UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS - PPGRGV
IZABELA LEONARDO RUAS
CULTIVO IN VITRO DE ORQUÍDEAS NATIVAS DO BRASIL: ASPECTOS FISIOLÓGICOS, ANATÔMICOS E GENÉTICOS
Feira de Santana - BA
2019
IZABELA LEONARDO RUAS
CULTIVO IN VITRO DE ORQUÍDEAS NATIVAS DO BRASIL: ASPECTOS FISIOLÓGICOS, ANATÔMICOS E GENÉTICOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Recursos Genéticos Vegetais.
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Selbach Schnadelbach
Co-orientadora: Profa. Dra. Moema Cortizo Bellintani
Feira de Santana - BA
2019
BANCA EXAMINADORA
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Profa. Dra. Alone Lima Brito Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS
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Profa. Dra. Sheila Vitória Resende
Universidade Federal da Bahia - UFBA
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Profa. Dra. Alessandra Selbach Schnadelbach
Orientadora e Presidente da Banca
Universidade Federal da Bahia - UFBA
Feira de Santana – BA 2019
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente aos meus pais por estarem sempre ao meu lado, por me apoiarem em todas as decisões, por se dedicarem tanto a realização dos meus sonhos, por serem meu porto seguro. Sem eles essa jornada não seria possível. A eles tudo dedico.
Agradeço a toda a minha família, pela base segura, por toda a força e incentivo.
Agradeço a Profa. Dra. Alessandra Selbach Schnadelbach pela orientação, amizade, e disponibilidade. Obrigada pelos novos laços formados e por toda a paciência e atenção que dedica aos seus alunos, e a aqueles que não são. A sua generosidade foi fundamental para a execução deste trabalho.
Agradeço a Profa. Dra. Moema Cortizo Bellintani pela orientação desde a graduação, que me recebeu e apresentou toda a gama de possibilidades dentro da cultura de tecidos, auxiliando sempre a independência e autonomia no campo da pesquisa. Agradeço por todo carinho que dedica aos seus alunos, aconselhando, incentivando, servindo como cabeça e base para todos, onde vemos um porto seguro.
Agradeço a Maria Nazaré Guimarães Marchi pela orientação e apoio ao longo de toda a minha formação, por todas as correções e análises estatísticas em tempo recorde, por toda a paciência em explicar várias vezes o resultado das análises, pela amizade e carinho, sendo solícita a todo momento.
Agradeço a Profa. Dra. Kelly Leite pela orientação e infraestrutura necessária para a análise anatômica e identificação do material analisado no Laboratório de Anatomia e Identificação de Madeiras (LAVIM) da UFBA.
Agradeço a todos os colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV), Daniel Pimentel, Eva Pires, Flavia Gonçalves, Isabela Sousa, Kaique Silva, Lucas Barbosa e Marina Sunshine, e Laboratório de Genética e Evolução de Plantas (LAGEV), Beatriz Barreto, Hédina Bezerra e Jéssica Leão, por estarem todos os dias ao meu lado, nutrindo sempre ótimas conversas na hora do almoço e regadas, ou não, a um bom café.
Agradeço em especial ao Gustavo Surlo e Izabela Dias por serem dois grandes presentes que a vida me deu, pessoas tão generosas que não consigo chamar de amigos mais, são dois grandes irmãos. Obrigada por estarem sempre disponíveis nas horas boas e
principalmente nas horas ruins, por cuidarem de mim, se preocuparem, por me levantarem sempre, seja quando estava no pior dos dias, ou no melhor de todos, por enxergarem sempre o melhor em mim, mesmo quando nem eu conseguia. Obrigada por sempre responderem a todas as minhas perguntas aleatórias, vocês são demais!
Agradeço aos amigos irmãos Albert Elliot, Aline Stadnik, Carlos Júnior, Diego Carvalho, Erick Vila Verde, Fabiano Saft, Gabriela Vieira, Maiara Marinho, Rapahel Vaz e Victor Guidez, que não soltaram a minha mão, que me acompanharam para que eu me tornasse quem sou hoje, que nunca desistiram de mim. O amor de vocês sempre foi incondicional, muito obrigada!
Agradeço a todos que colocaram um sorriso no meu rosto e que me fazem tão bem, em especial a Camila Chagas, Isabella Comodo, Marcela Venieris, Paula Lima, Rafaela Bandeira, Raoni Ferreira, Vanessa Castro, Victor Gonzalez, Yan Couto, e as minhas cantoras favoritas, Fernanda Reis e Fernanda Duarte, que sempre recarregam as minhas energias.
Agradeço a todos os amigos do curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal da Bahia (UFBA), impossível citar todos, mas todos igualmente importantes.
Agradeço aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV) especialmente a Táris Maria Macedo por ser uma grande amiga e conselheira em todos os momentos, e principalmente por toda a atenção, disponibilidade e hospitalidade em todas as vezes que me acolheu em sua casa sempre com muito carinho, fazendo com que me sentisse mais do que em casa.
Agradeço ao PPGRGV da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) pela formação acadêmica e aprendizado.
Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pela concessão de bolsa de estudos.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho.
RESUMO
Orchidaceae é uma das maiores famílias de plantas com flores e plantas epífitas, compondo 7% de todas as espécies distribuídas pelo planeta. O gênero Cattleya é um dos mais importantes da família, devido ao elevado valor ornamental, o que tem levado à redução das populações de diversas espécies na natureza devido à coleta intensiva para abastecer o mercado ornamental. Cattleya amethystoglossa, é uma orquídea epífita brasileira, distribuída ao longo das regiões Nordeste e Sudeste, sempre acompanhando a Serra do Mar. Cyrtopodium constitui outro gênero de orquídeas ornamentais, o qual possui distribuição neotropical. Este gênero apresenta maior diversidade de espécies no Brasil, dentre elas Cyrtopodium aliciae, endêmica da Cadeia do Espinhaço. A cultura de tecidos vegetais é uma importante aliada na conservação do germoplasma in vitro das espécies, sendo uma alternativa sustentável para o abastecimento do mercado ornamental, fornecendo plantas viáveis independentemente da estação do ano. No entanto, durante a multiplicação in vitro o ambiente de cultivo, o uso de reguladores vegetais, e as sucessivas repicagens podem gerar variação somaclonal nas culturas, não desejada quando a micropropagação é utilizada em plantas para fins comerciais e de conservação. Desta forma, os objetivos do presente trabalho foram estabelecer um protocolo de micropropagação e analisar a embriogênese somática durante a micropropagação em C. aliciae; estabelecer protocolos para germinação para C. amethystoglossa, analisar o crescimento lento para C. amethystoglossa, e a fidelidade genética das plantas de C. amethystoglossa após o cultivo in vitro por meio de marcadores ISSR. A micropropagação de C. aliciae deve ser realizada em meio líquido, MS com metade das concentrações salinas acrescido de 2 g L-1 de carvão ativado. A análise anatômica revelou que os calos originados nas raízes tratavam-se de calos embriogênicos, os quais diferenciaram-se em corpos semelhantes a protocormos ao longo do tempo. A espécie C. aliciae é responsiva a embriogênese somática indireta, o acondicionamento em sala de crescimento, sob a vedação de algodão, aumenta a sobrevivência, diminui a contaminação e recomenda-se utilizar sacarose no meio de cultura. A germinação de para C. amethystoglossa foi mais significativa em meio de cultura contendo carvão ativado, o meio de cultivo deve ser acrescido de 2 g L-1 de carvão ativado. No crescimento lento de C. amethystoglossa as plantas devem ser mantidas em meio MS acrescido de 2 g L-1 de carvão ativado sem a adição de sacarose. A micropropagação e a estabilidade genética de C. amethystoglossa devem ser realizadas em meio MS/2 suplementado com 0,537 µM de ANA, 8,880 µM de BAP e 2 g L-1 de carvão ativado, para a maior produção de brotos saudáveis e geneticamente estáveis ao longo de três gerações de cultivo.
PALAVRAS-CHAVE: cultura de tecidos vegetais; embriogênese somática; ISSR; Orchidaceae; plantas ornamentais; variação somaclonal.
ABSTRACT
Orchidaceae is one of the biggest families of epiphyte and flowering plants, composing 7% of all world-wide species. The Cattleya genera is one of the most important in this family, due to its high ornamental value, what has been reducing populations of various species on nature due to an intense collection intended to supply the ornamental market. Cattleya amethystoglossa is a brazilian epifhyte orchid, distributed throughout Northeast and Southeast regions, always near the Serra do Mar. Cyrtopodium constitutes another ornamental orchids genera, which posses neotropical distribution. It has the biggest species diversity in Brazil, and among them there’s Cyrtopodium aliciae, endemic from Cadeia do Espinhaço. The plants tissue culture is an important ally on in vitro germoplasm conservation of the species, since it’s a sustainable alternative for supplying the ornamental market, providing viable plants regardless any season of the year. However, during in vitro regeneration in the culture enviroment, the use of plant regulators and constant transplanting may produce somaclonal variation in the cultures, that isn’t desired when a micropropagation process is used aiming selling and conservation. Thus, this present study aims to establish a micropropagation protocol and analyse the somatic embriogenesis during micropropagation in C. aliciae; establish protocols for germination in C. amethystoglossa; and analyse the slow growth for C. amethystoglossa, and the genetic fidelity of the C. amethystoglossa plants, after the in vitro culture, using ISSR markers. The micropropagation of C. aliciae must be performed on liquid MS medium, with half of salts concentrations plus 2 g L-1 active charcoal. The anatomic analysis revealed that the callus originated from the roots were embriogenic callus, which differentiated themselves into protocorn-like bodies over time. The C. aliciae species is responsive to indirect somatic embriogenesis. The conditioning in growth room, using cotton as a seal, increases the survival, decreases contamination levels and it’s recommended to utilize sucrose on the culture medium. The germination for C. amethystoglossa was more significant in culture mediums with active charcoal, the medium must be added 2 g L -1 of active charcoal. In the slow growth process of the C. amethystoglossa plants, 2 g L-1 of active charcoal without sucrose addition must be added to the MS medium utilized. The genetic stability and the micropropagation process of C. amethystoglossa must be performed on MS/2 medium with 0,537 µM of ANA and 8,880 µM of BAP with the addition of 2 g L -1 of active charcoal, for a bigger production of healthier and more genetically stable callus during three culture generations.
KEY-WORDS: plants tissue culture; somatic embriogenesis; ISSR; Orchidaceae; ornamental plants; somaclonal variation.
LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO Figura 1 - Cyrtopodium aliciae L. Linden & Rolfe ...... 14 Figura 2 - Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex R. Warner...... 15
CAPÍTULO 1 - Micropropagação e embriogênese somática a partir de meristemas radiculares em Cyrtopodium aliciae L. Linden & Rolfe
Figura 1 - Planta de Cyrtopodium aliciae mostrando, na área destacada a porção correspondente aos explantes, com aproximadamente 2 cm...... 31 Figura 2 - Cultivo in vitro de Cyrtopodium aliciae...... 40 Figura 3 - Cortes transversais da raiz e ESMRs em Cyrtopodium aliciae...... 41
CAPÍTULO 2 - Estabelecimento in vitro e análise da fidelidade genética na micropropagação de Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb. f. ex R. Warner (Orchidaceae) Figura 1 - Gel de agarose a 2,0% mostrando o padrão eletroforético de amostras de Cattelya amethystoglossa amplificadas com o primer 899...... 67 Figura 2 - Dendograma obtido a partir da matriz de marcadores ISSR de brotos regenerados in vitro a partir de 12 plantas mãe de C. amethystoglossa e algoritmo UPGMA ...... 68
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1 - Micropropagação e embriogênese somática a partir de meristemas radiculares em Cyrtopodium aliciae L. Linden & Rolfe
Tabela 1 - Efeito dos ambientes de cultivo casa de vegetação (CV) e sala de crescimento (SC) e da concentração de sacarose (0 a 30 g L-1) no número de brotos produzidos por explante, percentual de sobrevivência dos explantes, percentual de explantes que apresentaram embriogênese na raiz, percentual de explantes que apresentaram hiperidricidade, percentual de explantes que apresentaram alterações na coloração e percentual de explantes que sofreram contaminação em plantas de Cyrtopodium aliciae cultivadas in vitro...... 35
CAPÍTULO 2 - Estabelecimento in vitro de e análise da fidelidade genética na micropropagação de Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex R. Warner (Orchidaceae)
Tabela 1 - Valores médios para germinação (%) de Cattleya amethystoglossa, em função de diferentes concentrações salinas do meio nutritivo (MS, MS/2, MS/4 na presença (CC) (2g L-1) ou ausência (SC) de carvão ativado ...... 59
Tabela 2 - Valores médios para a sobrevivência (S) (%), número de brotos (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA) (em cm), número de raízes (NR), comprimento da raiz (CR) (em cm) e percentual de explantes que formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea (COR) (%) de Cattleya amethystoglossa cultivadas em meio MS suplementado com diferentes concentrações de sacarose (0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90g.L-1) após 360 dias de cultivo in vitro ...... 60
Tabela 3 - Efeito de diferentes concentrações de BAP (µM) e ANA (µM) na micropropagação de C. amethystoglossa, para as variáveis sobrevivência (%), número de brotos por explante, contaminação (%) e percentual de explantes que formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea (%) ...... 64
LISTA DE SIMBOLOS E ABREVIATURAS
ANA - Ácido naftalenoacético BAP – Benzilaminopurina CITES - Convenção sobre o Comércio Internacional das Espécies da Flora e da Fauna Selvagens em Perigo de Extinção CNCFlora - Centro Nacional de Conservação da Flora CPA – Comprimento da parte aérea CR - Criticamente em perigo CMR – Comprimento da maior raíz DD - Dados deficientes EN - Em Perigo EW - Extinta na natureza EX – Extinta ISSR - Inter Simple Sequence Repeats MN - Meio Knudson MS - Meio Murashige & Skoog NB – Número de brotos NDM - Meio New Dogashima Medium NE - Não avaliadas NF – Número de folhas NR – Número de raízes NT - Quase ameaçadas VW - Meio Vacin e Went VU - Vulnerável g – Gramas L-1 - Litro µM – Micro molar pb – pares de bases
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL...... 11 REFERÊNCIAS...... 20 CAPÍTULO 1 – MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE Cyrtopodium aliciae L. Linden & Rolfe...... 27 1.1 Introdução...... 29 1.2 Material e Métodos...... 31 1.3 Resultados e Discussão...... 33 Referências...... 43 CAPÍTULO 2 - ESTABELECIMENTO IN VITRO DE E ANÁLISE DA FIDELIDADE GENÉTICA NA MICROPROPAGAÇÃO DE Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex R. Warner (Orchidaceae)...... 49 2.1 Introdução...... 51 2.2 Material e Métodos...... 53 2.3 Resultados e Discussão...... 57 Referências...... 72 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 79
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INTRODUÇÃO GERAL
A família Orchidaceae é uma das maiores famílias dentre as Angiospermas, e a segunda maior família encontrada no Brasil (DRESSLER, 1993; ABREU et al., 2015; CHASE et al., 2015), com aproximadamente 899 gêneros e 27.801 espécies, correspondem a 8% das plantas vasculares conhecidas no planeta (CHAO et al., 2017; THE PLANT LIST, 2019). Estas plantas apresentam uma ampla distribuição mundial, ocorrendo desde regiões frias e úmidas a desertos equatoriais, tanto ao nível do mar quanto em grandes altitudes (ARDITTI, 1979; CHAO et. al., 2017; FARIA et al., 2010; MOREIRA et al., 2007). Como muitos outros grupos de plantas, as orquídeas são mais diversas nas regiões tropicais, apesar de não serem uniformemente distribuídas (DRESSLER, 1993).
O Brasil abriga uma das maiores diversidades de orquídeas do mundo, com aproximadamente 219 gêneros e 2.4448 espécies, dentre as quais 1.571 são endêmicas, figurando entre as famílias mais importantes encontradas em quatro dos seis biomas que ocorrem no país. É considerada a família mais importante da Mata Atlântica, a segunda dentre as famílias presentes na Floresta Amazônica, a terceira do Cerrado, e na Caatinga, é a décima família mais importante (ABREU et al., 2015; BARROS et al., 2019). Ainda assim, Orchidaceae é uma das famílias de angiospermas com maior número de espécies ameaçadas de extinção (IUCN, 1999; SWARTS; DIXON, 2009; NIC LUGHADHA et al., 2017; A).
As orquídeas podem ser epífitas, quando crescem sobre os galhos das árvores; terrestres, quando crescem na terra; rupícolas ou litófitas, que são aquelas que crescem sobre as rochas, muitas vezes a pleno sol, sendo encontradas fixadas sobre os líquens e detritos vegetais decompostos, que se acumulam nas fendas e partes rebaixadas das rochas; e saprófitas, que não possuem clorofila e são muito raras, se alimentando de restos vegetais e animais, já que não realizam a fotossíntese (FARIA et al., 2010; CHAO et. al., 2017). Como as sementes de orquídeas não contêm endosperma, estabelecem relações com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento de mudas. Quando em condições naturais, a propagação das orquídeas se dá pela proliferação de brotos laterais ou pela disseminação natural das sementes, as quais são produzidas em cápsulas (COSTA et al., 2009; CHAO et. al., 2017).
As orquídeas são cultivadas e comercializadas para diversos fins, como plantas ornamentais, medicamentos e alimentos (HINSLEY et al., 2018). As orquídeas são responsáveis por uma grande parte do comércio mundial de floricultura, tanto de flores cortadas 12
quanto de plantas em vasos, e estima-se que compreendam cerca de 10% do comércio internacional de flores frescas, movimentando cerca de 483 milhões de dólares entre 2007 e 2012 (DE et al., 2015). Na indústria de flores de corte, a família ocupa uma posição significativa devido à sua atratividade, longevidade de prateleira, alta produtividade, época certa de floração, facilidade de embalagem e transporte (DE et al., 2015).
Atualmente, além da coleta extrativista, a perda de habitat é uma das maiores ameaças para as espécies de Cattleya estudadas neste trabalho, tendo em vista que são espécies litorâneas e de Mata Atlântica. Em 2018, a Fundação SOS Mata Atlântica, do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais, publicou um relatório técnico dos remanescentes florestais da Mata Atlântica no período de 2016-2017, apresentando uma visão global da conservação desse bioma. Nos estados da região Sudeste, os dados para o Espírito Santo, onde ocorrem três das quatro espécies estudadas neste trabalho, indicam que resta apenas 12,6% de mata natural. No Estado de Minas Gerais restam cerca de 11,6% de cobertura natural, no Estado de São Paulo somente 16,3%, e o Estado do Rio de Janeiro ainda conserva 20,9% de área natural. Na região Nordeste, no Estado da Bahia, restam 14% e em Pernambuco somente 12,5% dos remanescentes de Mata Atlântica. Na região Sul, o Rio Grande do Sul, apenas 13,6%, e o Estado de Santa Catarina é o segundo estado brasileiro com a maior porcentagem de remanescentes de Mata Atlântica, com 28,8% de mata natural (FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA, 2017).
Centro Nacional de Conservação da Flora - CNCFlora, criado em 2008, tem como um de seus objetivos, avaliar o estado de conservação das espécies da flora brasileira, subsidiando a atualização periódica da Lista Nacional Oficial das Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção. Nesta lista, o CNC Flora utiliza nove categorias, incluindo espécies que ainda não foram avaliadas (NE), espécies para as quais os dados são deficientes (DD), e a partir da classificação menos preocupante (LC), avalia o risco de extinção de forma crescente, seguida por quase ameaçada (NT) e categorias ameaçadas, que são a vulnerável (VU), em perigo (EN), criticamente em perigo (CR), até extinta na natureza (EW) e, por fim, extinta (EX) (IUCN, 2016). O gênero Cyrtopodium R. Br. possui 48 espécies (THE PLANT LIST, 2019), é neotropical, sendo distribuído do sul da Flórida, das Antilhas e do México até o sul do Brasil e Argentina (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). O Brasil é o país com o maior número de espécies, com 39 espécies descritas, das quais 25 são endêmicas, sendo o cerrado o centro de diversidade do gênero, onde são encontradas 29 espécies (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008, 13
CNCFlora, 2019). A maioria das espécies do gênero são terrestres (33 espécies), algumas são epífitas (7) e outras estritamente rupículas (5), enquanto algumas crescem tanto em ambiente terrestres quanto rupículas (3) (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). As espécies rupículas e epífitas têm pseudobulbos fusiformes, invariavelmente grandes, com folhas articuladas (ou seja, folhas com uma articulação ou camada de abscisão entre a lâmina e a bainha da folha) (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). As espécies terrestres são predominantemente de pastagens abertas e ocupam uma ampla gama de habitats de encostas rochosas secas a prados molhados (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). A maioria das espécies do gênero inicia um novo ciclo de crescimento e floração no final da estação seca e início da estação chuvosa, geralmente de fevereiro a abril no hemisfério norte ou setembro e outubro nas regiões central e sudeste do Brasil, onde um novo broto vegetativa cresce a partir do pseudobulbo formado na temporada anterior (ROMERO- GONZÁLEZ et al., 2008). O broto reprodutivo emerge da base da nova brotação vegetativa e, na maioria das espécies, desenvolve-se rapidamente, de modo que quando as plantas estão em plena floração as folhas estão apenas parcialmente desenvolvidas, e as folhas se tornam totalmente desenvolvidos somente alguns meses após a floração (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). À medida que a estação seca se aproxima, as folhas murcham e as plantas se tornam dormentes. Este hábito sazonal, combinado com os pseudobulbos enterrados de muitas espécies, torna difícil a localização das espécies terrestres no campo durante o período de dormência. As plantas são mais facilmente encontradas floridas em lugares recentemente queimados (ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). Cyrtopodium aliciae L. Linden Rolfe (Figura 4) é caracterizada por suas flores brancas com máculas purpúreas; brácteas, sépalas e pétalas fortemente onduladas, é uma espécie rupícola, que cresce nos campos rupestres, em áreas abertas ensolaradas, florescendo nos meses de julho, agosto e novembro (AZEVEDO e van den BERG, 2007a). Esta espécie é endêmica da Cadeia do Espinhaço, encontrada desde o estado de Minas Gerais até Pernambuco e, apresenta flor branca com máculas purpúreas, brácteas, sépalas e pétalas fortemente onduladas, morfologia floral bastante distinta (AZEVEDO e van den BERG, 2007a; ROMERO- GONZÁLEZ et al., 2008). A bibliografia para a espécie é escassa, sendo citada principalmente em levantamentos florísticos na região da Chapada Diamantina (AZEVEDO; van den BERG, 2007a, 2007b; ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008; VIEIRA et al., 2014). 14
Figura 4 – Cyrtopodium aliciae L .Linden & Rolfe . Autor: Emanoel Gomes. Hospedada em:< http://www.orchidspecies.com/cyrtoaliciae.htm>
Cattleya Lindl. é um gênero com aproximadamente 187 espécies, dentre as características mais marcantes está o habito de vida, na qual podem ser principalmente epífitas, e menos comumente rupícolas e terrícolas (THE PLANT LIST, 2019; BARROS et al., 2019). No Brasil, o gênero Cattleya apresenta 102 espécies, sendo 95 endêmicas (BARROS et al., 2019), e com elevado valor ornamental, de forma que a maior parte das espécies têm sido coletadas intensamente na natureza. A elevada frequência com a qual vem ocorrendo essa procura tem levado à redução e ao desaparecimento de várias espécies (CRUZ et al., 2003).
Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex R. Warner (Figura 1) é caracterizada por apresentar inflorescência com 3-8 flores, ápice dos lobos laterais do labelo truncado, sobrepondo-se, lobo terminal profundamente emarginado, papiloso, magenta. É uma espécie epífita, podendo ser raramente encontrada vivendo sobre as rochas (CRUZ et al., 2003). Possui ampla área de distribuição, ocorrendo nos biomas da Mata Atlântica, ocorrendo com maior frequência no estado da Bahia, mas também é encontrada nos Estados do Espírito Santo e Minas Gerais, e Caatinga exclusivamente no estado da Bahia entre 600m e 1200m de altitude, nas matas estacionais ao sul, planícies centrais e na região nordeste da Chapada Diamantina. Os exemplares encontrados ao sul do estado frequentemente apresentam pétalas e sépalas de 15
coloração creme pintalgadas de magenta. Sua floração ocorre de dezembro a fevereiro (CRUZ et al., 2003; CNCFlora, 2018).
Figura 1 – Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex R. Warner. Autor: Mauro Rosim, 2011. Hospedada em:
A Convenção sobre o Comércio Internacional das Espécies da Flora e da Fauna Selvagens em Perigo de Extinção (CITES), regulamenta o comércio internacional de fauna e flora silvestres e prevê um sistema de certificados e licenças para controlar o comércio de espécies ameaçadas. Apresenta três apêndices que classificam o grau de ameaça ao qual o táxon está submetido. No Apêndice I, estão inseridas as espécies ameaçadas de extinção, as quais podem ser afetadas pelo comércio, que só será permitido em circunstâncias excepcionais. O Apêndice II, lista as espécies não necessariamente ameaçadas de extinção, mas o comércio deve ser fiscalizado a fim de evitar a utilização incompatível com sua sobrevivência. O Apêndice III, inclui as espécies que são protegidas em pelo menos um país e que tenha solicitado assistência às demais partes da Convenção para controlar seu comércio (CITES, 2017). Dentro dessas classificações, C. amethystoglossa é uma espécie NT, que não se qualifica como ameaçada nesse momento, mas pode estar próxima de atingir essa classificação (CNCFlora, 2019). Está inserida também, no Apêndice II do CITES (2017), em virtude das atuais ameaças às quais está submetida. Em razão disso, devem ser tomadas providências que visem à sua conservação bem como a proteção das populações nativas desta espécie. 16
A literatura disponível para C. amethystoglossa é escassa, não estando disponíveis técnicas de germinação e estabelecimento in vitro eficientemente padronizadas, uma vez que grande parte dos estudos tem sido conduzidos com híbridos produzidos através do cruzamento desta espécie com outras orquídeas. Estudos sobre o desenvolvimento inicial já foram realizados por Spoerl (1948), que avaliou o crescimento utilizando diferentes concentrações de hidrocloreto de L-arginina como fonte de nitrogênio, em ausência e presença de luz, concluindo que à medida que se aumenta a concentração de nitrogênio o crescimento é reduzido, e que a luminosidade não influenciou significativamente no experimento. Ventura (2007), avaliou a germinação e desenvolvimento in vitro de C. amethystoglossa em meio Gambor et al. (1968) submetido a diferentes concentrações de carvão ativado, no qual observou reduzida taxa de germinação (1%), concluindo que a adição de carvão ativado foi deletéria. Para o desenvolvimento, os melhores resultados foram observados quando os protocormos foram transferidos para meio Knudson (1946) (MN), modificado por Novais e Rodrigues (2004), sem adição de carvão ativado. Hengling (2015), em seu teste de germinação com o meio Murashige & Skoog (1962) (MS) com metade das concentrações salinas (MS/2), observou baixa germinação inicial (13%) em C. amethystoglossa, apesar da alta viabilidade das sementes (88%).
A cultura de tecidos, que se refere a um conjunto de técnicas e de metodologias que permitem o crescimento e a multiplicação de células, tecidos ou órgãos de planta, em condições assépticas, sob condições controladas de luminosidade e temperatura, sobre um meio nutritivo, que auxilia na produção de plantas livres de vírus e outros agentes causadores de doenças. É importante, na conservação e intercâmbio de germoplasma in vitro, na micropropagação rápida de genótipos, na produção de haploides, e na transformação genética de plantas, dentre outras (CARVALHO, 1999; TORRES et al., 2000). Os meios nutritivos fornecem as substâncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos in vitro, e são elaborados com base nas exigências das plantas, quanto aos nutrientes e minerais, com algumas modificações para atender a necessidades específicas (TORRES et al., 1998).
Durante os últimos anos, as técnicas de cultura in vitro têm sido extensivamente desenvolvidas e aplicadas em mais de 1.000 espécies, incluindo muitas espécies tropicais, de grande interesse para bancos de germoplasma, pois possibilitam o armazenamento e multiplicação de espécies recalcitrantes e de propagação vegetativa (ENGELMANN, 1991). Uma vez que as cápsulas de orquídeas podem conter até cerca de 4 milhões de sementes, 17
(FRANCO, 1942; ARDITTI, 1961), sendo comum a formação de sementes em embriões ou com baixa viabilidade em que apenas 1% germinam na natureza em asssociação com micorrizas (ZHANG, 2000, HOSSOMI et al., 2012). Os estudos nesta área, para a família Orchidaceae, portanto, não representam um risco para as populações in situ, uma vez que não é necessária a coleta de todo o indivíduo, somente das cápsulas.
A micropropagação é uma técnica que possibilita a multiplicação clonal de vegetais in vitro, sendo considerada a aplicação mais prática da cultura de tecidos (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998) e pode ser dividida em três etapas: estabelecimento das culturas, que deve garantir o crescimento de tecidos e órgãos livres de algas, bactérias, fungos e outros contaminantes; a multiplicação do número de brotos ou embriões somáticos, e a aclimatização, que abrange a separação e a seleção de propágulos e o desenvolvimento de métodos eficientes de transferência para o ambiente ex vitro a fim de se obter um alto índice de sobrevivência (GEORGE, 2008).
A organogênese é um processo de multiplicação in vitro que envolve fatores internos e externos, que interagem tanto com o meio de cultura quanto com o explante utilizado, para formar uma estrutura organizada, um órgão, processo pelo qual células e tecidos são induzidos a sofrerem alterações (processos de diferenciação e desdiferenciação) que levam à produção de uma estrutura unipolar, ou seja, um primórdio da parte aérea ou raiz, cujo sistema vascular é frequentemente ligado aos tecidos do explante inicial (THORPE, 1994). Corresponde ao balanço entre os reguladores citocinina/auxina presentes no meio de cultura. Esses reguladores são utilizados para estimular a geração de raízes e partes aéreas a partir do tecido (TAIZ; ZEIGER, 2017). A organogênese é direta, quando a diferenciação ocorre diretamente do explante, ou indireta, quando ocorre primeiramente a formação de calos que posteriormente são diferenciados nos tecidos vegetais (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Os reguladores vegetais são amplamente utilizados na cultura de tecidos com objetivo de aumentar a eficiência na produção de mudas como induzir a divisão e diferenciação celular, estimular a formação de raízes e o alongamento das plantas (FEHER et al., 2003). Combinações entre diferentes concentrações de auxinas e citocininas, como o ácido naftalenoacético (ANA) e a benzilaminopurina (BAP), foram avaliadas obtendo resultados satisfatórios para várias orquidáceas, como a indução de brotos em Phalaenopsis utilizando meio Vacin e Went (VW) (ISHI et al., 1998), em híbridos de Dendrobium utilizando explantes foliares (MARTIN; MADASSERY, 2005), em Dendrobium chrysanthum Wall. ex Lindl. (HAJONG et al., 2013), 18
Dayaoshania cotinifolia W.T. Wang (YANG et al., 2014), e Cattleya labiata Lindl. utilizando explantes caulinares (RODRIGUES et al., 2017).
A multiplicação in vitro com a utilização de reguladores vegetais pode ser direta ou indireta, passando por uma etapa de calogênese. Em contraste, a embriogênese somática leva à produção de uma estrutura bipolar contendo um eixo raiz/brotação, com um sistema vascular autônomo fechado (THORPE, 1994). Nos processos de regeneração indireta a análise histológica é uma importante aliada na identificação e caracterização das estruturas iniciais e das etapas do desenvolvimento embriogênico ou organogênico (QUIROZ-FIGUEROA et al., 2006), sendo necessária para compreender e avaliar a formação e a viabilidade dos embriões somáticos (ULISSES et al., 2016).
Por fim, a aclimatização de plantas provenientes da cultura in vitro é fundamental para o sucesso da micropropagação. Cuidados para evitar excessiva perda de água são necessários, pois o ambiente in vitro geralmente mantém valores de umidade relativa próximo da saturação e, como consequência, as plantas produzidas com frequência não são capazes de controlar a perda de água (MALDA et al., 1999). Sendo assim, para orquídeas, é necessária uma aclimatização gradual do laboratório para a condição ex vitro para que as plantas possam suportar passagem do ambiente sob condições controladas para sobreviver quando transferidas para o ambiente ex vitro (ROUT et al., 2006).
A propagação de orquídeas por meio de sementes talvez seja a maneira mais importante de conservar o material genético in vitro das espécies, pois quando a semente é utilizada como material vegetal inicial, pode-se maximizar a diversidade genética das plantas produzidas por meio de técnicas in vitro, já que espera-se que o material genético das sementes não apresentem uma uniformidade morfológica e genética (ISHI et al., 1998; STANCATO et al., 2001; AOYAMA; GONTIJO; FARIA, 2012).
O crescimento e a morfogênese de células e tecidos in vitro são regulados pela interação e pelo balanço entre as substâncias adicionadas ao meio de cultura e por aquelas produzidas de forma endógena nas células (CHAPLA et al., 2009). Durante esse processo, os reguladores vegetais, o ambiente, e o tempo de cultivo, dentre outros fatores, podem induzir a formação de plantas morfológica e geneticamente diferentes da planta mãe. Quando o objetivo é a multiplicação clonal, a formação de calos é indesejável uma vez que a constituição cromossômica deste material é, em geral, instável, podendo originar variantes genéticos, por 19
meio de um processo chamado variação somaclonal (LARKIN; SCOWCROFT, 1981). Neste caso, o período de crescimento desorganizado deve ser o menor possível, ou preferencialmente eliminado (STREET, 1975).
Marcadores moleculares são amplamente utilizados em estudos sobre diversidade e estabilidade genética de plantas obtidas in vitro (SILVA et al., 2007; BUTIUC-KEUL et al., 2016). O Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) é um marcador dominante que tem sido frequentemente utilizado para a análise da fidelidade, diversidade e estrutura genética de plantas regeneradas in vitro, em virtude de ser reproduzível, simples, rápido e necessitar de um pequena quantidade de DNA (BHATIA et al., 2011; LIU et al., 2011).
Este marcador é baseado em reação em cadeia da polimerase (PCR), que envolve a amplificação do segmento do ácido desoxirribonucleico (DNA) presente em uma distância amplificável entre duas regiões de repetição de microssatélites idênticas e orientadas em direções opostas (ZIETKIEWICZ et al., 1994; REDDY et al., 2002). Quando comparado a outros marcadores, apresenta alta reprodutibilidade e polimorfismo, são mais estáveis, eficientes, simples, fáceis de trabalhar e é uma técnica poderosa pois permite diferenciar a variabilidade entre indivíduos estritamente relacionados (REDDY et al., 2002).
Diversos estudos de estabilidade genética em orquidaceas cultivadas in vitro foram realizados com marcadores ISSR, a exemplo de Vanilla planifolia Jacks (SREEDHAR et al., 2007; RAMÍREZ-MOSQUEDA & IGLESIAS-ANDREW, 2015; SOLANO et al., 2019), Anoectochilus formosanus HAYATA (ZHANG et al., 2010), Habenaria edgeworthii Hook. f. ex. Collett (GIRI et al., 2012), Phalaenopsis gigantea J.J.Smith (SAMARFARD et al., 2014), Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f. ex André (BHATTACHARYYA et al., 2015), Anoectochilus elatus Lindley (SHERIF et al., 2018), demonstrando a eficiência deste marcador para este tipo de análise.
Desta forma, o objetivo geral deste trabalho foi promover estudos em cultura de tecidos em espécies de Orchidaceae endêmicas do Brasil, Cattleya. amethystoglossa, C. schilleriana, C. tigrina e Cyrtopodium alice. Os objetivos específicos foram:
a) Estabelecer um protocolo de multiplicação in vitro para C. aliciae;
b) Avaliar morfologicamente calos surgidos a partir do meristema radicular em plantas in vitro de C. aliciae; 20
c) Analisar o efeito de diferentes meios nutritivos na germinação e crescimento in vitro de C. amethystoglossa, C. schilleriana e C. tigrina;
d) Analisar o efeito de diferentes concentrações de reguladores vegetais e os diferentes tipos de explante na multiplicação in vitro de C. amethystoglossa;
e) Analisar a multiplicação in vitro de C. amethystoglossa ao longo de diferentes gerações de cultivo;
f) Analisar a fidelidade genética de brotos de C. amethystoglossa ao longo de três gerações de cultivo.
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CAPÍTULO 1
Multiplicação in vitro de Cyrtopodium aliciae L. Linden & Rolfe
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RESUMO
Cyrtopodium aliciae é uma orquídea endêmica do Brasil, ameaçada, e com elevado valor ornamental devido às suas inflorescências com numerosas flores maculadas. Este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo de micropropagação fotoautótrofica, e avaliar a formação de embriões somáticos a partir do meristema radicular em plantas in vitro de C. aliciae. Utilizou-se o meio Murashige & Skoog (1962) acrescido de 2% de carvão ativado. Foram testados seis tratamentos, em arranjo fatorial 3x2, com diferentes concentrações de sacarose (0, 15 e 30 gL-1) e cultivo em casa de vegetação ou sala de crescimento, em tubos vedados com algodão, durante 180 dias. As estruturas surgidas a partir de meristemas radiculares foram fixadas, emblocadas em resina histológica sintética, seccionadas em micrótomo e analisadas em microscópio óptico. No cultivo em ausência de sacarose houve 100% de sobrevivência nas amostras mantidas em sala de crescimento, entretanto nas amostras mantidas sob luz natural 100% dos explantes morreram. As taxas de contaminação chegaram a 46,6% sob luz natural, não havendo contaminação em plantas mantidas em sala de crescimento. Em sala de crescimento e na presença de sacarose (15 e 30gL-1) 20% dos explantes apresentaram acúmulo de antocianinas, e maiores taxas de hiperidricidade (36,6% em 15gL-1 de sacarose). A análise anatômica revelou que os calos originados nas raízes se tratavam de calos embriogênicos, os quais se diferenciaram em corpos semelhantes a protocormos ao longo do tempo. Concluiu-se que C. aliciae é uma espécie responsiva para embriogênese somática indireta, que o cultivo em sala de crescimento, sob a vedação de algodão, diminui o percentual de contaminação e aumenta as taxas de sobrevivência das plantas obtidas in vitro.
Palavras-chave: Orchidaceae; calogênese; embrião somático; meio líquido; vedação com algodão. 29
INTRODUÇÃO
Com cerca de 27.800 espécies, a família Orchidaceae é a maior das angiospermas, compreendendo 8% das plantas vasculares conhecidas (GIVNISH et al., 2015. No Brasil ocorrem 221 gêneros e 2.499 espécies (BARROS et al., 2015), mais do que qualquer outra família de plantas, apresentam grande número de gêneros e espécies ameaçadas (BELLAVER et al., 2015). As orquídeas terrestres, podem apresentar um maior risco de extinção como resultado da multiplicidade de processos ameaçadores, particularmente sob os atuais cenários de mudança climática (BELLAVER et al., 2015). O gênero Cyrtopodium R. Br. é neotropical, sendo o Brasil o país com a maior diversidade, com 39 espécies descritas, das quais 25 são endêmicas (BATISTA; BIANCHETTI, 2004; ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). Cyrtopodium aliciae L. Linden & Rolfe é uma espécie endêmica da Cadeia do Espinhaço que apresenta flores brancas com máculas purpúreas de elevado valor ornamental e pseudobulbos expostos. É encontrada desde o estado de Minas Gerais até Pernambuco (AZEVEDO; van den BERG, 2007; ROMERO-GONZÁLEZ et al., 2008). A micropropagação vem sendo amplamente desenvolvida no Brasil há pouco mais de 25 anos, sendo importante principalmente na cultura de meristemas, aumentando a quantidade de mudas produzidas e, assim contribuindo para salvar muitas espécies de orquídeas da extinção (STANCATO et al., 2001). A cultura assimbiótica in vitro é muito eficiente na germinação e cultivo de orquídeas epífitas tropicais e subtropicais, nas fases iniciais de desenvolvimento. Um grande número de mudas pode ser facilmente produzido, crescendo num ambiente controlado de modo artificial e totalmente estéril (STANCATO et al., 2001). A micropropagação fotoautotrófica refere-se estritamente à propagação e crescimento de explantes ou plantas em condições isentas de agentes patogênicos em ambiente que possibilitem às mudas realizarem fotossíntese em um nível superior ao normalmente observado no cultivo in vitro, sendo capazes de produzir os carboidratos necessários para o seu desenvolvimento (NGUYEN et al., 2016). A cultura fotoautotrófica de células vegetais visa facilitar os avanços no campo da fisiologia de plantas, e permitir que os sistemas de cultivo possibilitem a produção do açúcar necessário para o crescimento das plantas por meio da fotossíntese, dispensando a adição de açúcar no meio de cultura, o que representa um grande avanço científico e econômico (YAMADA; SATO, 1978).
A produção de plantas in vitro pode ocorrer por embriogênese. Nesse processo, células somáticas geram embriões análogos aos embriões zigóticos (AMMIRATO, 1983). A 30
embriogênese oferece determinadas vantagens sobre as demais formas de multiplicação, pois pode gerar grandes quantidades de embriões com o mínimo de manipulação e espaço físico do laboratório, importantes componentes do custo de uma planta micropropagada (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). No entanto, nem todas as espécies se mostram responsivas a esta técnica (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Para garantir a respiração dos tecidos, podem ser utilizados vários tipos de vedação, desde os que restringem as trocas gasosas com o ambiente, até aqueles que permitem diferentes níveis de trocas gasosas. Aqueles que garantem melhor ventilação podem atuar positivamente na qualidade de plantas produzidas in vitro, pois minimiza os danos que podem ocorrer na etapa de aclimatização (MARTINS et al., 2015; SILVA et al., 2016). Quando o tipo de vedação limita as trocas gasosas, as plântulas produzidas in vitro podem apresentar desordens anatômicas e fisiológicas (MARTINS et al., 2015). A vedação com algodão proporciona maior aeração no interior do frasco e por consequência maior troca gasosa entre o ambiente interno e o ar atmosférico, diminuindo a umidade relativa no interior dos frascos, melhorando a transpiração da planta e o desenvolvimento de suas folhas (RIBEIRO et al., 2007).
Tradicionalmente, se considera essencial o uso de reguladores vegetais para que a micropropagação ocorra de forma rápida e eficiente, como observado em diversos trabalhos em Orchidaceae (BUSTAM et al., 2015; DEWIR et al., 2015; STELLA et al., 2015; BHATTACHARYYA et al., 2016; ZENG et al., 2016; BUSTAM et al., 2017; JAINOL; GANSAU, 2017; MIRANI et al., 2017; NAHAR et al., 2017; RIVA et al., 2017; ROMERO et al., 2017). No entanto, essas substâncias são reconhecidamente um dos componentes mais caros da cultura de tecidos e tendem a aumentar as chances de variação somaclonal (LARKIN; SCOWCROFT, 1981; GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Desta forma o desenvolvimento de protocolos de micropropagação que não utilizem reguladores vegetais ou os utilizem em baixas concentrações podem beneficiar o processo de produção de mudas saudáveis e de baixo custo.
OBJETIVOS Este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo de multiplicação fotoautotrófica e avaliar morfologicamente calos surgidos a partir do meristema radicular em plantas in vitro de C. aliciae.
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MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal Foram utilizadas como fonte de explantes plantas de Cyrtoppodium aliciae com dois anos de idade mantidas em meio Murashige & Skoog (1962) (MS) com metade das concentrações salinas (MS/2), gelificado com 7g L-1 de ágar e acrescido de 2g/L-1 de carvão ativado. Os explantes com 2cm de altura, na região do bulbo, foram obtidos após a remoção das raízes e da parte superior das folhas dessas plantas.
Figura 1 – Planta de Cyrtopodium aliciae mostrando, na área destacada, a porção correspondente aos explantes, com aproximadamente 2 cm.
Multiplicação fotoautotrófica in vitro A multiplicação in vitro foi realizada em meio MS líquido, suplementado com diferentes concentrações de sacarose (0, 15 e 30 g L-1), e 2g L-1 de carvão ativado. O pH foi ajustado para 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem, realizada a 121°C por 15 minutos. 32
O experimento foi realizado por 180 dias (de novembro de 2015 a maio de 2016), os explantes de Cyrtopodium aliciae foram inoculados em tubos de ensaio com 30 cm de comprimento, sobre uma ponte de papel germitest imersa em 50 mL de meio de cultura. As unidades experimentais foram fechadas com algodão e acondicionadas em dois ambientes de cultivo: em sala de crescimento (SC) a 25 ± 3°C sob luz branca fluorescente (60 μmol m-2 s -1) e 16h de fotoperíodo, e em casa de vegetação - CV (campus de Ondina da Universidade Federal da Bahia), a 30 ± 5°C sob sombrite 50%.
Parâmetros analisadas e análise estatística Decorridos 180 dias da inoculação, foram analisados o número de brotos produzidos por explante, o percentual de explantes que sobreviveram (%), o percentual de explantes que formaram embriões a partir das raízes (%), o percentual de explantes que formaram estruturas hiperhídricas (%), o percentual de explantes que formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea (%), e o percentual de explantes com contaminação (%). O delineamento estatístico foi inteiramente randomizado em arranjo fatorial 2x3 (ambiente de cultivo x concentração de sacarose) utilizando 6 repetições de 5 explantes cada. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando o programa estatístico Sisvar 5.1 (FERREIRA, 2011).
Análise histológica dos calos obtidos na multiplicação fotoautotrófica Após 180 dias, foi observada a formação de estruturas semelhantes a calos, surgidas a partir de meristemas radiculares (ESMRs). Essas estruturas foram fixadas em FAA70 (formaldeído, ácido acético e etanol 70%, 1:1:18, v/v) (JOHANSEN, 1940) por 24 horas, a fim de estabilizar os componentes celulares e paralisar tanto os processos vitais quanto a autólise (KRAUS; ARDUIN, 1997). Após a fixação, foram selecionadas seis amostras da região mediana dos calos, que foram desidratadas em série butílica terciária e incluídas em metacrilato conforme instruções do fabricante (Historesin, Leica®). Após a inclusão, os blocos de historesina foram seccionados em micrótomo rotativo Thermo Scientific (HM 325), obtendo- se secções transversais de 5 µm de espessura, utilizando-se navalhas de aço descartáveis. As seções foram coradas com azul de toluidina 0,05% pH 6,8 (O’BRIEN; McCULLY. 1964), e montados em Entellan (Merck®). A fotodocumentação foi realizada em fotomicroscópico Zeizz, Axio Scope A1, com câmera Cannon acoplada. 33
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Multiplicação fotoautotrófica in vitro
Resultados importantes para a multiplicação em Cyrtopodium aliciae (Figura 1 e Tabela 1) foram observados. A espécie apresentou baixa brotação em ambiente controlado, tanto em casa de vegetação quanto em sala de crescimento, não havendo diferença estatística entre os dois ambientes de cultivo. Porém, quando avaliada as diferentes concentrações de sacarose, foi observado que aqueles nos quais foram adicionados 15 g L-1 de sacarose, apresentam as maiores médias em número de brotos. Em casa de vegetação a média foi de 0,73 brotos por explante, enquanto em sala de crescimento a média de brotação alcançou 1,4 brotos por explante. Os tratamentos em ausência de sacarose apresentaram baixa brotação, com média de 0,16 brotos por explante em sala de crescimento e não foi observada brotação, uma vez que os explantes não sobreviveram em casa de vegetação. O único estudo realizado para germinação e micropropagação in vitro de C. aliciae anterior a este, foi realizado por Cristo (2014), em que, após germinação das sementes em meio MS com metade das concentrações salinas, as plantas com 0,5 cm de comprimento da parte aérea foram seccionadas na porção superior e submetidas a diferentes concentrações dos reguladores ácido naftalenoacético (ANA) e 6- benzilaminopurina (BAP), em tubos vedados com PVC, gerando uma média de 2,61 brotos por explante, sem interação significativa dos reguladores vegetais. No presente trabalho, no qual não foram utilizados reguladores vegetais, as taxas de brotação foram baixas (Tabela 1) e inferiores àquelas obtidas por Cristo (2014), independentemente do ambiente de cultivo. Para a micropropagação de Cyrtopodium paludicolum Hoene, Picolotto (2013) avaliou diferentes concentrações de ANA e Thidiazuron (TDZ), e observou a formação de 55,25 brotos por explante utilizando 0,25 mg L-1 de ANA associado a 0,50 mg L-1 de TDZ. Porém, no tratamento na ausência de reguladores, obteve apenas 0,5 brotos por explante, valor inferior ao obtido para C. aliciae no presente trabalho. Na multiplicação in vitro de Cyrtopodium saintlegerianum Rchb.f., Silva (2012) observou uma média de 14,05 brotos por explante no tratamento que continha 0,2 mg L-1 de ANA combinado com 4 mg L-1 de BAP. No tratamento controle, na ausência de reguladores, observou uma média de 2,4 brotações por explante, sendo esse número superior ao encontrado para C. aliciae. Rodrigues e colaboradores (2015), obtiveram 15,20 brotos por explante quando C. saintlegerianum foi submetido a 2 mg L-1 de BAP, e 2,10 brotos por explante no cultivo sem reguladores, taxas ligeiramente 34
superiores às encontradas para C. aliciae. Em seu trabalho com Alatiglossum fuscopetalum (Hoehne) Baptista (Orchidaceae) Ferreira et al. (2017) também obtiveram baixa taxa de brotação em ausência de sacarose, porém em presença de sacarose (30g/L-1) as taxas de brotamento foram maiores, atingindo 8 brotos por explante. Os carboidratos servem como fonte de energia no meio (HUH et al., 2016). A sacarose pode fornecer uma fonte equilibrada de carbono para o crescimento celular a partir das hexoses liberadas participando diretamente das vias glicolítica e das pentoses fosfato (ZHA et al., 2007), o que pode ser essencial para o desenvolvimento do cultivo in vitro. Os explantes cultivados em sala de crescimento apresentaram sobrevivência significativamente maior (74,44%) do que os cultivados em casa de vegetação (24,22%). Em sala de crescimento, a sobrevivência variou de 50%, em 30g L-1 de sacarose, a 100%, na ausência de sacarose, mas essas diferenças não foram significativas (Tabela 1). Apesar da alta taxa de sobrevivência na sala de crescimento em ausência de sacarose, tais explantes não se desenvolveram, o que demonstra a dependência de fontes de carbono no meio de cultura, indicando que o crescimento fotoautotrófico não foi alcançado (KOCH, 1996; HAQUE; NAHAR; KAZUHIKO, 2017).
Para a sobrevivência de C. paludicolum os resultados mais significativos (91,75%) foram observados em presença dos regulados vegetais ANA (0,25 e 0,50 mg L-1) e TDZ (1 mg L-1) (PICOLOTTO, 2013). Apesar das taxas de sobrevivência dos explantes obtidas por Picolotto (2013) terem sido maiores do que as obtidas no presente trabalho, observamos que mesmo na ausência de reguladores vegetais a sobrevivência dos explantes de C. aliciae foi superior a 70%, um índice similar ao observado para C. paludicolum com 0,50 mg L-1 de TDZ (75,25%), e muito superior ao encontrado em ausência de reguladores vegetais (8,25%). Estes dados demonstram que a suplementação do meio de cultura com reguladores é necessária para a sobrevivência in vitro de C. paludicolum, enquanto C. aliciae apresenta ótima taxa de sobrevivência na ausência de reguladores.
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Tabela 1: Efeito dos ambientes de cultivo casa de vegetação (CV) e sala de crescimento (SC) e da concentração de sacarose (0 a 30 g L-1) no número de brotos produzidos por explante (NB), percentual de sobrevivência dos explantes (S), percentual de explantes que sofreram contaminação (C), percentual de explantes que apresentaram hiperidricidade (H), percentual de explantes que apresentaram alterações na coloração (COR), e percentual de explantes que apresentaram embriogênese na raiz (E) em plantas de Cyrtopodium aliciae cultivadas in vitro. NB S C H COR E
SACAROSE CV SC CV SC CV SC CV SC CV SC CV SC
0 0,00bA 0,16bA 0,00bB 100,0aA 16,6aA 0,00aA 0,0aA 0,00aA 0,00aA 0,00aA 0,00aA 0,00aA
15 0,73aA 1,40aA 40,00aB 73,33bA 46,6bB 0,00aA 3,3aA 36,66cB 6,66aA 20,00bB 3,33aA 3,33aA
30 0,50aA 0,73bA 33,33aA 50,00bA 33,3abB 0,00aA 0,0aA 10,00bB 0,00aA 20,00bB 13,3aA 13,3aA
Médias 0,41 A 0,73 A 24,44 B 74,44 A 32,22 B 0,00 A 1,11 A 15,55 B 2,22 A 13,33 B 5,55 A 14,44 A
Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas linhas e maiúsculas nas colunas não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey (p>0,05). 36
Em casa de vegetação a sobrevivência variou de 0%, na ausência de sacarose, a 40% na presença de 15 g L-1 de sacarose (Tabela 1). Esse baixo índice pode ser explicado pelas condições de altas temperaturas, às quais os explantes foram submetidos durante o dia e também pela contaminação que chegou a 46,6% das unidades experimentais (Tabela 1). Nas amostras contaminadas, os fungos podem ter comprometido a sobrevivência dos explantes.
Quando avaliada a contaminação, em casa de vegetação, em média 32,22% das unidades amostrais apresentaram contaminação, variando de 46,6% no tratamento com 30g L-1 de sacarose, a 16,6% na ausência de sacarose. Para as amostras mantidas em sala de crescimento, não houve contaminação, apesar de ser utilizado o mesmo o tipo de vedação das amostras mantidas em casa de vegetação, que permitia trocas gasosas entre o ambiente in vitro e o ex vitro (Tabela 1). No ambiente externo as unidades amostrais estão mais susceptíveis a contaminação, pois não é um ambiente controlado e limpo como as salas de crescimento.
A contaminação é apontada como uma das razões para o alto custo de produção na micropropagação pela perda de explantes, sendo a sua causa principal a presença de açúcar no meio de cultura (KOZAI, 1991). No presente trabalho, observamos 16,6% de contaminação em casa de vegetação quando não havia sacarose no meio de cultura, demonstrando que a contaminação pode ocorrer mesmo na ausência de sacarose. A utilização de tampões de algodão para fechar os tubos nesse trabalho foi eficiente, uma vez que mesmo permitindo as trocas gasosas entre o meio in e ex vitro, em sala de crescimento, impediu a entrada de agentes contaminantes no meio. Essa forma de vedação não foi eficaz em garantir a esterilidade do cultivo in vitro em casa de vegetação.
Foram observados brotos hiperídricos nos dois ambientes de cultivo. Em casa de vegetação a taxa de brotos hiperídricos foi baixa, apenas 3,3% quando em presença de 15g L-1 de sacarose. Quando os explantes foram cultivados em sala de crescimento o percentual de hiperidricidade variou de 10% (30g L-1 de sacarose) a 36,6% (15g L-1 de sacarose), indicando que para essa variável, a concentração média de sacarose se mostrou prejudicial, sendo observado aumento do acúmulo de água nos tecidos. Disfunções fisiológicas também podem ser observadas em trabalhos com meio líquido, provocando má formação e perda de massa do explante, que absorve muita água do meio comprometendo os tecidos, causados pela baixa oxigenação e alto potencial hídrico do ambiente de cultivo (ETIENNE; BERTHOULY, 2002; GEORGIEV et al., 2017). A hiperidricidade é um distúrbio morfológico e fisiológico que afeta frequentemente plantas 37
herbáceas e lenhosas durante a regeneração in vitro em presença de altas concentrações de auxinas e citocininas, causando hipertrofia das células e defeitos na parede celular (LESHEN et al., 1988), que podem ocorrer também quando se trabalha com a microproopagação, e uma das razões pelo aumento dos custos, pela perda de explantes (KOZAI, 1991).
Em casa de vegetação foi observada uma baixa incidência (6,6%) de alteração na coloração das folhas, de verde para roxo (Tabela 1; Figura 1A). Em sala de crescimento observou-se que esse percentual chegou a 20%, nos tratamentos com 15 e 30g L-1 de sacarose. Essa alteração constitui um indicativo do acúmulo de antocianinas nos tecidos. No cultivo in vitro podem ocorrer alterações na coloração das folhas, seja por necrose foliar, estiolamento, deficiência nutricional e ataque fúngico, podendo gerar acumulo de antocianinas (pigmentos azuis, vermelhos e púrpuros). Essa coloração se deve à presença de substancias classificadas como flavonóides, que são metabólitos secundários produzidos pelas plantas que atuam nos vegetais com ação fotoprotetora e antioxidante (SCATENA; NUNES, 1996; TAIZ; ZEIGER, 2013). Thompson et al. (2007), trabalhando com a germinação de várias espécies de Disa, uma orquídea terrestre, observaram que o stress osmótico foi mais pronunciado em meios com maior concentração de sacarose, isso foi revelado pelo acúmulo de antocianinas nas folhas, com eventual morte das plantas. Segundo Lee et al. (1987), as antocianinas possivelmente estão associadas ao movimento de açúcares das folhas para outras partes da planta. A indução da embriogênese somática em plantas é uma técnica amplamente difundida e utilizada na propagação de diversos espécimes, porém a embriogênese normalmente é obtida com a adição de reguladores vegetais ao meio de cultura (REZENDE et al., 2011; ULISSES et al., 2016; FERREIRA et al., 2017). A obtenção dessas estruturas de forma espontânea reduz os custos de produção, pois os reguladores vegetais são caros. Neste estudo não houve o uso de reguladores vegetais no meio de cultura, tal como para Catasetum fimbriatum, sendo alcançadas taxas significativas de geração de corpos semelhantes a protocormos (PERES; KERBAUY, 1999). A presença de calos primários e secundários foi observada ao longo do meristema radicular nos dois ambientes de cultivo (Figura 2B), chegando a 20% no tratamento que continha 30g L-1 de sacarose em sala de crescimento.
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Análise histológica dos calos obtidos na multiplicação fotoautotrofica
Os explantes de C. aliciae cultivados in vitro foram seccionados em corte transversal em região não calogênica (Figura 3A – Seta 1). Neste corte, foi possível identificar mais externamente a epiderme (Ep), formada por uma camada de células, seguida pelo parênquima cortical (Pc), que é formado por células parenquimáticas, e mais internamente, o cilindro vascular (Cv), que compreende muitos pólos de xilema primário que se intercalam na periferia com o floema primário, evidenciando uma raiz poliarca, deixando células parenquimáticas medulares ao centro (Figura 3B). A análise histológica possibilitou a observação da desdiferenciação de células do sistema radicular em embrião somático (Figura 3C-E). A análise dos cortes evidenciou agrupamentos de células indiferenciadas em calos primários (Cp) (3D) originados do sistema radicular em calos secundários (Figura 3D) originados a partir do calo primário, com a presença de células em constante divisão na periferia das estruturas. A formação de calos com posterior ocorrência de embriogênese pode promover a formação de uma grande quantidade de mudas nessa espécie, o que é um excelente resultado visto que a indução à formação direta de brotos por meristemas da parte aérea não foi muito eficiente. O aspecto geral da formação calosa originada de células somáticas do meristema radicular, a partir do corte realizado na altura da seta dois (Figura 3A), evidenciou a desdiferenciação máxima(C), das células do parênquima cortical (Figura 3C) retomando a atividade meristemática que pode ser identificada nos centros de grande atividade mitótica (regiões com núcleos corados mais intensamente em azul. Em algumas regiões essas células meristemáticas desdiferenciadas, formaram embriões somáticos (Figuras 3D-E). Na Figura 3D, evidencia-se uma formação calosa secundária (Cs), formada a partir do calo primário (Cp), indicando um embrião em tradicional formato globular (Figura 3D - Eg).
Nos embriões derivados do calo por embriogênese indireta, é possível observar os primórdios foliares (F) e o meristema apical (Ma), com grande atividade mitótica (Figura 3E). Estes embriões diferenciaram-se em corpos semelhantes a protocormos ao longo do tempo (Figuras 3D-3E). Durante os estágios iniciais da formação de protocormos na micropropagação, as células apresentam características citológicas e marcadores de parede celular semelhantes ao desenvolvimento do embrião zigótico, caracterizando os protocormos gerados pela micropropagação como os embriões somáticos de orquídeas (LEE et al., 2013). 39
A competência de um calo para formar embriões está intrinsicamente relacionada com a sua origem. Em Oncidium (Orchidaceae), a capacidade calos derivados da ponta de raízes em formar embriões foi maior do que a de calos derivados de hastes e de folhas. Esta alta capacidade de regeneração pode ser devida à origem do calo das células meristemáticas das pontas das raízes (CHEN; CHANG; 2000; 2005).
A conversão de meristemas radiculares em corpos semelhantes a protocormos também é comum em algumas espécies da tribo Cymbidieae, como demonstrado por Peres e Kerbauy (1999) para Catasetum fimbriatum Lindl., e por Guo et al. (2010) para Cyrtopodium paranaense Schltr. Trabalhando em ambiente controlado, Rodrigues (2008) e Pedroso-de-Moraes e colaboradores (2014), observaram a embriogênese pela conversão de ápices radiculares em novas plantas de Catasetum fimbriatum Lindl. quando inoculados em meio modificado Vacin & Went (1949) e de Catasetum rooseveltianum Hoehne em meio simplificado contendo fertilizante e água de coco, respectivamente. Esses autores não observaram a desdiferenciação dos tecidos em estádio de calo, o que demonstra que obtiveram a embriogênese direta e não a indireta como observado no presente trabalho.
Este foi o primeiro estudo a demonstrar que calos derivados de segmentos de raízes de C. aliceae são capazes de formar embriões somáticos em meio MS na ausência de reguladores vegetais.
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A B
Figura 2 – Cultivo in vitro de Cyrtopodium aliciae. A – Cultivo em 15g/L-1 em luz artificial; e B - Cultivo em 30g/L-1 em luz natural. Escala = 1cm Foto: Gustavo Surlo Nascimento e Izabela Ruas. 41
Figura 3- Cortes transversais da raiz e ESMRs em Cyrtopodium aliciae. A – C. aliciae in vitro cultivada em 30g/L-1 em luz natural; B – Corte transversal da raiz realizado na altura da seta 1; C – Corte transversal da raiz e formação calosa realizado na altura da seta 2; D – Corte longitudinal da raiz e formação calosa realizado na altura da seta 2 evidenciando embrião somático globular; E - Embrião somático derivado do calo por embriogênese indireta. Cv = Cilindro vascular; Pc = Parênquima cortical; Ep = Epiderme; C = Massa calosa; Cp = Calo primário; Cs = Calo secundário; Eg = embrião globular Es = Embrião somático; Ma = Meristema apical; F = Primórdio foliar. Escala: A = 1 cm; B = 100µm; C, D e E = 200µm. Fotos: Izabela Ruas. 42
CONCLUSÕES
• O regime de cultivo em sala de crescimento, sob a vedação de algodão, diminui a contaminação e aumenta a sobrevivência dos explantes e a adição de sacarose no meio de cultura eleva a taxa de brotação no cultivo in vitro. • Cyrtopodium aliciae é uma espécie responsiva para embriogênese somática indireta. • A obtenção de calos com potencial embriogênico nas raízes de C. alicie utilizando meio MS líquido, sem a adição de reguladores de crescimento vegetal, constitui um grande avanço, tanto por possibilitar a obtenção de grande número de embriões somáticos, quanto por promover a redução de custos no cultivo in vitro. • Estudos posteriores, para avaliação do percentual de conversão dos embriões somáticos obtidos em plantas sadias são necessários, assim como para a avaliação da sua estabilidade genética. 43
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CAPÍTULO 2
Estabelecimento in vitro e análise da fidelidade genética na micropropagação de Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb. f. ex R. Warner (Orchidaceae)
50
RESUMO
Cattleya é um gênero da família Orquidaceae com elevado potencial ornamental, cujas populações vêm sendo reduzidas pela perda de habitat e predação antrópica. As técnicas de cultivo in vitro têm sido amplamente utilizadas a fim de permitir uma rápida multiplicação em curto espaço de tempo, entretanto o material vegetal acondicionado in vitro por longos períodos pode apresentar variações no seu genoma. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram estabelecer protocolos para a germinação e o estabelecimento, a micropropagação e a fidelidade genética de brotos após a regeneração de C. amethystoglossa. Os meios contendo carvão ativado apresentaram as melhores taxas de germinação para todas as espécies, diferindo apenas a concentração salina, MS/2 para C. amethystoglossa. Para o crescimento lento de C. amethystoglossa, se recomenda utilizar meio MS sem sacarose, acrescido de carvão ativado. A influência que diferentes tipos de explantes (plantas com 1 ou 0,3 cm) sofrem em concentrações variadas de reguladores vegetais foi analisada. Os explantes com 0,3 cm submetidas ao tratamento composto por 0,537 µM de ANA associado a 4,440 µM de BAP foram mais eficientes para obtenção de brotos, com uma média de 3,41 brotos por explante, e selecionados para multiplicação e avaliação da estabilidade genética. O perfil genético de 12 plantas mãe e 3 gerações clonais subsequentes foi comparado por meio de marcadores ISSR. Os 11 primers utilizados produziram 92 loci com boa resolução, totalizando uma média de 8,4 loci por primer. Não foi observada variação entre as plantas mães analisadas e suas respectivas gerações clonais, indicando que a multiplicação in vitro de C. amethystoglossa em meio de cultivo meio MS/2 a 1,5% de sacarose, suplementado com 2 g L-1 de carvão ativado, acrescido de 0,537 µM de ANA e 4,44 µM de BAP, é geneticamente estável até a 3ª geração de subcultura e pode ser utilizada para fins comerciais.
Palavras-chave: ANA. BAP. ISSR. Multiplicação in vitro. Regulador vegetal. Variação somaclonal. 51
2.1 INTRODUÇÃO
Orchidaceae é a segunda maior família de plantas encontrada no Brasil, e uma das maiores dentre as Angiospermas (DRESSLER, 1993; ABREU et al., 2015; CHASE et al., 2015). É considerada a família mais importante da Mata Atlântica. Entre os 219 gêneros que ocorrem no Brasil, Cattleya é um dos mais diversos, com 102 espécies, das quais 95 são endêmicas (ABREU et al., 2015; BARROS et al., 2019). Devido ao elevado valor ornamental, inúmeros exemplares têm sido coletados indiscriminadamente na natureza, e essa prática pode levar ao desaparecimento de várias espécies (CRUZ et al., 2003).
A Mata Atlântica é um bioma extremamente degradado, os estados brasileiros possuem menos de 30% da sua área florestal conservada (FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA, 2017), e essa perda de habitat constitui uma das principais ameaças às populações de orquídeas. Dentre as espécies brasileiras que ocorrem na Mata Atlântica, Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex R. Warner, apresenta diferentes estágios de conservação das suas populações, na qual C. amethystoglossa é descrita como quase ameaçada a extinção (IUCN, 2016).
A cultura de tecidos permite a multiplicação in vitro de espécies em perigo ou ameaçadas de extinção, e assim obter um grande número de mudas em um curto espaço de tempo, constituindo uma importante aliada na redução da extração clandestina das espécies do seu habitat natural (GALDINIANO-JÚNIOR, 2013). As orquídeas são comercializadas como plantas ornamentais atingindo vários tipos de consumidores (HINSLEY et al., 2018), se estima que as orquídeas compreendam cerca de 10% do comércio internacional de flores, sendoresponsáveis por uma grande parte do comércio mundial de floricultura, , movimentando cerca de 483 milhões de dólares entre 2007 e 2012 (DE et al., 2015).
O crescimento e a morfogênese de células e tecidos in vitro são regulados pela interação e pelo balanço entre as substâncias adicionadas ao meio de cultura e por aquelas produzidas de forma endógena nas células (CHAPLA et al., 2009). As técnicas de cultura em meio nutritivo, em condições assépticas de células, tecidos ou órgãos de planta, sob condições controladas de luminosidade e temperatura, auxiliam na recuperação de plantas livres de vírus e outros agentes causadores de doenças (TORRES et al., 2000). Os meios nutritivos fornecem as substâncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos in vitro, e são elaborados com base nas exigências das plantas, quanto aos nutrientes e minerais, com algumas modificações para atender a necessidades específicas (TORRES et al, 1998). Um dos componentes que podem ser adicionados ao meio de cultura é o carvão ativado, pode ter efeito benéfico, ou não, para o 52
desenvolvimento das plantas, absorvendo compostos fenólicos, estimulando o crescimento de raízes, e adsorvendo substâncias presentes no meio de cultura (MORAES et al., 2005). Além disso, vale ressaltar que os estudos nesta área, para a família Orchidaceae, não representam um risco para as populações in situ, uma vez que não é necessária a coleta de todo o indivíduo, apenas das cápsulas, que contem milhares e até milhões de sementes (FRANCO, 1942; ARDITTI, 1961).
As sementes das orquídeas são muito pequenas, podendo variar de 280 µm (Dendrobium parisii Rchb.f.) a 830 µm (Cattleya bowringiana Veitch) de comprimento (BUYUN, 2004), e não contêm endosperma, consistindo em pequenos embriões globulares compostos por poucas células e uma pequena reserva de lipídios e proteínas. Apresentam padrão uniforme de germinação e desenvolvimento, começando com a embebição das sementes, que leva à ruptura da testa, e a posterior liberação do embrião e formação de uma estrutura tuberiforme chamada protocormo (HOSSOMI et al., 2012). É comum a formação de sementes sem embriões ou com baixa viabilidade, sendo necessária a avaliação da qualidade fisiológica das sementes antes de serem armazenadas (HOSSOMI et al., 2012). Para conservação das plantas in vitro, existem três categorias que podem ser divididas em curto prazo (cultura in vitro), médio prazo (crescimento lento) e longo prazo (criopreservação) (CHA-UM; KIRDMANCE, 2007). O crescimento lento visa preservar o material genético em ótimo estado por um período médio de tempo sem que seja necessária a transferência das plântulas para um meio de cultura fresco. Essa técnica representa uma maneira alternativa de conservar os recursos genéticos das plantas para o uso sustentável, especialmente para plantas tropicais recalcitrantes. Ajustes nos fatores químicos do meio de cultura, tais como regulação da concentração de carboidratos para reduzir o potencial osmótico do meio, e nos fatores físicos do ambiente de cultivo podem reduzir o crescimento das plantas, aumentando o período de armazenamento dos bancos de germoplasma (GROUT, 1991; CHA-UM; KIRDMANCE, 2007). A adição de reguladores vegetais, como a auxina e citocinina, nos meios de cultura com a finalidade de aumentar a produção do número de brotos, é amplamente utilizada na micropropagação (FEHER et al., 2003) Durante a multiplicação in vitro, os reguladores vegetais, o ambiente e tempo de cultivo dentre outros fatores, podem induzir a formação de plantas morfológica e geneticamente diferentes da planta mãe (KUMAR; REDDY, 2011). A variação somaclonal pode ser definida como a variação encontrada em plantas derivadas da cultura de tecidos vegetais (LARKIN e SCOWCROFT, 1981), que podem ser facilmente 53
detectadas através do uso de marcadores moleculares (ZABICKI et al., 2019) e deve ser minimizada quando a propagação in vitro tem a finalidade de produzir plantas para fins de conservação, reintrodução e comercial.
O Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) é um marcador dominante baseado em reação em cadeia da polimerase (PCR), que envolve a amplificação de segmentos do ácido desoxirribonucleico (DNA) presente em uma distância amplificável entre duas regiões de repetição de microssatélites idênticas e orientadas em direções opostas (REDDY et al., 2002). Esse marcador tem sido frequentemente utilizado para a análise da fidelidade genética de plantas regeneradas in vitro, em virtude da fácil reprodução, de ser um método simples, da rapidez, e de necessitar de pequenas quantidades de DNA (BHATIA et al., 2011; LIU et al., 2011).
Os marcadores ISSR vem sendo amplamente utilizados em estudos de diversidade e estrutura genética de muitas espécies, porque em comparação com outros marcadores, apresentam alta reprodutibilidade e polimorfismo, são mais estáveis, eficientes, simples, fáceis de trabalhar e é uma técnica poderosa, pois permite diferenciar a variabilidade entre indivíduos estritamente relacionados (REDDY et al., 2002; VIANA, 2013; ARRIGONI-BLANK et al., 2016).
Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram estabelecer protocolos de germinação, da micropropagação e da fidelidade genética de brotos após a regeneração de C. amethystoglossa.
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi desenvolvido nos Laboratórios de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV), e de Genética e Evolução de Vegetal (LAGEV) do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia.
54
Material vegetal
Cápsulas de C. amethystoglossa coletadas no município de Porto Seguro – BA, todas de exemplares de coleção particular, foram armazenadas em sacos de papel em geladeira (entre 6 e 10ºC) e utilizadas como material vegetal inicial neste trabalho.
Germinação in vitro de C. amethystoglossa
Para o estabelecimento in vitro da espécie foi promovida a germinação das sementes. A desinfestação das cápsulas foi realizada com detergente neutro em água corrente e posteriormente imersa por 5 minutos em álcool 70% em mesa agitadora, 20 min em hipoclorito de sódio a 2,5% + água destilada (1:1) por 20 minutos em mesa agitadora. Em seguida, as cápsulas foram levadas para o fluxo laminar e lavadas com água estéril (3x), sendo abertas para retirada das sementes.
Cinco gramas de sementes foram suspensas em 50 mL de água destilada autoclavada, formando uma suspensão da qual foram inoculados 500 µL/placa em placas de Petri contendo 50 mL de meio de cultura. O meio nutritivo Murashige & Skoog (1962) – MS foi utilizado como substrato de germinação, em sua composição completa (MS), com metade das concentrações salinas (MS/2), e com um quarto da concentração salina (MS/4). Os meios foram testados em ausência e presença de carvão ativado (2 g L-1), suplementados com 15 g L-1 de sacarose, e gelificados com 7 g L-1 de ágar. Os meios tiveram pH ajustado para 5.7 ± 1 e foram esterilizados em autoclave, a 121°C por 15 minutos. Os experimentos foram mantidos sob temperatura de 25 ± 2°C, luz fluorescente (60µmol-2 s-1) e fotoperíodo de 16 horas/luz.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com arranjo fatorial 3 X 2 (meio nutritivo X carvão ativado), contendo cinco repetições de quatro amostras cada. Cada amostra apresentou aproximadamente 4.280 sementes. O número de sementes inoculadas em cada unidade amostral foi estimado a partir da contagem, em lupa de mesa, de 3 alíquotas de 500µL da solução de sementes.
Decorridos 60 dias do início do experimento, o número de sementes germinadas foi avaliado considerando-se germinadas as sementes com embrião intumescido e clorofilado, que apresentavam o estágio globular, com desenvolvimento e aumento de tamanho.
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Crescimento in vitro de C. amethystoglossa
Sete concentrações de sacarose foram testadas, 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 g L-1. O meio nutritivo utilizado foi o MS acrescido de 1% de Inositol, 1% de Solução F e 2% de carvão ativado, gelificado com 5g de ágar, sem adição de reguladores vegetais e autoclavado por 15 min a 121°C. O experimento foi montado em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio de cultura. As culturas foram mantidas durante 365 dias em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, intensidade luminosa de 60 µmol m-2 s-1 e temperatura de 25 ± 2°C.
Em cada unidade amostral foi inoculado um protocormo com dois folíolos (aproximadamente 0,2mm). Após 365 dias, o experimento foi avaliado considerando as seguintes variáveis: sobrevivência (%), número de brotos (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea em cm (CPA), número de raízes (NR), comprimento da maior raíz em cm (CMR) e percentual de plantas com alteração na coloração da parte aérea (%).
Multiplicação de C. amethystoglossa
Plantas de C. amethystoglossa procedentes de germinação in vitro, cultivadas em meio MS com metade das concentrações salinas (MS/2), a 15 g L-1 de sacarose, suplementado com 2 g L-1 de carvão ativado, foram utilizados como material vegetal inicial. Os experimentos de cultivo in vitro foram mantidos sob temperatura de 25 ± 2°C, luz fluorescente (60µmol-2 s-1) e fotoperíodo de 16 horas/luz.
Foram testados dois tipos de explantes, plantas in vitro com aproximadamente 1 cm de comprimento da parte área (E1) e plantas in vitro com 0,3 cm de comprimento da parte aérea (E2). Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio nutritivo MS/2 a 1,5% de sacarose, suplementado com 2 g L-1 de carvão ativado contendo diferentes combinações de reguladores vegetais. Foram utilizados os reguladores ácido naftalenoacético (ANA) nas concentrações 0,00; 0,537; 10,740 e 21,480 µM e 6- benzilaminopurina (BAP), nas concentrações 0,00; 4,44; 8,880 e 17,760µM. O meio nutritivo foi gelificado com 7 g L-1 ágar, o pH foi ajustado para 5,7 ± 1 e a esterilização foi realizada em autoclave, a 121°C por 15 minutos. 56
O delineamento foi inteiramente casualizado, com arranjo fatorial de 2 X 4 X 4 (tipo de explante X concentrações de ANA X concentrações de BAP) e contendo sete repetições com dez amostras cada. Após 160 dias foram avaliados os parâmetros sobrevivência (%), número de brotos, contaminação (%), percentual de explantes que formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea (%), explantes que formaram calos (%), número de raízes, número de folhas, comprimento da maior raiz (cm) e comprimento da maior folha (cm).
Análise estatística dos experimentos de cultivo in vitro
Os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelos testes de Tukey ou Scott-Knott a 5% de probabilidade, no programa estatístico Sisvar 5.6 (FERREIRA, 2011).
Análise da fidelidade genética de brotos de C. amethystoglossa via marcadores ISSR
Para a análise da fidelidade genética foi selecionado o explante E2. A propagação in vitro foi realizada em meio MS/2 a 15 g L-1 de sacarose, suplementado com 2 g L-1 de carvão ativado, acrescido de 0,537 µM de ANA com 4,44 µM de BAP, a fim de analisar o efeito dos reguladores vegetais sobre a estabilidade genética de C. amethystoglossa ao longo de três gerações de cultivo in vitro.
O DNA foi extraído a partir de folhas e de raízes, utilizando o protocolo de brometo cetiltrimetil-amônio 2% (CTAB) de Doyle & Doyle (1987) adaptado para microtubos. O DNA extraído foi quantificado em espectrofotômetro L-Quant, corado com GelRed® e analisado por meio de eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE 1X, e visualizado sobre luz ultravioleta.
As amplificações foram realizadas através da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os marcadores moleculares ISSR, em um volume final de 20 µL, contendo tampão de reação 1X, 2,5mM de MgCl2, 0,5mM de primer, 0,2mM dNTPs, 0,75 U de Taq DNA polimerase, água ultrapura e 1 μL de DNA template. Um controle negativo foi adicionado a fim de verificar a ausência de contaminação. Foram testados 20 primers ISSR descritos por Wolfe 57
et al. (1998), em uma amostra composta por quatro indivíduos estabelecidos in vitro, escolhidos aleatoriamente, em diferentes temperaturas de anelamento (44ºC, 45ºC, 46ºC e 47ºC).
Após a padronização das temperaturas de anelamento, foram selecionados para análise os primers BECKY, GOOFY, JOHN, 814, 898, 899, MAO, AW3, DAT, M1 e M2. A amplificação dos fragmentos se iniciou com um ciclo de desnaturação inicial de 94ºC por 4 minutos, seguido de 37 ciclos que consistiram de três etapas: desnaturação a 94ºC por 1 min., anelamento dos primers a 44°C (GOOFY e M1), 45°C (814, 898, 899, MAO, AW3 e M2), 46°C (DAT) ou 47°C (BECKY e JOHN) por 1 min., e extensão a 72ºC por 2 min. Por fim, foi realizado um ciclo final de 72ºC por 5 min.
Após a amplificação, os produtos de ISSR foram corados com GelRed®, separados por meio de eletroforese 2% em tampão TAE 1X, e os géis foram fotodocumentados com software L-PIX IMAGE EX 1.0.0 em transluminador de luz UV.
Análise de dados de ISSR
O perfil genético dos indivíduos foi determinado através da análise comparativa do perfil de bandas das plantas mãe e suas respectivas gerações clonais, para cada primer utilizado. Este perfil foi convertido em uma matriz presença e ausência de bandas (0 e 1) utilizada para as análises genéticas. A similaridade genética entre as plantas matrizes e seus respectivos brotos foi estimada por meio do índice de similaridade de Jaccard (JACCARD, 1908) e utilizada para análise de agrupamento pelo algoritmo UPGMA no programa Past 3.1 (HAMMER et al., 2001).
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Germinação in vitro de C. amethystoglossa
A desinfestação das cápsulas foi eficiente para a espécie estudada, pois não houve contaminação das unidades amostrais. A germinação das sementes iniciou a partir do 20º dia de inoculação, para C. amethystoglossa, quando a coloração inicial creme mudou para verde. As sementes foram consideradas germinadas quando apresentavam formato de protocormo na coloração verde. Para todos os tratamentos, durante a germinação, inicialmente todas as 58
sementes germinadas apresentaram a coloração verde. Diferente do que foi observado nesse experimento, Buyund et al. (2004), quando realizaram a germinação de Cattleya aclandiae Lindl., Cattleya bowringiana, Cattleya granulosa Lindl., Cattleya percivaliana (Rchb.f.) O’Brien, Cattleyopsis lindenii (Lindl.) Cogn. e Dendrobium parishii, observaram que a coloração dos protocormos variou de branco no início da germinação para verde claro com o tempo. Após 35 dias de cultivo, parte dos protocormos de C. amethystoglossa, perderam a sua coloração esverdeada, apresentando coloração esbranquiçada e interrompendo o desenvolvimento das plantas. Ao final de 60 dias de germinação (Figura 1), os protocormos que mantiveram a coloração esverdeada apresentaram dois estados. No primeiro estado, os protocormos se mantiveram na fase esférica inicial e no segundo estado, se desenvolveram em plantas normais.
Os resultados do teste de germinação realizado para a espécie de Cattleya são apresentados na Tabela 1. A concentração de sais do meio de cultura não interferiu na germinação. Para C. amethystoglossa os meios contendo carvão ativado apresentaram as maiores porcentagens de germinação.
Os maiores valores para a germinação foram observados na presença de carvão para C. amethystoglossa demonstram que essa substância favorece a germinação da espécie. Segundo Paiva e Paiva (2001), o carvão ativado adsorve produtos provenientes do metabolismo, bem como substâncias hormonais e vitaminas do meio de cultura, sendo utilizado para eliminar substâncias tóxicas produzidas pelo explante in vitro. Nos tratamentos em ausência de carvão, a germinação observada para ambas espécies foi de no máximo 27,6%, no tratamento com metade das concentrações salinas.
Resultados semelhantes foram observados por Viana (2013), que obteve germinação média de 40,7% para Cattleya elongata Barb. Rodr. independentemente da concentração salina do meio e da presença de carvão. Já Cattleya forbesii Lindl., quando cultivada na presença de carvão ativado, apresentou 90% de germinação em meio MS, entretanto na ausência de carvão ativado a germinação foi de apenas 45% (SCHNEIDERS et al., 2012). Na germinação de Cattleya tigrina em meio Knudson C sem adição de carvão ativado, Hossomi et al. (2012) obtiveram 100% das sementes germinadas quando embeberam as sementes, antes da inoculação, em uma solução de sacarose a 10%.
59
Tabela 1 - Valores médios para germinação (%) de Cattleya amethystoglossa, em função de diferentes concentrações salinas do meio nutritivo (MS, MS/2, MS/4 na presença (CC) (2g L-1) ou ausência (SC) de carvão ativado.
Cattleya amethystoglossa
CC SC MS 42,6 aA 23,6 bA MS/2 48,0 aA 27,6 bA MS/4 40,0 aA 22,6 bA Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas linhas e letras maiúsculas nas colunas, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05).
A obtenção de cápsulas de boa qualidade fisiológica é essencial para a germinação in vitro de orquídeas e a maturação dos frutos é uma variável importante, eles não podem ser coletados muito verdes, pois as sementes podem não ter atingindo a maturidade (PARDO; FERREIRA, 2006). As sementes de orquídea tem pouca ou nenhuma reserva, e a germinação na natureza é dependente da associação com fungos micorrízicos, pois as sementes de orquídeas não apresentam endosperma, as únicas substâncias de reserva contidas no embrião são gotículas de lipídios e uma pequena quantidade de proteína (SUZUKI et al., 2009, HOSSOMI et al., 2012).
Crescimento in vitro de C. amethystoglossa
A utilização da sacarose como regulador osmótico e fonte de carbono apresentou influência significativa no crescimento lento de C. amethystoglossa. Foram avaliados sete tratamentos, contendo 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 g L-1de sacarose. Os estão apresentados na Tabela 2.
60
Tabela 2 – Valores médios para a sobrevivência (S) (%), número de brotos (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA) (cm), número de raízes (NR), comprimento da maior raiz (CMR) (cm) e percentual de explantes que formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea (COR) (%) de Cattleya amethystoglossa cultivadas em meio MS suplementado com diferentes concentrações de sacarose (0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90g.L-1) após 360 dias de cultivo in vitro.
SACAROSE S NB NF CPA NR CMR COR
0 97,14 b 2,03 b 4,63 b 0,63 c 0,11 c 0,03 c 2,86 a
15 100 a 2,51 a 11,80 a 0,76 b 1,45 b 0,46 b 11,43 a
30 100 a 2,51 a 11,00 a 0,87 a 3,00 a 0,86 a 31,43 b
45 100 a 3,50 a 10,66 a 0,71 c 2,14 a 0,44 b 14,28 a
60 97,14 b 2,80 a 10,26 a 0,62 c 2,43 a 0,30 b 5,71 a
75 97,14 b 1,71 b 5,15 b 0,40 d 0,77 c 0,18 c 0 a
90 77,14 c 1,40 b 4,63 b 0,33 d 1,43 b 0,14 c 0 a
Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas colunas, não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p>0,05).
A concentração de sacarose interferiu significativamente em todas as variáveis analisadas. Foi observada uma alta taxa de sobrevivência em todos os tratamentos, ≥ 97,14%, exceto para o tratamento contendo 90g L-1 de sacarose (77,14%). Nos tratamentos contendo 15, 30 e 45 g L-1de sacarose, 100% das plantas sobreviveram, diferindo significativamente dos demais. Em experimento com Melocactus glaucescens e Melocactus paucispinus foi observada 100% de sobrevivência dos explantes mantidos em ancimidol e sacarose após 180 dias de cultivo in vitro (RESENDE, 2010). Porém, os tratamentos em ausência de sacarose, e na presença de 60 e 75 g L-1 de sacarose obtiveram 97,14% de sobrevivência, um índice muito próximo ao dos melhores tratamentos. Diferente do observado para C. amethystoglossa, para a 61
orquídea Caularthron bicornutum Raf. cultivada por 7 meses em meio MS/2, sem carvão ativado, a sobrevivência das plantas foi inferior a 50% em todos os tratamentos (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg L-1 de sacarose) (PIVETTA et al., 2010).
O tratamento contendo 45 g L-1 de sacarose apresentou o maior número de brotos (NB), 3,50 brotos por explante, não diferindo significativamente dos tratamentos contendo 15, 30, e 60 g L-1 de sacarose. Quando cultivado por seis meses em meio MS/2, com concentração de 30 g L-1 de sacarose, Epidendrum chlorocorymbos Schltr. apresentou uma média de 21 brotos por explante, número maior do que o observado no presente estudo (LOPEZ-PUC, 2013). Entretanto, o número de brotos para C. granulosa mantida em meio MS, sem carvão ativado e na ausência de sacarose, após 6 meses de cultivo, foi baixo, tendo apenas 1 broto por explante (PINTO et al., 2010).
Para a variável número de folhas (NF) os tratamentos contendo 15, 30, 45, e 60 g L-1 de sacarose não diferiram significativamente entre si, apresentando uma média que variou entre 10,26 e 11,80 folhas por explante. Os tratamentos que continham 0, 60 e 75 g L-1 de sacarose, apresentaram menor número de folhas, variando entre 4,63 e 5,15 folhas por explante. Diferentemente do observado no presente experimento, C. bicornutum apresentou apenas 2,95 folhas, em média, no cultivo em 30 L-1 de sacarose (PIVETTA et al., 2010). Já E. chlorocorymbos, cultivado em meio com 30 g L-1 de sacarose, produziu 53 folhas por explante (LOPEZ-PUC, 2013). Para C. granulosa, em 45 g L-1 de sacarose o número médio de folhas obtido foi bem próximo (10 folhas por explante) aos encontrados para C. amethystoglossa. Em ausência de sacarose foi observada uma média de 5 folhas por explante de C. granulosa (PINTO et al., 2010), resultado também similar ao obtido para C. amethystoglossa.
A maior média para comprimento da parte aérea (CPA), foi observada na concentração de 30 g L-1 de sacarose, com 0,87 cm de comprimento, diferindo significativamente dos demais tratamentos. Resende (2010) observou maior CPA nos tratamentos contendo 45 e 60 g L-1 de sacarose para M. paucispinus. O CPA ao longo de um ano não chegou a um centímetro em nenhum dos tratamentos, demonstrando que mesmo com a disponibilidade de sacarose no meio, o crescimento das plantas foi mínimo. Resultados similares foram observados para C. bicornutum, onde o comprimento da parte aérea não chegou a 1 cm para nenhum dos tratamentos após sete meses de cultivo (PIVETTA et al., 2010). Pinto et al. (2010) utilizaram explantes de 2 cm no cultivo de Cattleya granulosa, maiores do que os utilizados para no presente estudo (0,2 cm). Após algum tempo de cultivo na presença de 45 g L-1 de sacarose, os 62
explantes atingiram 3,5 cm, a taxa de crescimento foi proporcionalmente inferior à obtida para C. amethystoglossa. Já em ausência de sacarose, as plantas de C. granulosa apresentaram comprimento de 2,3 cm, e para C. amethystoglossa esse valor foi de 0,63 cm, ou seja, C. amethystoglossa apresentou proporcionalmente maior crescimento. Quando comparado ao tratamento controle (10,58 mm), foi observado que em todos os tratamentos houve redução do CPA para M. glaucescens, sendo o crescimento mais reduzido nas concentrações de sacarose de 90 e 105 g L-1 (5,79 mm e 5,25 mm respectivamente) (RESENDE, 2010).
O número de raízes (NR) foi superior nos tratamentos contendo 30, 45 e 60 g L-1 de sacarose, variando em uma média de 2,43 a 3 raízes por explante, com as menores médias apresentadas nos tratamentos contendo 0 e 75 g L-1 de sacarose, que não ultrapassaram a média de 0,77 raízes por explante. Quando em ausência de sacarose, Cattleya granulosa não apresentou o desenvolvimento de novas raízes (PINTO et al., 2010), resultados semelhantes foram obtidos para C. amethystoglossa, onde uma média de 0,11 raízes foi observada. Diferente padrão foi observado em C. bicornutum, que apresentou uma média de 1,6 raízes para todos os tratamentos, inclusive na ausência de sacarose (PIVETTA et al., 2010).
O comprimento da maior raíz (CMR) foi inferior a um centímetro em todos os tratamentos avaliados, com a maior média para o tratamento contendo 30 g L-1 de sacarose (0,86 centímetros). Para C. bicornutum, o maior comprimento das raízes (0,9 a 1 cm) se deu nos tratamentos contendo 10 e 20 g L-1 de sacarose (PIVETTA et al., 2010), sendo similar ao observado em C. amethystoglossa para 30 g L-1 de sacarose.
A alteração na coloração da parte aérea foi bastante pronunciada no tratamento contendo 30 g L-1 de sacarose, chegando a 3,43% das plantas, diferindo significativamente dos demais tratamentos. Os tratamentos com 75 e 90 g L-1 de sacarose não apresentaram alterações na coloração das folhas. Essa alteração que gera pigmentos azuis, vermelhos e púrpuros, pode ocorrer devido a necrose foliar, estiolamento, deficiência nutricional e ataque fúngico, que podem gerar o acúmulo de antocianinas (SCATENA; NUNES, 1996). A presença de flavonóides, metabólitos secundários produzidos pelas plantas, gera essa coloração que tem ação fotoprotetora e antioxidante (TAIZ; ZEIGER, 2013). As antocianinas, possivelmente, estão associadas ao movimento de açúcares das folhas para outras partes da planta (LEE et al., 1987). Thompson e colaboradores (2007), trabalhando com a germinação de várias espécies de orquídea terrestre do gênero Disa, observaram que o stress osmótico foi mais pronunciado em meios com maior concentração de sacarose, isso foi revelado pelo acúmulo de antocianinas nas 63
folhas, com eventual morte delas, diferente do que foi observado neste trabalho, onde as maiores concentrações de sacarose não apresentaram alteração na coloração da parte aérea O tratamento contendo 30 g L-1de sacarose foi o mais eficiente para o desenvolvimento das plantas de C. amethystoglossa para todas as variáveis, exceto alteração na coloração da parte aérea, o que não se mostrou prejudicial ao desenvolvimento das plantas. No entanto, o crescimento lento visa o menor número de subcultivos ao longo do tempo. Ao serem cultivados por um ano em diversos potenciais osmóticos, observou-se que em meio MS com carvão ativado e em ausência de sacarose, 97,14% dos explantes de C. amethystoglossa se mantiveram vivos com as menores taxas de desenvolvimento (demais variáveis) observadas, sendo assim, recomendado para o crescimento lento desta espécie.
Multiplicação de C. amethystoglossa
Explantes de C. amethystoglossa cultivados em meio MS/2 suplementados com diferentes concentrações de BAP e ANA não apresentaram interação tripla (explante x BAP x ANA) estatisticamente significativa para o número de raízes, número de folhas, comprimento da maior raiz (cm), comprimento da maior folha (cm) e percentual de explantes que formaram calos, após 160 dias de cultivo. Os resultados obtidos para as variáveis sobrevivência (%), número de brotos por explante, contaminação (%), e alteração na coloração em diferentes tipos de explantes submetidos a diferentes concentrações e combinações de BAP e ANA estão sumarizados na Tabela 3.
Para a variável sobrevivência, houve interação tripla significativa, entre BAP, ANA e o tipo de explante. A porcentagem de sobrevivência dos indivíduos em E1 variou de 17,14%, quando submetido a 4,440 µM de BAP e em ausência de ANA, a 97,14% dos indivíduos em presença da combinação de 17,760 µM de BAP com 10,740 µM de ANA, É possível observar que em alguns dos tratamentos nos quais houve taxas elevadas de contaminação (4,440 e 8,880 µM de BAP em ausência de ANA e 8,880 µM de BAP com 21,480 µM de ANA), a sobrevivência do E1 foi afetada, ficando abaixo de 29%. A sobrevivência do E2 foi significantemente superior, ou não diferiu estatisticamente do E1, na maioria dos tratamentos avaliados. A sobrevivência para o E2 variou de 77,14% (21,480 µM de ANA em ausência de BAP; 10,740 µM de ANA com 4,440 µM de BAP e 21,480 µM de ANA com 17,760 µM de BAP) a 94,28% (0,537 µM de ANA com 8,880 µM de BAP) dos indivíduos. As taxas de contaminação nos diversos tratamentos aos quais o E2 foi submetido não chegaram a 6%, fator que pode ter influenciado 64
Tabela 3 – Efeito de diferentes concentrações de BAP (µM) e ANA (µM) na micropropagação de C. amethystoglossa, para as variáveis sobrevivência (%), número de brotos por explante, contaminação (%) e percentual de explantes que formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea (%).
ANA
BAP E1 E2
0 0,537 10,740 21,480 0 0,537 10,740 21,480
SOBREVIVÊNCIA (%)
0 60,00bAa 74,28abABa 71,42abBb 85,71aABa 80 aAa 88,57aAa 91,42aAa 77,14aAa
4,440 17,14cBb 85,71abAa 65,71bBa 91,42aAa 82,85aAa 88,57aAa 77,14aAa 91,14aAa
8,880 14,28bBb 60,00aBb 71,42aBa 28,57bCb 88,57aAa 94,28aAa 85,71aAa 88,57aAa
17,760 60,00bAb 77,14abABa 97,1 aAa 62,85bBa 85,71aAa 91,42aAa 91,42aAa 77,14aAa
CONTAMINAÇÃO (%)
0 34,28bAb 0,00aAa 2,85aAa 100,0cBb 5,37aAa 0,00aAa 0,00aAa 0,00aAa
4,440 97,14cBb 0,00aAa 0,00aAa 80,0bAb 0,00aAa 0,00aAa 2,85aAa 0,00aAa
b a a b a a a a 8,880 100,0bB 0,00aA 0,00aA 100,0bB 2,85aA 0,00aA 0,0aA 0,00aA 17,760 25,71cAb 14,28bBb 0,00aAa 91,42dBb 0,00aAa 0,00aAa 2,85aAa 0,00aAa NÚMERO DE BROTOS
0 1,00aAb 1,40aAb 1,60aAa 0,97aAa 2,34aAa 2,34aBa 2,31aA a 0,91bAa 4,440 0,08bAb 1,94aAb 0,97aAa 1,14abAa 1,74bBa 3,41aAa 1,40bABa 1,14bAa
b a a b a a a a 8,880 0,14aA 1,22aA 1,05aA 0,28aA 2,14aA 1,51aB 1,48aAB 1,85aA 17,760 1,05aAb 1,54aAa 1,80aAa 0,82aAa 1,94aAa 2,11aBa 1,08aBa 1,37aAa ALTERAÇÃO NA COLORAÇÃO (%)
0 0,00aAa 11,42aAa 0,00aAa 37,14bBb 0,00aAa 0,00aAa 0,00aAa 0,00aAa 4,440 0,00aAa 5,71aAa 0,00aAa 34,28bBa 0,00aAa 8,57abAa 0,00aAa 22,85bBa
a a a a a a a a 8,880 2,85aA 2,85aA 5,71aA 0,00aA 0,00aA 0,00aA 0,00aA 0,00aA 17,760 5,71aAa 5,71aAa 5,71aAa 14,28aAb 0,00aAa 0,00aAa 5,71aAa 0,00aAa
Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas linhas, para cada tipo de explante, maiúsculas nas colunas e sobrescritas para comparação entre os tipos de explantes submetidos às mesmas concentrações de BAP e ANA, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05). 65
no sucesso desse explante. Para a micropropagação de Cattleya elongata Viana (2013) observou que explantes com aproximadamente 1 cm de comprimento, apresentaram melhores respostas para a sobrevivência, quando comparados com explantes com 0,3 cm seccionados na porção superior e explantes radiculares (sem folhas, apenas raízes), que não diferiram significativamente entre os tratamentos de ANA e BAP avaliados.
As combinações de concentrações de auxinas, citocininas e o tipo de explante influenciaram no número de brotos gerados em cada tratamento. Ao analisar o tipo de explante, é possível observar que E2 foi superior ou não diferiu significativamente do E1, com destaque principalmente para o tratamento que combina 0,537 µM de ANA com 4,440 µM de BAP, no qual a média foi superior a 3 brotos por explante. O tipo de explante escolhido pode resultar em diferentes respostas para a micropropagação. Na multiplicação do híbrido de orquídea, Aerides vandarum Rchb.f. x Vanda stangeana Rchb.f., por Kishor e Devi (2009), a média de número de brotos, 15,8 por explante, foi obtida quando 2 mg L-1 de TDZ foi acrescido ao meio de cultura, e a associação de 1 mg L-1 de ANA e 1 mg L-1 de BAP não foi tão eficiente nesse caso, apresentando uma média de 2,4 brotos por explante, resultado semelhante ao observado no presente trabalho.
Alguns explantes formaram plantas com alteração na coloração da parte aérea, de verde para roxo, ocorrendo em maior porcentagem em E1, chegando a 37,14% dos explantes no tratamento com 21,480 µM de ANA em ausência de BAP. Os dados na literatura ainda são bastante escassos para explicar as causas dessa alteração na coloração das folhas in vitro, mas, como citado anteriormente, as principais causas apontadas são o acúmulo de antocianinas nos tecidos, necrose foliar, estiolamento, deficiência nutricional e ataque fúngico (SCATENA; NUNES, 1996). A contaminação pode ser uma das possíveis causas para a alteração na coloração das folhas nesse trabalho, principalmente em E1, em que foram encontradas altas taxas de infestação por fungos. Porém essa alteração também foi observada em tratamentos nos quais não houve contaminação.
Considerando que o E2 cultivado em meio suplementado com 0,537 µM de ANA associado a 4,440 µM de BAP apresentou a melhor taxa de brotação e que o percentual de sobrevivência dos explantes submetidos a essa condição não diferiu estatisticamente do tratamento que apresentou maior percentual de sobrevivência (0,537 µM de ANA associado a 8,880 µM de BAP), nem apresentou alteração na coloração significativamente superior a outros tratamentos, recomenda-se a utilização de meio MS/2 com 1,5% de sacarose, 2 g L-1 de carvão 66
ativado e suplementado com 0,537 µM de ANA associado a 4,440 µM de BAP para a multiplicação in vitro de C. amethystoglossa. Por isso, esse tratamento foi selecionado para os experimentos de multiplicação ao longo das gerações com análise da fidelidade genética.
Estabilidade Genética
O DNA de doze plantas mãe (M1 a M12) e seus respectivos brotos foi amplificado com os 11 primers selecionados e produziu 92 loci com boa resolução. O número de loci por primer variou entre 5 (primer MAO) e 11 (primers AW3 e 899), com uma média de 8,36 loci/primer. O tamanho dos fragmentos variou entre 400 e 1500 pares de bases (pb). Apesar do grande número de loci analisados não houve variações no perfil dos marcadores ISSR observado entre os brotos gerados in vitro e suas respectivas plantas mãe (Figura 2), para todos os primers utilizados, ou seja, não foi detectada variação somaclonal entre os brotos regenerados de C. amethystoglossa obtidos in vitro. Os brotos originados a partir da mesma planta mãe foram mais similares entre si e com a sua planta mãe do que com os outros brotos e suas respectivas plantas mãe (Figura 3).
A variação somaclonal constitui a variação genética ou epigenética observada nas plantas regeneradas da cultura de tecidos de qualquer tecido vegetal (CHEN; CHEN, 2007). Este tipo de alteração não é desejado para plantas obtidas in vitro para fins comerciais e a utilização de reguladores de crescimento vegetais pode aumentar a probabilidade de ocorrer esse tipo de variação entre os regenerantes (LARKIN; SCOWCROFT, 1981). Desta forma, é necessário avaliar se os regenerantes produzidos são idênticos geneticamente às suas respectivas plantas mãe e, por este motivo, três ciclos de cultivo in vitro foram avaliados neste estudo. Os mecanismos que levam a estas variações durante a cultura de tecidos ainda são em grande parte desconhecidos, mas processos de metilação do DNA, ativação de elementos transponíveis ou retrotransposons e modificações de histonas já foram relacionados entre as causas prováveis (PESCHKE; PHILLIPS, 1992; HIROSHIKA et al., 1996; VALLEDOR et al., 2007; CHEN; CHEN, 2007; JALIGOT et al., 2000; MIGUEL; MARUM, 2011). Diversos fatores presentes na cultura de tecidos podem desencadear estes eventos e influenciar a ocorrência de variação somaclonal (PESCHKE; PHILLIPS, 1992). 67
Figura 1 – Gel de agarose a 2,0% mostrando o padrão eletroforético de amostras de Cattelya amethystoglossa amplificadas com o primer 899. 1 – Planta mãe 7 (M7); 2 – Geração 1 da M7 (G1); 3 – Geração 2 da M7 (G2); 4 – Geração 3 da M7 (G3); 5 – Planta mãe 8 (M8); 6 - G1 da M8; 7 – G2 da M8; 8 – G3 da M8; 9 – Planta mãe 9 (M9); 10 – G1 da M9; 11 – G2 da M9; 12 – G3 da M9; 13 – Planta mãe 10 (M10); 14 – G1 da M10; 15 – G2 da M10; 16 – G3 da M10; 17 – Planta mãe 11 (M11); 18 – G1 da M11; 19 – G2 da M11; 20 – Planta mãe 12 (M12); 21 – G1 da M12; 22 – G2 da M12; 23 – G3 da M12; 24 – Controle negativo; 25 - Marcador 100 pares de bases ladder.
O tipo de explante utilizado pode afetar a ocorrência de variação somaclonal durante o cultivo in vitro (PESCHKE & PHILLIPS, 1992; ADELBERG et al., 1994). A micropropagação baseada em meristema, por exemplo, é muito mais estável geneticamente do que aquela em que a regeneração ocorre por meio da fase de calos (BHATIA et al., 2011). No presente trabalho foi observada a formação de brotos de forma direta, o que proporciona maior estabilidade genética e menor chance de ocorrer variação somaclonal, fato comprovado pelas análises genéticas das três gerações de brotos produzidas. O regulador utilizado também pode influenciar na ocorrência de variação somaclonal. Em Phalaenopsis gigantea J.J.Smith (Orchidaceae) multiplicada in vitro na presença dos regulares quitosana e thidiazuron (TDZ) foi observada variação na quarta geração (SAMARFARD et al., 2014) enquanto naquelas cultivadas somente na presença de quitosana não houve variação entre as plantas mãe e seus regenerantes (SAMARFARD et al., 2013). Plantas de Vanilla planifolia Jacks. (Orchidaceae) estabelecidas em meio MS contendo BA (2 mg 1-1) e ANA (1 mg 1-1) após aproximadamente 10 anos não exibiram variação genética (SREEDHAR et al., 2007), enquanto aquelas obtidas em meio MS contendo 8,86 μM de BAP apresentaram polimorfismos a partir do primeiro ciclo de subcultura (SOLANO et al., 2019). 68
Figura 2: Dendograma mostrando a similaridade genética (índice de similaridade Genética de Jaccard) entre brotos de C. amethystoglossa regenerados in vitro e suas respectivas plantas mãe, calculado a partir da matriz de marcadores ISSR e algoritmo UPGMA. As cores correspondem a uma planta mãe e suas respectivas gerações clonais. 69
No presente trabalho, assim como observado por Sreedhar e colaboradores (2007), utilizando 4,440 µM de BAP associada a 0,537 µM de ANA não foi observado polimorfismo após três ciclos de cultivo, o que sugere que o balanço entre BAP e ANA promove maior estabilidade genética que a utilização exclusiva do BAP como observado por Solano e colaboradores (2019).
O tempo de cultivo in vitro também está relacionado com o surgimento de variação somaclonal. Em P. gigantea a variação somaclonal entre as plantas mãe e os protocormos induzidos de diferentes subculturas foi pequena ou nula após 16 semanas de cultura. Entretanto, uma alta dissimilaridade de cerca de 20% foi observada entre as plantas mãe e os protocormos produzidos após 20 semanas de cultura (SAMARFARD et al., 2014). Já em Vanilla planifolia os marcadores demonstraram que o percentual de polimorfismo aumenta significativamente a partir do quinto ciclo de subcultura (SOLANO et al., 2019). A variação genética no cultivo in vitro da mandioca (Manihot esculenta Crantz) foi detectada somente a partir do sexto ciclo de subcultura (OSENA et al., 2017). Para C. amethystoglossa não foram observadas variações até o terceiro ciclo de cultivo, mas é possível que surja variação somaclonal com o desenvolvimento de novos ciclos de cultivo, assim como observado para Vanilla planifólia e Manihot esculenta (SOLANO et al., 2019; OSENA et al., 2017) Apesar da existência de diversos fatores que podem favorecer a ocorrência de variação somaclonal no cultivo in vitro como discutido acima, muitos estudos, assim como o presente trabalho, têm relatado alta estabilidade genética em orquídeas micropropagadas. Em Habenaria edgeworthii, as plantas regeneradas após regeneração organogênica apresentaram padrão ISSR idêntico ao da planta mãe para todos os primers testados (GIRI et al., 2012). Ausência de variação genética também foi observada entre as plantas regenerantes do híbrido Aerides vandarum x Vanda stangeana (KISHOR; DEVI, 2009). Para Anoectochilus formosanus Hayata alta fidelidade genética (> 94%) foi observada após um período superior a cinco anos sob propagação in vitro, por meio de marcadores ISSR (ZHANG et al., 2010). Esses resultados, assim como os obtidos para C. amethystoglossa, demonstram que a cultura de tecidos é uma técnica eficiente para a conservação e a multiplicação dessas espécies uma vez que possibilitam a produção e manutenção de plantas geneticamente estáveis, característica desejável tanto para o comércio como para programas de conservação Em virtude dos resultados obtidos e do acima exposto, é possível concluir que apesar da utilização dos reguladores BAP (4,440 µM) e ANA (0,537 µM) a multiplicação in vitro de C. 70
amethystoglossa em meio MS/2 suplementado com 1,5% de sacarose e 2 g L-1 de carvão ativado é geneticamente estável até a 3ª geração de subcultura, e pode ser utilizada para fins comerciais.
CONCLUSÕES
A adição de carvão ativado no meio de cultura promoveu maiores taxas de germinação para C. amethystoglossa apresentou melhor desempenho em meio MS com um quarto das concentrações salinas acrescido de 2 g L-1 carvão ativado.
A conservação de C. amethystoglossa, em regime de crescimento lento, pode ser efetivamente realizada em meio MS acrescido de carvão ativado sem adição de sacarose.
A micropropagação de C. amethystoglossa foi mais eficiente, para produção de brotos, na presença de 0,537 µM de ANA associado a 8,880 µM de BAP. O cultivo de C. amethystoglossa nestas condições não promove variação somaclonal, e pode ser utilizado para sua propagação com fins comerciais, até a 3a geração clonal. 71
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
As melhores condições para a micropropagação de Cyrtopodium aliciae, com vistas a produção de maiores quantidades de brotos por explante, são o cultivo em sala de crescimento, em tubos vedados com algodão, em meio de cultura MS com metade das concentrações salinas suplementado com 15 gL-1 de sacarose e 2 g L-1 de carvão ativado. A embriogênese somática pode ser induzida nesta espécie, a partir do meristema radicular, cultivando-se as plantas em meio MS/2 líquido suplementado com 2 g L-1 de carvão ativado.
As cápsulas de Cattleya amethystoglossa podem ser eficientemente desinfestadas utilizando detergente neutro, álcool 70%, hipoclorito de sódio 2,5%, seguido de lavagem em água estéril. As sementes destas espécies apresentam diferentes exigências durante a germinação e o seu estabelecimento in vitro. O meio MS/4 suplementado com 2g L-1 de carvão ativado, 15 g L-1 de sacarose e gelificados com 7 g L-1 de ágar foi o mais efetivo para a germinação de C. amethystoglossa, por constituir uma alternativa mais econômica.
Para fins de conservação in vitro de C. amethystoglossa, o crescimento lento pode ser obtido utilizando plantas com aproximadamente 0,2cm, com 2 folhas, cultivadas por 12 meses em sala de crescimento em meio MS suplementado com 2 g L-1 de carvão ativado, gelificado com 7 g L-1 de ágar, na ausência de sacarose.
Quando a finalidade é a micropropagação de C. amethystoglossa, a utilização de explantes com aproximadamente 0,3 cm de comprimento da parte aérea, inoculados em meio MS/2 gelificado com 7 g L-1 ágar e suplementado com com 2 g L-1 de carvão ativado, 0,537 µM de ANA e 4,440 µM de BAP, promove altas taxas de sobrevivência e aumento do número de brotações.
A propagação da espécie C. amethystoglossa é geneticamente estável ao longo de três gerações de cultivo, mesmo quando realizada com a adição de reguladores vegetais no meio de cultura.