Ambrosia Arborescens (Marco)

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

Actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos preparados con diferentes solventes de las hojas de Ambrosia arborescens (Marco)

Trabajo de Titulación (modalidad proyecto de investigación) previo a la obtención del Título de Química Farmacéutica

AUTORA: Chamorro Rodríguez Jeniffer Gabriela TUTOR: Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño PhD.

Quito, 2020

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Jeniffer Gabriela Chamorro Rodríguez en calidad de autor y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: Actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos preparados con diferentes solventes de las hojas de Ambrosia arborescens (Marco), modalidad presencial, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACION, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecido en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

La autora declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

Firma:

Jeniffer Gabriela Chamorro Rodríguez

1726011677 [email protected]

APROBACION DEL TUTOR

En mi calidad de Tutor del Trabajo de titulación, presentado por JENIFFER GABRIELA CHAMORRO RODRIGUEZ, para optar por el grado de Química Farmacéutica; cuyo título es: ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PREPARADOS CON DIFERENTES SOLVENTES DE LAS HOJAS DE AMBROSIA ARBORESCENS (MARCO), considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes, incluido las páginas preliminares, para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe.

En la ciudad de Quito a los cuatro días del mes de septiembre del 2020

Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño PhD.

DOCENTE TUTOR

1707216527

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CONSTANCIA DE APROBACION DEL TRABAJO FINAL POR EL

TRIBUNAL

El tribunal constituido por: Doctora Rommy Terán y Doctora Carmita Reyes y Doctor Fernando Novillo, luego de revisar el Trabajo de Investigación titulado: “Actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos preparados con diferentes solventes de las hojas de Ambrosia arborescens (Marco)”. Previo a la obtención del Título (o grado académico) de Química Farmacéutica presentado por la señorita Jeniffer Gabriela Chamorro Rodríguez APRUEBA el trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

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Doctora Rommy Terán Doctora Carmita Reyes T.

CI: 1708168966 CI: 1712862034

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Doctor Fernando Novillo L.

CI: 1707216527

DEDICATORIA

Al eterno Rey, Jesús, el cual me encontró cuando más lo necesitaba, quien con su eterna sabiduría e inteligencia me ayudó a conseguir la meta más anhelada.

A mi maravilloso esposo Santiago Valencia por su apoyo incondicional, por su amor, su tiempo y paciencia que hicieron que nunca me rindiera.

A mis padres Henry y Sandra, quienes estuvieron alentándome durante este tiempo, su apoyo fue valioso.

A mi hermana, por las risas y ocurrencias que hicieron que todo mal momento pase.

A Lalita y abuelitos Rafael y luz María (+), gracias por sus palabras de aliento, por sus oraciones, fueron la fuerza que necesitaba

A mi Elías, te amo tanto hijo mío, fuiste el motor para llegar a la meta.

‹‹5 Entonces entenderás el temor de Jehová, Y hallarás el conocimiento de Dios. 6 Porque Jehová da la sabiduría, Y de su boca viene el conocimiento y la inteligencia. ››

Proverbios 2; 5-6

AGRADECIMIENTO

Quiero agradecer al Rey supremo, a mi Dios todopoderoso, al cual le entrego mi título, gracias a sus promesas la meta anhelada logre conseguir. “Mira que te mando que te esfuerces y seas valiente; no temas ni desmayes, porque Jehová tu Dios estará contigo en dondequiera que vayas” Josué 1; 9. Agradezco a la Universidad Central del Ecuador, que me permitió ser parte de esta prestigiosa institución y formación académicamente. A mi querida facultad de Ciencias Químicas, donde aprendí que la lucha debe ser constante, aunque todo parezca complicarse más, el amor a la profesión hizo posible todo obstáculo presente. A mi tutor, Doctor Fernando Novillo, gracias por su tiempo, su paciencia, su ayuda incondicional, por sus conocimientos, que fueron fundamentales durante este proceso de titulación. A mi tribunal, Doctora Carmita Reyes y Doctora Rommy Terán, gracias por sus conocimientos y ayuda durante el tiempo de realización de este proyecto de investigación. Un agradecimiento especial a la Doctora Janeth Montalvo y Doctora Liliana Naranjo, quienes, al impartir sus conocimientos farmacológicos, farmacéuticos, hicieron que creciera en mí el amor al cuidado del paciente. A mi amado esposo, Santiago Valencia, gracias por haberte subido en este barco, lleno de alegría, nostalgia y triunfos, gracias porque me apoyaste cuando todo estaba gris, me extendiste tu mano, me diste tu hombro, me abrazaste con tus oraciones, este triunfo es de los dos, te amo mi amor eterno. A mi papi Henry, gracias por aquella vez que me apoyaste, me alentaste a continuar con mi sueño, cuando parecía irse de mis manos, gracias porque creíste en mi desde el inicio. A mi mami Sandra, porque fuiste un ejemplo a seguir, me demostraste que no hay obstáculo alguno cuando uno quiere triunfar en la vida. A Lalita, gracias porque fuiste como una segunda madre para mí, gracias por preocuparte, por alentarme a continuar y por cuidar de Eli mientras estudiaba. A mi abuelito Rafael, gracias papito lindo por cuidar de mí, por levantarme con el desayuno cuando iba tarde a estudiar, por las llamadas y el amor incondicional. Al príncipe de mi vida, Elías Valencia, te amo mi chiquito, tú me inyectaste esas fuerzas que me hacían falta para escalar.

A todos ustedes, mil gracias porque todos me ayudaron a conseguir este título.

Índice de contenidos

DERECHOS DE AUTOR ...... ii APROBACION DEL TUTOR ...... iii CONSTANCIA DE APROBACION DEL TRABAJO FINAL POR EL TRIBUNAL.. iv DEDICATORIA ...... v AGRADECIMIENTO ...... vi Índice de contenidos ……………………………………………………………………………………………………….. vii Lista de tablas ...... x Lista de figuras ...... xiii Lista de anexos ...... xv ABREVIATURAS ...... xiv RESUMEN ...... xvii ABSTRACT ...... xviii INTRODUCCIÓN ...... 1 1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 3 1.1 Formulación del problema ...... 4 1.2 Preguntas de investigación...... 4 1.3 Objetivos ...... 4 1.3.1 Objetivo General ...... 4 1.3.2 Objetivos Específicos ...... 4 1.4 Importancia y justificación de la investigación ...... 5 2 MARCO TEORICO ...... 7 2.1 Antecedentes de la investigación ...... 7 2.2 Fundamento Teórico ...... 9 2.2.1 Familia Asteraceae en la región Andina Ecuatoriana ...... 9 2.2.2 Género Ambrosia ...... 10 2.2.3 Generalidades de Ambrosia arborescens...... 10 2.2.4 Usos medicinales ...... 12 2.2.5 Composición y principios activos ...... 12 2.2.6 Control de calidad del material vegetal ...... 13 2.2.7 Productos naturales ...... 16 2.2.8 Actividad antioxidante (DPPH) ...... 20 2.2.9 Butilhidroxitolueno (BHT)...... 21

vii

2.2.10 Flavonoides ...... 21 2.2.11 Fenoles ...... 23 2.2.12 Actividad Antimicrobiana ...... 24 2.3 Fundamento Legal ...... 29 2.4 Hipótesis ...... 30 2.4.1 Hipótesis alternativa, Ha ...... 30 2.4.2 Hipótesis nula, Ho ...... 31 2.5 Conceptualización de variables ...... 31 3 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ...... 33 3.1 Diseño de la investigación ...... 33 3.2 Población y muestra ...... 33 3.2.1 Población ...... 33 3.2.2 Muestra ...... 33 3.3 Métodos y Materiales...... 34 3.4 Metodología ...... 36 3.5 Procedimiento ...... 37 3.5.1 Obtención e identificación de la muestra vegetal ...... 37 3.5.2 Tratamiento del material vegetal ...... 37 3.5.3 Determinación del material vegetal por pérdida de secado ...... 37 3.5.4 Determinación de cenizas totales ...... 38 3.5.5 Determinación de cenizas insolubles en ácido ...... 38 3.6 Obtención de extractos totales ...... 39 3.6.1 Tamizaje fitoquímico ...... 39 3.6.2 Perfil cromatográfico ...... 41 3.6.3 Cuantificación de fenoles totales ...... 42 3.6.4 Cuantificación de flavonoides totales ...... 43 3.7 Evaluación de actividad antioxidante ...... 45 3.8 Evaluación de la actividad antibacteriana ...... 47 3.9 Diseño Experimental...... 48 4 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ...... 53 4.1 Etapa 1 ...... 53 4.1.1 Recolección e Identificación del material vegetal ...... 53 4.1.2 Control de calidad del material vegetal ...... 53 4.2 Etapa 2 ...... 56 4.2.1 Tamizaje fitoquímico...... 56

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4.2.2 Perfil cromatográfico ...... 58 4.2.3 Cuantificación de fenoles totales de los extractos obtenidos de los diferentes solventes de las hojas de la especie de Ambrosia arborescens ...... 61 4.2.3 Cuantificación de flavonoides totales de los extractos obtenidos de los diferentes solventes de las hojas de la especie de Ambrosia arborescens ...... 63 4.3 Actividad antioxidante ...... 65 4.4 Actividad antimicrobiana ...... 72 5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 83 5.1 Conclusiones ...... 83 5.3 Recomendaciones ...... 84 Bibliografía ...... 85 ANEXOS ...... 93

Lista de tablas

Tabla N° 1. Incubación de las placas con sus diferentes organismos ...... 25 Tabla N° 2. Características de los grupos patogénicos de Escherichia coli ...... 26 Tabla N° 3. Susceptibilidad de diferentes cepas bacterianas a gentamicina ...... 29 Tabla N° 4. Material de vidrio ...... 34 Tabla N° 5. Cepas Bacterianas ...... 34 Tabla N° 6. Reactivos ...... 35 Tabla N° 7. Equipos ...... 35 Tabla N° 8. Parámetros de control de calidad de materia vegetal ...... 39 Tabla N° 9. Curva de calibración del ácido gálico ...... 42 Tabla N° 10. Curva de calibración de quercetina ...... 44 Tabla N° 11. Curva de calibración del estándar BHT ...... 45 Tabla N° 12. Preparación de las muestras ...... 46 Tabla N° 13. Preparación de las muestras ...... 47 Tabla N° 14. Operacionalización de las variables de la etapa 2 ...... 48 Tabla N° 15. Factores y niveles de la etapa 2 ...... 49 Tabla N° 16. Operacionalización de las variables de la etapa 3 ...... 49 Tabla N° 17. Factores y niveles de la etapa 3 ...... 50 Tabla N° 18. Operacionalización de las variables de la etapa 4 ...... 50 Tabla N° 19. Factores y niveles de la etapa 4 ...... 51 Tabla N° 20. Especificaciones organolépticas de las hojas de la especie Ambrosia arborescens...... 53 Tabla N° 21. Porcentaje del material extraño de las hojas de la especie Ambrosia arborescens...... 54 Tabla N° 22. Resultados del porcentaje de humedad por el método termogravimétrico de las hojas de la especie Ambrosia arborescens ...... 54 Tabla N° 23. Resultados del porcentaje de rendimiento de las hojas de la especie Ambrosia arborescens ...... 55 Tabla N° 24. Resultados del porcentaje de cenizas totales de las hojas de la especie Ambrosia arborescens ...... 56 Tabla N° 25. Tamizaje fitoquímico del extracto metanólico de las hojas de Ambrosia arborescens...... 57 Tabla N° 26. Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico al 76% de las hojas de Ambrosia arborescens ...... 57 Tabla N° 27. Tamizaje fitoquímico del extracto diclorometano-metanol de las hojas de Ambrosia arborescens ...... 57 Tabla N° 28. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar alcaloides...... 58 Tabla N° 29. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar fenoles...... 59 Tabla N° 30. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar terpenos...... 60 Tabla N° 31. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar taninos...... 60 Tabla N° 32. Curva de calibración del ácido gálico ...... 61

Tabla N° 33. Concentración de fenoles totales expresados en mg ácido gálico/g de extracto total ...... 62 Tabla N° 34. Curva de calibración de quercetina ...... 63 Tabla N° 35. Concentración de flavonoides expresados en mg quercetina/g de extracto total ...... 64 Tabla N° 36. Porcentaje de inhibición del BHT a diferentes concentraciones ...... 66 Tabla N° 37. Promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Guano 66 Tabla N° 38. Promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Penipe67 Tabla N° 39. Análisis de varianza para el cantón Guano ...... 70 Tabla N° 40. Análisis de varianza para el cantón Penipe ...... 71 Tabla N° 41. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto etanólico 76%, cantón Guano ...... 73 Tabla N° 42 . Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto metanólico, cantón Guano ...... 74 Tabla N° 43. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol (1:1), Guano ...... 76 Tabla N° 44. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto etanolico 76%, cantón Penipe ...... 77 Tabla N° 45. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto metanólico, cantón Penipe ...... 78 Tabla N° 46. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol (1:1), cantón Penipe ...... 79 Tabla N° 47. Mayor concentración de halos de inhibición según cepa, solvente y zona geográfica ...... 81 Tabla N° 48 . Análisis de varianza de la concentración de fenoles totales de los diferentes extractos de la especie Ambrosia arborescens, considerando tipo de solvente y ubicación geográfica ...... 104 Tabla N° 49. Análisis de comparaciones múltiples ...... 105 Tabla N° 50. Análisis de varianza de la concentración de flavonoides de los diferentes extractos de la especie Ambrosia arborescens, considerando tipo de solvente y ubicación geográfica ...... 105 Tabla N° 51. Análisis de comparaciones múltiples ...... 106 Tabla N° 52. Análisis estadistico descriptivo de la absorbancia, según la concentración y el solvente, Guano...... 107 Tabla N° 53. Análisis estadistico descriptivo de la absorbancia, según la concentración y el solvente, Penipe...... 108 Tabla N° 54. Porcentaje de inhibición del extracto etanólico 76% de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano ...... 109 Tabla N° 55. Porcentaje de inhibición del extracto metanólico de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano ...... 109 Tabla N° 56. Porcentaje de inhibición del extracto diclorometano-metanol (1:1) de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano ...... 110 Tabla N° 57. Porcentaje de inhibición del extracto etanólico 76% de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Penipe ...... 111 Tabla N° 58. Porcentaje de inhibición del extracto metnolico de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Penipe...... 111

Tabla N° 59. Porcentaje de inhibición del extracto diclorometano-metanol (1:1) de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Penipe ...... 112 Tabla N° 60. Comparaciones múltiples del análisis de varianza para el cantón Guano ...... 113 Tabla N° 61. Comparaciones múltiples del análisis de varianza para el cantón Penipe ...... 114 Tabla N° 62. Pruebas de los efectos inter-sujetos ...... 115 Tabla N° 63. Comparaciones múltiples entre las concentraciones para determinar la mayor actividad antimicrobiana ...... 116 Tabla N° 64. Comparaciones múltiples entre los solventes utilizados ...... 117

xii

Lista de figuras

Figura 1. Cumanina ...... 10 Figura 2. Especie Ambrosia arborescens ...... 10 Figura 3. Coronopilina...... 11 Figura 4. Damsina (a), Coronofilina (b), Psilostaquina B (c) y Psilostaquina C (d) ...... 13 Figura 5. Principales interrelaciones entre metabolito primario y secundario de especies vegetales ...... 18 Figura 6. Estructura del radical libre 1,1-difenil-2-picril hidracilo, DPPH ...... 20 Figura 7. Estructura del BHT ...... 21 Figura 8. Estructuras de los Flavonoides...... 22 Figura 9. Estructura de quercetina...... 23 Figura 10. Curva de calibración de ácido gálico ...... 61 Figura 11. Promedio de fenoles totales expresado en mg AG/g ET según el tipo de solvente y la zona geográfica ...... 62 Figura 12. Curva de calibración de la quercetina ...... 64 Figura 13. Promedio de flavonoides expresado en mg QE/g ET según el tipo de solvente y la zona geográfica ...... 65 Figura 14Curva de calibración del estándar BHT ...... 66 Figura 15. Curvas del promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Guano ...... 67 Figura 16. Curvas del promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Penipe ...... 68 Figura 17. Comparación de la absorbancia promedio entre el cantón Guano y cantón Penipe ...... 69 Figura 18. Comparación del estándar BHT según solventes y concentraciones del Cantón Guano ...... 71 Figura 19. Comparación del estándar BHT según solventes y concentraciones del Cantón Penipe ...... 72 Figura 20. Promedio de halos de inhibición para extracto etanólico 76%, cantón Guano ...... 73 Figura 21 . Promedio de halos de inhibición para extracto metanólico, cantón Guano . 75 Figura 22. Promedio de halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol (1:1), cantón Guano ...... 76 Figura 23. Promedio de halos de inhibición para extracto etanólico 76%, cantón Penipe ...... 77 Figura 24. Promedio de halos de inhibición para extracto metanolico, cantón Penipe .. 78 Figura 25 . Promedio de halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol, cantón Penipe...... 79 Figura 26. Promedio de halos de inhibición de cada cepa por solvente y cantón ...... 81 Figura 27 . Representación del máximo halo de inhibición promedio para los diferentes tipos de cepa...... 82 Figura 28. A) Cromatoplacas para identificar alcaloides de los diferentes extractos para Guano y Penipe. B) Cromatoplaca de referencia identificando alcaloides pirrolizidínicos utilizando el revelador sulfato cérico amoniacal...... 102

xiii

Figura 29. A) Cromatoplacas para identificar fenoles de los diferentes extractos para Guano y Penipe. B) Cromatoplaca de referencia identificando fenoles. Fuente: (Hernández, J. y López, N., 2013, p. 55) ...... 102 Figura 30. A) Cromatoplacas para identificar terpenos de los diferentes extractos para Guano y Penipe. B) Cromatoplaca de referencia identificando terpenos...... 103 Figura 31. Cromatoplacas para identificar taninos de los diferentes extractos para Guano y Penipe...... 104 Figura 32. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto etanólico 76% en el cantón Guano ...... 109 Figura 33. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto metanólico en el cantón Guano ...... 110 Figura 34. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto diclorometano-metanol (1:1) en el cantón Guano ...... 110 Figura 35 . Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto etanólico 76% en el cantón Penipe ...... 111 Figura 36. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto metanólico en el cantón Penipe ...... 112 Figura 37. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto diclorometano-metanol (1:1) en el cantón Penipe ...... 112

xiv

Lista de anexos

ANEXO A. Árbol de problemas ...... 93 ANEXO B. Categorización de variables ...... 94 ANEXO C. Matriz de Operacionalización de Variables ...... 95 ANEXO D. Instrumento de recolección de datos ...... 97 ANEXO E. Certificado de identificación taxonómica ...... 100 ANEXO F. Certificado analítico de placas cromatográficas ...... 101 ANEXO G. Cromatoplacas de cada compuesto identificado de los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens ...... 102 ANEXO H. Análisis estadístico de la actividad antioxidante y actividad antimicrobiana de los diferentes extractos obtenidos de las hojas de Ambrosia arborescens, Guano y Penipe ...... 104 ANEXO I.Fotografías...... 118

ABREVIATURAS

A.G: ácido gálico

BHT: butilhidroxitolueno

CLSI: Instituto de estándares para el laboratorio clínico

CMI: Concentración mínima inhibitoria

DMSO: Dimetilsulfóxido

DPPH: 1,1-difenil-2-picril hidracilo

E.T: Extracto total

GDM-M: Extracto diclorometano-metanol, Guano

GE: extracto etanólico 76%, Guano

GM: Extracto metanólico, Guano

LT: Termolábil

NADPH: Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato

NSM: Nivel sobre el mar

PDM-M: Extracto diclorometano-metanol, Penipe

PE: extracto etanólico 76%, Penipe

PM: Extracto metanólico, Penipe

PPM: Partes por millón

QE: Quercetina

ST: Termoestable

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TÍTULO: Actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos preparados con diferentes solventes de las hojas de Ambrosia arborescens (Marco).

Autora: Jeniffer Gabriela Chamorro Rodríguez

Tutor: Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño PhD

RESUMEN

Los seres humanos desde sus inicios han utilizado las plantas como una fuente para sanar heridas, apaciguar dolores, entre otros. Dependiendo de la zona geográfica la presencia de los metabolitos secundarios pueden variar. En este trabajo de investigación se evalúa la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos etanólico al 76%, metanólico y diclorometano-metanol (1:1) de las hojas de Ambrosia arborescens (Marco), de los cantones Guano y Penipe pertenecientes a la provincia de Chimborazo, Ecuador. Al realizar el control de calidad del material vegetal se estableció que cumple con los parámetros establecidos. El tamizaje fitoquímico de los extractos dio positivo para alcaloides, fenoles, terpenos y taninos. El extracto etanólico (Penipe) presentó el mayor contenido de fenoles totales (56,43 mg A.G/g ET) y de flavonoides totales (0,6573 ± 0,003 mg QE/g ET). El evaluar la actividad antioxidante, la mayor inhibición del radical

DPPH se obtuvo con el extracto etanólico de las especies de Guano (CI50 de 2,18 ppm) y de Penipe (CI50 de 2,10 ppm). Finalmente, se evaluó la actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en disco donde, el extracto etanólico (Penipe) presentó mayor actividad antimicrobiana frente a las cepas Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006 y Enterococcus faecalis ATCC2912; mientras que el extracto etanólico de la especie de Guano presentó mayor actividad antimicrobiana frente a las cepas Enterococcus faecalis ATCC2912 y Pseudomonas aeruginosa C2-23. Demostrando así, que los extractos podrían ser usados en formulaciones farmacéuticas por las características antioxidantes y antimicrobianas favorables que presentan.

PALABRAS CLAVE: AMBROSIA ARBORESCENS / ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE / DPPH / ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

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TITLE: Antioxidant and antimicrobial activity of extracts prepared with different solvents of the leaves of Ambrosia arborescens (Marco).

Author: Jeniffer Gabriela Chamorro Rodríguez

Tutor: Dr. Fernando Augusto Novillo Logroño PhD

ABSTRACT

Humans since their inception have used plants as a source to heal wounds, ease pain, among others. Depending on the geographical area, the presence of secondary metabolites may vary. In this research, the antioxidant and antimicrobial activity of the 76% ethanolic, methanolic and dichloromethane-methanol (1: 1) extracts from the leaves of Ambrosia arborescens (Marco), from the Guano and Penipe cantons belonging to the province, are evaluated from Chimborazo, Ecuador. When carrying out the quality control of the plant material, it was established that it complies with the established parameters. Phytochemical screening of the extracts tested positive for alkaloids, phenols, terpenes, and tannins. The ethanolic extract (Penipe) had the highest content of total phenols (56.43 mg A.G / g ET) and total flavonoids (0.6573 ± 0.003 mg QE / g ET). When evaluating the antioxidant activity, the greatest inhibition of the DPPH radical was obtained with the ethanolic extract of the Guano species (IC50 of 2.18 ppm) and Penipe (IC50 of 2.10 ppm). Finally, antimicrobial activity was evaluated by means of the disk diffusion method where, the ethanolic extract (Penipe) presented greater antimicrobial activity against the Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006 and Enterococcus faecalis ATCC2912 strains; while the ethanolic extract of the Guano species showed greater antimicrobial activity against the Enterococcus faecalis ATCC2912 and Pseudomonas aeruginosa C2-23 strains. Demonstrating that the extracts could be used in pharmaceutical formulations due to the favorable characteristics antioxidant and antimicrobial they present KEYWORDS: AMBROSIA ARBORESCENS / ANTIOXIDANT ACTIVITY / DPPH / ANTIMICROBIAL ACTIVITY

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INTRODUCCIÓN

Los seres humanos desde sus inicios han buscado el empleo de plantas para sanar sus heridas, apaciguar dolores, entre otros. Con el tiempo, el conocimiento empírico de nuestros ancestrales ha causado cierta curiosidad que ha llevado al estudio de cada una de las plantas que se encuentran en nuestra biodiversidad. Con ello ha incentivado a muchos conocedores de la ciencia a estudiar los componentes, característicos, que hacen que tengan estas propiedades fitoterapeutas.

Es importante mencionar que, en nuestro país, Ecuador, se trata de mantener como primera fuente el uso de plantas medicinales.

Se debe fortalecer la salud intercultural, incorporando la medicina ancestral y alternativa al Sistema Nacional de Salud, que busca diseñar y aplicar protocolos para facilitar la implementación progresiva de la medicina ancestral y alternativa, en los servicios de salud pública y privada. (Gallegos, 2016, p.328)

En Ecuador en el 2014, el 23,17% de las defunciones por enfermedades cardiovasculares ocuparon la tercera causa de mortalidad en toda la población (Núñez S., Duplat A. y Simancas D., 2018, p.17). Por ello es importante relacionar la salud con la parte antioxidante. Según Coronado et. al (2015), se sabe que los polifenoles tienen acción antitrombótica, antilipémica, vasoprotectores y con respecto a enfermedades neurodegenerativas ayuda a inhibir la formación de radicales libres, como el superóxido e hidroxilo. Las enfermedades neurodegenerativas se han tratado de estudiar durante este tiempo, por lo que se ha visto un aumento del deterioro de proteínas específicas por la gran cantidad de especies que reaccionan con el oxígeno (Coronado et. al, 2015, p.208).

Si bien se conoce la diversidad de plantas que ofrece nuestro país, ha hecho posible el estudio de la especie Ambrosia arborescens. Esta especie cuenta con componentes que le proporcionan actividad antioxidante. Esta planta es rica en “cineol y pinenos, flavonoides, quercetinas, luteolina, lactonas, sesquiterpenos, artemisinina, ácido artemisinico, alcaloides, felandreno, codinenos, etc.” (Machacca, 2014, p.9). Uno de los componentes más importantes, son los polifenoles, el cual se encuentran en el reino vegetal, siendo parte de nuestra pirámide alimenticia, estos compuestos “contribuyen a la resistencia hacia microorganismos e insectos, pigmentación y características organolépticas y las plantas necesitan una multiplicidad de compuestos para preservar su

1 integridad debido a la continua exposición a cepas ambientales, incluidos los rayos UV y altas temperaturas” (Carratù y Sanzini, 2005, p.8).

Corroborando con el párrafo expuesto anteriormente referente a la actividad antimicrobiana, “los polifenoles se pueden unir a las cadenas de ADN interrumpiendo la reproducción o la síntesis de proteínas y elementos vitales para los microorganismos” (Berberán, citado en Martín, 2017. p.97). Por lo tanto este proyecto de investigación tiene como proposito la evaluación de la actividad antioxidante, usando el BHT como marcador de referencia y la actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en disco, utilizando como patógenos Escherichia coli ATCC 25922 , Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006, Pseudomonas aeruginosa C2-23 y Enterococcus faecalis ATCC2912, de los extractos obtenidos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens, que fueron recolectadas en la provincia de Chimborazo en los cantones de Penipe y Guano.

En el capítulo uno se describe el problema del trabajo investigado, seguido de las preguntas de investigación, objetivos tanto general como específicos en base a las directrices, y justificación que corrobora con la importancia del estudio que se realizó.

En el capítulo dos se detalla toda la información general, referente al marco teórico de la especie Ambrosia arborescens estudiada, aparte se redacta el fundamento teórico, siendo esta una visualización del contenido a realizar. Además, se especifica el fundamento legal, seguido de la hipótesis nula y específica, y la conceptualización de variables.

En el capítulo tres se desarrolla la metodología de la investigación, donde se pretende explicar el enfoque que se llegó en el proyecto. Se da a conocer el lugar donde se recolecto la muestra, los instrumentos a utilizar durante la ejecución, seguido de la operacionalización de las variables y las técnicas de recolección de datos.

En el capítulo cuatro se muestra el análisis estadístico, para emitir discusiones de acuerdo a los resultados obtenidos; a la vez se verifica el cumplimiento de los objetivos y de las hipótesis planteadas anteriormente.

En el capítulo cinco se establece las conclusiones, que son respuestas argumentadas a cada objetivo planteado inicialmente; seguido de las recomendaciones que ayudaran a posteriores investigaciones que se vayan desarrollando.

CAPITULO I

1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El conocimiento y uso de las plantas medicinales ha sido adquirido con el transcurso de los siglos; esto con el fin de apaciguar dolores, malestares y/o control de otros síntomas. Actualmente se tiene una amplia información bibliográfica de cada una de las plantas que se encuentran en nuestra flora ecuatoriana, facilitando el conocimiento para un adecuado uso de cada una de ellas. En este sentido, este proyecto de investigación hace referencia a la especie Ambrosia arborescens, en la que se ha encontrado una amplia literatura, pero no realizan un estudio comparativo de extractos obtenidos de diferentes solventes, razón por la cual se pretende llenar este vacío literario.

De acuerdo a Cornejo (2017), en 1962 empiezan a existir indicios de estudios referente a oxidaciones incontroladas por parte de Gerschman, farmacéutica argentina, con el fin de controlar el estrés oxidativo proveniente de los radicales libres presentes en el medio ambiente. Es por tal razón que uno de los propósitos es continuar con el estudio de la actividad antioxidante de especies nativas de nuestro país que presentan estas características, pudiendo explotar estas riquezas que nos brinda la naturaleza.

En el Ecuador, el uso inadecuado de los antibióticos producido por la automedicación ha llevado a un incremento de resistencias antimicrobianas; los betalactámicos (34%) son los más utilizados empíricamente, seguidos de las cefalosporinas (30%) y fluoroquinolonas (9%) (Silva, J et al., 2012, p.9).

De acuerdo al reporte de resistencia antimicrobiana en Ecuador 2014-2018, presentado por el Ministerio de Salud Pública menciona:

Las cefalosporinas como ceftazidina, ceftriaxona, cefepima y carbapenémicos como imipenen, meropenen presentan resistencia frente a Escherichia coli de hasta el 50% en áreas hospitalarias; los pacientes con resistencia de tipo comunitaria, es decir que antes de asistir al hospital ya presentaban esta bacteria resistente, son resistentes a sulfonamidas y quinolonas (Ministerio de Salud Pública, 2019, p.5).

El presente trabajo de investigación busca dar a conocer las propiedades fitoterapéuticas como son: la actividad antioxidante y antimicrobiana de los diferentes extractos preparados de las hojas de la especie Ambrosia arborescens, conocido como “Marco”; el cual al ser una planta silvestre que ha sido estudiada en diferentes campos, permitió compaginar con otros estudios realizados con el fin de tener un estudio más a profundidad de esta especie.

1.1 Formulación del problema ¿De qué manera afecta el uso de los diferentes solventes para la obtención de los extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens en la presencia de la actividad antioxidante y antimicrobiana?

1.2 Preguntas de investigación ¿Cómo asegurar la identificación de la especie Ambrosia arborescens proveniente del cantón Guano y Penipe?

¿De qué manera afecta la polaridad de los solventes utilizados para la obtención de los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens?

¿Cómo determinar cualitativamente los principales grupos de productos naturales presentes en los extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens?

¿Cómo es posible identificar ciertos metabolitos secundarios de los extractos obtenidos de las hojas de Ambrosia arborescens?

¿Presentan los extractos actividad antioxidante y antimicrobiana de las hojas de la especie Ambrosia arborescens?

1.3 Objetivos 1.3.1 Objetivo General Evaluar la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos preparados con diferentes solventes de las hojas de Ambrosia arborescens, conocido como “Marco”.

1.3.2 Objetivos Específicos - Identificar la taxonomía de la especie Ambrosia arborescens proveniente de los cantones Guano y Penipe.

- Preparar los extractos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens mediante maceración estática utilizando como solventes una solución hidroalcohólica al 76%, metanol y una mezcla de diclorometano-metanol (1:1).

- Realizar el tamizaje fitoquímico de los diferentes extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens

- Comparar los perfiles cromatográficos de los diferentes extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens.

- Determinar la actividad antioxidante con el marcador DPPH, utilizando como referencia BHT, de los diferentes extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens.

- Determinar la actividad antimicrobiana utilizando el método disco de los extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens frente a Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006, Pseudomonas aeruginosa C2-23 y Enterococcus faecalis ATCC2912.

1.4 Importancia y justificación de la investigación La flora ecuatoriana que nos provee la naturaleza, ha sido caracterizada por la cantidad de usos medicinales que se le da. Es por ello que para este uso se cuenta con 3.118 (60%) de especies y para su uso tradicional (social, ritual, religioso), 1.040 (20%) (Bravo, 2014, p.62). Es por tal razón que es necesario aprovechar todos estos beneficios. Cabe mencionar que existe una amplia literatura sobre estudios fitoquímicos del género Ambrosia, indicándonos varios métodos de extracción que se pueden aprovechar para consolidar los estudios realizados con el estudio que se va a realizar.

Si bien existen factores importantes que tienen que ser identificadas, como el tipo de especie, las condiciones ambientales en las que fueron recolectadas, verificando que no exista interferencia por los lugares donde se realizó el muestreo; Penipe y Guano. Debido al tipo de suelo, porque son dos lugares diferentes, donde su geología cambia, esto pudiendo influenciar al momento de obtener los metabolitos (Cires, 2013).

Los suelos analizados en el cantón de Guano, según Caizaluisa y López (2012) determina que son suelos secos, que están clasificados como pedocales donde presentan

5 coloración de gris claro a gris obscuros, sin embargo, no presenta salinidad en sus tierras (p.32). Lo cual significa que en este suelo permite que las plantas que crecen tengan gran cantidad de nutrientes, permitiendo una buena germinación, crecimiento vegetativo y crecimiento reproductivo (Lutenberg, s.f).

Por otro lado, tenemos el suelo del cantón Penipe, donde el pH que va de 5-6, el cual es medianamente ácido, disminuyendo la actividad microbiana y la asimilación de nutrientes como fosforo debido a la formación de fosfatos insolubles; considerándose los suelos ligeramente salinos (Gamboa y Tierra, 2016).

El amplio uso de la planta que comúnmente la conoce como “Marco” por parte de la comunidad de Guano y Penipe, el fácil acceso de obtenerla, permitió llevar a cabo los estudios referentes a las actividades antioxidante y antimicrobiana. Esto con el propósito de ayudar a buscar nuevas alternativas terapéuticas, puesto que, al tener gran cantidad de fenoles, permite retardar la degradación oxidativa, mejorando la calidad de vida y evitando enfermedades vasculares o neurodegenerativas (Padilla y Paucar, 2008).

Al trabajar con diferentes solventes, permitió observar la manera en cómo la polaridad de cada uno de ellos presentó una ligera variedad tanto en la actividad antioxidante como en la actividad antimicrobiana, siendo de aporte para concluir el mejor solvente que logre cumplir con las expectativas planteadas. Evidenciando así la diferencia que hay tanto en el uso de diferentes solventes, como en el área de recolección de la planta.

CAPITULO II

2 MARCO TEORICO

2.1 Antecedentes de la investigación

En la actualidad se ha presentado una serie de enfermedades neurodegenerativas, presentando 100.000 muertes al año, 60.000 millones de dólares en asistencia social anual (Segovia de Arana y Mora, 2002). Pudiendo ser controlada por la reducción de alimentos ricos en grasas saturadas, aumentar vitaminas, proteínas, minerales. Esto permitirá aumentar la esperanza de vida. Debido a la falta de educación alimenticia, se ha visto en la obligación de encontrar extractos de plantas que tengan esta actividad. Es por ello que en el estudio de Avello y Pastene (Moya, 2017) menciona que los taninos al hidrolizarse liberan ácido gálico, permitiendo que la actividad antioxidante se eleve (p.32). A la vez menciona Casares (Moya, 2017) que los componentes fitoquimicos como son los taninos y los flavonoides le confieren la capacidad que la especie Ambrosia arborescens tengan propiedades desinflamatorias. (p.34)

Ambrosia arborescens, una planta ampliamente estudiada, ha permitido que sea evaluada por diferentes autores que han presentado interés en esta especie; por ejemplo, Vera (2008), quien menciona en su estudio fitoquímico “el aislamiento de 5 lactonas sesquiterpénicas y 5 compuestos fenólicos. Estas cinco lactonas sesquiterpénicos y compuestos fenólicos son el bencil β-D-glucopiranosido (C13H18O6), el 3',4',5,7- tetrahidroxi-3,6,8-trimetoxi flavona (C18H16O9), el limocitrina (C17H14O8), el ácido salicílico (C7H6O3), el p-hidroxiacetofenona (C8H8O2). De estos, dos pertenecen al grupo de los flavonoides (3',4',5,7-tetrahidroxi-3,6,8-trimetoxi flavona, limocitrina)”.

Por otro lado, Morocho (2013), encontró 5 compuestos químicos de mayor cantidad que fueron el crisantemo (3,74%), el α-curcumeno (2,54%), el mirceno (2,40%), el t- muurolol (2,15%), y el -cimeno (1,26%), dando como resultado la gran actividad antioxidante que presenta esta especie.

En otro estudio donde determinan la composición del aceite esencial de la especie Ambrosia arborescens, Saltos (citado en Morocho, 2013) encontró una composición rica en monoterpenos, donde el compuesto de mayor cantidad es el crisantenona, y en

7 porcentajes representativos de sesquiterpenos como: -curcumeno y germacreno D (p.40). Ciertos componentes pertenecientes a los monoterpenos y sesquiterpenos poseen actividad antimicrobiana, Coy y Eunice (2013) en donde hacen referencia a la evaluación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales de R. officinalis (romero), T. vulgaris (tomillo) y C. longa (cúrcuma) mencionando:

Los tres aceites evaluados frente a la cepa de S. aureus, se pueden observar porcentajes de inhibición de 60 % para el caso del aceite de romero y 70 % en los aceites de tomillo y cúrcuma, respectivamente. Resulta interesante ver que estos dos últimos aceites se caracterizan porque poseen un porcentaje representativo de monoterpenos no oxigenados, con respecto al aceite de romero. (Coy y Eunice, 2013, p.244)

En otro estudio presentado por Cano de Terrones (2014) en su análisis determina la presencia de una espirolactona sesquiterpenica, el cual presenta propiedad diurética. Este metabolito al ser evaluada por Manrique (Potosino, 2015), menciona esta propiedad, a pesar que el estudio fue hecho para la planta diente de león (Taraxacum officinale) presentando el mismo metabolito, se puede pensar que esta planta también presenta esta propiedad.

Ampliando el estudio de esta especie, Ayala & Vásquez, (2014) e Ibarra & Paredes, (2013), mencionan similitud de resultados en sus investigaciones con respecto a la acción bactericida de la especie Ambrosia arborescens frente a Staphylococcus aureus, Candida albicans. Sin embargo, Ayala y Vásquez, (2014), realizan un estudio más a profundidad, en donde complementando lo mencionado anteriormente presentan resultados frente a la actividad antifúngica como son: “Trychophyton mentagrophytes, Trychophyton rumbrum, Microsporum canis y actividad antimicrobiana contra Escherichia coli, Staphylococcus epidermis” (p.57). No obstante Zapata, et. al, (2010), mencionan que “no presentan actividad antimicótica frente a las cepas de Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida krusei ATCC 6258, Aspergillus flavus ATCC 204304 y Aspergillus fumigatus ATCC 20430 (p.102).

Por otro lado, Cruz, (2009), al obtener el extracto hexánico en las hojas de la especie Ambrosia arborescens, en la que se encontró damsina, coronofilina y shiramool, se

8 realizó ensayos frente a la actividad antimicrobiana, hallándose que coronofilina tiene actividad frente a Bacillus subtilis y Staphylococcus oxford y damsina tiene actividad moluscicida y antitumoral; extendiendo de esta manera el estudio frente a diversas cepas que han sido estudiadas, con el fin de comparar los resultados obtenidos de otros autores con los resultados que se obtienen en este estudio realizado.

Además, Reyes et.al, recalcan que las propiedades antimicrobianas, antioxidantes, saborizantes y aromáticas en los aceites esenciales, va a depender de la cantidad de metabolitos que se encuentran en cada planta (Gómez, 2018). Estás actúan en enzimas que permiten la desnaturalización de proteínas bacterianas.

De acuerdo a los antecedentes encontrados en algunas literaturas bibliográficas se puede considerar que esta planta tiene compuestos fenólicos, por esta razón se pretende comparar su actividad antioxidante y actividad antimicrobiana en extractos que serán obtenidos de solventes con diferente polaridad.

2.2 Fundamento Teórico 2.2.1 Familia Asteraceae en la región Andina Ecuatoriana En el Ecuador existe un 30% de las especies de plantas vasculares, que se encuentran a una altura de 3000 hasta 4500 m. En este grupo se encuentra la familia Asteraceae, la cual se adapta bien en climas húmedos y secos. De esta familia, en el páramo ecuatoriano existe 101 géneros y 858 especies (Vásconez y Medina, s.f). Esta Familia que se deriva del género Aster L según Hyam y Pankhurt (Freire, 2004) mencionan que proviene del término latín “aster”, que significa “estrella” y que se refiere a la forma con apariencia de estrella de las inflorescencias (p.96).

Sin embargo, otro nombre que conlleva es “Compuestas”, haciendo referencia al tipo particular de inflorescencia, que le caracteriza a esta familia. Los miembros de esta familia llevan gran importancia en la ecología y economía. Esto debido a la distribución que se encuentran, ya que van desde las regiones polares hasta los trópicos, desde los desiertos secos hasta los pantanos y desde las selvas hasta los picos montañosos (Hinojosa y Moreno, 2013).

2.2.2 Género Ambrosia El género Ambrosia de acuerdo a Sanz Elorza et. al (citado en Morales, et.al, 2012) refieren que este género contiene cuarenta especies que se encuentran en Norteamérica y Sudamérica, que se distribuyen naturalmente por extensión (p.85). Por otra parte, el género Ambrosia ha sido estudiada como antioxidante por la cantidad de flavonoides y glicósidos que contienen, y son utilizados en el tratamiento de infecciones por Schistosoma mansoni, antiepiléptico, y como antiinflamatorio por la capacidad del compuesto cumanina presentado en la figura 1, inhibiendo la producción de óxido nítrico. (Lastra, citado de Yánez et.al.,2011, p.149)

Figura 1. Cumanina Fuente: (Lastra, A et al, 2004, p. 223)

2.2.3 Generalidades de Ambrosia arborescens.

Figura 2. Especie Ambrosia arborescens Fuente: Permatree, 2016

Ambrosia arborescens como se aprecia en la figura 2, conocida por su nombre común en Ecuador como “Marco”, pertenece a la familia Asteraceae. Se encuentra distribuida en todas las provincias andinas de la Sierra entre 2000 y 3500m de altitud (Minga y Verdugo, 2016). Estas plantas aromáticas son utilizadas principalmente en infecciones,

10 migraña, estreñimiento, fiebre, lesiones, problemas prostáticos y fracturas. Asimismo, se lo usa como insecticida y para combatir pulgas, garrapatas, entre otros (Ayala y Vásquez, 2014). Un estudio reciente, detectó que una lactona sesquiterpeno (coronopilina) como se observa en la figura 3 obtenido de la planta es activa contra la leucemia (Bosco, A. y Golsteyn, R., 2017), siendo así una especie muy considerada para obtener medicamentos que ayuden a este tipo de enfermedades.

Figura 3. Coronopilina Fuente: (Bosco, A. y Golsteyn, R., 2017, p. 12)

Taxonomía

De acuerdo a Ayala y Vásquez, 2014, p.10-11, se tiene la siguiente información de la especie Ambrosia arborescens

Nombre científico: Ambrosia arborescens

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Asterales

Familia: Asteraceae

Género: Ambrosia

Especie: Ambrosia arborescens Mill.

Sinónimo: Franseria artemisioides Willd.

Nombres Comunes: Marco, Marku, Markhu, Altamisa, Mano de marco

Hábito: Subarbusto, arbusto o arbolito

Origen: Nativa

Descripción botánica

Arbusto aromático de 1 a 3 m de altura, tallos erectos o inclinados, con abundantes ramificaciones, que inicia desde la base formando matas densas de 1 a 2 m de diámetro. Las hojas son simples, alternas, pinnatisectas de 8 a 18 cm, peciolos de 1 a 3 cm de largo, haz pubescente glanduloso de color verde oscuro, envés pubescente blanquecino; con respecto a las hojas son unisexuales dispuestas en cabezuelas separadas. Cabezuelas masculinas dispuestas en racimos espiciformes terminales, involucro en forma de copa de 0,6 a 0,8 mm de diámetro, con una serie de filarias connatas; flores femeninas 40 a 50 por cabezuela, corola cremosa de 0,4cm de largo, anteras libres. (Minga y Verdugo, 2016, p.102)

2.2.4 Usos medicinales Entre los usos que se da a la planta “Marco”, está aliviar la migraña, controlar el dolor de cabeza, contrarrestar el estreñimiento, aliviar la próstata. Las hojas, flores y tallos ayudan para cicatrizar y desinflamar de manera tópica o mediante una infusión (Hinojosa y Moreno, 2013); hay que mencionar que las preparaciones de remedios medicinales tradicionales son realizadas en infusión (60%), mediante azotes en el cuerpo (13%) y mediante baños en la zona afectada (9%) (Potosí, Villalba, & Arboleda, 2017, p.27).

2.2.5 Composición y principios activos

Estudios realizados de los metabolitos presentes en Ambrosia arborescens indican la presencia de flavonoides, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, y triterpenos (Vera, 2008), en pocas cantidades encontramos las saponinas; no tiene cumarinas, cardiotónicos, aceites fijos y esenciales. Se ha reconocido la presencia de cuatro lactonas sesquiterpenicas en las hojas: damsina, coronofilina, psilostaquina y psilostaquina C, estructuras presentadas en la figura 4. En las semillas se han encontrado la damsina y la coronofilina (Hinojosa & Moreno, 2013).

En un estudio para ver los componentes presentes en el aceite extraído de Ambrosia arborescens encontramos crisantemo (3,74%), α-curcumano (2,54%), mirceno (2,40%), T-muururol (2,15%) y p-cimeno (1,26%) (Morocho, 2013). Presentando una variedad cualitativa y cuantitativa con respecto a la composición química presente en esta especie.

Figura 4. Damsina (a), Coronofilina (b), Psilostaquina B (c) y Psilostaquina C (d) Fuente: (Martínez, Gonzalez, & Tuñon, 2002)

2.2.6 Control de calidad del material vegetal El control de calidad que se somete a un material vegetal empieza desde la identificación, características organolépticas, ensayos fisicoquímicos e identificación de los metabolitos presentes en cada una de ellas.

2.2.6.1 Identificación de la muestra vegetal Cada muestra de laboratorio deberá registrarse e identificarse correctamente y deberá ir acompañada con la etiqueta oficial y una ficha de muestreo, en la que se indique la naturaleza y origen de la muestra y la fecha y lugar de la toma de muestras, junto con toda la información complementaria que pueda ayudar al analista (NTN, 2001, p.9- 10)

2.2.6.2 Características organolépticas y físicas Las características principales que se deben tomar en cuenta son el olor, color, aspecto y en algunos casos el sabor. Para identificar estas propiedades, el autor Ramírez (1997) menciona:

Las plantas deben darse una interacción dinámica entre las características físicas, químicas y biológicas del suelo. Las propiedades físicas pueden ser: Fundamentales: aquellas que no se derivan de otras y se encuentran dentro de este grupo el color, la textura, la estructura, la densidad, la consistencia, la temperatura, etc. Derivadas: que, como su nombre lo indica, son todas las que nacen de la interacción de las fundamentales. (p.9)

2.2.6.3 Cenizas De acuerdo a la autora Márquez (2014) menciona que las cenizas

Es el residuo inorgánico que queda después de calcinar la materia orgánica; en los vegetales predominan los derivados de potasio. El carbonato potásico se volatiliza apreciablemente a 700°C y se pierde casi por completo a 900°C. El carbonato sódico permanece inalterado a 700°C, pero sufre pérdidas considerables a 900°C. Los fosfatos y carbonatos reaccionan además entre sí. (p.1)

Este procedimiento en sí va a ayudar a determinar la cantidad de minerales presentes en la planta.

2.2.6.4 Cenizas Insolubles en HCl Según Soto (citado en Germán, 2019) este método “son los residuos después de la ebullición de las cenizas totales con ácido clorhídrico diluido. Esta determinación mide la presencia de sílice, especialmente arena y tierra silícea”. (p.38)

2.2.6.5 Determinación de Humedad La cantidad de humedad presente en el material vegetal puede afectar a la conservación, al crecimiento bacteriano, fúngico. Por lo que es importante determinar la humedad como medio de control de calidad, de acuerdo a Peralta, Maldonado y Centeno (citado en Germán, 2019) la determinación de humedad es para “las drogas que absorben humedad fácilmente o se deterioran rápidamente en presencia de agua”. (p.39)

2.2.6.6 Extractos y tipos de procesos de extracción De acuerdo con el autor Pardo (2002) el extracto “es una mezcla compleja, con multitud de compuestos químicos, obtenible por procesos físicos, químicos y/o microbiológicos a partir de una fuente natural y utilizable en cualquier campo de la tecnología”. (p.2).

Esto ayuda a obtener metabolitos que puedan tener actividad farmacológica, antimicrobiana, antioxidante, insecticida, entre otros. Existen algunos procesos para la obtención de los mismos, como son, percolación, filtración, maceración, destilación, etc.

Maceración

Es un método de extracción solido-líquido donde la materia prima contiene compuestos solubles en el solvente a emplear. Este proceso genera productos que son ausentes de esencias o el propio extracto, dependiendo del empleo que se vaya a dar (López, E., 2008).

Según Fernaroli´s (citado en López, 2008) donde aclara que “La naturaleza de los compuestos extraídos depende de la materia prima empleada, así como del líquido de extracción”. (p.1).

Una de las ventajas de utilizar este método es el uso del solvente, ya que se usa una única ocasión, realizando movimientos, o si es estática, como su nombre lo dice, sin movimiento, aparte ayuda a todo tipo de vegetal, sea raíz, tallos, hojas, entre otros.

Hidrodestilación

De acuerdo al autor Cerpa (citado en López, 2008) comenta que la hidrodestilación “es el proceso para obtener el aceite esencial de alguna materia prima vegetal mediante el uso del vapor saturado a presión atmosférico” (p.1). La materia prima es colocada en el hidrodestilador, sea que este molido, entero, cortado; el vapor de agua junto con la presión generada entra en contacto con el material vegetal, calentándolo, para producir el aceite esencial. (López, 2008)

Percolación

De acuerdo a Selles (citado en Carrión y García, 2010) menciona:

Es un método que consiste en que el menstruo (generalmente alcohólico o mezcla hidroalcohólica) atraviesa la masa de droga pulverizada siempre en un solo sentido, alcanzando concentraciones crecientes de tal modo que el equilibrio entre el solvente dentro y fuera del marco nunca se alcanza, por lo que la droga bañada siempre por nuevas proporciones de menstruo acaba por ceder todos sus componentes solubles de manera progresiva. (p.27).

Una ventaja de este proceso es que se obtiene la mayoría de metabolitos para ser estudiados en un corto tiempo.

2.2.7 Productos naturales Los productos naturales son un conjunto de reacciones químicas entre los elementos carbono, oxígeno e hidrogeno que con la influencia de la luz solar forman moléculas orgánicas a las que se unen, en algunos casos también interviene el nitrógeno y el azufre.

Gracias a esto se producen funciones metabólicas que contienen compuestos orgánicos comunes llamados metabolitos primarios que son: proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos. Por otro lado, tenemos los metabolitos secundarios que son un conjunto de sustancias que se forman en el metabolismo individual de cada especie, que la caracteriza y transmite propiedades específicas (Carmona, 2013).

Metabolitos secundarios y primarios

Los metabolitos primarios son compuestos que se encargan del desarrollo de la planta, como referencia se observa la figura 5, mostrando los principales metabolitos que se encuentran en una especie vegetal, Llorente (2002) menciona:

Los metabolitos secundarios llevan a la formación de compuestos característicos de un grupo taxonómico; algunos vegetales producen estos metabolitos con el fin de interactuar con el medio ambiente (protección frente a depredadores, patógenos o estrés ambiental), he ahí donde algunas plantas presentan actividad antimicrobiana y antioxidante; a la vez existen otras relaciones referentes a la reproductividad de la planta (atracción de insectos para la promoción de la polinización). (p.43)

Por tal motivo la industria farmacéutica obtiene los metabolitos encontrados en cada especie vegetal con el fin de producir sustancias que ayuden al desarrollo de algún producto de beneficio humano, de esta manera, se muestra en la figura 5 los principales metabolitos primarios y secundarios que se encuentran habitualmente en la especie vegetal

FOTOSÍNTESIS CO2 + H2o

Carbohidratos Vía pentosas

Eritrosa-4-p Glucólisis

Ácido shikímico Fosfoenolpiruvato Ácido pirúvico

Alcaloides Acetil-CoA Triptofano indólicos

Prolina Fenilalanina

Alcaloides Ornitina pirrólicos

Ácido trópico

Alcaloides del tropano

Ácido cinámico Malonil-CoA

Fenilpropanoides Flavonoides Ácidos grasos

Policétidos Ligninas Poliacetilenos

Fenoles Taninos Glucósidos

Ácido mevalónico

Terpenoides Esteroides Carotenoides Figura 5. Principales interrelaciones entre metabolito primario y secundario de especies vegetales Fuente: (Llorente, 2002)

2.2.7.1Tamizaje Fitoquímico

De acuerdo al autor Prashant (citado en Castillo et. al, 2017) mencionan que el tamizaje fitoquímico “comprende el estudio de metabolitos secundarios presentes en especies vegetales, los cuales pueden ser fenoles y polifenoles, quinonas, flavonas y flavonoides, taninos, cumarinas, terpenoides y aceites esenciales, alcaloides, lectinas y polipéptidos, glucósidos y saponinas” (p.1).

Para ello es importante tener los extractos con los solventes a trabajar, con el fin de ver los metabolitos que permitieron ser extraídos. Es importante tomar en cuenta que, para reportar los resultados se lo realiza con los signos (+) o (-), para que de esa manera sea más fácil la interpretación.

2.2.7.2 Cromatografía

Según Harris (citado en Castillo et. al, 2017) establece:

La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes se distribuyen en dos fases, una constituye la fase estacionaria y la otra es un fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. La fase móvil puede ser un gas, un líquido o un fluido súper crítico que se usa como portador de la mezcla, y la fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte, de gran área superficial. (p.1)

Métodos cromatográficos

Los métodos utilizados para realizar los diferentes análisis son en la mayoría selectivos, pero no específicos, por lo que cuando se trata de separar los analitos pueden existir interferencias, por lo que el método más recomendable es el cromatográfico, permitiendo separar mezclas complejas, en donde, se va a poder identificar y cuantificar los compuestos presentes en muestras liquidas o gaseosas (Ayora, s.f).

Cromatografía en columna

Esta cromatografía está compuesta por una columna de vidrio donde se coloca la fase estacionaria, en donde la fase móvil liquida o gaseosa descenderá e ira separando las sustancias que se encuentren en la muestra, donde serán cuantificadas e identificadas (Latacunga, 2018).

Cromatografía en capa fina

Se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte, en el cual separa las moléculas relativamente pequeñas (Latacunga, 2018). Básicamente consta de una fase móvil liquida y la fase estacionaria consiste en un sólido, el cual es un componente polar y el eluyente es una sustancia menos polar que la fase estacionaria, de manera que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sean los menos polares (Universidad Autónoma de México (UNAM), 2007).

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

Hidrocarburos < olefinas < Flúor < cloro < nitro < aldehído < ester < alcohol < cetona < amina < ácido < amidas

2.2.8 Actividad antioxidante (DPPH) La actividad antioxidante de los extractos es evaluada mediante la capacidad captadora del radical DPPH (actividad inhibidora del radical libre 1,1-difenil-2-picril hidracilo), estructura representada en la figura 6, que son leídas por el espectrofotómetro UV-Vis a 517 nm. Los resultados son referidos en porcentajes y expresados como capacidad antioxidante en mol de equivalentes Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromo-2-carboxílico; TE) / g de EEP (TEAC) (Martínez A. , 2003).

Figura 6. Estructura del radical libre 1,1-difenil-2-picril hidracilo, DPPH Fuente: (Londoño, J, 2011, p. 158)

2.2.9 Butilhidroxitolueno (BHT) Es un compuesto químico resistente a altas temperaturas, se utiliza para potencializar la acción antioxidante; según los autores Delgado, Palacio y Aperador (2015) mencionan “El BHT, estructura representada en la figura 7, es soluble en aceites e insoluble en agua, se usa para preservar aceites vegetales y es considerado como el antioxidante más ampliamente usado en lubricantes de origen vegetal y productos alimenticios”. (p.82)

Figura 7. Estructura del BHT Fuente: (The Merck index, 2013)

2.2.10 Flavonoides Son compuestos que tienen efecto antioxidante y eliminador de radicales libres a dosis altas, tiene efectos antiinflamatorios, antivirales o antialérgicos. Esta propiedad antioxidante se debe al gran número de grupos hidroxilos fenólicos y a la excelente propiedad de quelación del hierro y otros metales de transición, protegiendo del daño oxidativo, demostrándose en las diferentes estructuras presentadas en la figura 8. (Martínez et al., 2002)

Entre otras propiedades se tiene la capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides (con respuesta anti-prostático y anti-inflamatoria), tiene efecto antitrombotico y previene la placa de ateroma (protege a las lipoproteínas de baja densidad de la oxidación) (Martínez et al., 2002)

Un ejemplo de la capacidad antioxidante de los flavonoides es en un estudio donde se comprobó que en las células U937 tratadas con el agente terbutilhidroperóxido en bajas concentraciones son capaces de evitar la rotura y la oxidación del ADN, debido a la potente acción protectora que está relacionada directamente con la lipofilicidad (Sestili, et al., 2002)

Figura 8. Estructuras de los Flavonoides. Fuente: (Martínez, Gonzalez, & Tuñon, 2002)

2.2.10.1 Cuantificación de Flavonoides totales Para la cuantificación de flavonoides se lo realiza a través de reacciones colorimétricas, es así como McMurry (como se citó en Portilla, 2018) utiliza “el tricloruro de hierro, tricloruro de azufre, tricloruro de aluminio; donde forman complejos coloridos, que presentan absorbancia en el espectrofotómetro UV-Vis y así poder ser identificadas” (p.15).

2.2.10.2 Quercetina Es un antioxidante natural presente en gran variedad de alimentos que se ha asociado con la prevención de diversas enfermedades. Una de las propiedades importantes es que actúa como un antioxidante, protegiendo a las especies reactivas de oxígeno, mediante la neutralización de radicales libres como aniones superóxido, óxido nítrico, entre otros; se debe principalmente a los grupos hidroxilos apreciados en la figura 9. Además, el efecto antioxidante puede deberse por la capacidad de inhibir enzimas como la xantina oxidasa, lipooxigenasa y NADPH oxidasa, impidiendo la muerte celular (Vicente, Prieto y Morales, 2013).

Figura 9. Estructura de quercetina. Fuente: (Li, Y. et al., 2016)

2.2.11 Fenoles El Fenol posee en su estructura un anillo bencénico, y tiene un grupo Hidroxilo en lugar de uno de los átomos de Hidrógeno propio del Benceno (C6H6). El Fenol es sensible a agentes oxidantes, debido a que el grupo hidroxilo es sucedido por resonancia del radical feniloxilo resultante; este radical se oxida con facilidad llevando a la formación de dihidroxibenceno, trioxibenceno y/o quinonas. Estas propiedades mencionadas hacen que el fenol actué como un buen antioxidante por su propiedad de capturar radicales (Montizanan, 1994).

La actividad antimicrobiana de los fenoles se debe a la presencia de un grupo hidroxilo, que forma un puente de hidrógeno con un centro enzimático activo, teniendo un espectro mayor aumentando de esta manera su actividad, a la vez actúan como

23 permeabilizadores de la membrana. Los organismos Gram positivos son más sensibles a los aceites que los Gram negativos (García, 2006, p.98)

2.2.11.1 Cuantificación de fenoles totales Para su identificación se lo realiza mediante reacciones colorimétricas de Singleton y

Rossi; donde se coloca el reactivo de Follin-Ciocalteu, adicionando Na2CO3 al 20%, se deja en reposo por una hora, donde finalmente se lee en un espectrofotómetro UV-Vis a 760nm (Palomino, García, Gil, Rojano, y Durango, 2009).

2.2.12 Actividad Antimicrobiana El 60% de plantas utilizadas a nivel mundial, son para uso medicinal por su efectividad fitoterapeuta. De las 520 drogas aprobadas en 1983 y 1984, el 60 a 80% tienen actividad antimicrobiana y anticancerígeno (Castro, 2012).

La actividad antimicrobiana se puede obtener luego de tener la extracción o utilizándola directamente a nivel tópico. Por ejemplo, Ambrosia arborescens presenta flavonoides, fenoles, terpenos, alcaloides y otros componentes más que le dan esta acción.

Métodos para determinar la actividad antimicrobiana

Existe una gran cantidad de métodos que se puede aplicar en el laboratorio, como es el método de difusión, método de dilución, autobiografía (Reyes, Palou, y López, 2014). Para los extractos, el uso de métodos de difusión en disco ayuda al estudio de compuestos polares y los métodos de dilución para compuestos polares y apolares; además el medio de cultivo más frecuentemente utilizado es el agar Mueller-Hinton y agar Tripticasa de Soya, por el crecimiento rápido de las diferentes cepas bacterianas y la mayor difusión de las muestras. En la Tabla N°1 se observa las condiciones de incubación de los diferentes microorganismos (Luna, 2012, p.54).

Método de difusión

Este es un método de laboratorio que determina la sensibilidad bacteriana. El método se basa en la relación entre la concentración de la sustancia necesaria para inhibir una cepa bacteriana y el halo de inhibición de crecimiento en la superficie de una placa de agar con un medio de cultivo adecuado y sembrado homogéneamente con la bacteria a

24 ensayar y sobre la cual se ha depositado un disco de papel filtro de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado en pozo impregnado con una cantidad conocida de la sustancia, cabe mencionar que únicamente permite la medición de los halos inhibidos en mm; estos halos son interpretados como Sensible, Intermedio o Resistente según las categorías establecidas por la guía de interpretación The Clinical & Laboratory Standars Institute (CLSI) (Ramírez y Marín, 2009, p.264).

Tabla N° 1. Incubación de las placas con sus diferentes organismos

Elaborado por: EUCAST, 2012 Método de dilución

El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad microbiana es ORGANISMO CONDICIONES DE INCUBACIÓN Enterobacteriaceae 35±1 °C en aire durante 16-20h Pseudomonas spp. 35±1 °C en aire durante 16-20h Stenotrophomonas maltophilia 35±1 °C en aire durante 16-20h Acinetobacter spp. 35±1 °C en aire durante 16-20h Staphylococcus spp. 35±1 °C en aire durante 16-20h Enterococcus spp. 35±1 °C en aire durante 16-20h

Estrepctococcus de los grupos A, B, C y G 35±1 °C en aire con 4-6% de CO2 durante 16-20h

Estreptococcus grupo Viridans 35±1 °C en aire con 4-6% de CO2 durante 16-20h

Streptococcus pneumoniae 35±1 °C en aire con 4-6% de CO2 durante 16-20h Haemophilus spp. 35±1 °C en aire con 4-6% de CO2 durante 16-20h Moraxella catarrhalis 35±1 °C en aire con 4-6% de CO2 durante 16-20h Listeria monocytogenes 35±1 °C en aire con 4-6% de CO2 durante 16-20h Otros microorganismos exigentes Pendiente o Resistente según las categorías establecidas por el NCCLS utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (MBC) y la concentración mínima inhibitoria (MIC), la cual es definida como la concentración más baja de sustancia que puede inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de incubar por 24 horas, y la (MBC) como la concentración más baja que puede prevenir el crecimiento de un organismo después de subcultivar en un medio libre del compuesto evaluado, estas variables son una herramienta para investigar nuevos antimicrobianos (Ramirez, L. y Marín, D., 2009, p.264-265).

El método de dilución ha sido estandarizado para patógenos de rápido desarrollo, estos incluyen Staphylococcus spp., Enteroccocus spp., Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, Acinetobacter spp., Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophila (Luna, J., 2012).

2.2.12.1 Cepas de prueba Staphylococcus aureus: Pertenece a la familia Coccaceae. Es un coco Gram positivo, su nombre proviene del griego staphyle que significa racimo de uvas, son responsables de la inflamación y supuración. Son anaerobias facultativas, la mayoría de ellas son catalasa positiva (enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre), coagulasa positiva. Esté género tiene 32 especies, de las cuales 16 forman parte de la microbiota de piel y mucosas en humanos, y otras solo se encuentran entre la flora de otros mamíferos y aves (Cervantes, 2014, p.30).

Según Aucapiña (2019) menciona:

Esta bacteria es capaz de causar enfermedades de amplio espectro como infecciones menores de la piel e infecciones invasoras serias como: bacteriemia, infecciones del sistema nervioso central, osteomielitis, infecciones del tracto respiratorio, infecciones del tracto urinario y el síndrome de choque tóxico, así como infecciones gastrointestinales. (p.3).

Escherichia coli: Es una bacteria patógena que normalmente vive en los intestinos de las personas y los animales, desempeñando la función de digerir los alimentos. Sin embargo, algunos tipos de E. coli provocan diarrea y otras enfermedades que cuando se ingieren, producen calambres estomacales intensos y vómito (Boston Public Health Comission, 2019).

De acuerdo al autor Velarde (como se citó en Castillo, 2019) menciona:

Es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo, móvil por flagelos perítricos, fermentador de lactosa y glucosa, y no forma esporas. Para identificarlas la USP 39-NF 34 indica que se debe emplear Agar MacConkey y Caldo MacConkey debido a su capacidad de fermentar la lactosa. Esta capacidad le permite distinguir de otros coliformes que no fermentan la lactosa y que se pueden encontrar en alimentos, heces, agua y suelo. (p.25).

Es importante mencionar que la bacteria Escherichia coli cuenta con cuatro grupos patogénicos, que son mencionados en la tabla N°2

Tabla N° 2. Características de los grupos patogénicos de Escherichia coli

Grupo de E.coli Mecanismo patogénico Clínica Epidemiología

Enteropatógena Asociado a lesiones de Diarrea líquida con Frecuente en niños (ECEP clásica) borrado de las moco, vómito, menores de 2 años. microvellosidades de los fiebre. enterocitos

Enteroinvasora Invasión de la mucosa, Diarrea Generalmente son (ECEI) como las Shigellas desenteriforme casos de diarrea del (moco y sangre), viajero o de origen dolor abdominal, alimentario por fiebre alimentos importados

Enterotoxigénica Producción de Diarrea líquida Generalmente son (ECET) enterotoxinas: termolábil profusa, náuseas casos de diarrea del (LT) y termoestable (ST) viajero o de origen alimentario por alimentos importados

Enterohemorrágica Borramiento de las Diarrea Frecuente en países (ECEH) microvellosidades de los sanguinolenta desarrollados. enterocitos y producción afebril, síndrome de verotoxinas (VT) hemolítico urémico

Fuente: (Margall, N., Domínguez, Á., Prats, G. y Salleras, L., 1997, p.439).

Klebsiella pneumoniae: Es un patógeno oportunista colonizador de piel y mucosas de pacientes hospitalizados que pueden presentar infecciones invasoras como bacteriemias o septicemias (Andrade y Silva, 2004, p.525). Las características que presenta esta bacteria es que es un bacilo Gram negativo, no móvil, perteneciente a la

27 familia Enterobacteriaceae, para fermentación de lactosa son positivos, desprenden gas (López y Echeverri, 2009, p.158).

Pseudomonas aeruginosa: Es un patógeno oportunista perteneciente a la familia Pseudomonaceae, suelen ser los responsables de producir infecciones dérmicas, ocular, otitis, neumonía. Las características de esta bacteria es que es bacilo Gram negativo, móvil por la presencia de un flagelo polar, es aerobia, catalasa positiva y oxidasa positiva (Tovar, 2018, p.22).

Enterococcus faecalis: Es un patógeno oportunista, puede diseminarse por transmisión fecal-oral, por contacto con fluidos de personas infectadas o superficies contaminadas. Causan infecciones genitourinarias, al sistema nervioso central (raramente), intraabdominal, pélvica. El género Enterococcus es causante del más del 10% de infecciones nosocomiales, que son adquiridas en los hospitales (Díaz, Rodríguez y Zhurbenjo, 2010, p.148).

Por lo general son resistentes a penicilinas, cefalosporinas de varias generaciones y aminoglucósidos, especialmente a la vancomicina, esto se debe a la habilidad de bloquear el sitio de unión de la droga a la pared celular, por tal razón se utiliza en combinación con otros antibióticos activos a la pared celular (Díaz et al., 2010, p.149).

Las características que presenta el género Enterococcus es que son cocos Gram positiva, no formadoras de endosporas, son anaerobios facultativos, quimiorganotrofos, fermentadoras de lactosa, no producen gas, son catalasa negativa o débilmente positiva. Crecen en presencia de 40% de bilis y de hidrolizar la esculina (Díaz et al., 2010, p.149).

2.2.12.2 Control positivo Gentamicina

Es un antibiótico aminoglucósido con acción bactericida, altamente eficaz en casi todos los bacilos Gram negativos: Escherichia coli, especies de Enterobacter, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y otras especies de Proteus positivos a indol, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter, Enterobacter, Providencia y Serratia. También es activa contra diversas especies de Acinetobacter y Pseudomonas. Su actividad se extiende contra algunas bacterias Gram positivas, como Staphylococcus

28 aureus y Enterococcus faecalis. La gentamicina atraviesa la membrana celular de las bacterias susceptibles y se une de manera irreversible a las subunidades ribosómicas 30S; esta acción impide el inicio de la síntesis proteínica y al final provoca la muerte celular (Acces Medicina, s.f).

La susceptibilidad de las diferentes cepas bacterianas frente a gentamicina se explica en las tablas N° 3. Se realizó utilizando la guía de interpretación The Clinical & Laboratory Standars Institute (CLSI).

Tabla N° 3. Susceptibilidad de diferentes cepas bacterianas a gentamicina

Categorías interpretativas y zonas del punto de quiebre en mm Aminoglucósido Contenido del disco

S I R

Enterobacterias ≥15 13-14 ≤12

Pseudomonas aeruginosa 10 g ≥15 13-14 ≤12

Staphylococcus spp. ≥15 13-14 ≤12

Enterococcus spp. ≥10 7-8 6

Modificado de CLSI, 2019, p.38,44, 64, 114.

2.3 Fundamento Legal Constitución de la República del Ecuador, Registro Oficial N° 449, emitido el 20 de octubre de 2008.

Art. 57.- Mantener, proteger y desarrollar los conocimientos colectivos; sus ciencias, tecnologías y saberes ancestrales; los recursos genéticos que contienen la diversidad biológica y la agrobiodiversidad; sus medicinas y prácticas de medicina tradicional, con inclusión del derecho a recuperar, promover y proteger los lugares rituales y sagrados, así como plantas, animales, minerales y ecosistemas dentro de sus territorios; y el conocimiento de los recursos y propiedades de la fauna y la flora.

Art. 74.- Las personas, comunidades, pueblos y nacionalidades tendrán derecho a beneficiarse del ambiente y de las riquezas naturales que les permitan el buen vivir. Los servicios ambientales no serán susceptibles de apropiación; su producción, prestación, uso y aprovechamiento serán regulados por el Estado.

Art. 386.- El sistema comprenderá programas, políticas, recursos, acciones, e incorporará a instituciones del Estado, universidades y escuelas politécnicas, institutos de investigación públicos y particulares, empresas públicas y privadas, organismos no gubernamentales y personas naturales o jurídicas, en tanto realizan actividades de investigación, desarrollo tecnológico, innovación y aquellas ligadas a los saberes ancestrales.

Art. 387.- Será responsabilidad del Estado:

1.- Facilitar e impulsar la incorporación a la sociedad del conocimiento para alcanzar los objetivos del régimen de desarrollo.

2.- Promover la generación y producción de conocimiento, fomentar la investigación científica y tecnológica, y potenciar los saberes ancestrales, para así contribuir a la realización del buen vivir, al sumak kawsay.

3.- Asegurar la difusión y el acceso a los conocimientos científicos y tecnológicos, el usufructo de sus descubrimientos y hallazgos en el marco de los establecidos en la Constitución y la Ley.

4.- Garantizar la creación e investigación en el marco del respeto a la ética, la naturaleza, el ambiente, y el rescate de los conocimientos ancestrales.

5.- Reconocer la condición de investigador de acuerdo con la ley.

2.4 Hipótesis 2.4.1 Hipótesis alternativa, Ha • La actividad antioxidante y antimicrobiana depende del solvente utilizado para preparar los extractos a partir de las hojas de Ambrosia arborescens

2.4.2 Hipótesis nula, Ho • La actividad antioxidante y antimicrobiana no depende del solvente utilizado para preparar los extractos a partir de las hojas de Ambrosia arborescens

2.5 Conceptualización de variables

Etapa 1: Identificación botánica y control de calidad

En esta etapa no se realizó un diseño experimental, pero si una estadística básica

Etapa 2: Rendimiento de los extractos con los solventes etanol al 76%, metanol y diclorometano-metanol (1:1), de las hojas de Ambrosia arborescens, identificación de los grupos de Productos Naturales mediante tamizaje fitoquímico, perfil cromatográfico para identificar la presencia de metabolitos y finalmente cuantificación de fenoles totales y flavonoides totales.

Para esta etapa se realizó una estadística básica para el porcentaje de rendimiento de cada extracto; mientras que para la cuantificación de fenoles totales y flavonoides totales se realizó un diseño experimental ANOVA de dos factores.

Variable dependiente Variable independiente Rendimiento del extracto - Solventes a utilizar (Etanol 76%, metanol, diclorometano-metanol 1:1) - Lugar de recolección (Penipe, Guano) Cuantificación de fenoles totales (mg GE/g - Solventes a utilizar (Etanol 76%, ET) metanol, diclorometano-metanol 1:1) - Lugar de recolección (Penipe, Guano) Cuantificación de flavonoides totales (mg - Solventes a utilizar (Etanol 76%, QE/ gET) metanol, diclorometano-metanol 1:1) - Lugar de recolección (Penipe, Guano) Elaborado por Gabriela Chamorro

Etapa 3: Evaluación de actividad antioxidante

En esta etapa se emplea un diseño ANOVA multifactorial

Variable dependiente Variable independiente

- Solventes a utilizar (Etanol 76%, Actividad antioxidante metanol, diclorometano-metanol 1:1) - Lugar de recolección (Penipe, Guano) - Concentraciones de los extractos (ppm) Elaborado por Gabriela Chamorro

Etapa 4: Evaluación de actividad antimicrobiana

Para esta etapa se aplicó un diseño ANOVA multifactorial

Variable dependiente Variable independiente

Actividad antimicrobiana - Solventes a utilizar (Etanol 76%, metanol, diclorometano-metanol (halos de inhibición, mm) 1:1) - Lugar de recolección (Penipe, Guano) - Tipo de cepa (Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006, Pseudomonas aeruginosa C2-23 y Enterococcus faecalis ATCC2912.) - Concentraciones de los extractos (ppm) Elaborado por Gabriela Chamorro

CAPITULO III

3 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1 Diseño de la investigación La investigación por realizar tiene un enfoque cuantitativo, debido a que se pretende explicar y predecir el porcentaje de extracción de cada solvente utilizando las hojas de la especie Ambrosia arborescens, para evaluar la actividad antioxidante mediante la cantidad de flavonoides totales utilizando como estándar referente el marcador DPPH, esto con el fin de establecer cuál es el mejor extracto que presenta esta actividad. A la vez de cada extracto nos permitirá medir el halo de inhibición de los extractos obtenidos con el fin de evaluar la actividad antibacteriana.

El nivel de investigación es explicativo debido a que se busca el porqué de los acontecimientos establecidos, teniendo una relación directa entre causa (investigación postfacto) y efecto (investigación experimental) (Arguello y Sánchez, 2015), obteniendo así resultados que permitan tener un conocimiento más profundo acerca de los fenómenos acontecidos. (Morales, 2012)

Los tipos de investigación utilizada son la bibliográfica y la experimental. En el primer caso es debido a que se obtiene información sobre investigaciones realizadas de la especie Ambrosia arborescens por diferentes autores. En el segundo caso, es decir, la experimental es porque se realizará en el laboratorio de síntesis orgánica, laboratorio de productos naturales y laboratorio de microbiología, en donde se recolectó datos numéricos de los procesos efectuados y se analizará mediante procedimientos estadísticos, permitiendo comprobar o desmentir la hipótesis establecida.

3.2 Población y muestra

3.2.1 Población Para la presente investigación se tomó como población la especie vegetal Ambrosia arborescens (Marco).

3.2.2 Muestra La muestra utilizada son hojas de la especie Ambrosia arborescens (Marco), recolectas en los cantones Guano y Penipe en la Provincia de Chimborazo.

3.3 Métodos y Materiales

Tabla N° 4. Material de vidrio

Material Capacidad, mL

Asa de inoculación - Balón de extracción 500, 1000

Balones de vidrio 1000 Cajas Petri (90 x 150 mm) Crisoles 25, 50 Discos estériles para antibiograma (6mm) - Espátula - Gradilla - Guantes de nitrilo - Hisopos de algodón, mango de madera de - 12 cm Kitasato 250, 500 Mangueras - Marcador permanente - Matraces 1000 Micropipetas 1 Microplacas Elisa de 96 pocillos - Papel aluminio - Papel empaque - Papel filtro - Pera de succión - Pinza metálica - Pinza metálicas - Pinza metálicas - Pipeta Volumétrica 1, 5, 10, 25 Placas de silica gel (5x2 cm) - Probetas 100 Tubos de ensayo con tapa rosca 5, 10, 20 Varillas de vidrio - Vaso de precipitación 5, 25, 50 Viales de vidrio -

Tabla N° 5. Cepas Bacterianas

CEPAS DESCRIPCIÓN Escherichia coli ATCC 25922

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Klebsiella pneumoniae RTB006 Pseudomonas aeruginosa C2-23 Enterococcus faecalis ATCC2912 Elaborado por Gabriela Chamorro

Tabla N° 6. Reactivos

Reactivos Grado Acetato de plomo 1% Técnico Ácido ascórbico Analítico Ácido clorhídrico 1% Técnico Ácido gálico Analítico Ácido sulfúrico concentrado Técnico Anhidro acético Analítico Butil hidroxitolueno (BHT) Técnico Cloroformo Técnico Cloruro férrico Analítico Diclorometano Técnico DPPH Analítico Etanol 76° Técnico Etanol 96° Técnico Gentamicina 10g OXOID Medio de cultivo Mueller Hinton DIFCO Medio de cultivo TSA DIFCO Metanol HPLC Quercitina Técnico DPPH Analítico Reactivo de Dragendorff Analítico Reactivo Mayer Analítico Reactivo Wagner Analítico Solución salina Analítico

Tabla N° 7. Equipos

Equipo Marca Autoclave WISECLAVE (maxterile 80)

Balanza analítica METTLER TOLEDO d = 0,0001g Bomba de vacío THOMAS MEDI Cocineta HACEB Espectrofotómetro FISHER SCIENTIFIC Estufa BINDER Incubadora INCUCELL Lámpara UV COLE-PALMER (modelo 9818) Lector de microplacas BIOTEK (Hybrid reader) Mechero Bunsen - Mufla SYBRON THERMOLYNE Refrigeradora DUREX Rotavapor IKA IRV10 Vortex VELP SCIENTIFIC Elaborado por Gabriela Chamorro

3.4 Metodología La parte experimental consta de 4 etapas

Etapa 1

Recolección de las hojas de la especie Ambrosia arborescens en la parroquia de Langos -San Miguel en el cantón Guano y en la parroquia Chauzazan del cantón Penipe; que fue identificada la especie en el Herbario “Alfredo Paredes” de la Universidad Central del Ecuador.

Una vez realizada la identificación, se procedió a tratar el material vegetal, eliminando materia extraña, impurezas, partes de las hojas que se encuentren deterioradas, para dejar secar únicamente las hojas al aire libre, se determinó cenizas totales y cenizas insolubles en ácido clorhídrico.

Etapa 2

Obtención de los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens de los diferentes solventes utilizando, etanol 76°, diclorometano-metanol (1:1) y metanol; seguido se realizó el tamizaje fitoquímico de cada extracto para identificar los grupos de Productos

36 naturales, luego se realizó el perfil cromatográfico que permitió identificar los metabolitos secundarios y se procedió a cuantificar fenoles totales y flavonoides totales.

Etapa 3

Evaluación de la actividad antioxidante de los extractos totales obtenidos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens utilizando el método del radical DPPH; como referencia se utilizó el BHT

Etapa 4

Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos totales de los solventes etanólico al 76%, metanólico y una mezcla diclorometano-metanol (1:1) obtenidos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens, donde se midió los halos de inhibición, utilizando el método de Kirby-Bauer (método de difusión en agar), usando como control positivo gentamicina 10 g y como solvente se utilizó DMSO 1%.

3.5 Procedimiento Etapa 1

3.5.1 Obtención e identificación de la muestra vegetal Las hojas de la especie Ambrosia arborescens se obtuvieron en dos cantones de la Provincia de Chimborazo; el primero en la parroquia de Langos - San Miguel, cantón Guano y el segundo en la parroquia Chauzazan del cantón Penipe. Fueron identificadas en el Herbario “Alfredo Paredes” de la Universidad Central del Ecuador.

3.5.2 Tratamiento del material vegetal Se procedió a retirar todas las hojas que se encontraban en mal estado, eso quiere decir deterioradas, quedándonos con las hojas que presentaban un color verde característico de la planta, se desinfecto con hipoclorito de sodio al 0,5%, sumergiendo las hojas durante dos minutos (Albó, et al., 2018). Posterior se dejó secar, se trituró y se tamizó para reducir el tamaño de partícula.

3.5.3 Determinación del material vegetal por pérdida de secado

Se pesó 250 mg aproximadamente de muestra vegetal seca y tamizado, la muestra fue colocada en el equipo de Analizador de Humedad Mettler Toledo, el cual fue sometida a 105°C por 5 minutos, donde se reflejó el peso inicial de la muestra y la pérdida de peso, transcurrido un cierto tiempo se estabilizo la pérdida total de peso, donde dio un resultado final para calcular la humedad.

3.5.4 Determinación de cenizas totales

Para esta parte se utilizó como referencia la farmacopea Argentina (ANMAT, 2013, p.28), con una variación en el proceso.

Se pesó 2,0 g de material previamente tamizado y seco en un crisol, que anteriormente fue tarado. Inicialmente se sometió a calentamiento en una estufa, hasta que deje de emanar humo negro; posteriormente se colocó en una mufla a 675°C durante 5 horas para eliminar residuos carbonosos y finalmente se dejó enfriar en un desecador y se pesó. El criterio de aceptación es no más de 12% según WHO, (2002). El proceso se realizó por duplicado y para los cálculos se utilizó la siguiente ecuación:

(푀2−푀) % Cenizas totales = 푥100% Ec. 1 푀1−푀

Donde:

M: Peso en gramos del crisol vacío

M1: Peso en gramos de la muestra vegetal

M2: Peso en gramos del crisol vacío + muestra calcinada

3.5.5 Determinación de cenizas insolubles en ácido

Siguiendo el proceso anterior y con la guía de la farmacopea Argentina (ANMAT, 2013), se calentó a ebullición las cenizas obtenidas en el proceso de cenizas totales, con 25 mL de ácido clorhídrico 3M durante 5 minutos. Se recolecto el material insoluble en un papel filtro que previamente fue lavado con agua caliente, secado y pesado. Se determinó el porcentaje de cenizas insolubles en ácido a partir del peso de material vegetal empleado; el criterio de aceptación es no más de 1%.

(푀2−푀) % Cenizas insolubles en ácido = 푥100% Ec. 2 푀1−푀

Donde:

M: peso en gramos del crisol vacío

M1: Peso en gramos de muestra vegetal

M2: Peso en gramos del crisol + muestra vegetal

Tabla N° 8. Parámetros de control de calidad de materia vegetal

Parámetro Descripción Cenizas totales No mayor a 8% Cenizas insolubles en ácido No más a 1% Humedad No más a 12% Fuente: (WHO, 2002).

Etapa 2

3.6 Obtención de extractos totales

Se pesó 40 g de las hojas de la especie Ambrosia arborescens, que anteriormente fue secado y tamizado para reducir el tamaño de partícula. Se colocó en frascos de vidrio de 500 mL de capacidad, con soluciones de Etanol al 76%, metanol y una mezcla de diclorometano-metanol (1:1). Los frascos fueron sellados y macerados estáticamente por 72 horas. Cumpliendo este lapso de tiempo se filtró y se concentró en el rotavapor a una temperatura de 40 °C. Finalmente se colocó en frascos pequeños, rotulados y refrigerados para su posterior análisis.

Para verificar el porcentaje de rendimiento se calculó con la siguiente formula:

푔푟푎푚표푠 푑푒 푒푥푡푟푎푐푡표 표푏푡푒푛푖푑표 % Rendimiento = 푥100% Ec. 3 푔푟푎푚표푠 푑푒 푚푢푒푠푡푟푎 푣푒푔푒푡푎푙 푖푛푖푐푖푎푙

3.6.1 Tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico fue realizado en los extractos etanólico al 76%, metanólico y diclorometano-metanol (1:1), para determinar cualitativamente los grupos de productos naturales presentes en cada uno de ellos. Para ello se tomó como referencia el artículo de Iqbal et al., (2015).

Prueba de alcaloides

Se pesó aproximadamente 15 mg de cada extracto, se colocó 6 mL de ácido clorhídrico al 1%, posteriormente se llevó a baño María por 5 minutos y se filtró. Se tomó 6 mL del filtrado y se colocó en una placa, repartiéndolo en tres partes, se colocó en orden 1 mL de los siguientes reactivos:

Dragendorff: positivo si da un precipitado color rojo anaranjado

Mayer: positivo si da un precipitado color crema

Wagner: Positivo si da un precipitado color marrón

Prueba para terpenoides

Se pesó aproximadamente 100 mg de cada extracto el cual fue puesto en un tubo de ensayo, a esto se adicionó 2 mL de cloroformo y con ayuda de una pipeta volumétrica se colocó por las paredes del tubo 2 mL de H2SO4 (c). Sí presenta coloración marrón rojizo indica presencia de terpenoides.

Prueba para esteroides

Se pesó aproximadamente 100 mg de cada extracto el cual fue puesto en un tubo de ensayo, a esto se adiciono 2 mL de cloroformo, seguido de 5 gotas de ácido acético, se llevó a baño María y se enfrió en agua helada. Con una pipeta volumétrica se colocó 2 mL de H2SO4(c) por las paredes del tubo. Sí se forma un anillo marrón y la parte superior un color verde indica presencia de esteroides.

Prueba para taninos

Se pesó 500 mg de cada extracto que fue colocado en un tubo de ensayo respectivamente, a esto se adiciono 10 mL de agua destilada realizando agitación constante por 5 minutos, este fue filtrado, adicionado 3 gotas de cloruro férrico al 5%. Sí presenta una coloración o precipitado negro o azul verdoso indica presencia de taninos.

Prueba para saponinas

Se pesó 500 mg de cada extracto que fue colocado en un tubo de ensayo respectivamente, a esto se adiciono 10 mL de agua destilada, se llevó a baño María para calentamiento. Sí la presencia de espuma dura 5 minutos y mide más de 1 cm hay saponinas.

Prueba para glucósidos de antraquinona

Se pesó 100 mg de cada extracto que fue colocado en un tubo de ensayo respectivamente, a esto se adiciono 1 mL de H2SO4 al 5%, se llevó a baño María hasta ebullición y luego fue filtrado. Al filtrado se colocó 1 mL de cloroformo y se dejó en reposo por 5 minutos; posterior a esto se agito la capa inferior de cloroformo con la mitad de su volumen con amoniaco diluido. Sí presenta una coloración rosa o roja en la capa de amoniaco indica presencia de glucósidos de antraquinona.

Prueba para glucósido cardiotónico

Se pesó 500 mg de cada extracto que fue colocado en un tubo de ensayo respectivamente, se colocó 5 mL de agua destilada realizando una agitación constante, se adiciono 2 mL de ácido acético glacial, seguido de 3 gotas de cloruro férrico, finalmente con ayuda de una pipeta volumétrica se colocó 1 mL de H2SO4(c) por las paredes del tubo. Sí hay una formación de anillo marrón en la interfaz indica presencia de glucósido cardiotónicos.

Prueba para fenoles

Se pesó 100 mg de cada extracto, al cual se le colocó 10 mL de agua destilada, manteniendo una agitación constante. Se filtró y se agregó 3 gotas de acetato de plomo. Sí forma un precipitado indica la presencia de fenoles.

3.6.2 Perfil cromatográfico

Para esta parte se utilizó la cromatografía de capa fina; para la determinación de alcaloides se utilizó la fase móvil: cloroformo: metanol (19:1), como revelador el reactivo de Dragendorff. Para determinar terpenos se usó la fase móvil: éter de petróleo-acetato de etilo (7:3), para fenoles se utilizó la fase móvil: acetato de etilo-tolueno (7:3) y finalmente para taninos se utilizó la fase móvil ternaria: butanol-ácido acético-agua (4:1,5:5). Para estos casos se usó como revelador químico una solución de sulfato cérico amoniacal en ácido sulfúrico 0,1 N.

En las placas de toque se colocó 2 mg de cada extracto y se adicionó 10 gotas de metanol (con pipeta Pasteur) y se procedió a homogenizar. En las cromatoplacas de silica gel se sembró en banda, colocando 2 gotitas (con capilar) de cada extracto obtenido; en la primera placa se colocó los tres extractos, etanólico al 76%, metanólico y la mezcla

41 diclorometano-metanol (1:1), de las hojas de Ambrosia arborescens provenientes del cantón Guano y en la segunda cromatoplaca las del cantón Penipe. Se dejó secar las placas por aproximadamente 2 minutos.

Posteriormente, se prepararon las cámaras cromatográficas con 2 mL de la fase móvil correspondiente, dejando que se sature por aproximadamente 5 minutos. Pasado este tiempo se colocaron las placas y se dejó recorrer la fase móvil hasta llegar a una distancia de 0,4 cm de la parte superior de la placa. Luego con ayuda de una pinza se sacó las placas y se colocaron al ambiente para que secaran.

Finalmente, las placas fueron leídas en la lámpara de luz UV a 365 nm y 264 nm. Para observar de mejor manera las manchas producidas de cada extracto, se colocó el revelador químico dependiendo de lo que se va a determinar, para poder medir las distancias recorridas y determinar los Rf correspondientes.

3.6.3 Cuantificación de fenoles totales Para cuantificar los fenoles totales en los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens, se siguió la metodología de Folin-Ciocalteu, donde se realizó una curva de calibración de concentraciones conocidas de ácido gálico, para obtener la ecuación que nos ayudó a calcular los fenoles totales de cada muestra.

Preparación de la curva de calibración

Se preparó 10 mL de solución hidroalcohólica de ácido gálico a concentraciones de 100, 200, 300, 500 y 600 ppm. Con ayuda de una pipeta volumétrica se tomó 0,1 mL de esta solución en tubos de ensayo que previamente fueron envueltos en papel aluminio, a esto se colocó 0,5 mL del reactivo Folin-Ciocalteu junto con 2 mL de carbonato de sodio al 20%, que finalmente fue completado con 7,4 mL de agua destilada. Se dejó en reposo por aproximadamente 2 horas en un lugar donde no haya el traspaso de luz.

Como blanco se tomó 0,5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 7,5 mL de agua destilada y 2 mL de carbonato de sodio al 20%.

Las soluciones preparadas incluido el blanco fueron leídos a una longitud de onda de 765 nm en el espectrofotómetro.

Tabla N° 9. Curva de calibración del ácido gálico

Vol. Vol. Reactivo Vol. Carbonato Con. de Vol. A. Folin – Estándar Agua de sodio A.G ppm Gálico mL Ciocalteu mL 20% mL mL Blanco 0 0 0,5 9,5 2 1 100 0,1 0,5 9,4 2 2 200 0,1 0,5 9,4 2 3 300 0,1 0,5 9,4 2 4 500 0,1 0,5 9,4 2 5 600 0,1 0,5 9,4 2 Elaborado por Gabriela Chamorro

Preparación de las muestras

Las muestras permanecieron en un lugar aislado de la luz por aproximadamente 2 horas. Se leyeron finalmente a una longitud de onda de 765 nm en el espectrofotómetro.

Para los cálculos respectivos se utilizó la siguiente ecuación:

Y = mx-b Ec. 4

Donde:

Y= absorbancia de cada muestra x= Concentración de las soluciones de ácido gálico m= Pendiente de la recta b= Intersección de la recta

Los resultados para compuestos de fenoles totales se expresaron como mg AG/g ET

3.6.4 Cuantificación de flavonoides totales

Para cuantificar los flavonoides totales presentes en los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens, se realizó una curva de calibración de quercetina a concentraciones conocidas; el cual ayudo a obtener la ecuación por regresión lineal, que permitió calcular la cantidad de flavonoides totales encontrados en cada muestra.

Preparación de la curva de calibración

Se preparó 25 mL de solución hidroalcohólica de quercetina de 200 ppm. Con la solución madre, se procedió a preparar concentraciones de 1,5; 2; 4,5; 6; 7,5 y 9 ppm. Para tratar la muestra se utilizó 200 L de tricloruro de aluminio al 10% y se adiciono hasta completar 5 mL con etanol al 96%. Se dejó en reposo por aproximadamente 30 minutos en un lugar donde no haya traspaso de luz.

Como blanco se tomó etanol al 96%.

Las soluciones preparadas incluido el blanco fueron leídos a una longitud de onda de 425 nm en el espectrofotómetro.

Tabla N° 10. Curva de calibración de quercetina

Con. de Vol. Reactivo etanol Vol. AlCl3 Estándar quercetina 96% 10%(mL) ppm mL Blanco 0 0 5,00 1 1.5 200 4,76 2 2 200 4,75 3 4.5 200 4,68 4 6 200 4,65 5 7.5 200 4,61 6 9 200 4,57 Elaborado por Gabriela Chamorro

Preparación de las muestras

Se pesó 100 mg de cada extracto de las hojas de Ambrosia arborescens, se aforó con una solución hidroalcohólica al 96% en un balón aforado de 10 mL. Con una pipeta volumétrica se tomó 0,5 mL de la solución preparada, el cual fue transferido a un tubo de ensayo, a eso se adiciono 0,2 mL de tricloruro de aluminio al 10% y se completó a 5 mL con etanol al 96%. Las muestras se dejaron en reposo por aproximadamente 30 minutos en un lugar donde no haya traspaso de luz y finalmente fueron leídas a 425 nm en el espectrofotómetro.

Para los cálculos respectivos se utilizó la siguiente ecuación:

Y = mx-b Ec.5

Donde:

Y= absorbancia de cada muestra x= Concentración de las soluciones de quercetina m= Pendiente de la recta b= Intersección de la recta

Los resultados de flavonoides totales se expresaron como mg QE/g ET

Etapa 3

3.7 Evaluación de actividad antioxidante

En esta etapa se evaluó la actividad antioxidante mediante el método DPPH, de cada muestra, utilizando como marcador el estándar BHT.

Preparación de la solución de DPPH (100 ppm)

Utilizando el método de Brand-Williams, Cuvelier, & Berset, (1995) con ciertas modificaciones, se pesó en un balon aforado 1 mg de 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH), se disolvio con metanol grado HPLC y se aforo a 10 mL. Se realizo un barrido espectral donde la longitud de onda máxima fue de 517 nm.

Curva de calibración del estándar BHT(100 ppm)

Se pesó 1 mg de BHT, se transfirió a un balón aforado, en donde se disolvió con metanol grado HPLC, finalmente se aforo hasta 10 mL (solución madre). A partir de esta solución se prepararon concentraciones diferentes. En la siguiente tabla se muestra las concentraciones que fueron preparadas en micropocillos.

Como blanco se utilizó DPPH con metanol HPLC.

Las soluciones preparadas, junto con el blanco se colocaron en un lugar oscuro por 30 minutos, donde posteriormente fueron leídos a una longitud de onda de 517 nm.

Tabla N° 11. Curva de calibración del estándar BHT

Vol. Solución Vol. DPPH Con. de Vol. Metanol Estándar madre BHT 100 ppm BHT ppm L L L Blanco 0 0 60 140 1 2 4 60 136 2 4 8 60 132 3 6 12 60 128 4 8 16 60 124 5 10 20 60 120 6 12 24 60 116 7 14 28 60 112 Elaborado por Gabriela Chamorro

Preparación de las muestras

Utilizando la metodología de German, (2019), con ciertas modificaciones; se pesó 10 mg de cada extracto de las hojas de Ambrosia arborescens, se colocó en balones aforados respectivamente, se disolvieron con metanol HPLC y se aforaron hasta llegar a 10 mL. En micropocillos se realizó el tratamiento respectivo. En la siguiente tabla se especifica.

Como blanco 1 se utilizó DPPH + metanol

Como blanco 2 se utilizó la solución de cada concentración con metanol

Tabla N° 12. Preparación de las muestras

Con. de Vol. DPPH Vol. Muestras Vol. Metanol Estándar muestras 100 ppm L L ppm L 1 2 4 60 136 2 4 8 60 132 3 6 12 60 128 4 8 16 60 124 5 10 20 60 120 Elaborado por Gabriela Chamorro

Para realizar los cálculos respectivos se utilizó la siguiente formula

퐴푚−퐴푏 % inhibición del radical DPPH = (1 − )푥100% Ec. 6 퐴푝푟

Donde:

퐴푚 = Absorbancia de la muestra 퐴푏 = Blanco de la muestra (muestra + metanol) 퐴푝푟 = Blanco del patrón de referencia (DPPH + metanol)

Etapa 4

3.8 Evaluación de la actividad antibacteriana

Para la evaluación de la actividad antibacteriana de cada extracto se realizó mediante el método de difusión de discos frente a cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006, Pseudomonas aeruginosa C2-23 y Enterococcus faecalis ATCC2912.

Activación de cepas bacterianas

Para la activación de la cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923, se realizó tomando con un palillo, previamente esterilizado, se estrió la cepa ATCC 25923 (se lo conservó en el ultracongelador a -80°C) en una caja que contenía Agar TSA, y se incubó a 35±2°C por 24 horas. Este mismo proceso se realizó para activar todas las cepas anteriormente mencionadas.

Preparación de las muestras

Esta técnica fue tomada de Ayala, S., & Vásquez, T. (2014), en donde se realizaron soluciones consecutivas a partir de una concentración de 1000 ppm, tomando en cuenta la densidad del dimetilsufóxido de 1,1 g/mL

Se prepararon soluciones de 1000 ppm de cada muestra (etanol 76%, metanol y diclorometano-metanol), donde se pesó 10 mg del extracto y se disolvió con DMSO 1%, posterior a esto se aforo con la misma solución hasta 10 mL; de esta solución madre se preparó concentraciones que van de 400 a 1000 ppm respectivamente para cada muestra.

Tabla N° 13. Preparación de las muestras

Vol. Solución madre Vol. DMSO Con. de muestras Tubos muestras (2000 ppm) mL ppm mL Blanco 0 10 1 1000 ------2 900 9 1 3 800 8 1 4 700 7 1 5 600 6 1 6 500 5 1 7 400 4 1 Elaborado por Gabriela Chamorro

Preparación de la escala 0,5 McFarland para cada inóculo

Se preparó una solución salina al 0,85% en tubos de ensayo que se llevó al autoclave; con ayuda de un asa se tomó de dos a tres colonias de la cepa que se encontraban en las cajas de TSA que anteriormente fueron activadas y se colocó en los tubos respectivos, se homogenizo con ayuda del vórtex y se comparó cualitativamente con una escala McFarland 0,5 certificada

Método de difusión de discos

Se preparó cajas Petri con Agar Mueller-Hinton de acuerdo a las especificaciones del fabricante, totalmente estériles y guardadas en la refrigeradora hasta su posterior uso.

En el puesto de trabajo con la mesa descontaminada utilizando alcohol al 70%, con llama encendida, se colocó de a poco las cajas Petri, con el fin de evitar contaminación con el área; se tomó un hisopo esterilizado, se sumergió en el tubo donde estaba la preparación de la escala McFarland y realizando una ligera presión en las paredes del tubo se trató de eliminar el exceso, se procedió a sembrar en la superficie de las placas de Agar-Mueller con el hisopo, de tal manera que cubriera toda la superficie y no quede ningún espacio sin ser sembrada. Se dejó secar por 5 minutos. Una vez que paso el tiempo mencionado, se colocaron los discos en blanco (d=6 mm), en la cual se vertió 30 L de cada concentración en su disco respectivo, aparte en cada caja se colocó el control negativo que fue DMSO 1% y el control positivo que fue gentamicina 10 g. Una vez realizado todo el procedimiento, se dejó en la incubadora por 24 horas a 35±2°C. Finalmente se midió con una regla los halos de inhibición. Este ensayo se realizó por duplicado.

3.9 Diseño Experimental

Etapa 1

En esta etapa se realizó únicamente una estadística básica.

Etapa 2

Para esta etapa se realizó una estadística básica para el porcentaje de rendimiento de cada extracto y perfil cromatográfico; mientras que para la cuantificación de fenoles totales y flavonoides totales se realizó un diseño experimental ANOVA bifactorial.

Tabla N° 14. Operacionalización de las variables de la etapa 2

Variable Dimensión Indicador Cantidad de metabolitos Concentración de fenoles mg de ácido gálico/ g ET secundarios presentes en totales cada extracto (etanol 76%, metanol, Concentración de mg de quercetina/g ET dilocormetano:metanol flavonoides (1:1)) de las hojas de Ambrosia arborescens Elaborado por Gabriela Chamorro

Tabla N° 15. Factores y niveles de la etapa 2

Especie Ubicación Solventes Absorbancia geográfica R1 R2 R3 - Etanol 76% PE1 PE2 PE3 - Metanol PM1 PM2 PM3 Penipe - Diclorometano- PD1 PD2 PD3 Ambrosia metanol (1:1) arborescens - Etanol 76% GE1 GE2 GE3 - Metanol GM1 GM2 GM3 Guano - Diclorometano- GD1 GD2 GD3 metanol (1:1) Elaborado por Gabriela Chamorro

Donde:

R: son las repeticiones

PE: Penipe-etanol 76%; PM: Penipe-metanol; PD: Penipe-diclorometano-metanol (1:1)

GE: Gueno-etanol 76%; GM: Guano-metanol; GD: Guano-diclorometano-metanol (1:1)

Etapa 3

La tercera etapa corresponde a la evaluación de la actividad antioxidante, en donde las variables son el lugar de recolección, los extractos, las concentraciones de las muestras analizadas y la variable respuesta es el porcentaje de inhibición de DPPH. En donde el diseño experimental es de tres factores. Cabe recalcar que se realizó por triplicado los análisis.

Tabla N° 16. Operacionalización de las variables de la etapa 3

Variable Dimensión Indicador Comparación de la ubicación geográfica Porcentaje de inhibición de -Estándar de referencia radical DPPH (BHT) Comparación del estándar -Extractos hidroalcohólico con cada extracto obtenido al 76%, metanólico y Actividad antioxidante de diferentes diclorometano-metanol concentraciones (1:1) Comparación del estándar - Concentraciones de cada con cada extracto obtenido extracto de diferentes solventes Elaborado por Gabriela Chamorro

Tabla N° 17. Factores y niveles de la etapa 3

Ubicación Solventes Concentración geográfica

Penipe - Etanol 76% PE1, PE2, PE3, PE4, PE5 - Metanol PM1, PM2, PM3, PM4, PM5 - Diclorometano- PDM1,PDM2,PDM3,PDM4,PDM5 metanol (1:1) Guano - Etanol 76% GE1,GE2, GE3,GE4,GE5 - Metanol GM1,GM2,GM3,GM4,GM5 - Diclorometano- GDM1,GDM2,GDM3,GDM4,GDM5 metanol (1:1)

Elaborado por Gabriela Chamorro

Donde las concentraciones de cada extracto fueron:

2 ppm; 4 ppm; 6 ppm; 8 ppm; 10 ppm

Etapa 4

La cuarta etapa corresponde a la evaluación de la actividad antimicrobiana, en donde las variables son el lugar de recolección, los extractos con los diferentes solventes, las concentraciones de las muestras analizadas, las cepas y como variable respuesta es el diámetro de halos de inhibición (mm). En donde el diseño experimental es de cuatro factores. Cabe recalcar que se realizó por duplicado los análisis.

Tabla N° 18. Operacionalización de las variables de la etapa 4

Variable Dimensión Indicador Actividad antibacteriana - Tipo de cepa Medición del halo de - Extractos inhibición (mm) usando hidroalcohólico al como control positivo 76%, metanólico y gentamicina 10 g. diclorometano- metanol (1:1) - Concentración de cada extracto Elaborado por Gabriela Ch.

Tabla N° 19. Factores y niveles de la etapa 4

Ubicación Solventes Tipo de bacteria Concentraciones Geográfica Penipe Etanol 76% Escherichia coli PEE1, PEE2,PEE3,PEE4,PEE5,PEE6,PEE7 ATCC 25922 Staphylococcus PES1, PES2,PES3,PES4,PES5,PES6,PES7 aureus ATCC 25923 Klebsiella PEK1, PEK2,PEK3,PEK4,PEK5,PEK6,PEK7 pneumoniae RTB006 Pseudomonas PEP1, PEP2,PEP3,PEP4,PEP5,PEP6,PEP7 aeruginosa C2-23 Enterococcus PEF1, PEF2,PEF3,PEF4,PEF5,PEF6,PEF7 faecalis ATCC2912 Metanol Escherichia coli PME1, ATCC 25922 PME2,PME3,PME4,PME5,PME6,PME7 Staphylococcus PMS1, aureus ATCC PMS2,PMS3,PMS4,PMS5,PMS6,PMS7 25923 Klebsiella PMK1, pneumoniae PMK2,PMK3,PMK4,PMK5,PMK6,PMK7 RTB006 Pseudomonas PMP1, aeruginosa C2-23 PMP2,PMP3,PMP4,PMP5,PMP6,PMP7 Enterococcus PMF1, faecalis PMF2,PMF3,PMF4,PMF5,PMF6,PMF7 ATCC2912 Diclorometano- Escherichia coli PDE1, PDE2,PDE3,PDE4,PDE5,PDE6,PDE7 metanol (1:1) ATCC 25922 Staphylococcus PDS1, PDS2,PDS3,PDS4,PDS5,PDS6,PDS7 aureus ATCC 25923 Klebsiella PDK1, pneumoniae PDK2,PDK3,PDK4,PDK5,PDK6,PDK7 RTB006 Pseudomonas PDP1, PDP2,PDP3,PDP4,PDP5,PDP6,PDP7 aeruginosa C2-23 Enterococcus PDF1, PDF2,PDF3,PDF4,PDF5,PDF6,PDF7 faecalis ATCC2912

Guano Etanol 76% Escherichia coli GEE1, ATCC 25922 GEE2,GEE3,GEE4,GEE5,GEE6,GEE7

Staphylococcus GES1, GES2,GES3,GES4,GES5,GES6,GES7 aureus ATCC 25923 Klebsiella GEK1, pneumoniae GEK2,GEK3,GEK4,GEK5,GEK6,GEK7 RTB006 Pseudomonas GEP1, GEP2,GEP3,GEP4,GEP5,GEP6,GEP7 aeruginosa C2-23 Enterococcus GEF1, GEF2,GEF3,GEF4,GEF5,GEF6,GEF7 faecalis ATCC2912 Metanol Escherichia coli GME1, ATCC 25922 GME2,GME3,GME4,GME5,GME6,GME7

Staphylococcus GMS1, aureus ATCC GMS2,GMS3,GMS4,GMS5,GMS6,GMS7 25923 Klebsiella GMK1, pneumoniae GMK2,GMK3,GMK4,GMK5,GMK6,GMK7 RTB006 Pseudomonas GMP1, aeruginosa C2-23 GMP2,GMP3,GMP4,GMP5,GMP6,GMP7 Enterococcus GME1, faecalis GME2,GME3,GME4,GME5,GME6,GME7 ATCC2912 Diclorometano- Escherichia coli GDE1, metanol (1:1) ATCC 25922 GDE2,GDE3,GDE4,GDE5,GDE6,GDE7

Staphylococcus GDS1, aureus ATCC GDS2,GDS3,GDS4,GDS5,GDS6,GDS7 25923 Klebsiella GDK1, pneumoniae GDK2,GDK3,GDK4,GDK5,GDK6,GDK7 RTB006 Pseudomonas GDP1, aeruginosa C2-23 GDP2,GDP3,GDP4,GDP5,GDP6,GDP7 Enterococcus GDF1, faecalis GDF2,GDF3,GDF4,GDF5,GDF6,GDF7 ATCC2912 Elaborado por Gabriela Chamorro

Donde las concentraciones de los extractos fueron:

1000 ppm; 900 ppm; 800 ppm; 700 ppm; 600 ppm; 500 ppm; 400 ppm

CAPITULO IV

4 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1 Etapa 1

4.1.1 Recolección e Identificación del material vegetal

Para esta investigación se recolectó únicamente las hojas de la especie Ambrosia arborescens provenientes de la Provincia de Chimborazo, en la parroquia de Langos - San Miguel en el cantón Guano con coordenadas (S 1° 36' 38"; O 78° 37' 5,3") y en el sector Chauzazan, parroquia matriz, cantón Penipe con coordenadas (S 1° 33' 18.2"; O 78° 32' 23,7"), esto se lo realizó a inicios del mes de abril del 2019, con el fin de obtener buen material vegetal; Ocaña y Mario (2000), menciona:

Es preferible obtener las plantas antes que empiecen las heladas, en el mes de marzo- abril para obtener una planta de buena calidad en términos de tamaño, lignificación y sistema radicular; eso debido a que las plantas tiernas son susceptibles a ser afectadas por temperaturas muy bajas. (p.33)

La identificación fue realizada en el Herbario “Alfredo Paredes” de la Universidad Central del Ecuador, donde se verificó que las muestras a estudiar pertenecen a la especie Ambrosia arborescens, recolectadas en los cantones de Guano y Penipe, las mismas que son nativas del Ecuador. El certificado emitido se encuentra adjunto en el Anexo E

4.1.2 Control de calidad del material vegetal

De acuerdo a las especificaciones tomadas por Linneo (1787) para las hojas de Ambrosia arborescens, se evaluaron las características organolépticas, color y olor, y para el cálculo del porcentaje de material extraño, de una forma visual se fue retirando las partes que no eran aptas para la realización de la maceración. Observándose así los resultados obtenidos en las tablas N° 20 y 21

Tabla N° 20. Especificaciones organolépticas de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Parámetro Especificación Ubicación geográfica Guano Penipe Características Alternas, lisas, algo Cumple Cumple rugosas, con pecíolo y vellosas por debajo Color Verde Cumple Cumple Olor Característico Cumple Cumple Elaborado por Gabriela Chamorro En la tabla Nº 20 se detalla las especificaciones organolépticas dadas por Linneo (1787) y Cano de Terrones (2014), que al comparar con la especie vegetal en estudio se determinó que cumplen con las especificaciones dadas.

Tabla N° 21. Porcentaje del material extraño de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Ubicación Peso inicial, g Peso final, g Materia Especificación geográfica extraña, % Guano 50,00 49,9586 4,14 No más del Penipe 50,00 49,9312 5,08 6% Elaborado por Gabriela Chamorro

El material extraño es cualquier organismo, residuos minerales, que no son parte de la descripción propia de la planta (ANMAT, 2013). En la tabla N° 21 se observa que el contenido de materia extraña para la especie de Guano es 4,14% y para la de Penipe es 5,08%. De acuerdo a la WHO (1998), las dos especies cumplen con las especificaciones.

4.1.2.3 Determinación de humedad del material vegetal La determinación de la humedad se realizó mediante el método termogravimétrico, usando como referencia WHO (2002)

Tabla N° 22. Resultados del porcentaje de humedad por el método termogravimétrico de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Ubicación Repetición Humedad, % 푿̅±휹 Especificación geográfica Guano 1 9,74 2 8,92 9,02±0,67 3 8,40 No más a 12% Penipe 1 8,43 2 8,43 8,31±0,21 3 8,06

En la Tabla N° 22 se detalla el porcentaje de humedad de las diferentes repeticiones y se establece que el porcentaje promedio para la especie de Penipe es 8,31±0,21, mientras que para la de Guano es 9,02±0,67, cumpliendo ambas con la especificación establecida por WHO (2002).

Estos resultados están en concordancia con los reportados por Ibarra y Paredes (2013), con un contenido de humedad de 7,8% y de Cruz (2009) con el 7,3%.

Porcentaje de rendimiento El cálculo de rendimiento de la preparación de los extractos se realiza según la siguiente ecuación: 푔 푑푒푙 푒푥푡푟푎푐푡표 푡표푡푎푙 % 푅푒푛푑푖푚푖푒푛푡표 = 푥100 푔 푑푒 푚푢푒푠푡푟푎 푣푒푔푒푡푎푙 푖푛푖푐푖푎푙 Tabla N° 23. Resultados del porcentaje de rendimiento de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Ubicación Solvente Peso inicial, g Peso Rendimiento, % geográfica extracto, g

Guano Etanol 76% 50,00 4,92 9,84 Metanol 50,00 7,52 15,04 Diclorometano- 50,00 8,62 17,24 metanol Penipe Etanol 76% 50,00 3,92 7,84 Metanol 50,00 6,24 12,48 Diclorometano- 50,00 7,27 14,54 metanol Elaborado por Gabriela Chamorro Como se observa en la tabla N° 23, el extracto preparado con la mezcla diclorometano-metanol (1:1) de la especie de Guano corresponde al de mayor rendimiento (17,24%), en cambio, el preparado con el etanol 76% de la especie de Penipe obtuvo el menor rendimiento (7,84%).

El mayor rendimiento obtenido se debe a que la mezcla diclorometano-metanol es un solvente móvil que ingresa con facilidad en los cuerpos porosos, teniendo la propiedad de disolver materias grasas, obteniendo así, la mayor cantidad de compuestos presentes en los extractos a evaluar. (Messchelein, L., 2004, p.69-70)

Tomando referencias como Ayala & Vásquez (2014), utilizaron como solvente etanol al 96%, obteniendo un rendimiento de 3,94%; de la misma manera Ibarra y Paredes (2013), trabajaron con el solvente etanol al 70% teniendo un rendimiento de 2,70% y

55 finalmente Vera (2008), utilizando como solvente metanol obtuvo un rendimiento de 9,56%.

4.1.2.4 Determinación de cenizas totales

푀 −푀 % Cenizas totales = [ 2 ] 푋100 푀1−푀 Donde: M: masa del crisol vacío

M1: Masa del crisol con la muestra vegetal

M2: Masa del crisol con cenizas Tabla N° 24. Resultados del porcentaje de cenizas totales de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Ubicación Repetición Cenizas 푿̅±σ Especificación geográfica totales, % (WHO) Guano 1 7,28 7,63±0,42 2 8,10 No más a 12% 3 7,53 Penipe 1 7,76 7,70±0,44 2 8,11 3 7,24 Elaborado por Gabriela Chamorro

De la tabla N° 24 se puede deducir que los promedios de cenizas totales de las hojas de Ambrosia arborescens casi son similares, para la de Guano (7,63±0,42%) y para Penipe (7,70±0,44%). Ambas especies cumplen con las especificaciones de la WHO (2002).

Ibarra & Paredes (2013), hacen una mención al referirse que el porcentaje de cenizas totales presentes en esta especie es del 16%, demostrando que la cantidad de minerales presentes en nuestras hojas es baja a comparación con el reportado.

4.2 Etapa 2

4.2.1 Tamizaje fitoquímico

La metodología para el tamizaje fitoquímico se observa en el apartado 3.6.1 del capítulo 3.

Tabla N° 25. Tamizaje fitoquímico del extracto metanólico de las hojas de Ambrosia arborescens

Ubicación geográfica Reacciones Penipe Guano Alcaloides Mayer + + Dragendorff +++ +++ Wagner +++ +++ Fenoles Acetato de plomo ++ ++ Esteroides/terpenos Salkowski - - Liebermann-Burchard + + Taninos Cloruro férrico al 5% ++ ++ Saponinas Agua - - Glicósidos Borntrager - - antraquinona Glicósidos Keller Killiani - - cardiotónicos Elaborado por Gabriela Chamorro

Tabla N° 26. Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico al 76% de las hojas de Ambrosia arborescens

Ubicación geográfico Reacciones Penipe Guano Alcaloides Mayer + + Dragendorff +++ +++ Wagner +++ +++ Fenoles Acetato de plomo ++ ++ Esteroides/terpenos Salkowski - - Liebermann-Burchard + + Taninos Cloruro férrico al 5% ++ ++ Saponinas Agua - - Glicósidos Borntrager - - antraquinona Glicósidos cardiotónico Keller Killiani - - Elaborado por Gabriela Chamorro Tabla N° 27. Tamizaje fitoquímico del extracto diclorometano-metanol de las hojas de Ambrosia arborescens

Interpretación: (+++) Mayormente (++) Medio (+) Bajo (-) Ausente Observando las Tablas N° 25, 26 y 27 referente al tamizaje fitoquímico de los diferentes solventes utilizados, de los dos lugares recolectados, dieron positivo a la presencia de alcaloides, fenoles, terpenos y taninos. En cambio, se determinó la ausencia de glicósidos, esteroides, saponinas. La presencia de ciertos grupos de Productos Naturales en ambas especies está en concordancia con los reportados por Machacca (2014), donde se menciona la presencia de alcaloides, taninos, fenoles y hasta incluso carbohidratos.

Según Rodón (Machacca, 2014), menciona que los metabolitos secundarios presentes, pueden producir afecciones, inclusive puede ser tóxica para el Ser Humano, si no es utilizada en la dosis adecuada.

4.2.2 Perfil cromatográfico Para la realización de cromatografía en capa fina, los extractos se disolvieron en metanol previo a su aplicación en la cromatoplaca. Se utilizaron diferentes fases móviles de acuerdo a los mencionados en las pp. 65-66 para comprobar la presencia de alcaloides, taninos, fenoles y terpenos, las respectivas cromatoplacas se encuentran en el anexo H.

Tabla N° 28. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar alcaloides.

Muestra Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 Compuesto identificado GE 0,46 0,70 ------GM --- 0,70 --- 0,90 GDM --- 0,70 --- 0,90 Alcaloides PE 0,46 0,70 --- 0,90 PM 0,34 0,70 --- 0,90 PDM --- 0,70 --- 0,90 Elaborado por Gabriela Chamorro

Se identificó la presencia de alcaloides mediante cromatografía en capa fina. En la cromatoplaca que se reveló en luz UV (365 nm) se observaron tres manchas: una rosada

58 con un Rf de 0,34 para PM y 0,46 para GE y PE, una violeta con un Rf de 0,70 y una rosada intensa con un Rf de 0,90. Observándose un mismo patrón en los extractos

Los autores Witabouna y Brahima (citado en San Román, 2014), comentan que “encontraron con el Método de Erlich por cromatografía que la Bidens pilosa (Asteraceae) eluyo obteniendo los siguientes (Rf) de 0.69 y Rf de 0.3, 0.06 y 0.05 para diferentes extractos de plantas” (p.119). Cabe mencionar que el reactivo de Erlich es exclusivamente para identificar alcaloides pirrolizidínicos. San Román realizó una comparación con el reactivo sulfato cérico amoniacal, dando positivo para este tipo de alcaloides, por lo tanto, utilizando los dos reactivos como reveladores, da positivo para este tipo de alcaloides.

En nuestro estudio el Rf es similar al de la referencia siendo de 0,69 y para la placa trabajada siendo de 0,70, por lo que existe presencia de alcaloide pirrolizidínicos en todos los extractos.

Tabla N° 29. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar fenoles.

Muestra Rf1 Rf2 Rf3 GE 0,51 0,66 0,80 GM --- 0,66 0,80 GDM --- 0,66 0,80 PE 0,34 0,66 0,80 PM 0,34 0,66 0,80 PDM 0,34 0,66 0,80 Elaborado por Gabriela Chamorro

Se identificó la presencia de fenoles mediante cromatografía en capa fina. En la cromatoplaca que se reveló en luz UV (365 nm) se observaron tres manchas: una rosada con un Rf de 0,34 para PE, PM, PDM y 0,51 para GE, una azul con un Rf 0,51 para GE y una violeta con un Rf de 0,80.

De acuerdo a Tolg, C., (2014) los compuestos fenólicos se presentan con una coloración azulada, como se indica en la fig. 9. Cabe mencionar que no identifica el tipo de fenol.

De acuerdo a Vera (2008), reporta en su estudio fitoquímico de la especie Ambrosia arborescens la identificación de 3 compuestos fenólicos que son benzil -D- glucopiranósido (C13H18O6), ácido salicílico (C7H6O3) y -hidroxiacetofenona (C8H8O2).

Tabla N° 30. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar terpenos.

Muestra Rf1 Rf2 Rf3 Compuesto identificado GE 0,17 0,52 0,87 GM 0,17 0,53 0,87 GDM 0,17 0,52 0,87 Terpenos PE 0,17 0,51 0,87 PM 0,17 0,52 0,87 PDM 0,17 0,51 0,87 Elaborado por Gabriela Chamorro

Se identificó la presencia de terpenos mediante cromatografía en capa fina. En la cromatoplaca que se reveló en luz UV (365 nm) se observaron tres manchas: una violeta con un Rf de 0,17, una violeta más intensa con un Rf que oscila entre 0,51-0,53 y una rosada con un Rf de 0,87. En todos los extractos se observó el mismo patrón.

Tomado de la Enciclopedia de Cromatografía, el autor Gocan (2004), en el análisis de terpenos por TLC utilizando como fase móvil acetato de etilo-hexano (7:5), menciona los valores obtenidos con Rf de 0,60 perteneciente al compuesto p-cimeno, y el Rf 0,83 pertenece al compuesto -pineno; de esta manera se puede verificar en la Fig. 10 en la cromatoplaca estándar, las coloraciones que dan para los diferentes tipos de terpenos, a la vez menciona Fun, Y., el tipo de terpenos que fueron identificados, coincidiendo con el compuesto p-cimeno.

Tabla N° 31. Valores de los factores de retención (Rf) de los diferentes extractos de las hojas de Ambrosia arborescens para identificar taninos.

Muestra Rf1 Rf2 Compuesto identificado GE 0,51 0,90 GM 0,53 0,90 GDM 0,56 0,90 Taninos PE 0,51 0,90 PM 0,53 0,90 PDM 0,56 0,90 Elaborado por Gabriela Chamorro

Para identificar taninos se utilizó como fase móvil la mezcla de solventes butanol- ácido acético-agua (4:1,5:5); al colocar en la lámpara de luz UV a 365nm se visualizó unas manchas rosadas muy pronunciadas con un Rf para todos los extractos que va desde

0,51-0,56; a la vez se observaron unas manchas celestes en todos los extractos con un Rf de 0,90.

El autor Rivera (2019) en el análisis farmacognóstico para identificar taninos del extracto etanólico de Ambrosia arborescens obtiene un Rf de 0,96. Al hacer una comparación con los datos obtenidos, se confirma la presencia de este metabolito; cabe mencionar que existen los taninos hidrolizables que bien puede estar en esta especie, estos pueden ser azúcares simples o ácido gálico.

4.2.3 Cuantificación de fenoles totales de los extractos obtenidos de los diferentes solventes de las hojas de la especie de Ambrosia arborescens

La cuantificación de fenoles se realizó con el método espectrofotométrico, utilizando como marcador ácido gálico, observándose los resultados a cada concentración trabajada. Tabla N° 32. Curva de calibración del ácido gálico

Concentración de ácido Estandar Absorbancia gálico, ppm Blanco 0 0 1 1,00 0,053 2 2,00 0,078 3 3,00 0,102 4 5,00 0,162 5 6,00 0,197 Elaborado por Gabriela Chamorro

Absorbancia Vs Concentración A.G

0,25 y = 0,0287x + 0,0207 0,2 R² = 0,996 0,15 0,1

Absorbancia 0,05 0 0 1 2 3 4 5 6 7

Concentración A.G ug/mL

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 10. Curva de calibración de ácido gálico Con la ecuación obtenida de la curva de calibración de ácido gálico, se realizó los cálculos para obtener la concentración de cada extracto, en la Tabla N° 32 se manifiesta

61 los resultados obtenidos directamente, cabe mencionar que las lecturas se realizaron por triplicado. A continuación, se realiza el respectivo cálculo:

Regresión:  = 0,02070 + 0,0287x 0.152 − 0.0207 퐶 = = 4,574휇푔퐸푄/푚푙 푓푒 0.0287 Para expresar por gramo de extracto seco: 4,574휇푔 10 푚푙 10 푚퐿 퐸퐸푇 1000푚푔 1000푚푔 퐶 = × × × × 푓푙 푚푙 푠표푙푢푐푖ó푛 0.1푚푙 퐸퐸푇 100 푚푔 푒푥푡푟푎푐푡표 푠푒푐표 1 푔 106휇푔

푚푔 퐴.퐺 퐶 = 45,74 푓푒 푔 푒푥푡푟푎푐푡표 푠푒푐표

Tabla N° 33. Concentración de fenoles totales expresados en mg ácido gálico/g de extracto total

Muestra Absorbancia Concentración, mg A.G/ g ET Promedio R1 R2 R3 R1 R2 R3 푿̅±휹 GE76% 0,152 0,152 0,151 45,74 45,74 45,40 45,63±0,20 GM 0,137 0,136 0,134 40,52 40,17 39,47 40,05±0,53 GDM 0,068 0,066 0,069 16,48 15,78 16,82 16,36±0,53 PE76% 0,182 0,184 0,182 56,20 56,89 56,20 56,43±0,40 PM 0,129 0,131 0,133 37,73 38,43 39,12 38,43±0,69 PDM 0,075 0,074 0,072 18,91 18,57 17,87 18,45±0,53 Elaborado por Gabriela Chamorro

60,00 56,43

50,00 45,63 40,06 38,43 40,00

30,00 18,46 20,00 16,36

10,00

0,00 Guano Penipe Guano Penipe Guano Penipe Etanol 76% Metanol DM

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 11. Promedio de fenoles totales expresado en mg AG/g ET según el tipo de solvente y la zona geográfica

La Tabla N° 33 y la figura 11. muestra las concentraciones promedias de fenoles según el tipo de solvente y la zona geográfica, Guano y Penipe; allí se observa que el solvente etanol 76% , utilizado en las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano presenta un promedio de 45,63 mg A.G/g ET, mientras que el extracto de las hojas de la especie Ambrosia arborescens para el cantón Penipe se tiene un promedio de 56,43 mg A.G/g ET, alcanzando el mayor valor de concentración promedio y el diclorometano- metanol (1:1) obtiene la menor concentración promedio para la muestra en estudio.

A la vez en la realización del análisis de varianza presentado en el anexo H de la tabla N° 48, se observa que el tipo de solvente y la ubicación geográfica, sí difiere en la concentración promedio de fenoles, debido a que presentan un valor menor al nivel de significancia del 5%

El resultado del análisis de las comparaciones múltiples presentado en el anexo H de la tabla N° 49 se observa el contraste de hipótesis de las diferentes combinaciones de pares de medias entre los solventes, que permite establecer, utilizando el nivel de significancia menor a 0.05, existen diferencias significativas entre las concentraciones promedios de fenoles según el tipo de solvente utilizado. 4.2.3 Cuantificación de flavonoides totales de los extractos obtenidos de los diferentes solventes de las hojas de la especie de Ambrosia arborescens

La cuantificación de flavonoides se realizó con el método espectrofotométrico, utilizando como marcador quercetina, observándose los resultados a cada concentración trabajada.

Tabla N° 34. Curva de calibración de quercetina

Estándar Concentración de ácido Absorbancia gálico, ppm Blanco 0 0 1 1,50 0,473 2 2,00 0,516 3 4,50 0,664 4 6,00 0,759 5 7,50 0,855 6 9 0,974 Elaborado por Gabriela Chamorro

Absorbancia Vs Con. Quercetina 1,2 y= 0,0649x + 0,3767 1 R² = 0,9978 0,8 0,6

0,4 Absorbancia 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Con. Quercetina, ppm

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 12. Curva de calibración de la quercetina Con la ecuación obtenida de la curva de calibración de quercetina, se realizó los cálculos para obtener la concentración de cada extracto, en la Tabla N° 34 se manifiesta los resultados obtenidos directamente, cabe mencionar que las lecturas se realizaron por triplicado. A continuación, se realiza un ejemplo de los cálculos realizados:

 = 0,0649 + 0,3767x 0.766 − 0.3767 퐶 = = 5,99휇푔퐸푄/푚푙 푓푙 0.0649 Para expresar por gramo de extracto seco: 5,99휇푔 5 푚푙 1 푚퐿 퐸퐸푇 1000푚푔 1000푚푔 퐶 = × × × × 푓푙 푚푙 푠표푙푢푐푖ó푛 0.5푚푙 퐸퐸푇 100 푚푔 푒푥푡푟푎푐푡표 푠푒푐표 1 푔 106휇푔

푚푔 퐶 =0,599 푓푙 푔 푒푥푡푟푎푐푡표 푠푒푐표

Tabla N° 35. Concentración de flavonoides expresados en mg quercetina/g de extracto total

Muestra Absorbancia Concentración, mg QE/ g ET Promedio R1 R2 R3 R1 R2 R3 푿̅±휹 GE76% 0,766 0,767 0,764 0,599 0,601 0,596 0,599±0,002 GM 0,671 0,675 0,674 0,453 0,459 0,458 0,457±0,003 GDM 0,475 0,477 0,474 0,151 0,154 0,149 0,152±0,002 PE76% 0,805 0,804 0,801 0,659 0,658 0,653 0,657±0,003 PM 0,605 0,602 0,608 0,351 0,347 0,356 0,352±0,004 PDM 0,483 0,486 0,485 0,163 0,168 0,166 0,166±0,002 Elaborado por Gabriela Chamorro

0,66 0,70 0,60 0,60 0,50 0,46 0,40 0,35 0,30 0,17 0,20 0,15 0,10 0,00 Guano Penipe Guano Penipe Guano Penipe Etanol 76% Metanol DM

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 13. Promedio de flavonoides expresado en mg QE/g ET según el tipo de solvente y la zona geográfica La tabla N° 35 y la figura 13 se muestra las concentraciones promedias de flavonoides según el tipo de solvente y la zona geográfica, Guano y Penipe; las pruebas han sido realizadas al nivel de significancia del 5%. Para el solvente Etanol 76% del cantón Penipe se observa una mayor concentración de flavonoides con un promedio de (0,6573 ± 0,003 mg QE/g ET); mientras que para el solvente Metanol del cantón Guano posee mayor concentración promedio de Flavonoides con (0,4570 ± 0,003 mg QE/g ET). Cuando se utiliza el solvente diclorometano-metanol del cantón Penipe, se observa un valor bajo promedio de concentración de flavonoides con (0,166 ± 0,0023 mg QE/g ET).

En el anexo H de la tabla N° 50 se observa que existe un efecto del tipo de solvente y la zona geográfica, ya que la significancia ubicada en la última columna ha sido menor a 0,05. Por lo tanto, existe diferencia ente la concentración de flavonoides entre Guano y Penipe.

Finalmente, en el anexo H de la tabla N° 51 donde se presenta las comparaciones múltiples se puede corroborar con lo mencionado anteriormente donde al haber diferencia significativa en los resultados menores a 0,05 entre las concentraciones promedias de flavonoides por cada solvente, se concluye que el tipo de solvente y la zona geográfica si difiere en los resultados a obtener.

4.3 Actividad antioxidante

Para la evaluación de la actividad antioxidante se utilizó el método del radical DPPH y como estándar el BHT (butil hidroxitolueno).

Tabla N° 36. Porcentaje de inhibición del BHT a diferentes concentraciones

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio, CI50, ppm % ppm R1 R2 R3 2 42,76 41,95 42,90 42,54 4 48,59 48,85 48,59 48,68 6 53,32 54,26 55,74 54,44 4,33 8 60,43 61,10 61,24 60,92 10 79,19 77,70 78,38 78,42

Porcentaje de inhibición Vs Concentración BHT 100 y = 4,2004x + 31,803 80 R² = 0,9296 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración BHT, ppm Porcentaje inhibición, de %

Figura 14Curva de calibración del estándar BHT En la figura 14. se detalla los datos de la relación del porcentaje de inhibición vs concentración del BHT, que permitió realizar un ajuste lineal y de esta manera se obtuvo la ecuación y = 4,2004x + 31,803 con un R2 de 0,9296.

Esto a la vez permitió calcular el CI50 dando como resultado 4,33 ppm.

Tabla N° 37. Promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Guano

Concentración, ppm Promedio etanol, % Promedio metanol, % Promedio DM-M, %

2 48,52 49,83 48,26 4 59,75 55,78 50,51 6 69,15 62,84 54,79 8 71,22 66,26 61,08 10 81,89 80,92 66,62

Porcentaje de inhibición Vs Concentración (Guano) 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12

Concentración, ppm Porcentaje inhibición, de % Promedio, % Etanol Promedio, % Metanol Promedio, % DM-M

Figura 15. Curvas del promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Guano En la figura 15. se detalla los datos de la relación del porcentaje de inhibición vs concentración de los extractos obtenidos, que permitió realizar un ajuste lineal y de esta manera se obtuvo la ecuación para el extracto etanólico 76% y = 3,9103x + 42,648 con un R2 de 0,9645, extracto metanólico y = 3,6325x + 41,336 con un R2 de 0,9473 y extracto diclorometano-metanol y = 2,3639x + 42,074 con un R2 de 0,9732

Esto a la vez permitió calcular el CI50 dando como resultado, para el extracto etanólico 2,18 ppm, extracto metanólico 2,38 ppm y extracto diclorometano-metanol 3,35 ppm.

Tabla N° 38. Promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Penipe Concentración, ppm Promedio etanol, % Promedio metanol, Promedio DM-M, % %

2 49,78 51,51 47,23 4 60,74 56,54 53,71 6 70,23 63,69 55,78 8 74,14 67,25 62,30 10 82,07 80,83 67,29

Porcentaje de inhibición Vs Concentración (Penipe) 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Porcentaje inhibición, de % 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración, ppm

Promedio, % Etanol Promedio, % Metanol Promedio, % DM-M

Figura 16. Curvas del promedio de porcentaje de inhibición de los extractos obtenidos, Penipe En la figura 16. se detalla los datos de la relación del porcentaje de inhibición vs concentración de los extractos obtenidos, que permitió realizar un ajuste lineal y de esta manera se obtuvo la ecuación para el extracto etanólico 76% y = 3,9486x + 43,903 con un R2 de 0,9781, extracto metanólico y = 3,9486x + 43,903 con un R2 de 0,9781 y extracto diclorometano-metanol y = 2,4359x + 42,65 con un R2 de 0,9829

Esto a la vez permitió calcular el CI50 dando como resultado, para el extracto etanólico 2,10 ppm, extracto metanólico 1,97 ppm y extracto diclorometano-metanol 3,01 ppm.

Análisis estadístico

Se presenta un análisis descriptivo por zona geográfica, de las diferentes concentraciones y solventes utilizados para determinar la actividad antioxidante, también se presenta el Análisis de Varianza discriminado por zona y el análisis de varianza de comparación con BHT, realizados con un nivel de significancia del 5%, con el programa SPSS versión 25 en español, eso se lo puede revisar en la tabla 52 y 53 presentados en anexo H

40 Etanol 76% Metanol Diclometano- Etanol 76% Metanol Diclometano- Metanol Metanol Penipe Guano

2 4 6 8 10

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 17. Comparación de la absorbancia promedio entre el cantón Guano y cantón Penipe En la figura 17. se muestra las barras que representan el valor medio de absorbancia obtenido en las diferentes concentraciones y solventes, comparando dichos valores entre las dos zonas geográficas involucradas en el estudio. Se observa que el valor medio de absorbancia presenta un crecimiento a medida que aumenta la concentración, lo que se evidencia para todos los solventes y las dos zonas; Guano y Penipe, además se observa que el solvente diclorometano-metanol (1:1) es el que obtiene el menor valor promedio de absorbancia, y etanol 76% obtienen los mayores valores medios de absorbancia en las diferentes concentraciones.

Tabla N° 39. Análisis de varianza para el cantón Guano

ANOVA de un factor Absorbancia Concentración Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática Inter-grupos 4,291 2 2,146 ,125 0,885 2 Intra-grupos 103,080 6 17,180 Total 107,372 8 Inter-grupos 128,812 2 64,406 4,937 0,054 4 Intra-grupos 78,272 6 13,045 Total 207,084 8 Inter-grupos 310,951 2 155,475 15,475 0,004 6 Intra-grupos 60,280 6 10,047 Total 371,231 8 Inter-grupos 154,225 2 77,112 8,148 0,019 8 Intra-grupos 56,786 6 9,464 Total 211,011 8 Inter-grupos 438,695 2 219,347 17,644 0,003 10 Intra-grupos 74,593 6 12,432 Total 513,287 8

En la tabla N° 39 se muestra la varianza para el cantón Guano, existiendo diferencias significativas con los solventes en las concentraciones 4, 6, 8 y 10 ppm, lo cual quiere decir que el solvente si interfiere en la actividad antioxidante. Así mismo podemos observar en el anexo H de la tabla N° 60 donde se encuentran las comparaciones múltiples, para mayor detalle

Soto, M. y Rosales, M. (2016), menciona que la polaridad del disolvente si interfiere en la actividad antioxidante, ya que depende de la composición química de los compuestos a extraer, la cantidad y posición de los grupos hidroxilo, del tamaño molecular, así como tiempo de contacto, tamaño de partícula y relación masa-solvente. p.702

Tabla N° 40. Análisis de varianza para el cantón Penipe

ANOVA de un factor Absorbancia Concentración Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática Inter-grupos 27,736 2 13,868 1,098 0,392 2 Intra-grupos 75,789 6 12,631 Total 103,525 8 Inter-grupos 75,119 2 37,559 3,919 0,082 4 Intra-grupos 57,501 6 9,583 Total 132,620 8 Inter-grupos 314,277 2 157,139 22,313 0,002 6 Intra-grupos 42,255 6 7,042 Total 356,532 8 Inter-grupos 251,555 2 125,778 94,367 0,000 8 Intra-grupos 7,997 6 1,333 Total 259,553 8 Inter-grupos 403,128 2 201,564 16,150 0,004 10 Intra-grupos 74,883 6 12,480 Total 478,010 8 En la tabla N° 40 se muestra la varianza para el cantón Penipe, existiendo diferencias significativas con los solventes en las concentraciones 6, 8 y 10 ppm, lo cual quiere decir que el solvente si interfiere en la actividad antioxidante. Así mismo podemos observar en el anexo H de la tabla N° 61 donde se encuentran las comparaciones múltiples, para mayor detalle

Al igual como se menciona a Soto, M. y Rosales, M en el anterior párrafo, la polaridad de los solventes, si afecta a la actividad antioxidante.

85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 Etanol 76% Metanol Diclometano- Metanol BHT Guano

2 4 6 8 10

Figura 18. Comparación del estándar BHT según solventes y concentraciones del Cantón Guano

40 Etanol 76% Metanol Diclometano- Metanol BHT Guano

2 4 6 8 10

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 19. Comparación del estándar BHT según solventes y concentraciones del Cantón Penipe En la Figura 18 y 19 se observa que existe un mayor porcentaje de inhibición DPPH para el solvente etanol 76% y metanol referente al BHT. Bochi et al (Soto, M. y Rosales, M., 2016), menciona que la actividad antioxidante, depende de la naturaleza de la estructura del compuesto extraíble, grado de polimerización y su relación con la polaridad del solvente utilizado.

Zhi-feng Fu (citado de Valencia, Z. et al., 2017), en el estudio de la actividad antioxidante de extractos con diferentes solventes (etanol acuoso, metanol acuoso, etc.) de las hojas de camote (Ipomoea batatas l.), observo que el rendimiento de la actividad antioxidante de los extractos fue afectado por la polaridad de los solventes p. 27. De la misma manera se observa que en la especie Ambrosia arborescens el tipo de solvente utilizado si afecta en la actividad antioxidante, por lo que es importante siempre utilizar el solvente de acuerdo a la estructura química, polaridad y solubilidad.

4.4 Actividad antimicrobiana

Para determinar esta actividad se utilizó el método de difusión en discos para todos los extractos. Se trabajó con un blanco (DMSO 1%) y con un control positivo

(gentamicina 10 g), para cada cepa de estudio. Los valores que se presentan como 6 mm en los resultados, representa al tamaño de disco, eso quiere decir que no hubo halo de inhibición. En las tablas presentes se observa los promedios obtenidos de los halos de inhibición por cada extracto y de su respectiva zona geográfica

Tabla N° 41. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto etanólico 76%, cantón Guano

Promedio de halos de inhibición + disco en blancos (mm) Concentración, Tipo de cepa ppm Escherichia Staphylococcus Klebsiella Pseudomonas Enterococcus coli ATCC aureus ATCC pneumoniae aeruginosa C2- faecalis 25922 25923 RTB006 23 ATCC2912

1000 6 8,5 13 15 16 900 6 6 13 14 15 800 6 6 16,5 10,5 11,5 700 6 6 18 20,5 6 600 6 6 17 21 6 500 6 6 17 17 6 400 6 6 6 6 6 Blanco 6 6 6 6 6 (DMSO)1% Gentamicina 10ug 17 20 13 22 16

Elaborado por Gabriela Chamorro

5 Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

DIÁMETRO DEL HALO (MM) DE HALO INHIBICIÓN, DIÁMETRO DEL 1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO 1%) Gentamicina 10 ug

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 20. Promedio de halos de inhibición para extracto etanólico 76%, cantón Guano

Como se observa en la tabla N° 41 y en la figura 20 el extracto etanólico 76% a una concentración de 900 y 1000 ppm presentan mayor halo de inhibición en la cepa Enterococcus faecalis ATCC2912, al comparar con el control positivo tiene similar tamaño de halo, siendo estas concentraciones las adecuadas para que tenga actividad antimicrobiana ante esta cepa. Seguido tenemos las concentraciones de 500-800 ppm teniendo halos de inhibición que oscilan entre 16,5-17 mm para Klebsiella pneumoniae RTB006, al comparar con el control positivo; el extracto etanólico 76% presenta halos mayores, favoreciendo la actividad antimicrobiana. Finalmente, tenemos las concentraciones de 600 y 700 ppm dando los halos de inhibición más altos para la cepa Pseudomonas aeruginosa C2-23, comparando con el control positivo tiene similar halo de inhibición.

Con respecto a las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 no hubo actividad antimicrobiana a ninguna concentración, a pesar que a 1000 ppm hubo un halo de 8,5 mm, es tan mínima que es recomendable buscar otras concentraciones que den halos de inhibición mayores.

Tabla N° 42 . Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto metanólico, cantón Guano

1000 6 6 6 11 14 900 6 6 6 11 14 800 6 6 18 11 15,5 700 6 6 14 14 12,5 600 6 6 6 16 6 500 6 6 6 16,5 6 400 6 6 6 6 6 Blanco 6 6 6 6 6 (DMSO)1% Gentamicina 17 20 13 22 16 10ug Elaborado por Gabriela Chamorro

23 21 19 17 15 13

(MM) 11 9 7 5 Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN, INHIBICIÓN, DE HALO DEL DIÁMETRO ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO 1%) Gentamicina 10 ug

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 21 . Promedio de halos de inhibición para extracto metanólico, cantón Guano Como se observa en la tabla N° 43 y en la figura 21 el extracto metanólico a una concentración de 700 y 800 ppm presentan mayor halo de inhibición en la cepa Klebsiella pneumoniae RTB006, al comparar con el control positivo, presenta mayor actividad ante esta cepa el extracto que el control positivo (gentamicina 10 g). Seguido tenemos las concentraciones de 500-700 ppm teniendo halos de inhibición mayores que oscilan entre 14-16,5 mm para Pseudomonas aeruginosa C2-23, al comparar con el control positivo; el extracto metanolico presenta halos de inhibición menores. Finalmente tenemos las concentraciones de 700 y 1000 ppm dando halos de inhibición que oscilan entre 12,5- 15,5 mm para la cepa Enterococcus faecalis ATCC2912, comparando con el control positivo tiene similar halo de inhibición, por lo que se puede trabajar a estas concentraciones para obtener una actividad antimicrobiana deseada.

Con respecto a las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 no hubo actividad antimicrobiana a ninguna concentración.

Tabla N° 43. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol (1:1), Guano

1000 6 6 16 15 6 900 6 6 6 15 6 800 6 6 6 12 6 700 6 6 6 12 6 600 6 6 6 10,5 6 500 6 6 6 6 6 400 6 6 6 6 6 Blanco 6 6 6 6 6 (DMSO)1% Gentamicina 10 17 20 13 22 16 g Elaborado por Gabriela Chamorro

23 21 19 17 15 13 11

9 INHIBICIÓN, (MM)INHIBICIÓN, 7 DIÁMETRO DEL HALO DE HALO DIÁMETRO DEL 5 Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO 1%) Gentamicina 10 ug

Elaborado por Gabriela Chamorro

Figura 22. Promedio de halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol (1:1), cantón Guano Como se observa en la tabla N° 43 y en la figura 22 el extracto diclorometano-metanol (1:1) a una concentración de 1000 ppm presenta mayor halo de inhibición en la cepa Klebsiella pneumoniae RTB006, al comparar con el control positivo, presenta mayor actividad ante esta cepa el extracto que el control positivo (gentamicina 10 g). Seguido tenemos las concentraciones de 600-1000 ppm teniendo halos de inhibición que oscilan entre 15-10,5 mm respectivamente para Pseudomonas aeruginosa C2-23, al comparar

76 con el control positivo; el extracto diclorometano-metanol (1:1) presenta halos de inhibición menores.

Con respecto a las cepas Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Enterococcus faecalis ATCC2912 no hubo actividad antimicrobiana a ninguna concentración.

Tabla N° 44. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto etanolico 76%, cantón Penipe

1000 6 6 6 18 15,5 900 13 6 6 16,5 14 800 10 6 6 16 13,5 700 10 6 17,5 15,5 6 600 10 6 17,5 6 6 500 9,5 12,5 21,5 6 6 400 6 8,5 17 6 6 Blanco 6 6 6 6 6 (DMSO)1% Gentamicina 10 17 20 13 22 16 g Elaborado por Gabriela Chamorro

23 21 19 17 15 13 11 9

7 INHIBICIÓN, (MM)INHIBICIÓN, 5 DIÁMETRO DEL HALO DE HALO DIÁMETRO DEL Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO 1%) Gentamicina 10 ug

Figura 23. Promedio de halos de inhibición para extracto etanólico 76%, cantón Penipe Como se observa en la tabla N° 44 y en la figura 23 el extracto etanólico 76% a una concentración de 500-900 ppm presentan halos de inhibición de 13-9,5 mm respectivamente para la cepa Escherichia coli ATCC 25922, seguido tenemos las

77 concentraciones de 400 a 500 ppm que dan halos de inhibición que van de 12,5 a 8,5 mm para Staphylococcus aureus ATCC 2592, a las concentraciones de 500-700 ppm tiene halos de inhibición de 17,5-21,5 mm para la cepa Klebsiella pneumoniae RTB006, para la cepa Pseudomonas aeruginosa C2-23 a concentraciones de 700-1000 ppm se obtuvieron halos de 18-15,5 mm respectivamente que al comparar con el control positivo, presenta mayor actividad al control positivo (gentamicina 10 g), sin embargo presenta una buena actividad antimicrobiana. Finalmente, para la cepa Enterococcus faecalis ATCC2912 se obtuvieron a concentraciones de 800-1000 ppm halos que oscilan de 15,5- 13,5 mm presentando actividad antimicrobiana similar al del control.

Tabla N° 45. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto metanólico, cantón Penipe

1000 12 14 17 12 6 900 9 8 11,5 6 6 800 8,5 6 6 6 11,5 700 8 6 6 6 6 600 6,5 6 6 6 6 500 6 6 6 6 6 400 6 6 6 6 6 Blanco 6 6 6 6 6 (DMSO)1% Gentamicina 10 17 20 13 22 16 g Elaborado por Gabriela Chamorro

23 21 19 17 15 13 11 9 7 INHIBICIÓN, (MM)INHIBICIÓN, 5

DIÁMETRO DEL HALO DE HALO DIÁMETRO DEL Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO 1%) Gentamicina 10 ug

Figura 24. Promedio de halos de inhibición para extracto metanolico, cantón Penipe

Como se observa en la tabla N° 45 y en la figura 24 el extracto metanolico a una concentración de 600-1000 ppm presentan halos de inhibición de 12-6,5 mm respectivamente para la cepa Escherichia coli ATCC 25922, seguido tenemos las concentraciones de 900 a 1000 ppm que dan halos de inhibición que van de 14 a 8 mm para Staphylococcus aureus ATCC 2592, a las concentraciones de 900-1000 ppm tiene halos de inhibición de 17-11,5 mm para la cepa Klebsiella pneumoniae RTB006, para la cepa Pseudomonas aeruginosa C2-23 a concentraciones de 1000 ppm se obtuvo un halo de inhibición de 12 mm respectivamente que al comparar con el control positivo, presenta mayor actividad el control positivo (gentamicina 10ug). Finalmente, para la cepa Enterococcus faecalis ATCC2912 se obtuvo a una concentración de 800 ppm un halo de inhibición de 11,5 mm.

Tabla N° 46. Promedios de las medidas de los halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol (1:1), cantón Penipe

1000 6 6 6 6 6 900 6 6 12 6 6 800 6 6 10 6 6 700 14,5 12,5 10 6 6 600 6 6 10 8,5 6 500 6 6 6 9 6 400 6 6 6 19 9 Blanco 6 6 6 6 6 (DMSO)1% Gentamicina 17 20 13 22 16 10ug 23 21 19 17 15 13 11 9 7 5 INHIBICIÓN, (MM)INHIBICIÓN, Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus

DIÁMETRO DEL HALO DE HALO DIÁMETRO DEL ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO 1%) Gentamicina 10 ug

Figura 25 . Promedio de halos de inhibición para extracto diclorometano-metanol, cantón Penipe

Como se observa en la tabla N° 46 y en la figura 25 el extracto diclorometano-metanol (1:1) a una concentración de 700 ppm presentan actividad frente a la cepa Escherichia coli ATCC 25922 con un halo de inhibición de 14,5 mm, seguido tenemos para la cepa Staphylococcus aureus ATCC 2592 a concentraciones de 600-700 ppm halos que oscilan de 12,5-8,5 mm respectivamente, para la cepa Klebsiella pneumoniae RTB006 a concentraciones de 600-900 ppm presenta halos de inhibición de 12-10 mm, al realizar una comparación con el control positivo, los halos que da el extracto son menores que la del control, para la cepa Pseudomonas aeruginosa C2-23 a la concentración de 400 ppm presenta un halo de inhibición siendo esta de 19 mm y finalmente para la cepa Enterococcus faecalis ATCC2912 se obtuvo a una concentración de 400 ppm un halo de inhibición de 9 mm que al comparar con el control positivo, es mucho menor la del extracto que la del control.

Análisis estadístico

Se presenta un Análisis de Varianza discriminado por zona geográfica de recolección (Guano y Penipe), realizado con un nivel de significancia del 5%, con el programa SPSS versión 25 en español; en el anexo H en la tabla N° 62 se observa la incidencia que tienen el tipo de cepa, el solvente, la concentración y la ubicación geográfica, y sus diferentes interacciones, obteniéndose un nivel de significancia menor al establecido para el estudio de 0,05; por lo tanto, se puede afirmar que existen diferencias significativas entre los diferentes factores analizados. Es decir, el tamaño del halo de inhibición es diferente dependiendo de la concentración, de la cepa y de la polaridad del solvente. Además, existen diferencias entre la zona geográfica (Guano y Penipe).

Como se indica en la tabla N° 63 (anexo H), las comparaciones múltiples para las diferentes concentraciones emitidas, resultan ser significativas al 5%, excepto la comparación entre la concentración de 800 y 900 ppm, que presentan una significancia de 0,997. Por lo que son las concentraciones que presentaron mayor actividad antimicrobiana.

Los resultados presentados en la tabla N° 64 (anexo H), la comparación entre las medias del tamaño de halos de inhibición según el solvente utilizado, han resultado todas significativas al 5%. Por ende, no tienen actividad antimicrobiana relevante, eso es debido a que cada solvente extrae diferentes metabolitos secundarios produciendo una interacción entre ellos, así lo menciona Martínez (citado en Sierra et al., 2018) afirma

80 que “Estos disolventes solubilizan la esencia, pero también solubilizan y extraen otras sustancias tales como grasas y ceras, obteniéndose al final una oleorresina o un extracto impuro”. (p.25)

López et al. (Citado en Sierra et al., 2018) menciona que existen alcaloides que son solubles en solventes orgánicos poco polares; pero a la vez pueden formar sales solubles en agua, por lo que el tipo de solvente que se use si infiere en el cumplimiento de la actividad antimicrobiana deseada.

0 Guano Penipe Guano Penipe Guano Penipe

DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN, (MM) INHIBICIÓN, DE HALO DEL DIÁMETRO Etanol 76% Metanol DM

Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 klebsiella pneumoniae RTB 006 Pseudomonas aeruginosa C2-23 Enterococcus faecalis ATCC2912

Figura 26. Promedio de halos de inhibición de cada cepa por solvente y cantón Tabla N° 47. Mayor concentración de halos de inhibición según cepa, solvente y zona geográfica

Cepa Halo de Concentración, Solvente Zona inhibición ppm

Escherichia coli ATCC 10 700 Diclorometano- Penipe 25922 metanol Staphylococcus aureus 14 1000 Metanol Penipe ATCC 25923 Klebsiella pneumoniae 21,5 500 Etanol 76% Penipe RTB006 Pseudomonas 21 600 Etanol 76% Guano aeruginosa C2-23 Enterococcus faecalis 16 1000 Etanol al 76% Guano ATCC2912

10 INHIBICIÓN, (MM)INHIBICIÓN,

5 DIÁMETRO DEL HALO DE HALO DIÁMETRO DEL

0 Escherichia coli Staphylococcus klebsiella Pseudomonas Enterococcus ATCC 25922 aureus ATCC pneumoniae RTB aeruginosa C2-23 faecalis 25923 006 ATCC2912

Figura 27 . Representación del máximo halo de inhibición promedio para los diferentes tipos de cepa.

Como se observa en la tabla N° 47 y figura 26, se encuentran el promedio de los diferentes tipos de cepas con las que se trabajaron, todos con diferentes concentraciones, el cual dieron un halo mayor al control positivo (gentamicina), Gómez, E., (2017) menciona en su estudio que para el microorganismo P. aeruginosa al utilizar el aceite puro de Ambrosia arborescens obtuvo un halo de 27,3 mm, para S. aureus un halo de 15,3 mm y en diluciones con metanol a diferentes concentraciones para E.coli hubo halos que oscilan de 12,7 a 7,3 mm, el cual no son significativas.p.35., dando como resultado halos similares al estudiado.

CAPITULO V

5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones

− Las hojas de la especie vegetal que fueron recolectadas en la parroquia de Langos - San Miguel, cantón Guano (S 1° 36' 38"; O 78° 37' 5,3") y en el sector Chauzazan, parroquia matriz, cantón Penipe (S 1° 33' 18.2"; O 78° 32' 23,7"), ambos pertenecientes a la Provincia de Chimborazo, fueron identificados en el Herbario “Alfredo Paredes” de la Universidad Central del Ecuador, verificando que se trata de la especie Ambrosia arborescens (Marco). − El extracto diclorometano-metanol (1:1) preparado a partir de las hojas de la especie Ambrosia arborescens (cantón Guano) fue la le mayor rendimiento (17,24%), mientras que la de bajo rendimiento fue el extracto metanólico de la muestra del cantón Penipe con 6,24%. − En el tamizaje fitoquímico realizado de los diferentes extractos preparados, a partir de las hojas de la especie Ambrosia arborescens, se identificaron alcaloides, fenoles, terpenos y taninos. − Se comprobó la presencia de alcaloides pirrolizidínicos, fenoles, terpenos y taninos mediante una cromatografía de capa fina. − El extracto etanólico 76% proveniente del cantón Penipe, presentó mayor cantidad de fenoles totales (56,43 mg A.G/g ET) y la mayor cantidad de flavonoides totales (0,6573 ± 0,003 mg QE/g ET). − El extracto etanólico 76% de las hojas de la especie Ambrosia arborescens provenientes del cantón Guano y Penipe presentaron la mayor inhibición frente al radical DPPH a una concentración de 10 ppm con un porcentaje de 81,89%

(CI50 de 2,18 ppm) y 82,07% (CI50 de 2,10 ppm), respectivamente. Esta actividad antioxidante es mayor al estándar BHT. − Al evaluar la actividad antimicrobiana los mayores halos de inhibición se obtuvieron con el extracto etanólico 76% preparados de las hojas de Ambrosia arborescens recolectada del cantón Penipe, presentando mayor actividad antimicrobiana frente a las cepas Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae y Enterococcus faecalis

ATCC2912 en concentraciones que oscilan de 400 a 1000 ppm; mientras que para el cantón Guano, el extracto etanólico 76% de las hojas de Ambrosia arborescens presentaron mayor actividad antimicrobiana frente a las cepas Enterococcus faecalis ATCC2912 y Pseudomonas aeruginosa C2-23, en concentraciones que oscilan de 600 a 1000 ppm. − Según el análisis estadístico, los solventes utilizados y la zona geográfica, en donde fueron recolectadas las hojas de la especie Ambrosia arborescens, influyen en los resultados de la actividad antimicrobiana.

5.3 Recomendaciones

- Evaluar la actividad antimicrobiana separando los metabolitos secundarios presentes en los extractos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens. - Determinar la concentración mínima inhibitoria de los diferentes extractos preparados a partir de las hojas de Ambrosia arborescens. - Realizar estudios farmacognósicos de las otras partes de la planta de la especie Ambrosia arborescens. - Evaluar la actividad antioxidante y antimicrobiana de otras especies del género Ambrosia que se encuentran en el Ecuador.

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ANEXOS Permitirá controlar problemas neurodegenerativas ANEXO A. Árbol de problemas presentes en la actualidad

Fuente bibliográfica Encontrar el mejor extracto, a Bajo aprovechamiento para referente a otros la mejor concentración que emplear en nuevas estudios distintos al cumpla con la actividad formulaciones que ayudaran a propuesto antibacteriana. combatir el estrés oxidativo

Falta de conocimiento de la actividad antioxidante y antibacteriana de los diferentes extractos obtenidos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Desconocimiento de las Falta de interés de estudio de la Confusión por parte de algunos propiedades y beneficios que planta, por la falta de apoyo de autores referente a la acción presenta esta especie de la instituciones o empresas antibacteriana, provocando una planta, utilizando diferentes desinformación referente a estas tipos de extractos propiedades

ANEXO B. Categorización de variables

Productos Naturales

Extractos con diferentes solventes de las hojas de la especie Ambrosia arborescens

Lugar de Método de Tipos de Metabolitos recolección extracción solventes primarios y secundarios

Guano Maceración Polaridad

Penipe estática Actividad Actividad antioxidante antimicrobiana

Marcha fitoquímica Porcentaje de inhibición, DPPH

ANEXO C. Matriz de Operacionalización de Variables

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos preparados con diferentes solventes de las hojas de Ambrosia arborescens, conocido como “Marco”.

ETAPAS DE ANÁLISIS

OBJETIVO ESPECÍFICO 1: Identificar la taxonomía de la especie Ambrosia arborescens proveniente de los cantones Guano y Penipe.

OBJETIVO ESPECÍFICO 2: Preparar los extractos de las hojas de la especie Ambrosia arborescens mediante maceración estática utilizando como solventes una solución hidroalcohólica al 76%, metanol y una mezcla de diclorometano-metanol (1:1).

OBJETIVO ESPECÍFICO 3: Realizar el tamizaje fitoquímico de los diferentes extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens

Variable Dimensión Indicador

Tamizaje fitoquímico Reacciones cualitativas Grupos de Productos Naturales encontrados

Concentración de fenoles mg de ácido gálico/ g ET totales

Concentración de mg de quercetina/g ET flavonoides

OBJETIVO ESPECÍFICO 4: Comparar los perfiles cromatográficos de los diferentes extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens.

Variable Dimensión Indicador

Cuantificación de Cromatografía en capa fina Factor de retención, Rf Productos Naturales

OBJETIVO ESPECÍFICO 5: Determinar la actividad antioxidante con el marcador DPPH, utilizando como referencia BHT, de los diferentes extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens.

Variable Dimensión Indicador

Actividad antioxidante Estándar de referencia Porcentaje de inhibición de (BHT) radical DPPH -Extractos hidroalcohólico al 76%, metanólico y diclorometano-metanol Comparación del estándar (1:1) con cada extracto obtenido de diferentes - Concentraciones de cada concentraciones. extracto Comparación del estándar con cada extracto obtenido de diferentes solventes

OBJETIVO ESPECÍFICO 6: Determinar la actividad antimicrobiana utilizando el método disco de los extractos preparados de las hojas de Ambrosia arborescens frente a Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae RTB006, Pseudomonas aeruginosa C2-23 y Enterococcus faecalis ATCC2912.

Variable Dimensión Indicador

Actividad Antibacteriana - Tipo de cepa Medición del halo de

- Extractos inhibición (mm) usando metanólico, como control positivo hidroalcohólico al gentamicina 10 g. 76% y diclorometano- metanol (1:1) - Concentración de cada extracto

ANEXO D. Instrumento de recolección de datos

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS GUÍA DE OBSERVACIÓN Tema: Estudio de las actividades antioxidante y antibacteriana de los diferentes extractos preparados a partir de las hojas de la especie Ambrosia arborescens (Marco).

Objetivo: Obtención de datos experimentales para el estudio en propuesta

Fecha de investigación Nombre del investigador Muestra Lugar de recolección Tratamiento de la muestra ESPECIFICACIONES ORGANOLÉPTICAS Parámetro Especificación Ubicación Geográfica Guano Penipe Características Alternas, lisas, algo rugosas, con pecíolo y vellosas por debajo Color Verde Olor Característico Porcentaje de No más del 6% material extraño Humedad No más a 12% Cenizas totales No más a 12% ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS PE PM PDM GE GM GDM Peso de la muestra Porcentaje de rendimiento (%) Color Olor Textura TAMIZAJE FITOQUÍMICO PE PM PDM GE GM GDM P N P N P N P N P N P N Alcaloides: Dragendorff Mayer Wagner

Terpenos/Esteroi des Cardiotónicos Fenoles Taninos Saponinas FENOLES TOTALES Concentración, mg Muestra Absorbancia Promedio A.G/ g ET R1 R2 R3 R1 R2 R3 Guano etanol 76% Guano metanol Guano DM-M Penipe etanol 76% Penipe metanol Penipe DM-M FLAVONOIDES TOTALES Concentración, mg Muestra Absorbancia Promedio QE/ g ET R1 R2 R3 R1 R2 R3 Guano etanol 76% Guano metanol Guano DM-M Penipe etanol 76% Penipe metanol Penipe DM-M ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (PORCENTAJE DE INHIBICIÓN FRENTE AL DPPH)

Absorbancias de los extractos obtenidos, Guano Concentración, ppm Extracto etanólico 76% Extracto metanólico Extracto diclorometano- metanol (1:1) R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 2 4 6 8 10 Absorbancias de los extractos obtenidos, Penipe Concentración, ppm Extracto etanólico 76% Extracto metanólico Extracto diclorometano- metanol (1:1) R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 2 4 6 8 10

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA (Método de los discos) Medición de halos de inhibición + disco en blancos (mm) del extracto (______) Tipo de Cepa

Concentración, Escherichia Staphylococcus Klebsiella Pseudomonas Enterococcus faecalis ppm coli ATCC aureus ATCC pneumoniae aeruginosa C2-23 ATCC2912 25922 25923 RTB006

R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 1000 900 800 700 600 500 400 Blanco (DMSO)1% Gentamicina 10ug Elaborado por: Chamorro Gabriela

Otras observaciones: ______

Siglas: PD: Penipe diclorometano-metanol (1:1) PE: Penipe Etanol 76% PM: Penipe Metanol GD: Guano diclorometano-metanol (1:1) GM: Guano Metanol GE: Guano Etanol 76%

P: Positivo N: Negativo Intensidad: + (baja) ++ (media) +++ (alta)

ANEXO E. Certificado de identificación taxonómica

100

ANEXO F. Certificado analítico de placas cromatográficas

101

ANEXO G. Cromatoplacas de cada compuesto identificado de los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens

A) Placa Placa de B) Referencia de cromatoplaca para alcaloides de Alcaloides tipo pirrolizidínicos con revelador sulfato Alcaloides (Penipe) cérico amoniacal (Guano)

0,70

GM GDM-M GE PM PDM-M PE coloración violeta intensa, característica de alcaloides tipo pirrolizidínicos Elaborado: Gabriela Chamorro Fuente: San Román, D., 2014, p. 116 Figura 28. A) Cromatoplacas para identificar alcaloides de los diferentes extractos para Guano y Penipe. B) Cromatoplaca de referencia identificando alcaloides pirrolizidínicos utilizando el revelador sulfato cérico amoniacal.

Fuente: (San Román, D., 2014, p. 116)

Placa de fenoles Placa de fenoles Referencia de cromatoplaca para fenoles (Guano) (Penipe)

0,66

Determinación de fenoles presentes por medio de Cromatografía GM GDM-M GE PM PDM-M PE en capa fina vista bajo UV. Revelador sulfato cérico amoniacal Elaborado: Gabriela Chamorro Fuente: Hernández, J. y López, N., 2013, p. 55 Figura 29. A) Cromatoplacas para identificar fenoles de los diferentes extractos para Guano y Penipe. B) Cromatoplaca de referencia identificando fenoles. Fuente: (Hernández, J. y López, N., 2013, p. 55)

102

Placa de Terpenos Placa de Terpenos Referencia de cromatoplaca para diferentes terpenos (Guano) (Penipe)

0,51

PM PDM-M PE GM GDM-M GE A: -cimeno B: borneol C: geraniol D: linalol E: citral F: eucaliptol G: citronelal

Elaborado: Gabriela Chamorro Fuente: Fun, Y. et al., 2016, p. 139 Figura 30. A) Cromatoplacas para identificar terpenos de los diferentes extractos para Guano y Penipe. B) Cromatoplaca de referencia identificando terpenos. Fuente: (Fun, Y. et al., 2016, p. 139)

Placa de Taninos (Guano) Placa de Taninos (Penipe)

GM GDM-M GE PM PDM-M PE

Elaborado: Gabriela Chamorro

103

Figura 31. Cromatoplacas para identificar taninos de los diferentes extractos para Guano y Penipe. ANEXO H. Análisis estadístico de la actividad antioxidante y actividad antimicrobiana de los diferentes extractos obtenidos de las hojas de Ambrosia arborescens, Guano y Penipe Tabla N° 48 . Análisis de varianza de la concentración de fenoles totales de los diferentes extractos de la especie Ambrosia arborescens, considerando tipo de solvente y ubicación geográfica

Estadística descriptiva

Solvente Zona Media Desviación típica N

Etanol 76% Guano 45,632 0,201 3 Penipe 56,434 0,402 3 Total 51,033 5,923 6 Metanol Guano 40,058 0,532 3 Penipe 38,432 0,696 3 Total 39,245 1,049 6 Diclorometanol-metanol (1:1) Guano 16,364 0,532 3 Penipe 18,455 0,532 3 Total 17,409 1,240 6 Total Guano 34,018 13,464 9 Penipe 37,773 16,459 9 Total 35,896 14,715 18

Análisis de varianza

Pruebas de los efectos inter-sujetos Origen Suma de gl Media cuadrática F Sig. cuadrados tipo III Modelo corregido 3678,116a 5 735,623 2870,174 ,000 Intersección 23193,727 1 23193,727 90494,720 ,000 Solvente 3492,590 2 1746,295 6813,500 ,000 Zona 63,461 1 63,461 247,605 ,000 Solvente * Zona 122,066 2 61,033 238,132 ,000 Error 3,076 12 ,256 Total 26874,919 18 Total corregida 3681,192 17 a. R cuadrado = ,999 (R cuadrado corregida = ,999)

104

Tabla N° 49. Análisis de comparaciones múltiples

(I)Solvente (J)Solvente Diferencia Error Sig. Intervalo de confianza de medias típ. 95% (I-J) Límite Límite inferior superior

Etanol 76% Metanol 11,788* 0,292 0,000 11,151 12,42 Diclorometanol- 33,623* 0,292 0,000 32,986 34,26 metanol (1:1)

Metanol Etanol 76% -11,788* 0,292 0,000 12,425 -11,15

Diclorometanol- 21,835* 0,292 0,000 21,198 22,47 metanol (1:1)

Diclorometanol- Etanol 76% -33,623* 0,292 0,000 -34,26 -32,98 metanol (1:1) Metanol -21,835* 0,292 0,000 -22,47 -21,19

Basadas en las medias observadas. El término de error es la media cuadrática(Error) = 0,256.

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.

Tabla N° 50. Análisis de varianza de la concentración de flavonoides de los diferentes extractos de la especie Ambrosia arborescens, considerando tipo de solvente y ubicación geográfica

Estadística descriptiva

Solvente Zona Media Desviación N típica Guano 0,599 0,00235 3 Etanol 76% Penipe 0,657 0,00320 3 Total 0,628 0,0318 6 Guano 0,457 0,00320 3 Metanol Penipe 0,351 0,00462 3 Total 0,404 0,0577 6 Guano 0,151 0,00235 3 Diclorometanol-metanol Penipe 0,166 0,00235 3 (1:1) Total 0,159 0,00815 6 Guano 0,402 0,197 9 Total Penipe 0,391 0,214 9 Total 0,397 0,200 18

105

Análisis de varianza

Pruebas de los efectos inter-sujetos

Origen Suma de gl Media F Sig. cuadrados cuadrática tipo III Modelo corregido 0,683a 5 0,137 13992,087 0,000 Intersección 2,841 1 2,841 291116,141 0,000 Solvente 0,661 2 0,330 33853,636 0,000 Zona 0,001 1 0,001 55,351 0,000 Solvente * Zona 0,021 2 0,011 1098,905 0,000 Error 0,000 12 9,760E-006 Total 3,524 18 Total corregida 0,683 17 a. R cuadrado = 1,000 (R cuadrado corregida = 1,000)

Tabla N° 51. Análisis de comparaciones múltiples

Comparaciones múltiples

(I)Solvente (J)Solvente Diferencia de Error Sig. Intervalo de medias (I-J) típ. confianza 95% Límite Límite inferior superior Metanol 0,223* 0,00180 0,000 0,220 0,227 Etanol 76% Diclorometanol- 0,469* 0,00180 0,000 0,465 0,473 metanol (1:1) Etanol 76% -0,223* 0,00180 0,000 -0,227 -0,220 Metanol Diclorometanol- 0,245* 0,00180 0,000 0,241 0,249 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -0,469* 0,00180 0,000 -0,473 -0,465 metanol (1:1) Metanol -0,245* 0,00180 0,000 -0,249 -0,241 Basadas en las medias observadas. El término de error es la media cuadrática (Error) = 9,760E-006. *. La diferencia de medias es significativa al nivel ,05.

106

Tabla N° 52. Análisis estadistico descriptivo de la absorbancia, según la concentración y el solvente, Guano.

Descriptivos

Absorbancia Concentración, ppm N Media Desviación Error Intervalo de Mínimo Máximo típica típico confianza para la media al 95%

Límite Límite inferior superior

Etanol 76% 3 48,520 7,170 4,140 30,707 66,333 44,38 56,80 Metanol 3 49,842 0,077 0,044 49,649 50,036 49,80 49,93

2 Diclorometanol- 3 48,268 0,339 0,196 47,424 49,111 47,91 48,58 metanol (1:1)

Total 9 48,876 3,663 1,221 46,060 51,692 44,38 56,80 Etanol 76% 3 59,754 6,119 3,533 44,552 74,955 56,15 66,82 Metanol 3 55,780 1,253 0,723 52,665 58,895 54,93 57,22

4 Diclorometanol- 3 50,517 0,339 0,196 49,673 51,361 50,20 50,88 metanol (1:1)

Total 9 55,350 5,087 1,695 51,439 59,261 50,20 66,82 Etanol 76% 3 69,153 5,467 3,156 55,570 82,736 65,60 75,45 Metanol 3 62,843 0,412 0,238 61,818 63,867 62,48 63,29 6 Diclorometanol- 3 54,790 0,269 0,155 54,120 55,461 54,52 55,06 metanol (1:1) Total 9 62,262 6,812 2,270 57,026 67,498 54,52 75,45 Etanol 76% 3 71,227 5,310 3,066 58,034 84,420 67,45 77,30 Metanol 3 66,261 0,269 0,155 65,591 66,932 65,99 66,53

8 Diclorometanol- 3 61,088 0,339 0,196 60,244 61,932 60,73 61,40 metanol (1:1)

Total 9 66,192 5,135 1,711 62,245 70,140 60,73 77,30 Etanol 76% 3 81,890 6,103 3,523 66,729 97,051 77,84 88,91 Metanol 3 80,926 0,155 0,089 80,539 81,313 80,84 81,11

10 Diclorometanol- 3 66,621 0,155 0,089 66,234 67,008 66,53 66,80 metanol (1:1)

Total 9 76,479 8,010 2,670 70,322 82,636 66,53 88,91

107

Elaborado por Gabriela Chamorro

Tabla N° 53. Análisis estadistico descriptivo de la absorbancia, según la concentración y el solvente, Penipe.

Descriptivos

Absorbancia Concentración, ppm N Media Desviación Error Intervalo de confianza Mínimo Máximo típica típico para la media al 95%

Límite Límite inferior superior

Etanol 76% 3 49,783 6,100 3,522 34,629 64,937 45,74 56,80

Metanol 3 51,507 0,339 ,196 50,663 52,350 51,15 51,82

2 Diclorometanol- 3 47,233 0,751 ,433 45,366 49,100 46,42 47,91 metanol (1:1)

Total 9 49,508 3,597 1,199 46,742 52,273 45,74 56,80

Etanol 76% 3 60,743 5,314 3,068 47,542 73,945 56,96 66,82

Metanol 3 56,545 0,588 0,339 55,083 58,006 56,14 57,22

4 Diclorometanol- 3 53,711 0,404 0,233 52,705 54,716 53,31 54,12 metanol (1:1)

Total 9 57,000 4,071 1,357 53,870 60,129 53,31 66,82

Etanol 76% 3 70,233 4,519 2,609 59,005 81,461 67,49 75,45

Metanol 3 63,697 0,486 0,280 62,489 64,906 63,16 64,10

6 Diclorometanol- 3 55,780 0,679 0,392 54,093 57,467 55,06 56,41 metanol (1:1)

Total 9 63,237 6,675 2,225 58,105 68,368 55,06 75,45

Etanol 76% 3 75,141 1,874 1,082 70,485 79,797 73,93 77,30

Metanol 3 67,251 0,561 0,324 65,855 68,647 66,80 67,88

8 Diclorometanol- 3 62,303 0,41229 0,238 61,279 63,327 61,94 62,75 metanol (1:1)

Total 9 68,232 5,695 1,898 63,853 72,610 61,94 77,30

Etanol 76% 3 82,070 6,106 3,525 66,900 97,239 77,17 88,91

Metanol 3 80,836 0,357 0,206 79,949 81,723 80,57 81,24

10 Diclorometanol- 3 67,296 0,155 0,089 66,909 67,683 67,21 67,48 metanol (1:1)

Total 9 76,734 7,729 2,576 70,792 82,676 67,21 88,91 Elaborado por Gabriela Chamorro

108

Tabla N° 54. Porcentaje de inhibición del extracto etanólico 76% de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio,% CI50, ppm ppm R1 R2 R3 2 44,38 56,80 44,38 48,52 4 56,28 66,82 56,15 59,75 6 66,41 75,45 65,60 69,15 2,18 8 67,44 77,30 68,93 71,22 10 77,84 88,91 78,92 81,89

Porcentaje de inhibición vs Concentración EET 76% 90 80 70 60 y = 3,9103x + 42,648 50 R² = 0,9645 40 30 20

10 Porcentaje inhibición, de % 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración EET 76% Guano, ppm

Figura 32. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto etanólico 76% en el cantón Guano Tabla N° 55. Porcentaje de inhibición del extracto metanólico de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio CI50, ppm ppm R1 R2 R3 2 49,93 49,79 49,79 49,83

4 57,22 54,92 55,19 55,78

6 62,75 63,29 62,48 62,84 2,38 8 65,99 66,26 66,53 66,26

10 81,11 80,84 80,83 80,92

109

Porcentaje de inhibición Vs Concentración EMT 90 80 70 60 y = 3,6325x + 41,336 50 R² = 0,9473 40 30 20 10 0 Porcentaje inhibición, de % 0 2 4 6 8 10 12

Concentración EMT Penipe, ppm

Figura 33. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto metanólico en el cantón Guano Tabla N° 56. Porcentaje de inhibición del extracto diclorometano-metanol (1:1) de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Guano

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio CI50, ppm ppm R1 R2 R3 2 47,91 48,31 48,58 48,26 4 50,87 50,20 50,47 50,51

6 54,52 54,79 55,06 54,79 3,35 8 61,40 60,72 61,13 61,08 10 66,53 66,80 66,53 66,62

Porcentaje de inhibición Vs Concentración EDM-M 70 60 50 y = 2,3639x + 42,074 R² = 0,9732 40 30 20 10 0

Porcentaje inhibicióm, de % 0 2 4 6 8 10 12 Concentración EDM-M Guano, ppm

Figura 34. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto diclorometano-metanol (1:1) en el cantón Guano

110

Tabla N° 57. Porcentaje de inhibición del extracto etanólico 76% de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Penipe

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio CI50 ppm R1 R2 R3 2 56,80 45,73 46,82 49,78 4 66,82 58,44 56,96 60,74 6 75,45 67,75 67,48 70,23 2,10 8 77,30 74,19 73,92 75,14 10 88,91 77,16 80,13 82,07

Porcentaje de inhibición vs Concentración EET 76% 100

60 y = 3,9486x + 43,903 R² = 0,9781 40

0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración EET 76% Penipe, ppm Porcentaje inhibición, de %

Figura 35 . Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto etanólico 76% en el cantón Penipe Tabla N° 58. Porcentaje de inhibición del extracto metnolico de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Penipe

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio CI50 ppm R1 R2 R3 2 51,55 51,82 51,14 51,51

4 57,22 56,14 56,27 56,54

6 63,83 63,15 64,10 63,69 1,97 8 66,80 67,07 67,88 67,25

10 80,56 81,24 80,70 80,83

111

Porcentaje de inhibición Vs Concentración EMT 90 80 70 60 y = 3,4683x + 43,158 50 R² = 0,9513 40 30 20

10 Porcentaje inhibición, de % 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración EMT Penipe,ppm

Figura 36. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto metanólico en el cantón Penipe

Tabla N° 59. Porcentaje de inhibición del extracto diclorometano-metanol (1:1) de las hojas de la especie Ambrosia arborescens del cantón Penipe

Concentración, Porcentaje de inhibición, % Promedio CI50 ppm R1 R2 R3 2 46,42 47,36 47,91 47,23 4 53,30 54,11 53,71 53,71 6 55,06 56,41 55,87 55,78 3,01 8 62,21 61,94 62,75 62,30 10 67,21 67,20 67,48 67,29

Porcentaje de inhibición Vs Concentración EDM-M

80 70 60 50 y = 2,4359x + 42,65 R² = 0,9829 40 30 20 10

Porcentajeinhibición,% de 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración EDM-M Penipe,ppm

Figura 37. Porcentaje de inhibición de DPPH, del extracto diclorometano-metanol (1:1) en el cantón Penipe

112

Tabla N° 60. Comparaciones múltiples del análisis de varianza para el cantón Guano

Concentración (I) Solvente (J) Solvente Diferencia Error Sig. Intervalo de de medias típico confianza al 95% (I-J) Límite Límite inferior superior

Metanol -1,322 3,384 0,709 -9,60 6,95 Etanol 76% Diclorometanol- 0,251 3,384 0,943 -8,02 8,53 metanol (1:1) Etanol 76% 1,322 3,384 0,709 -6,95 9,60 2 Metanol Diclorometanol- 1,574 3,384 0,658 -6,70 9,85 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -0,251 3,384 0,943 -8,53 8,02 metanol (1:1) Metanol -1,574 3,384 0,658 -9,85 6,70 Metanol 3,973 2,949 0,226 -3,24 11,18 Etanol 76% Diclorometanol- 9,236* 2,949 0,020 2,02 16,45 metanol (1:1) Etanol 76% -3,973 2,949 0,226 -11,18 3,24 4 Metanol Diclorometanol- 5,263 2,949 0,125 -1,95 12,47 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -9,236* 2,949 0,020 -16,45 -2,02 metanol (1:1) Metanol -5,263 2,949 0,125 -12,47 1,95 Metanol 6,310 2,588 0,051 -0,02 12,64 Etanol 76% Diclorometanol- 14,362* 2,588 0,001 8,03 20,69 metanol (1:1) Etanol 76% -6,310 2,588 0,051 -12,64 0,02 6 Metanol Diclorometanol- 8,052* 2,588 0,021 1,71 14,38 metanol (1:1)

Diclorometanol- Etanol 76% -14,362* 2,588 0,001 -20,69 -8,03 metanol (1:1) Metanol -8,052* 2,588 0,021 -14,38 -1,71 Metanol 4,965 2,511 0,095 -1,18 11,11 Etanol 76% Diclorometanol- 10,139* 2,511 0,007 3,99 16,28 metanol (1:1) Etanol 76% -4,965 2,511 0,095 -11,11 1,18 8 Metanol Diclorometanol- 5,173 2,511 0,085 -0,97 11,31 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -10,139* 2,511 0,007 -16,28 -3,99 metanol (1:1) Metanol -5,173 2,511 0,085 -11,31 0,97 Metanol 0,963 2,878 0,749 -6,08 8,00 Etanol 76% Diclorometanol- 15,268* 2,878 0,002 8,22 22,31 metanol (1:1)

10 Etanol 76% -0,963 2,878 0,749 -8,00 6,08 Metanol Diclorometanol- 14,304* 2,878 0,003 7,26 21,34 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -15,268* 2,878 0,002 -22,31 -8,22 metanol (1:1) Metanol -14,304* 2,878 0,003 -21,34 -7,26 *La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05

113

Tabla N° 61. Comparaciones múltiples del análisis de varianza para el cantón Penipe

Concentración (I) Solvente (J) Solvente Diferencia de Error Sig. Intervalo de medias (I-J) típico confianza al 95% Límite Límite inferior superior Metanol -1,723 2,901 0,574 -8,82 5,37 Etanol 76% Diclorometanol- 2,550 2,901 0,413 -4,55 9,65 metanol (1:1) Etanol 76% 1,723 2,901 0,574 -5,37 8,82 2 Metanol Diclorometanol- 4,273 2,901 0,191 -2,82 11,37 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -2,550 2,901 0,413 -9,65 4,55 metanol (1:1) Metanol -4,273 2,901 0,191 -11,37 2,82 Metanol 4,198 2,527 0,148 -1,98 10,38 Etanol 76% Diclorometanol- 7,032 2,527 0,062 ,84 13,21 metanol (1:1) Etanol 76% -4,198 2,527 0,148 -10,38 1,98 4 Metanol Diclorometanol- 2,834 2,527 0,305 -3,35 9,01 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -7,032 2,527 0,062 -13,21 -0,84 metanol (1:1) Metanol -2,834 2,527 0,305 -9,01 3,35 Metanol 6,535* 2,166 0,024 1,23 11,83 Etanol 76% Diclorometanol- 14,452* 2,166 0,001 9,15 19,75 metanol (1:1) Etanol 76% -6,535* 2,166 0,024 -11,83 -1,23 6 Metanol Diclorometanol- 7,917* 2,166 0,011 2,61 13,21 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -14,452* 2,166 0,001 -19,75 -9,15 metanol (1:1) Metanol -7,917* 2,166 0,011 -13,21 -2,61 Metanol 7,889* ,942 0,000 5,58 10,19 Etanol 76% Diclorometanol- 12,838* 0,942 0,000 10,53 15,14 metanol (1:1) Etanol 76% -7,889* 0,942 0,000 -10,19 -5,58 8 Metanol Diclorometanol- 4,948* 0,942 0,002 2,64 7,25 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -12,838* 0,942 0,000 -15,14 -10,53 metanol (1:1) Metanol -4,948* 0,942 0,002 -7,25 -2,64 Metanol 1,231 2,884 0,684 -5,82 8,29 Etanol 76% Diclorometanol- 14,773* 2,884 0,002 7,71 21,83 metanol (1:1) Etanol 76% -1,231 2,884 0,684 -8,29 5,82 10 Metanol Diclorometanol- 13,540* 2,884 0,003 6,48 20,59 metanol (1:1) Diclorometanol- Etanol 76% -14,773* 2,884 0,002 -21,83 -7,71 metanol (1:1) Metanol -13,540* 2,884 0,003 -20,59 -6,48 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

114

Tabla N° 62. Pruebas de los efectos inter-sujetos

Pruebas de los efectos inter-sujetos

Variable dependiente: Halos de inhibición (mm) Origen Suma de cuadrados gl Media F Sig. tipo III cuadrática

Modelo corregido 12510,413a 268 46,681 288,669 ,000

Intersección 46608,053 1 46608,053 288219,913 ,000

Ubicación 4,321 1 4,321 26,718 ,000

Concentración 5332,929 8 666,616 4122,293 ,000

Cepa 977,263 4 244,316 1510,825 ,000

Solvente 435,385 2 217,692 1346,189 ,000

Ubicación * Concentración 85,226 8 10,653 65,879 ,000

Ubicación * Cepa 314,159 4 78,540 485,683 ,000

Ubicación * Solvente 45,529 2 22,765 140,775 ,000

Concentración * Cepa 1194,563 32 37,330 230,846 ,000

Concentración * Solvente 334,819 16 20,926 129,406 ,000

Cepa * Solvente 316,983 8 39,623 245,024 ,000 Ubicación * Concentración * 632,501 32 19,766 122,229 ,000 Cepa Ubicación * Concentración * 264,201 16 16,513 102,112 ,000 Solvente Ubicación * Cepa * Solvente 98,365 8 12,296 76,035 ,000

Concentración * Cepa * Solvente 1318,141 64 20,596 127,363 ,000

Ubicación * Concentración * 1096,826 63 17,410 107,661 ,000 Cepa * Solvente

Error 43,500 269 0,162

Total 59227,000 538

Total corregida 12553,913 537

115

a. R cuadrado = ,997 (R cuadrado corregida = ,993) Tabla N° 63. Comparaciones múltiples entre las concentraciones para determinar la mayor actividad antimicrobiana

Comparaciones múltiples Variable dependiente: Halos de inhibición (mm) HSD Tukey Intervalo de confianza al 95% (I) (J) Diferencia de medias Desv. Límite Límite Concentración Concentración (I-J) Error Sig. inferior superior 1000 900 ,9632* ,08401 ,000 ,7131 1,2133 800 1,0132* ,08401 ,000 ,7631 1,2633 700 ,5299* ,08401 ,000 ,2798 ,7800 600 1,7132* ,08401 ,000 1,4631 1,9633 500 1,8632* ,08401 ,000 1,6131 2,1133 400 2,9466* ,08401 ,000 2,6964 3,1967 900 1000 -,9632* ,08401 ,000 -1,2133 -,7131 800 ,0500 ,08329 ,997 -,1980 ,2980 700 -,4333* ,08329 ,000 -,6813 -,1853 600 ,7500* ,08329 ,000 ,5020 ,9980 500 ,9000* ,08329 ,000 ,6520 1,1480 400 1,9833* ,08329 ,000 1,7353 2,2313 800 1000 -1,0132* ,08401 ,000 -1,2633 -,7631 900 -,0500 ,08329 ,997 -,2980 ,1980 700 -,4833* ,08329 ,000 -,7313 -,2353 600 ,7000* ,08329 ,000 ,4520 ,9480 500 ,8500* ,08329 ,000 ,6020 1,0980 400 1,9333* ,08329 ,000 1,6853 2,1813 700 1000 -,5299* ,08401 ,000 -,7800 -,2798 900 ,4333* ,08329 ,000 ,1853 ,6813 800 ,4833* ,08329 ,000 ,2353 ,7313 600 1,1833* ,08329 ,000 ,9353 1,4313 500 1,3333* ,08329 ,000 1,0853 1,5813 400 2,4167* ,08329 ,000 2,1687 2,6647 600 1000 -1,7132* ,08401 ,000 -1,9633 -1,4631 900 -,7500* ,08329 ,000 -,9980 -,5020 800 -,7000* ,08329 ,000 -,9480 -,4520 700 -1,1833* ,08329 ,000 -1,4313 -,9353 500 ,1500 ,08329 ,549 -,0980 ,3980 400 1,2333* ,08329 ,000 ,9853 1,4813 500 1000 -1,8632* ,08401 ,000 -2,1133 -1,6131 900 -,9000* ,08329 ,000 -1,1480 -,6520 800 -,8500* ,08329 ,000 -1,0980 -,6020 700 -1,3333* ,08329 ,000 -1,5813 -1,0853 600 -,1500 ,08329 ,549 -,3980 ,0980 400 1,0833* ,08329 ,000 ,8353 1,3313 400 1000 -2,9466* ,08401 ,000 -3,1967 -2,6964 900 -1,9833* ,08329 ,000 -2,2313 -1,7353 800 -1,9333* ,08329 ,000 -2,1813 -1,6853 700 -2,4167* ,08329 ,000 -2,6647 -2,1687 600 -1,2333* ,08329 ,000 -1,4813 -,9853 500 -1,0833* ,08329 ,000 -1,3313 -,8353 Se basa en las medias observadas. El término de error es la media cuadrática(Error) = ,208.

116

*. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0,05. Tabla N° 64. Comparaciones múltiples entre los solventes utilizados

Comparaciones múltiples Variable dependiente: Halos de inhibición (mm) DMS (I)Solvente (J)Solvente Diferencia de Error Sig. Intervalo de confianza medias (I-J) típ. 95% Límite Límite inferior superior Metanol 1,6444* ,04239 ,000 1,5610 1,7279 Etanol 76% Diclorometano- 2,1396* ,04251 ,000 2,0559 2,2233 metanol (1:1) Etanol 76% -1,6444* ,04239 ,000 -1,7279 -1,5610 Metanol Diclorometano- 0,4952* ,04251 ,000 0,4115 0,5789 metanol (1:1) Diclorometano- Etanol 76% -2,1396* ,04251 ,000 -2,2233 -2,0559 metanol (1:1) Metanol -,4952* ,04251 ,000 -,5789 -,4115 Basadas en las medias observadas. El término de error es la media cuadrática (Error) = 0,162. *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.

117

ANEXO I. Fotografías

Cantón Guano Cantón Penipe Almacenamiento de las hojas, Guano

Almacenamiento de las Secado de las hojas Tratamiento de la planta y envasado hojas, Penipe

Preparación de las hojas Preparación de las hojas para la Maceración. Foto referencia tomado del para la maceración, maceración, Penipe blog: línea y salud Guano

Determinación de humedad Guano Penipe

118

Preparación de los extractos con los diferentes solventes

Evaluación de fenoles y flavonoides Metanol de grado Evaluación de la actividad analítico antioxidante con el método BHT

Curva de calibración del BHT Preparación de los microposillos para la lectura de las absorbancias, para los cálculos de la actividad antioxidante

Lectura de las muestras en el equipo BIOTEK (Hybrid reader)

119

Activación de las cepas en el medio TSA Preparación de la escala Mc. Farland 0.5 de las diferentes cepas

Preparación de las muestras con DMSO 1%, para la evaluación de actividad antimicrobiana

Preparación de los discos con las diferentes concentraciones de los extractos.

Incubación a 37°C por 24 horas de las cajas Medición de los halos de inhibición en mm preparadas

120

Discos de gentamicina 10 g y discos en blanco

121