Universitat Jaume I Departament de Química Física i Analítica Àrea de Química Analítica Institut Universitari de Plaguicides i Aigües POTENTIAL OF LC-(Q)TOF MS IN TARGET AND NON- TARGET ANALYSES: WIDE SCOPE SCREENING OF ORGANIC CONTAMINANTS AND METABOLOMIC APPLICATIONS Tesis Doctoral RAMON DÍAZ SAN PEDRO 2016 Dr. Félix Hernández Hernández y Dr. Juan Vicente Sancho LLopís , catedráticos de Química Analítica de la Universitat Jaume I de Castellón, CERTIFICAN: que la Tesis Doctoral “Potential of LC-(Q)TOF MS in target and non-target analyses: wide scope screening of organic contaminants and metabolomic applications” ha sido desarrollada bajo su dirección, en el Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas, Departamento de Química Física y Analítica de la Universitat Jaume I de Castellón, por Ramon Díaz San Pedro . Lo que certifico para los efectos oportunos en Castellón de la Plana, a 27 de Octubre de 2015. Fdo. Dr. Félix Hernández Hernández Fdo. Dr.Juan Vicente Sancho LLopis AGRADECIMIENTOS/ACKNOWLEDGMENTS En primer lugar me gustaría agradecer a mis directores de Tesis, los Drs. Félix Hernández y Juan Vicente Sancho por darme esta oportunidad y por permitirme aprender de dos grandísimos investigadores. Estaré eternamente agradecido por todo el apoyo mostrado, especialmente en la distancia, y por el duro trabajo conjunto cuyo resultado es esta Tesis. También a la Dra. Maria Ibáñez y al Dr. Oscar Pozo por sus consejos y lecciones ofrecidas en el dia a dia, cuando más se necesita Hago extensivo este agradecimiento a todos los compañeros del IUPA que he ido encontrando en el camino. Los nombraría todos pero temo olvidarme de alguno y sentirme culpable. Me gustaría resaltar a Montse, Robert y, especialmente, a Arantxa por ser mis ojos en Castellón y acompañarme en toda la burocracia. No quisiera olvidarme de Toni Checa, que no se ha hecho el sueco y ha aportado, en un impresionante sprint final, el ultimo grano de arena necesario; y a Luz Karine por su toque de calidad en la portada. Como no olvidar a los amigos; Edu, Pascual, Miguel, Inés, Ximo B., Ampa, Rosa, etc. que me han permitido vivir uno de los momentos más bonitos de mi vida en Castellón. Especialmente a Jose y su familia (que es también la mia: Maria José, Adriana y Jose), Juanvi, Vicky y Carlinhos que han vivido cada momento, de principio a fin, de este proceso…sé que siempre podré contar con su amistad. Y como no….a Cris…que ha estado ahí incodicionalemente. I would like to acknowledge as well all my new colleagues that also gave me the motivation to continue, and especially Hans, Valentina (and Bram) and Rob who were always worried about my thesis. También a los nuevos amigos en Holanda: Víctor, Belén, Alejandra, Mayca y Rutger, entre otros. Gracias también a mi familia, por confiar en mí y no rendirse nunca, no únicamente durante la Tesis, sino toda la vida. Gracias a ellos por darme todo para que pudiera convertirme el la persona que soy ahora. Tampoco quiero olvidarme de mi sobrino del alma, que me ha alegrado en tantas veces solo con una sonrisa y su admiración. Por ultimo pero no por ello menos importante, Marian, la persona que más allá de estar en este apartado debería ser co-autora de este trabajo. Ella ha mantenido la llama viva cuando los vientos de Holanda asomaban en apagarla. Gracias morchi por todo la ayuda, por soportarme en los malos momentos, por entenderme y hacerme verlo todo de modo optimista, por nunca rendirte. Mil gracias por hacer que este sueño se haga realidad. En definitiva, gracias a todos las personas que he ido encontrando en este largo camino, ya que, de una y otra forma, han contribuido en esta Tesis. Resumen RESUMEN En la presente tesis se ha investigado el potencial de la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas de alta resolución en aproximaciones analíticas tanto de tipo target (análisis de compuestos diana) como non-target (análisis no dirigido). Las ventajas que este tipo de instrumentación ofrece, derivadas de la adquisición del espectro completo con alta resolución y medidas de masa exacta, la hacen idónea para el screening de contaminantes orgánicos así como para estudios metabolómicos tanto de denominación de origen de alimentos como de carácter biomédico. El trabajo presentado se ha estructurado en tres grandes bloques. En el primero de ellos se aborda el desarrollo y optimización de un método de screening “universal” de contaminantes orgánicos usando un acoplamiento instrumental LC-QTOF MS. Con este fin, se ha desarrollado una base de datos de compuestos, se ha optimizado la metodología analítica y, finalmente, se ha validado dicha metodología en matrices medioambientales. El segundo bloque muestra el potencial de la técnica para la investigación y diagnosis en exhalados pulmonares, los cuales presentan un bajísima concentración de metabolitos. En el tercer y último bloque, se lleva a cabo la búsqueda de compuestos que puedan utilizarse como marcadores de D.O. en muestras de naranja y vino, centrándose especialmente en aquellas pertenecientes a la Comunidad Valenciana. El primer bloque se inicia con la optimización de los parámetros instrumentales que puedan tener un efecto notorio en la creación de la base de datos y/o en el análisis de las muestras. Para ello, se han investigado los factores que afectan a la sensibilidad instrumental y a la exactitud de masa. Además, se estudia la fragmentación de los compuestos incluidos en la base de datos con el fin de facilitar de forma automática y simultánea la confirmación de la identidad de los compuestos detectados en las muestras. Finalmente se ha evaluado la influencia de la resolución de masa y cromatográfica en la exactitud de masa en el caso de matrices complejas. Posteriormente, se han creado dos bases de datos de contaminantes orgánicos: una Resumen teórica, la cual contiene alrededor de 1000 contaminantes orgánicos reportados en la literatura como analizables por LC-MS. Esta base de datos incluye tiempo de retención y fórmula empírica de fragmentos y aductos de aquellos compuestos de los que se dispone de patrones de referencia y que han sido inyectados de acuerdo con los parámetros previamente optimizados. La segunda base de datos se trata de una librería de espectros experimental que contiene los espectros a alta y baja energía de colisión (estos últimos proporcionando información sobre la fragmentación), así como tiempos de retención, de los compuestos con patrón disponible. Finalmente, se ha evaluado la eficacia de la librería en el análisis de muestras reales. En un segundo trabajo se evalúa el potencial de los dos principales procedimientos para la investigación de contaminantes orgánicos mediante métodos de screening: non-target y post-target. Para ello, se lleva a cabo un screening de muestras ambientales, alimentos y muestras de interés toxicológico mediante las dos metodologías y se comparan los resultados obtenidos. La primera aproximación (non- target), basada en la deconvolución del cromatograma para la búsqueda de componentes en la muestra, ha demostrado una notable dependencia de la intensidad del pico cromatográfico debido a la baja eficiencia del algoritmo de deconvolución. En el caso de la aproximación non-target, tras la búsqueda de los componentes, los espectros correspondientes son automáticamente comparados con la librería de espectros experimental creada anteriormente, así como con una librería teórica generada a partir de los compuestos incluidos en la base de datos de contaminantes. En cuanto a la segunda aproximación, tipo post-target, esta se basa en la búsqueda, después de la inyección de las muestras, de compuestos seleccionados (target) incluidos en la base de datos. Como se ha indicado anteriormente, ésta incluye información de fragmentación y tiempo de retención de aquellos compuestos con patrón de referencia disponible, es decir aquellos que están también presentes en la librería experimental de espectros. A la vista de los resultados, se concluye que la aproximación post-target resulta la más ventajosa para abordar un screening “universal” de un elevado número de compuestos. Además, los procesos de revisión de datos y los tiempos de procesamiento se reducen considerablemente. Sin embargo, la metodología non-target presenta una excelente capacidad de Resumen confirmación de la identidad de los contaminantes encontrados ya que facilita la comparación de los espectros de fragmentación de patrones con los obtenidos en la muestra. Mediante la aproximación post-target, se encontró un importante número de contaminantes en muestras ambientales y alimentarias, así como drogas de abuso y fármacos en las muestras de orina de voluntarios en tratamientos de desintoxicación. El primer bloque de la tesis finaliza con una validación cualitativa de la metodología desarrollada en muestras de agua subterránea, superficial y el efluente de una planta de tratamiento de aguas residuales. Se han evaluado dos tipos de relleno en la extracción en fase sólida aplicada a las muestras: Oasis HLB y MCX. El primero ha resultado más genérico, perdiéndose únicamente el fármaco Gabapentina en dicho proceso de preconcentración. Para la validación cualitativa, se fortifican 3 muestras independientes de cada tipo de agua analizada a dos niveles de concentración (0.1 y 1 µg/L) y se comprueba la capacidad del método para detectar (típicamente, usando la molécula protonada) e identificar (mediante al menos dos iones: molécula protonada y un fragmento) los contaminantes seleccionados como modelo: 146 compuestos entre los que se incluyen 52 pesticidas, 52 medicamentos (21 antibióticos), 13 drogas de abuso, 11 hormonas, 11 micotoxinas y 7 agentes de protección UV. El método desarrollado permite la detección de la gran mayoría de los compuestos ensayados y la identificación de un buen número de ellos. Posteriormente, se ha aplicado dicha metodología al análisis de muestras reales, identificando varios de los contaminantes seleccionados, incluso a niveles de concentración inferiores al más bajo validado.