FACULDADE MARIA MILZA
BACHARELADO EM FARMÁCIA
SILVANA CARLA VIEIRA DE ARAGÃO
TRIAGEM FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DE Iresine herbstii
GOVERNADOR MANGABEIRA-BA 2017
SILVANA CARLA VIEIRA DE ARAGÃO
TRIAGEM FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DE Iresine herbstii
Monografia apresentada ao Curso de Bacharelado em Farmácia da Faculdade Maria Milza, como requisito para aquisição do título de Bacharel em Farmácia.
Orientadora: Profª. Larissa de Mattos Oliveira Coorientadora: Profª. MSc. Carine Raisa Barbosa de Andrade
GOVERNADOR MANGABEIRA-BA 2017
Dados Internacionais de Catalogação
Aragão, Silvana Carla Vieira de A659t Triagem fitoquímica e avaliação da toxicidade do extrato bruto das folhas de Iresine herbstii / Silvana Carla Vieira de Aragão. – Governador Mangabeira – Ba, 2017.
51 f.
Orientadora: Profa. Larissa de Mattos Oliveira Coorientadora: Profa. Ma. Carine Raisa Barbosa de Andrade
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Faculdade Maria Milza, 2017.
1. Plantas Medicinais. 2. Compostos Bioativos. 3. Iresine herbstii. I. Oliveira, Larissa de Mattos. II. Andrade, Carine Raisa Barbosa de. III. Título.
CDD 633.88
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me proteger, me dar forças, me orientar nas horas mais difíceis, gratidão sempre!
Aos meus pais, Antonio Aragão e Raimunda Aragão, por todo amor, compreensão e dedicação. Obrigada por ter me ensinado os valores e formação moral, por estarem sempre ao meu lado nos momentos que mais precisei. Amo vocês!
A minha filha Fernanda, amor e razão da minha vida, por ela fui sempre forte e capaz de enfrentar qualquer dificuldade e obstáculo na vida. Te amo filha!
Aos meus sobrinhos e afilhadas, Lanna e Luany, Diego, Pepeu e Neto, pelo carinho e muito amor recebido. Amo todos
A meus irmãos, Selma, Simone e Junior, pelo carinho, amor e paciência. Amo muito vocês!
Às minhas tias Valdelice e Olindina, por toda dedicação e amor recebido. Amo vocês!
Aos meus cunhados em especial, Shirley e Pedrinho, pelo apoio e carinho sempre que precisei.
Aos meus amigos de sempre, Cristiane, Sonia, Rita, Socorrinho e Gadinha, pela presença sempre amiga e amorosa. Obrigada amigas!
As minhas amigas especiais da faculdade Alê, Francine e Géssika, pelo apoio e paciência nos momentos difíceis e de felicidades que passamos durante essa trajetória.
As colegas Lucileide, Neto, Analy e Reny, pelos momentos de dedicação e incentivo.
A tia Marlene, Rose, Sione e Karina, pelo carinho e acolhimento para realização deste trabalho. Obrigada por tudo!
As minhas orientadoras, Raisa e Larissa, pela compreensão e confiança no desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores em especial Jota Jota e Mesquita, por todo conhecimento transmitido, Muito obrigado!
“Há medicamentos para toda a espécie de doenças, mas, se esses medicamentos não forem dados por mãos bondosas, que desejam amar, não será curada a mais terrível das doenças: a doença de não se sentir amado.” Madre Teresa de Calcutá
LISTA DE ABREVIATURAS
(Fecl3) - Cloreto Férrico ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária CIPLAN - Comissão Interministerial de Planejamento e Coordenação CL50 - Concentração letal para 50% da população DNA – Ácido desoxirribonucleico EB - Extrato Bruto FAMAM - Faculdade Maria Milza HCL – Ácido clorídrico IV – Infravermelho MCA - Medicina Complementar e Alternativa MeOH – metanol MS - Ministério da Saúde NaOH - Hidróxido de sódio Nauplii - estágio larval do camarão OMS – Organização Mundial de Saúde PNAF- Política de Nacionalização de Assistência Farmacêutica PNPIC - Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares PPM - Pesquisas das Plantas Medicinais PPPM - Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais SUS - Sistema Único de Saúde TAS -Toxicidade frente Artemia salina UFRB - Universidade Federal do recôncavo da Bahia
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura química da morfina e Ilustração botânica de Papaver somniferum ...... 18 Figura 2: Estrutura química da Cafeína e Ilustração botânica de Coffea arabica 19 Figura 3: Iresine herbstii Hook (Amaranthaceae) ...... 20 Figura 4: Planta feminina procedente de Armênia (a), planta masculina procedente de Popayán (b); planta feminina procedente de Medellín (c); planta masculina procedente de Bogotá (d)...... 21 Figura 5: Microcrustaceo Artemia Salina Leach.)...... 26 Figura 6: Obtenção do extrato bruto metanólico das folhas de Iresine herbstii. (A) material seco pulverizado(B) extração por maceraçã (C) Extrato bruto metanólico ...... 28 Figura 7: Testes com a Artemia salina leach e o extrato bruto de Iresine Herbstii ...... 31 Figura 8: Identificação de taninos. (1) Reação com Cloreto Férrico (Fe) (A) reação positiva com mudança de coloração. (2) Extrato Bruto Iresine herbstii + Acetato de Chumbo. (B) Reação positiva mostrando a presença de precipitado. Em ambos os testes foram feitos os seus respectivos controles ...... 34 Figura 9: Identificação de flavonoides. (A) Resultado positivo para o teste com reagente Hidróxido de sódio (NaOH), mudança na coloração para amarelo alaranjado a parda. (B) Resultado negativo para o teste com o reagente de Shinoda no extrato bruto da Iresine herbstii (C) Extrato sem reagente ...... 35 Figura 10: Reação negativa para Heterosídeos cardiotônicos (reagente Keede) no extrato bruto da Iresine herbstii (não houve mudança de coloração)...... 35 Figura 11: O aparecimento da coloração azul seguida de verde indica reação positiva de (A) esteroides/triterpenóides com o reagente Libermann Buchard no extrato bruto de Iresine herbstii (B) Extrato bruto sem reagente - controle. ... 36 Figura 12: Identificação de alcaloides. A formação de precipitado castanho avermelhado (A) indica reação positiva no extrato bruto de Iresine herbstii com o reagente Dragendorff (B) Extrato sem reagente ...... 37
RESUMO
O uso das plantas para fins medicinais tem despertado grande interesse de pesquisadores que buscam conhecer a composição química das plantas, uma vez que são utilizadas na medicina popular com finalidades terapêuticas, contribuindo ao longo dos anos na formulação de fármacos indispensáveis ao tratamento de algumas doenças. A utilização de plantas pela população deve ser analisada em relação à sua toxicidade, a exemplo do uso da Iresine herbstii, popularmente conhecida como “Coração Magoado”, que é uma espécie vegetal utilizada no tratamento de doenças cardiovasculares, diabetes, como cicatrizante, dentre outros. Apesar do seu potencial terapêutico, existem poucos estudos que assegurem o uso desta espécie. Diante disso, esse trabalho tem como objetivo determinar o perfil fitoquímico e avaliar a toxicidade do extrato bruto das folhas de Iresine herbstii frente a Artemia salina Leach. Para ser alcançado esse objetivo, foram delineados como objetivos específicos: identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes no extrato bruto das folhas de Iresine herbstii por métodos colorimétricos e/ou precipitação e avaliar a toxidade do extrato frente ao microcrustáceo Artemia salina Leach. O extrato bruto foi obtido através da extração por maceração em metanol (MeOH). Na triagem fitoquímica, os metabólitos secundários foram identificados no extrato bruto metanólico das folhas de Iresine herbstii, através de reações colorimétricas e/ou formação de precipitados e índice de espuma, utilizando reagentes específicos para cada classe metabólica (flavonoides, taninos, saponinas, esteroides, alcaloides e heterosídeos cardiotônicos). Para o bioensaio de toxicidade, dez nauplii de Artemia foram colocados em contato com o extrato bruto em cinco concentrações diferentes (100, 250, 400, 800 e 1000 µg/ml) para determinar a concentração letal média (CL50). Os testes foram realizados em triplicatas. Com os resultados obtidos foram observados a presença de diferentes metabolitos secundários no extrato, sendo indicativo a presença de compostos fenólicos, flavonoides, taninos, esteroides/triterpenos e alcaloides e ausência de saponinas e glicosídios cardiotônicos. Essas variedades de metabolitos podem estar associadas ao uso desta espécie como medicinais, visto que estes metabolitos têm sido associados a uma grande variedade de atividades farmacológicas potenciais, possibilitando a descoberta de novos fármacos. Os resultados do ensaio de toxicidade mostraram CL50 = 562,40 µg/ml. Dessa forma, pode-se concluir que o extrato bruto de Iresine herbstii apresenta baixa toxicidade. No entanto, estudos tem correlacionado a toxicidade de extratos de plantas frente a Artemia salina a outras potencias atividades farmacológicas, tais como antimicrobiana, antiparasitária e antitumoral, sendo necessário que novos testes sejam feitos, já que existem poucos estudos com a espécie analisada.
Palavras-chave: Plantas medicinais. Compostos bioativos. Iresine herbstii. Toxicidade. Artemia salina.
ABSTRACT
The use of plants for medicinal purposes has aroused great interest of researchers who seek to know a chemical composition of plants, once they are used in popular medicine with therapeutic purposes, contributing over the years in the formulation of drugs indispensable to the treatment. The use of plants by the population should be analyzed in relation to their toxicity, as well as the use of Iresine herbstii popularly known as "Coração Magoado", which is a plant species used in treatment of cardiovascular diseases, diabetes, as healing, among others. Despite its therapeutic potential, there are few studies assure the use of this species. Therefore, this project aims to determine the phytochemical profile and to evaluate the toxicity of the crude extract of the leaves of Iresine herbstii against Artemia salina Leach. In order to reach this objective, the following especific objectives were outlined: to identify the main classes of secondary metabolites present in the crude extract of the leaves of Iresine herbstii by colorimetric methods and / or precipitation and to evaluate the toxicity of the extract against the microcrack Artemia salina Leach. The crude extract was obtained by extraction of maceration in methanol (MeOH). In photochemical screening the secondary metabolites were identified in the crude methanolic extract of the leaves of Iresine herbstii through colorimetric reactions and / or formation of precipitates and foam index, using specific reagents for each metabolic class (flavonoids, tannins, saponins, steroids, alkaloids and cardiotonic heterosides ). For the toxicity bioassay, ten Artemia nauplii were contacted with the crude extract at five different concentrations (100, 250, 400, 800, and 1000 μg / ml) the average lethal concentration (LC50) was obtained. The tests were performed in triplicates. With the obtained results we observed the presence of different non-extract secondary metabolites, being indicative a presence of phenolic compounds, flavonoids, tannins, steroids and alkaloids, and absence of saponins and cardiotonics. These metabolite varieties may be associated with the use of this species as medicinal, since these metabolites have been associated with a great variety of potential pharmacological activities, allowing the discovery of new drugs. The results of the toxicity test showed LC50 = 562.40 μg / ml thus, it can be concluded that the crude extract of Iresine herbstii presents low toxicity. However, studies have correlated the toxicity of plant extracts to Artemia saline to other potential pharmacological activities, such as antimicrobial, antiparasitic and antitumor.
Keywords: Medicinal plants. Bioactive compounds. Iresine herbstii. Toxicity. Artemia salina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...... 11 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 13 2.1 PLANTAS MEDICINAIS: UM BREVE CONTEXTO HISTÓRICO ...... 13 2.1.1 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ...... 15 2.1.1.1 TERPENOS ...... 17 2.1.1.2 COMPOSTOS FENÓLICOS ...... 18 2.1.1.3 ALCALOIDES ...... 19 2.1.2 ESPÉCIE IRESINE HERBSTII HOOK (AMARANTHACEAE) ...... 21 2.2 FITOTERAPIA ...... 23 2.2.1 PESQUISAS COM PLANTAS MEDICINAIS ...... 25 2.3 BIOENSAIOS DE TOXICIDADE FRENTE À ARTEMIA SALINA LEACH ...... 27 3 METODOLOGIA ...... 28 3.1 TIPO DE PESQUISA ...... 28 3.2 COLETA E IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DO MATERIAL VEGETAL ...... 29 3.2.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO ...... 29 3.3 TRIAGEM FITOQUÍMICA ...... 30 3.4 ENSAIOS DE TOXIDADE FRENTE À ARTEMIA SALINA LEACH ...... 32 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 35 4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA ...... 35 4.2 ENSAIO DE TOXICIDADE COM ARTEMIA SALINA LEACH ...... 41 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 44 REFERÊNCIAS ...... 45
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1 INTRODUÇÃO
O uso das plantas para fins medicinais tem despertado grande interesse de pesquisadores pelo conhecimento da sua composição química, sendo muito utilizadas na medicina popular com finalidades terapêuticas, o que tem contribuído ao longo dos anos na formulação de vários fármacos indispensáveis ao tratamento de algumas doenças (SILVA, 2001). Observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais contribuem de forma relevante para sua divulgação e virtudes terapêuticas (MACIEL et al., 2001). Apesar do uso de plantas medicinais serem uma das mais antigas formas de tratamento, cura e prevenção de doenças na prática medicinal da humanidade, algumas plantas apresentam difícil identificação, composição química variável ou ainda relativa toxicidade, e sendo o Brasil um país detentor de grande biodiversidade de espécies vegetais, muito ainda não foi investigado quanto à composição química e biológica dessas espécies (OLIVEIRA et al., 2001; OLIVEIRA; AKISUE, 1997; SIMÕES et al., 2007). A Organização Mundial de Saúde (OMS) relata que cerca de 80% da população dos países em desenvolvimento utilizam plantas medicinais nos cuidados básicos de saúde e muitas vezes o uso indiscriminado de algumas espécies de plantas está relacionado à falta de conhecimento das propriedades químicas e terapêuticas (OLIVEIRA; DALA COSTA, 2004; ALVES, et al., 2008). Estudos com plantas medicinais envolvem diversas áreas de pesquisas, tais como botânica, fitoquímica, farmacologia, toxicologia, dentre outras, responsáveis por fornecer informações acerca da flora mundial e obter novas moléculas terapêuticas, ou seja, outras vertentes em tratamentos medicamentosos (FALKENBERG; SANTOS; SIMÕES, 2004). A fitoquímica é a área responsável por conhecer os constituintes químicos presentes nos vegetais, juntamente com os bioensaios, a fim de obter protótipos de fármacos ou até mesmo desenvolver novos fitoterápicos (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010). Os bioensaios possibilitam detectar efeitos específicos de extratos e substâncias de várias espécies de plantas, como atividades antimicrobiana, antifúngica, antiinflamatória e citotóxica. A seleção de bioensaios para detecção do efeito específico deve ser simples, sensível e reprodutível, podendo-se utilizar 12
microrganismos, microcrustáceos, culturas de células animais ou humanos (MACIEL; PINTO; VEIGA JR, 2002; ARAÚJO; CUNHA; VENEZIANI, 2010). O bioensaio com Artemia salina Leach é um método simples e de fácil reprodução. Através deste bioensaio é possível avaliar a toxicidade geral, sendo um teste preliminar no estudo de extratos e substâncias de plantas com potencial atividade biológica (ARAÚJO; CUNHA; VENEZIANI, 2010). Considerando que o “Coração Magoado” é uma espécie vegetal utilizada pela população com propriedades terapêuticas contra asma, artrite, reumatismo, gota, diabetes, em regimes de emagrecimento, no tratamento de doenças cardiovasculares, como cicatrizante e até mesmo em casos de diarreias agudas. Apesar do seu potencial terapêutico, existem poucos estudos que assegurem o uso desta espécie (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010). Pesquisas demonstram que cerca de 80% da população brasileira utilizam produtos a base de vegetais para fins terapêuticos (YUNES et al., 2001). Contudo, muitas espécies ainda são utilizadas de forma indiscriminada, sem nenhum conhecimento prévio quanto a sua composição química e atividade biológica que assegure seu uso como medicinal. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi determinar o perfil fitoquímico e realizar ensaio biológico para avaliação da toxicidade do extrato bruto das folhas da espécie "Coração Magoado" (Iresine herbstii) através do bioensaio com Artemia salina Leach. Para se alcançar esse objetivo, foram delineados os seguintes objetivos específicos: identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes no extrato bruto das folhas de Iresine herbstii por métodos colorimétricos e/ou de precipitação e avaliar a toxidade do extrato frente ao microcrustáceo Artemia salina Leach. Dessa forma, devido aos escassos estudos com a espécie Iresine herbstii e nenhum que relate sobre a toxicidade da mesma, é fundamental realizar estudos químicos e biológicos que determine sua composição química e avalie a toxicidade do extrato bruto das folhas de “Coração magoado” através de bioensaio frente à Artemia salina.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Plantas medicinais: um breve contexto histórico
O conceito de planta medicinal abrange toda e qualquer espécie vegetal (suas partes ou órgãos) que contenham compostos ativos ou substâncias que podem ser empregadas para fins de tratamento, prevenção ou reabilitação ou que sejam precursores de medicamentos semissintéticos e sintéticos (OMS, 2005; GADELHA et al., 2013). Quanto à prática da utilização de plantas como terapêutica, Firmo et al. (2011) relatam que desde os princípios da civilização, vários povos utilizavam plantas medicinais para tratamento e cura de diversas enfermidades. Sendo assim, seu uso terapêutico tornou-se uma prática muito comum entre a população brasileira e em muitas regiões brasileiras é a única alternativa terapêutica disponível (ARGENTA et al., 2011). Antes mesmo do início da invenção da escrita, já existiam registros do uso de plantas medicinais no tratamento de enfermidades ou para a alimentação, e suas experiências resultavam em fracassos e/ou sucessos, produzindo a cura, a morte ou efeitos colaterais severos. Sendo assim, o conhecimento empírico abriu espaço para o descobrimento das propriedades nocivas ou terapêuticas de determinadas plantas (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006). Pode-se atribuir o alto consumo de produtos naturais no Brasil às diversas crenças e culturas, ao baixo nível de economia da população, às dificuldades de acesso à assistência médica e farmacêutica, ou ainda, à influência da mídia ao divulgar produtos que contém ervas e outros componentes naturais em suas formulações, bem como pelo acesso e grande disponibilidade dos recursos naturais, a exemplo do Brasil (HOEFFEL et al., 2011). Segundo Badinelli (2014), acredita-se que a origem das plantas medicinais no cenário brasileiro esteja ligada à vinda dos negros da África, pois constantemente, os africanos exploravam as plantas em rituais religiosos, isso porque era próprio de sua cultura acreditar que os preparos com as ervas possuíam poderes mágicos. Já no entendimento de Silva, Miranda e Conceição (2010), não apenas os negros trouxeram este costume para o território brasileiro, mas há a associação de que o uso de ervas no país esteja fortemente ligado à cultura indígena que utilizava vários 14
tipos de plantas como medicamentos e também as ervas aromáticas para banhos, aromatização do ambiente e atração de bons fluidos. No Brasil, a primeira descrição sobre o uso de plantas medicinais como remédio foi feito por Gabriel Soares de Souza em 1587, que definiu e classificou as plantas comumente utilizadas pelos índios e, com a chegada dos médicos portugueses no país, este uso foi se acentuando ao perceberem a importância das plantas utilizadas nas aldeias indígenas (ARGENTA et al., 2011). O conhecimento acerca das plantas medicinais historicamente foi transmitido ao longo das gerações através da oralidade, o que se constitui uma preocupação para o meio científico, uma vez que a confiabilidade e segurança das plantas medicinais ficam comprometidas pelo repasse falado (FIRMO et al., 2011). Desta forma, é necessário que através de pesquisas científicas, a população seja esclarecida sobre as propriedades das plantas, seus efeitos terapêuticos e tóxicos, modos de utilização a fim de evitar o consumo inadequado das plantas medicinais. O uso dos produtos naturais também está associado à crença de que estes não sofrem processamento e, por esse motivo, não podem fazer mal. Esse fato leva muitas pessoas a usarem indiscriminadamente estes produtos e desenvolver intoxicações e reações adversas, seja por causa dos próprios componentes das plantas ou ainda pela presença de contaminantes ou adulterantes presentes no processo das preparações, no momento da coleta e/ou durante sua extração (FIRMO et al., 2011; BADINELLI, 2014; GADELHA et al., 2013). Grande parcela da população utiliza as plantas inadequadamente. Por isso a inquietação dos pesquisadores sobre este uso indiscriminado pauta-se no escasso conhecimento que as pessoas possuem sobre determinadas plantas que podem ser nocivas, uma vez que nem todas foram testadas e avaliadas em sua efetividade, eficácia e segurança (FERREIRA, 2008). Em relação a isto, as plantas medicinais foram empregadas no passado a partir de testes em indivíduos inicialmente sintomáticos, a fim de apresentar efeitos terapêuticos benéficos. Essas avaliações favoreceram os atuais estudos das substâncias ativas no corpo humano e estabeleceram dosagem, posologia, conservação e armazenamento, uso por grupos (crianças, idosos e gestantes), bem como os efeitos colaterais e reações adversas relacionadas ao uso destas plantas medicinais. Muitas vezes, a medicina popular também utiliza a terapia com plantas medicinais como um método complementar ao tratamento, o que contribui 15
consideravelmente para os avanços na área de botânica, fitoquímica, farmacologia, toxicologia, dentre outras (ARGENTA et al., 2011). Os avanços nas pesquisas etnofarmacológicas, nas quais pôde-se empregar diversas técnicas mais atualizadas de farmacologia, bioquímica, toxicologia e biologia molecular, objetivaram garantir a segurança do uso de plantas medicinais na população (FIRMO et al., 2011). O uso de plantas medicinais faz parte da fitoterapia, assim Bruning et al. (2012) descrevem como fitoterápico todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado de matérias-primas vegetais, com fins profiláticos, curativos ou de diagnóstico, ou seja, são produtos que garantem eficácia e segurança em seu uso. Entretanto, não é considerado produto fitoterápico quaisquer substâncias ativas isoladas ou presente em misturas, mesmo que sendo de origem vegetal.
2.1.1 Metabólitos Secundários
Entende-se por metabolismo a associação de reações químicas que acontecem no ambiente celular, de modo a gerar a satisfação de suas necessidades estruturais e energéticas (PEREIRA; CARDOSO, 2012). Sendo assim, entende-se que este processo pode sintetizar ou degradar as biomoléculas para produzir energia (FERNANDES, 2012; TAIZ; ZEIGER, 2013). Pereira e Cardoso (2012) ressaltam que o metabolismo pode ser dividido em metabolismo primário e secundário. Logo, o que garante tais reações são enzimas específicas, que podem ocorrer na forma anabólica (anabolismo) ou catabólica (catabolismo). O metabolismo de síntese das biomoléculas (anabolismo) forma as unidades essenciais que são agrupadas para formação de macromoléculas componentes das células, a exemplo das proteínas, DNA, dentre outras. Já no catabolismo ocorre aquisição de nutrientes, energia e biossíntese de compostos essenciais à sua sobrevivência, através da degradação, ou seja, as moléculas orgânicas, nutrientes, carboidratos, lipídios e proteínas oriundas do ambiente ou dos reservatórios de nutrientes da própria célula são degradados por reações contínuas, tornando-se mais simples e pequenas (FERNANDES, 2012).
O metabolismo primário é essencial e comum ao vegetal, pois, do ponto de vista fisiológico, é responsável pelo funcionamento estrutural e armazenamento de 16
energia, sendo encarregado por produzir metabólitos primários que se caracterizam através de macromoléculas com grande produção e distribuição universal, ou seja, os metabólitos primários são essenciais à sobrevivência e reprodução da planta, possuem função direta no metabolismo e são essenciais como intermediários no catabolismo e anabolismo em todas as plantas (TAIZ; ZEIGER, 2013). Os metabólitos essenciais são micromoléculas de baixo peso molecular, de distribuição restrita e presentes em poucas quantidades, Possuem uma estrutura diversificada e complexa, com a finalidade de se adaptar ao meio, atuando como um mecanismo de defesa contra herbívoria e microrganismos, proteção contra raios Ultravioleta (UV), atração de polinizadores e animais dispersores de sementes. Não ocorre morte imediata do vegetal na ausência dos metabólitos especiais, mas sua falta em longo prazo afeta a sobrevivência e estética (PEREIRA; CARDOSO, 2012; TAIZ; ZEIGER, 2013). O metabolismo secundário, a princípio, não é essencial ao desenvolvimento do vegetal, mas é importante para adaptação e sobrevivência das espécies. Assim, por não ser universal, o metabolismo secundário está restrito a algumas espécies ou famílias, sua distribuição no reino vegetal é diferente e seus precursores químicos comuns podem gerar resultados diversos, podendo ofertar vantagem competitiva entre os vegetais (TAIZ; ZEIGER, 2013). Os metabólitos secundários são resultado de interações que envolvem biossíntese, transporte, estocagem e degradação de biomoléculas. Por serem produtos naturais que possuem atividades biológicas envolvidas nos mecanismos de adaptação da planta ao seu meio, sem relação direta com o crescimento e desenvolvimento do vegetal, apresentam potencial atividade farmacológica como bactericidas, antifúngicos, antivirais, dentre outros, sendo relevantes na área farmacêutica, alimentícia, agronômica e na produção de perfumes (MIRANDA et al., 2015). É notório que os metabólitos especiais vêm sendo utilizados na formulação de medicamentos, cosméticos e nutracêuticos, por apresentarem diversas atividades potenciais. Nesse contexto, vários setores têm demonstrado interesse em relação aos produtos naturais, entretanto, o que mais se destaca é o setor farmacêutico que observa não somente as atividades biológicas para a sobrevivência dos vegetais, mas, interessa-se pelas diversas atividades farmacológicas potenciais, o que 17
contribui para a síntese de novos fármacos (PEREIRA; CARDOSO, 2012; VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010). Askari et al. (2012) reiteram que os compostos advindos de metabólitos secundários são capazes de bloquear o desenvolvimento de patógenos ou suprimi- los, além de apresentarem baixa toxicidade para as células hospedeiras e por isso vem sendo utilizados para a formulação de antimicrobianos. Portanto, Vizzotto, Krolow e Weber (2010) salientam que os metabólitos secundários podem dividir-se em três grupos quimicamente distintos: os terpenos, os compostos fenólicos e os alcaloides.
2.1.1.1 Terpenos
Os Terpenos são hidrocarbonetos, de estrutura saturada ou insaturada, que possuem unidades sucessivas de isopreno, constituindo os óleos vegetais. Esta é a classe estruturalmente mais variada de produtos vegetais naturais, sendo constituídos por meio da justaposição sucessiva de isopentenilpirofosfato (IPP-C5), que origina todos os terpenos (monoterpenos, sequiterpenos, diterpenos, triterpenos e tetraterpenos) (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010; FELIPE; BICAS, 2017). Os autores supracitados ressaltam ainda que os monoterpenos possuem baixo peso molecular e costumam ser substâncias voláteis, estes são denominados óleos essenciais ou essências. Os óleos essenciais são de extrema relevância dentro do grupo de metabólitos secundários, sendo responsável por aromas e sabor de determinadas espécies de plantas (NASCIMENTO et al., 2007). De acordo com Felipe e Bicas (2017), de uma forma geral, os óleos essenciais são constituídos majoritariamente por terpenos ou seus derivados. Estas essências vêm sendo utilizadas na medicina popular, nas atividades industriais cosméticas e perfumarias, bem como em inúmeras atividades farmacológicas, dentre outras. Sua ação e utilidade já foram descritas cientificamente ,como anti-séptica, tópica, antimicrobiana, dentre outras (NASCIMENTO et al., 2007; VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010). Para Vizzotto, Krolow e Weber (2017) estas essências nos vegetais atraem polinizadores e, ao mesmo tempo, funcionam como repelente de insetos, como exemplos o limoneno, o mentol e os piretroides que são inseticidas naturais. 18
As saponinas, pertencentes à classe dos triterpenos, desempenham um importante papel na defesa contra insetos e microrganismos, assim, estes compostos regulam o crescimento do vegetal e protegem a planta contra vários patógenos e insetos (FELIPE; BICAS, 2017). Além disso, no corpo humano, possuem efeitos antioxidantes, antivirais, antiinflamatórios e antitumorais. Entretanto, as saponinas são citotóxicas em altas concentrações e podem ter efeitos prejudiciais ao organismo humano. Esta substância não é absorvida no trato digestivo, tendo seu efeito apenas a nível local. Já os fitosteróis possuem propriedades hipercolesterolêmicas (PEREIRA; CARDOSO, 2012).
2.1.1.2 Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos são sintetizados através do metabolismo secundário e estão muito presentes em nosso cotidiano, são eles que dão sabor, odor e tonalidade aos vegetais, logo, funciona como atrativo para a espécie humana e também para os animais que são atraídos para polinizar ou dispersar sementes. Além disso, compostos fenólicos também funcionam como protetores dos tecidos da planta contra insetos e ataque de animais (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010). Silva et al. (2010) destacam que estes compostos fazem parte da ampla variedade dos constituintes dos vegetais, frutas e produtos industrializados comercializados atualmente, seja pelo pigmento/coloração ou ainda pelas ações antioxidantes presentes nestes compostos, em razão de seus radicais intermediários estáveis, que impedem a oxidação de diversos ingredientes dos alimentos, especialmente dos lipídios. Assim, os compostos fenólicos agem em condições de perigo, como infecções patogênicas, injúrias, altas taxas de radiações UV, dentre outros. Esta família engloba os taninos, flavonóides, antraquinonas e as ligninas (PEREIRA; CARDOSO, 2012). Vizzotto, Krolow e Weber (2010) ressaltam que os compostos fenólicos são essenciais à conquista do ambiente terrestre pelas plantas, a exemplo das ligninas que promovem o desenvolvimento do sistema vascular, dando rigidez aos vasos. Esta hipótese foi comprovada cientificamente ao constatar que compostos fenólicos não estão presentes ou são raramente encontradas em ambiente úmido, local que 19
sobrevive as plantas primitivas. Porém, os autores fazem uma ressalva em relação aos flavonoides que, embora seja quase ausente em ambientes que contenham fungos, algas, briófitas e pteridófitas, sua importância é considerável nas angiospermas. Ainda de acordo com os autores acima mencionados, os compostos fenólicos estão envolvidos principalmente na sinalização entre plantas e outros organismos, ou seja, possui relação entre os vegetais e seus agentes polinizadores, ao qual a pigmentação das flores funciona como atrativos. Um exemplo clássico de compostos desta natureza são as antocianinas (flavonoide). Os Flavonoides são responsáveis pela pigmentação natural de determinadas plantas, contendo em sua composição química produtos fenólicos e propriedades quelantes de ferro que protegem o corpo contra danos produzidos por agentes e possui diversas funções, entre elas, ação antioxidante, antimicrobiana e inibição enzimática (MACHADO et al., 2008). Já foram identificadas mais de 8.000 substâncias pertencentes ao grupo dos flavonoides, podendo citar como exemplos as antocianinas, flavonóis, flavonas, isoflavonas e flavononas, possuindo efeitos antioxidantes, antitumorais, anti- inflamatórios, (PEREIRA; CARDOSO, 2012). Logo, a ingestão de flavonoides está diretamente associada ao aumento da expectativa de vida e redução de doenças cardiovasculares. As antocianinas são responsáveis pela pigmentação natural de vários vegetais, possui um papel profilático no aparecimento de várias doenças devido à sua ação antioxidante. As isoflavonas constituem outra classe de flavonoides com efeitos anticancerígenos (SILVA et al., 2010). Os taninos também fazem parte dos compostos fenólicos e possuem ação antioxidante e sequestradora de radicais livres, podendo interagir com macromoléculas, como por exemplo, as proteínas. Além de sua ação antioxidante, são descritas também ação antisséptica, cicatrizante e vasoconstritora. Já os polifenóis possuem propriedades desintoxicantes, anticancerígenas e antioxidantes (PEREIRA; CARDOSO, 2012).
2.1.1.3 Alcaloides
20
Os alcaloides são compostos orgânicos ativos, que possuem pelo menos um átomo de nitrogênio em sua estrutura molecular, são derivados de aminoácidos e possuem atividade antimicrobiana, analgésica, dentre outras. Atuam na defesa química da planta, pois tem efeito repelente contra insetos, no entanto, a maioria destes compostos apresenta elevada toxicidade (NASCIMENTO et al., 2006). De acordo com Vizzotto, Krolow e Weber (2010) esta classe de metabólitos especiais possui a presença de substâncias que atuam acentuadamente no sistema nervoso humano, a exemplo dos venenos ou alucinógenos, especialmente da morfina, ver Figura 1, (isolada e descoberta em 1806 pelo farmacêutico alemão Friedrich Sertürner, fortalecendo os estudos sobre os alcaloides).
Figura 1 – Estrutura química da morfina e Ilustração botânica de Papaver somniferum
Fonte: Cabral; Pita (2015).
Também, a partir de pesquisas com metabólitos especiais descobriu-se a cafeína, uma xantina produzida a partir de uma purina e que funciona na defesa da herbivoria. Os autores salientam ainda que se for manipulado o conteúdo da cafeína (FIGURA 2) em plantas transgênicas podem surgir plantas mais resistentes a pragas e, em relação à produção agrícola de grãos de café, podem surgir grãos de café já descafeinados e diminuir a onerosidade dos processos industriais (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010).
Figura 2 – Estrutura química da Cafeína e Ilustração botânica de Coffea arabica 21
Fonte: Cabral; Pita (2015).
Já Cabral e Pita (2015) dizem que o termo alcaloide foi proposto por W. Meissner no século XIX, ao qual se aplicou compostos básicos de origem natural que apresentam azoto na sua estrutura. Salientam ainda que os alcaloides possuem grande atividade farmacológica ou toxicológica.
2.1.2 Espécie Iresine herbstii Hook (Amaranthaceae)
A Iresine herbstii Hook é uma planta pertencente à classe da Magnoliopsida, tendo sua subclasse descrita como Caryophyllidae, da ordem Caryophyllales e subordem Chenopodiineae. Estão presente na taxonomia da Família Amaranthaceae, subfamília Gomphrenoideae, do gênero Iresine e a espécie herbstii (ORELLANA; ERAZO, 2011; SANTACRUZ; RODRIGUEZ; HENAO, 2015). A espécie é conhecida popularmente como coração magoado, manjericão de Nossa Senhora dos Passos, republicana, orelha-de-macaco e catinga de mulata. Suas folhas são utilizadas popularmente para doenças do coração e nos edemas. Contudo, todo o conteúdo da planta pode ser infundido, ingerido e utilizado para asma, artrite, reumatismo, gota e histeria, já a casca do caule é usada em pacientes portadores de diabetes, em regimes de emagrecimento e até mesmo em casos de diarreias agudas. Também é utilizada como planta ornamental, devido às suas folhas e seu caule apresentarem um pigmento violeta e atrativo (RODRÍGUEZ, HENAO, 2015; SANTACRUZ; ORELLANA; ERAZO, 2011). É uma planta perene, com um cultivo amplo, podendo medir aproximadamente 1 a 2 m de altura, o seu caule é grosso, ramificado e possui uma coloração predominantemente avermelhada. Seu pecíolo possui cerca de 2 a 3 cm de comprimento, quase glabroso, presenciam-se brácteas e bracteoles persistentes, 22
branco esverdeado ou amarelado branco, as disposições das folhas são opostas ou suplentes, apresentando um pecíolo alargado e morfologicamente circundante na base, levemente afinando em seu final e, além disso, apresentando de 1 a 1,5 mm de glabra (SANTACRUZ; RODRIGUEZ; HENAO, 2015). As suas flores são pequenas e unissexuais, contendo um ovo e suas pétalas apresentam uma coloração verde-branco ou branco amarelado, oblongo de aproximadamente 1 mm (ORELLANA; ERAZO, 2011), como mostra a figura 3.
Figura 3 - Iresine herbstii Hook (Amaranthaceae)
Fonte: Aguedelo-Henao (2008).
A figura 4 demonstra a Iresine herbstii Hook (Amaranthaceae) procedentes de diversos países como Medellín, Bogotá, Armênia e Popayán.
Figura 4 - Planta feminina procedente de Armênia (a), planta masculina procedente de Popayán (b); planta feminina procedente de Medellín (c); planta masculina procedente de Bogotá (d).
23
Fonte: Santacruz; Rodriguez; Henao (2015).
A composição química desta espécie é bastante variada, apresentando metabólitos secundários, tais como triterpenos, flavonoides, lactonas, saponinas, fenóis e açúcares redutores (ORELLANA; ERAZO, 2011). De acordo com Santacruz, Rodriguez e Henao (2015) a Iresine herbstii Hook está sendo utilizada para pesquisas voltadas para a área de biologia farmacológica, a qual se estuda a resposta dos extratos purificados desta planta (metabólitos) em associação com outras espécies. Já foi verificado, segundo os autores, em testes com camundongos, que houve resposta significativa na atividade de locomoção, coordenação motora e comportamento das cobaias, agindo como agentes psicotrópicos na resposta do sistema nervoso central, constituindo-se como um recurso natural para tratamentos de doenças como mal de Parkinson e esquizofrenia. Os autores supracitados revelam ainda que o departamento de botânica e zoologia de Hong Kong descobriu que estas espécies são ricas em betacianinas (pigmento violeta), o que eleva sua condição de corante natural. Acrescentam ainda que estas espécies estão sendo avaliadas por diversas áreas de pesquisa como no campo da morfologia, taxonomia, ecologia e, atualmente, em bioquímica, com relação ao seu potencial farmacológico.
2.2 FITOTERAPIA
Através do Decreto nº. 5.813 de 22 de junho de 2006, o Ministério da Saúde (MS) criou a Política Nacional de Plantas Medicinal e Fitoterápico. Nesse mesmo 24
ano, já havia sido criado também a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS (PNPIC) através da portaria do MS nº 971, abrangendo vários aspectos importantes como: fitoterapia, homeopatia, Medicina Tradicional, entre outras (CLIMÉRIO; IDÊ; GARIBALDI, 2014). A Comissão Interministerial de Planejamento e Coordenação (CIPLAN) foi responsável por disciplinar a introdução da Fitoterapia nos serviços de saúde. Essa organização foi realizada através da Resolução nº 08 de 1988, responsável por padronizar rotinas e procedimentos da Fitoterapia nas Unidades Assistenciais Médicas no SUS (FIGUEREDO; GURGEL; GURGEL JUNIOR, 2014). Define-se fitoterapia como o tratamento utilizando plantas medicinais, que pode ser realizado através da ingestão de várias partes da planta, como por exemplo, raízes, folhas, cascas, frutos e sementes (BRUNING, 2012). Essa utilização é feita através da infusão ou decocção, sendo esse último o mais realizado pela população, onde a planta e seus compostos ativos são consumidos através dos chás, xaropes, banhos, compressas, cataplasmas, dentre outras. Nesse contexto, a decocção é caracterizada pelo processo da planta ser fervida junto à água, na infusão a água é fervida sozinha e depois colocada sobre a planta (BRUNING; MOSEGUI; VIANA, 2012). Antes de ser criada a medicina convencional, também conhecida como alopatia, existia a medicina tradicional, que é uma prática de saúde praticada por várias culturas e possui o seu embasamento através de teorias, crenças e experiências indígenas, sendo empírica ou não. É exemplo de medicina tradicional, a medicina chinesa, aayurvédica hindu, a medicina unani-árabe e a medicina indígena (SILVA, 2015). Essa prática de saúde utiliza-se de ervas, minerais, animais, terapias manuais, espirituais e acupuntura. Já a medicina complementar e alternativa (MCA) é um conjunto de sistemas, práticas e produtos de uso clínico, não é descrita como medicina convencional, pois se utiliza de ervas medicinais, dietas especiais, suplementos vitamínicos, homeopatia, técnicas de relaxamento entre outros (LEAL; SCHWARTSMANN; LUCAS, 2008). A Organização Mundial de Saúde (OMS) reforçou o compromisso de estimular o desenvolvimento de políticas públicas e organizações, para ofertar subsídios complementares para a medicina tradicional, isso ocorreu em maio de 2005, através da publicação do documento da Política Nacional de Medicina Tradicional e Regulamentação de Medicamentos Fitoterápicos, que descreve a 25
situação das pesquisas com fitoterápicos no Brasil e no mundo. O Brasil possui um vasto acervo de plantas medicinais e tem aproximadamente 55.000 espécies registradas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 espécies, além de um histórico fiel na utilização das plantas medicinais associada ao conhecimento indígena e a cultura de cada população (VIEIRA, 2010). As pesquisas em busca de novas formas complementares para a utilização de plantas medicinais destacaram-se como prioridade pelo MS. A investigação das possibilidades do uso das ervas ocorreu por meio da Portaria nº 212 em 11 de setembro de 1981 e contribuiu para o estudo da flora medicinal brasileira maximizando o uso da Fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS). Através dessas contribuições, realizou-se o levantamento e sistematização das ações e pesquisas do Programa de Pesquisas das Plantas Medicinais (PPM) (MACEDO, 2016). Nesse sentido, o Programa de Nacionalização de Fármacos (PNAF) e o Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais (PPPM) objetiva alavancar estudos internos de extração e síntese química de matérias-primas para a formação de novos fitofármacos (BARRETO, 2015).
2.2.1 Pesquisas com plantas medicinais
As pesquisas nas áreas das substâncias derivadas de espécies vegetais vêm crescendo cada vez mais, pois os registros aumentaram expressivamente, tanto nas pesquisas através da área de química quanto na área de farmacologia (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010). Aos poucos, foi-se introduzindo, no tratamento das doenças, novos fármacos que se originaram das pesquisas com diversas espécies de plantas, denominados fitoterápicos. Para uma melhora da terapêutica convencional, houve constantes e expressivas explorações do conhecimento empírico, a fim de complementar ainda mais nova formas terapêuticas (TELES, 2013). Os metabolitos secundários das plantas apresentam atividades farmacológicas potenciais, contribuindo para a obtenção de novos fármacos. Sendo assim, a crença na utilização das plantas medicinais vem se tornando cada vez mais científica (FOGLIO et al., 2006). 26
A partir de então, várias espécies de plantas estão sendo utilizada, isso porque elas possuem vasto poder curativo comprovado pelo uso rotineiro da população (OLIVEIRA; MACHADO; RODRIGUES, 2014). Existem inúmeras pesquisas científicas que comprovam os efeitos terapêuticos da utilização das plantas medicinais, sua eficácia e segurança. Não obstante, devido a grandes quantidades de plantas utilizadas pela população, muitas delas ainda devem ser estudadas em relação a benefícios, riscos, interações e segurança. As preparações caseiras são outra fonte de utilização no tratamento com plantas medicinais, sendo essa a principal forma de utilização da população, a isso se acrescenta o fácil acesso a essas plantas, que podem ser adquiridas em vários locais como feira livre e mercados (CLIMÉRIO; IDÊ; GARIBALDI, 2014). Neste contexto, diversas pesquisas fitoquímicas são feitas com o objetivo de conhecer os constituintes químicos provenientes do metabolismo secundário das espécies vegetais, através do isolamento e elucidação de suas estruturas moleculares (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010). As plantas são utilizadas com finalidades terapêuticas e estão contribuindo, ao longo dos anos, para a obtenção de medicamentos industrializados. Porém, necessitam de fiscalização e regulamentação nas pesquisas e em seu processamento (OLIVEIRA; MACHADO; RODRIGUES, 2014). Assim, o órgão responsável pela regulamentação de plantas medicinais e seus derivados no Brasil é a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que tem como principal papel proteger e promover a saúde da população e também garantir a segurança sanitária de produtos e serviços, bem como registrar os medicamentos que são colocados à venda para a população, para isso, é avaliada a eficácia, qualidade e segurança destes produtos (FOGLIO et al., 2006). Verifica-se ainda que a população tende a fazer associações entre medicamentos e desconhecem os riscos destas combinações, pois, muitas vezes, as plantas são utilizadas como complemento de medicamentos. Em relação a isto, Vendrusculo e Mentz (2006) comprovaram em seu estudo que algumas pessoas apresentaram reações adversas após ingestão concomitante de algumas plantas juntamente com medicamentos. Os autores citaram como exemplo que os estudos sobre o uso de insulina (Sphagneticola trilobata), do cidró (Cymbopogon citratus) e do chá da marcela (Achyrocline satureioides) causaram efeitos indesejáveis aos pacientes, como dores abdominais, alergias, dentre outros. Portanto, percebe-se o 27
valor e importância das pesquisas das plantas medicinais para a área farmacológica e para a segurança da população, uma vez que os produtos naturais também podem oferecer riscos à saúde das pessoas se não forem observadas as especificações de cada espécie.
2.3 Bioensaios de toxicidade frente à Artemia salina leach
As plantas medicinais desde a antiguidade são utilizadas pelas pessoas na comunidade sem restrição. O uso, muitas vezes, acontece empiricamente e pode vir a gerar efeito negativo sobre o organismo do homem e causar toxicidade, seja por ter efeito nocivo ou até mesmo por superdose, porque o fato de ser natural não é sinônimo de inocuidade. Isso porque na utilização das plantas medicinais ocorrem a biotransformação das substâncias ativas, podendo ser gerados produtos tóxicos. (OLIVEIRA; MACHADO; RODRIGUES, 2014). Muitos perigos estão associados ao uso indiscriminado de medicamentos fitoterápicos e infusões de plantas medicinais. Algumas plantas medicinais já estão descritas como potencialmente tóxicas, exemplos clássicos, são as plantas do gênero Senecio, Solanum paniculatum L., conhecida popularmente como jurubeba, a Arnica montana L., que são responsáveis por irritar o trato gastrintestinal, a espécie Datura Suaveolens Humb&Boplex Willd, conhecida como trombeteira que pode causar lesões no sistema nervoso central, e também a Ruta graveolens, denominada popularmente por arruda, que têm propriedades abortivas, hemorrágicas, irritativas da mucosa bucal e causa inflamações na pele (SOLMAYRA; ERAZO, 2011). A finalidade dos ensaios biológicos é avaliar a toxicidade dos compostos onde há potencial atividade biológica a fim de estabelecer a segurança, eficácia e qualidade das preparações das plantas medicinais e descrever também sua composição química e seus compostos ativos (BASTOS et al., 2011). Dentre os bioensaios utilizados na monitoração de estudos fitoquímicos para verificar a toxicidade de extratos, frações e substâncias ativas está o de letalidade frente à Artemia salina (TAS). A Artemia Salina Leach (FIGURA 5) é um microcrustáceo, também conhecido como camarão salmoura, que vive em águas salgadas e é muito utilizado na alimentação de várias espécies de peixes. Seus ovos são facilmente encontrados em lojas de aquários e peixes (MOREIRA, 2013). 28
Figura 5 – Microcrustaceo Artemia Salina Leach.
Fonte: Moreira (2013).
A simplicidade do bioensaio TAS favorece sua utilização rotineira, podendo ser desenvolvido no próprio laboratório de fitoquímica, o que torna útil o uso destes testes na obtenção de compostos bioativos. Muitas pesquisas têm correlacionado a toxicidade de determinados extratos e compostos ativos sobre à Artemia salina com atividades antitumorais, antifúngicas, viruscidas, antimicrobianas, parasiticidas, tripanossomicidas, anti-inflamatórias, dentre outras (MOREIRA, 2013; FERRAZ FILHA et al., 2012). Neste sentido, os ensaios sobre letalidade deste microcrustáceo tem sido objeto de muitas pesquisas, é atualmente uma das ferramentas mais favoráveis para avaliar de forma preliminar a toxicidade geral de extratos, frações ou substâncias isoladas.
3 METODOLOGIA
3.1 TIPO DE PESQUISA
Foi realizada uma pesquisa experimental, de corte exploratório qualitativo. De acordo com Gil (2007), a pesquisa experimental tem a finalidade de determinar um objeto de estudo, selecionando variáveis influenciadoras na definição das formas de 29
controle e de observação dos efeitos que a variável produz no objeto que se é estudado. Nesse contexto, a pesquisa experimental pode ser desenvolvida em laboratório, criando-se artificialmente um meio a ser estudado, ou no campo, onde são criadas as condições de manipulação dos sujeitos nas próprias comunidades ou grupos.
3.2 COLETA E IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DO MATERIAL VEGETAL
Ramos florido da espécie Iresine herbstii foram coletados no município de Cruz das Almas, BA, e confeccionada uma exsicata para identificação da espécie. A exsicata foi depositada e identificada no Herbário da Universidade Federal do recôncavo da Bahia – UFRB de Cruz das Almas, Bahia.
3.2.1 Obtenção do extrato
Folhas de Iresine herbstii foram coletadas e submetidas à secagem em estufa de circulação de ar contínuo à temperatura de 60°C. Após a secagem, as folhas foram trituradas em macromoinho no Laboratório de Fisiologia da Faculdade Maria Milza (FAMAM). Para obtenção do extrato bruto, o material pulverizado foi submetido à técnica de extração por maceração em metanol (MeOH), através de cinco extrações consecutivas no intervalo de 72 horas cada, renovando-se o líquido extrator. Em seguida, a solução obtida foi concentrada em rotaevaporador, dando origem ao extrato bruto metanólico (EB) das folhas de Iresine herbstii para posteriores análises químicas e biológicas (Figura 6).
30
Figura 6 - Obtenção do extrato bruto metanólico das folhas de Iresine herbstii. (A) material seco pulverizado; (B) extração por maceração; (C) Extrato bruto metanólico.
(A) (B)
Fonte: autora (2017) Fonte: autora (2017)
(C)
Fonte: autora (2017)
3.3 Triagem fitoquímica
De acordo com Simões (2001), a finalidade da pesquisa fitoquímica é conhecer as substâncias, ou seja, os compostos químicos presentes nos vegetais ou avaliar se os mesmos estão presentes. Quando não há estudos que determinem os compostos químicos da espécie estudada, a análise fitoquímica identificará os grupos de metabólitos secundários. Os metabólitos secundários foram identificados no extrato bruto metanólico das folhas de Iresine herbstii, através de reações colorimétricas e/ou formação de precipitados e índice de espuma, empregando-se os protocolos descritos por Matos (1997). Para essas reações foram feitas análises qualitativas, utilizando-se 31
reagentes específicos para cada classe metabólica (FALKENBERG; SIMÕES, 2004), como descrito a seguir. Flavonoides: os testes foram realizados através da reação de Shinoda. O teste de Shinoda é realizado através do concentrado de HCL e fragmentos de magnésio. Em um tubo de ensaio, adicionou-se 2 ml do extrato bruto dissolvido em metanol e alguns fragmentos de magnésio. Em seguida, aproximadamente 2 mL de HCL foram vertidos pelas paredes do tubo. O fim da reação foi determinado pelo término de efervescência e pelo aparecimento de coloração que varia de parda a vermelha, o que indica a presença de flavonoides no extrato. A reação com hidróxidos alcalinos é atribuída à presença de hidroxilas fenólicas. Separou-se em 2 tubos de ensaio, 2 mL do extrato metanólico. Ao 1° tubo foi adicionado 0,5 mL de solução de NaOH 1 N. A coloração obtida foi comparada com o extrato no 2° tubo. A reação é positiva quando a solução básica do 1° tubo adquire coloração amarelo intenso. Compostos fenólicos e Taninos: os testes foram realizados utilizando Cloreto férrico 2% e acetato de chumbo. Para o ensaio utilizando o Cloreto férrico, foram evaporados 5 ml de extrato metanólico da Iresine herbstii e o resíduo dissolvido em 10ml de água destilada e filtrado em seguida. Separou-se 3 ml do extrato aquoso e foram acrescentadas 2 gotas de solução de cloreto férrico a 2%. A reação com acetato de chumbo foi realizada através de um tubo de ensaio contendo 2 mL do extrato aquoso e, posteriormente, adicionadas 5 gotas de acetato de chumbo 10%. O resultado é positivo quando há aparecimento de precipitado ou mudança de coloração. Coloração inicial entre o azul e o vermelho, é indicativo da presença de fenóis, quando o teste em branco for negativo, para o teste com cloreto férrico 2%. E colorações ou formação de precipitados azul e verde indicam a presença de taninos hidrolisáveis e condensados, respectivamente para o teste em acetato de chumbo. Saponinas: a presença de saponinas foi avaliada através do índice de espuma. Evaporou-se 5 ml do extrato metanólico da espécie, até secura e adicionou-se água fervente. Após resfriamento, agitou-se vigorosamente a solução, deixando separado por 20 min. Por fim, foi feita a avaliação da presença ou não de saponinas pela altura da espuma, 1 cm = +; 2 cm = ++ ; 3 cm = +++. 32
Esteroides/triterpenoides: Os testes foram realizados através da reação de Lieberman-Burchard. O resíduo de 10 ml de extrato metanólico da espécie foi tratado com 10 ml de clorofórmio anidro. Em seguida, foi filtrado e depositado em um tubo de ensaio e, posteriormente, adicionou-se 1 ml de ácido sulfúrico lentamente pela parede do tubo e observou-se o resultado. O aparecimento da coloração verde seguida de azul indica a presença de Esteroides/triterpenoides. Alcaloides: Os testes foram realizados através da reação de Dragendorf. Na placa de aquecimento, aproximadamente 30 ml de extrato bruto metanólico foi evaporado até a secura, adicionando-se 5 ml de ácido clorídrico a 10 % e, em seguida, aquecido por 10 minutos. Após resfriamento e filtração, transferiu-se o filtrado para um tubo de ensaio e foram adicionadas algumas gotas do reativo de Dragendorff e observou-se o resultado. Os resultados são positivos, indicando a presença de alcaloides, quando ocorre a presença de precipitado vermelho acastanhado ou tijolo. Heterosídeos cardiotônicos: Os testes foram realizados através da reação de Keede. Dissolveu o extrato seco em 3 ml de metanol e em seguida filtrou. Separou-se em dois tubos de ensaios e adicionou-se 3 gotas do reativo de Keede no 1º tubo. A reação é positiva quando se observa a mudança da coloração azul ou violeta, no tubo contendo o reagente, sendo o 2º tubo utilizado com o controle negativo para comparação da cor.
3.4 Ensaios de toxidade frente à Artemia Salina Leach
Os ensaios de toxicidade utilizando Artemia salina foram realizados de acordo com o método proposto por Meyer e colaboradores (1982). Através deste método, é possível determinar a concentração letal média (CL50) de substâncias ou extratos em um meio salino, ou seja, esse teste específico é responsável por indicar a toxicidade dos compostos ativos, extratos e frações dos produtos naturais frente à Artemia salina L. (ALVES et al., 2000; ARAÚJO; CUNHA; VENEZIANI, 2010). O preparo do aquário foi realizado com o auxilio de um isopor e papel alumínio, dividindo o aquário em dois compartimentos assimétricos com pequenos orifícios no isopor para interligação entre eles. A parte maior foi iluminada com a utilização de uma lâmpada incandescente de 60 w e a outra mantida no escuro, 33
cobrindo-a com papel alumínio. Uma bomba comum de aquário foi utilizada para a oxigenação da água. Para a obtenção da água do mar artificial, inicialmente pesou-se 19 g de sal marinho, adicionou-se 5 litros de água mineral (água sem cloro), agitando-se até a sua total dissolução. Em seguida, foi colocada a água do mar artificial no aquário e feita a ligação da bomba para oxigenação da água. Os ovos de Artemia salina foram depositados no aquário sob iluminação constante por 48 horas para obtenção dos nauplii recém-eclodidos (estágio larval do camarão) (Figura 7). Dez nauplii de artemia foram colocados em contato com o extrato bruto em cinco concentrações diferentes (100, 250, 400, 800, e 1000 µg/mL), e incubadas por 24 horas. Após esse período, foram contados os nauplii sobreviventes. Os nauplii considerados mortos foram aqueles que não exibiram nenhum movimento durante dez segundos de observação. O branco foi preparado com 10 camarões, utilizando apenas a água do mar artificial (5 mL). Todo o teste foi realizado em triplicata. Os frascos foram colocados próximos à lâmpada incandescente de 60W e após 24 horas de incubação, os camarões sobreviventes foram contados em todos os frascos utilizando-se uma lupa com lente de aumento como auxílio para facilitar a visualização. Os aparatos do ensaio são mostrados na Figura 7. Figura 7 - Testes com a Artemia salina leach e o extrato bruto de Iresine Herbstii.
Fonte: autora (2017) 34
A porcentagem de mortos em cada concentração é determinada como uma média aritmética dos valores encontrados nas três triplicatas. Nos casos em que ocorreu morte no branco, os dados foram corrigidos usando a fórmula de Abbot % mortos = [teste – branco / branco] x 100. Os resultados foram submetidos ao programa Microsoft Excel 2007, o qual forneceu o valor da concentração letal média (CL50) do extrato, a partir do gráfico da atividade citotóxica, com 95% de confiabilidade (MEYER et al., 1982). Dessa forma, foi determinada a faixa de concentração a ser testada, buscando sempre a maior concentração em que se observa 0% de mortalidade e a menor concentração em que se obteve 100% de mortalidade. As demais concentrações foram distribuídas dentro desse limite, de modo a obter a CL50 (concentração letal para 50% da população) dos extratos testados (VEIGA et al., 1989). 35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA
A análise da triagem fitoquímica da Iresine herbstii possibilitou verificar a presença de diferentes metabólitos secundários no extrato, sendo indicativa a presença de compostos fenólicos, flavonoides, taninos, esteroides/ triterpenoides e alcaloides como pode ser observado na Tabela 1.
Tabela 1 - Resultado da reação colorimétrica/precipitação do extrato bruto da Iresine herbstii.
METABÓLITOS RESULTADO REAGENTE REAÇÃO SECUNDARIOS Cloreto férrico (Fecl3) amarelo intenso + Taninos
Acetato Chumbo presença de precipitado +
Saponinas Água fervente ausência de - espumas Shinoda não houve - mudança de coloração Flavonoides mudança de NaOH + coloração amarelo/parda
não houve mudança de Heterosídeos Keede coloração para cardiotônicos - azul ou violeta
Esteroides/triterp mudança de Libermann Buchard coloração enos verde/azulado + mudança de Alcaloides Dragendorff coloração vermelho + acastanhado (+) presença e (-) ausência de metabólitos secundários no extrato bruto.
36
Na reação para a identificação de compostos fenólicos e taninos com cloreto férrico a 2% verificou-se a mudança de coloração no extrato da Iresine herbstii, como pode ser observado na Figura 8, fato que indica a presença de compostos fenólicos e taninos. Sendo confirmada a presença de taninos no extrato na reação com acetato de chumbo, no qual houve a formação de precipitados, visto que estes compostos tem a capacidade de se complexar com íons metálicos (Figura 8).
Figura 8 - Identificação de taninos. (1) Reação com Cloreto Férrico (Fecl3) (C- controle negativo; A- reação positiva com mudança de coloração). (2) Reação com acetato de chumbo (C- controle negativo; B- Reação positiva mostrando a presença de precipitado).
(1) (2)
A B C C
Fonte: autora (2017)
Os testes para a identificação de flavonoides com o reagente NaOH (hidróxido de sódio) foram positivos, mostrando uma mudança de coloração de amarela para parda. No entanto, para os testes com reativo de Shinoda, não houve nenhuma mudança de coloração para vermelho, o que pode sugerir que o extrato não possui ou apresente em baixas concentrações flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas (Figura 9).
37
Figura 9 – Identificação de Flavonoides. (A) Resultado positivo para o teste com reagente Hidróxido de sódio (NaOH), mudança na coloração para amarelo alaranjado a parda. (B) Resultado negativo para o teste com o reagente de Shinoda no extrato bruto da Iresine herbstii.(C) Extrato sem reagente
(A) A B C
Fonte: autora (2017)
O resultado obtido demonstra que o extrato de Iresine herbstii tem potencial biológico, visto que a presença de flavonoides pode inibir o crescimento de micro- organismos que colonizam o organismo humano e prevenir doenças envolvidas no estresse oxidativo tais como doenças cardiovasculares e neurodegenerativas (DORNAS et al., 2007) Os flavonoides são os metabólitos secundários de maior importância na manutenção da saúde de animais herbívoros, incluindo o homem, além de ser um dos mais importantes compostos dos grupos fenólicos (VALIM et al., 2007). Os flavonoides estão associados a atividades biológicas relevantes (MATTE et al., 2015).
Em relação aos testes realizados com Heterosídeos cardiotônicos, os resultados foram negativos, pois não houve mudança de coloração. A reação somente seria positiva se fossem observadas mudanças da coloração castanha avermelhada a roxo. Dessa forma, o extrato bruto de Iresine herbstii não apresentou estes metabólitos (Figura 10).
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Figura 10 – Reação negativa para Heterosídeos cardiotônicos (reagente Keede) no extrato bruto da Iresine herbstii (não houve mudança de coloração). (A- controle negativo; B- reação com reagente Keede).
A B
Fonte: autora (2017)
A triagem fitoquímica para a identificação de esteroides/triterpenoides no extrato de Iresine herbstii apresentou resultado positivo, pois o aparecimento de coloração azul seguida de verde indica sua presença, como mostra na Figura 11. Os esteroides apresentam diversas ações farmacológicas como atividade anti- inflamatória e analgésica, sendo frequentemente utilizado por indústrias farmacêuticas na síntese de fármacos esteroidais semissintéticos (RODRIGUES et al., 2010; SILVA et al., 2015). Os terpenos, por sua vez, são considerados a maior classe de metabolitos secundários existentes nas plantas (NOVAES, 2011), além de atuarem como repelentes para insetos herbívoros, fitoalexinas e também como reguladores de crescimento das plantas (ORTEGA et al., 2001; MAIRESSE et al., 2007).
Figura 11 – O aparecimento da coloração azul seguida de verde indica reação positiva de (A) esteroides/triterpenóides com o reagente Libermann Buchard no extrato bruto de Iresine herbstii. (B) Extrato bruto sem reagente – controle negativo
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B A
Fonte: autora (2017) Nos testes colorimétricos feitos no extrato bruto da Iresine herbstii através do reagente de Dragendorff, o resultado foi positivo na detecção de alcaloides (Figura 12). A presença destes compostos deve-se à formação de precipitados alaranjados, cuja cor varia de acordo com o tipo de composto encontrado que vai do amarelo a vermelho tijolo ou acastanhado. Alencar, Rossi e Pereira (2015) realizaram estudo fitoquímico do extrato da Alternanthera dentata da família Amaranthaceae e não observaram a presença de alcaloides nas folhas destas plantas. Os alcaloides tem apresentado atividade diurética, anestésica, analgésica, amebicida, estimulante do SNC, antiviral, antitumoral, antitussígena, dentre outras relatadas em literatura (RODRIGUES, 2010).
Figura 12 – Identificação de alcaloides. A formação de precipitado castanho avermelhado (A) indica reação positiva no extrato bruto de Iresine herbstii com o reagente Dragendorff.(B) controle negativo.
A
B
Fonte: autora (2017)
Em relação a estes achados, essas variedades de metabólitos podem estar associadas ao seu uso terapêutico, visto que muitos metabólitos secundários, em especial os compostos fenólicos, apresentam propriedades antioxidantes, e capacidade anticarcinogênica. Estudos revelam que estes antioxidantes de origem vegetal estão relacionados a outras propriedades biológicas, como cardioprotetoras, 40
antimutagênicas, antimicrobianas, entre outras, bem como exercem efeitos farmacológicos em distúrbios neurológicos. Estes metabolitos têm possibilitado a descoberta de compostos bioativos importantes na formulação de novos fitoterápicos (ADEWUSI; STEENKAMP, 2011; AHMED et al., 2013). No estudo fitoquímico de Alencar, Rossi e Pereira (2015) com espécies da família Amaranthaceae, foi identificada a presença de taninos e terpenoides no extrato da Alternanthera brasiliana e flavonoides e saponinas no extrato da Alternanthera dentata, como também não foi observada a presença de alcaloides nas folhas das plantas analisadas. Os testes fitoquímicos realizados no extrato da Iresine herbstii, estão de acordo com os dados na literatura, no entanto foi observada a presença de alcaloides e ausência de saponinas. Alencar, Rossi e Pereira (2015) constataram que atividades analgésicas e antibacterianas estão relacionadas à presença dos taninos, a ação analgésica e anestésica aos terpenoides, assim como ação anti-inflamatória, antialérgica, antioxidante aos flavonoides e ação anti-inflamatória e antiviral às saponinas. Natalli et al. (2011) realizaram a triagem fitoquímica no extrato das folhas de Amaranthus viridis L. da família Amaranthaceae e encontraram reações semelhantes as que foram encontradas neste estudo. Os autores evidenciaram a presença de compostos fenólicos, taninos, flavonoides, saponinas, alcaloides, glicosídeos cardiotônicos, esteroides e triterpenoides, cujo extrato apresentou atividade bactericida significativa no extrato etanólico, revelando potencial efeito antimicrobiano para as cepas analisadas. Os resultados mostrados para testes fitoquímicos em estudos na literatura evidenciam que, apesar das espécies pertencerem a um mesmo gênero, podem apresentar diferentes composições de metabólitos. Além disso, alguns metabólitos secundários podem apresentar-se em baixas concentrações em determinadas plantas, o que dificulta a sua determinação, devido à baixa sensibilidade dos testes. De acordo com Gobbo-Neto e Lopes (2007), há uma série de fatores que podem influênciar no conteúdo dos metabólitos secundários de plantas medicinais, tais como sazonalidade, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, altitude, disponibilidade de nutrientes, exposição à patógenos, entre outros. Diante dos resultados negativos para heterosídeos cardiotônicos na Iresine herbstii, foi constatado que tais fatores podem ter influenciado na composição dos metabólitos secundários da planta, visto que em espécies desta família tem-se 41
encontrado a presença destes compostos que possuem propriedades terapêuticas no tratamento de insuficiência cardíaca. Os testes fitoquímicos são importantes para auxiliar pesquisadores na escolha das espécies de plantas para estudos químicos e farmacológicos, assim como também, comprovar a presença de substâncias antioxidantes em alimentos e bebidas e identificar o grau de maturação e condições ambientais (ALVES et al., 2010). Portanto, identificar os compostos químicos presentes no extrato bruto de Iresine herbstii contribui para avanços científicos em relação à área de Fitoquímica como também na obtenção de compostos químicos para descoberta de novos fármacos e fitoterápicos, sendo importante a realização de estudos mais aprofundados com o extrato bruto da espécie, de modo a possibilitar o conhecimento dos extratos e indicar a natureza destas substâncias que tem feito parte das preparações populares. Os resultados obtidos através dos testes fitoquímicos mostram as diferenças de metabólitos secundários na espécie Iresine herbstii, assim como outras espécies estudadas, que apesar de fazerem parte do mesmo gênero, apresentam diferentes composições químicas nos metabolitos, podendo assim refletir na sua eficácia e segurança. Uma vez que os testes realizados até aqui são preliminares, uma avaliação da concentração dos metabólitos deve ser realizada para que se possam confirmar os resultados.
4.2 ENSAIO DE TOXICIDADE COM ARTEMIA SALINA LEACH
Os resultados do ensaio de toxicidade mostraram que o valor da concentração letal média (CL50) do extrato da Iresine herbstii foi de 562,4 µg/mL, obtida a partir do gráfico da atividade tóxica (Figura 13), apresentando baixa toxicidade. O critério utilizado para classificação de toxicidade, utilizando Artemia salina, foi baseado nas concentrações das CL50 segundo Amarante et al. (2011), onde considera-se baixa toxicidade quando a CL50 for superior a 500 μg/ml-1; moderada para CL50 entre 100 a 500 μg /ml-1 e muito tóxico quando a CL50 foi inferior 100 μg/ml-1. Neste sentido, a CL50 encontrado neste estudo demonstra que o extrato da espécie Iresine herbstii apresenta baixa toxicidade (tabela 2) 42
Figura 13 – Atividade Citotóxica da Iresine herbstii frente à Artemia salina Leach.
Fonte: autora (2017)
TABELA 2 - Valores de CL50 obtidos no bioensaio de letalidade frente à Artemia salina Leach para os testes do extrato da Iresine herbstii.
Concentração
(µg / mL) Ativ.Citot. (%) CL50=µg/mL
1000 93,33
800 76,66 562,41
400 33,33
250 13,33
100 6,66
O coeficiente de correlação obtido foi R²=0,9924
43
Em relação a isto, Scalco e Munhoz (2016) analisando metabólitos secundários em vegetais da família Amaranthaceae, através do teste de toxicidade para determinação da CL50 através do microcrustáceo Artemia salina encontraram na Alternanthera brasiliana e Miconia albicans pequena toxicidade frente ao microcustáceo, mas a Chenopodium ambrosioides apresentou uma alta toxicidade, representando letalidade e alto grau de intoxicação se houver ingestão de seu óleo essencial. Neste trabalho foram feitas comparações entre plantas de outras espécies diferentes. A Iresine herbstii, pelo fato de haver poucos estudos relacionados ao gênero e família da mesma. De acordo com os resultados obtidos, pode-se verificar que o extrato bruto de Iresine herbstii apresenta baixa toxicidade. Alguns fatores como, por exemplo, o meio ambiente (luz e temperatura) podem influenciar em alguns resultados dos testes com Artemia. No entanto, estudos têm sido correlacionados à toxicidade de extratos de plantas frente à Artemia salina a outras potenciais atividades farmacológicas, tais como antimicrobiana, antiparasitária e antitumoral. Salvador et al., (2006) afirmam que poucas espécies da família Amaranthaceae tem sido estudada e existem raros trabalhos explorando seu potencial. Por isso a importância de novos testes serem feitos neste sentido. Outros estudos utilizando outros bioensaios são necessários para caracterizar melhor os efeitos da planta estudada. Além disso, outros extratos desta planta estão sendo testados pelo mesmo grupo de trabalho, a fim de aprofundar os conhecimentos acerca do perfil farmacológico desta espécie. 44
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
De acordo com os resultados obtidos nos testes fitoquímicos através dos métodos colorimétricos e de precipitação do extrato bruto metanólico das folhas da espécie Iresine herbstii, pode-se constatar a presença de compostos fenólicos, flavonoides, taninos, esteroides/triterpenoides e alcaloides. Não sendo observada a presença de saponinas e heterosídeos cardiotônicos. Assim, identificar os compostos químicos presentes na Iresine herbstii contribui para avanços científicos em relação à área de fitoquímica. Sendo importante a realização de estudos mais aprofundados com extrato bruto da espécie, a fim de isolar e identificar compostos bioativos. Diante dos resultados para avaliação da toxicidade do extrato bruto metanólico da espécie Iresine herbstii, o ensaio de toxicidade mostrou que o valor da concentração letal média (CL50) do extrato foi de 562,4 µg/ml, obtido a partir dos testes de letalidade frente à Artemia salina. Apesar de ter sido constatada a baixa letalidade da Iresine herbstii frente à Artemia salina Leach, recomenda-se que sejam realizados novos testes químicos e toxicológicos com esta espécie, visto que os dados são insuficientes para determinar o potencial de toxicidade da espécie analisada.
45
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