ตรวจเอกสาร

อนุกรมวธานของิ hamata (USDA, 2004)

Kingdom Plantae – Subkingdom Tracheobionta – Vascular plants Superdivision Spermatophyta – Seed plants Division Magnoliophyta – Flowering plants Class Magnoliopsida – Dicotyledons Subclass Rosidae – Order – Family – Pea family Genus Stylosanthes Sw. -- pencilflower P Species Stylosanthes hamata (L.) Taubert -- cheesytoes P

ลักษณะทางพฤกษของ Stylosanthes hamata

ถั่วฮามาตา หรือ เวอราโนสไตโล (Stylosanthes hamata) มีแหลงกําเนิดอยูในหมู เกาะอินเดียตะวันตกและอเมริกากลาง (สายัณห, 2540) มีลักษณะคลายถั่วทาวสะวิลสะไตโล เปนถั่วไมเนื้อออนลําตนกึ่งตั้งตรง มีขนาดเล็ก เมื่อมีอายุมากขึ้นจะแผกิ่งกานออกทางดานขาง (Prostrate) ผิวเกลี้ยงอาจมีขนเล็กนอยสูงประมาณ 60 เซนติเมตร จํานวนกิ่งที่แตกจากแกนกลาง อยูสูงจากพื้นดินไมเกิน 5 เซนติเมตร การแตกกิ่งเปนแบบ Sympodial Branching กลาวคือกิ่ง เจริญเติบโตมาจากตาที่อยูบริเวณซอกใบ เมื่อเจริญเติบโตไดระยะหนึ่งจะมีการออกดอกที่ปลาย ยอดและมีการแตกกิ่งจากตาที่อยูบริเวณซอกใบใตดอกอีกในลักษณะเชนนี้ไปเรื่อยๆ ใบเปนแบบ Trifoliate leaf ใบยอยคลายรูปหอก ดอกมีสีเหลือง จัดเปนพืชวันสั้น ออกดอกเร็วประมาณ 35 วัน ในหองควบคุมอุณหภูมิ และ 60-67 วันในสภาพแปลง (ภาควิชาพืชไรนา, 2542) ประเทศไทยนิยม ปลูกกันอยางแพรหลายในภาคตะวันออกเฉียงเหนือในเชิงปรับปรุงทุงหญาและปลูกรวมกันใน แปลงหญาผสม (สายัณห, 2540)

การปรับตัวเขากับสภาพแวดลอม S. hamata เจริญไดดีในบริเวณที่ไดรับน้ําฝน ระหวาง 500-1270 มิลลิเมตรและมีฤดูแลงที่ชัดเจน ทนความแลงไดดีมาก ปรับตัวไดดีในดินที่มี สภาพเปนกรดและดินที่มีความอุดมสมบูรณต่ําเมื่อเทียบกับดินชนิดอื่นและยังทนทานตอดินที่มี อะลูมิเนียมสูง S. hamata ทนตอการแทะเล็มไดดี ในสภาพแปลงหญาผสมที่ตองการตัดหรือ ปลอยใหสัตวเขาแทะเล็มไดบอยครั้ง S. hamata (ภาควิชาพืชไรนา, 2542)

การถายยีนในพืช

การถายยีน (Genetic Transformation) เปนเทคนิคที่ใชสรางสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะ พิเศษคือไดรับการถายยีนที่ไมเคยมีมากอนในสิ่งมีชีวิตนั้นๆ อยางนอยหนึ่งยีน โดยอาศัยเทคนิค การถายยีน เทคนิคที่ใชในการถายยีนนั้นแบงไดเปน 2 ชนิดคือ (สนธิชัย, 2543) 1. การถายยีนใหกับเซลลพืชโดยตรง (Direct gene Transfer) เปนการถายยีนเขาเซลล พืชโดยอาศัยปฎิกิริยาของสารเคมีบางชนิด, การกระตุนดวย กระแสไฟฟา, การใช แรงดันเหนือสภาพทางกายภาพ เหลานี้เปนตัวชวยให DNA เคลื่อนเขาสูนิวเคลียสได 2. การถายยีนโดยใช Agrobacterium เปนพาหะนํายีนที่ตองการเขาสูเซลลพืช

ขั้นตอนการถายยีนดวย Agrobacterium โดยสังเขป (หนวยพันธุวิศวกรรมและ เทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ, ม.ป.ป.)

1. ทําการโคลนยีนและศึกษารายละเอียดของยีนที่ตองการจะถายยีน พรอมทั้ง จัดทํา พลาสมิดสําหรับการโคลนยีน 2. เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชใหไดชิ้นพืชที่ตองการจะถายยีนแลวตัดชิ้นสวนของพืชนั้น เพื่อใหเกิดรอยตัดของเซลลจากนั้นนําชิ้นพืชมาแชรวมกับเชื้อ Agrobacterium ที่มีพลาสมิดบรรจุ ยีนเปาหมายอยู 3. ยายชิ้นสวนพืชวางบนอาหารแข็งสําหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อชักนําใหเกิดยอด หรือแคลลัส ซึ่งเติมสารปฎิชีวนะเพื่อกําจัดเชื้อ Agrobacterium ถา Vector มีชุดโครงสราง ยีนที่เปน Selectable marker สามารถคัดเลือกเซลลไดโดยเติมสารที่ใชคัดเลือกเซลลที่เหมาะกับ ยีนชุดนั้นลงในอาหารเพาะเลี้ยงดวย ในที่สุดจะไดตนพืชที่ไดรับการถายยีนที่สมบูรณ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

ปจจุบันการถายยีนในพืชสามารถทําไดในพืชหลายชนิด สาเหตุหนึ่งที่ทําใหการถาย ยีนประสบความสําเร็จ คือ เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยสามารถชักนําสวนของพืชตั้งแตราก ใบ กิ่ง ดอก ละอองเกสร เอมบริโอ กลุมเซลล เซลล หรือแมกระทั่งโปรโตพลาสตใหเจริญเปนตนที่ สมบูรณได (สุรินทร, 2545)

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ การชักนําสวนของพืชนิดใดก็ได เชน อวัยวะตางๆ ขอ ปลอง ตา ยอด เนื้อเยื่อ เซลล หรือโปรโตพลาสตมาเลี้ยงในอาหารสังเคราะหที่ประกอบดวยธาตุ อาหารและสิ่งจําเปนในการเจริญเติบโตของพืช โดยชิ้นพืชจะถูกเลี้ยงโดยควบคุมสภาพแวดลอม และใหอยูในสภาพที่ปลอดจากเชื้อจุลินทรีย ทําใหพืชสามารถพัฒนาเปนตนได (รงรอง, 2542)

การเจริญเติบโต หรือการพฒนาของชั ิ้นสวนพ ืช ม ี 3 รูปแบบ คือ

1. เนื้อเยื่อพืชถูกชักนําใหเกิดอวัยวะ เชน ยอด หรือ ราก 2. เนื้อเยื่อพืชเจริญไปเปนแคลลัส ซึ่งเปนกลุมของ parenchyma cell เปนเซลลที่ยังไม มีกําหนดการเปลี่ยนแปลงพัฒนาไปเปนอวัยวะชนิดใดๆ แตละเซลลมีขนาดไมแนนอน สามารถ แบงออกเปน 2 ประเภท คือ (รังสฤษฎิ์, 2545) i. Compact callus คือแคลลัสที่มีลักษณะเปนกลุมกอนแข็ง กลุมเซลลเกาะกัน แนน ii. Friable callus คือ แคลลัสชนิดยุย กลุมเซลลเกาะกันอยางหลวมๆ 3. เซลลพืชเจริญไปเปนคัพภะ เกิดจากเซลลเริ่มตน 1 เซลลถูกชักนําใหแบงตัวแลวเกิด รูปรางลักษณะในระยะตางๆ เชนเกิดเปน proembryo stage, globular stage, heart shape, torpedo shape แลวเจริญเปนตนที่มียอดและรากโดยสมบูรณในที่สุด (รงรอง, 2542)

ปจจัยที่มีผลตอการเพาะเลี้ยงแคลลัส (รังสฤษฏิ์, 2545)

1. ขนาดและรูปรางของชิ้นสวนพืชเริ่มตนที่ใชเลี้ยง ขนาดชิ้นพืชโดยทั่วไปที่นํามา เพาะเลี้ยงจะใชชิ้นสวนที่คอนขางเล็ก แตไมเล็กเกินกวา critical minimum size ถาชิ้นพืชมีขนาด เล็กไปกวานี้จะไมสามารถชักนําใหเกิดแคลลัสได

2. สารควบคุมการเจริญเติบโต โดยเฉพาะอยางยิ่ง ออกซิน และ ไซโตไคนิน ทั้งนี้ สัดสวนของสารควบคุมการเจริญเติบโตทั้งสองมีผลอยางมากตอการพัฒนาของเซลล โดยถา สัดสวนของออกซินมากกวาไซโตไคนินชิ้นพืชจะถูกชักนําใหเกิดราก ตรงกันขามถาสดสั วนของออก ซินนอยกวาไซโตไคนินชิ้นพืชจะถูกชักนําใหเกิดยอด แตถาสัดสวนนี้สมดุล (ออกซินเทากับไซโตไค นิน) ชิ้นพืชจะถูกชักนําใหเกิดแคลลัส สัดสวนและความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตแต ละชนิดที่ตองการจะผันแปรไปขึ้นกับระยะการพัฒนาของเนื้อเยื่อที่เลี้ยงและชนิดพืช และการ กําเนิดอวัยวะโดยปกติจะถูกกระตุนเมื่อไดรับสารควบคุมในปริมาณที่สูงกวาการเจริญเติบโตของ แคลลัส

การเติมสารควบคุมการเจรญเติ ิบโตในอาหารอาจไมจาเปํ นสําหรับการเพาะเลยงี้ แคลลัส แตสารควบคุมการเจริญเติบโตมีสวนชวยเพ ิ่มอตราการเจรั ิญเติบโต หรือการกาเนํ ิด อวัยวะ และมีเนื้อเยื่อพืชเพยงไมี กี่ชนิดที่สามารถสรางแคลลัสไดในอาหารที่ไมมีสารควบคุมการ เจริญเติบโต สารควบคุมการเจริญเติบโตอยางหนึ่งที่นยมใชิ ในการเพมจิ่ ํานวนและรักษาสภาพการ เลี้ยงเปนแคลล ัสไว คือ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) ซึ่งเปนสารสังเคราะหในกลุม ออกซิน มีคุณสมบัติในการปดกั้นกระบวนการกําเนิดอวัยวะ

3. ธาตุอาหาร พบวาอาหารเสร ิมพวกกรดอะมิโน เชน กลูตามนิ แอสปาติน อารจินนิ และพวกเคซินไฮโดรไลเซท สารสกัดจากมอลท ยีสต นามะพร้ํ าว มบทบาทในการกระตี ุนใหเกดิ แคลลัสในพืชหลายชนิด

4. แหลงคารบอน การเติมอินทรียสารที่เปนแหลงใหธาตุคารบอน มีความจํา เปนมากตอเนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิด เนื่องจากมีเซลลพืชไมกี่ชนิดที่มีลักษณะเปน autotrophic โดยปกติแลวนิยมใชซูโครสความเขมขน 2-3 เปอรเซ็นต และหลักฐานชี้วาการสรางสารเมตา โบไลตบางชนิดในเนื้อเยื่อเปนผลมาจากความเขมขนของซูโครส

5. ปจจัยสิ่งแวดลอม โดยทั่วไปแคลลัสตองการความเขมของแสงต่ํา หรือไมใชแสง

6. สภาพอาหาร แคลลัสที่เลี้ยงในสภาพอาหารแข็ง หรือสภาพกึ่งแข็งมักเจริญเตบโติ ไดนอยกวาหรือชากวาในสภาพอาหารเหลว เนื่องจากสภาพผิวสัมผัสในอาหารแข็งมีนอยกวาใน อาหารเหลว

จากรายงาน Quecini และคณะ (2002) ไดเพาะเมล็ด Stylosanthes guianensis ใน สภาพอาหารแข็งสูตร ½ - MS ซึ่งปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต ที่มีน้ําตาลซูโครส 1.5 % และไฟตาเจล (phytagel) 0.18 %(W/V) โดยใชเวลา 7-8 วัน พืชจึงมีใบเลี้ยงที่สมบูรณ และ โปรโตพลาสตของ S. guianensis สามารถชักนําใหเกิดยอดไดโดยเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสตใน อาหารสูตรMS ที่มีน้ําตาลซูโครส 1% (W/V) ภายใตแสง 16 ชั่วโมง โดยใชอุณหภูมิ 25 + 2.4 องศาเซลเซียส

จากรายงาน Dornelas และคณะ (1991) สามารถชักนํา Stylosanthes scarbra ให เกิดแคลลัสจากสวนของ hypocotyl ภายในเวลา 10 วัน โดยใชอาหารสูตร ½ - MS ที่เติม BAP 2 มิลลิกรัมตอลิตร ภายใตแสง 835 ลักซ โดยในสภาพเดียวกันนี้ชิ้นแคลลัสสามารถพัฒนาเปนยอด ได

การคัดเลือกเซลลพืชที่ไดรับการถายยีน

การคัดเลือกเซลลพืชที่ไดรับการถายยีนเปนขั้นตอนหนึ่งของกระบวนการถายยีนใน พืช โดยคัดเลือกเซลลที่ไดรับการถายยีนออกจากเซลลที่ไมไดรับการถายยีน (Yu และคณะ, 2003) เซลลพืชที่ไดรับการถายยีนจะมียีนเครื่องหมาย (selectable marker) ที่แสดงการตานทานสารปฎ-ิ ชีวนะไดทําใหเซลลพืชดังกลาวเจริญไดในอาหารที่เติมสารปฏิชีวนะชนิดที่สอดคลองกับยีนนั้น (หนวยพันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ, ม.ป.ป.)

ยีนเครื่องหมายที่นิยมใชโดยทั่วไปไดแกยีน neomycin phosphotransferase II (npt II) ตานทานสารปฏิชีวนะ kanamycin, neomycin และ geneticin; ยีน hygromycin phosphotransferase (hph, hpt) ตานทานสารปฏิชีวนะ hygromycin; ยีน phosphinothricin acetyltransferase (bar) ตานทานสาร phosphinothricin; และยีน 5- enolpyruvyl – shikimate – 3 – phosphate syntase (bxn) ตานทานสาร glyphosate (Schrott, 1995)

สารปฏิชีวนะ hygromycin

สารปฏิชีวนะ hygromycin เปนสารปฏิชีวนะในกลุม aminoglycoside ซึ่งไดมาจาก เชื้อ Streptomyces hygroscopicus เปนสารปฏิชีวนะที่มีฤทธิ์ในการฆาแบคทีเรีย รา และเซลล ยูคาริโอต เนื่องจากสารปฏิชีวนะ hygromycin มีความสามารถในการยับยั้งโปรตีน (InvivoGen, 2003) โดย ไปขัดขวางการ translocation ของ ribosomal นั่นคือเขาไปขัดขวางการจดจําตําแหนง ของ aminocyl tRNA และการเขาเกาะที่ตําแหนง A-Site ของ ribosome (Freitag และ Sachs, ม.ป.ป)

ยีน hygromycin phosphotransferase (hph, hpt) เปนยีนตานทานสารปฏิชีวนะ hygromycin โดยยีนดังกลาวสามารถสรางเอนไซม kinase (A.G. Scientific, n.d) ไปทําลาย กระบวนการ phosphorylation ของ 4-hydroxyl group ใน hyosomine moiety จึงเปนผลใหสาร ปฏิชีวนะ hygromycin ไมสามารถทํางานได (Freitag และ Sachs,ม.ป.ป) พืชโดยทั่วไปมักมีการ ตอบสนองตอสารปฏิชีวนะ hygromycin มากกวา kanamycin หรือ geniticin โดยมากมักใชสาร ปฏิชีวนะ ที่ความเขมขน 20 – 200 มิลลิกรัมตอลิตร (A.G. Scientific, ม.ป.ป.)

Lin และคณะ (ม.ป.ป.) พบวาสารปฏิชีวนะ hygromycin มีผลยับยั้งการพัฒนาเปน ยอดของตนยาสูบที่ระดับความเขมขน 50 มิลลิกรัมตอลิตร ในสภาพอาหารแข็ง และที่ระดับความ เขมขน 25 มิลลิกรัมตอลิตร ในสภาพอาหารเหลว นอกจากนี้ยังพบวาที่ระดับความเขมขนของ hygromycin 5 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Agrobacterium ไดอยาง สมบูรณ

Park และคณะ (1995) ศึกษาอิทธิพลของความเขมขน hygromycin ที่มีผลตอการ พัฒนาแคลลัสของมันฝรั่ง (Solanum tuberosum) พบวาความเขมขน hygromycin 3–5 มิลลิกรัม ตอลิตร สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแคลลัส และที่ความเขมขน 10 มิลลิกรัมตอลิตร หรือ มากกวาสามารถหยุดการเจริญเติบโตของแคลลัสได สําหรับอิทธิพลของความเขมขน hygromycin ตอการพัฒนาเปนยอด พบวาความเขมขน hygromycin 1 มิลลิกรัมตอลิตร สงเสริม การเกิดยอด สาเหตุเนื่องมาจากผลของสารคลาย phytohormone และที่ความเขมขน 4 กรัมตอ ลิตร สามารถยับยั้งการพัฒนาเปนยอดไดอยางสมบูรณ

การกําจัดเชื้อ โดยใชสารปฎิชีวนะ cefotaxime

การถายยีนดวยเชื้อ Agrobacterium จําเปนตองใชสารปฎิชีวนะ ในการกําจัด แบคทีเรียพาหะเมื่อเสร็จสิ้นการถายยีนแลว สารปฏิชีวนะที่นิยมใชไดแก carbenicillin, cefotaxime และ paromomycin มีความสามารถในการกําจัดเชื้อแบคทีเรีย เนื่องจากสารปฎิชีว นะดังกลาวเขาจับกับ penicillin binding protein (PBP-3) ซึ่งเปนโปรตีนที่เปนองคประกอบของ inner membrane ใชในการแบงเซลลของแบคทีเรีย ทั้งนี้สารปฎิชีวนะ cefotaximeมีประสิทธิภาพ ในการยับยั้งเชื้อจุลินทรียไดมากชนิดกวาและยังมีฤทธิ์ทางเภสัชสูงกวา carbenicillin (Mathais และ Boyd, 1986)

สารปฎิชีวนะ cefotaxime

Cefotaximeเปนสารปฎิชีวนะในกลุม cephalosporins เริ่มมีการนํามาใชในชวง ค.ศ.1970 (Grady และคณะ, 1990) มักใชในการยับยั้งหรือกําจัดแบคทีเรียแกรมลบ มีความ คงทนในเอนไซม B-lactamase แตจะถูก hydrolysed ไดงายโดยกลุมของ TEM enzyme (A. Kucer และคณะ, 1997)

สารปฎิชีวนะ cefotaxime มีความเปนพิษตอเนื้อเยื่อพืชสวนใหญนอยมาก และยัง พบวาสารปฎิชีวนะ cefotaxime สามารถสงเสริมการเจริญเติบโตของแคลลัส, การชักนําให เกิดคัพภะ และการพัฒนาเปนยอดของขาวสาลี (Mathais และ Boyd, 1986) จากรายงานของ Nakano และ Mii (1993) (อางโดย Yu และคณะ, 2001) พบวาสารปฎิชีวนะ cefotaxime ที่ระดับ ความเขมขน 100–500 มิลลิกรัมตอลิตร สงเสริมการเกิด somatic embryogenesis ของ Dianthus

การใชสารปฎิชีวนะ cefotaxime ที่ความเขมขนระดับสูง มีผลกระทบตอเนื้อเยื่อพืช เชนกัน โดย Yu และคณะ (2001) พบวาการใชสารปฎิชีวนะ cefotaxime ที่ความเขมขน 375 – 500 มิลลิกรัมตอลิตร มีผลอยางมากในการยับยั้งการเติบโตของแคลลัสมะละกอ และการใชสาร ปฎิชีวนะ cefotaxime ในทุกระดับความเขมขน มีผลทําใหรอยละของการเกิด somatic embryo ลดลงเหลือ 86.4 เปอรเซ็นต และยังพบ somatic embryo ที่มีความผิดปกติในทุกระดับความ เขมขน

รายงานของ ฉัตรนภา (2545) ทําการทดลองกําจัดเชื้อ Agrobacterium โดยใช cefotaxime ความเขมขน 500 มิลลิกรัมตอลิตร พบวามีผลตอการเกิดยอด โดยลักษณะยอดที่ได จะสั้น ไมมีการยืดยาวของยอด เมื่อเปรียบเทียบกับความเขมขนที่ต่ําลง โดยเฉพาะอยางยิ่งใน อาหารสูตรที่ไมใส cefotaxime