Georges Mikhael Nammoura Neto

GEORGES MIKHAEL NAMMOURA NETO

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS METABOLICAMENTE ATIVOS EM BIOFILMES DE AMOSTRAS AMBIENTAIS ATRAVÉS DA ANÁLISE DE rRNA 16S

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

São Paulo 2018

GEORGES MIKHAEL NAMMOURA NETO

Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Área de concentração: Microbiologia

Orientador: Prof. Dr. René Peter Schneider

Versão corrigida

São Paulo 2018

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ______

Candidato(a): Georges Mikhael Nammoura Neto

Título da Tese: “Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro- organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S”

Orientador(a): Prof. Dr. René Peter Schneider

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ...... /...... /...... , considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ...... Nome: ...... Instituição: ......

Presidente: Assinatura: ...... Nome: ...... Instituição: ......

AGRADECIMENTOS

A minha família e amigos pelo suporte e incentivo durante todo o período de pós- graduação.

Aos colegas de bancada do Laboratório de Microbiologia Ambiental: Bianca de Miranda Peres, Júlia Helena Ortiz, Leandro Jorge da Silva, Thiago Ranzani da Costa, Fernando Freitas de Oliveira e Luciana de Oliveira. E do Laboratório de Genética Bacteriana: Fernanda Nogales e Luiz Gustavo de Almeida, pelo auxílio na realização dos experimentos. Em especial esse último por ter sempre tirado minhas dúvidas, por fornecer reagentes e por ser um grande amigo.

Ao Prof. Dr. René Peter Schneider pela orientação deste trabalho.

Trabalho realizado com o apoio financeiro (sob número e processo 1098637 e 1406318):

RESUMO NAMMOURA NETO, G. M. Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S. 2017. 200 f. Tese (Doutorado em Microbiologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, 2017.

A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA “gold standard” e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado. Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação “double digest” proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em ≥3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente.

Palavras-chave: Extração de RNA. Amostras ambientais. Bácterias metabolicamente ativas. MiSeq. RT-PCR. ARDRA.

ABSTRACT NAMMOURA NETO, G. M. Development and validation of method for the identification of metabolically active microorganisms in biofilms of environmental samples by 16S rRNA analysis. 2017. 200 p. Ph. D. thesis (Microbiology) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, 2017.

The optimization and standardization of molecular methods are fundamental to avoid distortions in the results caused by nucleic acid processing of the relative abundance of microorganisms in a sample. In the studies on microbial identification, the validation step is, in most cases, neglected. The main steps in which biases capable of altering the composition of the microbial community can occur are extraction and RT-PCR. The rRNA is the ideal molecule to identify metabolically active microorganisms because they are in the greatest amount within the cell. The lack of a gold standard RNA extraction protocol and specific commercial kits for each type of environmental sample may compromise the post-extraction steps. The RNA extraction protocol adapted in this work showed high efficacy in cell lysis and in the removal of co-extracted contaminants, guaranteeing the integrity and quality of the rRNA extracted from samples containing high concentrations of contaminants. Due to the different chemical characteristics of the environmental samples, the use of this adapted protocol can preserve the information about the metabolically active individuals of a microbial community. Artificial consortia were used to validate the PCR step. The synergistic effect of the use of additives, the high yield Taq polymerase, the sub-cycling program and the limitation of the amplification program in 10 cycles, kept the proportion of the molds of the consortia analyzed close to the expected. After standardization of the ARDRA technique, it was defined that there is a need for between 500 and 550 CFU for a complete coverage of the diversity of activated sludge. The use of MspI / HaeIII and HhaI / RsaI combined enzymes in the same double digest reaction provided the separation of activated sludge clones using fewer ARDRA steps. And the criterion of cut in ≥3% of the total groupings, allowed to select the most representative profiles without the loss of important groups for the analysis of the libraries. It was concluded that the use of an inadequate RNA extraction protocol from complex samples can generate extracts containing co-extracted contaminants that interfere with Taq polymerase activity and restriction enzymes. After the sequencing of the new generation, it was observed that the use of different PCR primers and manual preprocessing for the obtained data were essential to increase the coverage observed for the sludge sample and to improve the resolution of the results and the depth of taxonomic identification, respectively.

Keywords: RNA extract. Environmental samples. Metabolically active bacteria. MiSeq. RT-PCR. ARDRA.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Tecnologias utilizadas nos sequenciadores de nova geração Illumina (A) e Ion Torrent (B)...... 36 Figura 2 - Esquema da leitura paired-ends usando a plataforma MiSeq para a região hipervariável V3- V5...... 64 Figura 3 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo os produtos de extração de RNA dos organismos-teste (Pa: Pseudomonas aeruginosa; Sa: Staphylococcus aureus; Ec: Escherichia coli; Bs: Bacillus subtilis; En: Enterococcus sp. e Ec: Escherichia coli). Em cada carreira do gel foram aplicados o equivalente a 20 μg de rRNA...... 71 Figura 4- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através de diferentes metodologias...... 74 Figura 5 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através das adaptações entre os protocolos G e H...... 74 Figura 6 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através dos protocolos F e G...... 75 Figura 7 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através dos protocolos F e G, ressuspendidos com diferentes soluções de eluição...... 77 Figura 8 - PCR de amostras de RNA de lodo extraídos pelos protocolos F e G contendo diferentes soluções de ressuspensão (água ultrapura, água DEPC2% formamida e TE) e diferentes concentrações de cloreto de magnésio (1, 2, 4 e 5 mM) na reação de PCR. Para todas as reações foram utilizadas as mesmas concentrações de cDNA (1000 ng)...... 78 Figura 9 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo alíquotas de RNA submetidas ao processo de extração pelos protocolos F e G...... 80 Figura 10- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA de amostras contendo bactérias redutoras de ferro cultivadas em diferentes meios de cultura...... 81 Figura 11- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA em amostras contendo bactérias redutoras de cobre cultivadas em diferentes meios de cultura...... 83 Figura 12- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA em amostras de biofilme bacteriano coletadas de tanques de piscicultura marinha. P.a. = Pseudomonas aeruginosa...... 85 Figura 13 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA em amostras de biofilme coletadas em sistema de filtros de areia lento...... 86 Figura 14- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA extraído de lodo armazenado a 4°C e -80°C por 7 dias...... 87 Figura 15- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA extraídas de lodo armazenado por sete dias em freezer a -80º C...... 88 Figura 16- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo extratos de RNA obtidos de lodo ativado armazenados a -80 ºC por 365 dias (A) e 1460 dias (B)...... 89

Figura 17- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA feito com o protocolo G para amostras de biocorrosão do sistema montado na raia olímpica da USP...... 90 Figura 18- Determinação de orgânico/inorgânico (A) e massa seca (B) para amostras de biocorrosão provenientes da usina hidrelétrica de Belo Monte, do sistema de monitoramento da raia da USP e para lodo ativado...... 91 Figura 19- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA feito com o protocolo G para amostra de biolixiviação com diferentes volumes...... 92 Figura 20- Determinação de orgânico/inorgânico (A) e massa seca (B) para amostra de biolixiviação em diferentes volumes...... 93 Figura 21- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA feito com o protocolo G para amostra de biocorrosão inoculadas com diferentes alíquotas de cultura isolada (S.a.)...... 95 Figura 22 - Quantificação no equipamento DeNovix DS-11 dos produtos de síntese da 1ª fita de Burkholderia cepacia (B. c.), Staphylococcus aureus (S. a.), Bacillus subtilis (B. s.), Pseudomonas aeruginosa (P. a) e Klebsiella pneumoniae (K. p.) tratadas e não-tratadas com RNAse A...... 98 Figura 23 - Quantificação no equipamento DeNovix DS-11 dos produtos de síntese da 2ª fita Burkholderia cepacia (B. c.), Staphylococcus aureus (S. a.), Bacillus subtilis (B. s.), Pseudomonas aeruginosa (P. a) e Klebsiella pneumoniae (K. p.), não-tratados com RNAse A. A = Programa padrão e Taq Pol. B = Programa padrão e Taq Platinum...... 101 Figura 24 - Quantificação no equipamento DeNovix DS-11 dos produtos de síntese da 2ª fita Burkholderia cepacia (B. c.), Staphylococcus aureus (S. a.), Bacillus subtilis (B. s.), Pseudomonas aeruginosa (P. a) e Klebsiella pneumoniae (K. p.), tratados com RNAse A. A = Programa padrão e Taq Pol. B = Programa padrão e Taq Platinum...... 1011 Figura 25 - Gel de ARDRA 4% submetido a corrida eletroforética feito para a biblioteca (1:1:1) com 10 ciclos de PCR padrão...... 1033 Figura 26- Porcentagem de predominância dos consórcios montados com extratos de rRNA de culturas puras de P. aeruginosa, S. aureus e B. subtilis nas proporções de 1:1:1, 8:4:1 e 1:8:1. Submetidos à PCR de 10 e 30 ciclos e analisados por sequenciamento no equipamento MiSeq...... 108 Figura 27 - Porcentagem de rendimento obtido nos consórcios artificiais montados com extratos de rRNA de culturas puras nas proporções 1:1:1:1:1, 1:8:1:8:1, 8:1:8:1:8 e 8:4:1:1:8. Submetidos a PCR sub-ciclagem com 10 e 30 ciclos e normal com 10 ciclos...... 110 Figura 28 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo as 8 variações de PCR testadas para as cDNAs obtidos com a extração pelo protocolo F...... 113 Figura 29 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo as 8 variações de PCR testadas para as cDNAs obtidos com a extração pelo protocolo G...... 114 Figura 30 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo as variações de PCR testadas na Tm em 2.5 ºC menor em relação ao normal...... 115 Figura 31 – Gel de ARDRA 4% feito com as enzimas de restrição HhaI e RsaI para as duas metodologias de extração de RNA e com rampa de temperatura no termociclador em 1 ºC/s...... 117

Figura 32- Gel de ARDRA 4% feito com as enzimas de restrição HhaI e RsaI em conjunto para as bactérias separadas no termociclador em 1 ºC/s...... 117 Figura 33- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo os produtos das amplificações geradas por PCR utilizando as enzimas Taq DNA polimerase e Taq Platinum...... 118 Figura 34 – Gel de ARDRA 4% feito com as enzimas de restrição MspI/HaeIII (A) e HhaI/ RsaI (B) para as extrações contendo lodo armazenado (1460 dias) autoclavado...... 120 Figura 35 – Gel de ARDRA 4% feito com as enzimas de restrição MspI/HaeIII (A) e HhaI/ RsaI (B) para as extrações contendo lodo fresco autoclavado...... 121 Figura 36- Ressuspensão com água ultrapura da extração após extração feita com protocolo G e F...... 121 Figura 37 - Gel de RNA submetido a corrida eletroforética com os produto de extração utilizando os protocolos G e F...... 123 Figura 38- Gel de agarose 4% com os diferentes perfis de restrição de amostras de cDNAs clonados oriundos de lodo ativado digeridas com as enzimas de restrição MspI e HaeIII em conjunto...... 125 Figura 39 - Representação de todos os perfis clonais obtidos após a primeira corrida de ARDRA feita com as enzimas de restrição MspI e HaeIII...... 127 Figura 40- Comparação de clones entre bibliotecas de lodo. Número de clones com mesmo perfil de restrição com frequência ≥ 2%, 3% e 4% presentes nas bibliotecas 1, 2 e 3 das amostras de lodo ativado...... 130 Figura 41- Perfis clonais obtidos por ARDRA2 (RsaI e HhaI em conjunto) dos clones agrupados em ARDRA1. A linha pontilhada representa o critério de corte ≥ 3%...... 131 Figura 42- Curvas de acumulação de espécies obtidas da análise das três bibliotecas de clones construídas a partir de RNA extraído de lodo ativado...... 133 Figura 43- Representação de todos os clones obtidos de amostra de lodo ativado e os perfis que estiveram ≥ 3%, em relação ao total de clones analisados nas 3 bibliotecas...... 134 Figura 44- Resultado obtido por Bioanalyzer 2100 com kit DNA 1000 para os clones pertencentes ao grupo Q e agrupamento ZZ (5) submetidos à digestão com enzimas de restrição...... 139 Figura 45- Gel de ARDRA dos clones pertencentes ao grupo Q e agrupamento ZZ (5) submetidos à digestão com enzimas de restrição...... 140 Figura 46- Total de sequências identificadas em níveis de classificação taxonômica para a amostra de RNA de lodo ativado...... 142 Figura 47- Classificação taxônomica em níveis de filo (A), classe (B), ordem (C) e família (D), obtidos para amostra de lodo ativado pelo software 16S Metagenomics App...... 144 Figura 48- Classificação taxônomica em níveis de gênero (A) e espécie (B), obtidos para amostra de lodo ativado pelo software 16S Metagenomics App...... 145 Figura 49- Comparação da abundância de espécies obtidas pela técnica de ARDRA (A) e 16S Metagenomics App (B) para a amostra de lodo ativado...... 146 Figura 50- Classificação taxônomica em níveis de família (A) e gênero (B), obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + SILVA (97%)...... 148

Figura 51- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + GreenGenes 97% (A) e 99% (B) de identidade...... 149 Figura 52- Frequência de gêneros obtidos por metagenômica (16S rDNA) para lodo de esgoto ativado (A). E considerando o número de cópias do gene 16S (B)...... 152 Figura 53- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo F) por metagenômica e pré-tratamento QIIME com banco de dados SILVA 97% (A) e GreenGenes 99% (B) de identidade...... 156 Figura 54- Porcentagem de predominância do consórcio artificial contendo extratos de rRNA de culturas puras de P. aeruginosa, S. aureus e B. subtilis na proporção 1:8:1. Submetido à PCR de 10 ciclos e analisados por sequenciamento no equipamento MiSeq...... 158 Figura 55- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + SILVA 97% (A), GreenGenes 97% (B) e 99% (C) de identidade...... 160 Figura 56- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para as amostras de biolixiviação...... 162 Figura 57- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para as amostras de microcosmos...... 163

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Modos de ação e efeitos na PCR de diferentes tipos de aditivos...... 30 Tabela 2 Etapas de extração de RNA descritas pelos autores dos protocolos, mostrados em três subdivisões: lise, purificação e recuperação. * Adaptado ou modificado neste trabalho...... 48 Tabela 3 - Consórcios montados com extratos de rRNA em diferentes proporções...... 56 Tabela 4 - Variações aplicadas nas reações de PCR...... 59 Tabela 5 - Quantificações realizadas para as extrações de cultura pura...... 71 Tabela 6 - Alíquotas de cultura isolada (S.a.) inoculadas em amostra de biocorrosão coletada na usina hidrelétrica...... 94 Tabela 7 - Porcentagem de clones obtidos nos consórcios montados com extratos de rRNA de culturas puras de P. aeruginosa, S. aureus e B. subtilis nas proporções de 1:1:1 e 1:8:1, submetidos à PCR padrão de 10 e 30 ciclos...... 103 Tabela 8 - Consórcios artificiais submetidos à 10 e 30 ciclos de amplificação por PCR, sequenciados por MiSeq e analisados utilizando diferentes bancos de dados...... 107 Tabela 9– Quantificações das amplificações geradas por PCR utilizando as enzimas Taq DNA polimerase e Taq Platinum...... 119 Tabela 10 - Aplicação do critério de corte para análise das bibliotecas montadas...... 129 Tabela 11 - Variação dos perfis clonais que estiveram ≥ 3% da amostra de lodo ativado...... 132 Tabela 12 - Filogenia dos clones sequenciados...... 136

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AOC - Assimilable Organic Carbon

ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

ATP – Adenosine triphosphate

ATTC - American Type Culture Collection

BSA – Bovine Serum Albumin

CCD - charge-coupled device cDNAs – Complementary DNAs

CMI - Corrosão microbiologicamente induzida

DAM - Drenagem ácida de mina

DEPC - Diethyl dicarbonate

DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DMSO - Dimetilsulfóxido

DNA – Deoxyribonucleic Acid dNTP - Deoxyribonucleotide triphosphate dsDNA – Double Strand DNA

DTT - Ditiotreitol

EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid

EPS – exopolissacarídeo

FISH - Fluorescense In-Situ Hybridization

IVSs – Intervening Sequences

MG-RAST - Metagenomics – Rapid Annotation using Subsystems Technology mRNA – Messeger Ribonucleic Acid

MVLC - Microscopia de Varredura a Laser Confocal

NCBI - National Center of Biotechnology Information

OTUs - Operacional Taxonomic Units

OAFD - organismos acumuladores de fosfato denitrificantes

PBS - Tampão fosfato salino pb – pares de base

PCR -Polymerase Chain Reaction

PVP - Polivinilpirrolidona

QIIME - Quantitative Insights Into Microbial Ecology rDNA – Ribossomal Deoxyribonucleic Acid

RDP - Ribossomal Database Project

RDPipeline - Ribossomal Database Project Pipeline

RNA - Ribonucleic Acid rrn – Ribosomal RNA operons rRNA – Ribosomal Ribonucleic Acid

RT – Reverse Transcriptase

RT-PCR - Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

SDS - Sodium dodecyl sulfate ssDNA – Single Strand DNA

SSU rRNA - Small Subunit Ribosomal Ribosomal Ribonucleic Acid

TE – Tampão de Extração

TGGE - Temperature Gradient Gel Electrophoresis

TSA – Tryptic Soy Agar

TSB - Tryptic Soy Broth

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA...... 20

1.1 Estrutura e identificação da população de micro-organismos ...... 20

1.2 Moléculas alvo ...... 21

1.2.1 Identificação de comunidades microbianas ativas por rRNA 16S ...... 21

1.2.2 Determinação da abundância de espécies por 16S rDNA ...... 22

1.3 Validação de métodos de extração de RNA em amostras ambientais...... 25

1.4 Amplificação por PCR (polymerase chain reaction) em amostras ambientais ...... 27

1.5 Técnicas moleculares de identificação microbiana ...... 30

1.5.1 Clonagem bacteriana ...... 31

1.5.2 Técnica de “Fingerprinting” ...... 32

1.5.2.1 Análises de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA) ...... 32

1.5.2.2 DGGE e TGGE ...... 33

1.5.3 Sequenciamento de Nova Geração ...... 35

1.5.3.1 Sequenciamento de Regiões Hipervariáveis para Classificação Filogenética ...... 37

1.6 Processamento por bioinformática e banco de dados ...... 38

2 JUSTIFICATIVA ...... 41

3 OBJETIVOS...... 43

4 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 44

4.1 Amostras ambientais e consórcios artificiais ...... 44

4.1.1 Cultivo de micro-organismos ...... 44

4.1.2 Amostras de lodo de esgoto ativado ...... 44

4.1.3 Amostras de biolixiviação ...... 45

4.1.4 Amostras de biocorrosão ...... 45

4.1.5 Bactérias redutoras de ferro em microcosmos ...... 45

4.1.6 Amostras de biofilme marinho ...... 46

4.2 Métodos de Extração ...... 46

4.2.1 Protocolo A...... 49

4.2.2 Protocolo B...... 50

4.2.3 Protocolo C ...... 50

4.2.4 Protocolo D ...... 51

4.2.5 Protocolo E...... 52

4.2.6 Protocolo F ...... 52

4.2.7 Protocolo G ...... 53

4.2.8 Protocolo H ...... 54

4.3 Avaliação da ressuspensão de RNA em diferentes soluções ...... 54

4.4 Montagem de consórcios artificiais utilizando misturas de extratos de RNA ...... 55

4.5 Tratamento com DNAse ...... 56

4.6 Purificação do RNA ...... 56

4.7 RT-PCR ...... 56

4.7.1 Otimização na PCR ...... 58

4.8 Purificação ...... 59

4.9 Quantificação de ácido nucleico por análise no espectrofotômetro DeNovix DS-11 ...... 59

4.10 Clonagem e ARDRA ...... 60

4.11 Identificação de perfil de restrição pelo equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent, Califórnia, EUA)………...... 61

4.12 Sequenciamento ...... 61

4.13 Caracterização de Riqueza e Bioestatística ...... 61

4.14 Identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em amostras ambientais por sequenciamento de nova geração ...... 62

4.14.1 Região V3-V5 como alvo para análise de comunidades microbianas complexas...... 63

4.14.2 Preparo das amostras para sequenciamento por MiSeq ...... 64

4.14.3 Processamento por bioinformática e banco de dados ...... 68

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 70

5.1 (1) Padronização da etapa de extração ...... 70

5.1.1 Avaliação da extração de RNA de culturas puras ...... 70

5.1.2 Extração de rRNA de amostras de lodo de esgoto ativado ...... 72

5.1.3 Avaliação da ressuspensão do RNA em diferentes soluções ...... 77

5.1.4 Avaliação de interferentes predentes no lodo ativado na extração de RNA pelos protocolos F e G………...... 79

5.1.5 Aplicação do protocolo G em culturas específicas e em amostras ambientais ...... 80

5.1.5.1 Extração de RNA de biofilme em biocorrosão...... 81

5.1.5.2 Extração de RNA de biofilme em mineração ácida ...... 82

5.1.5.3 Extração de RNA de biofilme de membrana de osmose reversa ...... 84

5.1.5.4 Congelamento de lodo na preservação do RNA ...... 86

5.1.5.5 Extração de RNA e determinação de orgânico/inorgânico e massa seca em amostras provenientes de biocorrosão e biolixiviação ...... 89

5.1.5.6 Determinação da concentração mínima de células para extração de RNA em amostras de biocorrosão… ...... 94

5.2 (2) Otimização da etapa de RT-PCR ...... 97

5.2.1 Quantificação comparativa dos produtos da etapa de síntese do cDNA (RT) para culturas puras………...... 97

5.2.2 Quantificação comparativa dos produtos da etapa de síntese do complexo cDNA:DNA (PCR) para culturas puras ...... 99

5.2.3 Avaliação por clonagem do número de ciclos de PCR na fidelidade de representação de consórcios artificiais ...... 102

5.2.4 Análise do sequenciamento de nova geração para bibliotecas artificiais submetidas à amplificação por PCR com 10 e 30 ciclos ...... 104

5.3 Avaliação da adição de aditivos na PCR ...... 112

5.4 (3) Padronização da etapa de clonagem e ARDRA ...... 124

5.4.1 Análise de clones obtidos por método de extração de rRNA de lodo ativado ...... 124

5.4.2 Análise em géis de ARDRA utilizando enzimas em conjunto ...... 125

5.4.3 Reprodutibilidade entre bibliotecas de lodo ativado ...... 128

5.4.4 Homogeneidade dos grupos de ARDRA formados após a primeira etapa de digestão . 130

5.4.5 Identificação dos clones por sequenciamento ...... 134

5.4.6 Análise comparativa entre gel de eletroforese e Bioanalyzer dos agrupamentos de clones de lodo ativado ...... 138

5.5 (4) Classificação Filogenética por Metagenômica da região V3-V5 do rRNA 16S ...... 141

5.5.1 Resultado por sequenciamento de nova geração para amostra de lodo de esgoto ativado……… ...... 141

5.5.2 Estimativa de abundância de espécies por sequenciamento de nova geração utilizando rDNA 16S…...... 151

5.5.3 Comparação da abundância de espécies de lodo ativado utilizando diferentes protocolos de extração… ...... 155

5.5.4 Avaliação da interferência de contaminantes co-extraídos de lodo ativado em consórcios artificiais…… ...... 157

5.5.4.1 Avaliação da amplificação por PCR com 30 ciclos em amostra de lodo ativado ...... 158

5.5.5 Classificação filogenética de bactérias metabolicamente ativas de amostras ambientais……… ...... 161

6 CONCLUSÃO ...... 165

7 REFERÊNCIAS* ...... 169

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1.1 Estrutura e identificação da população de micro-organismos

Estudos envolvendo a prospecção da diversidade de procariotos em amostras ambientais utilizando métodos dependentes ou independentes de cultivo mostram que os micro-organismos raramente vivem sozinhos. Estes interagem uns com os outros para formar comunidades microbianas complexas, cuja estrutura é determinada por interações cooperativas e competitivas entre seus membros (ZHANG, 2013). Para a identificação de populações de bactérias em uma amostra complexa com uma diversidade grande de espécies de micro-organismos, é necessária a utilização de técnicas independentes de cultivo, também conhecidas como técnicas moleculares. As técnicas tradicionais de identificação bacteriana são baseadas no isolamento do organismo em meio de cultivo, porém, estes procedimentos são inadequados para identificação de bactérias de amostras ambientais, pois os meios de cultura artificiais não são capazes de mimetizar com precisão os diferentes nichos ecológicos (ALMEIDA, 2009; GIOVANNONI et al., 1990; TORSVIK et al., 1998). As reproduções de sistemas naturais em laboratório para pesquisas com biofilme utilizam um número controlado de micro-organismos, sendo uma grande simplificação dos processos naturais. Além disso, muitos micro-organismos aderidos em estruturas de biofilmes não são detectáveis por microscopia óptica convencional por permanecerem ligados a partículas de sedimentos (MUYZER et al., 1993). O biofilme é caracterizado pela síntese de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), produzido por bactérias que podem ou não estar aderidas a uma superfície. O EPS pode ser composto de diversas substâncias orgânicas dependendo de onde o biofilme é formado. Altas concentrações de carboidratos são encontradas no EPS de muitas culturas bacterianas isoladas, enquanto proteínas são mais predominantes em biofilmes de lodo ativado de estações de tratamento de esgoto. Outros compostos como substâncias húmicas, ácido urônico e DNA também são encontrados no EPS (LIU, 2002). O EPS influência na agregação e sedimentação dos flocos suspensos de biofilme em sistemas de tratamento de esgoto (ZENG et al., 2016). Essa matriz exopolimérica confere proteção aos micro-organismos do biofilme contra agentes antimicrobianos (COSTERTON et al., 1994), raios UV, desidratação (a matriz de EPS contem moléculas altamente hidratadas) e predadores como protozoários (XAVIER et 21

al., 2003). Existem diversos trabalhos caracterizando a diversidade microbiana de tanques de aeração dos sistemas de tratamento de esgoto (BOURREIN, 1999; GARBOR, 2003; GUOBIN, 2007; PUROHIT, 2002), águas marinhas (BAE, 2011; DANG, 2001), e sistemas de água potável (HONG, 2010) através do uso de técnicas moleculares, tendo como molécula alvo o 16S rDNA. Entretanto, com base na análise por rRNA 16S, ainda não se sabe quais são os micro-organismos biologicamente ativos presentes nessas amostras ambientais capazes de sintetizar componentes que formam a estrutura do biofilme. O emprego de técnicas independentes de cultivo de comunidades microbianas teve início com a análise de perfis de ácidos graxos (KANEDA, 1967; NASSER, 1990) e recentemente os ácidos nucleicos têm se tornado as moléculas alvo preferidas para estudo de diversidade microbiana. O uso do gene rRNA como molécula padrão para classificação taxonômica foi inicialmente proposto por Woese; Fox (1977) e atualmente os genes das subunidades rRNA 16S são amplamente utilizados para estudos e caracterização de comunidades bacterianas em muitos nichos ecológicos (MIZRAHI-MAN et al., 2013). Qualquer gene que possua domínios conservados pode ser empregado para taxonomia, porém o 16S rDNA e rRNA são as moléculas mais utilizadas para este tipo de estudo. A vantagem adicional da abordagem genética em estudos de consórcios microbianos é a flexibilidade inerente ao método. A molécula de escolha depende da questão abordada, que pode ser: (1) quais são os tipos de micro-organismos presentes? (2) o que estes micro-organismos estão fazendo? e (3) como as atividades destes micro-organismos estão relacionados a funções do ecossistema? (RASTOGI; SANI, 2011). A extração de DNA permite a caracterização de comunidades microbianas com enfoque em biodiversidade, pois cada organismo com DNA intacto contribuirá para o resultado da análise. A extração de RNA ribossômico, por outro lado, direciona a análise para o conjunto de micro-organismos fisiologicamente ativos do ambiente estudado (QIN et al., 2008).

1.2 Moléculas alvo

1.2.1 Identificação de comunidades microbianas metabolicamente ativas por rRNA 16S

A identificação de comunidades microbianas a partir da extração do DNA total e posterior amplificação e sequenciamento do gene de rRNA 16S de amostras ambientais não permite discriminar bactérias metabolicamente ativas de latentes (KEER e BIRCH, 2003; NOVITSKY, 1986; ZAKRZEWSKI et al., 2012), devido a esses genes estarem presentes em um mesmo número de cópias dentro da célula (variando entre as espécies), independente da taxa de crescimento do micro-organismo. Entretanto, a abundância do RNA ribossômico é proporcional a atividade metabólica celular em uma amostra de forma que a quantidade de ribossomos da célula reflete a intensidade de seu metabolismo, isto é, quanto maior a taxa de crescimento de um micro-organismo maior é a quantidade de ribossomos produzido por este (BARBOSA, 1998; WAGNER et al., 1994). As análises feitas utilizando o rRNA mostram com maior sensibilidade a dinâmica de uma comunidade microbiana quando comparado aos resultados obtidos por rDNA. Isto é devido a persistência do DNA no ambiente mesmo após a morte celular (QIN et al., 2008). Estes fatores credenciam o RNA ribossômico como molécula-alvo mais adequada para a identificação das bactérias formadoras de biofilme metabolicamente ativas (ALMEIDA, 2009; FELSKE et al., 2000; MORGAN et al., 2002). No entanto o RNA é uma molécula menos estável do que o DNA, podendo ser degradado por diversos fatores químicos, bioquímicos e físicos do ambiente como calor, pH, íons metálicos e ribonucleases (BRISCO, 2012; EIGNER, 1961). Esta característica deve ser considerada na elaboração de protocolos de análise de populações microbianas a partir da extração do rRNA.

1.2.2 Determinação da abundância de espécies por rDNA 16S

Para identificação dos micro-organismos metabolicamente ativos pela análise do rRNA 16S, partimos da premissa de que, a quantidade para cada tipo de molde de rRNA (isto é, para cada espécie) reflete a proporção da abundância dos micro- organismos dentro de uma amostra. Sabe-se que a concentração de rRNA no interior da célula depende da taxa de crescimento, sendo que a concentração de rRNA depende da abundância intracelular de nucleosídeos trifosfato (TAO et al.,1999). Assim, a composição do meio onde o micro-organismo está presente interfere na taxa de crescimento. Entretanto, não podemos estimar o número de células de cada espécie bacteriana de uma amostra adotando o rRNA 16S como molécula de escolha, porque a quantidade de rRNA não está relacionado com relacionado com a 23

abundância. Ramagopal (1984) observou no cultivo da mesma cepa de E. coli em diferentes meios de cultura complexos concentrações distintas de ribossomos no mesmo ponto de análise da curva de crescimento, porém o número total de células (viáveis e não viáveis) permaneceu idêntica para ambos dos cultivos. Em contrapartida, para a espécie Azotobacter agilis, não houve alteração na concentração de ribossomos mesmo com o aumento de 80% de células não viáveis (SOBEK, 1966). Alguns organismos, em condição de crescimento equilibrado, podem apresentar diferentes relações entre “taxa de crescimento/concentração de rRNA”. Como por exemplo: (1) taxa de crescimento baixa e concentrações de rRNA constantes; (2) taxa de crescimento intermediária, concentração de rRNA aumentando linearmente com a taxa de crescimento; (3) taxa de crescimento elevada, diminuição na concentração de rRNA com o aumento da taxa de crescimento e; (4) diminuição da taxa de crescimento com aumento da concentração de rRNA (BLAZEWICZ et al., 2013; BINDER; LIU, 1998; KERKHOF; KEMP, 1999; WORDEN; BINDER, 2003). O limite estequiométrico, isto é, a taxa de nutriente disponível (reagente) para a produção de moléculas (produto) estruturais celulares, é um fator importante na regulação do crescimento microbiano e na interação com o ambiente, onde em condições favoráveis, promove o aumento na biossíntese de proteínas ribossomais e de rRNA. De acordo com a hipótese da taxa de crescimento, a síntese de rRNA é mantida em função à taxa de crescimento celular, e o número de genes rRNA estão correlacionados a cada espécie bacteriana em responder a disponibilidade de recursos presentes no meio ambiente (ELSER et al., 2000; KARPINETS et al.,2006; STENER et al., 2002). Outro fator que pode determinar a quantidade de rRNA e ribossomos é o número de cópias do gene rRNA (rrn), onde bactérias de crescimento rápido e com genoma relativamente grande contém maior número de operons rrn, essa característica está vinculada à necessidade de ajustes rápidos do metabolismo em que os organismos de crescimento rápido precisam ter perante as mudanças repentinas do suprimento nutricional. Em contrapartida, as bactérias que vivem em ambientes aquáticos estáveis e com poucos nutrientes, tendem a exibir poucas cópias de operons rrn e possuem genomas menores (GYORFY et al.,2015). No domínio Bacteria, os genes que codificam o rRNA 16S estão organizados em um operon e embora a seleção natural favoreça a eliminação de genes redundantes em 24

procariotos, é comumente visto a presença de múltiplas cópias de cada gene que codifica os rRNA 16S e 23S (KLAPPENBACH et al., 2000). Os genes de rRNA (rDNA) são frequentemente usados para a identificação filogenética de micro-organismos, porém o rRNA é amplamente aplicado para caracterizar a atividade metabólica microbiana. Entretanto é necessário estar ciente que, todos os organismos em crescimento são ativos, mas nem todos os organismos ativos estão em crescimento (BLAZEWICZ et al., 2013). Para determinar se uma espécie metabolicamente ativa é a mais abundante dentro de uma amostra, não podemos ter como base somente os dados obtidos com análise do rRNA 16S devido as variações de concentração dessa molécula nas células. Campbell (2011) analisou a relação entre a abundância da comunidade bacteriana e a atividade metabólica pelo sequenciamento de rDNA e rRNA 16S respectivamente, cerca de 20% dos micro- organismos, quando na condição de raros (baixa abundância), apresentou maiores concentrações de rRNA 16S quando estes mesmos foram comparados na condição de predominante (alta abundância), sugerindo que as taxas de crescimento diminuem para algumas bactérias à medida que permanecem em alta abundância. Em amostras ambientais complexas cerca de 50% da comunidade microbiana alternam entre as condições de raros e abundantes, suportando a hipótese que algumas bactérias permanecem dormentes aguardando as mudanças de fornecimento nutricional (CAMPBELL et al., 2011; PEDRÓS-ALIÓ, 2006; SOGIN et al., 2006). Assim, o modo mais significativo de correlacionar à atividade metabólica com abundância da comunidade microbiana pela análise de rRNA e rDNA 16S é considerando também a quantidade do número de cópias do rDNA 16S por genoma de cada espécie bacteriana. Algumas bactérias em fase estacionária podem diminuir concomitantemente o volume celular e o número de ribossomos por célula, entretanto outras espécies como as ultramicrobacterias, podem manter estáveis o tamanho celular e a concentração de ribossomos (FEGATELLA et al., 1998; SCHUT et al., 1997). Assim, em um determinado volume de amostra, duas espécies em fase de crescimento diferentes podem contem concentrações de rRNA 16S similar, mas com concentrações distintas de rDNA, isto é, estar em abundâncias diferentes.

1.3 Validação de métodos de extração de RNA em amostras ambientais

Existe uma grande diversidade de protocolos de extração de DNA e RNA de amostras ambientais descritos na literatura. Porém pouco se sabe sobre a composição dos micro-organismos fisiologicamente ativos responsáveis pela formação dos biofilmes em amostras complexas, como por exemplo: lodo de esgoto ativado, membrana de osmose reversa, biocorrosão e marinho. A validação da extração de RNA é um ponto importante para a correta interpretação de resultados obtidos por análises moleculares subsequentes. Existe muitos estudos publicados nos últimos cinco anos sobre a caracterização de comunidades microbianas baseadas na extração de ácidos nucleicos, a maioria lastreada na extração de DNA das amostras (Scopus - 159 hits, agosto de 2017). Em contrapartida, estudos de comunidades microbianas a partir da extração de rRNA são mais raros (Scopus – 6 hits nos últimos cinco anos, agosto de 2017). Isto se deve as dificuldades técnicas na extração e no processamento de RNA de amostras microbianas complexas, que são bem maiores do que o processamento de DNA. Testes de aplicabilidade e otimizações em protocolos de extração de RNA ou na co-extração de DNA e RNA para amostras complexas foram descritos na literatura, tendo como alvo as amostras de: solo (FANG et al., 2014; KIM et al., 2013; NIKOLAUSZ et al., 2003; PAULIN et al., 2013; TÖWE et al., 2011), biorreator aerado (QIN et al., 2008), biorreator anaeróbio (IBRAHIM; AHRING et al., 2009), lodo ativado (JIN et al., 2010; McILROY et al., 2008; ROMANO; SPICA, 2001), água doce (McCARTHY et al., 2015), filtros marinhos (SCHNEIDER et al., 2017), sedimento (TATTI et al., 2016) e sistema de água potável (INKINEN et al., 2016). Na maior parte destes estudos, os resultados são interpretados quantitativamente com relação à proporção entre grupos taxonômicos de diversos níveis filogenéticos. As poucas publicações dedicadas à avaliação crítica dos procedimentos de manipulação de ácidos nucleicos nos protocolos empregados nestes estudos descrevem grande número de interferências nas análises. Tanto nas análises para a identificação parcial da comunidade microbiana (bibliotecas de clones, “fingerprinting”, Q-PCR, FISH, DNA microarrays, CARD-FISH) como para a identificação completa (DNA-DNA reassociação, sequenciamento genético inteiro, metagenômica, metatranscriptomica) são antecedidas pela etapa de extração de RNA ou DNA (RASTOGI; SANI, 2011). Apesar de muitos testes já terem sido realizados com kits comerciais e protocolos de extração de RNA, ainda não foi 26

descoberto um método que funcione para todos os tipos de amostras ambientais, sendo necessária a otimização dos métodos já existentes (LIM et al., 2016). Alguns trabalhos descritos na literatura têm focado na validação de protocolos de extração de RNA de amostras complexas. McCarthy (2015) avaliaram a eficiência de rendimento entre diferentes protocolos de extração de RNA de amostras de água doce. Os autores observaram que a escolha de um protocolo de extração inadequado pode alterar a informação produzida na análise da composição da comunidade microbiana. Diferentes protocolos de extração de ácido nucleico podem recuperar seqüências de diferentes subsecções da comunidade devido à seletividade de lise e limpeza de extratos (LEITE et al., 2012). Xie (2013) e Lim (2016) focaram na otimização de protocolo de extração de RNA para amostras de biolixiviação e solo respectivamente. McIlroy (2009) avaliaram diferentes protocolos de extração de RNA para lodo ativado, os autores observaram que os melhores resultados de recuperação de RNA foram obtidos com protocolos que adotaram a lise física e sugere que diferentes métodos de extração sejam usados em paralelo para analisar com maior precisão a diversidade da amostra. Assim, a validação do método de extração é uma etapa fundamental para evitar a perda de informação sobre a comunidade microbiana em estudo. E este tipo de validação é possível somente através do emprego de consórcios artificiais de composição conhecida. Stark (2014) avaliaram diferentes métodos de lise na extração de RNA de consórcios bacterianos. Os autores observaram que as espécies Gram positivas apresentaram diferentes níveis de eficiência de extração de RNA, o que resultou na alteração da proporção entre componentes do consórcio nos extratos comparado com o consórcio original. Um protocolo de extração pode ser dividido em três etapas essenciais (1) lise celular por métodos físicos, químicos ou enzimáticos (2) purificação do extrato através da remoção de material particulado, compostos orgânicos e inorgânicos da solução, finalizando com a (3) recuperação do ácido nucleico por precipitação ou filtração. A otimização do processo de extração é um ponto crítico, pois a aplicação de um protocolo com baixa eficiência de extração pode produzir informações erradas sobre a proporção entre membros da população microbiana (LEVER et al., 2015). Cada amostra ambiental possui uma característica particular, fazendo com que nenhum protocolo denominado “universal” de extração de RNA tenha ainda sido desenvolvido para todos os tipos de amostra. Feinstein (2009) observaram que, o uso de diferentes protocolos de extração de ácido nucleico gerou diferentes estimativas na composição 27

da comunidade microbiana. Assim, muitos trabalhos em que o objetivo é a caracterização filogenética de comunidades microbianas em amostras ambientais, tendo como alvo o RNA, acabam por desconsiderar a etapa de validação do método empregado na pesquisa em questão.

1.4 Amplificação por PCR (polymerase chain reaction) em amostras ambientais

A técnica de amplificação de ácidos nucleicos por PCR tem sido muito utilizada em microbiologia ambiental. As estratégias de identificação de comunidades microbianas geralmente incluem o uso da PCR (RASTOGI; SANI, 2011). Entretanto, à amplificação de amostras contendo moldes heterogêneos de DNA e cDNA pode estar sujeita à introdução de artefatos durante o processamento que podem alterar significativamente a proporção de moldes na amostra. A etapa de amplificação por PCR é essencial para aumentar a quantidade de DNA para análise. Erros introduzidos na reação de PCR podem ser causados por diversos mecanismos. Iniciadores denominados “universais” podem não reconhecer os sítios de anelamento de grupos importantes de micro-organismos presentes em uma determinada amostra. A alta temperatura de anelamento no programa de PCR pode impedir o iniciador de anelar no sítio do molde (SIPOS et al., 2010). A formação de estruturas secundárias no ácido nucleico pode dificultar o acesso e a ligação do iniciador ao seu respectivo sítio de ligação (LIESACK et al., 1991; MEYERHANS et al., 1990; PALLANSCH et al., 1990). Os ácidos húmicos presentes nos extratos podem se ligarem covalentemente ao DNA impedindo a sua amplificação e inibir a atividade da enzima polimerase. O mecanismo desta inibição ainda é desconhecido devido à natureza amórfica das substâncias húmicas (MATHESON et al., 2010). E por fim a enzima polimerase, onde mesmo o uso de enzimas de alta fidelidade podem produzir mutações (substituições de bases) durante a síntese do DNA (ECKERT e KUNKEL, 1991; McINERNEY et al., 2014). Hong (2010) observaram a perda de informação da diversidade amostral em decorrência do conjunto de iniciadores utilizados na reação de PCR. Mistura de diferentes iniciadores em uma única reação de PCR também pode causar erros como por exemplo, a formação de quimeras durante amplificação (WANG, 1997). Esta alteração na proporção de diferentes membros da comunidade também é observada no emprego de PCR com muitos ciclos de amplificação (QIU, 2001; SUZUKI; GIOVANNONI, 1996). Brooks et al. (2015), 28

analisou a alteração dos dados de composição de consórcios artificiais durante as etapas de extração, seguido de amplificação por PCR, sequenciamento e classificação taxonômica. O autor relatou que as etapas de extração e PCR foram as que mais introduziram alterações na proporção entre sinais dos diferentes membros da comunidade microbiana. Entretanto, os autores deste estudo submeteram as reações a um número extraordinariamente elevado de 30 e 35 ciclos de amplificação de PCR. Sipos (2007) avaliaram o efeito da variação do número de ciclos de PCR na diversidade microbiana em amostra ambiental. O autor concluiu que, tanto os programas de PCR com números reduzidos de ciclos (18) quanto os programas com muitos ciclos (48) de amplificação, não alteraram os resultados de composição microbiana. Entretanto, Suzuki e Giovannoni (1996) observaram que o aumento de ciclos pode de fato alterar a composição microbiana. Entretanto, um dos principais mecanismos de erros na reação de PCR de extratos com diversidade de sequências é a amplificação preferencial, onde ocorre a amplificação seletiva de certas sequências de DNAs de um extrato, alterando a proporção de cada sequência após a reação (KANAGAWA, 2003; POLZ e CAVANAUGH, 1998). A amplificação preferencial ocorre devido a diferenças de eficiência de amplificação entre moldes e é progressiva com o incremento do número de ciclos adotados. Erros na amplificação por PCR são frequentemente imputados à interferência das regiões ricas em G+C (KEBSCHULL; ZADOR, 2015; SEIFI et al., 2012). Essas regiões produzem dobramentos inter e intracadeias em decorrência do aumento das ligações de hidrogênio com guaninas vizinhas, causando o término prematuro da amplificação pela enzima polimerase. Suzuki e Giovannoni (1996) demonstraram que a variação da porcentagem de guanidina e citosina (G+C) entre moldes é um dos fatores responsáveis pela diferença de cinética de amplificação. Quanto maior o teor de G+C maior será a energia e o tempo necessários para a desnaturação do DNA. Assim, a quantidade de amplicons dos moldes com maior teor de G+C é diminuída progressivamente a cada ciclo de PCR e estes estarão sub-representados no final do programa de amplificação (DUTTON et al., 1993; REYSENBACH et al., 1992). Atualmente o genoma bacteriano de todas as espécies identificadas, exibe uma variação no teor de G+C entre 13% e 75% (BROCCHIERI, 2014; LASSALLE et al., 2015). Este amplo espectro no teor de G+C pode influenciar negativamente na preservação da proporção de moldes durante a amplificação. Dentre algumas medidas para minimizar os vieses de PCR causados por moldes estruturalmente 29

heterogêneos na mistura estão, a emulsificação da reação de PCR com óleo de silicone (Hori et al., 2007) e a redução do número de ciclos na reação de PCR (SUZUKI e GIOVANNONI, 1996; WILSON e BLITCHINGTON, 1996; WHITFORD et al., 1998). O número mínimo de ciclos necessários para evitar a distorção entre a proporção de moldes do extrato de uma amostra com a respectiva proporção de amplicons gerados durante a PCR não está definido. Muitos estudos sobre diversidade microbiana de amostras complexas que utilizaram a técnica de PCR não consideram a introdução de possíveis vieses em etapas de amplificação por PCR com muitos ciclos de PCR. Entre esses estudos, foram utilizados programas de amplificação com 35 ciclos (BRAUN et al., 2016; POITELON et al., 2009; JANG et al., 2016; NAZINA et al., 2017; SMETS et al., 2016), 30 ciclos (BAUTISTA-DE LOS SANTOS et al., 2016; BELILA et al., 2016; DELAFONT et al., 2016; FISCHER et al., 2016), 28 ciclos (XIE et al., 2016), 27 ciclos (CHEN et al., 2016; CAI et al., 2017), 25 ciclos (CAI et al., 2016; JEONG et al., 2016; McCARTHY et al., 2017; MATAR et al., 2017), 21 ciclos (BAKKE et al., 2015; GONZALES-SILVA et al., 2016), 20 ciclos (SAUNDERS et al., 2016) ou não informado (DOHERTY et al., 2017). Almeida (2009) observou que o número de 10 ciclos de amplificação por PCR diminuiu os vieses ocasionados em bibliotecas contendo moldes heterogêneos de cDNA e permitiu a manutenção da proporção relativa de cada molde no produto da reação. O uso de aditivos como a betaína (N,N,N-trimetilglicina), DMSO (dimetilsulfóxido), formamida, glicerina, glicerol, DTT (ditiotreitol), BSA (albumina de soro bovino), não somente previnem a formação de estruturas secundárias como também aumentam a taxa de anelamento dos iniciadores em temperaturas mais baixas (Tabela 1; JENSEN, 2010; SIMONOVIC, 2012; SARKAR,1990; STRIEN, 2013). Seifi et al. (2012) e Jensen (2010) demonstraram que a adição de sulfato de amônio na reação de PCR com concentrações padronizadas de cloreto de magnésio, betaína e DMSO melhorou a amplificação. Lajin (2013) relatou que a adição de 1M betaína melhorou a amplificação por PCR e que devido ao efeito desnaturante do aditivo, a temperatura de anelamento teve de ser reduzida entre 2 a 3 ºC em relação a temperatura ótima da reação de PCR sem a betaína. Farell; Alexandre (2012) concluiu que o BSA, quando usado na combinação com DMSO, atua como um poderoso intensificador de amplificação na PCR. Outros vieses também podem interferir na PCR como por exemplo: componentes da reação e especialmente o DNA, 30

podem adsorver a superfícies poliméricas dos tubos e ponteiras durante o processamento da amostra ou na PCR; nucleases podem degradar as moléculas de RNA e DNA; e o anelamento do iniciador pode ser perturbado por inibidores de PCR, como polissacarídeos (SCHRADER et al., 2012).

Tabela 1 - Modos de ação e efeitos na PCR de diferentes tipos de aditivos.

Tipo Aditivo Modo de ação Efeitos na PCR Aumenta a especificidade e eficiência Quebra no pareamento de Amidas Formamida Diminuição da Tm bases Redução das estruturas secundárias Aumenta a especificidade e eficiência, especialmente em Quebra no pareamento de amostras ricas em G+C Sulfóxido DMSO bases Diminuição da Tm Redução das estruturas secundárias Estabiliza e facilita a Melhora a eficiência, especificidade separação das fitas de DNA e processividade da PCR Aumenta o intervalo ideal da Solutos Diminuição da Tm Betaína concentração de MgCl2 Compatíveis Fraco efeito de termo- estabilização na Taq Aumenta a eficiência de qPCR polimerase Proteínas BSA Elimina os contaminantes Diminui as interferências na PCR

1.5 Técnicas moleculares de identificação microbiana

Como uma alternativa para a identificação dependente de cultivo, as ferramentas moleculares têm sido aplicadas extensivamente nas últimas décadas para identificação microbiana ambiental. As principais vantagens desta metodologia são o nível de precisão alcançado na determinação genotípica e o grande número de micro-organismos identificados em um curto tempo de análise. Inicialmente, o rRNA 5S era utilizado para as análises de diversidade microbiana, mas as baixas variações de nucleotídeos desta molécula que consequentemente limitava sua utilidade a ecossistemas menos complexos, levou a substituição pelo rRNA 16S (THERON; CLOETE, 2007). A princípio, qualquer gene bacteriano que esteja presente em todos 31

os micro-organismos que possua domínios variáveis e conservados pode ser empregado para taxonomia, mas o rRNA 16S é o gene preferido para estes estudos por estar incorporado na estrutura do ribossomo sendo altamente estável (ALMEIDA, 2009). Dentre as técnicas moleculares de identificação estão as baseadas em “fingerprinting” destrutivo e não-destrutívo dos amplicons gerados na etapa de PCR e em sequenciamento de nova geração. Este último é capaz de analisar uma quantidade extremamente grande de amplicons em uma única análise.

1.5.1 Clonagem bacteriana

A clonagem é uma técnica molecular muito difundida em ecologia microbiana, que consiste na extração de DNA de uma comunidade microbiana, amplificação do fragmento de interesse, inserção deste em um vetor de clonagem, por fim a inserção (transformação) desse vetor em bactérias competentes. A utilização da clonagem permite maior resolução na identificação de micro-organismos presentes em amostras ambientais (STOECK; EPSTEIN, 2003; LIANG et al., 2008). Isto é devido a capacidade de isolar cada fragmento clonado em UFC, permitindo o estudo preciso de taxonomia e a detecção de grupos minoritários, os quais são difíceis de detectar por técnicas de “fingerprinting” (ALMEIDA, 2009). As desvantagens da técnica de clonagem são: o alto tempo consumido; o método é laborioso; a extração de ácido nucleico pode ser dificultada quando a amostra é de solo ou sedimento; muitos clones têm que ser sequenciados para atingir cobertura amostral; a técnica não é quantitativa, pois a etapa de PCR pode intensificar ou mascarar a quantidade dos moldes heterogêneos devido às diferenças de acessibilidade aos sítios das moléculas de DNA pelos componentes da reação (ALMEIDA, 2009; SANZ; KOCHLING, 2007). Análises de rarefação de bibliotecas de clones indicam que a diversidade microbiana ambiental não é completamente alcançada com esse tipo de técnica, mas apesar dessas limitações, a clonagem era considerada o “padrão ouro” na pesquisa preliminar de diversidade microbiana (RASTOGI; SANI, 2011).

1.5.2 Técnica de “Fingerprinting”

Métodos de “fingerprint” são amplamente empregados para a caracterização de comunidades microbianas e de suas dinâmicas populacionais (BOTEVA et al., 2013; HEYNDRICKX et al., 1996; PARK, 2015; WEIDNER et al., 1996; ZHANG et al., 2017; YAMEI et al., 2017). Estas análises se iniciam com a extração de DNA ou rRNA das amostras e amplificação dos genes-alvo, sendo geralmente o gene rRNA 16S em procariotos e 18S em eucariotos, por reações de PCR ou RT-PCR com iniciadores universais. Como todos os amplicons terão o mesmo comprimento e, portanto, sendo impossível diferenciar sequências de diferentes espécies em géis de agarose, os produtos das reações de PCR devem ser submetidos a técnicas complementares para recuperar a informação sobre a constituição fenotípica da amostra.

1.5.2.1 Análises de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)

As técnicas destrutivas de análise dos produtos de PCR de extratos de comunidades microbianas incluem todos os procedimentos que dependem da digestão dos amplicons com uma ou mais enzimas de restrição de alta especificidade, seguida da separação eletroforética em gel de agarose. Os amplicons com sítios de digestão em posições distintas produzem um conjunto de fragmentos com tamanhos diferentes, que são identificados em géis de agarose através do perfil característico das bandas. Esta técnica não permite distinguir amplicons sem sítios de restrição e a resolução pode ser comprometida quando os produtos da digestão apresentarem pouca diferença em pares de bases. A combinação de fingerprinting não-destrutivo através da construção de bibliotecas clonais com digestão enzimática otimiza a resolução do método. A grande vantagem de submeter clones de bibliotecas clonais a análise com enzimas de restrição é a rapidez na varredura da amostra com identificação rápida de sequências repetidas com consequente economia nos custos de sequenciamento de amplicons individuais de DNA. A técnica de ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) é baseada no emprego de endonucleases de alta especificidade para sítios de restrição pouco frequentes em sequências de DNA (ALMEIDA, 2009). A execução de ARDRA com uma única enzima de restrição não é recomendável na análise de consórcios microbianos, onde existe a possibilidade de 33

amplicons de diferentes origens não possuírem sítios de clivagem ou da digestão destes amplicons resultarem em fragmentos de restrição muito similares ou até idênticos entre si. O uso de enzimas de restrição em conjunto proporciona maior poder de discriminação nas análises (BRUNK et al., 1996; LIN et al., 2009). Digestões enzimáticas utilizando duas (double digest) ou mais enzimas de restrição em conjunto para determinação filogenéticas pode melhorar o poder de discriminação de fragmentos originários de organismos diferentes em uma amostra (TODOROVA et al., 2012). A combinação de diferentes enzimas de restrição em ARDRA produz perfis mais diferenciados devido o maior número de fragmentos gerados de tamanhos diferentes (BRUNK et al., 1996). Lin (2009) e Moyer (1996) avaliaram as diferentes combinações de enzimas de restrição na identificação da diversidade bacteriana, onde foi observado que as combinações de enzimas MspI/HaeIII, MspI/RsaI possibilitaram o aumento da resolução na detecção de OTUs (unidade taxonômica operacional). As enzimas de restrição MspI, HaeIII, MspI e RsaI reconhecem sítios de corte de 4 bases, quando usadas em pares, permite ótimos níveis de fragmentação, isto é, são capazes de gerar um número maior de fragmentos permitindo a discriminação entre as espécies (MOYER, 2001). Além do uso de enzimas em conjunto, na análise de bibliotecas de clones é primordial o uso de consecutivas etapas de ARDRA, aumentando o limite de resolução para o agrupamento filogenético (INGRASSIA et al., 2001). Cada enzima de digestão reconhece diferentes sequências de pares de base no sítio de clivagem. Devido à grande diversidade de enzimas de restrição existentes há inúmeras possibilidades de combinação “double digest” em análises de ARDRA e a possibilidade de sequências diferentes serem classificadas como iguais no processo de análise. A aplicação de ARDRA na caracterização de comunidades microbianas complexas depende de uma estratégia para extrair o máximo de informação sobre a diversidade de sequências de uma amostra com um mínimo de esforço laboratorial. Assim, é necessário a padronização da técnica de ARDRA para determinação dos micro-organismos mais abundantes presentes em amostras ambientais complexas.

1.5.2.2 DGGE e TGGE

O processamento não-destrutivo de amplicons inclui técnicas como DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ou TGGE (Temperature Gradient Gel 34

Electrophoresis), possibilitam a análise de cada amplicon individualmente através de gel de acrilamida com gradiente desnaturante químico ou físico, respectivamente. Em ambas das técnicas, um dos iniciadores utilizados na amplificação dos moldes de DNA por PCR contém grampo rico em bases guanina e citosina (G+C) com aproximadamente 40 pb (MYERS et al., 1985), com isso os amplicons são separados de acordo com o peso molecular determinado pela quantidade de G+C do DNA. Porém durante a corrida eletroforética, ocorre o aumento gradual do agente desnaturante, o qual faz com que o ácido nucleico de fita dupla se abra ficando presa na malha do gel, assim os amplicons com maior quantidade de G+C terão maior mobilidade no gel. Esse método permite detectar diferenças no comportamento de desnaturação de pequenos amplicons, que teoricamente diferem em apenas uma base. Por ser uma técnica dependente de amplificação por PCR, outros fatores podem contribuir para a distorção nos resultados como: a presença de inibidores co- extraídos; amplicons de DNA de diferentes organismos com mesmo padrão de desnaturação; a presença do grampo G+C acoplado ao final de um dos iniciadores causando a baixa eficiência de amplificação por PCR aumentando o risco de geração de artefatos na etapa de anelamento, como a formação de heteroduplex (FERRIS et al., 1997; PITERINA; KOZDRÓJ; van ELSAS, 2000; LEE et al., 1996; PEMBROKE, 2013; RUANO e KIDD 1992; SEKIGUCHI, 2001); e a formação de dímeros no iniciador (MOESENEDER, 1999). O DGGE, assim como outras técnicas que empregam o uso de PCR, possui limitações de detecção e de comparações quantitativas das populações detectadas. O principal fator é a perda da correlação entre a abundância da população bacteriana com as intensidades de bandas em géis (PIERANGELA et al.; 2013). Araújo e Schneider (2008) visaram identificar numericamente os organismos dominantes de consórcios artificiais utilizando a técnica de DGGE. Os autores observaram que o uso dos iniciadores contendo o grampo G+C levou à amplificação preferencial de amplicons sub-representados nos consórcios. Os autores concluíram ser impossível obter com esta técnica uma representação exata das proporções relativas de um consórcio artificial ou dos organismos de uma comunidade. Outros fatores limitantes na técnica de PCR-DGGE e TGGE em culturas mistas incluem: a alta complexidade dos perfis em géis desnaturantes; informação de sequência limitada (< 500 pb) de bandas de DNA; amplicons com ponto de fusão semelhantes e o número de cópias do gene rDNA 16S, podendo distorcer a informação sobre a diversidade em análises de comunidades com composição 35

desconhecida (RASTOGI; SANI, 2011). Assim pode ser concluído que os métodos de DGGE e TGGE não são indicados para a análise de comunidades complexas com grupos minoritários de bactérias.

1.5.3 Sequenciamento de Nova Geração

A identificação de comunidades microbianas por clonagem e técnicas de “fingerprinting” são frequentemente utilizados. Entretanto, uma vez que somente um número limitado de clones pode ser analisado a complexidade da comunidade não é completamente representada (ZAKRZEWSKI et al., 2012). Os avanços no sequenciamento de nova geração permitiram descobrir as diversidades microbianas em uma ampla variedade de amostras, tendo como alvo o gene rRNA 16S para determinação das relações filogenéticas (REUTER, SPACEK; SNYDER, 2015). Os primeiros estudos de comunidades microbianas tipicamente sequenciavam o gene rRNA 16S inteiro, porém os dados da diversidade eram limitados devido pouca profundidade de sequenciamento. Com os sequenciadores de nova geração o foco mudou para sequenciamento de curtos fragmentos de genes (MIZRAHI-MAN et al., 2013). Atualmente os estudos com comunidades microbianas foram direcionados para as novas tecnologias de sequenciamento de nova geração devido ao barateamento e melhoramento das ferramentas de bioinformática (KOZICH et al., 2013). Os sequenciadores de nova geração estão sendo amplamente utilizados para caracterização microbiana utilizando o gene rRNA 16S como molécula alvo, mas com a atual limitação da técnica, ainda não é possível sequenciar o gene 16S inteiro (1500 pb). O sequenciamento de nova geração não requer etapas preliminares de clonagem, levando a redução no custo, rapidez e sequenciamento paralelo de muitos fragmentos de DNA. Esta característica gera uma cobertura de sequenciamento suficiente para análises de comunidades microbianas complexas, como por exemplo: sistemas de tratamento de esgoto (JI et al.; 2015) e sistemas de distribuição de água potável (LIU et al.; 2014). Um dos métodos mais novos para sequenciamento é o pirosequenciamento, onde a leitura da sequência é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas que se inicia com a liberação de um pirofosfato (PPi), oriundo da adição de um desoxinucleotídeo à cadela. Em seguida, esse pirofosfato é convertido para ATP pela enzima ATP sulfurilase, sendo este, utilizado 36

pela luciferase para oxidar a luciferina produzindo um sinal de luz que é captado por uma câmera CCD (CARVALHO; SILVA, 2010; RONAGHI, 2001). As plataformas mais utilizadas para estudos de comunidades microbianas são fornecidas pela Illumina (Califórnia, USA) e o Ion Torrent (New Hampshire, EUA), ambos utilizam ferramentas de bioinformática para remontagem das sequencias identificadas (JEON et al., 2015). O processo de sequenciamento dos equipamentos da Illumina envolve a ligação do DNA em uma superfície de vidro através de adaptadores específicos. A leitura das bases é feita em ciclos, iniciados com a incorporação da base, lavagem, captação da imagem e clivagem. Cada nucleotídeo incorporado emite uma fluorescência característica (Figura 1A). O sequenciador Ion Torrent desenvolvido pela empresa Life Technologies utiliza a tecnologia baseada na ligação do DNA em uma “bead” e amplificado por PCR-emulsão, o chip semi-condutor capta a mudança do pH através da liberação de íons hidrogênio durante a incorporação de dNTPs (Figura 1B; REUTER, SPACEK; SNYDER, 2015).

Figura 1 - Tecnologias utilizadas nos sequenciadores de nova geração Illumina (A) e Ion Torrent (B). Adaptado de: Reuter, Spacek; Snyder (2015). (A) anelamento da sequência no chip e amplificado, formando clusters, então tem o início do sequenciamento. (B) anelamento da sequência em beads e amplificado, cada bead é alocada em um poço no chip e então sequenciado.

Essa característica torna os sequenciadores de nova geração uma ferramenta de grande importância quando na caracterização microbiana de amostras ambientais, em particular os biofilmes, possibilitando realizar análises qualitativas e quantitativas. As vantagens desse método sobre a clonagem bacteriana são: diminuição das etapas de PCRs e manipulação das amostras; análise de grande número de amostras em curto período de tempo; maior confiabilidade qualitativa e quantitativa; utilização de barcodes para diferenciação de várias amostras em uma única corrida de sequenciamento. Os sequenciadores de nova geração permitem caracterizar as complexas comunidades microbianas. Considerando que o termo genoma é toda a informação genética de um organismo e a metagenômica é a coleção de toda a informação genética de um ecossistema inteiro, o transcriptoma pode ser descrito como a informação de todas as moléculas de RNA codificantes ou não expressados por uma célula sob uma determinada condição. Consequentemente, a metatranscriptoma pode ser descrito pela análise quantitativa de todos os genes expressos em uma amostra com diversos organismos ou por um ecossistema inteiro (WECHX, 2009). A análise por metagenômica se baseia na extração de DNA para a identificação dos micro- organismos e que consiste na análise de amostras contendo uma complexa diversidade microbiológica independendo de cultivo em laboratório, tendo em mente que somente uma pequena fração de micro-organismos podem ser cultivados. Em amostras ambientais, a comunidade microbiológica tem melhor cobertura com as análises por metagenômica pelos sequenciadores de última geração devido à enorme quantidade de fragmentos sequenciados que está tecnologia proporciona. Os principais objetivos da transcriptômica são: a catalogação de todos os genes transcritos em uma determinada amostra, incluindo mRNA, RNAs não-codificantes e pequenos RNAs; determinação da estrutura transcricional dos genes, em termos de sítios de início, padrão de splicing e outras modificações pós-transcricionais; e quantificação da mudança nos níveis de expressão de cada transcriptoma (WANG, 2009). O estudo das moléculas de mRNA por metatranscriptômica em biofilmes se torna importante para identificar quais nutrientes estão sendo consumidos e para se averiguar quais proteínas estão sendo formados para a formação da matriz do biofilme ambiental.

1.5.3.1 Sequenciamento de Regiões Hipervariáveis para Classificação Filogenética 38

Dentre as nove regiões hipervariáveis algumas possuem maior capacidade de identificação filogenética para linhagens bacterianas em particular, entretanto não há uma região específica para estudo de comunidades complexas, sendo recomendado o uso de várias regiões alvo em conjunto (JEON et al., 2015). Uma simples região hipervariável não pode diferenciar todas as espécies bacterianas, porém o uso concatenado dessas regiões pode melhorar a distinção das espécies bacterianas (CHAKRAVORTY et al., 2007). Muitos estudos sugerem o uso das regiões V1, V2 e V3 (BROOKS et al., 2015; BARTRAM et al., 2011; KUMAR et al., 2011; PITTA et al., 2014; WERNER et al., 2012), outros apontam que essas regiões superestimam a riqueza de espécies e promovem o uso da região V4, V5 e V6 como o mais apropriado (CAPORASO et al., 2011; GAIDOS, et al., 2011; JEON et al., 2015; KOZICH et al., 2013). No entanto, outros estudos demonstram que a região V7-V8 são mais representativos para caracterização de uma comunidade (KUMAR et al., 2011). Em estudo realizado por Chakravorty (2007) as regiões V2, V3 e V6 mostraram maior poder discriminatório para 110 espécies bacterianas analisadas. Zakrzewski (2012) e Mizrahi-Man (2013) recomendam as regiões V3 e V4 para estudos de comunidades bacterianas. A escolha dos iniciadores para amplificação da região de interesse também é um fator determinante. A otimização de iniciadores é crucial para alcançar uma representação sem interferências da composição da comunidade microbiana (HUGERTH et al., 2014). Bakke (2011) e Prosdocimi (2013) observaram que a amplificação da região V3 com o iniciador 518R pode levar a erros de interpretação dos resultados em comunidade bacteriana de amostras ambientais, pois esse iniciador possui homologia para genes (SSU rRNA) de eucariotos. Os iniciadores 341F - 534R (região V3) e 341R – 907R (região V3–V5) podem amplificar genes de diferentes organismos, dificultando a análise de dados obtidos por biologia molecular de amostras heterogêneas (HUYS et al., 2008).

1.6 Processamento por bioinformática e banco de dados

Existem diferentes softwares para análises de dados obtidos por sequenciamento de nova geração, os mais utilizados são o QIIME (www.qiime.org), o RDPipeline (www. omictools.com), o MOTHUR (www.mothur.org), o VAMPS 39

(http://vamps.mbl.edu), MG-RAST (www.metagenomics.anl.gov), CloVR-16S (www. http://clovr.org), EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net), METAGENassist (http://www.metagenassist.ca), SnoWMan (www.snowman.genome.tugraz.at) e o MEGAN (www.ab.inf.uni-tuebingen.de). Entretanto, o software QIIME possui algumas vantagens em relação aos demais como: maior precisão na atribuição taxonômica, implementação de testes estatísticos, rapidez de processamento de grande volume de dados, requisito computacional acessível, facilidade de uso e suporte documental (D’ARGENIO et al., 2014; GOODRICH et al., 2013; NILAKANTA et al., 2014; PLUMMER, et al., 2015). Devido ao fenômeno de reação cruzada de iniciadores de rRNA 16S com genes de eucariotos, muitas sequencias anotadas no GenBank para rRNA 16S são atualmente fragmentos de genes de rRNA 18S. Esse fator também pode levar a superestimação da diversidade procariótica, interferência no padrão de bandas em gel de agarose e interferência no monitoramento de populações (HUYS et al., 2008; PROSDOCIMI et al., 2013). A escolha do banco de dados de referência taxonômica pode impactar na fidelidade do resultado de classificação (SOERGEL et al., 2012). Para os resultados gerados por sequenciamento de nova geração podem ser utilizados bancos de dados distintos. O RDP (http://rdp.cme.msu.edu) é amplamente utilizado para análise de comunidade microbiana e na microbiologia ambiental, sendo que 85% das sequências bacterianas no RDP são provenientes de isolados diretos de amostras ambientais (COLE et al., 2013). O SILVA (http://www.arb-silva.de) é um banco de dados exclusivo para RNA microbiano que é atualizado frequentemente. Além disso, o novo conjunto de dados não-redundante do SILVA faz com que seja uma referência de classificação ideal para sequenciamentos de nova geração (QUAST et al., 2012). O Greengenes (http://greengenes.lbl.gov) é um banco de dados dedicado ao rRNA 16S como referência taxonômica, com aproximadamente 406.135 sequências filtradas (maio de 2013). O Greengenes é baseado em uma árvore filogenética de novo, isto é, gerado a partir de novas classificações taxonômicas ou transferência de classificações taxonômicas entre bancos de dados (McDONALD et al., 2012). A identificação filogenética é baseada na identidade da sequência (%ID), os limites de 97% e 99% são os mais utilizados para estudos com bactérias (GOODRICH et al., 2013). Existem diversos trabalhos na literatura que apresentam comparações analíticas entre diferentes softwares (ALBANESE, et al., 2015; MAJANEVA, et al., 40

2015; PLUMMER, et al., 2015; PUENTE-SÁNCHEZ et al., 2015) e bancos de dados para amostras microbianas (GARDNER, 2012; KOZLOV, et al., 2016; NEWTON; ROESELERS, 2012; WERNER et al., 2012). Entretanto, ainda existem muitas divergências entre os resultados apresentados para cada banco de dados utilizado em diferentes amostras analisadas. Apesar das vantagens apresentadas no uso de sequenciadores de nova geração, é necessário adotar medidas corretivas durante a análise dos dados para eliminar erros, como o uso de limiares de pontuação de alta qualidade para remoção de sequencias de baixa qualidade; correção de sequencias através de fluxogramas de correção; e o uso de sequencias pré-alocadas (PINTO; RASKIN, 2012).

2 JUSTIFICATIVA

Os biofilmes bacterianos estão presentes em várias atividades humanas como nas indústrias que envolvam bioprocessos, nas estações de tratamento de água e efluentes. Porem há várias atividades em que os biofilmes causam impactos negativos, como por exemplo, biocorrosão e perda de eficiência em filtragens. Assim, entender quais são os micro-organismos de maior atividade dentro destes processos pode levar a melhorias nas condições de operação. A correta informação sobre os micro-organismos ativos é de vital importância para o conhecimento das espécies responsáveis na produção do EPS. Em muitos trabalhos em que o objetivo é a caracterização filogenética de comunidades microbianas em amostras ambientais, tendo como alvo o RNA, acabam por desconsiderar a etapa de validação do método empregado na pesquisa em questão. Durante todo o processo, desde a coleta da amostra estudada até a aplicação da bioinformática para a confirmação filogenética, existe a possibilidade de ocorrer vieses capazes de alterar a composição da comunidade microbiana, como por exemplo: as condições de armazenamento e transporte podem causar impactos no rendimento e na qualidade do DNA e RNA; os diferentes protocolos de extração de ácido nucléico podem resultar em diferenciação no perfil da diversidade microbiana devido aos diversos métodos de lise e capacidade de remover contaminantes; a escolha do iniciador e as variações no programa de amplificação por PCR podem distorcer a proporção dos moldes de ácido nucléico e/ou apresentar especificidade de anelamento para alguns grupos bacterianos; e a escolha do software e do banco de dados para análise dos resultados gerados por sequenciamento de nova geração podem gerar resultados divergentes em sobre a microbiota. Já na análise por ARDRA, a escolha e uso em conjunto de enzimas de restrição podem influenciar na capacidade de discernimento entre as bandas em gel de agarose. Atualmente, as análises de comunidades microbianas baseadas em extração de ácidos nucleicos são tipicamente desenvolvidas por sequenciamento de alto rendimento de produtos de PCR dos genes-alvo, frequentemente o gene rRNA 16S, seguido da aplicação de ferramentas de bioinformática para alocação taxonômica de cada um dos fragmentos. Erros de processamento podem resultar em dados de composição de microbiota incorretos. Mesmo em recentes trabalhos sobre avaliação da efetividade de diferentes conjuntos de iniciadores de PCR em comunidade 42

microbiana complexas são observados o uso de programas de PCR com muitos ciclos de amplificação. Análises utilizando a técnica de PCR em extratos de rDNA também podem distorcer a abundancia em número de células devido o número de operons de rRNA presente no genoma bacteriano. Apesar do uso de poucos ciclos de PCR reduzir a quantidade de produto de PCR, é recomendado submeter os extratos da amostra a um baixo número de ciclos de PCR, para preservar a proporção dos moldes heterogêneos e, consequentemente, a precisão da estimativa da riqueza microbiana de uma amostra.

3 OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho é aprimorar e validar metodologias para análise de diversidade microbiana em biofilmes ambientais (lodo de esgoto, biofilme de membrana de osmose reversa, biofilme de biocorrosão em usinas hidrelétricas e biofilmes de biofiltros de tratamento de água do mar), que permitam identificar os micro-organismos metabolicamente ativos destas estruturas. Para isso, o rRNA 16S foi adotado como molécula de escolha devido a sua concentração refletir a atividade metabólica dos micro-organismos. Os objetivos específicos são:

1. Avaliar e validar um protocolo eficaz para extração de RNA em amostra de lodo ativado e a aplicabilidade em outros tipos de amostras complexas;

2. Otimização do programa de RT-PCR e avaliar quais combinações de aditivos permitem a geração de amplicons sem modificar as proporções originais entre moldes das amostras;

3. Definir o número necessário de clones para cobertura amostral completa e o número mínimo de tratamentos sequenciais de ARDRA necessários para agrupamento dos clones em conjuntos com sequência similares;

4. Analisar comparativamente os diferentes bancos de dados utilizados e a aplicação de pré-tratamento dos dados na confirmação de resultados das etapas anteriores e na caracterização filogenética de amostras complexas.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostras ambientais e consórcios artificiais

4.1.1 Cultivo de micro-organismos

Para avaliar a eficiência dos protocolos de extração e das análises moleculares, foram montados dois consórcios artificiais, composto pelas seguintes espécies: (1) três bactérias Gram positivas (Enterococcus sp – ATCC 202155, Bacillus subtilis – ATTC 6633 e Staphylococcus aureus - ATCC 6538) e duas Gram negativas (Escherichia coli K12 - ATCC 29425 e Pseudomonas aeruginosa – ATTC 15442); (2) duas bactérias Gram positivas (Bacillus subtilis – ATCC 6633 e Staphylococcus aureus - ATCC 6538) e três Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa – ATCC 15442; Klebsiella pneumoniae e Burkholderia cepacia – isoladas em laboratório), as linhagens bacterianas do consórcio2 possuem o teor de G+C no gene rRNA 16S de 55%, 51%, 54%, 56% e 52%, respectivamente. Foram utilizadas bactérias Gram negativa e positiva com o propósito de avaliar as diferentes técnicas de lise dos protocolos de extração testados neste trabalho (seção 4.2). Todas as espécies selecionadas foram cultivadas em meio TSA e mantidas em geladeira à 4 ºC. Para o preparo do inóculo foi transferida uma alçada de cada espécie para meio TSB. O inóculo foi incubado com agitação a 37 ºC e até a fase exponencial de crescimento. Alíquotas de 2 mL em tubos do tipo Falcon foram centrifugadas a 16000 g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi armazenado em freezer -80 ºC.

4.1.2 Amostras de lodo de esgoto ativado

As amostras foram coletadas do tanque de aeração da estação de tratamento de esgoto de Barueri (SABESP–SP) e acondicionadas em frascos do tipo Shott autoclavados e mantidos em isopor durante o transporte, no qual foram mantidos em temperatura ambiente. Imediatamente após a chegada da amostra no laboratório, foram separadas alíquotas de 7 mL (cerca de 200mg) em tubos do tipo Falcon e então centrifugadas a 16000 g por 5 minutos a temperatura de 4 °C. O sobrenadante foi 45

descartado e o lodo concentrado foi estocado em freezer -80 ºC. O volume da amostra para extração foi padronizado por Almeida (2009).

4.1.3 Amostras de biolixiviação

As amostras de biolixiviação foram fornecidas pelo Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Engenharia Química da Poli (USP - SP) e submetidas à extração logo após o tempo de incubação. Para manutenção do consórcio de micro-organismos, as amostras provenientes da lagoa de rejeitos da mina de Sossego (Pará, Brasil) foram misturadas ao meio de cultura 9K e concentrado de calcopirita. E o pH foi ajustado em 2 e 7, que são os valores encontrados durante o processo de biolixiviação e na lagoa de rejeito, respectivamente. Para verificar a possível presença de micro-organismos ferro e/ou enxofre oxidantes, foi fornecido uma amostra de biolixiviação enriquecida em pH 2, cultivada em meio 9K e suplementada com solução FeSO4.7H2O e/ou enxofre elementar.

4.1.4 Amostras de biocorrosão

As amostras foram coletadas em corpos de prova instalados no Rio Xingu (Pará, Brasil), no qual permaneceram em contato com o meio aquático por 190 dias. As amostras foram mantidas em isopor contendo gelo durante o transporte. Os materiais foram fornecidos pela empresa VOITH, no qual compõem as estruturas na usina hidrelétrica de Belo Monte (Pará, Brasil): aço carbono S355 N (material das travessas) - sem pintura, aço inox austenítico - ASTM A276 – tipo 304 (inox do tubo de sucção), aço carbono ASTM A36, aço inox AISI 410. Esse mesmo ensaio foi realizado para biofilmes crescidos em corpos de prova em sistema montado para análise de corrosão montado na raia olímpica da USP, no qual foram expostos ao fluxo de água com e sem pré-filtração em sistema de filtro de areia lento. Estas amostras foram submetidas à extração logo após o tempo de incubação

4.1.5 Bactérias redutoras de ferro em microcosmos

O estudo que envolve microcosmos consiste em fornecer condições controladas para uma comunidade microbiana e analisar a dinâmica de resposta a esta condição. 46

O óxido de ferro (III) insolúvel é um dos metais mais abundantes da crosta terrestre e alguns grupos microbianos são capazes de reduzir o Fe (III), utilizando este metal como aceptor final de elétrons (SILVA, 2007). As amostras foram fornecidas pelo Laboratório de Microbiologia Ambiental do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (USP-SP). Amostras de água residuária foram inoculadas em microcosmo contendo meio T&K e valor de pH 1.4. Os frascos foram purgados com gás nitrogênio (N2) e mantido por 60 dias até a extração de RNA. Uma segunda amostra fornecida era composta de água residuária coagulado com cloreto férrico (FeCl3) e suplementado com glicogênio (0.277 mmol). Esta amostra foi mantida por 20 dias até a extração de RNA. Em ambas das amostras a extração foi realizada logo após o tempo de incubação

4.1.6 Amostras de biofilme marinho

As amostras de biofilme marinho foram fornecidas pelo Centro de Biologia Marinha da USP – CEBIMAR, localizado no litoral norte de São Paulo (São Sebastião - SP). As amostras de biofilmes provenientes do sistema piloto de pre-tratamento com filtros rápido (amostra 1 e 3) e lento (amostra 2 e 4) de areia foram coletados de células de fluxo montadas com membranas de osmose reversa e instalados nas saídas dos filtros. Os filtros lentos foram operados a uma taxa de vazão de filtração de 100 l/m2/h. As amostras foram armazenadas em gelo seco durante o transporte até o momento da extração de RNA.

4.2 Métodos de Extração

Métodos de extração de RNA baseados em diferentes procedimentos de lise celular incluindo um método por lise química (RIO et al., 2010, adaptado), um de lise baseado em choque térmico (ORSINI; ROMANO-SPICA, 2001), um de lise física (ALMEIDA et al., 2009) e dois envolvendo a lise química e enzimática (JIN et al., 2010 e CHOMCZYNSKI; SACCHI, 1987, adaptado por ALMEIDA, 2010) foram avaliados em duplicata seguindo os protocolos descritos pelos autores. Também foram testados dois protocolos modificados neste trabalho (Tabela 2; Anexo 1). O método de extração descrito por Nikolausz (2004) foi utilizado para efeitos comparativos com os resultados obtidos pelo protocolo G (seção 5.1.2). Os testes foram realizados em duplicatas e 47

seguindo os protocolos descritos pelos autores, a quantificação e análise em gel de eletroforese foram realizadas seguindo um único protocolo padrão para todos os métodos.

ção. * Adaptado Adaptado * ção.

Etapas de extração de RNA descritas pelos autores dos protocolos, mostrados em três subdivisões: lise, purificação e recupera e lise, purificação subdivisões: três em mostrados protocolos, dos autores pelos descritas RNA de extração de Etapas

2 outrabalho modificado neste Tabela 49

4.2.1 Protocolo A

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g e 4°C por 5 minutos. Uma alíquota de 200mg do depósito foi extraída com uma solução contendo 30 µL de DEPC, 797 µL de espermidina (5 mM de espermidina em 20mM de Bis-Tris propano a pH 6,9) e 206 µL de solução EDTA (0.5 M a pH 8). Esta mistura foi homogeneizada com a ponteira até a dissolução total do precipitado. A espermidina liga-se ao DNA permitindo sua precipitação, o DEPC inibe a ação das RNAses e o EDTA age como um quelante para os íons metálicos presentes na amostra formando complexos estáveis e deixando-os indisponíveis para as RNAses, uma vez que funcionam como um cofator destas enzimas. O homogeneizado foi transferido para tubos de polipropileno com rosca, compatíveis com equipamento de bead beater (Savant FP120 - Thermo Fischer Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), contendo 0,5 gramas de esferas de vidro com 0,2 mm de diâmetro tratadas com DEPC 0,1%, para a lise bacteriana pela técnica de “Bead beater”. A amostra foi lisada no equipamento de “Bead beater” por três ciclos de 45 segundos na potência 4,5 (equivalente a uma rotação de 4500 rpm). A lise ocorre pelo forte atrito entre as esferas de vidro e as células. Imediatamente após a lise, o tubo foi resfriado no gelo por 1 minuto. A amostra foi concentrada por centrifugação a 10000 g e 4°C por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubos de polipropileno de 2 mL e adicionado 1 mL de solução de cobalto de hexamina (50 mM). Os tubos foram agitados no vortex por 1 minuto na potência máxima. O cobalto de hexamina forma um complexo com RNA, possibilitando sua precipitação por centrifugação a 15000 g em 4°C por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado resuspendido em 600 µL de solução contendo 300 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 20 mM de Bis-Tris propano e 6 M de ureia para a retirada do cobalto de hexamina. A solução foi mantida no gelo por 5 minutos. Foi adicionado 1,2 mL de etanol gelado e centrifugado à 16000 g por 15 minutos 4°C. Os tubos foram emborcados em lenço de papel por aproximadamente 2 minutos para evaporação do etanol remanescente. Após esta etapa o RNA foi ressuspendido em 40 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). O Tris da solução TE proporciona um tamponamento do pH e o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) é o agente quelante de cátions como o Mg2+, esta solução tem por finalidade manter a integridade do RNA.

4.2.2 Protocolo B

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g em 4°C por 5 minutos e uma alíquota de 200mg do precipitado foi utilizada para extração com 200 µL de solução de lisozima (9 mg/mL de lisozima em 10 mM de EDTA). A solução foi homogeneizada em vortex e centrifugada novamente a 6800 g, 4 °C por 5 minutos. O depósito foi resuspendido com 4 mL de RNAzol (25 mL de fenol saturado, pH 4,5 a 5,0) e 23 mL da solução A (50 gramas de guanidina tiocinato, 49 mL de água DEPC, 2,7 mL de citrato de sódio 1 M, 10 mL de acetato de sódio a 2 M - pH 4,0; 1,85 mL de sarcosil 10% e 150 μL de β-mercaptoetanol). Os tubos foram vigorosamente agitados em vortex por 2 minutos e a amostra foi dividida em tubos de 2 mL, que foram aquecidos a 65 ºC por 10 minutos. Posteriormente adicionou-se 400 μL de clorofórmio a cada tubo e agitou-se vigorosamente. As amostras foram centrifugadas a 18000 g em 4°C por 5 minutos. e a fase aquosa (contendo o RNA) foi removida cuidadosamente para não perturbar a fase intermediária e a do fundo. Adicionou-se um volume de isopropanol igual ao do volume removido e os tubos foram invertidos manualmente por algumas vezes para a completa homogeneização. A mistura foi mantida sobre a bancada por cerca de 10 minutos e em seguida centrifugada a 18000 g, 4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado com o auxílio da pipeta. Adicionou-se ao precipitado 500 μL de álcool 70% para a retirada de sais. Homogeneizou-se suavemente e centrifugou-se a 18000 g, 4°C por 5 minutos. O tubo contendo o precipitado foi emborcado em lenço de papel por aproximadamente 3 minutos para secagem. O precipitado foi ressuspendido em água DEPC contendo 2% de formamida, tratado com DNAse Turbo (Thermo Fischer Scientific) e armazenado em freezer a -20 ºC.

4.2.3 Protocolo C

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g, 4°C, por 5 minutos. Uma alíquota de 200mg do depósito foi ressuspendida em 1 mL de solução TENP (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaCl 100 mM e 1% (w/v) de PVP - polivinilpirrolidona) e transferida para tubo contendo esferas de vidro previamente tratada com água DEPC. Após homogeneização em vortex por 5 minutos a solução foi centrifugada a 8000 g, 4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o depósito resuspendido em 1 mL de tampão fosfato salino 10 mM (137 mM NaCl, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 51

2 mM), homogeneizado em vortex por 5 minutos e centrifugado a 8000 g, 4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado. O precipitado tratado com 200 μL de solução de lisozima (20 mg/mL de lisozima em 10 mM de EDTA) foi incubado a 37 ºC por 10 minutos. Em seguida foi adicionado 1 mL de Trizol (TRI Reagente, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) e após agitação da solução em vortex por 5 minutos a amostra foi centrifugada a 10000 g, 4°C por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo com 200 μL de clorofórmio e a mistura foi agitada em vortex por 15 segundos antes de nova centrifugação a 10000 g, 4°C por 2 minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo ao qual foi adicionado o mesmo volume de isopropanol. Após manter a solução em temperatura ambiente por 20 minutos ela foi centrifugada a 16000 g, 4°C por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi ressuspendido em 500 μL de álcool 70% e centrifugado a 10000 g, 4°C por 5 minutos. O tubo contendo o precipitado foi emborcado em lenço de papel por aproximadamente 3 minutos para secagem e posteriormente ressuspendido em água DEPC contendo 2% de formamida e armazenado em freezer a -20 ºC.

4.2.4 Protocolo D

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g, 4°C por 5 minutos e 200mg do precipitado foi misturada com 1 mL de Trizol. A suspensão foi homogeneizada em vortex e mantida em temperatura ambiente por 5 minutos. 200 μL de clorofórmio foram adicionados e a solução homogeneizada em vortex por 15 segundos foi mantida em temperatura ambiente por 2 minutos seguido de centrifugação a 10000 g, 4 ºC por 10 minutos. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo, o qual foi homogeneizado em vortex após adição de 500 μL de isopropanol. Após manter a solução por 10 minutos em temperatura ambiente, o RNA foi precipitado por centrifugação a 10000 g, 4 ºC por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado resuspendido em 1 mL de etanol 75%. A solução foi novamente centrifugada a 16000 g, 4 ºC por 15 minutos e o sobrenadante descartado. O tubo contendo o RNA precipitado foi emborcado em lenço de papel para secagem por aproximadamente 3 minutos. O precipitado foi resuspendido em água DEPC contendo 2% formamida e armazenado em freezer a -20 ºC.

4.2.5 Protocolo E

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g, 4°C por 5 minutos e 200mg do precipitado foi resuspendido em 1 mL de tampão fosfato com solução salina (0,1M; pH 8). Alíquotas de 500 μL da suspensão foram transferidas para tubos de 1,5 mL e centrifugadas a 5700 g, 4 ºC por 1 minuto. Os depósitos foram resuspendidos em 1 mL de solução de lavagem (Tris HCl 50 mM a pH 7,7, EDTA 25 mM, SDS 0,1% e 0,1% (w/v)), centrifugados a 5700 g, 4 °C por 1 minuto. Os sedimentos foram resuspendidos em 35 μL de solução de lise (Tris HCl 50 mM a pH 8, EDTA 25 mM, SDS 3% e polivinilpirrolidona 1,2 % (w/v)) e aquecidos em forno de micro-ondas a 600-700 W por 45 segundos. Em seguida foi adicionada 400 μL de solução de extração (guanidina tiocinato 1M, citrato de sódio 7 mM a pH 7, β-mercaptoetanol 0,025 M, acetato de sódio 0,3 M e polivinilpirrolidona 1,2% (w/v)) e o conteúdo dos tubos foi homogeneizado por agitação em vortex por 30 segundos antes de adição de 400 μL de fenol ácido saturado (pH 4,5- 5,0). A solução foi centrifugada a 10000 g, 4°C por 3 minutos e a fase aquosa foi misturada com um volume igual de álcool isopropílico. Esta solução foi centrifugada a 10000 g, 4°C por 3 minutos e o depósito lavado com etanol 70% antes da ressuspensão em 30 μL de água DEPC contendo 2% de formamida. O extrato foi armazenado em freezer a -20 ºC.

4.2.6 Protocolo F

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g, 4°C por 5 minutos e 200mg do precipitado foi homogeneizado em 1 mL de Trizol e transferido para tubos de polipropileno com rosca, contendo 1,6 gramas de esferas de vidro com 0,2 mm de diâmetro tratadas com DEPC 0,1%, para a lise bacteriana pela técnica de “Bead beater” (5000rpm por 2 minutos). A amostra foi concentrada por centrifugação a 12000 g, 4°C por 10 minutos e o sobrenadante foi transferido para tubos de polipropileno de 2 mL mantidos em temperatura ambiente por 5 minutos para completa dissociação do complexo núcleo-proteico. Em seguida foi adicionado 600 μL de clorofórmio e após agitação vigorosa a amostra foi mantida em temperatura ambiente por 8 minutos. Esta solução foi então centrifugada a 12000 g, 4°C por 10 minutos. O sobrenadante com o RNA foi transferido para novo tubo de polipropileno de 2 mL, misturado com 1.5 mL de isopropanol e mantido em temperatura ambiente por 10 minutos. O RNA foi 53

concentrado por centrifugação a 12000 g, 4°C por 15 minutos e o sobrenadante descartado. O precipitado foi resuspendido em 1.5 mL de etanol 75% e a solução centrifugada a 7500 g, 4 ºC por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o tubo contendo o RNA precipitado foi emborcado em lenço de papel para secagem por aproximadamente 3 minutos. O RNA foi resuspendido em 30 μL de água ultrapura e armazenado em freezer a -20 ºC.

4.2.7 Protocolo G

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g, 4°C por 5 minutos e 200mg do precipitado foi adicionado 30 µL de DEPC, 797 µL de solução contendo espermidina (5 mM de espermidina em 20 mM de Bis-Tris propano em pH 6,9) e 206 µL de solução EDTA (500 mM). Esta mistura foi homogeneizada com a ponteira até a dissolução total do precipitado. O homogeneizado foi transferido para tubos de polipropileno com rosca, compatíveis com equipamento de Fast Prep (Savant FP120 - Thermo Fischer Scientific), contendo 0,5 gramas de esferas de vidro com 0,2 mm de diâmetro tratadas com DEPC 0,1%, para a lise bacteriana pela técnica de “Bead beater”. A amostra foi lisada no equipamento de “Bead beater” por três ciclos de 45 segundos na potência 4,5 (equivalente a uma rotação de 4500 rpm). Imediatamente após a lise o tubo foi resfriado no gelo por 1 minuto. A amostra foi concentrada por centrifugação (10000 g, 4°C, 10 minutos). O sobrenadante foi coletado e dividido em porções iguais para tubos de polipropileno de 2 mL. Foram adicionados 1 mL de Trizol (TRI Reagente, Invitrogen Life Technologies). Os tubos foram agitados em vortex vigorosamente por 2 minutos e aquecidos a 65 ºC por 10 minutos. Posteriormente adicionou-se 400 μL de clorofórmio a cada tubo e agitou-se vigorosamente. As amostras foram centrifugadas (18000 g, 4°C, 5 minutos). Em seguida, a fase aquosa (contendo o RNA) foi retirada cuidadosamente para preservar a fase intermediária e a do fundo. Adicionou-se o mesmo volume de isopropanol e os tubos foram invertidos manualmente por algumas vezes para a completa homogeneização. A mistura foi mantida sobre a bancada por cerca de 10 minutos. Após esse período a amostra foi centrifugada (18000 g, 4°C, 5 minutos). O sobrenadante foi descartado com o auxílio da pipeta. Adicionou-se ao precipitado 500 μL de álcool 70% para a retirada de sais. Homogeneizou-se suavemente e centrifugou-se a 18000 g, 4°C por 5 minutos. O tubo contendo o precipitado foi emborcado em lenço de papel por aproximadamente 3 54

minutos para secagem. O precipitado foi ressuspendido em água ultrapura e armazenado em freezer a -20 ºC.

4.2.8 Protocolo H

O lodo ativado foi centrifugado a 16000 g, 4°C por 5 minutos e 200mg do precipitado foi homogeneizada em 200 µL de solução de lisozima (9 mg/mL de lisozima em 10 mM de EDTA), seguido de centrifugação (6800 g, 4 °C, 5 minutos). O precipitado foi homogeneizado em 1 mL de solução de Cobalto de hexamina a 50 mM. Os tubos foram agitados no vórtex por 1 minuto na potência máxima. O cobalto de hexamina forma um complexo com RNA, possibilitando sua precipitação (MURPHY et al., 2001). As amostras foram centrifugadas à 15000 g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao precipitado 600 µL de solução contendo 300 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 20 mM de Bis-Tris propano e 6 M de ureia para a retirada do cobalto de hexamina. Os tubos foram incubados no gelo por 5 minutos. O precipitado foi ressuspendido com a adição de 1,2 mL de etanol gelado e centrifugado à 16000 g por 15 minutos a 4°C. Os tubos foram emborcados em lenço de papel por aproximadamente 2 minutos para evaporação dos resíduos alcoólicos. O precipitado foi por fim ressuspendido em 40 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). O Tris da solução TE proporciona um tamponamento do pH e o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) é o agente quelante de cátions como o Mg2+, esta solução tem por finalidade proteger o RNA de degradação.

4.3 Avaliação da ressuspensão de RNA em diferentes soluções

Almeida (2009) avaliou a eficiência da ressuspensão do precipitado de RNA em soluções de água DEPC contendo 2% de formamida, no qual, a ressuspensão apresentou menor degradação de RNA. Sabe-se que alguns aditivos orgânicos melhoram o rendimento e a especificidade na PCR, como por exemplo: o DMSO, a Betaína (N,N,N-trimetilglicina) e a formamida (SARKAR, 1990; CHESTER, 1993). Em contrapartida o EDTA presente no TE pode inibir a reação de PCR devido sua capacidade de quelar íons Mg2+, necessário para a atividade da enzima DNA polimerase. Entretanto esse viés pode ser contornado adicionando uma concentração 55

maior de Mg2+, mantendo a atividade da polimerase na presença de agentes quelantes (ROSSEN, 1992; AL-SOUD, 2001). Os métodos de extração testados nesse trabalho empregam diferentes soluções para a ressuspensão do RNA como: água DEPC contendo 2% de formamida (Protocolo B, C, D e E); água destilada (Protocolo F); e TE (Protocolo A). Isso nos levou a averiguar qual solução tem maior eficiência para as etapas posteriores de RT e PCR.

4.4 Montagem de consórcios artificiais utilizando misturas de extratos de RNA

O RNA total obtido após a extração foi quantificado no equipamento Nanodrop® ND-1000™ (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). O RNA das culturas puras de B. subtilis, S. aureus e P. aeruginosa foi misturado nas proporções de 1:1:1, 8:4:1 e 1:8:1 (5.000:5.000:5.000 ng, 40.000:20.000:5.000 ng e 5.000:40.000:5.000 ng, respectivamente). Um segundo consórcio, foi misturado o RNA das culturas puras de B. subtilis, K. pneumoniae e B. cepacia nas proporções de 1:1:1, 1:4:8 e 1:8:1 (5.000:5.000:5.000 ng, 5.000:20.000:40.000 ng e 5.000:40.000:5.000 ng, respectivamente). E para um terceiro consórcio, foi misturado o RNA das culturas puras de B. cepacia, S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa e K. pneumoniae nas proporções 1:1:1:1:1, 1:8:1:8:1, 8:1:8:1:8 e 8:4:1:1:8 (5.000:5.000:5.000:5.000:5.000 ng, 5.000:40.000:5.000:40.000:5.000 ng, 40.000:5.000:40.000:5.000:40.000 ng e 40.000:20.000:5.000:5.000:40.000 ng, respectivamente; Tabela 3).

Tabela 3 - Consórcios montados com extratos de rRNA em diferentes proporções.

Bacillus Staphylococcus Pseudomonas Klebsiella Burkholderia Consórcios subtilis aureus aeruginosa pneumoniae cepacia 1:1:1 33% 33% 33% - - 8:4:1 62% 30% 8% - - 1:8:1 10% 80% 10% - - 1:1:1 33% - - 33% 33% 1:4:8 8% - - 30% 62% 1:8:1 10% - - 80% 10% 1:1:1:1:1 20% 20% 20% 20% 20% 1:8:1:8:1 6% 42% 6% 42% 6% 8:1:8:1:8 30% 5% 30% 5% 30% 8:4:1:1:8 35% 16% 7% 7% 35%

4.5 Tratamento com DNAse

Todos os extratos de RNA foram tratados com Turbo DNA-free™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) de acordo com instruções sugeridas pelo fabricante para a eliminação de qualquer resquício de DNA que porventura possa ter sido co-extraídos. As quantificações do produto de extração de rRNA e de síntese de cDNA foram realizadas por espectrofotometria, por meio do equipamento Nanodrop ND-1000 (Thermo Fischer Scientific).

4.6 Purificação do RNA

Todos os extratos de RNA foram purificados com o kit RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções sugeridas pelo fabricante.

4.7 RT-PCR

As reações de transcrição reversa foram realizadas com alíquotas de 2 μg de RNA e processadas de acordo com as instruções sugeridas pelos fabricantes da 57

enzima SuperScriptIII (Invitrogen Life Technologies) com o iniciador “universal” 1401 R (5’- CGG TGT GTA CAA GGC CCG GGA ACG – 3’, HEUER et al., 1997). Para a análise por clonagem, foram utilizados os iniciadores “universais” para 16S rDNA 27 F (5´- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG – 3´, LANE, 1991) e 1401 R (HEUER et al., 1997). E para o sequenciamento de nova geração, foram utilizados três iniciadores forward e um reverse modificados (338F1 - 5’ CCT ACG GGR GGC AGC AG 3’, 338F2 - 5’ACW YCT ACG GRW GGC TGC 3’, 338F3 - 5’ CAC CTA CGG GTG GCA GC 3’, 909R - 5’ CCG TCA ATT YHT TTR AGT 3’; PINTO e RASKIN, 2012) em reações independentes. As reações de PCR executadas segundo Kotewicz (1985) continham: 2 μL do produto da reação de transcrição reversa, 2,5 μl de Pfu Buffer PCR

10X (Invitrogen Life Technologies), 2 µL de MgCl2 (50 mM – Invitrogen Life Technologies), 1,25 μl de dNTPs (10 mM de cada – Invitrogen Life Technologies), 2 U de Taq DNA Polimerase Platinum (Invitrogen Life Technologies) ou Taq DNA Polimerase (Sinapse Inc., São Paulo, SP, Brasil), 0,25 μl de cada iniciador (10 μM – IDT - Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, EUA) e água ultra pura (Invitrogen Life Technologies) até o volume final de 25 µL. A reação de amplificação foi realizada no termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf AG, Hamburg, Alemanha). Foram utilizadas duas condições de amplificação: (1) desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos, desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 55/62,5 ºC (338F-909R/27F-1401R) por 20 e 60 segundos respectivamente, extensão a 72 ºC por 30 e 100 segundos (338F-909R/27F-1401R, respectivamente), durante 2, 10 ou 30 ciclos; (2) desnaturação inicial a 94 ºC por 5 minutos seguido de 2, 10 ou 30 ciclos a 94 ºC por 20 segundos, com 4 sub-ciclagens de 60 ºC por 60 segundos e 65 ºC por 100 segundos, extensão final a 65 ºC por 5 minutos (GUIDO et al., 2016; LIU; SOMMER, 1998). Todas as reações foram conduzidas utilizando a rampa de temperatura de 1 ºC/s. A diminuição da rampa de temperatura na amplificação para 1 ºC/s reduz consideravelmente a formação de quimeras e diminui os efeitos negativos na amplificação causados pelo alto teor de G+C dos moldes de DNA (KEBSCHULL; ZADOR, 2015; STEVENS et al., 2013). O cDNA sintetizado foi analisado por corrida de eletroforese em gel de agarose 1% (Invitrogen Life Technologies). As amostras de cDNA amplificadas foram purificadas com o kit GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK). A quantificação do DNA concentrado foi realizada no Nanodrop® ND-1000 Thermo 58

Fischer Scientific). As reações de PCR que utilizaram três iniciadores forward foram misturadas em um único tubo.

4.7.1 Otimização na PCR

A eficácia na amplificação por PCR é um pré-requisito crucial para análises subsequentes tal como a clonagem ou sequenciamento (STRIEN, 2013). Erros em análises de RNA são frequentemente citados devido à interferência das regiões ricas em G+C, essas estruturas geram uma visão distorcida da abundância de cada fragmento quando amplificado por técnica de PCR, fazendo com que os fragmentos com altas concentrações de regiões G+C apresentem uma menor taxa de amplificação. Esse viés pode gerar erros de análise na caracterização da população microbiana ambiental. Sequências contendo altas repetições de G+C produzem dobramentos inter e intracadeias em decorrência do aumento das ligações de hidrogênio com guaninas vizinhas, esses truncamentos causam o término prematuro da amplificação pela enzima polimerase. O uso de diferentes aditivos como a betaína (N,N,N- trimetilglicina), DMSO, formamida, glicerina, glicerol, DTT, BSA, não somente previnem a formação de estruturas secundárias como também aumentam a taxa de anelamento dos iniciadores em temperaturas mais baixas (JENSEN, 2010; SARKAR,1990; SEIFI et al., 2012; STRIEN, 2013). A combinação de dois ou três desses aditivos podem sinergicamente aumentar a amplificação de sequências com alto teor de G+C (GUIDO et al., 2016). A adição de alguns aditivos na reação de PCR altera a temperatura de anelamento (Tm) dos iniciadores, diminuindo entre 2 - 3 ºC nas reações contendo betaína e aproximadamente 0.6 ºC/1% de DMSO adicionado (LAJIN, 2013; SIMONOVIC, 2012; VASUDEVAMURTHY, et al., 2008). Após a extração de RNA, purificação e RT das amostras, foram testadas as adições de DMSO (dimetilsulfóxido), Betaína (N,N,N-trimetilglicina), BSA (albumina de soro bovino) e formamida em diferentes concentrações e combinações. Assim como em diferentes temperaturas de anelamento (Tm) durante a PCR. Após a purificação e reação de RT, foram feitas reações de PCR seguindo condições que apresentaram melhor resultados descritos nos seguintes trabalhos (Tabela 4).

Tabela 4 - Variações aplicadas nas reações de PCR.

PCR Enzima Referência Aditivo/Concentração MgCl2 Combinação Buffer polimerase

Betaína 0.5M + DMSO 5% Buffer a Seifi et al. * Betaína 0.75M + DMSO 7.5% AMS b (2012) - Buffer Pfu 4 mM c Farell; BSA 6 ug/μL + DMSO 10% * * d Taq DNA Alexandre BSA 6 ug/μL + Formamida * * Platinum e (2012) 5% (Life Jensen et al. DMSO 7.5% * * Technologies) f (2010) Betaína 2M * * g e Lajin et al. Betaína 1M * * h (2013) * Condição padrão descrito no protocolo da enzima polimerase. - Não aplicado.

4.8 Purificação

Todas as amostras de cDNA amplificadas foram purificadas com o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA) de acordo com instruções sugeridas pelo fabricante.

4.9 Quantificação de ácido nucleico por análise no espectrofotômetro DeNovix DS- 11

Foi utilizado o equipamento DeNovix DS-11 para quantificação dos ácidos nucleicos devido a capacidade de distinguir DNA de fita simples (ssDNA), DNA de fita dupla (dsDNA) e RNA, através da aplicação de fatores no comprimento de onda padrão de 33 ng-cm/μL, 50 ng-cm/μL e 40 ng-cm/μL, respectivamente. Para análise mais específica da síntese da 1º fita de cDNA, as amostras foram tratadas com RNAse A logo após a RT para quantificação de ssDNA. Reações sem amostras foram utilizadas como branco. Para alcançar o limite mínimo de detecção no equipamento 60

DeNovix DS-11 (DeNovix, Wilmington, Delaware, EUA) na avaliação da síntese da 1º fita de cDNA, foi realizada a amplificação com 2 ciclos de PCR. E o resultado foi corrigido matematicamente através da divisão da concentração obtida pelo número de ciclos utilizados.

4.10 Clonagem e ARDRA

O vetor de clonagem utilizado foi o p-Gem® Easy-T Vector Systems (Promega). Foram utilizadas as células competentes de Escherichia coli - JM 109 (Promega). Os iniciadores utilizados na reação de amplificação foram o M13 F (5`- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3´) e o M13 R (5´- TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’). Estes iniciadores reconhecem parte da sequência terminal do plasmídeo, possibilitando a amplificação do inserto. As reações de PCR foram efetuadas com os seguintes componentes: 2,5 μL de tampão de PCR (10X – Invitrogen Life Technologies), 0,85 μL de MgCl2 (50 mM - Invitrogen Life Technologies), 0,63 μL dNTPs (10 mM de cada base- Invitrogen Life Technologies), 1 U de Taq Polimerase (Invitrogen Life Technologies) e 0,38 μL de cada iniciador (20 μM), completando com água ultrapura esterilizada (Invitrogen Life Technologies) para um volume final de 25 μL. As condições de amplificação empregadas foram: desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 60 °C por 30 segundos, extensão a 72 ºC por 1 minuto durante 40 ciclos e extensão final de 5 minutos a 72 ºC. A amplificação do inserto clonado foi analisada em gel de agarose 1% (Invitrogen Life Technologies). Pela técnica de ARDRA foram estabelecidos perfis de restrição com cinco enzimas de restrição: a Hae III (GG/CC – CC/GG - Promega), Hha I (GCG/C – C/GCG - Promega), Rsa I (GT/AC – CA/TG -Biolabs - New England, Massachusetts, EUA), Msp I (C/CGG – GGC/C Biolabs) e Bhs1236I (CG/CG - Fermentas, Mariland, USA). No gel de agarose utilizou-se o marcador molecular de 50 pares de bases- DNA Ladder (Fermentas). As digestões foram realizadas utilizando as enzimas em conjunto “double digest” com MspI/HaeIII e RsaI/HhaI. A enzima Bsh1236I foi utilizada em “single digest”.

4.11 Identificação de perfil de restrição pelo equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent, Califórnia, EUA)

Para a identificação de fragmentos gerados por ARDRA e para comparação com os resultados obtidos por corrida eletroforética, as bibliotecas de clones de lodo ativado foram analisadas por equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent). A eletroforese capilar é baseada em princípios de eletroforese e citometria de fluxo e possui alta sensibilidade na detecção de fragmentos de DNA, eliminando erros na interpretação de leitura de géis de agarose. Para análise de fragmentos de DNA gerados na digestão com enzimas em conjunto (seção 4.10) foi utilizado o Kit DNA 1000, que possui a capacidade de detectar fragmentos de 25 a 1000 pb e resolução de tamanho detectável de aproximadamente 5 pb.

4.12 Sequenciamento

Clones selecionados foram submetidos à sequenciamento após a etapa de ARDRA. O sequenciamento foi realizado pelo Centro de Estudos do Genoma Humano (CEGH-IB-USP) e os resultados foram analisados através de consulta no banco de dados online NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e RDP (http://rdp.cme.msu.edu).

4.13 Caracterização de Riqueza e Bioestatística

Comunidades contendo diferentes espécies não estão intrinsecamente organizadas de forma linear na escala da diversidade taxonômica (HURLBERT, 1971). O grau de cobertura da diversidade de espécies da amostra foi avaliado pela análise de rarefação, no qual o incremento da diversidade de espécies na amostra é avaliado à luz do empenho amostral (número de indivíduos ou sequências amostradas). A riqueza de espécies refere-se ao número de espécies presente em uma determinada área (densidade de espécies) ou amostra (riqueza de espécies), sem considerar o número de indivíduos examinados (SANJIT; BHATT, 2005). Hurlbert (1971) propôs a seguinte equação:

Onde, (E(Sn)) é o número de espécie esperado para um determinado número de indivíduos selecionados aleatoriamente; (n) é o número de indivíduos selecionados em uma amostra contendo (N) indivíduos amostrados; (S) é a espécie e (Ni) é o número de indivíduos da mesma espécie. O software EstimateS (Estimativa Estatística de Riqueza de Espécies e Espécies Compartilhadas de Amostras) foi usado como uma segunda ferramenta de análise, que determina estimadores de riqueza de espécies não paramétricas e assintóticas para dados baseados em abundância (Chao 1 e ACE) e para dados baseados em incidência. A avaliação estatística foi realizada utilizando a ferramenta de variância ANOVA de fator único, no qual testa a hipótese de que as médias de duas ou mais populações são iguais. Também foi utilizado a ferramenta T-test para avaliação da a igualdade de cada par dentre os membros dos consórcios.

4.14 Identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em amostras ambientais por sequenciamento de nova geração

Devido a atual limitação da tecnologia em não ser capaz de sequenciar fragmentos de 1500 pb (seção 1.5.3), foi utilizado fragmentos menores “regiões hipervariáveis" capazes de distinguir filogeneticamente as espécies bacterianas. Além desta limitação, foi focado nas regiões hipervariáveis do RNA 16S com o intuito de aumentar a capacidade de leitura e diminuir o processamento por bioinformática. Assim, excluímos a necessidade da remontagem dos fragmentos das sequencias de DNA maiores do que o suportado pelo equipamento. E o fator de eliminar a remontagem acaba sendo importante em estudos com comunidades microbianas complexas, pois nesse tipo de amostra, pode existir bactérias ainda desconhecidas ou com semelhança genética. É bem documentado que as análises realizadas pela 63

plataforma Ion Torrent possuem altas taxas de erros de sequenciamento em comparação aos dados obtidos pela plataforma Illumina. Esse viés pode estar relacionado com as leituras de sequências prematuras, provavelmente ocasionado pela limitação do equipamento em não realizar sequenciamentos “paired-end”, gerando uma visão distorcida da população bacteriana estudada, sub-representando ou super-representando uma determinada espécie (LAM et al., 2012; LOMAN et al., 2012; SALIPANTE et al., 2014). Muitos estudos utilizam as regiões hipervariáveis presentes no 16S para identificação em ecologia microbiana (BARTRAM et al., 2011; JEON et al., 2015; KOZICH et al., 2013; UNNO, 2015; WHITELEY et al., 2012). Entretanto, classificação filogenética por 16S têm mostrado resultados conflitantes ao levar em consideração a variação de tamanho de leitura, região de escolha e profundidade de amostragem (MIZRAHI-MAN et al., 2013). Embora o impasse mencionado acima permaneça sem solução, a análise de comunidade microbiana utilizando a plataforma MiSeq da Illumina (San Diego, Califórnia, USA) tem começado a chamar a atenção devido ao comprimento de leitura, relação custo-benefício e alta multiplicidade, não alcançado por outras plataformas até o momento (JEON et al., 2015; UNNO, 2015). Atualmente o MiSeq da Illumina é capaz de produzir leituras de 2 x 300 pb (paired-end reads) com o kit MiSeq Reagent v3, o que possibilita o sequenciamento de regiões hipervariáveis concatenadas.

4.14.1 Região V3-V5 como alvo para análise de comunidades microbianas complexas

Para a escolha da região hipervariável, dois aspectos foram levados em consideração: a região hipervariável que possui a maior capacidade de discernimento entre as espécies bacterianas; e o tamanho do fragmento analisado compatível com o limite de leitura pelo sequenciador (600 pb). Não há uma única combinação de iniciadores (forward/reverse) ideal para várias amostras ambientais, entretanto, o uso em conjunto de iniciadores melhora a informação taxonômica esperada (SOERGEL et al., 2012). Foram utilizados três iniciadores forward e um reverse modificados (338F1 - 5’ CCT ACG GGR GGC AGC AG 3’, 338F2 - 5’ACW YCT ACG GRW GGC TGC 3’, 338F3 - 5’ CAC CTA CGG GTG GCA GC 3’, 909R - 5’ CCG TCA ATT YHT TTR AGT 3’; PINTO e RASKIN, 2012). O uso dos iniciadores redesenhados para a 64

região V3-V5, apesar de gerar mais artefatos de sequenciamento, resultou em melhora na detecção da diversidade bacteriana e redução da variabilidade entre réplicas de bibliotecas. Essa região foi escolhida por possuir alta correlação filogenética em correlação ao gene rRNA 16S, pelos bons resultados de classificação bacteriana (HERLEMANN et al., 2011; PINTO e RASKIN, 2012; SCHLOSS, 2010; YOUSSEF et al., 2009). E por possuir tamanho de sequenciamento compatível com o kit MiSeq Reagent v3, que possibilita a leitura da região amplificada V3-V5 (571 pb) com sobreposição das duas leituras de 29 pb para cada fragmento (Figura 2).

Figura 2 - Esquema da leitura paired-ends usando a plataforma MiSeq para a região hipervariável V3-V5.

4.14.2 Preparo das amostras para sequenciamento por MiSeq

As amostras para sequenciamento foram preparadas utilizando o kit TrueSeq RNA Sample Preparation v2 (Illumina). Esse kit foi escolhido devido a possibilidade de preparo de amostras contendo extratos de mRNA e de produtos de PCR. Como os produtos utilizados nesta etapa foram os amplicons, foi iniciado do ponto do protocolo do kit TrueSeq onde as extremidades dos fragmentos foram preparadas para a adenilação que posteriormente serviu de base para a ligação dos adaptadores, necessários para anelar no chip de sequenciamento. Com o intuito de reduzir o custo dos consumíveis utilizados, a solução AMPure XP beads (Beckman Coulter Genomics – Denver, Massachusetts, USA) foi substituída 65

por uma solução de limpeza que utiliza beads magnéticas preparadas em laboratório seguindo o protocolo descrito por Faircloth e Glenn (2014). O TE foi previamente preparado utilizando (10 mM Tris-HCl = 500 µL de solução Tris 1M pH 8; 1 mM EDTA = 100 µL de solução EDTA 0.5M; e o volume de 50 mL foi completado com água ultrapura). As beads magnéticas (Sera-Mag Mag Carboxil Modif., Sigma-Aldrich, Missouri, USA) foram agitadas e transferido 1 mL para um tubo de 1.5 mL. O tubo foi colocado na estante magnética e o sobrenadante foi removido como auxílio da pipeta. Foi transferido 1 mL de TE para o tubo contendo as beads magnéticas e homogeneizadas, posteriormente o tubo foi recolocado na estante magnética. O sobrenadante foi removido e esta etapa de lavagem com TE foi repetida 1 vez. Foi adicionado 1 mL de TE e o tubo contendo as beads magnéticas foi retirado da estante magnética. Em um novo tubo, foram adicionados: 9g de PEG-8000; 10 mL solução NaCl 5M (ou 2.92g); 500 µL 1M Tris-HCl; 100 µL de solução EDTA 0.5M; e o volume de 50 mL foi completado com água ultrapura e posteriormente homogeneizada. Após a dissolução total do PEG-800, foi adicionado à esta solução 27.5 µL de Tween 20 (Sigma-Aldrich) e todo o volume das beads magnéticas previamente tratadas. A solução contendo as beads foi homogeneizada, o tubo foi coberto com papel alumínio e armazenado à 4°C. O preparo das amostras foi iniciado a partir da etapa “Perform End Repair” do capítulo 2 (Low Sample Protocol). Esta etapa converte as extremidades dos amplicons de coesivas para cegas dos fragmentos contidos nas amostras. Foi adicionado em cada amostra 10 µL de Buffer de Ressuspensão e 40 µL de End Repair Mix. A amostra foi homogeneizada com o auxílio de pipeta e incubada em termociclador por 30 minutos à 30°C. O tubo contendo as beads magnéticas foi homogeneizada e uma alíquota de 160 µL foi transferido para a amostra e homogeneizada com o auxílio da pipeta. A amostra foi incubada por 15 minutos em temperatura ambiente e posteriormente o tubo foi colocado na estante magnética por 5 minutos. Um volume de 255 µL do sobrenadante foi descartado com o auxílio da pipeta. Com o tubo ainda na estante magnética, foi adicionado 200 µL de etanol 80% e incubado em temperatura ambiente por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado e esta etapa de lavagem com etanol foi repetida 1 vez. O tubo foi incubado em temperatura ambiente por 15 minutos para secagem total do etanol e então retirado da estante magnética. Foi adicionado 17,5 µL de Resuspension Buffer e homogeneizada com o auxílio da pipeta. O tubo foi incubado em temperatura ambiente por 2 minutos. O tubo 66

foi colocado na estante magnética em temperatura ambiente por 5 minutos, 15 µL do sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Após este ponto a amostra pode ficar armazenada em -25°C por até 7 dias. A etapa “Adenylate 3’ Ends” consiste na adição de um nucleotídeo adenina na extremidade 3’ dos fragmentos com corte cego para a posterior ligação dos adaptadores. Foi adicionado a amostra 2.5 µL de Resuspension Buffer e 12.5 µL de A-Tailing Mix. A amostra foi homogeneizada com o auxílio da pipeta e executado o programa ATAIL70 no termociclador (37°C por 30 minutos; 70°C por 5 minutos), após o término do programa foi prosseguido imediatamente para a próxima etapa do protocolo. A ligação dos adaptadores permite que o fragmento possa hibridizar no chip de sequenciamento. Foi adicionado a amostra 2.5 µL de Resuspension Buffer e 2.5 µL de Ligation Mix. Para cada amostra foi adicionado 2.5 µL de RNA Adapter Index. Para cada amostra foi utilizado um RNA Adapter Index diferente, permitindo a distinção de cada amostra após o sequenciamento. O tubo contendo a amostra foi incubada à 30°C por 10 minutos e posteriormente foi adicionado 5 µL de Stop Ligation Buffer, amostra foi homogeneizada com o auxílio da pipeta. Foi adicionado 42 µL de beads magnéticas previamente homogeneizadas. A amostra foi homogeneizada com o auxílio da pipeta e incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. O tubo foi colocado na estante magnética e mantido em temperatura ambiente por 5 minutos. Foi descartado 79.5 µL do sobrenadante e com o tubo ainda na estante magnética, foi adicionado 200 µL de etanol 80% e incubado em temperatura ambiente por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado e esta etapa de lavagem com etanol foi repetida 1 vez. A amostra foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos para secagem total do etanol e então retirado da estante magnética. Foi adicionado 52.5 µL de Resuspension Buffer e homogeneizada com o auxílio da pipeta. A amostra foi incubada a temperatura ambiente por 2 minutos e posteriormente colocada na estante magnética por 5 minutos. Foi transferido 50 µL do sobrenadante para um novo tubo e adicionado 50 µL de beads magnéticas. A amostra foi homogeneizada com o auxílio da pipeta e incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. O tubo foi colocado na estante magnética e mantido em temperatura ambiente por 5 minutos. Foi descartado 95 µL do sobrenadante e com o tubo ainda na estante magnética, foi adicionado 200 µL de etanol 80% e incubado em temperatura ambiente por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado e esta etapa de lavagem com etanol foi repetida 1 vez. A amostra foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos para 67

secagem total do etanol e então retirado da estante magnética. Foi adicionado 22.5 µL de Resuspension Buffer e homogeneizada com o auxílio da pipeta. A amostra foi incubada por 2 minutos e posteriormente colocado na estante magnética e mantido em temperatura ambiente por 5 minutos. Foi transferido 20 µL do sobrenadante para um novo tubo. Após este ponto a amostra pode ficar armazenada em -25°C por até 7 dias. A etapa “Enrich DNA Fragments” consiste na amplificação dos fragmentos de DNA que possuem o adaptador. Esta amplificação por PCR possui um número reduzido de ciclos, evitando distorções na representação da biblioteca. Foi adicionado a amostra 5 µL de PCR Primer Cocktail e 25 µL de PCR Master Mix. A amostra foi homogeneizada com o auxílio da pipeta e executado o programa PCR no termociclador (98°C por 30 segundos; 15 ciclos de 98°C por 10 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos; e 72°C por 5 minutos). Foi adicionado a amostra, 50 µL de beads magnéticas e homogeneizada com o auxílio da pipeta e incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. O tubo foi colocado na estante magnética e mantido em temperatura ambiente por 5 minutos. Foi descartado 95 µL do sobrenadante e com o tubo ainda na estante magnética, foi adicionado 200 µL de etanol 80% e incubado em temperatura ambiente por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado e esta etapa de lavagem com etanol foi repetida 1 vez. A amostra foi incubada em temperatura ambiente por 15 minutos para secagem total do etanol e então retirado da estante magnética. Foi adicionado 32.5 µL de Resuspension Buffer e homogeneizada com o auxílio da pipeta. A amostra foi incubada por 2 minutos e posteriormente colocado na estante magnética e mantido em temperatura ambiente por 5 minutos. Foi transferido 30 µL do sobrenadante para um novo tubo. Após este ponto a amostra pode ficar armazenada em -25°C por até 7 dias. Após o preparo das amostras, uma alíquota de 4 µL foi separada para checagem da qualidade dos fragmentos através do equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent) e para quantificação através do equipamento Qubit (Thermo Fischer Scientific). Após a realização da etapa de normalização das amostras em 10 nM utilizando solução Tris-HCl 10 mM pH 8.5. Para montagem da biblioteca, foi transferido 10 µL de cada amostra para um novo tubo e diluído para a concentração de 4 mM. Foi utilizado a concentração 10% do controle phiX, este percentual apresentou os melhores resultados de sequenciamento por MiSeq para bibliotecas artificiais (JEON et al., 2014). 68

4.14.3 Processamento por bioinformática e banco de dados

Foi implementado um pré-tratamento manual utilizando a ferramenta QIIME. Os arquivos foward.fasta e reverse.fasta gerados pelo sequenciamento no MiSeq foram unidos em um único arquivo. Foram testados diferentes valores de similaridade para a região de sobreposição (Figura 2), sendo que o valor de 50% permitiu o pareamento entre as duas sequências sem perda amostral significativa.

• join_paired_ends.py -p 50 -f -r -o

Foi utilizado o software NextGen para filtrar as sequências com tamanho mínimo de 585pb, essa etapa foi aplicada com o intuito de remover as sequências que não atingiram o tamanho da região V3-V5. O arquivo gerado foi então submetido aos comandos abaixo:

• convert_fastaqual_fastq.py -c fastq_to_fastaqual -f -o

• split_libraries.py -b 0 -p -m -f - q -o

Após essa etapa, foram construídas as OTUs utilizando diferentes banco de dados como referência de similaridade e taxonomia. Os bancos de dados utilizados foram o SILVA versão 123.1 (03/2016) e o Greengenes versão gg_13_5 (05/2013).

• pick_closed_reference_otus.py –i -r -o -t

Uma segunda etapa de filtragem foi adotada para excluir as OTUs que apresentam abundância muito baixa. Navas-Molinas (2013) e Bokulich (2013) recomendam descartar as OTUs com número de sequências menor que 0.005% do total de número de sequências.

• filter_otus_from_otu_table.py –i -o -- min_count_fraction 0.00005

Os valores obtidos no arquivo BIOM gerado foram observados através do comando abaixo:

• biom summarize-table -i

Para gerar os resultados de diversidade taxonômica e as curvas de rarefação para cada amostra analisada, foi executado o comando abaixo:

• core_diversity_analyses.py -i -m -t -e -o --suppress_beta_diversity

4.15 Determinação do percentual orgânico/inorgânico e massa seca em amostras ambientais

As amostras ambientais foram mantidas em estufa de secagem e esterilização MA033/1 (Marconi, Piracicaba, Brasil) a 103 ºC seguida de pesagem em balança analítica modelo AL104 (Aphox Technica, Brasil) até atingir peso constante, para a determinação da massa seca. Em seguida, as amostras foram transferidas para pedaços de papel alumínio – cuja massa foi previamente determinada após 1 hora na mufla – e foi determinado percentual de inorgânicos após calcinação em mufla a 550 °C, seguido de pesagem em balança analítica até atingir peso constante (APHA, 1999).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 (1) Padronização da etapa de extração

Devido a falta de um protocolo “gold standard” e de kits comerciais para extração de RNA de amostras complexas, foi necessário desenvolver e validar um protocolo eficaz na preservação da molécula e na recuperação em quantidade satisfatória. Almeida (2009) analisou a eficiência de diferentes protocolos de extração de RNA com culturas isoladas e o protocolo que apresentou melhor resultado foi o escolhido para a extração de RNA em amostra de lodo ativado e biofilmes de membrana de osmose reversa. Apesar do protocolo adaptado por Almeida (2009) ter extraído RNA de amostras complexas, o mesmo não demonstrou ser reprodutível, pois em algumas tentativas de extração realizadas para lodo ativado não foi obtido o RNA íntegro. Assim, foram testados diferentes protocolos de extração de RNA e ao final desta etapa, o protocolo que resultou no melhor rendimento foi selecionado para a extração de RNA com as demais amostras ambientais. Foi utilizado inicialmente amostras de lodo de esgoto ativado, por ser um tipo de ambiente com elevada concentração de contaminantes, tornando um desafio à extração de RNA de boa qualidade.

5.1.1 Avaliação da extração de RNA de culturas puras

Extratos de RNA foram obtidos seguindo os protocolos de extração (Tabela 2), para os organismos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Enterococcus sp. e Escherichia coli. A análise de extratos de rRNA de culturas puras por eletroforese em agarose (Figura 3) demonstra boa eficiência de extração para todos os organismos testados com os protocolos A e B. Os extratos obtidos pelos protocolos C, D e E continham concentrações satisfatórias de RNA na análise espectrofotométrica. Bandas fracas ou ausentes nos géis (Figura 3) sugerem que o rRNA foi degradado durante o processo de extração. Apesar das quantificações realizadas dos produtos das extrações mostrarem concentrações satisfatórias de RNA (Tabela 5), a ausência e diminuição de sinal na eletroforese sugere a degradação do RNA durante a extração através dos protocolos C, D e E.

Figura 3 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo os produtos de extração de RNA dos organismos-teste (Pa: Pseudomonas aeruginosa; Sa: Staphylococcus aureus; Ec: Escherichia coli; Bs: Bacillus subtilis; En: Enterococcus sp. e Ec: Escherichia coli). Em cada carreira do gel foram aplicados o equivalente a 20 μg de rRNA.

Tabela 5 - Quantificações realizadas para as extrações de cultura pura.

Protocolo A Protocolo B P.a S. a B. s E. f E. c P.a S. a B. s E. f E. c RNA (ng/uL) 4030 2960 1940 5790 8530 3525 990 4265 9130 9100 260/280 nm 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 260/230 nm 2 2,5 2,5 2 2 1,5 0,5 1,5 1,5 1,5

Protocolo E Protocolo D P.a S. a B. s E. f E. c P.a S. a B. s E. f E. c RNA (ng/uL) 7590 5840 5665 7450 5770 1030 400 1470 2980 3030 260/280 nm 1,5 2 2 1,5 2 2 2 2 2 2 260/230 nm 1 1 1 1 1 1 1 1,5 1,5 2

Protocolo C P.a S. a B. s E. f E. c RNA (ng/uL) 1460 730 2730 2520 1520 260/280 nm 2 2 2 2 2 260/230 nm 1 1 1 1,5 1 (Pa = Pseudomonas aeruginosa, Sa = Staphylococcus aureus, Ec = Escherichia coli, Bs = Bacillus subtilis, En = Enterococcus sp. e Ec = Escherichia coli). *A razão 260/280 nm tem indicativa de pureza para RNA em ~2,0 * A razão 260/230 nm tem indicativa de pureza com valores acima do 260/280 nm em ~2,0 - 2,2 72

5.1.2 Extração de rRNA de amostras de lodo de esgoto ativado

O lodo de estação de tratamento de esgoto é constituído pelos biofilmes produzidos no processo de tratamento aeróbio. Esta biomassa é formada pelo metabolismo pelos biofilmes em suspensão (biomassa suspensa) da matéria orgânica biodegradável particulada e dissolvida do esgoto, com inclusão de componentes abióticos orgânicos ou inorgânicos adsorvidos durante o processo de tratamento. Embora as estações de tratamento de esgoto sejam sistemas amplamente utilizados ao redor do mundo, os mecanismos de formação de flocos por comunidades microbianas de lodos ativados ainda não são totalmente conhecidos e a compreensão deste fenômeno pode permitir a otimização do processo (WEISSBRODT et al., 2013). O lodo ativado é um ambiente com altas concentrações de ribonucleases, o que representa um desafio na extração do RNA íntegro. O lodo difere das amostras de solo e sedimento em três aspectos: alta densidade de biomassa, baixo teor de ácido húmico e presença de bactérias agregadas em flocos (YU & MOHN, 1999). Substâncias húmicas são matérias orgânicas de composição variada que apresentam peso molecular elevado e resistência à degradação (GUOBIN, 2007; VON WINTZINGERODE, 1997; AIKEN, 1985). Essas substâncias inibem a atividade da enzima polimerase e desnaturam ácidos nucleicos pela ligação de seus grupos fenólicos a amidas ou, quando oxidados, formam quinonas que se ligam covalentemente a ácidos nucleicos, sequestrando o DNA da reação de amplificação. Além disso, o etanol utilizado nos kits de purificação de DNA e RNA, quando não é completamente removido, também inibe a amplificação (ROBE et al., 2003; GREEN and FIELD, 2012). Muitos métodos de extração incluindo kits comerciais e adaptações de métodos desenvolvidos para extrações de solo têm sido empregados para isolar ácidos nucleicos de amostras de lodo ativado sem a comprovação da adequação desses métodos para esse tipo de amostra (SEVIOUR & NIELSEN, 2010). Como discutido anteriormente, a extração de RNA total de amostras ambientais é uma etapa crítica que antecede a análise da diversidade microbiana metabolicamente ativa. Ao testar os protocolos de extração A, B, C, D e E em amostra de lodo ativado, o resultado obtido em gel de agarose apresentou as mesmas intensidades de bandas de rRNA ao comparar com o observado em culturas isoladas (Figura 3 e 4). Isto é, os protocolos A e B demonstraram os melhores resultados na integridade do rRNA e na 73

recuperação, respectivamente. O protocolo C foi o único protocolo testado que possui uma etapa de lavagem da amostra para a retirada de possíveis contaminantes. Com o intuito de averiguar a eficácia da lavagem da amostra, foi adicionado um protocolo teste que acrescenta ao protocolo A as etapas de lavagem do protocolo C. Essa etapa adicional de lavagem resultou em perda significativa de intensidade de banda de rRNA em comparação a extração realizada sem a lavagem (Figura 4). A extração realizada com o protocolo E apresentou pouco sinal de rRNA em comparação aos protocolos A e B. A hipótese para a pouca ineficiência pode estar vinculada a técnica de lise. Woo (2000) observaram que o aquecimento por micro- ondas à 600W causaram danos na parede celular de E. coli (Gram negativa), facilitando a lise na presença de SDS. Entretanto, quando o autor repetiu o experimento utilizando B. subtilis (Gram positiva) não foi observado lise celular. O resultado observado por Woo (2000) corrobora com o observado no resultado de extração obtido com o protocolo E (Figura 3). Outra hipótese é a de que o RNA tenha sido degradado pela ação da temperatura empregada no protocolo de extração. A injúria térmica pode ter causado a degradação das subunidades 16S e 23S do rRNA, como o observado por Almeida (2009) e Miller (1972). Khalil e Villota (1989) comprovaram a degradação de rRNA de Staphylococcus aureus por aquecimento quando exposto a 50 ºC por 30 minutos. A diminuição nas intensidades das bandas de rRNA observados nos protocolos C e A + lavagem indicam que as etapas de lavagem, além de retirar os contaminantes, também lisam as bactérias causando perda de material genético. A extração de rRNA com protocolo D resultou em perda de intensidade de banda em comparação aos protocolos A e B. O método de extração B apresentou intensidade de banda de RNA mais intensa quando comparado ao protocolo A, porém com maior rastro, indicando maior degradação de RNA (Figura 4). Em função destes resultados, foram criados dois novos protocolos, combinando as melhores partes dos protocolos A e B na esperança de obter extração de maior quantidade de RNA (como foi observado no protocolo B) com o mínimo de degradação (observado no protocolo A). O protocolo G apresentou altas quantidades de rRNA 16S íntegro, mesmo quando comparado com o resultado obtido do protocolo A o que sugere uma melhora na lise celular e proteção do rRNA das ribonucleases e contaminantes. Já o protocolo H, apresentou sinal de banda muito fraco, sugerindo perda de RNA na execução desse protocolo teste (Figura 5). 74

Figura 4 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através de diferentes metodologias.

Figura 5 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através das adaptações entre os protocolos G e H. 75

O protocolo G é quase similar ao protocolo F descrito por Nikolausz (2004), utilizado para extração de RNA de comunidades de bactérias do rizoma. Na comparação da extração de lodo ativado pelo protocolo F e G, a intensidade da banda de rRNA 16S foi maior no protocolo G (Figura 6). Porém não houve diferenças significativas nas concentrações e na qualidade do RNA entre as duas metodologias na análise por espectrofotometria (3.480 ng/µl e 3.610 ng/µl, respectivamente). Como os dois protocolos se mostraram eficientes para extração de RNA em lodo ativado, ambos foram testados nas etapas posteriores à extração.

Figura 6 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através dos protocolos F e G.

Protocolo F Protocolo G

16S

A integridade das moléculas de RNA extraídas é rotineiramente analisada através de eletroforese em géis de agarose. Em amostras com rRNA bem conservado, o fragmento de maior tamanho (28s e 23S) deve possuir o dobro de intensidade de coloração em relação ao fragmento menor (18S e 16S, BECHHOFER, 2008; HARTMANN et al., 2005; SAMBROOK et al., 1989). Entretanto, há casos em que rastros em géis de RNA não refletem degradação da molécula. Alguns micro- organismos como, por exemplo: Klebsiella, Citrobacter, Salmonella, Proteus, Yersinia, Campylobacter, Agrobacterium, Actinobacillus, Providencia, Rhizobium, Leptospira, Helicobacter e Rhodopseudomonas, possuem sequencias intermediárias (IVSs) nos genes estruturais do rRNA 23S, que são transcritos e posteriormente excisados da molécula pela RNAse III (PRONK et al., 2001; ZAHN, et al., 2000). IVSs auxiliam a bactéria a se adaptar a mudanças ambientais que demandem ajuste da concentração de rRNA e de ribossomos. As IVSs podem ocorrer em diferentes partes do fragmento de 23S rRNA (EVGUENIEVA-HACKENBERG, 2005). Durante a análise da integridade do rRNA por eletroforese capilar ou convencional, a presença das IVSs pode indicar erroneamente como extrato de rRNA “degradado”, levando a um falso julgamento sobre a qualidade da extração (BHAGWAT, et al., 2013).

5.1.3 Avaliação da ressuspensão do RNA em diferentes soluções

Para avaliar a eficiência das soluções de ressuspensão do RNA, os extratos de RNA obtidos pelos protocolos F e G foram diluídos com soluções TE, água DEPC contendo 2% formamida e água ultrapura (Figura 7). Todas as suspensões apresentaram bandas de RNA 16S de boa qualidade. Essas amostras foram avaliadas durante as etapas posteriores a extração (RT-PCR) para avaliação de possíveis interferências na aplicabilidade desses métodos.

Figura 7 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA de lodo de esgoto ativado extraídos através dos protocolos F e G, ressuspendidos com diferentes soluções de eluição.

Yasukawa (2010) observaram que a adição de solução com 6 a 8% de formamida nas reações de RT melhorou a eficiência na síntese de cDNA em baixas temperaturas. Cada aumento de 1% de formamida corresponde ao decréscimo de 2 78

ºC na temperatura de anelamento na RT. Essa melhora foi devido ao aumento da especificidade do iniciador e a diminuição da formação de estruturas secundárias do RNA. Entretanto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que a ressuspensão do RNA em solução contendo 2% formamida inibe a PCR das amostras de lodo de esgoto mesmo após a purificação do extrato de RNA e a diminuição na temperatura de síntese de cDNA (RT), mostrando que a formamida adicionada na etapa de extração interfere na amplificação por PCR para esse tipo de amostra (Figura 8). Com relação à concentração de cloreto de magnésio, as reações de PCR das amostras de RNA extraídas pelos protocolos F e G resuspendidos em água ultrapura mostraram maior eficiência em baixas concentrações de cloreto de magnésio (1 mM e 2 mM). As reações de PCR das amostras extraídas pelo protocolo G resuspendido em TE mostrou maior intensidade de banda na concentração de 4 mM de cloreto de magnésio (Figura 8). Todas as reações de PCR foram realizadas com concentrações iguais de cDNA (1000 ng). Porém, as intensidades das bandas obtidas pelo método F apresentaram melhor rendimento de amplificação em comparação ao obtido pelo protocolo G, nos levando a adota-lo nas avaliações seguintes.

Figura 8 - PCR de amostras de RNA de lodo extraídos pelos protocolos F e G contendo diferentes soluções de ressuspensão (água ultrapura, água DEPC 2% formamida e TE) e diferentes concentrações de cloreto de magnésio (1, 2, 4 e 5 mM). Para todas as reações foram utilizadas as mesmas concentrações de cDNA (1000 ng). 79

5.1.4 Avaliação de interferentes presentes no lodo ativado na extração de RNA pelos protocolos F e G

200mg de lodo autoclavado foram fortificados com 78ug de RNA de um consórcio microbiano artificial, para avaliar a interferência de componentes do lodo na extração de RNA. A amostra de RNA de fortificação continha partes iguais de RNA extraída de culturas puras de Enterococcus sp., Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A autoclavagem do lodo foi necessária para eliminar o RNA endógeno da amostra, de concentração desconhecida. Uma vez que, a hidrólise das ligações fosfodiéster do ácido nucleico pode iniciar entre 150 e 200 ºC, porém com a aplicação de pressão (autoclave), as ligações dos nucleotídeos dos ácidos nucleicos ficam mais sensíveis ao calor, podendo ser degradados em temperaturas mais baixas (KAWAMURA, 1999; KARNI et al., 2013). Outra justificativa é que, a combinação de alta temperatura e pressão (autoclave) pode mudar a estrutura do rRNA e das proteínas ribossomais, expondo as sequências do RNA para as RNAses intracelulares (McKILLIP,1998). Junto com a amostra foram utilizados: controle negativo (lodo de esgoto autoclavado); e um controle positivo (extrato de RNA). 80

Não houve interferência do RNA do lodo ativado nos ensaios (Figura 9), porém, mesmo após autoclavagem alguns compostos de natureza desconhecida do lodo interferiram na extração de RNA. Os protocolos F e G permitiram a recuperação de 50% e 80%, respectivamente, do RNA adicionado (Figura 9). Apesar do método de extração F apresentar uma porcentagem maior na recuperação de RNA, o protocolo G produziu RNA menos degradado no gel de agarose 1% (Figura 9). Isso demonstra que há perdas de RNA vinculada ao protocolo utilizado, mesmo para os métodos de extração mais eficazes para amostras de lodo de esgoto ativado.

Figura 9 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo alíquotas de RNA submetidas ao processo de extração pelos protocolos F e G.

5.1.5 Aplicação do protocolo G em culturas específicas e em amostras ambientais

5.1.5.1 Extração de RNA em amostras de biocorrosão

A biocorrosão ou corrosão microbiologicamente induzida (CMI) é o termo adotado para processos corrosivos influenciados por micro-organismos presentes em biofilmes aderidos à superfície de um metal. O CMI é iniciado pela interação (com características sinérgicas) entre a superfície do metal, produtos abióticos de corrosão, células bacterianas e seus produtos metabólicos. O biofilme pode agir por vários mecanismos no processo de corrosão como: formação de regiões anódicas e catódicas através da diferença de concentração de oxigênio na região interna e externa do biofilme; reações metabólicas nos biofilmes geram substâncias corrosivas ou reagentes catódicos; consumo do hidrogênio (H2) por bactérias redutoras de sulfato; dentre outros (SILVA, 2015; BEECH; SUNNER, 2004). A identificação das bactérias formadoras de biofilme (EPS) em ligas metálicas é de grande importância para elucidar quais espécies estão envolvidas no processo de formação dessa estrutura. A biocorrosão ocorre em instalações como: gasodutos, campos petrolíferos, estruturas portuárias, sistemas de distribuição de água e usinas hidrelétricas. Porém, a presença de minerais como o sulfeto de ferro e óxidos induzem processos de oxidação pela reação de Fenton, que catalisam a degradação do DNA e RNA em amostras de biocorrosão, em águas subterrâneas, águas residuais e nos processos de hidrometalurgia (MARTY et al., 2012). A exposição do RNA ao radical hidroxil leva ao ataque das bases e açúcares causando a despolimerização do ácido nucleico, além de interferir em análises posteriores, como, por exemplo, a PCR (COHN et al., 2004). A recuperação de RNA de boa qualidade (rRNA 16S íntegro) de amostras com presença de biocorrosão torna-se importante para manter a representatividade dos micro-organismos metabolicamente ativos. Amostras de bactérias redutoras de ferro coletadas águas residuárias e cultivadas em diferentes meios de culturas foram submetidas à extração de RNA com o protocolo G (Figura 10). Foi observado sinais de rRNA 16S das amostras contendo bactérias redutoras de ferro, com exceção da amostra cultivada em meio mínimo que apresentou pouco crescimento bacteriano (dados não mostrados).

Figura 10- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA de amostras contendo bactérias redutoras de ferro cultivadas em diferentes meios de cultura. 82

5.1.5.2 Extração de RNA de lixiviado em mineração ácida

Drenagem ácida de mina (DAM) é um fenômeno que se inicia quando rochas contendo minerais sulfetados são retiradas do interior da terra pelas atividades de mineração e, quando dispostas na superfície terrestre, oxidam por reação com água e oxigênio atmosféricos. Durante a penetração das soluções ácidas nas rochas e nos solos, podem solubilizar alguns elementos químicos presentes (lixiviação), podendo contaminar águas superficiais como rios, riachos e/ou águas subterrâneas. Alguns exemplos desses elementos são Mn, Cr, Cd, Zn, Pb, As, dentre outros. Esse fenômeno está associado a atividades de mineração, mais especificamente à etapa de retirada do minério, quando grande quantidade de rochas é exposta às condições atmosféricas, potencializando a drenagem ácida e o risco de contaminação ambiental. A oxidação pode ser acelerada por ação bacteriana presente naturalmente no meio ambiente, aumentando drasticamente a drenagem ácida (MELLO et al., 2014; FOSSATTI et al., 2011). A lixiviação bacteriana, ou biolixiviação, é um processo biotecnológico que se fundamenta na utilização de micro-organismos capazes de solubilizar metais pela oxidação de sulfetos metálicos (FRANCISCO JR et al., 2007). A biorremediação envolve a utilização de micro-organismos de ocorrência natural 83

(nativos), ou cultivados, para degradar ou imobilizar contaminantes em águas e solos. Dentre os micro-organismos utilizados, as bactérias são as mais empregadas e, por conseguinte, são consideradas como o elemento principal em trabalhos que envolvem a biodegradação de contaminantes (AVILA et al., 2013). As reservas minerais de elevado teor de minerais de interesse econômico estão se exaurindo rapidamente, o que obriga as indústrias a encontrar formas alternativas para produção desses minerais, como processar minérios de baixo teor, estéreis e rejeitos das operações de mineração atuais (AFONSO, 2017). O processo de validação de técnicas moleculares é uma etapa importante para o conhecimento da microbiota metabolicamente ativa em amostras de mineração. Assim, são escassas as informações das características microbianas anaeróbicas desses sítios. A extração de RNA em amostras contendo bactérias de biolixiviação foi satisfatório em meio com pH 7, tanto para o sobrenadante (fase líquida) quanto para o precipitado (sólido decantado) da amostra. Para o meio de cultivo em pH 2, houve sinal de rRNA 16S discernível, porém em menores quantidades (Figura 11).

Figura 11- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA de amostras contendo bactérias redutoras de cobre cultivadas em diferentes meios de cultura. 84

5.1.5.3 Extração de RNA de biofilme de membrana de osmose reversa

A membrana de osmose reversa é amplamente empregada na dessalinização de água, removendo muitos contaminantes como: constituintes microbiológicos, sólidos dissolvidos totais, componentes orgânicos e íons monovalentes, produzindo água de alta qualidade para uso industrial e para abastecimento público. Membranas de osmose reversa também são utilizadas em sistemas de dessalinização de água marinha, produzindo água potável para consumo humano. Porém, a eficiência de filtração e a vida útil da membrana podem ser diminuídas devido à formação de biofouling, que é caracterizado pelo crescimento de um biofilme bacteriano na superfície da membrana filtrante (CHIELLINI et al., 2012). O biofouling aumenta a resistência de filtração, resultando no aumento de pressão das bombas de água, inviabilizando a continuação de operação do sistema de filtração. A membrana deve ser retirada para a realização de limpeza química, o que reduz a vida útil da membrana e a perda da capacidade de abastecimento de água (BERESCHENKO et al., 2010). Com o intuito de diminuir a formação de biofilmes em sistemas de membranas, estudos vêm sendo realizados com o foco na utilização de biofiltros como forma de 85

pré-tratamento. O conceito de biofiltração é baseado no emprego de meios filtrantes biologicamente ativos a fim de consumir a matéria orgânica da água reduzindo, a jusante, o crescimento de biofilme nas membranas. Esses nutrientes englobam a fração de matéria orgânica assimilável pela bactéria, denominada (AOC), em português Carbono Orgânico assimilável (HALLÉ, 2009; DE OLIVEIRA, 2012). Existem diversos trabalhos caracterizando a comunidade microbiana em biofilmes crescidos em membranas filtrantes baseados em 16S rDNA e rRNA (ALMEIDA, 2009; AYACHE et al., 2013; BERESCHENKO et al., 2008; BERESCHENKO et al., 2010; BARNES et al., 2015; CHIELLINI et al., 2012; LEVI et al., 2016; MANES et al., 2011; ZHANG, 2011) e para a comunidade microbiana em sistemas de filtros de areia baseado em 16S rDNA (BAI et al.,2013; CALVO-BADO et al., 2003; WAKELIN et al.,2011). HAIG (2015) caracterizou a comunidade microbiana de filtros lentos de areia por análise de DNA de amostras coletadas em diferentes profundidades do filtro durante todo o período de funcionamento do sistema. Porém, pouco se sabe quais desses micro-organismos estão metabolicamente ativos e sintetizando o EPS. As amostras de biofilmes bacterianos crescidos em células de fluxo montadas com membranas de osmose reversa foram submetidas a extração de RNA com o protocolo G. As amostras 1 e 3 foram pré-tratadas com filtro rápido de areia e amostras 2 e 4 com filtro lento de areia. Podemos observar a presença tanto de rRNA 16S quanto de 18S devido à grande presença de algas para esse tipo de amostra (Figura 12). Foram observados sinais de rRNA de biofilmes crescidos em sistema de filtragem por filtro de areia lento, montado na raia olímpica da USP (Figura 13). Esse sistema tem como objetivo retirar os sólidos em suspensão e reduzir a matéria orgânica proveniente da água da raia.

Figura 12- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética com produto de extração de RNA de amostras de biofilme bacteriano coletadas de tanques de piscicultura marinha. P.a. = Pseudomonas aeruginosa. 86

Figura 13 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo produto de extração de RNA de amostras de biofilme coletadas em sistema de filtros de areia lento.

5.1.5.4 Congelamento de lodo na preservação do RNA

Como descrito por Qin (2008), após a coleta de amostras de biofilme em um reator de tratamento de água, foram imediatamente resfriados em gelo e transferido para o laboratório dentro de uma hora, em seguida as amostras foram imediatamente utilizadas para extração de DNA e RNA. A extração de RNA de lodo armazenado com o protocolo G, em quadruplicata, por sete dias à 4°C, não resultou em sinal de rRNA 16S discernível nas bandas no gel de agarose, porém com o armazenamento do lodo a -20°C (Figura 14) e a -80°C (Figura 15) por sete dias, foram observadas bandas de rRNA 16S discernível no gel de agarose.

Figura 14- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA extraído de lodo armazenado a 4°C e -80°C por 7 dias. Controle positivo = extração de RNA de cultura pura de P. aeruginosa.

Lodo armazenado Lodo armazenado RNA (C+) 4°C -20°C

23S

16S

Figura 15- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo amostras de RNA extraídas de lodo armazenado por sete dias em freezer a -80º C. Controle positivo = extração de RNA de cultura pura de P. aeruginosa.

As extrações de RNA realizadas com os protocolos G de amostras de lodo ativado congeladas por 365 e 1460 dias resultaram em sinal de rRNA 16S íntegro (Figura 16), já a extração realizada com o protocolo F resultou em sinal de rRNA degradado (Figura 16 B), mostrando que o protocolo G também possui eficiência de extração para amostras armazenadas por longos períodos, mantendo a qualidade da amostra para análises moleculares.

Figura 16- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo extratos de RNA obtidos de lodo ativado armazenados a -80 ºC por 365 dias (A) e 1460 dias (B) extraídos com o protocolo G. C -: Controle negativo.

5.1.5.5 Extração de RNA e determinação de orgânico/inorgânico e massa seca em amostras provenientes de biocorrosão e biolixiviação

Para determinação do biofilme crescidos em corpos de prova compostos por aço e outras ligas metálicas expostas às águas do rio Xingu, foi realizado a extração de RNA utilizando o protocolo G, adaptado nesse trabalho. Não houve sinal de RNA em gel de agarose para todas as extrações realizadas nos materiais coletados na 90

usina hidrelétrica de Belo Monte (dados não mostrados). Entretanto, ao realizar a extração de RNA em amostras de biocorrosão do sistema de monitoramento montado na raia olímpica da USP, foi observado sinal de bandas de rRNA 16S, com exceção da amostra sem filtração crescido em aço carbono (Figura 17).

Figura 17- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo produto de extração de RNA realizado com o protocolo G para amostras de biocorrosão do sistema montado na raia olímpica da USP.

A falha na extração de RNA em todas as amostras coletadas em corpos de prova instalados na usina hidrelétrica pode ter sido em decorrência à ineficiência da conservação da amostra entre o tempo de coleta e o armazenamento em laboratório. Ou devido a característica química da amostra, interferindo no protocolo de extração. Para determinar se a composição da amostra pode interferir na extração de RNA utilizando o protocolo G, foi realizado a determinação de massa seca e orgânico/inorgânico das amostras obtidas na usina hidrelétrica, no sistema montado na raia olímpica e em lodo ativado, no qual o protocolo foi primeiramente adaptado (Figura 18 A e B). 91

Figura 18- Determinação de orgânico/inorgânico (A) e massa seca (B) para amostras de biocorrosão provenientes da usina hidrelétrica de Belo Monte, do sistema de monitoramento da raia da USP e para lodo ativado.

O volume de amostra de lodo ativado padronizado por Almeida (2009), foi adotado nesse estudo (seção 4.1.2). Foi observado que a alíquota padronizada de lodo ativado (7 mL, cerca de 200mg de precipitado) possui o equivalente em massa seca, cerca de 20mg, dos quais 80% são provenientes de compostos orgânicos (Figura 18). As amostras de biocorrosão apresentaram uma composição de inorgânicos de 100 a 350% superior em relação ao lodo ativado (Figura 18 A). 92

Entretanto, podemos observar que as amostras onde não foram obtidos extração de RNA, a quantidade de massa seca era superior à 94mg (Figura 18 B). Os resultados obtidos mostram que a porcentagem total de inorgânicos não está relacionado a inibição de extração de RNA. Porém, para obtenção de RNA em amostras de biocorrosão, a quantidade de massa seca deve estar abaixo de 94mg. Para determinar se a quantidade em massa seca pode interferir na extração de outros tipos de amostras ambientais, esse mesmo experimento foi repetido com amostras de biolixiviação em diferentes alíquotas. Foi feito a extração de RNA com o protocolo G para amostra de biolixiviação em diferentes alíquotas (Figura 19). Podemos observar que houve maior recuperação de RNA para a amostra com alíquota de 2 mL e a inibição de extração de RNA para a amostra com alíquota de 7 mL.

Figura 19- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo produto de extração de RNA realizado com o protocolo G para amostra de biolixiviação com diferentes volumes.

Assim como observado para amostras de biocorrosão, a amostra de biolixiviação apresentou alta porcentagem de inorgânicos independente da alíquota utilizada (Figura 20 A). Entretanto, a quantidade em massa seca presente nas amostras que resultaram em bandas de rRNA (1 mL, 2 mL e 4 mL), foi consideravelmente maior em comparação as amostras de biocorrosão (Figura 20 B e 93

20 B), sendo que o maior sinal de extração de RNA foi obtido para a alíquota de 2 mL (654mg em massa seca; Figura 20 B).

Figura 20- Determinação de orgânico/inorgânico (A) e massa seca (B) para amostra de biolixiviação em diferentes volumes.

Esses resultados mostram que o protocolo G de extração adaptado nesse trabalho é capaz de extrair RNA de amostras contendo diferentes proporções de orgânico/inorgânico. Sendo um protocolo eficaz mesmo para amostras contendo altas concentrações de componentes inorgânicos capazes de catalisar a degradação de RNA, como a pirita, sulfeto de ferro e óxidos, que formam a radical hidroxila levando a decomposição do RNA (COHN et al., 2004; MARTY et al., 2012). Entretanto, para 94

diferentes tipos de amostras complexas, é necessário a padronização da alíquota utilizada na extração de RNA utilizando o protocolo G.

5.1.5.6 Determinação da concentração mínima de células para extração de RNA em amostras de biocorrosão

Devido a ineficácia na extração de RNA para as amostras de biocorrosão da usina hidrelétrica e para a amostra de aço carbono sem filtração (Figura 17), e após averiguar que a porcentagem total de inorgânicos e o teor de massa seca não interferem na aplicação do protocolo G. Foi realizado um ensaio para averiguar a quantidade mínima necessária de bactérias em uma determinada quantidade de amostra de biocorrosão. Foram inoculadas diferentes alíquotas de Staphylococcus aureus (S.a.) em 380mg de amostra de biocorrosão proveniente da usina hidrelétrica (Tabela 6) e realizado a extração com o protocolo G. Podemos observar na figura 21 que houve sinal de RNA na amostra de biocorrosão contendo alíquota de 200μL de cultura isolada. Entretanto, ao comparar a intensidade de sinal de RNA do controle positivo com a amostra contendo o dobro de alíquota utilizada no controle, notamos que há interferência na extração devido aos componentes presentes na amostra. Para as demais alíquotas não houve sinal de RNA. Para avaliar a quantidade de bactérias presentes na alíquota de 200 uL, foi realizado o ensaio de diluição em série, seguido de cultivo em meio de cultura seletivo para Staphylococcus aureus e contagem em placa (dados não mostrados). Foi determinado que a quantidade mínima necessária para extração de RNA de bactérias em biofilme de amostras de biocorrosão é de 16x104 células em aproximadamente 380 mg de amostra.

Tabela 6 - Alíquotas de cultura isolada (S.a.) inoculadas em amostra de biocorrosão coletada na usina hidrelétrica.

S.a. C+ 1 2 3 4 5 100uL 200uL 100uL 50uL 25uL 12uL Amostra Biocorrosão - 380mg 380mg 380mg 380mg 380mg

Figura 21- Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo produto de extração de RNA realizado com o protocolo G para amostra de biocorrosão inoculadas com diferentes alíquotas de cultura isolada (S.a.). C+ = 100 uL, 1 = 200 uL, 3 = 50 uL, 4 = 25 uL e 5 = 12 uL.

Esses resultados mostram a necessidade de padronização da alíquota utilizada para a extração de RNA de cada amostra complexa. Mesmo não havendo interferência por parte do teor de inorgânicos e de massa seca, o protocolo G só foi capaz de extrair RNA de amostras de biocorrosão em uma ordem mínima de 4,2x102 células por mg de amostra.

Nesta primeira etapa do trabalho, foi observado que a padronização de um protocolo eficaz para extração de RNA em amostras ambientais complexas é de grande importância para evitar a perda de informação contida nesses ambientes. E a principal etapa averiguada nesses protocolos foi à eficiência de lise celular. Os protocolos que empregam a lise física (Bead Beater) e por químico-enzimático foram os mais eficazes para esse tipo de amostra, mostrando baixa degradação e alto rendimento respectivamente. Ao avaliarmos o protocolo G (adaptado neste trabalho), observamos melhores resultados quando comparado com os resultados obtidos pelos métodos de Bead Beater e químico-enzimático. O RNA ressuspendido com água 96

ultrapura e TE foram os que apresentaram melhores resultados na etapa de amplificação por PCR. O protocolo G adaptado nesse trabalho mostrou ser eficaz para extração de RNA de diferentes amostras ambientais in natura (lodo ativado, tanques de piscicultura, filtro de areia) e para amostras ambientais cultivadas em diferentes meios de cultura (bactérias redutoras de ferro e biolixiviação). Mostrando que esse protocolo é eficaz para extração de RNA de diferentes amostras complexas. O armazenamento de amostras ambientais em -80ºC conservou o RNA, isso demonstra que o transporte em condições de baixa temperatura é necessário para a manutenção da integridade da amostra para análises moleculares. O protocolo G resultou ser eficiente para extração de RNA de lodo ativado conservado por longos períodos à - 80ºC e para amostras contendo altas concentrações de inorgânicos, porém, é necessário ressaltar a necessidade de padronização da alíquota utilizada na extração.

5.2 (2) Otimização da etapa de RT-PCR

Como descrito na seção 1.4, erros introduzidos durante a etapa de RT-PCR podem afetar fortemente a proporção original de moldes, podendo levar a distorções da verdadeira composição microbiana de uma amostra complexa. O uso de iniciadores de baixo poder de cobertura ou o uso de mais de um par na mesma reação, o número de ciclos aplicado a um programa de PCR e a temperatura de anelamento, são variáveis que podem levar a vieses na amplificação. Assim, a etapa de otimização da RT-PCR é de fundamental importância para preservar a proporção original de moldes de uma amostra.

5.2.1 Quantificação comparativa dos produtos da etapa de síntese do cDNA (RT) para culturas puras

Na análise de extratos de rRNA de consórcios microbianos, sequencias oriundas de diferentes organismos são amplificadas simultaneamente na reação de PCR. Erros de representatividade da amostra podem ser introduzidos na etapa de RT e na de PCR. Para verificar qual destas etapas é mais propensa para geração de erros de representatividade, extratos de RNA total de cultura pura dos cinco organismos- teste foram submetidos individualmente à reação de RT-PCR. Inicialmente, foi avaliado a produção de cDNA comparando o rendimento após o tratamento da reação com a RNAse A. A RNAse A possui a capacidade de degradar ssRNA, dsRNA e a fita de RNA do complexo RNA:cDNA. O tratamento com RNAse A em amostras a serem amplificadas melhora os resultados de PCR. A possibilidade da enzima Taq polimerase atuar como uma transcriptase reversa em moléculas de RNA presentes na reação compromete a eficiência de amplificação por PCR (MARTEL et al., 2002). A análise foi realizada em duplicata com medição da quantidade de produto após cada etapa. As reações com e sem o tratamento com RNAse A logo após a RT foram quantificadas com fator de comprimento de onda para ssDNA. E para a variação estatística, cada reação foi submetida a quatro leituras no equipamento DeNovix DS- 11 (Figura 22). As reações de transcrição reversa (RT- Reverse Transcription) produziram quantidades satisfatórias de cDNA (ssDNA) em relação a quantidade de moldes de RNA adicionados. Entretanto, foi observado que os rendimentos obtidos para as 98

espécies B. subtilis e Klebsiella pneumoniae foram menores (48 a 68%) em comparação ao observado para as espécies Burkholderia cepacia, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (80 a 100%). Este resultado indica que a eficiência de síntese de cDNA pode estar relacionada ao teor de G+C no gene rRNA 16S de cada uma das espécies utilizadas. Os rendimentos foram semelhantes entre as reações tratadas e não-tratadas com a RNAse A para as cinco espécies utilizadas, demonstrando que a adição da RNAse A não interferiu no rendimento da RT. Os baixos valores de desvio padrão das réplicas desta reação de síntese da 1ª fita demonstraram a excelente reprodutibilidade da reação, independentemente da origem do rRNA (Figura 22).

Figura 22 - Quantificação no equipamento DeNovix DS-11 dos produtos de síntese da 1ª fita de Burkholderia cepacia (B. c.), Staphylococcus aureus (S. a.), Bacillus subtilis (B. s.), Pseudomonas aeruginosa (P. a) e Klebsiella pneumoniae (K. p.) tratadas e não-tratadas com RNAse A.

Na análise dos resultados obtidos na síntese de cDNA mostraram que interferências podem ocorrer na etapa de RT. Esta diferença de rendimento pode estar relacionada aos diferentes teores de G+C dos moldes de rRNA 16S. Foi descrito que, 99

moléculas de RNA de fita simples são conhecidas por dobrar em estruturas tridimensionais complexas, sendo que estas estruturas são mais estáveis em sequencias ricas em G+C (PRICE et al., 2017). E a velocidade com que a enzima polimerase reversa se move ao longo de uma cadeia de RNA é associada a quantidade de estruturas secundárias encontradas pela enzima, funcionando em um ritmo mais lento quando confrontada com estas estruturas (LYUBETSKY et al., 2006). As cinco espécies escolhidas são consideradas mesófilas e apresentam similaridade no teor de G+C (51 a 56%). Entretanto, foi observado que moldes de rRNA 16S mesmo com pouca diferença no teor de G+C podem apresentar diferenças na eficiência de síntese de cDNA (Figura 22).

5.2.2 Quantificação comparativa dos produtos da etapa de síntese do complexo cDNA:DNA (PCR) para culturas puras

As reações de RT tratadas e não-tratadas com RNAse A foram submetidas a avaliação de rendimento da 2ª fita de DNA do complexo cDNA:DNA, utilizando as enzimas Taq DNA Polimerase (Sinapse Inc.) e a Taq DNA Polimerase Platinum (Invitrogen Life Technologies). E cada reação foi amplificada utilizando programas de amplificação por PCR distintos entre si. As leituras realizadas para as reações de síntese da 2ª fita (PCR) não-tratadas com RNAse A resultaram em quantidades muito menores que o esperado quando utilizado a Taq DNA pol. quando comparado com o uso da Taq Platinum (Figura 23). Além disso, os rendimentos na síntese da 2ª fita de DNA do complexo cDNA:DNA apresentaram maior diferenciação entre as cinco espécies quando utilizado o programa padrão em comparação com o programa de sub-ciclagem, sugerindo uma preferência de amplificação para cada tipo de molde (Figura 23 B e D). O uso da Taq Platinum com o programa de sub-ciclagem resultou em quantidades satisfatórias de síntese e na amplificação de forma igualitária para as cinco espécies utilizadas. As quatro leituras realizadas para cada reação de PCR geraram um valor de desvio padrão igual ao observado na etapa de RT, demonstrando a excelente reprodutibilidade também na etapa de PCR. O mesmo resultado foi observado quando foram utilizadas as reações tratadas com RNAse A (Figura 24), com exceção das amplificações utilizando a Taq pol. com o programa de sub-ciclagem, que 100

apresentaram maiores quantidades de síntese da 2ª fita quando comparado as quantidades obtidas sem o tratamento de RNAse A (Figura 24 C). A avaliação estatística das reações RT e PCR por ANOVA revelou diferenças significativas no rendimento do produto das reações de RT (com e sem RNase A) para as diferentes cepas (Anexo 3). A única condição de amplificação por PCR que produziu uma variação muito próxima da variação não significativa entre os modelos de cinco espécies foi o teste sem RNAseA com Taq Platinum e o programa sub- ciclagem, que também proporcionou os melhores rendimentos de reação (Figura 23). Entretanto, as sínteses da segunda fita para as 5 cepas utilizadas não atingiram o valor máximo de rendimento. A comparação estatística foi realizada para os rendimentos dentre as cepas em todas as reações. A análise por ANOVA para a condição sem RNAse A com Taq Platinum e sub-ciclagem revelou que as médias, apesar de muito próxima, não eram iguais. A comparação dentre os pares com t-Test indicou que apenas os valores médios de Staphylococcus aureus / Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis / Pseudomonas aeruginosa foram estatisticamente diferentes, todos os outros foram estatisticamente similares (Anexo 3).

101

Figura 23 - Quantificação no equipamento DeNovix DS-11 dos produtos de síntese da 2ª fita Burkholderia cepacia (B. c.), Staphylococcus aureus (S. a.), Bacillus subtilis (B. s.), Pseudomonas aeruginosa (P. a) e Klebsiella pneumoniae (K. p.), não-tratados com RNAse A.

Figura 24 - Quantificação no equipamento DeNovix DS-11 dos produtos de síntese da 2ª fita Burkholderia cepacia (B. c.), Staphylococcus aureus (S. a.), Bacillus subtilis (B. s.), Pseudomonas aeruginosa (P. a) e Klebsiella pneumoniae (K. p.), tratados com RNAse A.

102

Foi observado diferenças entre as quantidades de DNAs sintetizados a partir de amostras de rRNA de cultura pura, demonstrando a ocorrência de vieses também na etapa de PCR (Figura 23 e 24). Assim como o observado na etapa de RT, a síntese da 2º fita (PCR) apresentou rendimento correlacionado ao teor de G+C de cada molde, mesmo a diferença de G+C sendo de baixa disparidade. Na amplificação por PCR das reações tratadas com RNAse A demonstra que este viés não ocorre devido a possibilidade da Taq polimerase atuar como uma transcriptase reversa, mas possivelmente está relacionado aos diferentes teores de G+C de cada molde. Os mecanismos de interferência na reação de PCR contendo um único tipo de molde descritos na literatura incluem: a mutação mediada pela enzima polimerase durante a síntese de DNA, este viés faz com que a população de DNA contendo mutações cresça com a introdução de novas mutações a cada ciclo de PCR (ECKERT; KUNKEL, 1991); reações com baixas concentrações de moldes podem resultar em diferenças aleatórias na eficiência de anelamento dos iniciadores, alterando a abundancia da comunidade microbiana analisada, este viés é atribuído ao flutuação estocástica na formação do complexo iniciador : molde : enzima polimerase (CHANDLER et al., 1997); anelamento diferencial dos iniciadores (MUTTER; BOYNTON, 1995); degradação do molde e presença de impurezas no DNA (WALSH et al., 1991); amplificação seletiva de sequências de rRNA 16S devido ao anelamento não- específico dos iniciadores durante a PCR (REYSENBACH et al., 1992). Entretanto, mesmo com diferenças de quantidades de cDNA, foi observado que o uso da Taq DNA Platinum com o programa de sub-ciclagem e a diminuição da rampa de temperatura resultou na amplificação igualitária e em quantidades satisfatórias para as cinco espécies utilizadas.

5.2.3 Avaliação por clonagem do número de ciclos de PCR na fidelidade de representação de consórcios artificiais

A análise dos consórcios obtidos por clonagem das misturas de RNA (B. subtilis, P. aeruginosa e S. aureus) seguida da amplificação com Taq Platinum e RT- PCR padrão com 10 e 30 ciclos, permitiu detectar todos os representantes da mistura (Figura 25). Entretanto, os consórcios gerados a partir de PCR com 30 ciclos de amplificação, resultou em maior variação da proporção dos representantes em relação ao esperado e na comparação as variações geradas nos consórcios 1:1:1 de 10 ciclos 103

de PCR (Tabela 7). Consórcios contendo representantes nas proporções de 1:1:1 e 1:8:1 com 10 ciclos de PCR apresentaram variações em relação ao esperado de -9 a 15% e 0% a 50% respectivamente. Já os consórcios de 1:1:1 e 1:8:1, os quais passaram por 30 ciclos de PCR, apresentaram variações em relação ao esperado de -85 a 100% e -50 a 270% respectivamente (Tabela 7). Estes dados demonstraram que o aumento do número de ciclos acarreta em uma maior alteração nas proporções originais da mistura de moldes.

Figura 25 - Gel de ARDRA 4% submetido a eletroforese para a biblioteca (1:1:1) com produto de amplificação com Taq Platinum e PCR padrão com 10 ciclos.

Tabela 7 - Porcentagem de clones obtidos nos consórcios montados com extratos de rRNA de culturas puras de P. aeruginosa, S. aureus e B. subtilis nas proporções de 1:1:1 e 1:8:1, submetidos à PCR padrão de 10 e 30 ciclos. (E= esperado, O= obtido e V= variação em relação ao esperado, valores arredondados).

Misturas de Total de % de P. aeruginosa % de S. aureus % de B. subtilis rRNAs clones E O V E O V E O V

1:1:1 (10 ciclos) 105 33% 27% -15% 33% 38% 15% 33% 30% -10%

1:1:1 (30 ciclos) 106 33% 5% -85% 33% 66% 100% 33% 30% -10%

1:8:1 (10 ciclos) 104 10% 15% 50% 80% 75% -5% 10% 10% 0%

1:8:1 (30 ciclos) 110 10% 37% 270% 80% 40% -50% 10% 16% 60%

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A detecção de vieses na reação de PCR é frequentemente documentada na literatura (seção 1.4). Em amostras complexas, diversos fatores podem influenciar na amplificação preferencial, que ocorre quando DNAs de diferentes organismos são amplificados simultaneamente e a porcentagem de cada DNA não é conservada após a reação (KANAGAWA, 2003; POLZ; CAVANAUGH, 1998). Suzuki e Giovannoni (1996) observaram que amplificação preferencial é ocasionada pela taxa de eficiência que cada molde possui intrinsecamente, ocasionada pela variação da porcentagem de guanidina e citosina (G+C) dos diferentes DNAs. Quanto maior essa concentração maior será a energia necessária para a desnaturação do DNA. Quando DNA com diferentes eficiências de amplificação estão presentes em uma mesma reação, os substratos (iniciadores e DNTPs) são consumidos competitivamente na duplicação de cada fragmento de DNA. Assim, a porcentagem de DNA com pouca eficiência de amplificação (altas concentrações de G+C) no produto de PCR é diminuída com a progressão dos ciclos de PCR (DUTTON et al., 1993; REYSENBACH et al., 1992). Outras técnicas para minimizar os vieses de PCR causados por moldes estruturalmente heterogêneos na mistura incluem a emulsificação da reação de PCR com óleo de silicone (HORI et al., 2007) e a redução do número de ciclos na reação de PCR (SUZUKI, GIOVANNONI, 1996; WILSON, BLITCHINGTON, 1996; WHITFORD et al., 1998). Diferenças entre os consórcios de DNA derivadas da amplificação com 10 ciclos de PCR demonstraram que o número de ciclos está relacionado à diversidade e riqueza da população amostrada. A redução no número de ciclos de PCR apesar de acarretar em menor amplificação do DNA ocasiona, em contrapartida, uma diminuição dos vieses de PCR. A comparação entre bibliotecas geradas de misturas de mesma composição de cDNAs amplificadas com 10 e 30 ciclos revelou que a diminuição de ciclos de PCR proporciona maior manutenção da proporção relativa de cada molde na mistura, até mesmo para aqueles com baixa representatividade (10% da amostra).

5.2.4 Análise do sequenciamento de nova geração para bibliotecas artificiais submetidas à amplificação por PCR com 10 e 30 ciclos

Para efeitos comparativos com os resultados obtidos pela técnica de clonagem (seção 5.2.3) e para avaliar se a quantidade de clones analisados 105

foi satisfatória para a representatividade, os consórcios artificiais montados com o extrato de RNA foram submetidos à amplificação por PCR padrão utilizando a Taq DNA pol. com o programa padrão em 10 e 30 ciclos e sequenciados através da plataforma MiSeq. Foram realizadas análises por sequenciamento com os mesmos micro-organismos utilizados na clonagem, mantendo inalterada as proporções das misturas. E para avaliar a reprodutibilidade dos resultados um segundo consórcio artificial foi utilizado (Tabela 3). Com o intuito de gerar um resultado mais apurado, foi adicionado o consórcio com a proporção 8:4:1, alterando a proporção dos micro- organismos levando em consideração o teor de G+C do rRNA16S. Primeiramente, foi avaliado o uso de diferentes bancos de dados (SILVA e GreenGenes), foi observado que não houve variações significativas na alocação de sequências de fragmentos das espécies de organismos entre os bancos de dados avaliados (Tabela 8). Assim como foi observado nos resultados obtidos com clonagem (seção 5.2.3), os consórcios artificiais montados com B. subtillis, S. aureus e P. aeruginosa submetidos a PCR com 10 e 30 ciclos de amplificação apresentaram alteração na proporção de amplicons dos membros da população em relação a proporção de moldes esperado (Figura 26). As misturas contendo os moldes em proporções iguais (1:1:1; Figura 26 B) apresentaram alterações mais significativas em relação ao esperado quando comparado as outras misturas. As misturas 1:8:1, 1:4:8 e 8:4:1 amplificadas com 10 ciclos de PCR resultaram na proporção próxima ao esperado (Figura 26 A e C). A mistura de rRNA dos micro-organismos B. subtilis, K. pneumoniae e B. cepacia amplificada com 30 ciclos de PCR, resultou em maior disparidade em relação a mistura submetida à amplificação com 10 ciclos de PCR. Na comparação somente entre as variações dos consórcios submetidos a 10 ciclos e analisados por ARDRA e MiSeq foi observado a maior disparidade nos resultados obtidos por sequenciamento de nova geração (Tabela 7 e 8), isto pode ter ocorrido devido a etapa de PCR com 15 ciclos intrínseco ao protocolo do kit TrueSeq (seção 4.14.2). Este viés pode ser contornado utilizando kits de preparo livre de PCR. Com o resultado satisfatório da amplificação por sub-ciclagem obtido com os organismos individuais (Figura 23 D), foi avaliado a capacidade do programa de amplificação sub-ciclagem junto com a Taq Platinum em amplificar de forma igualitária os consórcios artificiais compostos por cinco micro-organismos. Foram utilizadas as misturas 1:1:1:1:1, 1:8:1:8:1, 8:1:8:1:8 e 8:4:1:1:8 amplificadas com o programa padrão (10 ciclos) e sub-ciclagem (10 e 30 ciclos). Foi observado um efeito sinérgico 106

na manutenção da proporção dos consórcios com a utilização de uma polimerase de alta fidelidade junto do programa de sub-ciclagem utilizando poucos ciclos de amplificação (Figura 27). Esta melhora reduziu a disparidade de amplificação em relação ao teor de G+C do rRNA 16S de cada membro dos consórcios. Apesar da significativa melhora dos resultados de rendimento em relação ao esperado para as misturas contendo misturas desiguais de RNA total, o consórcio 1:1:1:1:1 permaneceu sendo a mistura com a maior alteração de proporção (Figura 27 A). Ahn et al. (2012), observaram que a redução do número de ciclos de PCR manteve a precisão da estimativa da riqueza microbiana em comunidades artificiais. Além disso, o aumento do número de ciclos de PCR também contribuiu com o aumento de formação de quimeras. A redução do número de ciclos de PCR diminui a quantidade de produto de PCR, entretanto é recomendado a utilização de programas de amplificação com baixos ciclos, mantendo a proporção original dos moldes heterogêneos de uma amostra com alta complexidade de micro-organismos.

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Tabela 8 - Consórcios artificiais submetidos à 10 e 30 ciclos de amplificação por PCR, sequenciados por MiSeq e analisados utilizando diferentes bancos de dados. A = 16S Metagenomics App, B = SILVA 97%, C= GreenGenes 97% e D = GreenGenes 99%. E = Proporção esperada, O = Proporção observada, V = Variação entre o esperado e o obtido.

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Figura 26- Porcentagem de predominância dos consórcios montados com extratos de rRNA de culturas puras de P. aeruginosa, S. aureus e B. subtilis nas proporções de 1:1:1, 8:4:1 e 1:8:1. Submetidos à PCR de 10 e 30 ciclos e analisados por sequenciamento no equipamento MiSeq. * = Teor de G+C. 109

110

:1:1:1, :1:1:1,

com 10 ciclos. E analisados por sequenciamento de nova de por analisados ciclos. comE sequenciamento 10

padrão

ciclagem com 10 e 30 ciclagem10 ciclos e e com

orcentagem de rendimento obtido nos consórcios artificiais montados com extratos de rRNA de culturas puras nas proporções 1:1 nas puras proporções extratos de montados nos de com rRNA consórcios artificiais culturas rendimentode obtido orcentagem

1:8:1:8:1, 8:1:8:1:8 e 8:4:1:1:8. Submetidos a PCR sub PCR 8:4:1:1:8.a 1:8:1:8:1, Submetidos 8:1:8:1:8e de geração.G+C (*) Porcentagem = Figura 111

Embora os micro-organismos testados terem apresentado a eficiência de síntese da 2º fita correspondente ao teor de G+C (Figura 23 A e 24 A), as misturas amplificadas com 10 ciclos de PCR padrão e analisados por clonagem (seção 5.2.3) não apresentaram o mesmo nível de eficiência para as três espécies utilizadas. Entretanto, as significativas alterações nas misturas amplificadas com 30 ciclos indicam que o teor de G+C pode interferir negativamente com a progressão dos ciclos de PCR. É importante ressaltar que as alterações de proporção nos ensaios com 30 ciclos de PCR não seguiram um padrão consistente. Por exemplo, na amplificação do consórcio de rRNA misturada na proporção 1:1:1 os amplicons de P. aeruginosa (54% de G+C) sofreram forte redução enquanto os de S. aureus (51% de G+C) foram amplificados preferencialmente. O mesmo ensaio com a mistura 1:8:1 resultou em aumento da proporção de P. aeruginosa e redução drástica na proporção de S. aureus (Tabela 7). Estes dados demonstraram que a redução em 10 ciclos de PCR permitiu a detecção de todos os membros dos consórcios e manteve a proporção dos membros dos consórcios o mais próximo ao original. Como o observado por Almeida (2009), a aplicação da técnica de clonagem em consórcios de cDNA não interfere na alteração da proporção dos moldes, demonstrando que as etapas de RT-PCR são as mais críticas na manutenção das proporções dos moldes. Assim como observado na síntese da 2ª fita de DNA do complexo cDNA:DNA (Figura 23 e 24) e na análise dos consórcios pela técnica de ARDRA (Tabela 7), os resultados obtidos com o sequenciamento de nova geração mostraram que os micro- organismos com menor porcentagem de G+C (Staphylococcus aureus e Burkholderia cepacia) e o de maior porcentagem (Bacillus subtilis), mantiveram as respectivas eficiências de amplificação (Figura 26). Também foi observado que o uso de um programa de sub-ciclagem de PCR junto com a redução dos ciclos de amplificação aumentou a eficiência de manutenção da proporção dos micro-organismos dos consórcios analisados em relação ao programa padrão (Figura 27). Isto mostra que, as variações das proporções dos moldes dos consórcios artificiais ocorreram exclusivamente na etapa de PCR. Os mecanismos de interferência da PCR em reações contendo misturas de moldes descritos na literatura incluem: a formação de DNA quimérico a partir de amostras contendo misturas de DNA, moléculas de diferentes origens pode formar duplex em regiões de sobreposição e conservadas, levando à amplificação de moléculas hibridas (LIESACK et al., 1991; MEYERHANS et al., 1990; WANG, 1997); moldes heterogêneos com estruturas secundárias contendo 112

diferentes teores de G+C, o que levaria a baixa eficiência de amplificação para os moldes contento alto teor de G+C, devido a necessidade de maior demanda de energia para a desnaturação (KANAGAWA, 2003; PALLANSCH et al., 1990; POLZ; CAVANAUGH, 1998; SARKAR et al., 1990; SUZUKI; GIOVANNONI, 1996). Estes mecanismos de interferência impedem que os produtos da amplificação possam ser utilizados para quantificar a abundância de espécies em uma amostra complexa (FARRELLY et al., 1995).

5.3 Avaliação da adição de aditivos na PCR

Durante a amplificação de misturas de fragmentos de DNA, a variação no teor de G+C e a presença de contaminantes co-extraídos podem interferir na amplificação igualitária dos moldes. Existem diversos aditivos com modo de ação distintos que podem ser adicionados na reação com o intuito de minimizar os erros ocasionados durante a PCR (Tabela 1). Foi avaliado a adição de combinações e concentrações de aditivos de PCR que obtiveram os melhores resultados nos trabalhos descritos por Seifi (2012), Farell and Alexandre (2012), Jensen (2010) e Lajin (2013; Tabela 4), visando o melhoramento da amplificação dos cDNA obtidos pela extração de RNA de lodo de esgoto ativado. Os extratos purificados de RNA obtidos das cinco espécies bacterianas foram quantificados no equipamento Nanodrop® ND-1000™ (Thermo Fischer Scientific) e então realizada a mistura na proporção de 1:1:1:1:1 (20:20:20:20:20μg). As amostras foram preparadas adicionando uma alíquota de 78μg de RNA do consórcio artificial em 200mg de lodo de esgoto autoclavado. Para a análise, foram utilizados: consórcios artificiais (constituintes com Enterococcus sp., Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) como controle positivo; consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado (evitando a interferência de RNA provenientes da amostra ambiental; como explicado na seção 5.1.4), para avaliar a interferência da amostra de lodo ativado qualitativamente e quantitativamente na recuperação das sequências adicionadas; e lodo de esgoto autoclavado como controle negativo. Para efeito comparativo, todas as variações de PCR foram testadas com RNA previamente extraído com os protocolos F e G. Nas amplificações utilizando a temperatura de anelamento normal (62,5 ºC), as reações de PCR com as combinações C, F, G e H apresentaram os melhores resultados para ambos dos 113

protocolos testados (Figura 28 e 29). A combinação A apresentou maior eficiência de amplificação somente para o protocolo F. Esse experimento foi repetido (com exceção da combinação C) utilizando a diminuição da Tm em 2.5 ºC em relação ao normal (Figura 30), onde foi observado um aumento na intensidade das bandas, em consonância com o relato de LAJIN (2013).

Figura 27 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo as 8 variações de PCR testadas para as cDNAs obtidos com a extração pelo protocolo F. 1 = Consórcio artificial (controle positivo), 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado, 3 = Lodo de esgoto autoclavado (controle negativo).

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Figura 28 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo as 8 variações de PCR testadas para as cDNAs obtidos com a extração pelo protocolo G. 1 = Consórcio artificial (controle positivo), 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado, 3 = Lodo de esgoto autoclavado (controle negativo).

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Figura 29 - Gel de agarose 1% submetido a corrida eletroforética contendo as variações de PCR testadas na Tm em 2.5 ºC menor em relação ao normal, extraídos com o protocolo G. 1 = Consórcio artificial (controle positivo), 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado, 3 = Lodo de esgoto autoclavado (controle negativo).

Como descrito na seção 1.4, umas das principais etapas que distorcem a abundância representativa no estudo com bibliotecas genômicas para sequenciamento é durante a amplificação por PCR. Um problema recorrente na montagem de bibliotecas de extratos de RNA ou DNA de culturas mistas é a formação de quimeras, que ocorre quando há formação de sequências híbridas geradas a partir de um produto de PCR incompleto, que atuam como iniciadores para sequencias heterólogas. Essas sequências híbridas podem ser interpretadas como um novo 116

micro-organismo, introduzindo dados errôneos nas análises de metagenômica, uma vez que essas anomalias não podem ser detectadas anteriormente à etapa de sequenciamento. O aumento no tempo de desnaturação e a diminuição da rampa de temperatura durante os ciclos de PCR em conjunto com o uso de betaína e de uma polimerase de alta fidelidade melhora a amplificação das regiões ricas em G+C (AIRD, 2011; STEVENS, 2013). Para avaliar se as adições de aditivos podem distorcer a abundância de micro- organismos em uma amostra, foi adotado a diminuição da rampa de temperatura em 1 ºC/s durante a amplificação. Esta prática reduz consideravelmente a formação de quimeras produzidas na amplificação de sequências com alta concentração de G+C dos moldes de DNA (KEBSCHULL; ZADOR, 2015; STEVENS et al., 2013). As PCRs dos consórcios artificiais misturados ao lodo autoclavado que apresentaram amplificação, foram submetidos a digestões por enzimas de restrição HhaI e RsaI em conjunto, como descrito na seção 4.10 Após o ARDRA foram observadas diferenças nas intensidades relativas e no padrão de perfil das bandas em um mesmo perfil na utilização do protocolo F (Figura 31; marcador molecular de 50 pb - Invitrogen Life Technologies). Para correlacionar o padrão de perfil gerado com os membros do consórcio utilizados, foram realizados ARDRA com os extratos de RNA dos micro- organismos em individual. Foi observado que a banda de ARDRA adicional (Figura 31; destaque) é de origem do RNA da Staphylococcus aureus (Figura 32; destaque).

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Figura 30 – Gel de ARDRA 4% feito com as enzimas de restrição HhaI e RsaI para as duas metodologias de extração de RNA e com rampa de temperatura no termociclador em 1 ºC/s. 1 = Consórcio artificial (controle artificial), 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado.

Figura 31- Gel de ARDRA 4% feito com as enzimas de restrição HhaI e RsaI em conjunto para as bactérias separadas no termociclador em 1 ºC/s.

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Devido à falta de uma conclusão consistente do viés após a primeira avaliação dos produtos de PCR dos consórcios artificiais por ARDRA (Figura 31), testes foram realizados utilizando os extratos de RNA obtidos do consórcio artificial + lodo fresco e armazenado (-80°C por 1460 dias), ambos autoclavados. Estes extratos foram submetidos à amplificação com a combinação A de aditivo de PCR e com as duas enzimas polimerases utilizadas neste trabalho. As amplificações realizadas para os extratos de lodo fresco e armazenado apresentaram eficiência de rendimento similares para ambas das enzimas polimerases testadas (Figura 33 e Tabela 9).

Figura 32 - Gel de agarose 1% submetidas a corrida eletroforética contendo as amplificações geradas por PCR utilizando as enzimas Taq DNA polimerase e Taq Platinum. 1 = Consórcio artificial (controle positivo), extraído com Protocolo G; 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado extraído com Protocolo G; 3 = Consórcio artificial (controle positivo), extraído com Protocolo F; 4= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado extraído com Protocolo F.

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Tabela 9– Quantificações das amplificações geradas por PCR utilizando as enzimas Taq DNA polimerase e Taq Platinum. 1 = Consórcio artificial (controle positivo), extraído com Protocolo G; 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado extraído com Protocolo G; 3 = Consórcio artificial (controle positivo), extraído com Protocolo F; 4= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado extraído com Protocolo F.

Consórcio + Lodo Armazenado -80°C (Taq DNA pol.) Consórcio + Lodo Armazenado -80°C (Taq Platinum) 1 2 3 4 1 2 3 4 DNA (ng/uL) 1630 1431 1820 1412 2154 2267 2643 2024 260/280 nm 1 1 1 1 1,5 1,3 1,5 1,2 260/230 nm 1,8 1,7 1,7 1,7 2 1,8 2,1 1,5

Consórcio + Lodo Fresco (Taq DNA pol.) Consórcio + Lodo Fresco (Taq Platinum) 1 2 3 4 1 2 3 4 DNA (ng/uL) 1248 1366 1688 920 1355 1300 1572 880 260/280 nm 1 1 1 1 1,6 1,5 1,7 1,2 260/230 nm 1,4 1,7 1,5 1,4 1,8 1,8 1,6 1,7 *A razão 260/280 nm tem indicativa de pureza para RNA em ~2,0 * A razão 260/230 nm tem indicativa de pureza com valores acima do 260/280 nm em ~2,0 - 2,2

Após a digestão dos produtos de amplificação feita com as enzimas de restrição HhaI/RsaI e MspI/HaeIII, foi observado sinais de interferência dos contaminantes co- extraídos na atividade das enzimas de restrição (Figuras 34 e 35). Este viés pode ser observado com mais clareza nas digestões em que o produto de PCR foi amplificado com a enzima Taq DNA polimerase (Figura 34 A). Ao repetir esse experimento com o lodo fresco foi observado o mesmo viés também nas amplificações realizadas com a enzima Taq Platinum polymerase, mostrando que os contaminantes interferem nas enzimas de digestão mesmo com o uso de uma polymerase de alta fidelidade (Figura 35 B). Independente do período de armazenamento do lodo, os ácidos húmicos podem inibir a ação das enzimas de restrição, comprometendo o perfil de “fingerprinting”, levando ao erro de interpretação da comunidade microbiana ou até mesmo a impossibilidade de uso desta técnica em amostras ambientais. Umas das hipóteses para explicar a ocorrência da banda adicional no extrato obtido pelo protocolo G (Figura 31) seria a alta eficiência do método na lise, já que diferentes métodos de lise utilizados em protocolo de extração resultam em diferentes níveis de eficiência no rompimento da parede celular de bactérias gram positivas, distorcendo as quantidades originais dos representantes do consórcio artificial, interferindo nas análises baseadas em digestão enzimática (STARK, 2014; ZHANG, 2011). Porém, como ambos dos protocolos testados utilizam método físico e químico 120

de lise, a inconsistência no perfil de ARDRA para o protocolo F pode ter ocorrido devido à influência de ácidos húmicos ainda presente após a extração (ressuspensão amarelada), sendo que este contaminante não foi observado para o protocolo G (Figura 36).

Figura 33 - Gel de ARDRA 4% contendo os produtos amplificados e digeridos com (A) Taq DNA pol e MspI/HaeIII. E (B) Taq Platinum e HhaI/RsaI. Para as extrações contendo lodo armazenado (1460 dias) autoclavado. 1 = Consórcio artificial (controle positivo); 2 = Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado.

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Figura 34 - Gel de ARDRA 4% contendo os produtos amplificados e digeridos com (A) Taq DNA pol. e MspI/HaeIII. E (B) Taq Platinum e HhaI/RsaI. Para as extrações contendo lodo fresco autoclavado. 1 = Consórcio artificial (controle positivo); 2 = Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado.

Figura 35- Ressuspensão com água ultrapura da extração após extração feita com protocolo G e F.

122

Substâncias húmicas inibem a atividade da enzima polimerase e desnaturam ácidos nucleicos pela ligação de seus grupos fenólicos a amidas ou, quando oxidados, formam quinonas que se ligam covalentemente a ácidos nucleicos, sequestrando o DNA da reação de amplificação (ROBE et al., 2003; ROH et al., 2006). Baixas concentrações de ácidos húmicos (≥ 5 ng/µL) são suficientes para interferir nas reações de RT e PCR (WANG; FUJII, 2010). Os ácidos húmicos também podem interferir na digestão do DNA feita pelas enzimas de restrição, sendo que esta interferência varia para cada tipo de enzima (TEBBE; VAHJEN, 1993). Foi observado que a atividade das enzimas de digestão MspI, HhaI, HaeIII e RsaI são fortemente inibidas na presença dos contaminantes co-extraídos de lodo ativado fresco pelo protocolo F (Figuras 31, 34 e 35). Apesar do protocolo G ter apresentado menor rendimento de PCR em relação ao protocolo F (Figura 8), o protocolo adaptado neste trabalho, mostrou ser mais eficiente em termos de eliminação de contaminantes da amostra extraída (Figura 36). Quando utilizado uma Taq polimerase de alta fidelidade na amplificação por PCR, o protocolo G foi capaz de conferir consistência e intensidade das bandas entre as réplicas nos perfis de ARDRA (Figura 34 B e 35 B), apresentando maior confiabilidade para extrações de RNA de amostras de lodo ativado fresco. Isto é, em análises de amostra complexa real, a utilização do protocolo G pode fornecer um extrato de RNA livre de contaminantes, possibilitando o emprego da técnica de ARDRA, assim como outras técnicas moleculares “downstream” que tenham como foco a fidedigna característica filogenética e/ou identificação dos micro- organismos metabolicamente ativos. Outro fator que credencia o protocolo G foi a capacidade da ótima recuperação de RNA do consórcio artificial em contato com os contaminantes co-extraídos (Figura 37) e na preservação da integridade do RNA (Figura 9), mostrando a possibilidade de recuperação da informação filogenética na aplicação em outras amostras complexas.

123

Figura 36 - Gel de RNA submetido a corrida eletroforética dos produtos de extração utilizando os protocolos G e F. 1 = Consórcio artificial (controle positivo); 2= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado; 3 = Consórcio artificial (controle positivo); 4= Consórcio artificial + lodo de esgoto autoclavado.

Na avaliação de aditivos de PCR, o uso das combinações A, C, F e H junto da diminuição da temperatura de anelamento para 1ºC/s, melhoraram a amplificação por PCR para a amostra de lodo ativado. Foi concluído que a etapa de extração possui fundamental importância para a manutenção da proporção dos moldes de RNAs de uma amostra. Mesmo utilizando programas de amplificação otimizados e aditivos, os contaminantes co-extraídos podem influenciar negativamente em todo o processo de análise molecular, até mesmo em análises que empregam o uso de digestão por enzimas de restrição.

124

5.4 (3) Padronização da etapa de clonagem e ARDRA

Mesmo com o advento da tecnologia de sequenciamento de nova geração, a técnica de clonagem e ARDRA ainda é utilizada para a análises de comunidades bacterianas (CHANDRA et al., 2010; NERAL et al., 2015; RATHOD; ARCHANA, 2013). Porém, para análises em amostras complexas, a aplicação desta técnica requer uma etapa de padronização, com o intuito de atingir a cobertura satisfatória da biodiversidade e para realizar os agrupamentos dos clones utilizando menos etapas de ARDRA possível. Foram montadas de três bibliotecas a partir de uma mesma amostra com premissa de averiguar a reprodutibilidade do procedimento. Na realidade, pesquisadores raramente analisam mais de uma biblioteca por amostra complexa, ficando implícita a hipótese da reprodutibilidade de análise entre bibliotecas.

5.4.1 Análise de clones obtidos por método de extração de rRNA de lodo ativado

Após a extração de RNA de uma única amostra de lodo e à amplificação do rRNA 16S por RT-PCR, foi realizada a clonagem em vetor plamidial e transformado em bactérias competentes. Através da técnica “blue-white screening” que consiste na seleção de colônias recombinantes (as quais possuem o inserto), foram montadas três bibliotecas com 259, 271 e 267 clones, respectivamente. A técnica de clonagem revelou que há uma grande diversidade de indivíduos metabolicamente ativos na amostra e que não há predominância de poucos grupos de organismos ativos (Figura 38). Estes resultados atestam a possibilidade de utilização do método e comprovam a eficiência do uso com amostras de lodo ativado.

125

Figura 37- Gel de agarose 4% com os diferentes perfis de restrição de amostras de cDNAs clonados oriundos de lodo ativado digeridas com as enzimas de restrição MspI e HaeIII em conjunto. M= marcador 50 pb (Fermentas). A= biblioteca 1, B= biblioteca 2, C= biblioteca 3.

5.4.2 Análise em géis de ARDRA utilizando enzimas em conjunto

Para minimizar o número de clones a serem identificados por sequenciamento, utilizamos a técnica de ARDRA para agrupar os clones com mesmo perfil de digestão. Foram utilizadas enzimas de restrição em conjunto com intuito de diminuir o custo e as etapas laboratoriais das análises por ARDRA. A estratégia adotada para identificar organismos numericamente dominantes nestas bibliotecas foi submeter os amplicons de cada clone inicialmente a uma digestão com a combinação de enzimas de restrição 126

Msp I e Hae III, que produziu perfis de bandas bastante diversificados e bem discerníveis entre si (ARDRA1; Figura 38). A técnica de double digest tem por finalidade o uso de duas enzimas de restrição combinadas em uma única reação para minimizar as etapas laboratoriais. O uso de três ou mais enzimas de restrição em conjunto não é recomendado devido (1) ao limite máximo exigido de 5% de glicerol em cada reação, que pode inibir a atividade da enzima e (2) a alta fragmentação dos amplicons, pois a resolução em gel de agarose não é ideal para fragmentos pequenos de DNA (≤ 200 pb; Figura 38). A alta fragmentação pode gerar perda de informação filogenética em sistemas de detecção por eletroforese devido ao baixo poder de resolução do gel (TIEDJE et al., 1999). A estratégia de identificação do grupo de clones que seriam analisados mais detalhadamente foi baseada na hipótese de que seria razoável assumir que padrões oriundos de organismos metabolicamente mais ativos deveriam estar representados em proporção maior nas bibliotecas. Os padrões foram então classificados pelo critério de número de ocorrências nas bibliotecas (Figura 39).

127

Representação de todos os perfis clonais obtidos após a primeira corrida de ARDRA feita com as enzimas de restrição MspI e feita restrição com MspI ARDRA de as primeiraclonais enzimas corrida apósde obtidos a os perfis todos de Representação

Figura HaeIII.

128

5.4.3 Reprodutibilidade entre bibliotecas de lodo ativado

O objetivo da análise das bibliotecas é a identificação dos organismos ativos, ou seja, daqueles que contêm uma quantidade maior de ribossomos na célula. O rRNA destes organismos deveria então, ocorrer com maior frequência no extrato de rRNA do biofilme, o que se traduziria em um maior número de clones com a sequência característica do rRNA destes organismos nas bibliotecas. Assim, foi necessário definir um critério de corte que permitisse recuperar todos os clones dominantes de interesse sem expandir demasiadamente o espaço amostral. O critério de corte que estabelece a frequência de detecção de clones nas bibliotecas para identificar os organismos de maior atividade foi definido após o agrupamento de todos os clones de ARDRA1. O critério foi elaborado com base na proporção (%) dos membros de um clone na população geral de clones da biblioteca. Esse procedimento tem como objetivo selecionar os perfis numericamente mais representativos dentro da amostra, que, em tese, seriam representativos dos organismos metabolicamente dominantes na comunidade. Na tabela 10 podemos observar em um valor percentual de ocorrência, na aplicação do critério de corte em 4%, há uma perda de representatividade de aproximadamente 50% (6 grupos) em comparação com o critério de corte em 3% (12 grupos). Linhas de corte em 1% (20 grupos) e 2% (16 grupos) se revelaram pouco restritivo, pois acabavam incorporando grupos de clones contendo baixo número membros. Adotamos então, o critério de corte de 3% como o adequado para análise das bibliotecas. Na figura 40 são demonstrados os perfis que apresentaram frequência ≥ 2%, ≥ 3% e ≥ 4% após a primeira digestão (ARDRA1).

129

Tabela 10 - Aplicação do critério de corte para análise das bibliotecas montadas.

Bibliotecas 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Perfis Clonais 1% 2% 3% 4% D • • • • • • • •

E • • • • •

I • • • •

P • • • • • •

Q • • • • S • • • T • • Z • • Y • • • FF • • • • • • • • • • • • GG • • • • • • • • • • HH • • • • • • JJ • • • •

KK • • • • • • • • • • • •

PP • • • •

QQ • • • • • • • • •

RR • • • • • • •

SS • • ZZ • • • • • • • • • • • •

YY • • • • • • • • • • • •

WW • • • • • • • III • • •

KKK • •

QQQ • • •

VVV • •

Total 19 16 18 17 13 16 11 8 10 6 5 5

130

Figura 39- Comparação de clones entre bibliotecas de lodo. Número de clones com mesmo perfil de restrição com frequência ≥ 2%, 3% e 4% presentes nas bibliotecas 1, 2 e 3 das amostras de lodo ativado.

5.4.4 Homogeneidade dos grupos de ARDRA formados após a primeira etapa de digestão

A resolução na análise de ARDRA é limitada aos perfis produtos de digestão, o que ainda é muito distante da resolução obtida com o sequenciamento completo de uma banda do gel. Para analisar a consistência interna dos fragmentos de cDNA alocados aos perfis com frequência ≥ 3% nas três bibliotecas, todos os clones destes perfis foram submetidos a uma segunda digestão com as enzimas de restrição RsaI e HhaI em conjunto (ARDRA2). Se todos os clones agrupados em um grupo após a primeira digestão fossem da mesma espécie, os perfis de ARDRA da segunda digestão deveriam ser todos similares. Porém não foi este o resultado obtido após a segunda digestão, que produziu por vezes, grande diversidade de perfis para cada grupo de ARDRA1 (ARDRA2; Figura 41). O número de perfis que igualou ou ultrapassou o critério de corte de 3% da população variou entre 1 (grupos E, GG, ZZ, YY), 2 (grupos D e KK) e 5 (grupo FF). Os grupos de ARDRA1 I, P, HH, PP, QQ, RR 131

e WW não apresentaram nenhum perfil de ARDRA2 com frequência ≥ 3% (dados não mostrados). O ARDRA2 foi realizado com a totalidade de clones das três bibliotecas para cada um dos grupos montados com frequência ≥ 3% no ARDRA1.

Figura 40- Perfis clonais obtidos por ARDRA2 (RsaI e HhaI em conjunto) dos clones agrupados em ARDRA1. A linha pontilhada representa o critério de corte ≥ 3%. * O número de indivíduos foi limitado a 20 para melhor representação.

Como os resultados mostrados não foram consistentes na determinação dos agrupamentos de clones (Figura 41), foi necessário realizar uma digestão adicional dos grupos com frequência ≥ 3% de ARDRA2, desta vez com a enzima de restrição Bhs1236I. A fragmentação adicional de clones em ARDRA3 foi muito pequena (Anexo 2) em 12 dos 14 grupos de ARDRA2 foram gerados no máximo dois perfis diferentes em ARDRA3, sendo um dos perfis fortemente dominante (Tabela 11). 132

No caso dos grupo FF(11) o perfil mais comum agregou cerca de 70% dos clones, enquanto que no grupo ZZ(5), o perfil mais numeroso em ARDRA3 representou 55% dos clones do grupo. Estes resultados indicam que são necessárias duas digestões sequenciais, no mínimo, para obter grupos homogêneos para sequenciamento, sendo recomendável uma digestão adicional com uma quinta enzima para a confirmação da homogeneidade dos grupos. As identificações filogenéticas para os perfis dominante e distinto foram descritas na seção 5.3.5.

Tabela 11 - Variação dos perfis clonais que estiveram ≥ 3% da amostra de lodo ativado.

Clones Mesmo perfil Perfil distinto Total de clones (Dominante) (X) D (2) 8 7 1 D (3) 8 8 - E (1) 8 7 1 FF (1) 35 31 4 FF (2) 8 8 - FF (5) 39 37 2 FF (11) 10 7 3 FF (12) 15 14 1 GG (1) 8 8 - KK (1) 32 30 2 KK (3) 16 16 - ZZ (5) 11 5 6* YY (1) 8 7 1 AAA (4) 16 16 - (*) Perfis que diferenciaram não somente do grupo Ok como dentro dele mesmo.

A curva de rarefação das bibliotecas 1, 2 e 3 (Figura 42) demonstra cobertura somente parcial da biodiversidade em cada biblioteca individual. O agrupamento de todos os resultados das bibliotecas em uma única curva de rarefação indica que uma cobertura de biodiversidade muito boa pode ser obtida para a amostra analisada com uma biblioteca de cerca de 500 clones. Resultado similar foi obtido com o programa estatístico EstimateS (COLWELL, 2006) como segundo método alternativo independente para análise dos dados (dados não mostrados). No EstimateS são 133

computados o número de unidades de amostragem na amostra (T), o total de indivíduos em todas as amostras (N) e o número de espécies das amostras agrupadas, dada a amostra de referência (Mao Tau). Na figura 43 estão indicados os perfis de ARDRA que estiveram ≥ 3% após a terceira digestão em relação ao número total de clones analisados.

Figura 41- Curvas de acumulação de espécies obtidas da análise das três bibliotecas de clones construídas a partir de RNA extraído de lodo ativado.

Curva de Rarefação 70

60 Biblioteca 1 50 Biblioteca 2 40 Biblioteca 3 30 Bibliotecas unidas

20 Número de espécies (E) novas de espécies Número 10

30 60 90

390 570 780 120 150 180 210 240 270 300 330 360 420 450 480 510 540 600 630 660 690 720 750 810 840 Número de clones (N)

134

Figura 42- Representação de todos os clones obtidos de amostra de lodo ativado e os perfis que estiveram ≥ 3%, em relação ao total de clones analisados nas 3 bibliotecas.

2% 1% Total de Clones 1% 2% 1% 4% Total do Perfil D (2) Total do Perfil D (3) 1% 4% Total do Perfil E (1) 4% Total do Perfil FF (1) 1% 1% 1% Total do Perfil FF (2) Total do Perfil FF (5) Total do Perfil FF (11) Total do Perfil FF (12) Total do Perfil GG (1) Total do Perfil KK (1) Total do Perfil KK (3) Total do Perfil YY (1)

O agrupamento AAA (4) apresentou sua frequência ≥ 3% (Tabela 11) e foram sequenciados dois indivíduos clonais (duplicata), porém o resultado mostrou que apesar desses clones apresentarem UFC brancas o fragmento inserido no plasmídeo não era proveniente do DNA 16S extraído das amostras, sendo de um tamanho inferior aos 1500 pb. Este viés fez com que o perfil clonal obtido nas etapas de ARDRA que apresentaram fragmentos de tamanho inferior a 150 pb fossem descartados, isto é, todo o agrupamento AAA.

5.4.5 Identificação dos clones por sequenciamento

A técnica de ARDRA é um procedimento qualitativo de agrupamento de clones de baixa resolução, onde a decisão de classificação de um clone depende do posicionamento de entre x e y bandas no perfil de eletroforese. No sequenciamento, o agrupamento ocorre com base da análise comparativa de sequências de 1500 pares 135

de bases. Para verificar se a homogeneidade de grupos do ARDRA3 também se reflete em homogeneidade de espécies pós-sequenciamento, dois clones do grupo dominante e um com perfil distinto (Tabela 11) foram sequenciados (Tabela 12). Na avaliação dos dois clones de cada perfil dominante, 80% apresentaram similaridade em nível de espécie (D2 e 3; E1; FF1, 5 e 11; GG1; KK1), os grupos FF12 e FF2 apresentaram diferenciação em nível de espécie e ordem, respectivamente. Os clones de perfil distinto do dominante apresentaram filogenia diferente em vários níveis. Apenas o grupo KK1 resultou em mesma espécie, isto foi devido ao critério mais crítico adotado em relação a análise dos géis de ARDRA. Também foram sequenciados todos os indivíduos do agrupamento Q de ARDRA1, interessantemente, 90% dos clones apresentaram semelhança em nível de gênero. Porém, o agrupamento Q foi pertencente ao filo minoritário Bacteroidetes, o que pode ter favorecido a semelhança filogenética no ARDRA1. Além do mais, foi observado que etapas adicionais de ARDRA são primordiais para a fidelidade do agrupamento filogenético. No rRNA 16S de bactérias existem nove regiões hipervariáveis (V1-V9) que são flanqueados por regiões conservadas, permitindo a utilização de iniciadores específicos para a identificação de micro-organismos e análises filogenéticas (CHAKRAVORTY, 2007). Esta característica faz com que essas regiões sejam amplamente utilizadas para a identificação em nível de gênero e espécie. Os dados obtidos nos sequenciamentos foram analisados através dos bancos de dados NCBI (National Center of Biotechnology Information) e RDP (Ribossomal Database Project). As bactérias possuem nove regiões hipervariáveis no rRNA 16S, o que possibilita a identificação de espécies através da análise dessas regiões. Para cada clone foram averiguadas as regiões hipervariáveis V3, V6-V8 e o rDNA 16s completo, os três dados foram comparados entre si para maior confiabilidade dos resultados.

136

Tabela 12 - Filogenia dos clones sequenciados.

Agrupamento OK X D (2) Arcobacter cryaerophilus Arcobacter skirrowii D (2) Dupl. Arcobacter cryaerophilus D (3) Arcobacter cibarus D (3) Dupl. Arcobacter cibarus Haliscomenobacter E (1) Hymenobacter rigui hydrossis E (1) Dupl. Hymenobacter rigui FF (1) Zoogloea caeni Synergistes jonesii

FF (1) Zoogloea caeni

FF (2) Zoogloea caeni

FF (2) Curvibacter delicatus FF (5) Zoogloea caeni Zoogloea resiniphila FF (5) Dupl. Zoogloea caeni FF (11) Acidovorax temperans Hydrogenophaga flava FF (11) Dupl. Acidovorax temperans FF (12) Pseudacidovorax intermedius Azonexus fungiphilus FF (12) Dupl. Acidovorax caeni GG (1) Zoogleae ramigera GG (1) Dupl. Zoogleae ramigera KK (1) Dechloromonas hortensis Dechloromonas hortensis KK (1) Dupl. Dechloromonas hortensis KK (2) Dechloromonas hortensis KK(3) Dechloromonas hortensis KK(3) Dupl. Dechloromonas hortensis KK (4) Leptolinea tardivitalis KK (5) Catenibacterium mitsuokai KK (6) Catenibacterium mitsuokai YY (1) Tolumonas auensis * Aquabacterium ZZ (5) Perlucidibaca piscinae commune Q B11 166 Coprococcus comes Owenweeksia Q B8 205 hongkongensis Q B11 19 Parabacteroides goldsteinii Q B11 159 Parabacteroides goldsteinii Q B11 91 Parabacteroides goldsteinii Q B11 8 Parabacteroides johnsonii Q B8 60 Parabacteroides johnsonii Q B8 103 Parabacteroides merdae Q B8 229 Parabacteroides merdae Q B9 207 Parabacteroides merdae Q B8 22 Sphingobacterium anhuiense

* = clones que apresentaram resultado inconclusivo pelo sequenciamento. X = Sequenciamento do representante com perfil de restrição diferente. OK = Sequenciamento de um representante do subagrupamento que manteve o perfil de restrição. 137

As espécies identificadas por sequenciamento nesse trabalho são comumente vinculadas a amostras de lodo de esgoto ativado. Zoogloea caeni e Zoogloea ramigera são espécies bacterianas encontradas em flocos de lodo ativado, possuem forma celular característica, sendo encontradas incorporadas em matrizes gelatinosas, são aeróbias facultativas e fixadoras de nitrogênio (ROSSELLÓ-MORA, 1995; SHAO, 2009). Dechloromonas hortensis é uma espécie caracterizada por ser (per)clorato- redutora e anaeróbica facultativa, podendo ser encontrada em solos e em ambientes contaminados com clorato ou percloratos. O uso de bactérias (per)clorato-redutoras é uma alternativa mais econômica e rápida para bioremediação em ambientes contaminados (WOLTERINK, 2005). Membros da família Hydrogenophaga são conhecidos por serem quimiolitoautotróficos (usam a oxidação de H2 como fonte de energia e CO2 como fonte de carbono) e frequentemente isolados de amostras de lodo de esgoto ativado (CHUNG, 2007; KIMURA, 2013). Bactérias do gênero Azonexus são fixadoras de nitrogênio associadas a raízes de plantas e isoladas de tanques de aeração para tratamento de esgoto (CHOU, 2008; QUAN, 2006). Acidovorax temperans é encontrada em sistemas de tratamento de esgoto, frequentemente estudada em trabalhos sobre agregação bacteriana e produção de polímeros extracelulares (EHLERS, 2013; HEIJSTRA, 2010). Pseudacidovorax intermedius é uma espécie oxidase e catalase positiva, fixadora de nitrogênio e normalmente encontrada no solo. Membros do gênero Arcobacter são conhecidos por serem patógenos humanos e estando associados a raízes de plantas, solo e estogo ativado (SNAIDR, 1997). Catenibacterium mitsuokai e a Coprococcus comes são associadas à flora intestinal humana. Espécies de bactérias da família Anaerolineaceae foram inicialmente isolados de sistemas tratamento de esgoto, porém, podem ser encontrados em muitos ambientes naturais e artificiais (GREGÓRIE, 2011; YAMADA, 2007). Perlucidibaca piscinae foi inicialmente encontrado em lago eutrofizado (SONG, 2008). Espécies pertencentes à família da Perlucidibaca piscinae (Moraxellaceae), as espécies bacterianas Aquabacterium commune e Hymenobacter rigui são comumente encontrados em água potável (BAIK, 2006; KALMBACH, 1999). Tolumonas auensis pode ser encontrado em sedimentos anóxicos de lagos de água doce (FISHER-ROMERO, 1996).

138

5.4.6 Análise comparativa entre gel de eletroforese e Bioanalyzer dos agrupamentos de clones de lodo ativado

A técnica clássica de separação eletroforética de fragmentos de DNA e RNA em gel de agarose é frequentemente utilizada devido ao baixo custo, pois consiste basicamente na utilização de uma fonte de tensão e uma unidade de eletroforese. Entretanto, o uso da eletroforese para identificar perfis de restrição gerados por ARDRA utilizando enzimas em conjunto (seção 4.10) resultou em dificuldade de análise devido à baixa resolução do gel de agarose para fragmentos de tamanhos aproximados e para fragmentos menores que 200 pb (Anexo 2). Para corroborar resultados dos agrupamentos obtidos na terceira etapa de ARDRA para as bibliotecas de lodo ativado, foram submetidos à análise por eletroforese capilar: • Todos os indivíduos do grupo Q obtidos no primeiro agrupamento de ARDRA e digeridos com as enzimas de restrição Msp I e Hae III em conjunto. Pois na segunda etapa de digestão se diferenciaram entre si, mas no sequenciamento 90% dos clones pertenciam ao mesmo gênero (seção 5.4.5). • E todos os indivíduos do subagrupamento ZZ (5) digeridos com as enzimas de restrição HhaI e RsaI em conjunto. Pois na terceira etapa de digestão os indivíduos apresentaram quatro perfis de restrição diferentes (Anexo 2), mas no sequenciamento os indivíduos pertenciam a espécie (Dechloromonas hortensis). Os fragmentos gerados na digestão com enzimas de restrição foram purificados com kit comercial para DNA e quantificados por Nanodrop (Thermo Fischer Scientific). Os resultados obtidos por Bioanalyzer foram idênticos ao observado em gel de agarose para o grupo Q, porem os padrões de fragmentação obtido para todos os clones do agrupamento ZZ (5) foram diferentes ao observado pelo gel de agarose (Figura 44 e 45).

139

Figura 43- Resultado obtido por Bioanalyzer 2100 com kit DNA 1000 para os clones pertencentes ao grupo Q e agrupamento ZZ (5) submetidos à digestão com enzimas de restrição.

140

Figura 44- Gel de ARDRA 4% contendo os clones pertencentes ao grupo Q e agrupamento ZZ (5) submetidos à digestão com enzimas de restrição.

Para ambos dos grupos (Q e ZZ (5)) os valores obtidos por quantificação foram satisfatórios (dados não mostrados). A divergência dos dados obtidos no agrupamento ZZ (5) pode ter sido ocasionado devido os reiterados descongelamentos da biblioteca de clones para as análises anteriores. Outra possibilidade é o comprometimento da qualidade das enzimas de restrição HhaI e RsaI utilizadas para a digestão do agrupamento ZZ (5). Apesar da análise por Bioanalyzer ser mais dispendioso em comparação a corrida eletroforética, o resultado obtido por este método apresentou melhor resolução para identificação de fragmentos menores que 200 pb.

141

5.5 (4) Classificação Filogenética por Metagenômica da região V3-V5 do rRNA 16S

A plataforma MiSeq da Illumina foi escolhida por duas razões. Primeiro por alcançar o sequenciamento de fragmentos de até 600 pb (paired-end reads), permitindo a análise do fragmento inteiro da região V3-V5, descartando a necessidade de remontagem da biblioteca por ferramentas de bioinformática. E segundo, por gerar menos erros durante a análise de fragmentos contendo homopolímeros em comparação a outras plataformas (LOMAN et al., 2012). Esta vantagem reduz a distorção da comunidade microbiana na análise de consórcios artificiais e em amostras complexas (SALIPANTE et al., 2014). Todas as amostras sequenciadas na plataforma MiSeq foram pré-processados pelo software 16S Metagenomics App (basespace.ilumina.com), que utiliza o Naïve Bayes como algoritmo de classificação taxonômica e o banco de dados GreenGenes. Também, foi utilizado um pré-tratamento manual utilizando o software QIIME, em conjunto com os bancos de dados SILVA (97% de similaridade) e GreenGenes (97% e 99% de similaridade). Os resultados obtidos foram comparados entre si.

5.5.1 Resultado por sequenciamento de nova geração para amostra de lodo de esgoto ativado

O sequenciamento por MiSeq da amostra de RNA de lodo de esgoto ativado extraído com o protocolo G, gerou um total de 1.8 milhões de reads, no qual atingiram a qualidade de leitura em 84%. Cerca de 51% do total de reads foram caracterizados em nível de espécie (Figura 46). De todas as reads identificadas, 86,4% pertenciam ao reino bactéria e 11,2% ao reino vírus.

142

Figura 45- Total de sequências identificadas em níveis de classificação taxonômica para a amostra de RNA de lodo ativado.

100% 1,807,876 1,760,369 1,709,089 1,650,088 1,598,086 1,460,772 80%

60% 956,692

40%

20%

0% Total Classificados de Reads Total Reino Filo Classe Ordem Família Gênero Espécie Nível Taxonômico

A análise por metagenômica da amostra de RNA de lodo ativado mostrou a predominância do filo Proteobacteria (Figura 47, A), apresentando como classes dominantes a Alphaproteobacteria e a Betaproteobacteria com 26% e 20% respectivamente (Figura 47, B). Dentre as Alphaproteobacterias, a Rhizobiales foi a ordem que apresentou maior representatividade com 13% do total de reads, seguido pela Burkholderiales (10%) e a Rhodocyclales (8%), ambas pertencentes a classe Betaproteobacteria (Figura 47, C). A família de maior representatividade foram as Comamonadaceae e a Rhodocyclaceae (ambas com 8% do total de reads; Figura 47, D). Apesar da ordem Rhizobiales ter sido o grupo mais representativo, o membro de maior representação foi o Beijerinckiaceae com somente 4% do total de reads (Figura 47, D). Na comparação dos resultados obtidos entre a metagenômica (Figura 48 A e B) e pela técnica de ARDRA, podemos notar que os membros da classe Alphabacteria não foram observados nos sequenciamentos dos indivíduos agrupados por ARDRA (Tabela 12). Sendo que, para ambos dos experimentos realizados para lodo ativado, foram utilizadas alíquotas pertencentes a mesma amostra. Fredriksson (2013) observaram que, as classes Alphaproteobacteria e Betaproteobacteria são abundantes em lodo ativado. E que os conjuntos de iniciadores denominados “universais” utilizados na PCR afetam substancialmente a comunidade bacteriana, distorcendo o resultado em relação à estrutura, função e dinâmica da comunidade. Ainda é comumente observado o uso de somente um único par de iniciadores em pesquisas com amostras ambientais. Além disso, comparações empíricas indicam 143

que não há um par de iniciadores melhor que outro, sendo necessário determinar qual conjunto de iniciador é o mais adequado para cada amostra ambiental (FREDRIKSSON, et al., 2013; SÁNCHEZ, et al., 2007). Starke (2014) concluiram que, a escolha dos iniciadores pode afetar severamente os resultados obtidos por metagenômica, sendo necessário o uso de mais de um par de iniciador para a completa cobertura da diversidade bacteriana em amostras complexas. O uso dos iniciadores 338F1, 338F2,338F3 e 909R (PINTO; RASKIN, 2012) possibilitou uma cobertura mais abrangente para a amostra de lodo para o filo de maior dominância (Proteobacteria) em comparação ao uso dos iniciadores 27F e 1401R. Dentre as espécies de maior representatividade por metagenômica e pré- processados pelo software 16S Metagenomics App estão a Magnetospirillum bellicus, a Methylocella silvestris e a Dechloromonas hortensis (todas com 2% do total de reads; Figura 48, B).

144

Figura 46- Classificação taxônomica em níveis de filo (A), classe (B), ordem (C) e família (D), obtidos para amostra de lodo ativado pelo software 16S Metagenomics App. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

C D

145

Figura 47- Classificação taxônomica em níveis de gênero (A) e espécie (B), obtidos para amostra de lodo ativado pelo software 16S Metagenomics App. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância. 146

Ao comparar a abundância somente das espécies obtidas pela técnica de ARDRA (Figura 49 A) com o 16S Metagenomics App (Figura 49 B), foi observado que para ambas das técnicas de identificação utilizadas, as espécies com maior representatividade foram a Dechloromonas hortensis e a Zoogloea caeni. Apesar do resultado de metagenômica ter sido gerado pelo software 16S Metagenomics App, o alinhamento de sequências de RNA requer um pré-tratamento manual com o intuito de melhorar a precisão na análise comparativa com os bancos de dados utilizados (GARDNER, 2012).

Figura 48- Comparação da abundância de espécies obtidas pela técnica de ARDRA (A) e 16S Metagenomics App (B) para a amostra de lodo ativado.

147

No resultado obtido para a amostra de RNA de lodo ativado utilizando o QIIME + SILVA (97% de identidade), podemos notar uma redução considerável de OTUs de menor representatividade (outros) tanto em nível de família quanto em gênero (Figura 50 A e B). Mostrando que o uso de filtro de qualidade durante a análise dos dados é imprescindível para melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica. Foi observado a predominância do gênero Acinetobacter (10%), os membros desse grupo possuem características de oxidase negativa, aeróbias estritas e acumuladoras de fosfato, sendo normalmente encontrados em lodo ativado (CARR, et al., 2003; KIM, et al., 1997). Membros pertencentes a este gênero possuem a capacidade de produzir EPS, contribuindo para a formação da estrutura do biofilme (BADAVE; DHANANJAY, 2015; JANG et al., 2016; MEROD; WUERTZ, 2014). Também foi observado que os grupos de maior representatividade nos resultados obtidos por ARDRA e pelo software 16S Metagenomics App (Figura 50 A e B) permaneceram presentes na análise por QIIME+SILVA (97%; Figura 50 B). Na comparação dos resultados obtidos para a amostra de RNA de lodo ativado utilizando o QIIME + GreenGenes 97% e 99% de identidade (Figura 51 A e B, respectivamente) foi observado dominância de membros da família Comamonadaceae, seguido dos gêneros Acinetobacter, Dechloromonas e Zoogloea.

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Figura 49- Classificação taxônomica em níveis de família (A) e gênero (B), obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + SILVA (97%). (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

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Figura 50- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + GreenGenes 97% (A) e 99% (B) de identidade. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

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Bactérias quimio-organo-heterotróficas constituem a maior população em lodo ativado, especialmente os membros pertencentes à família Comamonadaceae. E dentre as bactérias denitrificantes a Aquaspirillum, Azoarcus, Thaurea e Zoogloea spp. são as espécies que predominam no lodo ativado. As bactérias redutoras de ferro, sulfato redutoras, acumuladoras de fosfato, metanotróficas, acumuladoras de glicogênio, nitrificantes e oxidante de enxofre são grupos também encontrados em sistemas de lodo ativado. Bactérias que pertencem ao gênero Zoogloea desempenham um importante papel na formação do floco. Entretanto, apesar do domínio desse grupo em algumas estações de tratamento, existem outros formadores de micro-colônias. Membros da família Comamonadaceae podem produzir EPS, como observado para as espécies Comamonadaceae testosteroni e Acidovorax temperans, ambas encontradas em lodo ativado (EHLERS, 2013; HEIJSTRA, 2010). O EPS tem uma função importante retenção de íons de metais pesados no tratamento de águas residuais e apesar da baixa produção de EPS pela Acidovorax temperans cultivada em laboratório, é possível que em lodo ativado a produção seja maior, contribuindo com a retenção de metais. A composição monossacarídica do EPS pode ser altamente variável entre as espécies formadoras de biofilme, essa variação também pode ocorrer entre cepas de uma mesma espécie em relação as condições do ambiente. A espécie Acidovorax temperans também produz DNA extracelular, no qual é utilizado como elemento estrutural na formação do biofilme. Acreditava-se que, o DNA extracelular encontrado em flocos de lodo ativado era proveniente somente da lise celular, entretanto essa molécula possui função estrutural no biofilme (HEIJSTRA, 2010; SEVIOUR; NIELSEN, 2010). Em lodo ativado não há somente uma espécie capaz de acumular fosfato (OAF – organismos acumuladores de fosfato), estudos sugerem que bactérias pertencentes aos gêneros Dechloromonas, Acidovorax, Zoogloea, e Acinetobacter, possuem essa capacidade metabólica (KAMIKA et al., 2014; OSHIKI, et al., 2008; TU; SCHULER, 2013). Entretanto, Dechloromonas spp. possuem o comportamento de acumular fosfato somente na condição com disponibilidade de nutriente (SEVIOUR; NIELSEN, 2010).

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5.5.2 Estimativa de abundância de espécies por sequenciamento de nova geração utilizando rDNA 16S

Dentro de comunidades microbianas complexas como os biofilmes, existem diversas espécies de bactérias que estão em estados fisiológicos distintos entre si. Assim sendo, o resultado baseado no rRNA 16S de um sequenciamento de nova geração apontando uma espécie como a mais abundante dentro da amostra tendo como base a quantidade de leituras por sequenciamento pode ser equivocado. A técnica molecular mais utilizada para identificação de organismos e comunidades bacterianas são as baseadas no gene rRNA 16S (rrn), devido a qualidade da informação filogenética, procedimento simples e ampla base de dados para informação da sequência. Apesar dessa vantagem, a variação do número de cópias do operon rrn entre os organismos resulta em erros na determinação filogenética, principalmente em amostras complexas, onde existem organismos desconhecidos com números desconhecidos de cópias do operon rrn (CROSBY; CRIDDLE, 2003). O número de operons por genoma bacteriano pode variar entre 1 a 15, bactérias que respondem rapidamente à oferta de nutrientes geralmente possuem maior número de copias do gene rRNA 16S em comparação as espécies que apresentam uma resposta lenta (KLAPPENBACH et al., 2000). Em um único genoma, os operons do gene rRNA16S podem apresentar diferença nas sequências de nucleotídeos. Entretanto, para a vasta maioria das espécies bacterianas, essa divergência é menor que 1% (ACINAS et al., 2004). Essa divergência entre os operons rrn em um único genoma pode gerar erros de interpretação em resultados gerados pela técnica de fingerprinting, caso essa mutação ocorra em um sítio de ligação da enzima de restrição. Para identificar se as bactérias com maior atividade metabólica dentro de uma amostra também são as que estão em maior abundância, foi correlacionado a abundância relativa de cada molde de rRNA 16S com a abundancia relativa de rDNA 16S, levando em consideração do número de genes 16S que cada grupo possui. O número de cópias do 16S para cada gênero encontrado foi estimado pelo rnnDB (The Ribosomal RNA Operon Copy Number Database; www.rrndb.umms.med.umich.edu). 152

O DNA de lodo ativado foi extraído com o protocolo descrito por Rosa (2008, adaptado), tratado com RNAse A e purificado. A amostra foi submetida a PCR com 10 ciclos de amplificação. O resultado obtido por metagenômica para lodo ativado mostrou a predominância dos gêneros Enterococcus, Acidovorax e Achromobacter e da família Enterobacteriaceae (Figura 52 A). Após considerar o número de cópias do 16S para cada gênero encontrado, os gêneros de maior representatividade para lodo ativado foram, Acidovorax, Achromobacter e Enterococcus respectivamente (Figura 52 B). As famílias Enterobacteriaceae e Procabacteriaceae não foram considerados devido à alta variabilidade de cópias do 16S (1 a 8) encontrados nos gêneros pertencentes à essas famílias.

Figura 51- Frequência de gêneros obtidos por metagenômica (16S rDNA) para lodo de esgoto ativado (A). E considerando o número de cópias do gene 16S (B).

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Enterococcus é um gênero que possui bactérias normalmente encontradas no sistema digestivo de humanos e de outros animais. Apesar das espécies pertencentes a esse gênero serem capazes de formar biofilme (KRISTICH et al., 2004; KAFIL; MOBAREZ et al., 2015; MARINHO et al., 2013; PAGANELLI et al., 2013), essa característica metabólica não é expressa em ambientes como o lodo de esgoto. Entretanto, a predominância em número de células para lodo ativado sugere que, essas espécies estão inativas e podendo se beneficiar da estrutura do biofilme como uma forma de proteção. Bactérias do gênero Achromobacter são comumente encontradas em lodo ativado, água e solo (McKINNEY, 2004), sendo bactérias denitrificantes e aeróbias estritas. Possuem a capacidade de remover sulfametazina e de degradar moléculas de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), que são poluentes existentes na natureza com alto peso molecular e toxicidade (TIWARI, et al., 2010). Assim como descrito para os gêneros Dechloromonas, Acidovorax, Zoogloea e Acinetobacter (seção 5.4.5), a Acidithiobacillus spp. também é um grupo capaz de acumular fosfato. O acumulo de fosfato (polyP) possui várias funções e importâncias nas células bacterianas, dependendo da espécie, estado fisiológico e condições ambientais. As propostas para o acumulo de fosfato incluem: conversão do polyP em ATP como fonte energética; fonte de fosfoto inorgânico (Pi) que, em condições estáveis, é essencial para o metabolismo e crescimento, sendo também forte quelante de íons (por exemplo, Mn2+, Mg2+, Ca2+); tampão contra condições alcalinas neutralizando prótons liberado pela hidrolise enzimática do polyP; formação do complexo polyP-DNA- Ca2+ na membrana celular para entrada de DNA na célula; regulação da expressão genica para estresse e promoção da sobrevivência em fase estacionária; e componente essencial do complexo Lon protease, envolvido na degradação de proteínas ribossomais (SEVIOUR; NIELSEN, 2010). Inicialmente acreditava-se que a captação de fósforo por OAF acontecia na zona aeróbia de sistemas de lodo ativado, sendo o oxigênio como aceptor final de elétrons. Entretanto, estudos recentes mostram que o processo de captação de fósforo pode ocorrer em condições anóxicas, onde bactérias utilizam o nitrato e o nitrito como aceptores de elétrons. Isto ocorre devido a habilidade de alguns OAFD em promover desnitrificação e captação de fósforo simultaneamente na fase anóxica (NÓBREGA, 2009). Embora as funções dos OAF em sistemas de tratamento de esgoto ainda não sejam totalmente 154

esclarecidas, há discussões em relação vantagem seletiva para OAF na competição por fontes de carbono sob condições anaeróbias (SEVIOUR; NIELSEN, 2010). Nos resultados obtidos por metagenômica dos extratos de RNA e DNA para as amostras de lodo ativado, observamos a dominância dos membros da família Comamonadaceae, tendo o gênero Acidovorax como o único a estar entre os principais metabolicamente ativos e em grande abundância (Figura 50 B e 52 B). A característica OAFD pode ser observada na família Comamonadaceae e para os gêneros Dechloromonas, Acidovorax e Zoogloea. A denitrificação é um importante processo biológico no tratamento de esgoto, podendo compor cerca de 90% das bactérias com essa capacidade metabólica em sistemas de lodo ativado (KHAN, et al., 2002). Entretanto, o processo de denitrificação em condições aeróbicas e anaeróbicas nos sistemas de tratamento de esgoto não é restrito aos organismos acumuladores de fosfato e glicogênio (WEISSBRODT et al., 2013). Andersson (2011) observou a interação entre as bactérias Comamonas denitrificans, Brachymonas denitrificans, Aeromonas hydrophila e Acinetobacter calcoaceticus, que são comumente encontradas em estações de tratamento de esgoto e formadoras de biofilme. Sendo que, a característica denitrificante e de acumular fosfato dessas espécies é influenciada por interações interespécies, o que produz uma alta competitividade na formação do biofilme. A presença de muitas espécies bacterianas em crescimento e produzindo EPS, afeta a disponibilidade, a concentração e a composição do substrato. As linhagens bacterianas que podem produzir mais de um tipo de EPS, podem reorientar seu anabolismo para produzir outro tipo de polímero em resposta a uma nova situação. Embora a Zoogloea possa produzir EPS, esse organismo não é essencial para o início da granulação. As condições de operação do sistema e a predominância dos organismos envolvidos determinam os mecanismos de início da granulação. Os sistemas de lodo granular aeróbico são considerados um ecossistema composto por bactérias produtoras e consumidoras de exopolissacarídeos, pois esse polímero pode ser utilizado como doador de elétrons (NI et al., 2009; SEVIOUR et al., 2012; WEISSBRODT et al., 2013).

155

5.5.3 Comparação da abundância de espécies de lodo ativado utilizando diferentes protocolos de extração

O protocolo F permitiu a extração de RNA de lodo ativado (Figura 6) porém, foi observado a presença de contaminantes co-extraídos (Figura 36). Ao avaliar a representatividade de organismos pela técnica de ARDRA utilizando amostra de lodo ativado autoclavado misturado com consórcio artificial, foi observado que os contaminantes co-extraídos interferem na representatividade dos micro-organismos (Figura 31, 34 e 35). Como descrito anteriormente, os ácidos húmicos co-extraidos podem interferir na PCR (ROBE et. al., 2003; ROH et al., 2006), nas reações de RT (WANG; FUJII, 2010) e no ARDRA (TEBBE; VAHJEN, 1993). E para avaliar em quais etapas estes contaminantes estariam interferindo e as possíveis distorções causadas na representatividade da comunidade microbiana devido ao uso de diferentes protocolos de extração de RNA, os extratos de RNA de lodo ativado obtidos com o protocolo de extração F foram amplificados por PCR com 10 ciclos e submetidos ao sequenciamento por MiSeq (Figura 53). Foi observado que houve diferenças na representatividade entre os micro- organismos mais abundantes em comparação ao resultado do sequenciamento da mesma amostra extraída com o protocolo G, tanto com o uso do banco de dados SILVA (Figura 50) quanto com o GreenGenes (Figura 51). No sequenciamento da amostra de lodo ativado extraída com o protocolo G os membros da família Comamonadaceae e os gêneros Dechloromonas e Acinetobacter foram os mais abundantes na análise com o banco de dados SILVA (7%, 9% e 10%, respectivamente) e com o GreenGenes 99% (14%, 13% e 9%, respectivamente). O sequenciamento realizado para a amostra de lodo ativado extraída com o protocolo F apresentou as famílias Comamonadaceae e Procabacteriaceae “β-proteobacteria” e o gênero Zoogloea como os mais abundantes na análise com o banco de dados SILVA (8%, 8% e 8%, respectivamente) e com o GreenGenes 99% (17%, 8% e 12%, respectivamente). E os gêneros Dechloromonas e Acinetobacter apresentaram abundância de 6-7% e 4% respectivamente. Como ambos dos protocolos utilizam os métodos químico e físico de lise, estes resultados comprovam o que havia sido previamente observado na análise por ARDRA (seção 5.2.3), mostrando que a ineficiência 156

da retirada de contaminantes durante a extração pode afetar a eficiência das etapas de RT-PCR.

Figura 52- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo F) por metagenômica e pré-tratamento QIIME com banco de dados SILVA 97% (A) e GreenGenes 99% (B) de identidade. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

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5.5.4 Avaliação da interferência de contaminantes co-extraídos de lodo ativado em consórcios artificiais

Para avaliar a alteração da proporção dos representantes de um consórcio artificial, o lodo ativado foi esterilizado por autoclave, submetido a extração de RNA com o protocolo F, tratado com DNAse e purificado. Posteriormente foi misturado ao extrato de RNA purificado do consórcio artificial (1:8:1) e a mistura foi submetida a PCR com 10 ciclos de amplificação e sequenciada por MiSeq. A presença de contaminantes co-extraídos interferiu negativamente na proporção dos representantes do consórcio artificial (Figura 54). Este resultado comprova que, mesmo utilizando programas de PCR com poucos ciclos de amplificação, a presença de substâncias co-extraídas pode gerar uma visão distorcida da abundância de micro- organismos de uma amostra. Ao comparar com o resultado obtido para consórcios artificiais amplificados com 30 ciclos de PCR (Figura 26 e 27), foi novamente observado a distorção dos moldes em relação ao esperado e a alteração de predominância dos moldes do consórcio. Podemos propor que a utilização de protocolos inadequados de extração de RNA em conjunto do uso de PCR com muitos ciclos de amplificação pode causar um efeito sinérgico, promovendo distorções significativas de predominância filogenética.

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Figura 53- Porcentagem de predominância do consórcio artificial contendo extratos de rRNA de culturas puras de P. aeruginosa, S. aureus e B. subtilis na proporção 1:8:1. Submetido à PCR de 10 ciclos e analisados por sequenciamento no equipamento MiSeq.

5.5.4.1 Avaliação da amplificação por PCR com 30 ciclos em amostra de lodo ativado

Para avaliar de modo comparativo os efeitos do uso de programas de PCR com muitos ciclos de amplificação, o mesmo extrato de RNA de lodo ativado usado na análise da seção 5.5.1 foi submetido a PCR com 30 ciclos e sequenciado por MiSeq. Foi observado grande variação de abundância na análise feita utilizando o banco de dados SILVA (97%) em comparação ao resultado obtido com poucos ciclos de amplificação. O uso de muitos ciclos de PCR alterou a dominância da população bacteriana da amostra de lodo ativado. O gênero Acinetobacter, no qual foi o mais abundante na amostra submetida a poucos ciclos de PCR, apresentou somente 5% na representatividade amostral, sendo classificado em sexto mais abundante. Os gêneros Variovorax e Pirellula apresentaram abundância de 8% e 7% respectivamente, sendo que, este último foi observado na amostra amplificada com 10 ciclos com abundância interior a 0.2% (Figura 50 B e 55 A). Também 159

foi observado variações de abundância nos resultados gerados com o banco de dados GreenGenes (97% e 99%) em comparação com a amostra amplificada com 10 ciclos (Figura 51 e 55 B e C). Esta avaliação mostra que a alteração da abundância dos micro- organismos de uma amostra complexa pode ser causada não somente pela utilização de protocolos inadequados de extração de RNA, como no uso de muitos ciclos de amplificação por PCR. Esta análise também é corroborada com o resultado obtido na análise realizada com consórcios artificiais (seção 5.2.4). 160

Figura 54- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para amostra de lodo ativado (Protocolo G) por metagenômica e pré-tratamento QIIME + SILVA 97% (A), GreenGenes 97% (B) e 99% (C) de identidade. (*) Conjunto das classificações abaixo de 3% de abundância.

161

5.5.5 Classificação filogenética de bactérias metabolicamente ativas de amostras ambientais

Após a validação do protocolo G de extração de RNA utilizando como amostra inicial o lodo ativado, foram analisados a classificação taxônomica das amostras de biolixiviação coletada em lago com calcopirita com o pH ajustado em 7 e 2. Também, a amostra suplementada com solução FeSO4.7H2O e/ou enxofre elementar. Na amostra cultivada em pH 7 foi observado a predominância do gênero Thimonas (95%) e em pH 2 a predominância foi do gênero Acidithiobacillus (96%). Para ambas das amostras foi observado a presença de bactérias ativas pertencentes ao gênero Alicyclobacillus (5%). Na amostra suplementada houve predominância de 100% do gênero Alicyclobacillus (Figura 56). Não houve diferenciação na classificação taxonômica para os diferentes bancos de dados utilizados (dados não mostrados). Bactérias pertencentes ao gênero Acidithiobacillus são acidófilas e autotróficas obrigatórias, sendo comumente isoladas de minas de drenagem ácida. A espécie A. ferrooxidans são abundantes em ambientes contendo minérios de pirita e drenagens ácidas. São importantes membros do consórcio microbiano, usado na recuperação de cobre pelos processos de biolixiviação ou biomineração (VALDÉS et al., 2008). A espécie A. thiooxidans, também pertencente a este gênero, são incapazes de oxidar pirita ou ferro, entretanto promovem a solubilização do cobre e oxidar o enxofre presente em minérios. Ambas das espécies são utilizadas para a eliminar os metais pesados de processos de biolixiviação e em tratamento de esgoto doméstico (PIRES, et al., 2016). Membros do gênero Thimonas são acidófilas moderadas e possuem a habilidade de metabolizar compostos contendo arsênio, normalmente encontradas em ambientes impactados por drenagem ácida. Na ausência de compostos inorgânicos, algumas cepas possuem a capacidade de crescimento autotrófico e outras são organotróficas (ARSÈNE-PLOETZE et al., 2010). Membros do gênero Alicyclobacillus fazem parte do consórcio bacteriano encontrado em minas de drenagem ácidas e são responsáveis pela oxidação de enxofre e ferro (BAKER et al., 2003; MÉNDEZ-GARCÍA et al., 2015). Este resultado mostra que membros do gênero Alicyclobacillus possuem a capacidade de manter a atividade metabólica em diferentes faixas de pH. Esta 162

característica pode estar relacionada a proteção que a estrutura do biofilme confere a estas bactérias, uma vez que, os membros dos três gêneros observados (Acidithiobacillus, Thimonas e Alicyclobacillus) possuem a capacidade de formar EPS (CIUFFREDA et al., 2015; FARASIN, et al., 2016; PIRES, et al., 2016; VALDÉS et al., 2008).

Figura 55- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para as amostras de biolixiviação.

Após a extração do RNA de amostras contendo bactérias redutoras de ferro em microcosmos (seção 5.1.5.1) foram submetidos ao sequenciamento por MiSeq. A amostra de água residuária cultivada em meio óxido mostrou a predominância dos gêneros Achromobacter, Delftia, Stenotrophomonas e Acinetobacter respectivamente (Figura 57 A). Como citado anteriormente, o gênero Achromobacter são comumente encontradas em lodo ativado, água, solo e águas residuais de refinaria (McKINNEY, 2004). Entretanto, não há registros da capacidade de membros deste gênero em utilizar o ferro como aceptor final de elétrons. O resultado de sequenciamento para a amostra de água residuária suplementada com glicogênio mostrou a predominância do gênero Propionispira (Figura 57 B). Em ambas das amostras analisadas não houveram diferenciação da classificação filogenética para os diferentes bancos de dados utilizados (dados não mostrados). 163

Figura 56- Classificação taxonômica em nível de gênero obtidos para as amostras de microcosmos. (A) água residuária cultivada em meio óxido e (B) água residuária suplementada com glicogênio.

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Foi observado que o uso de um pré-tratamento dos dados gerados pelo sequenciamento de nova geração é essencial para melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica. Assim como a avaliação dos resultados obtidos utilizando diferentes bancos de dados, gerando maior confiabilidade na classificação filogenética. A utilização de diferentes iniciadores em reações independentes de PCR possibilita uma cobertura mais abrangente sobre a diversidade filogenética de uma amostra. Foi possível determinar os grupos microbianos com maior atividade metabólica para as amostras de lodo ativado, biolixiviação e bactérias redutoras de ferro em microcosmos. O uso do sequenciador de nova geração permitiu corroborar com os resultados obtidos por ARDRA sobre a interferência dos contaminantes co-extraídos e no uso de muitos ciclos de PCR na distorção dos representantes dos consórcios artificiais.

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6 CONCLUSÃO

O advento das técnicas moleculares possibilitou grande avanço na compreensão das comunidades microbianas ambientais, tanto na composição da microbiota como na identificação de organismos metabolicamente ativos. Os micro-organismos em amostras ambientais geralmente estão presentes na forma de biofilmes e as características químicas destas amostras são complexas. As numerosas manipulações de ácidos nucleicos entre a etapa de extração e a análise final podem resultar em alteração significativa da proporção de moldes que representam os diferentes organismos das comunidades e desta forma inviabilizar a obtenção de dados confiáveis sobre a composição da comunidade. Assim sendo, processos de validação das diferentes etapas moleculares são de extrema importância para a obtenção de dados fidedignos sobre a característica filogenética da amostra em estudo. A análise detalhada de todas as etapas moleculares obtidas neste trabalho possibilitou identificar os pontos críticos do processo, permitindo otimizações e padronizações que garantiram uma maior fidedignidade dos resultados obtidos. Para auxiliar na validação de todas as etapas moleculares, foram utilizados consórcios artificiais de bactérias em concentrações e proporções conhecidas. Após testes de eficiência com diferentes protocolos de extração de RNA, o protocolo G (adaptado neste trabalho) foi o que ofereceu as melhores condições de lise e de recuperação do rRNA para as amostras de lodo ativado, tanto quantitativamente quanto qualitativamente. Foi comprovado também o aumento da eficiência na eliminação de contaminantes co- extraídos pelo protocolo G. Essa comprovação foi obtida após a comparação analítica com outro protocolo (F) similar ao adaptado neste trabalho. O protocolo G adaptado nesse trabalho mostrou ser eficaz para extração de RNA de diferentes amostras ambientais in natura (lodo ativado, tanques de piscicultura, filtro de areia e biocorrosão) e para amostras ambientais cultivadas em diferentes meios de cultura (bactérias redutoras de ferro e biolixiviação). O teor de matéria orgânica/inorgânica não interferiu na extração de RNA com o protocolo G, entretanto, é necessária a determinação da alíquota de amostra utilizada para a extração. Foi possível recuperar o RNA de lodo armazenado por longos períodos à -80 ºC utilizando o protocolo G, mostrando que a conservação em freezer preserva a integridade da molécula de RNA. A otimização da lise celular e da eliminação 166

de contaminantes do extrato de RNA obtidos no protocolo G possibilitou a redução de vieses nas etapas moleculares “downstream” aplicadas neste trabalho. Na otimização da RT-PCR, a redução no número de ciclos de amplificação durante a etapa de PCR para 10 ciclos junto com o programa de subciclagem e o uso de uma enzima polimerase de alta fidelidade, minimizou significativamente as variações entre as proporções obtidas e esperadas dos membros dos consórcios artificiais. Estas diferenças na eficiência de amplificação por PCR ocorreram devido ao amplo espectro no teor de G+C de cada espécie bacteriana. Após a análise dos extratos de RNA de lodo ativado obtidos pelos protocolos G e F, foi concluído que a presença de contaminantes co-extraídos interferiu na atividade da enzima polimerase. Na avaliação de aditivos de PCR, o uso das combinações A (Betaína 0.5M + DMSO 5%), C (Buffer Pfu + MgCl2 4mM), F (DMSO 7.5%) e H (Betaína 1M) junto da diminuição da rampa de temperatura para 1 ºC/s, melhoraram a amplificação por PCR para a amostra de lodo ativado. Ao final da otimização da etapa de RT-PCR, foi concluído que a etapa de extração possui fundamental importância para a manutenção da proporção dos moldes de RNA de uma amostra. Mesmo utilizando programas de amplificação otimizados e aditivos, os contaminantes co-extraídos podem influenciar negativamente em todo o processo de análise molecular, até mesmo em análises que empregam o uso de digestão por enzimas de restrição. A padronização de ARDRA revelou que são necessários entre 500 e 550 clones para uma cobertura completa da diversidade de micro-organismos. A utilização de enzimas misturadas na mesma reação de digestão “double digest”, proporcionou a separação dos clones utilizando 2 etapas de ARDRA porém, para uma separação mais fidedigna, uma terceira etapa de ARDRA é recomendada. O critério de corte em 3% possibilitou selecionar somente os grupos filogenéticos com maior representatividade. Após o sequenciamento dos clones da amostra de lodo ativado foi concluído que o agrupamento realizado na segunda etapa de ARDRA é efetivo para a separação das espécies da amostra, porém é recomendado uma terceira digestão para eliminação de eventuais clones não pertencentes ao agrupamento correspondente. O resultado obtido mostrou que este método é válido para a detecção e agrupamento de micro-organismos em amostras complexas, porém, o mesmo se mostrou laborioso. Mesmo com o surgimento de novas tecnologias moleculares, o uso da técnica de ARDRA ainda é utilizada para caracterização filogenética. Após as 167

padronizações da etapa de clonagem e ARDRA foi observado que os contaminantes co- extraídos pelo protocolo F interferiram na atividade das enzimas de restrição. Assim, foi concluído que o uso do protocolo G junto da padronização aplicada para o ARDRA possibilitou a detecção de todos os membros do consórcio artificial. Foi utilizado o sequenciamento de nova geração para identificação dos micro- organismos metabolicamente ativos em amostras complexas. O uso da ferramenta QIIME no pré-tratamento dos dados permitiu o melhoramento dos resultados obtidos, aumentando a resolução e profundidade taxonômica. Na correlação entre os resultados do sequenciamento do rRNA 16S (metabolicamente ativos) e do DNA (abundância em número de células) para lodo ativado, foi observado que dentre os principais gêneros responsáveis por produzir EPS (Acinetobacter, Acidovorax e Zoogloea) somente o gênero Acidorovax apresentou grande abundância na amostra. Após a análise detalhada de todas as técnicas moleculares empregadas neste trabalho, foi concluído que a validação é uma etapa essencial para preservar a verdadeira abundância filogenética e na identificação os organismos metabolicamente ativos de maior relevância em uma amostra. Trabalhos que negligenciam esta etapa podem introduzir vieses que comprometeram os resultados, gerando uma visão distorcida sobre a verdadeira composição microbiana estudada. No anexo 4 foi descrito um fluxograma de recomendação, contendo cada etapa validada e padronizada. No aspecto geral, para garantir a qualidade dos dados para uma amostra desconhecida, é recomendado adotar os seguintes controles: processar a amostra logo após a coleta; padronizar o volume da alíquota para cada tipo de amostra a ser extraída com o protocolo G; para PCR, utilizar diferentes combinações de iniciadores, enzima polimerase de alta fidelidade, combinação de aditivos, diminuição da rampa de temperatura em 1 ºC/s, 10 ciclos de amplificação e programa de subciclagem; para ARDRA, utilizar entre 500 e 550 clones, combinação de enzimas de restrição, 3 ciclos de agrupamento e adotar o critério de corte em ≥ 3%; para sequenciamento de nova geração, utilizar kits de preparo da amostra que não utilizem etapas de PCR, adotar o pré-tratamento manual dos dados e utilizar mais de um banco de dados. Embora a validação de todo o processo molecular tenha melhorado significativamente os resultados sobre a caracterização filogenética de organismos metabolicamente ativos é necessário que seja feito em estudos futuros uma avaliação das 168

vias metabólicas ativas, utilizando o mRNA como molécula alvo, com o intuito de gerar uma visão detalhada da atividade em comunidades microbianas.

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7 REFERÊNCIAS*

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