Dinámica De Crecimiento De Toxoplasma Gondii En Astrocitos Murinos Y Su Efecto En La Supervivencia Y La Apoptosis De La Célula Infectada”

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA

ESCUELA DE SALUD PÚBLICA DE MÉXICO

“DINÁMICA DE CRECIMIENTO DE TOXOPLASMA GONDII EN ASTROCITOS MURINOS Y SU EFECTO EN LA SUPERVIVENCIA Y LA APOPTOSIS DE LA CÉLULA INFECTADA”

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORA EN CIENCIAS DE LA SALUD PÚBLICA CON ÁREA DE CONCENTRACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS

PRESENTA

M. EN C. CARLA OLBIA CONTRERAS OCHOA

Cuernavaca, Morelos México Noviembre, 2011.

Instituto Nacional de Salud Pública Escuela de Salud Pública de México

Instituto Nacional de Pediatría

“Dinámica de crecimiento de Toxoplasma gondii en astrocitos murinos y su efecto en la supervivencia y la apoptosis de la célula infectada”

TESIS

Que para obtener el grado de Doctora en Ciencias de la Salud Pública con Área de concentración en Enfermedades Infecciosas

Presenta

M. en C. Carla Olbia Contreras Ochoa

Colaboradores: Dra. Ma. Dolores Correa Beltrán. Instituto Nacional de Pediatría (Directora de tesis)

Dr. Jaime Belkind Gerson. Centro de Investigación en Salud Poblacional (CISP)-INSP

M. en C. Alfredo Lagunas Martínez. Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas (CISEI)-INSP

Cuernavaca, Morelos México Noviembre, 2011.

Esta tesis se desarrolló bajo la dirección de la Dra. Ma. Dolores Correa Beltrán, en el Laboratorio de Inmunología Experimental del Instituto Nacional de Pediatría (INP) y en el laboratorio de Medicina Regenerativa, del Centro de Investigación en Salud Poblacional (CISP) del Instituto Nacional de Salud Pública (INSP). En conjunto con el Dr. Jaime Belkind Gerson del CISP-INSP y del M. en C. Alfredo Lagunas Martínez, del Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas (CISEI)-INSP.

El Jurado de examen estuvo integrado por los siguientes Investigadores:

Presidente: Dr. Ricardo Mondragón Flores. CINVESTAV-IPN Secretario: Dra. Ma. Dolores Correa Beltrán. INP Primer Sinodal: Dra. María del Carmen Rodríguez Gutiérrez. CISEI-INSP Segundo Sinodal: Dra. María de Lourdes Gutiérrez Xicoténcatl. CISEI-INSP Tercer Sinodal: Dr. Jesús Santa Olalla Tapia. UAEM

Y relegado a este estrecho reducto, sigo arrastrando mis cadenas...... pero ni siquiera esto puede encadenar mi sentir, gracias al cual tengo todos los días pensamientos libres y dignos de un hombre... y ya que la muerte se aproxima y mis días declinan... yo la espero con valor, porque los límites de mi encierro me acostumbraron a los límites de mi tumba... pero ¡no enterrarán al mismo tiempo mi cuerpo y mi nombre!"

Abjuro... los susodichos errores y herejías..... no diré nunca más cosas por las cuales se pueda tener de mí semejante sospecha……. Y sin embargo, se mueve. Eppur si muove

Galileo Galilei (Pisa, 1564 - 1642)

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Agradecimientos

A Bernardo, por tu paciencia y enorme apoyo.

Muy especialmente a las tres personas que hicieron posible la realización de este trabajo: 1. Dr. Jaime Belkind Gerson. Entonces Jefe del Laboratorio de Medicina Regenerativa, a quien le debo el gusto por las “stem cells”. Por darme la oportunidad de incorporarme a su laboratorio en agosto del 2004, además por brindarme su apoyo durante el cambio de tesis, y muy especialmente por todo el soporte económico para la realización de este proyecto.

2. Dra. Dolores Correa Beltrán. Quien me he ha llevado de la mano por el mundo de la toxoplasmosis. Por aceptarme como alumna y dirigir la tesis en una situación extraordinaria; al decir “remaremos juntas” me cambio la vida. Agradezco que confiara en mí y en que este “loco proyecto” era posible. Además, valoro infinitamente el tiempo que me ha brindado, sus enseñanzas, paciencia y dedicación, así como todo el apoyo moral, logístico y económico durante este proceso.

3. M. en C. Alfredo Lagunas Martinez. Quien me introdujo en el campo de la apoptosis. Por tu dedicación y paciencia, no solo al enseñarme las técnicas básicas, sino por la asesoría y guía en el trabajo diario, en la planeación de experimentos y la solución de problemas, por estar ahi para responder todas mis dudas, pero sobre todo por tu amistad y apoyo incondicional.

Dr. Alfonso Carreón. Laboratorio de Medicina Regenerativa. CISP-INSP. Por brindarme las facilidades logísticas para concretar este trabajo y por enseñarme a cultivar células de sistema nervioso. Así como a mis compañeras de laboratorio por su apoyo.

Al Tecnico Héctor Luna y al Biológo José Luis Hernández, del Laboratorio de Inmunología Experimental-INP, por proporcionarme los parásitos para los ensayos y por enseñarme a “lidiar con los taquizoitos” en cultivo. Así como a mis compañeros de laboratorio del INP, que me hicieron sentir en casa.

Dra. Adriana Ramírez y Dr. Vicente Madrid. Por el apoyo logístico y administrativo que recibi de su parte durante el cambio de tesis y a lo largo de todo el camino hacia el doctorado.

Dr. German Aguilar. Por tomarse el tiempo de representarme ante el Colegio de Profesores de CISEI, además por sus consejos y apoyo.

MVZ. Alberto Arcebez. Unidad de Bioterio CISEI-INSP, por el apoyo logístico para la obtención de los animales de laboratorio.

A los miembros del Jurado Revisor por sus comentarios y sugerencias para mejorar esta tesis.

Indice general Página RESUMEN 1 1. INTRODUCCIÓN 2 1.1. Biología de Toxoplasma gondii 2 1.2. Toxoplasmosis 4 1.2.1. Toxoplasmosis adquirida 4 1.2.2. Toxoplasmosis congénita 5 1.3. Respuesta inmune contra Toxoplasma 6 1.4. Toxoplasmosis en el Sistema Nervioso Central 8 1.4.1 Las células del Sistema Nervioso Central y sus funciones 9 1.5. Apoptosis 10 2. ANTECEDENTES DIRECTOS 14 2.1. Proceso de invasión de Toxoplasma a la célula huésped 14 2.2. Formación de la vacuola parasitófora 15 2.3. La invasión de Toxoplasma en células de Sistema Nervioso Central 16 2.3.1 Invasión de Toxoplasma en astrocitos 17 2.3.2. Papel de los astrocitos en el control de la infección con Toxoplasma 18 2.4 Efecto de la infección con Toxoplasma en la apoptosis de la célula huésped 21 2.4.1 Efecto de la infección con Toxoplasma sobre puntos específicos de la apoptosis 23 2.4.1.1. Bcl-2 23 2.4.1.2. Survivina 24 2.4.1.3. Iκβα 24 2.4.1.5. Caspasa 3 27 2.4.2. Toxoplasma y apoptosis en células de Sistema Nervioso Central 27 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 28 4. HIPÓTESIS 29 5. OBJETIVOS 29 5.1. Objetivo general 29 5.2 Objetivos específicos 29 6. METODOLOGÍA 30 6.1. Modelo de infección de astrocitos in vitro 30 6.1.1. Cultivo primario de astrocitos de ratón neonato 30 6.1.2. Identificación de los fenotipos celulares presentes en el cultivo primario 31 6.1.4. Evaluación de la invasión de Toxoplasma en astrocitos murinos 32 6.1.5. Replicación de Toxoplasma en astrocitos 32 6.1.6. Evaluación del efecto de la invasión y replicación de Toxoplasma en astrocitos por RT-PCR 33 6.2. Efecto de la infección con Toxoplasma en la apoptosis de astrocitos murinos 34

6.2.1. Estandarización de un modelo para evaluar la apoptosis en astrocitos 34 6.2.2. Expresión de mRNA de genes involucrados en la apoptosis en respuesta a la infección con Toxoplasma 35 6.2.3. Participación de las proteínas PARP-1 y Caspasa 3 involucradas en la apoptosis durante la infección con Toxoplasma 36 6.3. Análisis de resultados 38 7. RESULTADOS 39 7.1. Desarrollo de un modelo de invasión y replicación de Toxoplasma en astrocitos murinos 39 7.1.1. Invasión de taquizoitos en astrocitos a tiempos cortos post-infección 39 7.1.2 Replicación de Toxoplasma en astrocitos murinos 39 7.1.2.1 Parásitos extracelulares 39 7.1.2.2. Parásitos intracelulares 41 7.2. Efecto de la infección con Toxoplasma en la inducción o prevención de la apoptosis en la célula huésped 44 7.2.1 Estandarización de un modelo para evaluar la apoptosis en astrocitos 44 7.2.2. Expresión de genes involucrados en apoptosis en respuesta a la infección 44 7.3 Participación de proteínas involucradas en apoptosis durante la infección con Toxoplasma 46 7.3.1 PARP-1 46 7.3.2. Caspasa 3 48 7.4. Cambios en la morfología nuclear en respuesta a la infección con Toxoplama 49 8. DISCUSIÓN 51 9. CONCLUSIONES 63 10. PERSPECTIVAS 64 11. REFERENCIAS 65 12. APÉNDICE 1. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES. 76 13. APÉNDICE 2. ARTÍCULOS GENERADOS DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN. 79

Indice de figuras y cuadros Página Figura 1. Ciclo de vida de Toxoplasma gondii. 3

Figura 2. Esquema general del proceso de apoptosis en células de mamífero. 13

Figura 3. Proceso de invasión del taquizoito de Toxoplasma gondii a la célula 16 huésped.

Figura 4. Invasión de taquizoitos de T. gondii en astrocitos murinos durante 40 las primeras 4 h post-infección.

Figura 5. Cinética de replicación de T. gondii en astrocitos murinos. 42

Figura 6. Cinética de replicación de T. gondii y lisis de la célula infectada. 43

Figura 7. Cinética de expresión de genes anti-apoptóticos y pro-apoptóticos 45 en respuesta a la infección con Toxoplasma en astrocitos.

Figura 8. Cinética de expresión de la proteína PARP-1 durante la infección 47 con Toxoplasma en astrocitos.

Figura 9. Cinética de expresión la proteína Caspasa 3 durante la infección 48 con Toxoplasma en astrocitos.

Figura 10. Prevención de la fragmentación nuclear en los astrocitos infectados 50 con Toxoplasma.

Cuadro 1. Evidencia de la invasión y replicación de Toxoplasma gondii en 19 astrocitos in vitro.

Cuadro 2. Secuencia y condiciones de amplificación de PCR de los genes 77 utilizados para evaluar la infección y la apoptosis en los astrocitos infectados con Toxoplasma.

Cuadro 3. Reactivos empleados en la síntesis de cDNA y reacción de PCR. 78

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Abreviaturas

AIF Apoptosis-inducing factor AMA-1 Apical membrane antigen-1 Apaf-1 Apoptosis activating factor ATP Adenosin trifosfato Bcl-2 B-cell lymphoma 2 BIR Baculovirus IAP repeat CARD Caspase- recruiment domain cIAP-1 Cellular inhibition of apoptosis 1 DED Death effector domain DIABLO Direct IAP binding protein with low pI DEPC Dietil pirocarbonato DISC Death-inducing signalling complex DNA Deoxyribonucleic acid FADD Fas-associated death domain GABA Gamma-Aminobutyric acid GFAP Glial fibirillaric acidic protein G3PDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase h Horas HBSS Hank's balanced salt solution ICAM-1 Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 IFNγ Interferon-gamma IgA Inmunoglobulina A IgG Inmunoglobulina G IgM Inmunoglobulina M Ikbα Inhibitor of nuclear factor- kappa-light-enhancer of activated B cells, alpha Ikb IκB kinase IP-10 Inducible protein-10 MCP-1 monocyte chemotactic protein-1 MHC Major Histocompatibility Complex MIC Microneme min Minutos NFκβ Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK Natural killer NO Nitric oxide PAMPs Pathogen-associated molecular patterns PARP-1 Poli-ADP ribose polimerase PBS Phosphate buffered saline

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RIPA Radioimmunoprecipitation assay buffer RNA Ribonucleic acid ROP Rhoptry RON Roptry neck proteins SAG Surface antigens Smac Second mitochondria-derived activator of caspases SNC Sistema nervioso central TAE Tris-acetato-EDTA TBS Tris-buffered saline TgIKK Toxoplasma gondii IκB kinase Th1 T helper 1 TLRs Toll-like receptors TNFα Tumor necrosis factor-alfa TNFR Tumor necrosis factor-alfa receptor TRADD TNFR1 associated death domain protein VP Vacuola parasitófora XIAP X-linked inhibitor of apoptosis protein

Resumen Existe controversia sobre el papel de Toxoplasma gondii en la apoptosis de la célula huésped y esto posiblemente se deba a las variaciones en los modelos usados. En el Sistema Nervioso Central (SNC) la información sobre el efecto del parásito sobre la apoptosis es escasa y no concluyente. La evidencia indica que los astrocitos se infectan con más frecuencia, soportan la formación de quistes y además participan en la eliminación del parásito del cerebro; sin embargo, hay información contradictoria en relación a su susceptibilidad a la infección. Objetivo. Establecer un modelo de infección de astrocitos murinos con T. gondii in vitro, evaluar el efecto de la invasión y replicación del parásito en estas células, y determinar el efecto de la infección sobre la apoptosis de la célula infectada. Metodología. Se establecieron las condiciones óptimas de infección de astrocitos de ratón neonato con taquizoitos de T. gondii cepa RH, se evaluó la dinámica de invasión y replicación del parásito mediante tinción con Wright, así como la cuantificación de parásitos extracelulares por microscopia y la expresión de los genes B1 (Toxoplasma) y GFAP (específico de astrocitos). Además se estandarizó un modelo de apoptosis en astrocitos con Cisplatino (fármaco anti-neoplásico), y se evaluó la expresión de los genes anti-apoptóticos (Bcl-2 y Survivina) y pro-apoptótico (IKB ) mediante RT-PCR, además de la proteína PARP-1 (blanco de Caspasa 3) y la proteína Caspasa 3 (efectora) por inmunoblot. Así mismo, se analizó la fragmentación de núcleos mediante tinción con DAPI y microscopia de fluorescencia. Resultados. En el modelo de infección desarrollado se encontró que T. gondii invade y se replica activamente en los astrocitos (91% de infección a 4 h), con 1 a 7 parásitos por célula. La velocidad de replicación del parásito se estimó en 4 h, con 2 vacuolas parasitóforas por célula en promedio y un rango de 1 a 30 taquizoitos a las 24 h. El parásito provocó la lisis de la célula infectada desde las 24 h hasta las 96 h; lo que correlaciona con el incremento en la expresión del gen parasitario B1 y la disminución en la expresión del gen GFAP específico de astrocitos. La infección con los taquizoitos de T. gondii disminuyó parcialmente la expresión de los genes Bcl-2 y Survivina entre las 4 y 8 h post-infección, recuperándose a las 24 h, sin cambios en la expresión del gen IkB . La infección con el parásito no indujo la fragmentación de PARP-1 entre 0.5 y 24 h, más bien la previno parcialmente cuando fue inducida por el Cisplatino. Lo mismo ocurrió con respecto a la fragmentación nuclear de la célula huésped entre las 12 a 48 h. No se encontraron cambios en generación de la forma activa de Caspasa 3. Conclusiones. Se estableció un modelo de infección de astrocitos de ratón neonato infectados con T. gondii in vitro y se logró medir la invasión y velocidad de replicación del parásito, la cual culmina con la lisis de la célula infectada entre las 24 y 96 h. La infección con Toxoplasma no indujo la apoptosis en la célula huésped, más bien tuvo un papel protector contra un estímulo pro-apoptótico. El estudio sobre la invasión y replicación de los taquizoitos de T. gondii y su efecto en la apoptosis de astrocitos en ratones neonatos como modelo de infección congénita, aporta información sobre los fenómenos que provocan la generación de las patologías severas y más conocidas de la toxoplasmosis en el SNC.

1. Introducción 1.1. Biología de Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii es un protozoario intracelular obligado, que pertenece al Phylum Apicomplexa por la estructura característica de su complejo apical. El ciclo de vida del parásito inicia cuando un felino (hospedero definitivo), se infecta por el consumo de quistes tisulares contenidos en la carne de otros animales (Figura 1). En el intestino delgado se lleva a cabo la gametogénesis, la fecundación y la generación del ooblasto, que da origen al ooquiste inmaduro, liberado al ambiente con las heces. En condiciones óptimas de temperatura y humedad, éste esporula y puede permanecer viable hasta 18 meses en tierra húmeda o sobrevivir a temperaturas bajas y deshidratación por periodos cortos (Jones et al, 2003). Tanto en los hospederos intermediarios como en los definitivos se lleva a cabo la reproducción asexual del parásito; los intermediarios pueden infectarse por consumo de ooquistes esporulados o quistes tisulares presentes en los tejidos de otros hospederos, dependiendo de sus hábitos alimenticios. Una vez ingeridos, se liberan los esporozoitos o los bradizoitos, respectivamente, que invaden el epitelio intestinal, donde se convierten en taquizoitos (formas de replicación rápida) que se diseminan a diversos órganos y tejidos, incluyendo músculo, ojo y cerebro. Los taquizoitos se multiplican en el interior de las células; posteriormente las lisan e invaden células adyacentes nuevamente. Algunos taquizoitos se convierten en bradizoitos (formas de replicación lenta), que forman quistes en varios órganos y tejidos como músculo, hígado, ojo y cerebro (Petersen, 2007), ocasionando la fase crónica de la enfermedad. Si una hembra se infecta por primera vez durante la gestación, puede ocurrir la transmisión vertical del taquizoito al embrión o feto, ocasionando la toxoplasmosis congénita. En Europa, Estados Unidos y Canadá se hicieron los primeros aislamientos de T. gondii y originalmente estos se clasificaron en base a patrones de fragmentos de restricción o RFLP´s (Restriction Fragment Length Polymorphism) para definir genotipos y posteriormente se relacionaron con la virulencia y el tipo de hospederos infectados, estableciéndose tres linajes principales: a) Tipo I: con virulencia y capacidad de replicación altas, escasa o nula formación de quistes; estas cepas se asocian frecuentemente con infección sintomática en seres humanos; ejemplos de éstas son la

Figura 1. Ciclo de vida de Toxoplasma gondii. Los ooquistes liberados por el felino infectado son las formas infectivas que se dispersan en el ambiente, pero la infección también ocurre por comer carne cruda con quistes. Tomado de Correa et al, 2006.

RH, BK, CT-1 y Elg. b) Tipo II: virulencia y capacidad de replicación media, la infección progresa a la fase crónica con formación de quistes. Son las más prevalentes en infecciones en humanos inmunocompetentes, así como en la infección congénita y en pacientes inmunodeficientes, aunque también infectan animales domésticos de compañía y de granja; ejemplo de estas cepas son la ME49, la Prugniaud, la 76K, la C56 y la Beverly. c) Tipo III: virulencia variable, se asocian con la infección en animales domésticos y silvestres, aunque también pueden infectar humanos, ejemplo de éstas es la M7741 (Sibley et al, 2009; Howe y Sibley, 1995). Sin embargo, más recientemente, al analizar genéticamente estos tres grupos de cepas y otros considerados como “exóticos” procedentes de Norteamérica, Sudamérica y Europa mediante secuencias de intrones y a su capacidad de virulencia en ratones, se encontró que la estructura poblacional de T. gondii tiende a ser altamente clonal y se ha dividido en doce

haplogrupos no relacionados directamente con la virulencia del parásito (Khan et al, 2007, 2011).

1.2. Toxoplasmosis La toxoplasmosis es una enfermedad producida por el parásito Toxoplasma gondii que infecta a vertebrados homeotermos, incluyendo al ser humano. Presenta distribución mundial, pero es especialmente prevalente en zonas cálidas y húmedas (Petersen, 2007). En México, la toxoplasmosis también es más frecuente en zonas húmedas y cálidas (principalmente en las costas) y en personas de nivel socioeconómico bajo (Velasco-Castrejón et al, 1992; Caballero-Ortega et al, sometido). Toxoplasma gondii se trasmite al ser humano mediante la ingestión de carne mal cocida contaminada con quistes tisulares, o bien de agua, frutas o verduras contaminadas con ooquistes, así como por contacto directo con las heces de los gatos; también se transmite de madre a hijo durante el embarazo, lo que ocasiona la infección congénita (Jones et al, 2006).

1.2.1. Toxoplasmosis adquirida La infección en adultos, llamada “adquirida”, se presenta en dos fases: la aguda y la crónica, en ambas la mayoría de los individuos infectados son asintomáticos (Correa et al, 2006; Montoya y Liesenfeld, 2004); esto se debe en gran medida a la respuesta inmune del huésped. La infección aguda puede durar unos días o varios meses, dando paso a la infección crónica que es de por vida y generalmente pasa inadvertida, a menos que un evento induzca inmunosupresión, como algunas infecciones o medicamentos (Carruthers y Suzuki, 2007). La infección con T. gondii se considera un problema de salud pública importante en pacientes con VIH o sometidos a un tratamiento inmunosupresor. Las manifestaciones más comunes en estos casos involucran al SNC, ojo, sistema linfático, bazo e hígado. Hasta el momento no existe un tratamiento que erradique la infección con T. gondii, debido a que el parásito se enquista rápidamente, quedando fuera del alcance de los medicamentos. Durante la fase aguda se utilizan fármacos que interfieren con la síntesis de DNA (Deoxyribonucleic acid) y por ende inhiben la replicación de los

taquizoitos; los más utilizados son la sulfadiazina y la pirimetamina, siendo esta combinación de primera elección por su mayor eficacia (Montoya y Remington, 2008).

1.2.2. Toxoplasmosis congénita La transmisión vertical ocurre cuando una mujer se infecta durante el embarazo, ya que T. gondii atraviesa la placenta. Durante las primeras semanas de gestación la transmisión es poco frecuente, pero si ocurre, causa daño severo en el embrión provocando aborto espontáneo o muerte fetal (Dunn et al, 1999). A medida que progresa el embarazo, el riesgo de transmisión se incrementa de 14% en el primer trimestre, a 29% en el segundo, hasta un 59-80% en el tercero. En la mayoría de los casos de infección del segundo trimestre el feto infectado nace vivo pero con serias alteraciones del SNC tales como coriorretinitis, epilepsia, retraso mental y problemas de lento aprendizaje, hidrocefalia, microcefalia, calcificación intracraneal, así como ceguera, y en menor frecuencia sordera (Mazzola et al, 2007; Jones et al, 2006). La mayoría de los niños infectados durante el tercer trimestre nacen sin signos evidentes, pero el 80% los desarrollan posteriormente, y un 50% de ellos desarrollan secuelas neurológicas y oculares (Mazzola et al 2007; Petersen, 2007). Para reducir la transmisión del parásito de la madre al feto se usa la espiramicina o la clindamicina. Cuando se demuestra la infección fetal, el tratamiento se cambia a una combinación de pirimetamina y sulfadiacina; y debido a su alta toxicidad, debe administrarse ácido folínico. Por lo anterior, el desarrollo de nuevos fármacos o estrategias terapéuticas contra T. gondii es de las áreas investigación y desarrollo más urgentes (Montoya y Remington, 2008; Petersen, 2007). A nivel mundial la toxoplasmosis congénita es un problema de salud pública importante. Se ha reportado una prevalencia global de 7 a 85% en mujeres embarazadas, mientras que en aquellas con embarazo de alto riesgo e historial de abortos consecutivos la prevalencia oscila entre 17.5 y 52.3% (Ambroise-Thomas y Petersen, 2000). En México hay poca información sobre la epidemiología de la infección perinatal y de la congénita, pero se sugiere una frecuencia alta. En el Estado de Yucatán se reportó una prevalencia del 47% en mujeres con antecedentes de abortos espontáneos (Zavala-Velásquez et al, 1989). Así mismo, en Guadalajara se detectaron anticuerpos IgM e IgG contra T. gondii en 20.7% y 34.9% de mujeres con embarazo

normal, mientras que en un subgrupo de mujeres con historia de abortos múltiples, la frecuencia fue de 33.3% y 44.9% para los mismos marcadores (Galván-Ramírez et al, 1995). En Jojutla Morelos, el 85% de las mujeres embarazadas presentaron anticuerpos de clase IgG y el 11% de clase IgM, demostrando que es una zona de alto riesgo. Posteriormente se encontró que algunos niños de esta población presentan infección “adquirida” (no congénita) a los dos años, sugiriendo que ocurre una diseminación ambiental del parásito (Cañedo-Solares et al, sometido). En contraste con los sitios anteriores, en el Estado de Durango se encontró una prevalencia de anticuerpos IgG contra T. gondii de 6.1% en embarazadas y no se detectó infección aguda (Alvarado- Esquivel et al, 2006). Los estudios directos en recién nacidos son aún más escasos. En el 2005, se reportó una frecuencia de dos casos por cada 1,000 recién nacidos vivos de la Ciudad de México, ambos subclínicos al nacimiento, si bien uno de ellos nació prematuro (Vela-Amieva et al, 2005).

1.3. Respuesta inmune contra Toxoplasma En el huésped la infección con el parásito provoca la activación de la respuesta inmune innata y adquirida, la activación eficiente de esta respuesta conlleva a que la mayoría de los individuos infectados (80-90%) no presenten signos o síntomas de la enfermedad. La respuesta innata es mediada por neutrófilos, macrófagos/monocitos, células dendríticas y células NK (natural killer), que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, Pathogen-associated molecular patterns), a través de receptores particulares, entre ellos los TLRs (Toll-like receptors) que inducen la activación de neutrófilos y la expresión de citocinas tipo Th1 (IL-12, IFN-γ y TNF-α) que inhiben la replicación del parásito, ya que estimulan la fagocitosis de la célula infectada por parte de los macrófagos y neutrófilos. A su vez, estas citocinas Th1 (T helper 1) estimulan la capacidad citotóxica de los linfocitos CD8+ mediada por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC, Major Histocompatibility Complex) y de las NK mediada por anticuerpos. A sí mismo, los linfocitos CD4+ también tienen funciones citotóxicas, y junto con el TNFα (Tumor necrosis factor-alfa) producido por los macrófagos activados, inducen la apoptosis de las células infectadas (revisado en Ortíz- Alegria et al, 2010; Correa et al, 2007; Lang et al, 2007). A medida que la infección progresa, se producen citocinas tipo Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) que regulan la fuerte

respuesta Th1 pro-inflamatoria, la cual podría matar al huésped. Lo anterior indica que la respuesta inmune contra T. gondii inicia con un perfil Th1 pero debe ser regulada por citocinas tipo Th2 (Correa et al, 2007; Lang et al, 2007). Del mismo modo, la respuesta inmune humoral es fundamental para controlar la infección. Los anticuerpos IgM (Inmunoglobulina M) aparecen de 3 a 10 días después de la infección y persisten hasta la fase crónica; estos anticuerpos median la destrucción del parásito por medio de la fijación de complemento, mientras que los anticuerpos IgA (Inmunoglobulina A) tienen un papel protector neutralizando la invasión del parásito a la célula huésped, principalmente a nivel de mucosas, y se transfieren de manera pasiva durante la lactancia. Los anticuerpos IgG (Inmunoglobulina G) de todas las subclases se han encontrado en el suero humano, si bien predomina el subtipo IgG1, que tiene un papel protector durante la reinfección, pues al igual que IgG3 son estimulados por el IFNγ (Interferon-gamma) y se unen a los macrófagos y neutrófilos a través de sus receptores FcR para fagocitar a los parásitos o matarlos por citotoxicidad directa, respectivamente (revisado en Correa et al, 2007). La activación de la respuesta inmune es en gran parte responsable de la conversión del parásito en etapa de taquizoito (forma replicativa rápida) a bradizoito (forma replicativa lenta) el cual se enquista, permaneciendo por periodos prolongados sin provocar la destrucción del tejido. Se ha sugerido que los parásitos mantienen activa la respuesta inmune a lo largo de toda la vida del individuo infectado, ya que pueden desenquistarse y emerger nuevos taquizoitos re-estimulando el sistema inmune (Denkers y Gazzinelli, 1998). Esta idea se refuerza por el hecho de que la toxoplasmosis grave o fatal que se presenta en pacientes inmunodeficientes se debe a la reactivación de la infección crónica (Montoya y Liesenfeld, 2004). Finalmente, es importante tomar en cuenta que la respuesta inmune contra el parásito se presenta en varios tejidos del huésped al mismo tiempo; además las condiciones generales del huésped infectado como la edad, el género, el perfil genético y las co-infecciones influyen en esta respuesta (Roberts et al, 2001).

1.4. Toxoplasmosis en el Sistema Nervioso Central Como se mencionó T. gondii es un agente que afecta principalmente al SNC de los pacientes inmunosuprimidos por otras infecciones o bien porque han recibido tratamiento para prevenir el rechazo de trasplantes, o como coadyuvantes en el tratamiento de cáncer (Grosu et al, 2007; Galván-Ramírez et al, 2006; Jones et al, 2006). En el caso de los pacientes inmunosuprimidos la toxoplasmosis generalmente ocurre como resultado de una reactivación del estado crónico al estado agudo, con proliferación y diseminación de taquizoitos, aunque también se puede presentar una primo-infección; en ambas circunstancias se produce encefalitis severa y necrosante, con dolor de cabeza, fiebre, ataques y en casos severos, coma, siendo frecuentemente fatal (Jones et al, 2006). En los pacientes con VIH-SIDA, la infección con T. gondii es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad, ya que además del daño en el SNC, también puede inducir miocarditis fulminante o neumonitis (Eza y Lucas, 2006). Existe evidencia que indica que T. gondii tiene la capacidad de modificar la conducta del huésped infectado. En estudios con roedores (ratones y ratas) se ha encontrado que el parásito altera la percepción del predador, al parecer modificando la aversión natural a los felinos y convirtiéndola en atracción o ausencia del temor al predador, siendo este efecto específico al aroma de los gatos, lo que estaría confiriendo ventaja al parásito para completar el ciclo sexual (Vyas et al, 2007; Berdoy et al, 2000,1995). Así mismo, se ha encontrado que las ratas silvestres y los híbridos silvestre-laboratorio infectados con el parásito muestran un incremento en la actividad física y disminución en el temor a lo desconocido, parámetros que facilitan la transmisión del parásito al huésped definitivo; mientras que otros comportamientos que no tienen impacto en la transmisión no se alteran (Berdoy et al, 1995; Webster, 1994). Además, los ratones infectados presentan una patología cerebral expandida, con déficit sensorial y de coordinación (Gulinello et al, 2010). En los seres humanos con infección adquirida subclínica, también se ha sugerido una modificación de la conducta debida a la infección por T. gondii. Por un lado, las personas infectadas tienen una mayor propensión a provocar accidentes automovilísticos e incluso se han reportado cuadros compatibles con esquizofrenia y paranoia (Alvarado-Esquivel et al, 2011, 2006; Hamidinejat et al, 2010; Webster y McConkey, 2010; Torrey y Yolken, 2003). La infección con este parásito podría

provocar cambios de personalidad y disminución en la capacidad psicomotora, habiendo una asociación significativa entre la infección y el intento de suicidio en pacientes con desorden de personalidad (Arling et al, 2009; Flegr, 2007). En este sentido, recientemente se ha reportado que algunos medicamentos empleados en el tratamiento de la esquizofrenia en seres humanos (haloperidol y ácido valproico) administrados por vía oral a ratas infectadas con T. gondii, reducen los cambios de conducta descritos anteriormente en estos roedores y además inhiben la replicación del parásito in vitro (Goodwin et al, 2011; Webster et al, 2006). El mecanismo por el cual el parásito induce las alteraciones en el SNC no se conoce, pero se ha sugerido que los quistes alojados en el cerebro podrían afectar el sistema neuromodulatorio dopaminérgico u hormonal (testosterona) o bien podría deberse a la destrucción de las neuronas infectadas por el parásito en determinadas áreas del SNC (Flegr, 2007; Skallová et al, 2006).

1.4.1 Las células del Sistema Nervioso Central y sus funciones El SNC está compuesto principalmente de neuronas y células glia. Las neuronas reciben estímulos y conducen el impulso nervioso entre ellas mismas o a otros tipos celulares, mientras que la glia, también conocida como células gliales o neuroglia, son las células nodrizas del SNC, y existen varios tipos de glia: los astrocitos, los oligodendrocitos y la microglia. Los astrocitos (o astroglia) constituyen la población más abundante de las células gliales en el SNC. La proporción glia:neuronas varía entre las diferentes especies, siendo de 0.3:1.0 en la corteza cerebral de roedores, mientras que en humanos es de 1.6:1 (Sherwood et al, 2006). Morfológicamente los astrocitos tienen forma de estrella, con muchas prolongaciones llamadas pies que irradian del soma hacia las células vecinas. Se han descrito dos tipos principales: 1) protoplásmicos: se encuentran en la sustancia gris, y tienen prolongaciones citoplásmicas de forma variable pero muy ramificadas y 2) fibrosos: se encuentran principalmente en la sustancia blanca, con prolongaciones más largas y menos ramificadas, que contienen fibrillas llamadas gliofibrillas. Sin embargo, también se ha propuesto otra clasificación en nueve tipos: tanicitos, glia radial, glia de Bergman, astrocitos protoplámicos, fibrosos, glia marginal, glia perivascular, glia ependimaria y glia velada, basada en su morfología, localización y

en la expresión de la proteína GFAP (Glial fibirillaric acidic protein), proteína tipo III de filamento intermedio del citoesqueleto, que se encuentra exclusivamente en astrocitos (Giaume et al, 2007; Volterra y Meldolesi, 2005). Como se mencionó anteriormente la astroglia se considera como células nodriza de las neuronas, ya que forman redes de sostén alrededor de ellas y les aportan nutrientes. Cuando existe destrucción neuronal liberan factores de crecimiento para facilitar la regeneración de las conexiones neuronales. Así mismo, tienen función de protección, los astrocitos junto con las células endoteliales, forman la barrera hematoencefálica que controla el paso de nutrientes, oxígeno, vitaminas, hormonas, células del sistema inmune y microorganismos patógenos hacia el cerebro. En los últimos años se ha encontrado que la astroglia es tan diversa como las neuronas. Los astrocitos expresan en su membrana receptores para neurotransmisores (glutamato, GABA (gamma-Aminobutyric acid), acetilcolina, noradrenalina, óxido nítrico) liberados por las neuronas; además, reciben impulsos sinápticos y participan en la comunicación intercelular liberando “gliotransmisores” (glutamato, ATP o adenosin trifosfato), eicosanoides, citocinas, entre otros) que estimulan o inhiben a la neuronas o inducen vasodilatación o contracción (Giaume et al, 2007; Volterra y Meldolesi, 2005). Por su parte, los oligodendrocitos tienen función de sostén, unión y además forman la vaina de mielina que recubre el axón de las neuronas. Las células de la microglia son equivalentes a los macrófagos sistémicos, ya que tienen función fagocítica y eliminan las células dañadas o patógenos (Giaume et al, 2007; Volterra y Meldolesi, 2005).

1.5. Apoptosis La apoptosis es una forma controlada de muerte celular que involucra una cascada orquestada de eventos bioquímicos. Es un mecanismo homeostático que sirve para mantener las poblaciones celulares de los tejidos eliminando las células viejas o dañadas. Además, es vital para el desarrollo y funcionamiento del sistema inmune así como durante la embriogénesis y el desarrollo del sistema nervioso en los mamíferos (Elmore et al, 2007; De Zio et al, 2005). La apoptosis se presenta en todos los organismos multicelulares analizados, pero también se ha descrito en eucariontes unicelulares (Bruchhaus et al, 2007). A continuación se describe el proceso de

apoptosis de manera general (Figura 2, revisado en: Elmore et al, 2007; De Zio et al, 2005; Danial y Korsmeyer, 2004; James y Green, 2004; Degterev et al, 2003). Tal como se verá, uno de los componentes claves del proceso de apoptosis son las Caspasas, que pertenecen a una familia de proteasas de cisteína que cortan proteínas del citoesqueleto y nucleares involucradas en el ciclo celular, la replicación y la reparación del DNA en sitios específicos, provocando el desensamble de la célula. Se encuentran como pro-Caspasas, moléculas precursoras inactivas, que cuando reciben la señal apoptótica sufren un rompimiento proteolítico originando dos subunidades. Se han dividido en dos grupos: clase I (1, 2, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14, llamadas Caspasas iniciadoras) y clase II (3, 6 y 7, llamadas Caspasas efectoras). Las de clase I tienen un dominio N-terminal grande que les permite interactuar con otras proteínas y formar complejos, mientras que las de clase II tienen un dominio N-terminal pequeño o carecen de éste. Las pro-Caspasas iniciadoras tienen la capacidad de auto- degradarse y activan a las pro-Caspasas de tipo II que no se auto-activan e inician los mecanismos apoptóticos, hidrolizando a diversas proteínas. La apoptosis puede inducirse por dos vías: la extrínseca o la intrínseca. La vía extrínseca se activa mediante la unión de ligandos específicos que interactúan con los llamados receptores de muerte en la membrana celular, tales como CD95 (Fas) y ligando de CD95 (FasL) o el TNFα y TNFR (Tumor necrosis factor-alfa receptor). La unión del ligando al receptor provoca la formación de un complejo llamado DISC (Death-inducing signalling complex), el cual está formado por las proteínas adaptadoras FADD (Fas-associated death domain) o TRADD (TNFR1 associated death domain protein) las cuales se asocian con la pro-Caspasa 8 o la 10 a través del dominio efector de muerte DED (Death effector domain). La Caspasa 8 una vez auto-activada, rompe y activa a las Caspasas efectoras 3, 6 o 7 y también rompe a Bid, proteína citosólica pro- apoptótica miembro de la familia Bcl-2, que en su forma truncada se dirige a la mitocondria. La vía intrínseca es inducida por estrés y provoca daño a la membrana externa de la mitocondria provocando en consecuencia la liberación del Citocromo c y otros componentes de la membrana interna de la mitocondria. El Citocromo c interactúa con un factor llamado Apaf-1 (Apoptosis activating factor) en el citoplasma, induciendo su oligomerización en una estructura en forma de heptámetro llamada apoptosoma. Cada

Apaf-1 tiene un dominio de reclutamiento de Caspasas llamado CARD (Caspase- recruiment domain) que une una pro-Caspasa 9. La pro-Caspasa 9 unida al apoptosoma sufre rompimiento auto-proteolítico y se activa, induciendo a su vez, la activación de las Caspasas efectoras 3, 6 o 7. El control y la regulación de los eventos apoptóticos en la mitocondria lo lleva a cabo una familia de proteínas conocidas como Bcl-2, en la que se han identificado 25 miembros. Estos regulan la permeabilidad de la membrana mitocondrial y tienen funciones anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, Bcl-XS, Bcl-w, BAG, Mc-1) o pro- apoptóticas (Bax, Bak, Bad, Bim, Bik, Blk, Bcl-10, Puma, Noxa). Las proteínas Bcl-2 anti-apoptóticas neutralizan a las pro-apoptóticas responsables de la liberación de Citocromo c de la mitocondria, secuestrándolo. Con el rompimiento de la membrana de la mitocondria se liberan otros factores como Smac/DIABLO (Second mitochondria- derived activator of caspases/Direct IAP binding protein with low pI), la endonucleasa G, las proteasas de serina Omi/HtrA2 que residen en el espacio interno de la mitocondria y el factor AIF (Apoptosis-inducing factor). Además existen otras proteínas inhibidoras de apoptosis (IAPs, Inhibitor of apoptosis proteins), tales como cIAP-1, cIAP-2, (Cellular inhibition of apoptosis 1 y 2), XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) y Survivina, que interactúan y neutralizan a las Caspasas iniciadoras o efectoras. Así mismo, Omi/HtrA2 y Smac/DIABLO se unen a las IAPs y bloquean su efecto. En la regulación de la apoptosis también están involucrados factores de transcripción como el NFκβ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), que regula la transcripción de las IAPs y de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 (B-cell lymphoma 2). En el citoplasma se han identificado cinco componentes del complejo NFκβ (p50/p105, p52/p100, p65, cRel y RelB), los cuales permanecen inactivos porque están unidos a proteínas represoras llamadas Ikbα (Inhibitor of nuclear factor- kappa-light-enhancer of activated B cells, alpha). Después de recibir el estímulo apoptótico, los Ikbα son fosforilados por una cinasa llamada Ikb (IKK o IκB kinase), provocando la degradación de estos Ikbα por el proteosoma y la liberación del NFκβ activo, que se transloca al núcleo y se une a secuencias de DNA en el promotor; al unirse al DNA induce la expresión de varios genes involucrados en la prevención de la apoptosis, como Bcl-xl, cIAP1/2, XIAP y Survivina (Zanotto-Filho et al, 2011).

IAPs Survivina

PARP-1

Figura 2. Esquema general del proceso de apoptosis en células de mamífero. Los detalles de la figura se describen en el texto. Tomado y modificado de Carmen y Sinai, 2007, Molecular Microbiology.

Durante la etapa inicial de la apoptosis se presentan cambios morfológicos como encogimiento de la célula, pignosis debido a la condensación inicial de cromatina, citoplasma denso y compactación de organelos, así como alteraciones en la permeabilidad de la membrana plasmática, exposición de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana (normalmente se localiza en la cara interna). A medida que el proceso apoptótico avanza, hay pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial, condensación de cromatina, fragmentación de DNA y formación de cuerpos apoptóticos que contienen citoplasma u organelos empacados con o sin fragmentos del núcleo; estos cuerpos son fagocitados por los macrófagos. Una característica de la apoptosis es que no provoca una reacción inflamatoria, debido a que las células apoptóticas 13

no liberan su contenido al espacio intersticial; además los cuerpos apoptóticos son fagocitados rápidamente, y no producen citocinas inflamatorias (Elmore, 2007). Además de la vía extrínseca e intrínseca activadas durante la apoptosis, existe otra vía que provee una ruta alterna para la activación de Caspasas. Por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos pueden eliminar células blanco mediante la activación de la vía extrínseca (Fas/FasL). Sin embargo, también ejercen su efecto citotóxico en células tumorales o infectadas con virus mediante una vía que involucra la secreción de una molécula formadora de poros en la membrana llamada perforina, que permite liberar gránulos citoplásmicos dentro del poro en la célula blanco; las proteasas de serina granzima A y B son los componentes principales y una vez dentro activan a Bid o a Caspasa 3 directamente (Elmore et al, 2007; James y Green, 2004).

2. Antecedentes directos 2.1. Proceso de invasión de Toxoplasma a la célula huésped Toxoplasma tiene la capacidad de invadir prácticamente cualquier célula nucleada. La invasión del parásito es un proceso activo por penetración directa, mediado por componentes de varios organelos y del citoesqueleto del parásito y es dependiente de vías de señalización reguladas por calcio. Una vez dentro de la célula, el parásito se establece en una vacuola parasitófora (VP), nicho intracelular que le provee nutrientes para replicarse (Boyle et al, 2009; Sibley et al, 2004). El proceso de invasión es rápido, toma de 15 a 20 segundos y comprende una serie de eventos, de los cuales el primer paso es la unión del parásito a la célula blanco. Hasta el momento no se han identificado receptores específicos en la célula huésped para las proteínas de superficie del parásito, pero se han encontrado antígenos de superficie en los taquizoitos llamados SAG (surface antigens), que son una familia de proteínas ancladas a la membrana del parásito que interactúan con los glicosaminoglicanos sulfatados en la célula huésped (Blader y Saeij, 2009; Carruthers et al, 2000). Después de la unión, el parásito inicia la penetración a la célula huésped a través de su porción apical, haciendo uso de los micronemas, que son organelos secretorios que se localizan en la porción apical que contienen proteínas llamadas MIC (micronemes, se han identificado 20), que poseen dominios conservados de adhesinas. Se ha observado que la proteína MIC2 del parásito se une a moléculas de

adhesión de la célula del mamífero, como ICAM-1 (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1). Los micronemas secretan sus proteínas en respuesta a un incremento de Ca2+ intracelular. Simultáneamente se presenta la formación de la extrusión del conoide, proceso también dependiente de Ca2+ (Boyle et al, 2009; Del Carmen et al, 2009; Carruthers y Boothroyd, 2007; Sibley et al, 2004; Mondragón y Frixione, 1996). El parásito contiene unos organelos apicales llamados roptrias que descargan su contenido durante el proceso de invasión, y contienen una serie de proteínas conocidas como ROP (Rhoptry) y RON (Roptry neck proteins). Las proteínas RON forman un complejo con una proteína del micronema llamada AMA-1 (Apical membrane antigen-1) y esto provoca la formación de una “unión móvil” (moving junction) ésta tiene forma de anillo y permite una interacción muy estrecha entre el parásito y la célula huésped. De manera simultánea o inmediatamente después, las proteínas ROP son inyectadas en el citoplasma de la célula huésped. Algunas ROP se mantienen asociadas en pequeñas vesículas que se fusionan posteriormente para formar la membrana de la VP, otras ROP permanecen solubles y pueden actuar en distintos blancos de la célula huésped. El parásito penetra de manera activa, “jalando” a las MIC transmembranales, o al AMA-1 y al RON, invaginando la membrana plasmática de la célula huésped para crear la VP (Carruthers y Boothroyd, 2007; Sibley et al, 2004).

2.2. Formación de la vacuola parasitófora De manera simultánea a la invasión de la célula huésped, el parásito “construye” la VP. La membrana de la VP se considera clásica y se forma de novo rápidamente durante la entrada del parásito. Su origen deriva de dos fuentes: la internalización de membrana de la célula huésped y de los productos de vesículas secretorias derivadas de las roptrias que se descargan al citoplasma en el momento de la invasión. Uno de éstos es la proteína transmembranal RPS2 cuya función es regular la asociación de la VP con la mitocondria y el retículo endoplásmico del huésped (Carruthers y Boothroyd, 2007; Sibley et al, 2004). Se ha encontrado que algunos lípidos de la membrana del huésped como el colesterol y el gangliósido GM1 se incorporan a la membrana de la VP (Charron y Sibley, 2004).

Figura 3. Proceso de invasión del taquizoito de Toxoplasma gondii a la célula huésped. Detalles se explican en el texto. Tomado de Carruthers y Boothroyd, 2007.

La membrana de la VP tiene propiedades bioquímicas especiales, ya que es una vacuola no fusogénica, es decir, que no se fusiona con la mitocondria ni con el retículo endoplásmico de la célula huésped; además durante su formación, el parásito excluye de manera activa las proteínas de la membrana plasmática del huésped e inserta proteínas propias que probablemente permiten el paso de moléculas de la célula huésped al interior del parásito y viceversa (Coppens, 2006; Charron y Sibley, 2004; Mordue y Sibley, 1997).

2.3. La invasión de Toxoplasma en células de Sistema Nervioso Central En modelos animales se ha encontrado que durante la etapa aguda de la infección, los taquizoitos se replican en diversos tejidos, incluyendo el cerebro y forman quistes característicos de la etapa crónica. Las bases de la persistencia de éstos en cerebro no se conocen, pero podría deberse a que este órgano está relativamente aislado de la respuesta inmune sistémica (Wilson y Hunter, 2004).

La evidencia en estudios in vitro indica que el parásito se aloja y prolifera en neuronas, astrocitos, microglia y oligodendrocitos durante la infección aguda y crónica (Schlüter et al, 2001; Creuzet et al, 1998; Fagard et al, 1999; Luder et al, 1999; Fischer et al, 1997; Halonen et al, 1996). Sin embargo, los astrocitos parecen infectarse de manera preferencial y esto podría deberse a que son de mayor tamaño (100 µm) en relación a las neuronas (10-15 µm) o bien a receptores de superficie específicos, como la integrina o la laminina (Fagard et al, 1999). Al parecer, el parásito no tiene un tropismo particular por zonas específicas del SNC, ya que se han encontrado quistes en hipocampo, corteza, cerebelo y células neuroepiteliales (Schlüter et al, 2001; Fagard et al, 1999; Luder et al, 1999; Creuzet et al, 1998; Kurz et al, 1998; Fischer et al, 1997).

2.3.1 Invasión de Toxoplasma en astrocitos En la literatura científica existe evidencia de la susceptibilidad de los astrocitos a la infecciòn con T. gondii, sin embargo, hay una gran heterogeneidad en los modelos usados para evaluarlo, en relación a la especie del huésped (humano, ratón, rata y hámster), al modelo celular (líneas celulares de astrocitoma, glioblastoma o astrocitos de cultivo primario), así como a las cepas y dosis de parásitos. En el Cuadro 1 se presentan los resultados de una revisión sistematizada de la literatura sobre la invasión y replicación de Toxoplasma en astrocitos in vitro, con información obtenida de 15 artículos (Melzer et al, 2008; Estran et al, 2006; Martens et al, 2005; Brenier-Pinchart, et al, 2004; Troyo y Chinchilla, 2003; Halonen y Weiss 2000; Creuzet et al, 1998; Halonen et al 1998; 1996; Peterson et al, 1995, 1993; Pelloux et al, 1996, 1994; Luder et al, 1999; Daubener et al,1993). En los artículos analizados, la mayoría de los experimentos fueron únicos, es decir, las condiciones de cultivo, el tiempo post-infección, así como la cepa y dosis de parásito, se utilizaron una sola vez. Se emplearon cepas tipo I (RH y BK) y tipo II (ME49, 76K y Prugniaud); la dosis parásito:célula huésped osciló entre 0.2 a 20; y el tiempo post-infección evaluado fue de 1 a 50 h. Las variables que se evaluaron en estos trabajos fueron: porcentaje de células infectadas, número de parásitos por célula, número de VP por célula y número de parásitos por VP, algunas de las cuales no se mencionaban directamente y fueron calculadas de los datos mencionados en el texto. Se encontró que a tiempos cortos post-infección (de 1 a 4 h) el porcentaje de astrocitos

o astrocitomas infectados osciló entre 5 a 40%; mientras que a mayor tiempo post- infección (19 a 50 h) fue de 10% a 46%. En relación a la replicación del parásito, se reportó un rango de 1 a 25 parásitos por célula, con 1 a 5 VP por célula, y un rango de 1 a 18 parásitos por VP. Al parecer, el porcentaje de invasión o replicación de los parásitos no esta relacionado directamente con la dosis inicial de taquizoitos, sino mas bien con el tiempo post-infección y la virulencia de las cepas (Cuadro 1). Además, las líneas celulares de astrocitoma humano aparentemente son más susceptibles a la infección que los astrocitos de cultivo primario.

2.3.2. Papel de los astrocitos en el control de la infección con Toxoplasma En individuos inmunocompetentes la proliferación del parásito en el cerebro está regulada por la respuesta inmune. La microglia es la responsable de controlar la replicación de los taquizoitos mediante la fagocitosis y la producción de radicales libres de oxígeno y nitrógeno, como el oxido nítrico (NO, Nitric oxide); además, produce IFNγ, principal citocina que previene la reactivación de la encefalitis (Carruthers y Suzuki, 2007; Wilson y Hunter, 2004; Luder et al, 1999; Peterson et al, 1995). Los astrocitos se activan durante la infección con taquizoitos o bradizoitos in vitro y producen citocinas inflamatorias como IL-1β, IL-6 y TNFα (Fischer et al, 1997). También se ha descrito que los astrocitos de cultivo primario o líneas celulares de astrocitoma inhiben la replicación del parásito cuando son estimulados con IFNγ, solo o en combinación con otras citocinas inflamatorias como IL-1β. Al parecer los astrocitos, a diferencia de la microglia, pueden inhibir la replicación por mecanismos dependientes o independientes del NO (Halonen et al, 2001; 1998; Pelloux et al, 1996; Daubener et al, 1996,1993; Peterson et al, 1995). Los astrocitos producen quimiocinas durante la infección, que atraen a linfocitos T, tal como la proteína inducible-10 (IP-10, Inducible protein) y la proteína quimiotrayente de monocitos (MCP-1, monocyte chemotactic protein-1) para activar y reclutar macrófagos y linfocitos al cerebro (Brenier-Pinchart et al, 2004, 2002, 2000; Strack, et al, 2002a; 2002b). También funcionan como células presentadoras de antígenos y expresan moléculas co-estimuladoras (Wilson y Hunter, 2004). En su conjunto, esta evidencia indica que los astrocitos cuentan con diversos mecanismos para eliminar al parásito; sin embargo, el papel que desempeñan como célula efectora in vitro e in vivo aún no se ha establecido.

Cuadro 1. Evidencia de la invasión y replicación de Toxoplasma gondii en astrocitos in vitro.

Invasión Replicación dosis tipo tiempo porcentaje parásitos VP parásitos VP tipo celular huésped cepa parásito/ parásitos referencias parásito (h) de células por por por por célula por VP infectadas célula célula célula célula 3 32 Brenier- Pinchart 24 5 et al. 2004 Pelloux et 1 24 18a 1a al. 1996 RH 1 10

I 24 25 5 Astrocitoma/ Pelloux et Glioblastoma Humano 7a 1 20 al. 1994

24 45

3 22 Däubener BK 1 33b 12 19 et al. 1993

1 24 Pelloux et II 76K 7a 2 al. 1994

3 18 Brenier- 1 Pinchart 24 7 I RH et al. 2004 Peterson et 5 19c 6 Astrocitos al. 1995 Humano a 1 3 5 Estrán et al. PRU 48 1a 2006

II a c 0.2 25 24 6 Halonen et ME49 49c 18 al. 1996

Invasión Replicación dosis tipo tiempo porcentaje parásitos VP parásitos VP tipo celular huésped cepa parásito/ parásitos referencias parásito (h) de células por por por por célula por VP infectadas célula célula célula célula a 1 40 Peterson et 20a 21c 25a 5a 6a al. 1993 I RH 1 1e Troyo y 1 Chinchilla 24 4e 2003 2 14 1 Halonen 24 13 4 and Weiss,

Ratón 50d 11a 2000

d Halonen et 5 50 33 Astrocitos al. 1998 II ME49 2 1e 1

Martens et 10d 1e 1 al. 2005 26d 1e 6

Melzer et 8a 2 1e al. 2008 Creuzet et 1 24 46 14a 3a 4a al. 1998 I RH 1 1 1e Troyo y Rata Chinchilla 24 5e 2003 Lüder et al. II NTE 0.5 48 10 2a 1999 1 1 1e Troyo y Hámster I RH Chinchilla 24 18e 2003 a Calculado de los datos mencionados en el texto o en tablas; b, c, d: el tiempo señalado incluye un pulso de 3, 1 y 2 h, respectivamente; e Calculado de las gráficas del artículo. 20

2.4 Efecto de la infección con Toxoplasma en la apoptosis de la célula huésped El establecimiento de la infección por un patógeno intracelular obligado es un evento fundamental para garantizar su transmisión. El huésped infectado ha desarrollado estrategias para eliminar al agente infeccioso (virus, bacterias o eucariontes) y con ello inhibe su proliferación; una de éstas es la apoptosis, que es un mecanismo empleado por la célula huésped infectada para “destruirse a sí misma” con la finalidad de reducir la replicación y diseminación del patógeno, y con ello proteger a las células no infectadas limitando así el daño al organismo (Bienvenu et al, 2010; Bruchhaus et al, 2007; James y Green, 2004). Sin embargo, los parásitos han desarrollado una maquinaria compleja que les permite interferir con el proceso de apoptosis de la célula huésped, y T. gondii de acuerdo con algunos autores, es uno de los más exitosos (Laliberté y Carruthers, 2008; Carmen y Sinai, 2007; Sinai et al, 2004). No obstante, en la actualidad existe controversia sobre el efecto de la infección con T. gondii en la inducción o prevención de apoptosis en la célula huésped. La evidencia obtenida de modelos murinos y seres humanos in vitro e in vivo, indica que induce o previene la apoptosis de la célula infectada dependiendo de varios factores, entre ellos la etapa de la infección (aguda o crónica), la cepa del parásito (virulenta o no virulenta) y del tipo de célula infectada. Se considera que la regulación de este proceso podría relacionarse con la inmunopatogénesis de la infección (Luder y Gros, 2005; Wei et al, 2002). En modelos murinos y humanos Toxoplasma induce la apoptosis de la célula infectada en queratinocitos de córnea, células inflamatorias, linfocitos CD4+ y CD8+, linfocitos B, células NK, granulocitos, esplenocitos, células del ojo y del cerebro (Begum-Haque et al, 2009; Luder y Gros, 2005; Gavrilescu y Denkers, 2003, 2001; Hu et al, 2001; Shen et al, 2001; Wei et al, 2002, Liesenfeld et al, 1997). Al parecer el efecto depende de la cepa, ya que con cepas virulentas como la RH, hay mayor porcentaje de apoptosis en comparación con cepas menos agresivas, como la ME49 (Gavrilescu y Denkers, 2001). Se ha sugerido que la inducción de la apoptosis por Toxoplasma en las células del sistema inmune permitiría restringir la respuesta inmune del huésped contra el parásito para garantizar su diseminación (Debierre-Grockiego et al, 2007).

Por el contrario, T. gondii inhibe la apoptosis inducida por diversos agentes (radiación gamma, luz UV, eliminación de factores de crecimiento o fármacos como actinomicina-D y estaurosporina o TNFα) en líneas celulares humanas y murinas (linfoides y de fibroblastos), esplenocitos, macrófagos y neutrófilos (Hwang et al, 2010; Hippe et al, 2008; Vutova et al, 2007; Kim et al, 2006; Payne et al, 2003; Chanon et al, 2002; Heussler et al, 2001; Goebel et al, 2001, 1999, 1998; Nash et al, 1998). Lo anterior sugiere que el bloqueo de la vía apoptótica es importante para facilitar la supervivencia del parásito y la persistencia dentro de la célula huésped durante la fase aguda y crónica de la infección. La inhibición de la apoptosis en la célula infectada al parecer, también depende de la concentración de parásitos, se requiere que los parásitos intracelulares estén vivos, pero no necesariamente replicándose (Goebel et al, 1999; Nash et al, 1998). Además, a pesar del empleo de altas concentraciones de parásitos, la apoptosis no se inhibe completamente (Goebel et al, 1999; 2001). Sin embargo, hasta el momento no se conoce con precisión los mecanismos mediante los cuales Toxoplasma inhibe la apoptosis de la célula infectada, la evidencia experimental señala que actua sobre varios puntos reguladores del proceso de apoptosis: A través de la vía Fas/CD95, que es crucial para activar la inmunidad contra agentes infecciosos (Hippe et al, 2008; Vutova et al, 2007). Inhibiendo las Caspasas iniciadoras 8, 9 y las Caspasas efectoras 3 y 7 (Angeloni et al, 2009; Hippe et al, 2009, 2008; Gais et al, 2008; Vutova et al, 2007; Carmen et al, 2006; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001). Bloqueando la enzima poli-ADP ribosa polimerasa (PARP-1) que es blanco de la Caspasa 3 y Caspasa 7 (Kim et al, 2006; Goebel et al, 2001; Gais et al, 2008, véase más adelante). Inhibiendo la liberación de Citocromo c de la mitocondria (Hippe et al, 2009; Carmen et al, 2006; Goebel et al, 2001). Induciendo un incremento en la expresión de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Bf1-1 y Mcl-1), e inhibiendo la expresión de los pro-apoptóticos Bad y Bax (Hwang et al, 2010; Begum-Haque et al, 2009; Hippe et al, 2009, 2008; Kim et al, 2006; Molestina et al, 2003; Schlüter et al, 2002; Goebel et al, 2001).

Activando al factor de transcripción NF-κβ involucrado en varios procesos celulares que incluyen la regulación de la supervivencia celular (Laliberté y Carruthers, 2008; Molestina et al, 2003; Molestina y Sinai, 2005, véase más adelante). En líneas celulares la infección con el parásito inhibe la apariencia y progresión de los signos clásicos de apoptosis, tales como la condensación nuclear y la fragmentación de DNA, este efecto es dependiente de la concentración de parásitos (Kim et al, 2006; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001).

2.4.1 Efecto de la infección con Toxoplasma sobre puntos específicos de la apoptosis 2.4.1.1. Bcl-2 Los miembros de la familia Bcl-2 contienen una o varias regiones conservadas llamadas dominios de homología Bcl-2 (o BH), la mayoría de los miembros con propiedades anti-apoptóticas contienen 4 dominios BH, mientras los miembros pro- apoptóticos como Bax y Bak (conocidos como proteínas efectoras), tienen 3 dominios BH; el resto de los miembros pro-apoptóticos solamente tienen el dominio BH3 (Brunelle y Letai, 2009). Las proteínas anti-apoptóticas contienen una hendidura hidrofóbica que une el dominio BH3 de las pro-apoptóticas, que deben formar heterodímeros para activarse, de tal forma que al unirse a este dominio las inactivan; por lo tanto, Bcl-2 y las demás proteínas anti-apoptóticas bloquean la muerte celular previniendo la oligomerización de Bax/Bak y otros miembros pro-apoptóticos (Letai, 2005; Quinn y Richardson, 2004). Bcl-2 es una proteína endógena de 28 kDa, su sobre-expresión previene la redistribución de Bax en la mitocondria y la activación de Caspasas, así como un incremento en la concentración de calcio en la mitocondria y cambios en el potencial de membrana de ésta, previniendo la liberación de Citocromo c (Sheridan y Martin, 2010). La participación de Bcl-2 en la apoptosis durante la infección con T. gondii es contradictoria. Por un lado, en células de cerebro, leucocitos, líneas celulares linfoides, esplenocitos o fibroblastos no se encontraron cambios en la expresión del mRNA o la proteína Bcl-2 (Begum-Haque et al, 2009; Carmen et al, 2006; Kim et al, 2006; Goebel et al, 2001; Schlüter et al, 2001; Shen et al, 2001; Takahashi et al, 2001). Mientras que

hubo un incremento en la expresión de esta proteína Bcl-2 en una línea celular de leucemia humana, efecto que fue dependiente de la dosis de taquizoitos (Hwang et al, 2010). Sin embargo, en linfocitos de bazo la proteína disminuyó a medida que transcurrió el tiempo post-infección (Begum-Haque et al, 2009). Por su parte, la expresión del gen Bcl-2 aumentó seis veces en fibroblastos de ratón infectados (Molestina et al, 2003). Estas diferencias en la expresión de Bcl-2 en la infección con Toxoplasma podrían deberse a las diferencias en los modelos empleados, tales como el tipo de célula huésped, la cepa y dosis de parásitos o al tiempo post-infección.

2.4.1.2. Survivina La Survivina es una proteína de 16.5 kDa, por lo que es el miembro más pequeño de la familia de las IAPs que inhiben específicamente a las Caspasas 3, 7 y 9. Estas IAPs tienen de una a tres copias del “motivo” BIR (Baculovirus IAP repeat) en la región amino terminal; además, la mayoría de las IAPs tienen un dominio de dedo de zinc (RING) en la región carboxilo terminal, involucrado en la degración de proteínas por ubiquitinación, mientras que otras contienen además un dominio CARD para reclutar a las Caspasas activas. La Survivina contiene un solo dominio BIR y se han descrito cinco isoformas que se localizan en diferentes compartimentos celulares (núcleo o citoplasma). Dentro de sus funciones están la inhibición de la apoptosis en respuesta a diversos agentes, la regulación de la división celular y la estimulación de la angiogénesis. Se ha encontrado una sobre-expresión de esta proteína en células cancerosas (Mita et al, 2008; Duffy et al, 2007; Altieri, 2003). En la infección con T. gondii el papel de Survivina durante la apoptosis no se ha dilucidado. Existe un reporte de Molestina y cols. (2003) en el cual evalúan la expresión de este gen en una línea celular de fibroblastos murinos infectados con la cepa RH, pero el incremento encontrado de 1.3 veces en relación al control, no fue significativo.

2.4.1.3. Iκβα El factor de transcripción NF-κβ regula la transcripción de proteínas de la familia Bcl-2 y de las IAPs para inducir la supervivencia de la célula. Se han identificado 5 miembros del NF-κβ (p50, p52, p65, y RelB y c-Rel), estos son mantenidos en el citosol por medio de proteínas inhibidoras Iκβα, pero si este inhibidor es fosforilado por medio

de una cinasa IKK, el NF-κβ se transloca al núcleo regulando la transcripción (Laliberté y Carruthers, 2008; Elmore et al, 2007). En la infección con T. gondii, el NF-κβ desempeña un papel fundamental en la inhibición de la apoptosis, ya que el parásito tiene una cinasa llamada IkappaB o TgIKK (Toxoplasma gondii IκB kinase) que fosforila al represor en los sitios serina 32/36, permitiendo la translocación de las subunidades p50 y p65 al núcleo, lo que conlleva a la expresión de genes anti-apoptóticos (Molestina y Sinai, 2005; Molestina et al, 2003). Al parecer la fosforilación de Iκβα ocurre inicialmente en la membrana de la vacuola parasitófora (Molestina y Sinai, 2005; Molestina et al, 2003). Se ha sugerido que la cinasa IKK del huésped inicia la actividad anti-apoptótica del NF-κβ y la cinasa TgIKK del parásito la mantiene (Laliberté y Carruthers, 2008). La activación del NF-κβ por el parásito es rápida y correlaciona con la disminución de la proteína represora Iκβα en el citosol desde los 10 minutos post- infección (Kim et al, 2006). Por el contrario, en fibroblastos humanos infectados con la cepa ME49 se detectó la expresión del gen Iκβα durante las primeras horas post- infección (Blader et al, 2001).

2.4.1.4. PARP-1 La ADP-ribosa transferasa o poli ADP-ribosa polimerasa (PARP-1) es una enzima nuclear de 116 kDa presente en eucariontes, que cataliza el rompimiento de NAD+ en nicotinamida y ADP ribosa, que se usa para sintetizar polímeros de ADP ribosa que se unen de manera covalente a residuos de glutamato y aspártico en varias proteínas aceptoras y a sí misma. Esta enzima se activa en respuesta al daño a DNA causado por escisión de bases y rompimiento de cadena simple o doble, provocados por diversos procesos biológicos, estrés celular o agentes externos (drogas). Si el daño al DNA es menor, la enzima promueve la supervivencia de la célula participando en su reparación, pero si el daño es severo entonces promueve la muerte celular por apoptosis (Sodhi et al, 2010; Moroni, 2008). Durante el proceso de reparación PARP-1 se une al DNA dañado, forma homodímeros y sintetiza los polímeros de poli-ADP ribosa, parecidos a ácidos nucleicos ramificados, los cuales se unen de manera covalente a las proteínas aceptoras nucleares como histonas, topoisomerasas y endonucleasas. La carga altamente negativa de estos polímeros de poli-ADP ribosa afecta la función de las proteínas

blanco; y se ha encontrado que varios factores de transcripción, de replicación y moléculas de señalización son poli-ADP ribosilados (Sodhi et al, 2010; Moroni, 2008; Phulwani y Kielian, 2008; Nguewa et al, 2005). Además, PARP-1 interactúa directamente con el complejo polimerasa-α primasa y se une a proteínas de la maquinaria de reparación del DNA, que a su vez interactúan con la DNA ligasa II y la DNA polimerasa β. Al parecer, PARP-1 favorece el acceso del complejo de reparación al DNA, descondensando los cromosomas a través de la ADP-ribosilación de las histonas, la carga negativa de los polímeros de poli-ADP ribosa provocan la repulsión electrostática entre las histonas y el DNA, proceso implicado en la remodelación de la cromatina y reparación del DNA (Nguewa et al, 2005; Perrin et al, 2000). Sin embargo, PARP-1 también tiene la función de promover la muerte celular por apoptosis en respuesta a un daño excesivo al DNA. Como se mencionó anteriormente, la última etapa de la apoptosis es un proceso irreversible en el cual las Caspasas 3, 6 y 7 digieren proteínas celulares, es durante esta etapa que la Caspasa 3 y la Caspasa 7 reconocen la secuencia blanco DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) en PARP-1 y catalizan su proteólisis en dos fragmentos de 89 y 24 kDa respectivamente. El rompimiento de este sitio separa el dominio de unión a DNA del dominio catalítico, volviendo a PARP-1 inactiva, evitando que se una al DNA, y como consecuencia este se fragmenta y se forman los cuerpos apoptóticos (Sodhi et al, 2010; Moroni, 2008). La evidencia en la literatura señala que la infección con T. gondii reduce la expresión de PARP-1 endógena (116 kDa) y previene la fragmentación de ésta, evaluado mediante la disminución en la cantidad del fragmento de 89 kDa, inducida por agentes como la Estaurosporina (inhibidor de proteínas cinasas), la Actinomicina D (inhibidor de la transcripción) o el TNFα+Cicloheximida (inhibidor de la síntesis de proteínas) en células de bazo, en fibroblastos y en líneas celulares de leucemia, linfoma y macrófagos; pero la inhibición no es completa (Gais et al, 2008; Kim et al, 2006; Payne et al, 2003, Goebel et al, 2001). La disminución en la expresión de PARP-1 ocurre de manera rápida (desde los diez minutos post-infección), pero a tiempos prolongados (24 h) se normaliza, indicando que el efecto depende del tiempo y de la concentración de parásitos. Además, en las células infectadas disminuyó su actividad enzimática, mientras que los niveles de expresión del mRNA para PARP-1 no revelaron

cambios significativos, indicando que su inhibición durante la infección se regula a nivel post-transcripcional (Gais et al, 2008; Goebel et al, 2001).

2.4.1.5. Caspasa 3 La Caspasa 3, también conocida como CPP-32, Apoptain, Yama o SCA-1, es una proteasa de cisteína, considerada una de las más importantes Caspasas ejecutoras, ya que tanto la vía extrínseca como la intrínseca de la apoptosis convergen en su activación por las Caspasas iniciadoras 8, 9 y 10. En la forma de pro-Caspasa inactiva tiene un tamaño de 35 kDa; para activarse requiere procesamiento proteolítico en un residuo de ácido aspártico, originando dos fragmentos activos de 17 y 12 kDa. Esta proteína es responsable del rompimiento proteolítico activador de muchas proteínas celulares durante el proceso de apoptosis, también induce la desorganización del citoesqueleto y la desintegración de la célula en cuerpos apoptóticos. Como se mencionó, la Caspasa 3 también inactiva a la proteína nuclear PARP-1 involucrada en la reparación del DNA (Degterev et al, 2003; Fernandes-Alnemri et al, 1994). Se ha reportado que T. gondii inhibe de manera parcial la activación de la Caspasa 3 en células de bazo, fibroblastos, líneas celulares de macrófagos o linfoides, células Hela y BeWo (trofoblastos), ya que previene su rompimiento en los fragmentos de 17 y 12 kDa activos en las células infectadas desde tiempos cortos post-infección; al parecer esta inhibición es dependiente de la concentración de parásitos. Además, el parásito inhibe la actividad de esta proteína (Hwang et al, 2010; Angeloni et al, 2009; Gais et al, 2008; Hippe et al, 2008; Carmen et al 2006; Kim et al, 2006; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001).

2.4.2. Toxoplasma y apoptosis en células de Sistema Nervioso Central La evidencia del efecto de la infección del parásito sobre la apoptosis de células de cerebro es escasa y contradictoria. En un estudio in vivo se reportó que las neuronas de corteza del cerebelo de ratones adultos infectadas con taquizoitos de la cepa RH (virulenta), presentaron alteraciones morfológicas y una disminución del número de neuronas, así como presencia de apoptosis y necrosis, pero no se detectó expresión de la proteína Bax (pro-apoptótica) en estas células (el-Sagaff et al, 2005). Por su parte, Takahashi y cols. (2001) en un modelo de toxoplasmosis congénita murina usando la

cepa ME49 (baja virulencia) al día embrionario cinco de gestación, encontraron una disminución del número total de neuronas de corteza y un incremento del número de células en proceso de apoptosis; sin embargo, no identificaron los fenotipos celulares de las células apoptóticas. También estudiaron la expresión de la proteína Bcl-2 (anti- apoptótica) y de Bax mediante inmunohistoquímica, encontrando un incremento en la expresión de la primera a partir del día 10 de gestación, mientras que Bax se expresó a partir del día 14 y hasta el día 18; no obstante, no hubo diferencias significativas entre la expresión de ambas proteínas. Finalmente, también se ha reportado que la cepa ME49 induce apoptosis en células de cerebro de ratón, aunque no se especificó el tipo celular afectado y no hubo diferencias en la expresión de las proteínas Bcl-2 y Bax (Shen et al, 2001). En estos pocos estudios si bien la evidencia morfológica indica que las células neurales infectadas sufren apoptosis, la evaluación de marcadores específicos claves del proceso de apoptosis (proteínas o genes) no es consistente, lo que indica que no se conoce con precisión si la infección con T. gondii previene o induce la apoptosis en células del SNC, tal como se ha descrito para otros tipos celulares; y se desconoce por tanto, el efecto que tiene en el huésped la destrucción celular debida a la infección. En este sentido, se ha observado que los ratones que cursan la etapa crónica de la enfermedad, tienen afectadas la orientación espacial y la capacidad de memoria, reguladas por el hipocampo, y se ha sugerido que la destrucción celular en el SNC por el parásito podría ser la responsable de este efecto (Wang et al, 2006).

3. Planteamiento del problema Actualmente existe controversia sobre el papel de T. gondii en la apoptosis de la célula huésped, esto se debe posiblemente a las variaciones en los modelos usados, al tiempo de evaluación, así como al tipo de célula huésped, la cepa y la dosis del parásito (Hwang et al, 2010; Begum-Haque et al, 2009; Hippe et al, 2008; Laliberté y Carruthers, 2008; Carmen y Sinai, 2007; Sinai et al, 2004; Gavrilescu y Denkers, 2003; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001; Nash et al, 1998). El efecto de la infección con T. gondii sobre la apoptosis en células de SNC también es escaso y no concluyente. En modelos murinos la infección in vivo provoca la disminución del número de neuronas y hay evidencia de apoptosis. Sin embargo, no hay diferencias claras entre la apariencia

apoptótica de las células y la expresión de los marcadores de apoptosis Bcl-2 y Bax. Así mismo, la diferencia entre las células infectadas y los controles no fue significativa, y además, no se identificó el fenotipo de las células apoptóticas (el-Sagaff et al, 2005; Shen et al, 2001; Takahashi et al, 2001). Esto es de relevancia pues los pocos estudios que existen en relación a la infección de distintas estirpes celulares del SNC indican que los astrocitos se infectan con más frecuencia, y hay información contradictoria en relación a su susceptibilidad a la invasión y replicación parasitaria (Creuzet et al, 1998; Fagard et al, 1999; Luder et al, 1999; Fischer et al, 1997; Halonen et al, 1996). El estudio sobre la invasión y replicación de los taquizoitos de Toxoplasma y su efecto en la apoptosis de astrocitos de ratones neonatos (como modelo de infección congénita) brinda información sobre fenómenos que conducen a la generación de las patologías más conocidas y severas de la toxoplasmosis en el SNC.

4. Hipótesis La infección con taquizoitos de Toxoplasma gondii previene la apoptosis de los astrocitos de ratón.

5. Objetivos 5.1. Objetivo general Determinar el efecto de la infección con taquizoitos de Toxoplasma gondii sobre la apoptosis de astrocitos de ratón in vitro.

5.2 Objetivos específicos 1. Establecer un modelo de invasión y replicación de taquizoitos de T. gondii en astrocitos de ratón neonato in vitro.

2. Determinar si la invasión con T. gondii induce o previene la apoptosis de los astrocitos infectados.

6. Metodología 6.1. Modelo de infección de astrocitos in vitro Con la información obtenida de la literatura se desarrolló un modelo de infección in vitro a partir de cultivos primarios de astrocitos de cerebro de ratón neonato. La metodología empleada es una modificación de la estrategia reportada por Creuzet y cols. (1998).

6.1.1. Cultivo primario de astrocitos de ratón neonato Se usaron ratones Balb/c recién nacidos (menos de 12 h), que fueron sacrificados por decapitación, siguiendo protocolos de ética y bioseguridad de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio (NOM- 062-ZOO-1999). Se obtuvo el cerebro de los ratones en un ml de solución salina de fosfatos libre de calcio y magnesio (HBSS, Hank's balanced salt solution, Apéndice 1) a 37°C en condiciones estériles. Se cortó el tejido con tijeras y se hicieron lavados por sedimentación con HBSS; posteriormente se hizo la disgregación del tejido en un tubo cónico conteniendo una mezcla de las enzimas Tripsina tipo III (0.1%) y DNAsa I (0.1%) en HBSS, en agitación constante durante 10 minutos a 37°C. Se agregaron 200 µl de suero fetal bovino para inhibir a la Tripsina y las células se lavaron por centrifugación a 2,000 rpm (centrífuga Biofuge primo-R, Heraeus), durante 5 min a temperatura ambiente, con medio de cultivo DMEM suplementado (Apéndice 1) y el precipitado se resuspendió en 5 ml de este medio. Finalmente, las células se dispersaron mecánicamente, de manera suave con una pipeta Pasteur con punta adelgazada con calor, y se sembraron en cajas de Petri de 35 mm (catálogo 153066, Nunc) o en placas Lab-Teck de 8 pozos (catálogo 154534, Nunc) con medio DMEM suplementado (Apéndice 1). Las cajas de cultivo se trataron previamente con poli-D-lisina (50 µg/ml, catálogo P7289 Sigma, Apéndice 1) y se mantuvieron a 37°C durante 12 h previas para favorecer la adhesión celular; antes de sembrar las células, se retiró esta solución de las cajas y se hizo un lavado con medio DMEM sin suero. Posteriormente, las células se sembraron a una densidad de 100,000 por caja Petri o 10,000 por pozo en las Lab-Teck, y se hizo el cambio de medio de cultivo cada tercer día. Los cultivos se mantuvieron durante 7 días hasta que alcanzaron una densidad promedio de 1x106 células y 1x105 células, respectivamente.

De esta manera se obtuvo un cultivo mixto de células gliales y neuronas de ratón neonato. La identificación de los fenotipos celulares se hizo mediante imnunofluorescencia con anticuerpos específicos (véase sección siguiente). A los ocho días se obtuvo un cultivo primario enriquecido de astrocitos (98%) y neuronas (2%).

6.1.2. Identificación de los fenotipos celulares presentes en el cultivo primario Las células adheridas en las cajas Lab-tecks se fijaron con etanol durante 10 min y se hicieron dos lavados de 10 min cada uno, con solución salina de fosfatos (PBS, Phosphate buffered saline, Apéndice 1) y se incubaron con CAS-Block (catálogo 00- 8120, Invitrogen) para eliminar la reacción inespecífica, durante 20 min a 37oC, seguida de dos lavados como se indicó arriba. La población de astrocitos se identificó con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra una proteína específica de citoesqueleto de astrocitos llamada GFAP (catálogo 041062, Millipore, dilución 1:200 en PBS), el cual se incubó durante toda la noche a 4oC. Después se hicieron 3 lavados de 10 min cada uno con PBS para eliminar el anticuerpo no unido. La detección del primer anticuerpo se hizo con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con Alexa 488 (dilución 1:100 en PBS, catálogo A11001, Molecular Probes, Invitrogen) incubado durante 2 h a 37oC, cubriendo las cajas de la luz directa (Suárez-Rodríguez y Belkind-Gerson, 2004). La población de neuronas se identificó con un anticuerpo específico contra la proteína B-tubulina III de microtúbulos, este anticuerpo monoclonal ratón anti-ratón (catálogo MAB1637, Millipore, dilución 1:200 en PBS) se incubó toda la noche a 4oC; seguido de tres lavados con PBS como se indicó arriba. La detección del primer anticuerpo se hizo mediante un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (dilución 1:800 en PBS, catálogo A10521, Invitrogen) conjugado con Cy3. Finalmente las láminas se lavaron con PBS como se indicó arriba, en la obscuridad y se montaron con medio de montaje Clearmount (catálogo 00-8110, Zymed). La identificación de los astrocitos o neuronas se hizo en un microscopio de fluorescencia Leyca (modelo DMLS, con lámpara de fluorescencia marca Kubler Codix, adaptado a la cámara Leyca DFC, con el programa 3.3.1, objetivo 100x). Se determinó el porcentaje de astrocitos o neuronas contando 100 células positivas para cada marcador celular por pozo, por triplicado para cada experimento.

6.1.3. Cultivo de Toxoplasma Los parásitos de la cepa RH (virulenta, tipo I) se mantuvieron por medio de pases en ratones Balb/c adultos. Los taquizoitos se obtuvieron del peritoneo de los ratones inoculados 7 días antes y se mantuvieron en cultivo en células Vero en medio

DMEM suplementado con 5% de suero fetal bovino a 37°C y 5% de CO2 durante 7 a 10 días en frascos de cultivo de 25 cm2 (Corning), periodo en que se presentó la lisis de la célula infectada debido a la replicación del parásito. Los taquizoitos se colectaron del sobrenadante mediante centrifugación a 2,000 rpm durante 5 min; el botón celular se resuspendió en medio DMEM y se determinó el número total de parásitos en una cámara de Neubauer. En todas las infecciones se usaron parásitos obtenidos del tercer pase en células Vero con la finalidad de mantener estable la virulencia del parásito entre cada ensayo.

6.1.4. Evaluación de la invasión de Toxoplasma en astrocitos murinos Existe evidencia en la literatura que indica que la velocidad de replicación de los taquizoitos cepa RH en fibroblastos humanos es de 4 h (Radke et al, 2001, 1998). Por tal motivo, se hizo una cinética de infección de astrocitos murinos de 8 días de cultivo desde 30 minutos (min), 1, 2, 3 y 4 horas (h) post-infección, usando a una relación 10:1 parásito: célula huésped; transcurrido el tiempo de incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con metanol (100%) durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente se tiñeron con el colorante Wright (catálogo WS32, Sigma) durante 5 min, seguido de otros 5 min con agua destilada. Las láminas se lavaron con agua corriente y se analizaron en un microscopio óptico Leyca DMLS, con el objetivo 100x. Se determinó el porcentaje de infección, contando el número de células que contenían al menos un parásito en un total de 100 astrocitos por pozo. Además, se determinó el número de parásitos por célula contando 100 astrocitos infectados; cada uno de estos ensayos se hizo por triplicado en tres experimentos independientes.

6.1.5. Replicación de Toxoplasma en astrocitos Con la finalidad de evaluar la replicación del parásito en los astrocitos se hizo una cinética entre las 12 y las 96 h post-infección, siguiendo dos modalidades: a) infección continua: los astrocitos se incubaron con taquizoitos a una dosis 10:1

parásitos:célula huésped durante todo el tiempo indicado; y b) pulso y seguimiento: los astrocitos se incubaron con los parásitos durante 2 h, a la misma dosis, después se lavaron tres veces con PBS estéril para eliminar los parásitos que no entraron a la células y posteriormente se incubaron durante 12 a 96 h post-infección. La replicación del parásito se evaluó contando el número de parásitos extracelulares. Para cada punto, se colectó el sobrenadante de cultivo de las células infectadas, se centrifugó a 2,000 rpm durante 5 min, el precipitado resultante se resuspendió en un ml de PBS y se determinó el número de parásitos libres en una cámara de Neubauer (Degirmenci et al, 2011; Chatterton et al, 2002; Hughes et al, 1986). En otra serie de experimentos se hizo la determinación del número de parásitos intracelulares a las 24 h post-infección. De manera similar al experimento de arriba, los astrocitos se infectaron con el parásito a una dosis 10:1, y después de dos horas de incubación, las células se lavaron con PBS estéril como se indicó arriba, para eliminar a los parásitos que no invadieron las células; posteriormente se incubaron durante 24 h. Transcurrido el tiempo de incubación, las células se lavaron nuevamente con PBS, se fijaron con metanol (100%) y se tiñeron con el colorante Wright, como se indicó previamente y se analizaron en un microscopio óptico a 100x. Se determinó el número de vacuolas parasitóforas (VP) y el número de taquizoitos por cada VP, en un total de 100 células infectadas.

6.1.6. Evaluación del efecto de la invasión y replicación de Toxoplasma en astrocitos por RT-PCR Con el fin de corroborar el resultado de la invasión y replicación del parásito en los astrocitos infectados a 24, 48, 72 y 96 h, se midió la expresión del gen GFAP (específico de astrocitos) y del gen B1 (específico de T. gondii) mediante RT-PCR, usando el gen G3PDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) como marcador endógeno constitutivo. Los astrocitos se infectaron con los parásitos durante 2 h a 37oC, se lavaron tres veces con PBS estéril para eliminar los parásitos que no invadieron y después se incubaron durante los tiempos indicados arriba. Para la extracción de RNA total las células se lavaron con PBS y se agregó 1 ml de Trizol (catálogo 15596-018, Invitrogen). La extracción se hizo con cloroformo y mediante centrifugación a 12,000 g durante 15 min a 4°C; en la fase superior del gradiente se obtuvo el RNA, que se

precipitó con isopropanol, incubando durante 10 min; se centrifugó a 12,000 g durante 10 min, y al precipitado se le agregó etanol (75%). Después de centrifugar a 7,500 g durante 5 min, se desechó el sobrenadante y se removió el exceso de etanol. Posteriormente se agregó agua con DEPC (Dietil pirocarbonato) al 0.1% y se calentaron los tubos a 65°C durante 5 min. Finalmente se hizo la cuantificación del RNA (Ribonucleic acid) en un espectrofotómetro (WPA UV 1101, Biothech Photometer) a 260 nm. La síntesis del cDNA se hizo mediante RT-PCR, a partir de 1 µg de RNA total, con la enzima transcriptasa reversa M-MLV y oligodT, incubando durante 1 h a 37°C, y el PCR se hizo con los reactivos señalados en el Cuadro 2 (Apéndice 1). El producto del PCR se resolvió en un gel de agarosa al 1.5% en amortiguador TAE (Tris-acetato- EDTA, Apéndice 1) durante 1 h a 110 V y se tiñó con bromuro de etidio. Los geles se analizaron en un foto-documentador de imágenes Quantity One (Biorad), y se hizo la densitometría de las bandas para cada uno de los genes en unidades arbitrarias con el programa Quantity One 4.6 (Biorad). La expresión de GFAP y B1 a los diferentes tiempos post-infección se normalizó contra G3PDH. Una vez normalizado, se determinó el porcentaje de expresión de cada gen en las células infectadas para cada tiempo, considerando el tiempo cero como el 100%.

6.2. Efecto de la infección con Toxoplasma en la apoptosis de astrocitos murinos En esta etapa se evaluó si la infección con T. gondii previene o induce la apoptosis en los astrocitos infectados, para lo cual se emplearon tres estrategias: expresión de genes involucrados en apoptosis, expresión de proteínas involucradas en apoptosis (PARP-1 y Caspasa 3) y cambios en la morfología nuclear resultantes del proceso de apoptosis.

6.2.1. Estandarización de un modelo para evaluar la apoptosis en astrocitos Con la finalidad de contar con un control positivo de inducción de la apoptosis en los astrocitos de ratón neonato se evaluaron diversas estrategias: a) Deprivación de factores de crecimiento mediante la eliminación del suero fetal bovino en el medio de cultivo hasta 6 días; b) Irradiación con luz UV durante diversos tiempos (15, 30 min y 1 h) y c) Efecto de fármacos inductores de apoptosis en células tumorales tales como el Cisplatino (cis-diaminoplatinum (II) dicloro, catálogo P4394-25, Sigma), a una dosis de

10, 20, 40, 60, 80 y 100 µM (durante 12, 24 o 48 h) y el Resveratrol (250 mM durante 24 y 48 h), inhibidores del proteosoma como el MG132 (20 y 40 µM durante 24 y 48 h) o inhibidores de la síntesis de proteínas como la Cicloheximida (10, 50 y 100 mg/ml durante 24 o 48 h). En todos los ensayos de evaluación de los fármacos inductores de apoptosis se utilizaron astrocitos de ocho días de cultivo, incubados con medio DMEM suplementado (Apéndice 1) a 37°C con 5% de CO2, el fármaco se agregó directamente a la caja de cultivo a la concentración indicada. De todas estas estrategias, el tratamiento con Cisplatino (80 µM por 12 o 24 h, disuelto en agua estéril, cubierto de la luz) resultó el más efectivo para inducir la apoptosis en astrocitos. Se analizaron los cambios en la morfología de las células tratadas con estos inductores en un microscopio invertido Zeiss modelo Axiovert 25, con el objetivo 20x. Además, las células se tiñeron en la obscuridad durante 10 min con DAPI (4´6-diamino-2-fenindol dilactato, catálogo D9542, Sigma), que es un colorante fluorescente que se une al DNA, haciendo posible detectar las células con morfología nuclear normal o fragmentada (apoptótica); se lavaron con PBS y se observaron en un microscopio de fluorescencia Leyca modelo DMLS.

6.2.2. Expresión de mRNA de genes involucrados en la apoptosis en respuesta a la infección con Toxoplasma Los astrocitos se infectaron con los parásitos durante 2 h, se lavaron con PBS estéril para eliminar los parásitos que no invadieron y después se incubaron durante 4, 6, 8, 12, 18 y 24 h. Se evaluó la expresión de los genes anti-apoptóticos Bcl-2 y Survivina, del gen pro-apoptótico Ikbα y del gen constitutivo G3PDH como control endógeno, mediante RT-PCR. Además, los astrocitos se incubaron durante 12 ó 24 h con el Cisplatino (80 µM) como inductor de apoptosis. La extracción del RNA total se hizo como se mencionó en la sección precedente. La secuencia de los oligonucleótidos y las condiciones de PCR empleadas se presentan en el Cuadro 3 (Apéndice 1). Se hizo la densitometría de las bandas en unidades arbitrarias con el programa Quantity One 4.6 (Biorad). La expresión de Bcl-2, Survivina e IKbα a los diferentes tiempos post-infección se normalizó contra G3PDH (gen de interés/G3PDH). Una vez normalizado, se determinó el porcentaje de expresión de cada gen en las células infectadas en relación a los controles para cada tiempo (gen de interés en las células

infectadas/gen de interés en las células control). Además, se determinó el porcentaje de inhibición en la expresión de cada gen debido a la infección, mediante la diferencia entre el valor de expresión y el 100%.

6.2.3. Participación de las proteínas PARP-1 y Caspasa 3 involucradas en la apoptosis durante la infección con Toxoplasma Con la finalidad de determinar si la infección con T. gondii induce o previene la apoptosis en los astrocitos de cultivo primario, se evaluó la cantidad relativa de las proteínas PARP-1 y Caspasa 3 mediante Western blot. Estas células se infectaron con taquizoitos a una dosis 10:1 parásito: célula huésped durante 0.5, 1, 2, 4, 6, 12 y 24 h post-infección; o bien se trataron con Cisplatino como control positivo de inducción de apoptosis (80 µM, durante 12 y 24 h). Después de estos tiempos, se lavaron las células con PBS para hacer la extracción de proteínas totales (véase sección siguiente). En otra serie de experimentos, con la finalidad de evaluar si la infección con T. gondii previene la apoptosis de la célula inducida por el Cisplatino, se evaluó la fragmentación de PARP-1, empleando dos modalidades de infección: a) Infección con T. gondii y tratamiento con Cisplatino: los astrocitos se infectaron con taquizoitos a una dosis 10:1, durante 2 h, luego se lavaron con PBS estéril para eliminar los parásitos que no invadieron y se mantuvieron en incubación a 37°C durante 12 h; transcurrido este tiempo se lavaron dos veces con medio DMEM suplementado y se incubaron durante otras 12 h con el Cisplatino. Después de este tratamiento las células se lavaron tres veces con PBS estéril y se hizo la extracción de proteínas. b) Tratamiento con Cisplatino e infección con T. gondii: los astrocitos se trataron con Cisplatino durante 12 h, se lavaron dos veces con medio DMEM suplementado y se infectaron con el parásito, posteriormente se lavaron para extraer las proteínas totales como se indicó arriba. Para la extracción de proteínas los astrocitos se lavaron con PBS, se colectaron en un tubo Eppendorf y se centrifugaron a 10,000 rpm durante 5 min a 4°C; se desechó el sobrenadante y el precipitado se lisó en solución amortiguadora de extracción de proteínas RIPA (Radioimmunoprecipitation assay buffer, Apéndice 1) incubando durante 30 min en hielo. Posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm por 30 min, a 4°C para obtener las proteínas totales. Se colectó el sobrenadante y se determinó la concentración de proteína mediante el kit BCA (catálogo 23225, Pierce) en una placa

de 96 pozos en el equipo Cabsystems Multiskan MS a 540 nm. Las proteínas a analizar (50 µg) se trataron mediante condiciones desnaturalizantes y reductoras con amortiguador de muestra (Apéndice 1) y se hirvieron durante 5 min. Posteriormente se corrieron en un gel de acrilamida al 10% para PARP-1 o al 5% para Caspasa 3 durante 1.5 h a 120 V. La transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa (Hybond ECL, catálogo RPN303D, Amersham) se realizó durante 1.5 h a 200 mA; la eficiencia de la transferencia se analizó mediante tinción de la membrana con rojo de Ponceau (catálogo P-3504, Sigma). Después la membrana se bloqueó con 5% de leche en amortiguador TBS (Apéndice 1) con 0.1% de Tween-20 durante 1 h en agitación constante, seguido de tres lavados de cinco min con TBS-Tween-20. La membrana se incubó con el anticuerpo primario policlonal anti-PARP-1 (conejo anti-ratón, dilución 1:1000, catálogo 9542, Cell Signalling), o con el anti-Caspasa 3 (conejo anti-ratón, dilución 1:1000, catálogo 9665, Cell Signaling) o bien con el anticuerpo monoclonal anti-actina como control interno (ratón anti-ratón, dilución 1:5,000, donación personal del Dr. Manuel Hernández, CINVESTAV). Para PARP-1 y Caspasa 3 la dilución se hizo en el amortiguador TBS (Tris-buffered saline, Apéndice 1) pH 7.4 con 0.1% de Tween-20 y 5% de leche, para bloquear la reacción inespecífica, siguiendo las instrucciones del fabricante; mientras que para actina la dilución se hizo en PBS pH 7.4 (comunicación personal); en todos los casos se incubó durante toda la noche a 4°C. Se hicieron tres lavados como se indicó arriba y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa (dilución 1:10,000 en TBS, catálogo A6154, Sigma) para PARP-1 y Caspasa 3, o bien de cabra anti-IgG de ratón (dilución 1:10,000 en PBS, catálogo A4416, Sigma) para actina. Después de tres lavados se identificaron las proteínas de interés mediante una reacción de quimioluminiscencia (kit Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate, catálogo 34080, Thermo Scientific), exponiendo la membrana a una placa autoradiográfica en la obscuridad. Posteriormente se hizo la densitometría de las bandas detectadas por quimioluminiscencia con el sistema Quantity One 4.6. Para PARP-1 se hizo la suma del valor relativo en pixeles de la proteína de 116 kDa (endógena) y del fragmento de 89 kDa (resultante de la apoptosis), considerándola como el 100% de expresión de la

proteína; este valor se normalizó con la cantidad de actina para la misma muestra (PARP-1/actina x100). Así mismo, se determinó la cantidad relativa en pixeles Caspasa 3 como se indicó arriba (Caspasa 3/actina x100). Para ambas proteínas la intensidad relativa en las células control no infectadas y no tratadas se estableció como el 100% de expresión.

6.2.4. Inducción de cambios en la morfología nuclear en respuesta a la infección con Toxoplasma En las células infectadas con T. gondii se evaluó la fragmentación de núcleos mediante tinción con DAPI. Como control positivo los astrocitos se trataron con Cisplatino (80 µM durante 24 h). Con la idea de evaluar si la infección con T. gondii previene o induce la apoptosis evaluada mediante la fragmentación de núcleos, los astrocitos se infectaron durante 12, 24, 36 y 48 h con el parásito a una dosis 10:1. En otra serie de experimentos, los astrocitos se infectaron con el parásito durante 24 h y después se retaron con el Cisplatino por otras 24 h, o viceversa, se trataron primero con el inductor de apoptosis y después se infectaron; o bien se agregaron los parásitos y el Cisplatino simultáneamente durante 24 h. Una vez terminada la incubación las células se fijaron en etanol durante 10 min, se lavaron con PBS y se tiñeron con DAPI durante 10 min más; se determinó el número de cuerpos apoptóticos en un total de 100 células mediante un microscopio de fluorescencia Leyca modelo DMLS.

6.3. Análisis de resultados Para los experimentos de invasión y replicación, cada ensayo se hizo por triplicado en un total de tres experimentos independientes, y se obtuvo el promedio y la desviación estándar. Para los experimentos de expresión de genes y proteínas involucradas en apoptosis se hicieron tres experimentos independientes. Se hizo una comparación entre los tratamientos por medio de la prueba de Kruskall-Wallis, y para comparar entre dos grupos se usó la prueba U de Mann-Whitney. Se tomó un valor de p ≤0.05 como estadísticamente significativa. Ambas pruebas son no paramétricas y se usaron debido a que se manejó un número de muestras pequeñas (3 experimentos independientes con o sin triplicados).

7. Resultados 7.1. Desarrollo de un modelo de invasión y replicación de Toxoplasma en astrocitos murinos 7.1.1. Invasión de taquizoitos en astrocitos a tiempos cortos post-infección Los astrocitos fueron susceptibles a la infección del parásito; a los 30 min post- infección el 34% de las células estaban infectadas, alcanzando un 91% a las 4 h (Figura 4 A), y hubo entre 1 y 7 taquizoitos por célula infectada (Figura 4 B). A medida que la infección transcurrió aumentó el número de parásitos intracelulares; a los 30 min la mayoría de las células (81%) contenían un solo parásito y un máximo de tres, mientras que a las 4 h el 30% contenían entre 1 y 3 parásitos intracelulares, alcanzando hasta 7 parásitos por célula (0.8%). Los astrocitos infectados tuvieron un solo taquizoito por VP, independientemente del tiempo (Figura 4C). En promedio, a tiempos cortos de infección (30 min y 1 h) hubo 1 taquizoito por célula infectada, y 3 taquizoitos a las 3 y 4 h.

7.1.2 Replicación de Toxoplasma en astrocitos murinos Se utilizaron tres estrategias para evaluar la capacidad de replicación del parásito en los astrocitos murinos: a) Cuantificación de parásitos extracelulares, b) Cuantificación de parásitos intracelulares y c) Expresión del gen B1 de T. gondii.

7.1.2.1 Parásitos extracelulares Para determinar la cantidad de parásitos extracelulares se hizo una cinética de infección entre 12 y 96 h post-infección, siguiendo dos modalidades: 1) Infección continua: los astrocitos se incubaron con los taquizoitos durante el tiempo indicado arriba y 2) Pulso-seguimiento: los astrocitos se incubaron con los taquizoitos durante 2 h, se lavaron para eliminar los que no invadieron y se incubaron durante 12 a 96 h. En la modalidad de infección continua el inóculo inicial fue de 2 x106 parásitos, a las 12 h había 1.8 x106 parásitos libres (Figura 5 A), una cantidad menor al inóculo inicial, debido a que los parásitos se encontraban intracelulares; a las 24 h hubo más del doble de parásitos libres (5 x106), y a las 48 h su número se incrementó 10 veces, alcanzando casi 20 veces más taquizoitos en relación al inóculo inicial, a las 96 h (38 x106).

A B

100 100 número de parásitos por célula 1 2 3 4 5 6 7 80 80

60 60

40 40

20 20 Porcentaje de células infectadascélulas de Porcentaje 0 infectadascélulas de Porcentaje 0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 tiempo post-infection (h) tiempo post-infection (h)

C T. gondii (h)

0.5 1 2 3 4

10 µm

Figura 4. Invasión de taquizoitos de T. gondii en astrocitos murinos durante las primeras 4 h post-infección. Porcentaje de células infectadas (A) y número de parásitos por célula (B). En un experimento representativo (C) se muestra la presencia de un solo taquizoito por vacuola parasitófora (flechas) mediante tinción con Wright (100x). Las barras representan el promedio de 3 experimentos independientes por triplicado. El porcentaje de células infectadas y el número de parásitos por célula fue variable entre los diferentes tiempos post-infección, con un valor de P<0.002 y P<0.005, respectivamente.

En el ensayo de pulso y seguimiento la tendencia fue similar, pero con menor número de parásitos totales, debido a que se eliminaron aquellos que no entraron durante las primeras 2 h de infección. Se contaron 7x105 parásitos libres a las 12 h, pero a diferencia de la infección continua, a las 24 h no se duplicó las cantidad de parásitos (3 x106); y a las 48 h el incremento fue de 6 veces más (12x106), aumentando 16 veces a las 96 h (32.5 x106, Figura 5 A). Estos resultados indican que la replicación T. gondii en astrocitos murinos siguió un crecimiento exponencial, desde las 24 h post- infección, alcanzando la fase estacionaria a las 72 h. El tiempo de duplicación se estimó en 3.5 y 4.0 h para la infección continua y la de pulso-seguimiento, respectivamente.

7.1.2.2. Parásitos intracelulares Debido a que la replicación exponencial del parásito en astrocitos comenzó a las 24 h, se determinó el número de parásitos intracelulares en este tiempo, mediante la estrategia de pulso-seguimiento. Los astrocitos tuvieron entre 1 y 8 VP por célula, pero la mayoría tuvo 1 VP (49%), y un porcentaje menor entre 2 y 3 VP (30% y 16% respectivamente), estimándose una frecuencia de dos VP por astrocito infectado a las 24 h (Figura 5 B). En relación al número de parásitos, los astrocitos infectados tuvieron entre 1 y 30 taquizoitos por VP, aunque la mayoría tuvo entre 1 y 8. En promedio hubo 8 parásitos por VP, con un total de 16 parásitos por célula a las 24 h (Figura 5 C).

7.1.3. Destrucción de la célula huésped debido a la replicación del parásito La destrucción de los astrocitos debido a la replicación parasitaria se evaluó por medio de la expresión del gen GFAP (específico de astrocitos) y de B1 (específico del parásito). A las 24 h la expresión de B1 fue de 86%, y alcanzó su valor máximo a las 96 h, mientras que la expresión de GFAP disminuyó de manera progresiva entre las 24 y 96 h post-infección (Figura 6 A y B). La disminución de GFAP correlaciona con la destrucción celular y replicación del parásito observados por cuantificación de parásitos en el sobrenadante y por tinción celular con Wright (Figuras 5 y 6). Estos resultados indican que la replicación intracelular del parásito provocó la lisis de la célula infectada desde las 24 h, y que a la 96 h los astrocitos están totalmente destruidos.

A 50 infección contínua 40 pulso y seguimiento

10 Taquizoitos (millones) Taquizoitos 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 tiempo post-infección (h)

B C

Porcentaje de de infectadascélulasPorcentaje 0 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 28 30 número de taquizoitos por VP

Figura 5. Cinética de replicación de T. gondii en astrocitos murinos. Determinación de la cantidad de parásitos extracelulares liberados al medio de cultivo, mediante experimentos de infección continua o de pulso y seguimiento (A). Evaluación de la replicación intracelular del parásito determinado por el número de vacuolas parasitóforas (VP) por astrocito infectado (B), o el número de taquizoitos por VP a las 24 h (C), mediante tinción con Wright (100x). En el inserto se muestran dos imágenes representativas de los astrocitos con pocos o numerosos taquizoitos por VP (izquierda y derecha respectivamente, indicados con flechas). Las barras representan el promedio de 3 experimentos con triplicado, p<0.0001.

A B tiempo post-infección (h) 120 0 24 48 72 96 B1 GFAP

GFAP 90

60 B1

G3PDH (%) UA Intensidad 0 0 24 48 72 96 tiempo post-infección (h)

T. gondii (h) C 0 24 48 72 96

200 µm

Figura 6. Cinética de replicación de T. gondii y lisis de la célula infectada. Producto de amplificación de los genes GFAP (específico de astrocitos) y B1 (específico de Toxoplasma) mediante RT-PCR, en un gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio. Se muestra un experimento representativo (A). Resultados de la densitometría de estos genes, las barras representan el promedio de tres experimentos independientes (B), en los que la variación en la expresión de GFAP a los diferentes tiempos post-infección fue significativa (p<0.002), no así la expresión de B1 (p=0.131). Efecto de la replicación de T. gondii sobre la viabilidad de los astrocitos murinos entre 24 y 96 h, mediante análisis de microscopia en células teñidas con Wright (20x). Se muestra un experimento representativo de tres independientes (C).

7.2. Efecto de la infección con Toxoplasma en la inducción o prevención de la apoptosis en la célula huésped 7.2.1 Estandarización de un modelo para evaluar la apoptosis en astrocitos Se evaluaron diversas estrategias para inducir la apoptosis en los astrocitos murinos como control positivo de este proceso (véase Materiales y métodos), tales como: eliminación de factores de crecimiento (SFB), luz UV y fármacos inductores de apoptosis (Cisplatino, Resveratrol, MG132 y Cicloheximida). De éstos el Cisplatino y la Cicloheximida indujeron apoptosis cuantificable por microscopia; sin embargo, se decidió utilizar el Cisplatino debido a que el tratamiento con Cicloheximida fue muy agresivo en las condiciones utilizadas obteniendo poca concentración de proteínas. Los astrocitos fueron parcialmente resistentes al efecto del Cisplatino, ya que dosis altas de este fármaco (80 µM por 24 h) provocaron la formación de cuerpos apoptóticos (etapa final del proceso de apoptosis, véase Introducción) solamente en el 55% de estas células; mientras que en células de otros linajes como las Hela o Vero el 98% tuvieron evidencia morfológica de apoptosis (datos no mostrados).

7.2.2. Expresión de genes involucrados en apoptosis en respuesta a la infección Se evaluó la expresión de los genes anti-apoptóticos Bcl-2 y Survivina, y del pro-apoptótico Ikbα, en los astrocitos durante las primeras 24 h de infección. El Cisplatino (control positivo de apoptosis en astrocitos en ausencia de parásitos) inhibió la expresión de Bcl-2 y Survivina en 56% y 61% respectivamente a las 24 h, y únicamente un 19% para Ikbα (Figura 7 A y B). Por su parte, la infección con T. gondii inhibió la expresión de Bcl-2 alrededor de 24% entre las 4 y las 8 h post-infección, pero la expresión se fue recuperando llegando a 14% a las 24 h. De igual manera, la expresión de Survivina disminuyó un 20% entre las 4 y las 8 h, pero se recuperó a medida que la infección progresó, alcanzando un 3% de inhibición a las 24 h. Sin embargo, el parásito no indujo cambios en la expresión de Ikbα (0.2 a 0.6% de inhibición) a ninguno de los tiempos evaluados (Figura 7 A y B).

Figura 7. Cinética de expresión de genes anti-apoptóticos y pro-apoptóticos en respuesta a la infección con Toxoplasma en astrocitos. Producto de amplificación mediante RT-PCR de los genes Bcl-2 y Survivina (anti-apoptóticos), Ikba (pro-apoptótico) y G3PDH (constitutivo), en células infectadas con Toxoplasma (+) y controles no infectados y no tratados con el fármaco (-). Como control positivo de apoptosis los astrocitos se trataron con Cisplatino durante 24 h. Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio, se muestra un experimento representativo (A). Resultados de la densitometría de estos genes, las barras representan el promedio de tres experimentos independientes (B). La variación en la expresión de estos genes a los diferentes tiempos post-infección no fue significativa (p=0.2). Abreviaturas: C: Cisplatino, h: horas.

7.3 Participación de proteínas involucradas en apoptosis durante la infección con Toxoplasma 7.3.1 PARP-1 PARP-1 endógena es una proteína de 116 kDa, durante la apoptosis la Caspasa 3 o la Caspasa 7 inducen su rompimiento proteolítico generando dos péptidos inactivos de 89 y 24 kDa. En las condiciones evaluadas en este trabajo, solamente se detectaron los fragmentos de 116 y de 89 kDa, y con fines de análisis, la suma de estos dos se consideró como la proteína total (116 kDa). La expresión de PARP-1 total en los astrocitos control no infectados y no tratados con Cisplatin se consideró como el 100%. Se encontró que en los astrocitos infectados con Toxoplasma entre 1 y 4 h la expresión de esta proteína se incrementó (12%) en relación al control; pero a medida que transcurrió la infección su expresión disminuyó (25%); sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 8 A y B). Por su parte, el tratamiento con Cisplatino provocó un incremento significativo en la expresión de PARP-1 total (116 kDa, Figura 8 B). A 12 h de tratamiento este fármaco indujo un incremento de más del doble (220%), el cual disminuyó a las 24 h (146%). Así mismo, en los astrocitos infectados durante 12 o 24 h y después retados con el Cisplatino o viceversa, la expresión de PARP-1 total también se incrementó de manera significativa (144%, Figura 8 B). En relación a la fragmentación de PARP-1 debido a la apoptosis (fragmento de 89 kDa), un porcentaje mínimo de astrocitos no infectados y no tratados con el fármaco sufrieron apoptosis (4%, Figura 8 C); mientras que el Cisplatino indujo una considerable fragmentación de PARP-1 (62%) a los dos tiempos evaluados (12 y 24 h, Figura 8 A y C). Por su parte, la infección previa con Toxoplasma durante 12 o 24 h inhibió de manera parcial (20%) pero significativa la fragmentación de PARP-1 en los astrocitos retados con Cisplatino durante 12 h, mientras que la inhibición de la fragmentación fue menor (6%) en las células retadas primero con el fármaco y después infectadas (Figura 8 A y C). Además, la infección con T. gondii sin el fármaco, no indujo la fragmentación de PARP-1 (fragmento de 89 kDa) a ninguno de los tiempos evaluados; solamente entre 1 y 4 h hubo una ligera fragmentación (8%) en relación al control no infectado (Figura 8 C), inclusive a tiempos más largos de infección, el parásito parece prevenirla.

Tiempo (h) 0 0.5 1 2 3 4 6 12 24

C12 C12

C12 + T24 + C12 C12 + T12 + C12

C24 T 24 +C12 24 T T. gondii - - - + + + + + + +C12 12 T

116 kDa PARP-1 89

43 actina

* B 250

200

1 total 1 150 -

100

50 de PARP

0 Porcentaje de expresiónPorcentajede

C * *

- de PARP

Porcentaje de fragmentación Porcentaje fragmentación de Tiempo post-infección (h)

Figura 8. Cinética de expresión de la proteína PARP-1 durante la infección con Toxoplasma en astrocitos. Imagen de Western blot de la proteína endógena (116 kDa) y de su fragmentación durante la apoptosis (89 kDa), desde 30 min hasta 24 h. La proteína actina se usó como control de carga, se muestra un experimento representativo (A). Resultados de la densitometría de PARP-1 total (suma de las bandas de 116+89 kDa) en (B), y de su fragmentación (bandas de 89 o 116 kDa independientes en C); las barras representan el promedio de tres experimentos independientes. La variación en la expresión total de esta proteína a los diferentes tiempos post-infección no fue significativa (p=0.23), pero si entre el control y Cisplatino (p=0.029), y entre las combinaciones de Toxoplasma y Cisplatino (p=0.05), indicadas con un *. La variación en la fragmentación de PARP-1 a los diferentes tiempos post-infección no fue significativa (p=0.22), pero si entre los tratamientos C12 y T12+C12 (p=0.05) y C24 y T24+C12 (p=0.05). Abreviaturas: T: Toxoplasma, C: Cisplatino, h: horas.

7.3.2. Caspasa 3 La pro-Caspasa 3 inactiva es un zimógeno de 35 kDa, una vez que se activa se fragmenta en dos péptidos de 20 y 17 kDa en promedio. En los astrocitos de ratón no infectados tratados con Cisplatino durante 12 o 24 h, a pesar de que presentaron evidencia morfológica de apoptosis, únicamente se detectó la proteína completa (35 kDa), aunque su nivel de expresión disminuyó (13%) en relación al control no infectado y no tratado (Figura 9); indicando que hubo procesamiento parcial de esta Caspasa. A su vez, la infección con T. gondii no indujo cambios significativos en la cantidad relativa de esta banda durante todos los tiempos evaluados (Figura 9 A y B).

A Tpi (h) 0 0.5 1 2 3 4 6 12 24 C12 C24 T. gondii - + + + + + + + + - -

Caspasa 3 35 kDa

43 actina

120

100 B 80

de Caspasa 3 Caspasa de 40

Porcentaje de expresión de Porcentaje 20

tiempo post-infección (h)

Figura 9. Cinética de expresión la proteína Caspasa 3 durante la infección con Toxoplasma en astrocitos. Imagen de Western blot de la proteína Caspasa 3 endógena (35 kDa) en astrocitos infectados por 30 min hasta 24 h. La proteína actina se usó como control de carga, se muestra un experimento representativo (A). Resultados de la densitometría de esta proteína, las barras representan el promedio de tres experimentos independientes (B). La variación en la expresión de Caspasa 3 a los diferentes tiempos post-infección no fue significativa (p=0.2). Abreviaturas: T: Toxoplasma, h: horas, C: Cisplatino.

7.4. Cambios en la morfología nuclear en respuesta a la infección con Toxoplama Una de las etapas finales del proceso de apoptosis es la fragmentación del núcleo de la célula que, junto con la condensación del citoplasma, provoca la formación de los cuerpos apoptóticos visibles al microscopio. En los astrocitos control no infectados y no tratados con el fármaco, el porcentaje de cuerpos apoptóticos fue muy bajo (2%); mientras que el tratamiento con el Cisplatino durante 24 h indujo su formación en el 55% de células (Figura 10 A). La infección con Toxoplasma durante 24 h no indujo la fragmentación nuclear en la célula infectada, y el porcentaje de cuerpos apoptóticos encontrados fue igual al control (2%, Figura 10 A y B). Además, a tiempos más largos post-infección (48 h) tampoco hubo evidencia de fragmentación (resultados no mostrados). Más bien, aparentemente, el parásito previene en un 83% la formación de los cuerpos apoptóticos inducida por el Cisplatino en los astrocitos infectados durante 24 h y retados después con el fármaco. Incluso a pesar del efecto citotóxico del Cisplatino, el parásito logró prevenir la formación de estos cuerpos apoptóticos (23%) en los astrocitos retados primero con el fármaco e infectados después. Así mismo, la incubación simultánea con el parásito y el fármaco evitó en un 34% la fragmentación nuclear en la célula huésped (Figura 10 A). Mediante la tinción con DAPI se logró ver el núcleo de los taquizoitos dentro de la célula huésped. Es evidente que el parásito invadió y se replicó en los astrocitos infectados durante 24 h, o bien el los infectados y retados con Cisplatino después, e inclusive en las células tratadas primero con el fármaco y luego infectadas. En los astrocitos que recibieron el parásito y el Cisplatino simultáneamente se aprecia invasión parasitaria, pero no replicación (Figura 10 B).

A cuerpos apoptóticos morfología basal 100

40 porcentaje

0 Con C T T/C C/T T+C tratamiento

Con C T

T/C C/T T+C

Figura 10. Prevención de la fragmentación nuclear en los astrocitos infectados con Toxoplasma. Evaluación de la formación de cuerpos apoptóticos y morfología nuclear basal en astrocitos teñidos con el colorante fluorescente DAPI (A). Imágenes representativas de la morfología nuclear de los astrocitos en presencia de los distintos tratamientos (B): T/C: infección con T. gondii durante 24 h, lavado de las células e incubación con Cisplatino durante 24 h mas; C/T: tratamiento con Cisplatino por 24 h, lavado y después infección con el parásito por 24 h; T+C: parásitos y Cisplatino simultáneamente durante 24 h. Las flechas amarillas señalan los cuerpos apoptóticos producidos durante la etapa final del proceso de apoptosis; las flechas verdes señalan el núcleo de los taquizoitos (40x). Resultados de un solo experimento realizado por triplicado. Abreviaturas: Con: control, C: Cisplatino, T: Toxoplasma.

8. Discusión En modelos murinos y humanos in vitro se ha demostrado que Toxoplasma se aloja y prolifera en células de SNC de diversos linajes: neuronas, astrocitos y microglia, formando quistes en los primeros dos linajes durante la etapa crónica de la enfermedad. Sin embargo, los astrocitos se infectan principalmente, debido quizá a su mayor tamaño (Fagard et al, 1999; Luder et al, 1999; Creuzet et al, 1998; Fischer et al, 1997; Halonen et al, 1996). Existe evidencia que indica que los astrocitos se activan durante la infección y producen citocinas inflamatorias para controlar la replicación intracelular de Toxoplasma en el cerebro; además producen quimiocinas para atraer a células inflamatorias y efectoras (Halonen et al, 2001; 1998; Brenier-Pinchart et al, 2004, 2002; Strack, et al, 2002; Fischer et al, 1997; Pelloux et al, 1996; Daubener et al, 1996,1993; Peterson et al, 1995). La apoptosis es una estrategia empleada por la célula huésped para eliminar a un patógeno. Actualmente existe controversia sobre el efecto de la infección con T. gondii en la apoptosis de la célula, la evidencia señala que el parásito tiene la capacidad de inducirla o prevenirla dependiendo de la etapa de la infección y de la virulencia del parásito (Hwang et al, 2010; Begum-Haque et al, 2009; Hippe et al, 2008; Carmen y Sinai, 2007; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001; Nash et al, 1998). Además, esta controversia podría deberse a las variaciones en los modelos usados, al tiempo de evaluación, así como al tipo de célula huésped, la cepa y dosis del parásito. De manera particular, la evidencia del efecto de la infección con Toxoplasma sobre la apoptosis en células de SNC es escasa y no concluyente. Por un lado, a pesar de que las células presentaron evidencia morfológica de apoptosis o disminución en el número celular, este no correlaciona con la expresión de marcadores típicos de apoptosis (como Bcl-2 o Bax); además no se identificaron los fenotipos de las células apoptóticas (el-Sagaff et al, 2005; Shen et al, 2001; Takahashi et al, 2001). Debido a esto y con la finalidad de establecer un modelo de infección de astrocitos in vitro, llevamos a cabo una revisión sistematizada de la literatura científica y desarrollamos un modelo de infección para evaluar la invasión y replicación del parásito a tiempos cortos y largos post-infección, a partir de un cultivo primario de astrocitos de ratón neonato infectados con la cepa RH.

En la literatura revisada se encontró una gran heterogeneidad en los modelos de infección utilizados para evaluar la infección con T. gondii en astrocitos incluyendo: especie del huésped, tipo celular (línea celular de astrocitoma/glioblastoma o cultivo primario de astrotictos), tipo de cepa y dosis de parásito, así como del tiempo de evaluación. En los trabajos analizados se evaluaron las siguientes variables: porcentaje de células infectadas, número de parásitos por célula, número de VP por célula y número de parásitos por VP, algunas de las cuales no se mencionaban directamente y se calcularon a partir de los datos mencionados en el texto. Fue interesante encontrar que en ningún artículo se realizaron cinéticas de invasión o replicación, aunque en algunos evaluaron un tiempo post-infección corto (<3 h) y uno largo (≥ 24 h). Esta heterogeneidad probablemente se debe a que en la mayoría de los trabajos el objetivo principal del estudio no era evaluar la capacidad de invasión o replicación del parásito, sino más bien, se enfocaron al control de la replicación intracelular de Toxoplasma o a la producción de moléculas involucradas en la respuesta inmune; sólo algunos estudios evaluaron directamente el proceso de invasión o replicación (Troyo y Chinchilla, 2003; Lüder et al, 1999; Creuzet et al, 1998; Halonen et al, 1996). En relación a la invasión del parásito en los astrocitos o astrocitomas, en la literatura revisada la dosis parásito:célula más alta que se usó fue de 20:1, y el tiempo de seguimiento fue de 1 a 3 h; además, en ningún trabajo se reportó un porcentaje de invasión mayor a 46% tanto con cepas tipo I como tipo II. En el presente trabajo usamos una dosis parásito:célula de 10:1, con la finalidad de garantizar que la mayoría de las células se infectaran con al menos un parásito por célula, y evaluamos la infección desde 30 min hasta 4 h post-infección, con un porcentaje de invasión máximo de 90% a las 4 h, el doble de lo reportado en astrocitos. No obstante, el porcentaje de células infectadas a 1 h (47%) fue similar al reportado por Peterson y cols. (1993) en astrocitos murinos, al mismo tiempo post-infección pero con el doble de la dosis de taquizoitos (20:1). En la literatura revisada, al parecer no hay una relación directa entre la dosis y el porcentaje de astrocitos infectados, inclusive al comparar otros dos estudios, en donde se reportó que hubo 20% de infección a 1 h en una línea celular de astrocitoma humano infectada con la cepa RH a una dosis de 7:1 (Pelloux et al, 1994), mientras que a una dosis de 1:1 con la misma cepa, hubo 32% de infección después de 3 h (Brenier-Pinchart et al, 2004). Por su parte, el porcentaje de invasión obtenido en

este trabajo es similar al reportado en células IEC-6 de epitelio intestinal de rata, en donde encontraron un 55% a 1 h y 82% a las 2 y 4 h post-infección; sin embargo, no se tiene el dato de la dosis de parásitos empleada, ya que el trabajo esta escrito en idioma chino (Meng et al, 2009). En relación a la replicación del parásito, en los artículos revisados en la literatura la dosis parásito:célula más alta que se usó fue de 8:1, y el periodo de evaluación fue desde 10 a 49 h. De manera similar a la invasión, no hubo una relación directa entre la dosis, el tiempo post-infección y el grado de replicación, ya que se reportó un rango de 1 a 25 taquizoitos por célula, con 1 a 5 VP por célula y hasta 18 taquizoitos por VP. En el presente trabajo, la cuantificación de los parásitos intracelulares permitió estimar una frecuencia de 2 VP por astrocito infectado, con 8 taquizoitos por VP y un total de 16 parásitos por célula. Estos resultados son similares a los reportados por Creuzet y cols. (1998), en ratas infectadas con la misma cepa y durante el mismo tiempo que se empleó en este trabajo, pero a una dosis 10 veces menor (1:1), lo que sugiere que el inóculo inicial de parásitos no tiene una relación directa con la velocidad de replicación. Por su parte, la cuantificación de los parásitos extracelulares liberados al medio después de la ruptura de la célula infectada (Degirmenci et al, 2011; Chatterton et al, 2002; Hughes et al, 1986), resultó una estrategia conveniente para evaluar la replicación. Empleando esta estrategia y la cuantificación de parásitos por vacuola, el tiempo estimado de duplicación de los taquizoitos en los astrocitos murinos fue de 3.5 h a 4.0 h, similar al de los otros modelos de replicación en astrocitos. Así mismo, en fibroblastos humanos el tiempo de duplicación de la cepa RH, VEG y ME49 es de 4.5- 5.0 h, 7 h y 9 h respectivamente; al parecer, los taquizoitos de la cepa RH se replican más lentamente en fibroblastos humanos que en astrocitos de ratón (Radke et al, 2001; 1998; Jerome et al, 1998; este trabajo). Sin embargo, falta determinar si este fenómeno está relacionado con el tipo de célula o la especie del huésped. La evaluación de la expresión del gen B1 de T. gondii por PCR en punto final no resultó la estrategia más adecuada para evaluar la dinámica de replicación intracelular del parásito, ya que desde las 24 h post-infección la expresión de este gen alcanza el 90%, y no permite distinguir diferencias entre los subsecuentes días de infección. En este sentido, para medir la replicación y supervivencia intracelular de T. gondii se han empleado diversas técnicas como conteo de los parásitos en cámara de Neubauer o en

laminillas por microscopia óptica, así como la tinción de los parásitos con naranja de acridina, la inmunofluorescencia, la incorporación de 3H-Uracilo o bien directamente taquizoitos transgénicos bioluminiscentes (Kafsack et al, 2007; Radke et al, 2001; Halonen et al, 1996, 1998; Peterson et al, 1993). Si bien estos últimos métodos son sensibles, también son peligrosos, caros o ambos; por lo que el conteo de los parásitos en cámara de Neubauer o en laminillas por microscopia óptica (Degirmenci et al, 2011; Chatterton et al, 2002; Hughes et al, 1986), constituyen un método reproducible, barato, rápido, fácil de realizar y evita el uso de agentes nocivos para el usuario como la radioactividad. Por otro lado, para evaluar el efecto de la infección con T. gondii sobre la viabilidad de la célula huésped, el monitoreo de la expresión de GFAP resultó conveniente, pues permitió identificar una disminución progresiva de los astrocitos viables durante la fase de replicación del parásito; además este ensayo no depende de la experiencia del observador y no requiere del empleo de tripsina o de otros procedimientos agresivos para contar el número de células. Sin embargo, por este método no es posible determinar si las células están muriendo por necrosis o por apoptosis. Por ello, se evaluó la participación de tres genes involucrados en el proceso de apoptosis en los astrocitos infectados: Bcl-2 y Survivina (anti-apoptóticos) e Ikbα (pro-apoptótico) a diferentes tiempos. Hasta donde sabemos, este es el primer trabajo donde se evalúa la participación de estos genes en el proceso de apoptosis en astrocitos durante las primeras 24 h de infección. Se decidió evaluar la expresión del gen Bcl-2 debido a que tiene un papel clave en el control y la regulación de la apoptosis en la mitocondria, este y otros miembros de la familia Bcl-2 regulan la permeabilidad de la membrana mitocondrial previniendo la liberación de Citocromo c y además bloquean a las proteínas pro-apoptóticas. Hasta el momento, la evidencia de la participación de Bcl-2 en la infección con T. gondii no es contundente. En este trabajo encontramos que la infección con el parásito inhibe parcialmente la expresión de este gen entre las 4 y las 8 h post-infección (24%), la cual se va recuperando a medida que progresa la infección, sugiriendo que durante las primeras horas la célula entra en un estado pro-apoptótico transitorio, que se relacionaría con una muerte celular tendiente a eliminar al parásito. No obstante, de manera opuesta a lo observado en este trabajo, Molestina y cols. (2003) reportaron un

incremento de seis veces en la expresión de este gen en una línea celular de fibroblastos de ratón a 20 h de infección con la misma cepa RH y a la mitad de la dosis que fue usada aquí; mientras que Kim y cols. (2006), no encontraron cambios en la expresión de este gen en esplenocitos de ratón a 30, 60 y 120 min post-infección, con la misma cepa y dosis que se usó en este trabajo, lo cual sugiere que las diferencias encontradas podrían deberse al tipo de célula huésped infectada o al tiempo de infección. Así mismo, se evaluó el papel del gen Survivina debido a que es miembro de la familia de proteínas inhibidoras de apoptosis (IAPs) que inhiben a las Caspasas 3, 7 y 9, por lo que tiene un papel importante en la prevención de la apoptosis. Ademas, debido a que en Cryptosporidium parvum, que también es miembro del phyllum Apicomplexa, como se verá más adelante, participa en la inhibición de la apoptosis. En este trabajo se encontró una disminución parcial en la expresión de Survivina (20%) entre las 4 y las 8 h post-infección, que se recuperó a medida que la infección progresó. En comparación con la evidencia reportada en la literatura, solamente existe un trabajo de Molestina y cols. (2003), quienes encontraron un incremento en la expresión de Survivina de 1.3 veces (no significativo) en una línea celular de fibroblastos de ratón a 20 h de infección, con la misma cepa utilizada en esta tesis pero a la mitad de la dosis. Por su parte, en la infección con Cryptosporidium parvum, en las células de intestino infectadas, la expresión de Survivina se incrementó 1.6 y 4.3 veces a las 24 y 48 h respectivamente, a una dosis 1:1. En estas células, la sobre-expresión de este gen provoca el bloqueo de la actividad de las Caspasas 3 y 7, resultando en la inhibición de la apoptosis en la célula infectada, promoviendo así la progresión de la infección y el desarrollo del parásito (Liu et al, 2009; 2008). Las diferencias entre estos tres modelos de infección (Liu et al, 2009; Molestina et al, 2003 y el presente) además de la dosis es el tiempo de evaluación. En este trabajo, la expresión de Survivina fue semejante al control no infectado a las 24 h; en los fibroblastos de ratón hubo un incremento de 1.3 veces, y en células intestinales infectadas por C. parvum de 1.6 veces. En este último modelo las principales diferencias se presentaron a las 48 h de infección, tiempo que ya no se valuó en la infección con T. gondii, por lo que se requieren más estudios para determinar el papel

de la Survivina en la apoptosis durante la infección por Toxoplasma, evaluando distintas dosis de parásitos o incrementando el tiempo post-infección. En relación a Ikbα se decidió evaluarlo debido a que es el represor del factor de transcripción NF-κβ que regula la transcripción de proteínas Bcl-2 e IAPs, teniendo por tanto un efecto pro-apoptótico. Además, debido a que tiene un papel importante en la infección con T. gondii, ya que este parásito tiene una cinasa (TgIKK) que fosforila al represor Ikbα permitiendo la translocación del NF-κβ al núcleo (Laliberté y Carruthers, 2008; Molestina y Sinai, 2005; Molestina et al, 2003). En el presente trabajo no se encontraron cambios en la expresión del gen Ikbα en los astrocitos infectados con T. gondii a ninguno de los tiempos evaluados, indicando que este gen no esta involucrado directamente en la apoptosis en estas células. En otros modelos se han encontrado algunas diferencias, mediante microarreglos se detectó un incremento de 2 veces en la expresión de este gen a las 2, 6 y 24 h de infección, en fibroblastos humanos infectados con la cepa PDS a la misma dosis que nosotros usamos (clona de ME49, Blader et al, 2001). Mientras que en fibroblastos de ratón su expresión se incrementó 2.5 veces a las 24 h con la cepa RH, con la mitad de la dosis (Molestina y Sinai, 2005). Al parecer en estos estudios, la cepa y la dosis de parásitos no está relacionada directamente con la magnitud de la respuesta, y las diferencias entre estos modelos y el presente probablemente se deba al tipo de célula huésped. Como se ha mencionó, la participación de los genes Bcl-2, Survivina e Ikb en la apoptosis de la célula huésped infectada con T. gondii, no ha sido estudiada en detalle. En la literatura reportada existe heterogeneidad en los resultados encontrados, en ningún trabajo se analizó la expresión de estos tres genes simultáneamente y no se han realizado cinéticas de expresión, más bien se evaluó uno o dos tiempos, el modelo de infección por elección fué fibroblastos murinos (Molestina y Sinai, 2005; Molestina et al, 2003; Blader et al, 2001) y un solo estudio en esplenocitos (Kim et al, 2006). Con excepción del trabajo de Blader y cols. (2001) que usaron la cepa PDS (tipo 2) los otros estudios emplean la cepa RH, obteniendo resultados similares. Tomando en consideración nuestros resultados y la evidencia en la literatura, al parecer los genes Survivina e Ikb no sufren cambios significativos durante la apoptosis en la infección con T. gondii, sugiriendo que no tienen un papel clave en este proceso; mientras que la expresión de Bcl-2 se modula dependiendo del tipo de célula y del tiempo de infección.

No obstante, para dilucidar el papel de estos genes en la regulación de la apoptosis durante la infección con el parásito, es necesario llevar a cabo estudios detallados en distintas etapas de la infección, con distintos tipos celulares y cepas de parásito, mediante el uso de estrategias más sensibles como el PCR en tiempo real. Así mismo, sería importante evaluar la participación de otros genes anti-apoptóticos como Mcl-1, Bcl-xl, Bcl-w, IAP1, IAP2 o pro-apoptóticos tales como Bad, Bak, Bax Bid, que podrían estar participando en la regulación de este proceso. Además de los genes mencionados, se analizaron dos proteínas con funciones clave durante el proceso de apoptosis: PARP-1 y Caspasa 3. PARP-1 es una enzima endógena (116 kDa) que se activa en respuesta a daño severo al DNA promoviendo la apoptosis; la Caspasa 3 y la Caspasa 7 reconocen una secuencia blanco en PARP-1 y la rompen en dos fragmentos (89 y 24 kDa), volviéndola inactiva (Sodhi et al, 2010; Krishnakumar y Kraus, 2010; Moroni, 2008). En el presente trabajo, la infección con T. gondii no provocó la fragmentación de PARP-1 durante las primeras 24 h de infección. Aparentemente, el parásito provocó una modulación parcial en la expresión total de esta proteína, ya que a tiempos cortos post-infección (<4h) su expresión se incrementó en relación al control no infectado, pero entre 6 y 24 h disminuyó. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas y sería necesario realizar un mayor número de réplicas para determinar el significado biológico del fenómeno. En los astrocitos tratados con Cisplatino, la expresión total de PARP-1 se incrementó considerablemente, y de manera significativa, indicando que el fármaco provocó daño al DNA, activando la maquinaria de reparación de la célula e indujo la sobre-expresión de ésta; y debido a que no fue posible compensar el daño la célula entró en apoptosis, ya que la mayor parte de la proteína (62%) se encontraba en forma fragmentada (89 kDa). De manera interesante, la infección previa con Toxoplasma durante 12 o 24 h previene la fragmentación de PARP-1 de manera parcial (20%) en los astrocitos retados con Cisplatino por 12 h después de la infección, resultados estadísticamente significativos, sugiriendo que el parásito protege a la célula huésped de la apoptosis, efecto observado inclusive en los astrocitos retados primero con el fármaco y después infectados, pero en menor proporción (6%). En este sentido, sería interesante evaluar tiempos más cortos de infección con el parásito o con el fármaco para evaluar este aparente efecto protector.

Tomando en consideración los resultados obtenidos en el presente trabajo sobre el papel de PARP-1 en la infección con Toxoplasma gondii y la escasa evidencia de la literatura, se aprecian diferencias entre los modelos de infección, en relación al tipo de cepa, tiempo post-infección, evaluación del fragmento de 116 o de 89 kDa, así como en el uso de fármacos o agentes inductores de apoptosis. Este es el primer trabajo que evalúa la expresión de la proteína en su forma endógena y fragmentada en una cinética durante las primeras 24 h de infección en astrocitos, y que además evalua el efecto del Cisplatino para inducir la fragmentación de esta proteína. En este sentido, con la cepa virulenta RH la evidencia es contradictoria: por un lado, la infección provocó cambios en la expresión de PARP-1 endógena (116 kDa) a las 20 h, con una dosis 3:1 en fibroblastos de ratón, y en concordancia con nuestros resultados, el parásito previno la fragmentación de esta proteína (89 kDa) en estas células retadas con Actinomicina D o TNFα + Cicloheximida (Payne et al, 2003). De manera opuesta, hubo disminución de la proteína endógena en células de bazo murinas infectadas con una dosis 10:1 y retadas simultáneamente con Actinomicina D a 1 y 2 hpi (Kim et al, 2006); sin embargo, los autores no evaluaron el fragmento de 89 kDa. Por su parte, con cepas no virulentas como la NTE, la evidencia es opuesta al efecto observado en los astrocitos, ya que T. gondii provocó una reducción significativa en el nivel de expresión de PARP-1 endógena en una línea celular murina de monocitos/macrófagos infectados a una dosis de 4:1, desde los 10 min post-infección, la cual se normalizó a medida que progresa la infección, casi alcanzando el nivel del control a las 24 h post-infección. El efecto fue dependiente de la concentración de parásitos, ya que a una dosis tres veces más alta, la inhibición fue del 90% a 1 h (Gais et al, 2008). No obstante, en este trabajo solamente identificaron la proteína PARP-1 endógena, no el fragmento de 89 kDa, y no evaluaron el efecto de los fármacos inductores de apoptosis. Así mismo, en células de leucemia y linfoma humano taquizoitos a una dosis de 30:1 inhibieron de manera significativa la expresión de PARP-1 endógena a las 8 h, pero no indujeron su fragmentación. Al igual que en el modelo actual de astrocitos tratados con Cisplatino, el parásito previno parcialmente la fragmentación de PARP-1 en las células tratadas con Actinomicina D o con TNFα y Cicloheximida, provocando la disminución en la expresión del fragmento de 89 kDa (Goebel et al, 2001). La evidencia anterior y los resultados presentados aquí, indican

que el tipo de célula huésped o la cepa (virulenta o no virulenta) determinan la inhibición o expresión de PARP-1, más que la dosis o el tiempo post-infección. Aún no es claro el papel que desempeña esta proteína en la infección con Toxoplasma, aparentemente no es una proteína determinante en el bloqueo de la apoptosis inducida por el parásito, pero deben llevarse a cabo más estudios para determinar su función. Por su parte la Caspasa 3 es una de las Caspasas ejecutoras más importantes, ya que la tanto la vía intrínseca y la extrínseca convergen en su activación. Está presente en forma de pro-Caspasa (35 kDa) y al activarse origina dos fragmentos (20 y 17 kDa); es responsable del rompimiento proteolítico de muchas proteínas incluyendo PARP-1 (Degterev et al, 2003; Fernandes-Alnemri et al, 1994). En los astrocitos, la infección con T. gondii no provocó la activación de Caspasa 3 durante las primeras 24 h de infección, ya que solamente se detectó el fragmento de 35 kDa. Estos resultados concuerdan con lo encontrado en diversos modelos de infección en células Hela, líneas celulares humanas de leucemia y linfoma, fibroblastos y esplenocitos de ratón, ya que la infección con cepas tipo I (RH) o tipo II (NTE) de T. gondii no indujo su activación; solamente se detectó la proteína de 35 kDa, con dosis desde 1:1 hasta 30:1, entre 18 y 24 h (Hwang et al, 2010; Hippe et al, 2008; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001). Además, en estos trabajos se encontró que el parásito previene el rompimiento de la pro-Caspasa 3 (35 kDa) cuando las células son infectadas y tratadas simultáneamente con un estímulo apoptótico con diversos agentes, como trióxido de arsénico, anti Fas/CD95, estaurosporina, TNFα+, Cicloheximida o Actinomicina D (Hwang et al, 2010; Hippe et al, 2008; Kim et al, 2006; Payne et al, 2003; Goebel et al, 2001). Aunado a lo anterior, resultó interesante que en las condiciones empleadas en el presente trabajo el Cisplatino tampoco indujo la fragmentación de Caspasa 3, pues solamente se detectó una disminución parcial (13%) en el fragmento de 35 kDa en relación al control no tratado, indicando que aunque mínimo, hubo procesamiento de esta Caspasa. Probablemente los astrocitos de ratón neonato son parcialmente resistentes al efecto citotóxico del Cisplatino, por lo que valdría la pena probar dosis más altas o mayor tiempo de exposición, o bien evaluar otros fármacos citotóxicos (Etoposido, Estaurosporina, Vincristina o Topotecan). En este sentido, la falta de asociación entre la fragmentación de PARP-1 ocurrida durante la apoptosis y la nula o mínima fragmentación de Caspasa 3 ha sido reportada

en células de mesotelioma pleural maligno humano, en las cuales el Cisplatino (40 M) induce la fragmentación PARP-1 (89 y 24 kDa) a las 24 h de tratamiento; sin embargo, la fragmentación de Caspasa 3 en estas mismas condiciones fue mínima (Janson et al, 2010). Así mismo, en neuronas de cerebelo de ratas de 8 días, aparentemente el mecanismo mediante el cual el Cisplatino induce apoptosis no involucra una fragmentación significativa de Caspasa 3 o de Caspasa 9, en comparación con otros fármacos como la Vincristina o el Topotecan, ya que la fragmentación inducida con el Cisplatino fue muy baja, sugiriendo que este fármaco mas bien estaría activando a otras Caspasas como la Caspasa 7 (Wick et al, 2004). Esta Caspasa, considerada también una de las más importantes ejecutoras, al igual que Caspasa 3, induce el rompimiento proteolítico de varias proteínas, incluyendo PARP-1 (Janson et al, 2010; Sodhi et al, 2010), por lo que sería interesante estudiar su participación en el proceso de apoptosis en astrocitos. Una de las características distintivas de la apoptosis es la formación de cuerpos apoptóticos formados por citoplasma u organelos empacados con fragmentos de núcleo. Se desarrolló un modelo para evaluar la apoptosis en los astrocitos de ratón neonato, que nos permitiera identificar estos cuerpos apoptóticos mediante microscopía de fluorescencia. De las estrategias utilizadas (eliminación de factores de crecimiento, luz UV y fármacos inductores de apoptosis como el Cisplatino, Resveratrol, MG132 o Cicloheximida), tanto el Cisplatino como la Cicloheximida indujeron apoptosis cuantificable por este método, pero se decidió utilizar el primero porque no provocó daño drástico en las células, en comparación con la Cicloheximida, y permitió la obtención de suficiente concentración de proteínas. Cabe mencionar que, no se encontró evidencia en la literatura del uso del Cisplatino como agente inductor de apoptosis en la infección con Toxoplasma, por lo probablemente este sería el primer trabajo en usarlo. El Cisplatino es uno de los agentes anti-cancerígenos más ampliamente utilizados, se une al DNA provocando entrecruzamientos DNA-proteína y DNA-DNA, ya sea entre guaninas adyacentes o entre guanina y adenina (intra-hebras), o bien el entrecruzamiento entre dos guaninas de hebras opuestas (entre-hebras), aunque todavía no se conoce cuál de éstos es el responsable de la citotoxicidad inducida por el Cisplatino. Se sabe sin embargo, que este fármaco provoca arresto de la célula en la

fase G2 del ciclo celular, antes de que entre en apoptosis (Köberle et al, 2010, Siddik, 2003). En el presente modelo, los astrocitos fueron parcialmente resistentes al efecto del Cisplatino, ya que altas dosis de este fármaco (80 μM por 24 h) indujeron la apoptosis de sólo el 55% de las células, mientras que en otros linajes celulares, como Hela o Vero, fue de 98% con la mitad de la dosis. Al parecer los astrocitos, son más resistentes al efecto citotóxico de los fármacos pro-apoptóticos; efecto que ha sido reportado al comparar astrocitos y neuronas de rata de 8 días de edad (Wick et al, 2004), en donde se encontró que el Cisplatino (100 M) indujo 100% de apoptosis a las 72 h de exposición en astrocitos. Así mismo, en células de Schwann humanas una dosis de 75 μM durante 24 indujo 65% de apoptosis, de manera muy similar a lo que encontramos en astrocitos de ratón neonato (Jirsova et al, 2006). Además, en astrocitos se han descrito genes de resistencia a los fármacos anti-neoplásicos como el Cisplatino y otros, algunos de los cuales codifican para enzimas involucradas en la reparación del DNA como la metilguanina-DNA metiltransferasa (MGMT), o bien otras de la familia de las glutatión transferasas involucradas en el metabolismo del glutatión, la conjugación de este último con el fármaco lo vuelve más soluble en agua y menos tóxico (Köberle et al, 2010; Nutt et al, 2000). Por su parte, los resultados de la fragmentación nuclear sugieren que T. gondii previene la apoptosis inducida por el Cisplatino, congruente con los datos obtenidos al analizar la fragmentación de PARP-1. Se sabe que este parásito previene la fragmentación del DNA en células de bazo de ratón, líneas celulares humanas de leucemia y linfoides infectadas con cepas tipo I (RH) y tipo II (NTE), evaluada mediante la extracción de DNA total, separación por electroforesis y tinción con bromuro de etidio (Hwang et al, 2010; Kim et al, 2006; Goebel et al, 2001). En el presente trabajo, la estrategia empleada para evaluar la fragmentación de núcleos se basó en un trabajo reportado con otro Apicomplexo, Cryptosporidium parvum, donde se evaluó el tamaño y la morfología del núcleo en respuesta a la infección en células de adenocarcinoma ileocecal humano (Liu et al, 2009). Por lo tanto, ésta es una estrategia factible, sencilla de realizar, rápida y más económica que la extracción de DNA total. Resultó interesante que la tinción con DAPI, además de identificar el núcleo de la célula huésped también detectó el núcleo de los taquizoitos intracelulares, por lo que esta estrategia también puede utilizarse para evaluar la replicación del parásito. Esta tinción permitió identificar

que el parásito se replicó en los astrocitos infectados a las 24 h, e inclusive en los astrocitos tratados primero con el fármaco y luego infectados, mientras que en la infección con el parásito y tratamiento simultáneo con el Cisplatino se aprecia invasión pero no replicación. Estas diferencias podrían deberse al hecho de que en las primeros dos esquemas, el Cisplatino se elimina del medio mediante lavados con solución salina, mientras que en el último permanece simultáneamente con el parásito, posiblemente resultando tóxico para éste. Es necesario llevar a cabo estudios más detallados para evaluar la viabilidad de los astrocitos y para determinar si el parásito puede invadir y replicarse en las células afectadas por el fármaco, aunque si se considera que solamente el 55% de los astrocitos presentan señales morfológicas de apoptosis, habría un 45% de células aparentemente viables, susceptibles a la invasión. La evidencia obtenida en este trabajo indica que la infección con T. gondii previene la apoptosis en los astrocitos, e incluso los protege del estímulo pro-apoptótico inducido por el Cisplatino. Sin embargo, la disminución transitoria en Bcl-2 y Survivina, así como el incremento parcial de PARP-1 durante las primeras 4 h post-infección, estaría indicando que la respuesta inicial de la célula al parásito es entrar en proceso de apoptosis para eliminar la infección, aunque el parásito contrarresta esta señal y manipula a la célula huésped, previniendo la apoptosis como una estrategia para garantizar su supervivencia y diseminación. Actualmente se conocen varios mecanismos mediante los cuales el parásito inhibe la apoptosis de la célula infectada, ya sea interfiriendo con vías de señalización que regulan la supervivencia celular (Fas/FasL, PI3K, ERK/MAPK y NF-κβ), inhibiendo a Caspasas iniciadoras (8 y 9) y Caspasas efectoras (3 y 7), bloqueando a PARP-1 o inhibiendo la liberación de Citocromo c de la mitocondria. También induce la expresión genes anti-apoptóticos (Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Bf1-1 y Mcl-1) e inhibe a genes pro- apoptóticos (Bad y Bax) o bien previene la fragmentación de DNA (Hwang et al, 2010; Angeloni et al, 2009; Begum-Haque et al, 2009; Hippe et al, 2009, 2008; Gais et al, 2008; Vutova et al, 2007; Kim et al, 2006; Carmen et al, 2006; Molestina et al, 2003; Molestina y Sinai, 2005, Payne et al, 2003; Schlüter et al, 2001; Goebel et al, 2001). Sin embargo, hasta el momento no se conoce en detalle de qué manera el parásito modula cada uno de estos eventos; o bien si proteínas específicas del parásito, además de la cinasa TgIKK que fosforila al represor Ikbα (Laliberté y Carruthers, 2008; Molestina y

Sinai, 2005; Molestina et al, 2003), están involucradas directamente en la inhibición de la apoptosis en la célula infectada. Por lo tanto, el estudio de la invasión y replicación de T. gondii, y su efecto sobre la apoptosis de los astrocitos en ratones neonatos, ya sea como modelo de infección congénita, o de encefalitis por Toxoplasma, aporta información sobre los eventos que permiten la permanencia de este parásito en el cerebro, y que provocan la generación de patologías severas en el SNC.

9. Conclusiones

1. Se estableció un modelo de infección de astrocitos de ratón neonato con taquizoitos de Toxoplasma gondii cepa RH in vitro. La invasión del 90% de las células ocurre a las 4 h, con un tiempo estimado de replicación similar a otras estirpes celulares, y culmina con la lisis de la célula infectada a partir de las 24 h post-infección.

2. Toxoplasma no induce cambios en la expresión del gen pro-apoptótico IkB , pero provoca una disminución parcial en la expresión de los genes anti-apoptóticos Bcl-2 y Survivina a tiempos cortos, la cual se recupera en el transcurso de la infección.

3. Toxoplasma no induce la fragmentación de PARP-1 durante las primeras 24 h de infección, más bien la previene parcialmente en los astrocitos retados con el Cisplatino.

4. T. gondii no provoca la fragmentación activa de Caspasa 3 durante 24 h de infeción.

5. La infección con el parásito no promueve la fragmentación nuclear en la célula huésped entre las 12 y 48 h de infección; más bien la previene en los astrocitos tratados con Cisplatino.

6. La infección con taquizoitos de Toxoplasma gondii no induce la apoptosis en los astrocitos de ratón neonato; por el contrario, previene la muerte celular inducida por un estímulo pro-apoptótico, favoreciendo su persistencia dentro de la célula huésped.

10. Perspectivas Derivadas de este trabajo hay actividades pendientes que reforzarían los resultados encontrados: a) Estandarizar las condiciones para inducir la fragmentación de Caspasa 3 con otro agente inductor de apoptosis (Etoposido o Estaurosporina) y evaluar su efecto en la infección con Toxoplasma. b) Evaluar la participación de Caspasa 7 en la apoptosis inducida por el Cisplatino en los astrocitos y durante la infección con Toxoplasma, para determinar su relación en la fragmentación de PARP-1. c) Incrementar el número de réplicas para evaluar el efecto de la infección sobre la expresión de los genes anti-apoptóticos Bcl-2 y Survivina, así como seleccionar otros genes blanco involucrados en la apoptosis (Mcl-1, Bcl-xl, Bcl-w, c-IAP1, c-IAP2, PUMA, Bad Bak, Bax Bid) para evaluar su participación en la infección. d) Incrementar el número de réplicas para evaluar el efecto de la infección en la fragmentación de núcleos evaluada mediante tinción con DAPI, y además, realizar la cuantificación mediante microscopia confocal. e) Emplear otras estrategias para medir apoptosis temprana, como Anexina V, que detecta los cambios iniciales en la membrana plasmática durante el proceso de apoptosis. f) Evaluar si el efecto observado es dependiente de la dosis de parásitos, en los ensayos de invasión, replicación y apoptosis. g) Realizar cinéticas para evaluar el tiempo mínimo necesario para que el parásito tenga un papel protector contra el reto pro-apoptótico del Cisplatino, ya que sólo se evaluaron 2 tiempos (12 y 24 h). h) Comparar los resultados obtenidos con la cepa virulenta RH con otra cepa de menor virulencia como la ME49, para determinar si existen diferencias en la velocidad de invasión y replicación, así como en la apoptosis.

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12. Apéndice 1. Medios de cultivo y soluciones.

A. Medios de cultivo y soluciones empleados para el cultivo celular 1. Medio de cultivo suplementado DMEM alta glucosa (catálogo 11995) con 10% de suero fetal bovino, glutamina 1 mM, vitaminas (MEM 100x, catálogo 11120) y antibiótico-antimicótico (penicilina 10,000 unidades, estreptomicina 10 mg y 25 µg de anfotericina B/ml, 100x, catálogo 15240), todos los reactivos marca Invitrogen.

2. Enzimas .Tripsina tipo III 1:250 de páncreas bovino al 0.05% en HBSS (catálogo T-4799, Sigma) . DNAsa tipo I al 0.05% en HBSS (catálogo DN25-1, Sigma)

3. Poli-D-lisina 5 mg/ml en agua bi-destilada estéril, se diluye a una concentración final de 50 µg/ml, se agrega a las cajas de cultivo entre 8 y 12 h previas para favorecer la adhesión celular. Antes de sembrar las células, se retira la solución y se hace un lavado con medio DMEM sin suero.

B. Soluciones y amortiguadores: 1. Solución salina de fosfatos (PBS), 10x 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2PO4, pH 7.4

2. Solución salina de Hank´s libre de calcio y magnesio (HBSS), 5x 5.4 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 0.25 mM Na2HP04, 13.4 mM glucosa

3. Amortiguador TAE (Tris-acetato-EDTA), 10x 400 mM Tris-acetato, 10 mM EDTA

4. Búfer RIPA 1% NP-40, 50 mM Tris- HCl pH 7.4, 150 mM NaCl,1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinina, 10 μg/ml de leupeptina, 10 µg/ml de pepstatina, 0.5% de deoxicolato de sodio, 0.5% de SDS (dodecil sulfato de sódio).

5. Bufer de muestra 40% glicerol, 240 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 5% β- mercaptoenatol y 0.04% azul de bromofenol.

6. Bufer de corrida 20 mM Tris base, 200mM glicina, 0.1% SDS

7. Bufer de transferencia 25 mM Tris base, 192 mM glicina, 20% metanol

8. Amortiguador TBS 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl

Cuadro 2. Secuencia y condiciones de amplificación de PCR de los genes utilizados para evaluar la infección y la apoptosis en los astrocitos infectados con Toxoplasma.

Gen Oligonucleótidos y condiciones Producto Referencia de amplificación (pb) G3PDH forward: 5´- CCTCGTCCCGTAGACAAAATG3´ 100 Donación reverse: TCTCCACTTTGCCACTGCAA personal, diseño 10 min 94oC, 30 ciclos (1.15 min, 95oC, 1 min con programa 60oC, 1 min 72oC), 15 min 72oC Primer Express V 3.0 Applied Biosystems

GFAP forward: 5´- CACGAACGAGTCCCTAGAGC-3´ 303 Suárez- glia reverse: CCTTCTGACACGGATTTGGT Rodríguez y 4 min 94oC, 35 ciclos (45 seg 94oC, 45 seg Belkind-Gerson, 55oC, 45 seg 72oC), 10 min 72oC 2004

B1 forward: 5´-CAGGAGTTGGATTTTGTAGA-3´ 362 Pujol-Riqué et al, Toxoplasma reverse: CTGCTGGTGCGACGGGAGTG 1999 3 min 95oC, 40 ciclos (30 seg 94oC, 1 min 55oC, 1 min 72oC), 10 min 72oC

Bcl-2 forward: 5´-GTCGCTACCGTCGTCACTTC-3´ 329 Wong et al, 2005 Anti- reverse: ACAGCCAGGAGAAATCAAAC apoptótico 10 min 94oC, 35 ciclos (1 min 95oC, 1 min 59oC, 1 min 72oC), 10 min 72oC

Survivina forward: 5´TCGCCACCTTCAAGAACTGGCCC 254 Amiri et al, 2009 Anti- TTCCTGGA-3´ apoptótico reverse:GTTTCAAGAATTCACTGACGGTTAG TTCTT 10 min 94oC, 35 ciclos (30 seg 94oC, 30 seg 55oC, 40 seg 72oC), 10 min 72oC

Ikbα forward: 5´-CCGTCCTGCAGGCCACCAACT 204 Wolfrung et al, Pro- ACA-3´ 2007 apoptótico reverse: TCAGCCCCACATTTCAACAAGAGC 10 min 94oC, 35 ciclos (1 min 94oC, 1 min 60oC, 1 min 72oC), 10 min 72oC

Cuadro 3. Reactivos empleados en la síntesis de cDNA y reacción de PCR.

Reacción de RT-PCR PCR

reactivo volumen de reactivo volumen de reacción µl reacción µl RNA 1 µg en 12 µl DNA 1 µg/µl de agua-DEPC Agua-DEPC 1.2 Agua estéril 18

Bufer 5x (catálogo 28025- 4.0 Bufer 10x (catálogo 2.5 013, Invitrogen) 10966034, Invitrogen)

Ditiotreitol (DTT) 0.1 M 1.0 Cloruro de Magnesio 1.7 (catálogo 28025-013) 2mM (catálogo 10966034, Invitrogen)

dNTP´s 2 mM (catálogo 0.4 dnTP´s 2 mM 0.5 18427013, Invitrogen)

Oligo dT 500 ng/µl 1.0 Oligo forward 0.5 (sintetizado IBT-UNAM) (sintetizado IBT- UNAM)

Transcriptasa reversa M- 0.4 Oligo reverse 0.5 MLV 80U (catálogo 28025- (sintetizado IBT-UNAM) 013, Invitrogen) Taq polimerasa 1U 0.2 (catálogo 10966034, Invitrogen)

Volumen total 20 Volumen total 25

13. Apéndice 2. Artículos generados del trabajo de investigación.

A. Artículo de resultados originales

Apoptosis in murine astrocytes is modulated by Toxoplasma gondii A someterse en: Experimental Parasitology

Carla O. Contreras-Ochoaa,b,c, Alfredo Lagunas-Martíneza, Jaime Belkind-Gersonb, Dolores Correac* a Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas. Instituto Nacional de Salud Pública. Av. Universidad no. 655, Colonia Santa María Ahuacatitlán, cerrada los Pinos y Caminera, Cuernavaca, Morelos, México CP 62100. E-mails: [email protected]; [email protected] b Laboratorio de Medicina Regenerativa. Centro de Investigación en Salud Poblacional. Instituto Nacional de Salud Pública. Av. Universidad no. 655, Colonia Santa Maria Ahuacatitlán, cerrada los Pinos y caminera, Cuernavaca, Morelos, México CP 62100. E-mail: [email protected] *c Corresponding author: Dolores Correa. Laboratorio de Inmunología Experimental. Instituto Nacional de Pediatría. 2º Piso. Torre de Investigación. Av. Insurgentes Sur 3700-C. Col. Insurgentes Cuicuilco. México DF, México CP 04530. Tel. 5255- 10840900 ext 1873 or 1860. Fax: 5255-10843883. E-mail: [email protected] Key words: toxoplasma, apoptosis, astrocyte

Introduction Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that is capable of invading and replicating in all nucleated cells including the central nervous system (CNS).In immunocompetent individuals, the presence of parasites does not result in clinical disease; however it is an important cause of abortions, since the parasite crosses the placenta and infects the fetus, resulting in neuronal damage. Infants with congenital toxoplasmosis may present hydrocephalus, microcephaly, intracranial calcifications, deafness, seizures, chorio-retinitis and mental retardation (1,2).Immunocompromised patients may develop toxoplasmic encephalitis due to a reactivation of the acute infection (3). The brain is composed of neurons and glia subsets (astrocytes, microglia and oligodendrocytes). Astrocytes are the most abundant cells, which shape the micro-architecture of the brain matter, express receptors and channels such as neurons as neurons, receive synaptic inputs and provide structural network, growth factors and lines of communication for neurons (4, 5). In vitro studies have demonstrated that T. gondii tachyzoites can invade neurons, astrocytes and microglia, but astrocytes have been shown to principally support their growth, as well as cyst formation, which ensure parasite persistence in the brain (6-9). Apoptosis or programmed cell death is a physiological response to cell damage caused by external or internal stimuli, which serves to limit intracellular growth of infectious agents (virus, bacteria or protozoan)(10, 11). However, these agents have evolved strategies to modulate host cell apoptosis, in order to evade immunity and enhance intracellular parasite survival. Toxoplasma gondii is able to alter the apoptotic program, promoting or inhibiting it, which depends on the infection stage (acute or chronic), strain virulence (type I or II), parasite dose and cell type (12-21). The information about the effect of T. gondii infection on apoptosis of CNS cells is scarce and inconclusive. In murine models, parasite infection causes a decrease in cell number and neuronal apoptosis (22). The apoptotic cell types have not been identified (13,22,23). Likewise, no clear difference between the appearance of apoptotic cells and the expression of the

apoptosis markers Bcl-2 and Bax, between infected and uninfected cells has been observed (13, 22, 23). Bcl-2 has anti-apoptotic function; it prevents the redistribution of the pro-apoptotic members of Bcl-2 family in the mitochondria and activation of caspases, inhibiting Cytochrome C release (24). The involvement of Bcl-2 in apoptosis during T. gondii infection is contradictory. Some studies have found no change in its mRNA or protein levels, whereas others have reported an increase (13, 14, 17, 18, 23, 26-28). Survivin is the smallest member of the inhibitory apoptosis proteins (IAPs) family that inhibits caspases 3, 7 and 9 (29, 30). Its role during Toxoplasma infection has not been evaluated in detail, although one report found no difference in it expression (28). The transcription factor NF-κβ regulates transcription of Bcl-2 and IAPs family proteins to induce cell survival. It is kept in the cytosol by repressor proteins called Iκβα, but if this inhibitor is phosphorylated by a kinase IKK, then NF-κβ translocates to the nucleus (11, 31). Toxoplasma has a kinase called TgIKK that phosphorylates Iκβα, allowing the translocation of NF-κβ subunits to the nucleus, which leads to the expression of anti-apoptotic genes (28, 32). Caspase 3 is a cysteine protease responsible for the proteolytic breaking of many cellular proteins during apoptosis; it also induces cytoskeletal disruption (33, 34). In non-neural cells T. gondii infection partially inhibits the activation of Caspase 3 and prevents it fragmentation (17- 21, 25, 27, 35). Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is a multifunctional nuclear protein. At low level of DNA damage it promotes cell survival, but with extensive DNA damage it induces cell death via apoptosis (36, 37). During the last phase of apoptosis, Caspase 3 and 7 cleave PARP-1 rendering it inactive, ensuing in this way DNA fragmentation (37). T. gondii infection down-regulates PARP-1 expression, depending on time post-infection and tachyzoite concentration (17, 18, 35). The study of T. gondii effect on apoptosis of astrocytes in neonatal mice as a model of congenital infection can give light on events leading to the generation of pathology in the CNS. In the present study, the effect of Toxoplasma infection on an astrocyte-enriched primary cell cultures from neonatal mice brain was evaluated. The expression of key molecules in the apoptosis process was assessed, including the anti-apoptotic (Bcl-2, Survivin and PARP-1) and pro-apoptotic (Ikbα and Caspase 3) genes. Also, the end of this phenomenon was analyzed by studying nuclear cell fragmentation.

Materials and methods 2.1. Astrocyte cultures Balb/c neonates were euthanized by decapitation following international ethics and biosafety guidelines, and the brain was dissected and put in sterile Hank´s solution under sterile conditions. Tissue disaggregation was achieved with 0.1% of trypsin and type I DNAse (Sigma, St. Louis Missuri, USA) in agitation for 10 minutes at 37oC. Fetal calf serum (FCS) was added to inhibit trypsin. Cells were then washed by centrifugation, and resuspended in DMEM medium supplemented with 10% FCS, 1 mM glutamine, MEM vitamins and antibiotic-antimycotic o (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cells were cultured at 37 C in 5% CO2/ 95% air, and at a density of 100,000 per 35 mm Petri dish or 10,000/well in Lab-Teck-8 well-plates (Nunc, Roskilde, Denmark) pre-treated overnight with 0.5 mg/mL poly-D-lysine (Sigma, St. Louis Missuri, USA). At day two of culture, debris was removed. After 8 days in culture a 98% astrocyte enriched population and 2% neurons, was obtained with an average density of 1x106 or 1x105 cells, respectively. Identification of the cell types was done by immunofluorescence with mouse polyclonal anti-GFAP (astrocyte specific marker), and mouse monoclonal anti-B tubulin III (neuron specific marker, both Millipore, Billerica, MA, USA) as described previously (38).

2.2. Toxoplasma gondii invasion of astrocytes Tachyzoites of the RH strain (virulent, type I) were cultured in Vero cells as host cells in DMEM medium supplemented with 5% FCS and antibiotic-antimycotic for 7 to 10 days, following spontaneous host cell rupture and pelleted by centrifugation. Astrocytes were incubated with

10:1 parasite:host cell ratio and followed for 0.5 to 24 h. Previous invasion assays showed that 90% of astrocytes were infected with the parasite at 4 hours post-infection (hpi, 39).

2.3. RT-PCR assays Total RNA was isolated using Trizol following the manufacturer instructions (Invitrogen). The RT-PCR reaction (cDNA synthesis) was carried out using 1 µg total RNA and M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with oligodT primer. PCR was done using the following primers: GFAP (astrocyte specific) forward: 5´-CACGAACGAGTCCCTAGAGC-3´, reverse: 5´-CCTTCTGACACGGATTTGGT-3´ (38), Bcl-2 (anti-apoptotic) forward: 5´- TCGCCACCTTCAAGAACTGGCCCTTCCTGGA-3´, reverse: 5´- GTTTCAAGAATTCACTGACGGTTAGTTCTT-3´ (40), Survivin (anti-apoptotic) forward: 5´- TCGCCACCTTCAAGAACTGGCCCTTCCTGGA-3´, reverse: 5´-GTTTCAAGAATTCACTGACGGTTAGTTCTT-3´ (41), Ikbα (pro-apoptotic) forward: 5´- CCGTCCTGCAGGCCACCAACTACA-3´, reverse: 5´-TCAGCCCCACATTTCAACAAGAGC-3´(42), G3PDH (constitutive gene) forward: 5´-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3´, reverse: 5´-TCTCCACTTTGCCACTGCAA-3´ (designed by Primer Express V3.0 software, Applied Biosystems). PCR products were resolved on 1.5% agarose gels stained with ethidium bromide. Gene expression signals at each time post-infection were densitometrically quantified on a Quantity One 4.6.8 imaging system (BioRad, Hercules, CA, USA) in arbitrary units (AU); the value of gene expression was normalized with G3PDH, and the value of infected cells was divided by that of the non-infected cells of the same incubation time; finally, the inhibition percentage was determined by subtracting that value to 100%.

2.4. Western blot analyses To obtain total cellular lysates, T. gondii-infected or uninfected controls glial cells were washed with buffer phosphate (PBS), pelleted and lysed in RIPA buffer (1% NP-40, 50 mM TRIS HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% SDS) supplemented with protease inhibitors (1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 10 µg/ml pepstatin). Proteins were separated by standard SDS-PAGE under reducing conditions and transferred to nitrocellulose membrane; nonspecific binding sites were blocked using 5% nonfat dry milk, 0.1% tween-20 in TBS buffer pH 7.6. Membranes were probed overnight at 4oC with anti PARP-1 or Caspase 3 (1:1,000, Cell Signaling) diluted in 5% nonfat dry milk, 0.1% tween-20 in TBS buffer. Immune complexes were labeled with anti-rabbit IgG-horseradish-peroxidase conjugate (1:10,000 Sigma-Aldrich) and visualized by SuperSignal West Pico chemiluminiscence (Thermo Scientific). Polyclonal mouse anti-actin (1:5,000, personal donation Dr.Manuel Hernández, CINVESTAV) in PBS was used as western blot loading and constitutive expression control. The drug Cisplatin (Sigma) 80 µM for 12 or 24h was used as positive control of apoptosis induction. Western blot films signals were densitometrically quantified on a Quantity One 4.6.8 imaging system (BioRad). The sum of the relative value in pixels of the PARP-1 116 kDa protein (endogenous) and the fragment of 89 kDa (resulting from apoptosis), was considered as 100% of protein expression. This value was normalized with the amount of actin for the same sample (PARP-1/actin x100). Likewise, the relative amount of pixels Caspase 3 was determined as above (Caspase 3/actin x100). For both proteins, the relative intensity of uninfected control-untreated cells was set as 100% expression.

2.5. Nuclear fragmentation Fragmentation of cell nuclei in response of T. gondii infection at 12 to 48 h, was evaluated by staining with DAPI. Cisplatin (24 h) was used as positive control of cell nucleus fragmentation by apoptosis. In another series, astrocytes were infected (24 h) and challenged with Cisplatin (24 h), or vice versa, or parasites and drug were added the simultaneously. After incubation, the cells were fixed in ethanol, washed with PBS and stained with DAPI; the number of apoptotic bodies per 100 cells we determined in a fluorescence microscope (Leyca DMLS).

2.6. Statistical analysis Data are the mean ± SD of three independent experiments each performed in triplicate. Statistical analysis was done by the Kruskal-Wallis test followed, when proper, by the Mann- Whitney-U test. A P<0.05 was considered significant.

3. Results 3.1. Gene expression modulation in response to Toxoplasma infection The expression of anti-apoptotic genes Bcl-2 and Survivin, and the pro-apoptotic Ikbα was evaluated by mRNA relative levels during the first 24 h of infection. Cisplatin (apoptosis positive control inductor) inhibited Bcl-2, Survivin and Ikbα expression in 55.5, 61.2% and 19%, respectively (Figure 1).The tachyzoites of T. gondii inhibited Bcl-2 expression (22%) from 4 hpi, but it was recovered as the infection progressed (13% at 24 hpi). Likewise, Survivin expression decreased (20%) between 4 and 8 hpi, reaching 3% inhibition at 24 hpi. However the parasite did not induce changes in Ikbα (0.2 to 0.6% inhibition, Figure 1).

3.2. Toxoplasma infection prevent PARP-1 fragmentation The effect of T. gondii infection on PARP-1 fragmentation was evaluated by a kinetic from 0.5 to 24 hpi. The inmunoblot densitometric analysis showed PARP-1 fragmentation in response to Cisplatin treatment (Figure 2 A and B). This drug increased the total expression of PARP-1 at 12 and 24 h (220% and 146% respectively), while in astrocytes infected at early times, (between 1 and 4 hpi). The total amount of PARP-1 was increased (12%) in comparison with uninfected control cells, and decreased (25%) between 6 and 24 hpi. The parasite did not induce PARP-1 fragmentation at any of the time evaluated, only between 1 and 4 hpi there was a slight fragmentation (8%) compared to the uninfected control (Figure 2 A and B). Moreover, even at long times of infection, the parasite seems to prevent its fragmentation. To further support this, uninfected astrocytes were treated with Cisplatin. At the two times studied, PARP-1 fragmentation was considerable (62%). However previous Toxoplasma infection for 12 or 24 h, partially inhibited (20%) PARP-1 fragmentation in astrocytes later challenged with Cisplatin for 12 h; while inhibition of fragmentation was lower (6%) in cells first challenged with the drug and then infected (Figure 2 A and C).

3.3 T. gondii does not induce changes in Caspase 3 fragmentation The inactive pro-caspase 3 is a zymogen of 35 kDa, once activated during apoptosis it fragment on two peptide (20 and 17 kDa on average). In mouse astrocytes treated with Cisplatin for 12 or 24, no signs of Caspase 3 fragmentation was showed although they showed morphological evidence of apoptosis (Figure 3). Total expression of this protein decreased (13%) compared to uninfected and untreated cells. Moreover, infection with T. gondii did not induce significant changes in the relative amount of this band as shown by densitometric analysis of inmunoblots (Figure 3).

3.4. Toxoplasma infection prevents cell nucleus fragmentation in response to an apoptotic stimulus. The final stages of apoptosis, nuclear fragmentation, and condensation of the cytoplasm, cause the formation of apoptotic bodies microscopically visible. Cisplatin treatment of astrocytes induced the formation of apoptotic bodies in 55% of the cell population Figure 4), whereas it was very low (2%) in untreated or not infected cells. The parasite infection did not induce nuclear fragmentation between 12 and 48 hpi (data not shown), but it prevented 46% of that induced by Cisplatin in astrocytes previously infected for 24 h. In spite of the cytotoxic effect of Cisplatin, the parasite was able to prevent apoptosis (14%) in astrocytes first challenged with the drug and then infected at the same time (20%, Figure 4).

8. Discussion The infection establishment of an obligate intracellular pathogen is a key event to ensure its transmission. Apoptosis or programmed cell death is a mechanism used by the host cell to "destroy itself" in order to reduce replication and spread of the pathogen (10, 43). However, parasites have developed a series of strategies that allow them to interfere with the process of apoptosis, and T. gondii is one of the most successful ones (31, 44). At present, there is controversy about the effect of Toxoplasma on apoptosis. It induces it in corneal keratinocytes, CD4+ and CD8+ lymphocytes, NK cells, spleen, eye and brain (12-15). In contrast, T. gondii inhibits apoptosis induced by various agents (gamma radiation, UV light, removal of growth factors or drugs such as actinomycin-D and staurosporine or TNF-α) in lymphoid cell lines as well as fibroblasts, splenocytes, macrophages and neutrophils (16-20). Experimental evidence suggests that Toxoplasma induces or prevents apoptosis depending on several factors including the stage of infection (acute or chronic), the parasite dose and strain (virulent or non-virulent) and the cell type infected. It is considered that the regulation of this process could be related to the immunopathogenesis of infection (15, 45). Currently there are several known mechanisms by which Toxoplama inhibits apoptosis, either by interfering with signaling pathways that regulate cell survival (Fas/FasL, PI3K, ERK/MAPK and NF-κβ), inhibiting the initiator (8 and 9) or effector (3 and 7) caspases, or inhibiting PARP-1 or Cytochrome C release from the mitochondria; it also induces anti-apoptotic (Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w , BF1-1 and Mcl-1) and inhibits pro-apoptotic (Bad and Bax) genes expression, or it prevents DNA fragmentation (14, 17-21,25-28, 32,35). Particularly, evidence of the effect of Toxoplasma infection on apoptosis of brain cells is limited. Tachyzoites of RH strain induced a decrease in neuron number, as well as apoptosis, but Bax expression (pro-apoptotic gene) was not detected (22). Also, in a murine model of congenital toxoplasmosis infected with ME49 strain (low virulence) there was a decrease in neuron number, and increased Bcl-2 expression from day 10 of gestation, while Bax was expressed from day 14 until day 18; however, there were no statistically significant differences between the expression of both genes and phenotype of apoptosis in cells was not identified (23). Likewise, the ME49 strain induced apoptosis in mouse brain cells, but the affected cell type was not specified, and there were no differences in Bcl-2 or Bax expression (13). Therefore, we evaluated the effect of T. gondii infection on apoptosis of a neonatal murine astrocyte enriched population, by analyzing the expression of genes and target proteins involved in this process. We evaluated Bcl-2 and Survivin (anti-apoptotic genes) and Ikbα (pro- apoptotic gene) at different times post-infection. Apparently, during the first hours post-infection the cell enters a transient pro-apoptotic state to eliminate the parasite. This was suggested by partial reduction in the Bcl-2 and Survivin expression. Subsequently, the tachyzoites control the anti-apoptotic machinery of the cell, and the expression of some of these genes is normalized at 12 hpi. Participation of Survivin and Ikbα have not been evaluated in detail in T. gondii infection, whereas Bcl-2 results are controversial. Molestina et al. (28), reported a non-significant increase in Survivin expression in mouse fibroblasts infected with the RH strain at 20 hpi with half the dose used here. This result matches with our data in astrocytes at 24hpi. Whereas in Cryptosporidium parvum, a member of the phylum Apicomplexa, Survivin incresed 1.6 and 4.3 times at 24 and 48 hpi respectively and blocks Caspases 3 and 7 activity, resulting in inhibition of apoptosis in the infected cell (48, 49). On the other hand Ikbα was not affected by Toxoplasma infection in astrocytes. By microarrays it was detected a 2-fold increase in Ikbα at 2, 6 and 24 hpi in human fibroblasts challenged with the PDS strain (49), whereas in mouse fibroblasts its expression increased 2.5-fold at 24 hpi with the RH strain (32). Conversely, Molestina et al. (28) reported a six-fold increase in Bcl-2 expression in mouse fibroblasts at 20 hpi with the same strain using half the dose used here. Kim et al. (18) found no changes in infected mouse splenocytes for 30, 60 and 120 min post-infection, with the same strain and dose used in this study, indicating that the differences could be due to the cell type infected. In the present study, T. gondii infection did not induce PARP-1 fragmentation during the

first 24 hpi. The parasite caused partial expression modulation of this protein (116 kDa), since at short times post-infection (<4 h) it increased in relation to the uninfected cells, but between 6 and 24 hpi it decreased. Also, in astrocytes Cisplatin treatment, significantly increased PARP-1 expression, indicating that the drug activates the cell repair machinery. Interestingly, previous infection with T. gondii for 12 or 24 h partially prevents PARP-1 fragmentation in astrocytes challenged with Cisplatin for 12h, indicating that the parasite protects the cell from apoptosis. Consistent with these results is the RH strain mediated prevention of PARP-1 fragmentation in mouse fibroblasts challenged with Actinomycin D or TNF+ cycloheximide (19). Also, there was a decrease of this endogenous protein in murine spleen cells simultaneously infected and challenged with Actinomycin D (18), whereas with the non virulent NTE strain there was a reduction of endogenous PARP-1 in a murine monocytes/macrophage cell line at short times post-infection, which is normalized as infection progresses; this effect was dose-dependent (35). Similarly, in human leukemia and lymphoma cells the parasite inhibited PARP-1 endogenous expression, but not only it did not induce its fragmentation, but partially prevented it in cells treated with Actinomycin D or TNF-α plus Cyclohexamide (17). This evidence indicates that the host cell or strain types determines PARP-1 expression, rather than the dose or time post- infection. It is yet unclear which role has this protein in Toxoplasma infection; apparently it is not determinant in blocking apoptosis, but further studies should be done to determine its function. Under the experimental conditions used here, T. gondii did not result in the activation of Caspase 3 during the first 24 hpi, which is consistent with results obtained with Hela cells, human leukemia and lymphoma cell lines, fibroblasts and mouse splenocytes, with either type I (RH) or type II (NTE) strains (17, 19, 20, 27). In this work an apoptosis model was developed using Cisplatin, one of the more commonly used anticancer drugs; it binds to DNA causing DNA-protein and DNA-DNA crosslinks (50). Astrocytes were partially resistant to Cisplatin, since high doses (80 µM for 24h) induced apoptosis only in 55% of the cells, while in other cell lines such as Hela or Vero, it is almost 100% with half the dose. Apparently, astrocytes, are more resistant to the effects of pro- apoptotic drugs; this could be related to its protective role in the brain (51-52). However the dose used here is similar that used in human Schwann cells for apoptosis induction, evaluated by nuclear fragmentation and chromatin condensation (53). One of the final hallmarks of apoptosis is the formation of apoptotic bodies, composed of packed cytoplasm, organelles and nucleus fragments. T. gondii prevents nuclear fragmentation induced by Cisplatin, consistent with data obtained analyzing PARP fragmentation and other models, since it prevents DNA fragmentation in mouse spleen cells, human leukemia cell lines and lymphoid cells infected with s type I (RH) and II (NTE) strains (17,18, 27). To our knowledge, this is the first study assessing the involvement of Bcl-2 Survivin and Ikbα genes during apoptosis in astrocytes. The evidence indicates that T. gondii infection prevents apoptosis in murine astrocytes, and even protects against the pro-apoptotic stimulus induced by Cisplatin. However, the transient decrease in Bcl-2 and Survivin, and the partial increase in endogenous PARP-1 during the first 4 hpi, would indicate that the cell early response against the parasite is to enter in apoptosis in order to eliminate it, although the parasite counteracts this signal and manipulates the host cell, preventing death as a strategy to ensure its survival and replication before dissemination. In conclusion Toxoplasma infection with RH strain does not induce apoptosis in astrocytes, and even it has a protective role against pro-apoptotic stimuli. The study of the invasion and replication of this parasite and its effect on apoptosis of astrocytes in neonatal mice as a model of congenital infection provides information about the events leading to the installation and permanence of the parasite in the CNS.

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Tpi (h) 24 4 6 8 12 18 24 T. gondii C - + - + - + - + - + - +

Bcl-2 Figure 1. Expression analysis of anti-apoptotic and pro-apoptotic genes in response to T. gondii Survivin infection in murine astrocytes. RT-PCR products Ikb of the Bcl-2 and Survivin (anti-apoptotic), IKB (pro-apoptotic) and G3PDH (constitutive) G3PDH genes in cells infected with Toxoplasma (+) and uninfected controls (-) at different times post-

B infection. Cisplatin treatment was used for 24 h as apoptosis inductor. Agarose gel (1.5%) stained with ethidium bromide shows a representative experiment (A). Mean (+SD) densitometry results of three independent experiments are shown in B. Variations were not statistically significant (p=0.2). Abbreviations: C: Cisplatin, Tpi: time post- infection.

Figure 2. Westen blot analysis of endogenous PARP-1 (116 kDa) and its

A Tpi (h) 0 0.5 1 2 3 4 6 12 24 fragmentation (89 kDa) in astrocytes infected

C12 C12 T24 + C12

C12 + T12 + C12

C24 T 24 +C12 24 T T. gondii - - - + + + + + + +C12 12 T for 30 minutes to 24 h. Endogenous actin PARP-1 endogenous 116 kDa was used as loading control. A fragmentent 89 representative experiment is shows in (A). actin 43 Densitometric analysis of total PARP-1 * protein content (116 +89 bands) and its

B 1 - fragmentation (relative proportion of 89 kDa and 116 bands) are shown in B and C. Bars amount represent the average of three independent

total experiments. Variation in the expression of Percent of of PercentPARP this protein at different times post-infection was not significant (p=0.23), but it was so * * between the control and Cisplatin (p=0.029),

C 1 1 - and between combinations of T. gondii and Cisplatin (p=0.05), indicated with*. Variation in PARP-1 fragmentation along time of

infection was not significant (p = 0.22), but it fragmentation fragmentation

Percent of of PercentPARP was so among treatments C12 vs T12+C12 (p=0.05) and C24 vs C12+T24 (p=0.05). Time post-infection (h) Abbreviations: C: Cisplatin, T: Toxoplasma, Tpi: time post-infection.

A Tpi (h) 0 0.5 1 2 3 4 6 12 24 C12 C24 T. gondii - + + + + + + + + - - Figure 3. Astrocyte Caspase-3 expression Caspase 3 35 kDa in response to Toxoplasma infection.

43 actin Westen blot of endogenous Caspase 3 protein (35 kDa) in astrocytes infected for 30 minutes to 24 h. Actin was used as

B loading control. A resentative experiment is shown in A. In B the densitometric analysis of three independent experiments is shown as average+SD. Variations of Caspase 3 along time post- infection were not significant (p=0.2) Abbreviations: C: Cisplatin; T: Toxoplasma, Tpi: time post-infection.

apoptotic bodies basal morphology A 100 Figure 4. Prevention of nuclear fragmentation 80 in astrocytes infected with T. gondii, as evaluated by apoptotic bodies’ formation 60 using the fluorescent dye DAPI (A). Representative images of nuclear morphology

percent 40 of astrocytes in the presence of different 20 treatments (B): T/C: infection with T. gondii for 24 h, washing the cells and incubation with 0 Con C T T/C C/T T+C cisplatin for 24 h more, C/T: Cisplatin treatment treatment for 24 h, washed and then infected with the parasite for 24 h, T+C: parasites and B simultaneous cisplatin for 24 h. Yellow arrows point to apoptotic bodies produced during the final stage induced by Cisplatin (24 h).The green arrows indicate tachyzoite nuclei. Magnification 40x. Results from an Con C T experiment performed in duplicate are shown in B. Abbreviations: Ctrl: control, C: Cisplatin, T: T. gondii.

T/C C/T T+C

Apéndice 2. Artículos generados del trabajo de investigación. B. Artículo de revisión

Toxoplasma gondii invasion and replication in astrocyte primary cultures and astrocytoma cell lines: systematic review of the literature Sometido en: Parasitology research

Carla O. Contreras-Ochoaa,b,c, Alfredo Lagunas-Martíneza, Jaime Belkind-Gersonb, Dolores Correac* a Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas. Instituto Nacional de Salud Pública. Av. Universidad no. 655, Colonia Santa María Ahuacatitlán, cerrada los Pinos y Caminera, Cuernavaca, Morelos, México CP 62100. b Laboratorio de Medicina Regenerativa. Centro de Investigación en Salud Poblacional. Instituto Nacional de Salud Pública. Av. Universidad no. 655, Colonia Santa Maria Ahuacatitlán, cerrada los Pinos y caminera, Cuernavaca, Morelos, México CP 62100. E-mail: [email protected] *,c Corresponding author: Dolores Correa. Laboratorio de Inmunología Experimental. Instituto Nacional de Pediatría. 2º Piso. Torre de Investigación. Av. Insurgentes Sur 3700-C. Col. Insurgentes Cuicuilco. México DF, México CP 04530. Tel. 5255- 10840900 ext 1873 or 1860. Fax: 5255-10843883. E-mail: [email protected]

Key words: Toxoplasma gondii, astrocyte, invasion, replication, systematic review

Abstract. Toxoplasma gondii is a cosmopolitan parasite which infects all homoeothermic species, including humans. This parasite may cause to severe neurological problems in congenitally infected newborns or immuncompromised individuals, but also psychiatric and neurological disorders in humans or behavioral coordination and sensory changes in rodents. There is controversy regarding the effect of T. gondii upon astrocytes, which main function is to provide physical and regulatory support to neurons, since they may serve as parasite proliferation recipients or protective immune response activators within the central nervous system. This controversy couls partially be due to the infection degree obtained in the different experiments reported; thus, we decided to systematically review the in vitro models used to study this phenomena and found 15 articles from which direct invasion and replication data could be gathered. A very heterogenous panorama emerged regarding strains (virulence), host species, parasite dose and and evalution times after infection; also, the results were heterogenously maesured, i.e. some reported percent infected cells, while others informed parasites per vacuole, or per cell, or parasitic vacuoles per cell. Very few conclusions could be drawn, among them that human astrocytoma cell lines and mouse astrocytes seem more susceptible to infection than human astrocyte primary cultures, although the later seem more resistant to tachyzoite proliferation. No article presented more than 50% of infected cells at any time; despite few that report immunological or cellular events in infected cells only or discriminate between and non-infected cells, most papers report data that cannot be used to ascertain wherther the observatios apply to infected or to non-infected cells.

Introduction Toxoplasma gondii is a cosmopolitan parasite which infects all homoeothermic species, including humans (Montoya and Liesenfeld 2004). This parasite may cause toxoplasmic encephalitis in immunocompromised adults, often being fatal (Carruthers and Suzuki 2007). It also produces mild to severe neurological problems in congenitally infected newborns, such as hydrocephalus, mental retardation, blindness and deafness (Jones et al. 2006). The infection is commonly subclinical in immunocompetent individuals, although it may cause psychiatric and neurological disorders in humans, as well as behavioral changes and coordination/sensory deficits in mice (Carruthers and Suzuki 2007; Gulinello et al. 2010; Hamidinejat et al. 2010; Vyas et al. 2007; Webster and McConkey 2010). This could be due to parasite-induced host cell death and thus to reduction of brain cell numbers (el-Sagaff et al. 2005; Shen et al. 2001; Takahashi et al. 2001).

As it is known, the central nervous system (CNS) is composed of neurons and glial cells (astrocytes, microglia and oligodendrocytes) of which astrocytes or astroglia -organized in networks- are the most abundant. They perform neuron support, nutrition and waste clearance functions. They also participate in intercellular communication, providing neurons with substrates, releasing "gliotransmitters" that stimulate or inhibit neurons and expressing voltage-dependent ion channels and neurotransmiter receptors (Giaume et al. 2007; Volterra and Meldolesi 2005). Toxoplasma gondii is capable of invading and replicating within all nucleated cells, including those of the CNS and modifies several signaling processes related to its intracellular control over cell cycle progression and apoptosis (Boyle and Radke 2009). It has been suggested that astrocytes have an important role in the control of the immune response against T. gondii within the CNS. For example, they activate and produce inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and TNFα) in response to in vitro infection (Fischer et al. 1997). Astroglial primary cultures and astrocytoma cell lines inhibit parasite replication when they are stimulated with IFN and other cytokines, in both nitric oxide dependent and independent mechanisms (Däubener et al. 1993, 1996; Halonen et al. 1998; Halonen and Weiss; Pelloux et al. 1996; Peterson et al. 1995). Moreover, they produce chemokines (IP-10, MCP-1) which recruit macrophages and lymphocytes to the brain and act as presenting cells which express co-stimulatory molecules (Brenier- Pinchart et al. 2004; Strack et al. 2002; Wilson and Hunter 2004). This evidence suggests astrocytes are able to eliminate the parasite, although their role as effector cells has yet to be established. Apparently in contradiction with the above mentioned phenomena, in vitro studies have demonstrated that neurons, and principally astrocytes, support tachyzoites proliferation and are lysed by them (Creuzet et al.1998; Fagard et al. 1999; Fischer et al. 1997b; Lüder et al. 1999). The explanation of this controversy may partially lay in variations among in vitro models used, including times of infection, cell type and host species, parasite strain and dose. Besides, many reports lack information on tachyzoite invasion/replication data to relate immunological or cellular events to the infection degree. Thus, we decided to perform a systematic review of the literature related to in vitro models of T. gondii invasion and replication within astrocytes, with the final aim to do a meta-analysis and gather some conclusions on parasite effect upon these cells.

Materials and methods Scientific publications related to in vitro T. gondii invasion or replication in astrocyte primary cultures or astrocytoma cell lines were searched in indexed journals between 1963 and 2011. Databases consulted were ARTEMISA, BIREME, COCHRANE, EBSCO, ISI WEB, LILACS, OVID, PUBMED, SCIELO, SCIENCE DIRECT and SCOPUS. Mesh terms were: [“Toxoplasma gondii” or “T. gondii” or “toxoplasmosis”] AND [“brain”, “nervous system”, “astrocyte”, “glia”, “astrocytoma”, “glioblastoma”, “neuron” or “microglia”] AND [“invasion” or “replication”] AND [“in vitro” or “culture”]. Language was not restricted, thus, Mesh-related titles in English, French, Spanish, Italian, German, Portuguese and Chinese were found. Two reviewers independently screened databases to identify potentially relevant studies. The full text of selected articles were obtained and reviewed by the same two reviewers. For inclusion in analysis, papers should contain concrete data of all independent variables and at least one dependent variable; these were: independent: host species, model (primary culture or cell line), T. gondii strain or type, parasite/host cell ratio and post-infection evaluation time; dependent: percent infected cells, number of parasites per infected cell, number of parasites per parasitophorous vacuole (PV) or number of PV per cell. From 15 articles that met the inclusion criteria, all available independent and dependent variables results were captured in an excel database. A number of studies presented frequency distributions of dependent variables; in these cases, the sum of the products of each value by its frequency was included in the database for comparison. Some articles presented ranges while others mean plus standard deviation; all were included in the database as published, using the median as central tendency measure, in the case of articles reporting ranges. In one case, the parasite/host cell ratio was inferred from the text, because the actual ratio was not stated (Halonen et al. 1996).

Analysis and statistics With only two exceptions, infection conditions were uniquely used in the articles found. Thus, no statistical procedure was possible and only qualitative analysis was performed.

Results The articles gathered in each step of the study selection process are shown in Figure 1. As it can be seen, from 289 articles potentially relevant 66 non-redundant references were finally selected to obtain full- texts. Forty five of these papers were directly related to the theme, but only 15 presented all independent variables and at least one dependent variable in a useful manner to include for analysis (Table 1). Four articles studied astrocytoma or glioblastoma cell lines of human origin (GHE, U373MG or 86HG39). Other twelve included results of experiments with astrocyte primary cultures from humans (n=4), C57BL16 or Balb/c mice (n=6), Wistar or Sprague-Dawley rats (n=3) or hamsters (n=1); while only one work compared primary and astrocytoma cultures of human origin and another did studies in three rodent species (Brenier-Pinchart et al. 2004; Creuzet et al. 1998; Däubener et al. 1993; Estran et al. 2006; Halonen et al. 1996, 1998; Halonen and Weiss 2000; Lüder et al. 1999, Martens et al. 2005; Melzer et al. 2008; Pelloux et al. 1994, 1996; Peterson et al. 1993, 1995; Troyo and Chinchilla 2003). Five different strains of the parasite were employed: two type I (RH and BK) and three type II (ME49 mainly, 76K and Prugniaud). The parasite/host cell ratio was from 0.2 to 20 and the evaluation time was from 1 to 50 hours. Each condition was used only in one or two papers published by the same group (for example Halonen et al. 1998 vs. Halonen and Weiss 2000 or Pelloux et al. 1994 vs. Pelloux et al. 1996). In spite of this, a qualitative analysis of Table 1 allowed to gather some information: a) astrocytoma cell lines seem more susceptible to T. gondii infection than human astrocytes at short times post-infection (i.e., one to three hours); b) infection time has a stronger effect than parasite dose: the RH strain at 6.6 parasite/host ratio infected 20% of cells one hour after infection, whereas the same strain at 1.0 ratio produced 32% infection at 3 hpi; c) type II strains (ME49 and Prugniaud) seem to be less invasive than type I (RH and BK); d) mice astrocytes appear more susceptible than those from humans, regardless of parasite strain type; e) percent infected cells at long times post-infection (between 24 and 50 h) was higher in cultures challenged with 6.6 RH parasites/cell (45%) than with 1.0 (21%); f) it also appears that this strain has a greater ability to replicate than the other type I strain, BK; g) a similar proportion of human astrocytes infected with ME49 tachyzoites at 25 h and 0.2 parasite/cell ratio and astrocytomas infected with 5 times the dose of the RH strain was noticed; h) opposed to what was observed for invasion, mouse astrocytes were less frequently infected than those from humans; i) a type I strain produced higher frequency of infected cells at 24 h post-infection (hpi) than the type II at 48 h in rat astroglia. Toxoplasma gondii replication was studied between 19 and 50 h after infection and it was evaluated by the number of PV/cell or the number of tachyzoites/infected cell or PV; only in two papers there were sufficient data to calculate the three variables (Creuzet et al. 1998; Peterson et al. 1993). Data obtained suggest that parasite dose is not related to replication degree, independently on host species. Considering the number of parasites per infected cell, mouse and hamster, followed by rat astrocytes, had higher values as compared to human cultures (2 to 4 times) with RH strain, although the dose of parasites was 4 times higher in the mouse model. In astrocytoma lines type I strains produced a higher number of parasites 24 hpi than type II ones, although with a greater dose. On average, there were five parasites per PV with type I strains at 24 hpi, regardless of the initial dose of parasite and the host cell species, whereas with type II parasites this values were 5.5 and 17.5 at 25 and 49 hpi, respectively; however, there were no data for type I strains at 48 hpi for comparison. Finally, at 24 hpi there were around four and 0.6 PV per infected cell with type I and II strains, respectively.

Discussion The patho-physiological mechanisms through which the parasite exerts its effect in the central nervous system isare unclear, but direct impact on the brain cell populations and changes in neuro-immuno modulation or neurotransmission have been suggested (Skallová et al. 2006). Studies using murine and human cells in vitro have suggested that tachyzoites invade neurons, astrocytes and microglia and form cysts within the former two, although astrocytes are infected more efficiently in vitro and in vivo, probably

because they are around 10 times larger than neurons or because they are biologically more permissive (Carruthers and Suzuki. 2007; Fagard et al. 1999; Fischer et al. 1997; Lüder et al. 1999). Nevertheless, astrocytes seem able to inhibit parasite replication and produce cytokines and chemokines, which attract macrophages and lymphocytes into the brain, so the role of these cells in T. gondii infection is unclear, and this could be due to differences in the invasion and replication models used. (Brenier-Pinchart et al. 2004; Däubener et al. 1993, 1996; Fischer et al. 1997; Halonen et al. 1998, Halonen and Weiss 2000; Pelloux et al. 1996; Peterson et al. 1995; Strack et al. 2002). For these reasons we aimed to compare infection and replication degrees attained within astrocytes using different in vitro models. To our surprise, the experimental approach was quite heterogenous, i.e. with very few exceptions, the conditions,a large heterogeneity was found, regarding infection times, strains, dose, etc. were used once. Also, there are significant variations among models regarding evaluation timedoses, host species and cell types. Furthermore some articles report percent of infected cells, while others present number of parasites per cell or per vacuole, and some others show the number of PV per cell. No article contains invasion or replication kinetics, although some of them present one result at short and at one long timestime of infection. Moreover, different techniques were used to asses either invasion or replication, including Giemsa stain, 3H-Uracil incorporation, Diff Quick or immunofluorescence (Brenier-Pinchart et al. 2004; Daubener et al. 1993; Estran et al. 2006; Halonen et al. 1996; Halonen and Weiss 2000; Martens et al. 2005; Pelloux et al. 1994; Peterson et al. 1993; Troyo and Chinchilla, 2003). It has to be emphasized that most data were calculated from either the text or the graphs, because direct data were not reported, so comparison was hardly reliable. Only four works compared invasion and replication among groups. In one work it seems that human astrocytes are more resistant to parasite invasion than astrocytomas of human origin, but that they are similarly permissive to replication (Brenier-Pinchart et al. 2004). In another work, Troyo and Chinchilla (2003) found a significantly larger susceptibility of astrocytes from hamsters than those from rats or mice to parasite replication, in spite of identical invasion at short times. Nevertheless, Creuzet et al (1998) found almost thrice the number of parasites per cell at 24 hours in rat astrocytes than Troyo and Chinchilla (2003) using the same strain (RH) and dose. The other two articles compared astrocytes with other brain cell types. Using human cells Halonen et al. (1996) found that astrocytes are more permissive to replication of a type II strain (ME49) than neurons, while both cells from rats equally support invasion and multiplication of another type II strain (NTE). In conclusion, kinetic studies are needed to determine invasion and replication capacity of different T. gondii strains within astrocytes -and other cell types- of different host species before any conclusion about infection effect upon infected and neighboring cells can be drawn.

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289 Articles scanned by two authors in 11databases: ARTEMISA, BIREME, COCHRANE, EBSCO, ISI WEB, LILACS,OVID, PUBMED, SCIELO, SCIENCE DIRECT, SCOPUS Figure 1. Flow chart of the scientific literature reviewed

66 Unique citations 233 Citations excluded

45 Text articles directly related to topic 21Articles not included

15 Included for analysis

Table 1. Toxoplasma gondii invasión and replication in astrocytoma/glioblastoma or astrocyte primary cultures

Invasion Replication Parasite Parasite/ Evaluation Percent VP VP Cell type Host Strain Parasites Parasites Parasites References type cell ratio time (h) infected per per per cell per cell per VP cells cell cell 3 3 Brenier- Pinchart 24 5 et al. 2004 Pelloux et al. 1 24 18a 1a 1996 RH 1 10 I Astrocitoma/ 24 25 5 Pelloux et al. Human Glioblastoma 7a 1 20 1994

24 45

3 22 Däubener et BK 1.5 33b 12 19 al. 1993

1 24 Pelloux et al. II 76K 7a 2 1994

3 18 Brenier- 1 Pinchart 24 7 I RH et al. 2004 Peterson et 5 19c 6 al. 1995 Astrocytes Human a 1 3 5 Estrán et al. PRU 48 1a 2006

II a c 0.2 25 24 6 Halonen et ME49 49c 18 al. 1996

a 1 40 Peterson et 20a 21c 25a 5a 6a al. 1993

I RH 1 1e Troyo & 1 Chinchilla e 24 4 2003

2 14 1 Halonen and 24 13 4 Weiss, 2000 Mouse 50d 11a

Halonen et al. Astrocytes 50d 33 5 1998 II ME49 2 1e 1

Martens et al. 10d 1e 1 2005 26d 1e 6

Melzer et al. 8a 2 1e 2008 Creuzet et al. 1 24 46 14a 3a 4a 1998 I RH 1 1 1e Troyo y Rat Chinchilla 24 5e 2003 Lüder et al. II NTE 0.5 48 10 2a 1999 1 1 1e Troyo & Hamster I RH Chinchilla 24 18e 2003

a Calculated from data given in the text or tables; b, c & d: times include tachyzoite pulse of 3, 1 & 2 h, respectively; e Calculated from paper´