UNIVERSITÉ DE LA MÉDITERRANÉE

FACULTE DE MÉDECINE DE MARSEILLE

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE (EDSVS)

Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF, GABON)

Infection naturelle des primates non humains par les spumavirus et transmission inter-espèces au Gabon

T H È S E

Présentée et publiquement soutenue devant

LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE

Le 14 novembre 2011

Par M. Augustin Ghislain MOUINGA ONDEME

Né le 28 mai 1972 à FRANCEVILLE (GABON)

Pour obtenir le grade de DOCTEUR de L’UNIVERSITÉ de la MÉDITERRANÉE

SPÉCIALITÉ : Pathologie Humaine, Maladies Transmissibles et Pathologies Tropicales

Membres du Jury :

M. MEGE Jean Louis , Professeur Faculté de Médecine, Marseille Président

M. SIMON François , Professeur CHU Saint-Louis, Paris Rapporteur

M. Le GRAND Roger , Directeur de Recherches, CEA Fontenay aux roses Rapporteur

M. SAÏB Ali, Professeur Chaire de Biologie CNAM, Paris Examinateur

M. GESSAIN Antoine , Professeur, Institut Pasteur, Paris Examinateur

M. KAZANJI Mirdad , Chef de Laboratoire, Institut Pasteur, Bangui Directeur de thèse

«Longue et ardue est la route qui au sortir de l’enfer vous mène vers la lumière»

John MILTON, Le Paradis perdu, (1667)

2 Dédicaces

A Mon épouse Atogui , Cette thèse est aussi la tienne, pour tous les sacrifices et le soutien.

A tous les enfants: Brenda, Leslie, Wilfried, Luce, Otniel, Désiré et Grégory , Vous trouverez à travers cette thèse le justificatif de mes absences répétées de la maison.

A Gna Simone et Papa Romain , pour la doctrine famille.

A mes parents: feu Célestin Mouinga et Monique Ntsiba , Vous pouvez continuer à être fiers de vos enfants.

A tous mes frères et sœurs , Pour l’amour que vous avez pour moi, votre soutien et votre admiration

A tous les miens , partis pour un voyage sans retour, Je ne vous oublie pas.

A tous les membres de la ligue de TaeKwonDo du Haut-Ogooué qui ont dû faire sans moi, toujours en déplacement.

A toutes les personnes qui vivent des atrocités dans nos forêts, du fait des morsures par des gorilles. Votre collaboration a permis cette étude.

3 Résumé Les spumavirus (SV) sont des rétrovirus exogènes de la sous-famille des Spumavirinae appartenant à la famille des Retroviridae . L’infection naturelle chez les primates non humains (PNH) est décrite dans la nature et en captivité, avec 75 à 100% de singes adultes infectés. Chez les PNH, la transmission des SV se fait à travers des morsures très graves. Par ailleurs, ces virus ont été isolés chez des travailleurs de zoo, exposés aux animaux infectés dans le cadre de leur travail. Récemment, des études ont aussi montré l’infection dans le milieu naturel chez des chasseurs au Cameroun. Cependant, aucune pathologie n’a jamais pu être associée à l’infection par ces virus. Au Gabon, les infections par des SV n’ont été que très peu étudiées. Les objectifs de cette thèse sont donc : 1) D’évaluer au Gabon, la prévalence des SV dans la colonie de Mandrills en captivité au centre de primatologie (CDP) du CIRMF, ainsi que dans la nature chez un grand nombre d’espèces de primates non humains ; 2) De caractériser sur le plan moléculaire les souches SV circulant au Gabon ; 3) D’identifier chez des personnes mordues par un PNH des cas de transmission inter espèces. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que 83% (70/84) des mandrills du CDP (38 males et 46 femelles) et 60% (9/15) des mandrills sauvages étaient infectés par le SV. L’infection augmentait avec l’âge et la différence entre les males et les femelles n’était pas significative (84% et 82%, respectivement). Un fragment de 425pb de l’ integrase a été amplifié dans 60/69 et 53 nouvelles séquences ont été isolées. L’analyse phylogénétique a mis en évidence la circulation de 11 souches différentes dans la colonie, toutes étroitement liées sauf une. La confirmation de ces résultats à l’aide de séquences de virus chez des mandrills sauvages démontre l’existence de deux groupes de mandrills (nord et sud) localisés de part et d’autre du fleuve Ogooué. En plus, nous avons étudié 497 échantillons de plasma et tissus prélevés chez 13 espèces simiennes dans la nature. L’analyse sérologique a montré l’infection par SV chez 10.8% (31/286). Le fragment de l’ integrase a été caractérisé dans 38/497 échantillons, avec la description de nouvelles infections naturelles chez les C. solatus , C. nictitans et C. cephus . Dans la deuxième partie, nous avons décrit l’infection chez 20% (4/20) des travailleurs du CDP. La caractérisation moléculaire a été faite chez deux d’entre eux: l’un a été mordu il y a 10 ans par un mandrill clairement identifié, et l’autre par un macaque 25 ans auparavant. En milieu naturel, nous avons testé 78 personnes mordues par un PNH. Au total, 19 personnes mordues (24%) étaient séropositives pour le SV. Sur ces 19 individus, 15 séquences virales ont été obtenues dont 12 de gorilles, 2 de chimpanzés et une de cercopithèque.

4 Ces résultats montrent que les PNH du Gabon sont infectés par les SV et que la transmission inter espèces des SV intervient chez des personnes mordues par ces animaux.

Mots clés : Spumavirus; mandrills; primates non humains; transmission inter espèces; Gabon.

5 Abstract

Foamy viruses are members of the Spumavirus genus of the Retroviridae family. These complex exogenous retroviruses are highly prevalent in several animal species, including nonhuman primates (NHP). The seroprevalence of antibodies to Simian foamy virus (SFVs) in captive adult NHP populations can reach 75-100%. SFV infection has been reported in people occupationally exposed to nonhuman primates in zoos. Recently, naturally acquired SFV infections were described in a group of hunters living in Cameroon, central Africa. In Gabon, foamy viruses are less studied. In our study, we evaluated the natural history of SFV in a free-ranging colony of mandrills (CIRMF primate center) and in mandrills living in natura in Gabon (central Africa). We also determined the SFV prevalence in a series of 497 NHP living in different parts of Gabon. Lastly, we investigated the possible transmission of SFVs to humans.

First, SFV infection was determined by specific serological (Western blot) and molecular (nested PCR of the integrase region in the polymerase gene) assays. Seropositivity for SFV was found in 70/84 (83%) captive and 9/15 (60%) wild-caught mandrills. The 425-bp SFV integrase fragment was detected in peripheral blood DNA from 53 captive and 8 wild-caught mandrills. Sequence and phylogenetic studies demonstrated the presence of two distinct strains of mandrill SFV, one clade including SFVs from mandrills living in the northern part of Gabon and the second consisting of SFV from animals living in the south. Among the NHP, 10.8% (31/286) of the plasma/sera were SFV seropositive. Integrase gene was characterized in 38 samples with novel SFVs in several species of Cercopithecus. Second, the presence of SFV was also evaluated in 20 people who worked closely with mandrills and other NHP. Integrase region of 425 bp was found in 2/20 (10%) humans. One man who had been bitten 10 years earlier by a mandrill and another bitten 22 years earlier by a macaque were found to be SFV-infected, both at the Primate Centre. Comparative sequence analysis of the virus from the first man and from the mandrill showed nearly identical sequences, indicating genetic stability of SFV over time. The second man had a sequence close to SFVmac sequences. Of the 78 people, mostly hunters, who had been bitten or scratched by NHPs, 19 were SFV seropositive, with 15 cases confirmed by PCR. All but one were infected with ape SFV. We thus found novel SFV strains in NHPs in Gabon and high interspecies transmission of SFVs from gorilla bites.

Keywords : Simian foamy virus; non human primates; mandrills; interspecies transmission; Gabon

6 Remerciements

Je voudrais rendre un hommage mérité à feu le Président Omar Bongo Ondimba, pour avoir eu l’idée de créer le Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF) qui nous permet de réaliser nos travaux de recherche.

Je voudrais, très respectueusement, remercier Monsieur le Président Ali Bongo Ondimba qui a su maintenir cet outil, et pour l’intérêt qu’il porte à tous nos travaux de recherche.

Que Monsieur le Ministre Paul Toungui, Président du Conseil d’Administration du CIRMF, trouve à travers ces mots toute ma reconnaissance et mon admiration.

Je remercie très sincèrement Monsieur le Docteur Jean-Paul Gonzalez, Directeur Général (DG) du CIRMF, et à travers lui toute l’institution, pour m’avoir permis de faire le bon choix pour cette thèse et pour son soutien permanent. Je remercie aussi monsieur le Professeur Philippe Blot, ancien DG du CIRMF, qui m’a autorisé à m’inscrire dans cette longue formation doctorale et a engagé le CIRMF à me soutenir.

Je voudrais exprimer toute ma gratitude à Monsieur le Professeur Jean-Louis Mège pour m’avoir accepté à l’école doctorale EDSVS de Marseille et pour avoir accepté de présider ce jury.

Je voudrais rendre hommage au Docteur Mirdad Kazanji qui a redonné espoir à ma carrière scientifique. Beaucoup reste à faire, mais ce que je suis devenu dans le domaine scientifique, je le dois en grande partie à lui. Je le remercie en tant que DG de l’Institut Pasteur de Bangui (RCA), pour m’y avoir reçu afin de finaliser cette thèse. Je lui exprime toute ma reconnaissance pour avoir favoriser mes échanges professionnels avec ses collaborateurs et pour les critiques de ces derniers sur ma thèse. Enfin merci de m’avoir permis de découvrir le peuple frère de Centrafrique. Merci à tous! Je remercie Monsieur le Professeur François Simon pour avoir accepté, sans hésitation, de critiquer ce travail.

Je voudrais remercier Monsieur le Professeur Antoine Gessain, pour m’avoir suivi aux côtés du Dr Kazanji et pour m’avoir accueilli régulièrement dans son unité dans le cadre de ce travail. Toute ma reconnaissance à l’équipe de l’unité d’épidémiologie des virus oncogènes de l’institut Pasteur de Paris.

7 Je remercie Monsieur le Professeur Ali Saïb, pour sa disponibilité et sa rigueur. Mes remerciements vont aussi à toute son équipe de l’hôpital St-Louis à Paris.

Mes remerciements vont au Docteur Roger Le Grand, pour son engagement dans mon épanouissement scientifique.

Je voudrais remercier du fond du Cœur et très fraternellement, M. Jean Evariste Ngouas, au nom de tous, pour avoir misé sur le jocker «Ondé».

Je rends un hommage mérité aux docteurs Maria Makuwa et Sandrine Souquière qui ont été deux piliers de fer pour ma vie professionnelle en rétrovirologie. Je voudrais remercier monsieur Norbert Mouyabi, Directeur de la Communication et des relations extérieures du CIRMF pour ses conseils avisés. Je remercie le Docteur Lucas Sica pour son implication, dans le cadre de ses missions pour les Relations Académiques au CIRMF. Je remercie très amicalement le Docteur Erwann Loret, de la faculté de Pharmacie de Marseille qui a défendu mon dossier à l’école doctorale EDSVS de Marseille et qui m’a toujours chaleureusement reçu dans son laboratoire. J’exprime toute ma reconnaissance au Docteur Eric Leroy pour sa disponibilité et son oreille attentive à chaque fois que je l’ai sollicité. Mes remerciements vont au Docteur François Rouet pour l’aide qu’il m’a apportée depuis son arrivée afin de finaliser cette thèse. Je remercie tous les frères du 3è collège du CIRMF pour le soutien sans faille: Docteur Jean- Paul Akué, Docteur Foussény Touré-Ndouo, Docteur Benjamin Ollomo, Docteur Richard Onanga et Docteur Barthélémy Ngoubangoye. Mes remerciements vont aussi à monsieur Aristide Guibinga, Responsable des ressources Humaines du CIRMF pour tous les conseils. Je remercie le Docteur Dieudonné Nkoghé pour son assistance et sa disponibilité en mission comme au CIRMF. Je remercie le Docteur Pierre Roques pour tout ce que nous avons fait ensemble et pour le soutien qu’il m’a toujours apporté de là où il se trouve. Toute ma gratitude à mon frère et ami le Docteur Jean-Bernard Lékana qui peut être considéré comme un modèle. J’associe son épouse Sonia, pour la compréhension mutuelle depuis notre rencontre.

8 Je remercie tous les collègues qui ont été dans le laboratoire au démarrage de ce travail: Docteur Guy-Roger Ndong Atome, Docteur Armel Mintsa Ndong, Madame Marie-Thérèse, feu Issa Bédjabaga. Mes remerciements vont aussi à toute l’équipe du centre de primatologie: Docteur Delphine Verrier, Docteur Bettina Sallé et tous les animaliers. Je remercie mon très cher ami le Docteur Florian Liégeois pour ses critiques. Ces mêmes remerciements vont aux Docteurs Ghislain Moussavou, Xavier Pourrut et Pierre Béquart. Je remercie tout le service de maintenance, pour le suivi de l’appareillage et particulièrement le parc informatique (Jean-Louis, Marcel, Innocent, Eric et Alain, et tous les autres). Mes remerciements à mes compagnons de mission, Philippe Engandja, Christophe Ngokomaka et Blaise Kambiri. Je remercie tous ces collègues qui se donnent la peine, Docteur Ulrich Bisvigou, Docteur Gilda Grard, Mélanie Caron, Gael Maganga, Patrick Yangari, André Délicat et Philippe Yaba. Je remercie toute l’équipe technique de la rétrovirologie: Ngari Paul, Martine Koné, Jeannette Matsinda, Boué Vanina, Doris Kenfack, Alain Prince. Tous mes remerciements au personnel du laboratoire d’analyses médicales où j’ai fait mes premiers pas: Albert Ngouamizokou, Emmanuel Ndouna, Thelesfor Mbang Mboro, feu Bertrand Ebang Akué, Urbain Ossiassoura, Justice Mayombo, Ma Germaine L, Ma Vicky M, Ya Yvette L. Je remercie aussi tous les services généraux pour leur disponibilté et leur promptitude à nous aider: les approvisionnements (Nathalie BK, Brice N et Hervé M), la comptabilité (Marie-Joseph M, Goergina A, et Myglaige M). Le garage n’est pas en reste, à travers Messieurs Mouori JF, Lendoye JP, Ontsia A, Bassa A, Okouli F. Je remercie infiniment toutes les assistantes de direction du CIRMF pour leur professionnalisme: Ma Marie-Jeanne IB, Ma Nicole M, Ma Maguy A, Zoé A, Razia N, Sandra A, Zita M, Nadine O, Céleste N. Mes remerciements au département de la documentation: M. Nguiandoungou I, Ma Véronique N. Je voudrais spécialement remercier M. Nguiandoungou Sébastien pour sa disponibilité et son respect. Remerciements spéciaux: Mme Poyo A, Chabanel Mb, Moukana H, Mbou R, Ossari S, Gnala R. Je remercie enfin l’ensemble des agents du CIRMF, incluant les jardiniers, le poste de garde et les femmes de ménage, pour leur engagement dans l’image de l’institution.

9

Sommaire

INTRODUCTION ……………………………………………………………………………...17

I- Première partie: GENERALITES …………………….……………………………..….19

Chapitre 1: Les spumavirus chez les primates non humains et l’homme ………...20

1. Aspects virologiques des Rétrovirus (rappels) ……..…………………….…………………...21

1.1 Définition…………………………………………………………………………………....21

1.2 Taxonomie…………………………………………………………………………………..22

1.2.1 Les Lentivirinae……..………………………………………………………………..22

1.2.2 Les Oncovirinae…..………………..…………………………………………………22

1.2.3 Les Spumavirinae……………...………………………………………….……….....23

2. Virologie des Spumavirus ….…………………………………………………………………...24

2.1 Organisation et stabilité génétiques……….…...... ……………………………………...24

2.2 Les protéines virales…………………………………………………………………….26

2.2.1 La protéine de capside Gag…………………………………………………....26

2.2.2 La polyprotéine enzymatique Pol………………………………….………….29

2.2.3 La glycoprotéine Env…...……………………………………………………..30

2.2.4 Les protéines auxiliaires……………….……………………………………...32

2.3 Cycle réplicatif des spumavirus…………………………………………………………33

2.3.1 Les phases précoces…………………………………………………………...33

2.3.2 L’intégration…………………………………………………………………..34

2.3.3 Les phases tardives……………………………………………………………37

2.4 Particularités des spumavirus…………………………………………………………...39

2.5 Tropisme des spumavirus……………………………………………………………….40

3. Les différents types de spumavirus ……………….……………………………………………42

3.1 Les spumavirus de bovins (Bovine Foamy Virus [BFV])…………………..…………..42

10

3.2 Les spumavirus de félins Virus (Feline Foamy Virus [FFV])…………………………..43

3.3 Les spumavirus d’équins (Equine Foamy Virus [EFV])………………..……………....43

3.4 Les spumavirus simiens (Simian Foamy Virus [SFV])...……………………………….44

3.4.1 Origine et prévalence des spumavirus simiens………………………………..44

3.4.2 Transmission des spumavirus simiens chez les primates non humains et des primates à l’Homme…...... 44

3.4.2.1 Transmission des spumavirus simiens chez les primates non humains...... ………….44

3.4.2.2 Les infections à spumavirus simien chez les primates non humains…………………………………………...... …………….45

3.4.2.2.1 Les spumavirus simiens en Afrique……………………….45

3.4.2.2.2 Les spumavirus simiens en Asie…………………………..46

3.4.2.2.3 Les spumavirus simiens dans le reste du monde…………..47

3.5 Transmissions inter espèces des spumavirus à l’Homme……………………………….47

3.5.1 La promiscuité Hommes / primates non humains……………………………..47

3.5.2 Découverte des spumavirus simiens chez l’Homme.…………………………48

4. Histoire naturelle de l’infection de l’Homme par les spumavirus simiens ………...………...48

4.1 Transmission et prévalence des spumavirus simiens chez l’Homme dans des zoos...... 49

4.2 Transmission et prévalence des spumavirus simiens chez des humains dans la nature...50

4.3 Pathogénicité des spumavirus………………………………………………………...... 51

4.4 Les vecteurs spumavirus et la thérapie génétique……………………………………….52

Chapitre 2: Les primates non humains du Gabon ……………………………………..55

1. Généralités sur les primates non humains …….....………...…………………………………56

2. Primates non humains du Gabon …………..…………………………………...... 58

2.1 Présentation du lieu d’étude……………………………………………………………..58

2.2. Espèces régulièrement décrites…………………………………….………………..….60

2.3 Susceptibilité aux agents pathogènes et infections naturelles rétrovirales...... 60

11

2.4 Politique gouvernementale de conservation de la biodiversité ……..…………………..62

2.5 Les colonies de primates non humains du CIRMF………………….………………...... 63

2.5.1 La colonie des mandrills……………………………………………………....64 2.5.2 Les autres colonies de primates non humains...……………………………….64

II- Deuxième partie: 1-OBJECTIFS ……………..………………………………………..66

II- Deuxième partie: 2-Matériels et Méthodes ..…..……………………………………..70

1. Populations d’étude …………………………………………………………………………...71

1.1. Populations de primates non humains……………………..………………………...71

1.1.1. La colonie des mandrills du centre de primatologie (CDP)...…...…………....71

1.1.2. Les Primates non humains sauvages………………………………………….72

1.2. Les cohortes humaines………..……………………………………………...... 73

1.2.1. La cohorte des personnes du CIRMF………….……………………………..74

1.2.2. La cohorte des personnes mordues et des chasseurs.....……...………..……...74

2. Enquêtes épidémiologiques …………………………………………………………………..75

3. Analyses statistiques …………………………………………………………………………..76

4. Echantillons : Obtention, nature, traitement …………………….…………………………...77

4.1. Collecte et transport des échantillons……………………………………..……….....77

4.1.1 Echantillons des primates non humains du CDP...... 77

4.1.2 Echantillons des primates non humains en zone rurale...... 77

4.1.3 Prélèvement des humains...... 77

4.2. Tests de laboratoire……………………………………..…………....…………………78

4.2.1 Etudes sérologiques…………………………………………………………..78

4.2.1.1 Préparation d’antigènes viraux……………...………...………….....78 4.2.1.2 Séparation des antigènes sur gel de polyacrylamide…..………….....79 4.2.1.3. Le transfert…………………………………………….…………....79 4.2.1.4 L’hybridation…………………………..……………………………80 4.2.1.5 Révélation……………………………………………………..…….80 12 4.2.1.6 Analyses des résultats…………………………………………..…...81 4.2.2 Etudes moléculaires……..………………………...…………………………..82

4.2.2.1 Extraction…………………………………………………….……..82

4.2.2.2 Mesure de la concentration des extraits d’ADN...……...…………..82

4.2.2.3 Amplification moléculaire.....……………………………………….82

4.2.2.4 Purification………………………………………………………….83

4.2.2.5 Analyses des séquences……………………………………………..84

4.3 Etudes phylogénétiques…………………………………………………………………85

III- Troisième partie: RESULTATS ……………………………………………….……...86

1. Chapitre I: EPIDEMIOLOGIE DES INFECTIONS A SPUMAVIRUS CHEZ LES MANDRILLS CAPTIFS DU CDP …………………………………..………………...………87

Titre de l’article……...………………….....…...………………………………………...... 88

Résumé de l’article...... 89

2. Chapitre II: PREVALENCE DES INFECTIONS A SPUMAVIRUS CHEZ DES PRIMATES NON HUMAINS SAUVAGES ET LEUR TRANSMISSION INTER ESPECES AUX HUMAINS ………………………….……………………………………….106

Titre de l’article...……………………………………………………………………….....107

Résumé de l’article...... 108

DISCUSSION …………………………………………………………..………………………129

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ………...………………………………………...136

Annexes ...... 141

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES …….………………………………………….145

13

Tableaux

Tableau 1: Primates non humains du Gabon ------61

Tableau 2: Espèces de primates non humains hébergés par le CDP du CIRMF------63

Tableau 3: Espèces de primates non humains du Gabon testés au cours de l’étude------73

Tableau 4: Différentes amorces utilisées au cours de l’étude ------84

14 Figures

Figure 1: Particule virale d’un rétrovirus------21

Figure 2: Les spumavirus en images------23

Figure 3: Organisation génétique comparée des rétrovirus de mammifères------25

Figure 4: Génome proviral du spumavirus------26

Figure 5: Représentation schématique de la protéine Gag ------28

Figure 6: Modèle de la structure de Env du PFV ------31

Figure 7: Cycle r éplicatif du PFV ------35

Figure 8: Ordre des primates ------56

Figure 9: Carte du Gabon ------58

Figure 10: Répartition des mandrills ------65

Figure 11: Table généalogique des mandrills du CDP testés dans cette étude------71

Figure 12: Répartition des prélèvements de primates non humains par province ------72

Figure 13: a) Morsure fraîche------74 b) Cicatrice au mollet------74 c) Cicatrice avant-bras------74

Figure 14: Répartition des personnes mordues par un primate non humain------76

Figure 15: Membrane de nitrocellulose après transfert des protéines virales------80

Figure 16: Trois types de résultats obtenus en sérologie------81

Figure 17: Stratégie utilisée pour l’amplification moléculaire------83

Figure 18 : Quelques cas de co-infection chez des mandrills du CDP par les rétrovirus------92

15

Abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique AGM : Singes verts d’Afrique ALS: Amyotrophic lateral sclerosis BFV: Bovin foamy virus CDC: Centers for disease control and prevention CDP: Centre de Primatologie CIRMF: Centre International de Recherches Médicales de Franceville CMSP: Cellules mononucléées du sang périphérique DMEM: Dulbecco’s modified Eagle's minimal essential medium dNTP: deoxyribonucléotide triphosphate EFV: Equine foamy virus FFV: Feline foamy virus FIV: Feline immunodeficiency virus HFV: Human foamy virus HTLV: Human T-Lymphotropic Virus LTR: Long Terminal Repeat NPC: Carcinome du nasopharynx PCR: Polymerase chain reaction PFV: Prototypic foamy virus PNH: Primates Non Humains RT: Reverse transcriptase RTI: Rétrotransproson interne SFV: Simian foamy virus SIDA: Syndrome de l’immunodeficience acquise SRAS: Syndrome respiratoire aigü sévère STLV: Simian T-Lymphotropic Virus VIH: Virus de l’immunodeficience humaine VIS: Virus de l’immunodeficience simienne

16 INTRODUCTION

De nombreuses maladies virales, d’origine animale, émergent chez l’Homme. Cela a été démontré lors des épidémies d’Ebola, de grippe aviaire, de SRAS et des virus Hanta (Weiss and McMichael, 2004; Kruse et al. , 2004; Halpin et al. , 2007; Anderson and Tong, 2010). L’hypothèse d’une origine zoonotique de nouveaux virus émergents chez l’homme est très probable, voire inévitable, étant donné la diversité des réservoirs animaux et la variété des circonstances au cours desquelles les hommes et les animaux peuvent être en contact. La prévision des évènements favorisant la transmission virale de l’animal à l’Homme est difficile et hasardeuse. En effet, l’émergence de maladies virales d’origine zoonotique chez l’Homme résulte de la succession d’évènements complexes. Plusieurs facteurs liés au virus, à l’hôte, à l’environnement et à l’origine socioculturelle influencent la survenue ou non de cette émergence de maladies virales chez l’hôte. La coordination de ces évènements explique en partie la relative rareté de l’émergence virale chez l’homme des virus transmis par les animaux. Après le contact initial ayant conduit à la transmission inter espèces, les virus peuvent montrer leur capacité à se propager au sein de la population humaine à travers des mécanismes distincts et variés. Toutefois, les étapes conduisant à l’émergence des virus et des maladies associées restent dans plusieurs cas mal comprises. Cela souligne la nécessité de multiplier les surveillances microbiologiques dans des populations à haut risque pour pouvoir générer de nouvelles données sur les événements précoces du processus de l’émergence virale. Les infections des humains par des virus simiens représentent un autre exemple de zoonose. En effet, en raison de leur patrimoine génétique proche de celui de l’Homme, de leurs habitudes et des similarités physiologiques, les primates non humains (PNH) sont considérés comme de probables sources de virus pouvant infecter l’Homme. Ils constituent ainsi une menace sérieuse pour la population humaine. En particulier, les rétrovirus qui ont la capacité de franchir la barrière d’espèces, de s’adapter au nouvel hôte, et de s’y propager, illustrent bien cette hypothèse. A titre d’exemple, on peut citer les infections humaines à VIH-1 et VIH-2 dont les études phylogénétiques suggèrent très fortement qu’elles sont le résultat d’au moins 12 transmissions inter espèces indépendantes à partir de chimpanzés et sooty-mangabeys respectivement durant le siècle dernier. L’origine des sous types de HTLV-1 apparaît également liée à des épisodes de transmission inter espèces entre des singes infectés par le STLV-1 et des humains, suivies d’évolution et de transmission chez l’hôte humain. Il est important de noter que bien qu’ayant une origine simienne, les HIV et HTLV sont des virus humains et leur propagation planétaire au sein de l’espèce humaine se fait lors des contacts avec des hommes infectés et non des singes.

17 Les Spumavirus simiens (SV) se transmettent de la même manière que les autres rétrovirus cités ci-dessus. Les prototypes simiens (Simian Foamy Virus (SFV) en anglais) infectent naturellement certains PNH. Une des particularités des SFV est leur réplication au niveau de la muqueuse orale, et de fait leur possible transmission lors de morsures. Malgré l’absence pour ces virus d’un prototype humain, diverses équipes ont décrit des cas de transmission des spumavirus simiens chez des humains, suggérant (par analogie avec les VIH et HTLV-1) une possible émergence d’un spumavirus humain, pouvant potentiellement être à l’origine d’une nouvelle maladie humaine. Dans le contexte du Gabon (pays d’Afrique Centrale) où le risque d’émergence d’une telle infection chez l’Homme est possible, il nous est apparu important de pouvoir apporter une contribution scientifique dans le domaine de la connaissance des spumavirus circulant dans ce pays. C’est pourquoi ce travail de thèse a pour but initial la description et la caractérisation des spumavirus simiens chez différentes espèces de PNH, et de déterminer leurs prévalences au Gabon. Dans un deuxième temps, cette recherche a pour objectif d’évaluer le risque de transmission de ces virus simiens au sein d’une population humaine constituée notamment par des personnes victimes d’une agression par un PNH. Un suivi clinique au long cours des individus infectés doit permettre de documenter le pouvoir pathogène ou non de ces virus chez l’espèce humaine.

18

PREMIERE PARTIE :

GÉNÉRALITES

19

Chapitre 1

Les spumavirus chez les primates non humains et l’homme

20 1. Aspects virologiques des Rétrovirus (rappels)

1.1 Définition

Les Rétrovirus sont des virus dont le génome est constitué de deux brins d’ARN, ayant la particularité de le rétrotranscrire en un ADN double brin grâce à la présence d’une enzyme, la transcriptase inverse (RT pour reverse transcriptase en anglais). Ils possèdent des gènes structuraux et enzymatiques gag (pour group-specific antigen ), pol (pour polymerase ) et env (pour envelope ), communs à tous les rétrovirus. Ils disposent également de gènes dits auxiliaires situés pour la plupart en 3’ du génome viral. Les rétrovirus sont des virus enveloppés, le diamètre de la particule virale variant entre 90 et 125 nanomètres (Figure 1). Ils sont très répandus dans le monde animal. Certains sont la cause de différentes formes d’immunodéficience (dont le SIDA), de dégénérescence du système nerveux central (lentivirus), et de cancer (oncovirus). Leur génome s’intègre sous forme d’ADN proviral dans celui de la cellule hôte pour ensuite s’exprimer, ou rester silencieux pendant toute la vie de l’hôte.

Figure 1: Particule virale d’un rétrovirus ( Pr J.F. HERON, Faculté de Médecine de Caen, France )

21 1.2 Taxonomie

La famille des Retroviridae se divise en deux sous-familles: - La sous-famille des Orthoretrovirinae à laquelle appartiennent les genres Lentivirus et Oncovirus, - et la sous-famille Spumavirinae, représentée par le genre unique Spumavirus. Trois principaux critères permettent de classer les rétrovirus: certains critères morphologiques des particules virales, leur pouvoir pathogène et certains critères génétiques (Weiss, 1996).

1.2.1. Les Lentivirinae

Les lentivirinae sont responsables d’infections à évolution lente et persistante, de nature inflammatoire ou dégénérative chez l’Homme. Les virus de l’immunodéficience humaine (VIH) sont responsables du Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA). Les virus de l’immunodéficience simienne (VIS) infectent de nombreuses espèces de PNH, exclusivement en Afrique, au sud du Sahara (Apetrei et al. , 2004; VandeWoude and Apetrei, 2006). Dans la majorité des cas, ils sont non pathogènes chez leurs hôtes naturels.

1.2.2 Les Oncovirinae

Les oncovirinae sont extrêmement répandus et à l’origine de tumeurs et leucémies. Cette sous-famille comprend des virus humains : - le HTLV-1 à l’origine de cancers hématologiques (lymphomes/leucémies T) et de syndromes neurologiques (paraparésie spastique tropicale), - et le HTLV-2, virus très proche génétiquement qui serait responsable de certains cas de leucémie à tricholeucocytes. Cette sous-famille comprend aussi des virus simiens (STLV) qui infectent de nombreuses espèces de PNH. Ces oncovirus ont la capacité d’immortaliser les lymphocytes T, à la différence des VIH qui les détruisent.

22 1.2.3 Les Spumavirinae

Isolés pour la première fois en 1954 (Enders and Peebles, 1954), les spumavirus ne provoquent pas de pathologie au sein de l’organisme infecté. C’est pour cette raison que leur étude n’est pas apparue comme une priorité pendant plusieurs années. Le prototype PFV (pour Primate Foamy Virus ) a été isolé en 1971 à partir d’un patient atteint d’un carcinome du nasopharynx (Achong and Epstein, 1978; Achong et al. , 1971). Son génome n’a été séquencé qu’en 1987, ce qui a permis de le classer dans la famille des Retroviridae (Flugel et al. , 1987). Ces virus provoquent in vitro un effet cytopathique caractérisé par l’apparition de cellules géantes multinuclées (ou syncytia), associées à la formation de vacuoles cytoplasmiques. Cela donne un aspect mousseux à la culture cellulaire, d’où l’origine du nom de ces virus (Figure 2). De nombreuses lignées cellulaires sont sensibles à la réplication virale, suggérant fortement l’ubiquité du récepteur viral (Hill et al., 1999 ; Mergia et al., 1996) (Cf chapitre sur le tropisme des spumavirus page 40).

Figure 2 : Les spumavirus en images. Microscopie optique : A) Effet cytopathogène caractéristique des FV sur une culture cellulaire de rein de hamster BHK21. Les flèches indiquent l’effet de mousse à l’origine du nom de virus spumeux. Microscopie électronique : B) Bourgeonnement du PFV à partir de la membrane plasmique. C) Détail d’une particule de PFV. D’après Lehmann-Che, adaptées de Tobaly-Tapiero (Tobaly-Tapiero et al. , 2000).

23 2. Virologie des Spumavirus

2.1 Organisation et stabilité génétiques

Au sein de la famille des Retroviridae , on distingue les rétrovirus simples des rétrovirus complexes (Knipe, 2001). Ces derniers possèdent, en plus des gènes structuraux et enzymatiques gag (pour group-specific antigen ), pol (pour polymerase ) et env (pour envelope ), communs à tous les rétrovirus, des gènes auxiliaires situés, pour la plupart, en 3’ du génome viral (Figure 3). Les spumavirus sont des rétrovirus complexes au même titre que les lentivirus, dont le prototype est HIV-1 (pour Human Immunodeficiency Virus type 1) ou les virus des leucémies T, dont le prototype est HTLV-I (pour Human T-cell Leukemia Virus type I ). L’étude de leurs séquences nucléotidiques, d’une longueur de 11 956 à 13 246 pb, a mis en évidence la présence de gènes auxiliaires situés en 3’ du gène env (et non de part et d’autre de ce gène comme dans les génomes des virus VIH-1 et HTLV-I) (Figure 3). Cette localisation fut à l’origine de la dénomination initiale des gènes auxiliaires, les gènes bel (pour between env and LTR) (Rethwilm et al. , 1987; Flugel et al. , 1987). Parmi ceux-ci, on distingue deux cadres ouverts de lecture (ou ORF, pour Open Reading Frame ). L’ORF1 code le transactivateur viral Tas (Rethwilm et al. , 1991) tandis que l’ORF2 constitue la partie carboxyterminale de la protéine Bet. Cette dernière est en réalité une protéine de fusion entre l’ORF2 et la partie aminoterminale de Tas (Giron et al. , 1993; Fischer et al. , 1997) (Figure 4).

Le LTR (pour Long Terminal Repeat ) des provirus de spumavirus présente l’organisation moléculaire classique des rétrovirus, à savoir U3-R-U5 (Figure 4). Ces LTR sont plus longs que ceux décrits chez la plupart des autres rétrovirus exogènes, à l’exception des virus VIH-1 et MMTV (pour Mouse Mammary Tumor Virus ). Les extrémités 5’ non codantes des ARN viraux des spumavirus sont les séquences les plus courtes retrouvées chez les rétrovirus (51 pb dans le cas du prototype spumavirus) (Muranyi and Flugel, 1991).

La synthèse des protéines structurales et enzymatiques Gag, Pol et Env est dirigée par le LTR5’ dans l’ensemble des génomes rétroviraux. La région U3 des LTR contient les séquences régulatrices de la transcription à partir du LTR5’. Dans le cas des spumavirus, cette région contient, en plus des éléments de réponse et de fixation de Tas, d’autres éléments de réponse aux facteurs de transcription cellulaire (Schmidt et al. , 1997). Des éléments de contrôle négatif de la transcription sont décrits dans les régions R et U5 du LTR ainsi que dans la région U3 (Erlwein and Rethwilm, 1993; Mergia et al. , 1992). Par ailleurs, il

24 semble que la région 5’ non traduite des ARNm, en particulier la région R, joue un rôle important dans l’expression des protéines Gag et Pol (Heinkelein et al. , 2000b; Park and Mergia, 2000; Russell et al. , 2001).

Les spumavirus simiens présentent une grande stabilité in vivo (Meiering and Linial, 2001; Broussard et al. , 1997; Linial, 2000; Schweizer et al. , 1999; Schweizer and Neumann-Haefelin, 1995; Mouinga-Ondeme et al. , 2010). Des études phylogénétiques ont aussi montré une spécificité des spumavirus simiens dans différentes espèces de PNH, indiquant une coévolution très ancienne avec leurs hôtes naturels. (Switzer et al., 2005). Cette longue période d’adaptation entre l’hôte et le virus peut expliquer l’absence de pathogénicité in vivo et la persistance d’une longue infection.

VIH1 env LTR 5’ gag vif rev LTR 3’ pol tat nef vpr vpu

VIH2/SIVmac/SIVsmm vpx vpr env LTR 5’ gag vif rev LTR 3’ pol tat nef

rex tax HTLV1 TM pol LTR 5’ gag env LTR 3’

MLV

LTR 5’ gag pol TM LTR 3’ env

Spumavirus LTR 5’ PI pol Tas gag env LTR 3’ ORF2 U3R U5 Bet Figure 3: Organisation génomique comparée de rétrovirus de mammifères, adaptée de (Bouyac-Bertoia et al., 2001). Les gènes caractéristiques des rétrovirus ( gag , pol et env ) sont colorés en vert, rouge et bleu. Autour, il existe des gènes accessoires propres à chaque rétrovirus.

25 La synthèse des protéines auxiliaires Tas et Bet (cf chapitre sur les protéines auxiliaires, page 32) est dirigée par un promoteur interne (PI), localisé en 3’ du gène env (Lochelt et al. , 1993) (Figure 4). La présence d’un second promoteur dans un génome rétroviral est une propriété unique qui singularise les spumavirus du reste de la famille des Retroviridae. Cette propriété singulière les rapproche du genre des pararétrovirus (virus à ADN utilisant une transcriptase inverse au cours du cycle réplicatif des spumavirus) (cf chapitre sur les particularité des spumavirus, page 39). Comme dans le cas du LTR5’, l’initiation de la transcription à partir du PI nécessite la fixation du transactivateur viral Tas. Ce promoteur possède une activité basale forte qui assure une régulation temporelle de l’expression du génome viral (Lochelt et al. , 1994). Dans les étapes précoces de l’infection, les premières protéines virales synthétisées sont les protéines auxiliaires, en particulier la protéine Tas, qui peut non seulement promouvoir sa propre synthèse à partir du PI, mais également activer l’expression des protéines structurales et enzymatiques Gag, Pol et Env à partir du LTR5’.

Spumavirus LTR 5’ PI pol Tas gag env LTR ORF2 U3 R U5 Bet

Figure 4 : Génome proviral du spumavirus

2.2 Les protéines virales

2.2.1 La protéine de capside Gag

Au sein des rétrovirus, le précurseur Gag est classiquement codé par l’ARNm génomique et maturé en matrice (MA), capside (CA) et nucléocapside (NC) par la protéase virale (Swanstrom R et al, 1997), elle-même codée par le gène pol. Dans le cas des spumavirus, le précurseur Gag de 72 kDa est clivé pour environ 50 à 75% des précurseurs (Cartellieri et al. , 2005), dans sa partie C-terminale, libérant un produit mature de 68 kDa et un peptide de 3 à 4 kDa (Pfrepper et al., 1999) (figure 5). Ce processus est indispensable

26 à l’infectiosité du virus et a lieu durant les étapes tardives du cycle viral (Enssle et al. , 1997; Zemba et al. , 1998). Les capsides non modifiées des spumavirus sont incapables de bourgeonner des membranes cellulaires ; elles sont essentiellement dépendantes de la co-expression du gène Env authentique (Pietschmann et al. , 1999; Fischer et al. , 1998). Cela implique une interaction spécifique entre Env et Gag. Alors que le domaine interagissant de Env a presque été entièrement caractérisé, le domaine d’interaction de la contrepartie Gag est toujours non identifié (Cartellieri et al. , 2005; Life et al. , 2008). Il est clair cependant que les 100 premiers résidus des 648 acides aminés de la protéine Gag de PFV sont suffisants pour la réalisation de cette interaction (Cartellieri et al. , 2005). Plusieurs domaines de la protéine Gag ont été caractérisés au moins partiellement. Un motif « coil-coiled » est localisé à l’extrémité N-terminale de Gag (acides aminés 4-19) (figure 5), et un domaine d’interaction avec la protéine Env a été suggéré dans cette région (Cartellieri et al. , 2005; Life et al. , 2008) Comme chez les orthoretrovirus de type D, un CTRS (« cytoplasmic targeting and retention signal ») a été découvert dans la protéine Gag de PFV (acides aminés 43-60) (Cartellieri et al. , 2005; Eastman and Linial, 2001). Un autre domaine « coil-coiled » impliqué dans l’interaction Gag- Gag (Petit et al. , 2003; Tobaly-Tapiero et al. , 2001) est situé à l’extrémité C-terminale adjacente au CTRS (acides aminés 136-146). Il existe également un domaine « coil-coiled » qui semble intervenir dans l’interaction des futures particules virales avec le MTOC (pour « microtubular organizing center ») à travers les moteurs de dynéine du réseau des microtubules, des acides aminés 161 à 174 (Petit et al. , 2003). Les capsides virales ont souvent besoin d’un domaine appelé « L-domain » (Freed EO, 2002). Dans la majorité des protéines des capsides virales avec un L-domain, celui-ci est spécifié par un motif d’oligopeptide riche en proline. Habituellement, la mono ou l’oligo-ubiquitination est une caractéristique des protéines Gag possédant un L-domain. A cet effet, les spumavirus semblent être une exception, car ils sont les seuls virus avec un L-domain dans lequel l’ubiquitination de Gag ne peut être détectée (Zhadina et al. , 2007; Stanke et al. , 2005). A l’extrémité C-terminale de Gag, trois boîtes riches en glycine et en arginine ont aussi été identifiées (les boîtes GR) (Schliephake and Rethwilm, 1994) (figure 5). Alors que la boîte N°1 était initiallement décrite pour la fixation d’acide nucléique (Yu et al. , 1996b), il a été récemment suggéré que cette boîte GR joue un rôle dans l’encapsidation de la protéine virale Pol du spumavirus (Lee and Linial, 2008). La boîte GR N°2 a été identifiée comme étant le NLS (pour « nuclear localization signal ») (Schliephake and Rethwilm, 1994). Plus tard, il a été montré que ce NLS n’est en fait pas impliqué

27 dans la réplication du spumavirus (Yu et al. , 1996b). Par ailleurs, il a été récemment montré que la boîte GR N°2 favorise l’interaction des futures particules virales spumavirus avec du core H2A et H2B et, donc, l’interaction des structures de Gag viral avec la chromatine de l’hôte (Tobaly-Tapiero et al. , 2008). Aucune fonction de la boîte GR N°3 n’est encore décrite (Rethwilm, 2010). Toutefois, une étude de Mullers et collaborateurs a démontré que les boîtes GR N°1 et N°3 fonctionnent de manière complémentaire l’une de l’autre (Mullers et al. , 2011).

Figure 5 : Représentation schématique de la protéine Gag sous forme précurseur p72 et clivée p68. Les boîtes GR sont en gris avec GRI et sa séquence de liaison aux acides nucléiques (NAB), GRII avec sa séquence de localisation nucléaire (NLS) et GRIII. Les domaines coiled-coil sont en rouge, avec CC1 impliqué dans l’interaction avec la sous-unité LC8 de la dynéine et CC2 dans la multimérisation de Gag lors de la formation de la particule virale. Le domaine CTRS est en noir. Les domaines de bourgeonnement : la séquence en acides aminés des L-domaines est représentée avec les motifs consensus indiqués en rouge. La flèche rouge indique le site de clivage de la protéase virale lors de la maturation de la protéine Gag. D’après (Lehmann-Che et al ., 2006)

Les résidus de base sont fréquents dans les Gag des spumavirus, comme c’est également le cas dans les Gag des orthoretrovirus. Cependant ils sont presque représentés par des arginines. Une évidence théorique suggère que plusieurs de ces codons spécifiques de l’arginine ont été développés sur le plan d’évolution à partir des codons spécifiques de lysine (Rethwilm, 2010).

28 La mutation des codons de l’arginine en codons de lysine a curieusement révélé que la plupart des virus mutés se répliquent alors comme des virus sauvages. Récemment, il a été noté que des mutants de la boîte GR N°1 causent des changements importants dans la morphologie des particules virales. Chez les mutants de la boîte GR N°2, il manque le NLS, caractéristique des protéines Gag des spumavirus (Mullers et al. , 2011). Il apparaît donc qu’à l’image des motifs Cys-His retrouvés chez les orthoretrovirus, les boîtes GR de Gag des spumavirus sont importantes pour l’encapsidation des ARN, la transcription inverse du génome, et l’infectiosité du virion, ainsi que pour la morphogenèse des particules virales (Mullers et al. , 2011).

2.2.2 La polyprotéine enzymatique Pol

Chez tous les rétrovirus, la polyprotéine Pol dérive du clivage protéolytique du précurseur Gag-Pol généré à partir de l’ARN génomique. Cette stratégie permet son incorporation dans le virion par l’intermédiaire de la protéine Gag-Pol et limite la transcription inverse des ARN cellulaires. Chez les spumavirus, la polyprotéine Pol est directement synthétisée à partir d’un ARNm pol spécifique (Yu et al. , 1996a; Enssle et al. , 1996; Jordan et al. , 1996; Lochelt and Flugel, 1996), comme c’est le cas chez les Hepadnaviridae. Cette stratégie de synthèse de Pol, indépendante de celle de la protéine de structure Gag soulève un certain nombre d’interrogations concernant les mécanismes de régulation du ratio Gag/Pol et l’incorporation de Pol dans la particule virale. Il est à noter que la protéase des spumavirus possède une activité protéolytique limitée, déjà illustrée dans la maturation partielle de la protéine Gag. Chez les orthoretrovirus, quand le PR est codé dans le cadre de Pol, le précurseur de la protéine Pol est clivé en trois fragments, comme suit : PR-RT/RNaseH-intégrase. Chez les spumavirus, le clivage entre le PR et RT n’a pas lieu (Pfrepper et al. , 1998); le précurseur Pol, exprimé sous la forme d’une protéine de 127 KD (Lochelt and Flugel, 1996; Bodem et al. , 1996; Enssle et al. , 1996), est maturé de façon incomplète, ne générant que deux molécules identifiées dans les particules virales, à savoir l’ integrase de 40 KD et une polyprotéine PR-RT-RH (Rnase H) de 85 KD. Ces deux molécules sont localisées dans le noyau des cellules infectées par le spumavirus (Imrich et al. , 2000). Il a été récemment proposé que dans les cellules arrêtées en phase G1/S du cycle cellulaire, le complexe de préintégration (CPI) accède à la matrice nucléaire mais ne réussit pas à exprimer les gènes en raison d’un défaut d’intégration (Lo et al. , 2010). Il reste à déterminer si les particules virales qui en résultent contiennent les protéines Pol comme décrit ci-dessus (Rethwilm, 2010). Une 29 étude très récente suggère que la majorité du précurseur pol de 127 KD n’est pas associée aux particules virales. De même, cette protéine Pol de PFV ne possède pas d’activité protéolytique mais plutôt de type polymérase (Swiersy et al. , 2011). Curieusement, les molécules PR-RT du PFV et du spumavirus simien des macaques (SFVmac) présentent un état de monomère en solution. C’est uniquement dans ces conditions que leurs activités peuvent être mesurées (Hartl et al. , 2008b; Hartl et al. , 2008a; Hartl et al. , 2010b; Hartl et al. , 2010a). L’activité des deux enzymes nécessite en outre une dimérisation. Cette dimérisation est probablement transitoire et doit s’appuyer sur la proximité des monomères (Hartl et al. , 2010a; Hartl et al. , 2010b). Comme dans le cas des autres rétrovirus, le gène pol est phylogénétiquement le plus conservé, en comparaison des gènes gag et env . C’est pour cette raison qu’il est souvent utilisé pour la construction d’arbres phylogénétiques (Brun-Vezinet et al. , 1999).

2.2.3 La glycoprotéine Env

Les protéines Env des orthoretrovirus sont essentiellement bipartites (Hunter, 1997). Un peptide appelé « leader peptide » (LP), responsable de la traduction du précurseur de la glycoprotéine Env dans le réticulum endoplasmique (RE) est faiblement clivé à partir de la protéine Env entière (Hunter, 1997). La grande partie restante, à l’instar de la gp160 du HIV-1, est clivée par des protéases cellulaires en produits de maturation, en gp120 et gp41. La première constitue la protéine de surface (SU) tandis que la dernière représente la protéine transmembranaire de type 1 (TM). Dans le cas des spumavirus, la LP (gp18) n’est pas (ou très peu) dégradée après la synthèse dans le RE. La LP est donc un constituant intégral du virion, et représente en fait une protéine trans- membranaire de type 2, pointant son extrémité N-terminale dans le cytoplasme (Lindemann and Goepfert, 2003; Lindemann et al. , 2001). Le précurseur de la gp130 de Env est initiallement synthétisée sous forme de protéine transmembranaire de type 3 ancrée deux fois dans la membrane virale, dont une fois à son extrémité N-terminale par le LP. Etant donné que SU et TM sont présents dans les Env des spumavirus et organisés comme chez les orthoretrovirus, la membrane est traversée une fois de plus à son extrémité C-terminale (Lindemann and Goepfert, 2003; Pietschmann et al. , 2000). Les deux clivages conduisent à une protéine Env tripartite entre gp18 LP-gp80-85 SU-gp45- 48 TM. Ils interviennent très tard dans la réplication par des protéases cellulaires (Pietschmann et al. , 1999; Duda et al. , 2006). A ce jour, on ne sait pas lequel de ces deux clivages intervient en

30 premier. Une illustration schématique de ce mécanisme a été proposée par Axel Rethwilm (Rethwilm, 2010) (figure 6).

Figure 6 : Modèle de la structure de Env du PFV selon (Rethwilm, 2010). A) structure du précurseur de la protéine Env de 130 KDa avec 18 KDa du « leader peptide » (LP), la glycoprotéine de surface (SU) de 85 KDa, et la sous-unité transmembranaire (TM) de 48 KDa. B) Topologie de la molécule Env trimérique mature à l’intérieur de la membrane virale. C) Modèle de topologie de la membrane de Env avec les domaines interagissant avec la capside virale. D’après Rethwilm et collaborateurs (Rethwilm, 2010).

Par ailleurs, des études de mutagenèse ont révélé qu’à travers la partie longue du LP dans le cytoplasme, le précurseur de la protéine Env entre en contact avec la capside virale, expliquant la spécificité de l’interaction Gag-Env spécifique aux spumavirus (Pietschmann et al. , 1999; Lindemann et al. , 2001). Des études d’imagerie suggèrent que cette interaction a lieu dans le reseau trans-Golgi (Yu et al. , 2006). La spécificité de l’interaction Gag-Env chez les spumavirus prévient le pseudotypage des capsides non modifiées par d’autres glycoprotéines virales (Pietschmann et al. , 1999). Cependant, les capsides des orthoretrovirus peuvent à nouveau être pseudotypées par l’Env des spumavirus (Lindemann et al. , 1997). La réplication d’hybrides capables de se répliquer entre les cores des orthoretrovirus et les glycoprotéines des spumavirus est même autorisée (Shikova-Lekova et al. , 2003).

31 2.2.4 Les protéines auxiliaires

Les deux protéines auxiliaires codées par le génome des spumavirus sont la protéine Tas et la protéine Bet. Le transactivateur viral Tas est une phosphoprotéine de 36 kDa qui transactive à la fois le LTR5’ et le Promoteur Interne (PI) en fixant directement l’ADN (et non l’ARN comme c’est le cas de la protéine Tat du HIV-1) (He et al. , 1996; Karn, 1999). Le mécanisme structurel de cette transactivation n’est pas bien élucidé. Tas a une grande affinité pour le PI (Bodem et al. , 2007) qui a une activité de transcription basale et permet l’initiation de sa synthèse. Ainsi la transcription et la traduction sont accélérées et la protéine Tas est accumulée en quantité suffisante pour l’activation du LTR5’. Cela permet donc la transcription et la traduction des gènes Gag, Pol et Env. Il a été montré que l’expression in vitro du génome du spumavirus était inhibée par des micro ARN. Tas empêche cette inhibition et déclenche un cycle de réplication lytique. Ce fonctionnement reste non clarifié pour l’infection in vivo du spumavirus simien. En effet, la protéine de leucémie promyélocytaire (PML) fixe Tas et inhibe la réplication du spumavirus in vitro . Cependant, cette interaction ne contribue pas à l’établissement de la latence in vitro . L’importance de l’interaction PML-Tas in vivo est à l’heure actuelle inconnue. Les séquences des éléments de réponse à Tas ne présentent que peu de similitudes, limitant l’identification d’une séquence consensus (He et al. , 1996). Par ailleurs, il a été montré que les promoteurs de certains gènes cellulaires contiennent ces éléments de réponse (Kido et al. , 2002). Les domaines fonctionnels de Tas ont été caractérisés et comprennent un NLS, un domaine de transactivation, un domaine de multimérisation et un domaine de fixation à l’ADN (Chang et al. , 1995; He et al. , 1993; Lee et al. , 1994b).

La protéine Bet (62 kDa) est beaucoup moins bien caractérisée d’autant que l’absence d’homologie avec des protéines connues a limité son étude. Dans le cas du PFV, il s’agit d’une protéine de fusion entre les 88 premiers résidus de Tas et l’ORF2, dont l’ARNm est généré par épissage alternatif d’un intron de 301 pb dans l’ARNm codant Tas. Cette protéine n’est pas détectée dans les particules virales et est produite massivement au cours de l’infection (Giron et al. , 1993; Hahn et al. , 1994). Des mutations introduites dans la partie 3’ du génome viral ont révélé que seule la protéine Tas est nécessaire à la réplication virale, démontrant une absence de régulateur post-transcriptionnel (Lee et al. , 1994a; Yu and Linial, 1993). Bet aurait toutefois une fonction importante ; elle est exprimée en très grande quantité par rapport à Tas et à d’autres protéines virales in vitro et in vivo . Il a été suggéré que Bet était impliqué dans la latence virale in vivo . De manière intéressante, Bet du 32 spumavirus félin inactive l’APOBEC3 par un mécanisme différent de celui du VIH. Cependant, la protéine Bet du spumavirus simien n’aurait pas cette propriété (Lochelt et al. , 2005). On peut également noter la production d’une protéine de fusion entre les protéines Env et Bet (gp160, Env-Bet) (Giron et al. , 1998; Lindemann and Rethwilm, 1998). Cette glycoprotéine contient l’ensemble des déterminants de Env, à l’exception du domaine transmembranaire. En conséquence, elle est secrétée par la voie classique d’exocytose. La fonction de cette protéine n’est pas connue et son absence ne semble pas affecter la production virale (Lindemann and Rethwilm, 1998).

2.3 Cycle réplicatif des spumavirus

2.3.1 Les phases précoces

Comme dans le cas de tous les virus enveloppés, l’entrée virale se fait après reconnaissance du récepteur à la surface de la cellule cible par la protéine Env qui constitue la clé. Elle est responsable du processus d’accrochage à la cellule cible par sa partie SU et de fusion des membranes par sa partie TM assurant le relargage de la capside virale dans le cytoplasme (cf chapitre sur la glycoprotéine Env page 30). La protéine Env des spumavirus possède un très large tropisme même si, à l’heure actuelle, il n’existe aucune lignée cellulaire ne pouvant être infectée par ces virus. La nature du récepteur viral à la surface de ces cellules est toujours inconnue à ce jour mais semble être largement ubiquitaire (cf chapitre sur le tropisme des spumavirus page 40). Après l’entrée dans la cellule (figure 7), le core viral migre le long du réseau microtubulaire pour atteindre le centrosome, centre organisateur des microtubules, à proximité immédiate du noyau. Pour cela, Gag interagit avec la sous-unité LC8 du moteur microtubulaire dynéine/dynactine via un motif « coiled-coil » (acides aminés 160 à 180 de Gag) situé en position N-terminale de la protéine virale (Petit et al. , 2003). Les spumavirus, tout comme le VIH-1 et un grand nombre de virus à réplication nucléaire, empruntent les « autoroutes » de la cellule en détournant la machinerie cellulaire responsable du trafic intracellulaire pour se déplacer dans un milieu visqueux peu propice à la diffusion. Les capsides virales entrantes sont retrouvées concentrées autour du centrosome en microscopie électronique, mais jamais visualisées à proximité immédiate de la membrane nucléaire ni à l’intérieur du noyau, alors que la protéine Gag et le génome viral ont une localisation nucléaire à des temps plus tardifs (Saib et al. , 1997).

33 Cela implique l’existence d’une étape de démantèlement de la capside virale. Cette étape clé de décapsidation est particulièrement mal connue chez les rétrovirus ; pourtant elle semble être un point crucial de leur cycle réplicatif. Dans le cas des spumavirus, quelques heures après l’entrée dans la cellule, la protéine Gag subit des clivages protéolytiques internes faisant intervenir des protéases cellulaires mais également la protéase virale (Giron et al. , 1997). Le rôle de la protéase virale dans les étapes précoces du cycle réplicatif de divers virus, notamment l’adénovirus, est bien documenté. Dans le cas des rétrovirus, cette enzyme, classiquement responsable de la maturation de la particule virale dans les étapes tardives, a été impliquée dans les étapes précoces de l’infection dans le cas du PFV (Lehmann-Che et al. , 2005) mais également du MPMV ( Mason-Pfizer monkey virus ) (Rumlova et al. , 2003). Ces clivages précoces assurent l’étape indispensable de déstructuration de la capside virale. L’intervention de la protéase virale dans les étapes précoces a également été évoquée dans le cas du VIH-1, avec des implications thérapeutiques importantes (Nagy et al. , 1994).

Une étude récente conduite par Hartl et collaborateurs a permis l’identification d’un motif spécifique de l’ARN activant la protéase (PARM, pour « specific protease-activating RNA motif ») située dans la région Pol de l’ARN viral. Ce motif stimule l’activité PR in vitro et in vivo , mettant en évidence un nouveau et unique modèle d’activation de la protéase virale (Hartl et al. , 2011). Ce mécanisme est différent de celui des orthoretrovirus, où la protéase peut être activée même en l’absence d’ARN viral lors de l’assemblage des particules virales. Bien qu’il ait été montré que l’ integrase est importante pour l’absorption de Pol, l’activation de la protéase du spumavirus est indépendante de l’intégrase (Hartl et al. , 2011). Aussi, au moins deux molécules de PR-RT s’attachent au PARM, et seulement des ARN contenant le PARM présentent une activation significative de la protéase.

2.3.2 L’intégration

Une fois le génome viral importé dans le noyau, le génome viral s’intègre dans le génome hôte. Cette étape cruciale d’intégration est catalysée par l’intégrase virale. Chez les rétrovirus, cette étape a été tout d’abord décrite comme étant aléatoire, puis considérée comme étant favorisée dans des zones transcriptionnellement actives lorsque des études in vivo ont pu être menées. Enfin, au cours de ces dernières années, l’accès à la séquence complète du génome humain et les études de profil d’intégration à grande échelle ont mis en évidence des biais d’intégration pour les rétrovirus tels que le VIH-1, le MLV ou l’HTLV-1 (Schroder et al. , 2002; Wu et al. , 2003; Leclercq et al. , 2000; Bushman et al. , 2005). 34

Figure 7 : Cycle r éplicatif du PFV. La figure montre un aperçu de la réplication de PFV, avec des aspects uniques en rouge et des flèches, et des phases classiques en noir. Les différentes étapes de la transcription inverse conduisant à des particules de PFV avec de l'ADN infectieux. Le bourgeonnement des particules virales se fait à partir du réticulum endoplasmique. Figure adaptée de (Meiering and Linial, 2001).

De façon surprenante, les trois rétrovirus analysés de manière plus approfondie, le MLV, l’ASV ( avian sarcoma virus ) et le VIH, présentent des profils d’intégration différents. Dans le cas du MLV, Wu et al . (Wu et al. , 2003) ont localisé ces intégrations à proximité du site d’initiation de la transcription des gènes activement transcrits par l’ARN polymérase II. Bushman et collaborateurs (Bushman et al. , 2005) ont également mis en évidence une intégration préférentielle du VIH-1 et de vecteurs dérivés au niveau de ces gènes mais avec une distribution tout le long de la séquence génique. Quelques « hot spots » d’intégration ont pu aussi être mis en évidence (Bushman et al. , 2005).

35 L’ASV présente la distribution la plus aléatoire des trois virus étudiés avec un faible biais d’intégration dans les gènes activement transcrits (Mitchell et al. , 2004). Ce rétrovirus d’origine aviaire peut cependant ne pas trouver dans les cellules humaines les facteurs lui permettant de s’intégrer dans les sites habituellement ciblés dans le génome aviaire. L’intégration ne se fait donc pas au hasard mais plutôt dans des zones où l’expression des gènes qui les flanquent conditionne l’expression du virus. Le fait que ces trois rétrovirus possèdent des préférences de sites d’intégration différents dans le génome humain laisse supposer que chacun possède des mécanismes de ciblage différents et que la seule accessibilité au génome ne rend pas compte de la situation. Ces mécanismes de « guidage » du CPI sont activement étudiés. De plus, ces travaux semblent mettre en évidence un réel risque de mutagenèse insertionnelle. Ces constatations récentes ont eu un effet radical sur la recherche clinique en thérapie génique et remis en question l’utilisation des vecteurs rétroviraux sans maîtrise de leur site d’insertion (cf chapitre sur les vecteurs spumavirus et la thérapie génique, page 52). Dans le cas des spumavirus, deux publications précédentes précisent leurs profils d’intégration qui semblent différents de ceux décrits pour les trois autres rétrovirus évoqués précédemment (Trobridge et al. , 2006; Nowrouzi et al. , 2006). Tout comme les autres rétrovirus, les spumavirus présentent une distribution non aléatoire des sites d’intégration mais, en revanche, il n’existe pas de biais pour les séquences géniques. Une modeste préférence pour les sites d’induction de la transcription et les îlots CpG a été décrite mais elle est inférieure à ce qui a été décrit pour le MLV (Trobridge et al. , 2006). Ainsi, il semble que les vecteurs dérivés des spumavirus peuvent présenter un risque réduit de mutagenèse insertionnelle par rapport aux vecteurs dérivés du MLV ou des lentivirus. De plus, l’absence de pathogénicité associée à un risque réduit de mutagenèse insertionnelle offre aux vecteurs de type spumavirus des avantages sécuritaires par rapport aux autres vecteurs rétroviraux utilisés en thérapie génique (cf chapitre sur les vecteurs spumavirus et la thérapie génique page 52). Alors que les spumavirus présentent un certain nombre de caractéristiques communes avec les rétrotransposons de levure, rien n’est connu à ce jour concernant les mécanismes qui permettent le ciblage de l’intégration. En revanche, les facteurs cellulaires guidant l’intégration de Ty3 ou de Ty5, par exemple, sont parfaitement identifiés (Sandmeyer, 2003). Cette mécanistique reste à éclaicir pour tous les rétrovirus car sa connaissance est cruciale pour une utilisation raisonnée et rationnelle des vecteurs intégratifs de transfert de gènes dérivés de ces virus.

36 2.3.3 Les phases tardives

Il est communément admis qu’après intégration dans le génome hôte, la transcription des gènes viraux débute par la synthèse du transactivateur viral Tas à partir du promoteur interne, permettant ensuite l’expression des protéines structurales Gag et Env et enzymatiques Pol à partir du LTR5’. Les spumavirus s’assemblent dans le cytoplasme de façon comparable aux Betaretroviridae (type B/D). La capside s’assemble après adressage et concentration des protéines Gag en un site du cytoplasme grâce au motif « CTRS like ». La multimérisation se fait grâce aux motifs « coiled- coil » décrits précédemment. L’ARN génomique est encapsidé par interaction avec Gag via les boîtes GR. La boite GRI demeure le déterminant majeur de l’incorporation, mais toutes les boîtes GR semblent intervenir pour une encapsidation efficace (Stenbak and Linial, 2004). En revanche, il semble que l’ARN viral, contrairement à ce qui se passe dans le cas des orthorétrovirus (Muriaux et al. , 2001; Yu et al. , 2001; Rein, 1994), ne soit pas nécessaire à l’assemblage de la particule puisque des virus mutants de Gag incapables d’encapsider l’ARN continuent à s’assembler et à bourgeonner (Stenbak and Linial, 2004). Il faut noter que le recours indispensable à l’ARN pour l’assemblage du VIH-1 a aussi été récemment remis en cause (Wang et al. , 2004). Cet ARN viral possède toutes les caractéristiques d’un ARN messager mature cellulaire. Il doit donc être sélectivement encapsidé dans le virion. Pour cela, il comporte un signal d’encapsidation, généralement localisé en 5’ du génome viral. Dans le cas du PFV, cette séquence n’a pas été clairement localisée. Cependant, des séquences CAS (« cis acting sequences »), indispensables pour transférer un génome vecteur de spumavirus, ont été identifiées (Mergia and Heinkelein, 2003). De façon remarquable, deux CAS ont été cartographiées, CASI en 5’ du génome viral et CASII en 3’ du gène pol , ce qui constitue une nouvelle caractéristique unique des spumavirus au sein des rétrovirus. L’expression de la protéine Pol à partir d’un ARNm pol pose la question de son incorporation dans la particule virale. Dans le cas des orthorétrovirus, le mode d’expression de Pol permet de garantir un ratio Gag : Pol de l’ordre de 10-20 : 1). De fait, l’incorporation efficace de Pol dans la particule se fait grâce à sa fusion avec Gag, le clivage protéolytique n’ayant lieu que dans la particule préformée (Swanstrom and Wills, 1997). Dans le cas des spumavirus, un certain nombre de publications ont documenté le rôle essentiel de l’ARN génomique (Heinkelein et al. , 2000b; Heinkelein et al. , 1998) en tant que prérequis indispensable à l’incorporation de Pol dans la particule virale (Heinkelein et al. , 2002). Des séquences d’encapsidation de Pol (PES), ainsi que d’autres séquences nécessaires pour 37 l’activité de la protéase ont été très récemment localisées et caractérisées au sein des CASI et CASII de cet ARN (Peters et al. , 2005; Wiktorowicz et al. , 2009; Hartl et al. , 2011). La délétion de ces sites n’invalide pas l’incorporation de l’ARN. Ce qui montre bien qu’on peut dissocier les séquences d’encapsidation de l’ARN de celles de Pol (Peters et al. , 2005), définissant une cartographie plus fine des séquences cis indispensables à conserver au sein d’un génome vecteur. Il a également été montré que seul le précurseur Pol entier est incorporé, suggérant que les clivages protéolytiques en PR-RT et IN n’ont lieu qu’après l’incorporation dans la particule virale (Peters et al. , 2005; Lee and Linial, 2008; Roy and Linial, 2007; Heinkelein et al. , 2002). Néanmoins, se pose toujours la question de la régulation du ratio Gag : Pol au sein d’une particule virale. Des données récentes révèlent que cette incorporation (ratio Gag : RT de 15,8 : 1 et Gag : IN de 7,8 : 1) est aussi efficace que dans le cas d’une fusion GagPol d’orthoretrovirus (Cartellieri et al. , 2005). Ces résultats soulèvent d’autres interrogations : comment par exemple expliquer une efficacité d’incorporation différente entre IN et RT alors que seul le précurseur Pol semble incorporé puis clivé (Peters et al. , 2005)? Comment concilier ce ratio avec la découverte des PES laissant supposer l’incorporation de deux molécules de Pol par ARN génomique? On peut émettre l’hypothèse d’un complexe plus large entre les trois partenaires Gag, Pol et ARN génomique pour expliquer cette incorporation efficace des protéines enzymatiques du spumavirus. Finalement, il apparaît que les spumavirus mettent en place une stratégie d’incorporation de Pol totalement différente de celle des rétrovirus et des hépadnavirus. Enfin, la capside ainsi préformée dans le cytoplasme bourgeonne préférentiellement au niveau des membranes internes telles que le réticulum endoplasmique (RE). Cela peut être expliqué par l’existence d’un motif dilysine de rétention au RE présent dans la partie C-terminale de la protéine d’enveloppe. Néanmoins, de façon intéressante, ce motif n’est pas essentiel à la réplication in vitro (Goepfert et al. , 1999; Goepfert et al. , 1997). Il est à noter que les spumavirus EFV et BFV ne présentent pas ce motif dilysine et bourgeonnent préférentiellement depuis la membrane plasmique (Kong et al. , 2005; Tobaly-Tapiero et al. , 2000). Comme mentionné auparavant et de façon similaire au virus de l’hépatite B (HBV), les spumavirus ne bourgeonnent pas en l’absence de leur protéine d’enveloppe, contrairement aux orthoretrovirus. Bien qu’ayant une structure et une maturation classique d’enveloppe rétrovirale, la protéine Env de FV possède un peptide signal (PS) particulièrement long qui a clairement été détecté dans la particule virale extracellulaire, ce qui n’a jamais été démontré pour les autres rétrovirus (Lindemann et al. , 2001; Wilk et al. , 2001). De ce fait, il est très probable que le PS des spumavirus assure d’autres rôles que celui d’adresser la glycoprotéine d’enveloppe au lumen du RE. En effet, une interaction physique directe

38 et spécifique a été mise en évidence in vitro entre le PS et la partie Nter de Gag (Wilk et al. , 2001). Cette association réversible de faible affinité assure une interaction transitoire entre ces deux protéines au cours de la morphogenèse de la particule virale. Etant donné sa localisation du côté cytoplasmique du RE, le PS peut interagir avec la capside qui s’assemble dans le cytoplasme, puis se retrouver à l’intérieur de la particule virale après clivage et bourgeonnement dans la lumière du RE (Geiselhart et al. , 2003). De plus, il constitue un signal de rétention intracellulaire en l’absence d’expression des autres protéines virales (Lindemann et al. , 2001). Il est indispensable à la réplication virale contrairement au motif dilysine. Cette interaction Gag-Env semble donc être responsable de l’adressage des capsides virales préformées dans le cytoplasme au site de bourgeonnement au niveau du RE (figure 7), remplaçant le signal de myristylation classique des autres rétrovirus (Geiselhart et al. , 2003). Du fait de cette interaction indispensable, il n’est pas possible de pseudotyper les particules virales de spumavirus avec d’autres enveloppes virales, comme cela est classiquement réalisé dans le cas de vecteurs de transfert de gène (Baldwin and Linial, 1999; Fischer et al. , 1998; Pietschmann et al. , 1999). Il semble donc que, de façon originale, le PS des spumavirus soit impliqué dans l’adressage de la glycoprotéine Env à la voie de sécrétion de la cellule et qu’il joue également un rôle crucial dans la morphogenèse de la particule virale. En revanche, l’absence d’Env n’influence ni la formation des capsides qui s’assemblent normalement et restent intracellulaires, ni l’encapsidation de l’ARN et l’incorporation de Pol (Baldwin and Linial, 1998). Enfin, il faut noter que tout comme l’HBV, l’Env du FV est capable de former des VLP ( virus like particles ) en l’absence de toute autre protéine virale (Shaw et al. , 2003).

2.4 Particularités des spumavirus

De nombreuses particularités singularisant ces rétrovirus complexes ont conduit à la formation de la sous-famille des spumavirinae. Tout d’abord, la conversion de l’ARN génomique en ADN double brin, donnant naissance au provirus intégré dans le génome de la cellule hôte, est le processus clé de transcription inverse (RT) de la famille des Retroviridae . Dans le cas des Orthoretrovirinae , la RT a lieu durant les étapes précoces de l’infection, après la pénétration dans la cellule hôte et au cours du désassemblage de la particule virale, même si certains produits précoces de transcription inverse semblent pouvoir être détectés dans les virions issus de cellules infectées (Lori et al. , 1992; Trono, 1992). Les spumavirinae ont la particularité d’utiliser deux stratégies distinctes de réplication en fonction de la cellule cible (Trobridge and Russell, 1998; Zamborlini et al. , 2010). La première

39 nécessite une étape précoce de la transcription inverse alors que la deuxième consiste à la contourner grâce à la présence dans la particule virale d’un ADN linéaire infectieux. Cet ADN trouvé dans des particules de spumavirus extracellulaires suggère fortement qu’une partie de l’ARN génomique viral est rétrotranscrite après l’intégration provirale dans les cellules productrices et incorporé dans les virions (Yu et al. , 1999; Yu et al. , 1996a; Moebes et al. , 1997). Cette caractéristique rapproche les spumavirus des Hepadnaviridae , virus à ADN possédant un intermédiaire ARN avec une RT tardive. De plus, l’existence de cet ADN infectieux dans les étapes tardives de l’infection, rend possible un phénomène de rétrotransposition intracellulaire (RTI), c’est-à-dire l’intégration d’un ADNc viral sans phase extracellulaire. Ce mode de réplication est retrouvé notamment chez des retrotransposons de levure, rétroéléments ne possédant pas de phase extracellulaire (Sandmeyer, 1992). La RTI est un phénomène rare mais possible dans le cas des Orthoretrovirinae (Heidmann et al. , 1988; Heidmann and Heidmann, 1991), mais il est 3 à 4 fois plus fréquent pour le PFV (Heidmann et al. , 1988; Heinkelein et al. , 2000a). A ce jour, les conditions précises de cette rétrotransposition et sa fonction biologique restent inconnues.

2.5 Tropisme des spumavirus

A ce jour, le récepteur cellulaire des spumavirus n’est pas connu. Ce récepteur serait une molécule ubiquitaire puisque même les cellules de reptiles et de poissons peuvent être infectées (Hill et al. , 1999; Rethwilm, 2010). Le caractère ubiquitaire de ce récepteur est très probable puisque les spumavirus infectent des cellules épithéliales ou d’origine fibroblastique chez lesquelles l’infection induit un phénotype cytopathique sous forme de mousse. Ils infectent aussi des cellules primaires de PNH ou des explants de tissus. Afin d’identifier cette molécule ubiquitaire, plusieurs outils ont été developpés, en particulier par réduction de la région Env-SU, nécessaire à l’infectivité virale (Berg et al. , 2003). La fusion de certains domaines de liaison des récepteurs avec des fractions d’IgG a aussi été construite pour la caractérisation de l’interaction Env-récepteur. Actuellement, 15 sites potentiels ont été mis en évidence au niveau de l’enveloppe du PFV, dont 14 sont effectivement utilisées (Luftenegger et al. , 2005). Ils peuvent être N-glycosilés lors d’évènements post-traductionnels. En effet, la glycosilation des Env chez les spumavirus à partir de différentes espèces de sites conservés (en particulier, N8 dans SU et N13 dans TM) semble être cruciale pour la réplication virale (Luftenegger et al. , 2005).

40 La connaissance du rôle de la glycosylation dans la fonction de Env et sa comparaison avec la glycosilation observée chez Env du VIH sont importantes. Dans la mesure où le récepteur est identifié, l’approfondissement de la caractérisation de la glycosylation de Env du PFV et la construction de mutants avec une glycosylation déficiente consitutent des outils précieux permettant l’étude de l’interaction Env-récepteur (Rethwilm, 2010). Concernant l’absorption cellulaire des virions de spumavirus, il a été établi qu’elle a probablement lieu suivant une voie déjà mise en évidence chez d’autres virus enveloppés tel que le virus de la grippe ou le VSV (Picard-Maureau et al. , 2003). Ce dernier est un virus dont l’absorption est dépendante de l’acidification de Env pour la génération de la molécule de fusion compétente (Picard-Maureau et al. , 2003). Les résultats obtenus avec différents réactifs lysomotropiques, tels que la concanamycine A, le chlorure d’ammonium, la méthylamine et la bafilomycine A1 montrent une absorption cellulaire dépendante du PH. En revanche, ceux obtenus avec la chloroquine sont divergents. Tous ces travaux semblent indiquer qu’il existe des différences non comprises par rapport à d’autres glycoprotéines ayant une activité de fusion dépendante du PH. Une autre démarche consiste en la recherche du réservoir cellulaire des spumavirus par l’étude de plusieurs cellules du sang périphérique. Chez des espèces animales, les cellules T CD4 + et les monocytes ont été décrits comme réservoirs potentiels (von Laer et al., 1996). Chez l’Homme, les résultats sont moins concluants et controversés. Seules les cellules T CD8 + sont décrites comme porteuses du virus chez deux personnes infectées par le spumavirus simien. Chez un troisième individu, ce sont les monocytes, les lymphocytes B qui sont porteurs de l’ADN proviral, alors que les lymphocytes T demeurent négatifs (von Laer et al. , 1996; Callahan et al. , 1999). Les spumavirus simiens isolés chez ce sujet discordant présentent une délétion au niveau de la protéine Bet (Callahan et al., 1999), ce qui peut être noté comme une différence de tropisme, ou l’implication de Bet dans l’immunité d’inhibition innée. D’autres études de tissus et d’organes ont révélé une persistance généralisée, mais les cellules types de ces tissus qui portent l’ADN proviral n’ont pas été identifiées (Falcone et al. , 1999; Murray et al. , 2006).

41 3. Les différents types de spumavirus

A l’heure actuelle, il existe 4 types différents de spumavirus décrits:
Les spumavirus de bovins
Les spumavirus de félins
Les spumavirus d’équins
Les spumavirus simiens

3.1 Les spumavirus de bovins (Bovine Foamy Virus [BFV])

Dès les années 1960, des observations épidémiologiques avaient suggéré que le lymphosarcome des bœufs avaient une origine virale (Dutcher et al., 1967). Ainsi, plusieurs publications ont décrit la présence de corps ressemblant à des particules virales dans des tissus provenant d’animaux infectés. En 1969, un agent viral a été mis en évidence dans les ganglions, la rate chez 4 de 15 bœufs atteints de lymphosarcome (Malmquist et al., 1969), et dans le lait et le colostrum de vaches infectées (Miller and van der Maaten, 1982). Cet agent viral a été défini comme responsable de la formation de syncytia dans des cultures d’embryons de rate de bovin, conduisant à une rapide lyse cellulaire. Des analyses en microscope électronique ont révélé la présence d’un virus enveloppé, portant des projections protubérantes (14- 18 µm), similaires à la description faite chez les spumavirus de PNH. La présence de cet agent chez un large nombre de bœufs sains n’a pas permis d’établir une relation significative entre ce virus et la survenue d’un lymphosarcome (Johnston, 1974; Johnson et al. , 1988). Des tests sérologiques (immunodiffusion, western blot et immunofluorescence indirecte) et moléculaires (amplification enzymatique) ont démontré qu’en fait, entre 30% et 45% de bœufs étaient porteurs du bovine foamy virus (BFV, initialement dénommé bovine syncitial virus ou bovin spumavirus) (Kertayadnya et al. , 1988; Jacobs et al. , 1995; Pamba et al. , 1999). La structure moléculaire des BFV, publiée par Renshaw et al , démontre que ce provirus de 12 kb présente les mêmes caractéristiques que son homologue simien PFV, à savoir 2 LTR (long terminal repeats) aux extrémités du génome viral et un gap unique sur le brin positif de l’ADN (Renshaw and Casey, 1994).

42 3.2 Les spumavirus de félins (Feline Foamy Virus [FFV])

En 1969, un nouveau spumavirus a été isolé chez des chats domestiques, normaux et malades, en raison de la survenue d’effets cytopathogènes caractéristiques des spumavirus, après culture in vitro d’échantillons de tissus frais (Riggs et al. , 1969; Fabricant et al. , 1969). Les analyses morphologiques, biologiques et biochimiques ont démontré que FFV (initialement dénommé FSFV ou FeSFV pour feline syncytium-forming virus) appartient à la sous- famille des spumavirus des Retroviridae. Tout comme le BFV, le FFV est répandu dans des populations sauvages et domestiques de chats grâce aux surveillances immunologiques qui ont montré des taux de séroprévalence de FFV compris entre 31% et 70%, et variables en fonction de l’âge et de l’origine géographique (Winkler et al. , 1997b; Winkler et al. , 1999; Daniels et al. , 1999). Bien que la taille du provirus et la structure de l’ADN viral aient été étudiés sur le plan biochimique à la fin des années 1970 (Chiswell and Pringle, 1977; Chiswell and Pringle, 1979b; Chiswell and Pringle, 1979a), son clonage et son expression moléculaire n’ont été étudiés que récemment (Winkler et al. , 1997a; Bodem et al. , 1996; Helps and Harbour, 1997). Cette analyse a conduit à l’identification de deux serotypes distincts, la différence majeure étant confinée au niveau de la glycoprotéine de surface SU de ENV. Bien qu’aucune pathologie spécifique ne soit liée au FFV, la récurrence du co-isolement du FFV chez des chats infectés par le FIV a soulevé le rôle de cofacteur que peut jouer le « feline acquired immunodeficiency virus ». En outre, il a été démontré que le FFV ne facilite pas la progression vers des pathologies induites par le FIV, bien que les deux virus aient le même mode de transmission (Winkler et al. , 1999; Zenger et al. , 1993).

3.3 Les spumavirus d’équins (Equine Foamy Virus [EFV])

La présence de spumavirus a récemment été étudiée chez des chevaux domestiques. Un nouvel isolat de FV a été isolé et appelé EFV. Après la co-culture de cellules fraîches du sang périphérique de chevaux avec des cellules permissives humaines U373MG, un effet cytopathogène de type mousseux a été rapidement observé. Des virions de spumavirus étaient clairement présents dans ces cellules (observation en microscopie électronique). La séquence de PBS (pour « primer binding site ») de 18 pb utilisée comme sonde a permis de cloner entièrement le génome viral, démontrant que ce virus appartient à la sous-famille des Spumavirinae (Tobaly-Tapiero et al., 2000). Des infections expérimentales de lapins ont conduit à la production d’anticorps dirigés contre les polypeptides de EFV, permettant d’étudier les protéines virales sur le plan biochimique, (Lecellier et al., 2002).

43 3.4 Les spumavirus simiens (simian foamy virus [SFV])

3.4.1 Origine et prévalence des spumavirus simiens

La première description de l’infection par les spumavirus simiens a été réalisée en 1954 dans une culture cellulaire de rein de singe rhésus ( Macaca rhesus ) (Enders and Peebles, 1954). L’infection se caractérisait par l’apparition d’un effet cytopathogène (ECP) représenté par la présence de cellules géantes multinuclées (ou syncitia) présentant de nombreuses vacuoles et donnant un aspect mousseux à la culture. L’aspect typique de l’ECP, a été à l’origine de leur nom d’«agent spumeux» (spuma en latin signifie écume) ou « Foamy Virus » («foam» en anglais signifie mousse). Le prototype simien est le Simian Foamy Virus (SFV). La prévalence du spumavirus simien chez des PNH naturellement infectés est généralement élevé mais peut varier suivant les espèces (Meiering and Linial, 2001; Saib, 2003; Bastone et al. , 2003). Des études épidémiologiques indiquent que chez des populations de primates vivant en captivité, la séroprévalence peut varier entre 75% et 100% chez les adultes, mais est généralement plus faible chez les plus jeunes (Blewett et al. , 2000; Broussard et al. , 1997; Hussain et al. , 2003; Calattini et al. , 2006b). Des observations similaires ont été faites chez des groupes de PNH en semi-liberté en Asie (Jones-Engel et al. , 2007; Jones-Engel et al. , 2005). Malheureusement, ces données de séroprévalence sont basées sur le suivi d’un faible nombre d’espèces de PNH vivant en captivité et le plus souvent utilisés dans des recherches biomédicales (Meiering and Linial, 2001; Calattini et al. , 2006b).

3.4.2 Transmission des spumavirus simiens chez les primates non humains et des primates à l’Homme

3.4.2.1 . Transmission des spumavirus simiens chez les primates non humains

La recherche des modes de contamination a montré que les spumavirus simiens sont présents à forte concentration dans la salive des animaux infectés (Murray et al. , 2006; Falcone et al. , 2003; Falcone et al. , 1999). La muqueuse orale est en fait le site privilégié de la réplication virale chez les singes verts d’Afrique (AGM) (Falcone et al., 1999). Des études récentes ont démontré que la réplication des spumavirus simiens était limitée à la muqueuse orale dans des infections naturelles chez des macaques (Murray et al. , 2006; Murray et al. , 2008).

44 Au total, ces résultats suggèrent fortement une transmission via la salive au cours des morsures, éclaboussures et léchages. De même, une étude menée dans une colonie de macaques a permis de confirmer que les spumavirus simiens étaient transmis au cours des morsures, principalement chez des sub-adultes ou jeunes adultes qui participent à des compétitions pour l’accès aux partenaires sexuelles (Calattini et al., 2006b). D’autres études conduites dans des colonies de babouins ont laissé supposer que des transmissions sexuelle et/ou verticale à travers des contacts de salive peuvent avoir lieu (Blewett et al. , 2000; Broussard et al. , 1997). Finalement, une récente étude suggère que la transmission dans une colonie de macaques en semi-liberté intervient particulièrement à maturité sexuelle (Jones- Engel et al., 2007).

3.4.2.2 Les infections à spumavirus simien chez les primates non humains

A l’opposé des infections par SIV et STLV qui sont géographiquement limitées, celles des spumavirus simiens sont généralisées chez les PNH. La plupart des espèces simiennes du Nouveau et de l’Ancien Monde et les grands singes sont porteurs de spumavirus simien (Hussain et al. , 2003; Meiering and Linial, 2001). La désignation de départ des spumavirus a été faite suivant les serotypes, ce qui a permis de caractériser les infections chez des macaques rhésus ( macaca mulatta ), les singes verts d’Afrique (cercopithecus aethiops ), et les chimpanzés ( Pan troglodytes ) (Meiering and Linial, 2001; Calattini et al. , 2006b; Liu et al. , 2008; Morozov et al. , 2009). Avec l’isolement d’un même serotype de spumavirus simien chez plusieurs espèces de PNH, et la caractérisation moléculaire de chaque isolat, les spumavirus simiens sont désormais désignés par le nom de leur hôte (Schweizer and Neumann-Haefelin, 1995; Broussard et al. , 1997). D’autres espèces sont infectées par le spumavirus simien, tels les babouins ( Papio sp ) (Broussard et al. , 1997; Blewett et al. , 2000), les drills ( Mandrillus leucophaeus ), les mandrills (Mandrillus sphinx ) et les gorilles ( Gorilla gorilla ) (Calattini et al., 2004). La description des infections dans la majorité des espèces simiennes démontre la facilité des spumavirus simiens à se propager, contrairement aux autres rétrovirus de PNH.

3.4.2.2.1 Les spumavirus simiens en Afrique

L’Afrique est de loin le continent qui compte le plus d’espèces de primates. Ces derniers sont des hôtes naturels de plusieurs rétrovirus comme les SIV et les STLV.

45 La plupart des infections à spumavirus de PNH en Afrique ont été décrites à travers l’infection des humains (cf chapitre sur la transmission des spumavirus simiens chez l’Homme dans la nature, page 50). Les études qui rendent compte de l’infection directe des espèces simiennes par les spumavirus simiens ont mis en évidence l’infection chez les vervets (Kaschula et al. , 1978; Broussard et al. , 1997), les Hamlyn's guenons, les babouins et les singes patas (Broussard et al. , 1997; Blewett et al. , 2000). La mise en place de techniques de diagnostic assez efficaces a permis de tester des centaines de prélèvements pour la recherche de spumavirus simiens chez les singes d’Afrique (Hussain et al., 2003). En 2004, Calattini et collaborateurs décrivent pour la première fois l’infection chez le gorille, le mandrill et le drill (Calattini et al., 2004) dans la région d’Afrique centrale. Par la suite, la même équipe décrit des infections chez des chimpanzés, confirmant ainsi la particularité de la région pour les infections rétrovirales d’origine simienne (Calattini et al., 2006a). La transmission de ces virus peut se faire au sein d’une même espèce, mais parfois d’une espèce à une autre comme décrite par leendertz et collaborateurs chez des colobes et des chimpanzés dans le parc national de Taï en Cote-d’Ivoire (Leendertz et al. , 2008; Morozov et al. , 2009; Leendertz et al. , 2010). Les crottes des chimpanzés de ce parc national ont constitué avec d’autres en Afrique centrale et orientale les prélèvements testés dans la grande étude menée par Liu et collaborateurs qui démontrent que toutes les espèces de chimpanzés sont infectées par les spumavirus simiens (Liu et al., 2008).

3.4.2.2.2 Les spumavirus simiens en Asie

L’étude de l’infection des PNH d’Asie a souvent été couplée à celle des PNH d’Afrique; c’est le cas de l’infection chez les macaques rhésus décrite dans une étude comprenant à la fois des singes d’Afrique et des humains (Schweizer et al., 1995) et d’autres espèces (Hussain et al., 2003). Une très forte prévalence du spumavirus simien (97,4%) chez les macaques rhésus a été décrite dans un temple au Népal (Jones-Engel et al., 2006). Une étude entièrement consacrée aux singes d’Asie a permis de mettre en évidence l’infection des Macaca cyclopsis par le spumavirus simien (Johnston, 2000). Par ailleurs, des orangs-outans vivant en semi-liberté ont été testés pour plusieurs agents pathogènes, dont les spumavirus. Le taux de prévalence des spumavirus chez cette espèce de primate était de l’ordre de 75% (Kilbourn et al. , 2003; Verschoor et al. , 2004).

46 Une autre espèce de macaques ( Macaca fascicularis ) est infectée par le spumavirus simien, comme cela a été démontré lors d’une étude conduite en Indonésie (Schillaci et al. , 2005; Engel et al. , 2006). Tout comme pour les spumavirus simiens chez les PNH d’Afrique, les spumavirus circulant en Asie ont souvent été décrits lors de l’étude de transmissions inter espèces chez des personnes vivant en contact avec des primates non humains.

3.4.2.2.3 Les spumavirus simiens dans le reste du monde

En réalité, les études menées dans le reste du monde, particulièrement en Europe et en Amérique ont souvent porté sur les PNH d’Asie et d’Afrique. Ces animaux sont gardés dans des zoos, ce qui facilite leur étude. Ce fut par exemple le cas des Macaca tonkeana , infectés par le spumavirus simien dans le zoo de Strasbourg en France (Calattini et al., 2006b). L’infection de PNH a aussi été rapportée dans la réserve naturelle européenne de Gibraltar, chez des Macaca sylvanus (Engel et al., 2008). Les autres études réalisées en Europe et aux Etats-Unis concernent plus spécifiquement le risque de transmission des spumavirus simiens à l’homme dans des populations à risque travaillant dans des zoos.

3.5 Transmission inter espèces des spumavirus à l’Homme

3.5.1 La promiscuité Hommes / primates non humains

La promiscuité hommes/PNH est particulièrement significative en Afrique subsaharienne où chaque animal peut héberger un ou plusieurs pathogènes potentiellement dangereux pour l’homme. Du fait de sa faune, cette région constitue un important réservoir de virus sauvages. La chasse est largement pratiquée dans les forêts d’Afrique centrale. Certaines données suggèrent qu’à la suite de récession économique et/ou troubles politiques et sociaux dans plusieurs pays, la pratique de la chasse en brousse est en augmentation (Bowen-Jones E & Pendry, 1999). La chasse et la consommation de viande de brousse impliquent plusieurs comportements à haut risque pour les populations, par rapport à la transmission des virus. En premier lieu, les chasseurs peuvent être en contact avec des carcasses d’animaux fraîchement tuées et le contact sang-sang peut se réaliser, notamment si les chasseurs présentent des égratignures aux mains. Les carcasses de grande taille sont découpées pour faciliter leur transport,

47 et débitées de nouveau avant d’être vendues ou préparées. Cette population d’individus représente donc une porte d’entrée privilégiée de nouveaux agents pathogènes (Tutin, 1999). Cette promiscuité hommes/PNH explique la possibilité d’infections humaines à spumavirus, en particulier chez des chasseurs ayant été mordus par des PNH pendant des parties de chasse (Calattini et al., 2007). En effet, l’équipe de Calattini a pu diagnostiquer l’infection à spumavirus chez certains chasseurs mordus par des gorilles ou des chimpanzés. Ces données suggèrent fortement que dans la nature, le contact entre du sang humain et la salive d’un grand singe adulte ou d’un petit singe est un facteur clé de la transmission des spumavirus simiens à l’homme.

3.5.2 Découverte des spumavirus simiens chez l’homme

La première description des spumavirus simiens chez l’homme est intervenue en 1971. La souche a été nommée HFV (Human Foamy Virus). Initialement, ce virus fut considéré comme le prototype humain des spumavirus (Achong and Epstein, 1978; Achong et al. , 1971). Cependant, il est maintenant clairement démontré que cette souche est un variant d’origine simienne acquise lors d’une zoonose (Herchenroder et al., 1994). La souche HFV a été rebaptisée PFV (Prototypic foamy virus). Toutefois, certains individus dont l’activité professionnelle (technicien animalier, vétérinaire) ou les pratiques culturelles (chasseurs en Afrique) exposent à des contacts étroits avec des PNH ont été accidentellement infectés par des spumavirus simiens (Schweizer et al. , 1997; Jones-Engel et al. , 2005).

4. Histoire naturelle de l’infection de l’Homme par les spumavirus simiens

4.1 Transmission et prévalence des spumavirus simiens chez l’Homme dans des zoos

La transmission des spumavirus de PNH à l’homme peut intervenir principalement à travers des morsures, au cours des contacts avec des liquides corporels ou au moment du dépeçage (Wolfe et al. , 2004; Jones-Engel et al. , 2005; Calattini et al. , 2007). Certains auteurs ont approfondi la transmission en évaluant le risque de passage intrafamilial des spumavirus simiens . Des épouses de certains travailleurs ou chasseurs ont été testées pour évaluer la transmission sexuelle. Bien que les époux aient reconnu avoir eu des contacts sexuels depuis en moyenne 20 ans, les résultats sérologiques et moléculaires sont restés négatifs (Heneine et

48 al., 1998). Calattini et al ont aussi étudié la présence des spumavirus chez des femmes et ont abouti aux mêmes résultats négatifs (Calattini et al., 2007). Plusieurs travailleurs infectés par le spumavirus simien identifiés dans une étude du CDC ont reconnu avoir donné du sang, soulevant la question de la transmission du spumavirus simien lors de transfusions sanguines et de produits dérivés. La recherche des spumavirus simiens chez ces personnes ayant reçu des produits sanguins n’a montré aucune évidence de l’infection par ce virus (Boneva et al., 2002). Toutefois des mesures de précaution ont été prises pour que des personnes infectées par le spumavirus simien ne donnent pas leur sang tant que le risque de transmission par transfusion n’a pas été bien défini. La première évidence de la présence d’un spumavirus simien chez l’homme a été décrite en 1995 par Schweizer et al. (Schweizer et al., 1995), grâce au suivi de 41 personnes travaillant au contact de PNH dans des laboratoires ou animaleries. Ils ont reporté la présence d’anticorps anti- spumavirus simien, confirmée par l’obtention de séquences de gènes de spumavirus simien à partir d’ADN extrait du sang périphérique de ces travailleurs (Schweizer et al., 1995). L’épidémiologie des personnes positives a relevé des cas de morsure accidentelle depuis plusieurs années, suggérant des infections asymptomatiques par le spumavirus simien pouvant alors persister dans un état de latence (Schweizer et al., 1995). Cette latence/persistance virale a été décrite chez un animalier qui aurait été infecté 20 ans auparavant, après une morsure par un singe vert d’Afrique (AGM) (Schweizer et al., 1997). Cependant, la première grande étude de surveillance sur l’infection de l’homme par les spumavirus simiens a été menée chez des travailleurs exposés aux PNH dans le cadre de leurs occupations professionnelles (Heneine et al., 1998). Sur 231 personnes, 4 ont été détectées séropositives pour le spumavirus simien. Parmi ces 4 travailleurs, un avait été mordu par un AGM, deux autres personnes par des babouins, alors que le quatrième déclarait avoir des blessures à la suite soit d’une agression par un chimpanzé, soit par un babouin. Cette étude de surveillance en a suscité d’autres, en Amérique du Nord, notamment celle ayant effectué le suivi d’une cohorte de 422 travailleurs d’un zoo. Sur 133 personnes qui s’occupaient spécifiquement des PNH, 4 étaient séropositives (Sandstrom et al., 2000). Dans un centre de primatologie au Canada, 2 travailleurs sur 46 ont présenté une infection par le spumavirus du macaque. Ils ont tous les deux reconnu s’être longtemps occupés des macaques rhésus et Cynomolgus , avec une notion de morsures. (Brooks et al., 2002). Cette étude fut la première démonstration du passage du spumavirus simien d’un PNH asiatique à l’homme. Dix autres cas d’infection ont été reportés dans une population de 187 personnes s’occupant de PNH (Switzer et al., 2004). Les analyses phylogénétiques ont démontré que 8 des 10 personnes

49 infectées portaient un spumavirus de chimpanzés (7 de pan t. verus et 1 de pan t. vellerosus ), une portait un virus de babouin et pour la dernière, aucune étude moléculaire n’a pu être conduite.

4.2 Transmission et prévalence des spumavirus simiens chez des humains dans la nature

La démonstration de l’infection des personnes travaillant en contact avec des animaux de zoos et de laboratoires a constitué une base pour la recherche des infections de l’homme par ces rétrovirus dans la nature. Les premières études ont eu lieu en Afrique centrale et ont été effectuées chez des villageois en contact avec du sang et des liquides corporels de PNH en forêt (Wolfe et al., 2004). Sur un total de 1099 individus prélevés au Cameroun, 10 ont présenté des anticorps contre le spumavirus simien et c’est seulement chez 3 que des séquences d’ADN de ce virus ont été détectées dans les cellules du sang périphérique. L’analyse de ces séquences a révélé que ces trois infections avaient une origine simienne: De Brazza guenon (n=1), mandrill (n=1), et un gorille (Wolfe et al., 2004). Ces trois personnes ont déclaré avoir dépecé et consommé de la viande de singe, et deux d’entre elles étaient chasseurs. Cette étude est la première qui confirme qu’ in natura , des contacts avec des animaux, à travers la chasse, le dépeçage, peuvent jouer un rôle dans la transmission des rétrovirus (Wolfe et al. , 2004; Apetrei et al. , 2004). Une étude conduite sur une population particulière du sud Cameroun a consisté à tester 1164 plasmas chez des adultes pygmées Bakola et Bantus (Calattini et al., 2007). Vingt individus étaient considérés séropositifs (1.7 %), mais seulement 4 échantillons ont montré une évidence moléculaire de ces infections par amplification PCR. L’épidémiologie a révélé que 3 des 4 individus (2 pygmées et 1 Bantu) étaient des chasseurs et avaient été mordus par des gorilles 25 à 35 ans plus tôt (Calattini et al., 2007). La quatrième personne était une femme, jamais mordue par un PNH, mais ayant eu des contacts avec de la viande de singe au moment du dépeçage et de la préparation des repas. Les analyses phylogénétiques ont démontré que les trois personnes mordues portaient un spumavirus de gorille, alors que la femme Bantu était infectée par un virus de chimpanzé. Toujours dans le sud du Cameroun, l’équipe de Calattini s’est focalisée sur des populations de chasseurs vivant en forêt, et en contact permanent avec des PNH. Ils ont prélevé et testé 102 Bantu et pygmées Baka (84 hommes et 18 femmes); 29 avaient été mordus par des chimpanzés/gorilles, 56 par des Cercopithecus nictitans ou mandrills, et 17 par des PNH inconnus. Au total, dans cette enquête, dix individus étaient séropositifs, dont 9 ont été confirmés positifs par PCR. Sept de ces 9 individus avaient été mordus par un PHN (gorille, 4 personnes ; chimpanzé, 2 personnes ; gorille et chimpanzé, 1 personne); le temps écoulé depuis la morsure chez ces individus

50 variait de 1 à 53 ans. Les 2 autres individus ont été mordus par de petits singes, C. nictitans et mandrill. Tous ces cas d’infection ont montré une bonne concordance entre l’histoire de l’agression et la séquence virale isolée dans le sang de la personne infectée (Calattini et al., 2007). Dans les autres études, la transmission inter espèces reste plus hypothétique. C’est par exemple le cas de l’étude réalisée dans la réserve naturelle de Gibraltar où vivent des Macaca sylvanus . Le taux de séroprévalence de 90% constitue un risque potentiel pour les 700000 touristes qui côtoient ces animaux par an. Leur exposition aux liquides corporels constitue une voie pour la transmission inter espèces des virus de ces macaques (Engel et al., 2008).

4.3 Pathogénicité des spumavirus

A ce jour, aucune étude n’a pu mettre en évidence un quelconque pouvoir pathogène des spumavirus chez l’homme. Toutefois, plusieurs associations plus ou moins controversées de ce virus avec certaines maladies ont été décrites chez différents patients à travers le monde. La première description d’un lien entre l’infection par un spumavirus simien et une maladie chez l’homme a été faite en 1971. Un isolat de PFV a été décrit chez un patient Kenyan atteint d’un carcinome du nasopharynx (NPC) (Achong et al., 1971). Par la suite, une forte séroprévalence NPC a été observée chez des patients africains (Achong and Epstein, 1978; Muller and Castrup, 1980). Par contre, les sérums de patients atteints de NPC de différentes régions (Tunisie, Singapour, Grande Bretagne) ont tous été testés négatifs, indiquant une absence de lien entre le PFV et le NPC. Le suivi des patients atteints de la thyroïdite de Quervain en Slovénie a abouti à l’isolement du virus PFV dans différents organes (Stancek et al. , 1975; Stancek et al. , 1976; Werner and Gelderblom, 1979). Dans d’autres cas, cette association a été réfutée au cours d’autres études (Debons-Guillemin et al. , 1992; Schweizer et al. , 1995). L’amplification de l’ADN du PFV par PCR a été décrite chez 19 patients sur 29 atteints de la maladie de Graves. Ces séquences d’ADN ont été également détectées par hybridation moléculaire (Lagaye et al., 1992). Toutefois, tous les sérums de patients étaient négatifs pour la recherche d’anticorps contre le PFV. D’autres études ont rapporté la présence d’antigène de PFV dans des biopsies de patients atteints de thyroïdite (Wick et al. , 1993; Wick et al. , 1992). Plusieurs études de cohortes de patients n’ont pas pu montré une évidence moléculaire et sérologique d’une infection de PFV chez des patients atteints de la maladie de Graves (Mahnke et al. , 1992; Schweizer et al. , 1994; Schweizer et al. , 1995; Yanagawa et al. , 1995).

51 Un rapport sur des patients atteints de surdité soudaine et de la maladie de Ménière montrant une évidence de leur séropositivité par rapport au PFV par immunofluorescence (Pyykko et al., 1993) n’a pas été confirmée par d’autres (Simonsen et al., 1994). C’est plus tard qu’il a été admis qu’il y avait eu des réactions croisées avec des antigènes cellulaires. Le lien entre ces maladies et l’infection par le spumavirus a donc été réfuté (Pyykko et al., 1994). De même, des anticorps anti-spumavirus ont été détectés chez des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (ALS). L’étude sérologique a été réalisée à l’aide de deux tests ELISA, utilisant différentes protéines de PFV, suivi de la confirmation par western blot avec un antigène d’origine inconnue. La réactivité était plus élevée chez les patients atteints d’ALS (47 %) que chez des témoins sains (21 %) (Westarp et al. , 1993f; Westarp et al. , 1993e; Westarp et al. , 1993d; Westarp et al. , 1993c; Westarp et al. , 1993b; Westarp et al. , 1993a). Par contre, une étude indépendante n’a pas pu prouver une évidence d’infection PFV chez des patients atteints d’ALS (Rosener et al., 1996). De plus, des rapports isolés d’amplification d’ADN de PFV chez des patients coréens atteints de la fièvre méditerranéenne familiale et des patients atteints de la maladie de Graves ont été publiés (Tamura and Kira, 1995; Lee et al. , 1998). Malheureusement, la détection d’anticorps spécifiques contre PFV n’avait pas été faite dans ces études. Plusieurs autres études ont confirmé l’absence de lien entre l’infection PFV et certaines maladies comme des scléroses multiples (Svenningsson et al., 1992), le syndrome de la fatigue chronique (Gow et al. , 1992; Gunn et al. , 1993; Heneine et al. , 1994), divers cancers, la myasthénie grave (Saib et al., 1994), ainsi que la lymphocytopénie idiopathique des TCD4 + (Schweizer et al., 1995). L’un des enjeux de la recherche des spumavirus simiens chez l’homme reste la découverte de potentielles maladies associées. Plusieurs études ont rapporté que certains patients ont été mordus par un PNH des dizaines d’années avant d’être prélevés (Wolfe et al. , 2004; Calattini et al. , 2007). Dans tous les cas, au moment de la réalisation de ces prélèvements, aucun signe clinique de pathologie n’a pu être identifié et décrit. A cette absence de signes entre infection et maladies chez des personnes infectées par les spumavirus simiens s’ajoute l’absence de la transmission intra humaine de ce rétrovirus (Boneva et al. , 2007; Boneva et al. , 2002; Bastone et al. , 2003; Switzer et al. , 2004).

4.4 Les vecteurs spumavirus et la thérapie génique

Les caractéristiques uniques des spumavirus ont été exploitées dans le développement des vecteurs viraux, ayant abouti à un transfert efficace de gènes. A ce jour, nombreux transgènes

52 thérapeutiques l’ont été efficacement grâce aux vecteurs spumavirus, démontrant leur polyvalence (Trobridge, 2009). Chez les vecteurs spumavirus, la mitose est requise pour une transduction efficace (Trobridge and Russell, 2004). Cette dépendance sur la division cellulaire limite leur utilité pour des applications thérapeutiques quand la cellule cible est post-mitotique. Malgré cette limitation, un transfert stable de gènes médié par les vecteurs spumavirus a été obtenu chez des cellules cibles en division après la délivrance in vivo (Caprariello et al. , 2009). Leur capacité à former un intermédiaire stable de transduction dans les cellules quiescentes (Trobridge and Russell, 2004), environ 14 à 15 jours, rend les vecteurs spumavirus très pratiques pour les applications ex vivo tel que la thérapie génique des cellules souches hématopoïétiques. En effet, une cellule souche au repos peut être brièvement exposée aux vecteurs spumavirus, puis réintroduite chez un patient. Cependant, à l’opposé des gammaretrovirus, ce n’est pas l’entrée dans le noyau qui est inhibée dans les cellules quiescentes mais le processus d’intégration et, de fait, l’expression des gènes (Lo et al. , 2010). La capacité des lentivirus à infecter des cellules au repos ou non (et la capacité des vecteurs de VIH-1 à transducter ces cellules) a été attribuée à la présence d’un « central polypurine tract » (cPPT), suivi généralement d’un signal central de terminaison (CTS) au milieu du génome du VIH et des vecteurs VIH (Sirven et al. , 2000). Ces structures forment un intermédiaire triple (« flap ») composé d’un brin entier d’ADN+, d’un brin d’ADN-. Ce « flap » prend son origine à l’extrémité de PPT 3’, passe à travers le LTR 5’ après le « second saut » de la transcription inverse et se termine au CTS et à un brin d’ADN+ supplémentaire (Arhel et al. , 2006; Arhel et al. , 2007; Charneau et al. , 1994; Zennou et al. , 2000). Les spumavirus possèdent une région centrale riche en purine qui est identique en séquence au core du PPT 3’ (Kupiec et al., 1988; Tobaly-Tapiero et al. , 1991). La caractérisation de cette séquence (Peters et al. , 2008) n’a montré aucune structure triple comme décrit pour le VIH ou un CTS. A l’opposé, les spumavirus forment une structure présentant une délétion du cPPT. En outre, les vecteurs spumavirus de nouvelle génération sont dotés de plusieurs caractéristiques de sécurité et peuvent être produits par transfection transitoire à un titre très élevé et sans problème de contamination de la réplication virale. Les vecteurs spumavirus sont sensibles aux facteurs de restriction de l’hôte comme les enzymes TRIM5alpha et APOBEC3. Afin de contourner cette restriction (Trobridge et al ., 2010), des cellules HEK293 qui n'ont pas d'activité résiduelle APOBEC3 ont été utilisées afin d’augmenter le titre de vecteurs spumavirus produits dans ces cellules (Wiktorowicz et al. , 2009). L’utilisation des vecteurs spumavirus est considérablement préférable à celle des vecteurs MLV et VIH-1, en raison de l’absence de pathogénicité des virus natifs, de leurs profils

53 d’intégration, de leurs faibles potentiels à transactiver des gènes à proximité (Trobridge and Kiem, 2010). La réticence dans l’utilisation des vecteurs rétroviraux en thérapie génique s’explique par le risque de leur intégration dans des gènes actifs sur le plan transcriptionnel, en particulier dans les proto-oncogènes. Trobridge et collaborateurs (Trobridge et al., 2006), lors d’un travail portant sur les sites d’intégration dans des cellules humaines, ont abouti à des résultats prometteurs pour des études in vivo. Ils ont en effet montré que les spumavirus ont un faible taux d’intégration dans les gènes actifs sur le plan transcriptionnel. Ils apparaissent donc comme des vecteurs plus sûrs que d’autres rétrovirus (Trobridge et al., 2006). A ce jour aucun évènement indésirable n’a été rapporté, après l’intégration des vecteurs spumavirus pour le transfert de gènes dans des modèles animaux ; cela a été par exemple le cas dans la guérison de la déficience en CD18 chez le chien (Bauer et al. , 2008) et l’anémie de Fanconi chez la souris (Si et al. , 2008). Très récemment l’intérêt pour les vecteurs de spumavirus s’est encore renforcé en raison de leur capacité à infecter des cellules souches hématopoïétiques (Josephson and Russell, 2010). En effet, ces cellules souches ont la capacité de s’auto-renouveler, de proliférer et de repeupler la moelle osseuse après transplantation; une transduction efficace de ces cellules offre des perspectives de guérison de nombreuses maladies héréditaires mais aussi acquises. Finalement, les vecteurs spumavirus présentent un intérêt pour la thérapie génique contre le cancer, puisque leur réplication n’a lieu que dans des cellules qui peuvent se diviser (Trobridge and Russell, 2004; Rothenaigner et al. , 2009). Cet intérêt a été matérialisé par le développement de vecteurs spumavirus pour le transfert des gènes suicides, dont l’intérêt a été démontré dans la lutte contre des tumeurs solides chez des souris athymiques (Heinkelein et al., 2005).

54

Chapitre 2

Les primates non humains du Gabon

55 1. Généralités sur les primates non humains

Les primates non humains (PNH) se distinguent des autres mammifères par un certain nombre de caractéristiques morphologiques, anatomiques, physiologiques et comportementales. Parmi ces caractéristiques, on peut citer la réduction du sens de l'olfaction, le perfectionnement de la vision avec le développement de la vision binoculaire, l'existence de pieds et de mains préhensiles grâce au développement d'un pouce (sauf chez les colobes) et d'un gros orteil plus ou moins opposable, la présence d'ongles au lieu de griffes, et surtout le grand développement de la capacité crânienne par rapport au poids corporel ainsi que l'expansion du cortex cérébral. Avec une cinquantaine de genres et près de deux cents espèces, l’ordre des primates (figure 8) occupe une place particulière en dehors de tout anthropocentrisme, dans la classification des mammifères.

Figure 8 : Ordre des primates ( Johanne Leclerc , www.machronique.com/singes-ou-primates ). Les classifications peuvent différer selon les taxonomistes, en fonction des critères utilisés.

56 L’ordre des primates est divisé en deux sous-ordres: - Le sous-ordre des strepsirhini qui regroupe les prosimiens ou primates primitifs que sont les Tupaïdés, les Indriidés, les Lorsidés, les Lémuridés, les Tarsiidés et les Daubentoniidés. - Et le sous-ordre des Haplorhini , dont fait partie l’Homme, et qui regroupe aussi les Simiens proprement dits et qui sont des PNH plus évolués. Le sous-ordre des Haplorhini est divisé en deux infra-ordres: celui des platyrhini ou singes du nouveau monde et celui des Catarrhini ou singes de l’Ancien Monde o Les platyrhiniens sont des animaux de taille relativement petite. Ils ont une cloison nasale large, des narines rondes, une queue longue relativement préhensible. Leur pouce est peu développé et ils n’ont pas de callosités fessières. Ces animaux qui vivent en Amérique du sud ou en Amérique centrale, sont relativement plus dociles que les singes de l’Ancien Monde mais beaucoup plus fragiles du point de vue physique et psychologique. Ils sont notamment très sensibles au stress, ce qui rend leur maintien en captivité très difficile. Parmi les principales espèces, on peut citer les capucins, les atèles, les ouistitis, les sajous, les tamarins et les saïmiris. o Les catarhiniens sont des animaux dotés d’une assez grande puissance. Ils se caractérisent par une cloison nasale mince, des narines rapprochées, une queue peu préhensible. Leur pouce est très développé et ils ont souvent des callosités fessières. Les catarhiniens comprennent les familles des Pongidae , des Hylobatidae et des Hominidae . On note aussi l’appartenance des sous-familles des Colobinae et des Cercopithecinae . La famille des Hylobatidae avec les gibbons et celle des Pongidae avec les orangs-outans ne sont représentées qu’en Asie. Celle des Hominidae comprend les gorilles, les chimpanzés (uniquement présents en Afrique) et l'Homme. Gibbons, orangs-outans, gorilles et chimpanzés sont souvent regroupés sous le nom de grands singes (" apes " en anglais) par opposition aux petits singes (“ monkeys " en anglais). Ils sont tous caractérisés par l'absence de queue. En français, les grands singes sont souvent qualifiés d’anthropoïdes mais ce qualificatif prête à confusion. La sous-famille des Colobinae regroupe les semnopithèques, les nasiques et les colobes dont la fourrure était très prisée dans les années trente. La sous-famille des Cercopithecinae, regroupant divers genres et de nombreuses espèces, constitue numériquement le groupe le plus important. Elle comprend les genres Papio , Macaca , Cercocebus , Erythrocebus et Cercopithecus . Parmi les différentes espèces, on peut citer entre autres les macaques, les cynocéphales à grosse tête et au corps puissant (babouin, mandrill), le patas ou singe rouge pleureur, les mangabés et les cercopithèques (singes verts, moustac, mone, brazza, etc.). Le genre Cercopithecus recèle une importante diversité d’espèces arboricoles et terrestres réparties en plusieurs sous-espèces.

57 Les deux sous-familles des Colobinae et des Cercopithecinae forment une même famille appelée la famille des Cercopithecidae .

2. Primates non humains du Gabon

2.1. Présentation du lieu de l’étude

Le lieu de notre étude est le Gabon, pays d’Afrique centrale, situé de part et d’autre de l’équateur. Il couvre une superficie de 267667 km 2 avec des frontières délimitées au nord-ouest par la Guinée-équatoriale, au nord-est par le Cameroun et à l’est et au sud par le Congo Brazzaville. A l’ouest, le Gabon s’ouvre sur l’océan atlantique avec 885 km de côtes (figure 9). Lors du dernier recensement de la population et des biens, organisé en 2004, sa population a été estimée à 1,4 millions d’habitants répartis sur 9 provinces. Près de 73% de cette population vit en zone urbaine, dont 35% dans la capitale Libreville et sa périphérie. L’intérieur du pays reste peu peuplé.

Figure 9: Carte du Gabon (http://encyclo.voila.fr/wiki/Ivindo)

Le Gabon est caractérisé par une pluviométrie de basse altitude et est dominé par un climat équatorial à deux maxima séparés par deux saisons sèches. En forêt de plaine, la pluviométrie annuelle varie de 1.500 mm environ à plus de 2.300 mm. De façon générale, la grande saison des pluies s'observe aux alentours de février à avril et la petite saison des pluies a son pic autour

58 d'octobre/novembre. La petite saison sèche intervient en décembre et janvier ; la grande saison sèche, quant à elle, se situe entre mai et septembre. La forêt gabonaise est riche en espèces végétales. Ainsi, environ 10000 espèces de plantes, ligneuses et herbacées y ont été identifiées. Il s’est constitué une véritable richesse avec une remarquable variété d’arbres qui induisent des variations de la quantité et qualité des ressources disponibles pour les animaux (notamment fruits et feuilles). Ce qui influe sur leurs régimes alimentaires et, éventuellement, sur leur densité. Par ailleurs, la production des forêts est loin d’être continue au cours du cycle annuel d’autant que la foliaison, la floraison que la fructification sont saisonnières surtout dans les forêts primaires. De façon assez générale, la production en fruits qui constituent une part importante du régime des singes, est maximale autour de la petite saison sèche et minimale pendant la grande saison sèche. Cette dernière constitue une période critique pour les animaux frugivores. En outre, sur un même site, on note d’importantes fluctuations interannuelles. Cette importante couverture forestière représente 85% du territoire national répartis en une variété de forêts remarquables. Nous distinguerons en fonction de l'altitude les forêts de plaine (0 à 1.200 m), encore appelées planitiaires, des forêts de montagne (généralement >1.200 m). Les forêts de terre ferme et les forêts du bord de l’eau, appelées ripicoles se distinguent les unes des autres en fonction de la proximité des cours d'eau et de l'hydromorphie des sols. Dans ces dernières, l'importance des cours d'eau, le relief des rives et des bassins versants conditionnent l'intensité et la périodicité des inondations, l'hydromorphie du sol et l'importance des zones marécageuses. Celles-ci peuvent être absentes, limitées à quelques mètres de largeur, ou constituer des banquettes alluviales qui s'étendent sur plusieurs kilomètres. En fonction de l'âge, du stade de maturité et du degré de perturbation des forêts, nous distinguerons les forêts primaires et les forêts secondaires. Les forêts primaires sont des forêts âgées, à croissance lente, qui ne présentent pas de perturbations récentes importantes, hormis les chablis naturels provoqués par les chutes d'arbres. Elles sont dominées par de grands arbres qui forment une canopée plus ou moins continue, surplombée par quelques émergents. Leur sous-bois, qui ne reçoit que peu de lumière, est généralement clairsemé et la végétation herbacée y est réduite. Les forêts secondaires sont plus ou moins jeunes, et leur dynamique est importante. Elles constituent différents stades de reconstitution de la forêt après des perturbations naturelles (grands chablis provoqués par les tornades dont l'effet est renforcé là où les sols sont instables), ou des perturbations dues à l'action de l'homme (déforestation, cultures, feux...). Leur canopée est plus basse et plus ouverte que celle des forêts primaires. Leur sous-bois est d'autant plus encombré que la lumière y pénètre; les lianes y sont généralement abondantes; le sol est souvent couvert d'une végétation herbacée dominée par les marantacées et zingibéracées.

59 A priori, les forêts primaires et secondaires peuvent être présentes en terre ferme comme en milieu ripicole, en montagne comme en plaine. Toutefois, les belles forêts primaires aux grands fûts et au sous-bois dégagé s'observent surtout en terre ferme, dans les zones de plaine. Les forêts ripicoles, mêmes primaires, ont généralement une canopée plus basse et leur sous-bois peut être très encombré ou au contraire très dégagé, selon la nature et l'hydromorphie du sol. Avec l'altitude, la végétation se modifie, les arbres sont moins hauts, et la composition floristique change: lianes, plantes épiphytes et lichens se développent. Signalons aussi les forêts-galeries que l'on observe aux limites des forêts savanes et qui constituent des doigts de forêts longeant les cours d'eau et pénétrant dans la savane. Ces forêts étroites peuvent donner lieu à des isolats coupés du bloc forestier principal. Leur végétation arborée est peu diversifiée. Enfin, au bord de la côte atlantique s'observent des mangroves dont le sol marécageux, formé de boue et du réseau racinaire des plantes halophytes est régulièrement inondé. La végétation arborée, peu diversifiée, est surtout caractérisée par les palétuviers avec leurs énormes racines aériennes. Sur la totalité de ces forêts, les autorités gabonaises ont décidé de consacrer l’équivalent de 11% du territoire pour la création de 13 parcs nationaux en 2002. On y a répertorié, 65 espèces de reptiles, 1000 espèces d’oiseaux et 400 espèces de mammifères dont les PNH.

2.2. Espèces régulièrement décrites

Quatorze (14) espèces de PNH ont été régulièrement décrites sur le territoire gabonais, obéissant à une répartition nationale. Il est à noter l’existence des genres Cercopithecus, Miopithecus, les Mangabés ( Cercocebus et Lophocebus ), Papio , Mandrillus , Colobus , Gorilla , et le genre Pan (tableau 1) .

2.3 Susceptibilité aux agents pathogènes et infections naturelles rétrovirales

Les pathologies des PNH sont très variées. De part leur proximité phylogénétique, ils partagent avec l’Homme une certaine susceptibilité vis-à-vis d’un certain nombre de pathogènes. Ces agents peuvent être transmis à l’homme et vice versa. Il est par conséquent important de considérer l’Homme et les PNH de manière bilatérale, étant donné que chacun des protagonistes peut constituer un danger pour l’autre.

60

Tableau 1 : Primates non humains du Gabon et leurs infections rétrovirales Infections rétrovirales Espèces Nom commun SIV STLV SFV

Cercopithecus neglectus cercopithèque de Brazza + - (Hussain et al., 2003)

Cercopithecus solatus cercopithèque à queue de + - - soleil

Cercopithecus cephus moustac + + -

Cercopithecus pogonias cercopithèque pogonias + + -

Cercopithecus mona cercopitheque mona + + -

Cercopithecus nictitans Nez blanc + + -

Mandrillus sphinx Mandrill + + (Calatini et al., 2004)

Pan troglodytes troglodytes chimpanzé d'Afrique Centrale + + (Calatini et al., 2006)

Gorilla gorilla Gorille + + (Calatini et al., 2004)

Miopithecus ogouensis miopithèque de l'Ogooué + + -

Cercocebus torquatus mangabey à collier blanc + + (Switzer et al., 2005)

Cercocebus agilis mangabey Agile + + -

Lophocebus albigena mangabey à joues grises + + (Switzer et al., 2005)

Colobus guereza colobe guéréza + + (Hussain et al., 2003)

Chez les PNH, l’infection par certains pathogènes reconnus en pathologie humaine peut être asymptomatique, ce qui peut se traduire par un risque de transmission inter espèces du singe à l’Homme. Plusieurs mesures sont prises, notamment dans les zoos où les animaux sont sujets à des transmissions internes de pathologies, et mettant ainsi en péril la santé des humains qui y travaillent. De façon systématique, tous les animaux extérieurs arrivant dans un zoo sont soumis à un dépistage de pathologies virales infectieuses et transmissibles. Pour éviter la transmission de maladies entre

61 animaux et des animaux aux Hommes, des contrôles sont conseillés à intervalles réguliers pour évaluer l’état de santé des uns et des autres. De façon générale, pour la mise en évidence d’une transmission virale entre différentes espèces, cinq paramètres sont définis (Sharp et al., 1995): - Les similitudes dans l’organisation génomique, - Les relations phylogénétiques entre virus, - La prévalence de l’infection chez l’hôte naturel, - Les coïncidences géographiques, - Et les voies possibles de transmission.

Les singes sont des animaux à haut comportement psychique et social, par conséquent leur maintien en captivité peut être également à l’origine des troubles psychosomatiques et de pathologies comportementales telles que des diarrhées profuses, des vomissements, des colites, de l’automutilation et parfois même des syndromes dépressifs.

2.4 Politique gouvernementale de conservation de la biodiversité.

Le gouvernement gabonais a mis en place une politique de protection et de conservation d’espèces et des aires pour une utilisation rationnelle et maîtrisée. De ce fait, la création en 2002 de 13 parcs nationaux se justifie par la volonté des autorités de protéger des parties de la forêt pouvant fédérer tout type d’habitats. Les zones ripicoles abritent près de deux fois plus d’espèces que les zones voisines de terre ferme. C’est notamment le cas pour les gorilles où des densités plus importantes ne sont observées que dans les forêts primaires. Ces forêts inondables sont d’ailleurs moins soumises au risque d’exploitation forestière en raison des difficultés techniques qu’elles imposent. Dans ces espaces limités par les 13 parcs nationaux, la chasse est strictement interdite. Indépendamment de ces parcs, la chasse ou la capture et la vente de certaines espèces de PNH sont strictement interdites. Les espèces Cercopithecus solatus , Pan troglodytes troglodytes et Gorilla gorilla gorilla sont intégralement protégées. Des études scientifiques pouvant conduire au prélèvement de ces espèces font l’objet d’une autorisation spéciale des services des Eaux et Forêts.

62 2.5 Les Colonies de primates non humains du CIRMF

Le Centre de primatologie (CDP) a été créé en 1983, quelques années après l’inauguration du CIRMF. Il héberge actuellement plusieurs colonies d’espèces de PNH comprenant un total de 9 espèces au total, pour la plupart originaires du Gabon. Ces espèces sont les suivantes (Tableau 2) : - Chimpanzés, gorilles, mandrills, cercopithèques à queue de soleil, mangabeys à collier blanc, hocheurs, moustacs pour les espèces rencontrées au Gabon, - Vervets pour d’autres pays du continent africain - et macaques rhésus et cynomolgus pour l’Asie. Au total, la population de PNH du CDP du CIRMF est représentée par un peu moins de 400 individus vivant en semi-liberté, suivant les recommandations du National Institute of Health (NIH). En fonction des besoins, les animaux peuvent être accueillis selon trois types d’hébergement : - En cage individuelle dans des bâtiments de haute sécurité de type A2 et A3 (quarantaine ou périodes courtes selon des protocoles biomédicaux), - En « volières » collectives pouvant héberger jusqu’à une dizaine d'individus, - Et dans quatre enclos de semi-liberté répartis sur 12 hectares de forêt. Plus de la moitié des primates du Centre y sont hébergés (en particulier, les mandrills).

Tableau 2 : Espèces de Primates non humai ns hébergées par le CDP au CIRMF Espèces de primates non Nom usuel Origine Effectif humains Cercopithecus solatus Singe à queue de soleil Gabon 12 Chlorocebus aethiops Singe vert d’Afrique Afrique de 10 l’Ouest Cercopithecus cephus Moustac Gabon 1 Cercocebus torquatus Mangabey à collier blanc Gabon 3 Mandrillus sphinx Mandrill Gabon 212 Pan troglodytes troglodytes Chimpanzé Gabon 56 Gorilla gorilla Gorille Gabon 5 Macaca mulatta Macaques rhésus Chine 27 Macaca fascicularis Macaques crabiers Ile Maurice 31 Total: 357

63 2.5.1 La colonie des mandrills

La colonie des mandrills du CDP du CIRMF est unique au monde. Elle a été fondée en 1983 par 6 males et 8 femelles, tous apportés du nord et du sud du Gabon, et relâchés dans un enclos (Nerrienet et al. , 1998; Souquiere et al. , 2001). Elle compte maintenant plus de 200 individus.

Plusieurs études ont été menées dans cette colonie, notamment sur l’infection des mandrills par des rétrovirus. Elles ont abouti à la description de deux virus SIVmnd type 1 et SIVmnd type 2 (Souquiere et al., 2001) et de deux autres virus STLVmnd type 1 et STLVmnd type 2 (Makuwa et al., 2004a), dont la distribution tient compte de la séparation des mandrills par le fleuve Ogooué.

En 2003, Telfer et collaborateurs ont montré que les mandrills sauvages étaient diphylétiques avec 2.6% de divergence dans la séquence du cytochrome b (ADN mitochondrial) (Telfer et al., 2003). La distribution de ces deux haplogroupes mitochondriaux suggère que le fleuve Ogooué sépare deux sous-populations, l’une dans le Sud-Cameroun/Nord-Ogooué, et l’autre répartie au Sud de l’Ogooué (Figure 10). Selon cette répartition, la présence des mandrills a été mise en évidence au sud de la rivière Sanaga au Cameroun, au sud du Nigéria, en Guinée Equatoriale, au Gabon et au Congo.

Au CIRMF, et en fonction de leur infection, les mandrills à l’image d’autres espèces sont hébergés en cage individuelle dans des bâtiments de haute sécurité de type A2 et A3 (quarantaine ou périodes courtes de protocoles biomédicaux), en «volières» collectives pouvant héberger jusqu’à une dizaine d'individus ou dans quatre enclos de semi-liberté répartis sur douze hectares de forêt.

2.5.2 Les autres colonies de primates non humains

Les solatus (singe à queue de soleil) ont été introduits au CIRMF entre 1984 et 1985. Cette espèce de PNH est exclusivement endémique au Gabon, et le CIRMF possède l’unique colonie captive au monde. Cette colonie compte 12 individus qui sont tous des descendants directs ou indirects des quatre premiers fondateurs. Ils forment deux groupes reproducteurs vivant en semi liberté. Comme c’est le cas pour toutes les espèces, le personnel du CDP prend soin de leur bonne santé et favorise leur développement. Les macaques du CIRMF viennent de l’île Maurice et de Chine. Ils sont impliqués dans plusieurs projets de recherche orientés par exemple dans le développement de gels microbicides pour la prévention de la transmission sexuelle du VIH.

64 D’autres espèces ont été introduites au CIRMF pour l’étude comparée de l’infection par le SIV, parmi lesquelles on peut citer des cephus, des mangabeys, des torquatus et des singes verts d’Afrique.

Figure 10: Répartition des mandrills (Telfer et al., 2003)

Les grands singes, Gorilles et chimpanzés, ont longtemps servi pour des études comportementales. La tendance actuelle est leur réinsertion dans leur milieu naturel, notamment dans des parcs d’écotourisme.

65

DEUXIEME PARTIE

1- OBJECTIFS

66 Les récentes études sur les spumavirus simiens ont mis en évidence l’infection de plusieurs espèces de PNH en captivité dans des zoos en Amérique et en Europe (McClure et al. , 1994; Blewett et al. , 2000; Calattini et al. , 2006b). D’autres publications mettent l’accent sur l’infection des PNH en Afrique et particulièrement en Afrique centrale (Calattini et al. , 2004; Wolfe et al. , 2004). Ces différentes infections restent persistantes tout au long de la vie de ces animaux. Comme nous l’avons développé dans les généralités, des infections de spumavirus simiens des PNH ont été reportées à des taux oscillant entre 1 et 6% chez des personnes en contact avec des animaux infectés, dans le cadre de leur profession, dans des zoos, ou des centres de primatologie, ou des laboratoires. Ces études ont été conduites en Amérique du Nord, en Europe (Brooks et al. , 2002; Heneine et al. , 1998; Sandstrom et al. , 2000; Schweizer et al. , 1997; Switzer et al. , 2004) ou encore récemment en Asie chez des individus ayant eu des contacts réguliers avec des macaques (Jones-Engel et al. , 2008; Jones-Engel et al. , 2005). Au Cameroun, des infections de spumavirus simiens ont été décrites dans des cohortes de chasseurs (Wolfe et al. , 2004; Calattini et al. , 2007) ; une large proportion de ces chasseurs (24%), avaient été mordus et blessés par des gorilles et chimpanzés (Calattini et al., 2007). A ce jour, aucune pathologie associée à la transmission de ces virus n’a été décrite chez ces personnes infectées.

Les infections par les spumavirus simiens ont très peu été étudiées au Gabon. Une seule publication traite de l’infection de quelques mandrills du Centre de primatologie du CIRMF au Gabon (Calattini et al., 2004). Aucune donnée n’est disponible sur les autres espèces animales, en captivité ou dans la nature. De même, aucune donnée n’est disponible sur la probable infection des populations humaines gabonaises par les spumavirus de PNH. Le risque d’apparition de nouvelles zoonoses rétrovirales liées à la transmission inter espèces des spumavirus simiens constitue l’une des préoccupations des scientifiques. Notamment, quelles peuvent être les conséquences à long terme des infections humaines à spumavirus simiens ? Y a-t-il un risque réel d’émergence de ces virus dans les populations humaines? Certains chercheurs/cliniciens pensent que l’absence de pathologies décrites est peut-être due au nombre limité des cas étudiés. C’est pourquoi nous avons souhaité lors de ce travail de thèse multiplier les approches et les missions de terrain afin d’obtenir des échantillonnages suffisamment importants (à la fois dans les populations simiennes et humaines) pour pouvoir en tirer des conclusions significatives. Dans cette dynamique, et pour apporter notre contribution à cette problématique, nous avons défini au cours de ce travail de thèse des objectifs afin d’étudier la présence, la circulation et la

67 transmission des spumavirus simiens dans des populations de singes en captivité (primates non humains au CIRMF) et dans un échantillonnage plus large de PNH sauvages. Nous avons aussi élargi notre travail à des populations humaines cibles composées de personnes travaillant et vivant au contact de ces animaux.

Ainsi, nous pouvons résumer les objectifs spécifiques de ce travail de thèse selon les points suivants :

1-Détermination de la présence et de la circulation des spumavirus simiens dans la colonie des mandrills du centre de primatologie au CIRMF: a) Caractérisation des souches virales en circulation dans cette colonie, b) Compréhension de la dynamique virale et de la transmission des spumavirus simiens dans la colonie.

2) Evaluation de la transmission inter espèces des spumavirus simiens chez les personnes travaillant en contact avec ces PNH dans ce centre de primatologie.

3) Evaluation de la prévalence des spumavirus simiens chez des PNH dans la nature.

4) Caractérisation de souches virales chez les différentes espèces infectées et étude de relations phylogénétiques entre elles.

5) Etude de la transmission inter espèces dans des populations humaines à haut risque, en réalisant le suivi d’une cohorte de personnes, notamment mordues par des PNH.

Comme indiqué par la suite dans ce travail de thèse, ces travaux ont fait l’objet de deux publications scientifiques dans des revues à comité de lecture :

Two distinct variants of simian foamy virus in naturally infected mandrills (Mandrillus sphinx) and cross-species transmission to humans. Mouinga-Ondémé Augustin , Betsem E, Caron M, Makuwa M, Sallé B, Renault N, Saib A, Telfer P, Marx P, Gessain A, Kazanji M. Retrovirology. 2010 Dec 14;7:105.

68 Cross-species transmission of simian foamy virus to humans in rural Gabon, central Africa Mouinga-Ondémé Augustin , Mélanie Caron, Dieudonné Nkoghé, Paul Telfer, Preston Marx,

Ali Saïb, Eric Leroy, Jean-Paul Gonzalez, Antoine Gessain and Mirdad Kazanji.

Article accepté pour publication dans Journal of Virology. 2011 Nov.

69

DEUXIEME PARTIE

2- MATERIELS ET METHODES

70 1. Populations d’étude

Trois types de populations ont été étudiées: les mandrills en semi-captivité du CDP, les populations de primates non humains prélevés dans la nature et les cohortes humaines

1.1 Populations de primates non humains

1.1.1 La colonie des mandrills du Centre De Primatologie (CDP)

Pour évaluer l’infection des spumavirus simiens chez les mandrills, nous avons prélevé 84 individus de la colonie du CDP appartenant à 5 générations (figure 11). Les prélèvements ont été obtenus dans différentes tranches d’age (juvéniles [1 à 4 ans], sub-adultes [5 à 10 ans], adultes [11 à 15 ans] et les plus âgés [à partir de 16 ans]). Pour la réalisation des prélèvements, les mandrills ont reçu préalablement une anesthésie générale, à base de kétamine à raison de 0,1ml/kg administrée par fléchage.

Mandrills du CDP

ère 1 G Mnd2 Mnd5 Mnd6 Mnd10 Mnd12 Mnd16 Mnd U Mnd30Mnd17 Mnd31 Mnd P

2è G 5I, 5C, 10D, 2D, 2F 6G, 6H 12A, 12F 16I, 16B 17H, 17I PA, PB 5D, 5M 10M U2 12O, 12R, 16L PC 12T, 12Q

2D8, 2D9 12A3, 12P1 17A6, 17A7 3è G 5D3, 5D5, 10E5, 10E7 16G2 2D11 5D6, 5D8 10F8, 10F5 12D3, 12D5 17A9, 17D7 10N1 12A12, 17E2, 17F4, 12O2 17B6, 17B4 17B10

4è G 2D7C 5D3A, 10E3B 12A12A 17B4A, 17B4B 5D3B, 5D3C 12C3B 17B4C, 17A1D 12D3F , 17B2C 17B2D, 17B2E

5è G 17B2A1 17B2A2

Figure 11 : Table généalogique des différents mandrills testés dans cette étude. Les mandrills sont identifiés par des chiffres et des lettres; Le petit d’une femelle porte le numéro de sa mère, suivi d’un numéro ou d’une lettre d’ordre (Exemple : mère : 12A, petit : 12A3). Cinq générations ( G) ont été testées

71 1.1.2. Les Primates non humains sauvages

Les échantillons des singes sauvages ont été collectés dans les 9 provinces du Gabon (Figure 12). Nous avons prélevé des tissus chez des singes vendus dans des villages en bordure de route ou encore dans des marchés (viandes de brousse), ainsi que du sang chez des singes gardés comme animaux de compagnie par des habitants. Aucun échange d’argent n’a été effectué pour ne pas encourager le braconnage. Les tissus prélevés furent la rate, l’intestin, les ganglions, les amygdales, des morceaux de viande, etc., obtenus sur des singes abattus par des chasseurs. Cela s’est fait sans aucune contrepartie particulière pour éviter d’encourager la pratique de la chasse interdite à certaines périodes de l’année et pour ne pas être complice de la chasse de certaines espèces protégées. Au total, 286 échantillons de plasma et 211 d’organes répartis entre 13 espèces simiennes différentes ont été prélevés par nos équipes (Tableau 3).

29 25 31 14 61 0 15 Libreville 30 38 64 37 58 6 53 0 0

Capitale 36 Franceville Capitale provinciale 0 Prélèvements sanguins

Prélèvements d’organes

Figure 12: Répartition des primates non humains prélevés dans chaque province . En violet le nombre de prélèvements sanguins et en bleu celui des organes (rate, ganglions, intestin, amygdales).

72

Tableau 3 : Espèces de Primates non humains du Gabon prélevées au cours de l’étude

Nom usuel Type de prélèvement Espèces de primates non

humains plasma tissus

Cercopithecus solatus Singe à queue de soleil 16 0

Cercopithecus pogonias Guenon couronnée 6 0

Cercopithecus nictitans Hocheur nez-blanc 30 29

Cercopithecus negletus Singe de Brazza 3 3

Cercopithecus cephus Moustac 67 46

Cercocebus torquatus Mangabey à collier blanc 13 13

Mandrillus sphinx Mandrill 77 78

Pan troglodytes troglodytes Chimpanzee 49 34

Gorilla gorilla Gorille 3 8

Miopithecus ogoouensis Talapoin du Gabon 2 0

Lophocebus albigena Mangabey à joues grises 10 0

Miopithecus talapoin Singe talapoin 8 0

Colobus guereza Colobe guéréza 2 0

Total : 286 211

1.2 Les cohortes humaines

Deux types de cohortes humaines ont été étudiés : - Des personnes au contact de PNH du CDP au CIRMF, - Des chasseurs et personnes mordues par un PNH. Le suivi de ces cohortes a reçu l’aval du comité d’éthique local.

73 1.2.1. La cohorte des personnes du CIRMF

La cohorte était composée de volontaires, ayant tous lu et signé le consentement éclairé avant de se faire prélever. Vingt individus travaillant comme techniciens animaliers, aides animaliers ou vétérinaires ont été prélevés pour un volume de 5 ml de sang sur tube EDTA. Les échantillons étaient anonymes et répertoriés suivant des codes, avec des renseignements sur leur âge et leur histoire de vie avec les PNH du CDP. En particulier, nous avons cherché à savoir si ces travailleurs avaient déjà été mordus, griffés ou gravement blessés par un des PNH auxquels ils étaient (ou sont encore) exposés. La durée moyenne d’exposition calculée était de 12 ans (minimum, 5 mois ; maximum, 27 ans).

1.2.2. La cohorte des personnes mordues et des chasseurs

Figure 13: a) Morsure fraîche b) cicatrice au mollet. c) cicatrice avant-bras

Nous avons prélevé 154 personnes ayant déclaré une activité de chasse dans 8 des 9 provinces du Gabon. Seule la province de l’Ogooué-Maritime n’a pas été visitée car difficile d’accès à cause de nombreux lacs. La principale activité des populations dans cette partie du pays reste beaucoup plus la pêche au détriment de la chasse. Notre étude s’intégrait dans le cadre d’une grande enquête sur la surveillance nationale de l’émergence de certains virus au Gabon initiées par le CIRMF et le Ministère de la Santé publique. Plusieurs jours à l’avance, des émissaires étaient envoyés pour rencontrer les autorités de la province à visiter, notamment le gouverneur, les préfets et les chefs des villages pour leur expliquer le but de l’étude et préciser la date de passage pour permettre le rassemblement d’un maximum de personnes. Le jour du prélèvement, des entretiens avec les habitants avaient lieu dans l’école ou le dispensaire du village afin d’expliquer les fondements de l’étude, et d’avoir leur consentement avant le prélèvement. Plusieurs difficultés liées à la compréhension du message délivré ont souvent

74 constitué un facteur limitant pour la participation et ont abouti à un refus pour un certain nombre de sujets. Des difficultés plus grandes ont été enregistrées lorsque nous avons recherché dans 5 provinces sur 9 (incluant le Haut-Ogooué, l’Ogooué-Lolo, l’Ogooué-Ivindo, la Ngounié et la Nyanga), des personnes mordues par des PNH (figure 13). Le choix de ces provinces était lié à la présence d’une proportion plus importante de populations pratiquant une activité de chasse comparativement aux autres. Seule la province du Woleu-Ntem, au nord du Gabon, n’a pu être visitée pour des raisons logistiques. Dans ce contexte, il s’agissait de convaincre une seule personne en lui expliquant la nécessité de la prélever. Nous sommes parfois restés dans des villages tard la nuit, soit pour approfondir la nécessité de pouvoir étudier la transmission d’un virus d’un singe à l’homme, soit pour attendre un messager parti dans un campement à la recherche d’une personne exposée au risque. Là encore, des cas de refus ont été enregistrés. Au total, nous avons prélevé 78 personnes (figure 14), incluant 59 hommes, 10 femmes et 9 enfants. Contrairement aux adultes, presque tous les enfants avaient été mordus par des singes apprivoisés. Un questionnaire leur était soumis pour recueillir des informations sur leur mode de vie et sur les risques encourus ayant conduit à la morsure (voir questionnaire en annexe). La plupart des hommes étaient mordus au cours de leur métier de chasseur, lequel constitue un facteur de risque qui les différencie du premier groupe de sujets.

2. Enquêtes épidémiologiques

Pour conduire notre étude sur l’infection de l’Homme par les spumavirus simiens au Gabon, nous avons utilisé un questionnaire qui a été rempli par chaque participant. Ce questionnaire (présenté en annexe) a permis d’évaluer les facteurs de risque et les comportements à risque susceptibles de favoriser la transmission inter espèces des rétrovirus simiens et leur propagation au sein de la population humaine. L’accord pour la réalisation de cette étude a été obtenu auprès des Autorités du Ministère de la Santé et du comité national d’éthique du Gabon.

75 13 11

Libreville 10 3 10 3 15 3

Capitale 6 Franceville Capitale provinciale 4 Personnes mordues par un Grand singe (gorille et chimpanzé) Personnes mordues par d’autres espèces de singes

Figure 14: Répartition des personnes mordues par un primate non humain . En vert le nombre des personnes mordues par un grand singe (gorille et chimpanzé). En rouge celui des personnes mordues par d’autres espèces de PNH. Les provinces étudiées ont été sélectionnées en fonction de la densité de la forêt, de la présence des PNH et de la facilité d’accès pour notre centre de recherche.

3. Analyses statistiques

Pour toutes les analyses statistiques, nous avons utilisé les logiciels STATISTICA software version 7.1 (StatSoft France, http://www.statsoft.fr ) et STATA software version 10 (Stata Corporation, College station, USA). Dans chaque population, les prévalences ont été estimées par facteur de risque étudié: sexe et age pour les PNH, et age, sexe, circonstance du contact, type de PNH ayant mordu, type de blessure, localisation sur le corps et présence de cicatrices pour les humains.

76 Les différentes proportions ont été comparées à l’aide du chi 2 ou du test de Fischer lorsque nécessaire. L’association entre un facteur de risque et les résultats sérologiques a été mesurée à l’aide d’odds ratio et de l’intervalle de confiance à 95% correspondant. Les résultats ont été considérés comme significatifs au niveau d’incertitude de 5% (p<0.05). Les calculs ont été réalisés sur le nombre maximum d’observations disponibles.

4. Echantillons : obtention, nature et traitement

4.1. Collecte et transport des échantillons

4.1.1 Echantillons des primates non humains du CDP

Lors du contrôle sanitaire annuel des mandrills et d’autres espèces simiennes hébergées au CDP, un échantillon de sang total est prélevé sur EDTA et stocké dans des congélateurs à -80°C. Dans le cadre des recherches de spumavirus simiens chez les mandrills, de novembre 2006 à janvier 2007, 7 ml de sang ont été collectés dans des tubes contenant un anticoagulant, l’EDTA-K2, chez des animaux sous kétamine-HCl (10 mg/kg). Les cellules mononuclées du sang périphérique et le plasma obtenus ont été congelés.

4.1.2 Echantillons des primates non humains en zone rurale

De janvier 2006 à décembre 2008, nous avons effectué des missions de terrain en zone rurale au cours desquelles nous avons prélevé deux tubes de 7 ml de sang sur EDTA chez chaque animal rencontré chez des particuliers, après sensibilisation et accord des propriétaires, ou dans le parc national de la Lopé. Des morceaux d’organes obtenus d’animaux tués par des chasseurs (exposés en bordure des routes dans les villages) ou auprès de vendeuses dans des marchés étaient conservés dans du RNA later ou congelés à -20°C comme nous l’avons mentionné dans le paragraphe précédent.

4.1.3 Prélèvements des humains

Du sang total était prélevé dans deux tubes de 7 ml sur EDTA et traité suivant les procédures des missions de terrain. Des laboratoires ambulants de terrain étaient aménagés dans les dispensaires à proximité des lieux d’étude. Ils étaient équipés de centrifugeuses, congélateurs et autres matériels relativement

77 aisément transportables. Tous les prélèvements sanguins étaient séparés, après centrifugation, en plasma et «buffy coat», puis conservés dans des congélateurs de terrain à -20°C. Dans le cas des échantillons obtenus sur le terrain, le transport s’est toujours fait de façon à ce que la chaîne de froid ne soit pas interrompue entre le lieu de prélèvement et notre laboratoire au CIRMF. Les aliquots d’échantillons étaient classés dans des boîtes et rangés dans des glacières chargées de plusieurs packs à glace. Au laboratoire, les échantillons étaient transférés dans des congélateurs à -80°C pour une conservation beaucoup plus longue, dans l’attente de leur analyse respective.

4.2. Tests de laboratoire

Deux approches diagnostiques ont été utilisées pour le dépistage des spumavirus simiens dans cette étude, à savoir la sérologie et l’analyse moléculaire.

4.2.1 Etudes sérologiques

4.2.1.1 Préparation d’Antigènes viraux

Nous avons utilisé des lignées cellulaires de type BHK-21 pour la culture virale. Ces cellules ont préalablement été mises en culture dans un milieu approprié préparé à base du DMEM puis placées dans une étuve à CO 2. Lorsque les cellules atteignaient une confluence d’environ 70%, elles étaient infectées à l’aide d’une suspension de faible titre viral; cette suspension virale contenait environ 100 DECP 50 /ml (doses effet cytopathogène du PFV (prototypic foamy virus) 50 % par ml de culture) et était ajouté sous un volume de 3 ml. Chaque jour, nous effectuions un contrôle des cultures pour le suivi de l’apparition du syncytium. C’est en général au bout du quatrième jour que la formation d’amas cellulaires était observée. Une fois que la plupart des cellules étaient infectées, elles étaient regroupées dans un tube et centrifugées à 2500 rpm pendant 20 min à 4°C. Le culot cellulaire était resuspendu dans du tampon de Laemmli 1X (tampon de Laemmli 5X : mélanger 5mL de Tris / HCl 0.5M pH 6.8 ; 2g de SDS ; 4g de glycérol ; 5mL de β-mercaptoéthanol ; 1.25mL de Bleu de bromophénol à 1% ; qsp 20mL d’eau pure), puis chauffé à 70°C pendant 5 minutes et refroidi immédiatement sur de la glace pendant 5 minutes. Ce cycle était répété trois fois pour briser les faibles liaisons intramoléculaires et dénaturer les antigènes viraux. Le contenu du tube constituait le stock d’antigènes viraux (Calattini et al., 2006b).

78 4.2.1.2 Séparation des antigènes sur gel de polyacrylamide

Le SDS contenu dans le tampon de Laemmli procurait aux antigènes un environnement riche en charges négatives, tandis que le β-mercaptoéthanol empêchait la régénération des ponts disulfure. Le glycérol augmentait la densité des antigènes par rapport au tampon dans la partie supérieure du réservoir du gel de polyacrylamide à 10% (Biorad), à raison de 100 µl (environ 10 µg/ml). Sous l’effet d’un champ électrique uniforme de 130V, les protéines chargées négativement migraient de la borne négative (haut du gel) vers la borne positive (bas du gel). La migration durait 4h pour permettre une meilleure séparation des différentes protéines en bandes distinctes, en fonction de leur poids moléculaire.

4.2.1.3 Le transfert

Pour le transfert des protéines virales contenues dans le gel de polyacrylamide, celui-ci était mis en contact avec une membrane de nitrocellulose, le tout renforcé de part et d’autre par des éponges et du papier buvard. Le dispositif était placé dans une disquette remplie de tampon de transfert (Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) dilué). Un courant électrique était alors appliqué aux bornes de la plaque, les protéines chargées migrant depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel. La migration pour le transfert durait 1h à 30V. Elle était suivie d'une coloration au Rouge Ponceau à 0,1% (30 sec à 1 mn), pour visualiser les protéines transférées, reconnu pour sa fixation linéaire sur les protéines en fonction de leur poids moléculaire (permettant de vérifier la réussite du transfert) (figure 15). La décoloration s’effectuait dans l’eau à pH acide. La membrane était alors placée dans un récipient de 50 ml contenant du lait écrémé (5%, soit 2,5g de lait dans 50 ml de PBS, en présence de 0,1% de tween 20). Le récipient contenant la membrane était mis sous agitation toute la nuit pour la saturation des sites d'interactions non spécifiques entre la membrane et les anticorps. Ainsi, lorsque les anticorps étaient appliqués lors de l'étape suivante, ils reconnaissaient spécifiquement les épitopes des protéines cibles. Leur fixation à des sites non spécifiques était limitée, ce qui permettait de réduire le "bruit de fond".

79

Figure 15: Membrane de nitrocellulose, après transfert de protéines virales. Les bandes rougeâtres correspondent aux protéines virales après coloration au rouge ponceau.

4.2.1.4 L’hybridation

C’est l’étape principale au cours de laquelle des échantillons de sérum ou de plasma étaient déposés sur la membrane de nitrocellulose pour la recherche d’anticorps spécifiques dirigés contre les antigènes (épitopes) du spumavirus simien (Hussain et al. , 2003; McClure et al. , 1994; Schweizer et al. , 1995). Chaque échantillon était dilué au 1/100 et déposé dans des couloirs d’une calle qui fixait la membrane sur un socle du bloc de migration (Mini-Protean ® II Multiscreen Apparatus (Biorad)). Le tout était recouvert de parafilm puis incubé pendant 1h à 37°C dans une étuve. Après 3 lavages de 10 minutes chacun, la membrane était placée dans un bac contenant de l’anticorps secondaire de lapin couplé à la peroxydase (AbCys, S.A, dilué au 1/50 000 dans du lait écrémé dans du PBS et du tween 20). Le bac était mis sous agitation lente pendant 2h à température ambiante. Finalement, la membrane était lavée trois autres fois pendant 10 minutes, avant la révélation.

4.2.1.5 La révélation

Le substrat utilisé pour la révélation était le «SuperSignal west pico chemiluminescent substrate 34080», constitué de deux réactifs, le luminol (3-aminophthalhydrazide ou 5-amino-2,3- dihydro-1,4-phthalazinedione) et le peroxyde d’hydrogène (H 2O2), qu’il fallait préalablement mélanger volume à volume. Le luminol en présence du peroxyde était oxydé et doté d’une énergie plus élevée. La membrane placée dans le bac contenant ce mélange était agitée manuellement pendant deux minutes; la peroxydase présente sur l’anticorps secondaire agissait sur le substrat luminol et

80 provoquait une émission de la lumière. Cette membrane était ensuite montée dans une cassette puis transférée dans une chambre noire pour la révélation chimioluminescente. Lorsque la membrane était mise en contact avec un film photographique pendant 10 à 30 secondes, la lumière émise par le luminol était détectée sur le film photographique sous forme de tache restituant l’image du transfert. Le film était ensuite plongé successivement dans un liquide révélateur (pendant 2 minutes), un fixateur (2 minutes) et enfin dans de l’eau pour le rinçage.

4.2.1.6 Analyse des résultats

L’interprétation des résultats était faite suivant la présence ou l’absence d’une bande sur le film photographique. La séropositivité était définie par une réactivité comportant le doublet de la protéine Gag (protéines P74/70) du spumavirus simien (Hussain et al., 2003). La présence de l’une des deux bandes était interprétée comme un résultat indéterminé, alors que l’absence des deux bandes du doublet de la protéine Gag signait un résultat négatif (figure 16).

A B C

74KDa

70KDa

Figure 16: Les résultats de sérologie obtenus lors de la recherche des infections à spumavirus simien. 70 et 74 KDa (kilodalton) sont les masses moléculaires du doublet de la protéine Gag. A) Sérum d’un chimpanzé infecté par le spumavirus simien et servant de contrôle positif ; B) Sérum d’une personne n’ayant jamais eu de contact avec un primate non humain servant de contrôle négatif. C) Echantillon indéterminé.

81 4.2.2 Etudes moléculaires

La préparation du «mix», l’extraction de l’ADN viral, l’amplification génique (PCR) «nichée», et la migration des amplicons sur gel d’agarose ont été réalisées dans des salles différentes prévues pour chaque étape, afin d’éviter les risques de contamination.

4.2.2.1 Extraction

L’ADN viral a été extrait à partir de 200 µl de Cellules Mononuclées (environ 5.10 6 cellules) du Sang Périphérique (CMSP) ou de «buffy coat» des différents échantillons sérologiquement positifs ou douteux à l’aide d’un kit Qiagen (QIAmp blood Mini Kit, Courtaboeuf, France). C’est aussi à l’aide du même kit Qiagen que l’ADN a été extrait à partir d’organes des PNH, mais suivant un protocole différent nécessitant 25 mg de tissu. Dans tous les cas, l’extraction se déroulait en plusieurs étapes: 1) Lyse des échantillons dans des conditions dénaturantes à l’aide d’un tampon de lyse, 2) Fixation de l’ADN sur la membrane de la colonne, 3) Etapes de lavage (au nombre de deux) pour augmenter la pureté de l’ADN, 4) Elution de l’ADN avec 150µl de tampon d’élution et stockage à -20°C.

4.2.2.2 Mesure de la concentration des extraits d’ADN

Par dosage au spectrophotomètre, la concentration d’ADN de nos échantillons variait entre 33,1 et 38,5 µg/ml à 260 nm.

4.2.2.3 Amplification moléculaire

La détection de l’ADN proviral s’est faite par PCR en utilisant des amorces spécifiques pour l’amplification d’une région de 425 pb de l’integrase du gène pol (tableau 4) pour la recherche de spumavirus simien (McClure et al. , 1994; Schweizer et al. , 1995).

La composition du mix pour un volume final de 100 µl était la suivante: 10µl de tampon 10X de Mg 2+ (concentration finale 2.5 mM), 0,8 µl de dNTP (concentration finale 10mM), 2 µl de chaque amorce (SFVpol1/SFVpol2) (figure 17), 0.4 µl de taq et 5 µl (environ 5 ng) d’ADN extrait.

Les échantillons étaient soumis à 40 cycles d’amplification. L’étape de dénaturation était de 30 s à 94°C (4 minutes pour le premier cycle) , l’étape d’hybridation de 30 s à 55°C et l’étape d’élongation de 1 min 30 s à 72°C (4 minutes lors du dernier cycle). Pour la PCR «nichée», nous avons utilisé 5 µl de produit de la première PCR comme matrice auxquels nous avons ajouté la

82 même quantité et les mêmes réactifs que précédemment. Les amorces ont été changées (SFVpol3/SFVpol4) (figure 17), le tout dans un volume final de 100µl. Le programme de thermocyclage restait le même pour le second round.

Les produits de la deuxième PCR de 425 pb ont été visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,4% contenant du bromure d’éthidium.

La présence et la qualité de l’ADN ont été vérifiées en amplifiant un fragment du gène de l’albumine (tableau 4).

SFV pol 1

fragment de l’ intégrase de 519pb

SFV pol 2 PCR nichée SFV pol 3 Fragment de 425pb

SFV pol 4

Figure 17: Stratégie utilisée pour l’amplification moléculaire du fragment de l’integrase du spumavirus simien. Les deux premières amorces servent à amplifier un fragment de 519 pb et les deux autres celui de 425 pb. Avec l’autorisation d’Antoine Gessain.

4.2.2.4 Purification

Les amplicons ont été purifiés sur colonne en utilisant le kit de purification Qiaquik PCR (Qiagen Inc., Valencia, Calif). La purification des produits de PCR s’est faite en trois étapes:

1) Fixation de l’ADN double brin sur la membrane de la colonne à l’aide d’une solution tampon et élimination des amorces et des résidus nucléotidiques,

2) Lavage avec une solution tampon alcoolisée,

3) Elution de l’ADN à l’aide de 40 µl d’eau.

L’ADN ainsi purifié (30 à 40ng) a été envoyé à MACROGEN (Gasan-Dong, Séoul, COREE; www.macrogen.com ) pour séquençage.

83 Tableau 4: Différentes amorces utilisées au cours de l’étude Désignation Gène ou région Séquence (5’ vers 3’) amplifié SFV Pol 1 Integrase GCC ACC CAA GGG AGT TAT GTG G (Schweizer et al., 1995) (590 pb) SFV Pol 2 Integrase GCT GCA CCC TGA TCA GAG TG (Schweizer et al., 1995) (590 pb) SFV Pol 3 Integrase CCT GGA TGC AGA GTT GGA TC (Schweizer et al., 1995) (425 pb) SFV Pol 4 Integrase GAA GGA GCC TTA GTG GGG TA (Schweizer et al., 1995) (425 pb) AlbF Albumine GCT GTC ATC TCT TGT GGG CTG T (Laurendeau et al., 1999) AlbR Albumine ACT CAT GGG AGC TGC TGG TTC (Laurendeau et al., 1999) L14725 Cytochrome b CGA AGC TTG ATATGA AAA ACC ATC GTT G (Irwin et al., 1991) (267 pb) H15149 Cytochrome b AAA CTG CAG CCCCTC AGA ATG ATA TTT GTC (Irwin et al., 1991) (267 pb) CTC A

4.2.2.5 Analyses des séquences

Les résultats du séquençage, présentés sous la forme de chromatogrammes de type ABI contenant les séquences nucléotidiques ont été analysés à l’aide du logiciel Chromas 1.42 (32-bit) (Brisbane, Queensland Australia).

Les séquences ont ensuite été comparées aux séquences de la genbank à l’aide du BLAST pour leur caractérisation ( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ).

Sous format FASTA, elles ont été alignées avec d’autres précédemment publiées à l’aide du logiciel ClustalW 1.81 (Multiple séquence alignement www.align.genome.jp/ ; Kyoto University Bioinformatics Center) pour la détermination des similarités nucléotidiques.

Ce dernier alignement des séquences sous format «.aln» était converti au format «.nexus» à l’aide du logiciel BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htm ) pour les différentes études phylogénétiques.

84 4.3 Etudes phylogénétiques

L’alignement fut ensuite analysé suivant la méthode bayesienne mise en œuvre à l’aide du logiciel Mr Bayes version 3.1 (Ronquist F et al., 2003), avec les modèles Jones, Taylor et Thornton (Jones et al., 1992) et le modèle d’évolution rtREV (Dimmic et al., 2002), avec un million de générations et un burn-in de 2,5%.

Les paramètres de l’analyse pouvaient être examinés à l’aide du programme Tracer (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer) pour la détermination de la convergence vers des valeurs probables plus stables. Les différents essais de réplication ont été comparés entre eux pour une convergence vers des valeurs similaires.

Quand les essais de réplication étaient convergents, tous les arbres après le burn-in étaient combinés pour la construction d’un seul arbre consensus.

L’arbre phylogénétique final était obtenu par le consensus de la règle de majorité après enregistrement et utilisation des ressources graphiques contenues dans le logiciel FigTree v1.2

(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree.).

85

TROISIEME PARTIE

RÉSULTATS

86

CHAPITRE I

EPIDEMIOLOGIE DES INFECTIONS A SPUMAVIRUS SIMIEN CHEZ LES MANDRILLS CAPTIFS DU CDP

87

Infection naturelle des mandrills (Mandrillus sphinx) par deux variants distincts du spumavirus simien et transmission inter espèces à l’homme à la suite de graves morsures.

88 RESUME

Contexte et Objectifs

Les premières grandes études sur l’infection des spumavirus simiens ont été conduites dans des zoos et des centres de primatologie. Elles ont permis d’évaluer la prévalence et les modes de transmission de ces rétrovirus au sein de plusieurs colonies de PNH. Au Gabon, le centre international de recherches médicales de Franceville (CIRMF) héberge un centre de primatologie (CDP) où vivent des centaines de PNH dont les plus importants, en terme d’effectif, sont les mandrills. L’étude de cette colonie a montré leur infection par deux types de SIV et de STLV. L’objectif de notre première étude était donc d’évaluer dans cette colonie de mandrills, vivant en semi-liberté, l’histoire naturelle de leur infection par les spumavirus simiens, en déterminant les taux de prévalence, les modes de transmission, la diversité génétique des souches et leurs origines. De façon parallèle, nous avons aussi recherché le spumavirus simien chez des mandrills sauvages prélevés dans diverses régions du pays. Finalement, nous avons voulu comprendre le risque potentiel de transmission inter espèces de ces spumavirus de mandrills aux personnes qui sont exposées dans leur travail quotidien aux singes du CDP. L’étude a porté sur 84 mandrills du CDP (38 males et 46 femelles) dont la moyenne d’age était de 8 ans (intervalle, de 1 à 29 ans), et 15 mandrills sauvages. De même, nous avons étudié la transmission des spumavirus simiens chez 20 personnes travaillant au CDP (15 hommes et 5 femmes) avec une moyenne d’age de 39 ans (intervalle, 20-54 ans). Le temps moyen d’exposition de ces travailleurs était de 12 ans (intervalle, 5 mois-27 ans).

Résultats

Soixante dix (sur 84) échantillons de plasma de mandrills du CDP ont présenté une réactivité positive avec le doublet de la protéine Gag (protéines P74/70) du spumavirus simien, critère retenu pour la positivité d’un échantillon. Cela aboutit à une séroprévalence de 83% avec une différence non significative de l’infection entre les males et les femelles (84% et 82%, respectivement). L’infection augmentait avec l’age, avec une forte augmentation de la séropositivité à partir de 5 ans (94%). Sur 15 mandrills sauvages, 9 (60%) ont montré une séropositivité pour le spumavirus simien. Au moyen des études moléculaires, un fragment de 425pb de l’ integrase a été amplifié dans 61/70 des ADN testés. Au total, 53 nouvelles séquences de spumavirus simien chez des mandrills de la colonie, et 8 chez les mandrills sauvages ont été obtenues. Sur ces 53 séquences, nous avons mis en évidence 11 souches principales différentes, circulant dans la colonie et représentatives de toutes les autres. Ces souches étaient étroitement liées (avec un pourcentage de similarité variant de 94 à 100%), 89 à l’exception d’une seule (Mnd31CDP) obtenue chez un mandrill introduit dans la colonie à l’âge de 2 ans. Cette observation fut confirmée par l’analyse phylogénétique montrant que 52 des 53 séquences obtenues formaient un même cluster alors que celle du Mnd31CDP était seule. Pour déterminer l’origine des mandrills, nous avons amplifié le fragment de 267 pb du gène du cytochrome b dans l’ADN de 21 mandrills du CDP et 8 sauvages. L’analyse phylogénétique des séquences obtenues a mis en évidence l’existence de deux clusters, un au nord du Gabon et un autre au sud, séparés par le fleuve Ogooué, avec une concordance parfaite entre les lieux de prélèvement des mandrills sauvages et le résultat du cytochrome b. La séquence du cytochrome b du Mnd31CDP croisait avec celles des mandrills sauvages du sud et de celles obtenues chez 14 mandrills de la colonie du CDP. Seules 6 séquences des mandrills du CDP croisaient avec celles des mandrills sauvages prélevés au nord de l’Ogooué. Pour confirmer l’hypothèse de l’infection naturelle des mandrills par deux variants de spumavirus simien correspondant à deux types de virus relatifs à la séparation des mandrills en deux groupes du nord et du sud, nous avons amplifié et séquencé l’ADN de 8 mandrills sauvages du nord de l’Ogooué et de 7 mandrills sauvages du sud. Huit séquences de spumavirus simien ont été obtenues et comparées à celles obtenues chez les mandrills de la colonie du CDP. L’analyse phylogénétique a confirmé que les mandrills sont infectés par deux variants du spumavirus simien. La séquence du spumavirus simien du Mnd31CDP croisait avec celles obtenues chez les mandrills sauvages du sud, alors que les autres séquences des mandrills du CDP croisaient avec celles des virus infectant les mandrills du nord du Gabon. Nos résultats ont montré que les séquences obtenues dans la colonie étaient toutes liées, plusieurs d’entre elles étaient même identiques, à l’exception d’une seule. Chez les humains, nous avons évalué la transmission du spumavirus simien du mandrill chez 20 personnes travaillant à leur contact au CDP, en tant que vétérinaires ou animaliers. Les anticorps anti- spumavirus simien ont été mis en évidence chez 2 (10%) de ces personnes. Par amplification génique, le fragment de 425 pb de l’integrase a été obtenu chez les deux personnes séropositives, qui étaient les seules à avoir été mordues par un PNH durant leur travail dans ce centre. La première personne (H1CIRMF) a été mordue par un chimpanzé en 1996 et par un mandrill (Mnd2ACDP) la même année. La deuxième personne (H2CIRMF) a été mordue en 1985, sans avoir de souvenirs précis sur l’espèce du singe mordeur. Le fragment de 425 pb de l’integrase du spumavirus simien a été aussi détecté dans les ADN du chimpanzé et du mandrill (Mnd2ACDP) conservés le jour de la morsure. L’analyse phylogénétique a montré que les séquences de (Mnd2ACDP) et de (H2CIRMF) étaient identiques avec une seule base de différence (99.7% d’identité nucléotidique). La séquence obtenue chez le chimpanzé n’était de toute évidence pas en cause. Aucune

90 relation n’a été établie avec la séquence du spumavirus simien obtenue chez le chimpanzé malgré les 67 séquences de spumavirus simien que nous avons obtenues après clonage. L’analyse phylogénétique de la séquence du virus obtenue chez la deuxième personne a montré qu’elle était localisée avec les séquences du spumavirus simien infectant les singes d’Asie (96% de bootstrap) et croisait particulièrement avec celles du spumavirus des macaca fascicularis . Nous avons enfin évalué la variabilité génétique du spumavirus simien entre les séquences de la personne (H1CIRMF) et du (Mnd2ACDP) qui l’avait mordu, entre le moment de la morsure et 10 ans après (moment du prélèvement pour la présente étude). L’analyse des séquences a montré une forte similarité entre les deux séquences aux différents temps, avec l’émergence d’un clone majoritaire parmi les séquences obtenues chez le mandrill le jour de la morsure et 10 ans après. Le clone majoritaire chez l’homme différait d’une base nucléotidique, comparativement à celui obtenu chez le mandrill; les autres clones entre le mandrill et l’homme différaient d’une ou de deux bases. Toutefois, un seul clone de H1CIRMF (CIRMF1C9) était étroitement lié à la séquence du clone de Mnd2ACDP (Mnd2AC10Y10).

Conclusion

Les résultats obtenus dans cette étude rendent compte de l’infection des mandrills dans la colonie du CDP par deux variants du spumavirus simien. Ils suggèrent aussi que les mandrills du nord et du sud du Gabon sont infectés par deux variants différents. Le variant du nord est très majoritaire dans la colonie et nous renseigne sur l’histoire de sa création; l’un des mandrills fondateurs a probablement été infecté par un spumavirus simien du nord de l’Ogooué qui s’est ensuite propagé au fil des années dans la colonie. Des observations similaires sur l’infection des mandrills par deux autres rétrovirus, SIV et STLV ont été faites. Des analyses de polymorphisme suggèrent que le fleuve Ogooué, qui divise le Gabon en deux, sépare les mandrills en deux groupes phylogénétiques différents. La description d’infections persistantes par des spumavirus simiens chez deux personnes en permanence exposées aux PNH dans le cadre de leurs activités professionnelles confirme la transmission des rétrovirus simiens à l’homme. Par identité de séquences, nous avons démontré que le spumavirus simien qui infectait le (H1CIRMF) a été transmis par le mandrill (Mnd2ACDP) avec une grande stabilité génétique observée sur 10 ans. Ces résultats montrent que les spumavirus simiens sont fortement endémiques chez les mandrills du Gabon et peuvent être transmis à l’homme. D’autres études doivent être menées pour évaluer la séroprévalence de ces virus dans un large échantillonnage d’autres espèces simiennes en Afrique centrale. L’étude de l’infection des populations humaines, vivant de la chasse, par les spumavirus simiens doit nous renseigner sur la transmission de ces virus dans le milieu naturel.

91 Les co-infections dans la colonie des mandrills La répartition de la prévalence du spumavirus au sein des différentes générations de la colonie des mandrills du CDP, montre que les animaux de la deuxième et de la troisième génération sont les plus infectés, avec 28,5% et 23,8% respectivement. Ils sont suivis de ceux de la quatrième génération (16,7%), de la première (8%) et enfin de la cinquième (2,4%). Les résultats sur l’infection des mandrills du CDP par le spumavirus simien renforcent l’évidence sur la co-infection de ces PNH. En effet des cas de co-infection par le SIV/STLV ont été décrits au sein de la colonie (Nerrienet et al. , 1998). Ces infections par le spumavirus simien, dans le groupe des 84 individus que nous avons testés, indiquent non seulement des co-infections SFV/SIV mais aussi un cas de triple infection SFV/SIV/STLV (figure 18). La poursuite des études rétrovirales sur la totalité de la colonie permettra de décrire certainement d’autres cas de co-infections. Notamment celles dues aux SFV/STLV et d’autres triples infections.

Mandrills du CDP

Mnd2 Mnd5 Mnd6 Mnd10 Mnd12 Mnd16 Mnd U Mnd30 Mnd17 Mnd31 Mnd P

5I , 5C, 10D, PA, PB 2D, 2F 6G, 6H 12A, 12F 16I, 16B U2 17H , 17I 5D, 5M 10M 12O, 12R, 16L PC 12T, 12Q

12A3 , 12P1 17A6, 17A7 2D8, 2D9 5D3, 5D5, 10E5, 10E7 16G2 2D11 5D6, 5D8 10F8, 10F5 12D3, 12D5 17A9, 17D7 10N1 12A12, 17E2, 17F4, 12O2 17B6, 17B4 17B10

2D7C 5D3A, 10E3B 12A12A 17B4A, 17B4B 5D3B, 5D3C 12C3B 17B4C, 17A1D 12D3F , 17B2C 17B2D, 17B2E

17B2A1 17B2A2

Figure 18 : Quelques cas de co-infections chez des mandrills du CDP par les rétrovirus. En couleur bleue, des mandrills co-infectés par SFV/SIV et en rouge, un mandrill triplement infecté par SFV/SIV/STLV

92 Two distinct variants of simian foamy virus in naturally infected mandrills (Mandrillus sphinx) and cross-species transmission to humans Mouinga-Ondémé et al.

Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105 (14 December 2010) Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

RESEARCH Open Access Two distinct variants of simian foamy virus in naturally infected mandrills (Mandrillus sphinx) and cross-species transmission to humans Augustin Mouinga-Ondémé1, Edouard Betsem2, Mélanie Caron1, Maria Makuwa1, Bettina Sallé3, Noemie Renault4, Ali Saib4, Paul Telfer5, Preston Marx5, Antoine Gessain2, Mirdad Kazanji1,6*

Abstract Background: Each of the pathogenic human retroviruses (HIV-1/2 and HTLV-1) has a nonhuman primate counterpart, and the presence of these retroviruses in humans results from interspecies transmission. The passage of another simian retrovirus, simian foamy virus (SFV), from apes or monkeys to humans has been reported. Mandrillus sphinx, a monkey species living in central Africa, is naturally infected with SFV. We evaluated the natural history of the virus in a free-ranging colony of mandrills and investigated possible transmission of mandrill SFV to humans. Results: We studied 84 semi-free-ranging captive mandrills at the Primate Centre of the Centre International de Recherches Médicales de Franceville (Gabon) and 15 wild mandrills caught in various areas of the country. The presence of SFV was also evaluated in 20 people who worked closely with mandrills and other nonhuman primates. SFV infection was determined by specific serological (Western blot) and molecular (nested PCR of the integrase region in the polymerase gene) assays. Seropositivity for SFV was found in 70/84 (83%) captive and 9/15 (60%) wild-caught mandrills and in 2/20 (10%) humans. The 425-bp SFV integrase fragment was detected in peripheral blood DNA from 53 captive and 8 wild-caught mandrills and in two personnel. Sequence and phylogenetic studies demonstrated the presence of two distinct strains of mandrill SFV, one clade including SFVs from mandrills living in the northern part of Gabon and the second consisting of SFV from animals living in the south. One man who had been bitten 10 years earlier by a mandrill and another bitten 22 years earlier by a macaque were found to be SFV infected, both at the Primate Centre. The second man had a sequence close to SFVmac sequences. Comparative sequence analysis of the virus from the first man and from the mandrill showed nearly identical sequences, indicating genetic stability of SFV over time. Conclusion: Our results show a high prevalence of SFV infection in a semi-free-ranging colony of mandrills, with the presence of two different strains. We also showed transmission of SFV from a mandrill and a macaque to humans.

Introduction 1-6% of people occupationally exposed to nonhuman Foamy viruses are members of the Spumavirus genus of primates in zoos, primate centres and laboratories, the Retroviridae family [1]. These complex exogenous mainly in North America but also in Europe [8-14]. retroviruses are highly prevalent in several animal spe- Recently, naturally acquired SFV infections were cies, including nonhuman primates, felines, bovines and described in a group of hunters living in Cameroon, equines, in which they cause persistent infection [2-7]. central Africa [15,16], and in people in frequent contact Simian foamy virus (SFV) infection has been reported in with various macaque species in Asia [17,18]. In Camer- oon, 3.6% of people who were severely bitten and other- * Correspondence: [email protected] wise injured while hunting gorillas and chimpanzees had 1 Unité de Rétrovirologie, Centre International de Recherches Médicales de detectable SFV infection [16]. Franceville, Franceville, Gabon Full list of author information is available at the end of the article

© 2010 Mouinga-Ondémé et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 2 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

Foamy viruses are considered to be non-pathogenic in Results naturally or experimentally infected animals SFV is highly endemic among mandrills, and the [10,11,16,19,20]. This apparent lack of pathogenicity prevalence increases significantly with age strongly contrasts with the cytopathic effect seen in The seroprevalence of SFV was evaluated in 84 man- vitro in infected cell cultures, with the characteristic drills (mean age, 8 years; range, 1-29), comprising 38 foamy appearance of vacuolized cells [19,21,22]. It was males (mean age, 7 years; range, 1-20) and 46 females suggested recently that the non-pathogenicity of SFV (mean age, 8.6 years; range, 2-29). Of these, 28 were infection in nonhuman primates in vivo is due to repli- juveniles (< 4 years); 36 were sub-adults (5-10 years); 6 cation in a superficial cell niche of the oral mucosa [23]. were adults (11-15 years), and 14 were old adults (>16 In contrast to lentiviruses, such as HIV and simian years) (Table 1). We found by Western blot analysis immunodeficiency virus (SIV), foamy viruses show little that 70 of the 84 mandrills had gag doublet reactivity, genetic drift in vivo [2,24-27]. Phylogenetic analysis has and they were thus considered SFV seropositive (Figure shown species-specific distribution of foamy viruses, 1), for an overall seroprevalence of 83%. Four were of indicating long-term co-evolution with their natural indeterminate seropositivity, and the 10 others were hosts. Switzer et al. suggested that foamy viruses have considered seronegative. As seen in Table 1 the seropre- co-speciated with Old World primates for at least 30 valence increased significantly with age (p<0.001), from million years [28]. 57% in juvenile monkeys to 94% in adults and 100% in While the molecular features of foamy viruses in vitro older mandrills. No significant difference was found have been studied extensively [19,21,22,29,30], little between males (84%) and females (82%). information is available on their epidemiological and viral characteristics in vivo [3,4,18,20,24-26,31]. The Molecular detection of SFV and genetic diversity in published epidemiological studies indicate that the sero- mandrills prevalence of antibodies to SFVs in captive adult nonhu- The DNA samples obtained from peripheral blood man primate populations can reach 75-100% [4,20,24]. mononuclear cells (PBMCs) from the 84 mandrills were Although several reports have been published on the examined by nested PCR targeting a 425-bp fragment of prevalence of SFV in semi-free-ranging colonies and integrase, a region in the polymerase gene. The 14 sero- wild troops of nonhuman primates [2,17,27,32-40], the negative and indeterminate samples were PCR negative. timing and modes of primary infection in vivo, especially SFV DNA was detected in 61 of 70 seropositive samples in natura, are still poorly understood. (87%); although the other nine mandrills were serologi- A semi-free-ranging colony of mandrills (Mandrillus cally positive, no SFV DNA could be detected. The sphinx) was created at the Primate Centre of the Inter- sequence of the integrase fragment was obtained for 53 national Centre for Medical Research (CIRMF) in PCR-positive samples (Table 1). Nucleotide sequence Gabon in 1983, and more than 140 mandrills are now comparison showed that 52/53 sequences were closely housed in the Centre [41]. Mandrills are found in the related, with 94-100% sequence similarity, and they were wild in a restricted area of central Africa, in the tropical also closely related to the five SFV sequences previously forests of Cameroon, Equatorial Guinea, Gabon and obtained by Calattini et al. [3]. The one divergent sam- southern Congo [41]. It has been reported previously ple, Mnd31CDP, from a wild-born mandrill introduced that mandrills are naturally infected with SIV (SIVmnd) into the colony at the age of 2 years, showed greater and simian T-cell leukaemia virus (STLV-1) [41-48], but nucleotide divergence (8-9%) than all the other mandrill little information is available on SFV infection in man- SFV sequences. drills. Calattini et al. reported that a small series of wild- The phylogenetic analysis confirmed these findings, as born, wild-caught mandrills in Cameroon as well as five shown in Figure 2. This tree represents the 11 main mandrills in the Primate Centre in Gabon were infected SFV strains circulating in the colony and, in the insert, with SFV [3]. Furthermore, recent studies showed that all 53 sequences, including the 11 main strains (in col- interspecies transmission of SFV from mandrills to our). These 53 newly obtained SFV strains belong to a humans is possible [15,16,34]. large clade comprising all theavailablesequencesfrom The aim of our study was to evaluate the natural his- mandrills and drills, with a high bootstrap value (100%). tory of mandrill SFV in this free-ranging colony, includ- This clade contains two main clusters. The first com- ing the prevalence, modes of transmission, genetic prises most of the new sequences and others previously diversity and origin. We also investigated cross-species obtained from mandrills, including the five sequences of transmission of mandrill SFVs to people occupationally Calattini et al. [3], from the same breeding centre. The exposed to these animals. second consists of the unique Mnd31CDP strain, which Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 3 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

Table 1 Seroprevalence and PCR results for SFV in semi-free-ranging mandrills, by age and sex Age Male Female total (years) No. % [95% CI] No. No. % [95% CI] No. No. % [95% CI] No. positive/ sequence/ positive/ sequence/ positive/ sequence/ tested positive tested positive tested positive PCR PCR PCR 1-4 (juveniles) 7/12 58 [30-86] 2/3 9/16 56 [32-90] 7/7 16/28 57 [39-75] 9/10 5-10 (young adults) 19/20 95 [86-105] 19/19 15/16 94 [83-105] 12/13 34/36 94 [86-102] 21/32 11-15 (adults) 1/1 100 0/1 5/5 100 5/5 6/6 100 5/6 >16 (old adults) 5/5 100 0/5 9/9 100 8/8 14/14 100 8/13 Total 32/38 84 [73-95] 21/28 38/46 82 [71-93] 32/33 70/84 83 [75-91] 53/61

is localized between the large clade of mandrills and that As seen in the phylogenetic tree, two distinct clusters of drills (Figure 2). could be distinguished, with perfect correlation between cytochrome b sequences and the origin of the wild man- Mandrills in Gabon are naturally infected with two drills. One cluster consisted of mandrills from regions distinct variants of simian foamy virus north of the Ogooué River and the second of animals To determine the origin and distribution of the different from regions south of the Ogooué. The Mnd31CDP clades in the mandrill colony, a 267-bp portion of the cytochrome b sequence clustered with sequences cytochrome b sequence was amplified and sequenced obtained from mandrills originating in southern Gabon, from 21 SFV-infected monkeys in the colony and from as did 14 of 21 analysed sequences of cytochrome b eight mandrills caught in the wild (Figure 3) in various from our colony. Only six sequences from other man- regions of Gabon (Figure 4). drills in our colony clustered with sequences from man- drills from northern Gabon (above the Ogooué River, see Figure 4). To confirm the hypothesis that mandrills are infected naturally with two different SFV strains, we amplified

MW and sequenced SFV from DNA in blood or tissue sam- ples collected from eight mandrills (pets or ‘bush meat’) from northern Gabon and seven from the southern part (Figure 4). Eight SFV sequences were obtained and com- Figure 1 Detection of SFV-specific antibodies by Western blot analysis in mandrill and human plasma samples. Seropositivity pared with the SFV in our colony. Phylogenetic analysis was defined by the presence of reactivity to the Gag doublet of 70 confirmed that mandrills are infected with two SFV kDa and 74 kDa as shown for positive controls (CTRL+). strains (Figure 5). Mnd31CDP clustered with the SFV Seronegativity was defined as no bands of the gag doublet obtained from wild monkeys from the south, whereas observed by Western blot, as in the negative control (CTRL-). the other strain clustered with newly obtained viruses Reactivity with a single band in the 70- to 74-kDa molecular mass range was considered indeterminate. The mandrills samples from wild northern animals. Cytochrome b phylogenetic Mnd5DCP, F 19y; Mnd5D3CDP, F 11y; Mnd17A9CDP, M 4y; analysis also confirmed the geographical separation of Mnd2D9CDP, M 6y; Mnd10E5CDP, F 5y; Mnd2DCDP, F 20y; the wild mandrills (Figure 3). Mnd5MCDP, M 9y; MndNB, M 5y; Mnd17HCDP, M 10y; Mnd12D3CDP, F 15y; Mnd5D3B, F 4y; Mnd2D8CDP, M 7y; Transmission of SFV from mandrills to humans Mnd16G2CDP, F 4y; Mnd16iCDP, M 8y and human H1CIRMF and H2CIRMF are seropositive. Only mandrills Mnd2DCDP, MndNB and We evaluated the possible transmission of mandrill SFV Mnd5D3B were negative in PCR. The mandrill Mnd17D7CDP, M 4y to humans by examining 20 people (15 men and 5 and the human H3CIRMF are indeterminate; and mandrills women; mean age, 39 years; range, 20-54) occupationally Mnd17F4CDP, F 4y and Mnd12O2CDP are seronegative. Mnd: exposed to mandrills as animal caretakers or veterinar- mandrill; CDP: Centre de Primatologie; in the middle: mandrill ians at the Primatology Centre. The mean duration of identity; M: male; F: female; Y: years. The relative molecular masses of SFVcpz-specific Gag protein are indicated on the left (MW). The exposure to nonhuman primates was 12 years (range, Western blot positive control is a serum from an SFV-positive 5 months to 27 years). Two of these people (10%) were chimpanzee [16]. The negative serum was obtained from a person foundtobeSFV-seropositivebyWesternblotting who had never been in contact with a nonhuman primate. (Figure 1). The SFV integrase sequence was detected by H1CIRMF, H2CIRMF, and H3CIRMF are the results of Western blot nested PCR in PBMCs from the two seropositive per- serology for human samples. sons, who were found to be the only ones who had Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 4 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

88 83

79 M. sphinx 100

64

100100

100

100 100 100 100

75 100

93 100

97

100

100 69

100 99

100 100

100 100

100

57

Figure 2 Phylogenetic relationship of integrase sequences (425 bp) circulating in the mandrill colony at the CIRMF. Phylogenetic tree of the 11 main circulating sequences (in red, mandrills harbouring virus from northern Gabon; in blue, from southern Gabon), representing all sequences in the colony. The five SFV sequences obtained previously by Calattini et al. [3] are identified with an asterisk. The insert shows all 53 sequences, including clone 11 (in colour). All SFV sequences were aligned with ClustalW (1.81) and edited with Bioedit. Phylogenetic analyses were performed with the Bayesian Markov chain Monte Carlo (BMCMC) method implemented in MrBayes 3.1 and the Rtrev model. Sequence AspSFV8spm (from a New World spider monkey) was included as an outgroup. The maximum clade credibility tree topology inferred with FigTree v1.2 is shown. Values above the branches are bootstrap values. All new mandrill sequences are identified by Mnd (for mandrill), a number (frequently followed by a letter) and ending with CDP (Centre de Primatologie, their origin) (vg: Mnd12QCDP). In brackets is the accession number in GenBank. been bitten by nonhuman primates during their work at not related to the sequence obtained from the chimpan- the Centre. The first person (H1CIRMF) was bitten by a zee. Phylogenetic analysis of the SFV obtained from the chimpanzee on a finger in 1996 and by a mandrill second person showed that the virus was located in the (Mnd2ACDP) on a shoulder during the same year. The clade of Asian SFVs (bootstrap, 96%) and clustered with second person (H2CIRMF) recalled a bite on a finger by Macaca fascicularis (Figure6).ThetwoSFV-infected an unknown monkey in 1985. SFV sequences were humans are healthy and show no clinical signs related to obtained from amplified 425-bp integrase fragments in a retroviral infection, 15 years after the bites. PBMC DNA from the two SFV seropositive persons as well as from the chimpanzee and the mandrill SFV shows extremely low genetic drift in mandrills and Mnd2ACDP. Phylogenetic analysis (Figure 6) showed humans that the viruses from H1CIRMF and from mandrill To evaluate the genetic variability of SFV in vivo,we Mnd2ACDP were almost identical, with only one base investigated the virus population in one mandrill at an difference (99.7% nucleotide identity). This sequence was interval of 10 years, and we also studied the genetic Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 5 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

62 Oyem

MndOyemWd Mnd119Wd Mnd125Wd Libreville Makokou 100 M. Sphinx Mnd83Wd north Ogooue River

Lambaréné

MndIdiataWd MSP-038 Franceville Mnd014Wd 100 Mnd148Wd CIRMF

52 M. Sphinx south Figure 4 Location of SFV-positive wild mandrills. Map of Gabon, with the capital (Libreville) and main cities (Oyem, Lambaréné, Makokou, and Franceville) and locations of the samples collected from SFV-positive wild mandrills (Mnd and MSP). Line in blue represents the Ogooué River, which divides the country.

94 to some published sequences. Only one clone sequence from H1CIRMF, CIRMF1C9, was closely related to a clone sequence from Mnd2ACDP (Mnd2AC10Y10). Figure 3 Phylogenetic tree from 267 bp of the mitochondrial cytochrome b gene from some of the mandrills in the CIRMF Discussion colony. Phylogenetic tree of sequences from 21 mandrills in the colony at the CIRMF (in red) and 8 wild mandrills (in blue) inferred We found a high seroprevalence of SFV in a semi-free- as described in Figure 2. Wild mandrills are indicated as Mnd (for ranging colony of mandrills originating from and living mandrill), a number or a name and Wd (for wild) (vg:Mnd125Wd). in Gabon, central Africa. The habitat of mandrills is An outgroup was a sequence of RCM_27 (from a red-capped restricted to western central Africa, which is highly mangabey). endemic for other retroviruses, such as SIV and STLV [42-47]. A seroprevalence of 89.5% was found in a small variation of the virus after transmission to a human free-ranging macaque population (mostly adults) living through a severe bite. We studied several clones in a temple in Bali, Indonesia, with a higher prevalence obtained in a single PCR: 18 clones from mandrill in adults than in juveniles [18,31,39]. A larger study pro- Mnd2ACDP in 1996 on the day H1CIRMF was bitten, vided evidence that Macaca tonkeana acquire SFV 13 clones from the same animal 10 years later, and 11 mainly through severe bites, mainly when young adults clones from the bitten person 10 years after the bite. aged 5-8 years compete for sex partners [27]. In a study Comparative sequence analysis showed strong nucleo- of free-ranging colonies of chimpanzees, Liu et al. found tide sequence similarity (data not shown), with a major a significant increase in SFV infection with age, with no identical strain (12/18 and 9/13 clones identical) among evidence of vertical transmission to the young [32]. In the sequences obtained in the mandrill on day 0 and 10 our study, there was a clear increase in SFV infection at years later. The major strain (4/11 clones) in the 4-5 years of age. Altogether, these findings indicate hori- infected person differed by one base from the major zontal rather than vertical (perinatal) transmission as the mandrill strain. The other clones in the two mandrill predominant route of SFV infection in these nonhuman and the human samples differed only slightly, with a primate communities. Nevertheless, some species or col- divergence of one or two bases. Also, as seen in Addi- ony specificity may be found in natura among troops of tional file 1 clones sequenced from H1CIRMF clustered nonhuman primates, which might change the relative mainly at the top of the tree, while sequences of the importance of different modes and thus the timing of clones from Mnd2ACDP clustered in the middle, close SFV transmission. Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 6 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

[51,34-44]. It has also been reported that salivary glands 94 are the major reservoir of SFV replication in monkeys [23,26,29]. We did not observe any difference in

78 seroprevalence according to the sex of the animals. M. Sphinx SFV seroprevalence increased significantly with age. north These findings are similar to those on the seropreva- lence of STLV-1 in this colony, which was evaluated at

100 100 13.4% [52].

60 Our study indicates that all except one integrase

100 sequence of the SFV strains circulating in the colony are 100 closely related, and some are identical. The probable 98 99 82 M. Sphinx explanation is related to the history of the colony, which 100 100 south was founded in 1983 with only a few animals, some of

100 which probably harboured a virus originating from 100 90 M. leucophaeus northern Gabon. The virus was therefore transmitted L. albigena and spread in the colony during the past 25 years by the 59 Papio 94 founders from the northern part of the country. Ten dif- 100 C. neglectus 98 ferent strains are circulating in the northern group, with 100 96-99% sequence similarity. Similar observations have Cercocebus been made with regard to the circulation of several 100 strains in other nonhuman primates, including monkeys 99

100 G. gorilla and apes [2,17,27,53].

91 The animal that harboured the eleventh strain circu-

100 93 lating in the colony, which is quite different from the 84

100 PtP. trogl lodyt dtes other strains, was a wild-born mandrill brought to

100 100 the Primate Centre in 2003 from the southern part of the country at the age of 2 years. It was kept in quaran- tine for 6 months and then introduced into the mandrill Figure 5 Phylogenetic confirmation of the presence of two colony. Dissemination of the virus could occur in several circulating SFV strains among mandrills. Phylogenetic tree of the ways, as indicated above, but also because one of the 425-bp fragments of a region of the integrase region in the SFV infected mandrills is a dominant male in the colony. polymerase gene. All 11 representative strains newly identified from mandrills in the colony (in red) at the CIRMF and the 8 new strains This hypothesis cannot, however, be confirmed, since identified from wild mandrills (in blue) located in various regions of no sample was available from the first mandrills intro- the country are shown in the tree. The new strains from mandrills duced into the colony. were analysed with SFV sequences obtained from various species of Our finding that two different strains exist in the nonhuman primates available in Genbank. The phylogenetic tree colony suggests that mandrills living currently in was obtained by the Bayesian method implemented in MrBayes version 3.1 software as described in the legend to Figure 2. The northern and southern Gabon are infected by two dif- names of the different nonhuman primate species included in the ferent SFV strains. Similar situations have been tree are listed on the right side of the tree. reported for two other retroviruses that infect these monkey species, SIV [43] and STLV-1 [47]. As seen in Figure 3 the cytochrome b study showed that most of It is known that a similar virus can be transmitted the mandrills are from the south but are infected with quite differently in different nonhuman primate species: a SFV strain from the north. This suggests that they STLV-1 appears to be acquired mainly in breast milk in were infected in the breeding colony by a SFV virus M. tonkeana [27] but is acquired mainly in adulthood in from a mandrill originating from the north (Figure 2), chimpanzees [18,33,49]; in mandrills, it is probably except for mandrill 31 (see above). In contrast, the ori- acquired through bites [42,46-48,50] and to a lesser gin of each wild mandrill (Figure 3) was concordant extent by sexual contact, and a predator-prey system with the virus they harboured (Figure 5), confirming may sometimes be also involved [49]. In our mandrill infection in their natural area. Furthermore, studies of colony, about 50 animals were SFV-positive at the age cytochrome b polymorphism suggest that the Ogooué of 1 year, perhaps due to exchange of saliva with their River separates mandrill populations into two different mother during feeding. It was reported recently that phylogenetic groups: one in the north (northern mandrills have a prominent muzzle-muzzle behaviour, Gabon and Cameroon) and the other south of the usually between young naive and older individuals River (southern Gabon and Congo) [54]. Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 7 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

89

100

100 M. sphinx s

100 y

100

86

100 an monke c

100 100 Afri

75 100 87 100

100

97 67 100 100 94 98

100 100 100

100 100

94

96 99

94 nkeys 86 Macaca sp. 99 98

70 Asian mo

100

100 Apes

100

Figure 6 Phylogenetic tree of the 425-bp fragments of the SFV integrase sequences obtained from two workers at the Primate Centre of the CIRMF. The two cases of SFV infection are in colour: red for the first and blue for the second. The origin of the first SFV sequence (H1CIRMF) is clearly defined as a mandrill (Mnd2ACDP), shown in the same colour. The second SFV sequence (H2CIRMF) clusters with Asian macaque sequences. The tree was inferred as described in Figure 2. Identified by an asterisk are the three published mandrill sequences known to infect humans. Human sequences are indicated by H (for human), a number (1 or 2) and CIRMF (Centre International de recherches Médicales de Franceville), where the study was performed. Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 8 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

Monkeys have a long co-existence with their SFV virus detectable by PCR have also been reported in hun- [2,24,28,32,33,53,55,56], which would have started when ters in south Cameroon [16]. Co-infection with two dif- mandrills in both the north and the south had a com- ferent simian viruses was demonstrated recently in mon ancestor and has persisted since their separation, chimpanzees infected not only with their own chimpan- about 800 000 years ago [54]. These results for SFV zee SFV, but also with a Colobus strain [49]. The sec- infection in mandrills are supported by the fact that the ond human was infected with a strain related to a same mandrills are infected with SIV [43] and STLV macaque SFV. Despite the use of thousands of maca- [47]. Our analysis of the results for 15 wild mandrills ques in biomedical research, primate facilities and insti- caught in the northern and southern parts of Gabon tutions for decades (in both Europe and North clearly indicates the existence of two different variant America), only one case of human infection with a strains of SFV. The discrepancy in our study between macaque foamy virus has been reported (in a worker in serological data and the absence of the SFV sequence in Canada after a severe bite) [9]. In contrast, recent stu- mandrill PBMCs may be due to a low viral load in dies in Asia showed transmission of macaque SFV to blood samples. In some juveniles, it could be the result ninepeople,includingzooworkers,ownersofnonhu- of high levels of maternal antibodies against SFV [2]. man primate pets, ‘bush meat’ hunters and temple We also found that two of 20 people working at the workers [17,18]. Mathematical modeling shows that, in Primate Centre were infected with SFVs: one with a Bali, about six of every 1000 visitors to monkey temples mandrill strain and the second with a macaque virus. will be infected with SFV [39]. Only about 50 people worldwide have been shown to be In our work, we also observed high stability of the SFV-infected (both serologically and molecularly) integrase sequence of SFV over time (10 years in an [13,14], including people occupationally exposed to non- infected mandrill as well as in an infected human), with human primates [12,25] and people at risk in natural neither genetic drift over time nor the presence of settings, such as hunters in central Africa [15,16]. quasi-species. Foamy viruses are genetically very stable Furthermore, only three other human infections with [57] and, with the exception of cross-species transmis- mandrill SFV have been reported. In the first case, a sions, have co-evolved with their hosts [28]. Their high hunter living in Cameroon was found to be infected by genome conservation often allows attribution to a parti- a mandrill strain, but the route of infection was not cular monkey or ape subspecies through analysis of the documented [15]. The second case was in a blood appropriate foamy virus sequence [27,32,33]. Further- donor in Cameroon, also with no information on the more, in cross-species transmission to humans or apes, route of infection [34]. In the third case, a man aged 26 the transmitted virus can be easily traced back to the years had been bitten by a small monkey while hunting transmitting monkey species and appears to be geneti- 1 year before the presence of mandrill SFV was found cally stable in the new host for decades [53,58,59]. [16]. We demonstrated the identity of the viral foamy In conclusion, we have shown that SFV is highly ende- strain in the donor (Mnd2ACDP) by molecular sequen- mic in mandrills in Gabon, and this virus can be trans- cing at the time of the bite that probably transmitted mitted to humans. Further studies are being conducted the virus, and in the human recipient 10 years later, to evaluate the prevalence of this virus in larger samples with 99% similarity between the two sequences. from various monkey species in central Africa. We are Thispersonhadbeenbittenonlyoncebymandrill also studying the natural transmission of these viruses Mnd2ACDP and not by other mandrills. The presence to human populations living in this geographical area, of a sequence from the clones of H1CIRMF where consumption of ‘bush meat’ and hunting are (CIRMF1C9) among clone sequences from Mnd2ACDP, common. particularly Mnd2AC10Y0 (Additional file 1), sustains the hypothesis of the origin of H1CIRMF virus from Materials and methods Mnd2ACDP.Noclosesequence similarity was found Mandrills and biological samples between the H1CIRMF sequence and the three other We studied 84 mandrills in the semi-free-ranging colony sequences previously found in humans infected by a housed at the Primatology Centre of the International mandrill SFV [15,16,34] (Figure 6). Centre for Medical Research in Franceville, Gabon. Only one molecular demonstration of SFV interspecies Wild-born, wild-caught animals and animals born at the transmission has previously been reported, due to a bite Centre were maintained in accordance with the guide- by a chimpanzee to a zoo worker [12]. Although the lines of the United States National Institutes of Health. person infected by the mandrill virus in our study had The six male and eight female mandrills that founded also been bitten during his professional activity by a the colony were brought from various parts of Gabon chimpanzee, we were unable to detect any chimpanzee and released into the enclosure in 1983 [43,46]. A small SFV sequence in his PBMCs. ‘Dual’ risks with only one colony of macaques (M. fascicularis)wasalsofounded Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 9 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

in 1983. Blood samples from monkeys in this colony are the Qiagen kit (QIAmp blood Mini Kit, Courtaboeuf, collected every year, stored at -80°C and tested for dif- France). The first round of PCR involved a described set ferent retroviruses, including SFV. Thus, between of primers [61] (primer 1: GCC ACC CAA GGG AGT November 2006 and January 2007, 7 ml of blood were TAT GTG G, and primer 2: GCT GCA CCC TGA collected from mandrills in EDTA-K2 tubes under keta- TCA GAG TG) for amplifying an integrase fragment of mine HCl anaesthesia (10 mg/kg body weight). Plasma 590 bp (a region in the polymerase gene), under the fol- and PBMCs obtained after Ficoll separation were kept lowing conditions: 40 cycles of 30 s of denaturation at frozen. 94°C, 30 s of annealing at 55°C and 1 min of extension Wild mandrills were collected in cities and villages at 72°C. A 425-bp fragment corresponding to another throughout the country and in the Lopé Reserve. We portion of the integrase was amplified under the same collected blood samples from locally captured live ani- conditions with nested primers (primer 3: CCT GGA mals (pets) and from wild mandrills as previously TGC AGA GTT GGA TC and primer 4: GAA GGA described [43]. Small amounts of tissue (donated by GCC TTA GTG GGG TA), as reported previously hunters) were also collected from fresh cadavers in vil- [25,60,61]. lages or on markets [54]. No money or favours were ThepresenceandqualityoftheextractedDNAwere exchanged for these samples in order to prevent any verified by amplifying an albumin gene fragment. increase in demand for ‘bush meat’. All samples were Amplification and detection of albumin were carried out collected with the approval of the Gabonese Govern- as described for SFV pol sequences, but with specific ment and in accordance with national laws. Tissue sam- primers (forward: AlbF: GCT GTC ATC TCT TGT ples were immediately preserved and then stored at -20° GGG CTG T and reverse: AlbR: ACT CAT GGG AGC C until tested. TGC TGG TTC) [62]. Molecular amplification was also To evaluate possible transmission of SFV from man- performed, with the same program, to study the 267-bp drills to humans, blood was collected from caretakers or cytochrome b region, which was sufficiently variable to veterinarians working at the Primatology Centre. The differentiate the northern and southern populations of participants were volunteers, and fully informed consent mandrills [54] with these specific primers: L14725: CGA was obtained from each person before testing. The sam- AGC TTG ATATGA AAA ACC ATC GTT G and ples were anonymous, but age and information about H15149: AAA CTG CAG CCCCTC AGA ATG ATA the contact, such as a bite, scratches or other wounds, TTT GTC CTC A [63]. Positive PCR products were were retained (for 12 years of mean length of potential directly sequenced. In order to evaluate genetic drift in exposure to animals). The study obtained ethical clear- vivo, purified PCR products were cloned with the ance from the public health authorities. pCR2.1 TOPO plasmid (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), and various positive clones were selected, Serological studies extracted, purified and sequenced with an automatic Plasma from mandrills was screened for the presence of sequencing system (GATC, Germany). foamy virus antibodies as described previously [4,25,60]. Briefly, a Western blot assay was performed with an Nucleotide sequence accession numbers SFV-infected BHK-21 cell line as the source of foamy All the SFV and cytochrome b sequences from mandrills viral antigens [27]. Plasma was tested at 1:100 dilution. and humans obtained in this study have been submitted Western blot seropositivity was defined as the presence to GenBank as cytochrome b (accession numbers of reactivity to the Gag doublet of 70 kDa and 74 kDa, GU169713 to GU169741) and SFV (accession numbers as previously described [4]. Samples without reactivity GU169742 to GU169847). to either Gag protein were considered seronegative, and those with reactivity to a single band in the 70- to Phylogenetic analysis 74-kDa molecular mass range were considered indeter- For the phylogenetic analysis, the new SFV sequences minate. The Western blot positive control was serum were aligned with the ClustalW (1.81) program [64] and from an SFV-positive chimpanzee, used by Calattini then analysed and edited with Bioedit http://www.mbio. et al. [16]. The negative serum was obtained from a ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html. The final alignment was human who had never been in contact with a nonhu- submitted to the the Bayesian method implemented in man primate. MrBayes version 3.1 software (2005) [65] with the Jones, Taylor and Thornton model [66] and the rtREV model Molecular studies [67] of evolution and gamma distributed rates at sites, High relative molecular mass genomic DNA was with one million generations and burn-in of 2.5%. Baye- extracted from PBMCs from the tested animals and sian parameters were examined with the Tracer pro- tested against several positive and negative controls with gram http://evolve.zoo.ox.ac.uk/Evolve/Software.html to Mouinga-Ondémé et al. Retrovirology 2010, 7:105 Page 10 of 12 http://www.retrovirology.com/content/7/1/105

determine convergence to a stable log likelihood value. the paper. AS, PT, PM and BS contributed reagents and materials. All the Likelihood traces between replicate runs were compared authors were involved in drafting the paper. for convergence to similar log likelihood values. All esti- Competing interests mated sample sizes were greater than 545 [68]. If repli- The authors declare that they have no competing interests. cate runs converged, all trees after burn-in were Received: 25 May 2010 Accepted: 14 December 2010 combined to create a single consensus tree. BMCMC Published: 14 December 2010 posterior probability values represent the proportion of MCMC samples that contain a particular node. The References 1. Hooks JJ, Gibbs CJ Jr: The foamy viruses. Bacteriol Rev 1975, 39:169-185. final phylogenetic tree was obtained by majority rule 2. Blewett EL, Black DH, Lerche NW, White G, Eberle R: Simian foamy virus consensus and after editing with the graphic resources infections in a baboon breeding colony. Virology 2000, 278:183-193. contained in the FigTree v1.2 software http://tree.bio.ed. 3. Calattini S, Nerrienet E, Mauclere P, Georges-Courbot MC, Saib A, Gessain A: Natural simian foamy virus infection in wild-caught gorillas, mandrills ac.uk/software/figtree. and drills from Cameroon and Gabon. J Gen Virol 2004, 85:3313-3317. 4. Hussain AI, Shanmugam V, Bhullar VB, Beer BE, Vallet D, Gautier-Hion A, Statistical analysis Wolfe ND, Karesh WB, Kilbourn AM, Tooze Z, Heneine W, Switzer WM: Screening for simian foamy virus infection by using a combined antigen SFV serological status in relation to sex and age group Western blot assay: evidence for a wide distribution among Old World was analysed statistically by the chi-squared test with primates and identification of four new divergent viruses. Virology 2003, Yates correction, and prevalence and odds ratios were 309:248-257. 5. McClure MO, Bieniasz PD, Schulz TF, Chrystie IL, Simpson G, Aguzzi A, calculated. The corresponding 95% confidence intervals Hoad JG, Cunningham A, Kirkwood J, Weiss RA: Isolation of a new foamy were reported as measures of statistical significance. The retrovirus from orangutans. J Virol 1994, 68:7124-7130. Mann-Whitney U test was also used for statistical analy- 6. Saib A: Non-primate foamy viruses. Curr Top Microbiol Immunol 2003, 277:197-211. sis. Significance was assumed at p < 0.05. All analyses 7. Tobaly-Tapiero J, Bittoun P, Neves M, Guillemin MC, Lecellier CH, Puvion- were performed with Statistica software v7.1 (StatSoft Dutilleul F, Gicquel B, Zientara S, Giron ML, de The H, Saib A: Isolation and France, http://www.statsoft.fr). characterization of an equine foamy virus. J Virol 2000, 74:4064-4073. 8. 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Schweizer M, Falcone V, Gange J, Turek R, Neumann-Haefelin D: Simian CIRMF1C9). Clones from Mnd2ACDP are in two groups: on the day of foamy virus isolated from an accidentally infected human individual. J injury: Mnd2A (the mandrill), followed by C (for clone, with a Virol 1997, 71:4821-4824. corresponding number) and ending with J0 (day of injury). The clones 12. Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam V, Cong ME, Parekh B, Lerche NW, obtained 10 years after the injury have Y10 (10 years after) at the end. Yee JL, Ely JJ, Boneva R, Chapman LE, Folks TM, Heneine W: Frequent An outgroup is the sequence Mnd203SFV (reported by Calattini et al. [3] simian foamy virus infection in persons occupationally exposed to as originating from a drill, but clustering with Cercocebus species). nonhuman primates. J Virol 2004, 78:2780-2789. 13. Khan AS: Simian foamy virus infection in humans: prevalence and management. Expert Rev Anti Infect Ther 2009, 7:569-580. 14. Gessain A, Calattini S: Emergence of simian foamy viruses in humans: Acknowledgements facts and unanswered questions. Future Virol 2008, 3:71-81. We thank the CIRMF, which is funded by the Gabonese Government, Total- 15. Wolfe ND, Switzer WM, Carr JK, Bhullar VB, Shanmugam V, Tamoufe U, Gabon and the French Foreign Ministry. We thank Dr Olivier Bourry, Dr Nina Prosser AT, Torimiro JN, Wright A, Mpoudi-Ngole E, McCutchan FE, Birx DL, Jaffré and Dr Delphine Verrier for technical help. The funders had no role in Folks TM, Burke DS, Heneine W: Naturally acquired simian retrovirus the study design, data collection or analysis, the decision to publish or infections in central African hunters. Lancet 2004, 363:932-937. preparation of the manuscript. 16. Calattini S, Betsem EB, Froment A, Mauclere P, Tortevoye P, Schmitt C, Njouom R, Saib A, Gessain A: Simian foamy virus transmission from apes Author details to humans, rural Cameroon. 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doi:10.1186/1742-4690-7-105 Cite this article as: Mouinga-Ondémé et al.: Two distinct variants of simian foamy virus in naturally infected mandrills (Mandrillus sphinx) and cross-species transmission to humans. Retrovirology 2010 7:105.

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Chapitre II :

PREVALENCE DES INFECTIONS A SPUMAVIRUS SIMIENS CHEZ DES PRIMATES NON HUMAINS SAUVAGES ET LEUR TRANSMISSION INTER ESPECES AUX HUMAINS

106

Transmission inter espèces des spumavirus simiens à l’Homme au Gabon

107 RESUME

Contexte et objectifs

Nos résultats présentés dans le chapitre précédent ont montré que (i) le spumavirus simien est endémique au Gabon (étude des mandrills) ; (ii) la transmission de ce virus des mandrills à l’homme est réelle. Nous avons voulu continuer cette étude sur un grand nombre de PNH du Gabon. L’objectif de ce travail complémentaire a été d’estimer la présence, la circulation et la prévalence des spumavirus simiens à une plus grande échelle chez différentes espèces de PNH du Gabon. Ensuite nous avons suivi une cohorte de personnes vivant à proximité de l’habitat naturel de ces PNH qui présentaient des risques d’être infectées par des spumavirus simiens, par transmission du singe à l’homme. Notre population cible a donc été des chasseurs mordus par ces animaux. Au cours des différentes missions de terrain, nous avons prélevé, dans les 9 provinces du Gabon, du sang chez 286 primates non humains et des organes chez 211 autres, soit un total de 497 prélèvements répartis selon 13 espèces simiennes. Concernant les humains, 78 personnes (10 femmes, 59 hommes et 9 enfants) mordues par un PNH ont été prélevées dans diverses régions du pays. Par ailleurs, 154 chasseurs (non mordus) provenant des régions du Gabon ont été aussi inclus dans cette étude. Toutes les personnes ont été examinées sur le plan clinique au cours de l’étude, et une analyse de sang pour la numération formule sanguine a été réalisée.

Résultats

L’analyse sérologique a mis en évidence des anticorps contre le spumavirus simien dans 31/286 plasmas de PNH testés, soit une séroprévalence de 10.8 %. Les études moléculaires effectuées sur la totalité des 497 échantillons d’ADN ont permis d’amplifier le fragment de l’ integrase de 425pb et d’obtenir des séquences de spumavirus simien dans 38 échantillons obtenues chez 8 espèces distinctes de PNH selon la répartition suivante : mandrills (n=16 séquences), chimpanzés (n=8), solatus (n=6), nictitans (n=3), cephus (n=2), torquatus (n=1), neglectus (n=1) et albigena (n=1). Trois nouvelles espèces se sont avérées positives pour la première fois; les analyses phylogénétiques ont confirmé ces résultats car toutes les séquences s’intégraient dans leurs groupes phylogénétiques sauf celles obtenues chez les 3 types de cercopithèques, à savoir Cercopithecus nictitans, Cercopithecus solatus et cercopithecus cephus qui formaient trois nouveaux groupes phylogénétiques distincts. L’étude de la transmission inter espèces chez les personnes mordues par un PNH a révélé par analyse sérologique une séroprévalence de 24% (19/78). Toutes les personnes trouvées positives étaient des hommes dont la moyenne d’age est de 51 ans (21 à 80 ans). Par amplification

108 moléculaire, le fragment de 425pb de l’ integrase du spumavirus simien a été mis en évidence et séquencé dans 15 échantillons d’ADN sur les 19 personnes séropositives. L’étude phylogénétique a montré que sur les 15 séquences, 12 provenaient de Gorilla gorilla, 2 de Pan troglodytes troglodytes (P.t.t) et 1 de cercopithecus sp. Les deux séquences de spumavirus de P.t.t étaient identiques et ont été obtenues chez deux personnes mordues par un même animal au cours d’une partie de chasse. Aucun des 154 chasseurs non mordus n’a été diagnostiqué positif en sérologie et en PCR pour le spumavirus simien. Les études épidémiologiques sur les facteurs de risques ont montré que le risque majeur d’être infecté par un spumavirus simien est d’être mordu par un grand singe (surtout le gorille) au cours de la chasse en forêt.

Conclusion

La prévalence du spumavirus simien chez les PNH apparaît être largement plus faible chez les animaux sauvages que chez les animaux captifs, comme nous avons pu le constater entre la colonie de mandrills du CIRMF et l’étude sur la faune sauvage que nous avons effectuée dans un deuxième temps. Ceci est certainement dû à l’âge auquel les animaux ont été capturés. Le virus se transmet lors des rivalités pour l’accès aux femelles, les animaux prélevés sont récupérés très jeunes (6 mois à 1 an) après l’élimination de leur mère par les chasseurs. La description de nouvelles infections naturelles chez trois espèces de cercopithèques suggère que d’autres espèces de singes peuvent être infectées par ce virus. De fait, des recherches supplémentaires pour une meilleure cartographie de l’infection de spumavirus simien chez un très grand nombre de PNH en Afrique apparaissent nécessaires. La prévalence du spumavirus simien chez les humains en contact avec la forêt, et ayant été mordus par un PNH, est très élevée, comparativement à celle obtenue chez des personnes travaillant dans des zoos. En particulier, nos résultats révèlent un risque majeur de se faire infecter par un spumavirus simien en cas d’agression par un gorille. Les contacts réguliers que nous avons avec les personnes infectées montrent une absence de signes cliniques provoqués par le spumavirus simien, malgré la persistance de l’infection depuis des dizaines d’années. Toutefois, les recherches sur les spumavirus simiens doivent se poursuivre, pour évaluer le risque de transmission intra familiale, et pour prévenir l’émergence d’une nouvelle pathologie associée à cette infection zoonotique. L’étude clinique de l’infection par des spumavirus doit probablement privilégier des populations co-infectées par le VIH.

109 1 Note

2 Cross-species transmission of simian foamy virus to humans in rural

3 Gabon, central Africa

4 Augustin Mouinga-Ondémé1, Mélanie Caron1, Dieudonné Nkoghé2, Paul Telfer3, Preston

5 Marx3, Ali Saïb4, Eric Leroy2, Jean-Paul Gonzalez1, Antoine Gessain5 and Mirdad Kazanji1-6*

6

7 1Unité de Rétrovirologie, Centre International de Recherches Médicales de Franceville,

8 Franceville, Gabon

9 2Unité des Maladies Virales Emergentes, Centre International de Recherches Médicales de

10 Franceville, Franceville, Gabon

11 3Tulane National Primate Research Center, Covington, Louisiana, USA

12 4 CNRS UMR7212 - INSERM U944 - Institut Universitaire d'Hématologie – Conservatoire

13 National des Arts et Métiers, Chaire de Biologie. Paris, France

14 5Unité d’Epidémiologie et Physiopathologie des Virus Oncogènes, URA CNRS 3015, Institut

15 Pasteur, Paris, France

16 6 Institut Pasteur de Bangui, Bangui, Central African Republic.

17 Running head: SFV in wild non-human primates and interspecies transmission

18 Keywords: SFV, wild-born non-human primates, interspecies transmission, Gabon

19 * Corresponding author:

20 Institut Pasteur de Bangui

21 BP 923, Bangui, Central African Republic, E-mail: [email protected]

22

1 23 Abstract (116 words)

24 In order to characterize simian foamy retroviruses (SFVs) in wild-born non-human primates

25 (NHPs) in Gabon and to investigate cross-species transmission to humans, we obtained 497

26 NHP samples composed of 286 blood and 211 tissues (bush meat). Anti-SFV antibodies were

27 found in 31 of 286 plasma samples (10.5%). The integrase sequence was found in 38/497

28 samples including blood and tissues with novel SFVs in several Cercopithecus. Of the 78

29 people, mostly hunters, who had been bitten or scratched by NHPs, 19 were SFV seropositive,

30 with 15 cases confirmed by PCR. All but one were infected with ape SFV. We thus found

31 novel SFV strains in NHPs in Gabon and high cross-species transmission of SFVs from

32 gorilla bites.

33

2 34 Foamy viruses belong to the spumaretrovirus subfamily of the Retroviridae family. They are

35 highly prevalent in several animal species, particularly in non-human primates (NHPs), in

36 which they establish persistent infections (19), the documented level of infection being 75–

37 100% in captive adult NHPs. Most of the captive animals examined have been macaques and

38 baboons (3, 7). Recently, it was shown that colonies of NHPs living in the wild, including

39 various species of monkey and ape in Africa (mandrills, gorillas, chimpanzees) and Asia

40 (subspecies of macaques), are also infected with SFV (6, 13, 17). The oral mucosa has been

41 shown to be the main site of SFV replication in vivo, and saliva appears to be the principal

42 reservoir of SFV (20). In NHPs, SFV is presumed to be transmitted mainly through severe

43 bites, thus involving contact between infected saliva and blood (3, 7, 19). Other factors could

44 play an important role in SFV transmission: Leendertz el al demonstrated that SFV could be

45 transmitted to chimpanzees after the consumption of smaller NHPs such colobus monkeys

46 (16).

47 Zoonotic transmission of SFV from various NHPs to occupationally exposed people, such as

48 zookeepers, veterinarians and personnel of animal care facilities, is well documented (9, 14),

49 and bites from adult NHPs are presumed to be the major risk factor for viral acquisition.

50 Acquired SFV infection has also been reported in hunters in the rainforest area of south

51 Cameroon and in people living in close contact with macaques in various Asian countries (5,

52 12, 27). In Cameroon, 24% of people who were bitten while hunting apes were infected with

53 SFV (5). Neither signs of infection-associated disease in humans nor human-to-human

54 transmission of SFV have, however, been documented (2, 5, 9, 14).

55 Few data are available on SFV infection in Gabon (18). In this central African country, a wide

56 diversity of NHPs live deep in the rainforest, and hunting monkeys and apes is still frequent,

57 with wide circulation of ‘bush meat’. The aims of the study reported here were to detect and

3 58 characterize SFVs in wild-born NHPs in Gabon, to investigate interspecies transmission of

59 SFVs from NHPs to humans and to identity risk factors for such zoonotic infection.

60 Blood and tissues (bush meat) were collected from 497 monkeys and apes, representing 13

61 species of NHPs (Table 1) obtained from various regions in rural Gabon (supplementary

62 material). We obtained 273 blood samples from animals kept as pets, after their parents were

63 killed by hunters in the forest, and 13 others from mandrills from the Lopé National Park after

64 anesthesia by arrows. Killed animals are sold on stalls in villages; we sampled 211 NHPs sold

65 as ‘bush meat’ (Table 1). All samples were stored at –20 °C before transfer to the CIRMF for

66 analysis. Samples were collected in accordance with the rules of the animal care committee in

67 Gabon (22).

68 Blood was also collected from 78 people (10 women, 59 men and 9 children) who had

69 received severe bites or scratches from NHPs while hunting or playing with pets

70 (supplementary material Table S1). All received detailed information and gave consent during

71 personal interviews. Ethical approval was received from the Ministry of Health and from the

72 Ethical Committee of the CIRMF.

73 Plasma from NHPs and humans was screened by western blot (WB) for the presence of SFV

74 antibodies as described previously (7, 10, 18, 26). We used the same antigens of SFV

75 (chimpanzee foamy virus antigens) used in the study reported by Calattini et al. (5). Cell

76 lysates without SFV were used as negative antigen control. WB seropositivity was defined as

77 the presence of reactivity to the Gag doublet of 70 kDa and 74 kDa, as previously described

78 (5, 18). Samples with no reactivity to either Gag protein were considered seronegative, and

79 those with reactivity to a single band in the 70- to 74-kDa molecular mass range were

80 considered indeterminate. The WB positive control was serum from an SFV-positive

81 chimpanzee, published by Calattini et al. (5); the negative control was obtained from a human

82 who had never been in contact with NHPs.

4 83 DNA was extracted from buffy coat or tissues (bush meat conserved in RNAlater) with the

84 Qiagen kit (QIAmp blood Mini Kit, Courtaboeuf, France). The quality of the extracted DNA

85 were verified by amplifying an albumin gene fragment, as described previously (18). The set

86 of primers used in the round of PCR has been described previously (7, 24). These primers can

87 amplify the integrase fragment of SFV from humans and apes as well as from several

88 Cercopithecus monkeys and also some divergent SFV sequences from Asian monkeys.

89 Positive PCR products were directly sequenced with an automatic sequencing system

90 (Macrogen, Republic of Korea).

91 The SFV integrase sequences obtained were aligned with the ClustalW (1.81) program and

92 then analyzed with Bioedit http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html. Phylogenetic

93 trees were constructed by the Bayesian method as implemented in MrBayes version 3.1

94 software (2005) (23) and maximum likelihood by using the General Reversible Model of

95 evolution (GTR model) with a gamma distribution of rates across sites, run for 1,000,000

96 generations with a burn in of 25%. Parameters were examined with the Tracer program

97 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/), and all estimated sample sizes were greater than

98 545, as previously described (18). The trees were visualized using FigTree program

99 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).

100

101 SFV infection in wild-born non-human primates

102 Antibodies to SFV were found in 31 (10.8%) of the 286 NHPs plasma samples obtained from

103 wild-born NHPs. The samples showed clear gag-doublet reactivity and were thus considered

104 SFV seropositive (Table 1). Eleven samples were indeterminate, and the other 244 were

105 seronegative.

106 PCR was performed on all 497 NHP DNA samples obtained from 286 buffy coat and 211 tissues

107 (bush meat) including lymph nodes, muscles, lung and heart. SFV integrase fragment was

5 108 detected and sequenced in a total of 38 samples (22 from pets, 6 from mandrills in the National

109 Park and 10 from bush meat), including 16 Mandrillus sphinx, 8 Pan troglodytes troglodytes, 6

110 Cercopithecus solatus, 3 C. nictitans, 2 C. cephus, 1 C. neglectus, 1 Cercocebus torquatus, and 1

111 Lophocebus albigena (Table 1). Phylogenetic analyses (Figure 1) showed that the new sequences

112 obtained from these mandrills and chimpanzees clearly clustered within their respective clades

113 (containing prototypic sequences). Three new clades, as supported by high bootstrap values,

114 were identified: the first corresponded to the five new sequences of C. solatus, the second to

115 those from C. cephus, and the third to three new C. nictitans sequences. The three sequences

116 from L. albigena (LalKltWd), C. neglectus (Cne01Wd) and Cercocebus torquatus

117 (CtoMinkoWd) also clustered with their respective species clades.

118

119 Cross-species transmissionof SFV to humans

120 Antibodies against SFV were detected in 19 of 78 plasma samples (24%) from people who

121 recalled having been bitten, injured or scratched by monkeys or apes (supplementary material

122 Table S1). The SFV integrase fragment was detected by PCR in 15 DNA samples from the 19

123 seropositive persons and then sequenced (Table S1). Twelve of the DNA samples were from

124 people who had been severely bitten by gorillas, two from people bitten by chimpanzees and one

125 from a person who had been bitten by an unspecified Cercopithecus monkey. In all cases, there

126 was a perfect match between the history of the contact with a given species and the simian viral

127 sequence found in the infected person. The sequences from people bitten by gorillas belonged to

128 the large clade of gorilla foamy viruses (Fig. 2), while the sequences from the two people

129 (H3Gab1429 and H4Gab1481) who had been bitten by the same chimpanzee were infected with

130 an identical chimpanzee (P. t. troglodytes) foamy virus. The sequence obtained from the person

131 who had been bitten by an unknown Cercopithecus genus clustered with the CneDeb36 SFV

132 strain, obtained from a De Brazza monkey. A clinical examination conducted in the field by a

6 133 physician showed that all the SFV-infected humans were apparently healthy even several

134 decades after the bites.

135 In univariate analysis (Table 2), the presence of foamy viral infection was clearly associated with

136 the sex of the infected person (24% male versus 0% female, p = 0.035), the circumstances of

137 contact (26% hunting versus 0% pets, p = 0.011), and the type of NHP (33% apes versus 3%

138 monkeys, p = 0.001). Most of the contacts that resulted in an SFV infection were due to a bite by

139 a gorilla, accounting for 42% (16/38) of infections, while only two of the six people bitten by a

140 chimpanzee (33%) were infected.

141

142 In the present study, we found that SFVs naturally infect three species of monkeys (C. solatus,

143 C. nictitans and C. cephus), and we found a high rate of SFV infection in humans who had been

144 bitten, mainly by apes, indicating a high level of interspecies transmission from infected NHPs in

145 Gabon.

146 A low prevalence of SFV was found in blood obtained from wild monkeys and in various tissues

147 collected as bush meat. It has been reported previously that 50-100% of monkeys are infected

148 with SFV; however, the majority of these studies were done with monkeys born in the wild but

149 living in semi-free conditions, such as zoos, national parks and breeding colonies. Last year, we

150 reported a large study on free-living mandrills and showed a prevalence of SFV of 50–100%,

151 with a significant increase in SFV infection with age; the lowest prevalence being found in

152 juvenile monkeys (18). A seroprevalence of 89.5% was found in a small macaque population

153 (mostly adults) living in a temple in Bali, Indonesia, with a higher prevalence in adults than in

154 juveniles (11). Thus young monkeys are less frequently infected than older ones. In the present

155 study, the majority of blood samples were obtained from pets, which were monkeys generally

156 captured as juveniles after their mothers had been killed by hunters. This could explain in part

7 157 the low prevalence in our blood samples. The mandrills are typical of this situation. The

158 mandrills consisted of two groups: those collected as pets in various villages and those collected

159 from adult groups living in Lope National Park (n = 13 mandrills). A prevalence of 47% was

160 found in the latter group as compared with 9% in pets in various villages.

161 In our study, a lower prevalence of SFV was also found in various tissues collected as bush meat.

162 To our knowledge, the SFV prevalence in bush meat has not been reported previously. The

163 tissues were collected for SIV studies and kept for several years in RNAlater; we used the same

164 collection for our present studies. We cannot exclude the possibility that conservation of tissues

165 samples in RNAlater affected the presence of SFV; however, the presence and quality of the

166 extracted DNA were verified in all samples by amplifying an albumin gene fragment. It has been

167 reported that oral tissues are the major reservoir of SFV replication in monkeys (8, 20, 21).

168 Unfortunately, none of bush meat tissues contained oral tissue such as salivary glands. The

169 conservation of these tissues for many years and the origin of the samples might also explain the

170 low prevalence of SFV in our tissue collection. Our PCR methods was able to detect three new

171 species of monkey (C. solatus, C. nictitans and C. cephus) infected with species-specific SFVs,

172 which have not been shown previously to be infected with SFV.

173 C. solatus monkeys are a species of guenon, which are found specifically in Gabon. The six new

174 sequences obtained from this species were closely related and clustered, forming a clade

175 supported by a 100% boostrap value. The three new sequences obtained from C. nictitans were

176 closely related and formed a strongly supported clade with two other sequences (CAM2467 and

177 AG16) from two people living in south Cameroon (5, 27). AG16 was a hunter who had been

178 bitten by an unspecified small monkey (5); our data strongly suggest that the monkey was a C.

179 nictitans. This species, which is widely distributed in central Africa, including Gabon and south

180 Cameroon, is one of the most frequently hunted in these areas. We also showed that wild-born C.

181 cephus are naturally infected with SFV. The two new sequences clustered and were found to be

8 182 related to but different from two other sequences obtained from De Brazza guenons (Cne01Wd

183 and CnePollux).

184 The newly described sequences from eight chimpanzees and 16 mandrills clustered in the two

185 large groups of known strains, P. t. troglodytes for the chimpanzees and M. sphinx for the

186 mandrills. By adding new sequences of known geographical origin, we have confirmed that two

187 groups of strains naturally infect M. sphinx, as shown recently by our group (18). Further studies

188 are necessary to better understand the apparent presence of sub-clades of P. t. troglodytes, as

189 have already been initiated by others (17, 25).

190 In this study, we found 19 SFV seropositive people among the 78 who had been bitten or

191 scratched by an NHP, and an integrase fragment was detected by PCR in peripheral blood DNA

192 from 15 of them. The majority of individuals were infected with gorilla SFV. Although the

193 number of samples obtained from gorillas was low (only three blood samples and eight tissues),

194 none of these samples was positive for SFV by serology or PCR. This could be due to the fact

195 that these samples were obtained from pets in which a low prevalence of SFV was found. Our

196 results for SFV in humans are similar to that observed by Calattini et al. (5) in rural Cameroon.

197 They showed a prevalence of SFV in 24.1% of people who had had contact with apes (gorillas or

198 chimpanzees). This is not surprising, as the two cohorts are similar and from similar

199 geographical areas of Central Africa. It was also shown previously by Calattini et al. (5) that

200 transmission of SFV from NHPs to humans is much more likely after a deep bite and specifically

201 by an ape. In our study, 36 of the 78 individuals had been bitten by monkeys other than apes,

202 only one was positive for SFV. Furthermore, we collected 154 blood samples from people living

203 in Gabon who reported hunting NHPs but had never been bitten. None of these samples was

204 found to be SFV positive by serology or by PCR (Mouinga and Kazanji unpublished data).

205 We found that the major risk factor for humans for acquiring SFV infection after being bitten by

206 a NHP is the species and history of the NHP. Free-living apes confer a greater risk than pets and

9 207 small monkeys. This confirms the findings of a recent study of a comparable series in south

208 Cameroon (5, 9, 27). It may be that most pets, including wild-caught gorillas, are not infected, as

209 they are very young when captured. Furthermore, most wounds due to pet bites are not serious,

210 with mainly superficial tissue damage. This contrasts to the situation for apes, most animals,

211 mainly gorillas, being adults and giving bites that lead to major tissue damage, resulting in

212 contact between the ape’s saliva and human muscles, bones and blood, thus favoring cross-

213 species viral infection.

214 Some authors showed rare cases of transmission of SFV without a bite after contact with NHPs

215 (25, 27). In previous studies, few women were found to be SFV positive. In Africa, women do

216 not hunt, but they generally cut up the bush meat and are also exposed to the blood of animals

217 after injury and thus exposed to SFV transmission. Calattini et al. (4) also found a woman

218 infected with SFV after having handled bush meat in Cameroon. We cannot exclude the

219 possibility that other factors play an indirect role in SFV transmission, such as the proviral load

220 of SFV in the animals and the type of contact with humans. Furthermore, transmission of SFV

221 between monkeys could occur by routes other than bites. In our previous study on a mandrill

222 colony, 50% of the animals were SFV-positive at the age of 1 year, perhaps due to exchange of

223 saliva with their mothers during feeding. It was reported recently that mandrills have a prominent

224 muzzle–muzzle behaviour, usually between young naive and older individuals (15). Further

225 studies are needed to understand the factors influencing the transmission of SFV.

226 Five individuals were seropositive for SFV but no virus could be detected by PCR in their blood

227 samples. The lack of SFV sequences in WB-seropositive people was previously reported in

228 hunters in south Cameroon (5, 9, 27). Although the presence of divergent SFVs or exposure of

229 the NHPs and humans or abortive infections might explain this discrepancy, a low viral load in

230 the blood is more likely. Our PCR can amplify a large variety of SFVs, including several

231 divergent Asian variants (7).

10 232 In the present study we showed a strong similarity (93-97%) between SFV sequences obtained

233 from gorillas and from humans. We showed previously that SFV shows extremely low genetic

234 drift in both monkeys and humans (18). In our previous study, the genetic variability of SFV was

235 evaluated from an identified mandrill and after transmission to a person severely bitten at the

236 Primatology Center. Comparative sequence analysis showed also strong nucleotide sequence

237 similarity (99.7%) between SFV sequences obtained from the human and those from the

238 mandrill.

239 In Africa, SFV zoonosis has previously been reported in Zaire and most likely occurred in Kenya

240 when HFV was reported and is now documented to be of chimpanzee origin (1); in south

241 Cameroon also, 16 cases have been demonstrated serologically and molecularly (9, 5). Our series

242 of 15 well-documented cases expands such findings to Gabon and doubles the number of known

243 SFV-infected people in this area of the world. Our findings suggest that cross-species

244 transmission of SFV is widespread in central Africa, especially in villages and settlements in

245 lowland forest regions of Equatorial Guinea, Congo and the Democratic Republic of the Congo.

246 Hunting has increased in these countries due to a combination of urban demand for bush meat

247 and easier access to NHP habitats via logging roads, and this has increased the frequency of

248 human exposure to NHP retroviruses.

249 Further investigation of humans infected by SFV is ongoing in both central Africa and South-

250 East Asia, to investigate inter-human transmission in familial studies and the morbidity and

251 mortality that might be associated with this zoonotic infection, especially in people infected with

252 HIV.

253

254 We thank the CIRMF, which is funded by the Gabonese Government, Total-Gabon and the

255 French Foreign Ministry. We thank Dr Benjamin Ollomo, Dr Bertrand Mpiga-Mickoto and Dr

11 256 Delphine Verrier for technical help. The funders had no role in the study design, data collection

257 or analysis, the decision to publish or preparation of the manuscript.

258

259 References

260 261 1. Achong, B. G., P. W. Mansell, and M. A. Epstein. 1971. A new human virus in 262 cultures from a nasopharyngeal carcinoma. J Pathol 103:P18. 263 2. Boneva, R. S., W. M. Switzer, T. J. Spira, V. B. Bhullar, V. Shanmugam, M. E. 264 Cong, L. Lam, W. Heneine, T. M. Folks, and L. E. Chapman. 2007. Clinical and 265 virological characterization of persistent human infection with simian foamy viruses. 266 AIDS Res Hum Retroviruses 23:1330-7. 267 3. Broussard, S. R., A. G. Comuzzie, K. L. Leighton, M. M. Leland, E. M. 268 Whitehead, and J. S. Allan. 1997. Characterization of new simian foamy viruses 269 from African nonhuman primates. Virology 237:349-59. 270 4. Calattini, S., E. Betsem, S. Bassot, S. A. Chevalier, P. Tortevoye, R. Njouom, R. 271 Mahieux, A. Froment, and A. Gessain. 2011. Multiple retroviral infection by HTLV 272 type 1, 2, 3 and simian foamy virus in a family of Pygmies from Cameroon. Virology 273 410:48-55. 274 5. Calattini, S., E. B. Betsem, A. Froment, P. Mauclere, P. Tortevoye, C. Schmitt, R. 275 Njouom, A. Saib, and A. Gessain. 2007. Simian foamy virus transmission from apes 276 to humans, rural Cameroon. Emerg Infect Dis 13:1314-20. 277 6. Calattini, S., E. Nerrienet, P. Mauclere, M. C. Georges-Courbot, A. Saib, and A. 278 Gessain. 2004. Natural simian foamy virus infection in wild-caught gorillas, mandrills 279 and drills from Cameroon and Gabon, p. 3313-7, J Gen Virol, vol. 85. 280 7. Calattini, S., F. Wanert, B. Thierry, C. Schmitt, S. Bassot, A. Saib, N. 281 Herrenschmidt, and A. Gessain. 2006. Modes of transmission and genetic diversity 282 of Foamy Viruses in a Macaca Tonkeana colony. Retrovirology 3:23. 283 8. Falcone, V., J. Leupold, J. Clotten, E. Urbanyi, O. Herchenroder, W. Spatz, B. 284 Volk, N. Bohm, A. Toniolo, D. Neumann-Haefelin, and M. Schweizer. 1999. Sites 285 of simian foamy virus persistence in naturally infected African green monkeys: latent 286 provirus is ubiquitous, whereas viral replication is restricted to the oral mucosa. 287 Virology 257:7-14. 288 9. Gessain, A., and Calattini, S. 2008. Emergence of simian foamy viruses in humans: 289 facts and unanswered questions Future Virology Volume 3:pp. 71-81(11). 290 10. Hussain, A. I., V. Shanmugam, V. B. Bhullar, B. E. Beer, D. Vallet, A. Gautier- 291 Hion, N. D. Wolfe, W. B. Karesh, A. M. Kilbourn, Z. Tooze, W. Heneine, and W. 292 M. Switzer. 2003. Screening for simian foamy virus infection by using a combined 293 antigen Western blot assay: evidence for a wide distribution among Old World 294 primates and identification of four new divergent viruses. Virology 309:248-57. 295 11. Jones-Engel, L., G. A. Engel, M. A. Schillaci, A. Rompis, A. Putra, K. G. 296 Suaryana, A. Fuentes, B. Beer, S. Hicks, R. White, B. Wilson, and J. S. Allan. 297 2005. Primate-to-human retroviral transmission in Asia. Emerg Infect Dis 11:1028-35. 298 12. Jones-Engel, L., C. C. May, G. A. Engel, K. A. Steinkraus, M. A. Schillaci, A. 299 Fuentes, A. Rompis, M. K. Chalise, N. Aggimarangsee, M. M. Feeroz, R. Grant, 300 J. S. Allan, A. Putra, I. N. Wandia, R. Watanabe, L. Kuller, S. Thongsawat, R.

12 301 Chaiwarith, R. C. Kyes, and M. L. Linial. 2008. Diverse contexts of zoonotic 302 transmission of simian foamy viruses in Asia. Emerg Infect Dis 14:1200-8. 303 13. Jones-Engel, L., K. A. Steinkraus, S. M. Murray, G. A. Engel, R. Grant, N. 304 Aggimarangsee, B. P. Lee, C. May, M. A. Schillaci, C. Somgird, T. Sutthipat, L. 305 Vojtech, J. Zhao, and M. L. Linial. 2007. Sensitive assays for simian foamy viruses 306 reveal a high prevalence of infection in commensal, free-ranging Asian monkeys. J 307 Virol 81:7330-7. 308 14. Khan, A. S. 2009. Simian foamy virus infection in humans: prevalence and 309 management. Expert Rev Anti Infect Ther 7:569-80. 310 15. Laidre, M. E. 2009. Informative breath: olfactory cues sought during social foraging 311 among Old World monkeys (Mandrillus sphinx, M. Leucophaeus, and Papio anubis). J 312 Comp Psychol 123:34-44. 313 16. Leendertz, F. H., F. Zirkel, E. Couacy-Hymann, H. Ellerbrok, V. A. Morozov, G. 314 Pauli, C. Hedemann, P. Formenty, S. A. Jensen, C. Boesch, and S. Junglen. 2008. 315 Interspecies transmission of simian foamy virus in a natural predator-prey system. J 316 Virol 82:7741-4. 317 17. Liu, W., M. Worobey, Y. Li, B. F. Keele, F. Bibollet-Ruche, Y. Guo, P. A. 318 Goepfert, M. L. Santiago, J. B. Ndjango, C. Neel, S. L. Clifford, C. Sanz, S. 319 Kamenya, M. L. Wilson, A. E. Pusey, N. Gross-Camp, C. Boesch, V. Smith, K. 320 Zamma, M. A. Huffman, J. C. Mitani, D. P. Watts, M. Peeters, G. M. Shaw, W. 321 M. Switzer, P. M. Sharp, and B. H. Hahn. 2008. Molecular ecology and natural 322 history of simian foamy virus infection in wild-living chimpanzees. PLoS Pathog 323 4:e1000097. 324 18. Mouinga-Ondeme, A., E. Betsem, M. Caron, M. Makuwa, B. Salle, N. Renault, A. 325 Saib, P. Telfer, P. Marx, A. Gessain, and M. Kazanji. 2010. Two distinct variants 326 of simian foamy virus in naturally infected mandrills (Mandrillus sphinx) and cross- 327 species transmission to humans. Retrovirology 7:105. 328 19. Murray SM, L. M. 2006. Foamy virus infection in primates. J Med Primatol 35:225- 329 35. 330 20. Murray, S. M., L. J. Picker, M. K. Axthelm, K. Hudkins, C. E. Alpers, and M. L. 331 Linial. 2008. Replication in a superficial epithelial cell niche explains the lack of 332 pathogenicity of primate foamy virus infections. J Virol 82:5981-5. 333 21. Murray, S. M., L. J. Picker, M. K. Axthelm, and M. L. Linial. 2006. Expanded 334 tissue targets for foamy virus replication with simian immunodeficiency virus-induced 335 immunosuppression. J Virol 80:663-70. 336 22. Ollomo, B., P. Durand, F. Prugnolle, E. Douzery, C. Arnathau, D. Nkoghe, E. 337 Leroy, and F. Renaud. 2009. A new malaria agent in African hominids. PLoS Pathog 338 5:e1000446. 339 23. Ronquist, F., and J. P. Huelsenbeck. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic 340 inference under mixed models. Bioinformatics 19:1572-4. 341 24. Schweizer, M., R. Turek, H. Hahn, A. Schliephake, K. O. Netzer, G. Eder, M. 342 Reinhardt, A. Rethwilm, and D. Neumann-Haefelin. 1995. Markers of foamy virus 343 infections in monkeys, apes, and accidentally infected humans: appropriate testing 344 fails to confirm suspected foamy virus prevalence in humans. AIDS Res Hum 345 Retroviruses 11:161-70. 346 25. Switzer, W. M., V. Bhullar, V. Shanmugam, M. E. Cong, B. Parekh, N. W. 347 Lerche, J. L. Yee, J. J. Ely, R. Boneva, L. E. Chapman, T. M. Folks, and W. 348 Heneine. 2004. Frequent simian foamy virus infection in persons occupationally 349 exposed to nonhuman primates. J Virol 78:2780-9.

13 350 26. Tobaly-Tapiero, J., P. Bittoun, M. Neves, M. C. Guillemin, C. H. Lecellier, F. 351 Puvion-Dutilleul, B. Gicquel, S. Zientara, M. L. Giron, H. de The, and A. Saib. 352 2000. Isolation and characterization of an equine foamy virus. J Virol 74:4064-73. 353 27. Wolfe, N. D., W. M. Switzer, J. K. Carr, V. B. Bhullar, V. Shanmugam, U. 354 Tamoufe, A. T. Prosser, J. N. Torimiro, A. Wright, E. Mpoudi-Ngole, F. E. 355 McCutchan, D. L. Birx, T. M. Folks, D. S. Burke, and W. Heneine. 2004. 356 Naturally acquired simian retrovirus infections in central African hunters. Lancet 357 363:932-7. 358 359 360

14 361 Legends to Figures

362 Figure 1. Phylogenetic relationships of integrase sequences (425 bp) obtained from 38

363 wild-born monkeys and apes in Gabon. Phylogenetic tree of new sequences isolated from

364 16 Mandrillus sphinx (in red), one Lophocebus albigena (Lal, in brown), one C. neglectus

365 (Cne, in turquoise), one Cercocebus torquatus (Cto, in red), six C. solatus (in blue), three C.

366 nictitans (Cni, in green), two C. cephus (Cce, in purple) and eight new sequences isolated

367 from Pan t. troglodytes (Cpz for chimpanzee, in green). NHPs are indicated by the name of

368 the species (e.g. Mnd, for mandrill), the number of the sample (e.g. 122), followed by Wd

369 (wild) for the origin. SFV sequences from NHPs obtained in this study have been submitted to

370 the GenBank: Accession number HQ450599 to HQ450623 and HQ450625 to HQ450637.

371

372 Figure 2. Phylogenetic relationships of integrase sequences (425 bp) obtained from 15

373 persons bitten by a NHP. (*) indicate SFV sequences obtained from humans. The sequence

374 isolated from a man bitten by a Cercopithecus sp. is shown in blue, the 12 sequences from

375 people bitten by gorillas are in red, and the two sequences from people bitten by the same

376 P.t.troglodytes are in green. Sequence Asp8SFVsp (from a spider monkey) was included as an

377 out group. Values above the branches are bootstrap values. Human sequences are indicated by

378 H, an order number, Gab (for Gabon) and the initials (or a number) of the person. SFV

379 sequences from humans obtained in this study have been submitted to the GenBank:

380 Accession number HQ450584 to HQ450598.

381

382

383

15 100 Figure 1 80 77 100

100

100 M. sphinx 99 100

100 95

100

100

73 97 89 100

96 100 C. solatus 70 100 78 10082

100 98 82 92 C. nictitans 100

100 100 C. cephus 97 100 C. neglectus 53 90 C. torquatus 98 100

94 100

87

99

100

100

99 P. t roggylodytes

100 99

100

66 99

84 100 99

99

98 100 Gorilla

88 Figure 2 100 100 100 Mandrillus

100

100

100

95 100 78 90 95 50 * 100100 99

100 Cercopithecus

99 100 100 100

Macaca 100

100 87 * 88 * 99 * 59

60 * 77 * * Gorilla 51

99 51 * *

100

96

90

100 89 100 * 96 * PldP. troglodytes 67

99

72 Table 1. Species of monkeys and apes caught in the wild in Gabon, central Africa, with results of simian foamy viral serology and PCR

Names Common name No. positive/No. tested (%)

Seological tests in blood PCR samplesa b In buffy coat In Bush meat (Tissues)c

Cercopithecus solatus Sun-tailed monkey 8/16 (50) 6/16 (37.5) - Cercopithecus pogonias Crowned guenon 0/6 0/6 - Cercopithecus nictitans Greater white-nosed monkey 0/30 0/30 3/29 (10.3) Cercopithecus neglectus De Brazza guenon 0/3 0/3 1/3 (33.3) Cercopithecus cephus Red-eared guenon 0/67 0/67 2/46 (4.3) Cercocebus torquatus Red-capped mangabey 1/13 (7.7) 1/13 (7.7) 0/13 Mandrillus sphinx Mandrill 12/77 (15.6) 12/77 (15.6) 4/78 (5.1) Pan troglodytes troglodytes Central African chimpanzee 9/49 (18.4) 8/49 (18.6) 0/34 Gorilla gorilla Gorilla 0/3 0/3 0/8 Miopithecus ogooensis Gabon talapoin 0/2 0/2 - Miopithecus talapoin Talapoin monkey 0/8 0/8 - Colobus guereza Mantled guereza 0/2 0/2 - Lophocebus albigena Grey-cheeked mangabey 1/10 (10) 1/10 (10) -

Total 31/286 (10.8) 28/286 (9.8) 10/211 (4.7) aSerological tests was performed by Western Blot in sera obtained from various monkeys bPCR was performed in buffy coat obtained from monkeys and apes tested serologically with WB cPCR was performed only in tissues samples obtained from various bush meat (lymph nodes, muscles, lung and heart) collected from death monkey Table 2. Risk factors for infection with SFV

No. people Risk factor p Positive No. tested % Age at contact (years) 0.533 < 45 10 57 17.5 > 45 5 21 23.8 Sex 0.035 Male 15 63 23.8 Female 0 15 0 Circumstance of contact 0.011 Pet 0 20 0 Hunting 15 58 25.9 Type of non-human primate 0.001 Monkey 1 36 2.8 Ape 14 42 33.3 Type of wound 0.316 Scratch 0 4 0 Bite 15 74 20.3 Location 0.860 Upper body 8 40 20.0 Lower body 7 38 18.4 Presence of scars 0.018 No 0 18 0 Yes 15 60 25.0

Univariate analyses were performed by STATA software with χ2 and Fisher exact tests with critical p value of 0.05

DISCUSSION

129 Mon travail de thèse mené sur des populations de PNH et sur des populations humaines du Gabon (Afrique centrale) apporte une pierre à l’édifice pour une meilleure compréhension de ces agents pathogènes, leur distribution, leur dynamique et leur transmission. Il doit inciter à la mise en place d’une veille sanitaire dans cette région d’Afrique malheureusement «riche» en rétrovirus.

Les principaux résultats obtenus lors de mon travail de thèse sont discutés ci-dessous.

Infection des mandrills du Gabon : Existence de deux types distincts de spumavirus simien Lors de notre premier travail, notre équipe a montré que les mandrills vivant en semi-liberté, au centre de primatologie du CIRMF, sont infectés à 83% par le spumavirus simien. Ce résultat est conforme à ceux publiés précédemment dans des études épidémiologiques chez d’autres espèces de PNH vivant en captivité (Blewett et al. , 2000; Broussard et al. , 1997; Hussain et al. , 2003; Calattini et al. , 2006b). Cette prévalence est différemment répartie entre les deux enclos qui hébergent la colonie des mandrills. A savoir 91% dans le premier et 76% dans le deuxième. Même si cette différence n’est pas très grande, ces résultats semblent montrer que les contacts entre PNH sont plus importants et plus réguliers dans l’enclos 1 que dans l’enclos 2.

De même nous avons montré que les mandrills du Gabon, en l’occurrence ceux vivant en semi-liberté, au centre de primatologie du CIRMF, d’une part, et ceux appartenant à la faune sauvage des forêts gabonaises, sont infectés par deux variants différents du spumavirus simien. Cette observation est confortée par la détermination de l’origine des différentes populations de mandrills, en réalisant l’étude du cytochrome b. L’analyse phylogénétique montre une concordance entre la répartition des mandrills sauvages suivant leur origine et leur infection par le spumavirus simien. Ils sont ainsi divisés en deux groupes, l’un situé sur la rive droite du fleuve Ogooué au nord du Gabon et l’autre sur la rive gauche au sud du Gabon. Dans la colonie des mandrills du CDP, l’étude du cytochrome b a montré que les individus qui constituent cette colonie viennent pour certains du nord et pour d’autres du sud du pays. Un résultat intéressant de ce travail est la mise en évidence d’un variant circulant très majoritairement au sein des individus constituant cette colonie. En l’occurrence, il s’agit des mandrills du nord de l’Ogooué. En fait, un seul mandrill (Mnd31CDP) est infecté par le variant du sud. Il a été introduit dans la colonie en 2003 à l’âge de 2 ans.

130 Cette association spécifique entre la répartition géographique des mandrills et l’existence d’infection par des souches virales distinctes avait déjà été décrite dans notre laboratoire pour d’autres rétrovirus. Par exemple, Souquière et collaborateurs ont montré que les mandrills sont infectés par deux types de virus SIV, SIVmnd type 1 et SIVmnd 2 (Souquiere et al., 2001). Le SIVmnd-1 est exclusivement identifié chez des mandrills du centre et du sud Gabon, tandis que le SIVmnd-2 n’est présent que chez les mandrills du nord-est du Gabon et au Cameroun. De même, notre équipe a mis en évidence l’infection des mandrills par deux types de virus STLV (Simian T-Lymphotropic Virus) dont la répartition concorde avec la distribution géographique des mandrills (Makuwa et al., 2004a). La première étude sur l’infection des PNH par les spumavirus simiens en Afrique centrale a été menée en 2004 et était portée sur des animaux du Cameroun et du Gabon (Calattini et al., 2004). Au cours de cette étude, Calattini et collaborateurs ont montré que les mandrills du sud du Cameroun et du nord du Gabon sont infectés par un spumavirus simien. Telfer et son équipe ont proposé une organisation spécifique des populations de mandrills au Gabon, en montrant que les individus sauvages ont deux origines différentes avec 2.6% de divergence dans la séquence du cytochrome b (ADN mitochondrial) (Telfer et al., 2003). La distribution de ces deux haplogroupes mitochondriaux suggère fortement que le fleuve Ogooué sépare deux populations distinctes. L’une est localisée dans une région partant du Sud-Cameroun et s’arrêtant au Nord-Ogooué tandis que l’autre vit au Sud de l’Ogooué. Par analogie avec ces études précédentes publiées sur les mandrills (Makuwa et al. , 2004a; Souquiere et al. , 2001), mais aussi par confirmation des analyses du cytochrome b des mandrills du nord et du sud, notre étude confirme que les mandrills sont infectés aussi par deux types de spumavirus simien. L’infection des mandrills du CDP avec cette différentiation Nord/Sud renseigne sur les origines géographiques diversifiées des mandrills constituant cette colonie. Cela contribue aussi à une meilleure compréhension en terme de transmission de ces virus au sein de cette colonie.

En conclusion sur ce travail mené chez des mandrills en semi-liberté, nos résultats sur l’infection de ces PNH par deux variants de spumavirus simien, associée à leur organisation en deux groupes séparés par le fleuve Ogooué qui traverse le Gabon du sud-est à l’ouest, contribuent à une meilleure connaissance de ces PNH. L’une des particularités des mandrills de cette colonie reste incontestablement leur infection par trois rétrovirus différents, les SIV-mnd (1 et 2), le STLV-1 et le spumavirus simien (Souquiere et al. , 2001; Makuwa et al. , 2004a; Mouinga-Ondeme et al. , 2010). Aussi, certains individus sont

131 co-infectés par deux rétrovirus (SFV/SIV, SIV/STLV), et parfois par les trois. Ce profil des infections n’est pas surprenant au regard des études précédentes sur les co-infections dans les différentes colonies des PNH vivant en semi-liberté au CIRMF (Georges-Courbot et al. , 1996). Il est possible que le passage du spumavirus soit accompagné dans ce cas du passage du SIV, du STLV, ou des deux en même temps (Leendertz et al. , 2010). Pour chacun de ces rétrovirus, les mandrills, que cela soit ceux vivant en semi-liberté dans notre centre ou les individus de la faune sauvage, sont répartis en deux groupes géographiquement distincts. Cette répartition est probablement due à la séparation des mandrills dans leur évolution depuis plus de 800 000 ans (Telfer et al., 2003).

Existence de nouvelles souches de spumavirus simien chez les cercopithèques du Gabon

Dans la très giboyeuse forêt gabonaise, les mandrills cohabitent avec plusieurs autres espèces simiennes. Des infections naturelles sont décrites chez un grand nombre d’entre elles. En particulier, les infections par des SIV sont observées pour une grande variété de PNH africains (Apetrei et al. , 2004; Bibollet-Ruche et al. , 2004). Le cercopithecus solatus, endémique uniquement au Gabon est naturellement infecté par un SIV dénommé SIVsun (Beer et al., 1999). Une étude récemment menée dans notre laboratoire confirme l’infection naturelle des C. solatus par des virus SIV monophylétiques (Liegeois et al. , 2011). L’infection naturelle du C. nictitans du Gabon par un virus STLV-1 est aussi connu (Makuwa et al., 2004b). En revanche, aucune infection rétrovirale de type SIV et STLV-1 n’est à ce jour décrite chez les Cercopithecus cephus du Gabon. Toutefois, une infection naturelle par le SIV a été décrite précédemment chez ce cercopithèque au Cameroun (Courgnaud et al. , 2003; Aghokeng et al. , 2007), montrant ainsi la susceptibilité de cette guenon à cette infection rétrovirale.. Dans notre travail de thèse, nous décrivons, à notre connaissance pour la première fois, l’infection naturelle des C. solatus , C. nictitans et C. cephus par des spumavirus simiens spécifiques de chacune de ces espèces. A la lumière des séquences virales obtenues chez chacune de ces espèces, les analyses indiquent effectivement que chaque souche virale forme un groupe phylogénétique fortement soutenu (valeur de bootstrap 100%) avec trois «clades» solatus , nictitans et cephus clairement distincts. Cette observation suggère que plusieurs espèces de PNH sont naturellement infectées par des spumavirus simiens, et ce de façon spécifique à l’espèce considérée. D’une manière générale, la plupart des études phylogénétiques démontrent une distribution spécifique des spumavirus simiens chez différentes espèces de singes, indiquant une co-évolution depuis des dizaines de millions d’années entre ces rétrovirus et leurs hôtes naturels (Blewett et al. , 2000; Liu et al. , 2008; Broussard et al. , 1997; Switzer et al. , 2005; Thumer et al. , 2007).

132

Les C. nictitans trouvés positifs dans cette étude sont d’origine sauvage, écartant ainsi l’hypothèse d’une contamination ou d’une infection inter-espèces. Le croisement de ces séquences avec deux séquences humaines publiées par Wolfe et collaborateurs (CAM2467) (Wolfe et al., 2004) et Calattini et collaborateurs (AG16) (Calattini et al., 2007) pose l’hypothèse d’une transmission croisée entre espèces. En effet, ces séquences obtenues chez des chasseurs du sud Cameroun sont décrites comme proche de Cercopithecus neglectus et Cercopithecus hamlyn pour la première et provenant d’un cercopithecus sp pour la deuxième. Les analyses phylogénétiques dans notre étude montrent que ces deux séquences sont en réalité plus proches des trois séquences que nous avons obtenues chez C. nictitans . La description de l’infection chez C. nictitans nous permet de suggérer que les deux chasseurs décrits dans l’étude de Wolfe ont été mordus et sont probablement infectés par un spumavirus simien de C. nictitans. Nous pensons donc que ces chasseurs ont été infectés par un primate dont les auteurs ne connaissent pas la vraie nature. L’état des connaissances de l’époque sur le spumavirus simien a donné des séquences qui ont conduit à un arbre un peu approximatif dans l’étude de Wolfe et collaborateurs.

Transmission inter espèces des spumavirus simiens à l’homme

Les spumavirus simiens, comme d’autres rétrovirus, ont la particularité d’être transmis à l’Homme, surtout au sein des populations à risque, comme les chasseurs ou les travailleurs de zoo (Khabbaz et al. , 1994; Schweizer et al. , 1997). Actuellement, une trentaine de personnes infectées par un spumavirus simien ont été décrites dans le monde. Dix-sept d’entre elles ont été infectées par une souche en milieu naturel, particulièrement au cours d’activités de chasse. Les 14 autres cas d’infection sont le résultat d’accidents intervenus dans des zoos (Gessain, 2008; Calattini et al. , 2011). Avec la publication de nos séquences, il existe désormais environ 90 personnes connues dans le monde infectées par un spumavirus de PNH (Jones-Engel et al. , 2008; Gessain, 2008; Calattini et al. , 2011; Betsem et al., sous presse).

Plusieurs études ont permis de découvrir que des personnes travaillant en contact avec les PNH sont infectées par les spumavirus simiens. Ces cas de transmission inter espèces ont été confirmés par la présence de séquences virales de petits singes et de grands singes (gorille et chimpanzé) chez des sujets infectés (Heneine et al., 1998). Le principal mode de transmission dans ce cas est la morsure par les PNH des techniciens animaliers dans les zoos et dans les centres de primatologie.

133 Dans notre travail de thèse, nous avons démontré l’infection par le spumavirus simien chez deux techniciens animaliers de notre centre de primatologie après morsure par un PNH. La première personne a été mordue en 1996 par un chimpanzé puis par un mandrill. Elle est uniquement infectée par un virus de mandrill et constitue la quatrième évidence de l’infection de l’homme par un spumavirus simien issu d’un mandrill, après les observations similaires faites par les équipes de Wolfe, Calattini, et Switzer, respectivement (Wolfe et al. , 2004; Calattini et al. , 2007; Switzer et al. , 2008). En outre, grâce à un tube d’ADN du mandrill Mnd2ACDP, conservé au moment de la morsure, nous avons pu démontrer pour la première fois dans ce centre de primatologie, une similarité nucléotidique quasi-égale à 100% (99,7%) entre cet animal et la personne infectée. Cette similarité constitue une preuve quasi irréfutable du passage du spumavirus simien de ce mandrill à cette personne. C’est la deuxième fois dans le monde que le passage à l’homme d’un spumavirus simien d’une source bien connue est décrit, la première observation du même type ayant eu lieu en 2004 (Switzer et al., 2004) entre un chimpanzé et deux travailleurs d’un zoo. La deuxième personne de notre centre a été mordue en 1985 et est infectée par un virus proche du spumavirus simien des Macaca fascicularis. Ces deux séquences viennent donc s’ajouter aux 14 autres obtenues chez des personnes travaillant dans des zoos ou dans des temples en Asie (Gessain, 2008).

Dans notre deuxième article, 15 nouvelles séquences ont été obtenues chez des personnes ayant été mordues par un PNH lors de la pratique d’activités de chasse (24% de séroprévalence). Une prévalence similaire a été trouvée au Cameroun chez des chasseurs exposés aux grands singes (Calattini et al., 2007). Dans la même étude, Calattini et collaborateurs relèvent une faible prévalence du spumavirus simien chez les chasseurs mordus par un petit singe. C’est également le cas dans d’autres études menées en Asie, dans des régions où cohabitent humains et PNH (Jones-Engel et al. , 2008; Jones-Engel et al. , 2005; Calattini et al. , 2007; Switzer et al. , 2008). Les facteurs de risque intervenant dans la forte prévalence sont le dépeçage et la manipulation du gibier pendant la préparation des repas (Chastel and Charmot, 2004), ainsi que les morsures profondes et blessures occasionnées par des singes et des grands singes lors des parties de chasse en forêt. Il faut souligner que l’Afrique sub saharienne est caractérisée par la richesse de sa faune, chaque animal pouvant héberger un ou plusieurs virus potentiellement pathogènes pour l’homme. L’analyse de l’apparition des zoonoses virales (Ebola, Monkey pox, etc.) a montré, dans un nombre non négligeable de cas, que la chasse, le braconnage et le dépeçage du gibier ou de carcasses

134 trouvées en forêt peut favoriser le franchissement des barrières d’espèces. Au Gabon par exemple, lors des trois épidémies de la fièvre hémorragique due au virus ébola entre décembre 1994 et octobre 1996 (Georges et al. , 1999), les malades ou leurs proches avaient tué puis consommé des chimpanzés dont certains étaient manifestement malades. Sur les 15 séquences décrites dans notre travail, 12 sont du spumavirus de gorilles et 2 de chimpanzés, ce qui laisse apparaître la nature et l’ampleur des agressions que peuvent subir certains chasseurs dans nos forêts. Cela est probablement du à la profondeur de la morsure car les agressions par un gorille ou un chimpanzé sont toujours plus impressionnantes et dramatiques que ne le sont celles occasionnées par un petit singe. Une partie de la forêt gabonaise, plus précisément celle de la partie nord-est du pays, constitue, avec une partie du sud Cameroun et du nord Congo-Brazaville, un important complexe forestier entre trois pays. En effet, ce complexe forestier associe les forêts du Dja (Cameroun), d’Odzala (Congo-Brazzaville) et de Minkébé (Gabon). L’approfondissement des connaissances sur la transmission inter espèces des rétrovirus dans cette région nécessite que des études soient menées dans la partie du Congo, à l’intérieur et aux alentours du parc d’Odzala. Avec 250 000 ha, cette aire protégée héberge plusieurs espèces animales dont les grands singes (11 gorilles au km 2), et est régulièrement fréquentée par les braconniers (www.congo-site.com). Deux de nos séquences de spumavirus de gorilles obtenues chez des humains croisent d’ailleurs avec d’autres séquences du sud Cameroun et préalablement décrites par Calattini et al. (Calattini et al., 2007). Ces données suggèrent une forte circulation des gorilles dans cette zone et avec eux celle des rétrovirus simiens et d’autres virus qui infectent l’homme comme ébola et marburg (Rouquet et al. , 2005; Pourrut et al. , 2009). Certaines personnes dont l’infection par les spumavirus simiens a été décrite dans cette étude, sont de toute évidence infectées depuis plusieurs dizaines d’années, caractéristique d’infections persistantes dues à ces virus. Cependant, aucune pathologie n’a été spécifiquement associée à l’infection humaine par des spumavirus. Cela est le cas dans notre étude comme dans d’autres (Wolfe et al. , 2004; Calattini et al. , 2007; Switzer et al. , 2004). Cette absence de pathologie s’accompagne d’une absence de transmission intrafamiliale. Toutes les études qui ont évalué la transmission du spumavirus simien chez les épouses et les enfants de personnes positives n’ont pas abouti à la mise en évidence d’une transmission intra familiale (Switzer et al. , 2004; Calattini et al. , 2007). Finalement, aucun cas de transmission sexuelle, materno-fœtale ou par transfusion sanguine n’a été documenté.

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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

136 Jusqu’à très récemment, aucune donnée sur l’infection des PNH et des humains par les spumavirus simiens n’était disponible au Gabon.

Notre travail a permis des avancées notables dans ce domaine de recherche en démontrant l’existence de deux types différents de spumavirus chez les mandrills avec une localisation géographique spécifique dépendant étroitement de la barrière naturelle que constitue le fleuve de l’Ogooué.

Nous avons pu aussi identifier des spumavirus chez trois nouvelles espèces de cercopithèques ( C. solatus , nictitans , et C. cephus ).

Enfin, notre travail a identifié de façon formelle des cas de transmission inter-espèces du singe à l’homme, en l’occurence chez deux personnes travaillant dans le CDP du CIRMF et quinze chasseurs. Dans tous les cas, ces sujets ont fait l’objet de morsures par des PNH.

Il n’en demeure pas moins que ces travaux sur les spumavirus circulant au Gabon doivent être capitalisés tant les perspectives et pistes de recherche sont nombreuses.

Concernant l’infection simienne à spumavirus ,

1/ La colonie des mandrills du CIRMF constitue un atout indéniable pour la poursuite d’études virologiques sur les spumavirus simiens. L’accent doit être mis sur la compréhension de la dynamique virale et le type d’immunité impliquée dans l’infection chez le mandrill. L’étude de la transmission et la recherche du réservoir du spumavirus simien doit aussi être approfondie. Ces PNH, naturellement infectés par les spumavirus simiens, constituent un modèle unique au monde pour comprendre tous ces évènements in vivo .

2/ Diverses approches complémentaires doivent être définies pour la recherche de nouvelles infections chez d’autres espèces afin de permettre une description plus complète et une meilleure cartographie des risques encourus par l’homme. L’une de ces approches peut être la réalisation de grandes études de type non invasif, déjà expérimentées pour d’autres rétrovirus (notamment les SIV), et basées sur l’analyse des fécès, d’urines, et d’organes de PNH. Ces études non invasives doivent nous renseigner sur la circulation des spumavirus simiens en forêt et des risques encourus par l’homme (Liu et al., 2008). Une autre possibilité, émise par Gessain et collaborateurs, est représentée par un élargissement des zones géographiques d’étude des spumavirus simiens sur le continent Africain.

137 Après le Cameroun, et maintenant le Gabon, d’autres pays d’Afrique centrale, comme la Guinée Equatoriale, le Congo Brazzaville, la République Centrafricaine, la République Démocratique du Congo où les contacts entre humains et primates non humains sont très étroits (Gessain, 2008) doivent être impliqués dans ce type d’études. Ces études peuvent constituer une base pour la mise en œuvre de mesures de sécurité rigoureuses afin d’éviter la transmission inter espèces des virus de PNH à l’homme.

Concernant l’infection humaine à spumavirus ,

L’intérêt de la communauté scientifique reste limité pour l’infection humaine. La raison principale pour ce manque d’intérêt est due à l’absence de pathologie reconnue. A ce jour, l’enjeu médical reste donc très modeste. Le faible nombre de personnes infectées connues à ce jour et l’absence de séroprévalence dans les populations humaines constituent aussi des freins au développement de cette thématique de recherche.

De plus, la plupart des personnes trouvées positives ont souvent limité leur collaboration, refusant que leurs proches soient prélevés. Ceci est dû à l’incompréhension des informations qui leur sont données sur l’infection par ce virus. Chaque prononciation du mot « virus », dans leur entendement, fait référence au VIH et donc la mort, ce qui aboutit bien souvent à un refus de participer aux enquêtes.

Pourtant, il est très important d’approfondir la recherche sur les populations humaines qui cohabitent avec des singes et qui sont exposées aux risques de transmission de zoonoses, dont les spumavirus simiens font partie. L’origine simienne des VIH doit être une source de motivation pour continuer ces recherches. La possibilité d’une transmission inter humaine ne peut pas être définitivement écartée en tant que préoccupation de santé publique. Parmi les perspectives de recherche et de prévention, on peut citer les items suivants :

1/ Tester un maximum de personnes est indispensable car on ne peut pas éliminer l’existence de taux de prévalence plus élevés dans le futur, tout particulièrement dans des populations en proche contact avec de grands primates non humains.

2/ Confirmer l’absence de transmission intrafamiliale est nécessaire. Connaître le risque lié à la transfusion sanguine est également indispensable. Ce risque a d’ailleurs été démontré chez le macaque (Khan and Kumar, 2006; Brooks et al. , 2007) et interpelle les autorités en charge de la santé humaine.

138 3/ Réaliser le suivi au long cours (sur des mois, voire années) de personnes juste après qu’elles aient été mordues ou griffées par un PNH. Cette approche permettrait de comprendre ce qui se passe chez l’homme après la possible transmission du spumavirus simien, notamment le temps de séroconversion, l’existence de signes cliniques lors de la primo-infection, la nature et l’intensité de la réplication virale et le type d’immunité impliquée lors de l’infection. Au cours de ce travail, nous avons suivi durant 6 mois deux personnes juste après qu’elles aient été mordues par des PNH. Les résultats n’ont malheureusement pas montré une infection par un spumavirus simien. Ce genre d’études doit pourtant être développé, surtout en régions forestières où les morsures des chasseurs par les grands singes sont courantes. Le suivi régulier de sujets infectés et travaillant dans des zoos ou des centres de primatologie peut aussi nous aider à mieux comprendre le devenir des personnes infectées par les spumavirus simiens.

4/ Etudier le risque lié à des co-infections spumavirus/VIH Sur la centaine de personnes dans le monde, chez lesquelles une infection à spumavirus simien a pu être documentée, une trentaine vit en Afrique centrale, région d’émergence et de forte endémie d’autres rétrovirus comme les SIV et les STLV et les VIH. Une des craintes est le risque lié au danger potentiel de co-infection de patients par le spumavirus simien et par le VIH. La description de deux cas de co-infection spumavirus/VIH-1 au Cameroun (Switzer et al., 2008) a déjà été faite. Une surveillance du risque lié à la survenue de ce type de co-infections doit être vulgarisée car une telle association de rétrovirus peut être à l’origine de pathologies aux conséquences imprévisibles. On ne peut pas non plus exclure définitivement des phénomènes de recombinaison entre ces deux types de virus. Les facteurs impliqués dans la conversion d’un virus non pathogène, comme le spumavirus simien, en virus pathogène après la transmission inter espèces sont complexes et très peu connus. Le passage d’un individu à un autre peut être à l’origine de mutations virales qui sont une étape importante en terme de pathogénicité.

5/ Enfin, mettre en place des mesures strictes de biosécurité

Les accidents (de type morsure, griffure, etc.) intervenant dans les centres de primatologie peuvent être maîtrisés par la mise en place de mesures rigoureuses de biosécurité.

Ces mesures sont beaucoup plus difficiles à mettre en place parmi les populations humaines vivant en zones rurales. En effet, celles-ci mettent régulièrement leur vie en danger en fréquentant les profondeurs de la forêt équatoriale et en s’exposant aux grands PNH comme les gorilles. Les

139 villageois connaissent ces risques mais la pratique de la chasse est leur seule source de revenus. Abandonner cette activité est pour eux synonyme de mort programmée.

Il est toutefois nécessaire que des mesures de biosécurité soient vulgarisées au niveau des populations rurales afin d’éviter la transmission d’agents infectieux de PNH à l’homme qui favorise l’émergence de nouvelles pathologies et peut-être de nouvelles épidémies.

140

ANNEXES

141 Date de N° Village Province Nom Prénom Age Lieu de naissance Sexe Nationalité Naissance

Depuis cb Profession/ Avez-vous Statut Age dernier circon scarifi si oui, temps y Conjoints Enfants occupation Tatouage été Mordue marital enfant cision cation année vivez-vous principale par un singe

143 Avez-vs gardé transfu Avez-vous si oui, Etes-vous chasse chasse Si oui, Prélèvement No de Photo Singe? des animaux sions été hospitalisé nb fois chasseur proximité profonde lesquels? Feces sauvages?

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