Cultivo in Vitro De Orquídeas Nativas Do Brasil: Aspectos Fisiológicos, Anatômicos E Genéticos
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS - PPGRGV IZABELA LEONARDO RUAS CULTIVO IN VITRO DE ORQUÍDEAS NATIVAS DO BRASIL: ASPECTOS FISIOLÓGICOS, ANATÔMICOS E GENÉTICOS Feira de Santana - BA 2019 IZABELA LEONARDO RUAS CULTIVO IN VITRO DE ORQUÍDEAS NATIVAS DO BRASIL: ASPECTOS FISIOLÓGICOS, ANATÔMICOS E GENÉTICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Recursos Genéticos Vegetais. Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Selbach Schnadelbach Co-orientadora: Profa. Dra. Moema Cortizo Bellintani Feira de Santana - BA 2019 BANCA EXAMINADORA ______________________________________________________ Profa. Dra. Alone Lima Brito Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS ______________________________________________________ Profa. Dra. Sheila Vitória Resende Universidade Federal da Bahia - UFBA ______________________________________________________ Profa. Dra. Alessandra Selbach Schnadelbach Orientadora e Presidente da Banca Universidade Federal da Bahia - UFBA Feira de Santana – BA 2019 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente aos meus pais por estarem sempre ao meu lado, por me apoiarem em todas as decisões, por se dedicarem tanto a realização dos meus sonhos, por serem meu porto seguro. Sem eles essa jornada não seria possível. A eles tudo dedico. Agradeço a toda a minha família, pela base segura, por toda a força e incentivo. Agradeço a Profa. Dra. Alessandra Selbach Schnadelbach pela orientação, amizade, e disponibilidade. Obrigada pelos novos laços formados e por toda a paciência e atenção que dedica aos seus alunos, e a aqueles que não são. A sua generosidade foi fundamental para a execução deste trabalho. Agradeço a Profa. Dra. Moema Cortizo Bellintani pela orientação desde a graduação, que me recebeu e apresentou toda a gama de possibilidades dentro da cultura de tecidos, auxiliando sempre a independência e autonomia no campo da pesquisa. Agradeço por todo carinho que dedica aos seus alunos, aconselhando, incentivando, servindo como cabeça e base para todos, onde vemos um porto seguro. Agradeço a Maria Nazaré Guimarães Marchi pela orientação e apoio ao longo de toda a minha formação, por todas as correções e análises estatísticas em tempo recorde, por toda a paciência em explicar várias vezes o resultado das análises, pela amizade e carinho, sendo solícita a todo momento. Agradeço a Profa. Dra. Kelly Leite pela orientação e infraestrutura necessária para a análise anatômica e identificação do material analisado no Laboratório de Anatomia e Identificação de Madeiras (LAVIM) da UFBA. Agradeço a todos os colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV), Daniel Pimentel, Eva Pires, Flavia Gonçalves, Isabela Sousa, Kaique Silva, Lucas Barbosa e Marina Sunshine, e Laboratório de Genética e Evolução de Plantas (LAGEV), Beatriz Barreto, Hédina Bezerra e Jéssica Leão, por estarem todos os dias ao meu lado, nutrindo sempre ótimas conversas na hora do almoço e regadas, ou não, a um bom café. Agradeço em especial ao Gustavo Surlo e Izabela Dias por serem dois grandes presentes que a vida me deu, pessoas tão generosas que não consigo chamar de amigos mais, são dois grandes irmãos. Obrigada por estarem sempre disponíveis nas horas boas e principalmente nas horas ruins, por cuidarem de mim, se preocuparem, por me levantarem sempre, seja quando estava no pior dos dias, ou no melhor de todos, por enxergarem sempre o melhor em mim, mesmo quando nem eu conseguia. Obrigada por sempre responderem a todas as minhas perguntas aleatórias, vocês são demais! Agradeço aos amigos irmãos Albert Elliot, Aline Stadnik, Carlos Júnior, Diego Carvalho, Erick Vila Verde, Fabiano Saft, Gabriela Vieira, Maiara Marinho, Rapahel Vaz e Victor Guidez, que não soltaram a minha mão, que me acompanharam para que eu me tornasse quem sou hoje, que nunca desistiram de mim. O amor de vocês sempre foi incondicional, muito obrigada! Agradeço a todos que colocaram um sorriso no meu rosto e que me fazem tão bem, em especial a Camila Chagas, Isabella Comodo, Marcela Venieris, Paula Lima, Rafaela Bandeira, Raoni Ferreira, Vanessa Castro, Victor Gonzalez, Yan Couto, e as minhas cantoras favoritas, Fernanda Reis e Fernanda Duarte, que sempre recarregam as minhas energias. Agradeço a todos os amigos do curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal da Bahia (UFBA), impossível citar todos, mas todos igualmente importantes. Agradeço aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV) especialmente a Táris Maria Macedo por ser uma grande amiga e conselheira em todos os momentos, e principalmente por toda a atenção, disponibilidade e hospitalidade em todas as vezes que me acolheu em sua casa sempre com muito carinho, fazendo com que me sentisse mais do que em casa. Agradeço ao PPGRGV da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) pela formação acadêmica e aprendizado. Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pela concessão de bolsa de estudos. Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho. RESUMO Orchidaceae é uma das maiores famílias de plantas com flores e plantas epífitas, compondo 7% de todas as espécies distribuídas pelo planeta. O gênero Cattleya é um dos mais importantes da família, devido ao elevado valor ornamental, o que tem levado à redução das populações de diversas espécies na natureza devido à coleta intensiva para abastecer o mercado ornamental. Cattleya amethystoglossa, é uma orquídea epífita brasileira, distribuída ao longo das regiões Nordeste e Sudeste, sempre acompanhando a Serra do Mar. Cyrtopodium constitui outro gênero de orquídeas ornamentais, o qual possui distribuição neotropical. Este gênero apresenta maior diversidade de espécies no Brasil, dentre elas Cyrtopodium aliciae, endêmica da Cadeia do Espinhaço. A cultura de tecidos vegetais é uma importante aliada na conservação do germoplasma in vitro das espécies, sendo uma alternativa sustentável para o abastecimento do mercado ornamental, fornecendo plantas viáveis independentemente da estação do ano. No entanto, durante a multiplicação in vitro o ambiente de cultivo, o uso de reguladores vegetais, e as sucessivas repicagens podem gerar variação somaclonal nas culturas, não desejada quando a micropropagação é utilizada em plantas para fins comerciais e de conservação. Desta forma, os objetivos do presente trabalho foram estabelecer um protocolo de micropropagação e analisar a embriogênese somática durante a micropropagação em C. aliciae; estabelecer protocolos para germinação para C. amethystoglossa, analisar o crescimento lento para C. amethystoglossa, e a fidelidade genética das plantas de C. amethystoglossa após o cultivo in vitro por meio de marcadores ISSR. A micropropagação de C. aliciae deve ser realizada em meio líquido, MS com metade das concentrações salinas acrescido de 2 g L-1 de carvão ativado. A análise anatômica revelou que os calos originados nas raízes tratavam-se de calos embriogênicos, os quais diferenciaram-se em corpos semelhantes a protocormos ao longo do tempo. A espécie C. aliciae é responsiva a embriogênese somática indireta, o acondicionamento em sala de crescimento, sob a vedação de algodão, aumenta a sobrevivência, diminui a contaminação e recomenda-se utilizar sacarose no meio de cultura. A germinação de para C. amethystoglossa foi mais significativa em meio de cultura contendo carvão ativado, o meio de cultivo deve ser acrescido de 2 g L-1 de carvão ativado. No crescimento lento de C. amethystoglossa as plantas devem ser mantidas em meio MS acrescido de 2 g L-1 de carvão ativado sem a adição de sacarose. A micropropagação e a estabilidade genética de C. amethystoglossa devem ser realizadas em meio MS/2 suplementado com 0,537 µM de ANA, 8,880 µM de BAP e 2 g L-1 de carvão ativado, para a maior produção de brotos saudáveis e geneticamente estáveis ao longo de três gerações de cultivo. PALAVRAS-CHAVE: cultura de tecidos vegetais; embriogênese somática; ISSR; Orchidaceae; plantas ornamentais; variação somaclonal. ABSTRACT Orchidaceae is one of the biggest families of epiphyte and flowering plants, composing 7% of all world-wide species. The Cattleya genera is one of the most important in this family, due to its high ornamental value, what has been reducing populations of various species on nature due to an intense collection intended to supply the ornamental market. Cattleya amethystoglossa is a brazilian epifhyte orchid, distributed throughout Northeast and Southeast regions, always near the Serra do Mar. Cyrtopodium constitutes another ornamental orchids genera, which posses neotropical distribution. It has the biggest species diversity in Brazil, and among them there’s Cyrtopodium aliciae, endemic from Cadeia do Espinhaço. The plants tissue culture is an important ally on in vitro germoplasm conservation of the species, since it’s a sustainable alternative for supplying the ornamental market, providing viable plants regardless any season of the year. However, during in vitro regeneration in the culture enviroment, the use of plant regulators and constant transplanting may produce somaclonal variation in the cultures, that isn’t desired when a micropropagation process is used aiming selling and conservation. Thus, this present study aims to establish a micropropagation protocol and analyse the somatic embriogenesis during