ตรวจเอกสาร

อนุกรมวิธานของ hamata (USDA, 2004)

Kingdom Plantae – Subkingdom Tracheobionta – Vascular plants Superdivision Spermatophyta – Seed plants Division Magnoliophyta – Flowering plants Class Magnoliopsida – Dicotyledons Subclass Rosidae – Order – Family – Pea family Genus Stylosanthes Sw. -- pencilflower P Species Stylosanthes hamata (L.) Taubert -- cheesytoes P

ลักษณะทางพฤกษ์ของ Stylosanthes hamata

ถั่วฮามาต้า หรือ เวอราโนสไตโล (Stylosanthes hamata) มีแหล่งก าเนิดอยู่ในหมู่ เกาะอินเดียตะวันตกและอเมริกากลาง (สายัณห์, 2540) มีลักษณะคล้ายถั่วทาวสะวิลสะไตโล เป็นถั่วไม้เนื้ออ่อนล าต้นกึ่งตั้งตรง มีขนาดเล็ก เมื่อมีอายุมากขึ้นจะแผ่กิ่งก้านออกทางด้านข้าง (Prostrate) ผิวเกลี้ยงอาจมีขนเล็กน้อยสูงประมาณ 60 เซนติเมตร จ านวนกิ่งที่แตกจากแกนกลาง อยู่สูงจากพื้นดินไม่เกิน 5 เซนติเมตร การแตกกิ่งเป็นแบบ Sympodial Branching กล่าวคือกิ่ง เจริญเติบโตมาจากตาที่อยู่บริเวณซอกใบ เมื่อเจริญเติบโตได้ระยะหนึ่งจะมีการออกดอกที่ปลาย ยอดและมีการแตกกิ่งจากตาที่อยู่บริเวณซอกใบใต้ดอกอีกในลักษณะเช่นนี้ไปเรื่อยๆ ใบเป็นแบบ Trifoliate leaf ใบย่อยคล้ายรูปหอก ดอกมีสีเหลือง จัดเป็นพืชวันสั้น ออกดอกเร็วประมาณ 35 วัน ในห้องควบคุมอุณหภูมิ และ 60-67 วันในสภาพแปลง (ภาควิชาพืชไร่นา, 2542) ประเทศไทยนิยม ปลูกกันอย่างแพร่หลายในภาคตะวันออกเฉียงเหนือในเชิงปรับปรุงทุ่งหญ้าและปลูกร่วมกันใน แปลงหญ้าผสม (สายัณห์, 2540)

การปรับตัวเข้ากับสภาพแวดล้อม S. hamata เจริญได้ดีในบริเวณที่ได้รับน ้าฝน ระหว่าง 500-1270 มิลลิเมตรและมีฤดูแล้งที่ชัดเจน ทนความแล้งได้ดีมาก ปรับตัวได้ดีในดินที่มี สภาพเป็นกรดและดินที่มีความอุดมสมบูรณ์ต ่าเมื่อเทียบกับดินชนิดอื่นและยังทนทานต่อดินที่มี อะลูมิเนียมสูง S. hamata ทนต่อการแทะเล็มได้ดี ในสภาพแปลงหญ้าผสมที่ต้องการตัดหรือ ปล่อยให้สัตว์เข้าแทะเล็มได้บ่อยครั้ง S. hamata (ภาควิชาพืชไร่นา, 2542)

การถ่ายยีนในพืช

การถ่ายยีน (Genetic Transformation) เป็นเทคนิคที่ใช้สร้างสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะ พิเศษคือได้รับการถ่ายยีนที่ไม่เคยมีมาก่อนในสิ่งมีชีวิตนั้นๆ อย่างน้อยหนึ่งยีน โดยอาศัยเทคนิค การถ่ายยีน เทคนิคที่ใช้ในการถ่ายยีนนั้นแบ่งได้เป็น 2 ชนิดคือ (สนธิชัย, 2543) 1. การถ่ายยีนให้กับเซลล์พืชโดยตรง (Direct gene Transfer) เป็นการถ่ายยีนเข้าเซลล์ พืชโดยอาศัยปฎิกิริยาของสารเคมีบางชนิด, การกระตุ้นด้วย กระแสไฟฟ้า, การใช้ แรงดันเหนือสภาพทางกายภาพ เหล่านี้เป็นตัวช่วยให้ DNA เคลื่อนเข้าสู่นิวเคลียสได้ 2. การถ่ายยีนโดยใช้ Agrobacterium เป็นพาหะน ายีนที่ต้องการเข้าสู่เซลล์พืช

ขั้นตอนการถ่ายยีนด้วย Agrobacterium โดยสังเขป (หน่วยพันธุวิศวกรรมและ เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ, ม.ป.ป.)

1. ท าการโคลนยีนและศึกษารายละเอียดของยีนที่ต้องการจะถ่ายยีน พร้อมทั้ง จัดท า พลาสมิดส าหรับการโคลนยีน 2. เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชให้ได้ชิ้นพืชที่ต้องการจะถ่ายยีนแล้วตัดชิ้นส่วนของพืชนั้น เพื่อให้เกิดรอยตัดของเซลล์จากนั้นน าชิ้นพืชมาแช่ร่วมกับเชื้อ Agrobacterium ที่มีพลาสมิดบรรจุ ยีนเป้าหมายอยู่ 3. ย้ายชิ้นส่วนพืชวางบนอาหารแข็งส าหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อชักน าให้เกิดยอด หรือแคลลัส ซึ่งเติมสารปฎิชีวนะเพื่อก าจัดเชื้อ Agrobacterium ถ้า Vector มีชุดโครงสร้าง ยีนที่เป็น Selectable marker สามารถคัดเลือกเซลล์ได้โดยเติมสารที่ใช้คัดเลือกเซลล์ที่เหมาะกับ ยีนชุดนั้นลงในอาหารเพาะเลี้ยงด้วย ในที่สุดจะได้ต้นพืชที่ได้รับการถ่ายยีนที่สมบูรณ์ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

ปัจจุบันการถ่ายยีนในพืชสามารถท าได้ในพืชหลายชนิด สาเหตุหนึ่งที่ท าให้การถ่าย ยีนประสบความส าเร็จ คือ เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยสามารถชักน าส่วนของพืชตั้งแต่ราก ใบ กิ่ง ดอก ละอองเกสร เอมบริโอ กลุ่มเซลล์ เซลล์ หรือแม้กระทั่งโปรโตพลาสต์ให้เจริญเป็นต้นที่ สมบูรณ์ได้ (สุรินทร์, 2545)

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ การชักน าส่วนของพืชนิดใดก็ได้ เช่น อวัยวะต่างๆ ข้อ ปล้อง ตา ยอด เนื้อเยื่อ เซลล์ หรือโปรโตพลาสต์มาเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ที่ประกอบด้วยธาตุ อาหารและสิ่งจ าเป็นในการเจริญเติบโตของพืช โดยชิ้นพืชจะถูกเลี้ยงโดยควบคุมสภาพแวดล้อม และให้อยู่ในสภาพที่ปลอดจากเชื้อจุลินทรีย์ ท าให้พืชสามารถพัฒนาเป็นต้นได้ (รงรอง, 2542)

การเจริญเติบโต หรือการพัฒนาของชิ้นส่วนพืช มี 3 รูปแบบ คือ

1. เนื้อเยื่อพืชถูกชักน าให้เกิดอวัยวะ เช่น ยอด หรือ ราก 2. เนื้อเยื่อพืชเจริญไปเป็นแคลลัส ซึ่งเป็นกลุ่มของ parenchyma cell เป็นเซลล์ที่ยังไม่ มีก าหนดการเปลี่ยนแปลงพัฒนาไปเป็นอวัยวะชนิดใดๆ แต่ละเซลล์มีขนาดไม่แน่นอน สามารถ แบ่งออกเป็น 2 ประเภท คือ (รังสฤษฎิ์, 2545) i. Compact callus คือแคลลัสที่มีลักษณะเป็นกลุ่มก้อนแข็ง กลุ่มเซลล์เกาะกัน แน่น ii. Friable callus คือ แคลลัสชนิดยุ่ย กลุ่มเซลล์เกาะกันอย่างหลวมๆ 3. เซลล์พืชเจริญไปเป็นคัพภะ เกิดจากเซลล์เริ่มต้น 1 เซลล์ถูกชักน าให้แบ่งตัวแล้วเกิด รูปร่างลักษณะในระยะต่างๆ เช่นเกิดเป็น proembryo stage, globular stage, heart shape, torpedo shape แล้วเจริญเป็นต้นที่มียอดและรากโดยสมบูรณ์ในที่สุด (รงรอง, 2542)

ปัจจัยที่มีผลต่อการเพาะเลี้ยงแคลลัส (รังสฤษฏิ์, 2545)

1. ขนาดและรูปร่างของชิ้นส่วนพืชเริ่มต้นที่ใช้เลี้ยง ขนาดชิ้นพืชโดยทั่วไปที่น ามา เพาะเลี้ยงจะใช้ชิ้นส่วนที่ค่อนข้างเล็ก แต่ไม่เล็กเกินกว่า critical minimum size ถ้าชิ้นพืชมีขนาด เล็กไปกว่านี้จะไม่สามารถชักน าให้เกิดแคลลัสได้

2. สารควบคุมการเจริญเติบโต โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ออกซิน และ ไซโตไคนิน ทั้งนี้ สัดส่วนของสารควบคุมการเจริญเติบโตทั้งสองมีผลอย่างมากต่อการพัฒนาของเซลล์ โดยถ้า สัดส่วนของออกซินมากกว่าไซโตไคนินชิ้นพืชจะถูกชักน าให้เกิดราก ตรงกันข้ามถ้าสัดส่วนของออก ซินน้อยกว่าไซโตไคนินชิ้นพืชจะถูกชักน าให้เกิดยอด แต่ถ้าสัดส่วนนี้สมดุล (ออกซินเท่ากับไซโตไค นิน) ชิ้นพืชจะถูกชักน าให้เกิดแคลลัส สัดส่วนและความเข้มข้นของสารควบคุมการเจริญเติบโตแต่ ละชนิดที่ต้องการจะผันแปรไปขึ้นกับระยะการพัฒนาของเนื้อเยื่อที่เลี้ยงและชนิดพืช และการ ก าเนิดอวัยวะโดยปกติจะถูกกระตุ้นเมื่อได้รับสารควบคุมในปริมาณที่สูงกว่าการเจริญเติบโตของ แคลลัส

การเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตในอาหารอาจไม่จ าเป็นส าหรับการเพาะเลี้ยง แคลลัส แต่สารควบคุมการเจริญเติบโตมีส่วนช่วยเพิ่มอัตราการเจริญเติบโต หรือการก าเนิด อวัยวะ และมีเนื้อเยื่อพืชเพียงไม่กี่ชนิดที่สามารถสร้างแคลลัสได้ในอาหารที่ไม่มีสารควบคุมการ เจริญเติบโต สารควบคุมการเจริญเติบโตอย่างหนึ่งที่นิยมใช้ในการเพิ่มจ านวนและรักษาสภาพการ เลี้ยงเป็นแคลลัสไว้ คือ 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) ซึ่งเป็นสารสังเคราะห์ในกลุ่ม ออกซิน มีคุณสมบัติในการปิดกั้นกระบวนการก าเนิดอวัยวะ

3. ธาตุอาหาร พบว่าอาหารเสริมพวกกรดอะมิโน เช่น กลูตามิน แอสปาติน อาร์จินิน และพวกเคซินไฮโดรไลเซท สารสกัดจากมอลท์ ยีสต์ น ้ามะพร้าว มีบทบาทในการกระตุ้นให้เกิด แคลลัสในพืชหลายชนิด

4. แหล่งคาร์บอน การเติมอินทรีย์สารที่เป็นแหล่งให้ธาตุคาร์บอน มีความจ า เป็นมากต่อเนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิด เนื่องจากมีเซลล์พืชไม่กี่ชนิดที่มีลักษณะเป็น autotrophic โดยปกติแล้วนิยมใช้ซูโครสความเข้มข้น 2-3 เปอร์เซ็นต์ และหลักฐานชี้ว่าการสร้างสารเมตา โบไลต์บางชนิดในเนื้อเยื่อเป็นผลมาจากความเข้มข้นของซูโครส

5. ปัจจัยสิ่งแวดล้อม โดยทั่วไปแคลลัสต้องการความเข้มของแสงต ่า หรือไม่ใช้แสง

6. สภาพอาหาร แคลลัสที่เลี้ยงในสภาพอาหารแข็ง หรือสภาพกึ่งแข็งมักเจริญเติบโต ได้น้อยกว่าหรือช้ากว่าในสภาพอาหารเหลว เนื่องจากสภาพผิวสัมผัสในอาหารแข็งมีน้อยกว่าใน อาหารเหลว

จากรายงาน Quecini และคณะ (2002) ได้เพาะเมล็ด Stylosanthes guianensis ใน สภาพอาหารแข็งสูตร ½ - MS ซึ่งปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต ที่มีน ้าตาลซูโครส 1.5 % และไฟตาเจล (phytagel) 0.18 %(W/V) โดยใช้เวลา 7-8 วัน พืชจึงมีใบเลี้ยงที่สมบูรณ์ และ โปรโตพลาสต์ของ S. guianensis สามารถชักน าให้เกิดยอดได้โดยเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสต์ใน อาหารสูตรMS ที่มีน ้าตาลซูโครส 1% (W/V) ภายใต้แสง 16 ชั่วโมง โดยใช้อุณหภูมิ 25 + 2.4 องศาเซลเซียส

จากรายงาน Dornelas และคณะ (1991) สามารถชักน า Stylosanthes scarbra ให้ เกิดแคลลัสจากส่วนของ hypocotyl ภายในเวลา 10 วัน โดยใช้อาหารสูตร ½ - MS ที่เติม BAP 2 มิลลิกรัมต่อลิตร ภายใต้แสง 835 ลักซ์ โดยในสภาพเดียวกันนี้ชิ้นแคลลัสสามารถพัฒนาเป็นยอด ได้

การคัดเลือกเซลล์พืชที่ได้รับการถ่ายยีน

การคัดเลือกเซลล์พืชที่ได้รับการถ่ายยีนเป็นขั้นตอนหนึ่งของกระบวนการถ่ายยีนใน พืช โดยคัดเลือกเซลล์ที่ได้รับการถ่ายยีนออกจากเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน (Yu และคณะ, 2003) เซลล์พืชที่ได้รับการถ่ายยีนจะมียีนเครื่องหมาย (selectable marker) ที่แสดงการต้านทานสารปฎิ- ชีวนะได้ท าให้เซลล์พืชดังกล่าวเจริญได้ในอาหารที่เติมสารปฏิชีวนะชนิดที่สอดคล้องกับยีนนั้น (หน่วยพันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ, ม.ป.ป.)

ยีนเครื่องหมายที่นิยมใช้โดยทั่วไปได้แก่ยีน neomycin phosphotransferase II (npt II) ต้านทานสารปฏิชีวนะ kanamycin, neomycin และ geneticin; ยีน hygromycin phosphotransferase (hph, hpt) ต้านทานสารปฏิชีวนะ hygromycin; ยีน phosphinothricin acetyltransferase (bar) ต้านทานสาร phosphinothricin; และยีน 5- enolpyruvyl – shikimate – 3 – phosphate syntase (bxn) ต้านทานสาร glyphosate (Schrott, 1995)

สารปฏิชีวนะ hygromycin

สารปฏิชีวนะ hygromycin เป็นสารปฏิชีวนะในกลุ่ม aminoglycoside ซึ่งได้มาจาก เชื้อ Streptomyces hygroscopicus เป็นสารปฏิชีวนะที่มีฤทธิ์ในการฆ่าแบคทีเรีย รา และเซลล์ ยูคาริโอต เนื่องจากสารปฏิชีวนะ hygromycin มีความสามารถในการยับยั้งโปรตีน (InvivoGen, 2003) โดย ไปขัดขวางการ translocation ของ ribosomal นั่นคือเข้าไปขัดขวางการจดจ าต าแหน่ง ของ aminocyl tRNA และการเข้าเกาะที่ต าแหน่ง A-Site ของ ribosome (Freitag และ Sachs, ม.ป.ป)

ยีน hygromycin phosphotransferase (hph, hpt) เป็นยีนต้านทานสารปฏิชีวนะ hygromycin โดยยีนดังกล่าวสามารถสร้างเอนไซม์ kinase (A.G. Scientific, n.d) ไปท าลาย กระบวนการ phosphorylation ของ 4-hydroxyl group ใน hyosomine moiety จึงเป็นผลให้สาร ปฏิชีวนะ hygromycin ไม่สามารถท างานได้ (Freitag และ Sachs,ม.ป.ป) พืชโดยทั่วไปมักมีการ ตอบสนองต่อสารปฏิชีวนะ hygromycin มากกว่า kanamycin หรือ geniticin โดยมากมักใช้สาร ปฏิชีวนะ ที่ความเข้มข้น 20 – 200 มิลลิกรัมต่อลิตร (A.G. Scientific, ม.ป.ป.)

Lin และคณะ (ม.ป.ป.) พบว่าสารปฏิชีวนะ hygromycin มีผลยับยั้งการพัฒนาเป็น ยอดของต้นยาสูบที่ระดับความเข้มข้น 50 มิลลิกรัมต่อลิตร ในสภาพอาหารแข็ง และที่ระดับความ เข้มข้น 25 มิลลิกรัมต่อลิตร ในสภาพอาหารเหลว นอกจากนี้ยังพบว่าที่ระดับความเข้มข้นของ hygromycin 5 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Agrobacterium ได้อย่าง สมบูรณ์

Park และคณะ (1995) ศึกษาอิทธิพลของความเข้มข้น hygromycin ที่มีผลต่อการ พัฒนาแคลลัสของมันฝรั่ง (Solanum tuberosum) พบว่าความเข้มข้น hygromycin 3–5 มิลลิกรัม ต่อลิตร สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแคลลัส และที่ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัมต่อลิตร หรือ มากกว่าสามารถหยุดการเจริญเติบโตของแคลลัสได้ ส าหรับอิทธิพลของความเข้มข้น hygromycin ต่อการพัฒนาเป็นยอด พบว่าความเข้มข้น hygromycin 1 มิลลิกรัมต่อลิตร ส่งเสริม การเกิดยอด สาเหตุเนื่องมาจากผลของสารคล้าย phytohormone และที่ความเข้มข้น 4 กรัมต่อ ลิตร สามารถยับยั้งการพัฒนาเป็นยอดได้อย่างสมบูรณ์

การก าจัดเชื้อ โดยใช้สารปฎิชีวนะ cefotaxime

การถ่ายยีนด้วยเชื้อ Agrobacterium จ าเป็นต้องใช้สารปฎิชีวนะ ในการก าจัด แบคทีเรียพาหะเมื่อเสร็จสิ้นการถ่ายยีนแล้ว สารปฏิชีวนะที่นิยมใช้ได้ แก่ carbenicillin, cefotaxime และ paromomycin มีความสามารถในการก าจัดเชื้อแบคทีเรีย เนื่องจากสารปฎิชีว นะดังกล่าวเข้าจับกับ penicillin binding protein (PBP-3) ซึ่งเป็นโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของ inner membrane ใช้ในการแบ่งเซลล์ของแบคทีเรีย ทั้งนี้สารปฎิชีวนะ cefotaximeมีประสิทธิภาพ ในการยบั ยงั้ เชือ้ จลุ ินทรีย์ได้มากชนิดกว่าและยงั มีฤทธิ์ทางเภสชั สูงกว่า carbenicillin (Mathais และ Boyd, 1986)

สารปฎิชีวนะ cefotaxime

Cefotaximeเป็นสารปฎิชีวนะในกลุ่ม cephalosporins เริ่มมีการน ามาใช้ในช่วง ค.ศ.1970 (Grady และคณะ, 1990) มักใช้ในการยับยั้งหรือก าจัดแบคทีเรียแกรมลบ มีความ คงทนในเอนไซม์ B-lactamase แต่จะถูก hydrolysed ได้ง่ายโดยกลุ่มของ TEM enzyme (A. Kucer และคณะ, 1997)

สารปฎิชีวนะ cefotaxime มีความเป็นพิษต่อเนื้อเยื่อพืชส่วนใหญ่น้อยมาก และยัง พบว่าสารปฎิชีวนะ cefotaxime สามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตของแคลลัส, การชักน าให้ เกิดคัพภะ และการพัฒนาเป็นยอดของข้าวสาลี (Mathais และ Boyd, 1986) จากรายงานของ Nakano และ Mii (1993) (อ้างโดย Yu และคณะ, 2001) พบว่าสารปฎิชีวนะ cefotaxime ที่ระดับ ความเข้มข้น 100–500 มิลลิกรัมต่อลิตร ส่งเสริมการเกิด somatic embryogenesis ของ Dianthus

การใช้สารปฎิชีวนะ cefotaxime ที่ความเข้มข้นระดับสูง มีผลกระทบต่อเนื้อเยื่อพืช เช่นกัน โดย Yu และคณะ (2001) พบว่าการใช้สารปฎิชีวนะ cefotaxime ที่ความเข้มข้น 375 – 500 มิลลิกรัมต่อลิตร มีผลอย่างมากในการยับยั้งการเติบโตของแคลลัสมะละกอ และการใช้สาร ปฎิชีวนะ cefotaxime ในทุกระดับความเข้มข้น มีผลท าให้ร้อยละของการเกิด somatic embryo ลดลงเหลือ 86.4 เปอร์เซ็นต์ และยังพบ somatic embryo ที่มีความผิดปกติในทุกระดับความ เข้มข้น

รายงานของ ฉัตรนภา (2545) ท าการทดลองก าจัดเชื้อ Agrobacterium โดยใช้ cefotaxime ความเข้มข้น 500 มิลลิกรัมต่อลิตร พบว่ามีผลต่อการเกิดยอด โดยลักษณะยอดที่ได้ จะสั้น ไม่มีการยืดยาวของยอด เมื่อเปรียบเทียบกับความเข้มข้นที่ต ่าลง โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน อาหารสูตรที่ไม่ใส่ cefotaxime