavior in the retrieval test, but in the observation test the mothers treated with ALE stayed longer in a position of little arcuate nursing and at rest when compared to the control group. In the physical development of the offspring, greater latency was observed for opening the eyes in males and in females there was eruption of the incisor teeth earlier when compared to the control group. Male pups presented higher latency in the surface righting reflex on postnatal days (PND) 3, 6 and 7 and females in PND 5. No alterations were observed in anatomopathological examination in rats treated and offspring. In conclusion, the subchronic consumption of ALE produces toxicity in rats and may promote delays of sensorial motor development in the offspring of rats.

Keywords: alkaloids, maternal behavior, development of offspring.

1 INTRODUÇÃO

Psychotria colorata, encontrada na região Norte, Nordeste e Centro Oeste do Brasil é utilizada para tratamento de dores abdominais e de ouvidos (TAYLOR, CAMPOS; ZAPPI, 2007). Apesar dos efeitos medicinais em seres humanos, há relatos de pecuaristas que esta planta pode causar abortamentos em animais de criação (COSTA et al., 2011). Análises fitoquímicas das flores e folhas de P. colorata identificaram a presença dos alcaloides pirrolidinoindolínicos hodgkinsina, quimonantina, quadrigemina C e psicotridina, e dos alcaloides quinolínicos calicantina e isocalicantina (VEROTTA et al., 1998; VEROTTA et al., 1999). Os alcaloides pirrolidinoindolínicos hodgkinsina, quimonantina e psicotridina apresentaram atividade analgésica em testes de nocicepção. A hodgkinsina mostrou efeito analgésico, reversível pela naloxona, em modelos térmicos de nocicepção no teste de retirada de cauda e no teste de placa quente, sendo posteriormente complementados por estudo de ligação em receptores opioides do tipo µ com atividade agonista (AMADOR et al., 2000; AMADOR et al., 2001; VEROTTA et al., 2002). Os alcaloides hodgkinsina, quimonantina e psicotridina também promoveram analgesia no teste de dor induzida pela capsaicina, sendo a ação antagonista não competitiva de receptor NMDA, semelhante ao antagonista NMDA MK-801, verificada em teste de ligação às membranas do córtex cerebral de camundongos (AMADOR et al., 2000 ; AMADOR et al., 2001; VEROTTA et al., 2002).

112

Substâncias opioides administradas durante a gestação podem causar perda de apetite, anemia, infecção do trato urinário, efeitos sobre a reprodução como parto prematuro, retardo do crescimento intra-uterino, aborto espontâneo e hemorragia pós-parto. Além disso, podem promover alterações comportamentais, síndrome da abstinência neonatal, ansiedade e atraso na função cognitiva do neonato (PINTO et al., 2010; UNGER; METZ; FISCHER, 2012; NARKOWICZ et al., 2013; MEYER, 2014). Morfina e β-endorfinas inibem o comportamento materno em ratas (BRIDGES; GRIMM, 1982; FELICIO; MANN; BRIDGES, 1991; FODOR; TÍMÁR; ZELENA, 2014). Entretanto, há relato que a morfina melhora o comportamento materno quando injetada na área tegmental ventral (THOMPSON; KRISTAL, 1996). O comportamento materno é complexo, espontâneo, instintivo e com características espécie-específicas determinadas por modificações fisiológicas que visam à sobrevivência dos filhotes e a perpetuação da espécie (CUMMINGS; CLEMENS; NUNEZ, 2010). Os principais cuidados fornecidos por ratas durante esse período incluem: a amamentação, onde a mãe passa a maior parte do tempo em postura arqueada para exposição da região mamária, comportamento de construção de ninho para proteção dos filhotes e regulação da temperatura corporal da prole na ausência da mãe, comportamento de recolhimento dos filhotes para transporte e as lambidas das mães que além de limpeza tem a função de estimular a liberação de fezes e urina dos filhotes (NUMAN; STOLZENBERG, 2009; VASCONCELOS et al., 2012). As alterações hormonais no final da gestação estimulam o comportamento materno e incluem elevações nos níveis de estrógeno com consequente aumento da ativação de receptores estrogênicos em regiões cerebrais, como a aréa pré-optica medial, bem como ação de hormônios como a ocitocina e prolactina (GIORDANO; SIEGEL; ROSENBLATT, 1989; BRIDGES, 1996; PEDERSEN, 1997). Assim, considerando-se que a Psychotria colorata possui alcaloides como a hodgkinsina que pode atuar no sistema nervoso central como agonista opiodérgico é possível que a administração do extrato alcaloídico dessa planta possa prejudicar o comportamento materno e o desenvolvimento dos filhotes. Além disso, como existem relatos de que a ingestão dessa planta possui efeitos tóxicos reprodutivos em animais de criação o presente trabalho visou investigar os efeitos da

113 administração do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata durante a gestação e lactação em ratas Wistar sobre o comportamento materno, níveis séricos de ocitocina, e desenvolvimento físico e neurocomportamental da prole.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção das folhas de P. colorata

2.2 Obtenção do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata

A obtenção do extrato foi realizada de acordo com Elisabetsky et al. (1995) com mínima modificação. Após a completa secagem das folhas frescas até peso constante, as folhas secas foram umedecidas em solução de hidróxido de amônio

(NH4OH) a 6N e submetidas à extração em álcool etílico 99,5%, com uso de aparelho soxhlet, em seguida a solução etanólica foi evaporada sob pressão reduzida em rotaevaporador (Fisatom® Mod. 801) com temperatura controlada de 45°C para obtenção do extrato bruto (EB). O EB obtido foi ressuspendido em solução aquosa de ácido clorídrico a 5% para a obtenção dos alcaloides na forma de cloridratos. Em seguida, o extrato acidificado foi particionado com diclorometano para remoção das impurezas. A fase aquosa foi desprezada e a fase orgânica foi alcalinizada a pH 10 com hidróxido de sódio diluído, monitorado com uso de pHmetro (Hanna®). Posteriormente, a fase orgânica alcalinizada foi particionada 3 vezes com diclorometano e o extrato orgânico obtido foi concentrado em rotaevaporador para a obtenção do extrato alcaloídico (EAL) (Figura 1).

114

Figura 1. Fluxograma para obtenção do extrato alcaloídico de P. colorata (EAL).

2.3 Animais

O estudo foi realizado com 40 ratas Wistar, com 60 a 70 dias de idade, pesando entre 230 e 310g, obtidos do biotério do Programa de Pós – Graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Os animais foram divididos de forma inteiramente casualizada em grupos experimental e controle, mantidos individualmente em gaiolas de polietileno com tampas metálicas, medindo 40X50X20 cm, com acesso livre a ração e água em ambiente climatizado com temperatura controlada (22±2°C) e com iluminação em ciclo claro/escuro de 12 horas. As ratas foram aclimatadas as condições do biotério por 5 dias antes do início do experimento. O protocolo experimental foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA, da Universidade Federal do Tocantins sob o processo nº 23101.000666/2014-39. O EAL foi dissolvido em solução aquosa de Tween 80 a 5% (v/v) e administrado oralmente por meio de gavagem. O grupo controle recebeu apenas a solução de Tween 80.

115

Foram avaliados diariamente o consumo de ração, água e peso animal com início às 8h30min.

2.4 Administração do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata

As ratas foram distribuídas de forma inteiramente casualizada em grupos, tratado com extrato alcaloídico e controle, com 20 animais em cada grupo. A dose do extrato foi estabelecida considerando o consumo de ração, como se a planta fosse o único alimento para simular as condições naturais de intoxicação e o rendimento da planta, isto correspondeu a 238 mg.Kg-1, sendo o volume médio ingerido de 0,5mL por animal da solução com EAL. As fêmeas foram tratadas por 36 dias, isto é, a partir do 6º dia de gestação até o 21º dia de lactação (Figura 2).

2.5 Acasalamento e diagnóstico de prenhez

As ratas foram colocadas para acasalar no final da fase clara do dia, duas fêmeas para um macho por caixa. Na manhã do dia seguinte os machos foram retirados. As fêmeas foram submetidas a lavados vaginais para observação, em microscópio, do material obtido. Esse procedimento durou até a confirmação da prenhez pela presença de espermatozóides no lavado vaginal. O início da prenhez foi determinado como o dia de gestação zero (DG-0). As fêmeas prenhes foram mantidas em gaiolas individuais.

2.6 Avaliação dos parâmetros reprodutivos

Para avaliação do desenvolvimento reprodutivo das ratas os seguintes parâmetros foram avaliados: duração da prenhez, tamanho da ninhada, presença de más-formações externas, sexo e peso dos filhotes. O dia do parto foi considerado o dia pós-natal 0 (DPN0). No DPN1 todas as ninhadas, quando possível, foram padronizadas em 8 filhotes, com 4 fêmeas e 4 machos.

116

2.7 Avaliação do comportamento maternal

Para investigar os efeitos da exposição ao extrato alcaloídico sobre a interação mãe e filhotes, foi realizado a avaliação do comportamento maternal por dois tipos de análises, teste de observação e teste de retirada, que foram realizados de acordo com os métodos adaptados de Slamberová, Charousová e Pometlová (2005) e Arrati e colaboradores (2006), respectivamente.

2.7.1 Teste de observação

O comportamento maternal foi observado diariamente do 2º ao 21º dia de vida dos filhotes, durante o período claro do ciclo de luz. As observações foram divididas em duas sessões de 50 minutos cada, as 10:00h e 16:00h. Em cada sessão foi registrado o comportamento de cada lactante a cada 5 minutos. Foram observadas as posições de aleitamento e os tipos de atitudes corporais maternas e não maternas a cada observação. As posições de amamentação observadas foram: a) Mãe com postura muito arqueada, nesta posição a mãe fica com o dorso arqueado sobre os filhotes com os membros posteriores separados e claramente estendidos. b) Mãe com postura pouco arqueada, a rata fica sobre os filhotes, mas sem o dorso arqueado e sem extensão clara dos membros posteriores. c) Mãe amamentando de lado ou de costas; Os tipos de atitudes foram: (1) mãe dentro do ninho, (2) mãe fora do ninho, (3) mãe em posição de amamentação e lambida de qualquer de seus filhotes, (4) mãe lambendo qualquer de seus filhotes, (5) mãe em autolimpeza, (6) mãe construindo ninho, (7) mãe em repouso com olhos fechados, (8) mãe ingerindo água, (9) mãe ingerindo ração.

2.7.2 Teste de retirada

No quinto dia pós-natal os filhotes foram separados das mães por 30 minutos e os ninhos foram destruídos. Após esse período a mãe foi retirada brevemente da caixa moradia para os filhotes serem recolocados. A ninhada foi distribuída com um

117 filhote em cada um dos quatro cantos da caixa e dois filhotes nas laterais esquerda e direita de maior comprimento da caixa. A mãe foi reintroduzida no centro da caixa moradia para então iniciar a avaliação do comportamento materno. Foram observadas as latências para: mãe carregar o primeiro, segundo e terceiro filhotes, agrupar todos os filhotes, adotar a posição de amamentação (cifose fisiológica) e mantê-la por 3 minutos consecutivos, qualidade do ninho aos 45 minutos após início da avaliação. Para qualidade do ninho foram dados escores: 0 (ausência de ninho), 1 (ninho raso), 2 (ninho bom) a 3 (ninho ótimo, completo e bem elaborado). As observações foram realizadas durante a fase clara do ciclo de luz, entre 14h e 17h.

2.8 Atividade geral em campo aberto

O aparelho utilizado para a avaliação consistiu em uma arena circular de madeira (97 cm X 27 cm de altura), onde o fundo era dividido em 25 partes aproximadamente iguais. No quinto dia pós-natal, todas as ratas foram testadas em sessões de cinco minutos, contados a partir do momento em que eram colocadas no centro do campo aberto e cada animal foi testado apenas uma vez. Antes do início de cada teste o campo aberto foi limpo com uma solução de álcool (5%) para evitar que os animais usassem pistas olfativas possivelmente presentes no aparelho. As observações foram realizadas durante a fase clara do ciclo de luz, entre 14h e 17h. Foram observados os seguintes parâmetros: a) Frequência de locomoção: Para cada unidade de medida foi considerada a colocação das quatro patas dentro do espaço delimitado de cada subdivisão do campo aberto. b) Frequência de levantar: Foi considerado o comportamento da rata se apoiar nas patas posteriores, com a cabeça para cima. c) Duração de imobilidade: Foi registrado o total de ausência de movimentos, em segundos. d) Self-Grooming: Foi considerado o tempo total de autolimpeza, em segundos.

118

2.9 Avaliação do desenvolvimento físico dos filhotes

A avaliação do desenvolvimento e neurotoxicidade foram realizadas de acordo com as diretrizes da Organisation for Economic Co-operation and Development 426 (OECD, 2007). As observações foram feitas a partir das 11:00h da manhã. Para a avaliação do desenvolvimento físico foi aleatoriamente escolhido um filhote macho e uma fêmea por ninhada, marcados no dorso com pincel. Os seguintes parâmetros foram monitorados: a) Dia de aparecimento da pelagem: Foi observado do 1º ao 5° dia após o nascimento. b) Desdobramento das orelhas: Foi observado entre o 1° e o 5° dia de lactação. Foi considerada a separação do lado direito e esquerdo. c) Erupção dos dentes incisivos: Foi observado entre o 7º ao 12º dia de vida pós- natal. d) Abertura dos olhos: Foi avaliado a partir do 10º até o 15°dia da lactação e foi considerado como critério alcançado após a abertura dos 2 olhos. e) Abertura dos ouvidos: Foi monitorado a partir do 10º dia de vida e foi considerado como dia da abertura dos ouvidos quando houve a visualização do orifício que corresponde ao ducto auditivo.

2.10 Desenvolvimento neurocomportamental dos filhotes

A avaliação do desenvolvimento neurocomportamental foi realizada com os mesmos filhotes submetidos à avaliação do desenvolvimento físico, de acordo com as diretrizes da Organisation for Economic Co-operation and Development 426 (OECD, 2007) e foram observados os seguintes parâmetros: a) Reflexo de endireitamento em superfície: Foi avaliado o tempo necessário para que o animal retornasse a posição normal de superfície quando colocado de costas. Este parâmetro foi avaliado entre o 2º e 7º dia pós-natal. b) Geotaxia negativa: Foi medido o tempo necessário (até 30 segundos) para que o filhote girasse 180° após ter sido colocado com a cabeça voltada para baixo sobre

119 uma plataforma com inclinação de 45°. Quando o animal não apresentou o reflexo na 1° tentativa, ele foi testado mais duas vezes com latência idêntica. Foi realizado o reflexo do 7º ao 14º dia pós-natal. c) Reflexo de sobressalto: Foi observada a presença de reação do filhote quando exposto a um estalido curto e seco (estalar dos dedos). A reação indicou que o conduto auditivo estava aberto. Foi registrado o dia em que o animal apresentou pela primeira vez o reflexo. O teste foi realizado a partir do 10° dia de lactação. d) Reflexo de preensão palmar: A pata dianteira do filhote foi tocada com um clip de papel e foi avaliado o dia em que o animal perdeu o reflexo de agarrar o clip. e) Andar adulto: Foi observado a partir do 10º até o 15° dia de vida pós-natal. Foi apontado o dia que o animal passou a andar com as quatro patas sem encostar o ventre na superfície.

2.11 Dosagem hormonal de ocitocina

No final do experimento, no DL 21, amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal e centrifugadas para obtenção do soro. Para dosagem da ocitocina sérica foram usados os soros procedentes das fêmeas tratadas com extrato alcaloídico e das ratas do grupo controle. Cada amostra de soro foi acondicionada em recipiente de polipropileno com tampa resistente à baixas temperaturas. As amostras devidamente identificadas foram armazenadas em freezer a -20ºC até a utilização. A dosagem hormonal foi realizada por meio de conjunto diagnóstico (“kit”) comercial da Enzo Life Sciences Oxytocin EIA Kit ® de acordo com as orientações do fabricante e a leitura foi realizada em leitor de ELISA Biochromasys UVM340 (Analítica ®).

2.12 Hemograma

No final do experimento, no DL 21, amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal e transferidas para tubos com anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para a contagem de glóbulos vermelhos, concentração de hemoglobina (Hb), volume corpuscular médio (VCM), hematócrito, hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular

120 média (CHCM). Além disso, foram realizados esfregaços sanguíneos para contagem diferencial de leucócitos (LORENZI, 2006).

2.13 Exames bioquímicos

As amostras de sangue foram coletadas da veia cava caudal e centrifugadas para obtenção do soro. As amostras de soro foram colocadas em tubos tipo eppendorf e armazenadas em freezer a -20ºC até a utilização. Foram determinados os níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina, ácido úrico, colesterol, creatinina, fosfatase alcalina, proteína total, triglicerídeos, ureia, glicose e bilirrubina. Para as análises bioquímicas, foram utilizados conjuntos diagnóstico (“kit”) comercial da Labtest® pelo aparelho Biochrom asys UVM340® microplate reader.

2.14 Necropsia e avaliação anatomo-histopatológica

Ao final do experimento, no DL 22, os animais foram anestesiados com 10 mg de xilazina/kg associado a 90mg de cetamina/kg por via intraperitoneal para coleta de sangue e posteriormente eutanasiados para necrópsia (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010). Após a eutanásia, a necropsia foi realizada para a inspeção visual dos órgãos e detecção de possíveis alterações. Em todos os animais foram coletados e pesados: adrenais, pulmão, timo, coração, baço, fígado, rins, encéfalo, útero e ovários para determinação do peso relativo. Além dos órgãos mencionados acima, que passaram por pesagem, foram coletados estômago, linfonodos, intestino delgado e intestino grosso e medula espinal. A fórmula usada para calcular o peso relativo foi a seguinte: Peso relativo do órgão = (peso do órgão / peso corporal) x 100 Todos os órgãos foram seccionados e retirados fragmentos para fixação em formalina tamponada, com troca do formol após 24h da realização da necropsia. As amostras uma vez fixadas foram clivadas para processamento histopatológico, em seguida desidratadas com séries crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Fragmentos teciduais foram seccionados em micrótomo, com

121 espessura de 5,0 μm e submetidos a subsequente coloração por hematoxilina- eosina, para observação em microscópio óptico.

2.15 Análise estatística

As médias foram comparadas pelo teste de t de Student para comparação de grupos. Foi usado Teste Mann-Whitney para dados não paramétricos. As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Instat versão 3.02 e os gráficos foram confeccionados utilizando o programa GraphPad Prisma v 5.00. Para análise e confecção dos gráficos de comportamento materno no teste de observação foi utilizado o programa GraphPad Prisma v 5.00, assim os dados foram submetidos à análise de variância de duas vias de medidas repetidas e as comparações múltiplas post hoc foram feitas pelo teste de Bonferroni. O nível de significância crítico para todas as análises estatísticas realizadas foi de p < 0,05.

2.16 Delineamento experimental

2.16.1 Efeitos da exposição perinatal ao extrato alcaloídico das folhas de Psychotria colorata sobre o comportamento maternal, desenvolvimento físico e sensório-motor da prole de ratos

A avaliação do comportamento maternal foi realizado por meio de dois testes, teste de observação e teste de retirada, que foram realizados de acordo com os métodos adaptados de Slamberová, Charousová e Pometlová (2005) e Arrati et al., (2006) respectivamente descritos nos itens 2.7.1 e 2.7.2. Além disso, foi realizada a dosagem sérica de ocitocina para comparação com os resultados comportamentais. A avaliação do desenvolvimento e neurotoxicidade dos filhotes foi realizada de acordo com as diretrizes da OECD 426. Ratas Wistar fêmeas foram divididas de forma inteiramente casualizada de modo a formar dois grupos de 20 animais cada. Um grupo recebeu o extrato alcaloídico com o veículo, enquanto, o grupo controle recebeu apenas o veículo por gavagem.

122

As ratas foram tratadas a partir do 6º dia de gestação até o 21o dia pós-natal (PND). O estudo de toxicidade das fêmeas foi conduzido durante todo o período experimental por meio de monitoramento do peso corporal e dos consumos de água e ração. No PND22 as fêmeas foram eutanasiadas e foram coletados sangue, para estudos hematológicos, bioquímicos e dosagem hormonal, e coletadas amostras de órgãos para estudos histopatológicos.

123

3 RESULTADOS

3.1 Efeitos da administração subcrônica de extrato alcaloídico de Psychotria colorata em ratas Wistar

3.1.1 Rendimento do extrato alcaloídico

O rendimento de 1000 g de folha fresca foi de 52,5g de extrato bruto (5,25%) e o extrato alcaloídico apresentou rendimento de 0,03 g (0,3%) a partir de 1 g do EB.

3.1.2 Consumo de ração, água, peso corporal e ganho de peso

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as ratas tratadas com EAL de P. colorata quando comparadas com o grupo controle em relação ao consumo de ração (Figuras 2 e 3), consumo de água (Figuras 4 e 5) peso corporal (Figuras 6 e 7) e ganho de peso (Figuras 8 e 9) na gestação e lactação.

124

40 Controle 35 P. colorata

Consumo de ração (g) ração de Consumo 10

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Dias experimentais

Figura 2. Consumo de ração (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu, Tween 5% a partir do 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

120 Controle 110 P. colorata 100 90 80 70 60 50 40

Consumo de ração (g) ração de Consumo 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 3. Consumo de ração (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante a lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

125

90 Controle 80 P. colorata 70

Consumo de água (mL) água de Consumo 20

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Dias experimentais

Figura 4. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

180 Controle 170 160 P. colorata 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50

Consumo de água (mL) água de Consumo 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais Figura 5. Consumo de água (em mL) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante a lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

126

500 Controle 450 P. colorata

400

350

300

250

200

Peso corporal corporal (g) Peso 150

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Dias experimentais Figura 6. Peso corporal (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% a partir do 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

450 Controle 400 P. colorata

350

300

250

200

150 Peso corporal corporal (g) Peso

100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 7. Peso corporal (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante a lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

127

100

20 Ganho de Peso (g) Peso de Ganho

0 Controle Experimental

Figura 8. Ganho de peso (em gramas) de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5%, entre o 6º dia de gestação até o parto. São apresentadas as médias e erros padrões. p > 0,05, Teste t de student.

10 Ganho de Peso (g) Peso de Ganho

0 Controle Experimental

128

3.1.3 Hematologia, bioquímica sanguínea e ocitocina sérica

Nos parâmetros hematológicos houve linfocitose (grupo controle (GC) = 77,50±1,52; grupo experimental (GE) = 81,60±1,03; p = 0,0289) e neutropenia (GC = 20,83±1,42; GE = 16,75±0,81; p = 0,0149) no grupo tratado com EAL em comparação ao grupo controle Tween 5% (Tabela 1). Na análise bioquímica, foi verificado aumento significativo da concentração sérica de ácido úrico (GC = 1,28±0,09; GE = 2,20±0,25; p = 0,013) e diminuição de proteína total (GC = 5,94±0,16; GE = 5,30 ± 0,11; p = 0,0029) no grupo que recebeu EAL em relação ao grupo controle que recebeu apenas o veículo Tween 5% (Tabela 2). O grupo tratado com EAL apresentou níveis de ocitocina sérica maiores que o grupo controle (GC = 0,094±0,001; GE = 0,124±0,07; p = 0,0060) (Tabela 3).

129

Tabela 1. Hemograma de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Eritrócitos (x 106/µL) 8,67 ± 0,16 8,42 ± 0,13 Leucócitos (x 103/µL) 5,34 ± 0,33 5,03 ± 0,41 HGB (g/dL) 10,88 ± 0,21 11,18 ± 0,26 HCT (%) 41,70 ± 0,60 41,20 ± 0,55 VCM (µm3) 48,27 ± 0,72 49,04 ± 0,63 HCM (pg) 12,64 ± 0,35 13,33 ± 0,34 CHCM (%) 26,18 ± 0,58 27,01 ± 0,58 Linfócitos (%) 77,50 ± 1,52 81,60 ± 1,03* Neutrófilos (%) 20,83 ± 1,42 16,75 ± 0,81* Eosinófilos (%) 1,43 ± 0,20 2,00 ± 0,21 Monócitos (%) 1,00 ± 0,28 1,10 ± 0,19 * p < 0,05, Teste t de student.

Tabela 2. Bioquímica sérica de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Ácido úrico (mg/dL) 1,28 ± 0,09 2,20 ± 0,25* Albumina (g/dL) 3,70 ± 0,05 3,64 ± 0,06 ALT (U/L) 43,61 ± 0,41 44,29 ± 0,55 AST (U/L) 86,70 ± 0,63 86,38 ± 0,66 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,05 ± 0,00 0,05 ± 0,00 Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,03 ± 0,00 0,03 ± 0,01 Bilirrubina total (mg/dL) 0,07 ± 0,00 0,08 ± 0,01 Colesterol (mg/dL) 56,31 ± 2,05 53,82 ± 2,66 Creatinina (mg /dL) 0,83 ± 0,04 0,87 ± 0,05 Glicose (mg/dL) 74,95 ± 3,57 71,10 ± 3,82 Proteína total (g/dL) 5,94 ± 0,16 5,30 ± 0,11* Triglicerídeos (mg/dL) 89,10 ± 2,67 86,26 ± 2,50 Ureia (mg/dL) 54,42 ± 1,57 57,00 ± 1,71 * p < 0,05, Teste t de student.

130

Tabela 3. Concentração sérica de ocitocina de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle Equação da reta Valor de R P. colorata (n=20) (n=20) Ocitocina (ng/mL) 0,094 ± 0,003 Y= -46,557x + 148,45 R2 = 0,9918 0,124 ± 0,07* * p < 0,05, Teste t de student.

131

3.1.4 Peso relativo e avaliação anatomo-histopatológica

Não houve alterações estatisticamente significativas no peso relativo dos órgãos dos animais que receberam o EAL em relação aos animais do grupo controle (Tabela 4). Não foram observadas alterações estruturais dos tecidos avaliados do grupo tratado com EB de P. colorata em relação ao grupo controle na avaliação histopatológica.

132

Tabela 4. Peso relativo dos órgãos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Órgão Controle (n=20) P. colorata (n=20) Adrenais (%) 0,018 ± 0,001 0,017 ± 0,001 Baço (%) 0,292 ± 0,006 0,306 ± 0,010 Encéfalo (%) 0,612 ± 0,007 0,608 ± 0,010 Coração (%) 0,353 ± 0,008 0,358 ± 0,008 Fígado (%) 4,996 ± 0,107 4,967 ± 0,100 Pulmão (%) 0,723 ± 0,038 0,795 ± 0,035 Rins (%) 0,415 ± 0,008 0,395 ± 0,007 Timo (%) 0,124 ± 0,005 0,143 ± 0,018 Útero e ovários (%) 0,226 ± 0,011 0,221 ± 0,009 p > 0,05, Teste t de Student

133

3.1.5 Comportamento materno (Teste de retirada e teste de observação) e campo aberto

Na avaliação do comportamento materno, por meio do teste de retirada, não houve diferença estatisticamente significativa entre o grupo de animais que recebeu o extrato alcaloídico da planta, e o grupo controle que recebeu apenas o veículo, para as latências de recuperação de 1º, 2º e 3º filhotes, agrupamento da ninhada, posição de amamentação, cifose fisiológica e qualidade do ninho (Tabela 5). No teste de observação de atividades maternas e não maternas, as mães tratadas com EAL ficaram mais tempo em posição de amamentação pouco arqueada no 15º dia (GC = 0,25±0,12; GE = 1,45±0,32; p = 0,0120) de lactação no período da manhã e as outras posições de amamentação do teste de observação, como mãe amamentando em posição muito arqueada e de lado ou de costas não diferiram estatisticamente pela administração de EAL em relação ao grupo controle (Figura 10). No parâmetro mãe em repouso do teste de observação as ratas tratadas permaneceram maior tempo em repouso em relação ao grupo controle nos dias 6 (GC = 1,25±0,48; GE = 3,85±0,52; p = 0,0007), 7 (GC = 1,80±0,51; GE = 4,30±0,66; p = 0,0047) e 16 (GC = 2,15±0,45; GE = 4,85±0,70; p = 0,0024) pela manhã e no 14º dia (GC = 2,60±0,61; GE = 5,35±0,47; p = 0,0010) à tarde (Figuras 11 e 12). Nos demais parâmetros de observação de atividades maternas e não maternas, não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos quanto à posição de amamentação mãe dentro do ninho, amamentando muito arqueada, amamentando e limpando filhote, amamentado de costas ou de lado, lambendo filhote, carregando filhote, construindo ninho, comendo ração, bebendo, se coçando, se limpando e farejando com a cabeça erguida (Tabelas 6 e 7). Na avaliação no campo aberto verificou-se diminuição da frequência de locomoção (GC = 131,6±8,36; GE = 108,8±6,05; p = 0,0336) e aumento da imobilidade (GC = 24,35±3,87; GE = 37,74±4,77; p = 0,0355) nos animais tratados com EAL em relação ao grupo controle Tween 5% no 5º dia de lactação (Tabela 8).

134

Tabela 5. Latências em segundos do comportamento materno no teste de retirada, de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Recuperação do 1º filhote 25 ± 3,10 29 ± 3,54 Recuperação do 2º filhote 37 ± 3,18 46 ± 4,19 Recuperação do 3º filhote 50 ± 3,78 59 ± 4,04 Agrupamento 257 ± 31,67 267,32 ± 36,08 Posição de amamentação 427 ± 42,86 456 ± 44,25 Comportamento materno total 749 ± 50,51 801 ± 57,28 Qualidade do ninho 2,60 ±0,18 2,40 ± 0,22 p > 0,05, Teste t de student.

135

10 A Controle P. colorata 8

2 Amamentação em posição arqueada muito posição em Amamentação 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

10 Controle P. colorata 8 B

2 *

Amamentação em posição pouco arqueada pouco posição em Amamentação 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

10 Controle C P. colorata 8

2 Amamentação de lado ou de costas de ou lado de Amamentação

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 10. Frequência de comportamento materno, durante o período da manhã, de mães amamentando em posição muito arqueada (A), pouco arqueada (B) e de lado ou de costas (C) de ratas lactantes que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

136

10 Controle P. colorata 8

6 * * *

4 Mãe em repouso em Mãe

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 11. Frequência de comportamento, durante o período da manhã, de mãe em repouso, de ratas lactantes que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p<0,05, Teste t de student.

10 Controle P. colorata 8

6 *

4 Mãe em repouso em Mãe

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 12. Frequência de comportamento, durante o período da tarde, de mãe em repouso de ratas lactantes que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação. São apresentadas as médias e erros padrão. p<0,05, Teste t de student.

137

Tabela 6. Efeitos da administração do extrato alcaloídico de Psychotria colorata e grupo controle, que recebeu apenas Tween 5% durante a gestação e lactação, no período da manhã, sobre as atividades maternas e não maternas verificadas no teste de observação. São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle P. colorata Atividades maternais Dentro do ninho 6,30±0,20 6,48±0,29 Amamentando e limpando filhote 0,37±0,06 0,28±0,07 Lambendo filhote 0,45±0,08 0,42±0,08 Carregando filhote NA NA Construindo ninho 0,40±0,08 0,25±0,05 Atividades não maternais Comendo ração 1,78±0,15 1,45±0,14 Bebendo 0,69±0,05 0,48±0,06 Se coçando NA NA Se limpando 0,48±0,06 0,38±0,04 Farejando de cabeça erguida 3,50±0,32 3,83±0,32 p>0,05, Teste t de student.

138

Tabela 8. Atividade geral, avaliada no campo aberto no DPN 5, de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Locomoção (frequência) 131,6 ± 8,36 108,8 ± 6,05* Levantar (frequência) 14,2 ± 0,94 13,4 ± 0,68 Imobilidade (segundos) 24,35 ± 3,87 37,74 ± 4,77* Self-grooming (segundos) 10,06 ± 1,81 12,21 ± 2,84 *p < 0,05, Teste t de student.

139

3.1.6 Parâmetros reprodutivos

Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, tratado com extrato alcaloídico de P. colorata e o grupo controle que recebeu apenas o veículo Tween 5% (Tabela 9).

140

Tabela 9. Parâmetros reprodutivos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle, que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Dias de gestação 22,10 ± 0,07 22,15 ± 0,08 Presença de más-formações 0 0 Peso total da ninhada 83,64 ± 3,61 84,16 ± 4,45 Número total de filhotes 11,9 ± 0,62 12,05 ± 0,87 Filhotes machos 5,75 ± 0,43 5,45 ± 0,52 Filhotes fêmeas 6,15 ± 0,46 6,60 ± 0,58 p > 0,05, Teste t de student.

141

3.2 Efeitos sobre filhotes machos de ratas Wistar tratadas com extrato alcaloídico de Psychotria colorata

3.2.1. Peso corporal e ganho de peso

Durante o período experimental não houve morte de animais, e não foram observadas presença de más-formações ou sinais de toxicidade nos filhotes machos de ratas que receberam EAL. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os filhotes machos das ratas tratadas com EAL de P. colorata quando comparadas com o grupo controle em relação ao peso corporal (Figura 13) e ganho de peso (Figura 14).

142

80 Controle 70 P. colorata 60

30 Peso corporal corporal (g) Peso 20

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 13. Peso corporal (em gramas) de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

20 Ganho de Peso (g) Peso de Ganho

0 Controle Experimental

Figura 14. Ganho de peso (em grama) de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

143

3.2.2. Reflexo de endireitamento em superfície e geotaxia negativa

No reflexo de endireitamento em superfície os filhotes machos de ratas tratadas apresentaram latência significativamente maior para realização do teste quando comparado ao grupo controle nos dias pós-natal 3 (GC = 3,31±0,30; GE = 4,73±0,57; p = 0,0336), 6 (GC = 1,59±0,11; GE = 2,01±0,16; p = 0,0360) e 7 (GC = 1,49±0,08; GE = 1,85±0,13; p = 0,0197) (Tabela 10). Na realização do teste de geotaxia negativa não foram observadas diferenças entre os filhotes machos das fêmeas que receberam EAL em relação aos filhotes machos das fêmeas controle (Tabela 11).

144

Tabela 10. Tempo em segundos para a realização do reflexo de endireitamento em superfície de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Dia pós-natal Controle (n=20) P. colorata (n=20) PND2 6,04±0,37 6,92±0,59 PND3 3,31±0,30 4,73±0,57* PND4 3,15±0,37 3,43±0,59 PND5 1,94±0,17 2,31±0,31 PND6 1,59±0,11 2,01±0,16* PND7 1,49±0,08 1,85±0,13* *p < 0,05, Teste t de Student.

Tabela 11. Tempo em segundos para a realização do reflexo de geotaxia negativa de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Dia pós-natal Controle (n=20) P. colorata (n=20) PND7 23,21±1,23 23,35±1,27 PND8 20,35±1,30 20,52±1,25 PND9 17,46±1,13 19,19±1,08 PND10 16,61±0,66 16,03±0,73 PND11 15,13±0,74 14,94±0,78 PND12 12,28±0,64 12,41±0,68 PND13 9,04±0,41 8,25±0,46 PND14 4,97±0,23 5,34±0,22 p > 0,05, Teste t de Student.

145

3.2.3 Desenvolvimento sensório-motor e desenvolvimento físico

No desenvolvimento sensório-motor não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e tratado com EAL (Tabela 12). No desenvolvimento físico da prole, foi observado maior latência para abertura dos olhos (GC = 12,75±0,16; GE = 13,20±0,12; p = 0,0290) dos filhotes machos das mães tratadas em relação ao grupo controle (Tabela 13).

146

Tabela 12. Desenvolvimento sensório-motor de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão

Parâmetros em dias Controle (n=20) P. colorata (n=20) Reflexo de preensão palmar 7,45±0,20 7,65±0,34 Reflexo de sobressalto 12,60±0,11 12,45±0,18 Andar adulto 12,35±0,17 12,40±0,18 p > 0,05, Teste t de Student.

Tabela 13. Parâmetros do desenvolvimento físico de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão.

Parâmetros em dias Controle (n=20) P. colorata (n=20) Aparecimento de pelagem 1,60±0,11 1,80±0,09 Revestimento preliminar de pelos 3,85±0,17 4,10±0,14 Desdobramento de orelha 2,40±0,11 2,65±0,11 Erupção dos dentes incisivos 8,25±0,16 8,10±0,18 Abertura de olhos 12,75±0,16 13,20±0,12* Abertura de canal auditivo 12,90±0,16 13,05±0,11 *p < 0,05, Teste t de Student.

147

3.2.4 Bioquímica sérica, peso relativo dos órgãos e avaliação anatomo- histopatológica

Na bioquímica sérica e peso relativo dos órgãos não houve diferenças estatisticamente significativas entre os filhotes machos das fêmeas tratadas e o grupo dos filhotes machos que recebeu Tween 5% em nenhum dos parâmetros avaliados (Tabelas 14 e 15). Na avaliação histopatológica não foram observadas alterações estruturais dos tecidos avaliados da prole de ratas tratadas com EAL de P. colorata em relação ao grupo controle.

148

Tabela 14. Bioquímica sérica de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Ácido úrico (mg/dL) 1,46 ± 0,09 1,70 ± 0,20 Albumina (g/dL) 2,92 ± 0,05 2,92 ± 0,05 ALT (U/L) 47,16 ± 0,47 47,97 ± 0,54 AST (U/L) 73,29 ± 0,88 75,60 ± 0,76 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,07 ± 0,00 0,07 ± 0,00 Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,03 ± 0,01 0,05 ± 0,01 Bilirrubina total (mg/dL) 0,08 ± 0,01 0,10 ± 0,01 Colesterol (mg/dL) 67,73 ± 1,90 68,44 ± 1,72 Fosfatase alcalina (U/L) 54,47 ± 1,33 57,29 ± 2,00 Glicose (mg/dL) 73,70 ± 2,87 75,74 ± 3,37 Proteína total (g/dL) 4,39 ± 0,06 4,43 ± 0,05 Triglicerídeos (mg/dL) 93,66 ± 2,93 91,98 ± 3,41 Ureia (mg/dL) 60,57 ± 0,73 60,70 ± 0,53 p > 0,05, Teste t de Student

Tabela 15. Peso relativo dos órgãos de filhotes machos de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Órgão Controle (n=20) P. colorata (n=20) Adrenais (%) 0,024 ± 0,001 0,022 ± 0,001 Baço (%) 0,676 ± 0,018 0,718 ± 0,020 Coração (%) 0,540 ± 0,010 0,544 ± 0,008 Encéfalo (%) 2,661 ± 0,070 2,643 ± 0,042 Fígado (%) 4,018 ± 0,061 4,189 ± 0,060 Pulmão (%) 1,563 ± 0,081 1,545 ± 0,114 Rim direito (%) 0,656 ± 0,015 0,685 ± 0,016 Rim esquerdo (%) 0,603 ± 0,011 0,624 ± 0,013 Testículo e epidídimo dir. (%) 0,363 ± 0,012 0,349 ± 0,014 Testículo e epidídimo esq. (%) 0,360 ± 0,013 0,349 ± 0,011 Timo (%) 0,547 ± 0,017 0,534 ± 0,014 p > 0,05, Teste t de Student

149

3.3 Efeitos sobre filhotes fêmeas de ratas Wistar tratadas com extrato alcaloídico de Psychotria colorata

3.3.1 Peso corporal e ganho de peso

Não foram observados sinais de toxicidade e diferenças entre os filhotes fêmeas das ratas tratadas com EAL de P. colorata quando comparadas com os filhotes fêmeas das ratas do grupo controle Tween 5% em relação ao peso corporal (Figura 15), e ganho de peso (Figura 16).

150

80 Controle 70 P. colorata

30 Peso corporal corporal (g) Peso 20

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Dias experimentais

Figura 15. Peso corporal (em gramas) de filhotes fêmeas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de student.

20 Ganho de Peso (g) Peso de Ganho

0 Controle Experimental

Figura 16. Ganho de peso (em grama) de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e o do grupo controle Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. p > 0,05, Teste t de Student.

151

3.3.2. Reflexo de endireitamento em superfície e geotaxia negativa

Houve latência signigicativamente maior para realização do reflexo de endireitamento em superfície nos filhotes fêmeas de ratas tratadas quando comparado ao grupo controle apenas no dia pós-natal 5 (GC = 2,17±0,18; GE = 2,78±0,22; p = 0,0387) (Tabela 16). No teste de geotaxia negativa foi observado aumento de latência nos filhotes fêmeas do grupo experimental no PND7 (GC = 18,62±1,09; GE = 22,50±1,17; p = 0,0205) em relação ao grupo controle (Tabela 17).

152

Tabela 17. Tempo em segundos para a realização do reflexo de geotaxia negativa de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Dia pós-natal Controle (n=20) P. colorata (n=20) PND7 18,62±1,09 22,50±1,17* PND8 18,54±1,02 18,85±1,42 PND9 16,07±0,96 16,64±0,86 PND10 14,99±0,63 14,38±0,71 PND11 13,20±0,66 13,51±0,75 PND12 11,80±0,63 12,52±0,75 PND13 6,76±0,48 7,06±0,60 PND14 3,72±0,43 3,78±0,47 *p < 0,05, Teste t de Student.

153

3.3 Desenvolvimento sensório-motor e desenvolvimento físico

No desenvolvimento sensório-motor não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e tratado com EAL nos parâmetros avaliados (Tabela 18). Na avaliação do desenvolvimento físico, a erupção dos dentes incisivos foi precoce (GC = 8,55±0,17; GE = 7,80±0,24; p = 0,0139) nos filhotes fêmeas das ratas que receberam o EAL em relação ao grupo controle Tween 5% (Tabela 19).

154

Tabela 18. Desenvolvimento sensório-motor de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros em dias Controle (n=20) P. colorata (n=20) Reflexo de preensão palmar 7,25±0,14 7,90±0,37 Reflexo de sobressalto 12,55±0,11 12,40±0,15 Andar adulto 12,35±0,24 12,30±0,21 p > 0,05, Teste t de Student.

Tabela 19. Parâmetros do desenvolvimento físico de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Aparecimento de pelagem 1,30±0,11 1,40±0,11 Revestimento preliminar de pelos 3,65±0,17 3,80±0,19 Desdobramento de orelha 2,35±0,11 2,40±0,11 Erupção dos dentes incisivos 8,55±0,17 7,80±0,24* Abertura de olhos 13,15±0,15 13,00±0,10 Abertura de canal auditivo 12,70±0,15 12,75±0,16

*p < 0,05, Teste t de Student.

155

3.3.4 Bioquímica sérica, peso relativo dos órgãos e avaliação anatomo- histopatológica

Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de filhotes fêmeas de ratas tratadas e do grupo controle Tween 5% na bioquímica sérica e peso relativo dos órgãos (Tabelas 20 e 21). Na avaliação anatomo-histopatológica os filhotes de mães tratadas com EAL não napresentaram alterações estruturais dos tecidos avaliados em relação ao grupo controle.

156

Tabela 20. Bioquímica sérica de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Parâmetros Controle (n=20) P. colorata (n=20) Ácido úrico (mg/dL) 1,44 ± 0,10 1,47 ± 0,12 Albumina (g/dL) 3,03 ± 0,06 3,04 ± 0,08 ALT (U/L) 48,20 ± 0,67 49,13 ± 0,76 AST (U/L) 77,87 ± 0,80 79,59 ± 0,84 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,08 ± 0,00 0,07 ± 0,00 Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,05 ± 0,01 0,07 ± 0,01 Bilirrubina total (mg/dL) 0,11 ± 0,01 0,13 ± 0,01 Colesterol (mg/dL) 69,89 ± 1,81 69,78 ± 1,74 Fosfatase alcalina (U/L) 52,06 ± 1,16 51,99 ± 2,12 Glicose (mg/dL) 77,99 ± 2,42 80,89 ± 3,29 Proteína total (g/dL) 4,41 ± 0,06 4,39 ± 0,06 Triglicerídeos (mg/dL) 105,92 ± 2,18 103,66 ± 2,96 Ureia (mg/dL) 61,17 ± 0,71 60,11 ± 0,47 p > 0,05, Teste t de Student

Tabela 21. Peso relativo dos órgãos de filhotes fêmeas de ratas que receberam extrato alcaloídico de P. colorata e do grupo controle que recebeu Tween 5% durante o período de pós implantação até o pós natal (DPN 21). São apresentadas as médias e erros padrão. Órgão Controle (n=20) P. colorata (n=20) Adrenais (%) 0,024 ± 0,001 0,025 ± 0,001 Baço (%) 0,694 ± 0,023 0,693 ± 0,021 Coração (%) 0,535 ± 0,014 0,550 ± 0,016 Encéfalo (%) 2,711 ± 0,059 2,645 ± 0,085 Fígado (%) 4,070 ± 0,059 4,006 ± 0,056 Pulmão (%) 1,665 ± 0,105 1,674 ± 0,075 Rim direito (%) 0,696 ± 0,018 0,692 ± 0,013 Rim esquerdo (%) 0,651 ± 0,017 0,636 ± 0,012 Timo (%) 0,583 ± 0,013 0,555 ± 0,014 Útero e ovários (%) 0,213 ± 0,015 0,233 ± 0,019 p > 0,05 Teste t de Student

157

4 DISCUSSÃO

O extrato alcaloídico de Psychotria colorata promoveu diminuição de neutrófilos e aumento de linfócitos nas ratas tratadas em relação ao grupo controle. Esses achados podem ser atribuídos à ação do alcaloide hodgkinsina presente na planta, uma vez que este possui estrutura e atividade semelhante à morfina com ligação em receptores opioides (AMADOR et al., 2000). Substâncias opioides podem atuar como imunossupressores e alterar a atividade dos leucócitos, incluindo a inibição da quimiotaxia de neutrófilos (GRIMM et al., 1998; CLARK, 2007; ROY et al., 2011; VALLEJO; LEON-CASASOLA; BENYAMIN, 2004). Roedores tratados com morfina apresentaram redução da infiltração de neutrófilos em tecido peri-incisionado verificado pela redução da atividade da enzima mieloperoxidase e por meio da diminuição na contagem de neutrófilos dos animais tratados, avaliado na imunohistoquímica (CLARK, 2007). Por outro lado, a morfina também apresenta atividade imunoestimulante (DINDA; GITMAN; SINGHAL, 2005). Em estudo com Uncaria tomentosa, planta da mesma família da P. colorata, foi observado atividade imunoestimulante atribuída aos alcaloides do extrato da planta pela estimulação das células endoteliais a liberarem fatores que estimulam a proliferação de linfócitos B e T (WURM et al., 1998; KEPLINGER et al., 1999). Na análise bioquímica, foi observado aumento de ácido úrico e diminuição de proteínas totais nas ratas tratadas com o extrato alcaloídico de P. colorata. A determinação da concentração de ácido úrico reflete o catabolismo de ribonucleotídeos purínicos (FANG; ALDERMAN, 2000), sugerindo que os alcaloides da planta podem estar relacionados com o aumento da concentração sérica de ácido úrico, pois estudo com a morfina demonstrou aumento de ácido úrico em ratos pelo aumento da atividade das enzimas xantina oxidase e adenosina deaminase, enzimas-chave no catabolismo das purinas que tem como produto final o ácido úrico (LIU et., 2007). A redução da proteína total sérica está associada com menor concentração de albumina e/ou globulinas (THRALL et al., 2006). No presente trabalho não houve diferença significativa de albumina nas ratas tratadas com EAL, quando comparado ao grupo controle. A dosagem sérica de globulina não foi

158 realizada, mas possivelmente pode ter influenciado a redução da proteína total por ação dos alcaloides da planta. O teste de campo aberto foi realizado para medir a atividade motora, hiperatividade e comportamentos exploratórios (STANFORD, 2007). No presente trabalho as ratas que receberam o extrato alcaloídico de P. colorata apresentaram diminuição na frequência de locomoção e aumento da imobilidade em relação ao grupo controle. Apesar do antagonista NMDA MK-801 estimular a atividade locomotora (COOK, 2004), os opioides são relatados por promoverem efeitos tanto estimulatórios como inibitórios sobre a locomoção, dependendo da dose e intervalo de administração (SZÉKELY et al., 1980; RODRIGUES-ARIAS et al., 2000). O efeito inibitório dos opioides sobre o sistema nervoso central diminui a atividade motora. De fato, camundongos tratados com morfina via intraperitoneal apresentaram diminuição da frequência locomotora e aumento da imobilidade na dose de 10mg/Kg (PATTI et al., 2005). Assim, é possível que o alcaloide hodgkinsina desta planta, ao atuar sobre os receptores opioidérgicos presentes no cérebro, pode ter causado uma diminuição da atividade motora das ratas, levando a diminuição na frequência de locomoção e aumento da imobilidade das fêmeas tratadas em relação ao grupo controle. As funções cerebrais maternas, que controlam ações relacionadas ao cuidado materno, são modificadas durante e no final da gestação por alterações hormonais incluindo o aumento de ocitocina (NUMAN, 2006). A ocitocina é um neuro-hormônio sintetizado nos núcleos supra-óptico e paraventricular do hipotálamo (LANDGRAF; NEUMANN, 2004; BOSCH; NEUMANN, 2012) exercendo efeitos estimulatórios sobre os cuidados maternos, agressão materna e diminuição da ansiedade no pós- parto. Durante o período periparto ocorre aumento de expressão do receptor de ocitocina nas células contráteis mamárias e em várias regiões do cérebro, incluindo o septo lateral, área pré-óptica medial, núcleo central da amígdala, núcleo ventro medial do hipotálamo, núcleo accumbens, bulbo olfatório, núcleo paraventricular, bed núcleo leito da estria terminal e área tegmental ventral (PEDERSEN et al., 1994; CAUGHEY et al., 2011) Área tegmental ventral e núcleo accumbens fazem parte do sistema de recompensa cerebral (ESPERIDIÃO-ANTÔNIO et al, 2008). Aumento da expressão de ocitocina nestas áreas pode aumentar a liberação de dopamina, aumentando a sensação de prazer da mãe ao cuidar do filhote (LECKMANN, 2011).

159

A ocitocina melhora os cuidados maternais (BOSCH; NEUMANN, 2012), com aumento na duração do comportamento de lamber os filhotes e cifose em ratas, além de promover diminuição da ansiedade maternal (FRANCIS; CHAMPAGNE; MEANEY, 2000; GIMPL; ANDFAHRENHOLZ, 2001; FEBO et al., 2009). No presente estudo, no teste de observação do comportamento materno, nas atividades não maternais, foi observada diferença significativa quando as fêmeas experimentais estavam em repouso em relação ao grupo controle, sugerindo uma ação da ocitocina na diminuição da ansiedade materna. Em estudo com a infusão bilateral de um antagonista do receptor de ocitocina na região pré-límbica do córtex pré-frontal medial, foi observado aumento do comportamento de ansiedade em ratas no pós-parto (SABIHI et al., 2014) Semelhantemente, foi demonstrado que o antagonista do receptor de ocitocina promoveu aumento do comportamento de ansiedade e comprometimento no cuidado materno de ratas no pós parto (BOCCIA; PEDERSEN, 2001). Nossos resultados mostraram uma maior concentração sérica de ocitocina no grupo de ratas tratadas com extrato alcaloídico, comparadas às ratas do grupo controle, e na avaliação do comportamento materno, no teste de observação, verificou-se que as mães do grupo experimental permaneceram por mais tempo na posição de amamentação pouco arqueada, em um dia em relação às ratas do grupo controle. A produção de ocitocina bem como o aumento do número de seus receptores pode ser estimulada por fitoestrógenos em receptores de estrógeno REα no cérebro, localizados no núcleo hipotalâmico ventromedial, núcleos ventrolaterais talâmicos e núcleos amígdaloides laterais, e em receptores REβ, nos núcleos olfatórios anteriores, córtices cerebrais e piriformes e no hipocampo (SHUGHRUE; LANE; MERCHANTHALER, 1997). Além disso, estudo com implante de estrógeno na área pré-óptica medial melhorou o comportamento materno em ratas, por reduzir as latências para recuperação de filhotes (NUMAN, 1994). Assim, sugere-se que os alcaloides quinolínicos de P. colorata possam ter agido como fitoestrógenos, pois em estudo in vitro foi verificado que essa classe de alcaloides pode apresentar atividade estrogênica (NAZRULLAEV, BESSONOVA; AKHMEDKHODZHAEVA, 2001) e dessa forma ter contribuído para o aumento da concentração sérica de ocitocina nas ratas tratadas com EAL. Sabe-se que a

160 ocitocina melhora os cuidados maternais (BOSCH; NEUMANN, 2012). Portanto, a ocitocina pode ter atuado na melhora do comportamento materno, na posição de amamentação pouco arqueada, e ter atenuado os possíveis efeitos inibitórios do alcaloide semelhante à morfina, hodgkinsina, sobre os cuidados maternais. A exposição perinatal ao extrato alcaloídico das folhas de P. colorata resultou em alterações no desenvolvimento físico da prole, evidenciadas pelo aumento da latência para abertura de olhos em filhotes machos e erupção precoce dos dentes incisivos nos filhotes fêmeas. A avaliação do desenvolvimento físico em filhotes é importante, pois uma disfunção nesse processo pode acarretar aumento de mortalidade e insucesso no crescimento ou na reprodução (BROOM; JOHNSON, 1993). Alterações no desenvolvimento antes do desmame, como por exemplo, desdobramento da orelha, abertura dos olhos e erupção do dente incisivo, estão altamente correlacionados com o peso corporal. Sendo esse último o melhor indicador de desenvolvimento físico (CONOLLY; BECK; GOODMAN, 1999). No presente trabalho, não houve alteração no peso corporal dos filhotes, e as alterações de aumento de latência, em um dia para abertura de olhos nos machos, e menor latência também de um dia para erupção do dente incisivo nas fêmeas nos grupos das ratas tratadas com extrato alcaloídico foram pontuais e estavam dentro do período indicado para o desenvolvimento de cada parâmetro, de acordo com Zbinden (1981) e Oliveira (2011), quanto aos dias de abertura dos olhos que inicia no 10º dia de lactação e erupção dos dentes incisivos que inicia no 7º dia de lactação. Assim, a pequena variação de maior ou menor latência observada pode não ter significado biológico. Na avaliação sensório-motor da prole houve aumento da latência do reflexo de endireitamento em filhotes machos e fêmeas e maior tempo na realização do reflexo de geotaxia negativa nas fêmeas experimentais comparados às fêmeas do grupo controle. O reflexo de endireitamento, geotaxia negativa e andar adulto em filhotes de ratos ocorrem pela ação do desenvolvimento motor e requer integridade do sistema vestibular, bem como do cerebelo (ALTMAN; SUDARSHAN, 1975; CHIAVEGATTO; OLIVEIRA; BERNARDI, 1997). Estudos sugerem que os neurônios gabaérgicos e a sinalização gabaérgica são especialmente importantes para o desenvolvimento do cérebro (HENSCH; STRYKER, 2004; AKERMAN; CLINE, 2007) e qualquer interferência nesse sistema

161 pode levar a disfunção na maturação cerebral. Estudo com filhotes de ratas tratadas com fipronil, um antagonista gabaérgico, na dose de 0,1mg/Kg apresentou atraso na realização do teste de geotaxia negativa, sugerindo que o fipronil interferiu com o sistema GABAérgico dos filhotes durante a vida intrauterina e afetou os mecanismos neurais responsáveis pela adequada maturação cerebral (UDO et al., 2014). Os alcaloides calicantina e isocalicantina presentes nas folhas de P. colorata possuem atividade inibitória sobre o GABA (CHEBIB et al., 2003) e possivelmente podem ter retardado a maturação cerebral dos filhotes das ratas tratadas com EAL da planta por esta via. Assim, conclui-se que a administração subcrônica do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata pode promover toxicidade materna, causar alterações hematológicas, bioquímicas e na concentração sérica de ocitocina. Além de alterar o cuidado materno e a atividade no campo aberto, bem como promover atraso no desenvolvimento motor da prole de ratas Wistar.

162

CONCLUSÃO

 A administração do EB das folhas de P. colorata durante o período de organogênese e desenvolvimento fetal resultou em efeitos tóxicos sobre parâmetros hematológicos e bioquímicos das mães tratadas e sobre o desenvolvimento fetal das proles.

 Os compostos ativos do extrato acetático das folhas P. colorata promoveram toxicidade geral e efeitos deletérios sobre a morfologia e morfometria da placenta de ratas Wistar.

 A administração subcrônica do extrato alcaloídico das folhas de P. colorata pode promover toxicidade materna, efeitos tóxicos sobre parâmetros hematológicos, bioquímicos e na concentração sérica de ocitocina. Além de alterar o cuidado materno e a atividade no campo aberto, bem como promover atraso no desenvolvimento motor da prole de ratas Wistar.

163

5 REFERÊNCIAS

AKERMAN, C. J.; CLINE, H. T. Refining the roles of GABAergic signaling during neural circuit formation. Trends in Neurosciences, v. 30, p. 382–389, 2007.

ALTMAN, J.; SUDARSHAN, K. Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Animal Behavior, v. 23, n. 4, p. 896–920, 1975.

AMADOR, T. A.; VEROTTA, L.; NUNES, D. S.; ELISABETSKY, E. Antinociceptive profile of Hodgkinsine, Planta Medica Letters,v. 66. p.1–3, 2000.

AMADOR, T.A.; VEROTTA, L.; NUNES D.S.; ELISABETSKY, E. Involvement of NMDA receptors in the analgesic properties of psychotridine.Phytomedicine, v.8, p. 202-206, 2001.

ARRATI, P.; CARMONA, C.; DOMINGUEZ, G.; BEYER, C.; ROSENBLATT, J. GABA receptor agonists in the medial preoptic area and maternal behavior in lactating rats. Physiology and Behavior, v.87, p.51- 65, 2006.

BENEVIDES, P.J.C.; YOUNG, M.C.M.; BOLZANI, V.D. Biological activities of constituents from Psychotria spectabilis.Pharmaceutical Biology, v. 42, n.8, p. 565- 569, 2005.

BOCCIA, M. L.; PEDERSEN, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology, v. 26, n. 7, p. 657-672, 2001.

BOSCH, O. J.; NEUMANN, I. D. Both oxytocin and vasopressin are mediators of maternal care and aggression in rodents: from central release to sites of action. Hormones and Behavior, v. 61, n. 3, p. 293-303, 2012.

BRIDGES, R. S.Biochemical basis of parental behavior in the rat. Advances in the Study of Behavior, v. 25, p. 215-242, 1996.

BRIDGES, R. S.; GRIMM, C. T. Reversal of morphine disruption of maternal behavior by concurrent treatment with the opiate antagonist naloxone, Science, v. 218, p. 166-168, 1982.

164

BROOM, D. M.; JOHNSON, K. G. Stress and animal welfare. London: Chapman & Hall, 211p, 1993.

CAUGHEY, S. D.; KLAMPFL, S. M. ;BISHOP, V. R.; PFOERTSCH, J.; NEUMANN, I. D.; BOSCH, O. J.; MEDDLE, S. L. Changes in the intensity of maternal aggression and central oxytocin and vasopressin V1a receptors across the peripartum period in the rat. Journal of Neuroendocrinology, v. 23, p. 1113-1124, 2011.

CHEBIB, M.; DUKE, R. K.; DUKE, C. C.; KONNOR, M.; MEWETT, K. N.; JOHNSTON, G. A. R. Convulsant actions of calycanthine. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 190, p. 58-64, 2003.

CHIAVEGATTO, S.; OLIVEIRA, C. A.; BERNARDI, M. M. Prenatal exposure of rats to diphenhydramine: effects on physical development, open field, and gonadal hormone levels in adults. Neurotoxicology and teratology, v. 19, p. 511-516, 1997.

CLARK, J.D.; SHI X, LI X.; QIAO, Y.; LIANG, D.; ANGST, M.S.; YEOMANS, D.C. Morphine reduces local cytokine expression and neutrophil infiltration after incision. Molecular Pain, v. 3, n. 28, p. 1-12, 2007.

CONOLLY, R.B., BECK, B.D., GOODMAN, J.I. Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicological Sciences, v. 49,p. 1-4, 1999.

COSTA, A.M.D.; MARIANO-SOUZA, D.P.; CAVALCANTE, T, V., ARAÚJO, V. L.; RAMOS,A.T.; MARUO, V.M. Plantas tóxicas de interesse pecuário em região de ecótono Amazônia eCerrado. Parte II: Araguaína, norte do Tocantins. Acta VeterinariaBrasilica, v.5, p.317-324, 2011.

CUMMINGS, J. A.; CLEMENS, L. G.; NUNEZ, A. A. Mother counts: how effects of environmental contaminants on maternal care could affect the offspring and future generations. Frontiers in Neuroendocrinology, v. 31, p. 440-451, 2010.

DINDA, A.; GITMAN, M.; SINGHAL, P. C. Immunomodulatory effect of morphine: therapeutic implications. Expert Opinion on Drug Safety, v. 4, n. 4, p. 669-675, 2005.

ELISABETSKY, E.; AMADOR, T.A.; ALBUQUERQUE, R.R.; NUNES, D.S.; CARVALHO, A.C.T. Analgesic activity of Psychotria colorata (Willd. Ex R. & S.)Muell.Arg. Alkaloids.Journal of Ethnopharmacology.V.48, p.77-83, 1995.

165

ESPERIDIÃO-ANTONIO, V.; MAJESKI-COLOMBO, M.; TOLEDO-MONTEVERDE, D.; MORAES-MARTINS, G.; FERNANDES, J. J.; ASSIS, M. B.; SIQUEIRA- BATISTA, R. Neurobiologia das emoções. Revista de Psiquiatria Clínica, v. 35, n. 2, p. 55-65, 2008.

FANG, J.; ALDERMAN, M. H. Serum uric acid and cardiovascular mortality the NHAES I epidemiologic follow-up study, 1971-1992.National Health and Nutrition Examination Survey.The Journal of the American Medical Association. v. 283, n. 18, p. 2404-2410, 2000.

FEBO, M.; SHIELDS, J.; FERRIS, C. F.; KING, J. A. Oxytocin modulates unconditioned fear response in lactating dams: an fMRI study. Brain Research, v. 1302, p. 183-193, 2009.

FELICIO, L. F.; MANN, P. E.; BRIDGES, R. S. Intracerebroventricular cholecystokin in infusions block beta-endorphin-induced disruption of maternal behavior. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 39, p. 201-204, 1991.

FODOR, A.; TÍMÁR, J.; ZELENA, D. Behavioral effects of perinatal opioid exposure. Life Sciences, v. 104, p. 1-8, 2014.

FRANCIS, D.D.; CHAMPAGNE, F.C.; MEANEY, M.J. Variations in maternal behaviour are associated with differences in oxytocin receptor levels in the rat. Journal of Neuroendocrinology, v. 12, p. 1145-1148, 2000.

GIMPL, G.; FAHRENHOLZ, F.The oxytocin receptor system: structure, function and regulation. Physiological Reviews, v.81, p. 629-683, 2001.

GIORDANO, A. L; SIEGEL, H. I.; ROSENBLATT, J. S.Nuclear estrogen receptor binding in the preoptic area and hypothalamus of pregnancyterminated rats: correlation with the onset of maternal behavior.Neuroendocrinology, v. 50, p. 248- 258, 1989.

GRIMM, M.C.; BEN-BARUCH, A.; TAUB, D.D.; HOWARD, O.M.; WANG, J.M.; OPPENHEIM, J.J. Opiate inhibition of chemokine-induced chemotaxis. Annals of the New York Academy of Sciences. v. 840, p. 9-20,1998.

166

HENSCH, T.K.; STRYKER, M.P. Columnar architecture sculpted by GABA circuits in developing cat visual cortex. Science,v. 303, p.1678–1681, 2004.

KEPLINGER, K.; LAUS, G.; WURM, M.; DIERICH, M.P.; TEPPNER, H. Uncaria tomentosa (Willd.) DC. – ethnomedicinal use and new pharmacological, toxicological and botanical results. Journal Ethnopharmacology, 64: 23-34, 1999.

LANDGRAF, R.; NEUMANN, I. D. Vasopressin and oxytocin release within the brain: a dynamics concept of multiple and variable modes of neuropeptide communication. Frontiers in Neuroendocrinology,v. 25, p. 150-176, 2004.

LECKMAN, J. F. Variations in maternal behavior – Oxytocin and reward pathways – Peripheral measures matter?!. Neuropsychopharmacology, v. 36, p. 2587-2588, 2011.

LIU, C.; LIU, J-K.;KAN, M-J.GAO, L.;FU, H-Y,; ZHOU, H.; HONG, M.. Morphine enhances purine nucleotide catabolism in vivo and in vitro. Acta Pharmacologica Sinica, v. 28, n. 8, p. 1105-1115, 2007.

LIU, L.; SONG, C-H.; KHAN, A.; LI, X-N.; YANG, X-W.; CHENG, G-G.; LIU, Y-P.; LUO, X-D. A potent antibacterial índole alkaloid from Psychotria pilifera. Journal of Asian Natural Products Research, v. 18, n. 8, p. 798-803, 2016.

LORENZI, T. F. Manual de Hematologia – Propedêutica e Clínica, 4th edition. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2006.

MACEDO, A. F.; OSHIIWA, M.; GUARIDO, C. F. Ocorrência do uso de plantas medicinais por moradores de um bairro do município de Marília-SP. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, Araraquara, v. 28, n. 1, p.123-128, 2007.

MATTSON, B. J.; WILLIAMS, S.; ROSENBLATT, J. S.; MORRELL, J. I. Compararison of two positive reinforcing stimuli: pups and cocaine throughout the postpartum period. Behavioral Neuroscience, v. 115, p.683-694, 2001.

MEYER, MARJORIE. The perils of opioid prescribing during pregnancy.Obstetrics & Gynecology Clinics of North America, v. 41, p. 297-306, 2014.

167

NARKOWICZ, S.; PŁOTKA, J.; POLKOWSKA, Z.; BIZIUK, M.; NAMIEŚNIK, J. Prenatal exposure to substance of abuse: A worldwide problem. Environment International, v. 54, p.141–163, 2013.

NAZRULLAEV, S.S.; BESSONOVA, I.A.; AKHMEDKHODZAEVA, K.H.S. Estrogenic activity as a function of chemical structure in Haplophyllum quinoline alkaloids.Chemistry of Natural Compounds, v. 37: 551–555, 2001.

NUMAN, M. Hypothalamic neural circuits regulating maternal responsiveness towards infants.Behavioral and Cognitive Neuroscience Review, v. 5, n. 4, p. 163- 190, 2006.

NUMAN, M. Maternal behavior In: Knobil, E.; Neill, J. D., eds. The physiology of reproduction, 2nd ed. New York: Raven Press, p. 221-302, 1994.

NUMAN, M.; STOLZENBERG, D. S. Medial preoptic área interactions with dopamine neural systems in the control of the onset and maintenance of maternal behavior in rats. Frontiers in Neuroendocrinology, v. 30, p. 46-64, 2009.

OECD Guideline for testing of chemicals: Developmental Neurotoxicity Study 426. Paris: Organization for Economic Co-operation and Development, 2007.

OLIVEIRA, C. D. R.; MOREIRA, C. Q.; SPINOSA, H. S.; YONAMINE, M. Neurobehavioral, reflexological and physical development of Wistar rat offspring exposed to ayahuasca during pregnancy and lactation. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 21, n. 6, p. 1065-1076, 2011.

PATTI, C. L.; FRUSSA-FILHO,R.; SILVA, R. H.; CARVALHO, R. C.; KAMEDA,S. R., TAKATSU-COLEMAN, A. L.; CUNHA, J. L.S.; ABÍLIO, V. C. Behavioral characterization of morphine effects on motor activity in mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 81, p. 923-927, 2005.

PEDERSEN, C. A. Oxytocin control of maternal behavior. Regulation by sex steroids and offspring stimuli. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 807, p. 126-145, 1997.

PEDERSEN, C. A.; CALDWELL, J. D.; WALKER, C.; AYERS,G.; MASON, G. A. Oxytocin activates the postpartum on set of rat maternal behavior in the ventral tegmental and medial preoptic areas. Behavioral Neuroscience, v. 108, p. 1163- 1171, 1994.

168

PINTO, S. M.; DODD, S.; WALKINSHAW, S. A.; SINEY, C.; KAKKAR, P.; MOUSA, H. A. Substance abuse during pregnancy: effect on pregnancy outcomes. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, v. 150, p. 137-141, 2010.

RODRIGUES-ARIAS, M.; BROSETA, I.; AGUILAR, M.A.; MIÑARRO, J. Lack of specifc effects of selective D1 and D2 dopamine antagonist vs Risperidone on morphine-induced hyperactivity. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 66, n. 6, p. 189-197,2000.

ROY S., NINKOVIC J., BANERJEE S., CHARBONEAU R.G., DAS S., DUTTA R., KIRCHNER V.A., KOODIE L., MA J., MENG J., BARKE R.A. Opioid drug abuse and modulation of immune function: consequences in the susceptibility to opportunistic infections. Journal of Neuroimmune Pharmacology, v. 6, p. 442–465, 2011.

SABIHI, S.; DONG, S. M.; DUROSKO, N. E.; LEUNER, B. Oxytocin in the medial prefrontal cortex regulates maternal care, maternal aggression and anxiety during the postpartum period. Behavioral Neuroscience, v. 8, n. 258, p. 1-11, 2014.

SHUGHRUE, P. J.; LANE, M. V. ; MERCHANTHALER, I. Comparative distribution of estrogen receptors a & b mRNA in the rat central nervous system. Journal of Comparative Neurology, v. 388, p. 507- 525, 1997.

SILVA, D. M.; RIET-CORREA, F.; MEDEIROS, R.M.T. OLIVEIRA, O.F Plantas tóxicas para ruminantes e eqüídeos no Seridó Ocidental e Oriental do Rio Grande do Norte. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.26, n. 4, p. 223-236, 2006.

SLAMBEROVÁ, R.; CHAROUSOVÁ, P.; POMETLOVÁ, M. Maternal behavior is impaired by methamphetamine administered during pre-mating, gestation and lactation. Reproductive Toxicology, v. 20, p. 103–110, 2005.

STANFORD, S. C. The open field test: reinventing the wheel. Journal of Psychopharmacology, v. 21, n. 2, p. 134-135, 2007.

SZE´KELY, J. I.; MIGLECZ, E. R.O.; NAI, A.Z. Biphasic effects effects of a potente analogue (D-Met2Pro5)-enkephalinamide and morphine on locomotor activity in mice. Psychopharmacology (Berlin), v. 71, p. 299– 301, 1980.

169

TAYLOR, C.M.; CAMPOS, M.T.V.A.; ZAPPI, D. Flora da reserva Ducke, Amazonas, Brasil: Rubiaceae. Rodriguésia, v. 58, p. 549-616. 2007.

THOMPSON, A. C.; KRISTAL, M. B. Opioid stimulation in the ventral tegmental area facilitates the onset of maternal behavior in rats. Brain Research, v. 743, p. 184-201, 1996.

THRALL, M. A.; BAKER, D. C.; CAMPBELL, T. W.; DENICOLA, D.; FETTMAN, M. J.; LASSEN, E. D.; REBAR, A.; WEISER, G. Avaliação laboratorial das proteínas do plasma e do soro sanguíneo. In: Hematologia e Bioquímica Clínica Veterinária, São Paulo: Roca, cap. 26, p. 376-390, 2006.

UDO, M. S. B.; SANDINI, T. M.; REIS, T. M.; BERNARDI, M. M.; SPINOSA, H. S. Prenatal exposure to a low fipronil dose disturbs maternal behavior and reflex development in rats. Neurotoxicology and Teratology, v. 45, p. 27-33, 2014.

UNGER, A.; METZ, V.; FISCHER, G. Opioid Dependent and Pregnant: What Are the Best Options for Mothers and Neonates?. Obstetrics and Gynecology International, p. 1-6, 2012.

VALLEJO, R.; LEON-CASASOLA, O.; BENYAMIN, R. Opioid therapy and immunosuppression: a review. American Journal of Therapeutics, v. 11, n. 5, p. 354-365, 2004.

VASCONCELOS, R. G., KLEIN, M. O., CRUZ, A. M., FELICIO, L. F. Dynamics of mother-pup interactions: tradeoff between environment and physiology. Psychology and Neuroscience, v. 5, p. 215-219, 2012.

VEROTTA, L.; PILATI, T.; TATÒ, M.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. Pyrrolidinoindoline alkaloids from Psychotria colorata.Journal of Natural Products, v.61, p.392-396, 1998.

VEROTTA, L.; PETERLONGO, F.; ELISABETSKY, E.; AMADOR, T. A.; NUNES, D. S. High-performance liquid chromatography-diode array detection-tandem mass espectrometry analyses of the alkaloid extracts of Amazon Psychotria species. Journal of Chromatography, v. 41, p. 165-176, 1999.

VEROTTA, L.; ORSINI, F.; SBACCHI, M.; SCHEILDLER, M. A.AMADOR, T. A.; ELISABETSKY, E. Synthesis and Antinociceptive Activity of Chimonanthines and Pyrrolidinoindoline-Type Alkaloids.Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.10, p. 2133–2142, 2002.

170

WURM, M.; KACANI, L.; LAUS, G.; KEPLINGER, K.; DIERICH, M. P. Pentacyclic oxindole alkaloids from Uncaria tomentosa induce human endothelial cells to release a lymphocyte-proliferation-regulating factor. Planta Medica, v. 64, n. 8, p. 701-704, 1998.

ZBINDEN, G. Experimental methods in behavioral teratology. Archives of Toxicology, v. 48, p. 69-88, 1981.

ZIMBERKNOPF, E.; XAVIER, G. F.; KINSLEY, C. H.; FELICIO, L .F. Prior parity positively regulates learning and memory in young and middle-aged rats. Comparative Medicine, v. 61, n. 4, p. 366-3 77, 2011.