ตรวจเอกสาร อนุกรมวธานของิ Stylosanthes hamata (USDA, 2004) Kingdom Plantae – Plants Subkingdom Tracheobionta – Vascular plants Superdivision Spermatophyta – Seed plants Division Magnoliophyta – Flowering plants Class Magnoliopsida – Dicotyledons Subclass Rosidae – Order Fabales – Family Fabaceae – Pea family Genus Stylosanthes Sw. -- pencilflower P Species Stylosanthes hamata (L.) Taubert -- cheesytoes P ลักษณะทางพฤกษของ Stylosanthes hamata ถั่วฮามาตา หรือ เวอราโนสไตโล (Stylosanthes hamata) มีแหลงกําเนิดอยูในหมู เกาะอินเดียตะวันตกและอเมริกากลาง (สายัณห, 2540) มีลักษณะคลายถั่วทาวสะวิลสะไตโล เปนถั่วไมเนื้อออนลําตนกึ่งตั้งตรง มีขนาดเล็ก เมื่อมีอายุมากขึ้นจะแผกิ่งกานออกทางดานขาง (Prostrate) ผิวเกลี้ยงอาจมีขนเล็กนอยสูงประมาณ 60 เซนติเมตร จํานวนกิ่งที่แตกจากแกนกลาง อยูสูงจากพื้นดินไมเกิน 5 เซนติเมตร การแตกกิ่งเปนแบบ Sympodial Branching กลาวคือกิ่ง เจริญเติบโตมาจากตาที่อยูบริเวณซอกใบ เมื่อเจริญเติบโตไดระยะหนึ่งจะมีการออกดอกที่ปลาย ยอดและมีการแตกกิ่งจากตาที่อยูบริเวณซอกใบใตดอกอีกในลักษณะเชนนี้ไปเรื่อยๆ ใบเปนแบบ Trifoliate leaf ใบยอยคลายรูปหอก ดอกมีสีเหลือง จัดเปนพืชวันสั้น ออกดอกเร็วประมาณ 35 วัน ในหองควบคุมอุณหภูมิ และ 60-67 วันในสภาพแปลง (ภาควิชาพืชไรนา, 2542) ประเทศไทยนิยม ปลูกกันอยางแพรหลายในภาคตะวันออกเฉียงเหนือในเชิงปรับปรุงทุงหญาและปลูกรวมกันใน แปลงหญาผสม (สายัณห, 2540) การปรับตัวเขากับสภาพแวดลอม S. hamata เจริญไดดีในบริเวณที่ไดรับน้ําฝน ระหวาง 500-1270 มิลลิเมตรและมีฤดูแลงที่ชัดเจน ทนความแลงไดดีมาก ปรับตัวไดดีในดินที่มี สภาพเปนกรดและดินที่มีความอุดมสมบูรณต่ําเมื่อเทียบกับดินชนิดอื่นและยังทนทานตอดินที่มี อะลูมิเนียมสูง S. hamata ทนตอการแทะเล็มไดดี ในสภาพแปลงหญาผสมที่ตองการตัดหรือ ปลอยใหสัตวเขาแทะเล็มไดบอยครั้ง S. hamata (ภาควิชาพืชไรนา, 2542) การถายยีนในพืช การถายยีน (Genetic Transformation) เปนเทคนิคที่ใชสรางสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะ พิเศษคือไดรับการถายยีนที่ไมเคยมีมากอนในสิ่งมีชีวิตนั้นๆ อยางนอยหนึ่งยีน โดยอาศัยเทคนิค การถายยีน เทคนิคที่ใชในการถายยีนนั้นแบงไดเปน 2 ชนิดคือ (สนธิชัย, 2543) 1. การถายยีนใหกับเซลลพืชโดยตรง (Direct gene Transfer) เปนการถายยีนเขาเซลล พืชโดยอาศัยปฎิกิริยาของสารเคมีบางชนิด, การกระตุนดวย กระแสไฟฟา, การใช แรงดันเหนือสภาพทางกายภาพ เหลานี้เปนตัวชวยให DNA เคลื่อนเขาสูนิวเคลียสได 2. การถายยีนโดยใช Agrobacterium เปนพาหะนํายีนที่ตองการเขาสูเซลลพืช ขั้นตอนการถายยีนดวย Agrobacterium โดยสังเขป (หนวยพันธุวิศวกรรมและ เทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ, ม.ป.ป.) 1. ทําการโคลนยีนและศึกษารายละเอียดของยีนที่ตองการจะถายยีน พรอมทั้ง จัดทํา พลาสมิดสําหรับการโคลนยีน 2. เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชใหไดชิ้นพืชที่ตองการจะถายยีนแลวตัดชิ้นสวนของพืชนั้น เพื่อใหเกิดรอยตัดของเซลลจากนั้นนําชิ้นพืชมาแชรวมกับเชื้อ Agrobacterium ที่มีพลาสมิดบรรจุ ยีนเปาหมายอยู 3. ยายชิ้นสวนพืชวางบนอาหารแข็งสําหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อชักนําใหเกิดยอด หรือแคลลัส ซึ่งเติมสารปฎิชีวนะเพื่อกําจัดเชื้อ Agrobacterium ถา Plant Vector มีชุดโครงสราง ยีนที่เปน Selectable marker สามารถคัดเลือกเซลลไดโดยเติมสารที่ใชคัดเลือกเซลลที่เหมาะกับ ยีนชุดนั้นลงในอาหารเพาะเลี้ยงดวย ในที่สุดจะไดตนพืชที่ไดรับการถายยีนที่สมบูรณ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ปจจุบันการถายยีนในพืชสามารถทําไดในพืชหลายชนิด สาเหตุหนึ่งที่ทําใหการถาย ยีนประสบความสําเร็จ คือ เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยสามารถชักนําสวนของพืชตั้งแตราก ใบ กิ่ง ดอก ละอองเกสร เอมบริโอ กลุมเซลล เซลล หรือแมกระทั่งโปรโตพลาสตใหเจริญเปนตนที่ สมบูรณได (สุรินทร, 2545) การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ การชักนําสวนของพืชนิดใดก็ได เชน อวัยวะตางๆ ขอ ปลอง ตา ยอด เนื้อเยื่อ เซลล หรือโปรโตพลาสตมาเลี้ยงในอาหารสังเคราะหที่ประกอบดวยธาตุ อาหารและสิ่งจําเปนในการเจริญเติบโตของพืช โดยชิ้นพืชจะถูกเลี้ยงโดยควบคุมสภาพแวดลอม และใหอยูในสภาพที่ปลอดจากเชื้อจุลินทรีย ทําใหพืชสามารถพัฒนาเปนตนได (รงรอง, 2542) การเจริญเติบโต หรือการพฒนาของชั ิ้นสวนพ ืช ม ี 3 รูปแบบ คือ 1. เนื้อเยื่อพืชถูกชักนําใหเกิดอวัยวะ เชน ยอด หรือ ราก 2. เนื้อเยื่อพืชเจริญไปเปนแคลลัส ซึ่งเปนกลุมของ parenchyma cell เปนเซลลที่ยังไม มีกําหนดการเปลี่ยนแปลงพัฒนาไปเปนอวัยวะชนิดใดๆ แตละเซลลมีขนาดไมแนนอน สามารถ แบงออกเปน 2 ประเภท คือ (รังสฤษฎิ์, 2545) i. Compact callus คือแคลลัสที่มีลักษณะเปนกลุมกอนแข็ง กลุมเซลลเกาะกัน แนน ii. Friable callus คือ แคลลัสชนิดยุย กลุมเซลลเกาะกันอยางหลวมๆ 3. เซลลพืชเจริญไปเปนคัพภะ เกิดจากเซลลเริ่มตน 1 เซลลถูกชักนําใหแบงตัวแลวเกิด รูปรางลักษณะในระยะตางๆ เชนเกิดเปน proembryo stage, globular stage, heart shape, torpedo shape แลวเจริญเปนตนที่มียอดและรากโดยสมบูรณในที่สุด (รงรอง, 2542) ปจจัยที่มีผลตอการเพาะเลี้ยงแคลลัส (รังสฤษฏิ์, 2545) 1. ขนาดและรูปรางของชิ้นสวนพืชเริ่มตนที่ใชเลี้ยง ขนาดชิ้นพืชโดยทั่วไปที่นํามา เพาะเลี้ยงจะใชชิ้นสวนที่คอนขางเล็ก แตไมเล็กเกินกวา critical minimum size ถาชิ้นพืชมีขนาด เล็กไปกวานี้จะไมสามารถชักนําใหเกิดแคลลัสได 2. สารควบคุมการเจริญเติบโต โดยเฉพาะอยางยิ่ง ออกซิน และ ไซโตไคนิน ทั้งนี้ สัดสวนของสารควบคุมการเจริญเติบโตทั้งสองมีผลอยางมากตอการพัฒนาของเซลล โดยถา สัดสวนของออกซินมากกวาไซโตไคนินชิ้นพืชจะถูกชักนําใหเกิดราก ตรงกันขามถาสดสั วนของออก ซินนอยกวาไซโตไคนินชิ้นพืชจะถูกชักนําใหเกิดยอด แตถาสัดสวนนี้สมดุล (ออกซินเทากับไซโตไค นิน) ชิ้นพืชจะถูกชักนําใหเกิดแคลลัส สัดสวนและความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตแต ละชนิดที่ตองการจะผันแปรไปขึ้นกับระยะการพัฒนาของเนื้อเยื่อที่เลี้ยงและชนิดพืช และการ กําเนิดอวัยวะโดยปกติจะถูกกระตุนเมื่อไดรับสารควบคุมในปริมาณที่สูงกวาการเจริญเติบโตของ แคลลัส การเติมสารควบคุมการเจรญเติ ิบโตในอาหารอาจไมจาเปํ นสําหรับการเพาะเลยงี้ แคลลัส แตสารควบคุมการเจริญเติบโตมีสวนชวยเพ ิ่มอตราการเจรั ิญเติบโต หรือการกาเนํ ิด อวัยวะ และมีเนื้อเยื่อพืชเพยงไมี กี่ชนิดที่สามารถสรางแคลลัสไดในอาหารที่ไมมีสารควบคุมการ เจริญเติบโต สารควบคุมการเจริญเติบโตอยางหนึ่งที่นยมใชิ ในการเพมจิ่ ํานวนและรักษาสภาพการ เลี้ยงเปนแคลล ัสไว คือ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) ซึ่งเปนสารสังเคราะหในกลุม ออกซิน มีคุณสมบัติในการปดกั้นกระบวนการกําเนิดอวัยวะ 3. ธาตุอาหาร พบวาอาหารเสร ิมพวกกรดอะมิโน เชน กลูตามนิ แอสปาติน อารจินนิ และพวกเคซินไฮโดรไลเซท สารสกัดจากมอลท ยีสต นามะพร้ํ าว มบทบาทในการกระตี ุนใหเกดิ แคลลัสในพืชหลายชนิด 4. แหลงคารบอน การเติมอินทรียสารที่เปนแหลงใหธาตุคารบอน มีความจํา เปนมากตอเนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิด เนื่องจากมีเซลลพืชไมกี่ชนิดที่มีลักษณะเปน autotrophic โดยปกติแลวนิยมใชซูโครสความเขมขน 2-3 เปอรเซ็นต และหลักฐานชี้วาการสรางสารเมตา โบไลตบางชนิดในเนื้อเยื่อเปนผลมาจากความเขมขนของซูโครส 5. ปจจัยสิ่งแวดลอม โดยทั่วไปแคลลัสตองการความเขมของแสงต่ํา หรือไมใชแสง 6. สภาพอาหาร แคลลัสที่เลี้ยงในสภาพอาหารแข็ง หรือสภาพกึ่งแข็งมักเจริญเตบโติ ไดนอยกวาหรือชากวาในสภาพอาหารเหลว เนื่องจากสภาพผิวสัมผัสในอาหารแข็งมีนอยกวาใน อาหารเหลว จากรายงาน Quecini และคณะ (2002) ไดเพาะเมล็ด Stylosanthes guianensis ใน สภาพอาหารแข็งสูตร ½ - MS ซึ่งปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต ที่มีน้ําตาลซูโครส 1.5 % และไฟตาเจล (phytagel) 0.18 %(W/V) โดยใชเวลา 7-8 วัน พืชจึงมีใบเลี้ยงที่สมบูรณ และ โปรโตพลาสตของ S. guianensis สามารถชักนําใหเกิดยอดไดโดยเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสตใน อาหารสูตรMS ที่มีน้ําตาลซูโครส 1% (W/V) ภายใตแสง 16 ชั่วโมง โดยใชอุณหภูมิ 25 + 2.4 องศาเซลเซียส จากรายงาน Dornelas และคณะ (1991) สามารถชักนํา Stylosanthes scarbra ให เกิดแคลลัสจากสวนของ hypocotyl ภายในเวลา 10 วัน โดยใชอาหารสูตร ½ - MS ที่เติม BAP 2 มิลลิกรัมตอลิตร ภายใตแสง 835 ลักซ โดยในสภาพเดียวกันนี้ชิ้นแคลลัสสามารถพัฒนาเปนยอด ได การคัดเลือกเซลลพืชที่ไดรับการถายยีน การคัดเลือกเซลลพืชที่ไดรับการถายยีนเปนขั้นตอนหนึ่งของกระบวนการถายยีนใน พืช โดยคัดเลือกเซลลที่ไดรับการถายยีนออกจากเซลลที่ไมไดรับการถายยีน (Yu และคณะ, 2003) เซลลพืชที่ไดรับการถายยีนจะมียีนเครื่องหมาย (selectable marker) ที่แสดงการตานทานสารปฎ-ิ ชีวนะไดทําใหเซลลพืชดังกลาวเจริญไดในอาหารที่เติมสารปฏิชีวนะชนิดที่สอดคลองกับยีนนั้น (หนวยพันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ, ม.ป.ป.) ยีนเครื่องหมายที่นิยมใชโดยทั่วไปไดแกยีน neomycin phosphotransferase II (npt II) ตานทานสารปฏิชีวนะ kanamycin, neomycin และ geneticin; ยีน hygromycin phosphotransferase (hph, hpt) ตานทานสารปฏิชีวนะ hygromycin; ยีน phosphinothricin acetyltransferase (bar) ตานทานสาร phosphinothricin; และยีน 5- enolpyruvyl – shikimate – 3 – phosphate syntase (bxn) ตานทานสาร glyphosate (Schrott, 1995) สารปฏิชีวนะ hygromycin สารปฏิชีวนะ hygromycin เปนสารปฏิชีวนะในกลุม aminoglycoside ซึ่งไดมาจาก เชื้อ Streptomyces hygroscopicus เปนสารปฏิชีวนะที่มีฤทธิ์ในการฆาแบคทีเรีย รา และเซลล ยูคาริโอต เนื่องจากสารปฏิชีวนะ hygromycin มีความสามารถในการยับยั้งโปรตีน (InvivoGen, 2003) โดย ไปขัดขวางการ translocation ของ ribosomal นั่นคือเขาไปขัดขวางการจดจําตําแหนง ของ aminocyl tRNA และการเขาเกาะที่ตําแหนง A-Site ของ ribosome (Freitag และ Sachs, ม.ป.ป) ยีน hygromycin phosphotransferase (hph, hpt) เปนยีนตานทานสารปฏิชีวนะ hygromycin โดยยีนดังกลาวสามารถสรางเอนไซม kinase (A.G. Scientific, n.d) ไปทําลาย กระบวนการ phosphorylation ของ 4-hydroxyl group ใน hyosomine moiety จึงเปนผลใหสาร ปฏิชีวนะ hygromycin ไมสามารถทํางานได (Freitag และ Sachs,ม.ป.ป) พืชโดยทั่วไปมักมีการ ตอบสนองตอสารปฏิชีวนะ hygromycin มากกวา kanamycin หรือ geniticin โดยมากมักใชสาร ปฏิชีวนะ ที่ความเขมขน 20 – 200 มิลลิกรัมตอลิตร (A.G. Scientific, ม.ป.ป.) Lin และคณะ (ม.ป.ป.) พบวาสารปฏิชีวนะ hygromycin มีผลยับยั้งการพัฒนาเปน ยอดของตนยาสูบที่ระดับความเขมขน 50 มิลลิกรัมตอลิตร ในสภาพอาหารแข็ง และที่ระดับความ เขมขน 25 มิลลิกรัมตอลิตร ในสภาพอาหารเหลว นอกจากนี้ยังพบวาที่ระดับความเขมขนของ hygromycin 5 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Agrobacterium ไดอยาง สมบูรณ Park และคณะ (1995) ศึกษาอิทธิพลของความเขมขน hygromycin ที่มีผลตอการ พัฒนาแคลลัสของมันฝรั่ง (Solanum tuberosum) พบวาความเขมขน hygromycin 3–5 มิลลิกรัม ตอลิตร สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแคลลัส และที่ความเขมขน 10 มิลลิกรัมตอลิตร หรือ มากกวาสามารถหยุดการเจริญเติบโตของแคลลัสได สําหรับอิทธิพลของความเขมขน hygromycin ตอการพัฒนาเปนยอด พบวาความเขมขน hygromycin 1 มิลลิกรัมตอลิตร สงเสริม การเกิดยอด สาเหตุเนื่องมาจากผลของสารคลาย phytohormone และที่ความเขมขน 4 กรัมตอ ลิตร สามารถยับยั้งการพัฒนาเปนยอดไดอยางสมบูรณ การกําจัดเชื้อ โดยใชสารปฎิชีวนะ cefotaxime การถายยีนดวยเชื้อ Agrobacterium จําเปนตองใชสารปฎิชีวนะ ในการกําจัด แบคทีเรียพาหะเมื่อเสร็จสิ้นการถายยีนแลว สารปฏิชีวนะที่นิยมใชไดแก carbenicillin, cefotaxime และ paromomycin มีความสามารถในการกําจัดเชื้อแบคทีเรีย