Lymantria Dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) in Tunisia: Present Knowledge and Research Outlook M

Home , Lackey moth, R Leonis

IOBC / WPRS

Working group “ Integrated Protection in Oak Forests ”

OILB / SROP

Groupe de travail “ Protection Intégrée des Forêts de Chênes ”

Proceedings of the meeting

Comptes rendus de la réunion

at/à

Oeiras - Lisbonne (Portugal)

1-4 octobre 2001

Edited by C. Villemant & E. Sousa

IOBC wprs Bulletin Bulletin OILB srop Vol. 25 (5), 2002

The IOBC/WPRS Bulletin is published by the International Organization for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants, West Palearctic Regional Section (IOBC/WPRS)

Le Bulletin OILB/SROP est publié par l‘Organisation Internationale de Lutte Biologique et Intégrée contre les Animaux et les Plantes Nuisibles, section Regionale Ouest Paléarctique (OILB/SROP)

The Publication Commission of the IOBC/WPRS:

Horst Bathon Luc Tirry Federal Biological Research Center University of Gent for Agriculture and Forestry (BBA) Laboratory of Agrozoology Institute for Biological Control Department of Crop Protection Heinrichstr. 243 Coupure Links 653 D-64287 Darmstadt (Germany) B-9000 Gent (Belgium) Tel +49 6151 407-225, Fax +49 6151 407-290 Tel +32-9-2646152, Fax +32-9-2646239 e-mail: [email protected] e-mail: luc.tirry@ rug.ac.be

Address General Secretariat:

INRA – Centre de Recherches de Dijon Laboratoire de recherches sur la Flore Pathogène dans le Sol 17, Rue Sully, BV 1540 F-21034 DIJON CEDEX France

ISBN 92-9067-142-2 Web: http://iobc-wprs.org

Sponsors of the Meeting

IOBC / WPRS OILB / SROP

iii

Introduction

The gradual modifications of the environment and forest characteristics, which influence the species diversity; the structure and the density of stands; the tree dimensions and the ground configuration, may at any moment induce an increase or decrease of the general susceptibility of tree stands to the attack of biotic agents. The unusually wide decline phenomena observed in the forests stands since the 80’s was combined with a general increasing incidence of various adverse biotic agents. In Europe and North Africa, this decline particularly affected the Quercus spp. forests. In these forests, many research works were undertaken in order to evaluate their current decline situation and better recognize the inducing factors and their complex interactions. The aim of the study group “ Integrated protection in oak forests” founded in 1993 was to promote contacts between European and North African scientists involved in oak decline research in order to encourage the application of collective management strategies and the elaboration of common research programs. During the first meeting of the group which was held in Sardinia in September 1994 1, the participants emphasized the generalised worsening of the sanitary conditions of Mediterranean cork-oak forests and the necessity to ensure an efficient integrated protection in order to warrant a better conservation of this natural resource. The second meeting was held in Morocco, in October 1998 2, with the aim of increasing the involvement of the North African scientists in group activities. The meeting aimed to assess the current health status of oak forests and present the results of recent works. The importance of the topic, the group vitality and the distinct increase in the number of group members since the first meeting, incited the IOBC Srop General Assembly, which was held in Switzerland in September 2001, to suggest the upgrading of the group to a working group status. The third meeting of the group was organized in Portugal by the National Forestry Station (National Institute of Agricultural Research). It was attended by scientists from seven countries (Algeria, France, Italy, Morocco, Portugal, Spain, Tunisia) representatives of Portuguese research and local institutions as well as students from the National Forestry Station and the Lisbon University. The aim of the meeting was to carry on the periodic evaluation of the current situation of oak decline but also to reinforce contact between research teams from the different countries. The main resolution of the meeting was to outline a joint action strategy – with the help of cooperation conventions and common research programs – in order to standardize the methodological study approach of the entity “environment-tree-biotic agents”. The manifestation held, from 1 to 4 October in the National Agronomic Station in Oeiras, included more than eighty participants, scientists and students working mainly on the integrated protection of Mediterranean oak forests. Seventeen oral communications and twenty posters were presented during the 6 sessions, concerning the health status of oak forests and the involved decline factors; the biology and impact of phytopathogenous fungi; the biology and impact of insects pests; natural enemies and biological and integrated control, forest management.

1 Luciano P. ed., 1995. Integrated protection in cork-oak forests. IOBC/wprs Bulletin, 18 (6), 114 pp. 2 Villemant C. ed., 1999. Integrated protection in oak forests. IOBC/wprs Bulletin, 22 (3), 198 pp. iv

During the meeting, Edmundo Sousa, scientist of the National Forestry Station in Oeiras, was unanimously elected as deputy convenor of the working group by the IOBC member participants.

A guided excursion was organised on the last day of the meeting in the de Herdade dos Leitões oak forest. Scientists, forest technicians and oak stand owners were interested in sylvicultural management and the most phytosanitary problems of the cork oak forests.

Special thanks are due to the Agriculture State Secretary of Portugal, the President of the National Agronomic Station of Lisbon, the Director of the National Forestry Station of Oeiras, the Director of the National Forest Direction of Lisbon, the Director of the National Agronomic Station of Oeiras, as well as the Mayor of Oeiras We are also grateful to all the staff of the National Forestry Station of Oeiras for their role in the organization of the meeting. Their enthusiasm and willigness made the manifestation a success as well as the students who welcomed the participants. Thanks are also due to Mme Palczewski for corrections of the manuscripts in English.

Claire Villemant Convenor of the working group

Edmundo Sousa Deputy convenor v

Introduction

Les modifications progressives de l’environnement et des caractéristiques de la forêt, en intervenant sur la diversité des espèces, la structure et la densité des peuplements, les dimensions des arbres et la morphologie du terrain, peuvent à chaque instant augmenter ou diminuer la susceptibilité globale d’un peuplement à l’attaque des agents biotiques. Des phénomènes d’une ampleur inhabituelle de déclin des massifs forestiers ont étés observés à partir des années 80 en même temps qu’une augmentation générale de l’incidence de divers agents biotiques. En Europe et en Amérique du Nord, ce phénomène a touché particulièrement les forêts de Quercus spp. De nombreux travaux ont été entrepris dans le but d’effectuer un bilan de cette situation, et de mieux connaître les facteurs associés à ce déclin ainsi que leurs nombreuses et complexes interactions.

En 1993 a été fondé au sein de l’OILB, le groupe d´étude « Protection intégrée des forêts de chênes » dont le but était de favoriser l’échange des connaissances entre chercheurs d‘Europe et d’Afrique du Nord afin de faciliter la mise en œuvre de règles de gestion forestière et des projets de recherche communs. Durant le premier meeting du groupe, qui a eu lieu en Sardaigne en 19941, les participants ont insisté tout particulièrement sur la gravité du dépérissement des peuplements de chênes- lièges en région méditerranéenne et sur la nécessité d’assurer une protection intégrée de la subéraie afin de garantir une meilleure conservation de cette importante richesse naturelle.

Le deuxième meeting du groupe a eu lieu en 1998 au Maroc2 dans le but de favoriser une plus forte implication des chercheurs des pays du Maghreb dans les activités du groupe. Cette rencontre a été l’occasion d’un nouveau bilan de l’état phytosanitaire des forêts de chênes et d’une présentation des résultats des travaux de recherches les plus récents. L’importance du sujet, la dynamique du groupe et l’accroissement notable du nombre de ces membres a conduit l’assemblée générale de l’OILB Srop, réunie en Suisse en septembre 2001, à proposer la transformation de ce groupe d’étude en groupe de travail.

Le troisième meeting du groupe a eu lieu au Portugal, sous le patronage de la Station Forestière Nationale (Institut National de la Recherche Agronomique). Il a rassemblé les chercheurs de sept pays (Algérie, Espagne, France, Italie, Maroc, Portugal et Tunisie) ainsi que des représentants des institutions scientifiques et locales portugaises et les étudiants de Station Forestière Nationale et de l’Université de Lisbonne. L’objectif de la rencontre était de poursuivre les bilans périodiques concernant l’état sanitaire des forêts de chênes mais aussi de renforcer les contacts entre les équipes de recherche des différents pays. Le point fort de cette réunion a été l’élaboration d’un projet d’action conjointe, sous la forme de protocoles de coopération et de projets de recherche communs, de façon à uniformiser les méthodes d’étude de l’entité « environment-arbre-agents biotiques ».

1 Luciano, P. ed. 1995 : Integrated Protection in Cork-Oak Forests. IOBC/wprs Bulletin 18(6), 114 pp. 2 Villemant, C. ed. 1998 : Integrated Protection in Cork-Oak Forests. IOBC/wprs Bulletin 22(3), 198 pp. vi

La manifestation a réuni du 1 au 4 octobre, à Oeiras, dans les locaux de la Station Agronomique Nationale, plus de 80 personnes, chercheurs et étudiants, travaillent pour la plupart dans le domaine la protection intégrée des forêts de chênes en région méditerranéenne. Dix-sept communications et vingt posters ont été présentés au cours de 6 sessions concernant : l’état phytosanitaire des forêts de chênes en région méditerranéenne ; les facteurs de dépérissement ; la biologie et l’impact des champignons pathogènes ; la biologie et l’impact des insectes xylophages ; les ennemis naturels et la lutte biologique et intégrée ; l’aménagement forestier.

A l’occasion de cette réunion, à l’unanimité des participants membres de l’OILB/srop, Edmundo Sousa a été élu vice responsable de ce groupe de travail.

Le dernier jour du meeting a été consacré à une excursion dans la subéraie de Herdade dos Leitões. Excursion au cours de laquelle, chercheurs, techniciens et propriétaires forestiers se sont intéresséss à la gestion sylvicole de la forêt et ont discutés des problèmes phytosanitaires les plus importants. La journée s’est terminée par la visite d’une usine de transformation du liège (SuberCentro Cortiças Ldª) considéré comme la plus moderne d’Europe.

Nous tenons à remercier tout particulièrement le Secrétariat d’État de l’Agriculture au Portugal, le Président de l’Institut National de la Recherche Agronomique de Lisbonne, le directeur de la Station Forestière Nationale d’Oeiras, le Directeur de la Direction Générale des Forêts de Lisbonne, le Directeur de la Station Agronomique Nationale d’Oeiras et le président de la Mairie d’Oeiras. Par la cordialité de leur accueil et leur aide logistique et financière, ils ont contribué de façon décisive à la réussite de cette manifestation. Nous remercions également vivement toute l’équipe de la Station de recherche forestière d’Oeiras qui s’est impliquée avec beaucoup d’enthousiasme et de bonne volonté dans l’organisation de ce meeting ainsi que tous les étudiants qui ont assuré l’accueil des participants et contribué à la bonne marche de la manifestation. Un grand merci enfin à Mme Palczewski pour la relecture de tous les textes anglais de ce bulletin.

Claire Villemant Responsable du groupe

Edmundo Sousa Vice responsable vii

List of participants

AGTAY Fatima Ecole Normale Supérieure de Casablanca, Département de Biologie, BP 9172. Mers Sultan-Casablanca, MOROCCO fax : 212 22 80 11 05 [email protected]

ARDIZZONI Marco Alma Mater Studiorum University of Bologna, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA). Via Filippo Re 8, I-40126 Bologna, ITALY 39 79 67 15 43 [email protected]

ARNALDO Paula Seixas Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Departamento de Protecção de Plantas, Apartado 202. P-5001-911 Vila Real Codex, PORTUGAL fax : 351 25 935 04 80 [email protected]

ATAY-KADIRI Zineb Faculté des Sciences de Rabat, Département de Biologie. BP 1014. 10050 Rabat-Agdal, MOROCCO fax: 212 37 77 54 61 [email protected]

BARROS Maria da Conceição Direcção Geral das Florestas, Av. João Crisóstomo, 26-28, P-1069-040 Lisboa PORTUGAL fax : 351 21 312 48 96 [email protected]

BASTO Sofia Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

BEN JAMAÂ Mohamed Institut National de Recherches en Génie Rural, Eaux et Forêts, BP 10. 2080 Ariana-Tunis, TUNISIA fax : 216 1 717 951 [email protected]

BONIFÁCIO Luis Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

BOUHRAOUA Rachid Institut de Foresterie, Faculté des Sciences, Université de Tlemcen, BP 119, RP, 13000 Imama-Tlemcen, ALGERIA fax : 213 43 21 18 06 [email protected]

BRAGANÇA Helena Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

BRANCO Carmen Instituto Superior de Agronomia, Departamento de Engenharia Florestal, Tapada da Ajuda ; P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL fax : 351 213 645 000 viii

BRANCO Manuela Instituto Superior de Agronomia, Departamento de Engenharia Florestal, Tapada da Ajuda ; P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL fax : 351 213 645 000 [email protected]

BRIGAGLIA Nadia Regione Autonoma della Sardegna, Corpo Forestale e di Vigilanza Ambientale, Servicio Ispettorato Ripartimentale delle Foreste. Tempio Pausania (SS) Viale Kennedy,1. I-07029, Tempio Pausania (Sassari), Italy fax : 39 79 67 15 43 [email protected]

CAETANO Filomena Instituto Superior de Agronomia, Departamento de Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL [email protected]

CASIMIRO Pedro Piloto Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

CERBONESCHI Anna Stazione Sperimentale del Sughero. Via Limbara 9. I-07029 Tempio Pausania, ITALY fax : 39 79 67 1113 [email protected]

CHAKALI Gahdab Institut National Agronomique, Entomologie Agricole et Forestière, Département de Zoologie Agricole. El Harrach- Alger, ALGERIA [email protected]

CID FERREIRA Luis Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

CORDA Piero Departimento Protezione delle Piante, Istituto di Patologia Vegetale, Università di Sassari, Sezione di Patologia vegetale, Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax: 39 79 22 93 16 [email protected]

COTS Fermin IVIA, Carretera Moncada-Náquera km 4.5, Moncada E-46113 Valencia, SPAIN fax : 34 96 139 02 40 [email protected]

DI PILLO Luciana Alma Mater Studiorum University of Bologna, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA). Via Filippo Re 8, I-40126 Bologna, ITALY 39 79 67 15 43 [email protected]

ELEUTÉRIO Pedro Miguel Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

FRANCESCHINI Antonio Departimento Protezione delle Piante, , Universitá Sassari. Sezione di Patologia vegetale, Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax : 39 79 22 93 16 [email protected] ix

FERREIRA Maria Corinta Av. Ernest Solvay nº 5 1º B. P-2625-168 Póvoa de Santa Iría, PORTUGAL

FERREIRA Paula Teixeira Instituto Superior de Agronomia, Departamento de Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL 351 96 289 67 05 [email protected]

FONSECA Nominanda Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

GASPAR Clara Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

GUILLON Michel Calliope/Natural Plant Protection SA. POBox 80, Route d'Artix, F-64150 Noguères, FRANCE fax : 33 5 59 60 92 19 [email protected]

INÁCIO Maria Lurdes Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

HINAREJOS Concha IVIA, Carretera Moncada-Náquera km 4.5, Moncada E-46113-Valencia, SPAIN fax : 34 96 139 02 40 [email protected]

KHALDI Habdelhamid Institut National de Recherches en Génie Rural, Eaux et forêts, Unité de Gestion et de valorisation des Ressources Forestières, BP 346. 1082 Tunis-Mahrajène, TUNISIA [email protected]

LAPEÑA Blasco Inmaculada IVIA, Carretera Moncada-Náquera km 4.5, Moncada E-46113-Valencia, SPAIN fax : 34 96 139 02 40 [email protected]

LENTINI Andrea Departimento Protezione delle Piante, Universitá Sassari, Sezione Entomologia agraria, Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax: 39 79 22 93 29 [email protected]

LOPES Francisco Jacinto Direcção Regional de Agricultura do Alentejo. Quinta da Matagueira, Apartado83. P-7001 Évora Codex, PORTUGAL fax : 351 20 663 31 87

LOPES Sónia Instituto Superior de Agronomia, Departamento de Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL [email protected] x

LINALDEDDU Benedetto Departimento Protezione delle Piante, Universitá Sassari, Sezione di Patologia vegetale, Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax : 39 79 22 93 16 [email protected]

LUCIANO Pietro Departimento Protezione delle Piante, Universitá Sassari, Sezione Entomologia agraria Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax : 39 79 22 93 29 [email protected]

MACHADO Helena Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

MADDAU Lucia Departimento Protezione delle Piante, Universitá Sassari, Sezione di Patologia vegetale, Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax : 39 79 22 93 16 [email protected]

MARRAS Francesco Departimento Protezione delle Piante, Universitá Sassari, Sezione di Patologia vegetale, Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax : 39 79 22 93 16 [email protected]

MATEUS Filomena Direcção Geral das Florestas, Av. João Crisóstomo, 26-28, P-1069-040 Lisboa, PORTUGAL fax : 351 21 312 49 87 [email protected]

MERALI Zara Instituto Superior de Agronomia, Dep. Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL

MEROUANI Hachemi Instituto Superior de Agronomia, Dep. Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL fax : 351 21 364 50 00 [email protected]

MIRA Vidal Jose Luis IVIA, Carretera Moncada-Náquera km 4.5, Moncada E-46113-Valencia, SPAIN fax : 34 96 139 02 40 [email protected]

MONIZ Fátima Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

MONTEIRO Luis Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

MOREIRA Cristina Estação Agronomica Nacional, Quinta do Marquês. P-2780 Oeiras, PORTUGAL [email protected] xi

MOREIRA Mónica Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

NAVES Pedro Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

NIPOTI Paola Dipartimento di Scienze e Tecnologie, Università degli Studi di Bologna. via Filippo Re, 8, I-40126 Bologna, Italy fax: 39 05 12 09 14 45 [email protected]

OLIVEIRA João Instituto Superior de Agronomia, Dep. Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL [email protected]

PITÉ Marina Casa do Lago, Rua Moinho do gato, Várzea de Sintra, P-2710 Sintra, PORTUGAL [email protected]

PRIETO Miguel SPCAN-DGCN, Gran Via de san Francisco, 4. 3a pl. E-28005 Madrid, SPAIN fax : 34 91 597 55 65 [email protected]

RAMOS Paula Instituto Superior de Agronomia, Dep. Protecção de Plantas, Tapada da Ajuda, P-1349-017 Lisboa, PORTUGAL fax : 351 21 364 50 00 [email protected]

RODRIGUES José Manuel Direcção Geral das Florestas, Av. João Crisóstomo, 26-28, P-1069-040-Lisboa, PORTUGAL fax : 213124987 [email protected]

RUIU PINO Angelo Stazione Sperimentale del Sughero. Via Limbara 9. I-07029 Tempio Pausania, ITALY fax : 39 79 67 11 13 [email protected]

SABATINI Peverieri Dipartimento di Biotecnologie Agrarie - Università degli Studi di Firenze. Dipartimento di Biotecnologie Agrarie, Sezione Entomologia Agraria, Piazzale delle Cascine 28, I-50144 Firenze [email protected]

SANCHES Pena Gerardo SPCAN-DGCN. Gran Via San Francisco, 4. E-28005, Madrid, SPAIN fax : 34 91 347 63 02 [email protected]

SANTOS Maria de Lurdes Estação Florestal Nacional, Tapada das Necessidades, R. do Borja nº 2. P-1350-051 Lisboa, PORTUGAL fax : 351 21 397 31 63 [email protected]

SANTOS Maria Natércia Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected] xii

SECHI Clizia Stazione Sperimentale del Sughero. Via Limbara 9. I-07029 Tempio Pausania, ITALY fax: 39 79 67 11 13 [email protected]

SERRA Giuseppe Departimento Protezione delle Piante, Universitá Sassari, Sezione Entomologia agraria. Via E. De Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax: 39 79 22 93 16 [email protected]

SERRÃO Miguel Secretaria de Estado da Agricultura, Pç. Comércio, P-1149-010 Lisboa, PORTUGAL [email protected]

SOUSA Edmundo Departamento de Protecçao Florestal, Estaçao Florestal National, Quinta do Marques. P-2780 Oeiras, PORTUGAL fax : 351 21 441 87 82 [email protected]

TUSET Juano J. IVIA, Carretera Moncada-Náquera km 4.5, Moncada E-46113 Valencia, SPAIN fax : 34 96 139 02 40 [email protected]

VERDINELLI Marcello Istituto di Ricerca sul Controllo Biologico dell’Ambiente, CNR; c/o Dip. di Protezione delle Piante, Sezione Entomologia agraria, Via E. de Nicola 9. I-07100 Sassari, ITALY fax: 39 79 22 93 16 [email protected]

VILLEMANT Claire Muséum National d’Histoire Naturelle, ESA 8043 CNRS, Laboratoire d’Entomologie. 45 rue Buffon. F-75005 Paris, FRANCE fax: 33 1 40 79 36 99 [email protected] xiii

Contents

Minutes of the IOBC Working Group Meeting “ Integrated protection in oak forests ” held at Oeiras-Lisbon, Portugal, October 1-4, 2002.

Introduction ...... iii

List of participants...... vii

The main regions of cork oak decline in Portugal M. C. Barros, F. Mateus, J. M. G. Rodrigues...... 1 Further researches on the distribution of declining cork oak stands in Sardinia (Italy) C. Sechi, P. A. Ruiu, A. Franceschini, P. Corda...... 5 Current situation of oak decline in Italy and in other European countries A. Ragazzi, S. Moricca, I. Dellavalle ...... 13 Methodological approaches to outline control strategies of cork oak decline in Sardinia (Italy) A. Franceschini, L. Maddau, S. Serra, M. A. Pulina ...... 17 A three-year survey of oak decline in Modena (Italy) M. Ardizzoni, P. Nipoti, G. Amorelli, S. Gennari ...... 21 Fungi involved in oak decline in an urban area M. Ardizzoni, P. Nipoti, L. Di Pillo, M. G. Fantino...... 25 Endophytic incidence of fungi involved in the cork oak decline A. Franceschini, L. Maddau, F. Marras ...... 29 Molecular characterisation of Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze strains isolated from declining trees of Quercus suber L. in Sardinia A. Schiaffino, A. Franceschini, L. Maddau, S. Serra ...... 37 Distribution de Phytophthora cinnamomi dans les subéraies du Portugal C. Moreira...... 41 Distribution of the isolations of Phytophthora cinnamomi in the Spanish Quercus areas with oak decline disease J. J. Tuset, C. Hinarejos, J.J. Mira, J.M. Cobos ...... 49 Influence of culture water-solution of five species of Mediterranean Quercus in the asexual reproduction of Phytophthora cinnamomi F. Cots, J. J. Tuset...... 53 Influence of electrical conductivity due to nitrogen on Phytophthora infection in seedlings of Quercus rotundifolia I. Lapeña, J. J. Tuset ...... 57 Ectomycorhizian symbiosis of cork oak in Portuguese stands: current situation and future prospects H. Machado, M. N. Santos ...... 61 Insects and fungi involved in oak decline in Italy R. Tiberi, A Ragazzi, L. Marianelli, P. G. Sabbatini, P. F. Roversi ...... 67 Bioecological characteristics of Platypus cylindrus in Portugal E. M. R. de Sousa, D. Debouzie ...... 75 xiv

Health status of cork oak forests in western Algeria: impact of xylophagous insects R. T. Bouhraoua, C. Villemant, M. A. Khelil, S. Bouchaour...... 85 Insects pests of the oaks Quercus suber and Q. ilex in Algeria G. Chakali, A. Attal-Bedreddine, H Ouzani...... 93 The gypsy moth (Lymantria dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) in Tunisia: present knowledge and research outlook M. Lahbib Ben Jamâa, S. M’nara, C. Villemant, A. Khaldi ...... 101 Damage evolution and control of Lymantria dispar L. in a cork oak forest of southern Portugal M. Serrão...... 109 Control of gypsy moth by Bacillus thuringiensis kurstaki 3a-3b and problems induced by larval migration J.-C. Martin, C. Villemant, R. Mazet ...... 115 Sublethal effects on Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Lymantriidae) caused by treatment with Bacillus thuringiensis var. kurstaki A. Cerboneschi ...... 123 EAG responses to sex pheromone of Lymantria dispar L. males treated with Bacillus thuringiensis kurstaki A. Cerboneschi, R. Crnjar, A. Liscia, C. Masala, P. Solari...... 131 Observations on the lepidopterous fauna associated to the cork oak after a treatment with Bacillus thuringiensis kurstaki A. Cerboneschi, P. A. Ruiu...... 135 Effect of Melia azedarach L. (Meliaceae) extract on Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Lymantriidae) developement and reproduction Z. Atay-Kadiri, A. Semlali, N. Benhsain, C. Villemant ...... 139 Laboratory and field performance of in vitro and in vivo-reared Exorista larvarum (L.), a natural enemy of cork oak defoliators M. L. Dindo, M. Verdinelli, P. Baronio, G. Serra...... 147 Frequency distribution of Malacosoma neustria (L.) egg masses and nests in cork oak forests M. Verdinelli, P. Luciano, G. Serra ...... 151 Spatial distribution and sampling of Tortrix viridana L. egg-clusters G. Serra, P. Luciano, A. Lentini, G. Gilioli ...... 155 Gall inducing insects associated with oak trees (Quercus spp.) in Portugal M. L. I., P. Naves, M. Moreira, E. M. Sousa...... 159 Effect of insect predation on the quality and storage conditions of acorns of cork oak (Quercus suber L.) M. Branco, C. Branco, H. Merouani, M. H. Almeida...... 163 Importance of the temporary pools associated with the cork oak forest in the Zaërs region (Morocco) F. Agtay...... 169

Conclusions and recommendations...... 175

Table des matières

Comptes-rendus du meeting du groupe de travail “ Protection intégrée des forêts de chênes ” tenu à Oeiras-Lisbonne, Portugal, du 1 au 4 octobre 2001.

Introduction ...... iii

Liste des participants...... vii

Les principales régions de dépérissement du chêne-liège au Portugal M. C. Barros, F. Mateus, J. M. G. Rodrigues...... 1 Nouvelles recherches sur l’extension des phénomènes de dépérissement dans les subéraies de Sardaigne C. Sechi, P. A. Ruiu, A. Franceschini, P. Corda...... 5 Approches méthologiques pour l’élaboration d’une stratégie de lutte contre le dépérissement du chêne-liège en Sardaigne A. Franceschini, L. Maddau, S. Serra, M. A. Pulina ...... 13 Etat actuel du dépérissement des chênes en Italie et dans les autres pays européens A. Ragazzi, S. Moricca, I. Dellavalle ...... 17 Trois années de suivi du dépérissement des chênes à Modène (Italie) M. Ardizzoni, P. Nipoti, G. Amorelli, S. Gennari ...... 21 Les champignons impliqués dans le dépérissement des chênes en zone urbaine M Ardizzoni, P. Nipoti, L. Di Pillo, M. G. Fantino...... 25 Incidence endophytique de champignons impliqués dans le dépérissement du chêne- liège A. Franceschini, L. Maddau, F. Marras ...... 29 Caractérisation moléculaire de souches de Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze isolées de chênes-lièges (Quercus suber L.) dépérissants en Italie A. Schiaffino, A. Franceschini, L. Maddau, S. Serra ...... 37 Distribution de Phytophthora cinnamomi dans les subéraies du Portugal C. Moreira...... 41 Distribution d’isolats de Phytophthora cinnamomi dans des chênaies dépérissantes en Espagne J. J. Tuset, C. Hinarejos, J.J. Mira, J.M. Cobos ...... 49 Influence de la culture en solution aqueuse de cinq espèces de Quercus méditerranéens sur la reproduction asexuée de Phytophthora cinnamomi F. Cots, J. J. Tuset...... 53 Influence de l’électro-conductivité de l’azote sur l’infection des jeunes plants de Quercus rotundifolia par Phytophthora I. Lapeña, J. J. Tuset ...... 57 La symbiose ectomycorhizienne du chêne-liège dans les plantations portugaises : synthèse des connaissances et perspectives H. Machado, M. N. Santos ...... 61 Insectes et champignons impliqués dans le dépérissement du chêne en Italie R. Tiberi, A Ragazzi, L. Marianelli, P. G. Sabbatini, P. F. Roversi ...... 67 xvi

Caractéristiques bioécologiques de Platypus cylindrus au Portugal E. M. R. de Sousa, D. Debouzie ...... 75 Situation sanitaire de quelques subéraies de l’Ouest algérien : Impact des xylophages R. T. Bouhraoua, C. Villemant, M. A. Khelil, S. Bouchaour...... 85 Les insectes ravageurs des chênes, Quercus suber et Q. ilex, en Algérie G. Chakali, A. Attal-Bedreddine, H Ouzani...... 93 Lymantria dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) en Tunisie : état actuel des connaissances et perspectives de recherche M. Lahbib Ben Jamâa, S. M’nara, C. Villemant, A. Khaldi ...... 101 Evolution des dégâts et lutte contre Lymantria dispar L. dans les subéraies du sud du Portugal M. Serrão...... 109 Utilisation de Bacillus thuringiensis kurstaki 3a-3b dans la lutte contre le bombyx disparate et problèmes posés par les migrations de chenilles J.-C. Martin, C. Villemant, R. Mazet ...... 115 Effets sublétaux de Bacillus thuringiensis var. kurstaki sur le développement du Lépidoptère Lymantria dispar (L.) infecté à différents stades larvaires A. Cerboneschi ...... 123 Réponse EAG à la phéromone sexuelle de mâles de Lymantria dispar L. traités au Bacillus thuringiensis kurstaki A. Cerboneschi, R. Crnjar, A. Liscia, C. Masala, P. Solari...... 131 Observations sur la faune des Lépidoptères du chêne-liège après un traitement au Bacillus thuringiensis kurstaki A. Cerboneschi, P. A. Ruiu...... 135 Action de l’extrait de Melia azedarach (Meliaceae) sur le développement et la reproduction de Lymantria dispar (L.) (Lepidoptera, Lymantriidae) Z. Atay-Kadiri, A. Semlali, N. Benhsain, C. Villemant ...... 139 Impact au laboratoire et dans les conditions naturelles d’Exorista larvarum (L.), ennemi naturel des défoliateurs du chêne multiplié par élevage in vitro et in vivo M. L. Dindo, M. Verdinelli, P. Baronio, G. Serra...... 147 Distribution des pontes et des nids de Malacosoma neustria (L.) dans les subéraies M. Verdinelli, P. Luciano, G. Serra ...... 151 Distribution spatiale et méthode d’échantillonage des pontes de Tortrix viridana L. G. Serra, P. Luciano, A. Lentini, G. Gilioli ...... 155 Les insects gallicoles des chênes (Quercus spp.) au Portugal M. L. I., P. Naves, M. Moreira, E. M. Sousa...... 159 Influence des dégâts d’insectes sur la qualité et les conditions de stockage des glands de chêne-liège (Quercus suber L.) M. Branco, C. Branco, H. Merouani, M. H. Almeida...... 163 Importance des milieux aquatiques temporaires associés à la subéraie des Zaërs (Maroc) F. Agtay...... 169

Conclusions et recommandations...... 175 Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 1-4

The main regions of cork oak decline in Portugal

Maria da Conceição Barros, Filomena Mateus, José Manuel Gomes Rodrigues Direcção-Geral das Florestas, av. João Crisóstomo 26/28-Lisboa, Portugal

Abstract : Based on permits issued to cut dead or very damaged trees of Q. suber, this work presents the regions where, since 1991, a trend on vitality loss has been noted. The hypothesis of a relation between the presence of podzolic soils and the loss of oak vitality is taken under consideration. Special care should be taken with regard to the human intervention in those zones at tree level or in undercover areas, using the well known conservative technical rules for branch cutting, cork removing, soil mobilisation and cattle breeding

Keys words : map, oak decline, podzolic soils, Portugal

Introduction

Through specific protection legislation of Quercus. suber L. and Q. ilex L., the General Direction of Forest - Direcção Geral das Florestas - has been the competent authority to issue the necessary permits to cut individual trees of these species. Data concerning the permits issued has been collected since 1932, although using a computer database only after 1991 (Direcção-Geral das Florestas, 1932-2000). This work, based on permits issued to cut dead or very damaged trees of Q. suber, aims to show the regions where, since 1991, the trend on vitality loss has been noted (Barros et al., 2000). It does not provide an overall picture of the situation in the whole country because not all landowners remove dead or dying trees and some do it without applying for a permit. But they are a small minority, therefore our data may be representative of the real situation in Portugal.

Results

For this particular study, we only considered the cases where the intensity of removals was 4 or more trees per ha. Table 1 and figures 1 to 3 show the area, number of trees and ratio trees/ha, that were obtained from 1991 to 2000.

Table 1. Cuts of dead or very damaged trees (more than 4 trees/ha), from 1991 to 2000

Number of trees Year Area (ha) Young Adult Total of trees Trees/ha 1991 148.60 44 1524 1568 10.55 1992 6630.70 794 40371 41165 6.21 1993 3731.61 1208 22844 24052 6.45 1994 1784.23 26 10763 10789 6.05 1995 3437.10 0 20976 20976 6.10 1996 3372.35 195 32162 32357 9.59 1997 3872.85 699 25963 26662 6.88 1998 5257.69 4560 30168 34728 6.61 1999 2437.70 3486 12071 15557 6.38 2000 7251.13 2510 40181 42691 5.89

1 2

45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000

Number of trees 10000 5000 0 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 TOTAL TREES

Figure 1. Total of trees removed from 1991 to 2000

8000 7000 6000 5000 4000

Area (ha) 3000 2000 1000 0 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

AREA(HA)

Figure 2. Area where cuts of dead or very damaged trees (more than 4/ha) occurred, from 1991 to 2000

Trees/ha 4

0 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

TREE/HA

Figure 3. Average number of cut trees /ha from 1991 to 2000

The maps presented (figs. 4, 5), show the administrative regions (Freguesias) where those more intense removals occurred from 1991 to 2000 ; they analyse not only the intensity but also the total area concerned. We also clipped the areas with podzolic soils (fig. 5), with the annual recurrence of cuts in order to see if any correlation seems to exist..

Annual Recurrence 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figure 4. Number of years where the cuts of Figure 5. Number of years where the cuts of more than 4 trees/ha occurred more than 4 trees/ha occurred on podzolic soils in Portugal

Discussion and conclusion

The map showing the annual recurrence confirms the empirical knowledge concerning the zones where mortality is more frequent. In those zones, plots to monitor and identify the causes and to test methodologies to recover the ecosystem, should be installed. The loss of vitality and the presence of podzolic soils seems to be related (Pereira et al., 1999). However, from now on, special care should be taken with regard to the human

intervention in those zones at tree level or in undercover areas, using the well known conservative technical rules for branch cutting, cork removing, soil mobilisation and cattle breeding

References

Direcção-Geral das Florestas 1932-2000 : Arquivo referente às autorizações de corte e/ou arranque de sobreiros. Barros, M. C., Rodrigues, J. M., Dores, P. 2000 : Identificação e quantificação de áreas de montado de sobro mais afectadas por mortalidade. Congresso Mundial do Sobreiro e da Cortiça, 19/21 July, Lisboa, Portugal. Pereira, J. S., Barros, M. C., Rodrigues, J. M. 1999 : As causas da mortalidade do sobreiro revisitadas. Revista Florestal 12 (1/2) : 20 - 23

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 5-12

Nouvelles recherches sur l’extension des phénomènes de dépérissement dans les subéraies de Sardaigne

Clizia Sechi 1, Pino Angelo Ruiu 1, Antonio Franceschini 2, Piero Corda 2 1 Stazione Sperimentale del Sughero, Via Limbara 9, 07029 Tempio Pausania (SS), Italia. 2 Dipartimento di Protezione delle Piante – Università degli Studi di Sassari Via E. De Nicola, 9 – 07100 SASSARI (Italy)

Résumé : Les phénomènes de "dépérissement" du chêne liège sont apparus en Sardaigne aux débuts des années 90. Ils se sont manifestés en premier dans les subéraies où les effets négatifs de périodes prolongées de sécheresse se sont ajoutés à des conditions édaphiques peu favorables, un état végétatif précaire et une sylviculture inadéquate. Au cours de la décennie qui a suivi, ces phénomènes se sont progressivement étendus, atteignant même les subéraies aménagées de façon rationnelle. Les recherches entreprises au cours des 4 dernières années ont permis de repérer 60 subéraies en cours de dépérissement réparties dans les principales régions subéricoles de la Sardaigne. Les forêts de chêne- liège les plus affectées sont situées entre 200 et 400 m, sur des sols d’origine granitique, en terrain plat ou sur des versants exposés au sud-ouest. Leurs peuplements, purs et de même âge, ont une régénération naturelle insuffisante ou nulle ; ils sont fortement pâturés et sujets à des infestations répétées de lépidoptères défoliateurs. Les résultats de notre étude seront utilisés pour sélectionner des placettes expérimentales qui reflètent la totalité des subéraies sardes, ce qui permettrait d’une part de créer un réseau régional de surveillance des phénomènes de “dépérissement” et d’autre part d’assurer la mise en œuvre d’éventuelles stratégies d’intervention.

Mots clés : Quercus suber, chêne liège, dépérissement, Sardaigne

Introduction

Les phénomènes de “dépérissement” du chêne liège représentent de nos jours un sérieux problème qui menace la survie de cette importante ressource forestière que sont les subéraies dans tous les pays qui en possèdent. En Sardaigne ces phénomènes se sont manifestés dès les années 90 et ont concerné tout d’abord les subéraies caractérisées par des conditions édaphiques peu favorables, un état végétatif précaire et une gestion sylvicole inappropriée (Marras et al, 1995). Pendant la décennie suivante, soumise à des périodes prolongées de sécheresse, ces phénomènes se sont étendus progressivement à toutes les principales régions subéricoles de l’île, atteignant aussi les subéraies aménagées de façon rationnelle. C’est pourquoi, dès 1998, des recherches ont été entreprises dans le but de vérifier d’une part l’étendue de la diffusion de ces phénomènes à l’intérieur de l’île et de relever d’autre part les caractéristiques stationnelles, climatiques, forestières, phytosanitaires et sylvicoles des subéraies atteintes par le dépérissement. Les résultats préliminaires obtenus au cours des deux premières années de recherches ont été publiés dans un précédent travail (Franceschini et al., 2001). Dans les 48 régions subéricoles recensées, on a recherché quels étaient les types de peuplement de chêne-liège les plus concernés par le phénomène de dépérissement. Le présent travail résume brièvement l’état d’avancée du dépérissement au cours de ces deux dernières années et analyse l’ensemble des données recueillies au cours des 4 années d’observation.

5 6

Matériel et méthodes

Au cours des prospections périodiques effectuées dans les principales régions subéricoles de Sardaigne, on a sélectionné les subéraies dont les arbres présentaient des symptômes de dépérissement : éclaircissement de la canopée, exudats, nécroses et chancres sur les branches et sur le tronc, gourmands. Dans chaque site on a examiné au moins 100 arbres parmi lesquels on a noté le nombre d’individus présentant ces symptômes et le nombre de morts. En fonction du pourcentage de chênes-lièges montrant des signes de dépérissement, les subéraies ont été groupées en 4 classes : classe 1 (moins de 10% d’arbres atteints), classe 2 (11 à 25%), classe 3 (26 à 60%), classe 4 (plus de 60%). Les subéraies des différentes classes ont ensuite été comparées en fonction de leur état phytosanitaire, de leurs caractéristiques stationnelles (localisation géographique, nature du substrat, exposition et altitude) et sylvicoles (typologie et structure du peuplement, présence de sous-bois, régénération naturelle, pâturage). On a également pris en considération la présence éventuelle de lépidoptères défoliateurs et la périodicité de leurs infestations dans les régions concernées (Del Rio et al., 1982).

Résultats et discussion

Les recherches conduites pendant les deux dernières années ont aboutit à la mise en évidence de 12 autres subéraies présentant aussi des symptômes de dépérissement. Certaines d’entre elles sont localisées dans des régions où le dépérissement est manifeste, d’autres ont été repérées dans des régions où l’extension actuelle du dépérissement n’a pas encore été signalée. Ainsi, sur l’ensemble de la région, on a répertorié jusqu’ici un ensemble de 60 subéraies présentant des symptômes de dépérissement (fig. 1). La moitié d’entre elles environ est dans une situation de dégradation plutôt avancée : 25% fait partie de la 4e classe de dépérissement, 21,7% de la 3e, 3 5% de la 2e et 18,3% de la première. En analysant de plus près l’état sanitaire des subéraies en fonction de leur classe de dépérissement (tab. 1), on constate que dans la majorité d’entre elles les arbres présentent des symptômes d’éclaircissement de la canopée, des exsudats, des chancres et des nécroses sur les troncs et les branches; on remarque aussi que des arbres morts ont été repérés dans 65% des sites examinés. L’examen de l’ensemble de ces données montre que, d’une classe de dépérissement à l’autre, la fréquence de chaque symptôme augmente en même temps qu’augmente le nombre des subéraies qui présentent l’ensemble des symptômes , mettant ainsi en évidence l’extension progressive des symptômes considérés.

Tableau 1. Pourcentage de subéraies concernées par les différents facteurs de dépérissement en fonction de la classe de dépérissement.

Classe de dépérissement Symptômes Total 1 2 3 4 Éclaircissement canopée 81,7 36,4 81,0 100,0 100,0 Exsudats 80,0 45,5 71,4 100,0 100,0 Chancres et nécroses 88,3 54,5 90,5 100,0 100,0 Gourmands 60,0 9,1 38,1 92,3 100,0 arbres morts 65,0 27,3 38,1 100,0 100,0

Figure 1. Distribution en Sardaigne des subéraies présentant des symptômes de dépérissement

L’étude du substrat montre que plus de la moitié (53,3%) des subéraies dépérissantes et plus de 66,7% des subéraies appartenant à la classe de dépérissement supérieure poussent sur des terrains granitiques (tab. 2). Ce résultat était toutefois prévisible dans la mesure où le chêne-liège est une plante silicicole. Si l’on considère l’exposition (tab. 2), on constate que 36,7% des subéraies malvenantes se développent en terrain plat et 20% sur des pentes exposées au sud-ouest. Ces deux types d’exposition sont aussi les plus fréquents pour les forêts correspondant aux classes de

dépérissement les plus fortes. On estime que ces forêts sont plus sensibles au dépérissement car elles sont soumises à des vents répétés et à un fort ensoleillement. En ce qui concerne l’altitude, les subéraies ont été regroupées en 4 catégories (cf. tab. 2) La plupart se trouvent entre 201 et 600 m au-dessus du niveau de la mer. Dans la classe correspondant au dépérissement le plus grave, environ la moitié des subéraies est localisée entre 201 et 400 m au-dessus du niveau de la mer.

Tableau 2. Fréquence relative des caractéristiques stationnelles des subéraies à l’intérieur de chaque classe de dépérissement

Classes de dépérissement Caractères stationnels Total 1 2 3 4 Granit 53,3 54,5 42,9 53,8 66,7 Basalte 25,0 27,3 23,9 38,5 13,3 Schiste 13,4 9,1 23,8 7,7 6,7 Alluvial 3,3 0,0 0,0 0,0 13,3 Substrat Trachyte 3,3 9,1 4,8 0,0 0,0 Calcaire 1,7 0,0 4,8 0,0 0,0 Terrain plat 36,7 54,5 23,8 46,1 33,3 SW 20,0 9,1 9,5 15,4 46,7 W 10,0 18,2 14,3 7,7 0,0 NW 10,0 0,0 14,3 7,7 13,3 S 6,7 18,2 9,5 0,0 0,0

Exposition SE 5,0 0,0 9,5 0,0 6,7 NE 5,0 0,0 4,8 15,4 0,0 E 5,0 0,0 9,5 7,7 0,0 N 1,6 0,0 4,8 0,0 0,0 < 200 8,3 0,0 9,5 0,0 20,0 201-400 35,0 9,1 38,1 38,5 46,7 401-600 36,7 54,5 28,6 53,8 20,0

Altitude (m) (m) Altitude > 600 20,0 36,4 23,8 7,7 13,3

Pour chacune des caractéristiques sylvicoles étudiées, on a distingué deux types opposés de subéraies : peuplements d’arbres de même âge ou d’âges différents, avec ou sans sous-bois, purs ou mixtes, pâturés ou non-pâturés, avec ou sans régénération naturelle, périodiquement ou rarement défoliés par des lépidoptères. Le tableau 3 présente pour chacune de ces caractéristiques, le pourcentage de forêts appartenant au type de subéraie qui correspond à des pratiques sylvicoles défavorables ou à des facteurs interférant avec la gestion rationnelle de ces peuplements.

Tableau 3. Pourcentage de subéraies d’un type sylvicole donné dans chaque classe de dépérissement.

Classe de dépérissement Type de subéraie Total 1 2 3 4 Du même âge 31,7 18,2 28,6 38,5 40,0 Sans sous-bois 23,3 27,3 19,0 15,4 33,3 Pure 41,7 36,4 38,1 38,5 53,3 Pâturée 61,7 54,5 57,1 61,5 73,3 Sans régénération 63,3 63,6 52,4 69,2 73,3 Périodiquement défoliée 48,3 18,2 47,6 53,8 66,7

On constate d’après ce tableau que les peuplements d’arbres de même âge, purs et sans sous- bois représentent, respectivement, seulement 31,7%, 23,3% et 41,7 % du total. On remarque toutefois, que ces différents types de subéraies sont plus fortement représentés dans la classe de dépérissement 4 et que, sauf dans le cas des subéraies dépourvues de sous-bois, leur fréquence baisse progressivement lorsque l’intensité du dépérissement diminue. Plus des deux tiers des subéraies étudiées sont pâturées et privées de régénération naturelle. Ces types de subéraies sont encore plus fréquents dans la classe de dépérissement 4. De fait, le pâturage peut avoir un impact négatif sur la forêt quand la charge en bétail est excessive et qu’elle est associée à un labourage du terrain qui limite encore plus fortement la régénération naturelle. Il faut remarquer enfin que les peuplements subissant périodiquement des défoliations provoquées par des lépidoptères représentent près la moitié des forêts examinées (48,3%) et que leur fréquence est plus élevé dans les classes de dépérissement 3 et 4. La conclusion que l’on peut tirer de ces recherches est qu’en Sardaigne, beaucoup d’écosystèmes à chêne-liège sont dans une situation précaire qui a sans doute favorisé l’apparition de phénomènes de dépérissement et la mort consécutive des arbres. Cette situation est encore plus préoccupante si aux sites montrant des signes de dépérissement, on ajoute ceux qui ont, ayant été dégradés par des incendies estivaux, n’ont pas été pris en compte dans cette recherche. Si l’on analyse de plus près les facteurs qui ont contribué à l’apparition et à l’extension des phénomènes de dépérissements dans les subéraies de la Sardaigne, un rôle tout particulier doit être attribué aux changements climatiques qui sont apparus au cours des dernières années, se manifestant en particulier par des périodes de sécheresse fréquentes et prolongées. On a reporté dans le tableau 4 les valeurs moyennes relatives des précipitations au cours de la période 1997-2000 dans 11 stations météorologiques situées à proximité des subéraies dépérissantes (données fournies par le Service agro-météorologique de la Sardaigne). En comparant ces données avec les moyennes historiques citées par Arrigoni (1968), on considère que, pendant ces dernières quatre années, les précipitations ont été réduites en moyenne de 28%, avec des valeurs variant de 11,2% à 42,9% selon les localités. Compte tenu de la répartition des stations météorologiques sur le territoire sarde, ces données peuvent être considérées comme représentatives de l’ensemble des régions subéricoles de l’île.

Tableau 4. Précipitations moyennes (mm) relevées dans quelques localités de la Sardaigne

Moyenne Localité Moyenne historique Déficit (%) 1997/2000 Bonnannaro (SS) 563,0 634,0 -11,2 Berchidda (SS) 568,6 648,0 -12,3 Luras (SS) 739,5 862,0 -14,2 S.Teodoro (SS) 521,0 662,0 -21,3 Ghilarza (OR) 569,7 780,0 -27,0 Nurallao 503,1 704,0 -28,5 Chiaramonti (SS) 509,7 762,0 -33,1 Ozieri (SS) 418,8 648,0 -35,4 Masainas (CA) 393,6 655,0 -39,9 Orani (NU) 409,2 710,0 -42,4 Bitti (NU) 558,3 978,0 -42,9 Moyenne 523,1 731,2 -28,0

En général le chêne-liège résiste assez bien à la sécheresse, mais lorsque les conditions stationnelles et sylvicoles sont défavorables (exposition à des vents excessifs et à un fort ensoleillement, terrains superficiels et peu perméables, peuplements serrés, sol appauvri par les activités agricoles, élimination totale du sous-bois, pâturage excessif), il est plus facilement exposé à un stress hydrique. Les arbres soumis à de telles conditions sont rabougris et sont plus souvent attaqués par des insectes et des champignons. Ceux-ci sont à l’origine de défoliations souvent totales qui conduisent à de graves déséquilibres physiologiques. L’état sanitaire des arbres est ensuite définitivement compromis par les attaques successives des insectes xylophages et surtout des champignons pathogènes qui provoquent leur mort à plus ou moins longue échéance. Dans une telle situation, une gestion sylvicole raisonnée des subéraies est essentielle. L’aménagement doit se baser sur des critères qui, en accroissant leur seuil de résistance au stress, devraient permettre d’assurer aux arbres de meilleures conditions végétatives. Par contre, si ces critères ne sont pas appliqués, on verra les phénomènes de dépérissement apparaître puis s’étendre, entraînant un déclin végétatif progressif des chênes- lièges qui les conduira à la mort. Si les conditions climatiques défavorables de ces dernières années devaient persister, la situation sanitaire des subéraies de Sardaigne risquerait sans doute de s’aggraver, ce qui serait une entrave à la mise en œuvre de stratégies d’intervention adéquates. Dans cette perspective, les informations recueillies lors de cette étude seront utiles pour sélectionner des placettes expérimentales en vue de la création d’un réseau de surveillance régional permettant de suivre l’évolution des phénomènes de "dépérissement". De telles placettes permettront aussi d’expérimenter différentes méthodes de lutte intégrée en tenant

compte de la diversité des aspects phytopathologiques, écologiques et sylvicoles de l’ensemble des subéraies sardes.

Références

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Further researches on the distribution of declining cork oak stands in Sardinia (Italy)

Clizia Sechi, Pino Angelo Ruiu, Antonio Franceschini, Piero Corda

Abstract : Since the beginning of the 90’s, the decline of cork oak was observed in Sardinia. It was first reported in cork oak stands where poor edaphic and vegetational conditions as well as lack of common forest management have amplified the negative effect of the prolonged drought of the last years. Afterwards, the decline occurred over a ten-year period in all the main cork oak forests of the region. Surveys conducted in cork oak woodlands during 1998 and 1999 have led to the individuation of 48 declining sites. Further research in the last two-year period confirmed the widespread extent of the disease. Currently sixty cork oak stands are affected by decline in Sardinia. This situation could be even more severe if areas degraded by fire damage have been considered. The cork oak stands with the highest index of decline are located between 200 and 400 m s.l., have an exposition to SW and soils of granitic origin. Moreover, they are composed by even aged plants, pure, with natural regeneration nearly absent, grazing, and frequently attacked by defoliating pests. The data obtained will be used to select sample areas, representative of the different typologies of Sardinian cork oak forests, which will allow both the establishment of a regional monitoring net to follow the decline evolution, and the experimentation of suitable control measures.

Key words: Quercus suber L., oak decline, Sardinia

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 13-16

Current situation of oak decline in Italy and in other European countries

Alessandro Ragazzi1, Salvatore Moricca2, Irene Dellavalle2 1 Dipartimento di Biotecnologie agrarie-Sezione Patologia vegetale, Università degli Studi di Firenze, Piazzale delle Cascine 28, I-50144 Firenze, Italy. 2 Istituto per la Patologia degli Alberi Forestali del CNR, Piazzale delle Cascine 28, I-50144 Firenze, Italy

Abstract: A review on the status of oak decline in Italy and in Europe was carried out. The decline of oak stands was first reported in Italy in 1986, and in Europe (Germany) as early as 1739. In the last 15 years there has been a dramatic situation all over Europe. The oak species most affected in Italy are: Quercus cerris, Q. frainetto, Q. pubescens, Q. robur, Q. suber; whereas in Europe: Q. robur and Q. petraea. The decline symptoms common to all oak species in Europe (and in Italy) are: crown thinning, growth of epicormic shoots and bleedings. With regard to the causes, there was always the possibility that the disease was due to multiple abiotic and biotic causes. The main inciting cause was found to be drought.

Key words: oak decline, Italy, Europe, Quercus spp.

Introduction

The decline of oak woods was first reported in Italy (Circeo National Park, 40°20’N-13°15’E) by Ragazzi et al. (1986) on Quercus cerris L., Q. frainetto Ten., Q. pubescens Willd and Q. robur L. After 1986 the decline spread to the whole of Italy, though its manifestations differed in ways that will have to be described later. Other species become also marginally involved : Q. ilex L., Q. macrolepis Kotschky, Q. trojana Webb. and Q. suber L. The phenomenon is now known to affect almost all countries in Europe, including Germany, the first country to report the decline, as early as 1739 (Hartmann & Blank 1992). In the last 15 years there has been a dramatic rise in oak decline all over Europe, sometimes involving oaks in one country only, sometimes in a number of countries.

Oak decline distribution and incidence

The distribution of oak decline in Italy is showed in table 1. The incidence of the decline nation-wide can be quantified in general terms as follows: Northern Italy: Q. robur woods, located in two areas totalling 500 ha. Decline incidence: about 30%. Central Italy: Q. cerris woods of about 100 ha. each; incidence 20%. Woods of Q. pubescens, with areas of about 40 ha each. Incidence: 10%. Southern Italy: Woods of Q. cerris; incidence: 35-40%. Woods of Q. frainetto; incidence 30%. Woods of Q. pubescens, incidence: 20-25%. In Europe the situation is equally alarming inasmuch as almost no country is without declining oaks in decline, including oaks of the most widespread species, which are sometimes specific to one country, sometimes common to a number of countries. The EC-UN/CEE Survey ''Forest Condition in Europe - 1995'' confirmed the frequent occurrence of severely damaged oak trees in central Europe: the worst deterioration was seen in oak stands in France, Germany, the Czech Republic, Portugal, Poland and the Slovak Republic.

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Table 1. Distribution of oak decline in Italy.

Regions and localities Oak stands Quercus species Reference Circeo National Park cerris, frainetto, pubescens, Ragazzi et al. 1986 robur Viterbo cerris Vannini, 1987 Lazio, Molise, Puglia, single trees cerris, frainetto, pubescens, Luisi et al., 1988 Basilicata, Calabria robur Campania oak stands cerris, pubescens Cellerino et al. 1991 Tolfa (Roma) single trees cerris, pubescens Motta et al. 1991 Madonie (Sicilia) single trees cerris, ilex, pubescens Granata & Agosteo 1991 Muzzana del Turgnano single trees robur Moricca & Ragazzi 1991 (Udine) -Fagarè (Padova) Sicilia single trees ilex Grillo & Tirrò 1992 Toscana single trees ilex Blaschke et al. 1995 Toscana single trees cerris Tiberi & Ragazzi 1998

Oak decline symptomatology

In south-central Italy and in Sicily, young trees (not more than 25 years) trees are killed in the course of a single growth season. The main symptom is the heavy sprouting of epicormic shoots along the whole length of the trunk. The leaves of these shoots are smaller than normal. All along the trunk can be observed small cortical wounds from which oozes a mucilaginous substance. The adult trees (older than 25 years) die in 2-3 growing seasons. The first symptom here is the appearance of numerous epicormic shoots along the trunk, sometimes very close to each other, sometimes more widely spaced. Mucilage oozing is very abundant and always occurs prior to the death of a tree. Around the areas where the mucilage oozes out the cortical tissue is necrotised and easily flakes off. In northern Italy, on the other hand, the decline of Q. robur woods was somewhat different, also as regards the causes that were later identified (Ragazzi et al. 1993). Here trees of 40-50 years displayed over extensive areas marked crown thinning and transparency, without other symptoms, rapidly followed by tree death after two season’s growth. As with the first reported case of decline in Italy, as well as in other European countries, the disease sometimes displays a number of identical symptoms, or sometimes the symptoms are different.The decline symptoms common to all oak species throughout the European range include crown thinning, growth of epicormic shoots and bleedings.

Causes of oak decline

In the case of oak decline it is possible that the growth and development of the disease were due to multiple, abiotic and biotic causes. In south-central Italy and in Sicily, the inciting factor of the decline was found to be drought (Ragazzi 1987; Vannini et al. 1996) and the contributing factors included the action of fungi and defoliating, wood-inhabiting and defoliating insects (Battisti and Covassi 1991; Tiberi 1991; Tiberi and Ragazzi 1998). The situation in northern Italy was somewhat different: here neither inciting nor predisposing

factors were found, but the Deuteromycete Fusarium eumartii was always isolated from declining trees. In Europe, each country with oak decline has seen fit to identify a variety of causes of the disorder, abiotic as well as biotic, and interacting with each other, but the main inciting cause has been found to be drought (Brasier 1996; Rico et al. 1996; Thomas and Hartmann 1996; Wargo 1996). With regard to the contributing factors, the European researchers concerned specifically with plant pathology have focused on the effect of organic and inorganic factors found on declining or declined trees: Blaschke 1994; Ragazzi et al. 1995; Brasier 1996; Büttner and Führling 1996. The microrganisms associated with oak decline in Italy and Europe include fungi, bacteria, MLOs, viruses and virus-like organisms. In Italy it is important to underline the close relation between some fungi from declined or declining trees, and insect vectors, especially those belonging to the genera Agrilus, Scolytus, Sinoxylon and Xyleborus (Tiberi & Ragazzi 1998).

Conclusions

Oak decline as it is understood today has occurred in Italy since the early eighties. Since there, reports of oak decline have become more frequent in almost all countries of Europe. Instances of oak decline in Italy early in this century, and in Europe in the 18th and 19th centuries must be considered isolated events , sometimes linked to specific causes. In Italy and Europe the oak species involved are those of the greatest ecological, sylvicultural and economic importance. In Italy, as well as in many other parts of Europe, situations occasionally arise that seem similar to and comparable with each other from a climatic, pedologic, ecological or sylvicultural point of view, but no specific biotic or abiotic factors have ever been identified as the primary cause of oak decline. According to our present knowledge, it is generally agreed that, for south-central Italy and Sicily at least, one of the inciting factors is drought, and that among the contributing factors is the action of specific fungi and defoliating and wood-inhabiting insects.Similarly, each country in Europe has built up a picture of the onset and progression of oak decline in its own territory, identifying a succession of causes, usually beginning with an abiotic cause, and followed by the action of microrganisms, particularly fungi and insects. At this point it would appear to be a fairly straightforward, simple matter to compare what is happening on in different countries and thus extract the common cause underlying all types of oak decline mentioned at the outset. However it seems evident that such a procedure is not possible without adopting a different approach to the whole problem, an approach that all countries involved will have to adopt and implement. Then, a basis for making valid comparisons would be attained.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 17-20

Methodological approaches to outline control strategies of cork oak decline in Sardinia (Italy)

Antonio Franceschini 1, Lucia Maddau 1, Salvatorica Serra 1, Maria Antonia Pulina 2 1 Dipartimento di Protezione delle Piante, Sezione di Patologia vegetale, Università degli Studi di Sassari, Italy. 2 Dipartimento di Ingegneria del Territorio, Università degli Studi di Sassari, Italy

Abstract : The need to define suitable measures in order to overcome the increasing spread of cork oak decline in Sardinia has become of primary importance. To date, 60 declining areas all over the region have been found. However, it is very difficult to outline common control strategies because of the complex etiology of this disease and the remarkable variability of environmental and sylvo- cultural conditions of the different cork oak stands. Therefore, a research programme with the following objectives has been set up to : 1) characterize the vegetational typologies of declining cork oak stands; 2) create a net of stations, representative for each typology, useful for monitoring the phenomenon; 3) carry out integrated and exhaustive studies of climatic, edaphic, vegetational and sylvo-cultural characteristics in each station; 4) compare the results on the basis of disease evolution. In this paper, the methodology adopted and results of surveys carried out over a four-year period in one station located in North Sardinia are reported.

Key words : decline, cork oak, control strategies, methodology.

Introduction

In all Mediterranean countries, the definition of suitable control strategies in order to overcome the increasing spread of serious forest decline phenomena has become of primary importance. This need is felt most in oak forests and especially cork oak because of their social and economic importance and also in relation to the strategic role they play in large areas subject to degradation. However, it is extremely difficult to prevent the decline onset in the different situations where cork oak grows. This disease is the consequence of severe water stress of the plants, worsened by several abiotic and biotic adverse factors which can vary according to type, intensity, duration and frequency in the various forest situations. In Sardinia up to now, 60 declining cork oak stands in differing environmental and sylvo- cultural conditions, have been found (Sechi et al., 2002). Therefore, possible strategies should be defined only after having characterized, also taking into account the historical profile, the climatic, edaphic, vegetational and management aspects of each declining site, and having carried out suitable comparisons based on the disease incidence. So this aim, and in accordance with the study model proposed by Ragazzi et al. (2000), a research programme has been passed to characterize declining cork oak stands representing the various stational situations found throughout the region. Such areas will constitute the units of a monitoring net where, from year to year, climatic variations and disease evolution will be recorded. In this paper, the methodology adopted and the results obtained in one of these units are reported.

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Materials and methods

The area under investigation is near the locality of Bortigiadas in Northern Sardinia, and extends on 15,000 m2 along a sloping ground exposed to SSE, between 145 and 220 m a.s.l., with an average slope of 30%. The soil is of granitic origin and has a profile type A-Bw-C, belonging to the Cambisols unsaturated groups (District Cambisols, FAO 1998). The tree population is made up of uneven aged cork oak with few scattered elements of holm oak. The underwood is thick and consist of the typical shrubs (Arbutus, Calycotome, Cistus, Cytisus, Erica, Myrtus, Phillyrea, Pistacia, Rhamnus) of the Mediterranean bush. The climatic conditions have been determined on the basis of temperature and rainfall data recorded in the “Cantoniera Coghinas” weather station of the Regional Hydrographic Service network, which is nearest to the research area. The disease incidence has been detected annually from 1998 to 2001, evaluating in spring the decline degree of all the cork oak plants (417) in the area. The standard methodology defined by the EU (UN-ECE, 1994) to evaluate decline diseases has been followed only in part. This methodology, based on the degree of crown transparency (defoliation) and discoloration, is not well suited to the specific case due to the peculiarities of cork oak decline syndrome, the biology and variability of the vegetative aspect of this species. For these reasons, and taking into account the need to uniform the valutations made by different operators in various stations, only the main symptoms (crown dieback and cankers, cortical necrosis, exudates and epicormic sprouting on branches and trunk) have been considered. Crown dieback has been expressed as percentage of the canopy affected, using 4 classes: 0=0-10%, 1=11-25%, 2=26-60%, 3=>60%. The other symptoms have been evaluated as a whole in 4 classes of spread: 0=absent, 1=scarce, 2=average, 3=high. Combining the two groups of classes, as reported in table 1, the decline class of each plant has been defined.

Table 1. Classes of cork oak decline.

Dieback classes Spread classes of cankers, cortical necrosis, exudates of crown and epicormic sprouting on branches and trunk 0 1 2 3 0 0 0 1 2 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3

On the basis of the number of plants included in the four decline classes and in another of value 4 concerning dead plants, the Decline Index (DI) of the stand has been calculated with the following formula: DI = Σ(C x F)/N, where C = value (0÷4) of each class; F = frequency of the same class in the stand; N = number of all the examined plants. Finally, in order to ascertain the presence of fungal pathogens, symptomatic samples taken from trunk and branches of plants with different decline degree are analysed according to the methodology reported in another paper of this volume (Franceschini et al., 2002).

Results and conclusion

The climatic pattern of the examined area has been influenced by reduced rainfall. This is not surprising if one take into consideration that the climate of the last 20 years in Sardinia, as

well as in all the Mediterranean countries, has been characterized by drought conditions. The average rainfall during the years under investigation has been 478 mm, much lower than the average (806,1 mm) recorded in the thirty years from 1951-80 (Data of the Regional Hydrographic Service). More particularly, examining the diagrams elaborated on the basis of the monthly rainfall and temperature data reported in figure 1, it has been shown that in 1998, 1999 and 2000 a remarkable reduction of the side areas relative to the wet period of the year has occurred. In the mean thermo-pluviometric regime for the years 1951-80, the wet period included the autumn, winter and spring months.

Figure 1. Thermo-pluviometric diagrams of Bagnouls & Gaussen (1957) relative to the weather station “Cantoniera Coghinas” in the 1951-80 period and years 1998,1999 and 2000.

The increase of the central area, indicative of the length and intensity of the summer drought period, has also been relevant. The diagram relative to the year 2000 appears significant: an almost continuous drought from February to September occurred. As far as the health of the cork oak stand is concerned, figure 2 shows the percentage of plants that, in the years under investigation, were without symptoms, declining or dead. In the year 1998 more than half of the plants were declining or already dead. In the following years there have been new cases of decay, but above all, a considerable increase in plant mortality, most noticeably from 1998 to 1999 and from 2000 to 2001. As a consequence, the Decline Index of the stand increased progressively, so that in only four years it had nearly doubled. Finally, with regard to the parasitic fungi that could be involved in the decline pathogenesis, the presence of Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze and Diplodia mutila Fr. apud Mont. was verified. These fungi are very widespread in the Mediterranean environment, and their attacks are considered among the main inciting and contributing factors in the death of the cork oak plants affected by decline. In particular, the former has been the most frequently isolated. On the other hand, 85% of both declining and dead plants in 2001 showed typical “charcoal cankers” caused by this fungus.

Healthy plants Declining plants Dead plants Decline Index

60 2,5

50 2 40 1,5 30 1 20 Decline Index

Percent of plants 10 0,5 0 0 1998 1999 2000 2001

Figure 2. Evolution of cork oak decline from 1998 to 2001 in the area examined.

In conclusion, these results can be used as parameters of comparison either to find the variables influencing the onset and spread of decline, or to evaluate the efficacy of the consequent preventive measures which should characterize new sustainable management models of Sardinian cork oak stands.

Acknowledgements

This work was supported by the Italian National Project ex 40% “Weakness fungal parasites in oak decline: endophytism in their adaptation strategy”.

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 21-24

A three-year survey of oak decline in Modena (Italy)

Marco Ardizzoni1, Paola Nipoti1, Giuseppe Amorelli2, Silvia Gennari3 1 Alma Mater Studiorum University of Bologna, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), via Filippo Re 8, 40126 Bologna, Italy; 2 Comune di Modena, Environment Department; 3 Phytopathologist

Abstract: Quercus robur L. is the typical oak species of Emilia-Romagna region, because it prefers alluvial soils. Decline incidence is about 30% (totalling 500 ha) in the woods of Q. robur in Northern Italy. This work consists of a three-year study (1998-2000) on diseased oak trees growing in an urban environment in the city of Modena. The research included the collection of representative leaf samples from the trees chosen in a set of urban localities (Villanova, Fossalta, San Damaso, San Donnino and Viale Amendola). The leaves were subdivided into six classes (0 to V) according to the number of present spots, and into categories according to the damage by phytophagous insects, which in turn were subdivided according to their intensity. Significant analogies among the various localities were recorded. As a conclusion to this three-year study, it is possible to point out some recommendations to limit the spread of oak decline in an urban environment.

Key words: Oak decline, leaf spots, phytophagous insects, urban localities.

Introduction

The genus Quercus numbers between 300 and 350 species spread throughout the northern hemisphere (Gellini, 1973). Q. robur L. is the most common oak species in Emilia-Romagna region, due to the alluvial nature of the soil. The incidence of oak decline in the northern regions of Italy is approximately 30%. The range of symptoms in the trees affected by oak decline is as follows: microphyllia, yellowing, necrosis, early falling of the leaves, a thinning out of the foliage, drying of the branches, twigs and most extended areas of the canopy, epicormic branches bearing smaller leaves than normal, short longitudinal cracks in the bark that seep blackish liquid. The trees affected died during the vegetative season (for young specimens) or in 2-3 seasons (for adult trees) (Luisi et al., 1991; Motta et al., 1991; Ragazzi et al., 2000). The following study was undertaken by the proposal of the Environment Department of the City Authority of Modena with the aim of mapping symptoms and localities in an urban area.

Material and methods

Description of the study localities Five study locations were identified, four in the suburbs close to the city of Modena and one in the city centre. VILLANOVA is located north of the city centre; this locality has a single tree of a presumed age of 140 years with a rounded canopy in average vegetative condition. FOSSALTA is located south-east of the city centre; this locality has a single specimen in a park. The tree is estimated to be 110 years old and has a thick foliage in good condition but with dry terminal branches. SAN DAMASO is located south-east of the city centre; this locality has a row of eight trees mixed with other autochthonous species (maple and poplar). The tree chosen, estimated

21 22

to be 75 years old, has noticeably dried branches, both small and thick, in intermediate and topmost positions. The canopy is heavily asymmetrical due to the extreme proximity (roughly 150 cm) of another tree and it is defoliated by more than 50%. SAN DONNINO is located south- east of the city centre; in this locality a row of trees in a park is present. The tree chosen is estimated to be about 50 years old; it has diminished foliage, chlorotic, stunted and bundled vegetation, and marked dried sections in its intermediate and topmost sections. VIALE AMENDOLA is situated in the city centre; this locality has a row of trees that grow in a central reservation between two lanes of traffic. The vegetation of the tree chosen, of estimated age 45 years, is in mediocre condition and it shows evidence of pruning to raise the foliage. Many branches at the top and bottom of the tree have dried out.

Visual analysis In each of the three study years, samples of leaves were taken from several sides on the trees in each location using pruning shears with an extendable rod of maximum length 4.5 metres. In the laboratory the leaves were divided into six empirical classes depending on the number of spots present. The classes were as follows: 0 = no spots on the leaves; I = leaves with between 1-5 spots; II = leaves with between 6-10 spots; III = leaves with between 11-15 spots; IV = leaves with between 16-30 spots; V = leaves with more than 30 spots. The data obtained for each locality were transformed into percentages, so comparisons could be made between years and presented by graphs. Each sample of leaves was examined to identify the damage by phytophagous insects: leaf miners, erosions caused by Caliroa sp. (Tenthredinidae), Cynipidae galls and Tortricidae presence. A sub-division based on the intensity of these categories was made: mines (ophionomic, ptychonomic, stigmatonomic) 1 2 3 4 from 1 to 3 and more than 3 mines per leaf ; Caliroa /4, /4, /4 and /4 of leaf lamina eroded; Cynipidae from 1 to 5 and more than 5 galls per leaf; presence of erosions caused by Tortricids.

Results and discussion

From sub-division of the leaves into classes of spots and groups of intensity of the damage by phytophagous insects the following results were obtained (fig. 1 and fig. 2) In 1998, the number of leaf spots revealed three distinct situations. In Villanova, the percentage of leaves was higher in classes 0 and I. In Fossalta, San Damaso and San Donnino, the values of leaves with spots were similar, with an almost uniform distribution between classes. In Viale Amendola, the percentage of leaves in class V was greater than in all the other localities. The damage by phytophagous insect was split into two situations: in Villanova and Viale Amendola, the damage was practically non-existent, whereas in Fossalta, the presence of Cynipidae galls was higher than in San Donnino and San Damaso. In these localities the presence of leaves with mines in categories 1-3 was below 15%. The most concentrated erosion due to Caliroa sp. was recorded in Fossalta. In 1999, three different conditions were noted for leaf spots. In Villanova, the situation was similar to the previous year. The second condition grouped San Damaso, San Donnino and Fossalta together. In San Damaso and San Donnino the percentage of leaves had risen progressively from class V to class I, while in Fossalta the distribution of leaves showed an average value equal to that of the two other localities in this group. In Viale Amendola, over 80% of the leaves with necrotic spots were in class V. The damage by phytophagous insects was split into two situations. Damage by phytophagous insects was not recorded in Villanova and Viale Amendola. In Fossalta a high

1998

100

) 60 V. Amendola 40 S. Donnino S. Damaso Leaves (% Leaves 20 Fossalta Villanova 0 0 I II III IV V Classes

1999

100

) 60 V. Amendola 40 S. Donnino S. Damaso Leaves (% Leaves 20 Fossalta Villanova 0 0 I II III IV V Classes

2000

100

) 60 V. Amendola 40 S. Donnino S. Damaso Leaves (% Leaves 20 Fossalta Villanova 0 0 I II III IV V Classes

Figure 1. Situation noted for every year (1998-2000) for each class of leaf spots in the different localities.

degree of erosions by Caliroa sp. and Cynipidae galls was recorded. In San Damaso there was a high level of damage by Cynipidae galls. The percentage of leaves with mines was practically constant in all three localities. In the last year of observation (2000), two situations were recognized concerning the leaf spots. The first (Villanova, San Damaso, San Donnino and Fossalta) showed a high percentage of leaves in classes 0 and I with values differentiated between the localities. The second was Viale Amendola: the leaves were almost exclusively recorded in the highest classes (IV and V).

The damage by phytophagous insects was also split into two situations: the levels recorded in Viale Amendola and Villanova have always been very low; in the other three localities, Fossalta stands out for the amount of erosions caused by Caliroa sp.. The presence of leaves with mines, between 1 and 3, was high in Fossalta, San Damaso and San Donnino.

20 Leaves (%) S. Damaso 10 Fossalta S. Donnino 0 1-3 1/4 1-5 1-3 1/4 1-5 >5 1-3 1/4 Mines Erosion Galls Mines Erosion Galls Mines Erosion 1998 1999 2000

Figure 2. The most consistent damage by phytophagous insects observed during the period of trials (1998- 2000).

From these observations, it is possible to conclude that the typology of the locality (single tree or row) does not influence the level of leaf spots or damage caused by phytophagous insects. The localities San Damaso, San Donnino and Fossalta, which showed similar trends in the two parameters examined over the three-year observations, are all situated to the south-east of the city centre. Viale Amendola showed the greatest values of leaf spots and is located in an area of heavy traffic. Consistent damage by phytophagous insects was not observed in either Viale Amendola or Villanova. What can be done to limit oak decline in city environments? As chemical treatments cannot be implemented for technical reasons, one of the few possibilities that might be followed is that of good agronomic practices which foresees fertilisation where certain nutritive elements are missing, irrigation during prolonged periods of drought or falls in the water table, pruning to remove dried or sick branches in order to reduce the inoculum potential in the environment, protection of wounds caused by lopping and disinfection of tools used in these operations to avoid transmitting the diseases to healthy plants.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 25-28

Fungi involved in oak decline in an urban area

Marco Ardizzoni1, Paola Nipoti1, Luciana Di Pillo2, Maria Grazia Fantino1 1 Alma Mater Studiorum University of Bologna, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), via Filippo Re 8, 40126 Bologna, Italy; 2Phytopathologist

Abstract : Over the last few decades oak decline has affected millions of trees in the northern hemisphere (Europe, United States and Asia). Oak decline was closely investigated over a three-year period (1998-2000). The investigation was carried out in and around Modena and was based on two lines of research (in vitro explants and pathogenicity assays). The results of this three-year study showed the determining role of the laboratory investigations in defining the nature (abiotic or biotic) of the necrotic spots. The pathogenicity assays revealed the virulence of Chondroplea populea, which had not yet been widely recognized as a pathogen of the oak.

Key words : oak decline, leaf spots, in vitro explants, pathogenicity assays, Chondroplea populea.

Introduction

Among broad-leaved trees, the oak is one of the species of greater economic importance in Italy and the most widely cultivated (Ragazzi, 1988 ; Luisi & Manicone, 1991) as it is frequently used in the creation of urban and suburban green areas. Over the last few decades oak decline has caused the death of millions of trees in the northern hemisphere (Europe, USA and Asiatic countries). The first report of the problem in Italy was noticed in 1980 in the Circeo National Park (Latina) affecting the species Quercus robur L., Q. cerris L., Q. frainetto Ten. and Q. pubescens Willd. (Ragazzi, 1991). Oak decline is difficult to define because of its complex and much discussed symptomatology. Studies carried out support the hypothesis that the process involves three categories of factors (predisposing, inciting and contributing) that are both abiotic and biotic in nature. The aim of this study was to identify the main or concomitant causes that lead to oak decline in the urban area of Modena (in the North of Italy) and to assess the predisposing ones.

Material and methods

In vitro explants The samples of leaves taken from trees in five localities (Villanova, Fossalta, San Damaso, San Donnino and Viale Amendola) had previously been divided into six classes according to the number of spots on the leaf lamina (Ardizzoni et al., 2002). Following the traditional laboratory methodology, pieces of tissues were taken from leaves in each class. In total, over the 3 years of observation (1998-2000) the work plan involved the preparation of 540 Petri dishes giving a total of 3,780 fragments. The fungi developed were identified by observation of their reproductive structures by an optical microscope and classified using scientific texts (Hawksworth et al., 1996 ; Barnett & Hunter, 1999). The frequency indices (F.I.) of the total and pathogenic mycoflora were then calculated by applying the MacKinney formula. The F.I. were calculated for each repetition and analysis of variance (ANOVA) was performed.

25 26

Pathogenicity assays Pathogenicity assays were made using healthy leaves homogeneous in age, size and consistency of the tissue. The fungi chosen were in part the most representative and ones previously acknowledged as pathogens in the literature (Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Gloeosporium quercinum West., Pestalotia hartagii Tubeuf, Phomopsis quercina (Sacc.) Höhn and Phyllosticta maculiformis Sacc.) with the exception of Chondroplea populea (Sacc.) Kleb. [= Discosporium populeum (Sacc.) Sutton, also known as Dothichiza populea Sacc. et Briard], which has not yet been noted as a pathogen on oak. It was decided to test C. populea, because its presence was quantitatively irrelevant but constant when the oaks were near poplar trees. Fungal suspensions at a concentration of 104 propagules/ml were used for artificial infections. Each suspension represented a thesis. The control leaves were put in Czapeck liquid. Each thesis was placed inside a polyethylene bag in order to keep the moisture constant during the following 48 hours. Observations of the alterations present were taken at intervals of 12 hours over a period of two days.

Results and discussion

In vitro explants Over the three-year period, about thirty genera of fungi were isolated with different quantitative levels. VILLANOVA – In 1998 Aureobasidium pullulans (de Bary) Arn. was one of the most isolated fungi, in 1999 the presence of A. alternata, Cladosporium cladosporioides (Fres.) De Vries, and Stemphylium vesicarium (Wallr.) Simm. were also noted. These fungi are all considered polyphagous leaf pathogens in the literature. In the year 2000 the climatic conditions were unfavourable to the colonisation of fungi. The F.I. of total mycoflora reached values variable from 2.2% in the year 2000 to 32.7% in the year 1999; while F.I. of pathogenic mycoflora varied from 0.8% to 17.4% respectively in 2000 and 1999 (tab. 1). FOSSALTA – The most recurrent fungus was A. alternata with different levels of presence. During the first two years P. maculiformis, P. hartagii, Fusarium eumartii Carp. and Hypoxylon mediterraneum (De Not.) Mill. were also isolated. Occasional but worthy of mention was the isolation of C. populea, due to the close presence of poplar trees. During the year 2000, G. quercinum, the anamorphous of Apiognomonia quercina (Kleb.) Höhnel and P. quercina were observed. In the year 1998 the total and the pathogenic F.I. reached the maximum values, respectively with 55.6% and 35.2%. SAN DAMASO – Like Fossalta, the mycoflora isolated in San Damaso was high in 1998 and 1999 (above 50%) and low in 2000 (7.8%). C. cladosporioides, A. alternata and A. pullulans were always present. Among the agents of leaf spots, G. quercinum and P. maculiformis were isolated, while the endophytes were F. eumartii and P. quercina. During the first two years, C. populea was also isolated, with a maximum value of 21% in 1999. SAN DONNINO – A. pullulans, A. alternata and C. cladosporioides were the most recorded mycetes. F. eumartii, Ulocladium chartarum (Preuss) Simm., P. maculiformis and P. quercina were also present. In 1998 the total F.I. was 49.6%, decreasing in 1999 (18.1%) and in 2000 (8.7%). In 1998, the F.I. of pathogenic mycetes was 26.7%, in 1999 4.8% and in 2000 1.1%. VIALE AMENDOLA – Many mycetes were found in Viale Amendola in 1998 (49.3%), but gradually fell over the subsequent two years, 11.9% and 9.6% respectively. The most common were A. alternata, A. pullulans and C. cladosporioides. The year 1999 showed a high percentage of negative explants, with 64.3% in class IV and 61.9% in class V. In the year 2000, the negative explants in class V reached the value of 95.2%. The F.I. of pathogenic mycetes was 26.8% in 1998, 4.1% in 1999 and 3.2% in 2000.

Table 1. Average percentages of the frequency index (F.I.) of total and pathogenic mycoflora over the three-years study period.

Average F.I. (%) Localities 1998 1999 2000 total pathogenic total pathogenic total pathogenic Villanova 25.4 9.8 32.7 17.4 2.2 0.8 Fossalta 55.6 35.2 52.0 24.0 1.7 0.6 San Damaso 50.2 34.7 54.9 13.9 7.8 4.3 San Donnino 49.6 26.7 18.1 4.8 8.7 1.1 Viale Amendola 49.3 26.8 11.9 4.1 9.6 3.2

The ANOVA results show statistically significant differences (1% significance level) in the frequency indices for pathogenic mycetes between the localities and the years (Duncan tests with p ≤ 0.01). The average F.I. for pathogenic mycoflora over the three years for each locality and for each year are shown in figure 1. The localities with the greatest percentage of pathogenic mycoflora are Fossalta and San Damaso, though their values remain around 20%. The division into two statistically significant groups is immediately evident. Each year is statistically different from the others : the pathogenic mycoflora diminished progressively from 1998 to 2000. The meteo-climatic situation over the three-year period was marked by fairly constant average temperatures during the growth period of oak vegetation (May to November), while the average relative humidity underwent a noticeable drop between 1998 and 2000. In 1999 over 450 mm of rain fell, while in 2000 there was a lesser frequency of rainfall. This seasonal trend indicates that the conditions in 2000 were not optimal for the development of mycetes.

Fossalta A 1998 A S. Damaso A V. Amendola B 1999 B S. Donnino B 2000 C Villanova B

0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 30

Figure 1. Average frequency indices (%) of pathogenic mycoflora for locality (left) and for year (right). Means followed by the same letter are not significantly different at p ≤ 0.01 according to Duncan’s test.

Pathogenicity assays All the fungal suspensions produced symptomatic alterations on the leaves. The leaf symptoms most commonly observed during the final observation (48 hours after the

inoculum) were reddening of the principle nervation and necrosis of the edge of the leaf lamina. Other symptoms noted were curling, the presence of necrotic spots and drying up of the entire lamina. Most of the suspensions caused several associated symptoms, unlike C. populea and P. hartagii which caused marginal necrosis and curling respectively. The leaf spots, the most characteristic and expected symptom, were only induced by G. quercinum and P. quercina. The control leaves did not show alterations. In conclusion, over the three-year period the pathogenic mycetes constantly isolated from oak leaves were A. alternata, A. pullulans and C. cladosporioides. The isolation of C. populea should be emphasized, though this had not formerly been reported as a pathogen of the oak. We think, however, it should be the subject of epidemiological studies to prevent its spread. The results of the mycoflora isolated from the leaves in each locality showed that mycetes which escaped even from asymptomatic leaves (endophytic fungi) play a role in the oak decline as it has been shown in the literature by Halmschlager (1993) and Anselmi et al. (2000). In contrast high values of negative explants (greater than 60%) were obtained in leaves with a high number spots. This was the case in Viale Amendola in 1999 and 2000 which suggests that many of the spots on the leaf lamina were of abiotic origin. This hypothesis is supported by the fact that Viale Amendola is located in an area where traffic is very heavy and, therefore, dense with atmospheric pollutants that may have compromised the physiological state of the leaf structures. The climatic conditions were among the inciting factors of oak decline in trees that were already weak. If climatic conditions are adverse, multifaceted plans must be put into action to oppose the factors (abiotic and biotic) that predispose, incite or contribute to oak decline.

References

Anselmi N., Mazzaglia A. & Vannini A. 2000 : The role of endophytes in oak decline. In: Decline of oak species in Italy: problems and perspectives, Accademia Italiana di Scienze Forestali, Florence : 129-144. Ardizzoni M., Nipoti P., Amorelli G. & Gennari S. 2002 : A three-year survey of oak decline in Modena (Italy). IOBC/wprs Bull. 25(5) : 21-24. Barnett H.L. & Hunter B. B. 1999 : Illustrated genera of imperfect fungi, APS Press St. Paul, Minnesota, 4th edition : 1-218. Luisi N. & Manicone R. P. 1991 : Aspetti epidemiologici di micromiceti associati al deperimento di querceti nell’Italia meridionale. Proceedings Aspetti Fitopatologici delle Querce, Florence, 19-20 November 1990 : 110-121. Halmschlager E. 1993 : Endophytic fungi and oak decline. Proceedings of the International Congress on Recent Advances in Studies on Oak Decline, Selva di Fasano (Brindisi), Italy, 13-18 September 1992 : 77-83. Hawksworth D. L., Kirk P. M., Sutton B. C. & Pegler D. N. 1996 : Ainsworth & Bisby’s Dictionary of the fungi, IMI (UK), 8th edition : 1-616. Ragazzi A. 1988 : Il deperimento del bosco: uno sguardo ai querceti italiani. Proceedings Avversità del bosco e delle specie arboree da legno, Florence, 15-16 October 1987 : 153- 162. Ragazzi A. 1991 : Stato attuale delle conoscenze sulle malattie della Quercia in Italia. Proceedings Aspetti Fitopatologici delle Querce, Florence, 19-20 November 1990 : 37- 46.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 29-36

Incidence d’endophytes fongiques impliqués dans le dépérissement du chêne-liège 1

Antonio Franceschini, Lucia Maddau, Francesco Marras Dipartimento di Protezione delle Piante – Università degli Studi di Sassari – Via E. De Nicola 9, I-07100 SASSARI, Italy

Résumé: Dans une subéraie du Nord de la Sardaigne concernée par des phénomènes de dépérissement, on a noté l’incidence d’endophytes fongiques, en mai et novembre 2000 et en mai 2001, sur différents organes de la canopée (feuilles, rameaux, bourgeons et branches) de chênes-lièges présentant ou non des symptômes de dépérissement. Aucune différence significative n’a été mise en évidence dans la composition qualitative ou quantitative des mycocénoses de ces deux types d’arbres. Parmi les espèces fongiques isolées, deux peuvent être impliquées dans l’étiologie de la maladie: Biscogniauxia mediterranea, de loin la plus représentée dans tous les organes examinés, et Diplodia mutila. On a mis en évidence en particulier une fluctuation saisonnière des populations de B. mediterranea qui semble apparemment liée au stade phénologique de l’hôte et aux caractéristiques biologiques du champignon. Ce dernier passe une grande partie de son cycle à l’état d’endophyte dans les organes aériens de la plante, mais il peut avoir une action pathogène sur les organes ligneux lorsque l’état sanitaire de l’hôte se détériore. Dans les tissus colonisés, ce champignon forme, au début de l’automne, d’abondantes fructifications conidiennes puis un stroma typique avec des périthèces renfermant asques et ascospores. D. mutila n’a jamais été isolé des feuilles, alors qu’il est fréquent dans les rameaux et dans l’écorce des branches. Bien que l’incidence de cet endophyte ait toujours été limitée, il est intéressant pour mieux connaître l’étiologie du dépérissement d’avoir relevé sa présence sur les arbres dépérissants comme sur les arbres apparemment sains d’une subéraie présentant manifestement un potentiel élevé d’inoculum de B. mediterranea.

Mots clés : endophytes, Biscogniauxia mediterranea, Diplodia mutila, dépérissement, chêne-liège.

Introduction

Au cours des dernières années de nombreuses études ont été menées sur les endophytes fongiques de différentes espèces végétales, notamment du genre Quercus (Anselmi et al., 2000). On attribue en effet une importance de plus en plus grande à l’étude de ces champignons, que ce soit dans une perspective écologique ou pour mieux connaître les relations qu’ils établissent avec leur hôtes (Carroll, 1988 ; Petrini, 1991). Sous ce dernier aspect, les endophytes fongiques ayant de l’importance d’un point de vue phytopathologique, notamment en ce qui concerne les phénomènes de “dépérissement” à étiologie complexe, sont ceux qui sont capables de passer des longues périodes de latence dans les tissus des plantes sans qu’elles manifestent des symptômes, mais qui peuvent aussi se comporter en parasites de faiblesse lorsque ces dernières traversent des périodes de souffrance végétative sous l’action d’autres facteurs adverses. On les considère de ce fait comme d’importants facteurs “contribuant” à ces maladies (Manion & Lachance, 1992), parce que leur infection peut accélérer et même aggraver le déclin végétatif des plantes jusqu’à rendre le cours irréversible (Donaubauer, 1998).

1 Ce travail est dédié au professeur Antonio Graniti à l’occasion de son 75° anniversaire.

29 30

Parmi ces endophytes, Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze et Diplodia mutila Fr. apud Mont. sont sans doute les plus fréquemment associés au “dépérissement” de plusieurs espèces de chênes dans la région méditerranéenne (Franceschini et al., 2000). Cependant, beaucoup d’aspects, liés à leur endophytisme et à l’expression de la pathogénicité, qui varient selon les conditions physiologiques de l’hôte, sont encore à éclaircir pour connaître le rôle effectif de ces deux espèces dans l’étiologie de la maladie. Dans le but d’approfondir les connaissances sur la biologie de ces champignons, des recherches ont été menées dans une subéraie dépérissante de Sardaigne, pour étudier la variation temporelle de leur incidence dans les différents organes du houppier de chênes- lièges présentant ou non des symptômes de dépérissement. Cette note présente les résultats préliminaires des deux premières années d’observations.

Matériel et méthodes

Les recherches ont été effectuées dans une subéraie située dans le Nord de la Sardaigne dans la région de Bortigiadas (Sassari), qui présente des graves phénomènes de dépérissement. Au cours de l’année 2000, l’indice moyen de dépérissement (compris entre 0 = arbre sain et 4 = arbre mort), évalué sur 417 plantes réparties sur environ 1,5 ha, était de 1,98 (Franceschini et al., 2002). Dans cette subéraie on a sélectionné six plantes adultes de chêne-liège : 3 sans symptômes (asymptomatiques) et 3 avec une classe de dépérissement comprise entre 1 et 3. En mai et novembre 2000 et en mai 2001, on a effectué dans la partie moyenne inférieure du houppier de chaque plante les prélèvements suivants : 10 échantillons de feuilles, 20 échantillons de rameaux de l’année, 20 échantillons de bourgeons et 5 échantillons de branches d’environ 3 cm de diamètre. 4 petits disques de 2 à 3 mm d’épaisseur distants de 3 cm les uns des autres ont été découpés sur chacune des branches prélevées. On a prélevé également : 2 petits carrés d’environ 3 mm2 (l’un à la base et l’autre à l’apex) de chaque feuille, un petit cylindre de 2 à 3 mm de chaque rameau, un morceau de 2-3 mm3 de chaque bourgeon ainsi qu’un fragment d’écorce et un morceau de xylème de chacun des disques prélevés sur les branches. Un total de 100 fragments a ainsi été prélevé sur chaque arbre. Ces fragments ont été désinfectés en surface par immersion dans de l’eau oxygénée à 10% pendant 15 minutes et après rincés plusieurs fois dans de l’eau stérile. Ils ont ensuite été répartis dans des boîtes de Petri à 4 secteurs, sur un milieu de PDA (Potato-Dextrose-Agar, Difco Laboratories) additionné de 0,06 g/l de streptomycine. Après 4 jours d’incubation à l’obscurité dans une étuve à 25°C, un fragment de mycélium prélevé au bord de chaque colonie développée a été transféré dans d’autres boîtes de Petri contenant le même milieu. Après 20 jours d’incubation, toujours à 25°C, toutes les colonies ont été examinées pour l’identification. La densité des isolats a été exprimée en pourcentage (pourcentage d’échantillons colonisés par rapport au total des échantillons examinés). Après transformation en valeurs angulaires, ces données ont fait l’objet d’analyse de variance.

Résultats et discussion

A chaque période d’échantillonnage, la densité des endophytes présents dans les différents organes examinées ne diffère pas significativement entre les arbres asymptomatiques et les arbres dépérissants (tab. 1). Toutefois des variations significatives de densité ont été relevées entre les différentes périodes d’échantillonnage (p<0,001) et les différents organes (p<0,001). La densité totale des endophytes a très peu varié d’une période de prélèvement à l’autre au cours de l’année 2000, alors qu’elle a considérablement diminué en mai 2001 sur tous les arbres examinés qu’ils soient dépérissants ou non. La baisse de densité à cette période a

concerné l’ensemble des organes, mais elle a été plus importante dans les bourgeons et dans le xylème des branches.

Tableau 1. Variation temporelle de la densité (%) des endophytes fongiques dans les différents organes de la canopée de chênes-lièges apparemment sains (S) ou dépérissants (D)

Organes Mai 2000 Novembre 2000 Mai 2001 S D S D S D

Feuilles 98,3 98,3 60,0 70,0 58,3 45,0

Rameaux 98,3 78,3 91,6 93,3 61,6 56,6

Branches (bourgeons) 95,0 96,6 90,0 86,6 35,0 33,3

Branches (écorce) 80,0 85,5 80,0 86,6 58,3 56,6

Bois 61,6 63,3 60,0 85,0 15,0 30,0

Total 86,6 84,3 76,3 84,3 45,6 44,3

Ce phénomène est dû très probablement à l’amélioration des conditions végétatives des arbres et, en conséquence, à la meilleure réactivité des tissus contre les endophytes, à la suite des abondantes précipitations tombées en hiver. En janvier 2001, on a enregistré 100,4 mm de pluie, contre une moyenne de 30,7 mm pour ce même mois au cours des 4 années précédentes (données du Service Hydrographique de la Sardaigne). Au cours de l’étude, les espèces fongiques suivantes ont été isolées: Acremonium sp., Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Aspergillus sp., Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze, Botrytis cinerea Pers., Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, Cytospora sp., Diplodia mutila Fr. apud Mont., Discula quercina (West.) von Arx, Fusarium sp., Hysterographium sp., Monochaetia sp., Penicillium sp., Pestalotia sp., Phoma spp., Sordaria sp., Stemphylium sp., Trichoderma viride Pers., Ulocladium sp., et 12 mycelia sterilia. Aucune association préférentielle n’a été constatée entre ces espèces et les plantes de chêne-liège, qu’ils soient asymptomatiques ou dépérissantes. Certaines espèces n’étaient présentes que dans certaines organes des arbres examinés alors que d’autres étaient présentes partout mais avec de faibles densités, sauf dans le cas de B. mediterranea qui était de loin l’espèce la plus représentée. Ce champignon a été isolé de tous les organes et les tissus des arbres asymptomatiques ou dépérissants, avec une densité variant de 8,3 à 68,3% (tab. 2). Sa densité variait de façon statistiquement significative en fonction de l’époque d’échantillonnage (p<0,001) et en fonction des différents organes examinés (p<0,001). Les valeurs les plus élevées ont été enregistrées pour les échantillons de tous les organes prélevés en automne, alors que les plus basses ont été obtenues en mai 2001 des bourgeons et du xylème des branches. La densité totale avait augmenté en novembre 2000 et diminué au printemps suivant. Ceci s’explique probablement par le fait que la subéraie étudiée a produit vers la fin du mois de septembre une quantité considérable d’inoculum de B. mediterranea. En effet, chez de nombreux arbres dépérissants, le champignon a différencié d’abondantes fructifications

conidiennes sur le stroma en formation dans les tissus corticaux du tronc et des branches. Après fissuration de ces tissus sous la pression croissante du stroma, les conidies se sont répandues abondamment dans le milieu par voie anémophile, infectant tous les organes aériens des plantes environnantes. D’autre part, la réduction de la densité totale de cet endophyte en mai 2001, qui atteint alors des valeurs très proches de celles relevées l’année précédente, semblerait confirmer l’hypothèse d’une fluctuation saisonnière de ses populations.

Tableau 2. Densité (%) de B. mediterranea, de D. mutila et de l’ensemble des autres espèces isolées dans les différents organes de la canopée des chênes-lièges asymptomatiques et dépérissantes, en mai 2000 (M0), novembre 2000 (N0) et mai 2001 (M1).

Organes B. mediterranea D. mutila Autres espèces

M0 N0 M1 M0 N0 M1 M0 N0 M1 Feuilles 37,5 54,1 44,1 0,0 0,0 0,0 61,6 17,5 8,3

Rameaux 49,1 68,3 49,1 1,6 3,3 3,3 51,6 30,8 7,5

Branches (bourgeons) 23,3 61,6 19,1 3,3 1,6 0,0 78,3 30,8 14,9

Branches (écorce) 37,5 64,1 49,1 0,8 5,8 5,8 45,8 19,1 2,4

Bois 24,1 68,3 8,3 0,8 0,0 2,5 37,5 10,8 11,6

Total 34,3 63,3 34,0 1,3 2,1 2,3 54,9 21,8 9,0

Ce phénomène est mis en évidence seulement si l’on exprime les données concernant l’isolement du champignon en termes de fréquence (pourcentage de colonies de B. mediterranea par rapport au total des colonies isolées) (fig. 1). On constate en effet que la fréquence du champignon augmente de façon notable dans tous les organes de mai à novembre 2000, alors qu’elle diminue au printemps suivant seulement dans les bourgeons et, de façon plus marquée, dans le xylème des branches. L’examen des rapports de densité entre B. mediterranea et les autres endophytes (cf. tab.2) montre qu’en mai 2001, la réduction du nombre d’isolats de B. mediterranea se manifeste surtout au niveau des bourgeons et du bois des branches, alors que pour les autres espèces elle concerne tous les organes, à l’exception du xylème des branches. Il paraît donc vraisemblable que le développement de ce champignon dans les tissus du xylème puisse avoir été conditionné par le stade phénologique de l’hôte. Parmi les autres endophytes, D. mutila est sans doute le plus important compte tenu de ses remarquables capacités parasitaires. Il a été isolé de tous les organes examinés, sauf des feuilles; on l’a trouvé surtout dans les rameaux et dans l’écorce des branches, où on a enregistré les densité les plus élevées (5,8%), alors que sa présence dans les bourgeons et dans les tissus du xylème des branches était occasionnelle (tab. 2). Sa densité ne diffère toutefois pas significativement en fonction des périodes d’échantillonnage ou des organes examinés. Il faut souligner cependant que le nombre d’isolats obtenus au cours de cette étude était limité (35), ce qui ne permet pas d’avoir des indications précises sur son comportement endophytique. Ce champignon semble toutefois avoir un comportement différent des autres endophytes. En un an, la densité totale de D. mutila a presque doublée (de 1,3 à 2,3%), alors

que celle de B. mediterranea a subi une fluctuation saisonnière et celle du total des autres espèces s’est fortement réduite, de 54,9 à 9%. Néanmoins, si on s’intéresse à l’étiologie du dépérissement, il est important de constater que l’on a retrouvé D. mutila dans les rameaux et les branches d’arbres dépérissants ou asymptomatiques d’une subéraie renfermant manifestement un potentiel élevé d’inoculum de B. mediterranea.

100 mai-00 nov-00 mai-01 90

30 Fréquence d'isolement (%) 20

0 Feuilles Rameaux Bourgeons Branches (écorce) Branches (bois)

Figure 1. Fréquence d’isolement de B. mediterranea dans les différents organes de chênes- lièges asymptomatiques ou dépérisssants, en mai 2000, novembre 2000 et mai 2001.

Conclusions

Il ressort de l’examen global des résultats que, dans nos conditions expérimentales, la composition qualitative et quantitative de la mycocénose endophytique des organes aériens du chêne-liège ne différait pas significativement entre les arbres apparemment sains et les arbres dépérissants. Cela n’exclue pas évidemment que certains des endophytes isolés qui, comme B. mediterranea ou D. mutila, possèdent des caractères de pathogenicité puissent jouer un rôle important en tant que facteurs contribuant à la pathogénie du dépérissement. En particulier, la présence de B. mediterranea en densité élevée dans tous les organes de la canopée des chênes-lièges pourrait être à l’origine d’une diffusion épidémique de la maladie, compte tenu des remarquables capacités de survivance du champignon dans les tissus végétaux (Biocca & Motta, 1995) et de l’importante source potentielle d’inoculum que constitue la présence de plusieurs arbres infectés dans la subéraie. On sait que le rapport de B. mediterranea avec son hôte peut être un simple commensalisme dans les feuilles et les bourgeons, ou bien une action pathogène au niveau des organes ligneux. Les propagules pénètrent dans ces organes au moyen de solutions de continuité du rhytidome et le mycélium de germination se diffuse surtout dans le sens radial. Il est vraisemblable que dans les plantes en bonnes conditions végétatives l’activité nécrotrophique du champignon, liée à la production de substances enzymatiques (Magro & Vannini, 1991) et/ou toxiques (données non publiées) puisse être contrariée par la réactivité

des tissus. Au contraire, chez des hôtes déjà souffrants, une telle activité entraîne la dégradation progressive des différents tissus jusqu’à l’aubier. La destruction de ces tissus est suivie par la diffusion du mycélium dans le xylème, qui paraît bruni, et à travers les vaisseaux, dans le reste de la canopée (Vannini & Valentini, 1994). En même temps, dans les tissus corticaux colonisés commence la formation du stroma et des fructifications conidiennes. Enfin, les périthèces renfermant les asques et les ascospores se différentient à l’intérieur du stroma. La suite du cycle biologique du champignon sur chêne-liège comprend, comme sur le chêne vert (Vannini et al., 1996a), une phase endophytique, tant que l’hôte reste en bonnes condition végétative, et une phase parasitaire lorsqu’il devient souffrant (fig. 2).

État État asymptomatique de stress

Plante saine Phase endophytique

Phase parasitaire Vecteurs biotiques (insectes) et abiotiques (vent, eau)

Asques et Conidiophores Dévelop. ascospores et conidies anamorphe

Plante morte Plant dépérissante

Dévelop. télomorphe Phase saprophytaire

Figure 1. Cycle biologique de Biscogniauxia mediterranea sur chêne-liège.

Dans la dernière partie de son cycle vital, le champignon se développe en saprophyte sur des tissus déjà morts où il forme ses structures reproductives. Il se comporte alors non comme un parasite facultatif mais plutôt comme un saprophyte facultatif. La phase saprophytique est en général limitée par le développement d’autres saprophytes qui colonisent en un temps relativement court le stroma du champignon (Ju et al., 1998).

Dans les conditions climatiques méditerranéennes, toutefois, c’est cette dernière phase qui prend vraiment de l’importance dans l’épidémiologie du dépérissement, parce qu’elle conduit à maintenir une pression d’inoculum élevée et permet donc de multiplier les centres d’infection sur les arbres durant une grande partie de l’année, accélérant ainsi leur déclin végétatif (Vannini et al., 1996b). D’autres recherches sont sans doute nécessaires pour éclaircir les mécanismes pathogénetiques et le comportement endophytique de B. mediterranea dans les organes ligneux, en tenant compte en particulier du stade phénologique de l’hôte et des rapports de métabiose, synergisme ou antagonisme qui se peuvent instaurer lors de la colonisation du substrat par d’autres endophytes, en particulier D. mutila. Néanmoins, les résultats de cette recherche suggèrent que dans les subéraies où l’on trouve des arbres infectés par B. mediterranea, il est indispensable de recourir à une prompte élimination de tous les foyers d’infection de façon à limiter l’incidence du champignon et éviter la diffusion épidémique de la maladie.

Remerciements

Recherche effectuée avec une contribution financière du M.U.R.S.T (ex 40%) Progetto PRIN “I patogeni fungini di debolezza nel deperimento delle querce: endofitismo nella strategia di adattamento”.

Références

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Vannini, A. & Valentini, R. 1994 : Influence of water relation in Quercus cerris-Hypoxylon mediterraneum interaction: a model of drought induced susceptibility to a weakness parasite. Tree Physiol. 14 : 129-139. Vannini, A., Biocca, M. & Parapatti, B. 1996a : Contributo alla conoscenza del ciclo biologico di Hypoxylon mediterraneum su Quercus cerris. Informatore Fitopatologico 9 : 53-55. Vannini, A., Paganini, R. & Anselmi, N. 1996b : Factors affecting discharge and germination of ascospores of Hypoxylon mediterraneum (De Not.) Mill. Eur. J. For. Path. 26 : 12-24.

Incidence of fungal endophytes involved in the cork oak decline

Antonio Franceschini, Lucia Maddau, Francesco Marras

Abstract : In a cork oak stand affected by decline in North Sardinia, the incidence of fungal endophytes in canopy organs (leaves, shoots, buds and branches) of both asymptomatic and declining plants, were observed in May and November 2000 and in May 2001. No significant difference was observed in the quantitative and qualitative mycocenose composition of the plants. Among the fungal species isolated, those which may be involved in the disease aetiology were Biscogniauxia mediterranea, recurring often by far in all the examined organs, and Diplodia mutila. On particular, a seasonal fluctuation of B. mediterranea populations has been observed, probably linked to the phenological stage of the host and to the fungus biology. The fungus spends most of its life cycle as endophyte in the aerial plant organs, but it may establish pathogenic relations in the woody organs of the declining trees. In the colonized tissues it produces abundant conidia at the beginning of autumn and afterwards the typical stroma with perithecia containing asci and ascospores. D. mutila has never been isolated from the leaves, while its presence was more frequent in the shoots and bark of branches. Although the incidence of this endophyte was always low, it is interesting for decline aetiology to have revealed its presence in asymptomatic and declining plants in a cork oak stand where an high inoculum potential of B. mediterranea surely exists.

Key words : endophytes, Biscogniauxia mediterranea, Diplodia mutila, decline, cork oak.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 37-40

Molecular characterisation of Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze strains isolated from declining trees of Quercus suber L. in Sardinia

Angela Schiaffino, Antonio Franceschini, Lucia Maddau, Salvatorica Serra Dipartimento di Protezione delle Piante - Sezione di Patologia Vegetale, Università degli Studi di Sassari (Italy)

Abstract : A collection of Sardinian isolates of Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze was analysed by means of RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction), using twenty arbitrary 10-mer primers, in order to detect the genetic variation of the population. Five out of twenty OPA primers were particularly effective in detecting polymorphism. The dendrogram, obtained on the basis of these data by using UPGMA method and Pearson coefficient, showed a high level of genetic variability among the isolates of B. mediterranea analysed.

Key words : Biscogniauxia mediterranea, Quercus suber, RAPD-PCR, polymorphism.

Introduction

Biscogniauxia mediterranea (De Not.) O. Kuntze is one of the most important weakness parasites involved in the decline of various oak species. It is well-known that it spends a latent endophytic phase in healthy host tissues (Biocca & Motta, 1995; Vannini et al., 1996), invading them massively when the host plant is subjected to environmental stresses such as fire and drought (Vannini & Valentini, 1994; Anselmi et al., 2000). The fungus is frequently isolated in the Mediterranean area and it is very often found on declining trees of Quercus suber L. in Sardinia (Marras et al., 1995). Traditional identification methods, even though of crucial importance, do not provide complete information about pathogens. This problem is nowadays overcome by molecular techniques based on nucleic acids. Detection of DNA polymorphism has become central to the investigation of fungal genes and the consequent differentiation of fungal genotypes (Moricca & Ragazzi, 2000). An effective method to detect polymorphism in fungi is represented by RAPD-PCR, which does not require previous information on DNA sequence (Vannini et al., 1999).

Materials and methods

A collection of isolates of B. mediterranea (table 1) was analysed by means of RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction). Fifty-six isolates were obtained in Sardinia from Q. suber and one from Quercus pubescens Willd. Two other isolates were obtained from Q. suber in Spain. For DNA extraction, isolates were grown under shaking at 25°C for 4 days in Potato Dextrose Broth (PDB, Oxoid LTD, Basingstoke, Hampshire, England) with 0.5% yeast extract. Mycelia were harvested by filtration, kept at – 80°C for 48 hours, lyophilised, ground to a fine powder in a 50 ml polypropylene centrifuge tube and then stored at -20°C.

37 38

Total DNA for RAPD experiments was extracted according to Migheli et al. (1996) with the following modifications: 250 mg of sterile sand were added to the tube with 30-60 mg of mycelium before adding 600 µl of lysis buffer containing 50 mM Tris HCl pH 7.2, 50 mM EDTA pH 8.0, 3% SDS and 1% β-Mercaptoethanol; incubation with proteinase K was done at 50°C for 30 min; centrifugation at 12000 rpm. Concentration of DNA was measured by ethidium bromide fluorescent quantitation. Twenty arbitrary 10-mer oligonucleotides (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA, USA) were used as primers (table 2) for random DNA amplification of the B. mediterranea isolates. Amplifications were performed in 25 µl reaction mixture containing bidistilled sterile water, 10 X reaction buffer, 200 µM each of dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.2 µM primer, 1 unit Red Taq DNA Polymerase (Sigma) and approximately 20 ng of template DNA. PCR reactions were performed in a Hybaid PCR-Express apparatus as follows: 1 cycle at 94°C for 1 minute; 40 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 37°C, 2 min at 72°C; a final extension at 72°C for 10 min. RAPD analysis was done at least three times for each isolate to check reproducibility of bands. A negative control (bidistilled sterile water as template DNA) was included in each amplification. Amplification products were analysed by electrophoresis in 1.5% agarose gel containing 0.5 µg/ml ethidium bromide with TAE running buffer at 5V/cm. The size of products was estimated by using 1 Kb DNA ladder (Gibco). Gel images were acquired with a Gel Doc 2000 System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Gel analysis, elaboration of data and dendrogram were done with the UPGMA method (unweighted pair-group arithmetic average method) and Pearson coefficient by using the software Gel Compar Version 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium).

Results and discussion

A total of 59 isolates of B. mediterranea (table 1) were examined for RAPD patterns, by using twenty arbitrary 10-mer primers (table 2). No amplification of DNA was obtained with primers OPA-01, 06, 14, 16 and 17, thus indicating the absence of homologous sequences for these primers in the DNA of all isolates analysed. On the other hand, primers OPA-02, 03, 04, 09 and 13 were particularly effective in detecting polymorphism, whereas the remaining ten primers in many cases gave identical RAPD patterns or no amplification, thus providing no useful information. For this reason they were not considered for matrix construction. Five out of twenty OPAs detected polymorphism and produced a total of 28 scorable fragments, ranging from 400 to 3000 bp. The dendrogram was constructed on these data by using UPGMA method and Pearson coefficient (figure 1). Cluster analysis revealed three main groups with at least 58% similarity. Cluster 1 merged 7 strains at the similarity level of 62%. Cluster 2 grouped 44 strains with a similarity of 63%. Cluster 3 included 5 strains showing a similarity of 71%. Three isolates, which were not included in these groups, had a similarity lower than 55%. The two Spanish isolates (PVS 15 and 16) didn’t cluster together. A high level of genetic variability was detected within a population of B. mediterranea from a restricted area of Sardinia, as well as among isolates from different localities. The use of combined RAPD patterns allowed us to distinguish genetic polymorphism within a population from a single area and not only among isolates from different geographic areas, thus confirming results obtained by other researchers on various populations of B. mediterranea (Vannini et al., 1999). Further studies will be focused on detecting genetic polymorphism among isolates of B. mediterranea living in asymptomatic and declining cork oak plants.

Table 1. Biscogniauxia mediterranea isolates used in this study. Isolate Host Locality* Isolate Host Locality PVS 2 Q. suber Bultei PVS 63 Q. suber PB PVS 11 Q. suber Giara di Gesturi PVS 64 Q. suber PB PVS 15 Q. suber « La Bisbal » (Girona) PVS 65 Q. suber PB PVS 16 Q. suber « Romanya » (Girona) PVS 70 Q. suber PB PVS 46 Q. suber S. Gregorio PVS 71 Q. suber PB PVS 47 Q. suber Mastinarxius (CA) PVS 72 Q. suber PB PVS 48 Q. suber Giara Tuili (NU) PVS 73 Q. suber PB PVS 49 Q. suber Monti Mannu Villacidro PVS 74 Q. suber PB PVS 66 Q. suber Orune Tiliconnera PVS 75 Q. suber PB PVS 67 Q. suber Orune PVS 76 Q. suber PB PVS 68 Q. suber Orune PVS 77 Q. suber PB PVS 69 Q. suber Orune PVS 78 Q. suber PB PVS 80 Q. pubescens Bonnanaro PVS 81 Q. suber PB PVS 85 Q. suber Aggius PVS 82 Q. suber PB PVS 1 Q. suber Pampana Bortigiadas (PB) PVS 83 Q. suber PB PVS 12 Q. suber PB PVS 84 Q. suber PB PVS 39 Q. suber PB PVS 88 Q. suber PB PVS 50 Q. suber PB PVS 90 Q. suber PB PVS 51 Q. suber PB PVS 91 Q. suber PB PVS 52 Q. suber PB PVS 92 Q. suber PB PVS 53 Q. suber PB PVS 93 Q. suber PB PVS 54 Q. suber PB PVS 94 Q. suber PB PVS 55 Q. suber PB PVS 98 Q. suber PB PVS 56 Q. suber PB PVS 99 Q. suber PB PVS 57 Q. suber PB PVS 100 Q. suber PB PVS 58 Q. suber PB PVS 102 Q. suber PB PVS 59 Q. suber PB PVS 103 Q. suber PB PVS 60 Q. suber PB PVS 104 Q. suber PB PVS 61 Q. suber PB PVS 105 Q. suber PB PVS 62 Q. suber PB (*): isolates obtained from Sardinian localities except those from Girona (Spain).

Table 2. Sequence of primers used to amplify DNA of Biscogniauxia mediterranea.

Code - Sequence (5’→3’) Code - Sequence (5’→3’) OPA-01 - CAGGAAATTC OPA-11 - CAATCGCCGT OPA-02 - TGCCGAGCTG OPA-12 - TCGGCGATAG OPA-03 - AGTCAGCCAC OPA-13 - CAGCACCCAC OPA-04 - AATCGGGCTG OPA-14 - TCTGTGCTGG OPA-05 - AGGGGTCTTG OPA-15 - TTCCGAACCC OPA-06 - GGTCCCTGAC OPA-16 - AGCCAGCGAA OPA-07 - GAAACGGGTG OPA-17 - GACCGCTTGT OPA-08 - GTGACGTAGG OPA-18 - AGGTGACCGT OPA-09 - GGGTAACGCC OPA-19 - CAAACGTCGG OPA-10 - GTGATCGCAG OPA-20 - GTTGCGATCC

40 2 51

11 93 90 69 66 94 65 46 85 15 60 84 49 68 56 54 75 76 78 98 74 71 39 57 12 62 59 1 64 80 72 52 77 82 81 61 92 50 83 70 58 55 88 47 67 48 53 73 91 63 99 16 103 103 105 105 104 OPA 102 100 09

13 100 100 9 0

8 0

7 0 C3 C2 6 0 C1 50

Figure 1. Dendrogram of the 59 isolates of Biscogniauxia mediterranea based on OPA 02, 03, 04, 09, 13 RAPD patterns. C=cluster.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 41-48

Distribution of Phytophthora cinnamomi in cork oak stands in Portugal

Cristina Moreira Estação Agronómica Nacional , Quinta do Marquês, 2784-505, Oeiras, Portugal

Abstract : In Portugal, cork and holm oak trees are two important forest species that have been affected by decline disease, mainly during the last two decades. A survey of the presence of P. cinnamomi was carried out between 1994 and 1998. The presence of the fungus was assessed at 56 cork and holm oak stands on a range of different sites located in four regions of Portugal (Trás-os- Montes, Ribatejo, Alentejo and Algarve). Soils and roots samples of four trees in each site were assayed for the presence of P. cinnamomi. Occurrence of the fungus was related to some local and edaphic factors and to the health conditions of the crowns in each tree. Topographic and exposition site characteristics were also evaluated. Results show evidence that P. cinnamomi is widespread in Portugal soils, particularly in the Algarve region where the decline disease presents a high incidence. In this region crown defoliation is correlated with P. cinnamomi presence. Shallow and poor soils, with high content of silt and clay are more infested with P. cinnamomi than other soils. Cork oak stands situated on slopes facing South can also present the highest frequency of P. cinnamomi isolation.

Keywords : Phytophthora cinnamomi, Quercus suber, Q. rotundifolia, soil detection, root detection

Introduction

In Portugal the decline of cork oak tree has been described since the beginning of 20th century, however it was only during 1980’s that this problem became important. Some references assigned the decline of this forest species to insect attacks and pathogenic fungi in the aerial parts of the trees and to other biotic and abiotic factors. More recently, on the basis of some studies certain authors proposed that P. cinnamomi could be a very important contributory factor in the rapid decline of cork oak trees (Brasier et al., 1993; Moreira et al., 1993). Phytophthora cinnamomi Rands is a soil borne plant pathogen fungus that affects almost 1000 different plant species (Zentmeyer, 1980). This fungus has been associated to major declines of forest trees in many different parts of the world, including Castanea sativa Miller in Europe and United States (Grente, 1961 ; Crandall, 1950), Pinus echinata Mill in the United States (Campbell, 1949), Eucalyptus marginata Donn. Ex Sm. in Southwestern Australia (Podger, 1972) and in native forest species (Weste & Taylor, 1971). In Portugal, P. cinnamomi which was reported for the first time in 1947 (Pimentel, 1947) was isolated from diseased trees of C. sativa, Q. suber and Q. robur. So, taking into account the fact that P. cinnamomi has been present in Europe since early the 19th century (Brasier, 1993) and that environmental factors can influence the contribution of P. cinnamomi to tree decline (Newhook & Podger, 1972), this study aimed at assessing the frequency of P. cinnamomi in cork oak stands, associating its presence to the tree health status and to some site characteristics such as topography, exposition and soil type. This work attempts to contribute to a better knowledge of the role of P. cinnamomi in cork oak decline.

41 42

Material and methods

Sampling for P. cinnamomi was carried out from 1994 through 1998, in 56 cork and holm oak sites located in four regions of Portugal (Trás-os-Montes, Ribatejo, Alentejo e Algarve) (fig. 1). The presence of P. cinnamomi was assessed in the roots and soil of four trees in each site. In each tree, crown defoliation level (Cadahia et al.,1991) was assessed. Additional observations were made on each tree with regard to the topographic and exposition characteristics. The texture and the chemical characteristics were determined for each soil sample.

1-30- Algarve

PORTO 31- 46- Alentejo 47-50- Ribatejo 51- 56- Trás-os-Montes

Figure 1. Distribution of sampled sites in Portugal

Sampling regime and isolation methods Soil and root samples were taken from 5-20 top centimetres under each tree in four different directions. The four collections were mixed. Sub samples of soil were placed in separate plastic bags for physical and chemical analysis. The isolation techniques used baits on selective medium for soil and root samples and segments of roots directly placed onto selective medium. The selective medium used (PARBHy) contained 15 g L-1 of malt extract, 20 g L-1 of agar, 10 mg L-1 of pimaricin, 250 mg L-1 of salt ampicillin, 10 mg L-1 of rifampicin, 15 mg L-1 of benomyl and 50 mg L-1 of hymexazol (Robin, 1991). The presence of P. cinnamomi was obtained from soils suspensions (15-20 g suspended in 20 ml of deionised water) baited with floating young cork and holm oak leaves floating on the surface. Baiting was performed under laboratory conditions (20 ºC and diffuse light). Two

or three days later, the baits were removed, washed and blotted dry. After that baits were transferred to the selective medium. Root samples were washed and carefully examined for necroses or other symptoms of infection. Selected roots were cut into small segments (1 cm), surface sterilised (2m in hypocloride sodium solution), rinsed in sterile water, blotted dry and plated onto the selective medium. Sterilised root segments were placed inside a green apple (i.e. Granny Smith), covered with parafilm and incubated at 24ºC till to be necrosed. Small pieces of apple tissue between the necroses and healthy parts were transferred onto plates with selective medium. All plates were incubated at 24ºC in the dark. After 48-72 h P. cinnamomi hyphae were transferred to PDA medium (potato dextrose agar).

Statistical analysis P. cinnamomi isolation data from root and soil samples were expressed as the ratio between number of positive samples (where P. cinnamomi was present) and the total of samples. Contingency tables were built from these data and proportions between the two characteristics were compared using the statistic Chi2. The null hypothesis of independence was designated as H0. A site was considered positive when at least one sample (root or soil) was positive.

Results

Distribution of P. cinnamomi and its association with site factors From the 56 sites surveyed, 27 were infected with P. cinnamomi. Most of the positive sites were obtained from poor shallow soils located in Algarve region (73%) (fig. 2). It is also in this region that disease expression has the highest impact, and some sites have 90% of the trees diseased or dead. Taking into consideration all the samples collected in a given site, the percentage of P. cinnamomi recovery from roots and soils was very high in Algarve (58%) when compared with those from Alentejo+Ribatejo (12%) e Trás-os-Montes (14%) (tab. 1).

80 70 recovery 60 50 40 30 P. cinnamomi 20 10 0

Percentage of Algarve Alentejo e Ribatejo Trás-os-Montes

Figure 2. Presence of P. cinnamomi in studied sites in different regions

According to the exposure, 18 sites were sampled in the north, 15 in the south and 23 in the plains. Results show that P. cinnamomi frequency isolation is higher from samples collected in the South (73%) than those sampled in the North (44%) and in the plains (35%).

Data analysis from root and soil samples shows that recovery of P. cinnamomi from tree and soil, related to exposure are significantly different, thus the null hypothesis (H0) that these two characteristics are not related to P. cinnamomi recovery is rejected (table 2, 3).

Table 1. Recovery of P. cinnamomi in oak trees from root and soil samples

Samples Region Total Root (+) Soil (+)

Algarve 117 26% 32%

Alentejo+Ribatejo 80 9% 3%

Trás-os-Montes 22 9% 5% (+: positive isolation)

Table 2. Frequency of P. cinnamomi recovery in oak sites from root samples in relation to with tree exposure.

P. cinnamomi Tree exposure North South Plain Total

Present 10 19 10 39

Absent 61 41 78 180

Total 71 60 88 219 H is Chi2 = 11,02 df = 2 p = 0,404 0 rejected

The highest percentage of infected trees was recorded on sloping sites(fig. 3). It was found that frequency of P. cinnamomi recovery, particularly from root samples, was higher from stands situated on slopes than in valleys or on top-hills. Soil samples from valleys also showed a high recovery of the fungus. Frequency of P. cinnamomi presence is not 2 2 significantly different from the tree and soil situation (Chi =1,879 < Chi 0,05 (2) = 5,991). Varied slopes and terrain shapes could induce differences in edaphic factors, such as moisture and nutrients. P. cinnamomi was isolated from all soil groups sampled, however its distribution did not show a clear relationship to any soil texture. However, the highest frequency of P. cinnamomi recovery was obtained in soils with a high level of clay (> 15%) and silt (> 30%) as opposed to low level of sand (8-30%). The soil pH range (3,5- 6,5) did not show any restriction to P. cinnamomi activity though the highest frequency isolation was obtained in soils with pH > 4,0-6,0.

Table 3. Frequency of P. cinnamomi recovery in oak sites from soil samples and its association with soil exposure.

P. cinnamomi Soil exposure North South Plain Total Present 12 21 7 40

Absent 59 39 81 179

Total 71 60 88 219 2 Chi = 17,62 df = 2 p = 0,0149 H0 is rejected

P. 35 30 recovery 25 20 15 Percentage of

cinnamomi 10 5 0 Slope Tophill Valley Tree situation

Root Soil

Figure 3. Frequency of P. cinnamomi recovery from roots and soils on basis of tree situation

Distribution of P. cinnamomi and its association with crown status All the trees studied did not show signs or symptoms of other diseases or insect attack. Frequency of P. cinnamomi associated with crown status was only performed with data collected in Algarve and Alentejo+Ribatejo regions. Table 4 shows that frequency of P. cinnamomi in cork oak roots and soil samples collected in the Algarve region is significantly different from the crown status of each tree ; we reject the hypothesis that the two characteristics are independent. Roots of trees with high level defoliation (61-100%) were more infected than trees with weak defoliation. On the contrary, soil samples were more infested on rizhosphere of trees showing a low defoliation level (0-25%). Drought has a greater impact on soils under trees with bad crown status, which influences tree health and consequently P. cinnamomi activity. This situation was not observed on the Alentejo and Ribatejo samples.

Table 4. Frequency of P. cinnamomi recovery and its association with tree defoliation degree

Algarve Alentejo+Ribatejo Defoliation level +R -R +S -S +R -R +S -S 0 3 19 4 18 0 4 0 4 1 5 42 13 34 0 11 0 11 2 5 50 4 51 6 33 2 37 3 11 22 1 32 1 9 1 9 4 8 27 3 32 0 1 0 1 Chi2 (4) 9,92 r 14,5 r 2,8 a 1,45 a

H0 -defoliation degree is independent of P. cinnamomi isolation ; a-H0 accepted ; r- H0 rejected ; 2 + Chi 0,05 (4) = 9,8; R : number of trees with infected roots ; -R: number of trees with non infected roots ; +S : number of positive soil samples ; _S : number of negative soil samples.

Discussion

Relationship of some edaphic factors to distribution of P. cinnamomi P. cinnamomi was isolated from all sampled regions, although the Algarve region shows the higher incidence (73%). Shallow soils (schist areas) (Leptosols) with fine texture, high level of clay and silt, showed a high incidence of P. cinnamomi from roots and soils and had a high impact on decline disease. This soil type obstructs deep root growth and only a small volume of soil is available for the trees which thus develop a surface root system. On the other hand, this soil type dries and floods easily. This situation promotes high inoculum level and a quick infection of P. cinnamomi in favourable conditions (intense rainfall and severe and continuous drought). However, P. cinnamomi was isolated from all soil types sampled, including leptosols, cambisols, podzols, luvisols and complex luvisol+leptosol. The soil fertility was in general poor in the studied soils where the decline disease was present. Phosphorous and nitrogen levels were particularly low while potassium was high (Marcelino, 2001).

Relationship of some site factors to distribution of P. cinnamomi P. cinnamomi occurrence was higher in areas with south exposure where cork oak trees seemed more diseased. Sun radiation is higher on slopes exposed to south with a lower moisture concentration and less vegetation biomass covering the soil than in the north exposure. It is assumed that south exposure is prone to P. cinnamomi infection due to water stress as roots are damaged by water shortage. The results did not show a clear relationship between topographic situation and P. cinnamomi presence, nevertheless P. cinnamomi occurrence in slopes was more frequent.

Relationship of crown status to distribution of P. cinnamomi Results from Algarve region show a relationship between crown status and the occurrence of P. cinnamomi in roots and in rhizosphere. Mature trees that seems to remain healthy (d.l. 0,1) show a lower frequency of P. cinnamomi in roots than in rhizosphere. On the contrary, trees with a high defoliation level (d.l. 3,4) show an important occurrence of P. cinnamomi in roots, while soils samples appeared less infested. From our data we conclude that around roots of trees with low defoliation level there were better conditions for P. cinnamomi survival,

provided by protection of the healthy crowns that avoid soil drought and conduct to a favourable humidity level. Further more, P. cinnamomi invasion of these trees appeared to be slower. On the contrary, trees showing chronic disease with a high crown defoliation, provide less protection, thus the soil under them dries more quickly. This situation is prone to infection by P. cinnamomi. P. cinnamomi is known as a plant pathogen of many different hosts including cork oak tree (Tuset et al., 1996 ; Moreira et al., 1997 ; Robin et al., 1998). This fungus is known as an introduced pathogen (Zentmeyer, 1980), however the widespread occurrence in Portugal in different sites, favourable for its growth, leads us to recognise, at present, P. cinnamomi as a widespread soil borne pathogen. Its association to apparently healthy trees even in sites with good conditions for P. cinnamomi activity lead us to think that many other factors must occur to induce the disease (Moreira et al., 1999; Hansen & Delatour, 1999). In this study there was no pattern associated to the decline neither a clear association with the presence of P. cinnamomi as has already been suggested by Robin et al. (1998) and Hansen & Delatour (1999). However, there are some characteristics, such as, soil type and tree situation, that seem to influence P. cinnamomi distribution and disease expression. Future research must evaluate the combination of factors that influence the root system development, such as drought, temporary flooding or others that predispose trees to a quick invasion and progress by the pathogen.

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 49-52

Distribution of the isolations of Phytophthora cinnamomi in the Spanish Quercus areas with oak decline disease

Juanjo J. Tuset 1, Concha Hinarejos 1, J.J. Mira 1, J.M. Cobos 2 1 Departamento de Protección Vegetal y Biotecnología. IVIA, Moncada, Valencia, Spain. 2 Subdirección General de Sanidad Vegetal, MAPA, Madrid, Spain.

Abstract : The Quercus spp. decline (disease named “seca” in Spain) mainly affects holm and cork oaks. The soil fungus, P. cinnamomi is the principal causal agent of the “seca”. Since 1992, its presence has been detected either in the soil or in feeder roots of trees showing serious symptoms of desiccation and death. The General Subdirection for Plant Health of MAPA and the Unit of Mycology of IVIA contributed since 1992 to different research programs and cooperation agreements concerning “seca” disease, the most important part being given to field surveys and laboratory analyses of soil and feeder roots samples. The survey was performed from 1995 to 2000 in woodlands of 17 Spanish provinces where the two mediterranean species, Q. rotundifolia and Q. suber are predominant. Samples were completed in different seasons of the year, in trees showing symptoms of oak decline and growing in various orographic situations. From a total number of 536 samples, 40 isolations of this fungus were obtained in 10 provinces of the occidental part of Spain.The results of the positive isolation of P. cinnamomi, both in the soil and in the roots, from superficial or deep soil layers, showed that the detection of the fungus in the Spanish soil conditions greatly depends of the percentage of humidity of the samples.

Keys words : Quercus rotundifolia, Q. suber, oak decline disease, Phytophthora cinnamomi.

Introduction

Since the beginning of the 80’s, we observed in isolated and little stands, holm oaks and cork oaks with symptoms of weakness, defoliation and death. This symptomatology, a typical oak decline manifestation, is named “seca” in Spain(Anonymous, 1992). Later, in the 90’s, this disease increased (Cobos et al.,1993) and at present important extents of oak forest are damaged in the central and occidental parts of Spain. Phytophthora cinnanomi Rands is the fungus associated to the “seca” disease of Mediterranean Quercus, specially Q. rotundifolia Lam. and Q. suber L. (Tuset et al.,1996). From year 1991, its presence has been frequently detected, both in the soil and in the feeder roots of trees of these two species showing clear symptoms of desiccation and death (Cobos et al.,1993). For its development, this soil inhabitant fungus requires hot temperatures (20-30ºC) and a soil humidity higher than 7-8%. Free water is necessary for the formation, release and motility of the zoospores which are the main infection organs (Zentmyer, 1980). Low soil humidities and temperatures less than 10ºC clearly reduce fungus survival (Shea et al., 1980). Due to the importance of the subject, the General Subdirection for Plant Health of MAPA and the Unit of Mycology of IVIA participated since 1992 in several research programs and cooperation agreements concerning “seca”. In these programs, the main place was given to field surveys and laboratory analyses of soil and feeder roots samples. This paper presented the results of P. cinnamomi isolations obtained from 1995 to 2000 in several Spanish areas where Mediterranean Quercus species, specially Q. rotundifolia and Q. suber, constitute important forest masses.

49 50

Materials and methods

Number and provenance of the samples. The fungus isolation have always been obtained from soil and feeder roots of trees showing typical symptoms of oak decline and generally located in very damaged stands. The following provinces were surveyed : Alicante, Avila, Badajoz, Barcelona, Burgos, Cáceres, Cádiz, Castellón, Ciudad Real, Gerona, Madrid, Navarra, Salamanca, Segovia, Tarragona, Toledo, Valencia and Zamora. The responsible of the survey was the General Subdirection for Plant Health of MAPA from 1995 to 1997 and the Unit of Micology of IVIA from 1998 to 2000. A total of 536 samples were analysed, 269 from surface layers of the soil (depth less than 0,4 m) and the rest from 69 soil profiles with depths between 0.5 and 2.25 m. The samples (soil and roots) were always collected in spring-summer and in autumn-winter. The points chosen for execution of soil profiles were located in forest areas showing serious problems of “seca” and in various orographic situations (plane, valley and hillside). Phytophthora isolation. The following methodology was used in the study : – 1 Soil suspension in tap water (1:5) was directly poured (2 ml per dish) on the surface of a Phytophthora-selective medium, PONCHET modified (penicillin G 0.250 gr/l ; polymyxin B 0.001 gr/l ; benomyl 0.03 gr/l ; PCNB 0.130 gr/l ; hymexazol 0.1 ml/l.; malt extract 80 gr/l and agar 15 gr/l) and incubated at 24-25ºC for 3-5 days. – 2 Little pieces of small roots and feeder roots, previously washed with tap water and sterilized distilled water were placed (5-7 pieces per dish) on the surface of PONCHET modified medium modified and incubated at 24-25ºC for 3-5 days. – 3 Soil suspension in tap water (1:5) and small roots and feeder roots (in this case, in distilled water) were baited with colourless petals excised from unopened young carnation buds or small pieces of young avocado leaves on the laboratory bench (continuous daylight) for 2-4 days. The contaminated carnation petals or avocado leaves were transferred to PONCHET modified medium to induce mycelium growth. Identification. Phytophthora isolates were identified according to their mycelial morphology (hyphal swellings and chlamydospores) and reproductive structures (sporangia and oospores). For the production of sporangia the fungi isolates were cultured in an agar-vegetables medium for 6-8 days in the continuous light. Later discs or strips of this medium with mycelium were immersed in a nonsterile soil extract. For the production of oospores the Phytophthora isolates were paired with an isolate of P. capsici Leonian (mating type A1).

Results

Phytophthora cinnamomi was detected in ten Spanish provinces (fig. 1) with a total of 40 positive isolations (Table 1). 70% of isolates were obtained from samples collected in spring– summer and 30% in autumm-winter. 65% of the fungus isolates were obtained in deep soil layers and 35% in the surface layers. The soil humidity of the samples collected fluctuated between 2,8% and 19,3%. The positive P. cinnamomi isolations were principally obtained in the soil (35 samples) whereas only 28 samples of feeder roots permit P. cinnamomi isolation. Also significant was the fungus isolation from both the soil and the roots of 23 samples. In the Spanish conditions, P. cinnamomi was isolated from Q. rotundifolia, Q. suber and Q. rubra L. as well as from Cistus sp.

Table 1. Characteristics of samples from which P. cinnamomi was isolated.

Date Province Municipality Plant species Root (R) or Surface Deep % Soil Soil (S) layer layer Humidity /04/95 Toledo Oropesa Q. rotundifolia R X 2.8 /05/95 Toledo Sevilleja de la Jara Q. rotundifolia R, S X 6.3 /07/95 Navarra Baztan Q. rubra S X 5.6 /12/95 Cáceres Alcuescar Q. rotundifolia S X 17.5 /12/95 Cáceres Alcuescar Q. rotundifolia S X 13.6 /12/95 Cáceres Alcuescar Q. rotundifolia R X 14.4 /12/95 Cáceres Alcuescar Q. rotundifolia S X 14.9 /02/96 Toledo Sevilleja de la Jara Q. rotundifolia R, S X 12.1 /02/96 Badajoz Alburquerque Q. rotundifolia R X 16.9 /04/96 Cáceres Alcuescar Q. rotundifolia R, S X 19.1 /04/96 Toledo Oropesa Q. rotundifolia S X 9.2 /04/96 Avila Mijares Q. rotundifolia R, S X 11.9 /04/96 Avila Mijares Q. rotundifolia S X 6.7 /04/96 Avila Mijares Q. rotundifolia R, S X 12.8 /04/96 Badajoz Alburquerque Q. rotundifolia R, S X 10.8 /10/96 Avila Mijares Q. rotundifolia R, S X 15.2 /10/96 Avila Mijares Q. rotundifolia R, S X 10.4 /11/96 Cádiz La Almoraima Q. suber S X /11/96 Cádiz La Almoraima Q. suber S X /03/97 Cádiz La Almoraima Q. suber R, S X 8.6 /03/97 Cádiz La Almoraima Q. suber R, S X 18.4 /03/97 Cádiz La Almoraima Q. suber R, S X 9.2 /05/97 Toledo Oropesa Q. rotundifolia R, S X 7.2 /05/97 Toledo Oropesa Q. rotundifolia R, S X 8.2 /05/97 Madrid Manzanares el Real Q. rotundifolia R, S X 14.2 /04/98 Cádiz La Almoraima Q. suber R, S X 13.7 /04/98 Cádiz La Almoraima Q. suber R, S X 19.3 /04/98 Cádiz La Almoraima Q. suber S X 13.7 /05/98 Toledo Quintos de Mora Q. rotundifolia R X 7.8 /06/98 Cáceres Mesillas 1 Q. rotundifolia S X 11.7 /06/98 Cáceres Mesillas 2 Q. rotundifolia R, S X 14.4 /09/98 Segovia Rio Frio Q. rotundifolia R, S X 9.3 /11/98 Cáceres Pinofranqueado Cistus sp R, S X 4.8 /11/98 Cáceres Pinofranqueado Cistus sp R X 3.2 /05/99 Zamora Fermoselle Q. rotundifolia R, S X 16.9 /05/99 Zamora Fermoselle Q. rotundifolia R, S X 14.9 /05/99 Salamanc El Bodón Q. rotundifolia R, S X 6.8 /05/99 Salamanc El Bodón Q. rotundifolia R, S X 7.9 /05/00 Cáceres Monfragüe Q. rotundifolia S X 7.6 /05/00 Cáceres Monfragüe Q. rotundifolia S X 7.7

Conclusions

The positive fungus isolations obtained in the last ten years in many forest areas located in the central and occidental parts of Spain clearly suggests a wide distribution of P. cinnamomi. The fugus is isolated more frequently in the deep soil layers than in the surface soil layers.This is due to a minor oscillation of the temperature and the humidity in these soil fractions. The soil humidity is the first condition for survival of the fugus, and besides, this factor clearly favours its isolation. The fungus isolation was most frequently obtained in samples which soil humidity varies between 5% and 15% (fig. 2). In the Spanish climatic conditions, P. cinnamomi can be isolated, both from soil and feeder roots, in the four seasons of the year. Besides Quercus trees, P. cinnamomi also parasite plants of the maquis as Cistus sp., factor that enlarges the possibility of its survival.

Province No. of isolations 1. Ávila 6 2. Badajoz 2 3. Cáceres 1 4. Cádiz 8 5. Madrid 1 6. Navarra 1 7. Salamanca 2 8. Segovia 1 9. Toledo 6 10. Zamora 2

Figure 1. Actual recorded distribution of P. cinnamomi in Spain

40 30 20 10 % isolations 0 <5 5-10 10-15 >15 % soil humidity

Figure 2. Percentage of P. cinnamomi isolations in relation to the soil humidity.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 53-56

Influence of culture water-solution of five species of Mediterranean Quercus in the asexual reproduction of Phytophthora cinnamomi

Fermin Cots, Juanjo J. Tuset Departamento de Protección Vegetal y Biotecnología. Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. Carretera Moncada-Naquera, Km 4,5. 46113 Moncada, Valencia, Spain.

Abstract : The holm oak, cork-oak and American red oak are damaged by a disease induced by the fungus Phytophthora cinnamomi. Infection of the root system occurs mainly via zoospores which production in the soil depends on natural water amount. We studied the effect (possibly by fungistasis) of culture solutions from 5 Quercus species on the production of P. cinnamomi sporangia and zoospores. Oak seedlings were cultivated 30 days in deionized water. Afterwards, these culture solutions were employed in three conditions: non sterilised, sterilised 5 mn at 80 ºC and concentrated 5 times. Fungus mycelium was placed in petri dishes containing one of the culture solutions during 5-6 days, then the number of sporangia and released zoospores were counted. No difference in the production of these organs was observed in the three types of culture solutions from each oak species .

Key words : Quercus rotundifolia, Q. suber, Q. faginea, Q. pyrenaica. Q. petrea, Phytophthora cinnamomi, cultural solution, sporangia, zoospores

Introduction

Since the early 90’s, the sensitivity of Quercus rotundifolia Lam., Q. suber L. and Q. rubra L. to plant-pathogenic activity of Phytophthora cinnamomi Rands has been confirmed (Brasier, 1992 ; Cobos et al, 1993 ; Tuset et al, 1996). The disease caused by this fungus is known as “seca” (a typical oak decline manifestation) and is at present considered as the most important disease of the Mediterranean Quercus (Brasier et al, 1993; Tuset et al, 1996). The development of tolerant or resistant root stocks is necessary for the control of Quercus root rot caused by P. cinnamomi. Therefore, it is essential to know the pathogen relation between the plant and the fungus, as well as the mechanisms that provide infection condition to the roots. Zoospores are the most effective inoculum of the fungus (Hickman, 1970). Studies on Eucalyptus and other forest species (Hinch & Weste, 1979) and on Persea spp. (Ho & Zentmyer, 1977) have shown that a great number of zoospores are attracted by both susceptible and tolerant species. This takes place mainly in the region of root elongation (Zentmyer, 1960), and when contact occurs, the zoospores encyst rapidly on the root surface and germinate through a germ tube that penetrates the root surface (Ho & Zentmyer, 1977; Aveling & Rijkenberg, 1985). We analysed the host-parasite interaction, focusing the experimentation on the influence of root exudates produced in culture solution of seedlings of 5 species of Quercus on the formation of P. cinnamomi sporangia and zoospores.

Materials and methods

Fungus isolates. Two P. cinnamomi isolates have been employed, one named IVIA-2 and obtained from Q. rotundifolia (province of Caceres) and the other (IVIA-7) obtained from Q. rubra (province of Navarra). Both were isolated from feeder roots and trunk cankers respectively and were conserved in potato-dextrose-agar (PDA), until the experimentation trials.

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Seedlings. One-year-old seedlings of Q. rotundifolia, Q. suber, Q. faginea Lamk, Q. pyrenaica Willd, Q. petraea (Matt.) Lieb., all them from official nurseries of Castilla-Leon Community, were employed in the trials. They were 20-25 cm high. Culture solutions. The root systems of the seedlings of the 5 Quercus species were cleaned and washed perfectly and immediately placed 30 days in distilled water (E.C. : 0.03 mS/cm). Thus we obtained what we called « culture solutions » of each Quercus species. The obtained solution (non-sterile) was filtrated twice through a Whatman filter paper (nº 40-medium) and conserved at 4-5 ºC. The electrical conductivity (E.C.) of these culture solutions was measured during the experimentation (tab. 1). Production of sporangia and zoospores. Both isolates IVIA-2 and IVIA-7 were grown in PDA for 6-7 days at 24 ºC in the dark to produce a good mycelial growth. Afterwards, disks of 0.7 cm diameter mycelium carriers were cut and placed in Petri dishes (4.8 cm diameter) containing 10 ml of the three different types of culture solutions of each Quercus species: a) non sterilised culture solution; b) culture solution sterilised at 80 ºC for 5 min and c) non sterilised culture solution concentrated 5:1. Petri dishes holding the same number of mycelium disks but with non-sterile soil extract (prepared suspending 10g of natural fresh soil from holm oak stand in one litter of deionized water for 3 days and after filtering twice) and other dishes with distilled water used as control. All the Petri dishes prepared in this manner were placed in continuous light for 5 days. Afterwards we observed the production of sporangia and zoospores. Mature sporangia (sporangia/mm2) as well as released zoospores were counted. The latter by means of a hemacytometer.

Table 1. Electrical conductivity range (mS/cm) of the two culture solutions of 5 Quercus species

Quercus species Non sterile solution Concentrated solution : 5/1 Q. rotundifolia 122.10-144.10 544.10-575.40 Q. suber 136.37-151.37 543.60-555.50 Q. faginea 121.95-130.95 558.80-663.04 Q. pyrenaica 108.80-128.80 576.37-613.00 Q. petraea 143.60-146.60 510.02-521.95

Results and discussion

Both sporangia production and released zoospore number depended more the treatment received by the culture solutions than the Quercus species used to obtain these solutions. No significant differences in both sporangia and zoospores number appear among the culture solutions of the 5 Quercus species (tab. 2). After 30 days in distilled water, the seedlings showed a normal growth. both in the aerial part and in the roots. The point of using deionized water was to obtain a culture solution with a very small amount of external substances which would be able to interfere with the root exudates, and consequently affect the results. The originality of this work is that the susceptibility and tolerance of Quercus species to P. cinnamomi was studied by using culture solutions of each Quercus species for sporangia and zoospores production. We observed that sporangia and zoospores numbers are greatly influenced by the different culture solution treatments. The results obtained with sterilised culture solutions were significantly less than those obtained with non sterilised culture solution. The same occurs in the concentrated culture solutions 5:1 (tab. 2).

This negative effect on the asexual reproduction in the two P. cinnamomi isolates is due. on the one hand. to the increase of electrical conductivity (E.C.) of the culture solution (tab. 2) (Tsao & Zentmyer. 1979 ; Lapeña & Tuset,. 1999). On the other hand. it depends also from the sterilisation and concentration of the culture solutions by heat that induces death of bacteria and micro-organisms presents in the culture solution,. which are favourable to the sporangia formation (Ayers & Zentmyer, 1971).

Table 2. Sporangia and zoospores of two isolates of P. cinnamomi (IVIA-2 and IVIA-7) produced in three different culture solutions of 5 Quercus species.

Isolate IVIA-2 Culture solutions Quercus species non-sterile solution sterilised solution (80ºC / 5 mn) concentrated solution 5:1 A B A B A B Q. rotundifolia 117.13 a 68 104 a 73.49 a 42 104 a 91.07 a 46 104 a Q. suber 120.60 a 65 104 a 76.83 b 35 104 b 98.57 b 58 104 b Q. faginea 90.45 b 68 104 a 68.99 c 47 104 c 87.84 c 58 104 b Q. pyrenaica 90.45 b 62 104 b 82.91 d 39 104 b 87.84 c 47 104 a Q. petraea 82.91 c 51 104 c 69.72 c 38 104 b 81.61 d 54 104 c Control A B 4 H2O Distilled 96.10 d 48 10 d Soil extract 111.10 e 65 104 a

Isolate IVIA-7 Culture solutions Quercus species non-sterile solution sterilised solution (80ºC / 5 mn) concentrated solution 5:1 A B A B A B Q. rotundifolia 103.64 a 73 104 a 65.23 a 31 104 a 80.30 a 47 104 a Q. suber 118.87 b 52 104 b 66.83 a 28 104 b 101.30 b 56 104 b Q. faginea 126.26 c 79 104 c 58.42 b 36 104 c 97.84 c 53 104 c Q. pyrenaica 93.18 d 61 104 d 79.15 c 58 104 d 85.67 d 52 104 c Q. petraea 103.64 a 77 104 c 52.76 d 39 104 e 94.07 e 60 104 d Control A B 4 H2O Distilled 91.18 d 34 10 e Soil extract 106.10 e 62 104 d

IVIA-2: P. cinnamomi isolate from Q. rotundifolia; IVIA-7: P. cinnamomi isolate from Q. rubra; A: sporangia/mm2. B: zoospores/ml. Means in the same columns followed by the same letter do not differ according to Duncan multiple range test (P≤ 0.05)

The technique employed enables us to reject the influence of root exudates in culture solution of the 5 Quercus species on P. cinnamomi sporangia production and zoospore release. The amount of sporangia and zoospores always remained at normal intervals in all tests. Even. the culture solutions from species usually tolerant to P. cinnamomi (as Q. faginea and Q. petraea) produced greater number of sporangia and zoospores than those of susceptible species as Q. rotundifolia.

Studies on Eucalyptus spp. and other Australian forest species and Persea spp. have shown that during the pre-penetration phase the zoospores are attracted both by susceptible and by tolerant species (Hinch & Weste. 1979 ; Ho & Zentmyer, 1977). This should confirm the lack of influence of the root exudates of Quercus plants on the production of Phytophthora infectious organs. Therefore. the possible resistance of some Quercus species should be associated to the processes that are produced in the post- penetration phase (Ho & Zentmyer, 1977).

References

Aveling. T.A.S. & Rijkenberg. F.H.J. 1985 : Infection of susceptible avocado by Phytophthora cinnamomi. S. Afr. Avocado Growers´ Assoc. Yrbk. 9 : 55-56. Ayers. W.A. & Zentmyer. G.A. 1971 : Effect of soil and two soil Pseudomonas on sporangia production by Phytophthora cinnamomi. Phytopathol. 61 : 1188-1193. Brasier. C. M. 1992 : Oak tree mortality in Iberia. Nature. 360 : 539. Brasier. C. M.. Robredo. F. & Ferraz. J.F.P. 1993 : Evidence for Phytophthora cinnamomi involvement in Iberia oak decline. Plant Pathol. 42 : 140-145. Cobos. J.M.. Montoya. R. & Tuset. J.J. 1993 : New damage to the Quercus woodlands in Spain. Preliminary evaluation of the possible implication of Phytophthora cinnamomi. Proc. Int. Congress “Recent Advances in Studies on Oak Decline”. Università degli Studi. Bari (Italia) : 163-169. Hickman. C.J. 1970 : Biology of Phytophthora zoospores. Phytopathol. : 1128-1134. Hinch. J.M. & Weste. G. 1979 : Behaviour of Phytophthora cinnamomi zoospores on roots of Australian forest species. Austr. J. Bot. 27 : 679-691. Ho. H.H. and Zentmyer. G.A. 1977 : Infection of avocado and other species of Persea by Phytophthora cinnamomi. Phytopathol. 67 : 1085-1089. Lapeña. I. & Tuset. J.J. Influence of electrical conductivity due to nitrogen in the in vitro growth and sporulation of Phytophthora citrophthora. P. parasitica and P. cinnamomi. XIII Congress of European mycologists, 21-25 September (1999), Alcala de Henares (Madrid) : 74 Tsao. P.H. & Zentmyer. G.A. 1979 : Suppression of Phytophthora cinnamomi and P. parasitica in urea-amended soils : 191-199. In: Soil-borne plant pathogens. eds. Schippers and Gams. Academic Press. London. Tuset. J.J.; Hinarejos. C.. Mira. J.L.; Cobos. J.M. 1996 : Implicación de Phytophthora cinnamomi Rands en la enfermedad de la “seca” de encinas y alcornoques. Bol. San. Veg. Plagas 22 : 491-499. Zentmyer. G.A. 1960 : Chemotaxis of zoospores for root exudates in relation to infection by Phytophthora cinnamomi. (Abstr.). Phytopathol. 54 : 225-228.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 57-60

Influence of electrical conductivity due to nitrogen on Phytophthora infection in seedlings of Quercus rotundifolia

Immaculada Lapeña, Juanjo J. Tuset Departamento de Protección Vegetal y Biotecnología. Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. Carretera Moncada-Náquera, km 4,5. 46113 Moncada,Valencia, Spain.

Abstract : The holm oak (Quercus rotundifolia) is damaged by a disease known in Spain as “seca” which is a typical manifestation of “oak decline”. The main parasitic agent of this disease is the fungus Phytophthora cinnamomi. Generally, the electrical conductivity (E.C.) of the nutrients solution has not been considered in root rot induced by Phytophthora fungi. This is due to a lack of information about the influence caused by the N fertilizer carriers on the development of this diseases. It is more evident in the association Quercus-Phytophthora. Therefore, the present study shows the effect produced on the zoospores of P. cinnamomi and P. parasitica by four different levels of E.Cs. of the soil solution, three of them being due to NH4NO3 fertilizer during the infection of the roots of holm oak seedlings. In the experiment, P. cinnamomi appeared more susceptible to the toxicity of the fertilizer than P. parasitica. Thus, P. cinnamomi induced between 60% and 100% of damaged seedlings in all tested E.Cs. and a mortality that decreased from 80% to 20% when the E.C. increased. P. parasitica caused a similar injury of seedlings in all the E.Cs. and a mortality varying from 30% to 70% but in this last case no any correlation exists with the E.C. increment. Q. rotundifolia appeared to be sensible to P. cinnamomi and to P. parasitica also. The last species has never been mentioned as a pathogen of Quercus spp. In the test, the seedlings have also suffered alterations as a result of the transplantation.

Key words : Quercus rotundifolia, Phytophthora cinnamomi, P. parasitica, oak decline disease, N fertilizer carriers.

Introduction

The holm oak (Quercus rotundifolia Lam.) and the cork-oak (Q. suber L.) are the main Quercus species of the Iberian Peninsula, predominating in the occidental and central parts of the Spain and occupying approximately 10% of the total surface of this country. In these areas, the “seca” disease (an oak decline manifestation) induces a defoliation, a more or less rapid desiccation of the branches, sometimes with blackish gummy exudations in the trunk and death of the trees. Until the eighties, this disease was imputed to a complex association between diverse cultural factors linked to rains, severe droughts and secondary attacks of insects and fungi (Brasier et al., 1993; Cobos et al., 1993). However, since the beginning of the nineties , the repeated isolation of Phytophthora cinnamomi Rands from soil and feeder roots of holm oak and cork-oak showing “seca” symptoms modified the previous diagnostic, this pathogen appearing as the main agent cause of this disease in the Mediterranean Quercus (Tuset et al., 1996). The zoospores are the principal dispersion organs of Phytophthora fungi (Hickman, 1970) ; they are released from sporangia when free water is available in the soil (Matheron, 1996). Stress due to flooding can predispose the plants to the fungus infection (Kuan & Erwin, 1982), and the same way, a salty stress can increase the severity of the infection in increasing the zoospore fixation on the roots (McDonald, 1982) or in inhibiting their defences

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(McDonald, 1984) in spite of a coexisting inhibitory effect of the salts on the zoospore release and motility (Bouchibi et al., 1990). The electrical conductivity (E.C.) of the nutrients solution has generally not been considered in the root rot caused by the Phytophthora fungi (Thinggaard & Andersen, 1995), a lack of information existing about the influence caused by the N fertilizers carriers in the development of this fungal diseases. High concentrations of N in the fertilised solutions are considered as responsible for decay induced in the root rot by Phytophthora (Bingham et al, 1958). The present study shows the effect produced by four different levels of E.Cs of the soil solution, three of them due to NH4NO3 fertilizer. The experiment was carried out on the zoospores of two Phytophthora species extensively distributed in woody plants, either forest and fruit cultures, during the infection period.

Materials and methods

Fungi Two species of Phytophthora were used : P. cinnamomi, pathogen of many woody plants like avocado, holm oak, cork-oak, Eucalyptus spp., etc., and P. parasitica, pathogen of citrus and other fruits cultures. The first species was isolated from holm oak roots in a stand of the Caceres province and the second from soil and roots of citrus orchard of Valencia province. The two species were kept in Potato Destrose Agar (PDA).

Plants One-year-old Q. rotundifolia seedlings from a commercial nursery of the Comunidad Valenciana were used. These seedlings were transplanted to a substrate formed by peat (70%) and sand (30%) usually used in a nursery and disposed in a glasshouse.

Inoculum It was constituted by zoospores of P. cinnamomi and P. parasitica released from sporangia obtained from 9-days-old mycelium, grown in agar-vegetable medium, and incubated with soil extract for five days. The soil extract was prepared with citrus fresh natural soil suspended in distilled water at 1%; after three days, it was filtered twice with Whatman paper and conserved without sterilisation. The zoospores concentration was assessed with a hemacytometer “Thoma”.

Plant infection The roots of Q. rotundifolia seedlings were submerged in the soil extracts which contained -1 the zoospores and fitted with the NH4NO3 fertilizer at three different E.Cs : 0.3 mSm , 0.7 mSm-1 and 1.2 mSm-1 during 24 h. The E.C. values tested are the most frequent in the crop soils As control, roots of the seedlings were also submerged in distilled water (E.C. 0.09 mSm-1) with zoospores during 24 h. The zoospore concentration of the soil extracts and of the distilled water either in P. cinnamomi and in P. parasitica was 2.105 /ml. After, the seedlings were weighed, and immediately transplanted to containers (330 cc of capacity) containing the appropiate substrate which were placed in a glasshouse during 30 days. Seedlings not infected with zoospores but submerged both in the soil extracts and in the distilled water during the same time were used as control. At the end of the experiment both the infected and non infected seedlings were measured and weighed and their roots carefully examined in order to detect necrosis.

Results and discussion

Twelve days after fungus inoculation, the Q. rotundifolia seedlings showed symptoms of damage induced both by P. cinnamomi and P. parasitica. A general decline with withered and dryness of leaves were the most clear signs of the disease. The percentages of injured and dead seedlings of both inoculated and non inoculated samples are presented in fig. 1.

100 P. cinnamomi 80 60 40 20 0 0,09 0,3 0,7 1,2 0,09 0,3 0,7 1,2 100 P. parasitica % Injured plants

80 % Dead plants 60 40 20 0 0,09 0,3 0,7 1,2 0,09 0,3 0,7 1,2 Inoculated plants E.C. (mSm-1) Non inoculated plants

Figure 1. Percentage at 30 days of injured and dead Q. rotundifolia seedlings, which roots were inoculated with zoospores of P. cinnamomi and P. parastica in soil solutions with different E.Cs. due to NH4NO3

In spite of the short inoculation period (24 h), the zoospores of Phytophthora spp. produced the highest percentage of infection. P. cinnamomi has shown more sensitivity to the NH4NO3 fertilizer. This species damaged 100% of the Quercus seedlings in the E.Cs. 0.09, 0.3 and 0.7 mSm-1, and only 60% in the E.C. 1.2 mSm-1(fig. 1). The seedling mortality decreased from 80% to 20% when the E.C. of the soil solutions increased. P. parasitica is not as sensitive to the NH4NO3 fertilizer as the previous species. Whatever is the tested E.C, it damaged a similar percentage (80%-100%) of seedlings but the mortality it induced (30%- 70%) was not correlated with the E.C. increase. This results accord with those obtained by Lapeña & Tuset (1999) who indicated that the E.Cs. of soil solutions varying from 1.2 to 1.3 mSm-1 have a negative influence on the P. cinnamomi zoospore motility, whereas in P. parasitica this effect was only observed when E.Cs. were higher than 3.5 mSm-1. Tsao & Zentmyer (1979) affirm that the soil fertilisation with nitrogen compounds inhibits the germination of Phytophthora and eliminates or strongly reduces the number of the Phytophthora propagules in the soil. This was confirmed in our experiment for P. cinnamomi which zoospores produced a reduced percentage of damaged seedlings with the highest E.C. of the soil solution. In the case of P. parasitica, the E.C. should be higher than that employed in the trials to induce the same effects. Thinggaard & Andersen (1995) exposed that the epidemiology of Phytophthora causing root rot of plants is more influenced either by the soil moisture and the nutrient concentration in the soil solution than by the initial inoculum concentration. This has been also observed in our experiment, in which for a same amount of the fungus inoculum, the influence of the soil solution E.C. on both Phytophthora species have produced different percentages of damages in the inoculated seedlings. Q. rotundifolia appears very sensitive to P. parasitica. In the literature, this pathogen has been mentioned in other forest species. The fact that this fungus was not found producing damage on Quercus spp., could be due to the non coexistence of the pathogen and the host in

the same place. This is a factor to take into account, in the case of new plantations of Quercus trees near to fruit cultures or in re-plantations or re-forestations in soils previously cultivated with vegetables and fruit crops, where this fungus could be present. The pathogenicity of P. cinnamomi to Q. rotundifolia has been demonstrated in these trials, this fungus being mainly responsible of the “seca” in this forest culture. Also, this Quercus species is very sensitive to the transplantation, all the tested seedlings showing little damages after transplantation even those which have not been inoculated. In the experiment, we have not observed any influence of the nitrogenous fertilizer on the seedlings.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 61-66

La symbiose ectomycorhizienne du chêne-liège dans les plantations portugaises: synthèse des connaissances et perspectives

Helena Machado, Maria Natércia Santos Estação Florestal Nacional, Departamento de Protecção Florestal, Quinta do Marquês, 2784-505 Oeiras, fax: +351 21 4418782, email:[email protected]

Résumé : Compte tenu du rôle fondamental qu’elles jouent dans l’écologie des plantations forestières, les symbioses ectomycorhiziennes ont fait l’objet de plusieurs études au Portugal. Suite aux importants problèmes de dépérissement observés depuis plusieurs décades dans les plantations de chêne-liège, agriculteurs et scientifiques se sont intéressés de plus près à l’abondante mycoflore qui leur est associée, orientant principalement leur recherche sur l’identification des populations de champignons associés à cet écosystème, les conditions de mise en place de la symbiose et la mycorhization contrôlée en pépinière. Aucun essai de mycorhization contrôlée en conditions naturelles n’a encore été envisagé. Nous présentons ici une révision des connaissances acquises dans ce domaine et proposons un programme de recherche permettant la prise en compte des aspects les moins étudiés.

Mots-clés : Quercus suber, chêne-liège, ectomycorhization

Introduction

Les associations de type mycorhizien sont favorables au développement et la croissance des plantes mais assurent aussi une protection contre les pathogènes, notamment ceux qui se développent dans les racines et font d’importants dégâts dans les écosystèmes forestiers. Il a fallu plusieurs décennies pour acquérir les connaissances nécessaires à la répétition en conditions naturelles des succès de mycorhization obtenus en conditions contrôlées ou semi- contrôlées. Pourtant, un bilan à l’échelle mondiale des essais effectués en écosystème forestier montre que plusieurs d’entre eux ont été un succès (Le Tacon et al., 1992), ce qui constitue une perspective encourageante pour la recherche dans ce domaine. Le présent travail fait la synthèse des connaissances sur la flore ectomycorhizienne associée aux peuplements de chêne-liège au Portugal et présente des exemples de succès de la mycorhization contrôlée en pépinière. Enfin, il propose un programme de recherche dont l’objectif est de mieux prendre en compte les aspects les moins étudiés de ce domaine.

Les symbioses ectomycorhiziennes

Le dépérissement de la subéraie portugaise est attribué à une multitude de facteurs parmi lesquels deux agents fongiques, l’armillaire (Armillaria mellea (Vahl : Fr.) Kummer et Armillaria tabescens (Scopoli : Fr.) Emel) et la maladie de l’encre (Phytophthora cinnamomi Rand.). Nous n’avons pas de données concernant l’armillaire, par contre, plusieurs expériences ont montré qu'un système racinaire bien mycorhizé peut avoir un rôle protecteur contre la maladie de l’encre (Marx & Davey, 1969a, b ; Marx, 1970 ; Vrot et al., 1979 ; Martins, 1999 ; Machado, 2000).

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Plusieurs excellents champignons comestibles (truffes, cèpes, girolles, chanterelles...) sont des espèces mycorhiziennes. Dans le cas de la truffe noire (Tuber melanosporum Vitt.) la domestication passe par l’établissement de la symbiose au laboratoire puis en pépinière. Mais l’association truffe-racine ne peut persister que si le sol possède des caractéristiques précises comme la basicité, la forte teneur en calcaire et en matière organique (Giovanetti & Fontana 1982). Les recherches de l’INRA (France) sur Suillus granulatus (Fr.) O. Kuntze ont été un succès (Poitou et al., 1989). La synthèse mycorhizienne a été réalisée en laboratoire puis en serre. Un contrôle des arbres est ensuite effectué par observation des racines et de la culture. La synthèse mycorhizienne a aussi été obtenue pour les cèpes Boletus edulis Bull. : Fr., B. aereus Bull. : Fr. et B. aestivalis (Paul.) Fr. (Ceruti et al., 1988 ; Chauvin & Salesses, 1988 ; Zuccherelli, 1988) et pour Lactarius deliciosus (L. ex Fr.) S.F. Gray (Poitou et al., 1989). Au Portugal, quelques travaux font référence à la production de plants mycorhizés en pépinière (Azevedo 1957 ; 1987) et à celle de champignons comestibles avec le chêne-liège (Fonseca & Azevedo, 1994 ; Fonseca, 1997). Des plants de Quercus suber L. et Q. rotundifolia Lam. ont été inoculés avec Tuber melanosporum obtenu dans des pépinières françaises et Terfezia leonis Tull. récolté au sud du Portugal (Azevedo, 1987) ainsi que par Amanita caesarea Scop. et Boletus aereus Bull. (Fonseca & Azevedo 1994). Différentes méthodes d’inoculation ont été utilisées mais l’étude de la survie des mycorhizes et de leur effet en conditions naturelles ne semble pas avoir été abordée. L’étude des champignons ectomycorhiziens au Portugal (Machado 1995 ; Martins 1997) a permis l’identification des espèces présentes dans différents écosystèmes et l’analyse de leur influence sur la croissance et le développement des plants en pépinière. Aucune étude n’a été faite sur la mycorhization contrôlée en conditions naturelles. Le Tacon et al. (1992) présentent la synthèse des résultats obtenus sur la transplantation au champ des plants inoculés en pépinière. Les données concernant la compétitivité des espèces de champignons ectomycorhiziens et l’efficacité des espèces introduites demeurent cependant lacunaires. Certains essais ont été un succès, c’est le cas par exemple avec des espèces d’eucalyptus notamment au Portugal (Machado 1995), de pseudotsuga et de quelques pins (Le Tacon et al. 1992).

Identification des champignons associés à l’écosystème chêne-liège Au Portugal, la biodiversité des champignons associés aux plantations de chêne-liège est bien connue (Antunes 1984 ; Santos et al., 1999). Des prospections ont été entreprises dans des subéraies de l’Alentejo, au Sud-est du Portugal. Plusieurs subéraies sur sols sablonneux, schisteux et argilo-schisteux ont été prospectées. Nous avons tenté d’appréhender la variabilité et la biodiversité de la mycoflore symbiotique des écosystèmes ouverts de chêne- liège. La synthèse des relevés a été présentée par Santos et al. (1999). Le cortège des espèces fongiques associées au chêne-liège est très diversifié et inclut des champignons comestibles comme Boletus edulis, Amanita caesarea et A. rubescens. Les espèces rencontrées dans les subéraies ne sont en général pas strictement inféodées à Q. suber, mais sont une composante caractéristique de la flore fongique quercilicole. Un bon nombre sont communes aux peuplements de Quercus spp. La mycoflore est globalement thermophile avec une dominance marquée d’espèces xérothermophiles, caractéristiques des chênaies ouvertes et très chaudes. Ces espèces (Scleroderma meridionale, S. verrucosum, S. geaster, S citrinum, Xerocomus rubellus, X. subtomentosus, X. chrysenteron, Astraeus hygrometricus et Pisolithus tinctorius) ont été retrouvées dans pratiquement tous les sites prospectés.

Les espèces mycorhiziennes de type “ late stage ” (plusieurs amanites, lactaires, russules et cortinaires), particulièrement fragiles, ne fructifient qu’entre les arbres dont le système racinaire est intact et non perturbé. Elles semblent se réfugier dans les zones non labourées. L’observation des systèmes racinaires du chêne-liège révèle que le taux de mycorhization est d’environ 80% (Antunes 1984 ; Tomás 1999). La comparaison entre arbres sains et dépérissants montre que la quantité totale de mycorhizes est maximale chez ces derniers du fait de l’abondance des mycorhizes noires de Cenococcum geophilum Fr. dont le nombre augmente lorsque l’arbre dépérit (Tomás, 1999). Les arbres sains portent une plus grande diversité d’espèces mycorhiziennes et un nombre plus important de carpophores de Boletus edulis, Russula cyanoxantha et Amanita rubescens (Tomás, 1999).

Sélection des parcelles et des arbres en bon état sanitaire et avec dépérissement

Caractérisation de la Taux de mycorhization mycoflore associée Isolement de champignons

Évaluation de la capacité pour établir symbiose Test de la résistance à la sécheresse Évaluation de la production de biomasse Sélection de symbiotes

Mycorhization contrôlée

Évaluation des taux de mycorhization Mesure des paramètres dendrométriques et physiologiques

Sélection de champignons

Essais au champ Étude des relations plante-hôte

Détermination des taux de survie : Détermination des taux plants et champignons symbiotes de mycorhization

Sélection des symbiotes candidats à des programmes de mycorhization sur le terrain

Figure 1. Projet de recherche sur l’ectomycorhization du chêne-liège

Vérification de la capacité à établir une symbiose avec l’hôte Après avoir caractérisé la mycoflore associée au chêne-liège et réalisé une collection de souches fongiques isolées à partir de carpophores trouvées dans les plantations de chêne- liège, il faut toujours vérifier au laboratoire leur capacité à établir une symbiose avec l’hôte.

Au Portugal, des cultures pures de Pisolithus tinctorius, Scleroderma geaster, S. meridionale, Xerocomus subtomentosus, Boletus aestivalis et Hebeloma mesophaeum ont été obtenues par isolement à partir de souches trouvées dans des subéraies (Cabral et al., 1994). Nous avons vérifié l’établissement de la symbiose ectomycorhizienne en conditions axéniques avec des cultures de P. tinctorius, H. mesophaeum et A. rubescens (Cabral et al., 1994). Ces espèces sont considérées comme des mycorhiziens précoces du chêne-liège. Par contre, avec B. aestivalis et B. edulis, des mycorhizes peu typiques et peu abondantes ont été observées, un à deux mois après l’inoculation. Ceci peut s’expliquer par le caractère “ late stage ” de ces champignons. Ces études ont montré qu’il est important de travailler sur un grand nombre de souches fongiques car leurs aptitudes à la mycorhization peuvent être très diffèrentes.

Perspectives de recherche

Le schéma de la figure 1 trace les principaux axes d’études d’un projet de recherche de cinq ans dont l’objectif est d’assurer une continuité au travail déjà effectué. Ce projet prend en compte des étapes complémentaires permettant le développement expérimental d’une technique de mycorhization contrôlée dans les plantations de chêne-liège.

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The ectomycorrhizal symbiosis in Portuguese cork oak stands: knowledge synthesis and perspectives

Helena Machado, Maria Natércia Santos

Abstract: The important role of ectomycorrhizal symbiosis on forestry stands ecology, led to the implementation of several studies about this subject, in Portugal. Due to the high levels of cork oak mortality verified during the last two decades, farmers and researchers concentrate their attention on mycoflora associated to this ecosystem, mainly on both population identification and controlled mycorrhization in nursery. However, there is a deficient knowledge concerning symbiosis establishment and maintenance in the field. The main goal of this communication is to appraise the work developed since several decades on mycorrhizal status of cork oak stands in this country, as well as, to establish a proposal on research areas presenting knowledge gaps.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 67-74

Insects and fungi involved in oak decline in Italy1

Tiberi Riziero1, Alessandro Ragazzi A. 1, L. Marianelli 1, Peverieri Sabbatini 1, Pio Federico Roversi 2 1 Dipartimento di Biotecnologie Agrarie - Università degli Studi di Firenze 2 Istituto Sperimentale per la Zoologia Agraria - Firenze, Italy

Abstract: Field inspections and sampling of plant material attacked by insects and funghi were conducted in oak forests growing at different altitudes, from sea level to roughly 600 m, in Venetia, Tuscany, Marche and Latium. The micro-organisms suspected of causing decline were isolated from the insect bodies by cultures developed in dishes containing the insects, or from water in which the insects were previously immersed. The spread of phytopathogenic fungal agents was ascertained for Fusarium solani, Fusarium sp. and Verticillium dahliae transported by Scolytus intricatus, for Fusarium solani, Fusarium eumartii and Verticillium dahliae transported by Xyleborus dispar, and finally for Verticillium sp. by Agrilus graminis. It is likely that the spread of Diplodia mutila and Phomopsis quercina is attributable to Sinoxylon perforans and S. sexdentatum. Coroebus florentinus seems to be involved in the transport of Diplodia mutila and Verticillium sp.. There may also be associations between Chrysobotris affinis and Verticillium dahliae. Linkages may also be found between Agrilus biguttatus and Fusarium eumartii, between Anthaxia millefolii and Sporothrix sp., and finally between Platyphus cylindrus and Verticillium dahliae.

Key words: fungi, xylophagous insects, declining oaks, Italy.

Introduction

The life cycle of many xylophagous insects includes the establishment of fairly close relations with various micro-organisms, some of which may be pathogenic. These relations, often complex, may be manifested as obligate symbioses ; more frequently, however, they are not symbiotic in the strict sense, while still capable of giving rise to positive feedback that represents a danger for both contracting organisms. An important example is the case of coleopters belonging to the genus Scolytus, carriers of the agent reponsible for Dutch Elm Disease (Ceratocystis ulmi Buisman-C. Moreau) (Battisti & Covassi, 1991). Oak, like many tree species, is affected by the development of numerous xylophages whose biology, behavior and links with the host plant can assume a crucial role in the transport of pathogenic fungi, as demonstrated previously by Tiberi & Ragazzi (1996 ;1998). In Europe, studies are in progress on oak to investigate not only the existing relations between xylophages and indigenous fungi, but also new possible relations between insects and fungi deriving from other geographic areas. Attention is focused on the risk of introduction of the fungus Ceratocystis fagacearum (Bretz) Hunt, which is native to North America, where it causes a disease known as “oak wilt” on oaks belonging to the group rubra and velutina. It is feared that both in Italy and in other European countries this pathogenic agent could find suitable carriers in the scolytids of the genus Scolytus, and also in buprestids belonging for the most part to the genus Agrilus. In Italy, oak decline and die-off was reported as early as the beginning of the 1900s (Cecconi, 1912). But these phenomena have intensified and have been reported with greater frequency

1 This work was supported by a MURST ex 60% grant.

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in recent decades (Battisti & Covassi, 1991; Tiberi & Ragazzi, 1996). Initially, the major role in this destabilization of Italian oak forests was played by primary phytophagous insects such as defoliators. These are followed by various xylophages, acting either jointly with or independently of fungal agents ; their attack, whether concomitant or individual, can trigger and sustain host tree decline. In the case of concomitant attacks, xylophages and fungi often display mutual dependence relations (Tiberi & Ragazzi, 1996). Investigations have been conducted in the last decade in various oak forests of north-estern and central Italy, to examine the associations between pathogenic fungi and the most widespread xylophagous coleopters linked to oak. In addition, the role of such agents in the on-going destabilization of Italian oak forests has been explored.

Material and methods

The investigations were carried out from 1992 to 2001 in pure and mixed oak stands in north- eastern (Venetia) and central Italy (Marche, Tuscany, Latium). Sample plots were laid out in these stands, with the exception of Marche, where isolated trees were sampled. Every year the sample plots were inspected and samples taken once a month, except during May-August when inspection and sampling took place once every two weeks. The samples collected were examined in the laboratory to determine the presence of pathogenic fungi and/or insects. Study sites The oak stands in Venetia can be considered as remnants of the original primeval forest. The sample plots were located at the Bosco di Fagarè, Cornuda (TV), in mixed broadleaf stands with predominant 40-50-year-old Quercus robur L. (altitude 200-400 m a.s.l.) and at the Bosco di Selva degli Arvonchi, Muzzana del Turgnano (UD), consisting of 60-80-year-old mixed broadleaf stand (at sea level). In Tuscany two sample areas were examined : a mixed stand of 30-40-year-old Q. cerris L. and Q. pubescens Willd. at San Casciano Val di Pesa and Greve in the Chianti area (FI, altitude 200-550 m a.s.l.) and a mixed stand of 20-40-year-old Q. cerris and Q. pubescens with the rare presence of some other broadleafs at Fonte Marchi, Castiglione d’Orcia (altitude 300-400 m). In Latium there were also two sample areas: the first at Monte San Biagio (LT), a cork oak (Quercus suber L.) plantation older than a hundred years, interspersed with small clumps of much younger Q. cerris trees (altitude 50-100 m a.s.l.) ; the second at Gavignano (Roma), consisting of predominantly 50-80-year-old Q. cerris and Q. pubescens with some smaller areas of Q. robur of more than 100 years (altitude approx. 300 m a.s.l.). In Marche the inspection was conducted on isolated trees of Q. pubescens from 80 to over 100 years old, lining district and farm roads. Sampling With the exception of Marche, where single trees were studied, sample plots of 0.5 ha were laid out, in each of which 25 trees with clear signs of decline were selected for examination. The signs of decline included : peripheral crown dieback of young shoots and branches, bleedings on stems and branches, bark cracking and holes on the bark of stems and branches. The insertion and the crown volume of each tree were noted, as well as the position within the stand. Samples were collected in one of two ways : 15 branch portions 40 cm in length with diameters ranging from 8 to 15 cm were taken from each selected trees; four declining trees were felled and from each of which a 5-15-cm-thick portion of trunk was taken. Insect rearing Samples infested with insects were placed in bags inside in 1x1 mm mesh canvas rearing containers to allow the insects to develop and also to prevent them from flying away after emergence. The bags were monitored weekly.

Fungus isolation from insects Insects obtained by rearing were placed in Petri dishes containing MEA 1% supplemented with 250 mg/l Terramicin. Dishes were then set in a sterile environment. After 10 minutes the insect was removed and the Petri dishes were placed in an incubator for 4 days at 24°C. At the end of the 4-day period, the material was transferred to fresh dishes containing MEA 1%, and any fungal micro-organisms present were identified. The same insects were utilized for a second test using the “rinsing technique”. This consisted in immersing the xylophage in a deionized TWIN + water solution (ratio 1:100), previously sterilized in an autoclave. The rinsing water then was poured into Petri dishes containing MEA 1% + 250 mg/l Terramicin; these dishes were then placed in a thermostatted chamber set to 24°C and monitored daily. Each time fungal mycelium appeared, the mycelium was removed and placed in Petri dishes containing MEA 1% for rearing in pure conditions, until the moment of identification. This procedure was adopted both for live insects and for those that had been dead for a few days. During these operations, it was observed that the very great concentration of fungal propagules present in the rinsing water did not allow mycelium to develop to the point of being removable for identification in pure conditions, with the exception of Penicillium. To overcome this difficulty, the technique was partially modified. In detail, two solutions were obtained with the rinsing water : the first composed of 50% rinsing water and 50% sterile distilled water, and the second of 10% rinsing water and 90% sterile distilled water. The two solutions were then poured into dishes containing MEA 1% + 250 mg/l Terramicin and incubated for seven days at 24°C. Colonies that formed were then examined and identified with the keys of Booth (1971), Sutton (1980) and Domsch et al. (1980). Fungus isolation from wood Fungal agents were also isolated directly from twigs that presented signs of xylophage attack. This was achieved by flame sterilization of the twig surface and subsequent removal of the bark from the affected twigs. At the end of this phase, wood fragments were collected from inside the holes present on the twigs and also from the areas surrounding the holes. These fragments were then placed in Petri dishes containing MEA 1% supplemented with 250 mg/l Terramicin. In addition, for each of the above twigs, 3 sampling points were identified, from each of which 15 fragments of wood were collected. The latter fragments were placed in Petri dishes, for a total of 45 fragments per twig. The fragments thus obtained were then transferred to a thermostatted chamber set to 20°C. After 4-5 days, whenever new fungi developed from the fragments, the fungi were transplanted to further dishes containing MEA 1%, and maintained in culture at 20 °C. At the moment of fungal sporulation, identification was performed by consulting Booth (1971) and Ellis (1985) keys. As investigations proceeded, additional modifications were adopted in the technique used for sampling the wood fragments, to further limit the presence of contaminating agents. Thus 3 discs of wood were collected from each twig sample (one from each extremity and one in the central area). After surface sterilization, the discs were sectioned into three parts. Five fragments of wood were then taken from the thickness of each sectioned part, again for a total of 45 fragments per sample. Results obtained with this new technique successfully achieved a notable reduction in contaminating agents.

Results and discussion

Xylophagous coleopters emerged from the twig samples collected in the various zones belong mainly to the families of Bostrychidae, Buprestidae, Platypodidae and above all Scolitidae (tab. 1).

Table 1: Xylophagous coleopters obtained during the investigations (2).

Species Host tree Sample provenance Sinoxylon perforans (Schrank) Q. pubesc., Q. cerris Tuscany, Marche, Latium Sinoxylon sexdentatum (Olivier) Q. pubesc., Q. cerris Tuscany, Marche, Latium Coroebus florentinus (Herbst) Q. pubesc., Q. cerris Tuscany, Marche, Latium Chrysobotris affinis (F.) Q. pubesc., Q. cerris, Q. suber, Tuscany, Latium Q. ilex Agrilus biguttatus (Illiger) Q. robur Venetia Agrilus graminis (Cast. & Gory) Q. pubesc., Q. cerris Tuscany Anthaxia millefolii (F.) Q. pubesc. Tuscany Scolytus intricatus (Ratzeburg) Q. robur, Q. cerris, Q. pubesc. Venetia, Tuscany Xyleborus dispar (F.) Q. pubesc., Q. cerris Tuscany Platypus cylindrus (F.) Q. suber Latium

A large number of fungal micro-organisms were isolated during the investigations. The most frequent species were included within the divisions of Ascomycotina and Deuteromycotina (tab. 2). This study reports only on pathogenic fungi and xylophagous insects for which an association was clearly demonstrated by laboratory tests, and on entities (fungi and insects) for which a link can be hypothesized on account of their presence on the same host tree samples, even if at different times. Among the most frequent xylophagous coleopter species (an overall total of 10) obtained during the investigations, a direct link with pathogenic fungi could be demonstrated only for 3 of these in the course of laboratory tests. With the exception of the buprestid Agrilus graminis, these associations involved only the Scolytids Scolytus intricatus and Xyleborus dispar and the pathogenic fungi belonging to the genera Fusarium and Verticillium (tab. 3). As shown by the data in table 3, only 7 associations were found between fungal species and xylophagous insects. Fungal propagules were found to be transported externally, i.e. by simple adhesion to hairs or to other structures present on the body. However, other types of transport cannot be ruled out, especially for the scolytid X. dispar, on account of its behavior. In the case of S. intricatus,a total of 85 specimens were examined. For 18 of these an association with F. solani was demonstrated, for 21 with V. dahliae, and for 2 with Fusarium sp. In the case of X. dispar, 98 individuals were examined, 10 of which proved to be involved in transport of F. eumartii, 16 of F. solani and 15 of V. dahliae. A smaller number of specimens of A. graminis were obtained during the study (total of 7) ; only in 2 cases, an association with fungi of the genus Verticillium was demonstrated, and both of these instances involved exclusively individuals emerged from samples of Q. pubescens collected in oak stands growing near Volterra (Tuscany). These associations, as pointed out earlier, should all be considered optional, as the fungi either developed following contact (walking) of insect with the culture medium or were present in the insect rinsing water. Contact between insects and fungal propagules of the two species of Fusarium may have occurred on the external surface of branches or trunks after emergence of adults, or in subcortical or woody layers (the latter case holds for X. dispar) during larval development.

(2) The authors wish to thank Prof. K. Hellrigl for identification of the Buprestid coleopters.

Table 2: Fungal micro-organisms identified during the investigation

Species Host trees Sample area Alternaria alternata (Fr.) Keissler Q. pubesc., Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Amphiporthe leiphaemia * Sacc. Q. pubesc. Tuscany Arthrobotrys sp. Corda Q. pubesc. Tuscany Aspergillus spp. Link Q. cerris Tuscany Aureobasidium pullulans Arnaud Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Botrytis sp.Micheli ex Pers. Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Colpoma quercinum* (Fr.) Wallr. Q. pubesc., Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Cylindrocarpon sp. Wollenw. Q. pubesc., Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Cytospora sp.Ehrenb. Q. pubesc. Tuscany Diplodia mutila Fr. apud Mont. Q. cerris, Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Discula quercina* (Westend.) v. Arxt Q. pubesc., Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Epicoccum sp. Link. Q. cerris Tuscany Fusarium eumartii* Carp. Q. robur Venetia Fusarium solani (Mart.) Sacc. Q. robur, Q. cerris Venetia and Tuscany Fusarium sp. Link. Q. pubesc. Tuscany Gliocladium sp. Corda Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Hypoxylon mediterraneum* Mill. Q. cerris, Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Mucor sp. Micheli ex Fr. Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Penicillium spp. Link ex Fr. Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Phoma sp. Sacc. Q. cerris, Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Phomopsis quercina (Sacc.)* Hühn. Q. pubesc., Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Sporothrix sp. Hektoen & Perkins Q. pubesc. Marche, Tuscany, Latium Torula sp. Pers. Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Trichosporum sp. Vuill. Q. cerris Marche, Tuscany, Latium Ulocladium consortiale (Thum.) Simmons Q. cerris Tuscany Verticillium dahliae* Kleb. Q. pubesc., Q. cerris, Marche, Tuscany, Latium Q. suber, Q. ilex Verticillium sp. Nees ex Link Q. pubesc. Tuscany (*) Species marked with an asterisk are known for their pathogenicity on Quercus spp.

The site of contact between the scolytids S. intricatus and X. dispar with the microsclerotia of V. dahliae remains to be clarified. The microsclerotia are present in soil, but it cannot be excluded that adults of the two scolytids may find their way into soil, while contact with the larvae must be ruled out since the latter develop beneath the bark or in the wood. Similar considerations can be taken into account concerning the buprestid A. graminis, which exploits subcortical layers of branches and twigs for its juvenile development, while the adult stages feed on leafy branches. Although only 7 associations could be demonstrated, a link could be hypothesized between a considerably greater number of insect species and pathogenic fungi. In numerous cases, adult xylophages and pathogens were obtained or isolated from the same samples,

although at different times. Such a hypothesis is supported by the fact that the fungi were isolated from cultures of wood fragments collected at or close to the xylophage emergence holes. Table 4 shows an overview of these hypothetical associations.

Table 3: Xylophagous beetles carrying pathogenic fungi on oaks in Italy.

Insect Fungus Host tree Organ/tissue affected* Sample area Agrilus graminis Verticillium sp. Q. pubesc. B, T, S, C, W Tuscany Scolytus intricatus Fusarium solani Q. robur B, T, S, C, W Venetia Scolytus intricatus Verticillium dahliae. Q. cerris S (microsclerotia in soil) Tuscany Scolytus intricatus Fusarium sp Q. pubesc B, T, S, C, W Tuscany Xyleborus dispar Fusarium solani. Q. cerris B, T, S, C, W Tuscany Xyleborus dispar Fusarium eumartii. Q. robur B, S, C, W Venetia Xyleborus dispar Verticillium dahliae Q. cerris S (microsclerotia in soil) Tuscany (*) B : branches, T : twigs, S : stem, C: cortical tissue, W : woody tissue

Table 4: Xylophagous beetles for which the possibility of carrying fungal pathogens of oak is presumed.

Beetle Fungus Host tree Organ or tissue affected* Sample area Sinoxylon perforans Diplodia mutila Q. pubescens B, T, (S), C, W Marche S. perforans D. mutila Q. pubesc., Q. cerris B, T, (S), C, W Tuscany S. sexdentatum D. mutila Q. pubesc., Q. cerris B, T, (S), C, W Latium S. perforans Phomopsis quercina Q. pubescens B, T, (S), C Marche Sinoxylon perforans Phomopsis quercina Q. pubescens B, T, (S), C Marche S. sexdentatum P. quercina Q. pubesc., Q. cerris B, T, (S), C Tuscany, Latium Coroebus florentinus D. mutiila Q. pubescens B, T, (S) Marche ,Tuscany C. florentinus D. mutiila Q. pubesc., Q. cerris C, W Latium C. florentinus Verticillium sp. Q. pubescens B Tuscany Chrysobotris affinis Verticillium dahliae Q. pubesc., Q. cerris S, W (vessels) (micro- Tuscany Q. suber, Q. ilex sclerotia in the soil) Latium Agrilus biguttatus Fusarium eumartii Q. robur S, B, T, C, W Venetia Anthaxia millefolii Sporothrix sp. Q. pubescens B, T Tuscany Platypus cylindrus Verticillium dahliae Q. suber S, W (vessels) (micro- Latium sclerotia in the soil) (*) B : branches, T : twigs, S : stem, C: cortical tissue, W : woody tissue

It is worth noting that with the exception of Platypus cylindrus and C. florentinus, which develop by boring tunnels in trunks or branches, the insect species in question develop in subcortical layers, only partially attacking the wood during larval tunnel boring and/or during construction of pupation cells. Contact between insects and fungal propagules may occur both on the external surface of branches and trunks or at sites of larval development. D. mutila and

P. quercina colonize branches, twigs and sometimes the stem of various oak species, among which Q. cerris and Q. pubescens seem to be the most susceptible. Furthermore, we frequently observed C. florentinus present together with D. mutila on woody samples, and also the other buprestid C. affinis with Verticillium dahliae, whereas F. eumartii was isolated only from samples collected in Venetia from Q. robur attacked by A. biguttatus. An interesting feature was the simultaneous utilization of old specimens of Q. suber in Latium by P. cylindrus and V. dahliae. As pointed out above, V. dahliae forms microsclerotia in soil. Finally, we observed only one instance of presence of C. florentinus with Verticillium sp., namely on Q. pubescens samples derived from Volterra (Tuscany).

Conclusions

For a long time, phytopathologists widely believed that the transport of pathogenic fungi by insects was a secondary event as compared to other modes of dispersal. This conviction could, and indeed still can be considered well-founded if based predominantly on relations arising between pathogenic fungi and phytophagous insects linked to herbaceous plants (Ingold, 1978). However, the situation differs when one examines the relations in nature between phytophagous insects – xylophagous insects in particular – and trees (Webber & Gibbs, 1989). The natural environment offers innumerable ways in which insects and fungi can enter into complex and long-lasting relations with trees, leading to effects that assure advantages for both partners (Battisti & Covassi, 1991). Investigations carried out over many years in north-eastern and central Italy allowed detection of real or presumed associations between phytopathogenic fungi and xylophagous coleopters linked to oak. The results thereby obtained, highlighted the optional nature of these associations, since the fungal propagations were present on the external surface of the insect. However, symbiotic relations of an obligate type cannot be excluded, in particular as regards wood-eating xylophages obtained during the investigation as well as for the scolytid X. dispar (Tiberi & Ragazzi, 1998). Direct involvement of xylophages in transport of pathogenic fungi was confirmed for S. intricatus in north-eastern Itaky for Fusarium solani on Q. robur, and in central Italy for V. dahliae on Q. cerris and Fusarium sp. on Q. pubescens. Also X. dispar was found to be involved in the spread of F. eumartii on Q. robur in north-estern Italy, of F. solani and V. dahliae on Q. cerris in central Italy. A new association was observed between the buprestid A. graminis and a fungus belonging to the genus Verticillium, on Q. pubescens in Tuscany. For the other coleopters examined during the investigation, namely S. perforans, S. sexdentatum, C. florentinus, C. affinis, A. biguttatus, A. millefolii and P. cylindrus, their relation to the fungi D. mutila, P. quercinia, V. dahliae, Verticillium sp., F. eumartii and Sporothrix sp. (as pointed out by Tiberi & Ragazzi, 1998) can be presumed as they were obtained from the tree samples without a direct association. Additional studies are required to assess the possible contact of the scotilyds S. intricatus and X. dispar, and of the buprestids A. graminis, C. florentinus and C. affinis, with the propagules of V. dahliae and Verticillium sp., taking into consideration the behavior of the xylophages and the fungal development sites. Even though these associations may be occasional, in-depth knowledge of the true role played by xylophagous insects in fungal propagule transport, would make a valuable contribution to understanding the rise and evolution of decline phenomena that are affecting oak stands, not only in Italy but also in other European countries.

In addition, clarification of the nature of relations between xylophages and pathogenic fungi would facilitate the devising of a methodology for direct action designed to contain insect pullulations and thus inhibit the spread of the fungi involved in the destabilization of oak forests.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 75-83

Contribution à la bioécologie de Platypus cylindrus F. au Portugal

Edmundo M. R. de Sousa 1, Domitien Debouzie 2 1 Estaço Florestal Nacional, Dep. de Protecço Florestal, Quinta do Marquês, 2780 Oeiras, Portugal 2 Université Claude-Bernard Lyon 1 UMR CNRS 5558, Bd du 11 Novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex, France

Résumé : L’explosion de Platypus cylindrus F. (Col. Platypodidae), observée au Portugal au cours des années 80/90 dans la partie méridionale du pays, semble être liée à l’actuel processus de dépérissement des peuplements de chêne-liège. La dynamique de colonisation de P. cylindrus est directement liée aux caractéristiques de la phase de développement larvaire et des périodes d'émergence et de vol des adultes. Ces différents facteurs, déterminent en effet les potentialités de survie de l’espèce et ses capacités à sélectionner les hôtes les plus favorables. La bioécologie de P. cylindrus au Portugal, a été étudiée dans un peuplement de chêne-liège fortement attaqué. Cette étude a pour objectif de contribuer à l’élaboration de stratégies de contrôle des populations du ravageur dans le contexte du processus de déclin actuel du chêne-liège en région méditerranéenne..

Mots clés : Chêne-liège, xylophage, Platypus cylindrus, bioécologie, Portugal

Introduction

Platypus cylindrus F. est répandu dans toute l'Eurasie et dans la région méditerranéenne, où il attaque surtout des arbres morts ou affaiblis (Balachowsky et al., 1963). Néanmoins, l’explosion de ses populations dans les peuplements de chêne-liège du Portugal pendant les années 80/90, suggère qu’il existe des relations plus complexes entre le ravageur l’état physiologique des arbres hôtes (Sousa, 1992). On sait aujourd’hui que le dépérissement est le résultat de l’action combinée de nombreux facteurs (modifications du climat, de la physiologie des arbres, des cycles biogéochimiques et de l’eau, accroissement de la pollution, ravageurs, incendies et mauvaise gestion des peuplements (Ling & Ashmore, 1987). La biologie de P. cylindrus a été étudiée dès le début du siècle dernier (Strohmeyer, 1907 ; Escherich, 1923). Sa bioécologie (caractéristiques des phases de développement larvaire, d'émergence et de vol des adultes) demeuraient par contre trop mal connues pour qu’on puisse actuellement quantifier ses potentialités de survie et ses capacités à sélectionner les hôtes les plus favorables.

Matériel et méthodes

L’étude a été réalisée dans un peuplement naturel de chêne-liège de la propriété Vale de Boi, située dans la région de Coruche à environ 80 km au Nord-Est de Lisbonne. Trois arbres fortement attaqués par le ravageur ont été abattus, le premier fin septembre 1992 et les deux autres en décembre 1993. Les troncs ont été découpés en tronçons de 50 cm et ramenés aussitôt au laboratoire où ils ont été placés sous abri après que les surfaces coupées aient été recouvertes de paraffine. Chaque semaine, 5 galeries ont été disséquées. Pour chacune, on a noté la date de récolte, le nombre d'individus présents et leur stade de développement. La

75 76

mesure de la largeur des capsules céphaliques a permis d’estimer le nombre de stades larvaires. La structure des galeries a été reconstituée grâce à des dissections de rondins et des images aux rayons X ("G. E. Grain Inspection Unit" - voltage de 27000 KW, intensité de 3 MA et temps d'exposition de 20 mn). Les émergences ont été suivies sur le terrain, en échantillonnant les trous d'entrée présents sur des arbres attaqués l'année précédente. Quatre arbres, de dimensions voisines, écorcés l'année de leur colonisation, ont été choisis en mai 1993. 22 trous d'entrée ont été repérés par la sciure accumulée près de l'orifice. En mai 1994, 30 autres trous ont été échantillonnés sur trois arbres ayant des caractéristiques morphologiques identiques aux précédents. Les adultes émergents ont été récoltés chaque semaine, à l’aide d’un dispositif formé d’un tube en plastique s’ouvrant sur un sac en tissu transparent très mince. La période de vol a été étudiée à l’aide de six pièges à interception (pièges passifs) ne modifiant pas le comportement de l’insecte, placés dans la station à une hauteur comprise entre 60 et 160 cm. La gouttière fixée à la base de la vitre a été remplie d’un mélange d'eau et de Teepol.

Résultats et discussion

Développement de P. cylindrus sur chêne-liège La distribution temporelle des stades de développement de P. cylindrus est basée sur les données de 43 galeries (première année de descendance), dont on a extrait 95 œufs, 513 larves, 132 nymphes et 27 jeunes adultes (fig. 1). La ponte a commencé avant notre première dissection en octobre et des œufs ont été trouvés dans les galeries jusqu’en mars (fig. 1A). L’œuf, ovale, translucide, est de couleur blanche ou crème.

100

80 A

0 Octobre Novembre Décembre Janvier Février Mars Avril

oeufs L larves nymphes adultes 50 B 40

0 Octobre Novembre Décembre Janvier Février Mars Avril

Figure 1. A : Fréquence des différents stades de développement de P. cylindrus d'octobre 1992 à avril 1993. B : Evaluation du nombre d’œufs déposés par femelle (effectifs moyens cumulés des différents stades).

La longueur (0,62 à 0,80 mm) et la largeur (0,33 et 0,42 mm) de l’oeuf sont bien corrélées (r = 0,71; p < 0,001). Cette hétérogénéité peut être le résultat de l'effet des facteurs de la dynamique des populations de l’insecte (génétique, vigueur des femelles) et/ou du sexe des descendants (Baker, 1963), car aucune liaison avec la date de récolte n’a été mise en évidence. Compte tenu de la relation qui existe entre température et vitesse de développement et d'autre part des variations de température durant cette période, il n'est pas immédiat de relier une présence d’œufs à un épisode de ponte. Pour évaluer la fécondité d’une femelle, on a cumulé les effectifs d’œufs, de larves, de nymphes et d'adultes observés dans une même galerie (chaque galerie est creusée par une femelle). Trois phases correspondant à une fécondité croissante ont été distinguées (fig. 1B) : durant les 14 premières semaines (début octobre à mi-janvier) la ponte est limitée (11,4 ± 3,6 œufs/femelle); elle s’accroît au cours des 11 semaines suivantes (mi-janvier à début avril) avec en moyenne 22,0 ± 7,4 œufs/femelle et atteint son maximum en avril (40,2 ± 7,1 œufs/femelle). Le nombre moyen d’œufs pondus par femelle chaque semaine reste à peu près constant d’octobre à mars (0,81 et 0,96) puis augmente fortement en avril (3,64). Par ailleurs, la variabilité temporelle de l'éclosion des œufs permet la coexistence dans les galeries de descendants de P. cylindrus à différents stades de développement. Par ailleurs, la variabilité temporelle de l'éclosion des œufs permet la coexistence dans les galeries de descendants de P. cylindrus à différents stades de développement. La distribution de fréquence de la largeur des capsules céphaliques (fig. 2) permet de distinguer quatre pics bien individualisés pour les largeurs de plus de 0,625 mm. Sachant que le rapport entre les moyennes de deux stades consécutifs est constant et qu’il est compris entre 1,19 et 1,39 pour les quatre derniers stades, on peut supposer que les largeurs de capsules inférieures à 0,625 mm correspondent à deux stades: le stade I (0,250 à 0,388 mm) et le stade II (0,388 à 0,625 mm). On en déduit que P. cylindrus aurait au moins six stades larvaires (tab. 1). L'existence chez cette espèce de six stades larvaires et non de cinq comme cela a été suggéré pour P. cylindrus (Korolyov, 1989), peut avoir plusieurs causes : l'existence de races physiologiques, un nombre de mues différent selon le sexe, une sous-alimentation ou diverses influences du milieu (Pershing et Linit, 1988).

30 Fréquence

0,250 0,388 0,625 0,863 1,175 1,425 1,600 largeur de la capsule céphalique (mm)

Figure 2. Distribution des fréquences de la largeur des capsules céphaliques larvaires.

Les classes ont un pas de 0,025 mm. Les limites des intervalles définis pour chaque stade larvaire sont précisées en abscisse.

Tableau 1. Largeur moyenne des capsules céphaliques des différents stades larvaires de P. cylindrus. Le rapport est calculé entre les moyennes de deux stades consécutifs.

Stade Effectif Moyenne Ecart-type Rapport I 30 0,335 0,028 II 76 0,457 0,054 I/II : 1,36 III 44 0,741 0,051 II/III : 1,62 IV 113 1,027 0,072 III/IV: 1,39 V 204 1,256 0,046 IV/V : 1,22 VI 46 1,497 0,043 V/VI : 1,19

Avant leur métamorphose les larves creusent une loge nymphale, disposée à angle droit par rapport à la galerie larvaire ; elles en ferment l'entrée avec un mélange de sciure et de sécrétions glandulaires. La nymphose a duré environ six semaines (25 février-8 avril.).

Structure des galeries L’analyse radiologique montre que les galeries n’ont pas de structure spécifique (fig. 3). Leur complexité varie avec l'âge de la femelle, le nombre de descendants et la composition des tissus du bois. Le réseau des tunnels est construit surtout par la femelle. Le fragment initial de la galerie creusé par le mâle est légèrement incliné vers l'intérieur, perpendiculairement à la surface du tronc. Puis la femelle commence à excaver deux rameaux principaux, disposés selon les anneaux de croissance du bois et portant des ramifications sur une longueur d'environ 10 à 15 cm. Le réseau de galeries se développe ensuite par l'excavation d'un nombre variable de ramifications, au-dessus ou en dessous du plan initial. Nous avons vérifié ainsi que le nombre des œufs pondus dépend directement de la longueur totale des galeries. Pendant la période de développement des larves, le mâle reste dans les premiers centimètres de la galerie ; il protège l’entrée et évite la sortie des larves.

Figure 3. Modèle général d'une galerie de P. cylindrus sur chêne-liège (rondelle, diam. 10 cm)

La période d'activité des insectes, évaluée à partir de la production de sciure, s'est prolongée jusqu'à la fin octobre (maximum en août et septembre) ; l'activité s'arrête en hiver (le mâle ferme alors complètement l'entrée de la galerie par un mélange de sciure et de sécrétions) et reprend au printemps suivant. Pendant les émergences de la génération suivante on observe encore une grande activité d'excavation des galeries.

Distribution temporelle des émergences et du vol L'analyse préliminaire des émergences montre que presque 80% des galeries étudiées ont libéré des adultes (19/22 la première année et 21/30 la suivante). On a constaté toutefois une grande variabilité entre galeries que ce soit pour les caractéristiques temporelles des émergences (durée, début et fin des sorties) ou le nombre d'insectes produit par galerie. La relation entre ces différentes caractéristiques a été analysée par des AFC. Dans la première série de données (1993/1994) deux périodes d’émergence sont distinguées par le premier facteur (57% de l’inertie totale) (fig. 4A). Dans cinq galeries les adultes ont eu des émergences précoces (valeurs positives sur F1), tandis que dans les autres la période d'émergence s’est prolongée durant plusieurs semaines (valeurs négatives sur F1) (fig. 4B).

A F F F

B 20 Eff. 15 F moyen 10 5 0 3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 17 Semaines

1 4 1516 1019 13 7 1 F

12 Eff 20 moyen 15

10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Semaines

Figure 4. Typologie des galeries en fonction des émergences de P. cylindrus (1993-1994). A : représentation fonctionnelle des trois premiers facteurs pour les dates d’émer- gence. B : projection des galeries dans le plan F1xF2 ; Les ellipses correspondent à deux groupes de galeries dont les profils moyens des émergences sont présentés.

La seconde année (1994/1995), l’AFC a conduit à distinguer trois périodes d’émergence (fig. 5). Les émergences ont été précoces dans six galeries (valeurs négatives sur F1) et tardives dans les 15 autres. L'axe 2 permet de séparer ce dernier groupe en deux sous-groupes : dans

4 galeries (valeurs positives sur F2) les émergences se sont étalées du 27/5/94 au 19/1/95 tandis que pour les 11 autres (valeurs négatives sur F2) les sorties furent plus limitées dans le temps (du 3/6/94 jusqu'à 22/12/94) (fig. 5B).

F1 F2 F3

2 B 1

moyen Eff 1 5 2 0 1 F2 0 5 1 1 2 2 3 3 4 Semaine Eff moyen moyen Eff 1 38 3 26 5 39 3 40 0 37 0 5 1 1 2 2 3 3 4 30 2731 28 Semaine 34 3 F1 21 2933 2 25 22423 2 1 Eff 1 5 0 0 5 1 1 2 2 3 3 4 Semain Figure 5. Typologie des galeries en fonction des émergences de P. cylindrus (1994-1995). Projection sur le plan des deux premiers facteurs de l’AFC. Les ellipses correspondent à trois groupes de galeries dont les profils moyens des émergences sont présentés.

La synthèse de ces résultats permet le regroupement des galeries selon le profil des émergences (fig. 6). Un premier groupe comprend les galeries d’où les adultes émergent précocement, de mai à septembre. Les émergences s'étalent sur une durée moyenne de 4,5 mois mais en réalité 50 % des adultes sont sortis au bout de 2 mois et 90 % au bout de 3 mois. Le second groupe est composé de galeries d’où les premiers adultes ne sortent qu'en juillet- août et dont les émergences s'étalent sur environ six mois. Une nouvelle période d’émergence débute au mois de mai de l’année suivante pour s’achever trois à quatre mois plus tard. Le troisième groupe se caractérise par un fort étalement des émergences (7-8 mois) qui présentent une distribution temporelle bimodale avec un maximum absolu en octobre. Trois hypothèses peuvent expliquer les modèles d’émergence observés : 1) ils peuvent résulter de l'action conjuguée d’une série de facteurs liés à la population des insectes, à l’environnement ou à l’état sanitaire des hôtes ; 2) il existerait des sous-populations ; 3) le modèle 1 (précoce) étant très semblable à celui des émergences de la deuxième génération, il est possible qu’une deuxième génération ait lieu dans un nouvel hôte après la réemergence des parents à la fin de la première année. On a observé en effet dans ce dernier cas que les galeries n'ayant donné qu'une seule descendance correspondent à des attaques situées en bas

des troncs tandis que celles ayant libérés deux générations se situent plus haut. D'autres facteurs intra-populationnels, comme la vigueur et la taille des femelles, la vitesse de construction de la galerie, la nourriture disponible, la prédation ou le parasitisme, peuvent aussi jouer un rôle très important (Coulson, 1976).

25 A 20

15 Eff. moyen

0 13/5 22/7 30/9 9/12 17/2 28/4 7/7 15/9 24/11 2/2 Dates

25 B 20

Groupe 1 15

Eff. moyen Groupe 2 Groupe 3 10

0 14/5 23/7 1/10 10/12 18/2 Dates

Figure 6. Typologie du profil temporel des émergences selon les galeries. Série A (1993/95) : 2 groupes. Série B (1994/95) : 3 groupes.

L’analyse de l’ensemble montre que les émergences ne s'interrompent qu'en février, mars et avril. Dans certains cas la période d'émergence de P. cylindrus semble s'étaler sur au moins deux années consécutives. L'émergence des adultes commence fin juin en France,(Husson, 1955), en juillet en Allemagne (Strohmeyer, 1907), entre fin mai et début juin au Maroc (Chadigan et al., 1991). Toutefois, en Angleterre, on a enregistré des émergences sporadiques d’adultes de P. cylindrus pendant presque toute l'année, (Baker, 1963).

Le vol des adultes Des adultes de P. cylindrus ont été capturés pendant toute la période d'échantillonnage, de début mai jusqu'à fin décembre (fig. 7). Ils sont donc présents presque toute l'année dans les peuplements de chêne-liège de la région de Coruche. Malgré les fortes variations hebdomadaires, deux périodes se dégagent : la première, d'environ 8 semaines, s’étale du 6 juin au 24 juillet ; la deuxième plus courte (3 semaines) serait limitée au mois de septembre. Les variations d’effectifs peuvent dépendre de plusieurs facteurs : la distribution des émergences, les conditions climatiques lors du vol, la mortalité des adultes, leur installation

dans des arbres et leur émigration hors des parcelles étudiées. Ainsi, à chaque instant, de nouveaux couples vont se former avec un mélange d'insectes issus de différentes générations et de différents modèles d'émergences.

4 Nombre moyen de captures

0 1 5 10 15 20 25 30 Mai Juin Juillet Âout Sept. Oct. Nov. Déc. Dates

Figure 7. Effectifs d’adultes de P. cylindrus capturés en vol par des pièges à vitre en 1992. Moyenne par piège et par semaine.

Conclusion

Globalement on a vérifié que : – le développement biologique de l'insecte se déroule pendant une longue période de l'année au cours de laquelle œufs, larves, nymphes et adultes peuvent coexister dans la même galerie; – le développement se poursuit pendant toute l'année, y compris en hiver; – les stades larvaires et nymphal ont une longue durée. – la période d'émergence se prolonge pendant 9 mois et correspond peut-être à une première génération suivie d’une deuxième génération l'année suivante. – la grande longévité des femelles favorise chaque année un mélange de générations. P. cylindrus présente ainsi une stratégie de survie très complexe qui correspond probablement à une grande diversité génétique. La présence d’insectes en vol pendant presque toute l'année augmente la capacité de sélection des hôtes les plus favorables, ce qui donne à l’espèce de plus grandes potentialités de survie.

Références

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Bioecological characteristics of Platypus cylindrus in Portugal

Edmundo M. R. de Sousa, Domitien Debouzie

Abstract : The explosion of Platypus cylindrus F. (Col. Platypodidae), observed during the 80/90’s in southern Portugal, seems to be related to the current cork oak forest decline The interactions between forest insect populations and the decline factors affecting the hosts remain partly unknown. Moreover, the population dynamics of P. cylindrus is directly related to its larval development phase as well as adult emergence and flying periods. The capacities of survival and selection of the most favourable hosts are determined by these various factors. The results of the bioecological study of P cylindrus in Portugal in a greatly damaged cork oak stand are presented here with the aim to develop control strategies against this pest in the context of current cork oak decline in the Mediterranean region.

Key words : Cork oakt, forest decline, xylophagoous insect, Platypus cylindrus, bioecology, Portugal

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 85-92

Situation sanitaire de quelques subéraies de l’Ouest algérien : impact des xylophages

Rachid Tarik Bouhraoua 1, Claire Villemant 2, Mohamed Anouar Khelil 3, Sabeha Bouchaour 4 1 Département de Foresterie, 3 Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université de Tlemcen, BP 119, RP Imama, 13000 Algérie 2 ESA 8043, Laboratoire d’Entomologie, Muséum National d’Histoire Naturelle, 45 rue Buffon F-75005, Paris. 4 Conservation des forêts de la wilaya de Tlemcen, 13000 Algérie

Résumé : La situation sanitaire du chêne-liège a été évaluée dans quatre forêts domaniales de la région ouest de l’Algérie. En juillet 2000 et 2001, plus de 900 arbres ont été examinés. Plus de 60% montraient des signes de dépérissement. Ce déclin est plus marqué dans les zones littorale et montagneuse soumises à un climat plus sec (semi-aride). L’affaiblissement des arbres a favorisé l’installation d’un cortège de xylophages assez riche dont 17 espèces ont été identifiées. Leur pullulation a des conséquences néfastes sur la santé des arbres, dont certains meurent, mais aussi sur la qualité du liège. L’étude était centrée sur les deux Coléoptères les plus nocifs : Cerambyx cerdo mirbecki (Cerambycidae) et surtout Platypus cylindrus (Platypodidae) dont les dégâts sont plus forts (77 trous/m2 de tronc) en zone littorale qu’en montagne. D’autres facteurs contribuent aussi à l’altération de santé des arbres : ce sont principalement les incendies, l’embroussaillement, le surpâturage et la mauvaise qualité d’exploitation du liège.

Mots clés : Chêne-liège, Algérie, dépérissement, xylophages, Cerambyx cerdo, Platypus cylindrus.

Introduction

Le chêne-liège, Quercus suber L., constitue une des importantes richesses de l’Algérie (Battistini, 1938). Ses forêts tenaient et tiennent toujours une place primordiale dans la vie socio-économique la population riveraine car elles constituent, grâce à leur abondant sous- bois, un riche terrain de parcours pour un cheptel varié. Elles fournissent également le bois de chauffage, le charbon et le liège. Ce dernier occupait au début du siècle dernier le premier rang des produits forestiers et son exploitation représentait les ¾ de la recette forestière totale (Marc, 1916 ; Peyerimhoff, 1941). Les subéraies s’étendent sur tout le nord de l’Algérie mais sont en majeure partie localisées à l’est du pays. Sur une superficie totale d’environ 450.000 ha, un peu plus de la moitié (229.000 ha) est productive tandis que le reste est occupé par le maquis (Zine, 1992). La production nationale de liège a connu depuis plusieurs décennies des fluctuations annuelles parfois importantes. D’après les statistiques de la D.G.F. (1964/1999), elle atteint en moyenne 133.000 Q / an, ce qui est relativement faible. Le chêne-liège en Algérie est actuellement dans une situation inquiétante et son avenir apparaît sérieusement menacé. Les causes d’une telle situation sont multiples et complexes ; on les retrouve pour la plupart dans les autres pays subéricoles : France (Nageleisen et al., 1990), Espagne (Elena, 1992), Portugal (De Sousa, 1995), Italie (Marras et al., 1995) et Maroc (Bakry & Abourouh, 1996). Citons en particulier l’absence de sylviculture appropriée,

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la sécheresse, les incendies, le surpâturage et les attaques d’insectes ravageurs et de champignons pathogènes. Tous ont une influence directe sur la santé de l’arbre. Un bilan sanitaire des peuplements de l’ouest algérien a été effectué pendant ces deux dernières années afin d’apprécier la contribution de ces différents facteurs, et plus particulièrement du climat et des insectes xylophages, sur le dépérissement des arbres.

Matériel et méthode

Choix des forêts et stations L’évaluation sanitaire des peuplements de chêne-liège a été faite à partir d’un réseau de surveillance composé de 8 stations d’observation permanentes (deux dans chaque massif forestier) implantées dans la région oranaise. Cette région est bordée par la Méditerranée au nord, l’Atlas tellien au sud, le Maroc à l’ouest et le secteur algérois à l’est. Les quatre forêts domaniales sont inscrites dans un triangle comprenant M’Sila au nord, Zarieffet et Hafir au sud et Nesmoth à l’est. Le choix des forêts et des stations a reposé sur deux critères essentiels : l’étage bioclimatique et le relief. Dans chacune des stations, composées d’un certain nombre d’arbres marqués à la peinture blanche au printemps 2000, nous avons effectué différents relevés concernant notamment des données géographiques, topographiques et pédologiques, dendrométriques et sylvicoles. Les deux stations localisées dans la même forêt sont choisies de façon à représenter au moins deux aspects physiques ou forestiers différents. Evaluation de l’état sanitaire des arbres-échantillons Elle repose sur les observations habituellement réalisées lors des études de dépérissement (Nageleisen et al., 1990 ; Bakry et Abourouh, 1996 ; Franceschini et al., 1999). En juillet des années 2000 et 2001, 965 et 991 arbres ont été respectivement examinés et leur état sanitaire évalué à l’aide des critères suivants : 1-l’état de la cime a été noté selon la méthode européenne (Anonyme, 1991). Les cinq classes (0-4) habituelles ont été regroupées en 3 catégories, les deux premières constituant la catégorie des “arbres sains ” ayant perdu moins de 25 % de leur feuillage, les deux suivantes celle des “ arbres en voie de dépérissement ” en ayant perdu entre 25 et 75%, et la dernière celle des “ arbres dépérissants ou morts ” ayant perdu plus de 75% de leur feuillage. Seuls les arbres de ces deux dernières catégories ont été pris en considération dans cette étude. De même, en ce qui concerne la décoloration, nous n’avons considéré que les arbres présentant une coloration anormale sur plus de 1/10 de leur feuillage (Rolley et Bonneau, 1988). 2- l’état du tronc a été évalué sur sa partie démasclée et jusqu’à une hauteur de 3 m au dessus du sol. Nous avons noté son aspect (normal ou crevassé), la présence de trous de pénétration ou de sortie de xylophages en surface, la présence des champignons pathogènes les plus fréquents comme la charbon de la mère Hypoxylon mediterraneum, le départ de gourmands qui est considéré comme un indice de dépérissement (Marras et al., 1995), la qualité du liège (sain et adhérant à la mère ou sec et se détachant facilement) et l’importance de la surface de liège endommagée. Impact des xylophages Les défoliateurs du chêne-liège tels que Lymantria dispar (présent uniquement à M’Sila et à une densité très faible d’environ 1,5 pontes/arbre) étant rares, et le complexe des xylophages en revanche assez riche, nous avons choisi de centrer notre étude sur ces derniers dont l’action a des conséquences parfois inexorables sur la vigueur des arbres et la qualité de leur liège. Deux indices ont été utilisés pour quantifier l’impact de chaque xylophage identifié : la fréquence et la densité d’infestation (Soria et al., 1992). La fréquence des attaques (%

d’arbres attaqués) a été déterminée en comptant le nombre d’arbres présentant au moins un trou caractéristique du ravageur considéré (tab. 1). Tableau 1 : Caractéristiques des trous de sortie ou de pénétration (*) des principaux xylophages identifiés. Trous ronds (TR) ou trous ovales (TO)

Espèces TR : diamètre Espèces TO : longueur x (mm) largeur (mm) Platypus cylindrus F. * (Pl) 1,2-1,7 Cerambyx cerdo mirbecki Lucas (Ce) 15-60 x 10-30 Xyleborus monographus F.* (Sc) 0,8-1,0 Stromatium fulvum Villiers (Ce) 6-10 x 4-7 Xylopertha picea Olivier (Bo) 2,0-2,5 Leptura oblongomaculata Puquet (Ce) 7-8 x 4-5 Bostrichus capucinus L. (Bo) 3,0-4,0 Acmeaodera degener Scopoli (Bu) 3-4 x 2-3 Lichenophanes numida Lesne 4,0-6,0 Chrysobothris affinis F. (Bu) 6-8 x 3-5 (Bo) Penichroa fasciata Steph. (Ce) 4-5 x 2-3 Hesperophanes sericeus F.(Ce) 10-17 x 5-10 Pl : Platypodidae ; Sc : Scolytidae ; Bo : Bostrichidae ; Ce : Cerambycidae ; Bu : Buprestidae

Résultats

Caractéristiques des stations d’observation La description succincte des 8 stations d’observation est présentée dans le tableau 2. La densité des attaques (nombre moyen de trous par arbre) a été calculée de la façon suivante : en octobre 2000, après l’achèvement des émergences de la majorité des insectes, 453 arbres dont le tronc n’était pas crevassé ont été sélectionnés. Sur chacun, après avoir déterminé la surface observée, nous avons dénombré par unité de 50 cm tous les trous présents, anciens ou de l’année, selon la méthode utilisée par Du Merle et Attié (1992) et par De Sousa (1996 ; 1999). Etat sanitaire des arbres-échantillons L’état des cimes des 4 peuplements de chêne-liège (tab. 3) a varié selon les années. En 2000, les arbres se sont fortement défoliés : à l’échelle régionale, 70% d’entre eux avaient perdu plus de 25% de leur feuillage. Les plus forts éclaircissements du houppier ont été enregistrés à M’Sila et Nesmoth où 35 à 45 % des arbres ont perdu plus de 60% de leurs feuilles. Le taux de mortalité est resté faible (< 5%) partout sauf à Nesmoth où il a dépassé 13%. La décoloration des feuilles (vert-bronzé) s’est sévèrement manifestée en montagne en affectant une grande partie des arbres. En 2001 on a constaté une très nette amélioration de la coloration des feuilles : 6% seulement des arbres avaient plus d’1/10 de leur feuillage décoloré et seuls quelques cas de jaunissement de feuilles et de brûlure de rameaux ont été enregistrés. La perte de feuillage, encore importante, s’est plus ou moins atténuée selon les peuplements. De nouveaux cas de mortalité ont été recensés dans tous les peuplements (7 arbres à M’Sila, 3 à Nesmoth, 2 à Hafir et 1 à Zarieffet). Etat des troncs La majorité des arbres présente un tronc normal (tab. 4). A M’Sila cependant, un plus grand nombre d’arbres possède un tronc crevassé mais à des degrés variables. Les gourmands ne sont pas abondants et apparaissent plus nombreux dans les peuplements d’altitude que près du littoral. Les attaques d’insectes xylophages sont très fréquentes en forêt de M’Sila où elles concernent près de 87% des arbres. En montagne, les arbres sont moins attaqués : dans les deux subéraies de Tlemcen, moins de 23% des arbres sont atteints. Le charbon de la mère Hypoxylon mediterraneum est observé dans toutes les forêts mais dans des proportions variables. Il se manifeste plus à M’Sila et Nesmoth (8.5 et 12.8 % des arbres) où il affecte

troncs et même les branches des arbres dépérissants ; il est par contre rarement observé dans les deux autres forêts. Tableau 2 : Caractéristiques géographiques, physiques et sylviculturales des stations d’étude

Forêts M’Sila Hafi Zarieffet Nesmoth Wilaya (département) Oran Tlemcen Tlemcen Mascara Zone naturelle littoral montagne montagne montagne Bioclimat semi-aride sub-humide sub-humide semi-aride Nature de la roche mère Sables Grès séquariens Grès séquariens Dolomie calcaire pliocènes Texture du sol sablo-limoneux limono-sableux limono-sableux argilo-sableux Superficie (ha) 1068 9872 989 7416 Surface chêne-liège (ha) 600 4783 452 342 Stations 1 2 3 4 5 6 7 8 Topographie plateau ht versant cuvette haut versant haut versant Distance à la mer (km) 14 12 60 53 93 Superficie (ha) 0,75 0,65 0,84 0,5 3,1 0,4 0,72 0,5 Altitude (m) 325 380 1220 1180 940 1075 990 990 Exposition - - E N N NE O N Pente (%) 0 0 6 30 30 10 6 6 Profondeur du sol (cm) profond 190 60 40 profond > 60 Dernier incendie (année) néant néant 1994 néant Travaux sylvicoles néant néant néant néant Aménagement néant néant néant néant Chênes-lièges Nombre de brins/ha 230 130 204 218 60 270 146 140 Nature du peuplement pur mélangé pur mélangé pur Origine du peuplement naturel artificiel naturel naturel artificiel Régime et traitement futaie futaie taillis futaie taillis s/f. taillis s/f. futaie Age (ans) 60-100 60-100 60-80 40-80 60-100 20-80 40-60 40-50 Circonférence moy.(cm) 102 123 120 86 136 60 93 82 Hauteur moyenne (m) 9 10 13 8 11 6 8 6 Arbres à 1 brin (%) 77 76 99 95 78 69 94 99 Arbres démasclés (%) 98 98 100 94 97 100 78 80 Nombre d’écorçages 1-7 1-6 1 1-4 1-2 1 1-2 1-2 Coef .moyen d’écorçage 2,27 2,13 2,18 2,38 2,09 3,19 1,47 1,64 Dernier écorçage : année 1998 1998 1995 1995 1996 1996 1989 1989 Régénération (note 1-4) 0 3 0 0 0 0 0 0 Sous-bois (note 1-4) 0 3 1 2 1 3 0 0 Pâturage (note 1-4) 4 1 1 2 2 1 4 4 note : 0 ( nul), 1 ( faible), 2 ( moyen ), 3 ( assez important ), 4 ( important).

Les observations minutieuses faites au niveau des troncs ont permis de prélever des xylophages adultes directement dans leur trou d’émergence ou de pénétration. Une première liste de xylophages et les caractéristiques de leurs trous d’émergence ou de pénétration ont ainsi pu être établis (cf. tab. 1). 17 des 19 espèces récoltées ont été identifiées. La plupart sont communes aux quatre forêts. Stromatium fulvum, signalé seulement à M’Sila, semble se limiter à la zone littorale tandis que Leptura oblongomaculata n’est présent qu’en montagne . La présence de Bostrichus capucinus à Hafir et Zarieffet demeure à confirmer. La présence à Zarieffet du Buprestidae Agrilus hastulifer Ratzeburg qui creuse ses galeries dans les rameaux des chênes, est également à confirmer. Plusieurs Cerambycidae n’ont été collectés qu’à un

très petit nombre d’exemplaires : Agapanthia asphodeli (Latreille), Leptura desfontenayi Mulsant, Plagionotus arcuatus (L.) et Purpuricenus desfontainei (F.). Tableau 3. Etat sanitaire des cimes de chênes-lièges en 2000 et 2001 Forêt M’Sila Hafir Zarieffet Nesmoth Région Année 2000 2001 2000 2001 2000 2001 2000 2001 20002001 Nombre d’arbres observés** 336 325* 219 217* 222 221* 188 228 965 991 % avec > 25% de feuillage perdu 74,7 76,3 48,9 48,1 73,1 62,5 78,2 64,2 70 64 % avec > 60% de feuillage perdu 45 35 9,2 14,2 2,2 22 38 40 30.2 28,7 % avec >10% de feuillage décoloré 27,5 12,6 79,4 4,6 73,4 2,2 74,4 2,6 59,1 6,4 % avec > 60% de feuillage perdu 0,9 - 1.4 - 3,2 - 16,5 - 4,3 - % morts ou desséchés 4,8 6,2 0,4 0,9 1,8 0,9 12,8 13,6 4,7 6,4 * la différence provient des coupes illicites et chutes ; ** les arbres morts sans feuillage n’ont pas été pris en considération

Tableau 4. Caractéristiques des troncs des arbres-échantillons Forêts M’Sila Hafir Zarieffet Nesmoth % d’arbres crevassés 17,6 1,8 6,1 0,6 % d’arbres avec gourmands 2,5 32,9 20,2 14,5 % d’arbres avec au moins une attaque de xylophage 86,8 22,4 15,6 45,7 % d’arbres atteints par H. mediterraneum 4,6 (8,5*) 0,9 (0,9*) 2,3 (2,3*) 12,8 (12,8*) % de surface de liège endommagée** 25,1 6,6 6,2 31,1 (* ) : l’observation a été faite sur l’arbre entier ; ** : cas des arbres infestés aux troncs non crevassés

Impact des xylophages La forêt de M’Sila apparaît comme la plus infestée ; son cortège de xylophages est assez riche et provoque des dégâts dont la densité moyenne atteint environ un centaine de trous/m² (tab. 5). Nesmoth occupe le deuxième rang avec environ de 80 trous/m2. Partout, la majeure partie des attaques est due à Platypus cylindrus dont la proportion atteint 42 % à Nesmoth et 82 % à M’Sila La fréquence et la densité d’infestation de cet insecte varie selon les stations et sont plus fortes sur le littoral avec une densité moyenne de l’ordre de 77 trous/m2 qu’en montagne. En zone montagneuse, deux autres espèces, Acmaeodera degener et Lichenophanes numida, ont aussi un impact important ; à Nesmoth la fréquence et la densité de leurs attaques est voisine de celles du Platype. Les pullulations de xylophages provoquent non seulement la détérioration de l’état sanitaire des arbres mais aussi une perte de production de liège. A M’Sila par exemple, nous estimons à 20 à 25 % la surface de liège perdue (tab. 4), ce qui est une perte très importante deux ans seulement après la récolte de liège faite en 1998.

Discussion

Après deux années de suivi, il ressort que certains des peuplements de chêne-liège de l’ouest algérien ont une situation sanitaire médiocre et présentent de nets symptômes de dépérissement. Cette situation est le résultat de l’action conjuguée de nombreux facteurs : - le climat à caractère “ semi-aride ” qui s’est installé depuis le début du siècle dernier dans une grande partie de la région (Seltzer, 1946 ;Thinthoin, 1948) a contribué largement à

fragiliser les arbres. Le déficit pluviométrique accentué enregistré au cours de l’année hydrologique 1999-2000 (136 mm à Nesmoth, 336 mm à Zarieffet, 350 mm à Hafir et 420 mm à M’Sila ) est à l’origine de l’importante décoloration des feuilles, surtout dans les forêts de montagne. A faible altitude par contre, le déficit hydrique a été compensé par le taux élevé, notamment en été, de l’humidité atmosphérique (> 60%). - l’action des insectes xylophages et en particulier de Cerambyx cerdo et Platypus cylindrus. Il ne faut pourtant pas sous estimer l’effet combiné des autres espèces. C. cerdo, en provoquant le dessèchement et la mort des branches, est responsable de la perte de feuillage observée sur plus d’un tiers des arbres de la classe 3. P. cylindrus par contre est à l’origine de la majorité des cas de dépérissement “ aigu ” enregistrés en été et en automne de la première année. Le tableau 6 présente les caractéristiques arbres ayant succombé à l’attaque de ce ravageur. - l’action des champignons pathogènes sur le dessèchement des rameaux qui par la suite ont été attaqués en grand nombre par Lichenophanes numida.

Tableau 5. Importance des attaques des principales espèces d’insectes xylophages Forêts M’Sila Hafir Zarieffet Nesmoth Total des arbres observés* 180 49 27 197 Total de la surface observée (m²) 410 125,.8 65,.4 108,5 Total de trous dénombrés 38500 2923 738 8481 Densité moyenne de trous/m² 93,7 23,23 11,3 78,2 Classe moyenne de défoliation 2 1 1 2 C. c. mirbecki densité1 (fréquence2) d’attaque 149 (32) 4 (0,8) 6 (3) 30 (8) S. fulvum (id.) 2778 (44) 0 0 0 L. oblongomaculata (id.) 0 68 (8) 78 (5) 78 (6) L.numida (id.) 1113 (29) 219 (11) 42 (8) 1909 (35) B. capucinus (id.) 51 (4) 0 0 23 (2) X. monographus (id.) 1284 (22) 103 (5.4) 9 (2) 147 (10) X. picea (id.) 184 (10) 35 (1.7) 10 (0.2) 110 (8) A. degener (id.) 876 (26) 625 (11) 99 (5) 2487 (41) C. affinis (id.) 44 (6) 1 (0.8) 3 (2) 187 (17) P. cylindrus (id.) 31703 (61) 2137 (18 ) 411 (8) 3608 (37) P .fasciata (id) 302 ( 8,2) 7 (1,4) 2 (R) 120 (2,5) H. sericeus (id) (R) 0 0 (R) P. cylindrus densité moyenne de trous/m² 77,2 17,1 6,3 33,.3 * : Arbres infestés au tronc non crevassé ; 1 : nombre de trous ; 2 : % d’arbres attaqués (R) : rare

Tableau 6. Caractéristiques de quelques arbres ayant succombé aux attaques de P.cylindrus* Forêt Diam. Hauteur Age Nombre Coeff. Année Classe de Mort en Densité (cm) (m) (ans) écorçages écorçage écorçage défoliation (mois) trous/m² M’Sila 74 4,6 35-40 1 1,9 1992 3 Août-Sept 800 90 7,1 40-50 1 2,2 1998 3 Août 300 135 10 50-60 3 2,24 1998 2 Août 500 80 7,8 40-50 3 2,7 1998 3 Août-Sept 200 49 4,8 20-30 1 2,7 1998 3 Juil-Août 200 Hafir 70 6,5 35-45 1 3,0 1995 3 Juil-Sept 300 241 13,2 > 150 2 3,6 1995 3 Août 100 Nesmoth 65 5,5 40 1 1,6 1989 3 juin 70

*La densité des trous :m² est une estimation - la qualité de l’exploitation du liège. Les récoltes exagérées répondant rarement aux normes signalées dans la littérature forestière (Boudy, 1950 ; Natividade, 1956 ) et les récoltes de liège effectuées par du personnel n’ayant pas suffisamment de compétence ont contribué de façon sensible à l’altération de la vitalité des arbres. Plus de 60 % des arbres de M’Sila ont subi une levée excessive (coefficient d’écorçage > 2 en étage semi-aride) contre 17% à Nesmoth. - les incendies fréquents, le surpâturage, les coupes illicites de liège au cours du printemps , les blessures diverses provoquées par l’homme et l’absence de traitements sylvicoles indispensables comme les travaux d’assainissement et de débroussaillement, sont autant de facteurs ayant un rôle négatif sur l’état sanitaire des arbres.

Conclusion

La majorité des subéraies de la région oranaise est soumise à des conditions écologiques peu favorables au développement normal des arbres. La sécheresse qui sévit depuis longtemps a fragilisé les peuplements et favorisé par conséquent l’installation d’un important complexe d’insectes xylophages. Parmi les 17 espèces déjà identifiées, deux, Cerambyx cerdo mirbecki et surtout Platypus cylindrus, sont des ravageurs potentiellement dangereux car ils peuvent causer de graves dommages aussi bien pour la santé de l’arbre que pour la qualité de son liège. Il serait nécessaire d’apporter une plus grande attention à l’étude de la biologie et de la dynamique des populations de P. cylindrus dont les effectifs sont en phase d’explosion à M’Sila. Des mesures doivent être prises pour réduire son impact sur la subéraie. Ces deux facteurs ne sont toutefois pas les seuls responsables de la situation sanitaire actuelle des subéraies ; un grand nombre d’autres facteurs, comme les incendies et l’action négative des populations riveraines, sont aussi à l’origine d’une importante dégradation des peuplements.

Remerciements

Nous tenons à remercier chaleureusement Monsieur G. Tavakilian du Laboratoire d’Entomologie du Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris pour l’identification des Cerambycidae cités dans le texte, ainsi que les chefs des circonscriptions forestières de Boutlelis ( Mr H. Zeghlil), de Teghenif ( Mr A. Moumnine) et de Tlemcen ( M.Badaoui) et l’APF L. Abderrahim pour leur aide technique sur le terrain.

Références

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Health status of cork oak forests in western Algeria : impact of xylophagous insects

Phytosanitary condition of cork oak stands was assessed in 4 national forests in the western part of Algeria. In July 2000 and 2001, among the more than 900 trees examined, more than 60% showed decline symptoms. Oak decline is greater in littoral and mountainous areas which undergo dryer climatic conditions (semi-arid climate). The tree weakening benefits to the xylophagous pest complex from which 17 species were identified. Wood-boring insects induce sometimes the death of the trees and also oak quality decrease. The most injourious species are the Coleoptera Cerambyx cerdo mirbecki (Cerambycidae) and above all Platypus cylindrus (Platypodidae). The damage of this last species is greater in littoral stands (77 holes/m2) than in mountainous ones. Several others factors contributed in oak decline, notably drought, frequent forest fires, overgrazing and bad conditions of cork removing.

Keys words: Cork oak , Algeria, decline, xylophagous insects, Cerambyx cerdo, Platypus cylindrus

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 93-100

Les insectes ravageurs des chênes, Quercus suber et Q. ilex, en Algérie

Gahdab Chakali, Amel Attal-Bedreddine, Hassina Ouzani Institut National Agronomique, Département de Zoologie Agricole et Forestière, El-Harrach Alger (Algérie)

Résumé : Ce travail fait la synthèse des observations effectuées au cours de la dernière décennie sur les principaux insectes ravageurs de diverses subéraies et yeuseraies d’Algérie. Les pullulations périodiques des Lépidoptères phyllophages sont préoccupantes et constituent une menace latente pour les chênaies. Lymantria dispar et Ephesia nymphaea ont provoqué certaines années des défoliations importantes des peuplements de Quercus suber et Q. ilex. Q. suber est aussi régulièrement attaqué par Euproctis chrysorrhoea et Orgyia trigotephras. Les attaques d’insectes xylophages ont pris récemment de l’ampleur. Les dégâts des Coléoptères Cerambyx cerdo et Platypus cylindrus ont été observés dans diverses chênaies où ils contribuent fortement à leur dépérissement. Les dernières glandées ont subi une forte attaque de la tordeuse Cydia fagiglandana et du charançon Curculio elephas.

Mots clés : insectes, phyllophages, xylophages, glands, Quercus suber, Quercus ilex, Algérie.

Introduction

Les problèmes que connaissent les peuplements forestiers méditerranéens depuis quelques décennies sont très inquiétants (Luciano, 1995 ; Villemant, 1999). Les forêts algériennes n’en sont pas à l’abri et, chaque année, la dégradation des sols, les incendies, le surpâturage, les maladies fongiques et les attaques d’insectes ravageurs font disparaître des surfaces considérables. Les peuplements de chêne vert (Quercus ilex L.) et surtout de chêne liège (Q. suber L.) sont particulièrement concernés par ce phénomène et leur état sanitaire actuel est préoccupant. 60% environ des 440 000 ha de subéraies algériennes sont ainsi fortement dégradés et déjà en partie voués à disparaître (Messaoudène, 2000). Les informations concernant les insectes ravageurs du chêne-liège et du chêne vert en Algérie sont peu nombreuses et lacunaires. Beaucoup de données sur les périodes d’infestation, les aires de répartition et les plantes hôtes de ces ravageurs sont encore fragmentaires et nécessitent d’être mises à jour par des études de terrain plus nombreuses et plus régulières. Ce travail est une synthèse de diverses observations effectuées au cours de la dernière décennie dans plusieurs subéraies et yeuseraies des zones humide, sub-humide et semi-aride du nord de l’Algérie; il fait le bilan des informations recueillies sur les principaux ravageurs du chêne-liège et du chêne vert de ce pays.

Matériel et méthodes

L’étude a concerné huit sites du nord de l’Algérie (fig. 1) dont les caractéristiques sont précisées dans le tableau 1. Un ensemble de techniques de capture classiques (battage, récolte à vue des insectes présents dans le feuillage et sur les troncs) a été mis en oeuvre sur le terrain au rythme d’une à deux fois par mois. En 1996 et 1998, au moment de la chute des fruits, des lots de glands ont été prélevés et examinés pour évaluer l’impact de leurs ravageurs.

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Figure 1. Répartition géographique des suberaies et des yeuseraies prospectées en Algérie

Tableau 1. Caractéristiques des différents sites prospectés

Type de Nom du Région Surface Altitude Etage Années Références forêt massif (ha) (m) bioclimatiq d’étude Subéraie Adjarda Jijel 160,47 400 humide 1992 Bencheikh, 1992 Subéraie Larbatache Boumerdes 500 200 sub-humide 1992 Ghanem, 1992 Subéraie Tamentout Petite 1127 800 sub-humide 1991/92 Benmecheri, Kalylie 1994 Yeuseraie Haoud Chréa 3000 1400 sub-humide 1992/93 Attal-Bedreddine, 1994 Subéraie Zitouna Collo 3226 548 humide 1996 Bouabdella & Boukerdenna, 1997 Subéraies Brabtia El-Kala 1045,2 65 sub-humide 1996 Demnati, 1997 Ghora El-Kala 500 600 Subéraie Béni- Béjaia 11.000 800 sub-humide 1998 Ouzani, 1998 Mimoun Yeuseraie Ras-El- Bordj Bou- 1568 1100 semi-aride 1999 Derbal, 2000 Oued Arréridj

Résultats et discussion

Au cours de la période d’étude, les dommages occasionnés au feuillage des chênes étaient dus essentiellement à des Lépidoptères, principalement Lymantria dispar (L.), Ephesia nymphaea Esper, Euproctis chrysorrhoea (L.) et Orgyia trigotephras Boisduval (Chakali & Ghelem,

1998). Les pullulations périodiques de ces espèces demeurent préoccupantes pour les forestiers. Les attaques d’insectes xylophages des chênes ont pris de l’ampleur au cours de ces dernières années. Les dégâts des Coléoptères Cerambyx cerdo mirbecki Lucas et Platypus cylindrus (F.) sont de plus en plus souvent observés, notamment dans les subéraies où ils contribuent fortement au dépérissement des peuplements. La régénération naturelle des chênaies est limitée par les dégâts des ravageurs de glands. Les dernières glandées ont ainsi subi une forte attaque de la tordeuse Cydia fagiglandana Zeller et du charançon Curculio elephas Gyll.

Le bombyx disparate Lymantria dispar (Lepidoptera, Lymantriidae) En Algérie comme dans le reste de l’Afrique du nord, cet insecte est sans aucun doute le plus important défoliateur des forêts de chênes (Khous & Demolin, 1997). En 1992, la présence du ravageur n’a été observée dans aucune des subéraies prospectées au centre et à l’est du pays, alors qu’un de ses compétiteurs, Euproctis chrysorrhoaea, était abondant et provoquait localement des défoliations totales dans les subéraies de Jijel (Bencheikh, 1992). Une enquête faite auprès des services forestiers a montré qu’à la même époque, en Oranie, à l’ouest du pays, une pullulation de Lymantria dispar entraînait des défoliations partielles des peuplements de chêne vert, sur des surfaces atteignant 800 ha en 1992 et 1750 ha l’année suivante. Une autre défoliation, sur 1890 ha, a encore été signalée dans cette région en 1995. En 1993, seuls quelques rares individus de Lymantria dispar ont été récoltés localement dans la yeuseraie d’altitude de Haoud (Attal-Bedreddine, 1994). Cette année là, deux autres espèces, Ephesia nymphaea et Euproctis chrysorrhoaea, ont occasionné des défoliations partielles sur chêne vert à Haoud et sur chêne-liège à Tamentout (Attal-Bedreddine, 1994 ; Benmecheri, 1994). Des dégâts localisés du bombyx disparate ont également été observés lors des prospections menées au cours du mois d’avril 1996 dans les subéraies situées à l’est d’El- Kala, dans la station de Ghora (Demnati, 1997). A la même époque de fortes populations du ravageur étaient signalées dans la subéraie de Zitouna par Bouabdellah & Boukerdenna (1997). En 1998, seuls quelques adultes de L. dispar ont été récoltés dans la subéraie de Béni- Mimoun (Ouzani, 1998). L’évolution des gradations de L. dispar en Europe et en Afrique du nord a fait l’objet d’une synthèse par Villemant & Fraval (1999). La dynamique des populations de l’insecte à l’échelle d’un massif forestier est un phénomène extrêmement complexe dont la compréhension nécessite des observations régulières sur une longue période de temps. Une telle étude a été réalisée au Maroc par Fraval et ses collaborateurs (Fraval, 1989). Les conditions climatiques défavorables liées à la sécheresse qui a sévi au cours de la dernière décennie et le mauvais état sanitaire des chênaies jouent de toute évidence un rôle important dans la dynamique des populations du bombyx disparate en Afrique du nord. Toutefois, les observations très fragmentaires faites sur un ensemble hétérogène de peuplements forestiers ne permettent à l’heure actuelle ni d’établir un bilan précis de la situation du ravageur en Algérie ni d’apprécier l’impact des facteurs de dépérissement sur l’évolution de ses infestations.

Ephesia nymphaea (Lepidoptera, Noctuidae) Ephesia nymphaea est souvent confondue avec d’autres espèces de noctuelles du genre Catocala qui s’attaquent elles aussi aux chênes. Ses adultes se distinguent des espèces voisines par la présence, au niveau du bord externe supérieur de l’aile postérieure, d’une cavité ovale, ou alvéole, de couleur jaune orangé (Toimil, 1987).

En 1992, E. nymphaea a été observée en faibles effectifs dans la subéraie de Larbatache par Ghanem (1992) et en plus grands nombres dans les futaies de chêne vert de la yeuseraie de Haoud (Attal-Bedreddine, 1994). Cette noctuelle plutôt montagnarde se nourrit aussi bien du chêne-liège que du chêne vert ; elle est répandue au Maroc jusqu’aux régions pré-sahariennes (Rungs, 1981). Avec les Catocales, elle a provoqué dans les années 80 d’importantes défoliations dans les peuplements de chêne vert du Moyen Atlas marocain (Villemant & Fraval, 1991). Les observations menées par Attal-Bedreddine(1994) dans la yeuseraie de Haoud montrent qu’à 1 400 m d’altitude, les adultes émergent au cours de la deuxième quinzaine de juillet. Les chenilles éclosent fin mars-début avril et achèvent leur développement à la fin juin. Elles tissent alors un cocon de nymphose souvent placé à l’intérieur d’une bourse protectrice formée de deux ou trois feuilles de chêne vert maintenues par des fils de soie.

Le cul brun, Euproctis chrysorrhoea (Lepidoptera, Lymantriidae) Les premières observations et récoltes du cul brun en Algérie ont été effectuées dans le parc national de Taza par Chambon et al. (1992). Cette espèce monovoltine et polyphage cause des dommages aux chênes, à différents feuillus et à divers arbres fruitiers (Chambon et al., 1992). Des infestations ont été observées au cours des années 1992 dans les subéraies des régions de Jijel et des Babors par Bencheikh (1992) et dans la subéraie de Tamentout par Benmechri (1994). Les adultes volent à partir du début de juillet. Les femelles déposent leurs œufs à la face inférieure des feuilles de chênes et recouvrent l’ooplaque de poils roux. Les chenilles éclosent un mois après et commencent à s’alimenter et à tisser un nid d’hiver fait de feuilles agglomérées par des fils de soie, dans lequel elles demeurent en diapause jusqu’au printemps. Début mai, les chenilles de troisième stade quittent le nid pour s’alimenter à nouveau. La nymphose, dans un cocon, dure environ trois semaines.

L’orgye, Orgyia trigotephras (Lepidoptera, Lymantriidae) O. trigotephras est une espèce de la méditerranée occidentale ; la sous-espèce anceps Oberthür est présente en Algérie et au Maroc où elle s’attaque principalement au chêne-liège et au chêne vert (Chambon et al., 1992 ; El-Hassani et al., 1994). Sa présence en abondance dans le feuillage du chêne-liège a été constatée entre avril et juin 1992 dans la subéraie de Larbatache où une dizaine d’hectares ont été partiellement défoliés (Ghanem, 1992). Un petit nombre de cocons et d’adultes de cette espèce ont été collectés en 1994 sur chêne vert en altitude dans la forêt de Haoud (Attal-Bedreddine, 1994). Les chenilles dévorent les limbes des feuilles tout en respectant les nervures. La nymphose des femelles (aptères) se fait dans un cocon de soie blanchâtre généralement caché dans les crevasses du liège ou les fissures du tronc du chêne vert. Les mâles (ailés) tissent fréquemment leur cocon dans le feuillage des chênes (Ghanem, 1992). L’émergence des adultes s’échelonne du mois de juin au début du mois de juillet. L’espèce est monovoltine et son cycle de développement est très proche de celui du bombyx disparate avec qui cette espèce peut entrer en compétition (Fraval, 1989).

La tordeuse verte, Tortrix viridana L. (Lepidoptera, Tortricidae) La tordeuse verte du chêne, Tortrix viridana est l’un des principaux défoliateurs des espèces du genre Quercus dans la région paléarctique (Du Merle, 1999). D’importantes gradations de cette espèce ont été observées au début des années 90 dans les subéraies et les zénaies de la Kabylie des Babors à Tamezguida, située au sud de la région de Jijel. Sa présence a été notée également dans les subéraies de Guerrouch (Jijel), dans les chênaies de l’Akfadou situées entre les régions de Tizi-ouzou et Bejaia et dans les zénaies de

la forêt de Tamentout . Ses pullulations qui durent 2 à 3 ans sont séparées par des périodes de latence d’environ 5 ans (Benmechri, 1994). Les papillons de la tordeuse verte opèrent des déplacements de grandes amplitudes (Du Merle, 1980). La diversité et la répartition des chênes en Kabylie sous l’influence de divers facteurs stationnels contribuent à la distribution de T. viridana. Des infestations d’envergure sont à craindre dans les années à venir.

Le grand capricorne, Cerambyx cerdo var. mirbecki L. (Coleoptera, Cerambycidae) Cerambyx cerdo var. mirbecki est une espèce xylophage commune en Algérie et dans toute l’Afrique du Nord. Elle vit principalement aux dépens du chêne-liège. Les dégâts importants observés en Algérie ces dernières années semblent avoir été favorisés par la sécheresse et le mauvais état sanitaire des peuplements ; ils contribuent fortement aux dépérissements qui affectent plusieurs hectares de subéraie de l’est algérien, dans les régions d’El-kala, de Souk- Ahras et de Guelma (Zergoun, com. per.). A l’ouest du pays, où l’impact de la sécheresse est plus marqué, des dizaines d’hectares de chêne liège ont subi l’attaque de ce xylophage (Bouhraoua, com. per.). Les adultes apparaissent au cours de la période estivale et les femelles déposent leurs œufs dans les fissures de l’écorce dans la partie inférieure des troncs des chênes. Les larves creusent des galeries dans l’écorce puis s’enfoncent profondément dans l’aubier. La biologie et les dégâts de l’insecte ont été étudiés au Maroc en subéraie de la Mamora (Villemant & Fraval 1991 ; El Antry, 1999).

Le platype, Platypus cylindrus (Coleoptera, Platypodidae) Platypus cylindrus est bien connu des forestiers par les symptômes de son attaque appelée piqûre noire. Les orifices de pénétration de l’insecte se repèrent facilement par la présence d’une fine sciure provenant du forage des galeries par les adultes. Celles-ci sont tapissées d’un feutrage noir caractéristique. Les dégâts de cette espèce, qui a une vaste répartition en Europe et en région méditerranéenne (Balachowsky, 1949), ne sont devenus importants en Algérie que depuis quelques années. Nous avons collecté des adultes pour la première fois en 1998 dans la subéraie de Beni-Mimoun. A l’ouest, ses attaques ont été également signalées depuis 1999 sur Quercus ilex et Q. suber (Bouhraoua, com. pers.). Avec Cerambyx cerdo, Platypus cylindrus contribue fortement au dépérissement actuel des chênaies méditerranéennes et plus particulièrement des subéraies (Sousa & Debouzie, 1999 ; Bouhraoua et al., 2002).

La tordeuse des glands, Cydia fagiglandana (Lepidoptera, Tortricidae) Parmi les tordeuses des glands, l’espèce polyphage Cydia fagiglandana est l’une des plus fréquentes dans les glands en Algérie. Cette espèce est très répandue dans toute la région Eurasiatique et en Afrique du nord (El-Hassani et al., 1994). La tordeuse des glands présente une génération par an. Les femelles pondent leurs œufs entre août et septembre. A l’éclosion, les chenilles pénètrent dans les glands pour s’alimenter et quittent le fruit à la fin de leur développement pour se nymphoser dans la litière. A ce stade débute une diapause qui s’achèvera à la fin du mois de juin de l’année suivante (Derbal, 2000). Lorsque les chenilles, de couleur rose, ont quitté le fruit, on reconnaît leur attaque aux trous de sorties dont le diamètre est d’environ 2 mm. En 1996, 30% des 270 glands collectés dans la subéraie d’El-kala, étaient attaqués par la tordeuse (Demnati, 1997). En 1998, 300 glands ont été récoltés dans la yeuseraies de Ras-El- Oued ; leur taux d’infestation par C. fagiglandana avoisinait les 20% (Derbal, 2000).

En forêt de Tamentout, les glands de chêne-liège étaient surtout attaqués par Cydia splendana Hubner (Benmechri, 1994)

Le charançon des glands, Curculio elephas (Coleoptera, Curculionidae) Comme C. fagiglandana, les larves du charançon Curculio elephas se développent dans les fruits de différentes espèces de Fagacées (Hoffmann, 1954). A la fin de leur évolution les larves âgées quittent les glands pour se nymphoser dans le sol. Lorsque les conditions lui sont favorables, l’insecte a une génération par an. L’espèce est fréquente dans les chênaies des zones humides, sub-humides et dans les yeuseraies des zones semi-arides (Demnati, 1997 ; Derbal, 2000). On reconnaît les fruits attaqués à la présence de trous de sortie d’environ 2,5 à 5 mm de diamètre. L’attaque du charançon a concerné environ 28%. des glands collectés dans la subéraie d’El-kala en 1996 et 18% des glands dans la yeuseraies de Ras El-Oued en 1998. En forêt de Tamentout, les glands de chêne-liège sont attaqués par C. elephas et C glandium Marsham. (Benmecheri, 1994).

Conclusion

Les travaux entrepris dans quelques subéraies et yeuseraies algériennes ont permis de retrouver les insectes défoliateurs, xylophages et consommateurs de glands, considérés comme les principaux ravageurs du chêne-liège et du chêne vert en Afrique du Nord (Villemant & Fraval, 1991). Trop peu d’études toutefois se sont intéressées à la dynamique de des populations de ces ravageurs dans notre pays et celles qui ont été entreprises ont en outre été trop limitées dans le temps et dans l’espace. Un effort tout particulier doit être fait pour acquérir plus de connaissances sur la bioécologie et les fluctuations spatio-temporelles de ces espèces afin de mettre au point des méthodes de surveillance et de lutte intégrée qui permettront d’assurer une meilleure protection des forêts de chênes en Algérie. Par ailleurs, les entomologistes algériens devraient s’attacher à approfondir leurs connaissances sur l’ensemble des insectes inféodés aux chênes avec un intérêt tout particulier pour les phyllophages et les xylophages. Cette faune, à coup sûr extrêmement diversifiée compte tenu de la diversité des situations bioclimatiques et stationnelles des chênaies algériennes, demeure actuellement trop mal connue par rapport à celle des autres pays méditerranéens.

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Insects pests of the oaks Quercus suber and Q. ilex in Algeria

Gahdab Chakali, Amel Attal-Bedreddine, Hassina Ouzani

Abstract : This work is a review of observations made during the last decade on insect pests of cork oak and holm oak forests in Algeria. Forest managers are worried about periodical infestations of phyllophagous Lepidoptera which represent a latent threat for oak stands. Significant defoliation of Quercus suber and Q. ilex stands were induced by Lymantria dispar and Ephesia nymphaea. Frequently, Euproctis chrysorrhoea and Orgyia trigotephras damage cork oak foliage. Attacks of xylophagous insects recently increased in Algeria. Damage of Cerambyx cerdo mirbecki and Platypus cylindrus detected in several oak stands seem to greatly contribute to actual oak decline. Acorn production of the last years was reduced by the Tortricid moth Cydia fagiglandana and the weevil Curculio elephas.

Key words : phyllophagous insect, xylophagous insect, oak, Quercus suber, Quercus ilex, acorn, Algeria.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 101-108

Lymantria dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) en Tunisie: état actuel des connaissances et perspectives de recherche

Mohamed Lahbib Ben Jamâa1, Sofiane M’nara1, Claire Villemant2, Abdelhamid Khaldi1 1 INRGREF B.P. N°10, 2080 Tunis-Tunisie 2 MNHN, ESA 8043, Laboratoire d’Entomologie, 45 rue Buffon, F-75005 Paris, France

Résumé : Lymantria dispar L. provoque dans la subéraie tunisienne des défoliations partielles ou totales dont l’étendue peut atteindre certaines années plusieurs dizaines de milliers d’hectares. Pourtant très peu d’études se sont intéressées jusqu’ici au ravageur dans notre pays. Nous présentons ici un bilan de l’état actuel des connaissances. Les gradations du bombyx disparate en Tunisie se succèdent avec une période d’environ 20 ans. La phase de gradation générale durant laquelle ont lieu les défoliations dure environ 13 ans. La phase de latence générale qui suit la rétrogradation est environ 6 à 7 ans. Durant cette dernière période aucune défoliation n’a lieu : la population du ravageur est à son niveau le plus bas et sa présence n’est décelée qu’au niveau de foyers primaires localisés. En 1999 , l’absence totale de défoliation, la rareté et la petite taille des pontes, qui renferment une proportion élevée d’œufs non viables, suggèrent que les populations du ravageur sont en fin de rétrogradation et vont entrer en latence. Des stations d’étude et de surveillance du ravageur et de ses ennemis naturels en période de latence ont été mises en place entre 1999 et 2000 dans sept sites considérés d’après la bibliographie comme des foyers primaires d’infestation potentiels.

Mots clés: Lymantria dispar, biologie, dynamique des populations, Quercus suber, Tunisie.

Introduction

Les forêts de chênes en Tunisie La superficie actuelle des terrains forestiers en Tunisie est de 970 828 ha (I.F.N., 1995). Les forêts de chênes couvrent 6,5% de cette surface soit 52 909 ha. Elles sont toutes localisées sur une frange humide au nord-ouest du pays (tab.1). Le chêne-liège est l’espèce forestière feuillue autochtone la plus représentée sur le territoire tunisien et tout particulièrement en Kroumirie. Avec Nefza et les Mogods, cette région fait partie, d’un point de vue géologique, de la chaîne des Atlas septentrionaux représentés au Maroc par le Rif et le Pré-Rif et en Algérie par le Tell. L’ensemble est une zone montagneuse dont les sommets décroissent en altitude du sud-ouest vers le nord-est. Le point culminant se situe au jebel El Ghorra (1203 m) dans la région d’El Feidja, alors que le sommet le plus bas du massif est le jebel El Ghuech (416 m) à l’est de Tabarka. Les forêts de chêne liège en Tunisie se caractérisent par leur relief accidenté et leur sous- bois très dense par endroits. Les espèces de maquis représentatives de la région sont: Calycotome villosa, Cistus salviaefolius, Arbutus unedo, Crataegus azarolus, C. manogyna, Daphne gnidium, Erica arborea, Cytisus triflorus, Myrtus communis et Pistacia lentiscus (Hasnaoui, 1992).

Les pullulations du bombyx disparate Les infestations de L. dispar au Nord de l’Afrique sont anciennes. Elles ont été signalées dès 1877 en Algérie (Boudy, 1950), en 1919 au Maroc (De Lépiney, 1927) et seulement en 1925 en Tunisie (Debazac, 1952). L’histoire des pullulations de L. dispar en Kroumirie a été

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reconstituée à partir des archives des arrondissements des forêts de Aïn Draham et de Jendouba et des observations réalisées ces dernières années. Les données disponibles sont présentées dans le tableau 2. Elles mettent en évidence 4 gradations principales depuis 1920. Chaque pullulation dure plusieurs années puis régresse sans que l’insecte disparaisse complètement : l’infestation reprend à nouveau 10 à 15 ans après. La dynamique des populations du ravageur est complexe et montre des variations brutales pour des raisons qui demeurent encore de nos jours mal expliquées (Villemant & Fraval, 1999). La dernière gradation du bombyx disparate en Tunisie a commencé en 1986 et s’est terminée en 1998, avec un pic d’infestation en 1992, année au cours de laquelle 22 000 ha de forêt ont été complètement défoliés.

Tableau 1: Distribution et superficie (ha) des peuplements de chênes selon les gouvernorats (I.F.N., 1995).

Gouvernorat Chêne-liège Chêne zen Autres chênes Jendouba 35 608 6 151 547 Béja 7 658 263 491 Bizerte 2 190 0 0 Total 45 456 6 414 1 057 52 909

Tableau 2: Surfaces défoliées enregistrées en Kroumirie au cours des gradations de L. dispar

Gradation de Gradation de Gradation de Gradation de 1920-1935 1945-1955 1966-1977 1986-1998 1926: 3 030 ha 1950: 3 600 ha 1966: 500 ha 1986: 1 014 ha 1927: 4 000 ha 1952: 3 600 ha 1967: 6 000 ha 1987: 3 735 ha 1928: 3 500 ha 1956: 3 300 ha 1968: 7 000 ha 1988: 4 500 ha 1929: 23 000 ha 1969: 8 300 ha 1989: 7 843 ha 1930: 26 000 ha 1990: 1 070 ha 1991: 15 435 ha 1992: 22 032 ha 1993: 12 287 ha 1994: 8 555 ha 1995: 5 843 ha

D’après Villemant & Fraval (1999), les gradations en Kroumirie (Nord-ouest de la Tunisie) débutent tous les 20-25 ans et durent environ 10 ans. Si l’on se base sur les données des quatre dernières gradations présentées dans le tableau 2, la périodicité des gradations semble être d’environ 20 ans, Si l’on se réfère à la 4ème et dernière pullulation qui a débuté en 1986 et s’est terminée en 1999, on constate qu’elle a duré 14 ans avec une phase de progradation de 5 ans, une phase de culmination de trois ans, avec un pic en 1992, et une phase de rétrogradation de cinq ans. L’actuelle phase de latence devrait a priori se prolonger pendant environ 6-7 ans. Plusieurs auteurs s’accordent pour dire que le démarrage des infestations se fait toujours à partir de foyers privilégiés situés dans des zones particulières d’un massif forestier donné (Rabasse & Babault, 1975 ; Fraval, 1989). En Koumirie, la région d’Aïn-Draham-Babouche a été le point de départ des pullulations de 1945, 1966 et de la dernière pullulation de 1986. L’expansion géographique de l’insecte est due à la dispersion primaire des chenilles néonates

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qui sont entraînées par le vent vers d’autres massifs forestiers ou vers des points éloignés du même massif. La dispersion secondaire des chenilles vers d’autres arbres après la défoliation des premiers est à l’origine du déplacement progressif de l’infestation au sein d’un massif (Fraval, 1989).

Aire de répartition et arbres-hôtes Lymantria dispar est vraisemblablement originaire du Japon et de la Corée (Fraval, 1989). L’espèce se rencontre en Chine, en Afghanistan, en Iran, en Europe, dans les îles de la Méditerranée et en Afrique du Nord (Maroc, Algérie, Tunisie). En Tunisie, l’insecte est présent dans toutes les forêts de chêne-liège à l’exception de celle de Sejnane (Bizerte) probablement parce que ce dernier massif est nettement séparé du reste de la subéraie tunisienne. La polyphagie de L. dispar est très grande. En Afrique du Nord, sa principale plante-hôte est le chêne-liège, Quercus suber (Hérard, 1984). En cas de surpopulation, les chenilles peuvent s’attaquer à de nombreuses autres plantes forestières. Dans la forêt de Aïn-Draham, leurs dégâts ont été observés sur chêne zen (Quercus canariensis), sur des espèces du maquis (Halium halimifolium, Rubis ulmifolius, Erica scoparia, Arbetus unedo, Pteridium aquilinum, Pistacia lentiscus), des arbres fruitiers (cerisier) et même sur les pins (Pinus pinea et Pinus pinaster) et les Eucalyptus.

Méthodes de lutte Les méthodes de lutte contre ce ravageur sont très diversifiées ; les premières ont été utilisées bien avant le développement des insecticides modernes. La lutte mécanique consiste à détruire les pontes par grattage ou par badigeonnage à l’aide d’un mélange de goudron et de pétrole et à ramasser et détruire les chrysalides. Cette méthode a été appliquée de 1928 jusqu’à la fin des années 40. On l’a mise en oeuvre à nouveau en 1993 et 1994 mais elle est peu efficace, onéreuse et difficile à réaliser ; seule une infime proportion de pontes peut être détruite de cette façon en période de pullulation. La lutte chimique a été considérablement encouragée après la deuxième guerre mondiale, avec l’apparition du DDT. En Tunisie, ce type de lutte contre L. dispar a commencé en 1950 par des poudrage au toxane à 9% de HCH. On a utilisé ensuite un générateur de brouillard « TIFA » qui répandait une émulsion contenant 9% de DDT en mélange avec du gasoil. Un traitement par voie aérienne eu lieu pour la première fois en 1969 sur 1000 ha de subéraie. Le DDT a été interdit en 1972 à cause de sa très longue rémanence. La lutte biologique a été mise en œuvre contre L. dispar en Tunisie par l’introduction en 1947 du parasitoïde oophage Ooencyrtus kuvanae Howard par Guy Lacourly, inspecteur des Eaux et Forêts. Cet Hyménoptère Encyrtidae originaire du Japon s’est acclimaté sans difficulté. Il peut détruire jusqu’à 66% des œufs (Rabasse & Babault, 1975) mais demeure malgré tout incapable de réguler les pullulations du ravageur (Fraval, 1989). La lutte micro-biologique implique l’utilisation de micro-organismes, tels que virus, bactéries ou champignons. L’application de bioinsecticides à base de Bacillus thuringiensis a commencé en Tunisie en 1969, d’abord par voie terrestre puis par voie aérienne. En 1997, l’épandage par avion d’un produit à base de B. thuringiensis (liquide flow) a été réalisé sur 30 ha de forêt (Ben Jamâa, 1997). L’utilisation de moyens terrestres est rendue très difficile en Tunisie par la présence d’un maquis dense et d’un relief accidenté mais aussi par la surface très importante des peuplements à traiter (quelques milliers d’hectares). C’est pourquoi, il est souhaitable, comme cela s’est fait dans d’autres pays comme le Maroc, de traiter les foyers en période de progradation avant que les populations du ravageur prennent de l’ampleur. Dans

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certains cas, il est préférable de s’abstenir de traiter car les facteurs de régulation naturelle (parasites, prédateurs, virus) suffisent à eux seuls à enrayer la pullulation (Villemant & Legay, 1995). Le suivi de la dynamique de population de L. dispar s’avère donc un préalable indispensable à la mise en œuvre d’une lutte raisonnée.

Matériel et méthodes

Détermination des différentes écophases de bombyx disparate Des observations biologiques sur les différentes écophases ont été effectuées chaque semaine en 1994 dans deux stations de chêne-liège: Souiniet et Aïn-Debba.

Dénombrement des pontes de bombyx disparate Le dénombrement et l’étude de la répartition des pontes sur les arbres ont été effectués à vue depuis sol. Le critère de choix des stations n’a pas toujours été le même. En 1994 et 1996, le dénombrement a été fait dans la perspective de traitements terrestre et aérien. Les stations devaient être accessibles par la route pour le traitement terrestre (Aïn-Debba) et constituer des zones dégagées et peu accidentées pour le traitement aérien (Aïn-Boulehhia). En 1999, les pontes étant très rares, de nouvelles stations ont été prospectées. Le choix s’est porté, après analyse des données bibliographiques, sur des sites considérés comme des foyers primaires de gradation du ravageur. Dans les cinq stations sélectionnées en 1999, les arbres ont été marqués selon un dispositif en croix de 40 arbres. Les quatre axes, orientés selon les 4 points cardinaux comprennent chacun 10 arbres successifs (Fraval, 1989). Pour chaque station, on a noté la densité des arbres, les caractéristiques du sous-bois et le nombre de pontes présentes sur les 40 arbres du dispositif. Un échantillonnage aléatoire de 30 pontes accessibles a été réalisé en février 1999 dans chaque station pour déterminer l’effectif moyen d’œufs viables par ponte. Au laboratoire, les œufs débarrassés de leur feutrage de poils ont été triés sous la loupe binoculaire en différentes catégories: œufs stériles, œufs desséchés, œufs parasités et œufs viables (Fraval, 1989). Une estimation du nombre moyen par hectare de chenilles prêtes à éclore a été calculée à partir des valeurs moyennes du nombre d’œufs viables par ponte, du nombre de pontes par arbre et du nombre d’arbres par hectare. Les pontes analysées au laboratoire ont été stockées dans des boites en plastique et placées sous abri jusqu’à l’éclosion des œufs. Le comptage des chenilles néonates a permis de corriger éventuellement l’estimation du nombre d’œufs viables par hectares calculée avant les éclosions.

Résultats et discussion

Cycle biologique Le cycle biologique du L. dispar en Tunisie est très semblable à celui décrit au Maroc par Fraval (1989). L. dispar est une espèce monovoltine (une génération par an). La ponte a lieu en juin-juillet, le développement embryonnaire dure environ 15 jours, puis les œufs entrent en diapause estivo-hivernale jusqu’au printemps suivant. L’éclosion a lieu en avril (au moment du débourrement du chêne). Le développement larvaire dure 1 à 2 mois. Les chenilles passent par 5 (mâles) ou 6 (femelles) stades larvaires. La nymphose dure 2 à 3 semaines et les papillons émergent à partir de la mi-juin. Les femelles ne volent pas. Le vol des mâles ne dure que quelques jours au cours desquels ont lieu l’accouplement et la ponte. D’après Semlali

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(1986), la durée de vie des adultes est de l’ordre de 4 à 9 jours. La femelle dépose ses œufs par paquets de plusieurs centaines en ooplaques de quelques centimètres de diamètre, qu’elle recouvre avec les poils de son abdomen. Les pontes sont placées sur le tronc et la partie inférieure des branches mais aussi en cas de surpopulation, sous les pierres, dans les fentes de rochers, sur les murs et sur divers arbustes du maquis (arbousier, bruyère, ...). Sur l’arbre, la majorité des pontes est déposée sur les troncs lorsque la densité des populations de l’insecte est faible, comme c’est le cas en 1999 et 2000. Cependant, lors des phases de pullulation, le nombre de pontes augmente sur les branches et les rameaux de la frondaison des chênes-lièges et on peut observer alors une inversion totale de leur répartition sur l’arbre (78 % sur les branches contre 22 % sur les troncs à Souiniet en 1994). La surface offerte par le tronc étant limitée, les femelles en surpopulation se déplacent plus activement et gagnent la face inférieure des branches pour pondre (tab. 3). En Tunisie sur l’ensemble des sites étudiés, la période d’éclosion s’étend sur environ un mois. En 1994, les éclosions ont débuté précocement à Aïn-Debba (19/04/94) et plus tardivement à Souiniet (01/05/94). Cette année-là, les nymphoses ont eu lieu durant les trois premières semaines de juin à Aîn-Debba et de la fin juin à la mi-juillet à Souiniet.

Tableau 3: Effectifs moyens et répartition des pontes par arbre selon l’année et la station.

Répartition des pontes sur l’arbre (%) Année Station Nombre moyen de Tronc Branches Frondaison pontes par arbre principales Aïn Debba 203 ± 173 22 39 39 1994 Souiniet 125 ± 131 23 25 53 Aïn Boulehia 77 ± 34 - - - Aïn Debba 67 ± 27 - - - 1996 Ouled Hélal 213 ± 116 - - - Souk Essebt 3 ± 3 75 25 El Gonna 6 ± 12 92 8 El Bradaa 7 ± 8 79 21 Dar Echfa 2 ± 6 45 55 1999 Rihana (AD) 1 ± 2 56 44 Souk Essebt 1 ± 2 70 30 El Gonna 1 ± 3 85 15 El Bradaa 3 ± 5 55 45 2000 Dar Echfa 3 ± 2 35 65 Rihana (AD) 0,2 ± 1 100 0

Densité des populations de L. dispar Entre 1994 et 1999, on observe une nette diminution de l’effectif moyen de pontes par arbre (tab. 3) comme du nombre moyen d’oeufs par ponte (tab. 4). En 1999, la proportion d’œufs viables dans les pontes est extrêmement faible et le nombre estimé de chenilles écloses par hectare est de quelques milliers alors qu’il dépassait la centaine de milles en 1994. Pour la première fois depuis le déclenchement de la dernière gradation, aucune défoliation n’a été

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observée dans la subéraie tunisienne en 1999, ce qui confirme l’achèvement de la dernière gradation et l’entrée en latence des populations de L. dispar.

Tableau 4 : Effectifs moyens d’oeufs par ponte et estimation du nombre moyens de chenilles écloses par hectare selon l’année et la station Année Station Moyenne Œufs viables (%) Effectifs des chenilles oeufs/Ponte écloses par hectare 1994 Aïn Debba 583 ± 181 64 ± 22 290559 Souiniet 284 ± 116 40 ± 27 105594 1996 Aïn Boulehia 370 ± 123 50 ± 27 190862 Aïn Debba 122 ± 100 33 ± 46 30952 Ouled Hélal 207 ± 65 30 ± 18 40991 Souk Essebt 35 ± 27 5 ± 6 6050 1999 El Gonna 69 ± 56 1 ± 2 3229 El Bradaa 84 ± 64 2 ± 2 8797 Dar Echfa 42 ± 25 1 ± 2 1584 Rihana (AD) 30 ± 24 3 ± 3 698

En 2000, le nombre de pontes présent sur les arbres est devenu extrêmement faible. L’échantillonnage n’étant plus représentatif, nous n’avons pas effectué d’analyse des pontes. Aucune défoliation n’a été signalée.

Conclusion et perspectives de recherche

L’étude de l’historique des pullulations de L. dispar en Tunisie montre que ses populations présentent un régime cyclique dont la période est sensiblement égale à 20 ans avec - une phase de gradation générale d’environ 13 ans durant laquelle les défoliations sont plus ou moins importantes et une phase de latence générale durant laquelle aucune défoliation n’a lieu et où la population du bombyx disparate est à son niveau le plus bas. La présence du ravageur ne se manifeste que localement au niveau de foyers potentiels d’infestation. Cette phase de latence dure environ 6 à 7 ans. La génération de L. dispar de l’année 1999 correspond vraisemblablement à la fin de la phase de rétrogradation comme le suggèrent l’absence totale de défoliation et le taux très élevé d’œufs non viables contenus dans des pontes de taille relativement réduite. Au cours la nouvelle phase de latence qui vient de s’installer, il serait très intéressant de faire l’inventaire de la guilde des ennemis naturels de L. dispar et de déterminer en quoi ils interviennent dans le maintien des populations du ravageur à un faible niveau de densité. En effet, alors qu’une masse énorme de données a été recueillie à travers le monde sur les ennemis naturels du bombyx disparate en période de pullulation, peu d’études ont été entreprises au contraire durant la phase de latence de ses populations. On a montré en Autriche au moyen d’une exposition artificielle d’hôtes qu’il existait de grandes différences dans la composition spécifique du complexe parasitaire de L. dispar en faible et haute densité de population. Les taux de parasitisme étaient faibles en phase de pullulation et forts sur les populations de chenilles artificiellement augmentées dans les sites de latence. Dans ces sites, l’action des ennemis naturels a toujours entraîné l’éradication des populations de chenilles introduites avant leur nymphose (Hoch et al., 1999).

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Dans le contexte de la subéraie tunisienne , on envisage d’exposer en pleine forêt et selon un protocole précis, des pontes fraîches, des chenilles stérilisées de différents stades placées sur de jeunes chênes en pots et des chrysalides, toutes issues d’élevage. La localisation de tous les foyers primaires d’infestation et leur surveillance nous permettront de suivre la dynamique des populations du ravageur et tenter de mieux comprendre ainsi le déterminisme de ses infestations de façon à intervenir efficacement au bon moment pour limiter ses dégâts.

Références

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The gypsy moth (Lymantria dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) in Tunisia : present knowledge and research outlook.

Mohamed Lahbib Ben Jamâa, Sofiane M’nara, Claire Villemant, Abdelhamid Khaldi

Abstract : In Tunisian cork-oak stands, L. dispar induces partial or complete defoliation which can extend some years to several thousands hectares. Only few studies however, concern gypsy moth in Tunisia. This paper is an overview of the actual knowledge about the pest in this country. Gradations follow each other about every 20 years. The general gradation phase, during which defoliation takes place, lasts about 13 years while the latency phase lasts 6 to 7 years. During latency the pest population is at its lowest density level : no defoliation occurs and the pest is only observed in primary infestation sites. In 1999, total absence of defoliation, scarcity and smallness of egg masses as well as their high number of unhealthy eggs suggest that the pest was at the end of its retrogradation phase and had entered into latency. In 1999-2000, aiming at studying and forcasting the population dynamics of the pest and its natural enemies during the latency, we selected 7 study plots considered, according to the bibliography, as potential primary infestation sites.

Key words : Lymantria dispar, biology, population dynamic, Quercus suber, Tunisia.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 109-114

Damage evolution and control of Lymantria dispar L. in a cork oak forest of southern Portugal

Miguel Serrão Ministry of Agriculture, Pç. Comércio, 1149-010 Lisboa, Portugal, [email protected]

Abstract : The distribution of cork oak forest in Portugal is mainly situated in the southern part of the country, where Quercus suber finds the most adequate climatic conditions for its development. Ranging from the Tagus river valley to the plains of Alentejo, cork oak finds its sanctuary in the region of Ponte de Sôr, where we can find the best cork quality production is found. In the beginning of the 20th century, following the devastating damage caused by phylloxera on vast vineyard areas in the sandy soils south of the Tagus river, the largest existing contiguous plantation of cork oak was planted. The place called Rio Frio represents nowadays more than 3,000 ha of eighty years old trees, managed for cork and livestock production. In this area, the occurrence of moderate attacks of gypsy moth (Lymantria dispar L.) is not uncommon. These infestations are usually regulated by the natural enemies complex of the moth. The influence of L. dispar on cork oak is well known, particularly in the case of total defoliation which induce a reduction in fruit production, of cork growth and quality, and more important increases the difficulty of cork extraction. Cork oak stands in Rio Frio are managed so that cork harvest is done almost every year in different trees dispersed in the stand, creating a patchy pattern of mixed aged cork trees. Livestock also represents a very important part of this system. The control of severe defoliation by insects is considered very important for the economy of these forest areas. The present work is a case study of L. dispar damage monitoring and control methods implementation of an outbreak cycle promoted by abnormal weather conditions. The spread and intensity of damage was analysed over a series of three consecutive years, where different control methods were used. Availability, timing and efficacy of the different methods are discussed.

Keys words : Lymantria dispar, field survey, biological control, cork oak, Portugal

Introduction

Cork oak is a tree species well adapted to Portuguese soil and climatic conditions. Although present in all of the territory, with 713,000 ha of forest, the great majority of its formations are located in the South of Portugal (DGF, 2001). Very important contiguous areas of cork oak are located in the southern part of the Tagus river valley. This region, close to Lisbon, has sandy soils from the Pliocene period and a typical Mediterranean climate. The forest is mainly the result of natural regeneration in Samora Correia (Companhia das Lezírias) and Palma region, and plantation in Rio Frio, which is the largest contiguous area of planted cork oak (Natividade,1950). Rio Frio has about 3,000 ha of cork oak forest which was planted in the beginning of the 20th century (Natividade, 1950).This area was part of a 12,000 ha private estate mostly dedicated to wine production. Due to devastating phylloxera attacks, the decision was made to replace the vineyards. Rio Frio stand is nowadays divided into smaller parcels and belongs to different forest owners. Rio Frio is located in a region between the two largest cities of Portugal, with a population of circa 1 million people, and is crossed daily by hundreds of thousand of vehicles. It suffers from high anthropic pressure, in particular housing, and also by the proximity of an important power plant and the major Portuguese pulp mill.

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Traditionally the economy of cork oak stands in Portugal is based on cork itself but also on other complementary productions. This particular system is called montado and represents a low density forest, which allows varied productions in a mixed system such as livestock or cereals and other types of agriculture. Firewood, mushrooms and honey are different other products that are also part of montado agro-system. Production of beef for meat is a very important component of the annual farmer income, also wild and semi wild pork as well as wild bulls for bullfights. Damage caused by insects in cork oak stands in general does not only affect oak vigour and therefore cork production but also all of its economically dependent activities. The complex of insects that feed on cork oak is vast, but only some acquire pest status. Among them is gypsy moth, Lymantria dispar L. (Lepidoptera, Lymantriidae) that periodically causes severe defoliation in the Rio Frio cork oak stand since the middle of last century (Neves, 1950; Natividade, 1950). Other pests with some impact in this region are the defoliators Tortrix viridana and Periclista andrei, which does not occur with Euproctis chrysorrhoea or woodborer. Presence of some decline pathogens like Hypoxylon mediterraneum and Endothiella gyrosa are also of some importance like in the past (Natividade, 1950). In 1997 some landowners noticed a heavy defoliation caused by gypsy moth, and they established contact with the local forest association in order to address the problem and implement a control program. Due to the extent of damage, the control program design was based in the first year, on a pheromone trapping network to attempt to disrupt sexual attraction and monitor adults activity. A aerial spraying with biological insecticide was performed in the following year. The insecticide proved inefficient and a second spraying was needed, in the following year. The control strategy and program and the decisions taken are presented and discussed in detail as well as the results achieved. Conclusions were drawn to help design and implement future operational control programs for gypsy moth in the Portuguese context.

Material and methods

Control strategy After forest owners gave the alarm, a control strategy was proposed to address the problem and respond in the quickest and most efficient way. A preliminary fieldwork approach to evaluate the insect stage of development and the extent of damage was performed. The control program was then designed : - Field survey - Survey results analysis - Control method selection - Control method implementation - Follow up procedures - Control method result analysis

Taking into account the results of the preliminary work which showed us that all individuals reached at least the 5th larval instar, with a large part of them already at the pupal instar, the program was designed to last for two years. Operations concerning the control and monitoring of adult population were foreseen for the first year (1997), while in the second year action will be based on the aerial spraying with Bacillus thuringiensis based insecticides. Due to the inefficiency of the 1998 treatment, another one was performed in 1999 using diflubenzuron.

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Field survey Survey was performed in transects through the defoliated area and along its limits. Sampling plots for natural enemies impact evaluation were located randomly through the stand. Impact of predators and parasitoids was determined on the basis of an abundance, presence or absence classification scale. Not too much attention was paid to predator and parasitoid identification due to its relative non relevance in the selected control strategy and the need to act in the shortest possible time . During the subsequent years of implementation of the control program, survey was perform in a similar way, focused more on the delimitation of damage area than on the impact of natural enemies, although evaluation of their presence was also undertaken.

Control methods selection and implementation As stated previously, the developmental stage reached by gypsy moth in the field in May 1997 dissuaded the use of insecticides. The probability of failure was very high because insecticides are ineffective on pupae and adults of gypsy moth (Cabral & Ferreira, 1999; Prota et al, 1992; Ferreira & Ferreira, 1991; MAPA, 1981). In this situation the most adequate method to be used is the disruption of sexual attraction by the females with pheromone (Disparlure) baited delta traps. The strategy behind trapping was to stop the eastern limit expansion and simultaneously monitor gypsy moth population in order to determine its dimension. In 260 hectares in the eastern limit of the defoliated area, 49 traps were installed and surveyed every two to four weeks during one and a half month. Geostatistical analysis tools were used to perform spatial inference data analysis. Krigging method was selected because is a best linear unbiased estimator (Isaaks & Srivastava,1989) which minimizes modelled error variance (Soares, 2000). It allow us to make estimation of gypsy moth males distribution in the area, on the basis of the similarity and geographical relation between trap captures, and therefore study evolution of the attack. Maps were made with the estimated number of active males. In 1998 aerial spraying was selected to be used as control method, because at the beginning of the trial larvae were in the first larval instar. The treatment was done with an oil suspension of B. thuringiensis var. kurstaki (Foray 48B, Novo Nordisk A/S) using an airplane with 4 micronair spayers. 700 hectares were treated with 1,5 litre per hectare. In 1999, when larvae were at early stages of development, B. thuringiensis insecticides were unavailable at its correct formulation. Thus we used a diflubenzuron based insecticide (Dimilin 25 WP, Agroquisa) which was sprayed by means of an airplane with common spraying bars each having 8 nozzles. The concentration used per hectare was 280 grams in 20 litres, and more than 1100 hectares were treated.

Results

Defoliated areas and natural enemies impact The total area with severe defoliation was found to be 1,100 ha in 1997 and estimated to 210 ha for the previous year. The initial infested area was estimated to be located in the western part of the 1997 damaged area. Natural enemies were present in all the area, but were unable to control L. dispar population. Predators like Calasoma sycophanta L. (Coleoptera, Carabidae) and other larval ones were abundant, as well as cocoons of the braconids Apanteles spp. and other parasitoids. 1998 survey determined an area of 1,700 hectares of defoliation and a minor incidence of enemies. It appeared necessary to extent the program to 1999 and the survey delimited 2,100

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hectares with defoliation reaching Pinus pinaster and Pinus pinea trees that were in the vicinity of the cork oak stand.

Control methods result analysis The results of trapping are presented in table 1. They showed a slight decline in the mean number of males captured during the three periods of capture. The mean number of captures does not vary significantly between periods but its variation decreases slightly with time. Follow up of traps in the field ascertained their frequent felling due to wind action and the deposition of dust and sand on the sticky cards, both reducing traps efficacy. When geostatistical analysis is performed on the number of L. dispar males captured at each period a trend is perceived along the direction of expansion (fig. 1). A displacement of male emergences in this direction can explain this phenomena. It leads us to the hypothesis that larvae anticipates the pupal instar in the complete defoliated area, due to food shortage, and thus the ones who are able to reach the limits of the defoliated area complete their development later.

Table 1. Gypsy moth male captures per period (SE= standard error of estimate)

Period Total of captures Capture average ± SE 1st - June 3rd 799 18.58 ± 2.83 2nd - June 17th 737 16.02 ± 2.36 3rd - July 14th 587 11.74 ± 1.66

Figure 1. Estimation maps for gypsy moth distribution using geostatisticis (Krigging method)

The 1998 field survey enable us to determine the effective result of the 1997 trapping campaign. It proved inefficient to control the populations of gypsy moth, although it managed to slow the eastern dispersal of the pest. In 1998, aerial spraying of B. thuringiensis based insecticides, suffered from various problems that began with an unavoidable delay in the delivery of the agrochemical and the resulting undesirable development of larvae. Two days after spraying, the region experienced a sudden and unpredictable heavy rainfall, abnormal for the season. These factors

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significantly reduced the success of the control method, and follow up procedures clearly showed that only 15 to 25 % of the larvae were affected by the treatment and the remaining individuals completed their development. This results necessitated a second spraying action in 1999, as described above, this time with a different insecticide due to the market unavailability of the correct formulation at the moment. Diflubenzuron based insecticide was used. This time larvae mortality reached more than 85 %. Weather conditions were appropriate and gypsy moth larvae were at the accurate developmental stages.

Conclusions

Pheromone based traps have a significant price and a relatively low efficacy when used to control gypsy moth. Delta traps are not the most adequate type of trap since they quickly saturate and have a reduced sticky area for captures. Nevertheless, other types of traps with more capture capacity and less exposure to sand and dust can be used, since they are still an available control method to use during adult insect phase. When analysing trapping results, some inferences can be drawn concerning the possibility of using aerial spraying at the limits of the gypsy moth dispersal area, since in this sites larvae completed their development and pupated later than the rest of the population. Aerial spraying using the doses recommended by the producer cannot be sufficient to achieve control of gypsy moth populations, but the unpredictable rainfall and the delay that allowed insects to develop further seems to be the main reasons for the failure of the 1998 treatment. An important factor that contributed to the problems faced during the implementation of the control program was the lack of involvement of the owners of all the areas affected by defoliation. Re-infestation was a major factor of failure and it delayed the complete control achieved in 1999. With regard to the unavailability of adequate formulations for forest applications of Bt based insecticides, a major constraint to use this type of control method will prevail as long as producers maintain their actual commercial policy. While the situation remains under these conditions, forest producers confronted by gypsy moth infestations should shift to diflubenzuron based insecticides that are more aggressive to the natural enemies complex but really effective in controlling the larval populations of the defoliator.

Acknowledgements

This work was financed by AFLOPS - Associação de Produtores Florestais de Setúbal.

References

Cabral, M.T. & Ferreira M.C. 1999: Pragas dos Montados. Estação Florestal Nacional, Lisboa, 94 p. DGF 2001: Inventário Florestal nacional, (3ª revisão) 1995-1998. Direcção Geral das Florestas, Lisboa, 233 p. Ferreira, M.C. & Ferreira, G.W.S. 1991: Pragas das Folhosas - Guia de Campo. Ministério da Agricultura, Pesca e Alimentação. Lisboa, 191 p.

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Isaaks, E.H. & Srivastava, R.M. 1989 : An introduction to applied geostatistics. Oxford University Press, New York, 278-322. MAPA, 1981. Plagas de insectos en las masas forestales españolas. Ministério de Agricultura, Pescas y Alimentacion, Madrid, 252 p. Natividade, J.V. 1950 : Subericultura (2ª edição). Imprensa Nacional Casa da Moeda, Lisboa, 387 p. Neves, C. M. B. 1950 : Introdução à entomologia florestal portuguesa. Livraria Sá da Costa, Lisboa, 225 p. Prota, R., Luciano, P. & Floris, I. 1992 : La protezione delle forete dai lepidotteri defogliatori. La Celere Editrice, Alghero, 91 p. Sampaio, J. S., 1977. À la recherche d' une politique économique pour le liège au Portugal. École Pratique des Hautes Études, Lisboa, 29-67. Soares, A. 2000 : Geostatística para as Ciências da Terra e do Ambiente. IST Press, Lisboa, 23-96.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 115-122

Utilisation de Bacillus thuringiensis kurstaki 3a-3b dans la lutte contre le bombyx disparate et problèmes posés par les migrations de chenilles

Jean-Claude Martin 1, Claire Villemant 2, René Mazet 1 1 INRA, Unité expérimentale Forestière Méditerranéenne, Avenue Vivaldi, F-84000 Avignon, France 2 MNHN, ESA 8043 CNRS, Laboratoire d’Entomologie, 45 rue Buffon, F-75005 Paris, France

Résumé : Un essai de lutte biologique contre le bombyx disparate avec un nouvel insecticide à base de Bacillus thuringiensis kurstaki (BtK), le Foray 96B a été réalisé au printemps 2001 sur 5 hectares de chênaie en Corse du Sud. La chênaie environnante non traitée a servi de témoin. L’efficacité du traitement a été évaluée à l’aide d’indices de défoliation et de mesures coprométriques. Le traitement a été fait avec un avion Pawnee Piper équipé de buses micronair AU 5000. Il a provoqué un arrêt brusque de l'alimentation et une forte mortalité des chenilles. La zone témoin a été totalement défoliée puis les chenilles, affamées, sont parties en migration à la recherche de nourriture. Malgré son efficacité estimée à 86.67%, le traitement au Btk n’a pas empêché la réinfestation progressive de la parcelle traitée trois semaines après le traitement, ce qui a conduit à sa défoliation totale. La nouvelle stratégie de lutte intégrée proposée ici combine l'action des insecticides à base de BtK, dont la persistance est inférieure à 12 jours, à celle des insecticides à base de diflubenzuron, qui persistent environ 3 semaines : la protection des parcelles contre toute réintroduction de chenilles en migration pourrait être assurée en traitant au diflubenzuron une ceinture entourant les parcelles traitées aux BtK. Cette stratégie est adaptée à la protection des massifs forestiers fragmentés, des zones forestières périurbaines et des petites surfaces au sein de grands massifs infestés par le ravageur.

Mots-clés : lutte biologique, Lymantria dispar, Bacillus thuringiensis, diflubenzuron, défoliation, fragmentation, forêt périurbaine

Introduction

Depuis une trentaine d’années, la lutte biologique à l’aide du Bacillus thuringiensis var. kurstaki (BtK) est activement mise en œuvre pour limiter l’extension du bombyx disparate partout où ses chenilles provoquent de façon chronique la défoliation de vastes surfaces forestières. Dans les forêts de chêne-liège (Quercus suber L.) de Sardaigne et du Maroc, où les surfaces défoliées atteignent parfois plusieurs milliers d’hectares, des traitement au BtK sont régulièrement entrepris depuis les années 90 (Lentini & Luciano, 1995 ; Ramzi, 1999). De telles interventions ne sont cependant pas toujours nécessaires ni même souhaitables. Dans de nombreux cas en effet, les ennemis naturels jouent un rôle important et l’infestation s’achève sans qu’aucun traitement n’ait été effectué (Grison, 1955 ; Krehan, 1994 ; Villemant & Legay, 1995). Dans beaucoup de pays d’Europe, de tels traitements ne sont envisagés que pour protéger les peuplements les plus sensibles (plantations, semis) ou les forêts périurbaines pour éviter au public les nuisances consécutives à la divagation de hordes de chenilles (Villemant & Fraval, 1999). C’est dans cet esprit qu’a été testé une nouvelle formulation à base de BtK, le Foray 96B, dans une forêt de chêne vert (Quercus ilex L.) du Sud de la Corse. En Corse, les gradations du bombyx disparate se sont succédées tous les 10 ans environ depuis les années 50, affectant principalement la subéraie de Porto-Vecchio mais aussi les

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chênaies de la région de Bonifacio et du Cap Corse (Martouret & Emonnot, 1974; Cervera & Ham 1976; Ham & Cervera, 1976). La dernière gradation qui a débuté en 1991 a culminé en 1994 (Hett, 1994l). L'incendie de l'Ospédale qui, en 1995 a détruit une large bande de végétation entre la montagne et la mer, a semble-t-il arrêté l'extension de l'infestation au Nord de Porto-Vecchio (Céria, com. pers.). La période de latence qui a suivi cette dernière infestation a été beaucoup plus courte que les précédentes. Dès l’hiver 2000-2001 plusieurs foyers d’infestation du bombyx disparate ont été signalés par les correspondants-observateurs du Département Santé des Forêts : de gros foyers dispersés, comptant de nombreuses pontes, dans la région de Bonifacio (Corse du Sud) et d’autres moins importants dans la région du Cap et au centre de la Haute Corse (Audibert et Tastevin, com. pers.). En Corse du Sud, tandis que des interventions curatives par épandage d’une préparation classique à base BtK (Dipel 8L) étaient effectués dans différents secteurs de forêt, des tests d’efficacité du Foray 96B ont été réalisés par J.-C. Martin et R. Mazet dans une chênaie proche de Bonifacio. Ces tests ont montré l’efficacité réelle du produit mais aussi la durée limitée de son action qui n’empêche pas une réinfestation de la parcelle traitée par des chenilles provenant des parcelles voisines entièrement défoliées. Ces constatations ont conduit à proposer une stratégie de lutte intégrée adaptée aux situations de morcellement forestier (traitement d'îlots) ainsi qu’à la protection des lisières forestières et des jardins en périphérie des zones urbanisées.

Matériel et méthode

Le Foray 96B est un insecticide à base de Bacillus thuringiensis kurstaki 3a-3b titrant environ 25 milliards d'unités biologiques internationales (UBI) par litre. Le produit a été testé à la dose (2 litres/ha) utilisée et homologuée en France pour la lutte contre la processionnaire du pin, Thaumetopoea pityocampa Denis et Schiffermüller (Martin & Mazet, 2001). Choix des parcelles expérimentales L’expérimentation en Corse du Sud a été intégrée à un traitement opérationnel au Dipel 8L mis en œuvre par la FEDELEC. Le massif forestier étant extrêmement morcelé, ces traitements ont été effectués sur un certain nombre de parcelles de chêne vert représentant une surface totale de 500 hectares. Les tests d'efficacité du Foray 96B ont été réalisés dans une chênaie privée de 10 hectares située à quelques kilomètres de Bonifacio dans une zone isolée des traitements opérationnels : 5 hectares ont été traités et 5 hectares de forêt environnante ont servi de témoin. Détermination de la date d'intervention Trois conditions sont nécessaires pour effectuer un traitement à base de BtK : toutes les pontes doivent être écloses, le chêne doit être au stade végétatif "allongement" et les chenilles en cours d'alimentation. Le suivi des éclosions des pontes à Bonifacio a montré que la courbe d’éclosion du bombyx disparate s'est étalée du 20 mars au 15 avril 2001, le taux de 95% d’éclosion étant atteint le 10 avril (fig. 1). Le développement des chenilles a été suivi chaque semaine du 19 avril au 14 juin. Les trois conditions nécessaires au traitement étaient requises dès le 26 avril mais les conditions météorologiques particulièrement ventées de la fin du mois d'avril et du début mai nous ont contraints à effectuer le traitement le 10 mai 2001. Intervention Le traitement au Foray 96B a été réalisé le 10 mai 2001 dans les mêmes conditions que les interventions curatives en forêt, c’est à dire avec un avion équipé d'un système d'épandage Ultra-Bas-Volume (inférieur à 5 litres par hectare). L'avion de type Piper Pawnee PA 25-235

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était équipé de 4 buses Micronair AU 5000. La hauteur de vol et la vitesse correspondaient aux normes habituelles en matière de traitement aérien forestier. Le jour de l'intervention, la météo était bonne et le vent très faible. Cinquante plaques de verres (cache-diapos) ont été disposées avant l'intervention en différents points de la parcelle expérimentale afin de vérifier l’homogénéité de la pulvérisation. Ces plaques ont ensuite été relevées et contrôlées.

Eclosion des chenilles

30 T°C 1% 95% T° min. 25 T° max.

5 2001 0 01.03 08.03 15.03 22.03 29.03 05.04 12.04 19.04 26.04

Figure 1. Températures maximales et minimales à Bonifacio en mars-avril 2001 et période d’éclosion des chenilles du bombyx disparate.

A cette date, et suivant le type de végétation, les chenilles du bombyx disparate étaient aux stades L2-L3 sur chêne vert et aux stades L4-L5 sur arbousier (Arbutus unedo L.). Le chêne vert étant l'espèce prépondérante dans la parcelle expérimentale, toutes les observations visuelles ont été faites sur cette essence.

Méthode d'évaluation et de diagnostic Nous avons basé la méthode d'évaluation de l'efficacité du traitement contre le bombyx disparate sur deux critères : l'indice de défoliation et la coprométrie. La défoliation a été notée toutes les semaines par un indice allant de 0 (aucun dégât) à 5 (défoliation totale) sur 20 arbres par zone. Deux notations ont été effectuées, une sur le feuillage de l'année et l’autre sur le feuillage des années antérieures. Des copromètres, constitués par des cônes plastiques permettant la réception des crottes et de tout autre détritus tombant des chênes, ont été placés sous 9 arbres répartis dans toute la zone expérimentale à raison de 6 copromètres dans la parcelle traitée (3 au centre de la parcelle à 120 m de la bordure, et 3 autres à 40 mètres de la bordure) et de 3 copromètres dans la zone témoin (2 à une vingtaine de mètres de la zone traitée et un autre à 40 mètres). Leur surface de réception très importante (4 m²) et leur volume non saturable (hauteur 2 mètres), ont permis d'espacer les relevés qui ont été faits chaque semaine. Au total , 9 relevés ont été effectués : 3 relevés pré-traitement, un relevé le jour de l'intervention et 5 post-traitement. Après chaque relevé, le contenu des copromètres a été séché à l’étuve (afin que les pesées soient faites au même taux d'humidité) avant d’être trié. Les crottes calibrées par stade larvaire ont ensuite été pesées.

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Résultats

Le sous bois très dense de la zone témoin nous avait conduit à placer deux des copromètres non loin de la zone traitée de sorte qu’ils ont été atteints par le Btk au moment de la pulvérisation ; c’est pourquoi nous n’en avons pas tenu compte dans la suite de ce travail. Par ailleurs, pour éviter de prendre en compte l’effet de bordure, nous avons choisi de comparer les observations et mesures faites au centre de la zone témoin avec celles du centre de la zone traitée.

5 4,5 Arrivée des 4 chenilles en migration 3,5 Traitement 3 défoliation totale 2,5 2 1,5 Indice défoliation 1 0,5 0 19.04.2001 26.04.2001 03.05.2001 10.05.2001 17.05.2001 24.05.2001 31.05.2001 07.06.2001 14.06.2001

Feuilles de l'année non traitées Feuilles années antérieures non traitées Feuilles de l'année traitées BtK Feuilles années antérieures traitées BtK

Figure 2. Evolution de l’indice moyen de défoliation des arbres dans les zones témoin et traitée

Indice de défoliation La comparaison des indices de défoliation moyens des arbres de la parcelle témoin et des arbres situés au centre de la zone traitée est très significative (fig. 2). Après le traitement, la défoliation s'est aussitôt arrêtée. Nous pouvons donc conclure à un arrêt de l'alimentation des chenilles dès l'ingestion du Foray 96B. Les chenilles consomment de préférence le feuillage de l'année puis, lorsque cette nourriture commence à manquer, s’attaquent au feuillage des années antérieures. Dans la zone témoin, nous avons observé dès le 20 mai 2001 une migration des chenilles en quête de nourriture. Coprométrie L'indice de défoliation est un indicateur de l'état de la forêt ; il donne une "image" de l’état du peuplement traité mais ne permet pas d’évaluer avec précision l'efficacité d’un traitement. Dans le cas des traitements contre le bombyx disparate ou d’autres défoliateurs printaniers des chênaies, les études coprométriques sont un excellent moyen de chiffrer cette efficacité. Le tableau 1 et la figure 3 mettent en évidence une importante différence de poids entre les crottes collectées dans le copromètre de la zone témoin et à celles des trois copromètres placés au centre de la zone traitée.

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Tableau 1 : poids des crottes (en grammes) du bombyx disparate récoltées dans les copromètres en zone témoin et au centre de la zone traitée au Foray 96 B selon la date de relevé

Date des relevés 26/04/01 09/05/01 16/05/01 22/05/01 30/05/01 06/06/01 14/06/01 Zone témoin Cop. 1 4.6 56.2 139.6 175.1 1232.4 1381.4 32.7 Cop. 2 2.1 12 31.6 25.5 50 137 154.6 Zone traitée Cop. 3 1.1 9.3 23.6 24.9 66 100.3 196.7 Cop. 4 0.8 6.7 11.5 9.2 43.4 106.9 190

Tableau 2 : Poids cumulés (en grammes) des crottes récoltées dans les copromètres de la zone témoin et du centre de la zone traitée et efficacité du traitement au Foray 96B

Témoin Cop.1 Traitée Cop.2 Traitée Cop.3 Traitée Cop.4 Poids cumulés des crottes 3022 412.8 421.9 368.5 Efficacité du traitement (%) - 86.3 86.0 87.8

Efficacité du traitement L'efficacité du traitement a été évaluée en calculant par rapport au témoin le pourcentage du poids de crottes récoltées dans chacun des copromètres situés au centre de la zone traitée (tab. 2, fig. 4). L'efficacité moyenne est de 86,7%.

Défoliation totale 1600

1400

1200

1000

800 Arrivée des chenilles 600 Traitement migrantes 400

Poids des crottes (grammes) 200

r v a - -mai -mai -mai -mai -mai 6 3 0 7 4 1 4-juin 2 0 1 1 2 3 07-juin 1 Zone témoin (1 copromètre)

Zone traitée (moyenne de 3 copromètres)

Figure 3. Evolution du poids des crottes récoltées en zone témoin et au centre de la zone traitée au Foray 96B

Invasion de la parcelle traitée par les chenilles migrantes Dans la zone témoin comme dans toutes les chênaies de Corse du Sud, nous avons très vite constaté une défoliation totale, puis des migrations de chenilles vers les réservoirs de nourriture que constituaient les différentes parcelles traitées (beaucoup trop petites et

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morcelées). A partir du 22 mai, nous avons observé dans notre parcelle expérimentale traitée au Foray 96B l’arrivée de chenilles migrantes qui envahissaient les arbres situés à 40 mètres de la bordure. Le cheminement des chenilles du bombyx disparate dans la parcelle a été suivi semaine après semaine. Au 14 juin (35 jours après le traitement), les chenilles migrantes étaient arrivées au centre de la parcelle (120 mètres de la bordure).

3500 Date des relevés 3000 14/06/01 2500 06/06/01 2000 30/05/01 22/05/01 1500 16/05/01 09/05/01 1000 26/04/01

Poids des crottes (grammes) 500

0 1234

Figure 4. Comparaison des poids cumulés des crottes du bombyx disparate récoltées dans les copromètres en zone témoin (1) et au centre de la zone traitée au Foray 96B (2, 3, 4)

Discussion

Le Foray 96B utilisé à 2 litres par hectare est un excellent insecticide microbiologique à base de Bacillus thuringiensis qui permet de lutter efficacement contre les chenilles de bombyx disparate. Malgré la très forte infestation du ravageur en 2001, les expérimentations effectuées au cours du printemps ont montré une efficacité de l'ordre de 86 à 87% et ont conduit à une brusque interruption de l'alimentation des chenilles. Comme pour la processionnaire du pin, le Foray 96B constitue désormais un élément important à prendre en compte dans les stratégies de lutte contre le bombyx disparate. Néanmoins, malgré ces résultats très satisfaisants, nous avons constaté la rapide réinfestation des zones traitées par les chenilles migrantes issues des zones non traitées. Ce problème a été observé dans l'ensemble des zones concernées par les traitements opérationnels contre ce ravageur au cours du printemps 2001 en Corse du sud. Deux éléments sont à prendre en compte pour expliquer cette situation : la persistance d'action des insecticides et la taille des parcelles traitées. La persistance des insecticides à base de BtK est de 8 à 12 jours (Demolin & Martin, 1998) ; elle est du même ordre pour le Foray 96B puisque les chenilles migrantes arrivées dans la parcelle traitée 14 jours après le traitement n’ont pas été affectées par la bactérie (fig. 5). La taille réduite des parcelles et le

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fait qu'elles soient enclavées dans de vastes surfaces infestées par le bombyx disparate ont aussi favorisé leur réinfestation par les chenilles affamées venant des parcelles voisines non traitées et entièrement défoliées. Ces constations nous conduisent à proposer une stratégie de lutte intégrée adaptée aux massifs forestiers morcelés et au traitement d'îlots. La méthode s'appuie sur l'utilisation de deux types d'insecticides : ceux à base de BtK sur les parcelles cibles et un insecticide chimique à base de diflubenzuron (le Dimilin SC48) en ceinture de protection. Cette ceinture de protection de l'ordre de 60 mètres de large (3 andins en traitement aériens) doit constituer une barrière empêchant la progression des chenilles vers les zones traitées par BtK.

4,5

4 a

3,5 b 3

2,5 c 2

Indice défoliation 1,5

0,5

0 19/04/01 26/04/01 03/05/01 10/05/01 17/05/01 24/05/01 31/05/01 07/06/01 14/06/01

Feuilles de l'année non traitées Feuilles années ant.non traitées Feuilles de l'année traitées BtK Feuilles années ant. traitées BtK Feuilles de l'année traitées BtK Feuilles années ant. traitées BtK

Figure 5. Evolution des indices moyens de défoliation des arbres de la parcelle témoin (a) et de la parcelle traitée (b : situés à 40 m du bord, c : situés au centre de la parcelle)

Le Dimilin SC48 homologué en France à 0.1 litre par hectare est une préparation aqueuse qui présente une persistance d'action de l'ordre de trois semaines. Ce produit n'a pas d'effet direct sur l'entomofaune utile, ni sur l'environnement (Demolin, 1978). En outre, comme on a pu le constater lors de traitements au Btk (Luciano & Lentini, 1999), les mortalités de Lépidoptères que provoque l’insecticide sont probablement du même ordre que celles qu’entraîne une défoliation totale par le bombyx disparate. Un tel type de traitement mixte pourrait également être appliqué en période de pullulation du ravageur dans les zones périurbaines de façon à assurer une protection prolongée des jardins et des cultures mais aussi dans les zones forestières voisines des habitations afin de limiter au maximum les risques d’invasion de chenilles si redoutées de la population.

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Références

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Control of gypsy moth by Bacillus thuringiensis kurstaki 3a-3b and problems induced by larval migration

Abstract : A biocontrol essay with Foray 96B, a new Bacillus thuringiensis kurstaki product (BtK), was performed against gypsy moth in spring 2001 in the 5 ha of a South Corsican oak stand. The nearest oak stand was selected as the reference plot. Treatment efficacy was estimated using defoliation index and coprometric measurements. The treatment was done with a Pawnee Piper plane provided with micronair AU 5000 nozzles. It induced a rapid interruption of larval feeding and a high mortality of the pest while the reference plot was entirely defoliated by gypsy moth larvae which then migrated because of starvation. In spite of its high efficacy level (86.67%), Btk treatment did not prevent progressive re-infestation of the treated plot three weeks after treatment nor its subsequent total defoliation. The new biological control strategy we proposes combine BtK insecticide action, which persists during 12 days, with that of diflubenzuron which has a 3 weeks persistence : protection of oak stands against re-infestation of starving gypsy moth larvae could be ensured by a treatment with diflubenzuron of a belt surrounding forest plots treated with BtK. This strategy is appropriate to protect fragmented stands, suburban stands as well as small areas located inside large forests infested by gypsy moth.

Keys words : biological control, Lymantria dispar, Bacillus thuringiensis, diflubenzuron, defoliation, forest fragmentation, suburban forest

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 123-130

Effets sublétaux de Bacillus thuringiensis var. kurstaki sur le développement du Lépidoptère Lymantria dispar (L.) infecté à différents stades larvaires

Anna Cerboneschi Stazione Sperimentale del Sughero, via Limbara 9, 07029 Tempio Pausania (Sassari), Italia

Résumé : Des essais de laboratoire ont été effectués pour savoir si des doses sublétales de Bacillus thuringiensis ont des effets débilitants sur la santé des survivants de Lymantria dispar. Des larves de différents stades (du second au sixième) ont été nourries pendant 24 heures avec un milieu artificiel contenant du B. thuringiensis afin de déterminer les stades larvaires les plus sensibles. Les effets de l’infection par la bactérie sur la durée du stade infecté, le nombre et la durée des stades ultérieurs, la durée totale du développement larvaire, le poids des chrysalides et le taux d’émergence des adultes ont été évalués pour chacun des sexes. Des effets significatifs du traitement sur la durée du développement larvaire et sur le poids des chrysalides ont été mis en évidence ; ils diffèrent selon le stade larvaire traité et selon le sexe.

Mot clés : Lymantria dispar, Bacillus thuringiensis kurstaki, stades larvaires, développement

Introduction

Dans le cadre de la lutte contre les défoliateurs des forêts, on utilise de plus en plus de bioinsecticides répandus par voie aérienne et notamment ceux à base de Bacillus thuringiensis kurstaki. En Amérique du Nord et en Europe, on traite ainsi 1 à 2 millions d’hectares de forêts chaque année (Sanders, 1995). Depuis quelque temps, ces bioinsecticides sont aussi utilisés sur le terrain en Italie, même si, du fait des limites législatives actuelles, toutes les interventions ont un caractère expérimental. On a employé des composés à base de B. thuringiensis pour lutter contre Thaumetopoea pityocampa (Denis & Schiffermüller) (Brussino & Ugolini, 1995) et Hyphantria cunea Drury (Montermini, 1994) en Italie centrale et septentrionale et en Sardaigne pour protéger les subéraies des infestations de Lymantria dispar L. (Lentini & Luciano, 1995). Malgré les essais de terrain, on ne connaît pas encore bien les effets de la bactérie sur les insectes ayant survécu au traitement ni la sensibilité relative des différents stades larvaires au bioinsecticide (Frankenhuyzen et al., 1997). Les études concernant l’emploi de B. thuringiensis dans la lutte contre les défoliateurs se sont intéressées surtout à l’efficacité relative des différentes formulations et aux taux de mortalité qu’elles provoquent, tandis que l’analyse des effets secondaires du traitement sur les survivants a été dans la plupart des cas négligée. Parmi tous les travaux concernant les Lépidoptères, que ce soit dans le domaine agronomique ou forestier, peu se sont intéressés aux effets secondaires des traitements bioinsecticides (Hernandez, 1988 ; Li et al., 1995 ; Pedersen & van Frankenhuyzen, 1996). Les quelques études réalisées aboutissent en outre souvent à des conclusions différentes même dans le cas de tests effectués sur le même insecte cible. Dans les traitements en plein champ, dont le but est de limiter les populations de phytophages, un certain pourcentage d’insectes survit à l’infection. Il est donc important de connaître les potentialités des survivants en termes de capacité et de vitesse de développement mais aussi de potentiel biotique, compte tenu de l’âge des larves qui ont subi le traitement. Ces informations sont très importantes pour évaluer avec précision le résultat d’une

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intervention. Elles permettent aussi d’optimiser les dates de traitement en ciblant les interventions sur les stades de développement les plus sensibles. Nous basant sur ces considérations et sachant que de telles études n’ont jamais été réalisées sur les populations de L. dispar de Sardaigne, il a paru intéressant d’entreprendre des tests de laboratoire pour étudier l’effet d’une infection par B. thuringiensis sur le développement de l’insecte. Bien qu’en règle générale, de tels traitements soient ciblés sur les premiers stades larvaires du phytophage, nous avons étendu les expérimentations aux stades suivants afin de comparer les résultats à ceux concernant d’autres lépidoptères mais aussi dans le but d’évaluer les effets d’éventuelles interventions tardives. L’objectif de cette recherche est donc de déterminer si les effets débilitants provoqués par B. thuringiensis diffèrent selon le stade larvaire des insectes traités. Les résultats de cette étude peuvent être utiles également pour l’évaluation à moyen et à long terme des traitements effectués en forêt.

Matériel et méthodes

Lymantria dispar Les chenilles de L dispar employées pour l’expérimentation ont été obtenues en faisant éclore les oeufs pondus par des papillons qui avaient émergé au laboratoire de chrysalides récoltées dans une subéraie du Nord de la Sardaigne. Les oeufs, débarrassés de leurs poils protecteurs et désinfectés à la formaline à 10%, ont été mis en incubation dans des conteneurs stériles, dans une chambre climatisée à 25±0, 5°C, 65±5 % HR, avec une photopériode de 16 heures de lumière et 8 heures d’obscurité. Les chenilles ont été maintenues en chambre climatisée dans les mêmes conditions d’élevage sur un milieu artificiel à base de germe de blé, jusqu’au 2e, 3e, 4e, 5e ou 6e stade, selon les individus. Les chenilles de chaque stade ont été pesées individuellement ; une partie d’entre elles a été infectée par la bactérie tandis que les autres, non traitées, ont servi de témoins.

Bacillus thuringiensis. Les suspensions bactériennes employées ont été préparées à partir du produit commercial Foray 48B (10.600 U.I./mg). Le produit a été dilué dans de l’eau distillée stérile, additionnée de 0,01 % de dispersant (Triton X-100), de façon à obtenir des concentrations différentes allant de 0,5 à 1,25 ml/l. Des essais préliminaires ont en effet montré que de telles concentrations provoquent des taux de mortalité compris entre 50 et 60%.

Technique d’infection Au plus 15 heures après la mue, les chenilles d’un stade donné ont été soumises à un jeûne d’environ deux heures avant d’être placées dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre contenant 10 petits morceaux (10 x 3 x 3 mm) de milieu artificiel, contaminés au préalable par 0,003 ml de suspension bactérienne déposée à leur surface à l’aide d’une micropipette automatique. Cette technique de contamination superficielle équivaut à une incorporation du bioinsecticide au milieu nutritif. On a constaté en effet, qu’en ajoutant un colorant à la suspension, celle-ci se répand uniformément à l’intérieur des morceaux de milieu artificiel grâce à leurs dimensions réduites. Toutes les opérations de préparation et de manipulation des suspensions bactériennes et d’infection du milieu ont été exécutées sous une cape stérile. Les larves à infecter, placées par lots de 10 individus pour les chenilles de deuxième et troisième stades, de 5 pour celles de quatrième et cinquième stade et de 3 pour celles du sixième stade, ont été maintenues dans les boîtes contenant du milieu nutritif infecté pendant 24 heures. Par la suite, on les a placées individuellement dans des boîtes stériles contenant du milieu artificiel sain et les survivantes ont été élevées jusqu’à l’émergence des adultes. Pour

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chaque lot de chenilles infecté, on a déterminé le taux de mortalité 10 jours après le traitement. Lors des observations quotidiennes on a noté, pour chaque individu ayant survécu au traitement, la durée de l’arrêt de l’alimentation, le nombre et la durée des stades larvaires faisant suite au stade qui a subi l’infection et le poids de la chrysalide 48 heures après la nymphose. On a également noté le pourcentage d’adultes ayant émergé. Les données sur les stades larvaires et le poids des chrysalides ont été analysées séparément pour chacun des sexes. Les comparaisons de moyennes ont été faites à l’aide du test t de Student au seuil de probabilité de 0,01.

Résultats

Le poids frais moyen des larves des différents stades est reporté dans le tableau 1. Les taux de mortalité (tab. 2) observés 10 jours après l’infection sur les lots de chenilles de différents stades sont compris entre 48% (6e stade) et 60% (4e stade). On peut considérer que les résultats obtenus sont comparables pour les différents stades infectés. Dans les lots témoins la mortalité a été nulle pendant la même période d’observation. L’interruption temporaire de l’activité trophique induite par les toxines de la bactérie a été la même (3 jours en moyenne) pour tous les lots traités.

Tableau 1. Poids frais moyen (en mg) des chenilles des différents stades

Stade larvaire 2e 3e 4e 5e 6e effectif 100 90 100 100 77 moyenne 8,03 36,98 97,54 223,93 524,19 écart-type 1,90 8,03 19,44 58,56 174,35

Tableau 2. Taux de mortalité des chenilles infectées à différents stades

Stade larvaire 2e 3e 4e 5e 6e effectif 137 90 240 436 77 Taux de mortalité % 55,5 59 60 49 48

Développement larvaire On observe un allongement significatif de la durée du stade infecté par rapport aux échantillons témoins et ce quelque soit le stade larvaire ou le sexe considéré (tab. 3). Ce ralentissement du développement est une conséquence de l’interruption de l’alimentation qui suit l’infection par le Bacillus turingiensis. Le stade infecté dure en moyenne deux jours de plus chez les chenilles traitées que chez les témoins correspondants. La différence entre lots traités et lots témoins est d’environ 1 jour pour les femelles infectées au cinquième et sixième stades, et de 2 à 4 jours pour les mâles infectés au cinquième stade. Les différences de durée exprimées en pourcentage par rapport aux témoins indiquent que l’allongement du stade infecté est plus marqué lorsque les chenilles ont été traitées au début de leur développement. On remarque en particulier, dans le cas d’une infection au deuxième ou au troisième stade, un allongement de ces stades d’environ 43% et 51% respectivement ; cette allongement est en relation avec la durée plus brève de ces stades par rapport aux suivants. Lorsque les chenilles sont infectées au quatrième stade, la durée du stade est de 37% environ supérieure à celle des témoins ; la différence n’est

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plus que 8,7% dans le cas où l’infection a eu lieu au sixième stade. Nous n’avons pas observé de différences significatives en fonction du sexe.

Tableau 3. Durée moyenne (en jours) des stades larvaires exposés au B. thuringienis et ayant survécu à l’infection. Dans la même colonne les moyennes suivies par la même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 0,01.

Stades larvaires 2e 3e 4e 5e 6e sexe ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♀ effectif 50 39 36 68 36 68 53 50 45 Témoins moyenne 4,48 a 4,46 a 5,5 a 5,26 a 6,53 a 6,07 a 12,40a 8,26 a 13,12a écart-type 0,84 0,85 0,65 0,78 0,77 1,08 1,08 1,54 1,28 effectif 35 34 23 26 52 66 69 35 38 Traités moyenne 6,51 b 6,73 b 8,17 b 7,54 b 8,90 b 8,32 b 14,84b 9,26 b 14,26b écart-type 1,29 1,97 1,69 1,42 1,37 1,30 1,45 1,17 1,35

La durée totale de la vie larvaire après l’infection (tab. 4) est par contre en moyenne significativement plus longue que celle des témoins pour tous les échantillons sauf dans le cas des chenilles infectées au 3e stade. On a observé en effet dans ce dernier cas une réduction significative de la durée du cinquième stade chez les mâles et des stades 4 à 6 chez les femelles. L’allongement du 3e stade étant compensé par un raccourcissement des stades suivants, la durée totale de la vie larvaire après l’infection n’est donc pas significativement différente de celle du témoin. Ce phénomène de compensation n’a pas été observé chez les chenilles infectées à un autre stade larvaire. Par ailleurs, chez les mâles comme chez les femelles, l’infection n’a pas provoqué l’apparition de stades larvaires supplémentaires. Le léger retard observé est dû exclusivement à l’allongement du stade qui a subi l’infection ; il varie en moyenne de 1,15 jours chez les femelles infectées au quatrième stade à 2,79 jours chez les femelles infectées au 2e stade.

Tableau 4. Durée moyenne du développement larvaire (jours) de L. dispar après infection au B. thuringiensis en fonction du stade larvaire infecté et du sexe. Dans la même colonne les moyennes suivies par la même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 0,01.

Stades larvaires 2e 3e 4e 5e 6e sexe ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♀ effectif 49 39 30 66 30 66 53 47 45 Témoins moyenne 32,82 a 37,95 a 24,3 a 31,68 a 18,97a 26,41a 12,4 a 21,23a 13,12a écart-type 2,57 2,99 2,12 3,13 1,73 2,91 1,08 2,09 1,28 effectif 34 34 23 21 51 59 69 24 38 Traités moyenne 34,85 b 40,73 b 25,83a 30,95 a 21,29b 28,49b 14,84 b 22,91b 14,26b écart-type 2,95 5,1 2,96 1,80 2,15 3,04 1,45 1,80 1,35 Si l’on considère l’allongement du développement larvaire exprimé en pourcentage par rapport au témoin, on peut remarquer que les lots les plus affectés par le traitement sont ceux

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des mâles infectés durant leurs derniers stades larvaires. L’allongement de la vie larvaire atteint sa valeur la plus élevée (19,7 %) lorsque l’infection a lieu au 5e stade. De même, dans le cas des femelles, le retard de développement le plus grand (8,8 %) apparaît chez les individus infectés au cours de leur dernier stade larvaire.

Chrysalides Le poids frais moyen des chrysalides femelles ayant survécu à l’infection ne diffère pas significativement des témoins, et ce quelque soit le stade exposé au traitement (tab. 5). Par contre, dans le cas des mâles, l’infection détermine une réduction significative du poids frais moyen des chrysalides quand elle a eu lieu au cours des deux derniers stades de la vie larvaire. En outre, la réduction exprimée en pourcentage du poids des chrysalides par rapport aux témoins est plus grande (12,19 %) pour les mâles infectés au 4e stade que pour ceux infectés au 5e stade larvaire (8,7 %).

Tableau 5. Poids moyen frais des chrysalides (en g) des individus de L. dispar ayant survécu à l’infection par B. thuringiensis, selon le stade larvaire infecté. Dans la même colonne les moyennes suivies de la même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 0, 01.

Stades larvaires 2e 3e 4e 5e 6e sexe ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♀ effectif 50 45 34 61 34 61 53 45 45 Témoins moyenne 0,59a 1,70a 0,56a 1,95a 0,56a 1,95a 0,46a 1,70a 1,70a écart-type 0,12 0,59 0,11 0,39 0,11 0,39 0,09 0,56 0,56 effectif 35 33 23 22 51 54 66 38 36 Traités moyenne 0,52a 1,60a 0,52a 1,99a 0,49b 1,85a 0,42b 1,61a 1,50a écart-type 0,12 0.53 0,08 0,28 0,07 0,43 0,07 0,51 0,63

Tableau 6. Pourcentage d’émergence des adultes chez les individus ayant survécu à l’infection par B. thuringiensis selon le stade larvaire infecté. Dans la même colonne les moyennes suivies par une même lettre ne diffèrent pas significativement au seuil de 0,01.

Stades larvaires 2e 3e 4e 5e 6e effectif 118 89 89 109 48 Témoins % 99,15 a 89,89 a 89,89 a 96,33 a 97,92 a effectif 70 56 111 104 37 Traités % 97,14a 91,07 a 82,88 a 92,31 a 100 a

Le taux d’émergence des adultes dans les lots d’individus ayant survécu à l’infection et effectué leur nymphose ne diffère pas significativement de celui des témoins et ce quelque soit le stade larvaire ayant subi l’infection (tab. 6). Discussion et conclusions

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Bien que les observations n’aient concerné que les individus ayant survécu au traitement, et que les mortalités observées aient été inférieures à celles déterminées par les traitements en plein champ, les résultats obtenus lors de cette étude apportent des renseignements utiles sur les modalités d’action de la bactérie mais aussi sur l’importance relative des effets sublétaux de la bactérie sur les individus de L. dispar en fonction du stade larvaire qui a subi l’infection. On constate que l’infection par B. thuringienis n’entraîne, ni pour les mâles ni pour les femelles, l’apparition de stades larvaires supplémentaires. On sait en effet qu’un stress alimentaire peut provoquer chez L. dispar un allongement remarquable de la vie larvaire (Leonard, 1966). Même lorsqu’il est important, l’allongement de la durée du stade infecté n’entraîne une augmentation ni du nombre ni de la durée des stades suivants, c’est pourquoi le retard à la nymphose même s’il est significatif demeure limité (moins de trois jours) ou est même inexistant dans le cas des chenilles infectées au 3e stade. Le poids frais moyen des chrysalides dépend de la qualité et la quantité de nourriture ingérée au cours de la vie larvaire et de son taux d’assimilation. Nos observations montrent que chez les survivants, quelque soit le stade larvaire traité, l’infection par la bactérie n’entraîne pas de réduction significative du poids des chrysalides par rapport aux témoins, sauf dans le cas des chenilles mâles infectées au 4e ou au 5e stade. Ceci suggère qu’une fois dépassée la phase critique d’interruption de l’alimentation qui suit immédiatement l’infection, la plupart des individus sont en mesure de récupérer leur poids et de se développer normalement. Le poids des pupes femelles est étroitement corrélé à la fécondité. En se basant sur le poids frais moyen des chrysalides femelles d’une population de L. dispar donnée, il est possible de calculer le nombre moyen d’oeufs par ponte par le calcul de la droite de régression (Cerboneschi, 1999). On peut ainsi supposer que la fécondité des insectes ayant survécu à l’infection par la bactérie ne diffère pas significativement de celle des individus sains. Ceci nécessite toutefois d’être vérifié par une évaluation directe de la fécondité et de la fertilité des papillons femelles ayant survécu à un traitement au B. thuringienis. La comparaison des résultats obtenus en fonction du sexe montre que les mâles traités aux cours des derniers stades larvaires semblent réagir de façon plus sensible au traitement, par un ralentissement de leur vitesse de développement et par la réduction du poids de leurs chrysalides. Dans des études analogues menées sur des larves de Choristoneura rosaceana (Harris) (Lepidoptera: Tortricidae), on a constaté que seuls les survivants infectés au cours des derniers stades larvaires présentaient une réduction significative du poids moyen de leurs chrysalides par rapport aux témoins (Li et al., 1993). Sur la base de nos résultats et compte tenu des paramètres pris en considération, nous pouvons dire que, dans le cas de L. dispar, aucun stade larvaire ne semble nettement plus sensible que les autres aux effets sublétaux de la bactérie, même si les derniers stades sont un peu plus affectés que les premiers. Ces derniers sont par contre tués en plus grand nombre par la bactérie ce qui explique qu’ils soient la cible des traitements effectués en forêt. Pour conclure, les résultats de cette étude semblent indiquer que les épandages de B. thuringiensis, effectués dans le but de limiter les populations de phytophages, n’ont pas d’effets garantis à moyen ou à long terme. En effet, les individus survivant à l’infection ne semblent pas particulièrement déficients de sorte que, si d’autres facteurs naturels de régulation n’interviennent pas de façon décisive, la densité de population du phytophage pourrait augmenter à nouveau rapidement au cours des années qui suivent le traitement. Toutefois, pour mieux connaître les interactions entre la bactérie et l’insecte cible, il est nécessaire d’étudier la viabilité des adultes et le pourcentage d’éclosion des oeufs des générations suivant celle qui a subi le traitement. Dans un contexte plus général, nos résultats apportent des informations utiles en vue d’un emploi plus rationnel des bioinsecticides. Si la réduction immédiate de la population du phytophage est suivie d’effets à plus long terme, la fréquence des traitements bioinsecticides

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pourrait être réduite ce qui, outre l’avantage économique, permettrait de réduire l’impact des traitements sur l’environnement mais aussi de diminuer les risques d’apparition de phénomènes de résistance.

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Sublethal effects on Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Lymantriidae) caused by treatment with Bacillus thuringiensis var. kurstaki

Anna Cerboneschi

Abstract: Laboratory experiments were conducted in order to investigate whether or not sublethal doses of Bacillus thuringiensis kurstaki have any debilitating effects on the fitness of survivors of Lymantria dispar L. Larvae of different instars (second to sixth) were exposed during 24 h to Bacillus thuringiensis incorporated into artificial diet in order to determine which instars are the most sensitive. The effects of exposure to B. thuringiensis on the infected instar, the number and duration of the post- treatment instars, the larval development time, the pupal weight and the emergence of the moths were investigated both for surviving males and females. Some significant effect of the treatment on larval development time and pupal weight were observed ; they differ according to the sex and the instar of the infected larvae.

Key words: Lymantria dispar L., Bacillus thuringiensis kurstaki, larval instars, development

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 131-134

EAG responses to sex pheromone of Lymantria dispar L. males treated with Bacillus thuringiensis kurstaki

Anna Cerboneschi, Roberto Crnjar, Anna Liscia, Carla Masala, Paolo Solari Stazione Sperimentale del Sughero, Via Limbara, 9 - 07029 Tempio Pausania (Sassari), Italy; Dipartimento di Biologia Sperimentale, Sezione di Fisiologia Generale, Università di Cagliari, Cittadella Universitaria - 09042 Monserrato (CA), Italy

Abstract : Understanding of the factors that can influence the success of sex encounter in the gypsy moth Lymantria dispar, one of the most important defoliators of cork-oak forest, could improve field techniques, for example, by enhancing sublethal effects of microbial agents employed against this moth. Based on this working hypothesis, we recorded the electrophysiological olfactory responses of the antennae (EAG) to different concentrations of sex pheromone (+)disparlure in males healthy and treated with Bacillus thuringiensis, taking into account a variable in population dynamics : the ability of males to recognize pheromone signalling from females. Infections were performed during different larval instars (3rd, 4th, 5th) in specimens from two different localities of Sardinia, by exposition for 24 hours to a diet contamined with B. thuringiensis. Our results showed weak responses of all specimens at the two lowest tested pheromone concentrations (10-5, 10-4) while sensitivity strongly enhanced at higher concentrations, were the expected dose-response relationship was present. However, no statistical differences were detected in male sensitivity between untreated and infected specimens of the same locality, regardless of age of larval infection. Nevertheless, we cannot exclude that sublethal effects of microbial agents could be important for a long term program in population control.

Key words : Lymantria dispar, EAG, Bacillus thuringiensis, infection, Sardinia

Introduction

In Sardinia, the gypsy moth Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Lymantriidae) is the most important defoliator of Quercus suber L. forests, causing great economic damage to cork production. Factors underlying the reproductive programme of this Lepidoptera, which include production and release of sex pheromone from female moths and its perception by conspecific males, are critical to the mating success (Hildebrand, 1996); in this respect, for example, the knowledge of factors possibly influencing males sensitivity towards this sex attractant appears to be of particular interest (Cerboneschi et al., 1998). Since different mixtures of Bacillus thuringiensis were commonly used against gypsy moth, their effects on insects surviving the treatment are not yet clarified. Therefore we tried to investigate if EAG male sensitivity to sex pheromone could be influenced by their infection during larval stage. Based on this working hypothesis, our research focused on recording the electrophysiological olfactory activity of the antennae (EAG) to different concentrations of sex pheromone (+)disparlure in adult males healthy or treated with B. thuringiensis at different larval instars. The aim was to ascertain if delayed sublethal effects of this microbial agent could be used to control the population by another means than its known effect on mortality rate.

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Materials and methods

Rearing and infection of larvae with B. thuringiensis kurstaki Starting from two different egg-masses collected in Abbasanta (Central Sardinia, 40°12’N 8°47’E; altitude: 360 m a.s.l.), and Chiaramonti (Northern Sardinia, 40°45’N 8°49’E; altitude: 350 m a.s.l), larvae were reared on an artificial diet in an environmentally controlled chamber (25±5°C; 60±5% RH and 16 hrs daylight regime). Newly molted 3rd, 4th and 5th instar larvae, were infected by a 24 h exposition to a diet contaminated with B. thuringiensis at different concentrations by means of aqueous suspensions from the pure commercial product commonly used in the control of lepidopteran defoliators, Foray 48B (10,600 UI/mg). Subsequently, insects surviving infection and the control ones were individually placed in Petri dishes with untreated diet and monitored until pupation. Larvae from Abbasanta were infected during the 4th instar with a high mortality dose (80-95%), while those from Chiaramonti were infected during the 3rd, 4th (two different samples with a 3% low mortality and a 50-85% high mortality, respectively), and the 5th instar (42-59% mortality rate). Stimulation procedures and apparatus Stimuli were presented by means of an odour delivery system. The set-up consisted of two membrane air pumps, one of which delivered a constant pure air flow (0.5 l/mn) over the moth’s antenna through a glass nozzle positioned at a distance of 1 cm from the preparation. The other pump generated a second air flow that was manually switched to the input port of one of an array of odour cartridges, each containing a different stimulus. The output of the cartridges was then added to the main air flow (via separate glass capillary tubes). Each cartridge (the modified barrel of a 10 ml syringe) contained a zigzag folded piece of filter paper of standard area (1 x 8 cm) impregnated with the stimulation substance by total immersion of the paper into the solution. Both airflows, were kept at 25°C and 70% R.H., charcoal filtered, and adjusted, prior to delivery, by means of flowmeters (Cole-Palmer), to yield a final dilution ratio of 1:5. Each stimulation lasted 2 s and a recovery interval of 3 min was allowed between any two successive stimulations, with the intent of minimizing adaptation effects. The papers were always kept saturated. The odour saturated air flow was switched on and off by means of a 3-way air valve (LEE, LFAA 12001184) operated through a programmable timer. The air containing the stimulus was removed from the experimental arena by means of a suction pump operating at a flow rate slightly higher than the stimulation one. When not in use, the odour cartridges were stored at -20°C. EAG recording techniques and stimuli Electrophysiological tests were performed on males two to five days after emergence; recordings were obtained from single moth antennae positioned in such a way as to expose the largest surface to stimulation. The recording electrode, a saline filled glass micropipette (2 µm in average tip diameter) containing an Ag/AgCl wire, was gently pressed against the cut antenna tip; a similar Ag/AgCl wire, inserted into the base of the antennal shaft, acted as the reference electrode. Electroantennograms were recorded with a high input impedance electrometer (WPI M707), displayed on an oscilloscope and stored on magnetic tape; their amplitudes were measured by means of a wave-form digitizer (Tektronix 5D10). Student's "t" test with a 5% confidence level was used to verify differences in EAG amplitude between infected samples and the relative control. Each antenna (one per moth) was stimulated with a (+)disparlure solution within the 1:10 - 1:100000 (10-1 - 10-5) dilution range from pure pheromone, presented in increasing sequence; lower concentrations elicited subthreshold responses. Dilution were made in liquid paraffin; at the beginning of each experiment, stimulation with air was also provided as a control to measure the presence of a possible mechanoreceptor response component.

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Results and discussion

All tested concentrations of (+)disparlure evoked antennal responses of a negative sign, that is with a depolarization interpreted as a net excitatory response of the chemosensory neurons in the antennae; in all specimens a weak sensitivity was observed at the lowest pheromone concentrations (10-5 - 10-4) while increasing responses and a dose-response relationship were clearly present at higher concentrations. Figure 1 shows the EAG mean amplitude values ± standard error from antennal receptors of healthy (control) and infected males collected in Abbasanta, with a sensitivity level from 0.56 ± 0.1 to 3.04 ± 0.29 mV and from 0.7 ± 0.12 to 3.4 ± 0.5 mV for healthy and treated samples respectively, in the range 10-3-10-1 of pheromone concentration; no statistical difference was found. As regards specimens from Chiaramonti (fig 2), EAG values obtained from the control population ranged from 0.37 ± 0.04 to 2.67 ± 0.28 mV for (+)disparlure concentrations of 10-3 and 10-1, whereas from 0.37 ± 0.06 to 2.87 ± 0.28 mV, from 0.23 ± 0,03 mV to 2.08 ± 0.16 mV and 0.23 ± 0.03 to 2.08 ± 0.16 mV respectively for 3rd, 4th-low mortality and 4th-high mortality infected larvae in the same interval of (+)disparlure concentrations.

4 Control Inf. 4th a 3

2 mV/antenn 1

0 -5 -4 -3 -2 -1 (+)disparlure log concentration

Figure 1. EAG response from specimens collected in Abbasanta (Inf 4th : infected instar)

Control 3 Inf. 3rd Inf. 4th (low mortality) 2 Inf. 4th (high mortality)

1 mV/antenna

0 -5 -4 -3 -2 -1 (+)disparlure log concentration Figure 2. EAG response from specimens collected in Chiaramonti (Inf 3rd to 4th : infected instars) The comparative analysis between infected specimens and the control shows that a

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significant difference exists only between the 4th instar infected sample at low rate of mortality and its control at 10-3 and 10-2 pheromone concentrations; high variabilities observed within each specimen, probably explain undetected differences. Figure 3 shows EAGs recorded from the sample from the same locality but infected during the 5th instar larvae, with responses ranging from 0.33 ± 0.07 to 1.37 ± 0.13 mV and from 0.25 ± 0.04 and 1.47 ± 0.15 mV for healthy and treated samples respectively, in the same range of stimuli.

Control Inf. V

mV/antenna

-5 -4 -3 -2 -1 (+)disparlure log concentration

Figure 3. EAG response from specimens collected in Chiaramonti (5th infected instar)

Our electrophysiological results show no statistical differences in adult male olfactory sensitivity between healthy and treated samples with B. thuringiensis, regardless of age of larval infection; surviving males continue showing a complete sensitivity towards female sex attractant so that, at least in that case, this kind of infection could be considered irrelevant as an alternative method for population control. Nevertheless, these results provide new elements in the study of sublethal effects of microbial agents against forest defoliators, the knowledge of which, related to larval age of infection, could be important in optimizing times of intervention in a long term programme for population control.

References

Cerboneschi, A., Crnjar, R., Liscia, A. M., Maione, R. & Solari, P. 1998 : Influence of microclimatic variations on EAG responses of Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae) males to sex pheromone. Ital. J. Zool., 65: 267-272. Hildebrand, J.G. 1996 : Olfactory control of behaviour in moths: central processing of odor information and the functional significance of olfactory glomeruli. J. Comp. Physiol. A 178: 5-19.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 135-138

Observations on the lepidopterous fauna associated to the cork oak after a treatment with Bacillus thuringiensis kurstaki

Anna Cerboneschi, Pino Angelo Ruiu Stazione Sperimentale del Sughero, Via Limbara 9, 07029 Tempio Pausania (Sassari), Italy

Abstract : After a treatment with Bacillus thuringiensis kurstaki in a cork-oak forest, the mortality of Lymantria dispar, Malacosoma neustria and the other Lepidoptera was evaluated. Lepidopterous larvae were collected by beating 3 branches of 5 trees onto a 100 cm square cloth before the treatment and 4, 7 and 15 days after. The living and dead larvae were counted. To complete the mortality data the living larvae were laboratory reared on healthy leaves of cork-oak. The population density of L. dispar was estimated by counting the egg-masses on 40 trees before and after treatment. The mortality was also recorded for pupae of surviving individuals and for pupae collected one year after. Treatments against M. neustria and B. thuringiensis have a great impact on non-target Lepidoptera.

Key words : Bacillus thuringiensis, Quercus suber, Lymantria dispar, non target Lepidoptera

Introduction

Among the means employed to control the forest defoliators, the products composed of Bacillus thuringiensis kurstaki are more frequently used for the treatments by aerial means. Since 1972, in Sardinia, the compounds made with B. thuringiensis have been tested in the field (Magnoler, 1974). Recently different tests to fight against the forest defoliators have been carried out in some cork oak forests of the region (Lentini & Luciano, 1995). Nowadays it is widely known that besides the defoliators, many species of Lepidoptera are sensitive to the bacterium and there is still a lack of specific research connected to this problem (Peacock et al., 1998). In Sardinia, research aiming at assessing the effect of the treatment on the non target Lepidoptera living on cork oak and being a component of the forest ecosystem, never have been carried out. However, during the trial carried out in 1997, the abundance variations of the lepidopterous fauna associated to the cork oak in treated and witness areas were compared (Luciano & Lentini, 1999). During this same experiment realized with the contribution of the Stazione Sperimentale del Sughero in the experimental cork oak plantation in Cusseddu, the researchers of the Stazione Sperimentale del Sughero decided to manage a series of particular observations concerning the effect of the treatment regarding mortality, not only of the main defoliators, but also of the other species of Lepidoptera present at the larval stage.

Materials and methods

The treatment was executed the evening of the 22th May 1997 by helicopter at ultra low volume with a compound based on B. thuringiensis kurstaki (Foray 48B), with a dose of 5 l/ha corresponding to 63.5 BIU/ha.

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Before and after the treatment, population density of the defoliator Lymantria dispar L was assessed, on the basis of the egg masses present on a sample of 40 trees. In addition, the percentage frequency of the different larval instars of L. dispar was assessed at the treatment time. Before the treatment and 4, 7 and 15 days after the treatment some samples of larvae were collected to estimate the abundance and the mortality of the lepidopterous fauna. The collection was carried out on 5 cork oak trees with the larvae fallen onto a sheet of approximately 1sm from the shaking of three branches of every tree. The total number of dead or alive larvae of L. dispar, Malacosoma neustria L. and other lepidopterous species considered as a whole was recorded in each sample. The alive larvae were reared for 15 days on non treated oak foliage to complete the data on mortality. In addition, samples were collected of male and female pupae, of which the wet weight, the causes of mortality and the percentage of emergence were assessed. Exactly one year after this treatment, a further sampling of larvae and pupae was carried out on the same trees.

Results and discussion

Density of the lepidopterous fauna The density of L. dispar population, assessed from the egg masses number present before and after the treatment, was respectively on an average of 25.6 and 11.7 egg masses per tree. Therefore the population reduction reached about 54%. At the treatment time, the larval population of L. dispar was mostly constituted of 3rd and 4th instar larvae (47,3% and 43,9%), and for 8,1% of 2nd instar and 0,7% of 5th instar larvae. The data of the larval density of the lepidopterous fauna concerning the tests executed the morning before the treatment, 15 days after the treatment and a year after the treatment are related in the table 1. Among a total of 1222 larvae collected the morning before the treatment, 51,80% were L. dispar larvae, 37,40% M. neustria larvae and 10,8% belong to other species, with a predominancy of Tortrix viridiana L. The density of L. dispar and M. neustria larvae decreased respectively from 633 and 457 individuals before the treatment, to 102 and 54 individuals after 15 days, thus enduring a reduction of 83,9% and 88,2%. The density of the remaining lepidopterous fauna before and after the treatment decreased from 132 to 20 individuals, showing a reduction of 84,8%. In 1998, exactly one year after the treatment, a further decrease of the L. dispar density (96 individuals) was observed as well as an almost total disappearance of the M. neustria population (only 1 individual collected), while the number of the other Lepidopterous larvae remaind almost unchanged.

Mortality of the lepidopterous fauna The data concerning the mortality of the lepidopterous fauna, detected in the field and in the laboratory refer to the tests performed on the larvae of L. dispar, M. neustria and other species of Lepidoptera before and after the treatment (tab. 2). The mortality due to the pathogens (given by the sum of the mortality at the collection time and during the rearing) reached the highest degree (96,8%) for M. neustria, followed by the other species of Lepidoptera (86,5%) and by L. dispar (64,8%). For all the contemplated species, the higher mortality value due to pathogens is the one assessed a week after the treatment. From the analysis of the available data it appears also that M. neustria and the other Lepidoptera seem more sensitive to B. thuringiensis than L. dispar, both on the shortest and on the longest term.

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Table 1. Abundance and percentage composition of the Lepidopterous fauna before (*) and after a B. thuringiensis treatment

Date L. dispar M. neustria Others Total % L. dispar % M. neustria % Others 22/05/97* 633 457 132 1222 51.8 37.4 10.8 05/06/97 102 54 20 176 58.0 30.7 11.4 22/05/98 96 1 23 120 80.0 0.8 19.2

Table 2. Mortality percentages of the Lepidopterous fauna before (*) and after a B. thuringiensis treatment

Lepidopterous Date Nb Parasited Total Mortality due to the pathogens species larvae individuals mortality in field in culture total L. dispar 22/05/97* 633 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0 26/05/97 303 21.1 38.7 59.8 0.0 59.8 29/05/97 388 53.4 11.5 64.8 0.0 64.8 06/06/97 123 17.1 8.1 25.2 8.1 33.3 M. neustria 22/05/97* 457 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 26/05/97 146 69.9 no data 69.9 0.0 69.9 29/05/97 187 51.9 44.9 96.8 0.0 96.8 06/06/97 75 28.0 45.3 73.3 17.3 90.7 Others 22/05/97* 132 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 26/05/97 43 20.9 50.8 71.8 5.6 77.4 29/05/97 54 50.0 36.5 86.5 0.0 86.5 06/06/97 20 0.0 55.0 55.0 0.0 55.0

On the last samples of reared L. dispar, it has been assessed that 13,5% of the individuals dead owing to the pathogens, were attacked by an entomopathogenic virus, present in the natural habitat, as determined with a microscopical test. As this epizootic disease begins to reveal itself in a population since the first larval instars, it can be assumed that a part of the larvae dead for pathogenic causes after the treatment was attacked by the virus. The low mortality of L. dispar is probably to be ascribed to the delay of the treatment with regard to the conditions that are considered as optimum, as the larval population of the defoliator is mainly constituted by larvae of III and IV instars. Owing to the high insect density, the mortality determined by the treatment has not been sufficient to avoid a partial defoliation and the surviving insects were able to lay a large number of egg masses. The inquiry into the effects caused by B. thuringiensis were concluded by the observations on the samples of 100 pupae of L. dispar collected in the treated area during the year of the treatment and during the following year. The considered parameters were the medium wet weight and the mortality (tab. 3). The data analysis point out remarkable differences in the death rate between the two samples : in fact it decreased from 51,4% to 38,2% for the female pupae and from 15,4% to

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the 13,3% for the male pupae. The total mortality of the samples was 42% (1997) and 27% (1998). On the samples collected a few days after the treatment and one year later, the only cause of mortality was the attack of parasitic insects and particularly of Diptera Tachinidae. The year after the treatment, parasitoid impact was however reduced. It is very interesting to observe that the weight of the pupae in 1997 was lower than that of 1998 and that this difference is more evident for the female pupae.

Table 3. Mean wet weight and mortality percentage of L. dispar pupae in 1997 after B. thuringiensis treatment and in 1998, a year after the treatment.

Year Sex Nb Mean wet weight SD % mortality 1997 ♀ 74 0,98 0,23 51,4 1998 ♀ 55 1,93* 0,36 38,2**

1997 ♂ 26 0,42 0,07 15,4 1998 ♂ 45 0,54* 0,08 13,3** * Significanthly different from 1997 at the 0,01 level ; **Significanthly different from 1997 at the 0,05 level

It can been assumed that the lower weight of the pupae in 1997 was caused on the one hand by a lack of food, owing to the partial defoliation, and, on the other hand, to B. thuringiensis that, when it did not induce the death of lepidopterous larvae may have compromised their feeding capability, influencing the growth of the individuals survived to the treatment. The inquiry pointed out the remarkable effect that the B. thuringiensis treatments have on all the lepidopterous fauna present at the larval stage. It would be appropriate to broaden these observations also on the lepidopterous larvae present on the shrubby and herbaceous strata. Therefore we consider it important to verify the possibility of reducing this effect through a better management of the control programs against the forests defoliators.

References

Lentini, A. & Luciano, P. 1995 : Bacillus thuringiensis in the management of gypsy moth (Lymantria dispar L.) in Sardinian cork-oak forests. IOBC/wprs Bull. 18(6) : 104-109. Luciano, P. & Lentini, A. 1999 : Effects of Bacillus thuringiensis and defoliation by gypsy moth on lepidopterous fauna in cork-oak forests. IOBC/wprs Bull. 22(3) : 115-119. Magnoler, A. 1974 : Ground application of a Bacillus thuringiensis preparation for gypsy moth control. Z. Krankh. Pf1. Schutz 81 : 575-583. Peacock, J. W. Schweitzer, D.F. Carter, J. L. & Dubois, N. R. 1998 : Laboratory assessment of the Effects of Bacillus thuringiensis on native Lepidoptera. Environ. Entomol. 27(2) : 450-457.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 139-146

Action de l’extrait de Melia azedarach (Meliaceae) sur le développement et la reproduction de Lymantria dispar (L.) (Lepidoptera, Lymantriidae)

Zineb Atay-Kadiri1, Amina Semlali1, Noufissa Benhsain1, Claire Villemant2 1 Faculté des Sciences, Laboratoire de Zoologie et de Biologie Générale. Rabat, Maroc 2 MNHN, ESA 8043, Laboratoire d’Entomologie, 45 rue Buffon, F-75005 Paris, France

Résumé : Un extrait obtenu à partir des graines de Melia azedarach a été testé, à des doses variées, sur les larves de différents stades de L. dispar. L'ingestion de feuilles de chêne-liège badigeonnées par cet extrait produit des effets divers. Le comportement de prise de nourriture est perturbé, notamment chez les larves L4 et L5 dont la consommation est réduite. Pour les stades L2 à L4, la mortalité du stade testé croit avec la concentration de l’extrait et l’âge des chenilles. La durée des stades larvaires traités est allongée. La nympose des larves traitées au stade L5 est parfois bloquée. Le poids des chrysalides issues de larves testées aux stades L4 et L5 subit une réduction notable, la fécondité des femelles est également affectée.

Mots clés : Lymantria dispar, Melia azedarach, anti-appétant , mortalité, développement, reproduction

Introduction

Plusieurs arbres de la famille des Meliacées ne sont jamais attaqués par certains insectes. Les plus connus sont Azadirachta indica (A. Juss.) et Melia azedarach (L.) ou lilas des Indes. Les substances extraites de ces plantes sont réputées pour leurs propriétés anti-appétantes et toxiques pour les insectes, et thérapeutiques pour l'homme (Butterworth & Morgan, 1971). On utilise souvent l'azadirachtine, extraite d'Azadirachta indica, substance que l’on retrouve dans les extraits de M. azedarach (Doskotch et al., 1977). Une autre substance le meliantriol a été identifiée chez les deux espèces (Lavie et al., 1967). Enfin, la méliatine et plusieurs autres substances anti-appétantes ont été identifiées dans les feuilles de M. azedarach respectivement par Chauvin (1946) et Huang et al. (1994 ; 1995). Ces diverses substances exercent un effet anti-appétant sur certains insectes comme le criquet migrateur Schistocerca gregaria Forskal (Butterworth & Morgan, 1971) ou des Lépidoptères comme Spodoptera litura Boisduval (Joshi & Sitaramaiah, 1979) et Ostrinia nubilalis Hübner (Arnasson et al., 1985). Les effets physiologiques de l'azadirachtine ont été étudiés chez de nombreux insectes notamment des Lépidoptères (Schluter et al., 1985; Koul et al., 1987). Le présent travail concerne l'étude des effets de l'extrait des graines de Melia azedarach sur le développement et la reproduction de Lymantria dispar, le Bombyx disparate (Lep., Lymantriidae), important défoliateur des chênaies autour de la Méditerranée et ravageur mondial des forêts (Fraval, 1989).

139 140

Matériel et méthodes

Des œufs de L. dispar, récoltés en subéraie de la Mamora (N-W de Rabat, Maroc), sont mis à éclore au laboratoire. L'élevage massif des chenilles est réalisé à température ambiante (20 à 25°C) et sous photopériode naturelle, sur du feuillage Quercus suber L. renouvelé chaque jour. Les boîtes d’élevage, en matière plastique transparente, sont aérées, tapissées de papier filtre humide pour éviter le dessèchement des feuilles et nettoyées régulièrement pour éviter toute contamination. Les larves des stades L2, L3, L4 et L5 sont placées dans les boîtes juste après la mue, par lots de 50. Nourries le premier jour, elles sont ensuite mises à jeûner pendant 24 heures puis alimentées de feuillage trempé dans l'extrait de M. azedarach. L'extrait est préparé à l'aide d'un soxlet, à partir de fruits broyés. L'extraction est faite à l'éthanol 95°. Trois concentrations sont utilisées : 500 ppm, 2000 ppm et 10000 ppm. Le feuillage de Q. suber est trempé dans l'une des solutions puis séché à l'air libre avant d’être présenté aux larves pendant trois jours. Les chenilles de chaque stade sont réparties en quatre lots , les larves de trois lots sont nourries de feuillage trempé dans l'un des extraits, 500 ppm : lot (a), 2000 ppm : lot (b), 10 000 ppm : lot (c) tandis que celles du lot témoin (t) reçoivent du feuillage trempé dans de l'eau additionnée de 0,25 % de Tween 80 (agent émulsifiant). Les paramètres choisis pour mesurer l'effet des extraits de M. azedarach sur les chenilles de L. dispar sont : • La prise de nourriture : évaluée indirectement par le poids des fécès, récoltés après 24 heures de contact des larves avec le feuillage, séchés à 60°C pendant 12 h puis pesés. • La mortalité du stade traité, notée dès le premier jour du test. • La durée des stades larvaires traités. • Le poids des chrysalides mâles et femelles mesuré deux jours après la nymphose. • Le nombre moyen d'œufs pondus par femelle survivante. • Le pourcentage d'éclosion.

Résultats

Effet sur la prise de nourriture Les résultats obtenus montrent que les trois concentrations utilisées entraînent une réduction du poids des fécès des larves durant les 3 jours du test. La réduction de la prise de nourriture est d’autant plus forte que la concentration de l’extrait est plus élevée (fig. 1).

) 10 t ) 160 t 9 a 140 a 8 b 120 b 7 c 6 100 c 5 80 4 60 3 40 2 1 20 0 0 nb.jours nb.jours 1 23 123 1 23 123 Poids moyen des fécès (mg Poids moyen des fécès (mg L2 L3 L4 L5

Figure 1 : Poids moyen des fécès en fonction du temps et de la concentration des extraits

141

Effet sur la mortalité La mortalité cumulée des chenilles, une semaine après le début du test, est d’autant plus forte que la concentration de l’extrait est élevée. Elle est plus importante pour les stades L3 et L4 ème que pour les stades L2 (fig. 2). Un pourcentage important (34%) de larves de 5 stade ayant ingéré de l’extrait à 2 000 ppm n’ont pas dépassé le stade prénymphal tandis que 56% d’entre elles ont été tuées par l’extrait à 10 000 ppm.

40 t a 35 b 30 c 25 20 Mortalité cumulée 15 10 5 0 1234 567 1234 567 1234 567 Jours L2 L3 L4

Figure 2 : Mortalité cumulée des larves des stades L2, L3 et L4.

Effet sur la durée des stades larvaires On constate un allongement de la durée moyenne des stades larvaires traités en relation avec l’augmentation de la concentration de l’extrait (fig. 3). Signalons par ailleurs que toutes les femelles qui ont survécu au traitement, sont passées par six stades larvaires au lieu de cinq, la durée du 6ème stade étant de 13,5 à 14 jours.

Nb. jours t a 18 b 16 c 14 12 10 8 6 4 2 0 stade L2 L3 L4 L5 L6

Figure 3 : Durée moyenne des stades larvaires.

142

Poids des chrysalides Le poids moyen des chrysalides mâles et femelles issues de larves traitées aux 2ème et 3ème stades est peu différent de celui des témoins, par contre, on note une réduction importante du poids des chrysalides issues de chenilles ayant subi le traitement aux 4ème et 5ème stades (fig. 4 et 5).

P(mg) t P(mg) t a 60 a 160 b b 140 50 c c 120 40 100 30 80 20 60 40 10 20 0 0 stade L2 L3 L4 L5 stade L2 L3 L4 L5

Figure 4 : Poids des chrysalides mâles Figure 5 : Poids des chrysalides femelles.

Nombre moyen d'œufs pondus par femelle Par rapport aux témoins, le nombre moyen d'œufs pondus par femelle est nettement plus faible chez tous les individus traités au quatrième et au cinquième stade larvaire (fig. 6). Cette différence est statistiquement significative (t de Student, p < 0,001).

Nb.d'oeufs t a 600 b 500 c 400 300 200 100 0 stade L2 L3 L4 L5

Figure 6: Nombre moyen d'œufs pondus par femelle.

Pourcentage d'éclosion Le pourcentage d'éclosion des œufs semble peu affecté, quelque soit la dose d’extrait employée et le stade larvaire soumis au traitement (fig. 8).

143

Eclosion (%) t a 100 b 80 c

0 stade L2 L3 L4 L5

Figure 8 : Pourcentage moyen d’œufs éclos par ponte

Discussion

Les chenilles de L. dispar des stades L2 à L5 montrent, lorsqu’elles sont nourries de feuillage traité avec de l'extrait de M. azedarach, une réduction de leur consommation d’autant plus forte que la concentration de l’extrait est plus élevée. Cette diminution de la prise de nourriture pourrait résulter de la présence d'une ou de plusieurs substances connues pour leur pouvoir répulsif ou anti-appétant, telles que les azadirachtines A, B et C, isolées par Huang et al. (1994 ; 1995). Nos résultats montrent que la mortalité provoquée par l'extrait de M. azedarach peut affecter 70% des chenilles de L. dispar (L3 traité avec 10 000 ppm d’extrait). Les premières chenilles meurent en général 24 heures après avoir été mises en contact avec le feuillage traité. Des effets similaires ont été obtenus avec les extraits d’Azadirachta indica (Doscokotch et al., 1977). Cet effet ne doit probablement pas être imputé uniquement aux propriétés anti- appétantes de la plante, mais pourrait résulter aussi d’un effet toxique du produit. Les extraits de M. azedarach entraînent ainsi un taux de mortalité 80% chez S. gregaria (Doumbia, 1994). L'extrait de M. azedarach affecte également le développement de L dispar, en provoquant un ralentissement de la croissance de l'insecte qui se traduit par un allongement de la durée de son développement. De plus, un nombre important de larves traitées au 5ème stade par des doses de 2 000 ppm et 10 000 ppm n'a pas dépassé le stade nymphal. Des effets similaires sur la croissance ont été observés chez S. gregaria (Doumbia, 1994). L'action sur les processus de croissance et de métamorphose ont été plus largement étudiés par injection d'azadirachtine à de nombreux insectes notamment des Lépidoptères (McMillan et al., 1969 ; Arnasson et al., 1985). L’injection de ce produit à des larves du 5ème stade de Manduca sexta induit ainsi des réactions dose-dépendantes telle que l’augmentation du nombre de chrysalides malformées. Les fortes doses provoquent l'apparition de larves permanentes, avec parfois des intermédiaires larve-nymphe (Schluter et al., 1985). Chez Bombyx mori L., l'injection d'azadirachtine à des larves de dernier stade produit des réactions différentes selon le moment du traitement, les larves traitées au début du stade (0 à 3 jours) donnent des chrysalides malformées tandis que celles traitées entre le 4ème et le 6ème jour

144

meurent avant la nymphose (Koul et al., 1987). Une relation dose-réponse à également été mise en évidence chez L. migratoria (Mordue et al., 1985). Le poids des chrysalides issues de chenilles traitées aux 2ème et 3ème stades est tout à fait comparable à celui des témoins. Les jeunes larves semblent en effet capables de surmonter le déficit nutritionnel grâce à un allongement de la durée du stade larvaire traité ce qui leur permet d’effectuer un rattrapage nutritionnel. Dans le cas d'un traitement au 4ème et 5ème stades, nous avons observé une diminution importante du poids des chrysalides. Les chenilles âgées semblent plus sensibles à une réduction de leur alimentation. Hérard (1984) a montré que les larves de 4ème et 5ème stades ayant subi un jeûne partiel, donnent des chrysalides beaucoup plus légères. Ainsi, contrairement aux jeunes stades, les larves âgées se montrent incapables d’effectuer un rattrapage nutritionnel. L'extrait de M. azedarach entraîne une diminution du nombre d'œufs pondus par les femelles issues de larves traitées aux stades L4 et L5. Les mécanismes d'action des substances extraites de méliacées sont encore mal connus. L'azadirachtine affecterait les mécanismes endocrines du développement post-embryonnaire et la reproduction des insectes en agissant sur la dynamique des sécrétions des cellules neurosécrétrices ainsi que sur le taux des ecdystéroides et de l'hormone juvénile. Rembold et ses collaborateurs ont émis l'hypothèse selon laquelle ces produits, en agissant sur les récepteurs de la ß écdysone, entraînent un blocage des neurosécrétions cérébrales et une action anti-ecdystéroide (Schmutterer, 1985). Ainsi, l’allongement des stades larvaires soumis à l’action de l’azadirachtine pourrait provenir d'un retard du pic des ecdystéroides (Schluter et al., 1985 ; Dorn et al., 1986).

Conclusion

L'extrait de M. azedarach testé sur les stades larvaires de L. dispar a montré une réduction significative de la consommation de feuillage avec l’augmentation de la concentration de l’extrait, il a induit un taux de mortalité important pour les larves L3 et L4, un allongement des stades larvaires traités, un blocage partiel ou total de la mue imaginale, une diminution du poids des chrysalides et la diminution de la fécondité des femelles. Nous savons par ailleurs que l'action de l'extrait dure au maximum 24 heures (Sarehane, 1981 ; El Ouartassi, 1982). Ces produits se dégradent donc rapidement et ne peuvent être utilisés que pour une protection de courte durée. Cependant, en réduisant la consommation des chenilles et en intervenant sur sl'activité neuroendocrine de l'insecte, ils provoquent leur affaiblissement et même parfois leur mort. Il serait donc intéressant d'envisager une étude plus approfondie de l'action de M. azedarach sur la croissance de L. dispar en injectant aux chenilles des extraits purifiés, puis en effectuant des dosages de leurs ecdystéroides hémolymphatiques afin d’élucider le mode d'action de ces substances.

Références

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146

Effect of Melia azedarach L. (Meliaceae) extract on Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Lymantriidae) developpement and reproduction

Zineb Atay-Kadiri, Amina Semlali, Noufissa Benhsain, Claire Villemant

Abstract: A seed extract of Melia azedarach (Meliaceae) was tested under laboratory conditions on gypsy moth larvae (second to fifth instars) fed with cork oak foliage previously soaked in three different concentrations of the extract. Feeding behaviour of the treated larvae is perturbed, particularly in 4th and 5th instars, probably due to antifeedant or repulsive effects of the extract. Reduction in food consumption induced a reduction of larval survival and development duration of the treated instar. Pupal molt of larvae treated at the 5th instar is sometimes prevented. Pupae weight of males and females treated at their 4th or the 5th larval instar is reduced as well as egg number laid by the females.

Key words: Melia azedarach, Lymantria dispar, gypsy moth, antifeedant, motality, larval development

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 147-150

Laboratory and field performance of in vitro and in vivo-reared Exorista larvarum (L.), a natural enemy of cork oak defoliators*

Maria Luisa Dindo 1, Marcello Verdinelli 2, Piero Baronio 1, Giuseppe Serra 3 1 Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (Entomologia), via Filippo Re, 6, I-40126 Bologna, Italy, [email protected] . 2 Istituto di Ricerca sul Controllo Biologico dell’Ambiente, CNR, via E. De Nicola, 07100 Sassari, Italy, [email protected] 3 Dipartimento di Protezione delle Piante, sezione di Entomologia agraria, via E. De Nicola, 07100 Sassari, Italy.

Abstract : Exorista larvarum (L.) (Diptera: Tachinidae) was reared for one generation on an artificial diet composed of skimmed milk, chicken egg yolk, yeast extract and saccharose. The laboratory and field efficacy of in vitro-cultured E. larvarum was compared with that of parasitoids reared on the factitious host G. mellonella. The effectiveness of in vitro and in vivo-reared tachinids against the natural host Lymantria dispar (L.) was tested in the laboratory. For in vitro-reared E. larvarum the percentage of successfully parasitized larvae was 19.8% compared with 22.7% for parasitoids reared on the host. No significant difference was found between the in vitro and the in vivo-reared flies. In a cork oak forest in northern Sardinia (Italy), parasitism of L. dispar and Malacosoma neustria (L.) by E. larvarum cultured in vitro or in vivo was also evaluated. The in vitro-reared females oviposited a significantly lower number of eggs on L. dispar larvae. Nevertheless, no difference in percentages of successfully parasitized larvae was recorded between the two rearing methods. No eggs were laid on M. neustria larvae by the in vitro-reared females. No puparia formed in M. neustria larvae, not even in those exposed to in vivo-reared flies.

Key words : Exorista larvarum, rearing techniques, artificial diets, quality control, Lymantria dispar, Malacosoma neustria

Introduction

In the cork oak forests in Sardinia (Italy), Exorista larvarum (L.) (Diptera: Tachinidae) is known to be one of the more effective antagonists of Lymantria dispar (L.), especially during its latency phase and retrogradation (Luciano & Prota, 1984). It is also known to attack Malacosoma neustria (L.) (Delrio et al., 1983). E. larvarum is moreover one of the most promising parasitoids for in vitro production on artificial diets. In the laboratory, the adults obtained on the medium developed by Mellini & Campadelli (1995) showed biological traits comparable to those produced on the factitious host Galleria mellonella L. (Mellini et al., 1996). In vitro rearing may represent an opportunity for easier and less expensively mass production of entomophages. A major concern of programmes aimed at rearing parasitoids and predators on artificial media is the evaluation of insect quality, which is ultimately expressed as efficacy in the field. Yet, to date, this important topic has been addressed by only a few studies (Thompson & Hagen, 1999).

* Work supported by the Italian Ministero dell’Università e Ricerca Scientifica e Tecnologica (ex-40%; ex- 60%)

147 148

This paper reports the laboratory and field results of a study on the evaluation of parasitism of L. dispar and M. neustria by E. larvarum reared in vitro on the diet developed by Mellini & Campadelli (1995) and in vivo on G. mellonella.

Materials and methods

A colony of E. larvarum was maintained on G. mellonella under the conditions described by Dindo et al. (1999). The parasitoids were reared in vitro for one generation on an artificial diet composed of skimmed milk, chicken egg yolk, yeast extract and saccharose (Mellini & Campadelli,1995). In the laboratory, both the parasitoid and its natural hosts were kept at 26±1°C, 75±5% RH, and a 16:8 L:D photoperiod. Laboratory performance of in vitro and in vivo-reared E. larvarum L. dispar larvae were obtained from egg masses collected in a cork oak forest at Tempio Pausania (northern Sardinia, Italy) and reared on fresh leaves of cork oak. Fourth-instar larvae were exposed to E. larvarum females obtained either in vitro or in vivo and removed from the parasitoid cage after 5-6 eggs had been laid on their body. Each L. dispar larva was then placed separately inside 5-cm diameter plastic Petri dishes until E. larvarum puparium formation (Dindo et al., 1999). A number of larvae were not exposed to parasitoid females and were kept as controls. Field performance of in vitro and in vivo-reared E. larvarum Trials were performed at the end of June 2001 in a cork oak forest at Tempio Pausania. Mature L. dispar larvae were collected in a forest not very far from the experiment station. M. neustria larvae were obtained from egg masses collected in the same forest and reared on fresh leaves of coak oak. As E. larvarum mates soon after emergence, and pre-oviposition period lasts about 2-3 days (Hafez, 1953), the newly-emerged in vitro or in vivo-reared E. larvarum adults were kept in the laboratory for 3-4 days before trial. An experimental unit (= 1 replicate) consisted of a tree branch wrapped in a screen net and infested with 5 either L. dispar or M. neustria mature larvae. The volume of each unit was about 100 litres. Parasitoids were released at the rate of 1 male and 1 female per unit. Some units without parasitoid release were maintained as controls. About 4 days after release (when the parasitoids were dead) host larvae were transferred to the laboratory to evaluate parasitism.

Results and discussion

In the laboratory, no difference was found between the in vitro and in vivo-reared parasitoids. It is worth noting that in the larvae parasitized by E. larvarum and produced either in the diet or in G. mellonella, total mortality was much higher than in controls (tab. 1). Apart from successful parasitization, in parasitized larvae mortality was thus due to other causes, probably including partial parasitoid development. The forest experiments were partially compromised by the fact that both the in vitro and the in vivo-reared flies died within 48-72 hours after release. However, on L. dispar larvae the in vitro-reared females oviposited a significantly lower number of eggs than the in vivo- reared ones. Nevertheless, no difference in percentages of successfully parasitized larvae was recorded between the two rearing methods (tab. 2). A few control larvae were also found to be successfully parasitized by E. larvarum probably due to the fact that the L. dispar larvae used in the experiment had been collected in a forest where the population was dense. High host density was possibly associated with a high rate of parasitism by indigenous species, including E. larvarum. All L. dispar groups studied, however, showed a high rate of

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successful parasitism by indigenous species other than E. larvarum, the more abundant being the tachinid Blepharipa pratensis (Meigen). Indigenous parasitism was found to be significantly higher in the control larvae than in those exposed to E. larvarum, regardless of whether produced in vitro or in vivo. By contrast, mortality due to unknown reasons was found to be higher in parasitized larvae, especially those exposed to in vivo-reared flies. In these larvae the death of both the host and multiparasitoids was possibly caused by the competition among E. larvarum and indigenous parasitoids. In conclusion, in our forest trials, the in vivo-reared E. larvarum flies proved to be more effective against this target insect than those produced on artificial diet, in terms of oviposition capacity and potential to induce L. dispar mortality.

Table 1. Laboratory performance of in vitro and in vivo-reared E. larvarum against Lymantria dispar. Percentages of successfully parasitized larvae [= larvae from which E. larvarum puparia were obtained (LP)/original number of larvae (L) x 100] and of total larval mortality (= LP + dead larvae which did not produce E. larvarum puparia /L x 100). Means ± SD

L. dispar larvae % successfully parasitized % total larval mortality larvae Parasitized by in vitro reared females (n=5) 19.8±14.4a 77.2±18.2a Parasitized by in vivo reared females (n=6) 22.7±14.3a 82.1±17.5a Controls (n= 6) – 27.1±29.6b F (df) 0.13 (2,9) 9.19 (2,14) P 0.727 0.003* n= number of replicates; means in a column followed by the same letter are not significantly different (p < 0.05, one-way ANOVA, Tukey HSD multiple range test)

Table 2. Field performance of in vitro and in vivo-reared E. larvarum against Lymantria dispar. All percentages were calculated over the original number of larvae. Means ± SD

L. dispar larvae Number of % larvae from which % larvae attacked % larval mortality E. larvarum eggs E. larvarum puparia by other indigenous due to unknown laid on host larvae were obtained parasitoids reasons Exposed to in 0.5±0.8a 17.5±16.7a 35±25.6a 40±32.1ac vitro-reared flies Exposed to in 9.8±4.4b 17.5±16.7a 20±26.2a 62.5±40.6ab vivo-reared flies Controls 5±9.3a 75±31.6b 15±27.8c N= 16 g.l.= 2,21 g.l.= 2,21 g.l.= 2,21 H= 11.71 F= 1.9 F=7.37 F= 3.74 P 0.0006* 0.175 0.004* 0.041* Number of replicates = 8; means in a column followed by the same letter are not significantly different [p < 0.05, Kruskall-Wallis non parametric test (number of E.l. eggs laid on host larvae), Tukey HSD multiple range test (other parameters).

No eggs were laid by the in vitro-reared females on M. neustria larvae. No E. larvarum puparia formed, not even in the larvae exposed to in vivo-reared flies (tab. 3). A high indigenous parasitoid rate was also reported for M. neustria larvae fed on cork oak leaves that may have been contaminated by B. pratensis microtype eggs. Significant differences among

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the groups were not however found either for this parameter nor for mortality due to unknown reasons. In conclusion, neither the in vitro nor the in vivo-reared E. larvarum flies were effective against M. neustria.

Table 3. Field performance of in vitro and in vivo-reared E. larvarum against Malacosoma neustria. All percentages were calculated over the original number of larvae. Means ± SD.

M. neustria larvae Number of % larvae from which % larvae attacked % larval mortality E. larvarum eggs E. larvarum puparia by other indigenous due to unknown laid on host larvae were obtained parasitoids reasons Exposed to in vitro- 0±0a 0±0 20±16.3a 35±10a reared flies (n= 4) Exposed to in vivo- 8.4±9.6a 0±0 24±16.7a 40±14.1a reared flies (n= 5) Controls (n=5) 0±0 60±42.4a 32±46a g.l. = 1,7 g.l.=2,11 N= 14 F= 2.96 F= 2.22 H= 0.628 P 0.129 0.155 0.731 n = number of replicates; means in a column followed by the same letter are not significantly different [p < 0.05, Kruskall-Wallis non parametric test (% larval mortality), one-way ANOVA (other parameters).

Acknowledgements

We thank Maria Belen Gallego Sanz for her valuable collaboration in the in vivo and in vitro rearing of the parasitoid and Hans-Peter Tschorsnig for identifying E. larvarum emerged from L. dispar in forest trials. This research was funded by the Italian Education, University and Research Ministry (ex-40%).

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 151-154

Frequency distribution of Malacosoma neustria (L.) egg masses and nests in cork oak forests*

Marcello Verdinelli 1, Pietro Luciano 2, Giuseppe Serra 2 1 Istituto per lo Studio degli Ecosistemi, CNR, sezione Ecologia Applicata e Controllo Biologico, via E. De Nicola, 07100 Sassari, Italy 2 Dipartimento di Protezione delle Piante, sezione di Entomologia agraria, via E. De Nicola, 07100 Sassari, Italy

Abstract : In order to define a reliable sampling method for defoliating moth, data on population density of Malacosoma neustria (L.) were collected. Wild M. neustria populations were monitored at seven field localities in the major cork oak forests of Sardinia, in the spring of 1998 and 1999. Egg mass and nest location on trees was analysed. An insect preference in laying the egg masses on the East and South facing side of the tree canopy was recorded. Nest distribution on the trees followed the same trend. The spatial distribution among trees was analysed taking into account the fitting of Poisson’s, Neyman’s and negative binomial mathematical models to the actual distributions. In all localities nests had a gathered distribution among trees while the egg mass location showed a different pattern. Taylor’s power law regression was used to determine sample size requirements necessary for estimating population average with two fixed levels of precision (D = 0.10; D = 0.25). At low egg mass density condition a high number of trees should be observed (D = 0.10; x = 0.5 ÷1 ; n = 370 ÷ 223). Using Taylor’s power law parameters at a precision level D = 0.25 with a population density of 1 egg mass per tree, it is necessary to examine 36 trees. The results obtained encourage us to suppose that the observation of a limited part of the tree offers reliable data to estimate the pest population density.

Key words: spatial distribution, sampling methods, sample size

Introduction

The common lackey moth Malacosoma neustria (L.) represents one of the most harmful pests of cork oak (Quercus suber L.) in Sardinia. The infestations turned out to be more significant in the presence of other moths; for this reason extended defoliations can occur throughout consecutive years (Luciano et al., 1982). Adequate sampling plans have not been developed for M. neustria populations on Q. suber, despite the importance of this insect and the large body of literature dealing with its biology, various control techniques and related economic damage. The lack of a reliable sampling plan has represented a hindrance for the studies aimed at basic ecological research and has delayed the development of pest management strategies. For this reason, studies were conducted to provide and compare intra- and inter- tree dispersion of egg masses and nests of M. neustria using three mathematical distributions. A methodology for sampling field populations of Malacosoma neustria on cork oak with fixed levels of precision is presented.

*Work supported by European Commission and Italian State under the Multiregional Operation Programme “Support Activities for Agricultural Services”, Project “Strategie difesa risorsa bosco in ambiente mediterraneo”.

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Materials and methods

The study was performed in three cork oak forests (Logudoro, SS; Nuorese, NU; Abbasanta, OR) of northern and central Sardinia, in the spring of 1998 and 1999. The sites were divided into seven sampling stations. In 1998 the research was carried out in stations I, II, III and IV; in 1999, the observations were conducted in stations III, IV, V, VI and VII. In the selected stations, and in at least 100 trees per station (in station IV and in 1998 only 15 trees were observed), the canopy of each tree was divided into four sections: North, South, East, and West, and the number of egg masses and nests found in each was recorded. The data (collected in all the stations) concerning the proportion of counts observed in each section of the canopy, were analysed with a Chi-squared test (P = 0.05) in order to test the distribution homogeneity at each of the stations. The spatial distribution of egg masses or nests (i.e. the elements of the sampling) observed among the trees (i.e. the units of the sampling) was analysed by fitting actual distribution to three different theoretical models: Poisson’s random distribution, Neyman’s contagious distribution in its simpler form (type A 2 parameters), and the model of binomial negative (Wadley, 1950). The probabilities, calculated with the three models, were used in order to determine the expected frequencies of trees with x egg masses or nests, by using the procedures described in Scossiroli et al. (1974). The fitting of the theoretical models to the observed spatial distribution in the field was verified with the test of the Chi-squared, by comparing the expected frequencies with those observed (p = 0.05). The index of dispersion was calculated by using Taylor’s power law ( s 2 = a + x b ) (1961). Coefficient a and exponent b were estimated by linear regression of log s2 on log x , where s2 and x are the variance and mean of the samples (number of egg masses or nests per tree), respectively. A detailed discussion about the biological significance of Taylor’s power law parameters is provided in Southwood (1978) and has not been included in the present work. Finally the same coefficients were also used to determine sample size requirements necessary for estimating population means (expressed by number of egg masses or nests per tree) with a fixed precision level, by employing the following formula (Green, 1970): ax (b−2) n = D 2 where a and b are regression coefficients obtained from Taylor’s power law. Precision was defined as D = s x / x , where s x is the standard error of x ; in the study values of D = 0.10 and 0.25 were used.

Results and discussion

The ordinal distribution of egg masses and nests within trees was not homogeneous at any of the stations (tab. 1, P < 0.01, Chi-squared test). At all the stations, the greatest proportion of egg masses and nests was found in the southern canopy section. Inter-tree dispersion of egg masses is summarised in table 2. In practical terms, the negative binomial model was always better than Poisson’s frequency distribution. Further- more, Neyman’s model did not show a significant deviation from the negative binomial in stations III and IV. For the other stations, the same analysis was not performed because the available data did not permit implementing a reliable analysis. The spatial distribution of nests follows an aggregate model (tab. 3). Neyman’s model proved to be more adaptable to the actual distribution of the nests found in stations III (1998-99), IV (1998) and VII (1999) while negative binomial is better in the stations I and II (1998), IV, V and VI (1999).

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Table 1. Proportion of egg masses and nests of common lackey moth observed in each section of the tree canopy facing the four ordinal directions

Egg masses Stations (* : in 1998, ** : in 1999) I* II* III* IV* III** IV** V** VI** VII** North 0.12 0.11 0.07 0.07 0.09 0.11 0.24 0.05 0 East 0.38 0.13 0.06 0.08 0.05 0 0.27 0.1 0.12 South 0.5 0.66 0.83 0.71 0.82 0.89 0.40 0.8 0.88 West 0 0.1 0.04 0.14 0.04 0 0.09 0.05 0

Nests Stations (* : in 1998, ** : in 1999) I* II* III* IV* III** IV** V** VI** VII** North 0.13 0.17 0.08 0.08 0.1 0.07 0.26 0.16 0 East 0.35 0.13 0.08 0.05 0.2 0.06 0.22 0.23 0.42 South 0.52 0.62 0.8 0.79 0.59 0.87 0.45 0.56 0.53 West 0 0.08 0.04 0.08 0.11 0 0.07 0.05 0.05

Table 2. Fitting of egg mass actual spatial distribution to Poisson’s, Neyman’s and negative binomial models (NB) (Chi-squared test, α = 0.05) and comparison between critical 2 Chi-squared values ( χ c ) and the values calculated with the data of the present study.

Station Trees (n) Egg masses (n) Chi squared values

(in 1998) Poisson 2 Neyman NB 2 χ c χ c II 115 47 18.42 3.84 4.32 3.43 3.84 III 185 46 2.42 3.84 0.96 0.28 3.84 IV 15 14 1.93 3.84 0.26 0.34 3.84

The analyses concur to assert that in all the localities the nests are not randomly distributed among the trees, and that the distribution model more adaptable is independent from the population density expressed as number of nests per tree. The number of trees to be examined is very high at a precision level D = 0.10 at low population density expressed in terms of egg masses per tree (D = 0.10; x = 0.5 ÷1; n = 370 ÷ 223); at a precision level D = 0.25 and with a population density of 1 egg mass per tree, it is necessary to examine 36 trees. However, if we accept a precision level D = 0.25 and consider a population density expressed in terms of number of nests per tree, at nest density comprised between 0.14 and 1.67 per tree (the extreme values registered in the biennium of observation) the number of trees to examine varies between 217 and 32, respectively. The survey of egg masses, certainly more expensive and time consuming, in low density conditions implies an increase of the sample size requirements. It was not possible to define with precision the relationship between the number of egg masses and nests that would concur to avoid the expensive monitoring of egg masses in the future.

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Table 3. Fitting of nest actual spatial distribution to Poisson’s, Neyman’s and negative binomial models (NB) (Chi-squared test, α = 0.05) and comparison between critical 2 Chi-squared values ( χ c ) and and the values calculated with the data of the present study.

Chi squared values Stations Trees Nests * : 1998 (n) (n) Poisson 2 Neyman NB 2 χ c χ c ** : 1999 I* 120 23 10.81 3.84 3.62 2.87 3.84 II* 115 146 44.59 7.81 28.68 0.29 7.81 III* 185 67 25.23 3.84 2.95 3.34 3.84 IV* 15 25 14.34 5.99 2.74 5.85 3.84 III** 292 89 70.78 3.84 5.49 19.69 5.99 IV** 110 15 8.56 3.84 0.14 0.04 3.84 V** 105 55 29.5 3.84 30.32 1.5 3.84 VI** 105 75 46.98 5.99 13.46 1.81 3.84 VII** 106 46 4.63 3.84 0.64 0.83 3.84

This method could be carried out during autumn and winter and, therefore, over a long period of time. In the spring, a monitoring of larval population and nests, easy to perform by unskilled workers, could complete the sampling plan. It would be particularly useful to continue the research in order to define sequential sampling methods that can supply profitable indications as to the population density of the insect. Future efforts should be aimed at reducing the surveys as well as estimating the risk of infestation.

Conclusions

The observations carried out in Sardinia in 1998-99 suggest that, in order to estimate the population abundance of Malacosoma neustria, the random sampling of branch tips (collected exclusively from the South facing portion of the canopy) and the count of egg masses per branch tip can be successfully employed.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 155-158

Spatial distribution and sampling of Tortrix viridana L. egg-clusters*

Giuseppe Serra 1, Pietro Luciano 1, Andrea Lentini 1, Gianni Gilioli 2 1 Dipartimento di Protezione delle Piante, Università di Sassari, via E. De Nicola, 07100 Sassari, Italy 2 Dipartimento di Agrochimica e Agrobiologia, Università di Reggio Calabria, P.zza S. Francesco di Sales, 4, 89061 Gallina di Reggio Calabria, Italy

Abstract: The spatial distribution of the egg-clusters of the green oak leaf roller moth, Tortrix viridana L., was studied in Sardinia on deciduous oaks stands during 1997-99. A sampling design to estimate the population density in extensive sampling survey based on the Kuno’s technique was reported.

Key words: aggregation, sample size, sampling methods, Tortrix viridana, Quercus pubescens

Introduction

Tortrix viridana L. (Lepidoptera Tortricidae) is one of the main oak defoliators in the Palearctic region and is capable of causing heavy defoliation over widespread areas in forest during the peak population years. To evaluate the insect abundance, some researchers have relied on sampling egg-clusters, adopting a variety of methods which are difficult to compare (Znamenskii & Polyakova, 1978; Horstmann, 1984; Du Merle, 1985; Roversi & De Silva, 1994). In order to assist in overcoming incongruities among the various methods used, a study was carried out in Sardinia based on the principles of sampling theory (Cochran, 1977) aimed at investigating the spatial distribution of the egg-clusters and defining a sampling design that can be used for their rapid monitoring.

Materials and methods

The surveys were conducted in woods of Quercus pubescens Willd. in central Sardinia. During the winter of 1997-98, 8 trees were chosen at random in three different locations and their canopy was subdivided into 3 height strata (1-3 m, 3-5 m and over 5 m) and into 4 quadrants (North, South, East and West). From each of the 12 sectors thus obtained, a terminal branch was removed comprising growth formed over the previous 4-5 years having 2, 3 and 4 year old twigs with a total extension of not less than 30 cm. In the laboratory egg- clusters were counted, the branch length measured and the number of buds counted. An assessment was then made of the correlation between the number of eggs either with the branch length or with the number of buds per branch. Finally, a 3 x 4 factorial ANOVA was used to detect significant differences in the egg density among height strata and exposure and their interaction analysed.

* Work supported by European Commission and Italian State under the Multiregional Operation Programme “Support Activities for Agricultural Services”, Project “Strategie di difesa della risorsa bosco in ambiente mediterraneo”.

155 156

During winter 1998-99, on eight sites which ranged from 300 to 1000 hectares, the following hierarchic sampling design was applied : l = 8 one-hectare plots per site; k = 8 trees per plot; q = 4 branches per tree. Plots, trees and branches were randomly chosen and egg- clusters were counted on the branches. During the surveys, carried out using an all-terrain vehicle, work time for a 2 person team achieving the following tasks was recorded: c1 plot identification time; c2 tree identification time; c3 branch removal and laboratory inspection time. The spatial distribution of egg-clusters was analysed using “Taylor’s Power Law” (TPL) (Taylor, 1961) and “Iwao’s Patchiness Regression” (IPR) (Iwao, 1977). TPL and IPR indices were calculated for the three hierarchic sampling levels grouping data from the eight sites. The existence of significant differences in egg-cluster density was evaluated for each site using a nested ANOVA; for this analysis raw data were transformed using the function: y=x1- b/2 (Southwood, 1978). For each site the accuracy (provided by the adopted sampling design) of the estimate of egg-cluster density and the optimum allocation of sampling effort were evaluated using the model proposed by Kuno (1976) based on the relationship between mean and mean-crowding. The accuracy provided by the sampling was calculated using the 2 2 2 2 2 2 formula: D = ()sbI + (sbII + se /q)/ k / l x where s e, s bII, s bI, represent the variance components respectively for branches, trees and plots. The optimum allocation of sampling effort between the three spatial levels was evaluated using the cost function:

Ctot = c1 l + c2 lk + c3 l k q . For each site the optimum number of branches

2 2 2 2 (qopt = ()se /sbII ⋅ ()c2 /c3 ) and trees (kopt = (sbII /sbI )⋅ ()c1 /c2 ) to be sampled was first calculated. Lastly, the optimum number of plots was determined using 2 2 2 2 lopt = ()sbI + ()sbII + se / q′ / k′ ()xD where q’ and k’ are the average values of qopt e kopt calculated for each site. The allocation of effort was assessed for intensive sampling by setting a standard error of 10% of the mean, and for extensive sampling by applying standard error values of 20 and 25% (Southwood, 1978).

Results and discussion

First year observations revealed the average presence on the branches of 0.45 to 0.64 m 2-4 years old twigs suitables for oviposition and an average number of buds slightly over 80. The average number of egg-clusters per branch on two sites was approximately 10 and on the third approximately 20. The results proved that the number of egg-clusters per branch had correlation neither with the branch length (r² = 0.094) nor with the number of buds per branch (r² = 0.093) as indicated by the low values of the determination coefficients. The factorial ANOVA did not reveal significant differences on the egg-cluster distribution within trees either considering the three height strata, the four quadrants or through interaction between the two stratifications (Serra et al., 2000). The females of T. viridana do not therefore appear to show a preference for any sector of the canopy. Second year samplings were carried out in an interval of population abundance approximately ranging from 2 to 8 egg-clusters per branch (tab. 3). The pattern of the distribution evaluated using TPL and IPR showed an aggregated distribution both at the spatial level of branches within tree and trees within plot (values of b and β significantly higher than 1). Analysis instead indicated the presence of a random distribution on plots within site (b and β not significantly different from 1) (tab. 1). Nested analysis of variance indicated in six of the eight sites significant differences in mean density of egg-clusters between plots (tab. 2). On the lower hierarchic level (between trees) significant differences

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emerged only in half of the sites while in the remaining four no significant difference was apparent in the egg-cluster density (tab. 2). The results obtained through the nested ANOVA thus provide an extremely dissimilar representation of the distribution of egg-cluster density: while one site in fact shows no significant differences either between trees or plots, three sites revealed differences at both spatial levels (tab. 2). The T. viridana population therefore appears to follow an aggregate distribution pattern at branch and tree level and a random distribution at plot level. The results of nested ANOVA point instead to an increase in the variability of egg-cluster density per branch as the spatial level increases.

Table 1. Indices of aggregation of T. viridana egg-clusters at the three spatial levels.

Spatial level n† TPL IPR ln(a) b r2 α ß r2 - branches within tree 503 0.082 1.389* 0.64 0.040 1.336* 0.80 - trees within plot 64 -0.480* 1.435* 0.77 -0.327 1.146* 0.94 - plots within site 8 -0.612 1.221 0.40 -0.333 1.053 0.94 † zero excluded; * ln(a) and α significantly different from 0, b and ß significantly greater than 1.0, (t- test; P ≤ 0.05 ).

Table 2. Results of nested ANOVA performed on the number of egg-clusters per branch obtained for the eight sites.

Site Mean Square F-value Plot Tree Branch Between plots Between trees M.te S. Antonio 3.76 0.50 0.41 7.50** 1.23 Frida 4.08 0.52 0.38 7.89** 1.37 Cherchelighes 0.65 0.52 0.38 1.26 1.36 Sedda e Rughes 2.31 0.56 0.27 4.14** 2.09** Passo Caravai 2.07 0.32 0.23 6.54** 1.36 Scala Pezzos 2.55 0.32 0.22 8.02** 1.43* Padru Mannu 1.61 0.36 0.21 4.48** 1.70** Pratobello-Olai 0.60 0.49 0.22 1.22 2.20**

* significant difference at 5% (α = 0.05: F7;56 = 2.18; F56;192 = 1.40); ** significant difference at 1% (α = 0.01: F7;56 = 2.98; F56;192 = 1.60).

Table 3. Average number of egg-clusters ( x ) (± standard error) and accuracy (D) provided by

the sampling design applied. Number of plots (lopt ) to sample for three levels of accuracy using a sampling design based on q’ = 2 branches per tree and k’ = 4 trees per plot.

Site x ± se D (%) Plots (lopt) D = 0.25 D = 0.20 D = 0.10 M.te S. Antonio 1.93 ± 0.19 23.3 11 17 67 Frida 3.15 ± 0.25 23.0 9 14 56 Cherchelighes 3.33 ± 0.22 10.4 4 5 20 Sedda e Rughes 5.45 ± 0.31 13.3 4 6 22 Passo Caravai 6.07 ± 0.36 14.4 4 6 25 Scala Pezzos 6.69 ± 0.42 19.5 6 10 38 Padru Mannu 6.75 ± 0.35 15.2 4 6 24 Pratobello-Olai 7.82 ± 0.40 8.3 2 3 13

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The reliability of the adopted sampling design, evaluated according to the procedure proposed by Kuno, varied over the sites between 8.3% and 23.3% and appeared correlated with the egg-cluster density (tab. 3). The average times of the survey team for the removal and inspection of branches were: c1 = 0.11 hours; c2 = 0.025 hours; c3 = 0.075 hours. These average times were used to establish the optimum allocation of sampling effort which provided the following results: the number of branches to remove per tree (qopt) was 2 on all sites; the number of trees to sample per plot (kopt) however varied from a minimum of 2 to a maximum of 7 with an average value of 4. The number of plots to sample per site (lopt), calculated using the values q’ = 2 and k’ = 4 is indicated in table 3 where it can be noted that the average value is 5 units with an accuracy of 25%, 8 units if the required accuracy is 20% and 32 for the greatest level of precision.

Conclusions

The results of our observations suggest that, in order to achieve reliable estimates of the T. viridana egg-cluster density, it is sufficient to remove 4-5 year-old branches regardless of their height and exposure in the canopy, and simply to carry out an egg-cluster count disregarding the length of the branches themselves. As far as the optimum allocation of sampling effort is concerned, with regard to the number of branches to examine, it has been estimated that when using extensive sampling on areas up to 1000 ha it is sufficient to examine 40 branches from 5 plots of one-hectare, removed from 4 trees per plot, taking 2 branches per tree, selecting all elements on a random basis. These results are of particular importance since they were obtained during years in which T. viridana showed a low or medium abundance. The improved sampling design will be particularly helpful, without employing a high workforce, in pointing out the start of the progradation phase of much- feared T. viridana infestations and may be employed with good results in planning the integrated pest management.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 159-162

Gall inducing insects associated with oak trees (Quercus spp.) in Portugal

Maria Lurdes Inácio, Pedro Naves, Monica Moreira, Edmundo Manuel Sousa Estação Florestal Nacional, Departamento de Protecção Florestal, Quinta do Marquês, 2780 Oeiras, Portugal

Abstract: A total of 240 gall midge species (Diptera: Cecidomyiidae) are known from the Iberian Peninsula, among which 118 were reported from Portugal. However, only six of them have been recorded associated with the cork oak Quercus suber L. or the holm oak Quercus ilex L. (=Q. rotundifolia Lam.). After the death of Tavares in 1934, practically no one studied the gall midge fauna in Portugal, whereas in Spain and other European countries several papers concerning this group were published since. The gall wasps (Hymenoptera, Cynipidae) are another important group of gall inducing insects, with 86% of the species affecting different Quercus species. In this work, we report an intense attack of the gall midge Dryomyia lichtensteini (F. Löw) on green oak in the Alentejo region. A brief review of the available literature of the gall midge and gall wasps associated with Quercus spp. in Portugal is also presented.

Key words: Dryomyia lichtensteini, Cecidomyiidae, Cynipidae, Portugal, Quercus.

Introduction

Several groups of insects and mites are capable of inducing gall formation on various plants (Aldrey & Ibañez, 2000). Among the most important groups affecting oak trees are the gall midge (Diptera, Cecidomyiidae) and the gall wasps (Hymenoptera, Cynipidae) (Villemant & Fraval, 1991). Until 1900, few studies concerning gall midges and their galls were conducted in the Iberian Peninsula. Trotter was one of the first to study cecidomyiids in this region and the results concerning Portugal are summarized in Trotter (1899, 1900, 1902). The great Portuguese entomologist, Prof. Joaquim da Silva Tavares, published many papers dealing whit gall midges and gall wasps (Tavares, 1902-1930). He can be considered the founder of Cecidology in the Iberian Peninsula and his work still remains valid (Aldrey, 1985; Skuhravá et al., 1996). Since, there’s no Portuguese experts on this subject and, excepting for a few papers from foreign authors, this interesting group hasn’t been studied in this country.

Gall midges (Diptera, Cecidomyiidae)

The gall midge fauna may be evaluated by its larval feeding habits (Skuhravá et al., 1984). The cecidomyid species found in the Iberian Peninsula belong to two groups: the first, including the majority of the species, comprises both gall inducers and inquilines in the galls produced by other insects; the second group includes the zoophagus species (Skuhravá et al., 1996). 240 gall midge species are recorded for the Iberian Peninsula, with 118 described from Portugal. It is interesting to note that the number of species recorded from Portugal is rather high compared with that found in Spain which is two and half times bigger than Portuguese territory.

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Among the best-explored areas in Portugal are the Lisbon area (36 gall midge species reported), Serra da Estrela and Covilhã (38 species) and the Gerês National Park (40 species). Between 5 and 20 species are known from the rest of the country : Portimão, in the south; Torres Vedras, Porto, Castelo Branco, Fundão e Coimbra in the central area; Braga and Monção and several other localities in the north (Skuhravá et al., 1996). Some of these areas have important oak stands. In 2000 a severe attack of Dryomyia lichtensteini in Q. ilex was recorded in Southern Portugal (Alandroal, in Alentejo province). The trees, more than 100 years old, were decaying and dying from unknown causes, probably induced by a complex of biotic and abiotic factors related to the deficient soil conditions. All the adult trees exhibited a very high attack of D. lichtensteini with practically all the leaves covered by numerous small galls. Apparently, this species benefited from the poor sanitary condition of the trees, and developed a huge population in the area. Although it is common to find galls of Cecidomyiidae and Cynipidae in Portuguese oaks, it is rather unusual to observe such an intense attack. A brief update of the available scientific literature didn’t reveal any reports of a similar attack occurring in the last years in Portugal. Saliva produced by the feeding larvae of this species apparently induces the host plant to form gall tissue (Hill, 1994). The D. lichtensteini galls are round shaped (an average of 4 mm long, 2 mm width), covered by a white, smooth pubescence and are located at the downer limb leaf. The unique larva develops totally inside the gall. The adults fly from May to August and the egg laying take place just after the hatching. The new galls produce adults only the next year (Villemant & Fraval, 1991). D. lichtensteini is one of the five species of gall midges associated with Q. ilex in Portugal (tab. 1). This group is taxonomically very complex. The family is easy enough to recognise but the genera and species usually require an expert taxonomist for identification. Generally, the field entomologist relies on the body colour of the insect together with host plant identity and the type of gall formed to achieve a correct identification.

Table 1. Gall midge species associated with oak trees in Portugal (adapted from Skuhravá et al., 1996).

Gall midge specie Principal host tree in the Iberian Peninsula Blastodiplosis cocciferae Tavares Quercus coccifera L. and Q. ilex L. Contarinia ilicis Kieffer Q. ilex C. luteola Tavares Q. ilex C. quaesita Tavares Q. robur L. Dasineura ilicis Tavares Q. rotundifolia Dryomyia cocciferae Marchal Q. coccifera D. lichtensteini F. Löw Q. ilex and Q. suber L. Macrodiplosis dryobia F. Löw Q. robur L., Q. faginea Lam., Q. pyrenaica Willd. M. volvens Kieffer Q. robur

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Gall wasps (Hymenoptera Cynipidae)

The Cynipidae are the true “gall wasps” and the plants attacked are mainly ornamentals (notably Rosa spp.) or Fagaceae (namely oak trees). It has been estimated that 86% of these gall wasps occur on Quercus, and are confined to this genus (Hill, 1994). The majority of oak galls are very conspicuous and distinctive, and some are detrimental to the host, notably those destroying the seeds (acorns) which can prevent regeneration of natural oak forest. In spring generally, the female wasp lays her egg into the growing host plant tissues, using the ovipositor. The gall is formed as a result of the feeding activity of the young larva stimulating the cambium tissues. Most of the galls are unilocular with only one larva per gall. Many oak cynipids show an alternation of generations, with an asexual (agamic) overwintering generation followed by a bisexual generation in the summer, living either on different parts of the same host or on different hosts. Galls of the asexual generation develop slowly and the larvae emerge in the spring of the following year (sometimes one or two years later). The insects of different generations are often quite different in appearance (Aldrey, 1981). In the Iberian Peninsula occur 10 genus associated with Quercus, each one including species attacking one or several different oaks (Table 2). Several of these species regularly occur in oak forest all over the country, and although they sometimes can be found in large numbers they don’t seem to cause serious damage to their host trees. The evaluation of our present knowledge shows that an update on the knowledge of this interesting group is needed, and an intensive survey of the gall fauna in the country, one hundred years after the death of Tavares, is quite desirable.

Table 2. Gall wasp genus associated with oak trees in the Iberian Peninsula (adapted from Aldrey, 1987). Gall wasp genus Principal host tree Neuroterus Q. robur, Q. pyrenaica, Q. faginea, Q. suber Cynips Q. robur, Q. pyrenaica, Q. faginea Trigonaspis Q. pyrenaica, Q. faginea Biorhiza Q. robur, Q. pyrenaica, Q. faginea Callirhytis Q. pyrenaica, Q. faginea, Q. suber, Q. ilex Plagiotrochus Q. suber, Q. ilex, Q. coccifera Andricus Q. robur, Q. pyrenaica, Q. faginea Synophrus Q. suber Saphonecrus Q. robur, Q. pyrenaica, Q. faginea, Q. ilex, Q. coccifera Synergus Quercus spp.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 163-167

Effect of insect predation on the quality and storage conditions of acorns of cork oak (Quercus suber L.)

Manuela Branco, Carmen Branco, Hachemi Merouani, Maria Helena Almeida Centro de Estudos Florestais, Instituto Superior de Agronomia, Tapada da Ajuda 1349-018, Lisboa, Portugal

Abstract : The present study focused on the importance of insects in damaging Quercus suber acorns both immediately after harvesting and during storage (0ºC), and on assessing the influence of exposing acorns to heat treatment, i.e. water bath at 45ºC, on insect survival and seed performance. Seed performance was assessed by analysing moisture content and embryo electrolyte leakage on recently treated acorns and by determining seed germination and seedling dry mass from stored acorns.. The percentage of insect attacked acorns was high but differed according to harvest periods, averaging 56% in November and 33% in December. Damage due to larvae feeding activity persisted during storage, particularly for the weevil Curculio elephas. On the other hand, heat treatment proved to be very efficient in controlling insects, accounting for 100% of larvae mortality. Our results evidenced that heat treatment does not affect embryo quality, seed germination and seedling growth of Q. suber.

Key-words : acorns, insect damage, storage, heat treatment, Quercus suber.

Introduction

Cork oak, Quercus suber L., is one of the major forest species in Portugal; its importance is justified not only for economic but also for sociological and environmental purposes Yet, a large proportion of cork oak stands are old, which explains the state and forest owners’ efforts focusing on its natural and artificial regeneration. Several biotic factors contribute to a large proportion of damaged acorns. Insects are one of the most important damaging agents on acorns of several Quercus species (Andersson, 1992; Bakry et al., 1999; Fukumoto & Kajimura, 2000). For seedling production in nurseries, problems with the insects persist during storage. In fact, to maintain a regular seedling production in the proper timing, acorns need to be stored for several months. Furthermore, Q. suber seeds are recalcitrant, so they need to be stored with relatively high moisture content and not very low temperatures (Kozlowski & Pallardy, 1997). Optimal storage conditions to obtain high quality Q. suber seeds are reported to be about 0-2ºC and 40-42% of seed moisture content (Merouani et. al, 2001). These storage conditions raise the question about the possibility of insects survival and feeding during storage, thus implying further damage to stored acorns. The use of heat treatment, i.e. water bath at 45ºC, has been advised as an adequate and ecological sound control measure, particularly for preventing fungi damage as well as insects injury during the storage of acorns (Delatour & Morelet, 1979). However, the possibility of heat treatment affecting seed quality has arisen (Crocker et al., 1987). Objectives of this work were : 1) quantify and compare insect damage to cork oak acorns in different habitats, 2) determine insect survival and feeding activity during storage of acorns, 3) assess the influence of exposing acorns to heat on insect survival and seed quality.

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Materials and methods

Field experiments were conducted in 3 Q. suber stands with different stand substrata (natural flora, permanent pasture and cereal) in the South of Portugal (38º33’N, 8º 42’W). To quantify insect infestation, on each stand 1000 mature acorns were collected from 5 randomly selected trees, by using nets under the canopy, at two harvest periods, November and December, 1998. Acorns were carefully observed under a binocular microscope. Crop size was evaluated on each stand by estimating tree density and the number of acorns produced on 15 random trees. Heat treatment consisted in immersing fresh acorns, with no holes, in a water bath at 45ºC, for 2 hours. Larvae mortality was recorded after treatment by observing about 200 acorns. To assess the influence of exposing acorns to heat on seed quality, the moisture content (MC) of acorns and the Electro-conductivity (REL) of embryo were determined on treated and untreated acorns. The MC were determined on 3 replicates of 25 acorns (for whole acorn) and of 10 acorns (for embryo, pericarp and cotyledons) by using dry weight after oven drying for 17 h at 103ºC (International Rules for Seed Testing, 1985). REL from individual embryo axis was determined on 15 replicates using the relative conductivity method (Vertucci, 1989). To analyse the effect of heat treatment during storage lots of treated and untreated acorns were stored in polyethylene bags (30 µm thick) at 0°C, 40% of acorn moisture content. Acorns submitted to heat treatment were rapidly dried at 30°C and 30% RH. Seed germination and seedling dry mass were evaluated after 2, 4 and 6 months of storage Germination tests were performed on 25 acorns with four replicates from each group. Before germination acorns were soaked for 48 h at 20ºC. Acorns were placed in the dark at 20ºC in moist heat-sterilised sand with a solution of thyram (1,5 g/l) to germinate. Acorn germination, i.e. when the radicle protruded, was recorded every 2 or 3 days. After germination acorns were transplanted to polythene bags (30 cm x 15 cm) filled with sand and peat. Sowed seeds were placed in a chamber at 65% RH, 350ppm CO2, 25ºC for 10h/day light and 18ºC for 14h/day dark. Ninety-five days later seedling were harvested and root and stem and leaves dry mass were determined after drying at 80ºC during 48h. The effect of storage conditions on the development of insects was studied by storing four lots of about one hundred acorns with no holes. Each lot of acorns was observed after 11, 22, 47 and 91 days of storage. The presence of larvae, their vitality and developmental stage were registered. Acorns with holes were also counted. Excrements allowed to distinguish acorns with holes that had been attacked by larvae of weevils or tortricidae. Tukey´s HSD test was used for comparison between group means. For comparing percentage of germination and mean germination time the Mann-Whitney U test was used.

Results

Intensity of damage caused by insects A higher proportion of insect attacked acorns was observed on the first period, on average 56%, whereas on the second harvest period the proportion decreased to 33%, presenting a significant effect of harvest period (F1,24 =17.56, P<0.01). Yet, no significant differences between stands were observed (F1,24 =3.01, P=0.07) and no interaction was observed between stand and harvest period (F1,24 =0.68, P=0.52). Otherwise, the acorn crop size, expressed by the average number of acorns produced per tree (173 ± 25, 1656 ±107, 738 ± 74) and thus the number of attacked acorns per ha (7 378, 74 619, 39 262) differed largely on the three stands, i.e. cereal, pasture and natural flora, respectively. Acorns on all stands were mostly infested

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by the weevil Curculio elephas. Yet, larvae of tortricidae moths (Cydia sp.), mainly Cydia splendana, were also found at an average rate ranging from 1 to 11% (tab 1).

Table 1. Percentage of insect attacked acorns (average ± SD) and occurrence of each pest (%). Stand 1st harvest 2nd harvest substrata Infested acorns C. elephas Cydia sp. Infested acorns C. elephas Cydia sp. Cereal 50.7 ± 5.0 95.1 4.9 34.6± 7.5 99.3 0.7 Pasture 52.9 ± 6.2 93.2 6.8 22.2± 6.8 92.3 6.7 Natural flora 63.2 ± 5.6 89.1 10.9 43.2± 7.6 90.0 10.0

Effect of heat treatments on larvae mortality and seed quality Heat treatment proved very efficient in controlling insects on harvested acorns, 100% of larvae mortality was observed from a total of 112 insects. No detrimental effect due to heat treatment was observed both on recently treated acorns or after treated acorns had been submitted to storage. MC of acorns and embryo electrolyte leakage did not differ between recent treated and untreated acorns (fig. 1). After 6 months of storage the two groups still show similar performance. The germination rate was very high, about 98 and 90%, respectively for treated and untreated acorns (tab 2). Also, no difference on seedling dry mass was observed between the two groups. On the contrary, treated acorns showed a better performance than controls considering germination rate and seedling dry mass parameters after 2 and 4 months of storage which can be ascribed to the presence of insect infested acorns on the untreated groups (tab 2). For stem and leaves and roots dry mass, no interaction was found between storage and heat treatment, P= 0.278 and 0.609, respectively.

Fresh acorns % 70.0 a a 60.0 a b Heat treated acorns aa 50.0 a a 40.0 aa 30.0 20.0 10.0 0.0 Acorn MC Pericarp MC Cotyledons Embryo MC Embryo EL MC

Figure 1. Comparison of average (± SD) moisture content (MC) of whole acorns and its components and embryo electrolyte leakage (EL) on fresh and heat treated acorn. Bars with the same letter are not significantly different (P = 0.05).

Effect of storage conditions on the development of insects Larvae of C. elephas remained active during storage with a low rate of mortality under 10%. After 3 months of storage, about 70% of the larvae had completed their larval stage

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successfully opening holes in the acorns. Also, during the first four weeks the percentage of third and fourth instar larvae increased with time accounting for by a decrease in the percentage of young larvae. On the other hand, larvae of Cydia sp. did not develop as well during storage. Even so, only 25% of larval mortality was observed after 3 months of storage. Moreover, the percentage of acorns with holes due to the activity of larvae, increased only slightly, up to 35%, and the percentage of larvae in each developmental stage remained almost constant, showing that an important part of this population may not be active during storage.

Table 2. Mean germination time (MGT), percentage of germination and dry mass parameters on heat treated and control groups of acorns after 2, 4 and 6 months of storage (average ± SD). Group means with the same letter are not significantly different (P = 0.05).

2 months 4 months 6 months MGT treated 4.14a ± 0.17 3.77a ± 0.33 4.18a ± 0.34 untreated 5.36a ± 0.26 3.55a ± 0.33 4.27a ± 0.48 % germination treated 100a ± 0.00 99a ± 0.87 98a ± 1.73 untreated 94b ± 3.00 97a ± 1.66 90a ± 3.61 Roots dry mass treated 0.77a ± 0.04 0.94a ± 0.05 0.92a ± 0.04 untreated 0.65b ± 0.04 0.81a ± 0.05 0.87a ± 0.05 Stem and leaves treated 1.23a ± 0.07 1.86a ± 0.10 1.35a ± 0.07 dry mass untreated 1.14a ± 0.09 1.51b ± 0.12 1.22a ± 0.07

Discussion

The percentage of infested acorns in the field was surveyed in three stands with different substrata and was consistently high, on average above 50%, which concords with the importance of insect attacked acorns to Quercus species reported by other authors (Vazquez, et. al, 1990 ; Andersson, 1992 ; Herrera, 1995). Differences in the proportion of insect attacked acorns were observed considering two harvest periods. Acorns in the first harvest period were more intensely attacked than in the second period which is, therefore, more advantageous for acorn collecting. We also found a very low number of attacked acorns per hectare in the stand with cereal. This result is compatible with the fact that soil mobilisation destroys pupae on the ground and thus may decrease weevil population. Yet, the result may also be related to the low acorn production observed on the stand, consequently attracting few weevils to the area. Heat treatment proved to be very efficient to control insects on harvested acorns, as 100% of larval mortality was observed. As opposed to findings of Crocker et al (1987) for Q. virginiana, our results evidenced that heat treatment does not affect embryo quality, seed germination and seedling growth of Q. suber. Furthermore, heat treatment did not influence the way acorns responded to storage conditions. On the other hand, damage due to larvae feeding activity persisted during storage in the conditions tested, particularly for the weevil C. elephas. So we maintain that to avoid increasing damage during storage acorns should be treated against insects. Heat treatment may also be prescribed for germination of fresh acorns since insects inside acorns may continue to feed on endosperm while seeds are germinating.

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Acknowledgements

This work was carried out with financial support from the EC FAIR RTD progr., CT97-3480.

References

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Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 169-174

Importance des milieux aquatiques temporaires associés à la subéraie des Zaërs (Maroc)

Fatima Agtay Ecole Normale Supérieure de Casablanca, Département de Biologie (Ecologie), BP. 9172, Mers Sultan, Maroc

Résumé : Du fait de son appartenance à l'étage bioclimatique semi-aride, la subéraie des pays Zaërs souffre depuis quelques décennies de mauvaises conditions climatiques, surtout dans la région de Ben Slimane près de Casablanca où la forêt est, en outre, soumise à une forte pression anthropique. Ces conditions défavorables sont toutefois localement atténuées par la présence de dayas (mares temporaires). Les dayas, en stockant l'eau, permettent en effet à la subéraie de profiter d’un apport prolongé d’humidité au début de la saison sèche ; elles contribuent aussi à un important enrichissement faunistique de l’écosystème forestier. Cette étude met l'accent sur la contribution des dayas de la région de Ben Slimane-Sidi Bettache à la biodiversité de la subéraie.

Mots clés : Quercus suber, forêt, daya, faune ripicole, arthropodes, Ben Slimane, pays Zaër, Maroc.

Introduction

Le domaine mesetien forestier des pays Zaërs est parsemé de milieux humides temporaires, ou dayas, d'étendue et de profondeur variables. Sept de ces dayas ont été suivies dans la région de Ben Slimane-Sidi Bettache. Dans cette région semi-aride, les précipitations annuelles ne dépassent pas 500 mm et les dayas (à fond limono-argileux) sont inondées normalement entre novembre et juin-juillet. La phase humide (de 1 à 8 mois) et la hauteur d'eau maximale (de quelques centimètres à 60 cm) varient suivant les dayas et les années. Ces dayas sont souvent fréquentées par les populations riveraines qui viennent y chercher du pâturage pour leur bétail et de l’eau (abreuvoir, lavoir public). Certaines subissent en outre une pression agro-anthropique très forte : agriculture, urbanisation, dépôts d'ordures (Agtay, 1999, 2001a, 2001b). Bien qu’ayant, selon certains gestionnaires forestiers, des impacts négatifs sur la forêt et sur l’homme (dégradation du sol, foyer de moustiques), ces mares temporaires sont pour de nombreux chercheurs d'un intérêt patrimonial évident (Titolet & Rhazi, 1999). A cette dernière conclusion concourent plusieurs recherches effectuées dans ces milieux à partir de 1980 sur la végétation (Cuzin in Agtay 2001a ; Marque, 1986 ; Metge, 1986), en hydrobiologie (Metge, 1986 ; Ramdani, 1986), et sur les peuplements ripicoles (Agtay, 2001a), dans le cadre l'Action Intégrée franco-marocaine AI 44. Le présent travail met l'accent sur l’importante contribution des dayas, et tout particulièrement des milieux rivulaires associés, à la richesse et au maintien de la biodiversité de l’écosystème forestier dans cette région.

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Matériel et méthodes

Les dayas prospectées, trois à Ben Slimane et quatre à Sidi Bettache, diffèrent principalement par leur localisation en milieu agro-pastoral, forestier ou périurbain et, pour les dayas forestières, par leur enfoncement plus ou moins profond à l'intérieur de la subéraie (tab. 1). Elles ont fait l'objet d'une étude pluridisciplinaire globale programmée dans le cadre de l'A I 44. Les recherches entreprises sur plusieurs cycles annuels inclus dans la période 1980-1995 ont concerné le milieu aquatique, les rives et les microbiotopes associés, ainsi que la lisière forestière limitrophe (tab. 2).

Tableau 1 : Principales caractéristiques des stations d'étude

Région Daya Environnement Densité Anthropisation de la forêt Nature Intensité D1 Subéraie ++ Abreuvoir, pâturage, drainage ++++ DA Subéraie ++ Abreuvoir + Ben Slimane DB Milieu périurbain et + Abreuvoir, pâturage, dépotoir, ++++++ périforestier surfréquentation D2 Milieu agropastoral – Culture à partir de 1983 +++++ D3 Milieu agropastoral – Lavoir public, abreuvoir, pâturage +++ Sidi Bettache D4 Subéraie ++++ Abreuvoir, pâturage + D5 Subéraie +++++ Abreuvoir* + * la daya D5 subit en plus l'impact des sangliers.

Les recherches ont porté d’une part sur les caractéristiques du milieu (climatiques, morphométriques, pédologiques et hydrobiologique) et d’autre part sur le peuplement arthropodien. Parmi les descripteurs du milieu, certains ont été suivis régulièrement, en même temps que les prélèvements de faune ; c'est le cas de la température, l'humidité et la matière organique du sol. L'humidité édaphique en particulier a été déterminé par différence pondérale entre les échantillons de sol humides et les mêmes échantillons séchés à 105°C pendant 48 heures. La faune a fait l'objet de prélèvements mensuels ou bimensuels, qualitatifs et quantitatifs. Les prélèvements de faune ripicole ont été effectués en bordure d'eau, sur une bande de 0,5 m de large sur x 10 m de long.

Résultats et discussion

Principales caractéristiques des milieux étudiés L'étude des descripteurs abiotiques a été développée dans plusieurs travaux sur ces milieux (Agtay, 1991, 1999, 2001). L'analyse des descripteurs abiotiques a permis d'établir une typologie des stations qui révèle une relation évidente entre l'épaisseur du sol de la dépression, sa teneur en eau et le milieu environnant (Agtay, 2001a). Les stations se répartissent ainsi en 2 groupes :

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– des dayas imperméables dont le sol épais demeure longtemps humide pendant la phase d’assèchement ; les principales dayas de ce groupe sont DA, D4 et DB. – des dayas perméables dont le sol, mince, s'assèche rapidement. Les stations les plus affines de ce goupe sont D1 et D3. Au niveau des dayas forestières, la teneur en eau du sol augmente avec la densité de la forêt environnante. D’autre part, l'humidité édaphique en forêt paraît liée à la durée de mise en eau et à l'épaisseur du sol de la daya voisine. Celle-ci contribue localement à un prolongement de l’apport d’humidité (Agtay, 2001a).

Importance de la faune inféodée aux rives. Le suivi des stations pendant plusieurs cycles annuels (tab. 2) montre la richesse des peuplements floristiques et faunistiques des dayas prospectées et l'importance relative de la faune inféodée aux rives.

Tableau 2. Richesse spécifique des dayas du domaine forestier des pays Zaër

Peuplement Richesse Nb de dayas Référence Période d'étude spécifique étudiées

Végétation Algues 104 3 Marque, 1986 1984-1985 Phanérogames 93 7 Metge, 1986 1982-1984

Faune Aquatique 108 7 Metge, 1986 1982-1984

Ripicole 460* 7 Agtay, 2001 1982-1985 1994-1995 * : 457 des 60 espèces ont été capturées pendant la période 1982-1985

Les 460 espèces collectées en milieu rivulaire sont des Arthropodes représentant 19 ordres parmi lesquels celui des Coléoptères est le plus diversifié (337 espèces dont 259, soit 41 160 individus proviennent des relevés quantitatifs). Plusieurs nouvelles espèces ont été découvertes au cours de cette étude, deux étaient nouvelles pour la science : le Staphilinidae Xantholinus poneli Coiffait, 1985 et l'Anthicidae Microhoria (Immicrohoria) agtayi Bonadona, 1986 et une autre nouvelle pour le Maroc : le Staphylinidae Paragabrius fagniezi Jarrige. D'autres espèces, comme le Paederidae Lathrobium negrei Jarrige, étaient nouvelles pour la région des Zaërs (Agtay, 2001a) Au niveau stationnel (tab. 3), les peuplements les plus abondants et les plus diversifiés correspondent aux dayas les moins anthropisées (cf. tab. 1) et, parmi celles-ci, à celles qui demeurent le plus longtemps inondées et surtout à celles dont le sol est épais (Agtay, 2001a). Les deux dayas les plus riches en faune sont forestières, une petite (DA) à Ben Slimane et une grande (D4) à Sidi Bettache. Ces dayas diffèrent par leur étendue, leur situation géographique et leur environnement, D4 étant bien enfoncée dans la forêt et DA plus périphérique, mais toutes les deux sont imperméables et ont un sol épais. Un sol épais assure le maintien d'une humidité résiduelle relativement élevée, favorise le développement de la végétation et la constitution de micro-milieux refuges pour la faune (fentes de retrait, monticules,...).

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Apport faunistique du milieu forestier limitrophe Parmi la faune ripicole réunie au cours de la période 1982-85, 105 espèces (dont 69 sont des Coléoptères) sont communes avec le milieu forestier. Ces espèces ont été observées dans la litière (Agtay, 1991 ; Mahari, 1992) ou dans les dendrotelmes (Agtay, 1991) ou ont été signalées de ce milieu par d'autres auteurs (in Villemant & Fraval, 1991)

Tableau 3 : Importance du peuplement de Coléoptéres ripicoles (relevés quantitatifs, 1985)

Région Daya Richesse spécifique Effectif D1 86 1 921 DA 107 5 582 Ben Slimane DB 24 215 D2 30 333 D3 81 4 596 Sidi Bettache D4 116 7 376 D5 63 2 116 Total 168 22 139

Parmi les espèces les plus fréquentes citons : Scarites occidentalis Bedel, Steropus globosus (F), Conosoma cavicola Scriba, Thorectes distinctus Marseul, Pachychila punctata mamorensis Antoine, Labidostomis taxicornis F. et Dasytes terminalis J. Duval. L'importante représentation des espèces forestières en milieu de rive paraît liée à la sécheresse qui s’est abattue sur le pays pendant la période d'étude. Les déplacements faunistiques observés entre les rives des dayas et le milieu forestier limitrophe, et dont le sens dépendrait de l'humidité édaphique de ces biotopes, paraissent influencés par le climat général. (Agtay, 2001a). La sécheresse provoquerait la migration d'une partie de la faune du milieu forestier vers la dépression encore en eau ou en début d'assèchement, qui, de ce fait, présente de meilleures conditions hygro-thermiques que la forêt. Lorsque la dépression est totalement sèche, les déplacements faunistiques se font en sens inverse : de nombreuses espèces ripicoles sensu lato quittent le milieu de rive et vont coloniser des micro-milieux plus favorables en forêt, les dendrotelmes par exemple (Agtay, 1991).

La faune des microbiotopes associés aux rives Les dayas interviennent également dans la biodiversité de l'écosystème forestier par le biais des microbiotopes associés aux berges dont les plus caractéristiques sont les bouses et les dépôts d'ordures. Ces biochores se distinguent en effet, par leur fonctionnement relativement indépendant du milieu général et par leurs peuplements originaux (plusieurs dizaines d'espèces d'Arthropodes) qui, dans le cas des bouses, assurent un apport faunistique très important en milieu forestier. De plus les espèces coprophages, en particulier les Scarabéidae fouisseurs, interviennent dans l'aération du sol et son enrichissement en matière organique. Les dépôts d'ordures sauvages, par contre, concentrent à leur niveau d'importantes populations ripicoles et forestières comportant des espèces très intéressantes comme les rares Carabidae : Macrothorax rugosus F., Eurycarabus favieri Fairmaire et Colosoma inquisitor

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L., ce dernier étant probablement une espèce nouvelle pour la région (Agtay, 1999, 2001b). Ces microbiotopes, qui sont souvent brûlés, sont des pièges pour la faune qui les exploite et disparaît avec eux ; ils pourraient ainsi avoir un impact négatif non négligeable sur la biodiversité de l'écosystème forestier (Agtay, 2001a).

Conclusion

La présente étude montre que les dayas contribuent de manière significative à la richesse faunistique de la forêt environnante. Elle atteste également de l'existence de liens étroits entre ces deux écosystèmes ; la subéraie en particulier tire avantage de la présence de ces milieux temporaires. Elle profite ainsi notamment d'un prolongement local de l'apport d'humidité au début de la saison sèche et du maintien du pâturage aux abords des dayas, ce qui freine la dispersion des troupeaux à l'intérieur de la forêt. Elle subit toutefois les contrecoups de l’impact des facteurs défavorables auxquels sont exposés ces milieux (aléas climatiques, pression anthropique). L'élimination de ces dépressions, comme l’avaient suggéré divers intervenants au cours d’un colloque tenu en novembre 1999 sur la forêt de Ben Slimane, ou la réduction de leur étendue suite à un drainage ou à un comblement par les déchets, porte une atteinte considérable à l'écosystème subéraie et plus généralement au maillage écologique et à la biodiversité.

Références

Agtay, F. 1991 : Les dendrotelmes du chêne-liège, refuges estivaux de la faune ripicole des dayas. In : La faune du chêne liège, eds Villemant and Fraval, Rabat, Actes Editions: 276-277. Agtay, F. 1999 : Impacts des déchets ménagers sur la subéraie à Ben Slimane (Maroc). IOBC/wprs Bull. 22(3) : 163-166. Agtay, F. 2001a : La faune ripicole de milieux temporaires (dayas) de la Meseta Occidentale Marocaine. Thèse d'état, Faculté des Sciences de Rabat, 200 p. Agtay, F. 2001b : Impact humain sur les peuplements ripicoles des milieux humides temporaires (dayas) dans le domaine forestier en pays Zaërs. In : Gestion et valorisation de la biodiversité au Maroc. Actes du Premier congrès de l'Association Marocaine de Biodiversié, 5p. Mahari, S.1992 : Etude synécologique des niveaux de peuplement arthropodien de l'écosystème Chêne-liège dans les subéraies de la Mamora et de Ben Slimane (Maroc). Thèse d'Etat, Univ. d'Aix-Marseille III, 295p. Marque, C. 1986 : Etude de la structure et du fonctionnement des dayas (mares temporaires) de la Meseta Occidentale Marocaine. Thèse de 3ème cycle, Université de Toulouse, 119 p. Metge, G. 1986 : Etude des écosystèmes hydromorphes (dayas et merjas) de la Meseta Occidentale Marocaine. Typologie et synthèse cartographique à objectif sanitaire, appliquée aux populations d'Anopheles labranchiae (Fallenori, 1926), Culicidae, Anophelinae). Thèse d'Etat, Université d'Aix-Marseille III, 280 p. Ramdani, M. 1986 : Ecologie des Crustacés (Copépodes, Cladocères et Ostracodes) des dayas marocaines. Thèse d'Etat, Université d’Aix-Marseille I, 180 p.

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Titolet, D. & Rhazi, L. 1999 : Intérêt patrimonial d'un milieu associé aux subéraies : les mares temporaires des rives gauche et droite de l'oued Cherrat. IOBC/wprs Bull., 22(3) : 189- 194. Villemant, C. et Fraval, 1991 (eds.) : La faune du chêne liège, Rabat, Actes Editions, 336 p.

Importance of the temporary pools associated with the cork oak forest in the Zaërs region (Morocco)

Fatima Agtay

Abstract : Because it undergoes a semi-arid climate, the cork-oak forest of the Zaërs region is actually in bad condition especially at Benslimane near the town of Casablanca where forest endergoes great human pressure. This condition however is locally improved by the presence of temporary pools named dayas. By retaining water, dayas enable the forest to take advantage of a prolonged humidity supply ; they also contribute notably in enriching the fauna of the forest ecosystem. This study is focused on the contribution of the temporary pools of the Ben Slimane-Sidi Bettache region to the biodiversity of the cork-oak forest.

Key words : cork-oak, forest ecosystem, temporary pools, poolside fauna, arthropods, Ben Slimane, Zaër region, Morocco.

Integrated Protection in Oak Forests IOBC/wprs Bull. 25(5), 2002 pp. 175-176

Conclusions and recommendations

It is common knowledge that the forest decline in Europe and North Africa linked to various biotic and abiotic decay factors which directly or indirectly induce a reduction of tree strength followed by loss of defensive capacities. This situation is favourable to negative agents such as insects and pathogenous fungi whose action accelerate tree decline. Progressive reduction of cork oak stand areas and a reduction of cork production were recorded in Portugal, Spain, France, Italy, Morocco, Algeria and Tunisia. During the meeting, All the oral communications and posters emphazised the evidence of the current oak decline and showed the diversity of the decay factors involved as well as their complex interactions. Today it seems evident that a better understanding of the phenomena could only be obtain by undertaking multidisciplinary studies and creating databases compiling knowledge at a macro-regional level. Although several strategies are already available to minimise the decline incidence, mainly by controlling a number of insect pests and pathogenous fungi, it is not known however how to reinvigorate the oak stands by favouring an increase of the tree vitality.

The following suggestions were made by participants of the meeting :

• repeat the evaluation of the current decline, taking into account not only the biotic factors but also abiotic factors such as climatic conditions, soil quality or conditions of sylvicultural management • create a database concerning all the identified decay factors in Europe and North Africa • standardize the methodologies of symptom and damage assessment • review and publish the control strategies employed in each country • write a global diagnostic of the current situation in order to establish an action plan concerning management strategies as well as forest protection and development, principally in the Mediterranean countries • create thematic subgroups having more regular contacts in order to better organise common action and facilitate the definition of common methodologies. • create a network of scientists and forest managers concerned by oak forest protection • create a web-site with a discussion forum • improve the involvement of the scientists of the North African countries • make the community aware of the urgent need to obtain financing enabling the participation of North African scientists in order to establish common research programmes

Finally, it was noted that one of the best strategies for scientists involved in oak forest protection to get integrated knowledge of the phenomenon, is by meeting regularly and sharing experiences and results as this last meeting under the patronage of OIBC Wprs demonstrated with success.

• The next meeting of the group is scheduled for October 2004 in Tunisia.

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Conclusion et recommandations

On sait aujourd’hui que le dépérissement des forêts de chêne-liège en Europe et en Afrique du Nord est lié à une grande diversité de facteurs de déclin (biotiques et abiotiques) qui peuvent de façon directe ou indirecte provoquer une diminution graduelle de la vigueur des arbres. Celle-ci s’accompagne d’une réduction de leurs capacités de défense, ce qui crée des conditions favorables à l’installation d’agents favorisant l’accélération du dépérissement tels que les insectes xylophages et les champignons pathogènes. Les travaux présentés au cours du meeting ont fait ressortir le caractère évident du phénomène de dépérissement des forêts de chênes et plus particulièrement des subéraies. Une réduction graduelle de l’aire de répartition du chêne-liège et de la production annuelle du liège est ainsi observée depuis plusieurs décennies au Portugal, en Espagne, en France, au Maroc, en Italie, en Tunisie et en Algérie. Les facteurs impliqués dans ce phénomène sont multiples, ils varient selon les régions et leur intervention dans le processus du dépérissement est sous la dépendance d’interactions extrêmement complexes. On a constater au cours du meeting que la connaissance plus globale du problème ne pourra être atteinte que dans le cadre d’études pluridisciplinaires mises en œuvre au niveau de chaque écosystème et impliquant à la fois des entomologistes, des phytopathologistes et des responsables de l’aménagement forestier. En parallèle la création des bases de données à un niveau macro-régional s’avère indispensable. Bien que l’on dispose déjà de stratégies plus ou moins spécifiques pour minimiser les effets de certains agents du dépérissement, notamment en ce qui concerne le contrôle des populations de certains insectes ravageurs et certains champignons pathogènes, on connaît encore mal les méthodes indirectes qui permettraient d’améliorer l’état sanitaire des peuplements en favorisant une amélioration de la vitalité globale des arbres.

Concrètement, les participants au meeting proposent de : • Réétudier la stratégie d’évaluation du déclin en prenant en compte d’autres facteurs que les facteurs biotiques, et en s’intéressant notamment à l’influence des facteurs du climat, des sols et de la gestion sylvicole des peuplements ; • Créer une base de données concernant tous les facteurs de déclin déjà identifiés en Europe et en Afrique du Nord ; • Uniformiser des méthodologies d’évaluation des synptômes et des dégâts ; • Effectuer un bilan des méthodes de lutte des agents biotiques qui sont utilisées dans chaque pays • Créer un réseau des chercheurs concernés par la protection des forêts de chênes ; • Rédiger un diagnostic global de la situation visant l’établissement d’un plan d’action sur les stratégies d’aménagement, de développement et de protection des forêts de chênes dans le bassin méditerranéen ; • Etablir des projets de recherche conjointe entre les chercheurs des différents pays ; • Créer des sous-groupes thématiques ayant des contacts plus réguliers pour la mise en oeuvre d’actions conjointes ; • Créer un site Internet avec un forum de discussion ; • Définir des stratégies visant une plus forte participation au niveau du groupe des chercheurs des pays du Maghreb ; • Sensibiliser la Communauté sur l’urgence d’obtenir des sources de financements, permettant une plus grande implication des chercheurs des pays du Maghreb à la réalisation de projets de recherche communs.

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Comme on l’a constaté à l’occasion des précédents meetings, le rassemblement sous le patronnage de l’OILB Srop de tous les chercheurs impliqués dans la protection des forêts de chêne constitue en lui-même une des meilleures stratégies pour permettre à chacun d’eux d’acquérir une certaine connaissance intégrée de ce vaste et complexe domaine de recherche. L’établissement de relations internationales à l’aide de protocoles de coopération, de contrats et projets de recherche est l’une des étapes les plus urgentes à mettre en oeuvre.

Le prochain meeting du groupe est prévu en octobre 2004 en Tunisie.