Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l’Univers Département de Biologie Laboratoire des produits Naturels

THÉSE Présentée par Mr TOUL Fethi

Pour l’obtention du diplôme de Doctorat en Biologie Option : Biologie cellulaire et biochimie

Profil polyphénolique et activité antioxydante des

extraits des différents organes de Pistacia atlantica

Desf. subsp. atlantica de la région de Tlemcen

Soutenue le 15/03/2018, devant le jury composé de :

Pr. DJAZIRI Rabah Président Univ.Tlemcen

Pr. ATIK-BEKKARA Fawzia Directrice de thèse Univ.Tlemcen Dr. BELYAGOUBI- Co-directrice Univ.Tlemcen BENHAMMOU Nabila Examinatrice Pr. BELARBI Meriem Univ.Tlemcen

Pr. BENMEHDI Hocine Examinateur Univ.Bechar

Pr. DJEBLI Noureddine Examinateur Univ.Mostaganem

Année Universitaire : 2017/2018

‘‘La perfection n’est pas de ce monde.

Ne sont parfaites que les intentions.’’ -proverbe arabe - DÉDICACES

Au centre de gravité et à l’esprit de notre famille, mon cher grand -père .

À celui qui a fait de ma réussite sa préoccupation majeure, mon honorable père .

À celle qui m’a donné vie et ne cesse de m’en donner, ma précieuse mère .

À celle qui partage ma vie et qui ne cesse de m’encourager, ma chère épouse .

À celle qui m’apporte joie, à la fragrance de la maison, notre petite R AYHANA .

À ceux qui m’épaulaient et qui m’épaulent toujours, mes chaleureux frère et sœurs

À ma belle -famille , mes amis et tout le reste de ma famille .

TOUL Fethi REMERCIEMENTS

Je voudrais tout d'abord adresser toute ma gratitude au professeur ATIK- BEKKARA Fawzia , d’avoir accepté la direction de cette thèse, je tiens à lui exprimer ma profonde reconnaissance et ma gratitude pour sa disponibilité, sa patience, ses conseils, sa compréhension et ses qualités pédagogiques et scientifiques. Veuillez trouver ici, madame, ma reconnaissance et tout mon respect.

Un spécial remerciement est adressé à Mme BELYAGOUBI-BENHAMMOU Nabila, maitre de conférences au département de Biologie, faculté des sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers, université Abou Bekr Belkaid Tlemcen , pour son aide scientifique et matérielle et ses conseils précieux, qu’elle trouve ici le témoignage de ma profonde reconnaissance.

Je tiens à remercier Monsieur DJAZIRI Rabah , professeur au département de biologie, faculté des sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers, université Abou Bekr Belkaid Tlemcen, pour l’honneur qu’il m’a fait en acceptant de juger ce travail et de présider le jury.

Je désire aussi remercier Madame BELARBI Meriem, Professeur au département de biologie, facultés des sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers, université Abou Bekr Belkaid Tlemcen, d’avoir accepté de lire et d’examiner ce travail, je tiens à lui transmettre tous mes sentiments d’estime et de respect que je lui dois.

J’exprime également mes sincères remerciements à Mr. DJEBLI Noureddine , Professeur au département de Biologie, Université Abdelhamid IBN BADIS Mostaganem, d’avoir accepté d’examiner cette thèse, qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude.

Mes remerciements vont également à Mr. BENMEHDI Houcine , Professeur au département de Biologie, Université TAHRI Mohamed Bechar, pour m’avoir honoré d’être examinateur de ce travail. Je tiens à vous exprimer, Monsieur, ma sincère reconnaissance et mon plus profond respect. Je remercie aussi Mr. KOKKALOU Eugenius, professeur et chef du laboratoire de pharmacognosie au sein de la faculté de pharmacie à l’université d’Aristote de Thessalonique, Grèce, de m’avoir accueilli dans son laboratoire et d’avoir mis à ma disposition tout le matériel et le personnel du laboratoire, qu’il sache que je lui en suis très reconnaissant.

Un remerciement particulier à Mme. MOUSSOUNI Sonia, Docteur en pharmacie à l’université d’Aristote de Thessalonique, Grèce, pour m’avoir gentiment apporté son aide qui m’était très précieux. Je vous adresse, madame, tout le respect et l’estime que je vous dois.

Je remercie spécialement, Mme DJENDAR Amina , ma chère femme, pour son aide, pour sa patience et sa présence et pour son soutien permanent.

Un remerciement fraternel et amical à Mme SELADJI Meryem , à Mme ZITOUNI Amel , à Mme GHEMBAZA Nacera , à Mme DIB Hanane et à Mr HACI Imad Abdelhamid, pour leurs aides scientifiques et leurs bonnes humeurs.

Enfin j’adresse mes remerciements à tous ce qui ont participé à l’accomplissement de ce travail, de prés et de loin.

Merci.

رجاا وعفإافداتأة، وانةاتع،،وال، ةا" Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica "وارت ً ااا ّاوذتاداتال.

فااإاطادةتا أءااذ،وذأيأىادة ة، وا ا ات : ارة ادة ة،ارا DPPH ،رةاوارة ارون،إإا ىاداتالل ت.

ن ل ا أن ا ام ا ا دات ال، اات،اتوات،أنأرةدة ة،ارا DPPH وارون دةاا (IC50) 0.016 /و 0.006 /،.

ا ا ام ا ادة ة وﻩ دات ال لاتا:وااا،و اا د و اواازوالإ ا ا ناوي ا د «NMR -2D» أااتا. ّ لاااأرت و:إنر ،ن و ن.

اتا : ا ،داتات،اادةة،اوا از، اناويا د . .

Résumé

Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un programme de longue haleine visant à découvrir des antioxydants naturels. Plusieurs plantes font l’objet de nombreuses recherches dans notre laboratoire, nous citons l’espèce Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica , une plante médicinale de la pharmacopée traditionnelle de l’Algérie, très riche en substances bioactives notamment les polyphénols.

Le but de ce travail est d’évaluer l’activité antioxydante des extraits obtenus à partir des différents organes de P.atlantica afin de pouvoir connaitre celui ayant le pouvoir antioxydant le plus élevé, ceci a été fait par plusieurs techniques : la capacité antioxydante totale, DPPH *, Pouvoir de réduction du Fer et le test d’inhibition du blanchiment de β-carotène. En outre,les teneurs en polyphénols ont été mesurées par des techniques spectrophotométriques.

L’extrait brut des bourgeons s’est révélé le plus riche en polyphénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols et en tanins. L’extrait des anthocyanes de la même partie a montré l’activité antioxydante la plus importante, en comparaison avec l’antioxydant de référence (BHT), dans les deux tests de piégeage du radical libre DPPH *et d’inhibition du blanchiment de β-carotène, 16 µg/mL et 6µg/mL, respectivement.

L’extrait brut des bourgeons, à cause de sa forte teneur en polyphénols et son importante activité antioxydante, a fait l’objet de plusieurs fractionnements successifs, par chromatographie sur couche mince, chromatographie sur colonne ouverte chromatographie CLHP-préparative. Ces fractionnements nous ont permis de passer à l’identification des fractions obtenues par RMN-2D.

Ce travail nous a permis de mettre en évidence quatre molécules : la 7- ethoxycoumarine, 3',5,7-Trihydroxy-4'-methoxyflavanone, la 7-hydroxy-5- methoxycoumarine et la 5,6,7,4'-tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside.

Mots clés : Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica , composés phénoliques, activité antioxydante, CLHP, RMN-2D. Abstract

This work is a part of a long-term program, which aims to discover natural antioxidants. Several plants are the subject of several researches in our laboratory; we quote the species Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica , a medicinal plant of the traditional pharmacopoeia of Algeria, very rich in bioactive substances including polyphenols.

The aim of this work is to evaluate the antioxidant activity of the extracts obtained from the different organs of P.atlantica in order to know the one having the highest antioxidant power, this has been done by several techniques : total antioxidant capacity , DPPH * radical scavenging assay, Ferric Reducing Ability assay and β-carotene bleaching assay. In addition, polyphenol contents were measured by spectrophotometric techniques.

The crude extract of buds was the richest extract in total polyphenols, flavonoids, flavonols and tanins. The anthocyanins extract of the same part showed the most important antioxidant activity, compared to reference (BHT), in DPPH * radical scavenging and β-carotene bleaching assays, 16 µg / mL and 6 µg / mL, respectively.

Buds crude extract, because of its high content of polyphenols and its high antioxidant activity, has been subjected to several successive fractionations, by thin layer chromatography, open column chromatography, and preparative-HPLC. These fractionations allowed us to go on to identify the fractions obtained by NMR-2D.

This work allowed us to identify four molecules: 7-ethoxycoumarin, 3 ', 5,7- Trihydroxy-4'-methoxyflavanone, 7-hydroxy-5-methoxycoumarin and 5,6,7,4'- Tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside.

Keywords : Pistacia atlantica Desf.subsp atlantica , phenolic compounds, antioxidant activity, HPLC, NMR-2D.

TABLE DES MATIÈRES

Dédicace Remerciements Résumé Abstract Table des matières Liste des figures Liste des photos Liste des tableaux Abréviations Introduction……………………………………………………………………… 1

Première partie : Synthése bibliographique

CHAPITRE 1 : Description botanique, composition chimique et activités 3 biologiques de Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica

I- Généralités sur la plante étudiée………………………………………………. 3 I-1- Description botanique et systématique de Pistacia atlantica Desf…………. 3 I-2- Propriétés et usages thérapeutiques…………………………………………. 4 I-3- Travaux antérieurs…………………………………………………………... 5

CHAPITRE 2 : Les composés phénoliques, classification et activité 7 antioxydante

I- Classification des composés phénoliques……………………………………... 7 I.1. Les non flavonoïdes…………………………………………………………. 7 I.1.1. Acides phénoliques (C6-C1 ou C6-C3)…………………………………… 7 I.1.2. Stilbènes C6-C2-C6………………….………………….………………… 9 I.1.3. lignines (C6-C3)n………………….………………….…………………… 9 I.1.4. Lignanes (C6-C3)2………………….………………….………………….. 11 I.1.5. Coumarines C6-C3………………….………………….………………….. 11 I.2. Les flavonoïdes C6-C3-C6………………….………………….…………… 12 I.2.1. Flavonols………………….………………….………………….………… 13 I.2.2. Flavones………………….………………….…………………………….. 13 I.2.3. Flavanones………………….………………….………………….………. 14 I.2.4. Flavan-3-ols ou flavanols………………….………………….…………… 14 I.2.5. Isoflavones………………….………………….………………….………. 15 I.2.6. Anthocyanes………………….………………….………………………… 15 I.3. Tanins………………….………………….………………….……………… 16 I.3.1. Tanins hydrolysables………………….………………….……………….. 17 I.3.2. Tanins condensés………………….………………….…………………… 17 II- Rôle et intérêt des composés phénoliques………………….……………….. 18 II-1- Chez les végétaux………………….………………….…………………... 18 II-2- Chez les humains………………….………………….…………………… 19 III- Antioxydants et radicaux libres ………………….………………….……… 19 III.1. Les antioxydants………………….………………….……………………. 19 III.1.1. Généralités sur les antioxydants………………….……………………… 19 III.1.2. Mécanismes d’action des radicaux libres………………….…………….. 19 III.1.3. Les principales sources d’antioxydants………………………………….. 23 III.1.4. Rôles des complexes antioxydants………………………………………. 25 III.2. Intérêts économiques des composés phénoliques…………………………. 26 IV-Objectifs généraux de la thèse……………………………………………….. 27

Deuxième partie : Matériel et méthodes 29

CHAPITRE 1 : Screening phytochimique, extraction et teneurs en 29 composés phénoliques

I- Identification botanique……………………………………………… 29 II- Récolte et préparation des échantillons……………………………… 29 III- Tests phytochimiques………………………………………………... 30 IV- Extractions et dosages des composés phénoliques…………………... 30 IV-1- Préparation des extraits bruts (phénols totaux)…………………………… 30 IV-2- Extraction des flavonoïdes………………………………………………... 30 IV-3- Extraction des tanins…………………………………………………….. 31 IV-4- Extraction des anthocyanes……………………………………………….. 31 IV-5- Calculs des rendements des extractions…………………………………... 31 IV-6- Dosage des phénols totaux………………………………………………... 32 IV-7- Dosage des flavonoïdes…………………………………………………… 32 IV-8- Dosage des flavonols……………………………………………………… 32 IV-9- Dosage des tanins condensés…………………………………………….. 33 IV-10- Dosage des anthocyanes…………………………………………………. 33

CHAPITRE 2 : Evaluation du pouvoir antioxydant des extraits 34

I- La capacité antioxydante totale (CAT)……………………………………... 34 II- Le piégeage du radical libre DPPH…………..…………..…………..…….. 35 III- La réduction du fer FRAP (Ferric reducing antioxidant power) …………... 36 IV- Le test de blanchiment du β-carotène…………..…………..………………. 36

CHAPITRE 3 : Fractionnement, purification et identification 38

I- Identification et quantification des composés phénoliques dans les extraits 38 actifs par Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance……………. I-1- hydrolyse acide des échantillons……………………………………………. 39 I-2- Mode opératoire……………………………………………………………... 39 II- Fractionnement…………………………………………………………...... 40 II-1- Chromatographie sur couche mince…………..…………..………………... 40 II-2- Chromatographie en phase liquide sur colonne...………..…………..…….. 40 II-3- Chromatographie sur couche mince préparative…………..……………….. 42 II-4- Chromatographie liquide à haute pression semi-préparative (CLHP)……... 42 III- La résonance magnétique nucléaire (RMN-2D)…………………………….. 43 IV- Analyse statistique…………………………………………………………... 44

Troisième partie : Résultats et discussion 45 CHAPITRE 1 : Screening phytochimique, extraction et teneurs en 45 composés phénoliques

I- Introduction…………………………………………………………………… 45 II- Résultats……………………………………………………………………… 46 II-1- Tests phytochimiques………………………………………………………. 46 II-2- Rendements des extraits……………………………………………………. 47 II-3- Teneurs en phénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols et en tanins……. 48 II-3-1- Courbe d’étalonnage pour le dosage des phénols totaux………………… 49 II-3-2- Dosage des phénols totaux………………………………………………. 50 II-3-3- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Flavonoïdes…………………… 50 II-3-4- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Flavonols……………………... 51 II-3-5- Dosage des Flavonoïdes et des Flavonols……………………………….. 51 II-3-6- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Tanins………………………… 52 II-3-7- Dosage des Tanins condensés……………………………………………. 53 II-3-8- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Anthocyanes………………….. 53 II-3-9- Dosage des Anthocyanes………………………………………………… 54 III- Discussion…………………………………………………………………… 55 IV- Conclusion…………………………………………………………………... 56

CHAPITRE 2 : Evaluation du pouvoir antioxydant des extraits 57

I- Introduction…………………………………………………………………… 57 II- Evaluation du pouvoir antioxydants des extraits……………………………... 57 II-1- La capacité antioxydante totale…………………………………………….. 57 II-2- Le piégeage du radical libre DPPH………………………………………… 59 II-3- La réduction du fer (FRAP) ……………………………………………….. 60 II-4- Le test de blanchiment du β-carotène……………………………………… 62 III-Discussion……………………………………………………………………. 65 IV- Conclusion…………………………………………………………………... 67

CHAPITRE 3 : Fractionnement, purification et identification des 68 composés actifs I-Introduction……………………………………………………………………. 68 II- Résultats………….………….………….………….………….……………... 69 II-1- Identification et quantification des composés phénoliques dans les extraits 69 actifs par CLHP………….………….………….………….………….………….

II-2-Séparation et purification des composés actifs………….………….………. 71 II-2-1- Première étape : Chromatographie sur couche mince (CCM)……………. 71 II-2-2- Deuxième étape : Chromatographie en phase liquide sur colonne ouverte 71 II-2-3- Troisième étape : tester les fractions actives par DPPH ………………… 72 II-2-4- Quatrième étape : CLHP semi-préparative...... 73 II-2-5-Cinquième étape : Colonne ouverte et CCM………………………………… 73 II-2-6-Sixième étape : résonnance magnétique nucléaire bidimentionnelle…….. 75 Interprétation des spectres RMN-2D et identification des composés purifiés...... 75 Molécules F16-1………….………….………….………….………….…...... 75 Molécules F16-3………….………….………….………….……………...... 78 Molécules F16-4………….………….………….………….……………...... 82 Molécules F16-5-2………….………….………….………….…………………. 86 III-Discussion……………………………………………………………………. 92 Conclusion générale ……………………………………………………………...... 94 Références bibliographiques ………………………………………….……………….. 96 Annexes …………………………………………………………………………………… 109 Valorisations des travaux de recherche ……………………………………………… 116

LISTE DES FIGURES

Figure 01 : Systématique et photos de Pistacia atlantica Desf. subsp. Atlantica 04

Figure 02 : Quelques exemples des acides hydroxybenzoïques………………... 08 Figure 03 : Quelques exemples des acides hydroxycinnamiques………………. 08 Figure 04 : Quelques exemples des structures chimiques des stilbènes………... 09 Figure 05 : principaux constituants de la lignine……………………………….. 10 Figure 06 : Structure d’une lignine……………………………………………... 10

Figure 07 : Exemples des structures chimiques des lignanes…………………... 11 Figure 08 : Quelques exemples des structures chimiques des coumarines……... 12 Figure 09 : Structure de base des flavonoïdes…………………………………... 12 Figure 10 : Des exemples des structures chimiques des flavonols……………... 13 Figure 11 : Des exemples des structures chimiques des flavones………………. 14 Figure 12 : Des exemples des structures chimiques des flavanones……………. 14 Figure 13 : Deux exemples des structures chimiques des flavan-3-ols………… 15 Figure 14: Deux exemples des structures chimiques des isoflavones………….. 15 Figure 15 : Deux exemples des structures chimiques des anthocyanes………… 16 Figure 16 : Exemple des tanins hydrolysables………………………………….. 17 Figure 17: Exemple des tanins condensés………………………………………. 18 Figure 18 : Métabolites secondaires et prévention des certaines maladies……... 22 Figure 19 : Production des formes actives de l’oxygène et des intermédiaires qui en deroulent………………………………………………………………….. 23 Figure 20 : Plan de travail : extraction, dosage et activité antioxydante………... 45 Figure 21 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique pour le dosage des phénols totaux…………………………………………………………………………….. 49

Figure 22 : Teneurs en phénols totaux………………………………………….. 50 Figure 23 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des flavonoïdes 51 Figure 24 : Courbe d’étalonnage de la quercétine pour le dosage des flavonols 51 Figure 25 : Teneurs en Flavonoïdes et en Flavonols……………………………. 52

Figure 26 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des tanins condensés………………………………………………………………………... 52

Figure 27 : Teneurs en tanins………………………………………………….. 53

Figure 28 : Courbe d’étalonnage de la délphinidine pour le dosage des anthocyanes……………………………………………………………………...... 54

Figure 29 : Teneurs en anthocyanes…………………………………………….. 54 Figure 30 : Courbe d’étalonnage de l’acide ascorbique pour l’activité antioxydante totale……………………………………………………………………………………... 53

Figure 31 : Pourcentages d’inhibition du radical libre DPPH en fonctions des différentes concentrations du meilleur extrait de chaque partie étudiée…………………………….. 60

Figure 32 : Pouvoir réducteur du Fer du meilleur extrait de chaque partie étudiée…….. 62 Figure 33 : pourcentages d’inhibition du blanchiment de la β-caroténe en fonctions des différentes concentrations du meilleur extrait de chaque partie étudiée………………… 64 Figure 34 : Etapes de fractionnement, de purification et d’identification des composés actifs……………………………………………………………………………………... 68

Figure 35 : Exemple de plaque CCM après chromatographie sur colonne……... 71 Figure 36 : Etapes de fractionnement, de purification et d’identification des composés actifs contenus dans l’extrait brut des bourgeons……………………………………….. 74

Figure 37 : Spectre UV de la fraction F16-1……………………………………. 75

Figure 38 : Spectre 1 Η-NMR de la molécule F16-1 (CD 3OD, 500MHz)……… 76 1 1 Figure 39 : Spectre Η- Η COSY de la molécule F16-1 (CD 3OD, 500MHz)….. 76 Figure 40 : Structure de la 7-ethoxycoumarine…………………………………. 77 Figure 41 : Spectre UV de la molécule F16-3…………………………………... 78 1 Figure 42 : spectre H-NMR de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)……….. 80 1 1 Figure 43 : Spectre Η- Η COSY de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)….. 80

Figure 44 : Spectre HSQC de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)…………. 81 Figure 45 : Structure de la 3',5,7-Trihydroxy-4'-methoxyflavanone …………... 81 Figure 46 : Spectre UV de la molécule F16-4…………………………………... 82 1 Figure 47 : Spectre H-NMR de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)………. 83

Figure 48 : Spectre COSY de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)…………. 84

Figure 49 : Spectre HSQC de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)…………. 84

Figure 50 : Spectre HMBC de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)………… 85 Figure 51 : Couplages H-C résultant de la HMBC……………………………... 85 Figure 52 : Structure de la 5,6,7,4'-tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside……… 86

Figure 53 : spectre UV de la molécule F16-5-2………………………………… 86 Figure 54 : Spectre 1Η-RMN de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)……. 89 Figure 55 : Spectre 1Η-1Η COSY de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz).. 89 Figure 56 : Spectre HSQC de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)………. 90 Figure 52 : Structure de la 5,6,7,4'-tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside……… 90

LISTE DES PHOTOS

Photo 01 : Pistacia atlantica Desf. subsp. Atlantica ………………...... 04

Photo 02 : Pistacia atlantica Desf. subsp. Atlantica ………………...... 04

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 01 : Système d’élution de la chromatographie sur colonne…………… 40 Tableau 02 : Gradient d’élution de la chromatographie CLHP………………… 42 Tableau 03 : Systéme Résonance magnétique nucléaire bidimentionnelle…….. 43 Tableau 04 : Résultats des tests phytochimiques réalisés sur les différents organes de Pistacia atlantica Desf. Subsp atlantica………………………………… 46 Tableau 05 : Rendements des extractions………………………………………. 48 Tableau 06 : Résultats des teneurs en phénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols et en tanins…………………………………………………………… 49 Tableau 07 : Résultats de la capacité antioxydante totale des extraits des différents organes exprimés en mg d’équivalent acide ascorbique par gramme de matière sèche (mg EAA/g MS)…………………………………………………... 58 Tableau 08 : Résultats du piégeage du radical DPPH des extraits des différents organes exprimés en mg/mL…………………………………………………….. 59 Tableau 09 : Résultats du test de la réduction du Fer des extraits des différents organes exprimés en mg/mL…………………………………………………….. 61 Tableau 10 : Résultats du test du blanchiment du β-carotène des extraits des différents organes exprimés en mg/mL…………………………………………... 63 Tableau 11 : Analyse qualitative et quantitative de la teneur phénolique (µg/g MS) de quelques extraits………………………………………………………… 70

Tableau 12 : Résultats du test du blanchiment du β-carotène des extraits des différents organes exprimés en mg/mL…………………………………………... 72 Table au 13 : Masses des sous-fractions issues de CLHP-préparative………….. 73 Table au 14 : Masses des sous-fractions issues de la seconde chromatographie sur colonne…………..…………………………………………………………... 73 Table au 15 : Résultats RMN-1H et RMN-13 C de la molécule F16-1…………… 76 Table au 16 : Résultats RMN-1H et RMN-13 C de la molécule F16-3…………… 79 Table au 17 : Résultats RMN-1H et RMN-13 C de la molécule F16-4…………… 83 Table au 18 : Résultats RMN-1H et RMN-13 C de la molécule F16-5-2………… 88

ABRÉVIATIONS

AA : Acide ascorbique

AG : Acide gallique

BHA : Butylhydroxyanisole

CAT : Capacité antioxydante totale

CCM : Chromatographie sur couche mince

DO : Densité Optique

DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl

EOR : espèce oxygénée reactive

FRAP : Ferric reducing antioxidant power

CI50 : Concentration permettant d’inhiber 50% du radical DPPH

CE50 : Concentration effective médiane mg EAA/g MS : mg équivalent acide ascorbique par gramme de matière sèche mg EC/g MS : mg équivalent catéchine par gramme de matière sèche mg EAG/g MS : mg équivalent acide gallique par gramme de matière sèche

RMN-2D : Résonance magnétique nucléaire bidimentionnelle

CLHP : chromatographie en phase liquide à haute performance

UV/Vis : Ultra-violet/Visible

CD 3OD: Méthanol deutéré

COSY: spectroscopie de correlation homonucléaire

HMBC: Spectroscopie de corrélation à liaisons multiples hétéronucléaires

HSQC: Spectroscopie de corrélation quantique unique hétéronucléaire


 Introduction générale

L’Algérie par sa position géographique présente une grande diversité de biotope occupée par une importante richesse floristique. Cette flore compte environ 3139 espèces reparties dans près de 150 familles parmi lesquelles 653 espèces sont endémiques soit un taux d’endémisme d’environ 12,6% (Mate, 2009) . A cela s’ajoute la riche connaissance Algérienne des bienfaits et des utilisations des plantes pour guérir ou soulager les différents malaises.

Dans le cadre de la valorisation de la médecine traditionnelle, il y a eu un intérêt croissant ces dernières décennies dans l'étude des plantes médicinales et leurs utilisations traditionnelles dans différentes régions du monde. Aujourd'hui, selon l'organisation mondiale de la santé (OMS), près de 80% des populations dépendent de la médecine traditionnelle pour des soins de santé primaire. Des avantages économiques considérables dans le développement de la médecine traditionnelle et dans l'utilisation des plantes médicinales pour le traitement des diverses maladies ont été constatés (Muthu et al., 2006) d’où la nécessité d’une valorisation de la médecine traditionnelle.

Les plantes médicinales restent encore le premier réservoir de nouveaux médicaments. Elles sont considérées comme source de matière première essentielle pour la découverte de nouvelles molécules nécessaires à la mise au point de futurs médicaments (Maurice, 1997) . Chacune de ces plantes peut contenir des centaines voire des milliers de métabolites secondaires, ou de principes actifs qui peuvent produire différentes actions physiologiques sur le corps humain (Edeoga et al., 2005) .

Les molécules de synthése, tels que le butyl hydroxy anisole (BHA) et le butylhydroxytoluène (BHT) sont certes très efficaces mais susceptibles de manifester des effets secondaires et voir même toxiques (Manian et al., 2008) . Plusieurs molécules à propriétés antioxydantes sont isolées des plantes. Il est donc loisible de chercher des antioxydants naturels efficaces sans ou avec moins d’effets secondaires pour remplacer les synthétiques ou pour plus de choix à base des plantes alimentaires et médicinales.

Actuellement, les scientifiques favorisent le développement d’une nouvelle génération de substances antimicrobiennes et/ou antioxydantes d’origine végétale pour remplacer celles de synthèse. De même, un certain nombre de secteurs industriels se tournent de nouveau vers l’incorporation de ces molécules aux caractéristiques biologiques intéressantes dans leurs formulations (Taviano et al., 2013) . A cet effet, des études scientifiques s’intéressent à la Phytochimie et aux activités des extraits de plantes, dans le but d’élargir les perspectives de valorisation des produits naturels, raison pour laquelle

1 Introduction générale

notre laboratoire et particulièrement notre équipe s'intéresse avec minutie à la chimie et aux activités biologiques (antioxydantes et antimicrobiennes) des extraits végétaux des plantes soupçonnées médicinales dans le but d'élargir les perspectives de valorisation des produits naturels (Atik Bekkara et al., 2007 ; Bendimerad et al., 2007 ; Benhammou et al., 2009 ; Belarbi et al., 2011 ; Bekhechi et al., 2012; Dib et al., 2013 ; Seladji et al, 2014 ; Ghembaza et al., 2014.

Dans cette optique, les objectifs généraux de cette thèse se focalisent sur la mise en évidence de l’activité antioxydante de l’espèce Pistacia atlantica Desf. Subsp. Atlantica (en particulier la capacité antioxydante des polyphénols présents) et sur la caractérisation physico-chimique des molécules qui seraient responsables de cette activité. Cette plante spontanée a été soumise à plusieurs études phytochimiques, telles que celles de Benhammou et al. (2008, 2009) et Belyagoubi-Benhammou et al. (2014), Mais seulement ses feuilles et ses graines ont fait l’objet majeur de ces études. Pour approfondir davantage notre recherche, nous avons choisi d’étaler l’étude dans sa totalité à savoir une recherche rationnelle prenant en charge toute la plante, des feuilles jusqu’aux racines, sept organes en totalité.

Cette recherche s’inscrit dans une démarche différente, puisqu’elle vise à étudier, dans un premier temps, non pas la plante dans sa globalité, mais tous les organes qui la composent et chaque organes à l’écart de l’autre (Fruits, Feuilles, Bourgeons, Tiges, Ecorce interne, Ecorce externe et Racines).

Cette démarche a un double objectif : celui d’améliorer les connaissances quasi inexistantes relatives à la capacité antioxydante de la plupart des parties étudiées et à sa composition phytochimique, ensuite d’entrevoir des usages nouveaux par la création de produits dérivés à court ou moyen terme, tels que des compléments alimentaires, des aliments fonctionnels (alicaments) ou des produits cosmétiques et pharmaceutiques.

Ce travail s’articule autour de trois parties :

• La première partie est une synthèse bibliographique sur la plante étudiée, les composés phénoliques, les oxydants et les antioxydants ; • La seconde partie est consacrée à au volet expérimental : extractions, dosages spectrophotométriques, tests antioxydants, purification et identification des molécules bioactives. • La troisième partie est consacrée aux résultats et à leurs discussion.

2

    Première partie : Synthèse bibliographique

CHAPITRE 1 : Description botanique, composition chimique et activités biologiques de Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica

I- Généralités sur la plante étudiée : II-1- Description botanique et systématique de Pistacia atlantica Desf. Subsp atlantica :

Le pistachier de l’Atlas (ou Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica ), vernaculairement appelé Bêtoum, Batma ou Iggh, est un arbre fort à odeur simplement résineuse (Quezel et Santa, 1963) .

Les feuilles sont larges, imparipennées, à rachis finement ailés, et à folioles lancéolées et abtuses au sommet caduques et chutent en automne, d’une couleur vert pâle, imparipennées, glabres et sessiles (El Zerey-Belaskri et Benhassaini, 2015).

Les fleurs apparaissent en été, elles sont apétales, rougeâtres et petites en panicules axillaires (Quezel et Santa, 1963).

Les fruits, dont l’appellation vernaculaire « El khodri », due à sa couleur vert foncée à maturité (Belhadj, 1999) , ou « Godhime » par la population saharienne (Benarradj, 2010), ou « Tikouaouéche » au Maroc (Yaaqobi et al.,2009) sont des drupes comestibles mesurant de 6 à 8 mm de long et de 5 à 6 mm de large à maturité, légèrement ovales et aplaties, elles prennent au départ une couleur jaune au mois de mars, qui change progressivement en rouge puis atteignent leur maturité au mois de septembre tout en ayant une couleur vert foncée.

L’écorce est lisse à l’âge jeune et squameux à un âge avancé, rouge au départ puis grisâtre assez claire avant de devenir dure, crevassée et noirâtre (Monjauze, 1980) , produit une résine mastic qui exsude naturellement de façon abondante par temps chaud (Belhadj, 2001) .

Le bêtoum est une espèce ubiquiste qui s’étend des îles Canaries jusqu’au Pamir en passant par l’Afrique du Nord, le Sahara septentrional et la Tripolitaine avec relique au Hoggar, Chypre, la Grèce, la Turquie, la Bulgarie, le Caucase, la Transcaucasie et l’Arménie, la Jordanie, la syrie, l’Iran, l’Iraq, l’Arabie, le Baloutchistan et le Pakistan.

3 Première partie : Synthèse bibliographique

Quezel et Santa (1963) et Ozanda (1977) considèrent le Bêtoum comme endémique de l’Afrique du Nord. Monjauze (1968, 1980) a localisé le Pistachier de l’Atlas dans le secteur oranais, dans le secteur algérois occidental, les hauts plateaux et l’Atlas saharien. Pour Zohary, (1996) , le grand Maghreb est concerné par une sous-espèce à part entière : Pistacia atlantica Desf subsp. Atlantica . Cette dernière étude a été mise à jour par El Zerey-Belaskri et Benhassaini (2016) prouvant que, dans cette même sous espèce : Pistacia atlantica Desf subsp. Atlantica, il y a des différences morphologiques dues à des facteurs climatiques et/ou environnementaux comme les précipitations, l’altitude et la température.

Systématique

Embranchement : Phanérogames ou Spermaphytes

Sous embranchement : Angiospermes

Classe : Eudicots

Sous classe : Rosidées

Ordre : Sapindales (Rutales) Photo 01 : Pistacia atlantica Desf subsp. Atlantica Famille : Anacardiacées- Térébinthacées

Genre : Pistacia

Espèce : Pistacia atlantica Desf.

Sous espèce : Pistacia atlantica Desf subsp. Atlantica

Limane et al., 2014 Photo 0 2 : Pistacia atlantica Desf subsp. Atlantica

Figure 01 : Systématique et photos de Pistacia atlantica Desf. subsp. Atlantica

II-2- Propriétés et usages thérapeutiques :

Grâce à ces potentiels antioxydant, antimicrobien, anti-inflammatoire, antipyrétique, antidiabétique et cytotoxique (Hamdan et Afifi, 2004 ; Topçu et al., 2007; Benhammou et al., 2008, 2009), les espèces du genre Pistacia occupent une place appréciable dans la médecine traditionnelle et pharmaceutique depuis l’antiquité, employées dans le traitement d'eczéma, les infections de la gorge, la lithiase rénale, l’asthme, l’estomac et comme un stimulant (Kordali et al., 2003) .

4 Première partie : Synthèse bibliographique

L'huile est souvent mélangée aux dattes écrasées et peut être consommée à toute heure de la journée avec du petit lait. L'huile a un goût très proche de celui du beurre, elle est très appréciée dans la région. Les graines sont séchées, écrasées ou moulues et ramassées avec de l'eau sucrée et consommées en boulettes ou bien séchées et croquées telles quelles comme des cacahuètes (Belhadj, 2007) .

L'écorce produit une résine-mastic qui exsude naturellement de façon abondante par temps chaud. Les populations locales s'en servent comme antiseptique du système respiratoire (Duru, 2003) et aussi pour d’autres usages médicaux (Belhadj, 2001) . L’arbre fournit un bois d'artisanat et toutes les espèces du pistachier constituent un apport en fourrage considérable pour l'alimentation du bétail surtout en automne. Cette essence peut entrer dans le cadre de la lutte contre la désertification utilisée pour la fixation des dunes, comme brise-vents, elle est également source en bois de chauffage dans les régions retranchées. En Algérie, l'utilisation de la culture reste faible malgré son potentiel d'adaptation aux conditions arides du milieu. (Belhadj, 2008) . Les fruits trouvent leur application dans la cuisine et les pratiques médicinales algériennes en particulier, dans la région de Djelfa, Laghouat et Ghardaïa.

Utilisées aussi comme antiseptique, antifongique et dans les maladies abdominales (Baba Aissa, 2000) . Le suintement du tronc d’arbre donnant l’encre rouge est utilisé dans la tannerie des peaux (Hamdan et Afifi, 2004) . Chez les marocains, la décoction des feuilles est largement employée pour traiter les infections de l’oeil (El-Hilaly et al., 2003) .

II-3- Travaux antérieurs :

L’analyse phytochimique de différentes parties de la plante a été l’objet de quelques études. Les potentiels antioxydants des espèces du Pistacia sont du en particulier à la présence des flavonoïdes et des flavones (Kawashty et al., 2000 ; Topçu et al., 2007) , des gallotanins (Wei et al., 2002 ; Zhao et al., 2005) et des phénols simples tels que l’acide gallique et l’acide p-coumarique (Benhammou et al., 2008) .

D’autres groupes chimiques caractérisent l’huile des fruits du pistachier de l’Atlas : les triterpénoides, les acides gras insaturés tels les acides oléique, linoléique, palmitique, palmitoléique, stéarique , linolénique, les stéroïdes et les triglycérides (Yousfi et al., 2002 ; Yousfi et al., 2003, Yousfi et al., 2005; Benhassaini et al., 2007; Tavakoli et

5 Première partie : Synthèse bibliographique

Pazhouhanmehr, 2010) . Cependant, la composition chimique de l’huile essentielle d’oléorésine révèle sa richesse en α-pinène (70%) et β-pinène (1.94 %) (Delazar et al., 2004; Benhassaini et al., 2008) . Les composés de l’huile essentielle de différentes parties de P. atlantica du Maroc sont : le terpinen-4-ol (21.7%) et l’elemol (20.0%) comme des principaux constituants dans les feuilles avec des quantités faibles en β−eudesmol (8.4%), γ−eudesmol (7.0%) et en p-cymene (5.0%).

Réciproquement, les fruits ont été dominés par le bornyl acétate (21.5%) et l’acide octanoique (8.2%) d’une part, et le α−pinène (42.9%), β−pinène (13.2%) et p-cymen-8- ol (8.7%) dans la gomme d’autre part (Barrero et al., 2005) . Les monoterpènes hydrocarbonés tels le α−pinène (32.6–54.7%) et le β−pinène (8.0–20.2%) constituent la classe majoritaire suivie par les sesquiterpènes dans les feuilles, les fruits et les écorches de cette plante (Mecherara-Idjeri et al., 2008) . Une étude similaire sur les feuilles a permis à Gourine et al (2010) de confirmer la dominance de ces deux classes.

Peu de travaux ont été consacrés à l’étude des teneurs en polyphénols et les propriétés antioxydantes de différentes parties de P. atlantica (Benhammou et al., 2008, 2009, 2014 ; Yousfi et al., 2009). Les résultats de ces travaux ont montré la richesse de cette plante en composés phénoliques et l’identification d’un nouveau antioxydant le 1 (méthyl 5-(3,4- dihydroxyphényl)-3-hydroxypenta-2,4- dienoate) (Yousfi et al., 2009) . Une autre étude réalisée par Adams et al (2009) a mis en évidence une nouvelle substance anti- Plasmodium falciparum , le flavone 3-methoxycarpachromène dans l’extrait d’acétate d’éthyle de P.atlantica .

6 Première partie : Synthèse bibliographique

CHAPITRE 2 : Les composés phénoliques : classification et activité antioxydante.

I- Classification des composés phénoliques :

Les polyphénols peuvent être regroupés en deux grands groupes : Les non flavonoïdes dont les principaux composés sont : les acides phénoliques, les stilbènes, les lignanes, les lignines et les coumarines et les flavonoïdes, dont on caractérise principalement : les flavones, flavanones, flavonols, isoflavonones, anthocyanines, proanthocyanidines et flavanols (Pincemail et al., 2007) .

I.1. Les non flavonoïdes

I.1.1. Acides phénoliques (C6-C1 ou C6-C3)

Les acides phénoliques font partie des formes les plus simples des composés phénoliques et se séparent en deux grands groupes distincts qui sont les acides hydroxybenzoïques et les acides hydroxycinnamiques.

• Acides hydroxybenzoïques C6-C1

Les acides hydroxybenzoïques sont dérivés de l’acide benzoïques et ont une formule de base de type C6-C1 (figure 02). Ils sont particulièrement représentés chez les Gymnospermes et les Angiospermes d’où ils sont souvent libérés après hydrolyse alcaline du matériel végétal.

Les acides hydroxybenzoïques existent fréquemment sous formes d’esters ou de glycosides. Les principaux acides hydroxybenzoïques retrouvés dans les végétaux sont les acides phydroxybenzoïque, protocatéchique, vanillique, gallique et syringique (Macheix et al., 2005) .

7 Première partie : Synthèse bibliographique

Figure 02 : Quelques exemples des acides hydroxybenzoïques (Lopez-Giraldo et al., 2007).

• Acides hydroxycinnamiques C6-C3

Les acides hydroxycinnamiques représentent une classe très importante dont la structure de base C6-C3 dérive de celle de l’acide cinnamique (figure 03). Le degré d’hydroxylation du cycle benzénique et son éventuelle modification par des réactions secondaires sont un des éléments importants de la réactivité chimique de ces molécules. De plus, l’existence d’une double liaison dans la chaîne latérale conduit à deux séries isomères (cis ou Z et trans ou E) dont les propriétés biologiques peuvent être différentes. Les formes trans sont cependant naturellement prépondérantes et il est possible que les formes cis ne correspondent qu’à des artefactes d’extraction (Macheix et al., 2005) .

Figure 03 : Quelques exemples des acides hydroxycinnamiques (Biais et al., 2006).

8 Première partie : Synthèse bibliographique

I.1.2. Stilbènes C6-C2-C6

Les stilbènes présentent une structure en C6-C2-C6, avec un cycle A portant deux fonctions hydroxyles en position méta et un cycle B portant des fonctions hydroxyles ou méthoxyles en méta, ortho et para (figure 04). Les deux noyaux aromatiques sont reliés par une double liaison, formant un système conjugué. Cette particularité leur confère une grande réactivité due à la délocalisation des électrons π sur la totalité de la molécule. Les stilbènes se trouvent en petites quantités dans l’alimentation humaine. Ils sont généralement isolés des plantes sous formes hydroxylés, méthylés, esterifiés, glycosylés ou même prenylés. Leur solubilité est négligeable dans l’eau et accrue dans la plupart des solvants organiques (Vrchotova et al., 2010).

Figure 04 : Quelques exemples des structures chimiques des stilbènes (Manach, 2004).

Le resvératrol ou le 3,5,4’-trihydroxystilbène est un polyphénol non flavonoïde et appartenant à la classe des stilbènes. Il est surtout présent dans la pellicule du grain de raisin, Seul son isomère trans est actif. Le resvératrol possède de nombreuses propriétés biologiques ; cependant, son pouvoir anticancéreux a suscité un grand intérêt (Fibach et al.,, 2012) .

I.1.3. lignines (C6-C3)n

La lignine est un polymère fortement ramifié, formé par trois alcools phénoliques simples (figure 05). Les alcools sont oxydés en radicaux libres par une enzyme

9 Première partie : Synthèse bibliographique

ubiquiste chez les plantes; la peroxydase. Les radicaux libres réagissent ensuite spontanément et au hasard pour former la lignine (Hopkins, 2003) .

Figure 05 : principaux constituants de la lignine (Manach, 2004).

La lignine est localisée dans les parois cellulaires et plus spécialement dans les parois secondaires des éléments conducteurs, contribuant à la résistance mécanique et à la rigidité des tiges lignifiées. (Hopkins, 2003) , la figure 06 met en relief la structure d’une lignine.

Figure 06 : Structure d’une lignine (Manach, 2004).

10 Première partie : Synthèse bibliographique

I.1.4. Lignanes (C6-C3)2

Les lignanes (figure 07) répondent à une représentation structurale de type (C6-C3)2 l’unité (C6 - C3) est considérée comme un propylbenzène. Ce sont des composés phénoliques bioactifs, non-nutritifs, non caloriques. On les trouve en plus forte concentration dans le lin et les graines de sésame et en faibles concentrations dans les fruits et les légumes (Peterson et al., 2010) . Ils ont été définis comme étant les dimères des phénylpropanoïdes où deux unités de phénylpropane C6-C3 sont liés par leur carbone 8 (sainvitu et al., 2012) . Ils proviennent de la condensation initiale de deux molécules phénoliques de type monolignol comme l’alcool coniférylique (Muanda et al., 2010) . Ce sont des substances phénoliques apparentées aux lignines, ils n’ont guère de valeur alimentaire humaine. Ils sont présents dans la plante sous forme de glucosides (Descheemaeker, 2003) .

Figure 07 : Exemples des structures chimiques des lignanes. (A) unité de phénylpropane C6-C3. (B)Sauriol A (lien β-β '). (C) rufescidride (Manach, 2004).

I.1.5. Coumarines C6-C3

Les coumarines sont des hétérocycles oxygénés ayant comme structure de base le benzo-2-pyrone. Ils ont été isolés pour la première fois par Vogel en 1820 dans le Coumarouna odorata (Lacy et al., 2004) . Ce sont des composés phénoliques cyclisés (figure 08) qui dérivent des acides t-cinnamique et p-coumarique pour la majorité d’entre eux. Cependant, leur voie debiosynthèse peut varier d’une espèce à l’autre. En effet, la scopolétine de tabac dérive de l’acide férulique, tandis que des expériences d’apport de précurseurs marqués semblent montrer que ce n’est pas le cas chez le tournesol.

11 Première partie : Synthèse bibliographique

Figure 08 : Quelques exemples des structures chimiques des coumarines (Pincemail et al., 2007).

Les coumarines ont des effets différents sur le développement des plantes suivant leur concentration mais aussi suivant l’espèce. Dans la cellule, les coumarines sont principalement présentes sous forme glycosylée. Cette glycosylation serait une forme de stockage permettant d’éviter les effets toxiques des coumarines sur la cellule et la croissance. Elles sont considérées comme des phytoalexines. Celles-ci sont des molécules de faible masse moléculaire provenant de voies métaboliques variées comme celle des phénylpropanoïdes ou des sesquiterpènes (Pincemail et al., 2007).

I.2. Les flavonoïdes C6-C3-C6

Les flavonoïdes constituent un groupe de plus de 6000 composés naturels qui sont quasiment universels chez les plantes vasculaires. Ils constituent des pigments responsables des colorations jaune, orange, et rouge de différents organes végétaux (Ghedira, 2005) . Tous les flavonoïdes possèdent la même structure de base (C6-C3- C6), ils contiennent quinze atomes de carbone dans leur structure de base : deux cycles aromatiques A et B à six atomes de carbones (figure 09) liés avec une unité de trois atomes de carbone qui peut ou non être une partie d'un troisième cycle C (Tapas et al., 2008) .

Figure 09 : Structure de base des flavonoïdes (Manach, 2004).

12 Première partie : Synthèse bibliographique

Les flavonols les flavones, les flavanones, les flavan-3-ols, les isoflavones et les anthocyanes, ils varient dans leurs caractéristiques structurelles par la diversité fonctionnelle autour de l’oxygénation de l’hétérocycle (Sadasivam, 2003) .

I.2.1. Flavonols

Les flavonols sont caractérisés par la présence d’une double liaison en position 2-3 et d’un groupement hydroxyle en C3 (figure 10). Elles sont les flavonoïdes les plus répandus dans le règne végétal, leur couleur varie du blanc au jaune, elles sont essentiellement représentés par la quercétine, le kaempférol et la myricétine. Les flavonols qui s'accumulent dans les tissus végétaux sont presque toujours sous la forme conjugués glycosylés (Fraga, 2009) .

Figure 10 : Des exemples des structures chimiques des flavonols (Manach, 2004).

I.2.2. Flavones

Les flavones sont structurellement très similaire aux flavonols et ne diffèrent que par l'absence d'hydroxylation en position 3 sur le cycle C (figure 11). Elles sont principalement représentées dans l'alimentation par l'apigénine et la lutéoline. Contrairement aux flavonols, elles sont moins répandues dans les fruits et les légumes. Par conséquent, leur apport alimentaire est très faible (Fraga, 2009) .

13 Première partie : Synthèse bibliographique

Figure 11 : Des exemples des structures chimiques des flavones (Manach, 2004).

I.2.3. Flavanones

Ces molécules sont caractérisées par l’absence de double liaison en 2, 3 et par la présence d’un centre d’asymétrie en position 2 (figure 12). Chez les flavanones naturelles, le carbone 2 est normalement de configuration S. Elles existent sous forme libre ou sous forme glycosylée (Di Majo et al., 2005).

Figure 12 : Des exemples des structures chimiques des flavanones (Manach, 2004).

I.2.4. Flavan-3-ols ou flavanols

Ces molécules sont toujours hydroxylées en C3 et se caractérisent par l’absence du groupe carboxyle en C4 (figure 13). Elles sont souvent à l’origine des polymères

14 Première partie : Synthèse bibliographique

flavoniques appelés proanthocyanidols ou tanins condensés. Les flavan-3-ols sont très abondant dans les fruits comme les abricots, les cerises, les raisins, etc (Fraga, 2009) .

Figure 13 : Deux exemples des structures chimiques des flavan-3-ols (Manach, 2004).

I.2.5. Isoflavones

Les isoflavones sont considérées comme des dérivés des flavones, elles représentent une sous-classe importante et très distinctive des flavonoides (Bouheroum et al., 2007) . Contrairement à la plupart des autres flavonoïdes, les isoflavones sont caractérisées par la présence d’un cycle B fixé à C3 plutôt que la position C2 (figure 14). Ils ont une distribution très limitée dans le règne végétal (Fraga, 2009) .

Figure 14: Deux exemples des structures chimiques des isoflavones (Manach, 2004).

II.2.6. Anthocyanes

Les anthocyanes (en grec Anthos signifie fleur, et kyanos signifie bleu) sont des pigments hydrosolubles présents dans la plupart des espèces (Kong et al., 2003) . Ces pigments sont des dérivés du cation 2-phénylbenzopyrylium plus communément appelé

15 Première partie : Synthèse bibliographique

cation flavylium (figure 15). Ils sont accumulés dans les vacuoles cellulaires (Kerio et al., 2012) et ils sont responsables des couleurs rouges, violettes et bleues dans les fruits, les légumes, les fleurs et les graines, mais aussi jouent un rôle important dans la physiologie végétale comme attracteurs des insectes et dans la dispersion des graines (Shipp et al., 2010) .

Figure 15 : Deux exemples des structures chimiques des anthocyanes (Riaz et al., 2016).

Les anthocyanes sont stabilisés dans les plantes par des interactions avec des acides aminés, des tanins et des 4-oxo-flavonoïdes (Vierling, 2008).

I.3. Tanins

Les tanins sont des substances polyphénoliques de structures variées, ayant en commun la propriété de tanner la peau, c’est-à-dire de rendre imputrescible. Ces substances ont en effet la propriété de se combiner aux protéines, ce qui explique leur pouvoir tannant.

Très répandu dans le règne végétal ils peuvent exister dans divers organes, mais on note une accumulation plus particulièrement dans les tissus âgés ou d’origine pathologique. Ils sont localisés dans les vacuoles, quelques fois combinés aux protéines et aux alcaloïdes. On distingue : les tanins hydrolysables et les tanins condensés (Roux & Catier, 2007) .

Les tanins sont largement répandus dans les organismes végétaux et plus particulièrement dans les fruits, les graines de céréales et diverses boissons (Pénicaud, 2009) .

16 Première partie : Synthèse bibliographique

I.3.1. Tanins hydrolysables

Les tanins hydrolysables (figure 16) ou acides taniques sont des polymères de l’acide gallique ou de son produit de condensation ; l’acide éllagique. Ils ont un poids moléculaire plus faible et précipitent beaucoup moins les protéines que les tanins condensés.

Ils peuvent diminuer la dégradation des parois dans le rumen et être hydrolysés dans l’intestin en libérant des produits toxiques pour le foie et le rein (Jarrige et al., 1995) . Ils sont divisés en éllagitanins et gallotanins, Les gallotanins libèrent par hydrolyse acide, hydrolyse basique, à l'eau chaude ou par action enzymatique de l'acide gallique (Collin & Crouzet, 2011) .

Figure 16 : Exemple des tanins hydrolysables (Bouzabata, 2016).

I.3.2. Tanins condensés

Appelés aussi proanthocyanidines ou procyanidines, les tanins condensés (figure 17) sont des polyphénols de masse molaire élevée. Ils résultent de la polymérisation auto- oxydative ou enzymatique des unités de flavan-3,4-diol liées majoritairement par les liaisons C4-C8 (parfois C4-C6) des unités adjacentes, et se nomment ainsi proanthocyanidines de type B.

Lorsque la condensation se produit entre les unités adjacentes par la liaison C4-C8 et par une liaison d’éther additionnelle entre C2 et C7, les proanthocyanidines sont dits de types A (Wollgast & Anklam, 2000 ; Dykes & Rooney, 2006) .

17 Première partie : Synthèse bibliographique

Figure 17: Exemple des tanins condensés (Bouzabata, 2016).

II- Rôle et intérêt des composés phénoliques :

II-1- Chez les végétaux :

Les composés phénoliques peuvent intervenir dans certains aspects de la physiologie de la plante (lignification, régulation de la croissance, interactions moléculaires avec certains microorganismes symbiotiques ou parasites...), dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique (relations avec les bactéries, les champignons, les insectes, résistance aux UV); soit directement dans la nature soit lors de la conservation après récolte de certains végétaux; dans les critères de qualité (couleur, astringence, amertume, qualités nutritionnelles...) qui orientent les choix de l'homme dans sa consommation des organes végétaux (fruits, légumes, tubercules...) et des produits qui en dérivent par la transformation; dans les variations de certaines caractéristiques des végétaux lors des traitements technologiques (préparation des jus de fruits, des boissons fermentées...) pendant lesquels apparaissent fréquemment des brunissements enzymatiques qui modifient la qualité du produit fini (Fleuriet et al., 2005) .

18 Première partie : Synthèse bibliographique

II-2- Chez les humains

Le rôle des composés phénoliques est largement montré dans la protection contre certaines maladies en raison de leur interaction possible avec de nombreuses enzymes et de leurs propriétés antioxydantes (Fleuriet et al., 2005) . Spécifiquement, on attribue aux flavonoïdes des propriétés variées: veinotonique, antitumorale, anti-radicalaire, anti-inflammatoire, analgésique, antiallergique, antispasmodique, antibactérienne, hépatoprotectrice, estrogénique et/ ou anti-estrogénique. Ils sont également connus pour moduler l’activité de plusieurs enzymes ou de récepteurs cellulaires. Les flavonoïdes favorisent la relaxation vasculaire et empêchent l'agglutinement des plaquettes sanguines. Par conséquent, ils réduisent la coagulation du sang et le rendent plus fluide. Ils limitent l'oxydation des lipides sanguins et contribuent à la lutte contre les plaques d'athérome. Ils sont aussi anxiolytiques, protègent nos artères contre l'athérosclérose et réduisent la thrombose (caillots dans les artères) (Fleuriet et al., 2005) .

III- Antioxydants et radicaux libres :

III.1. Les antioxydants

III.1.1. Généralités sur les antioxydants

L’oxygène est la source de vie pour les organismes aérobies. Mais l’oxygène peut être également une source d’agression pour ces organismes. En effet des dérivés hautement réactifs de l’oxygène peuvent apparaître au cours des réactions enzymatiques ou sous l’effet des rayons U.V, des radiations ionisantes et de métaux de transition (Afonso et 1 al., 2007)Les formes de l’oxygène provoquant ces troubles sont: l’oxygène singulet O2, le peroxyde d’hydrogène H 2O2, les peroxydes alkyles ROOH, le radical superoxyde O 2, les radicaux hydroxyles HO, peroxydes ROO et alkoxyles RO. Les conséquences au niveau de l’organisme se font ressentir sur l’ADN, les lipides et les protéines (Gravot, 2008).

III.1.2. Mécanismes d’action des radicaux libres

Les radicaux libres peuvent être considérés comme des déchets du métabolisme cellulaire. Ce sont des atomes et des molécules dotés d’une forte énergie et qui, avant d’être neutralisés détruisent ce qu’ils rencontrent. Ils sont produits dans toutes les cellules de l’organisme tout à fait normalement et en faible quantité dans les

19 Première partie : Synthèse bibliographique

mitochondries. Il s’agit des ions oxygène, hydroxyde et de l’eau oxygénée qui sont libérés lors des réactions biochimiques. Avant d’être neutralisés ils provoquent des lésions sur tous les éléments qu’ils côtoient (Rani & Yadav, 2014).

L’organisme sait cependant se défendre contre eux, grâce aux enzymes antioxydantes contenues dans nos cellules. Ces enzymes sont aidées dans leur action antiradicalaire par la vitamine E, C, provitamine A, le zinc et le sélénium. Si ces systèmes de défense sont débordés ou insuffisants, les radicaux libres ont tout le loisir d’être nuisibles : ils s’attaquent alors aux membranes cellulaires dont les acides gras insaturés sont dénaturés (leur structure est modifiée); ils agressent également les protéines, les microfibrilles de collagène, l’acide hyaluronique, les acides nucléiques des chromosomes et l’ADN lui- même est transformé entrainant l’apparition d’où une série d’anomalie dont le risque de cancérisation. Lorsque les radicaux libres lèsent les acides gras insaturés on parle de lipidoperoxydation des membranes cellulaires. Cela déclenche alors une réaction en chaîne sur les divers acides gras du voisinage jusqu’à ce qu’ils soient neutralisés.

Il en résulte des lésions de la membrane cellulaire, qui peuvent aboutir à des dérèglements d’intensité variable, conduisant éventuellement à la mort cellulaire. Ils ont un effet analogue sur les mitochondries, les enzymes cellulaires, les chromosomes, le collagène et l’acide hyaluronique. Au cours de la vie nous sommes soumis à des millions de circonstances favorisant la production de ces radicaux libres, particulièrement néfastes pour la peau (Franceschini, 1994) .

Dans le Figure 18 , la génération des espèces oxygénées réactives (EOR) est initiée pendant la respiration. Cette génération est facilitée par l’implication de divers facteurs physiologiques et environnementaux (UV, radiation, ozone, cigarette, pollution,….). Dans l’organisme la fabrication d'un assortiment de EOR à partir de l'O2 moléculaire et de la L-arginine se réalise par l’intermédiaire de différentes enzymes tels que le MPO (myloperoxidase), la NADPH oxydase, le SOD (superoxyde dismutase) et le NOS (nitrite oxyde synthase). La présence de ces composés dans l’organisme engendre plusieurs phénomènes au niveau cellulaire, à savoir, les dommages de protéines de réparation de l'ADN, de caspases et la peroxydation lipidique. Notons que le dommage de l'ADN est suivit par une mutation et une activation de NF-kB (nuclear factor-kappa B). Tous ces phénomènes donnent naissance à une vaste gamme de maladies.

20 Première partie : Synthèse bibliographique

Figure 18 : Mécanisme d’action des radicaux libres et des métabolites secondaires (Franceschini, 1994).

Les métabolites secondaires inhibent les générations des radicaux libres en piégeant non seulement la mère, la fille mais aussi les produits en induisant une augmentation de la SOD, CAT, la GST et la GSH, ce qui entraîne l'obstruction de la formation de diverses maladies (Mandal et al., 2009) . Il est indéniable que les polyphénols présentent

21 Première partie : Synthèse bibliographique

d’importantes propriétés sur divers systèmes biologiques. Ces effets pourraient avoir des applications en thérapeutique. Mais toutes ces potentialités ne sont pas encore concrétisées même si de nombreux travaux soutiennent l’utilisation possible de ces composés en thérapeutique. Cependant, les dérivés de la rutine sont utilisés en thérapeutique pour améliorer la résistance capillaire. Les flavonoïdes sont les constituants habituels des vasculo-protecteurs et veinotoniques utilisés en phlébologie. Par ailleurs, l’utilisation de plantes renfermant des flavonoïdes, seules ou en association, est en progression constante en raison d’une demande croissante par les consommateurs de produits d’origine naturelle et en raison de l’intérêt porté aux plantes aussi bien médicinales qu’ alimentaires contenant cette classe de composés d’origine naturelle ayant des propriétés justifiant leur emploi dans la prophylaxie des maladies cardiovasculaires, alzheimer, des cancers… (Mandal et al., 2009).

Les dérivés de l’oxygène a) L’ion peroxyde

L’ion peroxyde est formé par fixation d’un électron sur l’oxygène moléculaireet les ions superoxydes sont produits pendant la réoxydation des flavines (Novelli, 1997) . b) Oxygène singulet

Il est formé par action de rayonnement UV sur l’oxygène ou par les leucocytes ou encore au cours de la peroxydation lipidique.

C’est une forme excitée de l'oxygène ordinaire : c'est une molécule d'oxygène dont on a réussi à «déplacer» momentanément l'un des électrons, ce qui la rend moins stable et donc susceptible de réagir plus facilement avec d'autres molécules. Ainsi, l'oxygène singulet est un oxydant à la fois plus puissant et plus sélectif que son homologue ordinaire. Toutefois, comme pour toutes les molécules excitées,

- le radical peut attaquer un cycle et l’ouvrir en se neutralisant par addition et déplacement d’un H (exemple vit E) (LePerchec, 1994) .

22 Première partie : Synthèse bibliographique

Figure 19 : Production des formes actives de l’oxygène et des intermédiaires qui en découlent (LePerchec, 1994).

III.1.3. Les principales sources d’antioxydants

Certaines classes thérapeutiques telles que les AINS (anti-inflammatoire non stéroïdien), les antihyper-lipoproteinémiques, les ß-bloquants et antihypertenseurs sont connus pour leurs propriétés antioxydantes (Quenum et al., 2014).

23 Première partie : Synthèse bibliographique

Le plus simple des capteurs des radicaux libres est l’alcool éthylique, agent de transfert d’hydrogène qui conduit à un composé biologiquement compatible, l’acétaldéhyde, bio- oxydable par la chaîne enzymatique avec production d’énergie.

a) Les médicaments

Certains médicaments (exemple du probucol (Lurselle)) fait diminuer le taux du cholestérol dans le sang et, la N- acétylcystéine agit dans la régénération du glutathion en pénétrant les cellules.

Les propriétés de la glutathionne ont été reconnues lors d’études sur les phospholipides des feuilles de certains végétaux. En effet les thiols sont beaucoup plus actifs que les hydrocarbures, les alcools ou les phénols comme agents de capture radicalaire (LePerchec, 1994) .

La capacité de protection de la glutathionne est jugée supérieure à celle d’un antioxydant aussi puissant que l’ α-tocophérol. On observe in vitro, que la glutathionne introduit une période d’induction à la prise d’oxygène par l’hémoglobine et retarde l’oxydation de la fraction hydrocarbonée insaturée des lécithines (esters insaturées d’acide gras de phospholipides) et de l’aniline (Mieyal, 1978) . b) antioxydants naturels

- Acide ascorbique : Vitamine C

La Vitamine C contient une forme énediol qui produit la forme dicétonique par transferts successifs de ses deux atomes d’H. La forme énediol est régénérée par l’intervention d’enzyme superoxyde dismutase en présence d’une catalase.

On trouve la vitamine C dans les légumes, les choux, le poivron, le persil, les agrumes et le kiwi. Elle joue un rôle important dans la régénération du vit E (Rani & Yadav, 2014).

24 Première partie : Synthèse bibliographique

- La vitamine E

Elle semble devoir fixer le radical hydroxyle avec formation d’une molécule d’ouverture de cycle. On la retrouve dans les huiles végétales (arachides, soja, chardon, tournesol, olive pressé à froid), les amandes, les graines, le lait, les oeufs, les légumes à feuilles vertes (Rani & Yadav, 2014).

- ß-carotène

Le ß-carotène est un photo-protecteur qui apparaît comme un piégeur efficace. Sa structure polyiénique lui confère une capacité de piégeage de l’oxygène par formation d’un dioxétane (addition d’une oléfine et d’une molécule d’oxygène) ou par production d’hydroperoxydes (insertion d’oxygène dans toutes liaisons C-H conjuguées d’une double liaison) susceptibles d’être réduits à leurs tour. Il est présent dans les légumes verts, la salade, les carottes, l’abricot, le melon, les épinards, la papaye (Rani & Yadav, 2014).

III.1.4. Rôles des complexes antioxydants

La vie en aérobiose se traduit au niveau cellulaire par l’existence d’une chaîne respiratoire mitochondriale nécessaire au stockage de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP). La chaîne respiratoire est une succession de phénomènes d’oxydoréduction au cours desquels il existe des transferts d’électrons. Ces électrons peuvent réagir avec une molécule avoisinante pour aboutir à la formation d’un radical libre. Un radical libre est une espèce chimique contenant un ou plusieurs électrons non appariés sur l’orbite électronique la plus externe (Rani & Yadav, 2014). Les radicaux libres sont produits au cours de nombreuses réactions engagées dans les mécanismes physiologiques (respiration mitochondriale), dans les mécanismes pathologiques (inflammation, infection, toute pathologie dégénérative et vieillissement accéléré) et par la pollution (par les métaux lourds, les xénobiotiques, ozone, les rayonnements ionisants…). L’athérosclérose est un bon modèle de pathologie liée au stress oxydant car c’est à la fois une maladie dégénérative, inflammatoire et infectieuse. Dans toutes les cellules aérobies, les radicaux libres sont essentiellement des radicaux oxygénés. Leur hyperactivité les engage dans des réactions de dénaturation des constituants cellulaires de type peroxydation, avec les glucides, les lipides, les protéines et l’ADN, formant des produits très instables. Ceux-ci donnent lieu à des réactions en chaîne

25 Première partie : Synthèse bibliographique

générant de nouveaux radicaux libres. Ce processus de peroxydation s’auto-entretient de lui-même et il faut attendre l’obtention de produits stables par réaction entre deux radicaux ou l’intervention de substances protectrices dites “piégeurs de radicaux libres” pour l’arrêter (Mandal et al., 2009) . La protection contre les effets délétères induits par les radicaux oxygénés s’effectue à l’aide de trois types d’agents différents :

- les protéines non enzymatiques (albumine, haptoglobine et transferrine) jouent un rôle antioxydant par chélation des ions.

- les enzymes tels que les superoxyde-dismutases et les glutathion-peroxydases transforment des radicaux très prooxydants en substances inoffensive,

- les antioxydants d’origine nutritionnelle, les caroténoïdes, les tocophérols (vitamine E) et l’acide ascorbique (vitamine C).

Le rôle des métabolites secondaires en matière de prévention des maladies causées par les radicaux libres a été clairement établi par plusieurs études (Mandal et al., 2009) . Un schéma représentatif de l’impact de ROS et du rôle des divers métabolites secondaires dans l’apparition des diverses maladies et de leurs modes de suppression est établit ci- dessus ( Figure 18 ).

Ces sont des antioxydants essentiels pour l’homme dont les apports peuvent prévenir et même aider au traitement des maladies liées au stress oxydant. Il existe de nombreux autres composés parmi lesquelles certains sont regroupées dans le grand groupe des polyphénols. Bien que non essentielles, ces substances jouent un rôle majeur dans la lutte contre le stress oxydant (Curtay & Robin, 2000) .

III.2. Intérêts économiques des composés phénoliques

Les phénols sont employés dans l’industrie comme antioxydants, intermédiaires de synthèse, désinfectants, agents de tannage, révélateurs photographiques et additifs des lubrifiants et des essences. Ils sont largement utilisés en photographie, dans les industries du pétrole, des peintures, des explosifs, du caoutchouc, des matières plastiques et dans les industries pharmaceutique et agroalimentaire.

Certains chlorophénols sont utilisés comme intermédiaires de synthèse et agents conservateurs dans les industries des peintures, du textile, des cosmétiques et du cuir.

26 Première partie : Synthèse bibliographique

L’o-chlorophénol et le 2,4-dichlorophénol sont employés en synthèse organique. L’o- chlorophénol sert à la fabrication de colorants et à l’extraction des composés soufrés et azotés présents dans la houille. Le 2,4,5-trichlorophénol trouve des applications comme conservateur dans les adhésifs, les textiles synthétiques, le caoutchouc, le bois, les peintures et le papier; et le 2,4,6-trichlorophénol joue le même rôle pour le bois et les colles. Les tétrachlorophénols (et leurs sels de sodium) sont également utilisés comme fongicides et pour la protection du bois.

En industrie agroalimentaire, ils sont partiellement responsables des qualités sensorielles et alimentaires des aliments végétaux. L'astringence et l'amertume des nourritures et des boissons dépendent de la teneur en polyphénols ( Lugasi et al., 2003 ).

27









 

 
Deuxième partie : Matériel et méthodes

CHAPITRE 1 : Screening phytochimique, extraction et teneurs en composés phénoliques

I- Identification botanique :

L’identification botanique de l’espèce étudiée a été faite par Mr.BABA ALI Ibrahim, enseignant-chercheur au département d’écologie, Faculté des SNV/STU et membre du laboratoire d’Ecologie et Gestion des Ecosystèmes Naturels, université de Tlemcen. Un échantillon a été classé dans l’herbier N°1784.

II- Récolte et préparation des échantillons :

Les différentes parties de Pistacia atlantica Desf. Subsp. Atlantica (fruits rouges, feuilles, bourgeons, tiges, écorce et racines) ont été récoltées, à ABOU TACHFINE – Tlemcen, les bourgeons au mois de février et le reste des organes au mois d’Août 2011. L’écorce a été divisée en deux parties : interne et externe pour être étudiées séparément.

Les parties végétales récoltées ont été triées, séchées à l’ombre et conservées à l’abri de la lumière et à température ambiante.

Figure 20 : position géographique de la station de collecte de la plante.

Le matériel végétal renferme souvent des quantités non négligeables de graisses, cires, pigments et autre substances lipophiles qui peuvent perturber le processus extractif (formation d’émulsion). Pour cela, un préalable dégraissage est nécessaire. (Bruneton, 1999).

29 Deuxième partie : Matériel et méthodes

Pour dégraisser, on a utilisé la méthode d’extraction continue par percolation à l’aide d’un soxhlet, en faisant passer lentement un solvant à travers une couche de substance pulvérisée (broyée) contenue dans une cartouche de papier filtre épais et poreux (Bruneton, 1999) .

Un siphon contenant une cartouche d’environ 50g est monté sur un ballon rodé de 500ml contenant 400ml d’éther de pétrole, le tout est surmonté d’un réfrigérant. L’ensemble est porté à reflux de 6 à 8h à température d’ébullition stable à l’aide d’un chauffe ballon.

NB : Les parties de la plante ont été conservées entièrement. En revanche les quantités nécessaires aux extractions ont été broyées et dégraissées.

III- Tests phytochimiques :

Les tests phytochimiques sont des tests qualitatifs basés sur des essais de solubilité, des réactions de coloration, de turbidité et de précipitation, ainsi que des examens de lumière UV (voir les figures 01, 02 et 03 des annexes).

Cette première étape est préliminaire et essentielle, elle permet de connaitre les différentes classes de métabolites secondaires contenues dans le matériel végétal à étudier.

IV- Extractions et dosages des composés phénoliques :

IV-1-Préparation des extraits bruts (phénols totaux) :

1 g du matériel végétal broyé et dégraissé de chaque partie de la plante est macéré dans 20ml méthanol pendant 24h à température ambiante. Les solutions métahnoliques récupérées après filtration sont évaporées à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif type Buchi R-200 à 60°C. Les résidus secs pesés sont repris dans 3mL de méthanol et conservés au réfrigérateur pour une ultérieure utilisation (Benhammou et al, 2008).

IV-2-Extraction des flavonoïdes :

L’extraction a été faite selon la description de Bekkara et al ., (1998) , en y apportant quelques modifications. Deux grammes (2g) du matériel végétal broyé et dégraissé sont macérés dans 40 ml de méthanol pendant 48h à température ambiante. La solution

30 Deuxième partie : Matériel et méthodes

métahnolique récupérée après filtration est évaporée à sec. Le résidu sec obtenu est dissout dans 20 ml d’eau chaude, versé dans une ampoule a décanté et extrait avec 3 fois 20 ml d’acétate d’éthyle, les trois fractions d’acétate d’éthyle récupérées après décantation sont évaporées à sec et la fraction aqueuse est extraite une deuxième fois avec 3 fois 20 ml du n.butanol, les fractions butanoliques sont regroupées et évaporées à sec.

Les deux fractions de flavonoïdes (fraction acétate d’éthyle et fraction butanolique) sont dissoutes chacune dans 3mL de méthanol et conservées au réfrigérateur pour une ultérieure utilisation.

IV-3-Extraction des tanins :

L’extraction des tanins a été effectuée selon la méthode décrite par Zhang et al. (2008). Une macération de 2,5g du matériel végétal broyé et dégraissé dans 100 ml d’un mélange acétone/eau distillée (70/30, V/V) pendant 72h à une température ambiante. La solution obtenue est filtrée puis évaporée à l’aide d’un Rotavapor pour éliminer l’acétone. La phase aqueuse récupérée est lavée par deux fois 30 ml de dichlorométhane afin d’éliminer les pigments et les lipides. Après décantation et séparation de la phase organique, la phase aqueuse est extraite avec 2 fois 30 ml d’acétate d’éthyle. Les deux phases d’acétate d’éthyle sont évaporées à sec puis pesées et reprises dans 3mL de méthanol pour être utilisées ultérieurement

IV-4-Extraction des anthocyanes :

Les extraits des anthocyanes des différentes parties étudiées ont été préparés selon la description de Longo et al. (2007) . 2,5g du matériel végétal broyé et dégraissé mis en suspension dans 12,5mL d’une solution HCL/méthanol (v/v, 0,1%) pendant 24 heures à température ambiante. Après filtration, le marc obtenu et lavé deux fois par la même solution d’extraction afin d’épuiser le maximum d’extrait. La solution totale obtenue est ensuite évaporée à sec et le résidu résultant est pesé puis repris dans 3mL de méthanol pour la suite du travail.

NB . Tous les extraits ont été remis en suspension après extraction et conservés dans le réfrigérateur.

31 Deuxième partie : Matériel et méthodes

IV-5-Calculs des rendements des extractions :

Après extraction, évaporation du solvant et obtention du résidu sec, le rendement en pourcentage (Rdt %) a été calculé selon la formule suivante :

2 − 1 % = × 100 3

Dont :

P1 = poids du ballon vide.

P2 = poids du ballon après évaporation.

P3 = poids du matériel végétal utilisé pour l’extraction.

IV-6-Dosage des phénols totaux :

Les phénols totaux ont été dosés selon la méthode de Singleton et Rossi, 1965 basée sur l'oxydation des composés phénoliques par le Folin-Ciocalteu de couleur jaune, qui entraîne la formation d'un complexe molybdène-tungstène de couleur bleue.

Un volume de 200 µl de chaque extrait brut est mélangé avec 1 ml du réactif de Folin-Ciocalteu 10 fois dilué et 0,8 ml de carbonate de sodium (Na2CO3) à 7,5%. L’ensemble est incubé à température ambiante pendant 30 minutes et la lecture est effectuée contre un blanc à l’aide d’un spectrophotomètre à 765 nm.

Une courbe d’étalonnage d’acide gallique a été établie. Les teneurs en phénols totaux sont exprimées en milligramme équivalent d’acide gallique par gramme du poids de la matière sèche (mg EAG/g MS).

IV-7-Dosage des flavonoïdes :

Le dosage des flavonoïdes a été effectué suivant la méthode de Zhishen et al. (1999) . Un volume de 500 µl de chaque extrait brut convenablement dilué est placé dans un tube a hémolyse en verre avec 1500 µl d’eau distillée. A temps zéro, 150 µl de nitrite de sodium NaNO2 à 5% est ajouté au mélange. Après 5 min, 150 µl de trichlorure d’aluminium AlCl3 à 10% (m/v) est rajouté.

32 Deuxième partie : Matériel et méthodes

Après 6 min d’incubation à température ambiante, 500 µl d’hydroxyde de sodium NaOH à 1M est additionné, le mélange est homogénéisé et l’absorbance est immédiatement lue à 510 nm contre le blanc.

Les teneurs en flavonoïdes des extraits bruts des sept parties étudiées sont exprimées en milligramme équivalents de catéchine par gramme du poids de la matière sèche (mg EC/g MS).

IV-8-Dosage des flavonols :

Le dosage des flavonols a été fait suivant la méthode de Kumaran et al. (2007) . Un volume de 0,25 ml de chaque extrait brut est mélangé avec 0,25 ml de AlCl 3 à 2 mg/ml et 1,5 ml d’acétate de sodium à 50 mg/ml. Le mélange est homogénéisé et l’absorbance est lue à 440 nm après une incubation de 150 min à température ambiante.

Le contenu en flavonols est exprimé en milligramme équivalents de Quercetine par gramme du poids de la matière sèche (mg QE/ g MS).

IV-9-Dosage des tanins totaux :

Les teneurs en tanins sont estimées en utilisant la méthode de vanilline décrite par Julkunen-Titto. (1985) . Un volume de 50 µl de d’extrait brut est ajouté à 1500 µl d’une solution de vanilline/méthanol à 4% (m/v). Ensuite, 750 µl d’acide chlorhydrique concentré HCl est additionné, le mélange est homogénéisé et incubé à température ambiante pendant 20 min. L'absorbance est mesurée à 550 nm contre un blanc.

Une courbe d’étalonnage de catéchine a été établie et les teneurs en tanins ont été estimées en milligramme équivalents de catéchine par gramme du poids de la matière sèche (mg EC/g MS).

IV-10-Dosage des anthocyanes :

On a procédé au dosage des anthocyanes selon la méthode de décoloration par l'acide sulfureux décrite par Jurd. (1967) . Une première solution est préparée comme suite : 1mL de l’extrait brut ; 1 ml d'éthanol (0,1 % Hcl) et 20 ml d'Hcl concentrée à 2 %. A partir de cette solution, on met dans un premier tube (A ou tube témoin) 10 ml de la

33 Deuxième partie : Matériel et méthodes

solution et 4 ml d'eau distillée, dans un deuxième tube (B) on met 10 ml de la solution et 4 ml de bisulfite de sodium à 15%.

Après de 20 mn d’incubation à température ambiante, les densités optiques des deux tubes A et B sont mesurées à 520 nm contre un blanc qui est l’eau distillée.

La différence entre les deux densités des deux tubes A et B est calculée et les résultats sont exprimés en milligramme équivalent de Délphinidine par gramme de matière sèche en se référant à une courbe d'étalonnage préalablement tracée.

34 Deuxième partie : Matériel et méthodes

CHAPITRE 2 : Evaluation du pouvoir antioxydant des extraits

Par définition, un antioxydant est une molécule qui, même à faible concentration par rapport aux substrats oxydables ou oxydés, inhibe ou ralentit le processus d’oxydation en agissant soit par transfert d’atome d’hydrogène ou par transfert d’électron (Halliwell, 1999 ). Pour évaluer l’activité antioxydante, in vitro , des extraits naturels, différentes méthodes mimant le phénomène physiologique ont été développées. Ces méthodes impliquent un mélange d’espèces oxydables ou oxydés avec un échantillon qui contient des antioxydants capables de piéger les radicaux ou d’inhiber la génération de ces derniers.

En tenant compte des différents facteurs qui peuvent être impliqués, tels que les propriétés physico-chimiques des molécules, il est recommandé d’utiliser plusieurs tests pour confirmer une activité antioxydante (Prior et al., 2005).

Dans le cadre de cette étude, les tests standardisés évaluant l’activité antioxydante in vitro sont simples, peu coûteux et rapides à mettre en œuvre et à la fois visant des cibles différentes. La capacité antioxydante totale (CAT), le piégeage du radical libre DPPH, la réduction du fer et le test de blanchiment du β-carotène ont été retenus. Des modifications ont été, cependant, apportées afin de les optimiser et de les adapter à notre étude.

I- La capacité antioxydante totale (CAT) :

Décrite par Prieto et al (1999) , c’est la technique qui a été suivie pour estimer la capacité antioxydante totale de nos extraits. Cette technique est basée sur la réduction 2- 2+ de molybdène présent sous forme d’ions molybdate MoO 4 à molybdène MoO en présence de l’extrait pour former un complexe vert de phosphate à pH acide.

Un volume de 0.3 ml de chaque extrait est placé dans un tube à vis contenant 3 ml de la solution du réactif constituée d’acide sulfurique à 0.6 M, de phosphate de sodium à 28 mM et molybdate d’ammonium à 4 mM. Les tubes sont incubés à 95°C pendant 90 min après avoir été bien fermés. Une fois l’incubation terminée, les tubes sont refroidis et l’absorbance est lue à 695 nm contre un blanc, semblablement préparé. La capacité antioxydante totale est exprimée en milligramme équivalents d’acide ascorbique par

35 Deuxième partie : Matériel et méthodes

gramme de la matière sèche (mg EAA/ g MS). Chaque extrait été testé trois fois en même temps, et ce pour s’assurer de la reproductibilité et la fiabilité des résultats.

II- Le piégeage du radical libre DPPH :

Cette technique qui a été décrite par Sanchez-Moreno et al. (1998) est basée sur la réduction, par les antioxydants présents dans le milieu réactionnel, du radical 2,2- diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ayant une couleur violette en un composé jaune, le diphénylpicrylhydrazine, dont l'intensité de la couleur est inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu à donner des protons.

Un volume de 50 µl de différentes concentrations de chaque extrait exprimées en g/l est ajouté à 1,95 ml de la solution méthanolique du DPPH (0.025 g/l) fraîchement préparée. En parallèle, un contrôle négatif est préparé en mélangeant 50 µl de méthanol avec 1,95 ml de la solution méthanolique de DPPH.

L’absorbance à 515 nm est lue après une incubation de 30 min à l’obscurité et à temperature ambiante. Le BHA est utilisé comme référence.

Le pourcentage de réduction du radical libre DPPH est exprimé par la formule suivante:

% d’inhibition= [(Abs c – Abs e)/ Abs c] x 100

Abs c : Absorbance du contrôle ;

Abs e : Absorbance de l’échantillon testé.

Pour chaque extrait nous avons déterminé la valeur CI50 qui est la concentration de l’extrait nécessaire pour réduire à 50% la concentration initiale du radical DPPH. (Samarth et al., 2008) et ce en traçant une courbe des pourcentages d’inhibition en fonction des différentes concentrations correspondantes.

36 Deuxième partie : Matériel et méthodes

III- La réduction du fer FRAP (Ferric reducing antioxidant power) :

Le pouvoir réducteur du fer des différents extraits est déterminée selon la méthode décrite par Oyaizu (1986) , basée sur la réduction du Fe3+ présent dans le complexe K3Fe(CN)6 en Fe2+.

Dans un premier temps, une solution de tampon phosphate à 0,2 M et à un pH=6,6 est préparée. 1 ml de l’extrait à différentes concentrations est mélangé avec 2,5 ml de la solution tampon et 2,5 ml d’une solution de ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1% (m/v). L’ensemble est incubé au bain marie à 50°C pendant 20 minutes ensuite ;

• 2,5 ml d’acide trichloroacétique à 10% sont ajoutés pour stopper la réaction ; • Les tubes sont centrifugés à 3000 rpm pendant 10 minutes ; • 2,5 ml du surnageant sont mélangés à 2,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml d’une solution de chlorure ferrique fraîchement préparé à 0,1%.

La lecture de l’absorbance est faite à 700 nm contre un blanc contenant de l’eau distillée à la place de l’extrait. L’acide ascorbique est utilisé comme contrôle positif.

Une augmentation de l’absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur des extraits testés.

IV- Le test de blanchiment du β-carotène :

La capacité d’inhibition du blanchiment du β-carotène de nos extraits a été testée suivant le protocole expérimental décrit par Moure et al., (2000) . Le blanchiment du β- carotène est causé par les radicaux libres dérivés d’hydroperoxydes formés à partir de l’oxydation d’acide linoléique dans une émulsion aqueuse (Unten et al., 1997) . La présence des antioxydants comme les polyphénols réduisent l’ampleur de la destruction du β-carotène en neutralisant les hydroperoxydes et d’autres espèces radicalaires formées à l’intérieur du milieu réactionnel.

Dans un premier temps, 2 mg de β-carotène sont dissouts dans 10 ml de chloroforme. 1 ml de cette solution est ajouté à 20 µl d'acide linoléique et 200 mg de Tween 40. Le chloroforme a été évaporé sous vide à 40°C, le volume est ensuite complété à 100 ml avec de l’eau distillé. Une émulsion a été obtenue par agitation vigoureuse.

37 Deuxième partie : Matériel et méthodes

Des volumes de 4 ml de cette émulsion ont été ajoutés dans des tubes contenants à 0,2 ml de nos différents extraits à différentes concentrations. L’absorbance a été mesurée à T=0 min à 470nm contre blanc contenant l’émulsion sans β-carotène. Ensuite les tubes ont été fermés et placés dans un bain marie à 50°C pendant 120 min avec un contrôle négatif contenant le méthanol au lieu de l’extrait. L’absorbance a été relue après fin de l’incubation contre le même blanc. Le BHA été utilisé comme référence à des fins comparatives.

L’activité de l’extrait est calculée par rapport à celles du contrôle négatif. En termes d’inhibition de la décoloration du β-carotène en utilisant la formule suivante :

Pourcentage d’inhibition du blanchiment du β-carotène

% = [(Abs e120 – Abs c120 ) / (Abs c0 - Abs c120 ) x 100]

Dont :

Abs c0 : absorbance du contrôle à 0 mn.

Abs c120 : absorbance du contrôle à 0 mn 120 min.

Abs e120 : absorbance de l'échantillon à 120 min.

Cette activité est également exprimée en CI 50 (mg/ml) comme décrit pour le test du DPPH˙.

38 Deuxième partie : Matériel et méthodes

CHAPITRE 3 : Fractionnement, purification et identification

Les parties de la plante ayant révélé les plus forts pouvoirs antioxydants ont fait l’objet d’une étude chimique incluant l’isolement, la purification et l’identification structurale des potentiels principes actifs responsables de cette activité.

Diverses techniques analytiques sélectives et sensibles ont été utilisées pour le profilage métabolique de nos extraits. Les techniques chromatographiques ont été les plus utilisées, telles que la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur couche mince préparative, la chromatographie en phase liquide (sur colonne), la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) et la chromatographie liquide à haute pression préparative.

La détermination des structures chimiques était faite par la résonance magnétique nucléaire (RMN-2D). I- Identification et quantification des composés phénoliques dans les extraits actifs par Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance :

La chromatographie en phase liquide à haute performance ou pression est une technique de séparation analytique basée sur l'hydrophobicité des molécules ou d’un mélange de composés. L’échantillon à analyser est poussé par un éluant liquide sous pression environ 70 Bar (phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire composée de grains solides très fins.

Le débit d'éluant est assuré par une pompe à haute pression. Dans la colonne, les divers composés de l’échantillon sont séparés l’un de l’autre en raison de leurs diverses affinités à l’égard des deux phases – stationnaire et mobile. A la sortie de la colonne les composés sont détectés à l’aide d’un détecteur.

Une analyse quantitative des extraits qui ont montré la plus forte activité antioxydante a été faite pour révéler la présence ou l’absence de molécules connues par leurs potentiels antioxydants, tels que l’acide tanique, la rutine, l’acide gallique, l’acide ascorbique, l’acide vanillique, l’acide p-coumarique, la catéchine, l’acide syringique, l’acide ferulique la quercetine et la naringenine. Tous les standards ont été dissouts dans du méthanol à une concentration de 1 mg/mL. Puisque les composés de référence sont généralement sous formes aglycones, une hydrolyse préalable de nos échantillons était nécessaire.

39 Deuxième partie : Matériel et méthodes

I-1- Hydrolyse acide des échantillons :

L’hydrolyse par HCL a été faite suivant la méthode décrite par Hertog et al. (1992) , avec quelques modifications. Chaque résidu sec obtenu par les différentes méthodes d’extractions, précédemment décrites, est dissout dans 40 mL d’une solution à 62,5% méthanol/eau. À cette solution, 10mL d’HCL à 6M ont été ajoutés pour obtenir une solution finale d’HCL à 1,2M dans 50% méthanol/eau, le tout est porté à reflux à 90°C pendant 2h avec une agitation régulière. L’extrait obtenu est laissé refroidir, puis le volume est ajusté à 100 mL avec du méthanol. Une filtration est nécessaire avant l’injection.

I-2- Mode opératoire :

20µl de de l’extrait à analyser ont été injectés dans une colonne Grace® C18 Basic (25 cm x 4,6 mm, 5 µ),VisionHT d’une CLHP de type (YL 9100 CLHP system, Korea). La phase mobile consiste à un mélange de deux solvants, le solvant A (eau / acide formique 0.4%) et le solvant B (acétonitrile). La détection UV a été faite à 280nm et chaque composé phénolique a été quantifié en comparant le temps de rétention et la surface de son pic à celle du même composé commercial. Le gradient de solvants utilisé est le suivant :

Tableau 02 : Gradient d’élution utilisé pour la chromatographie en phase liquide à haute performance

Temps % solvant A % solvant B Flux (mL)

0 à 2 min 99 1 1.2

2 à 15 min 99 à 93 1 à 7 1.2

15 à 25 min 93 à 80 7 à 20 1.2

25 à 35 min 80 à 60 20 à 40 1.2

35 à 46 min 60 à 0 40 à 100 1.2

46 à 47 min 0 100 1.2

47 à 48 min 0 à 99 100 à 1 1.2

48 à 55 min 99 1 1.2

40 Deuxième partie : Matériel et méthodes

II- Fractionnement II-1- Chromatographie sur couche mince :

La chromatographie sur couche mince est une méthode de séparation des composés qui permet d’analyser la complexité d’un mélange. Cette technique a été utilisée pour visualiser la séparation des molécules de l’extrait au cours de son fractionnement sur colonne et pour évaluer la complexité des fractions.

Une cuve de migration est partiellement remplie du mélange de solvant (phase mobile) afin qu’elle soit saturée en vapeur d’éluant ce qui facilite et améliore la migration. Une ligne de dépôt est tracée à 1 cm du bord inférieur de la phase stationnaire (gel de silice ou cellulose), les échantillons y sont déposés, puis la plaque est mise en contact avec la phase mobile dans la cuve jusqu’à migration de la phase mobile à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque ou une autre ligne est tracée.

Les systèmes de solvant que nous avons employés sont en concordance avec le gradient utilisé en chromatographie en phase liquide (chromatographie sur colonne). Ces compositions ne sont qu'indicatives et peuvent être adaptées aux besoins spécifiques d'une analyse.

Les CCM sont analysées en lumière visible et sous UV (254 et 356 nm), avant la révélation par le réactif de vanilline ou une solution méthanolique d’Aminoethyl diphenylborinate 1%. L'utilisation de différents réactifs sur les plaques de chromatographie sur couche mince après élution, permet de comparer les profils des fractions séparées et de les rassembler en fonction de leurs similitudes, d'obtenir des renseignements supplémentaires sur le type d'une molécule et éventuellement permettre de localiser certains composés, invisibles sans dérivatisation chimique.

II-2- Chromatographie en phase liquide sur colonne ouverte :

La chromatographie sur colonne est une technique physico-chimique de séparation qui permet de fractionner et de récupérer séparément les fractions d’un mélange de composés qui est placé en haut de la colonne. Selon la nature de l’éluant et du contenu de la colonne, certaines molécules sont plus facilement éluées que d’autres et la séparation des composés du mélange est ainsi permise.

Cette chromatographie a été réalisée dans une colonne en verre équipée d’un robinet. Du coton hydrophile est placé au bas fond de la colonne pour servir de filtre afin d’éviter les

41 Deuxième partie : Matériel et méthodes

pertes de la phase stationnaire (gel de silice ou sephadex) qu’on a mise en suspension dans le premier éluant puis coulé dans la colonne. Le premier mélange de solvant est ensuite élué sur la colonne jusqu’à ce que la silice soit tassée et stabilisée. Une fine couche de sable est ajoutée pour servir de filtre de la phase mobile et pour éviter les perturbations du dépôt de l’extrait lors de l’élution.

L’extrait à fractionner est dissout dans du méthanol puis déposé sur la couche de sable à l’aide d’une pipette.

L’élution des composés par différents mélanges de solvants successifs est alors réalisée en veillant à ne jamais laisser la colonne s’assécher. Les fractions sont alors récoltées dans des tubes à essai. Le suivi de l’élution des composés s’est fait sur CCM.

L’élution a été faite sur du gel de silice, comme phase stationnaire, et par un système de deux solvants, comme phase mobile, le dichlorométhane et le méthanol, selon le gradient suivant :

Tableau 01 : Système d’élution utilisé pour la chromatographie sur colonne (gel de silice)

Solvants Volume

Dichlométhane Méthanol

100% 0% 100 ml

90% 10% 100 ml

80% 20% 100 ml

70% 30% 100 ml

60% 40% 100 ml

50% 50% 100 ml

40% 60% 100 ml

30% 70% 100 ml

42 Deuxième partie : Matériel et méthodes

20% 80% 100 ml

10% 90% 100 ml

0% 100% 100 ml

Une deuxième chromatographie sur colonne a été réalisée sur le même type de colonne en verre précédemment décrite, mais cette fois remplie d’une phase stationnaire différente (Sephadex). Le méthanol était choisi comme phase mobile. . Cette étape a été suivie d’une CCM préparative sur des plaques de cellulose.

II-3- Chromatographie sur couche mince préparative :

Le principe est identique à celui de la chromatographie sur couche mince mais dans un but de purification. Après fin de la migration et après avoir séché la plaque, les tâches contenant les composés voulus sont grattées de la plaque et récupérées séparément, mises en suspension, puis centrifugées pour éliminer la phase stationnaire (gel de silice ou cellulose). Ensuite, le solvant est éliminé par évaporation, pour obtenir des résidus secs.

II-4- Chromatographie en phase liquide à haute performance semi-préparative :

Le principe est identique à celui de la chromatographie liquide à haute pression, décrit précédemment, mais dans un but de purification, pour cela un volume de 1 ml a été injecté dans une colonne semi-préparative de type Waters Spherisorb 10mm ODS1 (250 x 10 mm). La CLHP utilisée est aussi équipée d’une pompe de type Lab Alliance Series III, et la détéction été faite à 254nm et à 366nm et les fractions ont été récupérées séparément pour l’identification. La phase mobile consiste à un mélange de deux solvants : solvant A (H 2O) et le solvant B (Methanol), Le gradient de solvants utilisé est le suivant :

43 Deuxième partie : Matériel et méthodes

Tableau 03 : Gradient d’élution utilisé pour la chromatographie en phase liquide à haute performance semi-préparative

Temps % solvent A % solvent B Flux (ml)

0 à 5 min 90 à 60 10 à 40 1.0

5 à 35 min 60 à 40 40 à 60 1.0

35 à 45 min 40 à 0 60 à 100 1.0

45 à 55 min 0 100 1.0

55 à 57 min 0 à 100 100 à 0 1.0

57 à 60 min 100 0 1.0

III- Identification des fractions purifiées par résonance magnétique nucléaire bidimentionnelle (RMN-2D) :

La Résonance Magnétique Nucléaire ou RMN-2D est une technique d’analyse spectroscopique non destructive permettant d’accéder à la structure des molécules. Elle exploite les propriétés magnétiques des atomes en les soumettant à de forts champs magnétiques. L’absorption d’énergie obtenue est enregistrée, intégrée et transformée en un signal de résonance puis en spectre de RMN-2D.

Pour l’analyse RMN-2D, un spectromètre Varian V500 (499,833 MHz pour 1H-NMR) a été utilisé. Le spectre est obtenu par le méthanol deutéré CD3OD sans standard interne en prenant le signal du solvant comme référence (3,31ppm to 1H-NMR). Les déplacements chimiques sont exprimés en d (ppm) et les constantes de couplage (J) en Hertz (Hz). Les techniques suivantes ont été utilisées :

Corrélation homonucléaire

- COSY (1H – 1H) : cette expérience fournit des informations sur les couplages homonucléaires 2J et 3J (protons séparés par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents.

44 Deuxième partie : Matériel et méthodes

Corrélations hétéronucléaires

- HSQC (1JH-C) : cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones et les protons directement liés entre eux. Toutefois, elle ne permet pas d'observer les déplacements chimiques des atomes de carbones quaternaires.

- HMBC (2JH-C, 3JH-C) : cette technique permet de répondre aux problèmes précédemment posés, puisqu'elle permet la détection des couplages longue distance 2JHC, 3JH-C, et permet de déduire les carbones quaternaires couplés aux protons.

Les échantillons sont dissous dans du méthanol deutéré.

IV- Analyse statistique :

Les données expérimentales ont été exprimées par la moyenne ± l’écart type en utilisant l’Exel et l’Origin 6. Chaque manipulation a été répétée 3 fois en ce qui concerne les dosages des composés phénoliques et deux fois pour ce qui est de l’évaluation du pouvoir antioxydant.

45









 

  
Troisième partie : Résultats et Discussion

CHAPITRE 1 : Screening phytochimique, extraction et teneurs en composés phénoliques

I- Introduction :

Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica , une plante parmi les milliers qui constituent la flore algérienne qui est très riche, diversifiée et toujours peu valorisée.

Ce travail est une contribution à l’étude de la composition des différents organes de l’espèce Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica en polyphénols et de leurs potentiel antioxydant, ce qui est l’un des axes principaux de recherche développé dans notre laboratoire.

La macération est l’une des méthodes les plus utilisées pour l’étude du contenu des plantes en métabolites secondaires, en raison de la sensibilité de certains composés aux traitements thermiques, tels que les polyphénols.

45 Troisième partie : Résultats et Discussion

Résultats

II-1- Tests phytochimiques :

Les résultats des tests phytochimiques effectuées sur les sept parties étudiées sont regroupés dans le Tableau 04. On remarque la présence des flavonoïdes et des tanins dans toutes les parties étudiées, par contre une absence totale des anthraquinones, des stérols et stéroïdes et des composés réducteurs et cela dans tous les organes.

Les anthocyanosides et les coumarines ont été révélés dans les fruits, les tiges et l’écorce interne, seulement.

Tableau 04 : Résultats des tests phytochimiques réalisés sur les différents organes de Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica.

Parties étudiées Classes Ecorce Ecorce recherchées Fruits Feuilles Bourgeons Tiges Racines interne externe Flavonoïdes + + + + + + +

Tanins + + + + + + +

Anthocyanosides + - - + + - -

Anthracénosides - - - + + - -

Anthraquinones ------

Coumarines + - - + + - -

Alcaloïdes + - + - - - -

Saponosides + - + - + + + Stérols et stéroïdes ------Acides gras + - + - + + + Composés réducteurs ------Huiles volatiles + - + - - + -

Amidon + - - - + + - (+) : présence (-) : Absence

46 Troisième partie : Résultats et Discussion

Par ailleurs, la présence des saponosides et des acides gras a été constatée dans la plupart des parties sauf les feuilles et les tiges.

Les anthracénosides et les alcaloïdes n’ont été révélés que dans les tiges et l’écorce interne et dans les feuilles et les bourgeons, respectivement.

Ces tests ont montré aussi la présence des huiles volatiles dans les fruits, les bourgeons et l’écorce externe et en fin la présence de l’amidon dans les fruits et l’écorce interne et externe.

Les tests phytochimiques nous ont permis de connaitre la composition préliminaire de l’espèce étudiée et nous ont aidés à se décider des composés qu’on doit extraire dans la suite du travail.

II-2- Rendements des extraits :

Les résultats obtenus montrent que les rendements d'extraction varient de 1,41 à 35,24% (Tableau 05) .

L’écorce externe a enregistré les rendements les plus faibles 6,62% en phénols totaux, 1,41% flavonoïdes, 2,56% tanins et 2,52 en anthocyanes, contrairement à l’écorce interne avec les rendements les plus élevés : 35,24% de phénols totaux, 9,15% de flavonoïdes, 5,18% de tanins et 12,46% d’anthocyanes.

A partir de ces résultats, l’écorce externe et les bourgeons sont les parties de la plante qui ont donné les rendements les plus élevés. Ces résultats ne corroborent pas toutes avec les travaux antérieurs, pour cela, il nous était difficile de comparer nos résultats avec ceux de la bibliographie, car aucune étude antérieure n’a été faite sur les bourgeons, les tiges, l’écorce ou les racines.

47 Troisième partie : Résultats et Discussion

Tableau 05 : Rendements des extractions (exprimés en %)

Phénols totaux Flavonoïdes Tanins Anthocyanes (%) (%) (%) (%)

Fruits 31,25 5,26 5,82 7,52

Feuilles 25,21 6,44 5,05 8,33

Bourgeons 33,85 7,51 8,06 9,20

Tiges 10,30 3,25 3,74 3,23

Ecorce interne 35,24 9,15 5,18 12,46

Ecorce externe 6,62 1,41 2,56 2,52

Racines 27,04 3,86 7,74 9,25 II-3- Teneurs en phénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols et en tanins :

Les analyses quantitatives en phénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols et en tanins ont été faites par un spectrophotomètre UV-Visibles. Les phénols totaux ont été quantifiés suivant la méthode du Folin-ciocalteu, les flavonoïdes par méthode de trichlorure d’aluminium, les flavonols par méthode d’acétate de sodium, les tanins par méthode de la vanilline et finalement l’estimation de la teneur en anthocyanes a été faite par la méthode de décoloration par l'acide sulfureux. Les densités optiques D.O obtenues ont été projetées sur les courbes d’étalonnages appropriées, les teneurs ont été déduites par la suite et regroupées dans le tableau 06.

48 Troisième partie : Résultats et Discussion

Tableau 06 : Résultats des teneurs en phénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols, en tanins et en anthocyanes des différents organes.

Phénols totaux Flavonoïdes Flavonols Tanins Anthocyanes (mg EAG/g MS) (mg EC/g MS) (mg EQ/g (mg EC/g (mg ED/g MS) MS) MS)

Fruits 205.219 ± 9.974 6.866 ± 0.539 3.291±0.087 5.178±0.126 13.587±0.235

Feuilles 255.789 ± 4.733 22.683 ± 0.693 1.539±0.015 11.805±0.307 35.324±0.152

Bourgeons 233.946 ± 6.205 24.623 ± 0.252 8.942±0.208 48.615±0.141 39.921±0.165

Tiges 90.727 ± 7.360 9.466 ± 0.305 2.538±0.136 24.653±0.513 24.514±0.131

Ecorce 131.449 ± 18.972 21.805 ± 0.664 5.139±0.176 49.095±0.306 30.062±0.056 interne

Ecorce 6.236 ± 0.081 1.690 ± 0.050 0.788±0.005 5.913±0.031 3.562±0.127 externe

Racines 35.603 ± 2.256 17.021 ± 0.280 1.497±0.014 29.789±0.391 21.105±0.018

II-3-1- Courbe d’étalonnage pour le dosage des phénols totaux :

Cette courbe a été établie en utilisant, comme référence, l’acide gallique. La formule de régression linéaire de cette courbe est de y = 2.916 x, avec un coefficient de détermination (R 2 = 0.9978) (figure 21).

0.8 y = 2.916 x 0.7 R2 = 0.9978 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Absorbance (765nm) Absorbance 0.1 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Concentrations d'acide gallique (mg/ml)

Figure 21 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique pour le dosage des phénols totaux.

49 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-3-2- Dosage des phénols totaux :

Selon les résultats représentés dans le tableau 06 et le figure 22, les teneurs en phénols totaux varient énormément, on a pu distinguer deux groupes, le premier groupe et celui des organes ayant des teneurs supérieures ou égales à 205.219 ± 9.974 mg GAE/g MS et inférieures ou égales à 255.789 ± 4.733 mg GAE/g MS qui inclus les fruits, les bourgeons et les feuilles. Le deuxième groupe contient les organes ayant des teneurs variant entre 131.449 ± 18.972 mg GAE/g MS et 6.236 ± 0.081 mg GAE/g MS, ce groupe inclus l’écorce interne, les tiges, les racines et l’écorce externe.

300

250

200

150 255,789 233,946 100 205,219 Phénols totaux (mg GAE/g GAE/g Phénols MS) totaux (mg 131,449 50 90,727 6,236 35,603 0 Fruits Feuilles Bourgeons Tiges Ecorce interneEcorce externe Racines

Figure 22 : Teneurs en phénols totaux des différents organes, exprimées en mg EAG/g MS

II-3-3- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Flavonoïdes :

La catéchine a été utilisée comme référence pour tracer cette courbe d’étalonnage qu’on a utilisé pour le dosage des flavonoïdes. La formule de régression linéaire de cette courbe est de y = 5.140 x, avec un coefficient de détermination (R 2 = 0.9911) (figure 23).

50 Troisième partie : Résultats et Discussion

1.4

1.2 y = 5.1403 x 2 1 R = 0.9911 0.8

0.6

0.4

Absorbance (510 nm) (510 Absorbance 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Concentrations de catéchine (mg/ml)

Figure 23 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des flavonoïdes.

II-3-4- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Flavonols :

Le composé de référence qui a été utilisé pour l’établissement de cette droite est la quercetine. La formule de régression linéaire de cette courbe est de y = 7.601 x, avec un coefficient de détermination (R 2 = 0.9910) (figure 24).

4,5

4 y = 7,601x 3,5 R² = 0.991 3 2,5 2 1,5 1

Absorbances ( 440nm) 0,5 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Concentrations de la quercétine (mg/ml)

Figure 24 : Courbe d’étalonnage de la quercétine pour le dosage des flavonols.

II-3-5- Dosage des Flavonoïdes et des Flavonols :

En ce qui concerne les flavonoïdes et les flavonols, représentés dans le tableau 06 et la figure 25, les teneurs les plus élevées sont celles des bourgeons avec 24.623 ± 0.252 mg EC/g MS et 8.942±0.208 mg QE/g MS de flavonoïdes et de flavonols, respectivement. Les teneurs les plus faibles ont été observées dans l’écorce externe égales à 1.690 ± 0.050 mg EC/g MS et 0.788±0.005 mg EQ/g MS, respectivement.

51 Troisième partie : Résultats et Discussion

30

25

20

15

24,623 22,683 21,805 10 17,021

5 3,291 8,942 9,466 2,538 6,866 1,539 1,690 1,497 5,139 0,788 0 Fruits Feuilles Bourgeons Tiges Ecorce interne Ecorce externe Racines

Flavonoïdes (mg CE/g DM) Flavonols (mg QE/g DM)

Figure 25 : Teneurs en Flavonoïdes et en Flavonols de différents organes, exprimées en mg EC/g MS et en mg EQ/g MS, respectivement.

II-3-6- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Tanins :

Afin de tracer cette courbe d’étalonnage on a choisi la catéchine comme référence. La formule de régression linéaire de cette courbe est de y = 0.1161 x, avec un coefficient de détermination (R 2 = 0.9968) (figure 26).

0.2 0.18 y = 0.1161x 2 0.16 R = 0.9968 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 Absorbance (550 nm) (550 Absorbance 0.02 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Concentrations de catéchine (mg/ml)

Figure 26 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des tanins condensés.

52 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-3-7- Dosage des Tanins condensés :

Les teneurs en tanins, représentées dans le tableau 06 et la figure 27 , sont considérablement variées. Les valeurs supérieures avoisinant les 49 mg EC/g MS ont été enregistrées dans les racines, l’écorce interne et les bourgeons, la valeur moyenne a été observée dans les tiges avec 24.653±0.513 mg EC/g MS et en passant par les feuilles à 11.805±0.307 mg EC/g MS, les fruits et l’écorce externe n’ont pas atteint les 6 mg EC/g MS de tanins condensés.

60

50

40

30 48,615 49,095 49,789 20 Tanins (mg CE/g MS) CE/g (mg Tanins

24,653 10 5,178 5,913 11,805 0 Fruits Feuilles Bourgeons Tiges Ecorce interne Ecorce externe Racines

Figure 27 : Teneurs en tanins des différents organes, exprimées en mg EC/g MS

II-3-8- Courbe d’étalonnage pour le dosage des Anthocyanes :

La délphinidine a servi comme standard pour l’établissement de cette courbe d’étalonnage. La formule de régression linéaire de cette courbe est de y = 0.2119 x, avec un coefficient de détermination (R 2 = 0.9984) (figure 28).

53 Troisième partie : Résultats et Discussion

0,7

0,6 y = 0.2119x + 0.0275 R² = 0.9984 0,5

0,4

0,3

0,2 Absorbance(520nm) 0,1

0 0 100 200 300 400 500 600 Concetrations de délphinidine (mg/ml)

Figure 28 : Courbe d’étalonnage de la Délphinidine pour le dosage des anthocyanes.

II-3-9- Dosage des Anthocyanes :

Les résultats du dosage des anthocyanes dans les différentes parties étudiées montrent deux groupes où les teneurs varient considérablement, le premier groupe ayant des valeurs supérieures à 30 mg ED/g MS est celui des bourgeons, des feuilles et de l’écorce interne avec des teneurs égales à 39.921±0.165, 35.324±0.152 et 30.062±0.056 mg ED/g MS, respectivement. Le deuxième groupe la ou les valeurs sont inférieures à 25 mg ED/g MS contient les tiges, les racines, les fruits et en dérnier lieu l’écorce externe avec 3.562±0.121 mg ED/g MS, respectivement (Tableau 06 et figure 29).

Figure 29 : Teneurs en Anthocyanes des différents organes, exprimées en mg ED/g MS

54 Troisième partie : Résultats et Discussion

II- Discussion :

A cause de leurs effets biologiques, l’extraction et la purification des antioxydants naturels suscitent énormément d’intérêt, surtout en industrie agroalimentaire. Dans ce travail, le choix des solvants d’extraction des polyphénols totaux, des flavonoïdes, des tanins et des anthocyanes est basé sur plusieurs travaux antérieurs, qui même sur la même espèce végétale montrent généralement des différences de rendements, qui semblent être liées à plusieurs facteurs : géographiques, environnementales, à la durée du stockage, à la période de récolte et aussi aux conditions dans lesquelles l’extraction a été effectuée.

Le rendement massique des fruits en polyphénols totaux (31.25%) est proche à ceux reportés par Benhammou et al. (2014) et Belyagoubi et al. (2016), soit respectivement 33.43% et 36.4%. Toutefois, il est difficile de comparer nos résultats, concernant le reste de parties étudiées, avec ceux de la bibliographie, car d’après notre recherche, aucun travail n’a été effectué sur ces organes (bourgeons, tiges, écorce et racines).

Peu de travaux concernant les teneurs en composés phénoliques des parties étudiées ont été réalisés, seuls les feuilles et les fruits ont fait l’objet de différentes études, comme celle de Hatamnia et al. (2015) qui a rapporté des teneurs de 57.7 mg GAE/g MS de phénols totaux et 3.45 mg EC/g MS de flavonoïdes dans les graines de P.atlantica, aussi l’étude de Benhammou et al. (2014) a enregistré 285.95mg GAE/g MS et 12.44 mg EC/g MS de phénols totaux et de flavonoïdes, respectivement, ce qui est proches de nos résultats sur la même partie (fruits) avec 205.219 mg GAE/g MS et 6.866 mg EC/g MS. A ces études s’ajoute celle de Ben Ahmed et al. (2017) avec 258 mg GAE/g MS de polyphénols totaux, 2.30 mg EQ/g MS et 3.19 mg d’équivalent catéchine par gramme de feuilles sèches, ce qui concorde avec notre résultat en ce qui concerne les phénols totaux avec 255.789 mg GAE/g MS mais faible en ce qui concerne les flavonoïdes 22.683 mg EC/g MS et les tanins11.805 mg EC/g MS.

Nadernejad et al. (2013) a rapporté 10.042 mg ED/ gramme de matière fraiche contre 13.587 mg ED/g de matière sèche. Cette différence peut se traduire par le fait qu’ils ont travaillé sur des graines fraiches contrairement à notre étude qui a été effectuée sur des graines sèches.

55 Troisième partie : Résultats et Discussion

III- Conclusion :

Dans ce premier volet, les études qualitatives et quantitatives réalisées par des essais de coloration, de précipitation d’examens par lumière UV, ainsi que des méthodes spectrophotométriques, nous ont permis de révéler la richesse des différents organes de cette espèce étudiée en composés phénoliques, surtout les bourgeons qui viennent en premier lieu, suivis des feuilles, des fruits et de l’écorce interne.

La richesse de cette plante en composés phénoliques est peut-être fortement liée au climat et surtout à la localisation géographique, car plus la plante est proche des agglomérations, plus elle est exposée à la pollution et aux conditions défavorables de ces dernières, ce qui l’incite à construire un fort patrimoine en métabolites secondaires qui lui permet de résister à ces conditions.

Les teneurs en phénols totaux, en flavonoïdes, en tanins et en anthocyanes sont importantes et variées. Cette variabilité des teneurs en composés phénoliques est généralement liée à l’importance des activités biologiques. D’ailleurs, et d’une manière générale, le pouvoir antioxydant est fortement corrélé à la concentration en composés phénoliques (Hanson et al., 2004) . C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés par la suite à l’évaluation de l’activité antioxydante et de nos extraits dans le deuxième volet de cette étude.

56 Troisième partie : Résultats et Discussion

CHAPITRE 2 : Evaluation du pouvoir antioxydant des extraits

I- Introduction :

Dans ce deuxième volet, 35 extraits ont fait l’objet de cette étude, nous nous sommes intéressés à étudier la capacité antioxydantes de ces derniers (extrait brut, flavonoïdes, tanins et anthocyanes) des sept organes de pistacia atlantica Desf. subsp. Atlantica , et comme il est fortement recommandé d’utiliser plusieurs tests pour l’évaluation de l’activité antioxydante d’une plante (Prior et al., 2005), quatre techniques qui sont couramment employées au sein de notre laboratoire ont été mises en œuvre, la capacité antioxydante totale (CAT), le test du piégeage du radical DPPH, la réduction du fer (FRAP) et le test de blanchiment du β-caroténe. Des antioxydants synthétiques tels que le BHA ont été utilisés à titre comparatif.

II- Evaluation du pouvoir antioxydant des extraits :

II-1-La capacité antioxydante totale (CAT) :

La capacité antioxydante totale des différents extraits étudiés est exprimée en nombre d’équivalents d’acide ascorbique par gramme de la matière sèche (mg EAA/ g MS) à partir d’une courbe d’étalonnage établie en utilisant l’acide ascorbique comme référence (Figure 30). La formule de régression linéaire de cette courbe est de y = 4.671 x, avec un coefficient de détermination (R 2 = 0.986)

Figure 30 : Courbe d’étalonnage de l’acide ascorbique pour l’activité antioxydante totale

57 Troisième partie : Résultats et Discussion

Les résultats de ce dosage sont regroupés dans le tableau 07 , ces résultats montrent que l’extrait brut des feuilles possède la plus forte capacité de l’ordre de 123.558±8.309 mg EAA/g MS, suivi de l’extrait brut des bourgeons avec 75.293±3.187 mg EAA/g MS, puis les deux extraits des anthocyanes et les tanins des feuilles avec des valeurs de l’ordre de 56.261±1.323 mg EAA/g MS et 53.204±0.079 mg EAA/g MS, respectivement. Le reste des extraits sont au-dessous des 40 mg EAA/g MS et la plus faible capacité est celle de l’extrait brut de l’écorce externe avec 1.130±0.581 mg EAA/g MS.

Tableau 07 : Résultats de la capacité antioxydante totale des extraits des différents organes exprimés en mg d’équivalent acide ascorbique par gramme de matière sèche (mg EAA/g

CAT mg EAA/g MS

Flavonoïdes Flavonoïdes Extrait brut (Acétate Tanins Anthocyanes (n. butanol) d’éthyle)

Fruits 35.518±0.790 29.411±1.571 12.098±0.045 24.318±0.0363 26.421±0.631

Feuilles 123.558±8.309 19.417±1.260 5.244±0.020 53.204±0.079 56.261±1.323

Bourgeons 75.293±3.187 25.246±0.949 14.323±0.985 36.197±0.624 39.566±0.971

Tiges 34.863±0.989 12.169±0.390 5.190±0.043 31.013 ±0.231 39.245±1.353

Ecorce 31.799±1.362 11.263±0.672 7.242±0.229 11.160±0.204 26.717±0.826 interne

Ecorce 1.130±0.581 1.924±0.292 1.785±0.136 5.061±0.488 11.682±1.537 externe

Racines 15.270±4.286 11.152±1.178 21.077±1.446 10.541±0.326 36.916±1.105

58 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-2-Le piégeage du radical libre DPPH : La gamme de concentrations utilisée est de 0.0625 à 1 mg/mL. Les densités optiques enregistrées montrent une augmentation proportionnelle des pourcentages d’inhibition en fonction concentrations utilisées (Figure 31) .

Les résultats montrent que l’extrait d’anthocyanes des bourgeons a le plus fort effet de piégeage du radical libre DPPH avec une CI 50 =0.016 mg/mL et son pourcentage d’inhibition a atteint plus de 60% à une concetration de 0,007 mg/mL, suivi de l’extrait d’anthocyanes des feuilles, l’extrait brut des feuilles, l’extrait des flavonoïdes n.butanol des feuilles et l’extrait flavonoïdique des racines avec 0.026, 0.059, 0.060 et 0.072mg/mL, respectivement. Tous ces extraits ont montré un effet antiradicalaire meilleur que celui de l’antioxyadnt de référence BHT=0.090 mg/mL. Le reste des extraits ont des CI 50 entre 0.095 et 5.712 mg/mL (Tableau 08, Figure 31).

Tableau 08 : Résultats du piégeage du radical DPPH des extraits des différents organes, exprimés en mg/mL.

IC 50 (mg/mL)

Flavonoïdes Flavonoïdes Extrait brut Tannins Anthocyanes (Acétate d’éthyle) (n. butanol)

Fruits 0.182±0.005 0.132±0.004 0.333±0.007 0.104±0.001 1.006±0.114

Feuilles 0.059±0.001 0.095±0.002 0.060±0.001 0.124±0.001 0.026±0.002

Bourgeons 0.097±0.001 0.214±0.021 0.138±0.002 0.143±0.005 0.016±0.005

Tiges 0.177±0.007 0.329±0.0073 0.133±0.009 0.208±0.009 0.102±0.015

Ecorce interne 0.181±0.004 0.568±0.013 0.201±0.005 0.234±0.003 0.120±0.005

Ecorce externe 1.059±0.001 1.180±0.001 5.712±1.509 0.440±0.001 1.110±0.007

Racines 0.095±0.001 0.233±0.001 0.072±0.001 0.304±0.001 0.218±0.004

BHA 0.090±0.001

59 Troisième partie : Résultats et Discussion

120

100

80

60

Pourcentage d'inhibition Pourcentage d'inhibition (%) 40

20

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 concentrations mg/mL

ETFr: extrait tanins fruit, EAFe : extrait anthocyanes feuilles, EAB : extait anthocyanes bourgeons, EAT : extrait anthocyanes tiges, EAEi : extrait anthocyanes ecorce interne, ETEe : extrait tanins ecorce externe, EFbR : extrait flavonoides nbutanol racines.

Figure 31 : Pourcentages d’inhibition du radical libre DPPH en fonctions des différentes concentrations du meilleur extrait de chaque partie étudiée

II-3-La réduction du fer (FRAP) :

Cette technique d’évaluation du pouvoir antioxydant se traduit par la réduction de Fe3+/complexe ferricyanide à la forme ferreux. Par conséquent, Fe2+ peut être évalué en mesurant et en surveillant l’augmentation de la densité de la couleur bleu dans le milieu réactionnel à 700 nm.

Dans notre travail, nous avons testé les différents extraits de chaque partie étudiée à des concentrations allant entre 0.0125 et 0.2 mg/mL. Les valeurs obtenues nous ont permis de tracer des courbes à allures linéaires et avec R2 entre 0.90 et 0.99. Les résultats obtenus corroborent avec le fait que la capacité de réduction est proportionnelle à l’augmentation de la concentration des échantillons.

La capacité réductrice des différents extraits est exprimée en CE 50 qui représente la concentration efficace qui correspond à une absorbance égale à 0.5.

60 Troisième partie : Résultats et Discussion

Le tableau 09 et la figure 32 montrent que l’extrait brut des feuilles, suivi l’extrait des tanins, l’extrait des anthocyanes des bourgeons et l’extrait des anthocyanes des feuilles

ont la plus forte activité avec des CE 50 =0.015, 0.021, 0.027 et 0.029 mg/mL,

respectivement. Les CE 50 du reste des extraits varient entre 0.062 et 0.863mg/mL.

Tableau 09 : Résultats du test de la réduction du Fer des extraits des différents organes exprimés en mg/mL

CE50 (mg/mL)

Flavonoïdes Flavonoïdes Extrait brut (Acétate Tanins Anthocyanes (n. butanol) d’éthyle)

Fruits 0.334±0.003 0.154±0.006 0.184±0.001 0.127±0.001 0.271±0.004

Feuilles 0.015±0.001 0.068±0.001 0.080±0.001 0.021±0.001 0.029±0.001

Bourgeons 0.132±0.001 0.273±0.008 0.137±0.001 0.245±0.006 0.027±0.001

Tiges 0.219±0.002 0.645±0.010 0.356±0.016 0.086±0.001 0.159±0.001

Ecorce interne 0.192±0.003 0.446±0.015 0.283±0.011 0.171±0.002 0.217±0.001

Ecorce externe 0.553±0.004 0.863±0.005 0.145±0.005 0.170±0.005 1.414±0.020

Racines 0.062±0.001 0.381±0.019 0.129±0.019 0.154±0.001 0.272±0.002

BHA 0.060±0.001

61 Troisième partie : Résultats et Discussion

ETFr: extrait tanins fruit, EBFe : extrait brut feuilles, EAB : extait anthocyanes bourgeons, ETT : extrait tanins tiges, ETEi : extrait tanins ecorce interne, EFbEe : extrait flavonoides nbutanol ecorce externe, EBR : extrait brut racines.

Figure 32 : Pouvoir réducteur du Fer du meilleur extrait de chaque partie étudié

II-4-Le test de blanchiment du β-carotène :

Dans ce test l’activité antiradicalaire des extraits est déterminée en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydatif du β-carotène (décoloration) par les produits d’oxydation de l’acide linoléique. Etant donné que ce test est basé sur un système d’émulsion des lipides dans l’eau, Frankel et Meyer en 2000 ont proposé que les antioxydants apolaires exposent des propriétés antioxydantes plus importantes que les antioxydants polaires. Dans ce système, les antioxydants apolaires sont concentrés dans l'interface lipide-eau, permettant ainsi de prévenir la formation des radicaux lipidiques et, par conséquent, l’oxydation du β-carotène. Alors que les antioxydants polaires restent dilués dans la phase aqueuse et sont, donc, moins efficaces.

62 Troisième partie : Résultats et Discussion

Les résultats regroupés et illustrés dans le tableau 10 et la figure 33 montrent un très fort effet inhibiteur du blachiment du β-carotène de la part de l’extrait des anthocyanes des

bourgeons avec une CI 50 =0.006mg/mL, suivi de l’exrait brut, l’extarit des anthocyanes

des feuilles et de l’extrait brut des fruits avec des CI 50 =0.064, 0.070 et 0.091 mg/mL, respectivement. Ces quatres extraits ont montré une meilleure activité inhibtrice méme en les comparant a celle de l’antioxydant de référence BHT=0.243 mg/mL. Le reste des extraits étaient entre 0.108 et 5.021mg/mL à son maximum.

Tableau 10 : Résultats du test du blanchiment du β-carotène des extraits des différents organes exprimés en mg/mL

IC 50 (mg/mL)

Flavonoïdes Flavonoïdes Extrait brut Tanins Anthocyanes (Acétate d’éthyle) (n. butanol)

Fruits 0.091±0.012 0.256±0.001 2.632±0.089 0.415±0.020 0.207±0.026

Feuilles 0.110±0.001 0.273±0.007 0.292±0.006 0.313±0.009 0.070±0.002

Bourgeons 0.064±0.029 1.621±0.047 0.156±0.022 1.624±0.004 0.006±0.009

Tiges 0.136±0.029 0.452±0.009 0.155±0.006 4.190±0.534 0.111±0.007

Ecorce interne 0.382±0.011 0.280±0.047 2.351±0.113 2.136±0.309 0.136±0.017

Ecorce externe 1.485±0.001 1.082±0.001 5.021±1.332 0.131±0.002 1.254±0.052

Racines 0.257±0.009 0.512±0.029 0.354±0.010 0.094±0.006 1.058±0.033

BHA 0.243±0.002

63 Troisième partie : Résultats et Discussion

EBFr: extrait brut fruit, EAFe : extrait anthocyanes feuilles, EAB : extait anthocyanes bourgeons, EAT : extrait anthocyanes tiges, EAEi : extrait anthocyanes ecorce interne, ETEe : extrait tanins ecorce externe, ETR : extrait tanins racines.

Figure 33 : Pourcentages d’inhibition du blanchiment de la β-caroténe en fonctions des différentes concentrations du meilleur extrait de chaque partie étudiée

64 Troisième partie : Résultats et Discussion

III- Discussion :

L’évaluation de l‘activité antioxydante et comme il est recommandé d’utiliser plusieurs tests pour la confirmer (Prior et al., 2005) quatre différentes méthodes ont été mise en œuvre pour mesurer et mettre en évidence le potentiel antioxydant de nos 35 extraits. Il s’est avéré que les extraits des bourgeons et des feuilles suivis de ceux des fruits et de l’écorce interne sont les plus potents, même en les comparant avec les antioxydants de synthèse.

Plusieurs travaux antérieurs ont confirmé le puissant pouvoir antioxydant des extraits de cette espèce végétale. Benhammou et al. (2014) a rapporté que l’extrait brut des fruits a une activité antioxydante totale de mg 45.510±1.630 mg EAA/g MS contre notre extrait avec 35.518±0.790 mg EAA/g MS. Un deuxième travail de Benhammou et al. (2014) ou la fraction acétate d’éthyle et la fraction butanolique des flavonoïdes ont montré une activité antioxydante totale égale à 31.20±1.87 et 20.21±1.02 mg EAA/g MS, respectivement, ce qui est proche de nos résultats avec, 29.411±1.571 et 12.098±0.045 mg EAA/g MS, respectivement.

En ce qui concerne le test du piégeage du radical libre DPPH, Hatamnia et al. (2014) a rapporté une CI 50 =0.076 ± 0.002 de l’extrait brut des fruits, à cette étude s’ajoute celle de

Belyagoubi et al. (2016) avec une CI 50 =0.130±0.000 du même extrait, et celle de Rigane et al. (2017) avec une CI 50 =0.200±0.00. Ces résultats sont différentes et, en moyenne, proche du nôtre avec une CI 50 =0.182±0.005, mais reste loin par rapport à l’extrait des anthocyanes des bourgeons qui a montré un pouvoir piégeur très élevé avec une

CI 50 =0.016±0.005, loin même de celui de l’antioxydant de référence BHT avec une

CI 50 =0.090±0.001.

Le pouvoir réducteur du Fer de cette espèce a été confirmé dans pas mal de travaux, surtout sur les fruits, comme celui de Hatamnia et al. (2014) ou l’extrait brut des fruits a montré une CE 50 =0.320±0.010 mg/mL, ce résultat et proche du notre

CE 50 =0.334±0.003mg/mL et loin de celui reporté par Benhammou et al. (2014) avec une

CE 50 =0.130±0.001 mg/mL, à ces études s’ajoute celle de Benhammou et al. (2014) ou la fraction acétate d’éthyle et la fraction butanolique des flavonoïdes des fruits ont enregistré des CE 50 égales à 0.050±0.001mg/mL et 0.140±0.001mg/mL, respectivement, contre 0.154±0.006 et 0.184±0.001 dans notre étude. Ces résultats restent toujours moins actifs que certains extraits de notre étude, tels que l’extrait brut des feuilles avec une CE 50

65 Troisième partie : Résultats et Discussion

égale à 0.015±0.001 mg/mL contre 0.055±0.001 mg/mL dans l’étude de Peksel (2008) , suivi de la fraction butanolique des flavonoïdes de la même partie avec une CE 50 égale à 0.021±0.001 mg/mL, même en les comparant avec l’antioxydant de référence BHT (0.060±0.001 mg/mL). Cette forte activité peut être due à la présence de groupements hydroxyles en positin 3, 5 et/ou 7 dans les composés phénoliques de nos extraits qui peuvent servir de donneurs d’électrons. Par conséquent, les antioxydants sont considérés comme des réducteurs et inactivateurs d’espèces oxydantes (Siddhuraju et Becker, 2007) .

Les résultats du test de blanchiment du β-carotène dans notre étude sont consolidés par différentes études antérieures, telles que celles de Peksel (2008) et Peksel et al. (2013) ou l’extrait méthanolique des feuilles a montré, respectivement dans les deux études, des

CI 50 égales à 0.600±0.050 et 0.400±0.040 mg/mL contre 0.110±0.001mg/mL du même extrait dans notre étude, et celle de Benhammou et al. (2014) ou la fraction acétate d’éthyle et la fraction butanolique des flavonoïdes des fruits ont enregistrés des CE 50 égales à 3.52±0.070 et 37.810±4.430mg/mL, respectivement, ces résultats sont trop faibles par rapport aux CE 50 montrées dans notre étude 0.256±0.001 et 2.632±0.089mg/mL, respectivement, et beaucoup trop faibles en les comparant avec notre extrait le plus potent qui est l’extrait des anthocyanes des bourgeons avec 0.006±0.009 mg/mL. Cette forte activité et peut être due au fait que les bourgeons possèdent un ensemble de propriétés thérapeutiques supérieures à celles des diverses parties de la plante mature. Le bourgeon étant un embryon, il porterait en lui le potentiel de la plante complète, comme s’il était à la fois les tiges, les feuilles, les fleurs et les fruits. (Henry. 1989)

66 Troisième partie : Résultats et Discussion

IV- Conclusion :

Dans ce deuxième volet, le pouvoir antioxyant de nos 35 extraits préparés des 7 parties sélectionnées a été évalué à travers différentes méthodes, ce travail est le premier de son genre, selon la littérature, sur l’espece Pistacia atlantica . Desf qui a mis en œuvre toutes les parties de la plante, de ses feuilles à ses racines.

Dans ce chapitre, et selon les résultats enregistrés, l’extrait brut des feuilles et l’extrait des anthocyanes des bourgeons étaient les plus puissants et les plus intéressants, en terme de potentiel antioxydant. Cette forte activité est liée à la forte teneurs de ces parties en composés phénoliques (Hanson et al., 2004 ; Benhammou et al., 2014), , et aux interactions synergiques entre ces composés phénoliques.

Les anthocyanes des bourgeons, qui sont jusque-là très peu étudié, ont été, et de loin, les molécules ayant la plus puissante activité antioxydante, d’où la gemmothérapie, et cela peut-être due à la glycosylation du cycle-B qui augmente le potentiel antioxydant des anthocyanes, ainsi que l’ortho-hydroxylation et la méthylation (Wang et al., 1997 ; Genskowsky et al., 2016.)

A cause de la forte teneur de nos extraits en phénols totaux, en flavonoïdes, en tanins et en anthocyanes, nous nous sommes intéressés, dans la suite du travail, au fractionnement et à l’identification des composés phénoliques afin de confirmer cette forte activité antioxydante.

67 Troisième partie : Résultats et Discussion

CHAPITRE 3 : Fractionnement, purification et identification des composés actifs

I- Introduction :

Dans ce troisième et dernier volet de cette étude, quelques organes et quelques extraits ont été sélectionnés selon leurs teneurs en composés phénoliques et leurs potentiels antioxydants pour la suite du travail.

La puissante activité antioxydante des bourgeons, des feuilles et des racines est peut être liée à leurs fortes teneurs en composés phénoliques. On a pensé que cela peut être confirmé par une chromatographie en phase liquide (comparative) en premier lieu et un fractionnement par différentes techniques chromatographiques, en deuxième lieu, et une identification par RMN-2D en dernier lieu. Le protocole experimental suivi est résumé dans la figure 34 .

L’étude comparative CLHP a été faite dans le laboratoire central de la faculté SNV- STU de l’université de Tlemcen.

La CLHP semi-préparative ainsi que l’identification des composés isolés par RMN- 2D a été faite dans le laboratoire de pharmacognosie au sein de la faculté de pharmacie à l’université d’Aristote de Thessalonique, Grèce. Les spectres RMN ont été interprétés par l’équipe du professeur KOKKALOU Eugenius, directeur du laboratoire, précédemment cité.

68 Troisième partie : Résultats et Discussion

Feuilles Bourgeons Racines

Flavonoïdes Flavonoïdes Flavonoïdes Flavonoïdes Flavonoïdes Flavonoïdes Extrait brut Extrait brut Acéthate d'éthyle n.butanol Extrait brut Acéthate d'éthyle n.butanol Acéthate d'éthyle n.butanol

Chromatographie en phase liquide de haute Chromatographie sur performance colonne

CLHP préparative

RMN-2D

Figure 34 : Etapes de fractionnement, de purification et d’identification des composés actifs

II- Résultats :

II-1- Identification et quantification des composés phénoliques dans les extraits actifs par CLHP:

Trois parties de la plante ont fait l’objet de cette identification spectrale, à cause de leur richesse en polyphénols et leurs remarquables potentiels antioxydants, les feuilles, les bourgeons et les racines. De chaque partie trois extraits ont été préparés, l’extrait brut, la fraction acétate d’éthyle et la fraction n.butanol des flavonoïdes.

Les composés phénoliques dans les différentes parties de la plante ont été identifiés en comparant leurs temps de rétention et les propriétés des spectres UV-Vis (tableau 11) à ceux des standards de référence (l’acide tannique, la rutine, l’acide gallique, l’acide ascorbique, l’acide vanillique, l’acide p-coumarique, la catéchine, l’acide syringique,

69 Troisième partie : Résultats et Discussion

l’acide ferulique, la quercétine et la naringénine). Les résultats de l'analyse quantitative (µg / g MS) de chaque composé phénolique identifié sont présentés dans le tableau 11. Dans les extraits de feuilles, la quantité de composés identifiés variaient largement, à partir de 1050,32 µg / g de MS d'acide ferulique dans l'extrait brut à 12,51 µg / g MS d'acide syringique dans la fraction d'acétate d'éthyle. Cependant, l'acide tannique, l'acide vanillique et l'acide p-coumarique n'ont pas été trouvés dans tous les extraits de feuilles. Dans les extraits de bourgeons, la quantité la plus élevée de composés phénoliques identifiés était l'acide ferulique (1376,62 µg / g MS extrait brut) et la plus faible était la catéchine (0,69 µg / g de MS dans l'extrait de 1-butanol).

Dans les extraits des racines, l'acide gallique (600,02 µg / g de MS dans l'extrait brut) et l'acide ascorbique (0,90 µg / g de MS dans l'extrait d'acétate d'éthyle) ont été observés comme la plus forte et la plus faible quantité, respectivement, tandis que l'acide tannique, la rutine, la vanillique et l'acide p-coumarique ne l'étaient pas.

70 Troisième partie : Résultats et Discussion

Table 11 : Analyse qualitative et quantitative de la teneur phénolique (µg/g MS) de quelques extraits (EB: Extrait brut; FAE: Flavonoïdes fraction acétate d’éthyle; FB: Flavonoïdes fraction n.butanol). MS: matière séche. (1) acide tannique; (2) rutine; (3) acide gallique; (4) acide ascorbique; (5) acide vanillique; (6) acide ρ-coumarique; (7) catechine; (8) acide syringique; (9) acide ferulique; (10) Quercetine; (11) naringenine. N.I: non identifié; T.R : temps de rétention.

Standards 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 T.R (min) 1.58 1.85 3.50 4.60 15.20 15.48 18.48 21.50 24.80 31.68 34.00

EB N.I 21.95 709.37 135.02 N.I N.I 258.14 25.36 1050.32 80.51 325.12

Feuilles FAE N.I N.I N.I N.I N.I N.I 198.31 12.51 185.67 69.54 106.64

FB N.I N.I N.I N.I N.I N.I 851.42 42.24 151.37 32.59 21.90

EB N.I N.I N.I 600.10 100.62 680.21 5.32 20.14. 1376.62 10.42 N.I

Bourgeons FAE N.I N.I 1166.82 N.I 59.45 N.I 1.02 11.64 26.97 87.43 17.65

FB N.I 7.87 27.27 133.54 42.32 N.I 0.69 N.I 54.24 17.75 N.I

EB N.I N.I 600.02 2.02 N.I N.I 275.64 64.80 9.07 89.73 6.25

Racines FAE N.I N.I 6.56 0.90 N.I N.I 8.32 25.49 1.68 4.36 N.I

FB N.I N.I 592.346 1.41 N.I N.I N.I 83.59 10.6 42.13 5.39

71 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-2- Séparation et purification des composés actifs

En fonction des résultats de l’activité antioxydante et des rendements obtenus dans les procédures d’extraction, l’extrait brut méthanolique des bourgeons a été choisi pour le fractionnement et l’identification de ces composés.

II-2-1-Première étape : Chromatographie sur couche mince (CCM):

Une première étape de pré-séparation a été effectuée sur la totalité de l’extrait brut des bourgeons par la méthode de chromatographie sur couche mince. Cette étape a abouti au choix d’un seul système : Dichlorométhane/méthanol (50:50), qui été utilisé par la suite pour la chromatographie sur colonne.

II-2-2-Deuxième étape : Chromatographie en phase liquide sur colonne ouverte :

Cette deuxième étape a été réalisée comme continuité à la première étape de CCM sur le même extrait (5g). L’élution a été réalisée par le dichlorométhane et ensuite par une succession de mélanges de solvants dichlorométhane-méthanol avec un pourcentage croissant de méthanol (de 100 % dichlorométahne à 100 % methanol), des fractions de 5mL ont été recueillies, puis évaporées à sec après avoir été analysées par CCM et regroupées (Figure 34). Ce fractionnement a abouti à l’obtention de seize fractions nommées de F1 à F16 et dont les masses sont indiquées dans le Tableau 12 .

Figure 35 : Exemple de plaque CCM après chromatographie sur colonne

72 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-2-3-Troisième étape : tester les fractions actives par DPPH :

Afin de trouver les fractions qui sont responsables de l’activité antioxydante, un test DPPH a été réalisé sur chaque fraction obtenue (Tableau 12).

Table 12 : Masses et pourcentages d’inhibition des fractions de la chromatographie sur colonne ouverte

Fractions Masse (mg) % inhibition

F1 23.83 87.01

F2 10.00 29.39

F3 10.70 11.56

F4 6.45 5.77

F5 22.45 35.74

F6 25.90 38.35

F7 9.44 21.27

F8 16.00 50.14

F9 16.35 47.42

F10 17.15 92.81

F11 4.80 94.25

F12 3.85 92.80

F13 15.40 92.34

F14 51.65 95.73

F15 24.50 96.07

F16 411.04 96.61

Selon les résultats des 16 fractions testées, la fraction n°16, nommée F16, a été choisie pour la suite du travail à cause de son pouvoir réducteur du radical DPPH élevé (96.61%) et à cause de sa masse aussi élevée (411.04 mg).

73 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-2-4-Quatrième étape : CLHP semi-préparative :

Cette étape nous a permis de continuer le fractionnement, mais cette fois on s’est concentré juste sur la fraction F16. Une grande colonne (250mm x 7mm, Apollo, Grace) avec pré-colonne de 5µm C18 (33mm x 7mm, Apollo, PrepGuard, Alltech) et un gradient de deux solvants (H 2O, Methanol) nous ont permis de récupérer séparément 4 sous fractions et une sous fraction des intermédiaires qu’on a regroupé par la suite. (Tableau 13).

Table 13 : Masses des sous-fractions issues de l’CLHP-préparative

Sous-Fractions Masse (mg)

F16-1 10.33

F16-2 15.30

F16-3 10.70

F16-4 6.45

Fractions intermédiaires (F16-5) 25.00

II-2-5-Cinquième étape : Colonne ouverte et CCM :

La sous fraction F16-5 (fractions intermédiaires) a subi un autre fractionnement sur colonne ouverte 40x1.6 cm remplie de Sephadex LH-20 avec un éluant 100% méthanol, suivie d’une CCM préparative sur plaques de cellulose, qui nous a permis de regrouper et purifier les sous fractions récupérées. La révélation a été faite par une solution de 1% du 2-Aminoethyl diphenylborinate.

A la fin de cette étape, on a pu récupérer 3 autres sous fractions :

Table 14 : Masses des sous-fractions issues de la seconde chromatographie sur colonne ouverte

Sous-Fractions Masse (mg)

F16-5-1 2

F16-5-2 1.50

F16-5-3 0.1

74 Troisième partie : Résultats et Discussion

Fractionnement F1 sur colonne F2 Gel de silice F3

F4

F5

F6

F7

F8 Extrait brut des bourgeons F9 F10 Fractionnement RMN -2D F11 par CLHP préparative F12

F13 Fractionnement F16-1 F14 sur Colonne F16-2 Sephadex F15 F16-3 F16 F16-4 F16-5-1 Le reste F16-5-2 F16-5 Figure 36 : Etapes de fractionnement, de purification et d’identification des F16-5-3 composés actifs contenus dans l’extrait brut des bourgeons 75 Troisième partie : Résultats et Discussion

II-2-6-Sixième étape : résonnance magnétique nucléaire :

Interprétation des spectres RMN-2D et identification des composés purifiés :

Molécules F16-1 :

La substance donne une fluorescence violette sous la lampe à UV-Visible. Le contrôle de pureté a été fait sur couche mince.

Le spectre UV-Vis de la molécule F16-1 montre une absorption dans la bande II à 289nm et une absorbance dans la bande I à 325 nm. Le spectre UV de la substance isolée fait référence à la coumarine, ce qui est confirmé par la RMN-2D de spectres.

Figure 37 : Spectre UV de la fraction F16-1 Dans la région aromatique du spectre 1H-RMN-2D du composé on observe deux doublets à 7.88ppm (J = 9 Hz) et 6.24ppm (J = 9,5 Hz) correspondant à H-3 protons d'oléfine et H-2. H-8. A 7.53ppm (J = 8,5 Hz) on a observé un doublet correspondant au proton H-5. Le signal du proton H-8 apparaît comme un double pic à 6.89cm avec couplage 2Hz constant dit meta-couplage avec protons H-6. Enfin, à des valeurs de champ plus élevées on a observé un pic de quatre fois au 4.13ppm (J = 14Hz, 7,5 Hz) et triple à 1.42ppm (J = 14Hz, 7 Hz) attribuable aux protons H-10 et H-11 groupe éthylène respectivement.

Les spectres de RMN-2D ont été pris à 500MHz (AGILENT DD2) CD3OD solvant.

76 Troisième partie : Résultats et Discussion

Tableau 15 : Résultats RMN-2D-1H et RMN-2D-13 C de la molécule F16-1

Déplacement Multiplicité chimique Ar.H Attribution J(Hz) δΗ (ppm) 7.88 1 d(J=9Hz) H-3

7.53 1 d(J=8.5Hz) H-5

6.92 1 d(J=8.5Hz, 2.0Hz) H-6

6.89 1 d(J=2.0Hz) H-8

6.24 1 d(J=9.5Hz) H-2

4.13 2 q(J=14Hz, 7Hz) H-10

1.42 3 t(J=14Hz, 7Hz) H-11

Figure 38 : Spectre 1 Η-NMR de la molécule F16-1 (CD 3OD, 500MHz)

77 Troisième partie : Résultats et Discussion

1 1 Figure 39 : Spectre Η- Η COSY de la molécule F16-1 (CD 3OD, 500MHz)

L'étude des spectres UV-visible, 1H-RMN-2D et COSY cette étude, ainsi que par comparaison avec les données de la littérature (Fisher et al., 2002), a confirmé que la substance F16-1 est la 7-éthoxycoumarine.

11 10 8 1 H3CH2CO 7 O O 2 6 5 3

Figure 40 : Structure de la 7-ethoxycoumarine

78 Troisième partie : Résultats et Discussion

Molécules F16-3 :

La substance donne une fluorescence jaune sous la lampe à UV-Visible. Le contrôle de pureté a été fait sur couche mince.

Le spectre de la substance Uv-Vis F16-3 affiche une absorption dans la bande II en 285.5nm et une absorption dans la bande I à 331nm. Le Uv de la substance isolée fait référence à la molécule de hespérétine, ce qui est confirmé par la RMN-2D de spectres.

Figure 41 : Spectre UV de la molécule F16-3

Dans la région aromatique du spectre 1H-RMN-2D à 6.95ppm (J = 7,5 Hz), un doublet correspondant au proton H-5. H-8 à 6.93ppm affiche un pic unique correspondant au proton H-2, tandis qu'à 6.91ppm (J = 8,5 Hz, 1,2 Hz) on remarque un pic double doublet correspondant aux signaux des protons H des protons 6.Ta et H-6 apparaissant comme deux doublets à 5.89ppm et 5.87ppm, respectivement. Le signal du proton H-2 apparaît comme un doublet de doublet à 5.32ppm (J = 13Hz, 3Hz), le couplage avec le proton H- 3a et H-3b. Le pic simple, trois protons observée à 3.86ppm en raison du groupe méthoxy (OCH3) en position quatre. Enfin, les signaux des protons H-3b-3a et H apparaissent comme deux doubles doublets fonctionnels à 3.06ppm (J = 17.0Hz, J = 12,5 Hz) et 2.71ppm (J = 17.0Hz, J = 3 Hz), respectivement.

A partir du spectre HSQC du composé divisé par les atomes de carbone auxquels ils correspondent aux protons de la substance F16-3, à savoir: H-5΄(C5 ΄: δC 111.15ppm), H-

79 Troisième partie : Résultats et Discussion

2΄(C2 ΄: δC 113.11ppm), H-6΄(C6 ΄: δC 117.41ppm), H-8(C8: δC 94.84ppm), H-6(C6: δC 95.75ppm), OCH3(C4 ΄: δC 79.96ppm), H-2(C2: δC 54.92ppm), H-3a,3b(C3: δc 43.16ppm).

En comparant les spectres de 1H-RMN-2D, COSY et HSQC de cette étude à la littérature (Maltese et al., 2009) , a confirmé que la substance F16-3 appartient à la classe des flavanones et spécifiquement l’hespérétine.

Les spectres de RMN-2D ont été obtenus à 500MHz (AGILENT DD2) solvant CD3OD.

Tableau 16 : Résultats RMN-2D-1H et RMN-2D-13 C de la molécule F16-3

Déplacement chimique Déplacement chimique Multiplicité n°H Attribution δΗ ( ppm) δC(ppm) J(Hz)

6.94 111.15 1 d(J=7.5Hz) H-5΄

6.94 113.11 1 bs Η-2΄

6.91 117.41 1 dd(J=8.5Hz, 1.2Hz) Η-6΄

5.89 94.84 1 d(J=1.5Hz) Η-8

5.87 95.75 1 d(J=1.5Hz) Η-6

5.32 79.25 1 dd(J=13Hz, 3Hz) Η-2

3.86 54.92 3 s -ΟCH3

dd(J=17Hz, 3.06 43.16 1 H-3b J=12.5Hz) dd(J=17.0Hz, 2.71 43.16 1 H-3a J=3Hz)

80 Troisième partie : Résultats et Discussion

1 Figure 42 : spectre H-NMR de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)

1 1 Figure 43 : Spectre Η- Η COSY de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)

81 Troisième partie : Résultats et Discussion

Figure 44 : Spectre HSQC de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)

En comparant les spectres de 1H-RMN-2D, COSY et HSQC de cette étude à la littérature (Maltese et al., 2009) , a confirmé que la substance F16-3 appartient à la classe des flavanones et spécifiquement l’hespérétine (la 3',5,7-Trihydroxy-4'-methoxyflavanone).

5' 6' OCH3 8 2 HO O OH 2' 6 3 OH O

Figure 45 : Structure de la 3',5,7-Trihydroxy-4'-methoxyflavanone

82 Troisième partie : Résultats et Discussion

Molécules F16-4 :

La substance donne une fluorescence bleue sous la lampe à UV-Visible. Le contrôle de pureté a été fait sur couche mince.

Le spectre UV de la molécule F16-4 montre deux points d’absorption dans la bande II à 257.5nm et 294.5nm, et une absorption dans la bande I à 345.5nm. Le spectre UV de cette molécule isolée fait référence à la coumarine, ce qui est confirmé par la RMN-2D.

Figure 46 : Spectre UV de la molécule F16-4

À partir du spectre 1H-RMN-2D du composé F16-4 On observe un doublet à 7.86ppm (J = 9,5 Hz) correspondant au proton H-3, qui, comme le montre l'étude du spectre 1H-1H COSY clivée avec le proton H-2, apparaît comme un doublet à 6.20ppm (J = 9,5 Hz). A 7.11ppm et 6.77ppm on observe deux singulets correspondant aux protons H-5 et H-8, respectivement. Enfin, le groupe méthoxy de la C6 à 3.90ppm apparaît comme un singulet de trois protons. A partir du spectre HSQC du composé divisé par les atomes de carbone auxquels ils correspondent aux protons de la substance F16-4 à savoir : H-3(

C3 : δC 144.67ppm), H-5 (C5: δc 108.39ppm), H-8(C8: δC 102.47ppm), H-2(C2:

δC 111.04ppm), H-10(C10: δC 55.26ppm). À partir du spectre de corrélation composé de protons distingués et carbones adjacents, H-3(C1: δC 162.62ppm, C9: δC

149.96ppm, C5: δC 100.41ppm), H-5(C7: δC 151.57ppm, C9: δC 149.97ppm, C6:

δC 144.72ppm), H-8(C7: δC 151.55ppm, C9: δC 149.97ppm, C6: δC 145.64ppm, C4:

δC 111.04ppm), H-2(C1: δC 162.64ppm, C4: δC 111.02ppm), H-10(C6: δC

83 Troisième partie : Résultats et Discussion

145.66ppm). Les spectres RMN-2D ont été pris à 500MHz (AGILENT DD2) solvant CD3OD.

Tableau 17 : Résultats RMN-2D-1H et RMN-2D-13 C de la molécule F16-4

Déplacement Déplacement Multiplicité chimique chimique Αr.H HMBC Attribution J(Hz) δΗ ( ppm) δC (ppm) (HSQC) 7.86 144.67 1 d(J=9.5Hz) C1,C9,C5 H-3

7.11 108.39 1 s C7,C9,C6 H-5

6.77 102.47 1 s C7,C9,C6,C4 H-8

6.20 111.04 1 d(J=9.5Hz) C1,C4 H-2

3.90 55.26 3 s C6 H-10

1 Figure 47 : spectre H-NMR de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)

84 Troisième partie : Résultats et Discussion

Figure 48 : Spectre COSY de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)

Figure 49 : Spectre HSQC de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)

85 Troisième partie : Résultats et Discussion

Figure 50 : Spectre HMBC de la molécule F16-4 (CD 3OD, 500MHz)

8 HO 7 9 O 1 O

6 2 4 10 H3CO 5 3

Figure 51 : Couplages H-C résultant de la HMBC

Après l’interprétation des spectres 1H-RMN-2D, COSY et HSQC et après la comparaison des résultats avec la littérature (Darmawan et al., 2012) on a confirmé que la F16-4 appartient à la classe des coumarines et représente la 7-hydroxy-5-methoxycoumarine (scopolétine)

86 Troisième partie : Résultats et Discussion

8 HO O O 7 2 H3CO 6 5 3

Figure 52 : Structure de la 7-hydroxy-5-methoxycoumarine

Molécules F16-5-2 :

La substance donne une fluorescence brune jaunâtre sous la lampe à UV-Visible. Le contrôle de pureté a été fait sur couche mince.

Le spectre Uv-Vis de la molécule F16-5-2 présente une absorbance dans la Bande II à 258.5nm et bande I à 360nm. Le spectre UV de la substance isolée se réfère à un flavonoïde, ce qui est confirmé par la RMN-2D.

Figure 53 : spectre UV de la molécule F16-5-2

RMN-2D : Partie aglycone :

À partir du spectre, on observe un doublet à 7.53ppm correspondant au proton H-2, J = 2,0 Hz constante de couplage 1H-de RMN-2D à cause de la période post-couplage avec le proton H-6. A 7.50ppm (J = 8,5 Hz, J = 2,0 Hz) un double pic de doublet correspondant au proton H-6 est observé, clivé par les protons H-2 et H-5. A 6.81ppm (J = 8,5 Hz), on

87 Troisième partie : Résultats et Discussion

observe un doublet correspondant au proton H-5, clivé avec le proton H-6. A 6.35ppm deux doublets (J = 2,0 Hz) et 6.16ppm (J = 2,0 Hz) correspondant aux protons H-8 et H- 6, respectivement. A partir du spectre HSQC de la partie aglycone du composé divisée par les atomes de carbone auxquels ils correspondent aux protons de l'aglycone de la molécule F19-5-2 : H-2΄(C2΄: δC 116.21ppm), H-6΄(C6΄: δC 122.29ppm), H-5΄(C5΄:

δC 114.71ppm), H-8(C8: δC 93.51ppm), H-6(C6: δC 98.66ppm).

Partie glucidique :

A partir de la molécule de glucose, on distingue le proton anomère de H-1 à 5.11ppm (J = 7,5 Hz). Le spectre 1H-1H COSY révèle la position du proton H-2 en raison du couplage du proton de la position H-1. Dans la région de 3.25-3.47ppm les protons sont divisés H- 2, H-3, H-4, H-5 comme un multiplet. Enfin, le proton H-6b apparaît comme un doublet large à 3.80ppm (J = 10,5 Hz) et le proton H-6a est représenté par un multiplet à 3.38ppm.

En continuant avec la molécule de rhamnose, distinguer le proton anomère du H-1’’’ à 4.51ppm comme un singulet large. Le proton H-2’’’ est représentée par un multiplet à 3.62ppm, en raison de la séparation de H-3’’’ et H-1’’’. Le proton H-3’’’ apparaît comme un doublet de doublet à 3.53ppm (J = 10,0 Hz, J = 3,5 Hz), due au clivage des protons H- 2’’’ et H-4’’’. Dans 3.44d et 3.28d apparaissent comme des pics multiples protons H-5’’’ et H-4’’’ respectivement. Enfin, le groupe méthyle de la position (CH3) Stis 6 apparaît comme un doublet à 1.11ppm (J = 6,5 Hz), dû au clivage du proton H-5’’’.

La corrélation des protons voisins dans la molécule de glucose et du rhamnose sont présentés dans 1H-1HCOSY des sucres composés. Enfin, a partir du spectre HSQC de la région glucidique du composé, on observe que les protons H-6a, b correspondent à l'atome de carbone C-6 de la molécule de glucose, ce qui provoque un déplacement chimique δC67.02ppm. Cette valeur est augmentée par rapport à l'atome de carbone correspondant à molécule de glucose, qui présente un groupe hydroxyle libre en position

6 (δC 60-62ppm) (Ersoz T. et al., 2001, Yassa N. et al., 2007) . Cela nous amène à croire que la liaison glycosidique se produit entre la position 6 de la molécule de glucose et une position de molécule rhamnose, il est donc un (1 → 6) glucoside.

Les spectres de RMN-2D ont été pris à 500MHz (AGILENT DD2) solvant CD 3OD.

Table 18 : Résultats RMN-2D-1H et RMN-2D-13 C de la molécule F16-5-2

88 Troisième partie : Résultats et Discussion

Déplacement chimique Déplacement chimique Multiplicité N. H Attribution δΗ ( ppm) δC (ppm) (HSQC) J(Hz) Aglycone 7.53 116.21 1 d(J=2.0Hz) H-2΄ dd(J=8.5Hz, 7.50 122.29 1 Η-6΄ J=2.0Hz) 6.81 114.71 1 d(J=8.5Hz) Η-5΄ 6.35 93.51 1 d(J=2.0Hz) Η-8 6.16 98.66 1 d(J=2.0Hz) Η-6 1er sucre (Glucose) 5.11 103.32 1 d(J=7.5Hz) H-1΄΄ 3.80 67.07 1 d(10.5Hz) H-6΄΄ b 3.38 67.07 1 m H-6΄΄ a H-2΄΄ , Η-3΄΄ , Η-4΄΄ , 3.25-3.47 4 m Η-5΄΄ 2éme sucre (rhamnose) 4.51 101.00 1 bs Η-1΄΄΄ 3.62 70.64 1 m H-2΄΄΄ dd(J=10Hz, 3.53 71.11 1 Η-3΄΄΄ J=3.5Hz) 3.44 74.25 1 m Η-5΄΄΄ 3.28 1 m H-4΄΄΄ 1.11 16.28 3 d(J=6.5Hz) CH3-5΄΄΄

89 Troisième partie : Résultats et Discussion

Figure 54 : Spectre 1Η-RMN-2D de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)

Figure 55 : Spectre 1Η-1Η COSY de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)

90 Troisième partie : Résultats et Discussion

Figure 56 : Spectre HSQC de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)

Après l’intérprétation des spectres RMN-2D 1H, 1H-1HSQC et 1HCOSY et par rapport à la littérature (Guvenalp et al., 2006) , on a pu confirmer que la substance F16-5-2 appartient aux flavonoïdes et représente rutine (5,6,7,4'-tetrahydroxyflavonol-3-O- rutinoside).

OH 2' OH 8 5' HO O 6' H-2'' H-3'' 6 HO O OH H-1'' O H-4'' OH O H-5'' OH H-6'' H-1''' O H-5''' O H3C H-2''' HO HO H-3'''OH H-4'''

Figure 57 : Structure de la 5,6,7,4'-tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside

91 Troisième partie : Résultats et Discussion

III- Discussion :

Les résultats obtenus dans notre étude concernant l’identification des composés phénoliques par CLHP dans les feuilles de Pistacia atlantica sont en accord étroit avec ceux de Hatamnia et al. (2014) et Hatamnia et al. (2015) Puisque la majorité des composés identifiés dans ces deux études ont également été identifiés dans la nôtre. En outre, certains autres composés ne l’ont pas été comme la naringénine, la catéchine et la quercétine. La présence de la quercetine et de l’acide gallique dans l’extrait brut a été signalée dans le travail réalisé par Rezaie et al. (2016). Les résultats des bourgeons avec 1376.62 µg d’acide férulique par gramme de matière sèche et les racines avec 600.02 µg d’acide gallique par gramme de matière sèche, n’ont pas pu être discutés car aucune étude antérieure n’a été trouvée sur ces parties de la plante.

Le fractionnement par méthodes chromatographiques et l’identification par RMN-2D nous ont permis à mettre en évidence, pour la première fois, dans l’espèce Pistacia atlantica Desf. Subsp. Atlantica , quatre molécules de nature phénolique, dont deux coumarines : l’Ombellifèrone (7-ethoxycoumarine) et la Scopolétine (7-hydroxy-5- methoxycoumarine), et deux flavonoïdes, un flavonone glycosylé : l’Héspérétine (3',5,7- Trihydroxy-4'-methoxyflavanone) et un flavonol glycosylé : 5,6,7,4'- tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside. Ces molécules sont toutes dotées d’activités antioxydantes selon plusieurs travaux antérieurs (Mittal et Gupta, 2000 ; Shaw et al., 2003 ; Ramesh et Pugalendi, 2005 ; Malik et al., 2011; Mogana et al., 2013 ; Parhiz et al., 2015 ; Suzuki et al., 2015 ; Roowi et al., 2016 ; Jayaraman et al., 2017).

Ces résultats sont en concordance avec ceux rapportés dans les deux premiers chapitres, ce qui prouve la richesse de cette plante, surtout les bourgeons, en composés phénoliques qui sont responsables de la forte activité antioxydante.

La relation entre la structure chimique et l’activité antioxydante des polyphénols a été prouvée dans plusieurs travaux comme celui de Wolfe et Liu, (2008) ou ils ont rapporté que la présence d’un groupement hydroxyle en position 5 peut contribuer à l’activité antioxydante dans le cas des Flavones, flavonols. Les hydroxyles sont des donneurs d’hydrogène et d’électrons, conduisant à des espèces beaucoup plus stables. Les flavonoïdes portant un 3-OH sur l’hétérocycle C (Figure 09) augmente leurs activité antioxydante, mais les flavonoïdes avec un 5-OH et/ou 7-OH montrent une cytotoxicité

92 Troisième partie : Résultats et Discussion

élevée, aussi la présence d’un groupement methoxy en position 3 et/ou 5 a un été positif sur l’activité antioxydante (Choi et al., 2007) .

Toutes ces hypothèses confirment la règle, que l’espèce Pistacia atlantica Desf. Subsp. Atlantica est une mine de molécules antioxydante, et nous encouragent de finir le fractionnement des 15 fractions restantes.

93









  
 
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108










Annexes

Annexe 01 : Tests phytochimiques – Epuisement du matériel végétal avec de l’éthanol

109 Annexes

Annexe 02 : Tests phytochimiques – Epuisement du matériel végétal avec de l’éther diéthylique

110 Annexes

Annexe 03 : Tests phytochimiques – Epuisement du matériel végétal avec de l’eau et à chaud

111 Annexes

Annexe 04 : Détails du spectre 1 Η-RMN de la molécule F16-1 (CD 3OD, 500MHz)

Annexe 05 : Détails du spectre 1 Η-RMN de la molécule F16-1 (CD 3OD, 500MHz)

112 Annexes

Annexe 06 : Détails du spectre 1 Η-NMR de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)

Annexe 07 : Détails du spectre 1 Η-NMR de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)

113 Annexes

Annexe 08 : Détails du spectre HSQC de la molécule F16-3 (CD 3OD, 500MHz)

1 Annexe 09 : Détails du spectre H- RMN de la molécule F16-5-2 (CD 3OD, 500MHz)

114 Annexes

1 Annexe 10 : Détails du spectre H- RMN de la molécule F16-5-2 (CD 3OD, 500MHz)

1 1 Annexe 11 : Détails du spectre Η- Η COSY de la molécule F16-5-2 (CD 3OD, 500MHz)

115 Annexes

Annexe 12 : Détails du spectre HSQC de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)

Annexe 13 : Détails du spectre HSQC de la molécule F16-5-2 (CD3OD, 500MHz)

116









 

 

  
Valorisation des travaux de recherche

Communications nationales

1er Congrès international de la société Algérienne e Nutrition Tlemcen/Mai 2013 In vitro antioxidant effects of flavonoid-rich extracts from Pistacia atlantica Auteurs : TOUL FETHI , GHAMBAZA NACERA, ZITOUNI AMEL, BENHAMMOU NABILA, ATIK-BEKKARA FAWZIA

Communications internationales

1er Congrès international de la société Algérienne e Nutrition Oran-Algérie/Décembre 2012 Profil phénolique et Activité antioxydante des extraits bruts de quelques plantes médicinales Auteurs : TOUL FETHI , GHAMBAZA NACERA, ZITOUNI AMEL, BENHAMMOU NABILA, ATIK-BEKKARA FAWZIA

Journées Internationales de Biotechnologie Mehdia-Tunisie/Décembre 2012 Profil phénolique et Activité antioxydante des flavonoïdes extraits de Pistacia atlantica Auteurs : TOUL FETHI , GHAMBAZA NACERA, ZITOUNI AMEL, BENHAMMOU NABILA, ATIK-BEKKARA FAWZIA

5ème Symposium International sur les plantes aromatiques et médicinales Marrakech-Maroc/Novembre 2013 A comparative study of antioxidant activity of methanolic extracts from different parts of Pistacia atlantica Auteurs : TOUL FETHI , GHAMBAZA NACERA, ZITOUNI AMEL, BENHAMMOU NABILA, ATIK-BEKKARA FAWZIA

3ème Congrès International sur les Molécules bioactives, Aliments fonctionnels et Maladies associées au stress oxydant Hammamet-Tunisie/Mars 2014 Antioxidant activity of anthocyanins from Pistacia atlantica Auteurs : TOUL FETHI , BENHAMMOU NABILA, ATIK-BEKKARA FAWZIA

25 ème Forum des Sciences Biologiques et de Biotechnologie Hammamet-Tunisie/Mars 2014 Profil phénolique et Activité antioxydante des tanins extraits de Pistacia atlantica Auteurs : TOUL FETHI , BENHAMMOU NABILA, ATIK-BEKKARA FAWZIA

117 Toul et al., IJPSR, 2016; Vol. 7(1): 121-26. E-ISSN: 0975-8232; P-ISSN: 2320-5148

IJPSR (2016), Vol. 7, Issue 1 (Research Article)

Received on 22 June, 2015; received in revised form, 20 September, 2015; accepted, 19 October, 2015; published 01 January, 2016 IN-VITRO ANTIOXIDANT EFFECTS OF TANNIN EXTRACTS OF PISTACIA ATLANTICA

Fethi Toul *, Nabila Belyagoubi-Benhammou, Amel Zitouni, Nacéra Ghembaza and Fawzia Atik-Bekkara

Laboratoire des Produits Naturels (LAPRONA), Département de Biologie, Faculté des Science de la Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l’Univers, Université Abou BakrB elkaid, BP 119, Imama, Tlemcen, Algérie.

Keywords: ABSTRACT: Seven parts of Pistacia atlantica were collected from Pistacia atlantica , Tlemcen in Algeria (fruits, leaves, buds, stems, roots internal and Tannins, Antioxidant capacity, external trunk barks). Tannin content was determined and antioxidant DPPH, FRAP, β -carotene. activity of tannic extracts were measured using different assays: Total Correspondence to Author: antioxidant capacity, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), reducing Fethi Toul power (FRAP) and β -carotene bleaching assay The results showed that Laboratoire des Produits Naturels the highest tannin contents were observed in roots(49.789±0.391 mg (LAPRONA), Département de CE/g DM) and internal trunk barks (49.095±0.306 mg CE/g DM). Biologie, Faculté des Science de la Nature et de la Vie, des Sciences de Tannins extracted from leaves, roots and external trunk barks showed la Terre et de l’ Univers, Université very good DPPH radical scavenging activity (IC50 of 0.124±0.001, Abou BakrBelkaid, BP 119, Imama, 0.304±0.001 and 0.440±0.001 mg/mL), ferric reducing power Tlemcen, Algérie . (0.021±0.001, 0.154±0.001 and 0.170±0 .005 mg/mL) and β -carotene bleaching inhibition (0.313±0.009, 0.094±0.006 and 0.131±0.002 E-mail : [email protected] mg/mL), respectively. Therefore, the results suggest that this plant with all its studied parts might be considered as a potential candidate of possible health-promoting functional foods.

INTRODUCTION: Pistacia atlantica Desf., is a Moreover, P. atlantica has long been used in folk tree located in north Africa, which can reach over for different medicinal purposes such as mouth 15 m in height and grows in arid and semi-arid flavouring, tanning, and as fodder in Greece 3, for areas, vernacularly called “Butom”, valued in mouth disease and wound healing in Turkey 4, Algeria because it is the source of mastic gum, stomach ache and as an antidiabetic in Jordan 5, as exudates which strengthens gums, deodorizes mouth freshener, antiseptic, gum tissue breath, fights coughs, chills and stomach diseases 1, strengthener and antidiarrheal in Iran 3, as gum also used for stress, as tonic, and antidiarrheal 2. tissue strengthener, for breath deodorizer, cough, chill, and stomach disease in south Africa 6.

QUICK RESPONSE CODE Tannins, the non-nutritive substances from plant DOI: 10.13040/IJPSR.0975-8232.7(1).121-26 sources exhibit potent biological activities that lower the risk of chronic diseases without any side effects. Tannins are most abundant and multipotent Article can be accessed online on: www.ijpsr.com molecules exhibiting antioxidant, proapoptotic and antiangiogenic activity and thus being effective in DOI link: http://dx.doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.7(1).121-26 the treatment of degenerative diseases including initiation and progression of tumors 7.

International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 121 NATURAL PRODUCT RESEARCH, 2016 http://dx.doi.org/10.1080/14786419.2016.1217205

SHORT COMMUNICATION Antioxidant activity and phenolic prole of di€erent organs of Pistacia atlantica Desf. subsp. atlantica from Algeria

Fethi Toul, Nabila Belyagoubi-Benhammou, Amel Zitouni and Fawzia Atik-Bekkara

Laboratory of Natural Products (LAPRONA), Faculty of Natural Sciences, Life, Earth and Universe Sciences, Department of Biology, Tlemcen University, Imama, Algeria

ABSTRACT ARTICLE HISTORY The present study evaluated the antioxidant activity of 21 extracts Received 22 February 2016 prepared from seven parts of Pistacia atlantica Desf. subsp . atlantica . Accepted 29 June 2016 (Fruits, leaves, buds, stems, roots, internal and external trunk barks) KEYWORDS collected from Tlemcen, Algeria. Total phenolic, !avonoid and Pistacia atlantica Desf. !avonol contents were determined and the antioxidant properties subsp . atlantica ; antioxidant were measured using di"erent assays: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl activity; phenolic radical (DPPH), ferric antioxidant reducing power and β-carotene composition; flavonoids; bleaching assay. BHA (butylated hydroxyanisole) was used for flavonols; HPLC comparison purposes. The results showed that the extracts of leaves and buds had the highest phenolic contents with 255.789 ± 4.733 and 233.946 ± 6.205 mg GAE/g DM, respectively. For the antioxidant

activity, values of EC 50 concentrations ranged from 0.059 to 5.712 mg/ mL for DPPH, 0.015 to 3.141 mg/mL for reducing power and 0.068 to 5.021 mg/mL for β-carotene method, for all studied extracts. Analysing the phenolic composition, 10 components were identi%ed in di"erent parts of the plant.

1. Introduction

The genus Pistacia (Anacardiaceae) is an economically important genus considering its mem- ber ( P. vera ). Furthermore, the other species are valorised for their natural products. It has 11 recognised species) and most of them yield phenolic compounds. However, Pistacia atlantica and Pistacia lentiscus are the major sources of phenolic compounds (Romani et al. 2002 ). P. atlantica Desf. is widely distributed in North Africa, where the trees reach over 15 m in

CONTACT Fethi Toul [email protected] Supplemental data for this article can be accessed here at http://dx.doi.org/10.1080/14786419.2016.1217205 . © 2016 Informa UK Limited, trading as Taylor & Francis Group

رجااوعفإافداتأة،وانةاتع ،،وال،ةا" Pistacia atlantica Desf subsp atlantica "وار تااااوذ ً ّتاداتال. فااإاطادةتاأءااذ،وذأي أى ادةة،واا ات:ارةادةة،ارا DPPH ، رةاوارةارون،إإاىادات اللت. ن ل اأناامااداتال،اات،اتوات،أ ن أرةدةة،ارا DPPH وا رون دةاا (IC50) 0.016 / و 0.006 /،. اااماادةةوﻩداتاللاتا:وا اا، وااد واواازوالإ اا ناوي ا د « -NMR 2D » أ ااتا. ّ لاااأرتو:إنر،نون. اتا: اتا،داتات،اادةة،اوااز، اناويا د.

Résumé Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un programme de longue haleine visant à découvrir des antioxydants naturels. Plusieurs plantes font l’objet de nombreuses recherches dans notre laboratoire, nous citons l’espèce Pistacia atlantica Desf.subsp atlantica , une plante médicinale de la pharmacopée traditionnelle de l’Algérie, très riche en substances bioactives notamment les polyphénols. Le but de ce travail est d’évaluer l’activité antioxydante des extraits obtenus à partir des différents organes de P.atlantica afin de pouvoir connaitre celui ayant le pouvoir antioxydant le plus élevé, ceci a été fait par plusieurs techniques : la capacité antioxydante totale, DPPH *, Pouvoir de réduction du Fer et le test d’inhibition du blanchiment de β-carotène. En outre,les teneurs en polyphénols ont été mesurées par des techniques spectrophotométriques. L’extrait brut des bourgeons s’est révélé le plus riche en polyphénols totaux, en flavonoïdes, en flavonols et en tanins. L’extrait des anthocyanes de la même partie a montré l’activité antioxydante la plus importante, en comparaison avec l’antioxydant de référence (BHT), dans les deux tests de piégeage du radical libre DPPH *et d’inhibition du blanchiment de β-carotène, 16 µg/mL et 6µg/mL, respectivement. L’extrait brut des bourgeons, à cause de sa forte teneur en polyphénols et son importante activité antioxydante, a fait l’objet de plusieurs fractionnements successifs, par chromatographie sur couche mince, chromatographie sur colonne ouverte chromatographie CLHP-préparative. Ces fractionnements nous ont permis de passer à l’identification des fractions obtenues par RMN-2D. Ce travail nous a permis de mettre en évidence quatre molécules : la 7-ethoxycoumarine, 3',5,7-Trihydroxy-4'- methoxyflavanone, la 7-hydroxy-5-methoxycoumarine et la 5,6,7,4'-tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside. Mots clés : Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica , composés phénoliques, activité antioxydante, CLHP, RMN-2D.

Abstract This work is a part of a long-term program, which aims to discover natural antioxidants. Several plants are the subject of several researches in our laboratory; we quote the species Pistacia atlantica Desf.subsp atlantica , a medicinal plant of the traditional pharmacopoeia of Algeria, very rich in bioactive substances including polyphenols. The aim of this work is to evaluate the antioxidant activity of the extracts obtained from the different organs of P.atlantica in order to know the one having the highest antioxidant power, this has been done by several techniques : total antioxidant capacity , DPPH * radical scavenging assay, Ferric Reducing Ability assay and β-carotene bleaching assay. In addition, polyphenol contents were measured by spectrophotometric techniques. The crude extract of buds was the richest extract in total polyphenols, flavonoids, flavonols and tanins. The anthocyaninsextractof the same part showed the most important antioxidant activity, compared to reference (BHT), in DPPH* radical scavenging and β-carotene bleaching assays, 16 µg / mL and 6 µg / mL, respectively. Buds crude extract, because of its high content of polyphenols and its high antioxidant activity, has been subjected to several successive fractionations, by thin layer chromatography, open column chromatography, and preparative- HPLC. These fractionations allowed us to go on to identify the fractions obtained by NMR-2D. This work allowed us to identify four molecules: 7-ethoxycoumarin, 3 ', 5,7-Trihydroxy-4'-methoxyflavanone, 7- hydroxy-5-methoxycoumarin and 5,6,7,4'- Tetrahydroxyflavonol-3-O-rutinoside. Keywords : Pistacia atlantica Desf. subsp atlantica , phenolic compounds, antioxidant activity, HPLC, NMR-2D.