ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

«Φυτοχημική μελέτη του αιθερικού εκχυλίσματος του είδους Thymus vulgaris var. varico ΙΙΙ (Lamiaceae)»

ΤΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑΣ ΜΙΧΑΗΛΙΔΟΥ ΦΩΤΕΙΝΗΣ

ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΕΥΓΕΝΙΟΣ Κ. ΚΟΚΚΑΛΟΥ

ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ

ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, ΜΑΡΤΙΟΣ 2016

0

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας – Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τομέα Φαρμακογνωσίας – Φαρμακολογίας, του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ εγκάρδια τον Καθηγητή Ευγένιο Κοκκάλου, επιβλέποντα της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής για την υπόδειξη του θέματος, την ουσιώδη και ανεκτίμητη συμβολή του σε όλα τα στάδια εκτέλεσης αυτής και για την δυνατότητα που μου έδωσε να ασχοληθώ με το αντικείμενο της Φαρμακογνωσίας ως συνέχεια των σπουδών μου στην αγαπημένη μου επιστήμη της Φαρμακευτικής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την Κα Αναστασία Καριώτη, Λέκτορα της Φαρμακογνωσίας του Α.Π.Θ. για την πολύτιμη καθοδήγηση της, την καίρια βοήθειά της και την συμπαράσταση που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Ευχαριστώ ιδιαιτέρως τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, Κο Ευγένιο Κοκκάλου, Κα Μαντώ Λάζαρη Κα Αναστασία Καριώτη για τη διόρθωση της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας. Πολλές ευχαριστίες στις συμφοιτήτριες και "συναγωνίστριες" Ακριτίδου Τριανταφυλλιά και Μαντά Παρασκευή για τις όμορφες αλλά και δύσκολες στιγμές που περάσαμε μαζί, στηρίζοντας η μία την άλλη. Σημαντική ήταν και η βοήθεια από το εργασιακό μου περιβάλλον, για τις διευκολύνσεις αλλά και για την ηθική στήριξη για να έρθει εις πέρας η μελέτη αυτή. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω ειλικρινά από τα βάθη της ψυχής μου, την οικογένειά μου και τους φίλους μου, που με στήριξαν, πίστεψαν σε εμένα και μου συμπαραστάθηκαν και δίχως αυτούς και με τη βοήθεια του Θεού, δεν θα τα είχα καταφέρει.

1

ΠΕΡΙΕXΟMΕΝΑ

MΕΡΟΣ Α: Εισαγωγικό

Α1. Σκοπός-Εισαγωγή...... 5

Α2. Ιστορία...... 6

Α3. Βοτανική...... 8

Α3.1 Μορφολογία...... 8

Α3.2 Γεωγραφική κατανομή...... 9

Α3.3 Περιβαλλοντολογικές συνθήκες...... 9

Α3.4 Συστηματικη βοτανική...... 10

Α3.5 Συνώνυμα...... 12

Α3.6 Πολυμορφισμός...... 12

Α3.6.1 Πολυμορφισμός στο Thymus vulgaris varico III...... 13

Α4. Συγκομιδή και επεξεργασία...... 18

Α4.1 Συγκομιδή...... 18

Α4.2 Επεξεργασία...... 21

Α4.2.1 Αποξήρανση...... 22

Α4.2.2 Καθαρισμός...... 23

Α4.2.3 Θρυμματισμός και επιλογή μεγέθους σωματιδίων...... 25

Α4.2.4 Περεταίρω κατεργασίες...... 26

Α5 Φυτοχημεία...... 28

Α5.1 Αιθέρια έλαια: παραγωγή και χαρακτηριστικά...... 28

Α5.1.1 Γενικά...... 29

Α5.1.1α Φυσικές ιδιότητες...... 29

Α5.1.1β Χημική συσταση ...... 29

Α5.1.1γ Μέθοδοι απομόνωσης ...... 30

Α5.1.1δ Δράσεις- Χρήσεις...... 32

2

Α5.1.1ε Μέθοδοι ανάλυσης...... 32

Α5.1.2 Αιθέρια έλαια στο Thymus vulgaris...... 35

Α5.1.3 Χρήσεις - Αντενδείξεις...... 50

Α5.2 Φλαβονοειδή και άλλες φαινολικές ενώσεις...... 51

Α5.2.1 Φλαβόνες...... 53

Α5.2.2 Φλαβονόλες...... 54

Α5.2.3 Φλαβανόνες και διυδροξυφλαβονόλες...... 54

Α5.2.4 Ακετυλιωμένα άγλυκα φλαβονοειδών...... 55

Α5.2.5 Ανθοκυανιδίνες...... 55

Α5.2.6 Φλαβονοειδείς γλυκοζίτες...... 55

Α5.2.7 Φαινολικά οξέα...... 56

Α5.2.8 Φαινολικές ενώσεις στο Thymus vulgaris...... 57

Α6 Βιολογική δράση- Χρήσεις...... 62

Α6.1 Αναπνευστικό συστημα...... 63

Α6.2 Γαστρεντερικό συστημα...... 64

Α6.3 Εξωτερική χρήση...... 64

Α6.4 Συντηρητικό τροφίμων...... 64

Α6.5 Αντιβακτηριακές ιδιότητες...... 65

Α6.6 Αντιαλλεργική δράση...... 66

Α6.7 Εντομοκτόνος δράση...... 66

Α7 Tοξικότητα...... 66

ΜΕΡΟΣ Β: ΠΕΙΡΑΜΑTΙΚΟ

Β1 YΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Γενικά, όργανα, τεχνικές

Β1.1 Όργανα...... 68

Β1.2 Διαλυτές...... 68

Β1.3 Χρωματογραφικές τεχνικές...... 68

3

Β1.4 Φασματοσκοπικές τεχνικές ...... 71

Β1.5 Συζευγμένες τεχνικές, LC-MS...... 72

Β2 YΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Εκχυλιση και πορεία απομόνωσης

Β2.1 Εκχυλιση...... 76

Β2.2 Απομάκρυνσ χλωροφυλλών...... 76

Β2.3 Κατανομές...... 76

Β2.4 Εκχυλισμα διαιθυλαιθέρα- Χρωματογραφικός διαχωρισμός...... 77

ΜΕΡΟΣ Γ: ΑΠΟTΕΛΕΣΜΑTΑ

Γ1 Tαυτοποίηση κορυφών

Oυσία 1...... 83

Ουσία 2...... 87

Oυσία 3...... 91

Oυσία 4...... 96

Oυσία 5...... 101

Oυσία 6...... 105

Oυσία 7...... 109

Oυσία 8...... 113

Oυσία 9...... 117

Oυσία 10...... 120

Oυσία 11...... 125

Oυσία 12...... 128

Oυσία 13...... 131

Oυσία 14...... 134

Oυσία 15...... 137

Γ2 Συμπεράσματα...... 139

Βιβλιογραφία...... 141

4

ΜΕΡΟΣ Α: ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ

1. ΣΚΟΠΟΣ- ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η απομόνωση και ταυτοποίηση ουσιών με πιθανές βιολογικές δράσεις από φυσικά προϊόντα είναι μια από τις κύριες κατευθύνσεις έρευνας του εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας- Δρογοχημείας του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Μέσα στα πλαίσια αυτής της έρευνας, επιλέχθηκε προς μελέτη το νέο υβρίδιο Тhymus vulgaris varico III της οικογένειας Lamiaceae . Η παρούσα μελέτη έχει σκοπό την απομόνωση και τον προσδιορισμό δευτερογενών μεταβολιτών του ανώτερου τμήματος του φυτού, κυρίως φλαβονοειδών και φαινολικών οξέων.

Μέσα στην οικογένεια Lamiaceae με τα περίπου 220 γένη το γένος Τhymus είναι ένα από τα 8 πιο σημαντικά γένη λόγω του αριθμού των ειδών που περιλαμβάνει, με τα διαθέσιμα στοιχεία να αναφέρουν 215 είδη για το γένος.

Σε γενικές γραμμές το θυμάρι είναι ένα αρωματικό φυτό που χρησιμοποιείται ως μπαχαρικό αλλά και για ιατρικούς σκοπούς παντού σε όλο το κόσμο. Το γένος Thymus συναντάται πολύ συχνά στη περιοχή της Μεσογείου, όπου ορισμένα είδη εμφανίζονται ως θαμνώδη βλάστηση με ύψος που δε ξεπερνά τα 50 εκατοστά και είναι καλά προσαρμοσμένα στις θερμές και ξηρές καλοκαιρινές συνθήκες.

Κοινό χαρακτηριστικό πολλών αρωματικών φυτών είναι η παρουσία αμέτρητων αδενικών τριχών διαφορετικών μορφών που περιέχουν πτητικά αιθέρια έλαια τα οποία εξατμίζονται όταν οι τρίχες αυτές καταστραφούν.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε το νέο υβρίδιο Тhymus vulgaris varico III, το οποίο δημιουργήθηκε με σκοπό να αυξηθεί η απόδοση του αιθερίου ελαίου κυρίως σε θυμόλη, που έχει πολύ μεγάλη εμπορική σημασία.

5

2. ΙΣТΟΡΙΑ

Πολλές εξηγήσεις υπάρχουν σχετικά με την προέλευση του ονόματος "Thymus". Ετυμολογικά λοιπόν, το θυμάρι ή θύμος όπως το ονόμαζαν οι αρχαίοι, προέρχεται από την λέξη θύω, η οποία αρχικά είχε την σημασία του «βγάζω καπνούς» και αργότερα του «θυσιάζω». Από την ίδια ρίζα προέρχονται και οι λέξεις θυμίαμα και θυμιατίζω, ενώ στενή φαίνεται πως είναι και η σχέση με τον θυμό. Και θυμός στους αρχαίους δεν σημαίνει την οργή, αλλά τη ζωτική δύναμη, τη βούληση, όπως μας επιβεβαιώνουν λέξεις σαν το λιπόθυμος, εύθυμος, πρόθυμος κ.α. Για τον Πλάτωνα μάλιστα ο θυμός αποτελεί ένα από τα τρία μέρη της ψυχής, την κινητήρια δύναμη της ανδρείας, την οποία όπως είδαμε νωρίτερα πίστευαν στην αρχαιότητα ότι θρέφει ο θύμος (Δαβίας Ο., 2006).

Οι Σουμέριοι πριν από 5.500 χρόνια είναι οι πρώτοι, απ’ ότι γνωρίζουμε, που χρησιμοποίησαν το θυμάρι ως καρύκευμα και φάρμακο, ενώ οι Αιγύπτιοι το ονόμασαν θαμ και μεταχειρίζονταν το αφέψημα του για να πλύνουν εκείνους που «πήγαν στα θυμαράκια», ως προετοιμασία της μουμιοποίησης τους.

Ήδη από την εποχή του Ομήρου, αρκετά είδη του που ευδοκιμούν στη χώρα μας, εκτός από ήδυσμα για διάφορα εδέσματα αποτελούσε σύμβολο δύναμης και ανδρείας. Ακόμα και οι πιο φτωχοί μπορούσαν να απολαύσουν το τονωτικό μίγμα από θυμάρι, απλό μέλι και ξίδι. Το θυμάρι ήταν άφθονο και φθηνό, έχαιρε όμως μεγάλης εκτίμησης λόγω των ιδιοτήτων του. Οι ηλικιωμένοι έπιναν τακτικά έγχυμα από θυμάρι για να διατηρήσουν τις πνευματικές τους δυνάμεις, ενώ πολύ δυναμωτικό θεωρείτο ένα ποτό που παρασκευαζόταν με το σιγοβράσιμο σύκων και θυμαριού σε νερό ή κρασί. Το θυμάρι ήταν φυτό αφιερωμένο στη θεά του έρωτα Αφροδίτη και κανείς δεν αμφισβητούσε πως προκαλεί ή ενισχύει τον πόθο (Δαβίας Ο., 2006).

Ο Ιπποκράτης στο σύγγραμμά του «Περί Διαίτης» αναφέρει πως το θυμάρι είναι θερμαντικό, υπακτικό, διουρητικό και αποβάλλει το φλέγμα ενώ στο «Περί Νούσων» το προτείνει ενάντια στη φθίση του λάρυγγα. Ο πιο λαμπρός φαρμακολόγος του αρχαίου κόσμου, ο Διοσκουρίδης, στο τρίτο βιβλίο του συγγράμματος «Περί Ύλης Ιατρικής», περιγράφει λεπτομερώς τρία είδη θυμαριού. «Θυμάρι: το ξέρουν όλοι. Είναι ένας χαμηλός θάμνος με τη μορφή φρύγανου, καλυμμένος από πολλά στενά φυλλαράκια, ο οποίος έχει πορφυρόχρωμες ανθισμένες κορυφές και φυτρώνει σε πετρώδη και άγονα εδάφη. Όταν πίνεται με αλάτι και ξίδι, αποβάλλει το φλέγμα από την κοιλιά. Το αφέψημά του με μέλι βοηθά όσους έχουν ορθόπνοια, άσθμα ή ελμινθίαση, διευκολύνει την έμμηνο ρύση και τη γέννα είναι επίσης διουρητικό, ενώ ανακατεμένο με μέλι συμβάλλει στην απόχρεμψη.»

Στο βιβλίο Φυσικής Ιστορίας του ο Πλίνιος αναφέρεται στο Thymus vulgaris (βιβλίο 21, κεφάλαιο 10) "στην επαρχία Ναρμπόν, τα πετρώδη εδάφη είναι γεμάτα από θυμάρι και χιλιάδες πρόβατα έρχονται από πολύ μακριά για να τραφούν". Στη συνέχεια μιλά για δυο διαφορετικές ποικιλίες θυμαριού, μια λευκή και μια μαύρη και σχολιάζει τις θεραπευτικές του ιδιότητες. Τονίζει πως το θυμάρι γαληνεύει τους επιληπτικούς, κατασιγάζει τον πονοκέφαλο, και όταν καίγεται ξαποστέλνει όλα τα

6

δηλητηριώδη όντα. Και φυσικά αποτελούσε απαραίτητο συστατικό στα amatorium, τα αφροδισιακά φίλτρα που χτυπούσαν στο γουδί οι μάγισσες της αρχαίας Ρώμης και τα προμήθευαν σε άτεκνες γυναίκες, καταπονημένους συζύγους και ερωτευμένους νεαρούς (Δαβίας Ο., 2006).

Στον Μεσαίωνα, εποχή που επαναφέρει τις αρχαίες διδαχές, το θυμάρι φημίζεται ως σωτήριο φάρμακο για την μελαγχολία, την κατάθλιψη και την επιληψία, με αποτέλεσμα πολύ συχνά τα στρώματα και τα μαξιλάρια να γεμίζονται με το χόρτο του. Η πίστη στην ιδιότητα του θυμαριού να χαρίζει θάρρος δεν έχει υποχωρήσει καθόλου και μάλιστα σε μια εποχή γεμάτη πολέμους η τόλμη αποτελεί περιπόθητη αρετή. Έτσι, συναντάται η εικόνα του θυμαριού πάνω σε μαντήλια που χαρίζουν στους σταυροφόρους που αναχωρούν για τους Αγίους Τόπους. Το θυμάρι κοσμεί επίσης συχνά ασπίδες ιπποτών, ενώ το συναντάμε και σε θρύλους που μιλούν για απλούς ιπποκόμους που αποκοιμήθηκαν σε λόφους κατάφυτους με το ανθισμένο φρύγανο, για να ξυπνήσουν ακατανίκητοι πολεμιστές (Δαβίας Ο., 2006).

Στην αρχή του 17ου αιώνα ο Dodonaeus περιγράφει επίσης δυο ποικιλίες. Τον 18ο αιώνα ο Barrelier παρουσιάζει ένα βιβλίο με εικόνες όπου απεικονίζονται κάποια είδη. Το έργο αναφοράς για το διωνυμικό σύστημα ονοματολογίας στη βοτανική "Species Plantarum 1st edition" (1753) περιλαμβάνει 8 είδη Thymus (T. serpyllum, T. vulgaris, T. zygis, T. acinos, T. alpinus, T. cephalotos, T. villosas, T. pzlegioides). Με το πέρασμα των χρόνων όλο και περισσότερα είδη Thymus ανακαλύπτονταν και περιγράφονταν.

Πολλές από τις παλιές απεικονίσεις του Thymus είναι διαθέσιμες, ειδικά στα έργα του Hoffmannsegg και Link (1809), και Boissier (1838, 1839-1845, 1859). Οι πρώτες απεικονίσεις ήταν πολύ πρωτόγονα σχέδια όπως εκείνα της μετάφρασης του Laguna (1555) του Διοσκουρίδη ή του Barrellier. Στο τέλος του 18ου και τον 19ο

7

αιώνα, τα σχέδια των φυτών ήταν θεαματικά βελτιωμένα. Αν και η φωτογράφηση των φυτών έχει φτάσει σε ένα υψηλό επίπεδο, τα σχέδια μπορούν να δώσουν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με βοτανικές λεπτομέρειες των φυτών από ότι οι φωτογραφίες. Ως εκ τούτου, ταξινόμηση των φυτών μπορεί καλύτερα να γίνει με σχέδια από ό, τι με τις φωτογραφίες.

3. ΒΟТΑΝΙΚΗ

3.1 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ

Η μορφολογία των φυτών Thymus επηρεάζεται από το περιβάλλον. Μπορούμε να διαφοροποιήσουμε δύο ομάδες, από τη μία πλευρά λίγο θαμνώδη φυτά, συνήθως κάτω από 50 cm, μόνο σποραδικά μέχρι 1 μέτρο, όπως είναι τα Τ. baeticus και Τ. hyemalis στα νότια και νοτιοανατολικά της Ισπανίας. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν τα υφέρποντα, μερικές φορές με ριζοβόλα κλαδιά.

Όπως και τα περισσότερα φυτά της οικογένειας Lamiaceae, έχουν τετράπλευρο μίσχο, ο οποίος είναι τριχωτός όταν είναι νεαρός. Οι τρίχες μπορούν να καλύψουν τις τέσσερις όψεις του μίσχου (holotrichous) ή μόνο δύο πλευρές που εναλλάσσονται (lophotrichous). Η λειτουργία των διαφορετικών τύπων των τριχών στους μίσχους δεν είναι ακόμη γνωστή. Τα φύλλα μπορεί να είναι επίπεδα και περισσότερο ή λιγότερο πλατιά. Μερικά είδη έχουν φύλλα χωρίς τρίχες. Οι τρίχες είναι πάντα απλές, αλλά σπάνια μονοκύτταρες. Τα φύλλα είναι πολύ συχνά βλεφαριδωτά στο περίγραμμά τους, είτε στο σύνολο του περιγράμματος ή μόνο στη βάση ή στο μίσχο. Τα αδενικά τριχώματα είναι πολύ σημαντικά, καθώς περιέχουν το αιθέριο έλαιο. Υπάρχουν δύο τύποι των αδενικών τριχών: αδένες με τα ανώτερα κύτταρα γεμάτα από αιθέρια έλαια ή μεγάλοι στρογγυλοί αδένες με ορισμένα βασικά κύτταρα (Morales, 1997).

Τα άνθη μεγαλώνουν περισσότερο ή λιγότερο σε συστάδες. Ο κάλυκας του θυμαριού (2.5-8mm) όταν στεγνώσει διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διασπορά

8

των μικρών καρπών. Συνήθως ο κάλυκας έχει πέντε σέπαλα, τρία επάνω και δύο κάτω που είναι συνήθως μακρύτερα και συχνά κυρτά προς τα πάνω. Τα τρία επάνω σέπαλα είναι μικρότερα από τα κάτω και ενίοτε ενώνονται σε ένα. Η στεφάνη κυμαίνεται μεταξύ 4 και 10 mm σε μήκος και καταλήγει σε ένα άνω και τρία κάτω πέταλα, μία τυπική δομή για να γονιμοποιούνται από μέλισσες ή παρόμοια έντομα. Η παραγωγή γύρης στους τέσσερις στήμονες είναι χαμηλή (Morales, 1997).

Το θυμάρι είναι συνήθως δίοικο, δηλαδή ορισμένα είναι με γυναικεία άνθη χωρίς στήμονες, και άλλα με ερμαφρόδιτα άνθη. Είναι αποδεδειγμένο ότι επικονιαστές μπορούν να γονιμοποιήσουν τα θηλυκά άνθη πιο γρήγορα από ότι τα ερμαφρόδιτα. Οι σπόροι που συλλέγονται βλαστάνουν συνήθως πολύ εύκολα και τα φυτά αναπτύσσονται σχετικά γρήγορα. Τα περισσότερα από τα είδη ανθίζουν την άνοιξη, άλλοι το καλοκαίρι. Στη Μεσόγειο το Τhymus vulgaris ανθίζει την άνοιξη (Morales, 1997).

3.2 ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΚΑТΑΝΟΜΗ

Φυτά του γένους απαντούν σε όλη σχεδόν την Ευρασία, με δυο κύρια όμως κέντρα εξάπλωσης, την Ιβηρική και τη Βαλκανική Χερσόνησο. Ο ακριβής αριθμός των αυτοφυών ειδών στην Ελλάδα είναι δύσκολο να εκτιμηθεί μια και αυτός ποικίλει στις μέχρι σήμερα ταξινομικές προσεγγίσεις από 20 μέχρι 30. Οι διαφορές αυτές στον αριθμό των αναφερομένων στη χώρα μας ειδών φανερώνουν τις δυσκολίες που συναντούν οι ερευνητές που ασχολούνται με την ταξινόμησή τους. Φυτά του γένους Тhymus μπορεί κανείς να συναντήσει σε ένα εύρος διαφορετικών υψομέτρων (από μηδέν έως και πάνω από τα 2000 μέτρα) και τύπων βλάστησης (μεσογειακή έως και τα αλπικά λιβάδια). Η ικανότητα αυτή των φυτών να φύονται σε διαφορετικά περιβάλλοντα φαίνεται και από την ευρεία εξάπλωση τους σε ολόκληρη σχεδόν την Ελλάδα, απουσιάζοντας μόνο από τα νησιά του Ν. Αιγαίου (Morales, 1989).

3.3 ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝТΟΛΟΓΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ

Το θυμάρι αγαπά τον ήλιο. Τα φυτά συχνά ζουν σε βράχια ή πέτρες και είναι πολύ σημαντικό το γεγονός ότι τα εδάφη είναι πολύ ξηρά. Αλλά διαφορετικά είδη θυμαριού απαιτούν πολύ διαφορετικά υποστρώματα. Το Thymus vulgaris προτιμά τα ασβεστολιθικά εδάφη. Το θυμάρι είναι πολύ ανθεκτικό φυτό, για αυτό μπορούν να ζουν κάτω από ακραίες κλιματολογικές συνθήκες όσον αφορά τη θερμοκρασία και την παροχή νερού. Οι πυκνές και χνοώδης τρίχες, καθώς και βελονοειδή φύλλα επιτρέπουν κάποια είδη να υποστηρίζουν πολύ ξηρές συνθήκες. Η υψηλή παραγωγή των αιθέριων ελαίων μπορεί επίσης να είναι ένα προσαρμοστικό χαρακτηριστικό για το ξηρό κλίμα, επειδή οι πτητικές ουσίες εξατμίζονται και παράγουν μία κορεσμένη ατμόσφαιρα γύρω από το φυτό που κάνει την απώλεια νερού περισσότερο δύσκολη (Morales,1989).

9

3.4 ΣΥΣТΗΜΑТΙΚΗ ΒΟТΑΝΙΚΗ

Το γένος Thymus είναι ένα από τα πλέον σημαντικά γένη των Lamiaceae. Ανήκει στη φυλή Mentheae μέσα στην υποοικογένεια Nepetoideae. Τα πιο συγγενικά γένη είναι Origanum, Satureja, Micromeria και Thymbra. Tο Thymus θεωρείται ένα καλά καθορισμένο γένος, με βάση τα μορφολογικά και χημικά χαρακτηριστικά του είδους του (Morales, 1997).

Πολυετή, ημιθαμνώδη ή θάμνώδη, μερικές φορές με ποώδη σχήμα, αλλά ξυλώδη στη βάση.

Σύμφωνα με τον Jalas (1971),το γένος Thymus χωρίζεται σε οκτώ ενότητες: Micantes, Mastichina, Piperella, Teucrioides, Pseudothymbra, Thymus, Hyphodronzi, και Serpyllum.

I. Sect. Micantes II. Sect. Mastichina III. Sect. Piperella

10

IV. Sect. Teucrioides V. Sect. Pseudothymbra 1. Subsect. Pseudothymbra 2. Subsect. Anomalae VI. Sect. Thymus 1. Subsect. Thymastra 2. Subsect. Thymus VII. Sect. Hyphodromi 1. Subsect. Subbracteati 2. Subsect. Serpyllastrum 3. Subsect. Thymbropsis VII I. Sect. Serpyllum 1. Subsect. Insulares 2. Subsect. Kotschyani 3. Subsect. Pseudopiperellae 4. Subsect. Isolepides 5 . Subsect. Alternantes 6. Subsect. Pseudomarginati 7. Subsect. Serpyllum

Για το Τhymus που αποτελεί αντικείμενο της παρούσας μελέτης θα γίνει αναλυτικότερη αναφορά. Όρθια ή έρποντα φυτά με τριχωτούς μίσχους, φύλλα που στρέφονται προς τα πάνω, συνήθως τριχωτά και λουλούδια σε ταξιανθίες. Στο δυτικό τμήμα της Μεσογείου συναντάμε τα τρία πιο σημαντικά είδη: T. vulgaris, Τ. Ζygis και Τ. willdenowii. Το πρώτο φύεται συνήθως σε αλκαλικά εδάφη σε βόρεια Ιταλία, Νότια Γαλλία και ανατολική Ισπανία. Το Τ. zygis είναι ένα πολύ κοινό είδος σε όλη την Ιβηρική Χερσόνησο και ενώ το Τ. willdenowii είναι κοινό στη Βόρεια Αφρική (Μαρόκο και Αλγερία) και επίσης αναπτύσσεται στην περιοχή του Γιβραλτάρ στην Ιβηρική Χερσόνησο (Jalas,1971). Αναγνωρίζουμε δύο υποενότητες:

1. Subsect. Thymastra: Όρθια φυτά με τριγωνικά-ωοειδή ή λογχοειδή-ωοειδή φύλλα, χωρίς βλεφαρίδες στη βάση, με ταξιανθία περισσότερο ή λιγότερο στρόγγυλη και με βράκτια διαφορετικά από τα φύλλα.

Εδώ ανήκουν τα: Τ. capitellatus και Τ. camphoratus

2. Subsect. Thymus: Όρθια φυτά με φύλλα συνήθως τριχωτά, βλεφαριδωτά ή όχι στη βάση, με βράκτια πιο πλατιά από τα φύλλα, αλλά όχι πολύ διαφορετικά.

Εδώ ανήκουν τα: Τ. carnosus, T. vulgaris (subsp. vulgaris. και subsp. aestivus), Τ. orospedanus, T. hyemalis (subsp. hyemalis, subsp. millefloris και subsp. fumanifolius), T. zygis (subsp. zygis, subsp. gracilis, subsp. sylvestris), T. baeticus, T. willdenowii, T. loscosii, και Τ. serpylloides (subsp. serpylloides και subsp. gadorensis).

11

Για το Тhymus vulgaris varico III που μελετάται στη παρούσα εργασία θα μπορούσαμε συνοπτικά να δώσουμε τον παρακάτω πίνακα:

Domain (Αυτοκρατορία) Εukaryota Kingdom (Βασίλειο) Plantae Subkingdom (Υποβασίλειο) Τracheobionta Division (Διαίρεση) Magnoliophyta Class (Κατηγορία) Magnoliopsida Order (Τάξη) Lamiales Family (Οικογένεια) Lamiaceae Genus (Γένος) Тhymus Species (Είδος) Тhymus vulgaris Variety (Ποικιλία) Тhymus vulgaris varico III

3.5 ΣΥΝΩΝΥΜΑ

Тα συνώνυμα του Тhymus vulgaris, όπως τα συναντάμε στην βιβλιογραφία, είναι:

 common Тhyme (κοινό θυμάρι)  German Тhyme (γερμανικό θυμάρι)  garden Тhyme (θυμάρι του κήπου)  ή απλά Тhyme, δηλαδή σκέτο θυμάρι

3.6 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ

To γένος Τhymus αποτελεί μια ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα περίπτωση, για να μελετήσει κανείς την οικολογική και εξελικτική σημασία της χωροταξικής δομής του πληθυσμού. Από τις αρχές τις δεκαετίας του 1960 το είδος Thymus vulgaris ήταν στο επίκεντρο της οικολογικής και γενετικής έρευνας για την εξελικτική δυναμική του όχι μόνο σε ένα αλλά σε δυο γενετικούς πολυμορφισμούς (Thompson et al., 1998). Από το 1963, όταν ο καθηγητής Valdeyron ξεκίνησε να μετράει και να παρατηρεί τα θηλυκά άνθη στην περιοχή γύρω από το Μονπελιέ στη νότια Γαλλία, η λειτουργική σημασία και η εξελικτική δυναμική στο άγριο θυμάρι είχε κεντρίσει το ενδιαφέρον σε μεγάλο βαθμό στους ερευνητές. Ο σκοπός αυτής της έρευνας ήταν να διευκρινίσει γιατί τα θηλυκά είναι τόσο άφθονα σε πολλούς πληθυσμούς και τι είναι αυτό που προκαλεί μεταβολή στην αφθονία τους, μεταξύ των πληθυσμών.

Κατ' αρχάς, καθώς ανήκει στην οικογένεια Lamiaceae, το θυμάρι είναι ένα αρωματικό φυτό με αδενικές τρίχες στα φύλλα και τμήματα των ανθών να περιέχουν αιθέρια έλαια πλούσια σε μονοτερπένια. Τα φυτά του θυμαριού έχουν ποικιλομορφία στη σύσταση των αιθερίων ελαίων τους σε μονοτερπένια, με ένα μόνο μονοτερπένιο να βρίσκεται σε μεγάλο ποσοστό σε κάθε φυτό.

Η δεύτερη μορφή πολυμορφισμού είναι ο φυλετικός πολυμορφισμός στον οποίο οι φυσικοί πληθυσμοί περιλαμβάνουν δυο είδη φυτών, τα θηλυκά και τα ερμαφρόδιτα. Τα ερμαφρόδιτα φέρουν τέλεια άνθη, ενώ τα θηλυκά φέρουν μικρότερα άνθη που δεν έχουν ανθήρες ή έχουν μόνο στοιχειώδη ανθήρες που δε

12

φέρουν γύρη. Όλα τα άνθη σε ένα συγκεκριμένο φυτό είναι ή θηλυκά ή ερμαφρόδιτα (Thompson et al., 1998). Πρώτος ο Δαρβίνος (1877) παρατήρησε τον πολυμορφισμό αυτό.

3.6.1 Тhymus vulgaris varico III

Με σκοπό να ανταποκριθεί στις απαιτήσεις παραγωγών αλλά και καταναλωτών, διατέθηκε στην αγορά μια νέα ποικιλία υβριδικού θυμαριού το 1994, που ονομάζεται Varico. Χαρακτηρίζεται από την ομοιογένεια στον φαινότυπο του, στητό και ζωηρό φυτό. Το γκρι-μπλε φύλλωμα το διαφοροποιεί σαφώς από ποικιλίε γερμανικής προέλευσης με το γκρι-πράσινο χρώμα τους. Απαλό ροζ είναι τα άνθη του που ανθίζουν από τις 20 Μαΐου μέχρι 10 Ιουνίου στο Arbaz (Ελβετία, 920μ υψόμ.). Η καλή ποιότητά του αντικατοπτρίζεται στη μέση απόδοση σε αιθέριο έλαιο (3,9% v/w μετά από 5 συγκομιδές) και το ποσοστό της θυμόλης του πάνω από 50%. Η αντοχή του σε παγετό είναι καλή (Rey, 1994).

Οι in vitro τεχνικές καλλιέργειας παρέχουν ένα ευρύ φάσμα εργαλείων για τον παραγωγό που συμπληρώνουν τις επιλογές που πραγματοποιούνται ex vitro έξω από το εργαστήριο. Με την τροποποίηση των συνθηκών στις οποίες εκτίθεται το φυτό, ο ερευνητής είναι σε θέση να επηρεάσει αλλά και να προσδιορίσει τις μεταβολικές οδούς του φυτού. Οι συνθήκες αυτές περιλαμβάνουν ένα πλήθος παραμέτρων όπως είναι η θερμοκρασία, η ποιότητα και η ένταση του φωτός και η σύσταση του υποστρώματος αλλά και της ατμόσφαιρας.

Тο Agroscope Changins-Wadenswill ACW διεξήγαγε ένα πρόγραμμα για την βελτιστοποίηση της ποσότητας και της απόδοσης του Тhymus vulgaris, και έλαβε 56 νέα υβρίδια διασταυρώνοντας 5 στείρα αρσενικά με 12 γόνιμους αρσενικούς κλώνους.

13

Тο πιο ενδιαφέρον που δημιουργήθηκε είναι το "Varico 3" που χαρακτηρίζεται από την υψηλή ομοιογένεια, τον χημειότυπο της θυμόλης και την υψηλή περιεκτικότητα σε αιθέρια έλαια (>5%).

Тο Varico 3 καλλιεργήθηκε για 3 χρόνια (2007-2009) σε πεδιάδες και βουνά και συγκρίθηκε με άλλες ποικιλίες από Ελβετία, Γερμανία και Γαλλία. Υπολογίστηκε η επίδραση του αριθμού των αδενικών τριχών και της περιόδου συλλογής στη σύσταση του αιθέριου ελαίου. Η μέγιστη παραγωγή αιθερίων ελαίων παρατηρείται το πρωί και η μέγιστη συγκέντρωση αιθερίου ελαίου είναι στη δεύτερη συγκομιδή μεταξύ 20 Ιουλίου και 20 Αυγούστου (Vouillamoz, 2011).

Οι ποικιλίες αξιολογήθηκαν για την ομοιογένεια τους συλλέγοντας 10 στελέχη ανά υβρίδιο σύμφωνα με ένα καθορισμένο σχέδιο. Тα διαφορετικά χαρακτηριστικά των φυτών μετρήθηκαν στη συνέχεια, όπως το μήκος των βλαστών, η απόσταση μεταξύ των κόμβων από το 5ο έως το 6ο φύλλο και το μήκος των φύλλων από τον 5ο κόμβο. Η απόδοση σε ξηρό βάρος και σε αιθέριο έλαιο, καθώς και η ανοχή στο χειμώνα και το παγετό μελετήθηκαν επίσης (Vouillamoz, 2011).

Ειδικότερα, το υβρίδιο "VARICO 3" έδειξε υψηλή περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο με 4,4% κατά μέσο όρο από 5 συγκομιδές και υψηλή απόδοση των φύλλων. Οι "γονείς" αυτού του υβριδικού είναι καλά συγχρονισμένοι στις περιόδους ανθοφορίας τους και έχουν ένα αρκετά καλό δυναμικό παραγωγής σπόρων. Η σύγκριση των 56 υβριδίων έδειξε ότι τα υβρίδια του θυμαριού με υψηλή παραγωγή βιομάζας δεν χαρακτηρίζονται αναγκαστικά από χαμηλή περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο. Αυτό δείχνει ότι οι διαδικασίες που διέπουν την παραγωγή ξηρού βάρους και την παραγωγή του ελαίου δεν σχετίζονται άμεσα. Αυτό δίνει τη δυνατότητα να αναπαράγονται για την αύξηση των αποδόσεων και την περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο ταυτόχρονα (Vouillamoz, 2011).

14

Παρακάτω δίνεται πίνακας με τη σύγκριση των 56 νέων υβριδίων του θυμαριού με τις αποδόσεις και τη περιεκτικότητα των φύλλων σε έλαιο και αντιστοιχούν στο άθροισμα / μέσο όρο 5 συγκομιδών (2000-2002) στο Arbaz .

Διασταύρωση Αριθμός Συνολική Περιεκτικότητα Απόδοση Απόδοση MS x MF υβριδίου απόδοση σε αιθέριο έλαιο αιθέριου σπόρων ξηρής (% v/w) ελαίου (g/plant) μάζας (L/ha) (t/ha) DW-1 x ACW- 48 13,1 3,6 261 0,3 b ACW-1 x 3 (' 12,6 4,4 288 0,4 ACW-a Varico 3') DW-1 x A-c 38 12,3 4,5 300 0,1 A-2 x ACW-b 46 11,5 3,8 229 0,2 A-1 x ACW-b 45 11,5 4,3 278 0,4 DW-2 x ACW- 49 11,4 3,5 221 0,1 b DW-1 x A-a 16 11,4 3,8 230 0,5 A-2 x ACW-a 2 11,2 4,3 258 0,2 A-4 x ACW-b 52 11,1 3,7 230 0,7 DW-1 xACW-a 4 11,0 3,7 225 1,0 A-4 x A-c 42 10,8 4,3 255 0,1 A-1 x ACW-a 1 10,3 4,6 266 0,1 A-6 x ACW-a 12 9,8 4,9 268 0,2 A-5 x ACW-a 9 9,8 4,5 247 0,4 ACW-2 x 50 9,8 3,7 203 0,6 ACW-b A-4 x ACW-a 8 9,7 3,9 204 0,4 A-5 x ACW-b 53 9,7 4,5 247 0,3 A-3 x ACW-a 7 9,7 4,4 237 0,7 A-4 x A-b 31 9,5 4,4 227 1,0 DW-1 x A-b 27 9,5 4,0 209 0,2 A-3 x ACW-b 51 9,2 4,1 212 0,4 ACW-3 x 10 9,0 3,8 189 0,8 ACW-a ACW-2 x A-c 40 8,9 4,2 204 0,2 ACW-3 x 54 8,8 4,1 206 0,4 ACW- b ACW-2 x A-a 18 8,8 3,7 184 1,0 ACW-2 x A-b 29 8,7 4,3 217 1,0 A-6 x ACW-b 56 8,6 4,6 229 0,1 A-2 x A-c 36 8,6 4,5 208 0,1 A-4 x A-a 20 8,5 3,7 174 0,6 ACW-4 x A-c 44 8,5 4,2 201 1,4

15

ACW-1 x 46 8,4 4,1 201 0,8 ACW-b ACW-2 x 6 8,3 3,9 184 0,7 ACW-a A-2 x A-b 25 8,0 4,2 177 0,4 DW-2 x ACW- 5 7,8 3,5 160 0,5 a ACW-1 x A-b 26 7,7 4,8 196 0,4 ACW-4 x 11 7,7 4,0 166 2,9 ACW-a ACW-4 x 55 7,6 3,8 165 1,2 ACW-b DW-2 x A-a 17 7,5 3,4 145 0,1 A-2 x A-a 14 7,5 4,1 168 0,1 ACW-3 x A-c 43 7,4 4,0 163 0,3 ACW-1 x A-a 15 7,2 4,3 178 0,4 ACW-1 x A-c 37 7,0 5,2 201 0,1 ACW-3 x A-a 22 6,9 4,0 154 0,5 ACW-4 x A-a 23 6,8 4,1 155 2,3 A-1 x A-b 24 6,3 5,1 178 0,5 ACW-4 x A-b 34 5,8 4,0 132 1,8 A-1 x A-c 35 5,8 4,8 156 0,6 A-5 x A-b 32 5,7 4,6 153 0,3 DW-2 x A-c 39 5,4 3,6 109 0,1 ACW-3 x A-b 33 5,4 4,3 127 0,6 A-1 x A-a 13 5,3 4,5 143 0,9 A-5 x A-a 21 5,1 4,1 119 0,3 A-3 x A-b 30 5,0 4,6 126 0,1 DW-2 x A-b 28 4,4 3,7 91 0,1 A-3 x A-a 19 3,1 3,9 66 0,1 A-3 x A-c 41 3,0 4,1 69 0,1 MS= male sterile, MF= male fertile, assessions from ACW= Agroscope ACW, DW= Deutscher Winter, A=Aosta Valley

16

Στη συνέχεια δίνεται ένας πίνακας με τη σύγκριση από έξι ποικιλίες θυμαριού ως προς τις αποδόσεις και τη σύσταση σε αιθέρια έλαια, παίρνοντας ένα μέσο όρο από τα 3 χρόνια καλλιέργειας τους στο Arbaz.

Ποικιλία Αναλογία Περιεκτικότητα Απόδοση φύλλων (%) φύλλων σε αιθερίων αιθέρια έλαια ελαίων (% v/w) (L/ha) Varico 3 63 4,9 191 Varico 2 63 3,5 146 Deutscher 67 2,9 97 Winter L2 67 4,9 130 112 64 6,2 212 147 64 5,1 150

Η σύσταση αιθερίων ελαίων των 6 ποικιλιών του θυμαριού δίνεται στο παρακάτω πίνακα, από τις καλλιέργειες που συλλέχθηκαν στον πρώτο χρόνο τους τον Ιούνιο (2008) στο Arbaz.

Ποικιλία Thymol Carvacrol Linalool γ-Terpinene p- Cymene (%v/v) (%v/v) (%v/v) (%v/v) (%v/v) Varico 3 65 3 2 13 7 Varico 2 57 3 2 15 8 Deutscher 56 3 2 16 9 Winter L2 11 23 48 5 3 112 30 31 5 15 7 147 22 41 6 11 8

Συμπερασματικά, οι ποικιλίες VARICO 3 και VARICO 2 παρουσίασαν τις υψηλότερες αποδόσεις ξηρού βάρους. Η ποικιλία Deutscher Winter και η υβριδική ποικιλία 122, παρήγαγαν περίπου 25% μικρότερη απόδοση ξηρού βάρους. Οι χαμηλότερες αποδόσεις σε ορεινές περιοχές ελήφθησαν με τις δύο γαλλικές ποικιλίες L2, και 147. Η Deutscher Winter είχε τη χαμηλότερη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο (λιγότερο από 3%). Η VARICO 3 είχε περίπου 75% και η VARICO 2 25% υψηλότερες περιεκτικότητες από την Deutscher Winter. Την υψηλότερη περιεκτικότητα σε έλαιο έδωσαν οι τρεις γαλλικές ποικιλίες. Δεν καταγράφηκαν ζημιές λόγω παγετών το χειμώνα σε καμία από όλες τις ποικιλίες (Carlen, 2010).

17

4. ΣΥΓΚΟΜΙΔΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ

Λόγω του ότι το θυμάρι καλλιεργείται ευρέως καθώς αποτελεί εμπορικό προϊόν με οικονομικά οφέλη εξαιτίας των ευεργετικών του ιδιοτήτων, και μάλιστα η εξεταζόμενη ποικιλία Тhymus vulgaris varico III δημιουργήθηκε και καλλιεργείται καθαρά για εμπορικούς σκοπούς, αξίζει να αναφερθούν κάποια πράγματα σχετικά με τον τρόπο συγκομιδής αλλά και περεταίρω επεξεργασίας του φυτού έτσι ώστε να λαμβάνεται τελικό προϊόν αρίστης ποιότητας.

4.1 ΣΥΓΚΟΜΙΔΗ

Υπάρχουν πολλά είδη θυμαριού, ωστόσο, μόνο λίγα από αυτά έχουν εμπορική σημασία (Reineccius, 1994), όπως τα: Τ. vulgaris L., Τ. Ζygis L. ssp. gracilis Boiss. (κόκκινο θυμάρι), Τ. satareioides , Τ. serpyllum L. (άγριο θυμάρι), Τ. capitatus (ισπανική ρίγανη). Τα δύο πρώτα είναι είδη που χρησιμοποιούνται ευρέως και οι βιβλιογραφικές πηγές ασχολούνται κυρίως με αυτά δύο βότανα. Tο Τ. vulgaris είναι το μόνο είδος που καλλιεργείται εμπορικά σε μεγάλες ποσότητες. Άλλα είδη θυμαριού συλλέγονται άγρια από τη φύση, αποξηραίνονται και χρησιμοποιούνται ως φαρμακευτικά βότανα. Προκειμένου να αποκτήσει το προϊόν την καλύτερη ποιότητα, η συγκομιδή, καθώς και η ανάπτυξη και όλα τα άλλα στάδια επεξεργασίας του θυμαριού θα πρέπει να βελτιστοποιηθούν εξετάζοντας διάφορους σημαντικούς παράγοντες. Αυτοί οι παράγοντες, οι οποίοι σε γενικές γραμμές είναι κοινοί σε πολλά αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά, θα συζητηθούν εν συντομία. Τα στάδια κοπής και επεξεργασίας που φαίνονται στο παρακάτω διάγραμμα αντιπροσωπεύουν τις πλέον παραδοσιακές διαδικασίες, οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί γενικά στην παρασκευή των αποξηραμένων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών (Reineccius, 1994).

Το Thymus vulgaris ευδοκιμεί στην περιοχή της Μεσογείου, ωστόσο, επίσης καλλιεργείται ευρέως σε διάφορα μέρη του κόσμου, συμπεριλαμβανομένης της Βόρειας Αμερικής, της Ευρώπης και της Βόρειας Αφρικής. Σε γενικές γραμμές, το θυμάρι είναι πιο αρωματικό κατά την περίοδο της άνθισης (ή στην αρχή της πλήρης άνθισης). Ως εκ τούτου, η περίοδος αυτή θεωρείται ως η καλύτερη στιγμή για τη συγκομιδή. Ωστόσο, η περίοδος της βλάστησης και η ανθοφορία μπορεί να είναι

18

διαφορετικές σε διάφορες γεωγραφικές ζώνες ανάλογα με τις κλιματολογικές συνθήκες τους. Η Ισπανία είναι ένας από τους μεγαλύτερους παραγωγούς θυμαριού στην περιοχή της Μεσογείου, και η συγκομιδή πραγματοποιείται κατά την ανθοφορία, δηλαδή την περίοδο από το Φεβρουάριο έως τον Αύγουστο, ανάλογα με το είδος (Tainter και Grenis, 1993). Στη Γαλλία, το θυμάρι μπορεί να συλλέγεται δύο φορές το χρόνο, μία τον Μάιο και στη συνέχεια και πάλι το Σεπτέμβριο. Στις κεντρικές περιοχές της Ρωσίας το θυμάρι συλλέγεται κατά τη διάρκεια του δεύτερου έτους της βλάστησης του φυτού (Poludennij και Zhuravlev, 1989). Συνήθως, η πρώτη κοπή εκτελείται τον Ιούνιο κατά τη διάρκεια της ανθοφορίας, ενώ η δεύτερη τον Σεπτέμβριο-Οκτώβριο, δηλαδή 1,5-2 μήνες πριν το τέλος βλάστησης. Τα εναέρια τμήματα κόβονται σε 10-15 cm ύψος από το έδαφος.

Η ποιότητα του βοτάνου εξαρτάται από την τοποθεσία και τις κλιματικές συνθήκες της καλλιέργειας. Η συγκέντρωση των αιθερίων ελαίων (ΕΟ) στα βότανα, άμεσα ή έμμεσα, εξαρτάται από το φως. Ο Li et.al. (1996) μελέτησε την ουσιαστική παραγωγή ελαίου στο θυμάρι και το φασκόμηλο που καλλιεργούνται στο 15%, 27%, 45% και 100% φως του ήλιου. Τα αποτελέσματά τους έδειξαν ότι η υψηλότερη απόδοση των αιθέριων ελαίων και το ποσοστό της θυμόλης και μυρκενίου στο θυμάρι εμφανίστηκε σε πλήρες φως του ήλιου. Οι καιρικές συνθήκες κατά τη διάρκεια της ημέρας της συγκομιδής, είναι επίσης σημαντικές. Σε γενικές γραμμές, ηλιόλουστες ημέρες θα πρέπει να προτιμώνται, αφού έχει εξαφανιστεί η πρωινή υγρασία. Τα φυτά που συλλέγονται μετά από βροχή ή με υγρασία είναι δύσκολο να στεγνώσουν, θα αλλοιωθούν πολύ γρηγορότερα, και θα επηρεαστεί αρνητικά η ποιότητα του χρώματός τους και των χρήσιμων ιδιοτήτων τους (Kauniene και Κaunas, 1991).

Τα περισσότερα φαρμακευτικά φυτά άγριας καλλιέργειας συλλέγονται με το χέρι. Ο κύριος στόχος αυτής της συγκομιδής είναι να συλλέγονται τα πιο πολύτιμα ανατομικά μέρη των φυτών. Στη περίπτωση του θυμαριού (Τ. serpyllum, Τ. pulegioides, Τ. vulgaris και άλλα είδη), αυτά είναι τα φύλλα και τα ανθοφόρα μέρη. Ξυλώδη τμήματα, τα οποία είναι ήσσονος αξίας, θα πρέπει να αποφεύγονται όσο το δυνατόν περισσότερο. Για παράδειγμα, οι Guillen και Manzanos (1998) μελέτησαν τη σύνθεση ενός ισπανικού Τhymus vulgaris και διαπίστωσαν ότι η απόδοση που λαμβάνεται από την εκχύλιση με διχλωρομεθάνιο από φύλλα και άνθη ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη που λαμβάνεται από τους βλαστούς. Η χημική σύνθεση των εκχυλισμάτων που λαμβάνονται από διαφορετικές ανατομικές περιοχές ήταν επίσης διαφορετική. Είναι επίσης σημαντικό, για την αποφυγή καταστροφής των εκτάσεων καλλιέργειας των φυτών, να εξασφαλιστούν ανανεώσιμες καλλιέργειες κατά τη διάρκεια των επόμενων ετών από τη συγκομιδή. Τα απλά μέσα που προτείνονται στα πολυάριθμα εγχειρίδια για τους παραγωγούς φαρμακευτικών φυτών είναι, π.χ. να χρησιμοποιήσει ψαλίδι ή μαχαίρι για να κόψει το χορτάρι αντί του ξεριζώματος (Borngen, 1979). Το Τhymus vulgaris ως ένα εμπορικά καλλιεργούμενο βότανο μπορεί να συγκομισθεί πιο αποτελεσματικά από κοινά μηχανήματα συγκομιδής, που κόβουν το φυτό σε ύψος 10-15 cm από το έδαφος (Mashanov και Pokrovskij, 1991).

Η απόδοση αιθερίου ελαίου και η χημική σύνθεση του είναι τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των αρωματικών φυτών. Η σύσταση των αιθερίων ελαίων του

19

Τhymus vulgaris που καλλιεργούνται στη Λιθουανία έχει ερευνηθεί σε διαφορετικές φάσεις βλάστησης (Venskutonis). Τα αποτελέσματα της συνολικής περιεκτικότητας σε έλαιο και μερικά από τα συστατικά του στα φύλλα (L) και άνθη (F) δίνονται στο παρακάτω πίνακα.

Περιεκτικότητα (%) των αιθερίων ελαίων του θυμαριού (Тhymus vulgaris) σε διάφορες ημερομηνίες συλλογής.

Συστατικό Φύλλα Φύλλα Φύλλα Φύλλα Φύλλα Φύλλα Φύλλα - 25 6 - Άνθη -Άνθη -Άνθη -Άνθη Άνθη Μαΐου Ιουνίο 16 28 7 19 7 υ Ιουνίο Ιουνίο Ιουλίο Ιουλίο Αυγούστο υ υ υ υ υ α-Тhujene 0.59 0.62 0.67 0.72 0.50 0.97 0.98 α-Pinene 0.67 0.50 0.55 0.50 0.43 0.64 0.63 Camphene 0.52 0.26 0.25 0.22 0.22 0.32 0.34 Oct-1-en-3-ol 0.61 0.56 0.51 0.71 0.73 0.52 0.76 Myrcene 1.17 1.07 1.19 1.114 0.84 1.52 1.66 α-Тerpinene 1.37 1.00 1.23 1.03 0.69 1.82 1.89 p-cymene 14.43 10.21 11.19 8.27 10.83 7.36 6.63 Limonene 0.29 0.25 0.28 0.24 0.35 0.33 0.39 β- 0.76 0.45 0.48 0.50 0.72 0.49 0.37 Phellandrene 1,8-cineole 0.29 0.25 0.28 0.24 0.36 0.33 0.42 γ-Тerpinene 13.40 6.52 7.50 7.58 5.23 16.39 17.21 tr-Sabinene 0.27 0.64 0.60 0.71 0.79 0.86 0.82 hγdrate Linalool 1.60 2.04 1.91 2.23 2.51 1.79 1.70 Camphor 0.25 0.19 0.08 0.12 0.23 0,17 0.19 Borneol 1.30 0.78 0.65 0.63 0.73 0.78 0.83 Тerpinen-4- 0.83 0.67 0.67 0.62 0.72 0.57 0.54 ol α-Тerpineol 0.27 0.17 0.22 0.23 0.21 0.21 0.18 Тhymol 2.61 0.59 0.34 1.33 0.52 0.73 0.46 methyl ether Carvacrol 1.58 0.44 0.23 0.89 0.32 0.52 0.13 methyl ether Тhymol 49.12 65.98 63.11 65.20 66.94 57.13 57.91 Carvacrol 1.66 3.35 3.33 2.95 3.79 2.55 2.83 β- 1.87 2.74 2.44 2.41 1.90 1.76 1.75 caryophyllen e γ-cadinene 0.40 0.31 0.30 0.37 0.26 0.24 0.17 δ-cadinene 0.22 0.40 0.28 0.33 0.25 0.16 0.15 Caryophyllen 0.44 0.41 0.37 0.32 0.60 0.23 0.13 e oxide Т-cadinol 0.78 0.28 0.38 0.48 0.32 0.46 0.26

20

Aιθέριο 1.75 1.40 2.90 2.86 2.14 3.24 4.29 έλαιο (%)

Η μεγαλύτερη ποσότητα αιθέριου ελαίου αποστάζεται από τα ανθισμένα τμήματα που συλλέγονται στις τελευταίες φάσεις της ανθοφορίας. Το ποσοστό του p- κυμένιο ήταν υψηλότερo τoν Μάιο, ενώ η περιεκτικότητα τoυ μεγάλoυ φαινολικoύ συστατικoύ θυμόλη στην ίδια φάση ήταν η χαμηλότερη. Έπειτα αυξήθηκε και ήταν αρκετά σταθερή κατά την περίοδο της βλάστησης. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι το ποσοστό του α-τερπινένιο τον Ιούνιο - αρχές Ιουλίου ήταν μάλλον χαμηλή, ωστόσο, αυξήθηκε σημαντικά στο τέλος του Ιουνίου και αρχές Αυγούστου, όταν παρατηρήθηκε κάποια μείωση στην περιεκτικότητα θυμόλης. Ο Mohamed (1997) επίσης ανέφερε την επίδραση του χρόνου της συγκομιδής για τη σύνθεση του αιθέριου ελαίου από το Τ. vulgaris. Όσον αφορά τη χρήση του αιθέριου ελαίου ως συστατικό τροφίμων, προτείνεται ότι η πιο ενδιαφέρουσα φάση είναι η μετα- ανθοφορίας περίοδος, το αιθέριο έλαιο αυτή τη στιγμή είναι πλούσιο σε θυμόλη (περίπου 21 %), γερανυλο-οξικό (περίπου 17 %) και γερανιόλη (περίπου 13 %).

4.2 ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ

Μόνο ένα μικρό μέρος των θυμαριών που συγκομίζονται μπορούν να καταναλωθούν ως νωπά φυτά. Οι τεχνικές επεξεργασίας σε γενικές γραμμές πού εφαρμόζονται στο γένος Thymus είναι παρόμοιες με αυτές που εφαρμόζονται συνήθως για πολλά άλλα της οικογένειας Lamiaceae. Αυτές οι τεχνολογίες και οι παράμετροι επεξεργασίας παρουσιάζονται διεξοδικά σε αρκετά διεθνώς αναγνωρισμένα εγχειρίδια, βιβλία και μονογραφίες (Tainter και Grenis 1993, Heath και Reineccius 1986, Farrell 1985, Heath 1981, Reineccius 1994, Underriner και Hume 1994, Richard 1992, Ashurs 1991, Gerhard 1994).

Η διάρκεια ζωής των φρέσκων αρωματικών είναι συνήθως πολύ μικρή και, ως εκ τούτου, παραδοσιακά, τα βότανα χρησιμοποιούνται ως αποξηραμένα προϊόντα. Ωστόσο, οι διαδικασίες για την παράταση της διάρκειας ζωής των βοτάνων και μπαχαρικών έχουν αναπτυχθεί. Η αποθήκευση φρεσκοσυλλεχθέντων βοτάνων σε θερμοκρασία κοντά στους 0⁰C είναι η πιο απλή μέθοδος για να παρατείνει τη διάρκεια ζωής των φρέσκων βοτάνων. Τέτοια αποθήκευση μπορεί να καθυστερήσει την καταστροφή του φυτού για λίγες μόνο ημέρες. Ορισμένες διαδικασίες για την παραγωγή κατεψυγμένων βοτάνων, τα οποία διατηρούν τη γεύση και την εμφάνισή τους για σημαντικά μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, έχουν πρόσφατα αναπτυχθεί και δοκιμαστεί. Για παράδειγμα, ο LaBell (1991) περιγράφει μία διαδικασία κατά την οποία τα φυτά καθαρίζονται, ψιλοκόβονται και επιστρώνονται ελαφρώς με λάδι canola λίγες ώρες μετά τη συγκομιδή. Μια μικρή ποσότητα του οξέως προστίθεται επίσης τα βότανα να αναστέλλει την αμαύρωση. Τα βότανα μετά αποθηκεύονται κατεψυγμένα και με αυτό τον τρόπο είναι σταθερά για 1 χρόνο. Η επεξεργασία αυτή επιτρέπει σε περισσότερες πτητικές ουσίες να διατηρηθούν από ότι με τη ξήρανση.

21

4.2.1 ΑΠΟΞΗΡΑΝΣΗ

Η ξήρανση είναι αναμφίβολα η πιο αρχαία και ακόμα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος επεξεργασίας των νωπών βοτάνων. Κατά τη στιγμή της συγκομιδής, τα περισσότερα βότανα και μπαχαρικά περιέχουν 60-85% νερό. Προκειμένου να ληφθούν σταθερά προϊόντα, τα οποία θα αντέχουν για μεγάλες περιόδους αποθηκευμένα χωρίς να υποβαθμίζονται, αυτή πρέπει να μειωθεί σε 8- 10%. Η ξήρανση είναι η πιο κρίσιμη διαδικασία λόγω της αστάθειας και της ευαισθησίας στις χημικές αλλαγές στο αιθέριο έλαιο (Heath, 1982).

Ανάλογα με το βότανο ή μπαχαρικό η αναλογία του βάρους του φρέσκου ακατέργαστου υλικού με το βάρος του ξηρού προϊόντος μπορεί να είναι από 1: 1 έως 10: 1. Για θυμάρι η αναλογία αυτή μπορεί να είναι από 3: 1 έως 5:1 (Gerhardt, 1994). Η διαδικασία της ξήρανσης για πολλά φαρμακευτικά και αρωματικά φυτά είναι κρίσιμη για τον καθορισμό της ποιότητας του αποξηραμένου υλικού και των προϊόντων που παράγονται από αυτό. Οι Heindl και Μiller (1997) περιγράφουν διεξοδικά την ξήρανση των φαρμακευτικών φυτών και μπαχαρικών. Παραδοσιακά τα βότανα κόβονται και στεγνώνουν στον ήλιο ή στη σκιά.

Σε γενικές γραμμές, όλες οι μέθοδοι ξήρανσης μπορoυν να διαιρεθούν σε θερμική και μη-θερμική ξήρανση. Οι θερμικές μέθοδοι μπορούν να ταξινομηθούν σε (1) φυσικό άμεσο στέγνωμα (ξήρανση του αέρα με την ενίσχυση της ενέργειας του ήλιου), (2) ηλιακή έμμεση ξήρανση, και (3) την τεχνητή αποξήρανση (με τη βοήθεια ζέστης, κρύου ή IR). Μη θερμική ξήρανση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη χρήση (1) υλικά που απορροφούν υγρασία , (2) παράγοντες ξήρανσης και (3)ηλεκτρολύτες (Gerhardt, 1994). Υπάρχουν διαφορετικές τροποποιήσεις αυτών των μεθόδων, οι οποίες χρησιμοποιούνται ανάλογα με το κόστος και τις απαιτήσεις ποιότητας. Η φυσική ξήρανση είναι ο απλούστερος τρόπος για την προετοιμασία βοτάνων για την αποθήκευση και την περαιτέρω επεξεργασία. Μέχρι στιγμής, καθώς η μέθοδος είναι φθηνή και δεν απαιτεί δαπανηρό εξοπλισμό ευρέως χρησιμοποιείται σε πολλές χώρες. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι της ξήρανσης των πρώτων υλών, όπως σε ήλιο ξήρανση (SD), ξήρανση στη σκιά, ηλιακή ξήρανση, ξήρανση με θερμό αέρα. Η μέθοδος της υπό ήλιο ξήρανσης είναι η πιο συνήθης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, το υλικό πρώτα θρυμματίζεται και απλώνεται στο έδαφος σε ψάθες και εκτίθενται στο άμεσο ηλιακό φως. Αυτή η μέθοδος είναι απλή και πολύ φθηνή. Ωστόσο, διαθέτει κάποια μειονεκτήματα: (α) τη δυνατότητα για την εισαγωγή των ρύπων με πολλούς διαφορετικούς τρόπους (τρωκτικά, έντομα, και προκύπτουσα μόλυνση τους), (β) η απώλεια πτητικών υλών , (γ) η υποβάθμιση των θερμό- ή φωτό- ευαίσθητων συστατικών, (δ) τις δυσκολίες στον έλεγχο της διαδικασίας, (ε) συνήθως μεγάλο χρονικό διάστημα της ξήρανσης. Φυσική ξήρανση του ολόκληρου T. vulgaris βότανου είναι ιδιαίτερα προβληματική, διότι ο θάμνος αποτελείται από φύλλα πού στεγνώνουν γρήγορα σε σχέση με το ξυλώδες μέρος. Ως εκ τούτου, η διαδικασία μπορεί να διαρκέσει έως και 120 ώρες προκαλώντας σοβαρή απώλεια του πτητικού ελαίου (Raghavan, 1995).

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι όσο υψηλότερη είναι η θερμοκρασία ξήρανσης, τόσο μικρότερη είναι η ώρα της διαδικασίας. Ωστόσο, έχουμε μεγαλύτερες απώλειες του

22

πτητικού ελαίου. Οι θερμοκρασία ξήρανσης και όροι θα πρέπει να είναι προσαρμοσμένα για κάθε αρωματικό φυτό για να επιτευχθεί η βέλτιστη ποιότητα. Οι Poludennij και Zhuravlev (1989) προτείνουν ξήρανση για θυμάρι στη σκιά σε καλά αεριζόμενους χώρους. Όταν χρησιμοποιείται φούρνος ξήρανσης, η θερμοκρασία δεν πρέπει να υπερβαίνει 43- 45⁰C. Μέχρι στιγμής οι παραδοσιακές συνθήκες ξήρανσης απαιτούν μεγάλο χρόνο στεγνώματος. Υπάρχουν μερικές ενδιαφέρουσες εκθέσεις σχετικά με τη χρήση διαφορετικών μεθόδων που αποσκοπούν στη βελτίωση της διαδικασίας επεξεργασίας του βότανου. Οι Aung και Fulger (1993) περιγράφουν μία μέθοδο για την ξήρανση φρέσκων αρωματικών φυτών διατηρώντας παράλληλα το χρώμα, το άρωμα, τη γεύση και τη συνολική τους εμφάνιση και περιλαμβάνει κατεργασία με ένα οσμωτικό παράγοντα ο οποίος, μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας ξήρανσης, αποτελεί μια σταθερή άμορφη μάζα. Αυτή η μάζα επικαλύπτει και εμποτίζει το επεξεργασμένο βότανο. Μία μέθοδος για την διατήρηση των βοτάνων ή άλλων αρωματικών φυτών βασίζεται στην ανάμιξη του βρώσιμου μέρους του φυτού με μια ουσία που μειώνει την ενεργότητα του νερού. Διάφορα μπαχαρικά ξηραίνονται με ένα ξηραντήριο αφύγρανσης, στο οποίο οι δίσκοι των προϊόντων είναι παράλληλα και ο αέρας κυκλοφορεί από έναν ανεμιστήρα. Μετά το πέρασμα μέσα από το προϊόν, ο υγρός αέρας ψύχεται, για την απομάκρυνση των υδρατμών, και στη συνέχεια θερμαίνεται πριν ξαναμπούν τα προϊόντα (Rattanapant και Phongpipatpong, 1990).

4.2.2.ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ

Το 1975, η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) ξεκίνησε μια μελέτη διάρκειας τριών χρόνων, συμπεριλαμβάνοντας περισσότερα από 1.000 δείγματα, για την ανάπτυξη δεδομένων για τα επίπεδα μόλυνσης από έντομα, πουλιά, τρωκτικά και άλλα ζώα σε επιλεγμένες αγορές, σε αλεσμένα και μη αλεσμένα μπαχαρικά (Gecan, 1986). Η δειγματοληψία και αναλυτικές λεπτομέρειες σχετικά με εννέα καρυκευμάτων (συμπεριλαμβανομένου και το θυμάρι) από το εν λόγω πρόγραμμα παρουσιάστηκαν. Οι έρευνες δείχνουν ότι το θυμάρι ήταν ένα πολύ μολυσμένο βότανο, ιδιαίτερα με υπολείμματα εντόμων, ακάρεων, θρίπες και αφίδες.

Οι Tainter και Grenis (1993) έχουν περιγράψει τις γενικές αρχές των μεθόδων καθαρισμού και τον εξοπλισμό. Οι αρχές όλων των εξοπλισμών καθαρισμού είναι με βάση τη φυσική διαφορά (δηλαδή το σχήμα, πυκνότητα) μεταξύ του βοτάνου και το ξένου υλικού που θέλουμε να αφαιρεθεί. Ο εξοπλισμός μπορεί να αποτελείται από μαγνήτες, κόσκινα, διαχωριστές αέρα, διαχωριστές σπιράλ και άλλα. Η επιλογή των μεθόδων καθαρισμού και ο εξοπλισμός εξαρτάται από τα φυσικά χαρακτηριστικά του βότανου, το κόστος του μηχανήματος, την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας της αφαίρεσης των ξένων αντικειμένων, και την απώλεια του κύριου υλικού κατά τον καθαρισμό.

Στη διαδικασία είναι απαραίτητο να καθοριστούν τα όρια των ξένων σωμάτων στα καθαρισμένα προϊόντα. Μερικά από αυτά τα χαρακτηριστικά συνήθως παρέχονται στους κανονισμούς για ένα συγκεκριμένο μπαχαρικό ή βότανο. Μαγνήτες χρησιμοποιούνται ευρέως για την εξάλειψη σιδηρομαγνητικών σωματιδίων από

23

βότανα και μπαχαρικά. Τα σύγχρονα συστήματα διασφάλισης της ποιότητας, π.χ. HACCP), απαιτούν από κάθε σύστημα καθαρισμού βοτάνου να περιλαμβάνει μαγνήτες ή άλλες συσκευές ανίχνευσης μετάλλων. Ο κύριος σκοπός της απομάκρυνσης μετάλλων από τα προϊόντα είναι να προστατεύσει τον τελικό χρήστη από φυσικούς κινδύνους. Υπόλοιπα κομμάτια μετάλλων μπορούν επίσης να βλάψουν άλλους εξοπλισμούς επεξεργασίας, π.χ. μηχανήματα άλεσης (Tainter και Grenis, 1993).

Η πιο βασική μηχανή καθαρισμού είναι η χρησιμοποίηση του κόσκινου. Περνώντας το βότανο πάνω από ένα σύνολο κόσκινων είναι δυνατόν να απομακρυνθούν τα μεγαλύτερα και μικρότερα σωματίδια από το προϊόν που καθαρίζεται. Αν και η αρχή του κοσκινίσματος είναι αρκετά απλή, είναι μάλλον δύσκολο στην πράξη, διότι τα αποξηραμένα βότανα είναι τυχαία κομμάτια των φύλλων. Ως εκ τούτου, γενικά δεν χρησιμοποιούνται κόσκινα για τον καθαρισμό, αλλά και για το μέγεθος. Ένας πίνακας αέρα ή ένας διαχωριστής βαρύτητας είναι το πιο ευέλικτο κομμάτι του εξοπλισμού καθαρισμού για τα βότανα και τα μπαχαρικά. Στην πραγματικότητα, ένα τραπέζι αέρα είναι μια σίτα από συρματόπλεγμα με ένα ρεύμα αέρος να φυσά επάνω μέσα από αυτό. Το ρεύμα αέρα φυσά τα πολύ ελαφρά κομμάτια από το σύστημα. Κατά την διάρκεια λειτουργίας η σίτα έχει κλίση και όλα τα σωματίδια θυμαριού κινούνται προς το κάτω άκρο της σίτας. Περιστροφική δόνηση μεταδίδεται στην σίτα, η οποία ρυθμίζεται έτσι ώστε μόλις αγγίζει τα βαρύτερα σωματίδια να χτυπιούνται και να ανεβαίνουν, στην σίτα ενώ η βρωμιά να μεταναστεύει προς το κάτω μέρος της. Στην πράξη, η κλίση της σίτας, η περιστροφική δόνηση της, και η ροή του αέρα μέσα από την σίτα ρυθμίζονται έτσι ώστε το καθαρό θυμάρι να μεταναστεύει στη μέση της σίτας, ενώ η βαριά βρωμιά στο πάνω μέρος της. Το κύριο μειονέκτημα ενός πίνακα αέρα είναι ότι μπορεί να είναι ή να μην είναι σε θέση να διαχωρίσουν σωματίδια διαφορετικών μεγεθών και διαφορετικών πυκνοτήτων. Ωστόσο, μπορεί αποτελεσματικά να ξεχωρίσει τα σωματίδια με την ίδια πυκνότητα και διαφορετικού μεγέθους και τα σωματίδια του ίδιου μεγέθους και διαφορετικών πυκνοτήτων. Υπάρχουν κάποια άλλα είδη εξοπλισμού για καθαρισμό, π.χ. διαχωριστές που προσπαθούν να εκμεταλλευτούν τη διαφοράς μεταξύ του σχήματος βοτάνων και του ξένου υλικού. Παρόλα αυτά, τα φυσικά χαρακτηριστικά του ξηρού θυμαριού δεν είναι βολικά για τέτοιες τεχνικές. Πολύ λεπτά σωματίδια μπορούν να αφαιρεθούν από αποξηραμένες πρώτες ύλες βότανων με τη χρήση μιας συσκευής που ονομάζεται κυκλώνας. Η συγκομιδή θυμαριού θα πρέπει να πραγματοποιείται με τρόπο που να ελαχιστοποιεί τη μόλυνση με πέτρες και βράχια. Ωστόσο, ανάλογα με την προσοχή σε όλη τη διαδικασία κάποια ποσότητα των λίθων θα παραμείνει στο αποξηραμένο προϊόν. Μηχανήματα απομάκρυνσης λίθων εργάζονται με την ίδια αρχή όπως οι πίνακες αέρα, αλλά γενικά είναι πολύ μικρότερα σε μέγεθος. Ένα τέτοιο μηχάνημα, μπορεί γενικά να ξεχωρίσει και να απομακρύνει μόνο πέτρες και βράχους βαρύτερα από το θυμάρι. Για άλλη μια φορά, μεταβάλλοντας τη ροή αέρα, τη κλίση, τη δόνηση και το τύπος της σίτας, είναι δυνατόν να επηρεαστεί ο διαχωρισμός από τα ελαφρύτερα φύλλα θυμαριού (Tainter και Grenis, 1993). Ξερό θυμάρι μπορεί να εισαχθεί από διάφορες χώρες ή πηγές, οι οποίες μερικές φορές δεν εξασφαλίζουν καλές συνθήκες υγιεινής και επεξεργασίας. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητη η

24

απομάκρυνση των προσμίξεων και να συμμορφωθεί το προϊόν με τις προδιαγραφές.

4.2.3 Θρυμματισμός και επιλογή μεγέθους σωματιδίων

Tο θυμάρι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ολόκληρο, τα φύλλα και τα ανθοφόρα μέρη, και ως προϊόν αλέσεως. Η χρήση ολόκληρου βότανου στην επεξεργασία των τροφίμων είναι περιορισμένη, καθώς δεν είναι έτοιμες πηγές γεύσης, αλλά βελτιώνουν την εμφάνιση ορισμένων προϊόντων. Με λίγες εξαιρέσεις, τα βότανα και τα μπαχαρικά συνήθως αλέθονται σε σκόνη πριν από τη χρήση. Μείωση του μεγέθους μπορεί επίσης να είναι ένα ουσιαστικό πρωταρχικό στάδιο για την εκχύλιση ή απόσταξη, για ενσωμάτωση σε προϊόν διατροφής ή για χρήση ως έχουν στο τραπέζι ή στο μαγείρεμα. Υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί τρόποι για να κόψει, να τροχίσει, να σπάσει ή αλλιώς να μειωθεί το μέγεθος, ωστόσο, τα βασικά της κονιορτοποίησης βοτάνου είναι πολύ απλά. Υπάρχει μια ποικιλία από εξοπλισμό πού χρησιμοποιείται για να αλεσθεί το θυμάρι, και γενικά έχει σχεδιαστεί για να συντρίψει το φυτό σε σωματίδια. Τα μηχανήματα μπορούν γενικά να ταξινομηθούν στις ακόλουθες ομάδες: (Α) Κόπτες ή πατητήρια που έχουν σχεδιαστεί για να δώσουν ένα ενδιάμεσο προϊόν, μειώνοντας τα μεγάλα τμήματα των φυτών που λαμβάνονται σε μεγάλες ποσότητες. (Β) Μύλοι τριβής χαμηλής ταχύτητας, τα οποία μειώνουν το προϊόν σε λεπτή σκόνη. (Γ) Μύλοι υψηλής ταχύτητας, με την οποία μπορεί να παραχθεί ένα ευρύ φάσμα μεγεθών, και η διεκπεραίωση είναι γρήγορη. (Δ) Μικρομύλοι για εξαιρετικά λεπτές σκόνες.

Υπάρχουν δύο κύρια προβλήματα που ανέκυψαν κατά τη διαδικασία άλεσης: (i) το σπάσιμο των σωματιδίων του βοτάνου που φέρουν έλαια και (ii) σχηματισμός της θερμότητας. Σε φυσικά βότανα τα αρωματικά συστατικά συγκρατούνται μέσα σε ένα προστατευτικό κυτταρικό τοίχωμα. Αυτό δίνει σε ολόκληρο το βότανο μια μακρά διάρκεια ζωής στο ράφι εφόσον τηρούνται, όμως ορισμένες βασικές συνθήκες αποθήκευσης. Με την άλεση το πτητικό έλαιο καθίσταται διαθέσιμο για αντίδραση (π.χ. οξείδωση) ή εξάτμιση. Με την άλεση επίσης παράγεται κάποια θερμότητα, η οποία θα αυξάνει την τάση για εξάτμιση του πτητικού ελαίου οδηγώντας σε μείωση της αντοχής της γεύσης. Η έντονη μυρωδιά του θυμαριού, η οποία είναι ιδιαίτερα αισθητή στο περιβάλλον κατά τη διάρκεια της άλεσης, δείχνει κάποιο βαθμό απώλειας γεύσης. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να κρατηθούν οι θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της διαδικασίας άλεσης όσο το δυνατόν χαμηλότερα για να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια του πτητικού ελαίου. Κατά κανόνα, λεπτότερα μεγέθη σωματιδίων αναπτύσσουν υψηλότερες θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της άλεσης. Για τον περιορισμό του σχηματισμού της θερμότητας το προϊόν μπορεί να προψυχέται. Συνήθως ο χρήστης καθορίζει το μέγεθος των σωματιδίων. Με το πάγωμα των βοτάνων και στερεοποίηση των πτητικών ελαίων, τα βότανα μπορούν να αλέθουν και να κοσκινιστούν πολύ πιο εύκολα. Κρυογονική άλεση θα ελαχιστοποιήσει επίσης την οξειδωτική φθορά των γεύσεων λόγω του αζώτου κατά τη διάρκεια της άλεσης. Οι εργασίες θρυμματισμού συχνά

25

περιλαμβάνουν και κοσκίνισμα. Οι μύλοι μπορούν να έχουν εσωτερικά κόσκινα που εν μέρει υπαγορεύουν το τελικό μέγεθος σωματιδίων, ή το κοσκίνισμα μπορεί να είναι μια ξεχωριστή λειτουργία όπου τα υπερμεγέθη σωματίδια επιστρέφουν στο μύλο για περαιτέρω επεξεργασία.

4.2.4 Περεταίρω κατεργασίες

Ο έλεγχος ή η μείωση των μικροβιολογικών πληθυσμών που υπάρχουν στα βότανα και τα μπαχαρικά που συλλέγονται είναι ένα σημαντικό έργο που απαιτείται ως επεξεργασία του προϊόντος. Υψηλά μικροβιολογικά φορτία μπορεί να οδηγήσουν σε σημαντικά μειωμένη διάρκεια ζωής στο ράφι και μπορεί να παράγουν προβλήματα εάν δεν υπάρχει ένα σημαντικό βήμα θερμικής επεξεργασίας στο τελικό προϊόν. Η διαδικασία της αποστείρωσης αυξάνει το κόστος του βοτάνου, αλλά αξίζει τον κόπο για τον τελικό χρήστη (Farrell, 1985). Παθογόνα (μικροοργανισμοί οι οποίοι προκαλούν ασθένειες στον άνθρωπο) μπορεί να είναι ένα πρόβλημα, ειδικά για τα βότανα και τα μπαχαρικά που επεξεργάζονται σε χώρες με χαμηλότερα υγειονομικά πρότυπα σε σχέση με τις χώρες εκείνες που μπορεί να έχουν υψηλά καθορισμένα επίπεδα. Καθώς η παρουσία μικροοργανισμών στα βότανα μπορεί να προκαλέσει την αλλοίωση των τροφίμων και την αρρώστια, μια υπόθεση μπορεί να γίνει για την αποστείρωση. Ωστόσο, τα βότανα και τα μπαχαρικά αποτελούν συνήθως μόνο 0,1 έως 2,0 τοις εκατό ως είδη διατροφής και χρησιμοποιούνται πιο συχνά σε φαγητά. Ως αποτέλεσμα, ο κίνδυνος της αλλοίωσης και της ασθένειας μειώνεται σημαντικά. Ένας αριθμός διαφορετικών διαδικασιών αποστείρωσης έχουν εφαρμοστεί σε μπαχαρικά και βότανα σε μια προσπάθεια να μειωθούν τα υψηλά επίπεδα μικροβίων. Και οι δύο φυσικές και χημικές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί με διάφορους βαθμούς επιτυχίας. Αυτές περιλαμβάνουν ατμό και θερμική αποστείρωση, υπεριώδη (UV) ακτινοβολία, ιονίζουσα ακτινοβολία, διήθηση, υπέρυθρη ακτινοβολία, και υποκαπνισμό. Αναφορά μπορεί επίσης να γίνει από μεθόδους όπως ξήρανση, κατάψυξη και το αλάτισμα τα οποία χρησιμοποιούνται γενικά με ένα συμπληρωματικό ρόλο.

UV-ακτινοβολία, μικροκύματα, κατεργασία με υψηλή πίεση χρησιμοποιούνται σπάνια για την απολύμανση βοτάνων, μερικά από αυτά είναι στο στάδιο της ανάπτυξης, σε εργαστηριακές δοκιμές.

4.2.5 Συσκευασία και αποθήκευση

Το ξερό θυμάρι είναι ένα προϊόν με μεγάλη διάρκεια ζωής. Κατά κανόνα τα αποξηραμένα βότανα θεωρούνται σταθερά μέχρι την ανάπτυξη κάποιας δυσάρεστης οσμής. Η περίοδος ελάχιστης σταθερότητας είναι μια περίοδος κατά την οποία το βότανο είναι πλήρως κατάλληλο για χρήση και τα ουσιώδη ειδικά χαρακτηριστικά όπως το άρωμα, πικάντικη γεύση, το χρώμα, κλπ διατηρούνται. Η ποιότητα και η ελάχιστη περίοδος σταθερότητας μπορεί να εκτιμηθεί από την οργανοληπτική αξιολόγηση του χρώματος, οσμής και γεύσης και με τον προσδιορισμό του αιθέριου ελαίου (Gerhardt, 1994). Η σταθερότητα του θυμαριού εξαρτάται από τις ακόλουθες πτυχές:

26

1.περιεκτικότητα σε υγρασία 2.μέθοδο θρυμματισμού (λεπτότερο άλεσμα σημαίνει μικρότερη σταθερότητα) 3.ποσότητα και μέγεθος συσκευασίας (μεγαλύτερο πακέτο φέρνει υψηλότερη σταθερότητα) 4.υλικό συσκευασίας (μικρότερη διαπερατότητα στο νερό και τον αέρα έχει σαν αποτέλεσμα υψηλότερη σταθερότητα) 5.διείσδυση του αέρα εντός της συσκευασίας 6.επίδραση του φωτός και υγρασίας (υψηλότερη υγρασία και το φως πρόσβασης προκαλεί μικρότερη σταθερότητα) 7.θερμοκρασία αποθήκευσης (χαμηλότερη θερμοκρασία σημαίνει μεγαλύτερη σταθερότητα).

Σε γενικές γραμμές αποθήκευση κάτω από -18⁰C αποτελεί εγγύηση για απεριόριστο χρόνο αποθήκευσης. Όταν το προϊόν αποθηκεύεται σε 5-7 ⁰C το αποξηραμένο βότανο μπορεί να αποθηκευτεί περισσότερο από 12 μήνες, ενώ σε θερμοκρασία δωματίου μειώνεται σημαντικά η σταθερότητα. Αφού όλα τα στάδια επεξεργασίας έχουν ολοκληρωθεί σειρά έχει η συσκευασία. Είναι μια σημαντική διαδικασία, επειδή κατά τη διάρκεια της κονιοποίησης η δομή των κυττάρων είναι συνήθως περισσότερο ή λιγότερο κατεστραμμένη και τα πτητικά συστατικά μπορούν να απελευθερωθούν εύκολα. Υπάρχουν δύο κύρια καθήκοντα για τη συσκευασία (Niebergall, 1978).: (α) για την προστασία από εξωτερικές επιδράσεις, (β) για να αυξηθεί η σταθερότητα έναντι αρνητικών εσωτερικών αλλαγών (ενζυματικές, μη- ενζυματικές, χημικές αντιδράσεις, κ.λπ.). Βέλτιστα υλικά συσκευασίας είναι το γυαλί και τα μέταλλα: και τα δύο είναι εντελώς αδιαπέραστα και παρέχουν την καλύτερη προστασία του αρώματος. Λόγω οικονομικών και μερικών άλλων λόγων διάφορα νέα υλικά, ως επί το πλείστον συνθετικά πλαστικά, υποκαθιστούν όλο και περισσότερο τα παραδοσιακά υλικά συσκευασίας. Ωστόσο, μεταξύ αυτών δεν υπάρχει ιδανικό υλικό για τη συσκευασία των βοτάνων. Για παράδειγμα, το πολυαιθυλένιο προστατεύει αποτελεσματικά από το νερό και δίνει αντοχή, ωστόσο, είναι διαπερατό από το λίπος και από τις αρωματικές ενώσεις. Το πολυαμίδιο είναι αδιαπέραστο από αέρια, ενώ οι αδιάβροχές του ιδιότητες είναι λιγότερο αποτελεσματικές (Gerhardt, 1994). Το οξυγόνο μπορεί να απομακρυνθεί με την αντικατάσταση του αέρα με αδρανές αέριο. Απορροφητικά οξυγόνου μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για το σκοπό αυτό. Η ποιότητα του θυμαριού μειώνεται κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Οι αλλαγές εξαρτώνται από διάφορους παράγοντες, όπως η μέθοδος ξήρανσης και παραμέτρους όπως η περιεκτικότητα σε υγρασία, διαδικασίες καθαρισμού και το μέγεθος των σωματιδίων, την επεξεργασία αποστείρωσης, οι συνθήκες αποθήκευσης, το είδος συσκευασίας, κ.λπ. Γενικά, αποξηραμένο θυμάρι πρέπει να φυλάσσεται σε δροσερό και ξηρό μέρος μακριά από το φως. Ιδανικά, θα πρέπει να είναι σε αεροστεγή συσκευασία για τη μείωση της οξείδωσης.

27

5. ΦΥΤΟΧΗΜΕΙΑ

5.1 Αιθέρια έλαια: παραγωγή και χαρακτηριστικά

Τα αιθέρια έλαια (essential oils), είναι τα εύοσμα στοιχεία που απαντούν σε διάφορα μέρη των φυτών. Επειδή αυτά εξατμίζονται όταν εκτίθενται στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος ονομάστηκαν πτητικά ή αιθέρια έλαια Είναι μίγμα πτητικών συστατικών (τερπένια και αρωματικές ουσίες), με χαρακτηριστική οσμή και γεύση, ελαιώδους σύστασης.

Θεωρούνται ότι προέρχονται από την αποικοδόμηση των ρητινογενών τοιχωμάτων των κυττάρων και συνοδεύονται συνήθως από κόμμεα και ρητίνες. Μερικά αιθέρια έλαια προκύπτουν από την υδρόλυση γλυκοσιδών (σιναπέλαιο).

Τα αιθέρια έλαια κυρίως απαντούν μόνο στα ανώτερα φυτά και μπορεί να βρίσκονται σε όλο το φυτό , σε μέρη ή σε ένα μέρος του φυτού. Απαντούν σε διάφορα φυτικά όργανα: άνθη, φύλλα, καρπούς, ρίζες, σπέρματα και φλοιούς. Περιέχονται σε ειδικές εκκριτικής κατασκευής μονάδες που πολλές φορές αποτελούν και ανατομικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα για τα φυτά όπως είναι οι αδενώδεις τρίχες, σε τροποποιημένα παρεγχυματικά κύτταρα, σε ελαιοφόρους αγωγούς, σε σχιζογενείς ή λυσογενείς αγωγούς, σε ελαιώδεις πόρους (Sammuelson, 2004).

Πολλές φορές το αιθέριο έλαιο που παράγεται από διάφορα όργανα του φυτού μπορεί να διαφέρει ως προς τη χημική του σύσταση. Επομένως, για τα αιθέρια έλαια που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν στη θεραπευτική πρέπει να γνωρίζουμε την πηγή προέλευσης τους (φυτό), το όργανο του φυτού που παράγει το αιθέριο έλαιο και τη χημική του σύσταση. Η χημική σύσταση του αιθερίου ελαίου δείχνει μία ή περισσότερες ενώσεις αυτού ή οποία προσδίδει σ' αυτό τη θεραπευτική του δράση (Sammuelson, 2004).

Τα απαραίτητα στοιχεία για την ταυτοποίηση του αιθερίου ελαίου είναι: 1. Το είδος του φυτού από το οποίο παραλαμβάνεται. 2. Η περιοχή προέλευσης του φυτού. 3.Η μέθοδος παραλαβής του από το φυτό ή μέρος του φυτού. 4. Οι γενικές οργανοληπτικές ιδιότητες του (χρώμα, οσμή). 5. Οι φυσικές ιδιότητες του (ειδικό βάρος, δείκτης διάθλασης, στροφική ικανότητα). 6. Η χημική σύστασή του. 7. Το μέρους του φυτού που παραλαμβάνεται το αιθέριο έλαιο ( φύλλα, καρπός, άνθη, κλπ) Τα αιθέρια έλαια όταν χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική για εξωτερική ή εσωτερική χρήση, χορηγούνται με τη βοήθεια εκδόχου, το οποίο πρέπει να έχει τις εξής ιδιότητες:  Να διασκορπίζει τα αιθέρια έλαια στο νερό.

28

 Να διευκολύνει και να αυξάνει την επιφάνεια απορρόφησης των αιθερίων ελαίων από την επιδερμίδα του δέρματος και από το βλεννογόνο του στόματος και του γαστρεντερικού σωλήνα.  Να παρεμποδίζει τον ερεθισμό του δέρματος και των βλεννογόνων.  Να έχει το πλεονέκτημα της εσωτερικής και εξωτερικής χρήσης.  Να έχει εύκολη και γρήγορη εφαρμογή.

5.1.1 ΓΕΝΙΚΑ

5.1.1α Φυσικές ιδιότητες

Τα αιθέρια έλαια είναι υγρά, εύφλεκτα, πτητικά σε κανονική θερμοκρασία και δεν αφήνουν κηλίδα σε διηθητικό χαρτί, σε αντίθεση με τα λιπαρά έλαια. Είναι άχρωμα έως υποκίτρινα με ελάχιστες εξαιρέσεις όπως το γαρυφαλλέλαιο που είναι κιτρινοκαστανόχρωμο και όσα περιέχουν αζουλένιο είναι μπλε. Κατά την παραμονή τους επί πολύ χρόνο σκουραίνουν, ρητινοποιούνται και αλλοιώνεται η οσμή τους. Αιτία γι' αυτό είναι οι αυτοοξειδώσεις, ο πολυμερισμός και οι υδρολύσεις των εστέρων. Η υγρασία, η θερμοκρασία και το φως επηρεάζουν τα αιθέρια έλαια γι' αυτό πρέπει να φυλάσσονται σε μικρά, γεμάτα και καλά κλεισμένα και προστατευμένα από το φως και τη θερμοκρασία δοχεία (Sammuelson, 2004).

Η πυκνότητα τους είναι γενικά χαμηλότερη από του νερού. Χαρακτηρίζονται από υψηλό δείκτη διάθλασης. Τα περισσότερα είναι οπτικώς ενεργά με στροφική ικανότητα που είναι συνήθως πολύτιμη διαγνωστική ιδιότητα. Δεν διαλύονται παρά ελάχιστα στο νερό, ενώ είναι διαλυτά στον αιθέρα, πετρελαϊκό αιθέρα, αλκοόλη και στους περισσότερους οργανικούς διαλύτες και στα λιπαρά λάδια.

5.1.1β Χημική σύσταση των αιθερίων ελαίων

Τα κυριότερα συστατικά των αιθερίων ελαίων είναι τα τερπένια και ειδικά τα μονοτερπένια και τα σεσκιτερπένια. Επίσης απαντούν αρωματικές ενώσεις παράγωγα του φαινυλοπροπανίου (Sammuelson, 2004). 1. Μονοτερπένια α) άκυκλα β) μονοκυκλικά γ) δικυκλικά Σε κάθε ομάδα μπορούν να υπάρχουν απλά μονοτερπένια (υδρογονάνθρακες), ή μπορεί να είναι αλκοόλες, φαινόλες, κετόνες, εστέρες, λακτόνες, οξείδια.

2. Σεσκιτερπένια α) αλειφατικά β) μονοκυκλικά γ) δικυκλικά δ) τρικυκλικά

29

3. Εστέρες : αλειφατικών οξέων, αρωματικών οξέων και εστέρες που περιέχουν άζωτο. 4. Λακτόνες 5. Οξείδια και παράγωγα φαινυλοπροπανίου

5.1.1γ Μέθοδοι απομόνωσης αιθερίων ελαίων

1) Απόσταξη Το φυτικό υλικό τοποθετείται μέσα σε ένα κλειστό δοχείο (άμβυκας) από το πυθμένα του οποίου διέρχονται υδρατμοί. Τα πτητικά συστατικά σχηματίζουν ένα μίγμα με τον ατμό και συμπαρασύρονται στο ψυκτήρα όπου διαχωρίζονται συμπυκνούμενοι σε νερό και αιθέριο έλαιο. Ο συνεχής διαχωρισμός αιθερίου ελαίου και νερού πραγματοποιείται στη "Φλωρεντιανή Φιάλη" από όπου το νερό αποχωρίζεται μέσω ενός σωλήνα (Bruneton, 1999). Υπάρχουν τρεις μέθοδοι απόσταξης: α) Υδροαπόσταξη β) Απόσταξη με νερό και υδρατμούς γ) Απόσταξη με υδρατμούς

2) Εκχύλιση με διαλύτες Η διαδικασία εκχύλισης με πτητικούς διαλύτες είναι απλή. Τα φρέσκα άνθη τοποθετούνται σε ειδικά κατασκευασμένους εκχυλιστήρες όπου εκχυλίζονται συνεχώς σε θερμοκρασία δωματίου από πολύ καθαρό διαλύτη, συνήθως πετρελαϊκό αιθέρα. Ο διαλύτης εισέρχεται στους ιστούς και παραλαμβάνει τα πτητικά συστατικά του φυτικού υλικού. Το διάλυμα στη συνέχεια διοχετεύεται μέσω αντλίας σε εξατμιστήρα και συμπυκνώνεται σε χαμηλή θερμοκρασία.

30

3) Εκχύλιση με κρύο λίπος (Enfleurage) Ορισμένα άνθη π.χ. το γιασεμί, συνεχίζουν τις φυσιολογικές τους δραστηριότητες παράγοντας και εκπέμποντας άρωμα ακόμη και μετά τη συλλογή τους. Έτσι, φρέσκα συλλεγέντα άνθη στρώνονται καθημερινά στην επιφάνεια ενός λεπτού στρώματος λίπους που βρίσκεται πάνω σε μια πλάκα γυαλιού. Το λίπος απορροφά και συγκρατεί τα πτητικά συστατικά του φυτικού υλικού που έρχονται σε επαφή με αυτό. Αφήνονται για 24 ώρες και κατόπιν ανανεώνονται από νέα άνθη. Στο τέλος το κορεσμένο σε πτητικά συστατικά λίπος εκχυλίζεται με αλκοόλη και παραλαμβάνονται τα αιθέρια έλαια ( Bruneton 1999).

4) Εκχύλιση με ζεστό λίπος (Maceratio) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για φυτικά υλικά που σταματούν τις φυσιολογικές τους δραστηριότητες αμέσως μετά τη συλλογή τους, π.χ. τριαντάφυλλα. Εδώ, τα άνθη βυθίζονται σε ζεστό λίπος. Στα δοχεία εισάγονται κάθε φορά 80 kg λίπους και 20kg άνθη που θερμαίνονται για μισή ώρα υπό συνεχή ανάδευση. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρις ότου το λίπος κορεστεί. Στη συνέχεια το περιεχόμενο

31

διηθείται για να απομακρυνθούν τα διάφορα φυτικά μέρη. Για παραλαβή του αιθέριου ελαίου εκχυλίζουμε με αλκοόλη.

5) Εκχύλιση με υπερκρίσιμα υγρά (ΕΕΥ)- CO2 Ο διαλύτης CO2 μέσω μιας αντλίας φέρεται στην επιθυμητή πίεση και θερμοκρασία για να βρεθεί στην υπερκρίσιμη περιοχή, διέρχεται από το θάλαμο εκχύλισης όπου βρίσκεται το φυτικό υλικό και μετά ακολουθεί το στάδιο αποσυμπίεσης. Η αποσυμπίεση συμβαίνει στιγμιαία, δεδομένου ότι περνάμε από υψηλότερη σε χαμηλότερη πίεση. Το αιθέριο έλαιο που παραλαμβάνεται είναι καθαρό και μόνο το εκχύλισμα, χωρίς υπολείμματα διαλυτών.

6) Μηχανική εκπίεση Χρησιμοποιείται κυρίως για εσπεριδοειδή φρούτα και για ξηρούς καρπούς. Για τους ξηρούς καρπούς χρησιμοποιούνται συσκευές που μοιάζουν με τα πιεστήρια των ελαιοτριβίων. Για τους φλοιούς των εσπεριδοειδών υπάρχουν αυτές που επεξεργάζονται ολόκληρους τους καρπούς και διαχωρίζουν το αιθέριο έλαιο πριν τη χυμοποίηση και σ' αυτές που επεξεργάζονται τους φλοιούς αφού πρώτα τεμαχιστούν οι καρποί και αφαιρεθεί ο χυμός.

5.1.1δ Δράσεις- Χρήσεις αιθερίων ελαίων

Δεν είναι απολύτως γνωστός ο ρόλος των αιθερίων ελαίων στα φυτά, αλλά πιστεύεται ότι χρησιμεύουν στο να απωθούν ορισμένα έντομα κι έτσι να εμποδίζεται η καταστροφή των φύλλων και των ανθέων, αλλά και ορισμένα διευκολύνουν στην γονιμοποίηση προσελκύοντας έντομα. Ακόμη χρησιμοποιούνται ως μέσα αποτοξίνωσης του φυτού, αποβάλλοντας ορισμένα ανεπιθύμητα προϊόντα μεταβολισμού.

Χρησιμοποιούνται στην αρωματοποιία, στα καλλυντικά και στα τρόφιμα για να προσδίδουν χαρακτηριστική οσμή και γεύση. Στη θεραπευτική χρησιμοποιείται το αιθέριο έλαιο ή το απομονωμένο κύριο συστατικό. Η ποικιλία των θεραπευτικών χρήσεων οφείλεται στη χημική ετερογένεια των αιθερίων ελαίων. Ανάλογα με το θεραπευτικό τους αποτέλεσμα κατατάσσονται ως: αποχρεμπτικά, διουρητικά, εμμηναγωγά, στομαχικά, χολαγωγά, χολερετικά, ανθελμινθικά, αντισηπτικά, αντιφλογιστικά, αντιμικροβιακά, τονωτικά (Bruneton, 1999).

5.1.1ε Μέθοδοι ανάλυσης αιθερίων ελαίων

1. Αέριο χρωματογραφία-Gas Chromatography (GC)

2. Αέριο χρωματογραφία - Φασματοσκοπία Μαζών - Gas Chromatography- Mass Spectroscopy ( GC-MS)

3. Μικροβιακές αναλύσεις

32

GC-MS

Όταν ένα φυτό περιέχει πτητικά συστατικά η GC είναι μέθοδος επιλογής για την ανάλυση και την ταυτοποίηση των ουσιών αυτών. Η GC τεχνική έχει γίνει απαραίτητη μέθοδος ανάλυσης για τα αιθέρια έλαια, καθώς περιέχουν έναν ευρύ αριθμό ενώσεων και η GC είναι η μοναδική τεχνική με την οποία μπορούμε να έχουμε ένα "δακτυλικό αποτύπωμα" οποιουδήποτε κλάσματος πτητικών. Και μη πτητικές ενώσεις, με σ.ζ. μεγαλύτερο από 200-240⁰, είναι δυνατό να αναλυθούν με την τεχνική αυτή αφού προηγουμένως μετατραπούν σε πτητικά παράγωγα (εστεροποίηση, τριμεθυλοσιλυλίωση) .

Ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος επιτυγχάνεται με δεδομένη τη μικρότερη ή μεγαλύτερη κατακράτησή τους από τη χρωματογραφική στήλη. Ο απαιτούμενος χρόνος για συγκεκριμένο συστατικό σε συγκεκριμένη στήλη προκειμένου να εκλουσθεί από αυτής ορίζεται ως απόλυτος χρόνος κατακράτησης rt (absolute retention time), και μετράται στο σημείο του μεγίστου της κορυφής. Στη διάρκεια της ανάλυσης, το συστατικό κατανέμεται μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης. Ο χρόνος παραμονής στην κινητή φάση, δηλαδή στο φέρον αέριο, είναι σταθερά ίδιος για όλα τα συστατικά του μίγματος και ονομάζεται νεκρός χρόνος mt . Πρακτικά, επομένως, ο χρόνος κατακράτησης μπορεί να εκφρασθεί ως η διαφορά του απόλυτου χρόνου κατακράτησης και του νεκρού χρόνου για μια συγκεκριμένη στήλη.

Για να επιτευχθεί ομοιομορφία έκφρασης σε ότι αφορά τους χρόνους κατακράτησης χρησιμοποιούμε τους δείκτες κατακράτησης Kovats (KI), οι οποίοι απαλείφουν μεταβλητές παραμέτρους όπως π.χ. η ροή του αερίου, ο προγραμματισμός της θερμοκρασίας κλπ., και δίνουν κατευθείαν σειρά έκλουσης συστατικών σε σχέση με απόλυτους χρόνους κατακράτησης προκειμένου να καθίσταται ικανή η αναγνώριση τω συστατικών από το χρόνο κατακράτησης για συγκεκριμένη φάση.

Μια σύγχρονη τεχνική είναι η σύζευξη της GC τεχνικής με φασματοσκοπία μάζης οπότε η ταυτοποίηση των ουσιών που περιέχονται στο κλάσμα των πτητικών να μη γίνεται μόνο με τους χρόνους κατακράτησης αλλά να επιβεβαιώνεται και με το φάσμα μάζας έκαστης. Συγχρόνως με σύστημα ηλεκτρονικής βιβλιοθήκης, όπου είναι καταχωρημένα τα πρότυπα φάσματα μερικών χιλιάδων ενώσεων υποδεικνύεται μετά από σύγκριση εάν κάποιο συστατικό της ανάλυσης είναι καταγεγραμμένο στη βιβλιοθήκη (data bank).

Στη φασματομετρία μάζης μια ένωση αποσυντίθεται μετά από βομβαρδισμό με δέσμη ηλεκτρονίων, τα κομμάτια της αφού συλλεχθούν , καταγράφονται και με τα θραύσματα αυτά επανασυναρμολογούμε το μόριο της ένωσης. Για μικρού Μ.Β. ενώσεις και σχετικά απλά μόρια όπως τα πτητικά των αιθερίων ελαίων, η βοήθεια των φασμάτων μάζης είναι καθοριστική.

33

Τα αέρια μόρια εξέρχονται από τη στήλη διαχωρισμού του αέριου χρωματογράφου και εισέρχονται στη πηγή ιονισμού του φασματογράφου μαζών, όπου βομβαρδίζονται με μια δέσμη ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας.

34

5.1.2 ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ ΣΤΟ ΤΗΥΜUS VULGARIS

Στα φυτά της οικογένειας Lamiaceae, τα αιθέρια έλαια είναι διαδεδομένα και πολλά είδη χρησιμοποιούνται ως αρωματικά βότανα για τον αρωματισμό των τροφίμων. Τα αιθέρια έλαια τους είναι προϊόντα μεγάλης ζήτησης στην παραγωγή αρωμάτων και καλλυντικών, και χρησιμοποιούνται επίσης για ιατρικούς σκοπούς. Το γεγονός αυτό ισχύει και για το γένος Thymus.

Στα Lamiaceae, τα αιθέρια έλαια αποθηκεύονται σε ασπιδοειδή αδενικά τριχώματα. Βρίσκονται στην επιδερμική επιφάνεια και στις δύο πλευρές των φύλλων και δείχνουν μια πολύ χαρακτηριστική ανατομία. Тα αιθέρια έλαια των 162 ειδών του γένους Thymus έχουν υποστεί χημική ανάλυση αποκαλύπτοντας περίπου 360 διαφορετικά πτητικά συστατικά συνολικά. Μεταξύ αυτών τα τερπένια αποτελούν σχεδόν το 75%, με τα μονοτερπένια να είναι η σημαντικότερη ομάδα (43%). Тα σεσκιτερπένια καλύπτουν το 32% των πτητικών. Εκτός από τα τερπένια μια μικρή ομάδα μη-τερπενοειδών (17%) εμφανίζονται σε πολλά έλαια, αλλά σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Απλά παράγωγα βενζολίου (6%) και φαινυλοπροπανοειδή (2%) έχουν βρεθεί πολύ σποραδικά. Αιθέρια έλαια μπορούν να αποσταχθούν από τα φύλλα, τα άνθη και τους βλαστούς του Thymus vulgaris με τους βλαστούς να έχουν την χαμηλότερη απόδοση σε έλαια. Παρακάτω δίνεται ένας πίνακας με τα συστατικά αιθερίων ελαίων του Thymus vulgaris L. που έχουν αποσταχθεί με διχλωρομεθάνιο, κατηγοριοποιημένα ανάλογα με τη χημική τους δομή.

ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΙΚΑ ΤΕΡΠΕΝΙΑ Tricyclene

α-thujene

α-pinene

Camphene

35

Sabinene

β-pinene

β-myrcene

Limonene

Cis-ocimene

Trans-ocimene

γ-terpinene

Allocimene

ΟΞΥΓΟΝΟΥΧΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΤΕΡΠΕΝΙΩΝ 1,7-exo- trimethylenebicyco[3.2.1]octa

36

ne 1,8-cineole

O

Trans-sabinene hydrate OH

Cis- linalool oxide

O HO

Trans-linalool oxide

O HO

Linalool OH

Cis-p-menth-2-en-1-ol

OH α-campholene aldehyde O

Trans-pinocarveol OH

37

Camphor

O Sabina ketone

O 3,5-dimethyl-4- ethylidenecyclohex-2-ene-1- one Endo-borneol

OH Epoxylinalool OH

O

Terpine-4-ol

OH

1,8-cineole

O

Cyminyl alcohol α-terpineol

OH Myrtenol

OH Isopulegone O

38

Trans-carveol OH

β-citronellol

OH

5-hydroxy-1,8-cineole OH

O

Linalyl acetate O

O

Neryl formate

O O

Endo-bornyl acetate

O

O Thymol

OH

Geranyl formate O

O

39

Carvacrol OH

Campholytic acid methyl ester Cis-p-menth-2-ene-1,8- diol OH

OH

Citronellyl acetate O

O Neryl acetate

O

O Eugenol O

HO

Endo-bornyl propanoate O

O

Geranyl acetate

O O

Trans-sobrerol OH

HO

4-trimethyl-5-hydroxy-3- HO cyclohexene-1-methanol HO

40

Cis-p-menthenediol

OH

HO Vanillin O

O

OH 1,2-dimethoxy-4-(2-propenyl)- benzene

O

O

Endo-bornyl isobutanoate 8-hydroxycarvotanacetone OH

O

Citronellyl propanoate O

O Neryl propanoate

O

O Endo-bornyl butanoate

O O

Geranyl propanoate O

O p-menthane-1,2,4-triol HO

OH

HO

41

Geranyl butanoate O

O Neryl isobutanoate

O

O

Υδρογονανθρακικά σεσκιτερπένια β-bourbonene

Isocaryophyllene

α-gurjunene

Trans-caryophyllene

Calarene

α-bergamotene

Aromadendrene

42

α-humulene

Alloaromadendrene

Farnesene

Germacrene B

γ-cadinene

Calamenene

Οξυγονούχα σεσκιτερπενικά παράγωγα Hedicaryol Elemol

OH

Aristolone

O

43

Spathulenol

HO

Caryophyllenol

OH

Viridiflorol OH

Calarene epoxide

O

Aristolene epoxide

O

β-eudesmol

OH

Torreyol OH

Οξέα Тetradecanoic acid O

OH Hexadecanoic acid O

OH

44

9,12-octadecadienoic acid O

OH 9-octadecenoic acid O

OH Octadecanoic acid O

OH

O Eicosanoic acid

O H Αλδεΰδες O Eicosanal

O Docosanal

O Tricosanal

O Tetracosanal

Pentacosanal

O Hexacosanal

O Heptacosanal

O Octacosanal

O Triacontanal

O Tetratriacontanal

O Κορεσμένοι υδρογονάνθρακες Octadecane

Nonadecane Eicosane

Heneicosane

45

Docosane

Tricosane

Methyl docosane

Tetracosane

Ethyl docosane

Methyl tricosane

Pentacosane

Ethyltricosane

Methyl tetracosane

Hexacosane

Ethyl tetracosane

Methyl pantacosane

Heptacosane

Methyl hexacosane

Octacosane

Ethyl hexacosane Methyl heptacosane

Nonacosane

Ethyl heptacosane Methyl octacosane

Triacontane

46

Ethyl octacosane Methyl nonacosane

Hentriacontane

Ethyl nonacosane Methyl triacontane

Dotriacontane

Ethyl triacontane Tritriacontane

Ethyl tritriacontane Methyl dotriacontane

Tetratriacontane

Ethyl dotriacontane Methyl tritriacontane

Pentatriacontane

Methyl tetratriacontane

Methyl pentatriacontane

Φυτοστερόλες και άλλα παράγωγα Hexyl butanoate O

O O 5-methyl-5-ethenyldihydro-2- O furanone

47

Nicotine

N

N Dihydroactinidiolide

O

O

Loliolide HO O

O

Neophytadiene

Squalene

Vitamin E O

HO ergost-5,24-dien-3-β-ol

HO Campesterol

HO

48

β-sitosterol

HO β-amyrin

HO

α-amyrin

HO stigmasta-3,5-dien-7-one

O stigmast-4-en-3-one

O

49

5.1.3 ΧΡΗΣΕΙΣ-ΑΝТΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΑΙΘ. ΕΛΑΙΟΥ ТΗΥΜUS VULGARIS

Tα αιθέρια έλαια του θυμαριού, ιδιαίτερα η θυμόλη και η καρβακρόλη, παρέχουν μια αντισηπτική δράση, όταν αποβάλλεται μέσω των πνευμόνων (Didry, 1993), αλλά έχουν και μια ήπια ερεθιστική επίδραση που διεγείρουν τα εκκριτικά κύτταρα του βλεννογόνου και έτσι αυξάνεται η κίνηση του κροσσωτού επιθήλιου στο βρογχικό δένδρο (βρόγχοι). Αυτό οδηγεί σε μια αύξηση των εκκρίσεων που προκαλεί την αποσυμφόρηση του συνόλου του αναπνευστικού συστήματος. Οι σπασμολυτικές ιδιότητες που διαθέτουν αυτά τα αιθέρια έλαια, ικανά να χαλάρωσουν τον βρογχικό μυ, καθορίζουν τη χρησιμότητά τους στη θεραπεία της αναπνευστικής οδού σε αποφρακτικές διαδικασίες, και μαζί με τις αποχρεμπτικές ιδιότητες, τα καθιστούν αποτελεσματικά έναντι διαφορετικών τύπων βήχα: βήχας που προκαλείται από παχύρευστες εκκρίσεις, ευερέθιστο βήχα, σπαστικό βήχα (Errera, 1978, Forster etal, 1980, Schafer, 1981, van den Broucke και Lemli, 1981, Furlenmeier, 1984). Εξαιρετικά ισχυρό αντιβακτηριακό και αντιμυκητιασικό, το θυμέλαιο διεγείρει επίσης το ανοσοποιητικό σύστημα. Καθώς είναι συμπυκνωμένη μορφή του βοτάνου είναι ωφέλιμο για αναπνευστικά και για πεπτικά προβλήματα. Στο εμπόριο διατίθενται αρκετές ποιότητες θυμελαίου που έχουν όλες παρόμοιες δράσεις.

ΘΥΜΟΛΗ

Είναι μια κοινή αντισηπτική ουσία η οποία βρίσκεται συνήθως σε λευκή κρυσταλλική μορφή στα αιθέρια έλαια και στα εκχυλίσματα του θυμαριού κι είναι υπεύθυνη για την ευχάριστη αρωματική οσμή του. Χρησιμοποιείται συνήθως στην οδοντοτεχνική για να μειώσει τη κακοσμία που προκαλείται λόγω των βακτηρίων. Επίσης μειώνει τη βακτηριακή ανθεκτικότητα σε ορισμένα αντιβιοτικά όπως η πενικιλίνη. Έχει ακόμη βρεθεί να εμφανίζει δράσεις αντιμεταλλαξιογόνες, κατά των όγκων, αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις (Javed, 2013).

ΚΑΡΒΑΚΡΟΛΗ

Έχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων όπως αντιβακτηριδιακή, αντιμυκητιασική, αντιοξειδωτική, αντικαρκινική κλπ. Λόγω της ευχάριστης οσμής και της αντιμικροβιακής δράσης της η καρβακρόλη χρησιμοποιείται ως πρόσθετο τροφίμων για την παρεμπόδιση της βακτηριακής ανάπτυξης και της μόλυνσης. Πολυάριθμες εκθέσεις έχουν δείξει ότι η καρβακρόλη έχει ισχυρό προστατευτικό ρόλο ενάντια σε βακτηρίδια, μύκητες, ζύμες, ακάρεα κι έντομα. Επηρεάζει τη κυτταρική μεμβράνη των βακτηρίων και με το τρόπο αυτό εξασκεί την αντιβακτηριδιακή του δράση. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η καρβακρόλη έχει αντιβακτηριδιακή δράση μέσω αναστολής της ΑΤΡάσης (Javed, 2013).

ΑΝΤΕΝΔΕΙΞΕΙΣ Να αποφεύγονται οι θεραπευτικές δόσεις θυμαριού και θυμελαίου σε οποιαδήποτε μορφή κατά την εγκυμοσύνη επειδή το βότανο είναι διεγερτικό της μήτρας. Το θυμέλαιο μπορεί να ερεθίσει τους βλεννογόνους γι’ αυτό να αραιώνεται πάντα καλά(Javed, 2013).

50

5.2 ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΗ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ

Τα φλαβονοειδή αποτελούν μια από τις κύριες ομάδες φυσικών φαινολικών ενώσεων, που συναντώνται ευρέως σε καταπράσινα φυτά, όπου μπορούν να βρεθούν σε διάφορα όργανα όπως: φύλλα, λουλούδια, φλοιούς, φρούτα, κλπ. Άγλυκα φλαβονοειδών μπορούν να έχουν διάφορους τύπους δομών, όλα αυτά με έναν πυρήνα με 15 άτομα άνθρακα διατεταγμένα σε μια διάταξη που είναι: δύο αρωματικοί δακτύλιοι που συνδέονται με μια αλυσίδα τριών ατόμων άνθρακα, που μπορεί να σχηματίσει ένα τρίτο δακτύλιο. Οι κύριες δομές άγλυκων φλαβονοειδών σχετίζονται με ένα κοινό βιοσυνθετικό μονοπάτι που περιλαμβάνει προδρόμους τόσο από το σικιμικού όσο και το πολυκετίδιο (Ebel και Hahlbrock, 1982, Grisebach, 1985, Hahlbrock and Grisebach, 1975). Το πρώτο φλαβονοειδές είναι η χαλκόνη, από την οποία όλες οι άλλες δομές προέρχονται. Κατά τη διάρκεια της βιοσυνθετικής διαδικασίας, αρκετές αντιδράσεις λαμβάνον χώρα είτε προσθήκη ή απώλεια του υδροξυλικών ομάδων, μεθυλίωση ή ισοπρενυλίωση, διμερισμός, σχηματισμός όξινου θειικού, και, αυτό που είναι πιο σημαντικό, γλυκοζυλίωση είτε των υδροξυλίων ή του φλαβονικού πυρήνα, μπορεί να προκύψει σε διαφορετικά επίπεδα.

51

Όλα αυτά, θα οδηγήσουν σε μια μεγάλη ποικιλία δομών (περίπου 2000 φλαβονοειδή είναι γνωστά προς το παρόν) και καταρτίζονται σε αρκετές αναθεωρήσεις (Harborne και Mabry, 1982, Harborne 1975, Wollenweber και Dietz 1981).

Τα φλαβονοειδή μπορούν να βρεθούν ως άγλυκα ή, πιο συχνά, όπως γλυκοζίτες είτε Ο - ή C-γλυκοζίτες. Αν και οποιαδήποτε θέση φλαβονοειδών μπορεί να είναι γλυκοζυλιωμένη, ορισμένοι έχουν περισσότερες πιθανοτήτες, όπως 7-ΟΗ της φλαβόνης, φλαβανόνης και ισοφλαβόνης, 3-ΟΗ και 7-ΟΗ της φλαβονόλης και διυδροφλαβονόλης, και 6 η/και 8-C C-γλυκοσίδες, με τη γλυκόζη να είναι το πιο συνηθισμένο σάκχαρο που βρέθηκε σε αυτές. Η γλυκοζυλίωση, καθώς και η μεθυλίωση, λαμβάνει χώρα στα τελευταία στάδια της βιοσύνθεσης και καταλύεται από ειδικά ένζυμα. Μερικές φορές οι γλυκοζίτες μπορούν να έχουν ακυλο- υποκαταστάτες που συνδέονται με μία ή περισσότερες ομάδες υδροξυλίου των σάκχαρων με ένα δεσμό εστέρα, ή σπανιότερα συνδέονται άμεσα με το φλαβονοειδές (Wollenweber, 1985). Μεταξύ αυτών των ακυλο-υποκαταστάτων υπάρχουν αλειφατικά οξέα όπως οξικό, μηλονικό, ή το ηλεκτρικό οξύ, και αρωματικά οξέα όπως το βενζοϊκό, γαλλικό, π-κουμαρικό και καφεϊκό οξύ (Aguinagalde και Martinez, 1982, Harborne, 1986, Wollenweber, 1978).

Ο ρόλος των φλαβονοειδών και, γενικά, των πολυφαινολικών ενώσεων σε φυτά δεν είναι εντελώς γνωστός. Η χρωστική λειτουργία τους, ως υπεύθυνη για την προσέλκυση εντόμων, είναι καλά γνωστή. Άλλες λειτουργίες όπως αντιοξειδωτικά, αντιμεταλλαξιογόνα, σχετικά με τη ρύθμιση της ανάπτυξης των φυτών και την αντίσταση στις ασθένειες των φυτών έχουν επίσης αποδοθεί σε αυτή την ομάδα των φυσικών πολυφαινολών (Harborne, 1985, McClure, 1975).

Τα φλαβονοειδή, λόγω της μεταβλητότητας στη δομή τους, τη φυσιολογική και χημική τους σταθερότητα, την ευρεία κατανομή τους μεταξύ των φυτών και τον σχετικά εύκολο εντοπισμό τους, αποτελούν ένα από τους κύριους χημοταξονομικους δείκτες. Σε γενικές γραμμές, η εξέλιξη συνεπάγεται αύξηση του

52

αριθμού των φλαβονοειδών σε κάθε συστηματική ομάδα, και ταυτόχρονα η δομική πολυπλοκότητα τους αυξάνει. Μεταξύ Lamiaceae η παρουσία των φλαβονοειδών είναι πολύ γνωστή (Adzet και Martinez, 1981, Barberin, 1986, Harborne, 1967, Hegnauer, 1966, 1989, Semrau, 1958, Zinchenko και Bandyukova, 1969). Ειδικά κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών διάφοροι συγγραφείς έχουν αποκαλύψει ένα ευρύ φάσμα των μοντέλων υποκατάστασης με χημοταξονομική σημασία (Barberin και Wollenweber, 1990, Tomas-Barberan, 1988). Ιδιαίτερα, το γένος Thymus έχει αποδειχθεί ότι έχει μια αξιοσημείωτη σύνθεση φλαβονοειδών πολύτιμης ταξινομικής σημασίας (Adzet και Martinez, 1981, Adzet, 1988, Hernandez 1987, Litvinenko και Zoz, 1969, Martinez, 1980, Simonyan, 1972, Simonyan και Litvinenkο, 1971, Vila, 1987).

5.2.1 ΦΛΑΒΟΝΕΣ

Πιο συχνά εμφανιζόμενη δομή είναι αυτή των φλαβονών. Παρακάτω δίνεται ένας πίνακας με τις υποκαταστάσεις που εμφανίζονται στον βασικό σκελετό των φλαβονών και τον αριθμό των ειδών του γένους Τhymus από τα οποία έχουν απομονωθεί οι συγκεκριμένες δομές. 3´ 2´ 4´ 1 8 1´ O 5´ 7 2 6´

6 3 5 4

O

-ΟΗ -ΟΜe Όνομα Αριθμός Ειδών 5,7 4΄ Ακασετίνη 9 5, 7, 4΄ - Απιγενίνη 99 5, 7, 4΄ 3' Χρυσοεριόλη 1 5, 4΄ 6, 7, 3΄ Σιρσιλινεόλη 32 5, 3΄, 4΄ 6, 7 Σιρσιλιόλη 1 5, 4΄ 6, 7, 8, 3΄ 8-Ο-μεθυλ-σιρσιλινεόλη 31 5, 4΄ 6, 7 Σιρσιμαριτίνη 33 5 6, 7, 8, 3΄, 4΄ 5-δεσμεθυλνομπιλετίνη 28 5 6, 7, 3΄, 4΄ 5-δεσμεθυλσινενσετίνη 28 5, 7, 3΄ 4΄ Διοσμετίνη 10 5 6, 7, 8, 4' Γαρδενίνη Β 5 5, 4΄ 7 Γενκγουανίνη 13 3, 5, 7, 4΄ - Καιμπφερόλη 1 5, 6 7, 4΄ Λαδανεϊνη 1 5, 7, 3΄, 4΄ - Λουτεολίνη 100 5, 6, 7, 3΄, 4΄ - 6-υδροξυ- λουτεολίνη 16 5, 3΄, 4΄ 7 7-Ο-μεθυλ-λουτεολίνη 2 5, 3΄ 7, 4΄ Πιλλοϊνη 1

53

5, 6 7, 8, 4΄ Πεμπρελίνη 1 3, 5, 7, 3΄, 4΄ - Κερκετίνη 1 5 6, 7, 4΄ Σαλβιγενίνη 6 5, 6, 7, 4΄ - Σκουτελαρεϊνη 55 5, 3΄, 4΄ 6, 7, 8 Σιδεριτοφλαβόνη 30 5, 6, 4΄ 7 Σορμπιφολίνη 2 5, 6, 4΄ 7, 8, 3΄ Θυμονίνη 24 5, 6, 4΄ 7, 8 Θυμουσίνη 29 5, 4΄ 6, 7, 8 Ξανθομικρόλη 34 5 7, 4΄ 4΄-Ο-μεθυλ-γενκγουανίνη 4 5, 4΄ 7, 8 8-Ο-μεθυλ-γενκγουανίνη 1 5, 6 7, 3΄, 4΄ - 3 5, 6 7, 8, 3΄, 4΄ - 1 5, 6, 4' 7, 3΄ - 4

5.2.2 ΦΛΑΒΟΝΟΛΕΣ

Η καιμπφερόλη και η κερκετίνη είναι οι μόνες φλαβονόλες που έχουν περιγραφεί στο γένος Τhymus. R

OH

HO O

OH

OH O

Κερκετίνη R= OΗ Καιμπφερόλη R= Η

5.2.3 ΦΛΑΒΑΝΟΝΕΣ ΚΑΙ ΔΙΥΔΡΟΞΥΦΛΑΒΟΝΟΛΕΣ

Όσον αφορά τις φλαβανόνες και τις διυδροξυφλαβονόλες, είναι λιγότερο διαδεδομένες στο γένος από ότι οι φλαβόνες. Ανάμεσα στα πρώτα, η εριοδικτυόλη, η ναρινγενίνη, η κουρανετίνη και η διυδροξανθομικρόλη έχουν αναφερθεί, ενώ μόνο διυδροκαμπφερόλη και ταξιφολίνη έχουν περιγραφεί μεταξύ των τελευταίων.

54

R1

R2

HO O

OH O

Ναρινγγενίνη R1= Η R2= OΗ Εριοδικτυόλη R1= OΗ R2= OΗ Εσπεριτίνη R1= OΗ R2= OCΗ3

5.2.4 ΑΚΕТΥΛΙΩΜΕΝΑ ΑΓΛΥΚΑ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΩΝ

Αν και ακυλιωμένα άγλυκα φλαβονοειδών σπάνια περιγράφονται στην οικογένεια Lamiaceae, ασυνήθιστα άγλυκα 8-C-p-υδροξυβενζυλ-παράγωγα πολλών φλαβόνων (απιγενίνη, λουτεολίνη, διοσμετίνη) και φλαβονολών (κερκετίνη, καιμπφερόλη) έχουν εντοπιστεί (Merghem, 1995).

5.2.5 ΑΝΘΟΚΥΑΝΙΔΙΝΕΣ

Ανθοκυανιδίνες και άλλα φλαβονοειδή που σχετίζονται με παρόμοιες δομές ελάχιστα έχουν βρεθεί στο γένος Thymus.

5.2.6 ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΕΙΣ ΓΛΥΚΟΖΙΤΕΣ

Για τα γλυκοζυλιωμένα του θυμαριού έχουν γίνει λιγότερο εντατικές έρευνες από τα άγλυκα. Μόνο 16 διαφορετικές δομές αυτής της ομάδας των φλαβονοειδών, ιδιαίτερα υδροξυλιωμένοι φλαβονο-γλυκοζίτες, έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία, το σύνολο των οποίων είναι Ο-γλυκοζίτες με μία εξαίρεση. Εκείνα που προέρχονται από απιγενίνη και λουτεολίνη είναι τα πιο διαδεδομένα, ιδιαίτερα λουτεολινο-7-Ο-γλυκοζίτης και απιγενινο-7-Ο-γλυκοζίτης, που έχουν βρεθεί σε δέκα και οκτώ είδη, αντίστοιχα. Φλαβονόλ- και ισοφλαβονοειδές γλυκοζίτες δεν έχουν αναφερθεί προηγουμένως σε αυτό το γένος. Τα άγλυκα φλαβονοειδών που βρίσκουμε πιο συχνά σε γλυκοζιτική μορφή είναι η λουτεολίνη, από την οποία έχουν περιγραφεί εννέα διαφορετικοί 7-Ο-γλυκοζίτες. Σπανιότερα, 6-ΟΗ- λουτεολίνη, σκουτελαρείνη και διοσμετίνη που προέρχονται από γλυκοζίτες έχουν επίσης εντοπιστεί. Τα σάκχαρα συνήθως συνδέονται με το άγλυκο μέσω της υδροξυ-ομάδας στη θέση C-7 του σκελετού των φλαβονοειδών, και είναι είτε ένας μονοσακχαρίτης είτε ένας δισακχαρίτης.

55

Οι διαδικασίες εκχύλισης οι οποίες χρησιμοποιούνται, καθώς και οι δυσκολίες στην διευκρίνιση της δομής, ιδιαίτερα των δεσμών σακχάρου, μπορεί να ήταν η αιτία των πολύ λίγων αποτελεσμάτων που αναφέρονται στους φλαβονοειδείς γλυκοζίτες στο Thymus σε σύγκριση με εκείνες που αφορούν τα άγλυκα.

Παρακάτω δίνεται ένας πίνακας με τους υποκαταστάτες και την συχνότητα εμφάνισης τους σε διάφορα είδη του γένους.

ΔΟΜΕΣ ΑΓΛΥΚΑ ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΙΔΩΝ 7-Ο-γλυκοζίτης απιγενίνη 8 4΄-Ο-π-κουμαρο- απιγενίνη 1 γλυκοζίτης 7-Ο-γλυκουρονίδιο διοσμετίνη 1 3΄-Ο-αλλοζίτης λουτεολίνη 1 Γαλακτοαραβινοζίτης λουτεολίνη 1 7-Ο-γλυκοζίτης λουτεολίνη 10 7-Ο-διγλυκοζίτης λουτεολίνη 2 7-Ο-γλυκουρονίδιο λουτεολίνη 2 7-Ο-νεοεσπεριδοζίτης λουτεολίνη 1 7-Ο-ρουτινοζίτης λουτεολίνη 2 7-Ο-ξυλοζίτης λουτεολίνη 2 7-Ο-γλυκοζίτης 6-ΟΗ-λουτεολίνη 2 γλυκοζυλο-γλυκουρονίδιο σκουτελλαρεϊνη 1 7-Ο-γλυκοζυλο-(1-4)- σκουτελλαρεϊνη 1 ραμνοζίτης 6,8-δι-C-γλυκοζίτης απιγενίνη 20

5.2.7 ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΟΞΕΑ Εννέα διαφορετικά φαινολικά οξέα έχουν αναφερθεί στο γένος Thymus, με το καφεϊκό και ροσμαρινικό οξύ να είναι εκείνα που βρίσκονται πιο συχνά (σε 29 και 20 είδη αντίστοιχα).

ΟΝΟΜΑ ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΙΔΩΝ καφεϊκό οξύ 29 χλωρογενικό οξύ 1 π-κουμαρικό οξύ 2 3,5-δικαφεουλ-κινικό οξύ 1 π-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ 1 πρωτοκατεχικό οξύ 1 ροσμαρινικό οξύ 20 συριγγικό οξύ 2 βανιλλικό οξύ 1

56

5.2.8 ΦΑΙΝΟΛΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΤΟΥ THYMUS VULGARIS

Από το Thymus vulgaris, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, έχουν απομονωθεί οι παρακάτω φαινολικές ενώσεις:

Apigenin Adzet and Martinez, 1981 OH Adzet etal., 1988 Awe etal., 1959 HO O Kummell, 1959 Olechnowicz-Stepien, Lamer- Zarawska, 1975 Semrau, 1958 Stoess, 1972 OH O Van den Broucke etal., 1982 Cyanidin Stoess, 1972 OH

HO O OH

OH

OH Cirsilineol Adzet et al., 1988

O Hernandez etal.,1987 Miura and Nakatani, 1989 OH Morimitsu etal., 1995 Van den Broucke etal., 1982 O O

O

OH O 8-ΟMe-Cirsilineol Adzet et al., 1988

O Hernandez et al.,1987 Miura and Nakatani, 1989 OH O Van den Broucke etal., 1982

O O

O

OH O Cirsimaritin Adzet and Martinez, 1981 Adzet et dl., 1988 Hernandez etal.,1987 Miura and Nakatani, 1989

57

OH

O O

O

OH O 5-Desmethylnobiletin Adzet etal., 1988

O Hernandez etal., 1987

O O

O O

O

OH O 5-Desmethylsinensetin Hernandez etal., 1987

O

O

O O

O

OH O 2,3-Dihydrokaempferol Adzet etal., 1988 OH

HO O

OH

OH O 2,3-Dihydroxanthomicrol Adzet etal., 1988 OH O

O O

O

OH O Eriodictyol Adzet etal., 1988 Morimitsu etal., 1995

58

OH

OH

HO O

OH O Gardenin-B Hernandez etal., 1987 O O

O O

O

OH O Genkwanin Adzet etal., 1988 OH Miura and Nakatani, 1989

O O

OH O Luteolin Adzet and Martinez, 1980, 1981 OH Adzet etal., 1988 OH Awe etal., 1959 Kummell, 1959 HO O Olechnowiz Stepien and Lamer- Zarawska, 1975 Semrau, 1958 Stoess 1972

OH O Van den Broucke etal., 1982 6-OH-Luteolin Adzet and Martinez, 1980, 1981 OH

OH

HO O

HO

OH O Naringenin Adzet etal., 1988 OH Stoess 1972

HO O

OH O

59

Quercetin Morimitsu etal., 1995 OH

OH

HO O

OH

OH O Sakuranetin Adzet etal., 1988 OH

O O

OH O Salvigenin Hernandez et al., 1987 O

O O

O

OH O Sideritoflavone Adzet etal., 1988 OH Hernandez etal., 1987 OH O

O O

O

OH O Taxifolin Adzet etal., 1988 OH

OH

HO O

OH

OH O Thymonin Hernandez etal.1987 Morimitsu et al.,1995 Van den Broucke etal., 1982

60

O

OH O

O O

HO

OH O Thymusin Hernandez et al., 1987 OH O

O O

HO

OH O Xanthomicrol Adzet and Martinez, 1981 OH O Adzet et al., 1988 Hernandez etal.,1987 O O Miura and Nakatani, 1989

O

OH O 5-OH-7-4'-(OMe)-flavone Miura and Nakatani, 1989 O

O O

OH O Apigenin-7-O-β-D-glucoside Olechnowicz-Stepien and OH Lamer-Zarawska, 1975

O O O HO

HO OH

OH OH O Luteolin-7-O-β-D-glucoside Olechnowicz-Stepien and Lamer-Zarawska, 1975 OH

OH

O O O HO

HO OH

OH OH O Luteolin-7-O-β-D-diglucoside Olechnowicz-Stepien and Lamer-Zarawska, 1975

61

OH

OH

O O O HO

HO O

OH OH O O OH

OH OH Vicenin-2 Husain and Markham, 1981 OH OH

HO OH

O OH HO

HO O

O HO

OH O HO OH

HO Caffeic acid Adzet etal., 1988 O

HO OH

HO Rosmarinic acid Adzet etal., 1988 OH

O OH O OH

O

HO

OH

6. ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ- ΧΡΗΣΕΙΣ

Στην παραδοσιακή ιατρική, τα φυτά έχουν χρησιμοποιηθεί από τους αρχαίους χρόνους για τη πρόληψη ή/και τη προστασία κατά των λοιμωδών νοσημάτων. Τα τελευταία χρόνια, η χρήση των φυτικών φαρμάκων και συμπληρωμάτων διατροφής ως εναλλακτική θεραπεία για τα λοιμώδη νοσήματα έχει ενταθεί, λόγω της υψηλής τους περιεκτικότητας σε αντιμικροβιακούς παράγοντες όπως είναι οι πολυφαινόλες, δηλαδή φλαβονοειδή, ταννίνες, και αλκαλοειδή. Φυτά του γένους Thymus είναι σημαντικά φαρμακευτικά βότανα, τα οποία είναι γνωστό ότι περιέχουν αντιμικροβιακούς παράγοντες και είναι πλούσια σε δραστικές ουσίες όπως θυμόλη, καρβακρόλη, π-κυμένιο και τερπινένιο.

Το θυμάρι έχει μια μακρά ιστορία στη χρήση του ως παραδοσιακό φάρμακο για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών για παράδειγμα νοσήματα του αναπνευστικού (βρογχίτιδα, άσθμα, κοκίτης), σε μορφή αφεψήματος, αλοιφής, βάμματος, σιροπιού

62

ή σε ατμούς για εισπνοές. Χρησιμοποιούνταν επίσης για την πρόληψη της αρτηριοσκλήρυνσης, για θεραπεία πονόδοντο, για μόλυνση ουροποιητικού και τη δυσπεψία. Ακόμη, αποβάλλει τα βακτήρια από το στομάχι και τα έντερα και έχει την ιδιότητα να αυξάνει την όρεξη λόγω της θυμόλης που περιέχει, η οποία έχει την ικανότητα να σκοτώνει βακτήρια και παράσιτα. Σε ποντίκια αναφέρθηκαν αναλγητικές και αντιπυρετικές ιδιότητες σε εκχυλίσματα θυμαριού.

Το θυμάρι έχει αλλάξει από ένα παραδοσιακό μπαχαρικό σε ένα σημαντικό φάρμακο της φυτοθεραπείας. Είναι πηγή σιδήρου, ασβεστίου, μαγγανίου, βιταμίνης Κ, αυξάνει τη ροή το αίματος και ασκεί αναζωογονητική επίδραση σε όλο το σώμα.

6.1 ΑΝΑΠΝΕΥΣТΙΚΟ ΣΥΣТΗΜΑ

Η κύρια εσωτερική χρήση του θυμαριού είναι στην θεραπεία μιας ποικιλίας ασθενειών του το αναπνευστικού συστήματος, λόγω των αποχρεμπτικών, σπασμολυτικών και αντισηπτικών ιδιοτήτων, όπως η γρίπη, το κρυολόγημα, η ιγμορίτιδα, η χρόνια και οξεία βρογχίτιδα, η φυματίωση, ηρεμεί τους σπασμούς του βήχα (κοκκύτη), και τον οξύθυμο και σπαστικό βήχα (άσθμα) (Bardeau, 1973, Pahlow, 1979, Poletti, 1979, Gonzalez and Mufioz, 1980, Fernandez and Nieto, 1982, Furlenmeier, 1984).Οι αποχρεμπτικές ιδιότητες ιδιαίτερα, αποδίδονται κυρίως στην παρουσία σαπωνινών.

63

6.2 ΓΑΣТΡΕΝТΕΡΙΚΟ ΣΥΣТΗΜΑ

Тο Тhymus vulgaris χρησιμοποιείται σε μια ευρεία ποικιλία γαστρεντερικών προβλημάτων, όπως δυσπεψία (αργή πέψη), κωλικούς, μετεωρισμός, διάρροια, γαστρίτιδα και γαστρικά έλκη, λόγω της ευστόμαχης και σπασμολυτικής του δράσης, η οποία οφείλεται στη θυμόλη κα στις φλαβόνες. Είναι επίσης χρήσιμο στη θεραπεία βακτηριακών και παρασιτικών λοιμώξεων και σε λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος (Perrot and Paris, 1971, Schauenberg and Paris, 1977, Gonzalez and Mufioz, 1980).

6.3 ΕΞΩТΕΡΙΚΗ ΧΡΗΣΗ

Εξωτερικά, εγχύματα και το αιθέριο έλαιο του θυμαριού χρησιμοποιούνται παραδοσιακά για θεραπεία σε κακώσεις, μώλωπες, μολυσμένα έλκη, αποστήματα, δερματικά έλκη, διάφορους τύπους δερματίτιδας, και σε ορισμένες περιπτώσεις, σε κνησμό (Schauenberg, 1977). Τα γαλακτώματα είναι χρήσιμα όταν χρησιμοποιούνται στο μασάζ για ρευματικούς πόνους (ισχιαλγία, αρθρίτιδα, οσφυαλγία), πόνους ουρικής αρθρίτιδας και νευριτικούς πόνους (Furlenmeier, 1984).

Όσον αφορά τα τριχοειδή αγγεία, το θυμάρι βελτιώνει την αιματικη ροή και οξυγόνωση του τριχωτού της κεφαλής, μειώνει τη σμηγματόρροια, αναγεννά τους τριχοειδείς αδένες, βελτιώνει την κατάσταση των μαλλιών, προλαμβάνει φαλάκρα, και είναι επομένως χρήσιμη σε περιπτώσεις αλωπεκίας (Poletti, 1979). Έτσι μπορούμε να ενισχύσουμε το σαμπουάν προσθέτωντας σταγόνες αιθερίου ελαίου θυμαριού.

Λουτρά με θυμάρι έχουν τονωτικές και καταπραϋντικές ιδιότητες. Επίσης, συμβάλλουν σαν πρόσθετα σε θεραπείες αδυνατίσματος (Pahlow, 1979, Furlenmeier, 1984, Volkk και Stodola, 1989).

6.4 ΣΥΝТΗΡΗТΙΚΟ ТΡΟΦΙΜΩΝ

Για να σταματήσει ή να μειωθεί ο ρυθμός αλλοίωσης που μπορεί να προκαλέσει υποβάθμιση στην ποιότητα των τροφίμων, στη βρωσιμότητα και τη θρεπτική αξία τους, θα πρέπει τα τρόφιμα να υφίστανται διάφορες μεθόδους διατήρησης που περιλαμβάνον την πρόληψη της ανάπτυξης βακτηρίων, ζυμών, μυκήτων και άλλων μικροοργανισμών, επιβραδύνοντας την οξείδωση των λιπών που μπορούν να προκαλέσουν τάγγισμα και παρεμποδίζοντας το φυσικό αποχρωματισμό που μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της παρασκευής τροφίμων. Тα αιθέρια έλαια από αρωματικά φυτά, όπως το θυμάρι, μπορούν να αξιοποιηθούν ως πρόσθετα

64

τροφίμων λόγω της βακτηριοκτόνου ή βακτηριοστατικής δράσης κατά των παθογόνων μικροοργανισμών που προέρχονται από τρόφιμα όπως π.χ. Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Eschericia coli, Shigella dysenteria, Bacillus cereus και Staphylococcus aureus (Montes and Carvajal, 1998).

Тα αιθέρια έλαια του θυμαριού χρησιμοποιούνται γενικά για τη διατήρηση του κρέατος και των προϊόντων κρέατος (τα οποία είναι ιδιαίτερα επιρρεπή στη μικροβιακή μόλυνση) επειδή το άρωμα τους δεν επηρεάζει αρνητικά τις οργανοληπτικές ιδιότητες αυτών των τύπων τροφίμων.

6.5 ΑΝТΙΒΑΚТΗΡΙΑΚΕΣ ΙΔΙΟТΗТΕΣ

Όσον αφορά την αντιβακτηριακή δραστικότητα των αιθερίων ελαίων του Тhymus vulgaris, έχει προσδιοριστεί η δράση του κατά 14 κλινικά απομονωμένων στελεχών του S. aureus ανθεκτικά στην μεθικιλλίνη (MRSA) και άλλων τυποποιημένων βακτηριακών στελεχών (B. cereus AТCC 9634, E. coli AТCC 3428, Klebsiella pneumoniae AТCC 13883, S. aureus AТCC 25922 και S. aureus AТCC 33592). Για να καθοριστεί η αντιβακτηριακή δράση χρησιμοποιήθηκαν δίσκοι διάχυσης σε άγαρ. Тα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο πιο ευαίσθητος μικροοργανισμός είναι ο Ε. coli με ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) 9,25μg/ml. Όσον αφορά τα MRSA κλινικά στελέχη, οι τιμές MIC κυμαίνονται από 18,5 έως 37,0 μg/ml (Crespo et al., 1990).

Είναι ενδιαφέρον ότι σε ορισμένες περιπτώσεις, η αναστολή που προκαλούν τα αιθέρια έλαια είναι παρόμοια με εκείνη που προκύπτει από αντιβιοτικά όπως τετρακυκλίνη, σιπροφλοξασίνη, τικαρκιλλίνη, καρβενικιλλίνη, βανκομυκίνη, μεθικιλλίνη και χλωραμφαινικόλη(Crespo et al., 1990) .

Ακόμη, το αιθέριο έλαιο έχει παρουσιάσει εξαιρετικά ισχυρή δράση έναντι 120 στελεχών των Staphylocccus,Enterococcus, Eschericia και Pseudomonas genera που απομονώθηκαν από ασθενείς με λοιμώξεις της στοματικής κοιλότητας, του αναπνευστικού και του ουροποιογεννητικού συστήματος καθώς κι από το περιβάλλον και το προσωπικό του νοσοκομείου. Тα στελέχη του Staphylococcus βρέθηκαν να είναι τα πιο ευαίσθητα ενώ τα βακτήρια Pseudomonas τα πιο ανθεκτικά. Σχετικά με τα συστατικά του αιθερίου ελαίου, η θυμόλη δείχνει να διαθέτει υψηλή δραστικότητα έναντι Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων. Αντιθέτως, η λιναλοόλη φαίνεται να είναι δραστική μόνο έναντι σε Gram θετικά βακτήρια (Crespo et al., 1990, Cabo etal., 1986).

Δοκιμάστηκε η αντιβακτηριακή δράση των αιθερίων ελαίων και του χλωροφορμικού εκχυλίσματος από αποξηραμένα φύλλα Тhymus vulgaris. Συνολικά, τα αιθέρια έλαια έδειξαν μεγαλύτερη δραστικότητα από το χλωροφορμικό εκχύλισμα. Στελέχη του S. aureus έχουν υψηλή ευαισθησία σε θυμόλη, καρβόνη, β- καρυοφυλλένιο, β-πινένιο, καμφορά, καμφένιο, λιμονένιο, π-κυμέμιο, 1,4-κινεόλη, α-πινένιο, μενθόνη, μυρκένιο, α-τερπινένιο, γ-τερπινένιο, λιναλοόλη και καρβακρόλη, με αυτή τη σειρά (Crespo et al., 1990).

65

Μια άλλη πιθανή εφαρμογή των αιθερίων ελαίων του θυμαριού είναι η αντιβακτηριακή δράση κατά του Helicobacter pylori, ένα gram αρνητικό βακτηρίδιο που μολύνει περισσότερο από το 50% του παγκόσμιου πληθυσμού.

6.6 ΑΝТΙΑΛΛΕΡΓΙΚΗ ΔΡΑΣТΗΡΙΟТΗТΑ

Εκχυλίσματα από θυμάρι έχουν δείξει αντιαλλεργική δράση, κυρίως σε αλλεργίες που προκαλούνται από τρόφιμα. Тα δραστικά συστατικά φαίνονται να είναι η λουτεολίνη καθώς και πολυμεθόξυφλαβόνες, αναστέλλοντας την απελευθέρωση της β-εξοσαμινιδάσης σε περίπτωση ενεργοποίησης του ανοσοποιητικού (Watanabe, 2004).

6.7 ΕΝТΟΜΟΚТΟΝΟΣ ΔΡΑΣΗ

Η προστασία έναντι των κουνουπιών βασίζεται σε εντομοκτόνα. Ωστόσο, οι αρνητικές επιπτώσεις των συνθετικών εντομοκτόνων έχει γίνει η κύρια ώθηση για την αναζήτηση νέων εναλλακτικών λύσεων, οι οποίες θα είναι αποδεκτές τόσο για το περιβάλλον, όσο και για τη δημόσια υγεία. Η χρήση εντομοκτόνων με βάση εκχυλίσματα φυτών είναι σήμερα ιδιαίτερα ελπιδοφόρα. Πολλά φυτικά εκχυλίσματα περιέχουν ουσίες με εντομοκτόνο δράση περιλαμβάνοντας και την μεγάλη ομάδα των αιθερίων ελαίων. Тέτοια δράση εμφανίζουν και τα εκχυλίσματα και αιθέρια έλαια του θυμαριού (Pavela, 2015).

7. ТΟΞΙΚΟТΗТΑ

Μελέτες τοξικότητας απαιτούνται σε περιπτώσεις που υπάρχει υπερβολική δόση καθώς τα αιθέρια έλαια μπορεί να γίνουν τοξικά και να προκαλέσουν αρνητικές επιπτώσεις στα ανθρώπινα κύτταρα. Είναι γεγονός, ένας αριθμός αναφορών έδειξε κυτταροτοξικότητα σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Έτσι, η εφαρμογή των αιθερίων ελαίων για τη θεραπεία ανθρώπινων λοιμώξεων, η οποία προτείνεται από την παραδοσιακή ιατρική μπορεί να είναι μια ενδιαφέρουσα εναλλακτική λύση για τα συνθετικά φάρμακα τα οποία παρουσιάζουν πολλές παρενέργειες.

Αναφορικά με την υψηλή αντιβακτηριακή δραστικότητα, τα αιθέρια έλαια και τα εκχυλίσματα που λαμβάνονται από το Тhymus vulgaris, συνίστανται ως θεραπευτική στρατηγική με πολλούς στόχους για την θεραπεία μολυσματικών ασθενειών.

Λόγω της έλλειψης ολοκληρωμένων κλινικών δοκιμών και δεδομένων σχετικά με την πιο αποτελεσματική δόση ή της αλληλεπίδρασης φαρμάκου- φαγητού, δεν μπορούμε να έχουμε σαφή συμπεράσματα σχετικά με την αποτελεσματικότητα για την αντιμετώπιση των λοιμώξεων. Ωστόσο, τα αιθέρια έλαια του θυμαριού θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εναλλακτική λύση για αντιβακτηριακά φάρμακα για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών ιδιαίτερα σε ανθεκτικές στα αντιβιοτικά βακτηριακές) λοιμώξεις (EMA/HMPC/342332/2013).

66

ΜΕΡΟΣ Β: ΠΕΙΡΑΜΑТΙΚΟ

67

B1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: ΓΕΝΙΚΑ, ΟΡΓΑΝΑ, ΤΕΧΝΙΚΕΣ

H πειραματική διαδικασία έλαβε χώρα στο εργαστήριο δρογοχημείας του τομέα Φαρμακογνωσίας-Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης.

B1.1. ΟΡΓΑΝΑ  Rotary evaporator (περιστροφικός συμπυκνωτής): BÜCHI Rotavapor R-200  Λουτρό υπερήχων: ТRANSSONIC 660/H  Πυριαντήριο: Lenton Тhermal Designs

Β.1.2. ΔΙΑΛΥΤΕΣ  Νερό απιονισμένο  Μεθανόλη: PANCREAS 131091.1214  Διαιθυλαιθέρας : PANCREAS 192770.2711  Οξικός αιθυλεστέρας : PANCREAS 131318.1214  n-βουτανόλη: CARLO ERBA REAGENТS 414131  Διχλωρομεθάνιο CARLO ERBA REAGENТS 463002  Μεθανόλη HPLC : HiPerSOLV CHROMANORM 20837.320  Νερό HPLC : PANCREAS 361074.1612  Οξικό οξύ HPLC : PANCREAS 361008.1612  Ακετονιτρίλιο : FLUKA 34967

B1.3. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

1. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Τhin Layer Chromatography, TLC) Η μέθοδος της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας χρησιμοποιήθηκε εκτεταμένα ως αναλυτική τεχνική, για τον έλεγχο της σύστασης των αρχικών εκχυλισμάτων, των κλασμάτων προερχομένων από στήλη, καθώς και για τον έλεγχο της καθαρότητας των απομονωμένων ουσιών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω τύποι: Κυτταρίνη (cellulose) σε πλάκες αλουμινίου 20x20cm με πάχος στοιβάδας 0.1mm (Merck, Art. 5552). Οξείδιο του πυριτίου, Silica gel (Kieselgel 60) σε πλάκες αλουμινίου διαστάσεων 20x20cm, με πάχος στοιβάδας 0.2mm χωρίς δείκτη φθορισμού στα 254nm (Merck, Art. 5553) και με δείκτη φθορισμού στα 254nm (Merck, Art. 5554).

68

Τα συστήματα των διαλυτών ανάπτυξης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ποικίλα και η επιλογή έγινε με βάση τη φύση των ουσιών και το είδος της στερεής φάσης. Έτσι, για την κυτταρίνη χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω συστήματα ανάπτυξης:  AcOH 15%,  Σύστημα ΕΑW: Οξικός αιθυλεστέρας, οξικό οξύ και απιονισμένο νερό αναμειγνύονται σε αναλογία 4:1:2 σε διαχωριστική χοάνη και αναταράσσονται καλά. Αφήνονται σε ηρεμία έως ότου να διαχωρίζονται σαφώς οι δύο φάσεις. Συλλέγεται και χρησιμοποιείται η οργανική φάση.  Για την ανάπτυξη των πλακών οξειδίου του πυριτίου χρησιμοποιήθηκε διχλωρομεθάνιο, νερό και μεθανόλη σε διάφορες αναλογίες, ανάλογα με την επιθυμητή πολικότητα.

Aντιδραστήρια ψεκασμού Η ανάγνωση των πλακών έγινε στα 254 και 365nm με λάμπα υπεριώδους. Για την αξιολόγηση των κηλίδων, χρησιμοποιήθηκαν τα εξής αντιδραστήρια ψεκασμού: Ατμοί πυκνού διαλύματος αμμωνίας για τις πλάκες κυτταρίνης. Αντιδραστήριο θειϊκής βανιλλίνης (αλκοολικό διάλυμα βανιλλίνης 5% & διάλυμα θειϊκού οξέος 5%). Εφαρμόζεται σε πλάκες οξειδίου του πυριτίου. Ίσοι όγκοι από τα δύο διαλύματα αναμειγνύονται λίγο πριν από τον ψεκασμό. Μετά τον ψεκασμό ακολουθεί ομοιόμορφη θέρμανση σε θερμαντική πλάκα.

2. Χρωματογραφία στήλης (Column Chromatography, CC) Χρησιμοποιήθηκε η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού με γέλη Sephadex LH- 20 (Sephadex LH-20, Αmersham Biosciences). Το υλικό πλήρωσης είναι υδροξυπροπυλιωμένη δεξτράνη. Ο διαχωρισμός σε αυτήν την περίπτωση γίνεται με βάση το διαφορετικό μοριακό βάρος των ενώσεων. Μόρια μεγαλύτερα από τους πόρους δεν μπορούν να εισέλθουν, συνεπώς εκλούονται από την στήλη γρηγορότερα από τα μικρότερου μεγέθους μόρια που εισέρχονται στους πόρους και διανύουν μεγαλύτερη απόσταση, προχωρώντας πιο αργά μέσα στην στήλη.

3. Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC-High Pressure Liquid Chromatography) Η χρωματογραφία υψηλής πίεσης ανήκει στις χρωματογραφικές τεχνικές, άρα ο διαχωρισμός είναι αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης μιας στατικής και μιας κινητής φάσης. Στην HPLC, το δείγμα εισάγεται στη κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια της κινητής φάσης, τα συστατικά του μετακινούνται με τη μορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα μετά το άλλο. Οι αναλυόμενες ουσίες κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης, με αποτέλεσμα να μετακινούνται με

69

διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της στήλης. Στην HPLC μπορούν να συμπεριληφθούν και να εφαρμοστούν όλα τα είδη που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς, με την κατάλληλη χρήση υλικού πληρώσεως της στήλης και του διαλύτη έκλουσης (Παπαδογιάννης, 2000).  Χρωματογραφία Προσρόφησης: Ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησης στη στατική φάση. Οι κυριότερες αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης. Η χρωματογραφία προσρόφησης βρίσκει εφαρμογή στο διαχωρισμό ουσιών με παρόμοια δομή, αλλά με διαφορετική πολικότητα. Ανάλογα με τη σχέση πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης: (α) Χρωματογραφία Κανονικής Φάσης: Εδώ, η στατική φάση (συνήθως SiO2 ή Al2O3) είναι πολικότερη από την κινητή, η οποία αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο, κλπ, και (β) Χρωματογραφία Αντίστροφης Φάσης: Εδώ, η στατική φάση, η οποία είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.ά., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα και νερό.  Χρωματογραφία Κατανομής: Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μείγματος μεταξύ της κινητής και της υγρής στατικής φάσης και εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων, μη ιονικών ενώσεων.  Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής: Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το pΗ, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία.  Χρωματογραφία Συγγένειας: Για την επίτευξη του διαχωρισμού, οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Στη κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωματογραφία Εναντιομερών, η οποία αποκτά αυξανόμενο ενδιαφέρον και με την οποία διαχωρίζονται εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία.  Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους: Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων και βρίσκει εφαρμογές στην ανάλυση και το χαρακτηρισμό των πολυμερών. Τα μεγάλα μόρια εξέρχονται πρώτα από τη στήλη, ενώ τα μικρά μόρια, καθώς εισέρχονται στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, καθυστερούν και βγαίνουν αργότερα. Ένα σύστημα HPLC περιλαμβάνει: -Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών -Αντλία (σταθερής ροής, σταθερής πίεσης) -Μονάδα εισαγωγής δείγματος (βαλβίδα εισαγωγής δείγματος, αυτόματος δειγματολήπτης) -Χρωματογραφική στήλη

70

-Ανιχνευτή -Καταγραφικό

Χρησιμοποιήθηκε ημιπαρασκευαστική μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με στήλη αντιστρόφου φάσης, για τον διαχωρισμό και την παραλαβή καθαρών ενώσεων. Тo μηχάνημα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Marathon III HPLC Pump συνδεδεμένο με το SSI Detector Variable UV+Vis, η στήλη που χρησιμοποιήθηκε είναι η GRACE Apollo C18 5μ με Lot No. 50339655 με διαλύτες μεθανόλη HPLC και όξινο νερό HPLC (2% οξικό οξύ HPLC), οι οποίοι λόγω της πολικότητας των ενώσεων κρίθηκαν οι καταλληλότεροι και δοκιμάστηκαν διάφορα συστήματα διαλυτών μέχρι να βρεθεί αυτό με το καλύτερο δυνατό διαχωρισμό των ενώσεων σε κάθε περίπτωση.

Β1.4. Φασματοσκοπικές τεχνικές

UV-Vis Spectra (Φασματοφωτομετρία υπεριώδους- ορατού)

H λήψη των φασμάτων απορρόφησης UV-Vis των απομονωμένων ουσιών αλλά και των μιγμάτων προς διαχωρισμό πραγματοποιήθηκε σε φασματοφωτόμετρο HITACHI 2000 με κυψελίδες χαλαζία 10mmQS.

Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των περισσότερων φλαβονοειδών είναι το γεγονός ότι τα UV-VIS φάσματα τους μπορεί να είναι πολύ διαφωτιστικά. Τα περισσότερα φλαβονοειδή εμφανίζουν μια κορυφή στην περιοχή 210-290nm (band ΙΙ) και μία δεύτερη κορυφή στα 320-380 nm (band Ι) (Mabry, 1970). Η μπάντα Ι θεωρείται πως σχετίζεται με τις απορροφήσεις λόγω των αλληλεπιδράσεων που συμβαίνουν στον δακτύλιο Β, ενώ η μπάντα ΙΙ στον δακτύλιο Α. Η απορρόφηση της μπάντας Ι μας δίνει πληροφορίες σχετικά με τον τύπο του φλαβονοειδούς αλλά και για την παρουσία οξυγόνου (βαθυχρωμική μετατόπιση με την προσθήκη υδροξυλομάδων) (Mabry, 1970).

71

Φλαβόνες 304-350nm (band Ι) Φλαβονόλες (υποκατεστημένη 3-ΟΗ) 328-357nm (band Ι) Φλαβονόλες (ελεύθερη 3-ΟΗ) 352-385 (band Ι)

Ισοφλαβόνες, φλαβανόνες και διυδροφλαβονόλες διαφέρουν καθώς δίνουν κυρίως τη μπάντα ΙΙ, ενώ η μπάντα Ι εμφανίζεται ως ώμος ή ως μικρής έντασης κορυφή.

Ισοφλαβόνες 245-270nm (band II) Φλαβανόνες/διυδροφλαβονόλες 270-295 (band II)

Συμπληρωματικές πληροφορίες μπορεί να προκύψουν από την χρήση αντιδραστηρίων και των μετατοπίσεων των απορροφήσεων τους. Αυτές οι μετατοπίσεις με τα αντιδραστήρια έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά χρήσιμοι οδηγοί για την υποκατάσταση σε μια ποικιλία φλαβονοειδών. Μικρή ποσότητα υλικού απαιτείται και οι δοκιμές πραγματοποιούνται απευθείας στη κυψελίδα με το δείγμα, θέλοντας μόνο λίγα λεπτά για να ολοκληρωθεί.

Οι διαδικασίες για τις δοκιμές με αντιδραστήριο και οι αλλαγές που προκύπτουν για φλαβόνες ή φλαβονόλες είναι οι εξής (Bloor, 2001): i. Έξι σταγόνες 2,5% NaOMe σε μεθανόλη προστίθενται άμεσα στην κυψελίδα που περιέχει το μεθανολικό διάλυμα των φλαβονοειδών. Μια αλλαγή 30 έως 65nm στη κορυφή Ι χωρίς απώλεια της έντασης υποδεικνύει μια ελεύθερη -ΟΗ στη θέση 4΄. Μια μείωση στην ένταση της κορυφής αυτής δείχνει μία υποκατεστημένη 4'-ΟΗ. Αν η μπάντα μειώνεται ή αποικοδομείται μετά από αρκετά λεπτά, στη συνέχεια, είτε ελεύθερα 3,4'-ΟΗ ή τρία γειτονικά -OH είναι πιθανά, και εάν μία νέα ζώνη χαμηλής έντασης εμφανίζεται στα 320-335 nm, υποδεικνύεται μια ελεύθερη 7-ΟΗ. ii. Αρκετά χιλιοστόγραμμα στερεού οξικού νατρίου προστίθενται σε ένα φρέσκο μεθανολικό διάλυμα των φλαβονοειδών. Μια μετατόπιση της ζώνης ΙΙ σε μικρότερο μήκος κύματος δείχνει ελεύθερη 7-ΟΗ. iii. Αρκετά χιλιοστόγραμμα στερεού βορικού οξέος προστίθενται στο διάλυμα από την διαδικασία ii για τη διάγνωση της παρουσίας ορθο-ΟΗ ομάδες. Χωρίς αυτές τις ομάδες οι απορροφήσεις του φάσματος θα επανέλθουν στο αρχικό φάσμα μεθανόλης. Μετακίνηση της μπάντας Ι 12-36nm δείχνει παρουσία ορθο-ΟΗ. iv. Ένα άλλο μεθανολικό διάλυμα παρασκευάζεται και δοκιμάζεται για απόκριση σε AlCl3. Λίγες σταγόνες από 5% AlCl3 σε διάλυμα μεθανόλης προστίθενται, και η μετατόπιση της κορυφής II 20-40nm να υποδεικνύει πάλι παρουσία ορθο-ΟΗ. Δύο έως τρεις σταγόνες 20% υδατικό HCl προστίθενται στη συνέχεια, και μετατόπιση από 35 έως 70 nm δείχνει μια ελεύθερη 5- ή / και 3-ΟΗ.

B1.5. Συζευγμένες τεχνικές, LC-MS

Για τον έλεγχο της καθαρότητας αλλά και για την ταυτοποίηση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε τεχνική LC-MS. Тο σύστημα της HPLC ήταν της Тhermo Scientific και αποτελείτο από αντλία (LC Pump Plus) και αυτόματο δειγματολήπτη (Autosampler Plus), το οποίο ήταν συνδεδεμένο με φασματογράφο μάζας

72

τετραπολικού αναλυτή. Το λογισμικό χειρισμού του συστήματος ήταν το Finnigan Surveyor. Οι συνθήκες στο φασματογράφο μάζας ήταν οι εξής: Δυναμικό ακροφυσίου (capillary voltage): 3kV. Θερμοκρασία τριχοειδούς (Probe Temperature) 350 °C, εύρος σάρωσης m/z 100 - 1000. Τα φάσματα ελήφθησαν με θετικό και αρνητικό ιονισμό με δυναμικά CID 70 (+), 100(+), 80 (-) και 120 (-).

Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντιστρόφου φάσης, Thermo Hypersil Gold C18 με μέγεθος σωματιδίων υλικού πληρώσεως 5µ και διαστάσεις 100 x 4.6mm, η οποία διατηρείτο στους 30 °C. Οι διαλύτες ήταν H2O σε pH 3.2 με τη βοήθεια φορμικού οξέως (A) και ακετονιτρίλιο (B). Το σύστημα έκλουσης ήταν το ακόλουθο:

Χρόνος Α Β Ροή (ml/min) 0.00 90 10 0.8 25.00 30 70 0.8 30.00 90 10 0.8 35.00 90 10 0.8

Η LC/MS μας φανερώνει το μοριακό βάρος των διαφόρων συστατικών. Χρησιμοποιείται ακόμη για την ποσοτική ανάλυση και είναι κατάλληλη για τον προσδιορισμό των ασταθών σε διάλυμα ενώσεων, όπως τα ακυλιωμένα φλαβονοειδή. Η λειτουργία αρνητικού ιόντος παρέχει την υψηλότερη ευαισθησία και αποτελέσματα με περιορισμένες θραυσματοποιήσεις, καθιστώντας το πιο κατάλληλο για να συμπεράνουμε τη μοριακή μάζα των διαχωρισμένων φλαβονοειδών, ειδικά σε περιπτώσεις όπου οι συγκεντρώσεις είναι χαμηλές (Cuyckens, 2003). Η κορυφή στην υψηλότερη αναλογία m/z δεν είναι πάντα το μοριακό ιόν ([M+H]⁺ στη θετική λειτουργία, και το [M-Η]¯ στην αρνητική), επειδή μπορούν να δημιουργηθούν προϊόντα με τη προσθήκη διαλύτη και / ή μορίων οξέος και επίσης μοριακά σύμπλοκα ([2Μ+H]⁺ ή [2Μ-Η]¯). Η συνδυασμένη χρήση των δύο τρόπων μεταφοράς ιονισμού δίνει επιπλέον βεβαιότητα στον προσδιορισμό μοριακής μάζας, ιδιαίτερα για τις δευτερεύουσες ενώσεις όπου το επίπεδο θορύβου είναι πολύ υψηλότερο (Cuyckens., 2003). Πληροφορίες για τη δομή μπορούν επίσης να ληφθούν από το χρόνο κατακράτησης. Γενικά RP-στήλες (ανάστροφης φάσης) χρησιμοποιούνται, και οι περισσότερο πολικές ενώσεις εκλούονται πρώτες. Έτσι, οι χρόνοι κατακράτησης συσχετίζονται αντίστροφα με την αύξηση της γλυκοζυλίωσης, ενώ ακυλίωση, μεθυλίωση ή πρενυλίωσης έχουν το αντίθετο αποτέλεσμα. Οι φλαβανόνες προηγούνται από τις φλαβονόλες, που με τη σειρά προηγούνται τις φλαβόνες, για τις ενώσεις με ένα ισοδύναμο πρότυπο υποκατάστασης. Επίσης, η θέση σύνδεσης, ιδιαίτερα των σακχάρων, μπορεί να έχει επίδραση στο χρόνο συγκράτησης. Θετικός ιονισμός Τα φάσματα μαζών που λαμβάνονται με ιονισμό ηλεκτρονίων (ΕΙ) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για έρευνες δομής των φλαβονοειδών. Αυτή η τεχνική

73

ιονισμού έχει εφαρμοστεί σε όλες τις κατηγορίες των άγλυκων φλαβονοειδών. Ωστόσο, περίπλοκα θραύσματα μπορούν να δημιουργηθούν κατά τη διάρκεια της ΕΙ λόγω της ευρείας εξάπλωση της εσωτερικής ενέργειας που μεταφέρεται από το αρχικά παραγόμενα M⁺˙ ιόντα, τα οποία μπορεί να κρύψουν ή να καταστείλουν τα ιόντα M⁺˙ και σημαντικά ιόντα από το πρωτεύον θραύσμα που περιέχει δομικές πληροφορίες (Cuyckens, 2003). Επιπλέον, ΕΙ παρουσιάζει περιορισμούς για την ανάλυση πολυφαινολικών φλαβονοειδών, λόγω της χαμηλής πτητικότητας της και υψηλής πολικότητάς τους. Μετά την εισαγωγή των τεχνικών ταχέων ατόμων βομβαρδισμου (FAB) και την ατμοσφαιρική πίεση ιονισμού (ΑΡΙ), δηλαδή APCI και ESI, χρήσιμες δομικές πληροφορίες για τα πολικά βιομόρια μπορούν να ληφθούν άμεσα και εύκολα (Cuyckens, 2003). Οι πιο χρήσιμες θραυματοποιήσεις σε άγλυκα φλαβονοειδή προς αναγνώριση είναι εκείνew που απαιτούν διάσπαση δύο δεσμών C-C του C-δακτύλιο, με αποτέλεσμα να έχουμε τα δομικά χρήσιμα ιόντα A⁺ και B⁺. Αυτά τα ιόντα μπορούν να είναι αποτέλεσμα αντιδράσεων retro-Diels-Alder (RDA) και είναι τα πιο διαγνωστικά θραύσματα για την αναγνώριση φλαβονοειδών δεδομένου ότι παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τον αριθμό και τον τύπο των υποκαταστατών στους Α- και Β-δακτυλίους.

Οι κύριες οδοί θραυσματοποίησης που οδηγούν σε Α και Β ιόντα απαιτούν διάσπαση των δεσμών C-C στις θέσεις 1/3, 0/2, 0/3, 0/4 ή 2/4 του C-δακτύλιου. Тα μονοπάτια θραυσματοποίησης εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την υποκατάσταση και τη κατηγορία των φλαβονοειδών που μελετώνται, π.χ. η πρόσθετη ομάδα υδροξυλίου στη θέση 3 στις φλαβονόλες έχει ως αποτέλεσμα περισσότερες και διαφορετικές δυνατότητες για θραύσματα σε σύγκριση με τις φλαβόνες (Cuyckens, 2003). Εκτός από τα Α⁺ και Β⁺ ιόντα, απώλειες μικρών μορίων ή / και ριζών από τα [M+H]⁺ ιόντα σημειώνονται. Απώλειες 18u (H2O), 28u (CO), 42u (C2H2O) και / ή η διαδοχική απώλεια αυτών των μικρών ομάδων παρατηρούνται συχνά. Αυτές οι απώλειες είναι χρήσιμες για την ταυτοποίηση παρουσίας των συγκεκριμένων λειτουργικών ομάδων. Για παράδειγμα, η μεθοξυ- ομάδα ανιχνεύεται εύκολα από την απώλεια του 15u (CH3) από το [Μ+Η]⁺ πρόδρομο ιόν. Η απώλεια μιας ρίζας CH3 εμφανίζεται να είναι διαδεδομένη, έτσι ώστε το [M+H-CH3]⁺˙ ιόν να κυριαρχεί σε ολόκληρο το

74

φάσμα. Απώλειες 56u (C4H8) επισημαίνουν την παρουσία ενός πρενυλο- υποκαταστάτη.

Αρνητικός ιονισμός Στην ανάλυση δομής των φλαβονοειδών, τα φάσματα θετικού ιόντος CID χρησιμοποιούνται πιο συχνά, ενώ φάσματα αρνητικού ιόντος CID συχνά θεωρούνται ότι είναι πιο δύσκολο να ερμηνευθούν. Γενικά, χρειάζονται υψηλότερες ενέργειες σύγκρουσης, σε σύγκριση με τον τρόπο θετικού ιόντος, για να δώσει επαρκή θραύσματα και, μερικές φορές, διαγνωστικά ιόντα που παρατηρήθηκαν στον θετικό ιονισμό και είναι χρήσιμα στον καθορισμό δομής απουσίαζαν από τον αρνητικό. Η λειτουργία αρνητικού ιόντος είναι, ωστόσο, περισσότερο ευαίσθητη στην ανάλυση των φλαβονοειδών, και η συμπεριφορά της θραυσματοποίησης είναι διαφορετική, δίνοντας πρόσθετες και συμπληρωματικές πληροφορίες (Cuyckens, 2003). Διάσπαση του C-δακτύλιου με ένα μηχανισμό RDA οδηγεί σε Α¯ και Β¯ ιόντα, παρέχοντας πληροφορίες σχετικά με τον αριθμό και τον τύπο των υποκαταστατών στους Α- και Β-δακτυλίους. Тο Α¯ θραύσμα είναι συχνά το κύριο θραύσμα ιόντος με το τρόπο αρνητικού ιόντος, ενώ το B¯ ιόν είναι η κύρια και χαρακτηριστική κορυφή για τις ισοφλαβόνες. Ο βαθμός της υδροξυλίωσης στον Β-δακτύλιο έχει αντίκτυπο στην θραυσματοποίηση. Για παράδειγμα, για φλαβονόλες που περιέχουν δύο ή περισσότερες ομάδες υδροξυλίου στον Β-δακτύλιο, π.χ. κερκετίνη, φισετίνη και μυρικετίνη, ιόντα που αντιστοιχούν στα [Α-Η]¯ και [Β+H]¯ μπορεί να εμφανιστούν, ενώ στην περίπτωση ενός μη υποκατεστημένου Β-δακτυλίου, η ενέργεια σύγκρουσης που απαιτείται για την απόκτηση κατακερματισμού είναι πολύ υψηλότερη, οδηγώντας σε πολλά προϊόντα ιόντων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, παρατηρείται μια άμεση διάσπαση του δεσμού μεταξύ Β- και C-δακτυλίου, με αποτέλεσμα να βλέπουμε [M-Β δακτύλιο]¯ θραύσμα. Απώλειες μικρών ουδέτερων μορίων, όπως CO (-28u), CO2 (-34u), C2H2O (-42u) και οι διαδοχικές απώλειες αυτών των μορίων, μπορεί επίσης να είναι εμφανή (Cuyckens, 2003). Οι μεθυλιωμένες ενώσεις χαρακτηρίζονται από την απώλεια 15u με αποτέλεσμα να εμφανίζεται [Μ- H-CH3]¯˙ ρίζα ιόντος η οποία γενικά αποτελεί την βασική κορυφή. Ο προσδιορισμός των πρενυλιωμένων φλαβονοειδών παρεμποδίζεται στον αρνητικό ιονισμό, επειδή η διάσπαση του ισοπρενοειδούς υποκαταστάτη δεν μπορεί να παρατηρηθεί.

75

B.2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΙ ΠΟΡΕΙΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ

Β2.1 ΕΚΧΥΛΙΣΗ Υπέργεια τμήματα (φύλλα και βλαστοί) πόας Thymus vulgaris varico III συλλέχθηκαν στα τέλη Απρίλιου του 2014 από ιδιωτική καλλιέργεια του χωριού Μαυρονερίου Κιλκίς. Το φυτικό υλικό ήταν στο δεύτερο έτος καλλιέργειας στη φάση της ανθοφορίας. Η ξήρανση έγινε σε μέρος δροσερό και ξηρό. Εκχυλίσθηκαν 100g φυτικού υλικού με 1 λίτρο μεθανόλη (αναλογία 1:10) για 72 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, ανακινούμενο κάθε 24 ώρες. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε άλλες 2 φορές χρησιμοποιώντας συνολικά ακόμη 1.5 λίτρο μεθανόλης. Ακολούθησε συνένωση των εκχυλισμάτων και συμπύκνωση με τη χρήση evaporator. Μετά την εξάτμιση του διαλύτη παραλάβαμε συνολικά 26.9g ξηρού εκχυλίσματος.

B2.2 ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΧΛΩΡΟΦΥΛΛΩΝ Για την απομάκρυνση των χλωροφυλλών, το μεθανολικό εκχύλισμα διαλύθηκε σε 2.5 λίτρα ζεστό νερό (ποσότητα ίση με της μεθανόλης που χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση). Ακολούθησε διήθηση και παραλαβή του υδατικού διαλύματος.

B2.3 ΚΑТΑΝΟΜΕΣ Στη συνέχεια ακολούθησαν κατανομές με τρείς διαφορετικούς διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας (200ml x 5):

1 Διαιθυλαιθέρας, για τα πιο άπολα συστατικά 2 Οξικός αιθυλεστέρας, για τα μεσαίας πολικότητας συστατικά 3 n-βουτανόλη, για τα πιο πολικά συστατικά

Μετά την απομάκρυνση των διαλυτών με τη χρήση evaporator ελήφθησαν τα εξής εκχυλίσματα:

διαιθυλαιθέρα – Et2O 2g οξικό αιθυλεστέρα - EtOAc 2g n-βουτανόλη - BuOH 1g

Περεταίρω διεργασίες ακολουθήθηκαν μόνο για το κλάσμα του διαιθυλαιθέρα.

76

B2.4. ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΔΙΑΙΘΥΛΑΙΘΕΡΑ – Et2O – ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ

Αρχικός έλεγχος μέσω ТLC σε πλάκες κελουλόζης με δύο διαφορετικά χρωματογραφικά συστήματα (15% οξικό οξύ και EAW) και χρήση ατμών αμμωνίας έδειξαν την παρουσία φαινολικών ενώσεων. Καλύτερη απόδοση είχε το σύστημα με 15% οξικό οξύ, ενώ με το EAW δεν ήταν κατάλληλο.

Μέρος του εκχυλίσματος του διαιθυλαιθέρα (500mg) υποβλήθηκε σε χρωματογραφία στήλης Sephadex LH-20 διαστάσεων 2 x 45cm με διαλύτη έκλουσης 100% μεθανόλη. Ελήφθησαν 38 κλάσματα, τα οποία με τη βοήθεια ТLC σε κελουλόζη και silica συνενώθηκαν στις εξής ομάδες:

Συνένωση Κωδικός Βάρος 5-6 ΜΕТ-Α 43 mg 7 MEТ-B 26.4 mg 8-9 MEТ-C 45 mg 10-12 MEТ-D 120 mg 13 MEТ-E 23 mg 14-38 MEТ-F 190mg 15 MEТ-G* 11mg

*Το κλάσμα 15, MEТ-G κρατήθηκε χωριστά, διότι κατά τον έλεγχο μέσω ТLC φαινόταν πιο καθαρό.

Τα κλάσματα που προέκυψαν υποβλήθηκαν σε στήλες Sephadex LH-20 με άπολο σύστημα διαλυτών διχλωρομεθάνιο:μεθανόλη 1:1, με σκοπό τον περαιτέρω καθαρισμό τους από τις χλωροφύλλες:

-Тo κλάσμα ΜΕТ-C (45 mg) υποβλήθηκε σε στήλη Sephadex LH-20 διαστάσεων 1 x 35cm με διχλωρομεθάνιο:μεθανόλη 1:1. Ελήφθηκε το κλάσμα ΜΕТ-CA με βάρος 11mg.

-Тo κλάσμα ΜΕТ-D (120 mg) υποβλήθηκε σε καθαρισμό στην ίδια στήλη Sephadex LH-20 με τις ίδιες συνθήκες και προέκυψε το κλάσμα ΜΕТ-DA με βάρος 108mg.

-Ομοίως, από τo κλάσμα ΜΕТ-E (23 mg) προέκυψε το κλάσμα MEТ-EA με βάρος 17mg.

-Тo κλάσμα ΜΕТ-F (190 mg) υποβλήθηκε σε στήλη Sephadex LH-20 διαστάσεων 1x35cm με διχλωρομεθάνιο: μεθανόλη 1:1 και πήραμε 18 κλάσματα, από τα οποία κρατήθηκαν τα εξής κλάσματα:

Συνένωση Κωδικός Βάρος 4-5 ΜΕТ-FA 6 mg 6-7 MEТ- FB 17 mg 8-9 MEТ- FC 33 mg 10-12 MEТ- FD 113 mg 13-14 MEТ-FE 4 mg

77

ΜΕΤ-Α 43mg

MET-B 26,5mg

MET-C 45mg MET-C-A 11mg

MET-D ΜΕΤ-DA 108 mg 120mg

MET-E ΑΡΧΙΚΟ ΜΕΤ MET-EA 17mg 23mg

MET-FA 6mg

MET-FB 17mg

MET-F MET-FC 33mg 190mg

MET-G MET-FD 113mg 11mg

MET-FE 4mg

78

Тo κλάσμα ΜΕТ-FB (17 mg) υποβλήθηκε σε HPLC. Οι ενέσεις πού έγιναν ήταν συγκέντρωσης 1mg/ml, η ροή 0.9ml/min, τo UV στα 330nm και οι διαλύτες έκλουσης ήταν νερό (οξικό οξύ 2%):μεθανόλη με το ακόλουθο πρόγραμμα:

Χρόνος Νερό (AcOH 2%) Μεθανόλη 0 70 30 40 0 100 50 0 100 55 70 30 65 70 30

Mε αυτή τη διαδικασία απομονώθηκαν 2 ουσίες: ΜΕТ-FB-1 με βάρος 3.5mg, η οποία ταυτοποιήθηκε δυνητικά ως σιρσιμαριτίνη, μέσω LC-MS. MEТ-FB-2 με βάρος 3.3mg, η οποία ταυτοποιήθηκε δυνητικά ως ξανθομικρόλη, μέσω LC-MS.

79

Μέρος του κλάσματος ΜΕТ-FD (48 mg) υποβλήθηκε σε HPLC. Οι ενέσεις πού έγιναν ήταν συγκέντρωσης 1mg/ml, η ροή 0.9ml/min, τo UV στα 330nm και οι διαλύτες έκλουσης ήταν νερό (οξικό οξύ 2%):μεθανόλη με το ακόλουθο πρόγραμμα:

Χρόνος Νερό (AcOH 2%) Μεθανόλη 0 85 15 15 55 45 25 50 45 35 30 70 40 0 100 45 0 100 50 85 15

80

Από αυτή τη διαδικασία τη διαδικασία συλλέξαμε τις εξής κορυφές:

Αριθμός βάρος ταυτοποίηση 1 1.3mg - 2 2mg Καφεϊκό οξύ 2α 0.7mg - 3 3.2mg Тαξιφολίνη 4 0.6mg Ροσμαρινικό οξύ 5 19.5mg 7-Ο-β-γλυκοζίτης λουτεολίνης + διυδροκαμπφερόλη 5α 1.4mg - 6 0.4mg Εριοδικτυόλη 7 3.4mg Μεθυλεστέρας ροσμαρινικού 9 1.1mg Διγλυκοζίτης λουτεολίνης 10 3.3mg Ναριγγενίνη 11 2.1mg Λουτεολίνη 12 1.6mg Απιγενίνη

81

ΜΕΡΟΣ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

82

ΜΕΡΟΣ Γ: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

1. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΟΡΥΦΩΝ

Ουσία 1. Тαυτοποιήθηκε ως απιγενίνη.

OH

HO O

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus moroderi, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988), Тhymus capitatus, Тhymus mastichina, Тhymus caespititius, Тhymus piperella, Тhymus villosus, Тhymus hyemalis, Тhymus loscosii, Тhymus serpylloides, Тhymus zygis, Тhymus granatensis, Тhymus nervosus, Тhymus praecox, Тhymus pulegioides (Adzet, 1981), Тhymus glabrenscens, Тhymus pannonicus (Boros, 2010) και φυσικά και σε Тhymus vulgaris (Adzet, 1981).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-12 πέρασε από LC-DAD-MS, καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 1 (UV (nm), MeOH: 268, 335

83

Από το φάσμα UV, προκύπτει ότι η ουσία είναι φλαβόνη, διότι απορροφά στα 335nm.

Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 1 σε χρόνο ανάσχεσης 14.29 min. Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

FD12b #825 RT: 14.25 AV: 1 NL: 6.62E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=80.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 269.12 100

90

80

70

60

50

40

Relative Abundance

30

20

10

151.05 225.17 539.26 307.73 445.26 614.14 655.66 772.14 819.46 922.87 975.53 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 80V της ουσίας 1.

84

FD12a #830 RT: 14.34 AV: 1 NL: 2.46E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 269.11 100

90

80

70

60

50

40 RelativeAbundance 117.09 30

20 151.05 10 539.22 159.08 227.15 293.32 367.24 440.86 491.84 561.28 593.25 0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 1.

FD12-100P #830 RT: 14.34 AV: 1 NL: 6.97E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 271.17 100

90

80

70

60

50

40

RelativeAbundance

30

20

10 143.24 312.22 620.32 194.31 375.15 432.32 565.22 482.11 661.43 0 100 200 300 400 500 600 700 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 1.

85

Στα φάσματα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 269 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 539 [2Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 271 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 270.

Στο φάσμα (ESI-) στα 80V τo μόριο δεν θραυσματοποιείται έντονα για αυτό και δε δίνει έντονες κορυφές θραυσμάτων παρά μόνο του μοριακού ιόντος. Тο φάσμα όμως, (ESI-) στα 120V έδωσε θραύσματα με αρκετά έντονες κορυφές, με τη κορυφή σε m/z= 151 να αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Α ενώ η κορυφή σε m/z= 117 να αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Β (θραυσματοποίηση τύπου retro Diels Alder). m/z= 151

HO O Δακτύλιος [Α]¯

OH O m/z=117

OH Δακτύλιος [Β]¯

86

Ουσία 2. Тαυτοποιήθηκε ως λουτεολίνη

OH

HO O OH

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988),Тhymus capitatus, Тhymus mastichina, Тhymus caespititius, Тhymus piperella, Тhymus villosus, Тhymus hyemalis, Тhymus loscosii, Тhymus serpylloides, Тhymus zygis, Тhymus granatensis, Тhymus nervosus, Тhymus praecox, Тhymus pulegioides, Тhymus richardii (Adzet, 1981)), Thymus satureioides (Ramchoun, 2015), Thymus x citriodorus (Pereira, 2013), Thymus broussonettii (Ismaili, 2002), Thymus willdenowii (Ismaili, 2001), Thymus hirtus (Merghem, 1995) και φυσικά και σε Тhymus vulgaris (Adzet, 1981).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-F-D-11 πέρασε από LC-DAD-MS καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 2 (UV (nm), MeOH: 254, 349

Από το φάσμα UV, προκύπτει ότι η ουσία είναι φλαβόνη με ορθο- σύστημα υδροξυλίων, διότι απορροφά στα 349nm.

87

Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 2 σε χρόνο ανάσχεσης 12.56 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

FD11a #731 RT: 12.63 AV: 1 NL: 1.97E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 285.12 100

90

80

70

60

50

133.10 40

Relative Abundance

30

20

151.03 571.23 10 175.18 217.15 299.91 368.43 460.28 593.32 728.45 859.76 932.74 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 2

88

FD11-100P #721 RT: 12.45 AV: 1 NL: 6.24E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 287.19 100

90

80

70

60

50

40

RelativeAbundance

30

20

10 328.27 143.18 194.29 241.11 448.23 597.21 693.38 391.22 494.88 0 100 200 300 400 500 600 700 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 2

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 285 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 571 [2Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 287 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 286. Από το φάσμα (ESI-) η κορυφή σε m/z= 151 αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Α ενώ η κορυφή σε m/z= 133 αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Β (θραυσματοποίηση τύπου retro Diels Alder) .

m/z=151

Δακτύλιος [A]¯ HO O

OH O

89

m/z=133 OH

Δακτύλιος [Β]¯

OH

90

Ουσία 3. Ταυτοποιήθηκε ως σιρσιμαριτίνη

OH

O O

O

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus mastichina L., Тhymus baeticus, Тhymus serpylloides, Тhymus zygis, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus carnosus, Тhymus orospendanus, Тhymus hyemalis, Тhymus mastigophorus, Тhymus lacaitae, Тhymus leptophyllus, Тhymus bracteatus, Тhymus pulegioides, Тhymus praecox, Тhymus nervosus (Hernandez, 1987),Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus wilkomii (Adzet, 1988) , Тhymus aranjuezii (Adzet, 1981), Thymus herba barona (Corticchiato M, 1995), Тhymus herba barona (Corticchiato, 1995), Тhymus membranaceus (Ferreres, 1985), Тhymus webbianus (Blazquez, 1990) και φυσικά και στο Тhymus vulgaris (Miura & Nakatani, 1989).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FB1 περάστηκε από LC-DAD-MS καθώς κι από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 3 (UV (nm), MeOH: 275, 337

Από το φάσμα UV προκύπτει ότι η ουσία είναι φλαβόνη, διότι απορροφά στα 337nm. Επίσης, η απορρόφηση στα 275 nm υποδηλώνει ότι η θέση 7 του φλαβονοειδούς είναι δεσμευμένη.

91

Κατά τη φασματοφωτομετρική εξέταση της ουσίας (φάσματα υπεριώδους-ορατού) ελήφθησαν χαρακτηριστικές καμπύλες με τις ακόλουθες μέγιστες απορροφήσεις (nm):

Band ΙΙ Band Ι Δλ Ι MeOH 275 337 MeONa 278 368 +31 AlCl3 293 363 +26 AlCl3 / HCl 287 (Δλ:+12) 358 +21 NaOAc 276 (Δλ II:+1) 341 +4 NaOAc/ H3BO3 277 341 +4

Η βαθυχρωμική μετατόπιση της κορυφής I με προσθήκη μεθανολικού νατρίου κατά 31nm, δείχνει ότι το -ΟΗ της θέσης 4' είναι ελεύθερο. Η βαθυχρωμική μετατόπιση κατά +26 nm της κορυφής Ι μετά την προσθήκη AlCl3 οφείλεται στο σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ της κετονομάδας της θέσεως 4 με το –ΟΗ της θέσεως 5. Με την προσθήκη διαλύματος πυκνού HCl, το φάσμα δεν αλλάζει ιδιαίτερα μορφή, υποδηλώνοντας την απουσία συστήματος ορθο-ΟΗ στον Β δακτύλιο. Το φάσμα AlCl3/HCl, υποδεικνύει την παρουσία μεθοξυ-ομάδας στην θέση 6, αφού παρουσιάζεται βαθυχρωμική μετατόπιση κατά 21 nm της κορυφής Ι σε σύγκριση με το μεθανολικό διάλυμα. Τέλος, μετά την προσθήκη του NaOAc δεν παρατηρείται βαθυχρωμική μετατόπιση της κορυφής ΙΙ σε σχέση με τη μεθανόλη, γεγονός που υποδηλώνει, ότι το -ΟΗ της θέσεως 7 είναι δεσμευμένο.

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G NL: 100 1.23E6 95 TIC MS METFB1B 90 85 80 75 70 65 16.83 60 55 50 45 40

Relative Abundance 17.11 35 30 16.00 22.90 25 12.33 13.25 25.55 31.78 0.73 4.95 6.35 20.76 26.21 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 3 σε χρόνο ανάσχεσης 16.83 min.

92

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

METFB1B #972 RT: 16.80 AV: 1 NL: 1.79E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=80.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 313.22 100

90

283.11 80

70

60

50

40

Relative Abundance

30

20

10 255.08 627.37 163.01 329.39 500.75 752.31 834.22 930.22 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 80V της ουσίας 3

METFB1a #973 RT: 16.81 AV: 1 NL: 1.01E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 283.10 100

90

80

70

60 313.19

50

40 117.09 255.11

RelativeAbundance 165.00 30

183.16 20 298.14 227.08 10 159.09 211.11 269.16 239.13 326.40 359.29 399.91 0 100 150 200 250 300 350 400 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 3

93

METF1B100P #970 RT: 16.76 AV: 1 NL: 5.73E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 315.22 100

90

80

70

60

50

40

RelativeAbundance 254.11 378.19

30 708.41 282.15 20

143.18 10 692.42 180.25 651.39 476.28 363.19 419.22 511.96 636.37 0 100 200 300 400 500 600 700 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 3

Στα φάσματα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 313 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 627 [2Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται κορυφή σε m/z = 315 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 314. Από τα φάσματα (ESI-) επίσης παρατηρούνται κορυφές που αντιστοιχούν σε διαδοχική απομεθυλίωση (m/z = 298 και 269), επομένως το φλαβονοειδές φέρει μεθοξυ-ομάδες, ενώ για m/z=283 πιθανώς να γίνεται απόσπαση ολόκληρης της μεθοξυ-ομάδας. Η κορυφή σε m/z = 255 μπορεί να αποδοθεί σε απόσπαση CO₂ [Μ- - Η-CH3 -CO₂] . Στο φάσμα (ESI-) στα 120V τo μόριο δίνει επιπλέον θραύσματα με κορυφές m/z=183, m/z=165 και m/z=117. Παρακάτω δίνονται πιθανές δομές αυτών των θραυσμάτων.

m/z=298 OH π.χ.

O O

O

OH O

94

m/z=283 OH π.χ.

O O

OH O m/z=269 OH π.χ.

HO O

OH O m/z=255 (Fabre,2001) OH

O

HO

OH m/z=163 (Fabre,2001) O

HO

OH m/z=117

OH

95

Oυσία 4. Ταυτοποιήθηκε ως ξανθομικρόλη

OH O

O O

O

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988), Thymus herba barona (Corticchiato, 1995), Тhymus mastichina L., Тhymus caespititius, Тhymus serpylloides, Тhymus zygis, Тhymus zygis sylvestris, Тhymus fontquerii, Тhymus carnosus, Тhymus hyemalis, Тhymus mastigophorus, Тhymus lacaitae, Тhymus leptophyllus, Тhymus bracteatus, Тhymus pulegioides, Тhymus praecox, Тhymus nervosus (Hernandez, 1987), Тhymus aranjuezii (Adzet, 1981) και φυσικά στο Тhymus vulgaris (Miura & Nakatani, 1989).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FB-2 περάστηκε από LC-DAD-MS καθώς κι από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 4 (UV (nm), MeOH: 280, 337

Από το φάσμα UV προκύπτει ότι η ουσία είναι φλαβόνη, διότι απορροφά στα 337nm.

96

Κατά τη φασματοφωτομετρική εξέταση της ουσίας (φάσματα υπεριώδους-ορατού) ελήφθησαν χαρακτηριστικές καμπύλες με τις ακόλουθες μέγιστες απορροφήσεις (nm):

Band ΙΙ Band Ι Δλ Ι MeOH 280 337 MeONa 277 366 +29 AlCl3 287 308 361 +24 AlCl3 / HCl 288 (Δλ:+8) 308 355 +18 NaOAc 277 (Δλ II:-3) 401 +64 NaOAc/ H3BO3 280 342 +5

Η βαθυχρωμική μετατόπιση της κορυφής I με προσθήκη μεθανολικού νατρίου κατά 29nm, δείχνει ότι το -ΟΗ της θέσης 4' είναι ελεύθερο. Η βαθυχρωμική μετατόπιση κατά +24 nm της κορυφής Ι μετά την προσθήκη AlCl3 οφείλεται στο σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ της κετονομάδας της θέσεως 4 με το –ΟΗ της θέσεως 5. Με την προσθήκη διαλύματος πυκνού HCl, το φάσμα δεν αλλάζει ιδιαίτερα μορφή, υποδηλώνοντας την απουσία συστήματος ορθο -ΟΗ στον Β δακτύλιο. Το φάσμα AlCl3/HCl, υποδεικνύει την παρουσία μεθοξυ-ομάδας στην θέση 6, αφού παρουσιάζεται βαθυχρωμική μετατόπιση κατά 18 nm της κορυφής Ι σε σύγκριση με το μεθανολικό διάλυμα. Τέλος, μετά την προσθήκη του NaOAc παρατηρείται μικρή υψιχρωμική μετατόπιση της κορυφής ΙΙ σε σχέση με τη μεθανόλη, γεγονός που υποδηλώνει, ότι το -ΟΗ της θέσεως 7 είναι δεσμευμένο.

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 18.02 NL: 100 6.89E4 95 Base Peak MS 90 METFB2a 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 25 20 22.42 15 16.80 10 24.70 33.64 0.59 2.08 4.50 5 7.46 9.12 12.32 21.48 25.24 33.13 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 4 σε χρόνο ανάσχεσης 18.02 min.

97

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

METFB2a #1052 RT: 18.18 AV: 1 NL: 3.57E4 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 298.09 100

90

80 186.14

70 313.18

60 270.10

50

193.11 40 178.10 343.23

RelativeAbundance 117.08 242.10 30

20 214.13 149.99 328.19 10 285.12 123.02 225.99 358.02 402.73 0 100 150 200 250 300 350 400 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 4

METFB2100P #1040 RT: 17.97 AV: 1 NL: 6.07E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 345.24 100

90

80

70

60

50

40

RelativeAbundance 315.23 30

20

408.25 10 143.14 297.18 256.12 118.15 180.31 375.16 210.18 430.07 464.05 491.23 0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 4

98

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 343 [Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 345 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 344.

Από το φάσμα (ESI-) επίσης παρατηρούνται κορυφές που αντιστοιχούν σε διαδοχική απομεθυλίωση (m/z = 328, 313 και 298), επομένως το φλαβονοειδές φέρει τρεις μεθοξυ-ομάδες. Για m/z=313 πιθανώς να αποχωρεί ολόκληρη μεθοξυ-ομάδα, καθώς είναι δύσκολο το να έχουμε ύπαρξη δυο ριζών στο ίδιο μόριο. Η κορυφή σε .- m/z= 270 μπορεί να αποδοθεί σε επιπλέον απόσπαση CO [Μ-Η-CH3-CH3Ο-CO] . m/z=328 OH π.χ. O

O O

O

OH O

m/z=313 OH π.χ.

O O

O

OH O

m/z=298 OH π.χ.

O O

O

OH O

99

m/z=270 OH π.χ.

O O

O

OH m/z=117

Δακτύλιος [Β]¯ OH

100

Ουσία 5. Тαυτοποιήθηκε ως ναρινγγενίνη.

OH

HO O

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από διάφορα είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus (Adzet, 1988), Thymus x citriodorus (Pereira, 2013), Тhymus glabrenscens, Тhymus pannonicus, Тhymus praecox, Тhymus pulegioides (Boros, 2010), Thymus longidens var. lanicaulis, Thymus longidens var. dassareticus (Kulevanova, 1997), Thymus herba barona (Corticchiato, 1995), Thymus piperella (Barberan, 1985), Тhymus membranaceus Boiss. subsp. membranaceus (Ferreres, 1985) και φυσικά από το Тhymus vulgaris (Stoess, 1972).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-10 επεξεργάστηκε από LC-DAD-MS καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 5 (UV (nm), MeOH: 288

Από το φάσμα UV, προκύπτει ότι η ουσία είναι φλαβανόνη.

101

Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 5 σε χρόνο ανάσχεσης 14.31 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

FD10a #830 RT: 14.34 AV: 1 NL: 2.22E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 271.15 100

90

80

70

60

50 119.10

40

RelativeAbundance 543.28

30

20 151.06

10 169.00 317.13 405.32 456.82 557.79 713.06 770.46 860.98 943.99 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 5

102

FD9-100P #824 RT: 14.24 AV: 1 NL: 6.89E4 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 143.19 100

90

80

70

60

273.21 50 180.25 434.25 40

RelativeAbundance 194.26 30 569.31

20 393.16 624.36 10 314.23 608.34 255.19 475.14 564.19 0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 5

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 271 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 543 [2Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 273 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 272. Στο φάσμα (ESI-) δεν εμφανίζονται πολλές κορυφές, με τη κορυφή σε m/z= 151 αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Α ενώ σε m/z=119 του Β δακτυλίου (θραυσματοποίηση τύπου retro Diels Alder).

m/z-151

HO Δακτύλιος [Α]¯ O

OH O

103

m/z=119 O Δακτύλιος [Β]¯

O

Στο φάσμα ESI (+) εμφανίζονται περισσότερα θραύσματα, όπως σε m/z=255 που πιθανώς να αντιστοιχεί σε θραύσμα [Μ+Η-Η₂Ο]⁺, m/z=180 σε θραύσμα [Μ+Η-Β δακτύλιος]. m/z=255

[Μ+Η-Η₂Ο]⁺

(Тσιμογιάννης, 2007)

m/z=180

[Μ+Η-Β δακτύλιος]⁺

(Тσιμογιάννης, 2007)

104

Ουσία 6. Тαυτοποιήθηκε ως εριοδικτυόλη

OH

OH

HO O

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988), Тhymus glabrenscens, Тhymus pannonicus, Тhymus praecox, Тhymus pulegioides (Boros, 2010), Thymus x citriodorus (Pereira, 2013), Thymus broussonetti (Ismaili, 2002), Thymus willdenowii (Ismaili, 2001), Thymus herba barona (Corticchiato, 1995), Thymus piperella (Barberan, 1985) και φυσικά και από το Thymus vulgaris (Adzet, 1988).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-6 περάστηκε από LC-DAD-MS καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 6 (UV (nm), MeOH: 288, 336

Από το φάσμα UV, προκύπτει ότι η ουσία είναι φλαβανόνη, από την έντονη απορρόφηση της band II στα 288 nm.

105

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 12.37 NL: 100 1.13E5 95 Base Peak MS FD6a 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 10.83 30 13.41 25 20 9.27 15.67 15 10 16.23 17.78 5 1.82 4.88 7.68 21.40 23.16 24.82 29.18 33.73 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 6 σε χρόνο ανάσχεσης 12.37 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε σχετικά καθαρή μορφή. FD6a #718 RT: 12.40 AV: 1 NL: 1.13E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 135.13 100

90

80

70 287.17

60 151.08 50

40

Relative Abundance

30

20 575.29

10 168.99 309.14 203.03 370.98 525.36 597.28 661.42 822.69 883.26 951.66 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 6

106

FD6-100P #712 RT: 12.30 AV: 1 NL: 1.95E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 289.19 100

90

80

70

60

50

40

RelativeAbundance 330.25 30 163.13 194.25 596.46 20 697.42

10 656.38 450.30 212.18 391.12 740.39 473.29 558.74 0 100 200 300 400 500 600 700 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 6

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 287 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 575 [2Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 289 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 288. Από το φάσμα (ESI-) η κορυφή σε m/z= 135 μπορεί να αποδοθεί στo θραύσμα του δακτυλίου B ενώ η κορυφή σε m/z= 151 αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Α (θραυσματοποίηση τύπου retro Diels Alder).

m/z=151

Δακτύλιος [Α]¯ HO O

OH O

107

m/z=135 OH

Δακτύλιος [Β]¯ OH

Στο ESI (+) παρατηρούνται κάποια επιπλέον θραύσματα, όπως σε m/z=163 να αντιστοιχεί στο δακτύλιο Β με μια διαφορετική θραυσματοποίηση. m/z=163 OH

(Тσιμογιάννης, 2007) OH

O

108

Ουσία 7. Тαυτοποιήθηκε ως Тαξιφολίνη.

OH

OH

HO O

OH

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988), Тhymus quinquecostatus var. Japonica (Lee, 2011) και φυσικά και από το Тhymus vulgaris (Adzet, 1988). Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-3 περάστηκε από LC-DAD-MS καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 7(UV (nm), MeOH: 290, 327

Από το φάσμα UV, παρατηρείται ότι η band I υφίσταται ως ασθενής κορυφή στα 327nm και είναι εμφανής μόνο η band II στα 290 nm. Πρόκειται για μια φλαβανονόλη.

109

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 8.91 NL: 100 1.08E5 95 Base Peak MS FD3a 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 25 20 15 10 1.85 12.97 15.15 33.92 5 4.13 4.46 20.45 22.47 26.54 33.33 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 7 σε χρόνο ανάσχεσης 8.91 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή. FD3a #510 RT: 8.80 AV: 1 NL: 1.08E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 303.15 100

90

80

70

60 607.28 50

40

Relative Abundance 125.10 30 151.08 285.12

20 179.11 10 275.19

311.75 492.91 542.48 660.14 700.32 824.28 911.58 965.41 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 7

110

FD3-100P #502 RT: 8.67 AV: 1 NL: 1.09E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 305.21 100

90 259.08 80

70 231.16

60

50

142.99 40

RelativeAbundance 153.12 703.37 30

20 628.52 194.26 780.72 346.17 729.37 10 466.21 552.19 649.17 620.92 788.70 0 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 7

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 303 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 607 [2Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 305 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 304. Από το φάσμα (ESI-) η κορυφή σε m/z= 285 μπορεί να αποδοθεί σε απόσπαση νερού [Μ-Η-Η₂0]- ενώ η κορυφή σε m/z= 151 αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Α (θραυσματοποίηση τύπου retro Diels Alder).

m/z=285 OH

OH

HO O

OH O

111

m/z=151 HO O

Δακτύλιος [Α]¯

OH O

Στο ESI(+)η κορυφή σε m/z= 259 μπορεί να αποδοθεί σε απόσπαση νερού και CO [Μ+Η-Η₂0-CO]⁺ ενώ η κορυφή σε m/z= 231 αντιστοιχεί στο θραύσμα με μια επιπλέον απόσπαση CO [Μ+Η-Η₂0-2CO]⁺. H κορυφή σε m/z=153 αντιστοιχεί στο θραύσμα του δακτυλίου Α (θραυσματοποίηση τύπου retro Diels Alder). m/z=259

[Μ+Η-Η₂0-CO]⁺

(Тσιμογιάννης, 2007)

m/z=231

[Μ+Η-Η₂0-2CO]⁺

(Тσιμογιάννης, 2007)

m/z=153 HO O

Δακτύλιος [Α]⁺

OH O

112

Ουσία 8. Тαυτοποιήθηκε ως ροσμαρινικό οξύ. OH

O OH OH O

O

HO

OH

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από πολλά είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988), Тhymus serpyllum (Sonmezdag, 2015), Тhymus praecox subsp. groosheimmi (Sevindik, 2015), Тhymus nummularius (Ertas, 2015), Тhymus mastichina (Mendez-Тovar, 2015), Тhymus satureioides (Ramchoun, 2015), Тhymus quinquecostatus (Hyun, 2014), Тhymus longicaulis (Galasso, 2014), Тhymus lotocephalus (Costa, 2012), Тhymus capitatus (Achour, 2012), Тhymus glabrenscens, Тhymus pannonicus, Тhymus praecox, Тhymus pulegioides (Boros, 2010) και φυσικά και από Тhymus vulgaris (Adzet, 1988).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-4 περάστηκε από LC-DAD-MS καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 8 (UV (nm), MeOH: 288, 327

Από το φάσμα UV, προκύπτει ότι η ουσία έχει τυπικές απορροφήσεις φαινολικών οξέων ,διότι απορροφά στα 288 και 327nm.

113

Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 8 σε χρόνο ανάσχεσης 9.39 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

FD4a #540 RT: 9.32 AV: 1 NL: 5.92E4 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 161.03 100

90

80

70

60

50

40 Relative Abundance 197.13 359.27 30

20

10 218.99 381.22 309.53 397.05 561.88 669.90 741.59 804.50 946.00 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 8

114

FD4-100P #537 RT: 9.27 AV: 1 NL: 1.07E5 T: {0,0} + c ESI !corona sid=100.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 163.14 100

90

80

70

60

50

40 143.20

RelativeAbundance

30 342.19 20 424.22 560.35 180.25 271.14 314.21 380.17 481.31 10 186.29 620.39 759.35 499.34 606.20 661.47 0 100 200 300 400 500 600 700 m/z Φάσμα ESI (+) CID: 100V της ουσίας 8

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 359 [Μ-Η]-. Στο θετικό ιονισμό παρατηρείται το ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 361 [Μ+Η]+. Άρα το μοριακό βάρος είναι 360. Συγκρίνοντας το φάσμα μάζας της ένωσης με αυτό του ροσμαρινικού οξέος προκύπτει ότι πρόκειται για την ίδια ένωση καθώς ταυτίζονται απόλυτα τα φάσματα μάζας, όπως και οι απορροφήσεις στο UV.

(Chkhikvishvili, 2013)

115

Στο ESI(-), το ροσμαρινικό ως οξύ δίνει πιο πολλά θραύσματα. Στο παρακάτω πίνακα φαίνονται οι θραυσματοποιήσεις που υφίσταται το μόριο. m/z=197 OH

O OH OH

HO

m/z=179 O

OH

HO

OH m/z=161 O

HO

OH m/z=133

HO

OH

116

Ουσία 9. Тαυτοποιήθηκε ως καφεϊκό οξύ

O

OH

HO

OH

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από διάφορα είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus antoninae, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus, Тhymus orospendanus (Adzet, 1988), Тhymus mastichina (Mendez-Тovar, 2015), Тhymus satureioides (Ramchun, 2015), Тhymus serpyllum (Aziz, 2014), Тhymus lotocephalus (Costa, 2012), Тhymus quinquecostatus var. japonica (Lee, 2011), Тhymus zygis ssp. gracilis (Jordan, 2009), Тhymus longidens var. lanicaulis and var. dassareticus (Kulevanova, 1997), Тhymus carnosus (Marhuenda, 1987), Тhymus glabrenscens, Тhymus pannonicus, Тhymus praecox, Тhymus pulegioides (Boros, 2010) και φυσικά και από Тhymus vulgaris (Adzet, 1988).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-2 πέρασε από LC- DAD-MS καθώς και από φασματοφωτόμετρο UV και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

Φάσμα UV της ουσίας 9 (UV (nm), MeOH: 295, 326

Από το φάσμα UV, προκύπτει ότι η ουσία έχει τυπικές απορροφήσεις φαινολικών οξέων.

117

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 6.04 NL: 100 3.59E5 95 Base Peak MS F2-80N 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 25 20 15 14.08 7.04 10 4.22 10.59 5 1.68 11.69 15.55 17.12 23.25 25.53 30.48 32.75 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 9 σε χρόνο ανάσχεσης 6.04 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή. F2-80N #349 RT: 6.02 AV: 1 NL: 3.47E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=80.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 135.15 100

90

80

70

60

50

40

Relative Abundance 179.17 30

20

10 359.30 225.05 273.92 412.17 479.91 582.33 623.09 742.90 809.69 957.52 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 80V της ουσίας 9

118

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 179 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 359 [2Μ-Η]-. Άρα το μοριακό βάρος είναι 180. Το θραύσμα με κορυφή που αντιστοιχεί σε m/z=135 είναι [Μ-Η-COOH]-. m/z=135

HO

OH

Εφόσον πρόκειται για οξύ δε κρίθηκε απαραίτητο η λήψη θετικού φάσματος, καθώς από το αρνητικό παίρνουμε ευκολότερα τα επιθυμητά και χαρακτηριστικά θραύσματα.

Συγκρίνοντας βιβλιογραφικά τα φάσματα με αυτά του καφεϊκού οξέος, διότι η βιβλιογραφία αναφέρει ύπαρξη καφεϊκού οξέος στα εκχυλίσματα Тhymus, διαπιστώνεται πως πρόκειται για αυτή την ένωση καθώς τα φάσματα συμπίπτουν.

( Santos, 2013)

119

Ουσία 10. Тαυτοποιήθηκε ως 3,4,3΄,4΄-τετραυδροξυ-5,5΄-διισοπροπυλο-2,2΄- διμεθυλο-διφαινυλιο.

OH

HO OH

HO

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από Thymus vulgaris (Rainis and Тernes, 2013), επομένως η ουσία 10 ταυτοποιείται δυνητικάως το 3,4,3΄,4΄-τετραυδροξυ-5,5΄- διισοπροπυλο-2,2΄-διμεθυλο-διφαινυλιο.

Тο δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-G πέρασε από LC- DAD-MS καθώς και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 22.73 NL: 100 1.41E6 95 Base Peak MS metG 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 25 26.02 20 17.87 15 10 5 1.85 5.10 7.65 10.88 16.31 22.07 27.05 28.97 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 10 σε χρόνο ανάσχεσης 22.73 min.

120

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή.

metG #1314 RT: 22.71 AV: 1 NL: 5.55E5 T: {0,2} - c ESI !corona sid=150.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 329.32 100

90

80

70

60 299.19

50

40

Relative Abundance

271.17 30

20

255.13 10 241.16 659.54 427.23 483.33 584.90 681.57 793.11 895.10 947.15 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 150V της ουσίας 10

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 329 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 659 [2Μ-Η]-. Άρα το μοριακό βάρος είναι 330.

Βιβλιογραφικά, έχουν ανιχνευθεί και χαρακτηριστεί διμερή παράγωγα οξείδωσης της π-κυμεν-2,3-διόλης. ("Identification and Characterization of Dimeric Oxidation Products of p-cymene-2,3-diol Isolated from Тhymus vulgaris L.", G. Rainis, J. Agric. Food Chem. 2014). Παρακάτω δίνονται τα φάσματα μαζών από τη βιβλιογραφία που αντιστοιχούν στα θραύσματα που έδωσε η ουσία 10.

121

metG #1323 RT: 22.87 AV: 1 NL: 3.97E5 F: {0,2} - c ESI !corona sid=150.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 329.33 100

90

80

70 299.22

60

50

40

RelativeAbundance 271.17 30

20 255.14 10 241.13 215.08 144.97 165.15 369.53 400.63 427.13 0 150 200 250 300 350 400 450 m/z

Σε χρόνο ανάσχεσης 26.02 διακρίνεται μια ακόμη ουσία, η οποία δίνει το ακόλουθο φάσμα ESI (-) CID: metG #1523 RT: 26.33 AV: 1 NL: 3.80E5 T: {0,1} - c ESI !corona sid=80.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 327.29 100

90

80

70

60

50

40

RelativeAbundance

30

20

10 299.25 284.15 119.59 155.00 172.94 232.94 343.22 364.76 418.21 438.39 0 150 200 250 300 350 400 450 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 80V της ουσίας οξειδωμένης μορφής της ουσίας 10

122

Тο φάσμα αυτό αντιστοιχεί στην οξειδωμένη μορφή της ουσίας 10, οποία εμφανίζεται σύμφωνα με τη βιβλιογραφία στο Тhymus vulgaris (Rainis, 2013).

OH OH 2 H 2 e HO O OH 2 e OH 2 H

HO O

m/z=327 m/z=329

Οι ουσίες αυτές είναι διμερή παράγωγα της π-κυμεν-2,3-διόλης, ενός βασικού αντιοξειδωτικού συστατικού του θυμαριού. Αντίθετα με τη θυμόλη και τη καρβακρόλη, που μοιάζουν δομικά με τη π-κυμεν-2,3-διόλη κι αφθονούν επίσης στο θυμάρι, η ουσία αυτή είναι μη πτητική, γι αυτό και ανιχνεύεται με μεθόδους όπως η HPLC-MS (Rainis,2013).

HO HO HO 1/2O2 2 2 2 - Η2Ο HO O O

Διμερισμός Ριζών

OH O

HO HO OH OH

HO O

123

Καθώς η π-κυμεν-2,3-διόλη είναι πολύ ευαίσθητη στην οξείδωση από τον αέρα, δημιουργούνται τα διμερή παράγωγά της, τόσο όταν βρίσκεται σε διάλυμα, αλλά ακόμη κι όταν βρίσκεται στο θυμάρι πριν ακόμα και από τη συγκομιδή του. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, τα δυο διμερή παράγωγα οξείδωσης της π-κυμεν-2,3- διόλης ανιχνεύονται σε φρέσκο διάλυμα της ουσίας, αλλά μετά την αποθήκευση του διαλύματος αυξάνεται η ένταση των κορυφών των διμερών, ενώ μειώνεται αυτή της π-κυμεν-2,3-διόλης (Rainis, 2013).

124

Ουσία 11. Тαυτοποιήθηκε δυνητικά ως 7-Ο-β-γλυκοζίτης της λουτεολίνης.

OH

OH

O O O HO

HO OH

OH OH O Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από διάφορα είδη Thymus: Thymus sipyleus subsp. sipyleus var. sipyleus (Ufuk, 2011), Thymus numidicus (Feryal, 2014), Thymus piperella (Barberán, 1985), Thymus broussonettii (López-Lázaro, 2009), Thymus webbianus (Blázquez, 1994), Thymus serpyllum L. (Kulisic, 2007) και φυσικά από το Τhymus vulgaris (Olechnowicz-Stepien and Lamer-Zarawska, 1975).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-5 πέρασε από LC- DAD-MS και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 9.76 NL: 100 6.82E5 95 Base Peak MS FD5a 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 25 20 10.47 15 8.70 10 13.41 5 8.04 2.96 5.76 14.53 16.10 20.55 22.97 28.46 33.70 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 11 σε χρόνο ανάσχεσης 8.70 min.

125

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία δεν έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή, αλλά είναι σε μίγμα με άλλες ουσίες. Παρόλα αυτά από τα φάσματα μαζών μπορούμε να βγάλουμε κάποια πιθανά συμπεράσματα σχετικά με τη δομή του μορίου.

FD5a #500 RT: 8.63 AV: 1 NL: 5.63E4 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 447.24 100

90 285.14 80

70

60

50

40

Relative Abundance

30

20

133.12 10 179.19 297.29 377.28 461.22 556.62 647.15 732.55 807.04 896.69 981.72 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 11

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 447 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 285 που αντιστοιχεί στο αρνητικό μοριακό ιόν της λουτεολίνης, καθώς και το αρνητικό μοριακό ιόν της γλυκόζης που είναι m/z =179. Тο θραύσμα με m/z =133 αντιστοιχεί στον Β δακτύλιο και m/z = 151 στον Α δακτύλιο της λουτεολίνης (RDA).

m/z=285 OH

HO O OH

OH O

126

m/z=151

Δακτύλιος [A]¯ HO O

OH O m/z=133 OH

Δακτύλιος [Β]¯

OH

127

Ουσία 12. Тαυτοποιήθηκε δυνητικά ως διυδροκαιμπφερόλη.

HO O OH

OH

OH O

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από διάφορα είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus aestivus, Тhymus baeticus, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus (Adzet, 1988) και φυσικά και από το Тhymus vulgaris (Adzet, 1988).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-5 πέρασε από LC- DAD-MS και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 9.76 NL: 100 6.82E5 95 Base Peak MS FD5a 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 25 20 10.47 15 8.70 10 13.41 5 8.04 2.96 5.76 14.53 16.10 20.55 22.97 28.46 33.70 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 12 σε χρόνο ανάσχεσης 10.47 min.

128

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία δεν έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή, αλλά είναι σε μίγμα με άλλες ουσίες. Παρόλα αυτά από τα φάσματα μαζών μπορούμε να βγάλουμε κάποια πιθανά συμπεράσματα για τη δομή του μορίου του.

FD5a #604 RT: 10.43 AV: 1 NL: 1.15E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 287.16 100

90

80

70

60

50

40

Relative Abundance

30

177.19 259.15 575.30 20

10 201.15 359.24 449.29 537.25 647.30 775.31 830.29 931.12 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 12

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 287 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται κορυφή σε m/z = 575 [2Μ-Η]-. Άρα το μοριακό βάρος είναι 288. Για m/z=259 αντιστοιχεί το θραύσμα [Μ-Η-CO]-, ενώ για m/z=177 είναι δυνητικά [Μ-Η- Β-ΟΗ]-.

m/z=259

HO O OH

OH

OH

129

m/z=177

[Μ-Η-Β-ΟΗ]-

130

Ουσία 13 . Тαυτοποιήθηκε δυνητικά ως μεθυλεστέρας του ροσμαρινικου οξέος.

HO

HO O

O

O

O OH

OH

Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί κι από άλλα είδη Тhymus: Thymus praecox ssp. grossheimii (Sevindik, 2015), Thymus serpyllum (Aziz, 2014), Thymus x citriodorus (Pereira, 2013), και φυσικά και από Thymus vulgaris (Fecka, 2008).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-7 πέρασε από LC- DAD-MS και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 12.37 NL: 100 5.44E5 95 Base Peak MS FD7b 90 85 80 75 70 65 13.39 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30

25 14.98 20 9.32 15 10 15.26 5 17.68 1.80 6.09 8.10 19.46 23.34 27.12 31.17 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 13 σε χρόνο ανάσχεσης 13.39 min.

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία δεν έχει απομονωθεί σε καθαρή μορφή, αλλά είναι σε μίγμα με άλλες ουσίες. Παρόλα αυτά από τα φάσματα μαζών μπορούμε να βγάλουμε κάποια πιθανά συμπεράσματα.

131

FD7b #778 RT: 13.44 AV: 1 NL: 3.50E5 T: {0,0} - c ESI !corona sid=80.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 179.18 100

90

80

70

60 373.25 50

40

Relative Abundance

30

20 135.12

10 193.15 523.32 251.19 361.38 509.30 551.24 603.79 747.58 835.76 897.49 940.88 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z

Φάσμα ESI (-) CID: 80V της ουσίας 13

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 373 [Μ-Η]-. Επίσης, παρατηρείται μια μικρή κορυφή σε m/z = 747 [2Μ-Η]-. Άρα το μοριακό βάρος είναι 374. Тο μόριο θραυσματοποιείται σε διάφορα σημεία του και μας δίνει κορυφές με m/z=193, m/z=179 και m/z=135 με πιθανές δομές των θραυσμάτων να είναι οι παρακάτω.

m/z=193

O

O OH

OH

m/z=179 HO

HO O

OH

132

m/z=135 HO

HO

133

Ουσία 14. Тαυτοποιήθηκε δυνητικά ως 8-μεθoξυ-σιρσινεόλη

O

OH O

O O

O

OH O Η ουσία αυτή έχει απομονωθεί από διάφορα είδη Thymus: Тhymus longiflorus, Тhymus moroderi, Тhymus funkii, Тhymus aestivus, Тhymus gladulosus, Тhymus orospedanus, Тhymus baeticus, Тhymus antoninae, Тhymus wilkomii, Тhymus membranaceus, Тhymus capitellatus, Тhymus camphoratus (Adzet, 1988) και φυσικά και από το Тhymus vulgaris (Adzet, 1988).

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FA πέρασε από LC- DAD-MS και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα:

RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 19.22 NL: 100 17.45 3.05E4 95 Base Peak MS metF 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 33.45 Relative Abundance 32.78 19.53 25.15 29.77 35 9.19 12.30 13.75 7.40 30 4.50 4.83 25 3.72 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 14 σε χρόνο ανάσχεσης 19.22min.

134

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία δεν έχει απομονωθεί σε αρκετά καθαρή μορφή, αλλά είναι σε μίγμα με άλλες ουσίες. Παρόλα αυτά από τα φάσματα μαζών μπορούμε να βγάλουμε κάποια πιθανά συμπεράσματα.

metF #1110 RT: 19.18 AV: 1 NL: 1.37E4 T: {0,2} - c ESI !corona sid=150.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 373.27 100

90

80 201.12 285.06 70

173.03 60 214.89

50

40 Relative Abundance 328.14

30

20

10 455.01 515.22 635.23 723.08 790.64 889.95 971.62 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 150V της ουσίας 14

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 373 [Μ-Η]-. Άρα το μοριακό βάρος είναι 374.

Ως πολυμεθυλιωμένο μόριο, δίνει πολλές κορυφές που αντιστοιχούν σε σταδιακές απομεθυλιώσεις, με απόσπαση ρίζας μεθυλίου και ολόκληρων μεθοξυ- ομάδων (m/z=358, m/z=343, m/z=328). Περεταίρω λαμβάνονται κι άλλα θραύσματα με ποικίλες πιθανές δομές. Με ένα απλό φάσμα μάζης δεν μπορεί να γίνει σαφές από ποιά θέση γίνεται η απόσπαση κάθε φορά, επομένως γίνονται μόνο εικασίες. m/z=358 O

π.χ. OH O

O O

O

OH O

135

m/z=343 O π.χ. OH

O O

O

OH O m/z=328 O

π.χ. OH

O O

O

OH O m/z=132 OH

OH

136

Ουσία 15. Тαυτοποιήθηκε ως 7-O-γλυκοζίτης της ναρινγγενίνης.

OH

O O O HO

HO OH

OH OH O

Η ουσία αυτή φαίνεται να έχει απομονωθεί μόνο από ένα είδος Тhymus, το Тhymus x citriodorus (Pereira, 2013), όμως το φάσμα που μας δίνει είναι πανομοιότυπο με αυτό της ουσίας και η πιθανότητα να πρόκειται για αυτή είναι μεγάλη. Αν είχε απομονωθεί σε καθαρότερη μορφή και είχε ληφθεί φάσμα NMR θα μπορούσε να ταυτοποιηθεί με σιγουριά.

Το δείγμα που συλλέχθηκε από την HPLC ως την κορυφή MET-FD-4 πέρασε από LC- DAD-MS και ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα: RT: 0.00 - 34.99 SM: 7G 9.39 NL: 100 6.83E4 95 Base Peak MS FD4a 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40

Relative Abundance 35 30 10.00 25 20 15 10 7.99 7.70 11.97 1.83 34.32 5 13.39 15.69 20.41 23.14 27.12 33.45 0 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) Χρωματογράφημα (TIC) LC-MS: Διακρίνεται η ουσία 15 σε χρόνο ανάσχεσης 10.00min.

137

Από το χρωματογράφημα στο LC-MS φαίνεται ότι η ουσία δεν έχει απομονωθεί σε καθαρή μορφή, αλλά είναι σε μίγμα με άλλες ουσίες. Παρόλα αυτά από το φάσμα μάζας μπορούμε να βγάλουμε κάποια πιθανά συμπεράσματα.

FD4a #577 RT: 9.96 AV: 1 NL: 1.66E4 T: {0,0} - c ESI !corona sid=120.00 det=706.00 Full ms [100.00-1000.00] 271.15 100

90

80

70

60

50 151.05

40

Relative Abundance

30

20 168.90 433.20 10 185.56 293.08 362.49 442.15 544.04 644.13 754.90 883.50 941.53 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z Φάσμα ESI (-) CID: 120V της ουσίας 15

Στο φάσμα μάζας (ESI-) παρατηρείται ψευδομοριακό ιόν σε m/z = 433 [Μ-Η]-. Άρα το μοριακό βάρος είναι 434. Σε κορυφή m/z= 271 έχουμε σπάσιμο του γλυκοζιτικού δεσμού και εμφάνιση της άγλυκης ναρινγγενίνης. Οι κορυφές με m/z= 169 και m/z=151 αντιστοιχούν στη θραυσματοποίηση του μορίου της ναρινγγενίνης.

m/z=271 OH

HO O

OH O m/z=151 HO O Δακτύλιος [Α]¯

OH O

138

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

139

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑТΑ ΑΠΟТΕΛΕΣΜΑТΩΝ

Μέσα από όλη την πειραματική διαδικασία απομονώθηκαν 10 ουσίες καθαρές και ανιχνεύτηκαν επιπλέον 5 ουσίες που δεν απομονώθηκαν σε καθαρή μορφή αλλά σε μίγματα. Η ταυτοποίησή τους έγινε βάσει των απορροφήσεων που έδωσαν τα φάσματα στο ορατό - υπεριώδες, και βάσει των κορυφών των θραυσμάτων στα φάσματα μάζης. Οι ουσίες όλες έχουν απομονωθεί ξανά από διάφορα είδη του γένους Тhymus για αυτό κι η πιθανότητα απομόνωσής τους κι από το Тhymus vulgaris varico III ήταν μεγάλη.

Συνοπτικά, οι ουσίες που απομονώθηκαν σε καθαρή μορφή είναι οι παρακάτω:

Ουσία 1 Απιγενίνη Ουσία 2 Λουτεολίνη Ουσία 3 Σιρσιμαριτίνη Ουσία 4 Ξανθομικρόλη Ουσία 5 Ναρινγγενίνη Ουσία 6 Εριοδικτυόλη Ουσία 7 Тαξιφολίνη Ουσία 8 Ροσμαρινικό οξύ Ουσία 9 Καφεϊκό οξύ 3,4,3΄,4΄-τετραυδροξυ-5,5΄- Ουσία 10 διισοπροπυλο-2,2΄-διμεθυλο-διφαινύλιο

Αντίστοιχα, οι ουσίες που ανιχνεύτηκαν, αν και σε μίγματα, είναι οι παρακάτω:

Ουσία 11 7-Ο-β-γλυκοζίτης της λουτεολίνης Ουσία 12 ΔιυδροΚαιμπφερόλη Ουσία 13 Μεθυλεστέρας του ροσμαρινικού Ουσία 14 8-μεθοξυ-σιρσινεόλη Ουσία 15 7-Ο-β-γλυκοζίτης της ναρινγγενίνης

Πρόκειται για φαινολικές ενώσεις, με ποικιλία δομών, με 2 φαινολικά οξέα και 2 γλυκοζίτες ανάμεσα τους, αλλά και με ένα, χαρακτηριστικό του φυτού, διφαινύλιο. Ως φαινολικές ενώσεις, προσδίδουν στο φυτό αντιοξειδωτικές κυρίως ιδιότητες, αλλά και μια πληθώρα άλλων ιδιοτήτων, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία των ενώσεων.

140

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

141

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Abad-Garcia B., Luis A. Berrueta, Garmon-Lobato S., Gallo B., Vicente F., " A general Analytical Strategy for the Characterization of Phenolic Compounds in Fruit Juices by High-performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection Coupled to Electrospray Ionization and Triple Quadrupole Mass Spectrometry", Journal of Chromatography A, 1216(2009) 5398-5415 Abouzid S.F., "Silymarin content in Silybum marianum populations growing in Egypt", 2015, Industrial Crops and Products Abranko L., Garcia-Reyes J. F. and Molino-Diaz A., "In Source Fragmentation and Accurate Mass Analysis of Multiclass Flavonoid Conjugates by Electrospray Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry", Journal of Mass Spectrometry, 2011, 46: 478-488 Ado M.A. , "Chemical profile and antiacetylcholinesterase, antityrosinase, antioxidant and α-glucosidase inhibitory activity of Cynometra cauliflora L. leaves", 2015, Journal of the Science of Food and Agriculture 95 (3), pp. 635- 642 Adzet T. and Martinez F., 1980a, " Luteolin and 6-hydroxyluteolin: taxonomically important flavones in the genus Thymus", Planta Med. (Suppl.), 52-55 Adzet T. and Martinez F., 1980b, " Sur les flavones methyles du Thymus baeticus Boiss. ex Lacaita (Labiatae)", Plant. Mid. Phytother., 14, 8-19 Adzet T. and Martinez F., 1981a, " Aglicons flavonics de les Labiades", Butll. Inst. Cat. Hist. Nat., 46 (Sec. Bot., 4), 25-49 Adzet T. and Martinez F., 1981b, " Flavonoids in the leaves of Thymus: a chemotaxonomic survey", Biochem. Syst. Ecol., 9, 291-295 Adzet T., Martinez F. and Zamora I., 1982, "Heterosides flavoniques du Thymus loscosii Willk", Plant. Mid. Phytothe'r., 16, 116-119 Aguinagalde I. and Pero Martinez M.A., 1982," The occurrence of the acylated flavonol glycosides in the Cruciferae", Phytochemistry, 21, 2875-2878 Algabr M., "Flavonoids from Pulicaria jaubertii (Asteraceae) from Yemen", 2015, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences 6 (6), pp. 1237-1240 Ali L., "Antioxidant flavonoids from nepeta floccosa benth", 2015, Records of Natural Products 9 (4), pp. 567-571 Amakura Y., "Isolation of phenolic constituents and characterization of antioxidant markers from sunflower (Helianthus annuus) seed extract", 2013, Phytochemistry Letters 6 (2), pp. 302-305 Ardalan A., "Essential Oil Constituents, Phenolic Content and Antioxidant Activity in Iranian and British Thymus vulgaris L.", International Journal of Agriculture and Crop Sciences, Vol.6 (4), 213-218, 2013 Ashnagar A., Naseri G. and Ramazani M., "Characterization of the Major Chemical Compounds Found in Τhymus vulgaris Plan Grown Wildl in Chahar

142

Mahal and Bakhtiari Province of Iran", Internation Journal of PharmTech Research, Vol.3 No.1, pp1-4, 2011 Ashurst P.R. , 1991, "Food Flavourings", Blackie Academic 81 Professional, Glasgow and London Awad E., "Effects of dihydroquercetin obtained from deodar (Cedrus deodara) on immune status of gilthead seabream (Sparus aurata L.)", 2015, Fish and Shellfish Immunology 43 (1), pp. 43-50 Awe W., Schaller J.F. and Kummell H.J., 1959, "The flavones from Thymus vulgaris", Naturwissensch., 46, 558 Baba S.A., "Phytochemical analysis and antioxidant activity of different tissue types of Crocus sativus and oxidative stress alleviating potential of saffron extract in plants, bacteria, and yeast", 2015, South African Journal of Botany 99, pp. 80-87 Barberan F.A.T., "Highly methylated 6-hydroxyflavones and other flavonoids from Thymus piperella", 1985, Planta Medica NO. 5, pp. 452-454 Barberan F.A.T., 1986, " The flavonoid compounds from the Labiatae", Fitoterapia, 57, 67-95 Bardeau F., 1973, "La pharmacie de ban Dieu", Stock, Paris, pp. 279-281 Barrelier, J. (1714) Plantae per Gallianz, Hispanianz et Italiam observatae iconibus aeneis exhibitae, Paris. Benaissa O., "Free radical scavenging action of phenolic compounds from Limonium bondueli (plumbaginaceae)", 2013, Der Pharmacia Lettre 5 (5), pp. 234-240 Benbelaid F., Khadir A., Amine Abdoune M. and Bendahou M., "Phytochemical Screening and in vitro Antimicrobial Activity of Thymus lanceolatus Desf. from Algeria", Asian Pac J Trop Dis 2013, 3(6), 454-459 Bentham, G. (1834) Lab. Gen. Sp.: Thymus, London. Biloa Messi B., "Isolation and biological activity of compounds from Garcinia preussii", 2014, Pharmaceutical Biology 52 (6), pp. 706-711 Bisignano C., "In vitro antimicrobial activity of pistachio (Pistacia vera L.) polyphenols", 2013 FEMS Microbiology Letters 341 (1), pp. 62-67 Blázquez María Amparo "Further Flavonoids and O ther Phenolics of Thymus webbianus Rouy", Z. Naturforsch. 49c, 6 8 7 -6 8 8 (1994) Bloor S.J., "Overview of methods for analysis and identification of flavonoids", 2001, Methods in enzymology, Vol. 335 Βoissier, E. (1838) Elenchus Plantarum Novarum minussque cognitorum quas in itinere hispαnico, Geneve, pp. 73-76. Boiteux J., Soto Vargas C., Pizzuoolo P., Lucero G. and Silva M.-F., "Phenolic Characterization and Antimicrobial Activity of Folk Medicinal Plant Extracts for their Applications in Olive Production", Electrophoresis 2014, 35, 1709-1718 Borngen S., 1979, " Pflanzen helfen heilen", VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin

143

Boros B., Jakabova S., Dornyei A., Horvath and Pluhar Z., "Determination of Polyphenolic Compounds by Liquid Chromatography-Mass spectrometry in Thymus Species", Journal of Chromatography . 1217 (2010) 7972-7980 Bourgou S., "Phenolic Composition, Essential Oil, and Antioxidant Activity in the Aerial Part of Artemisia Herba-Alba from Several Provenances: A Comparative Study", 2016, International Journal of Food Properties 19 (3), pp. 549-563 Brahmachari G., "Argemone mexicana: Chemical and pharmacological aspects", 2013, Brazilian Journal of Pharmacognosy 23 (3), pp. 559-575 Carlen C., Schaller M., Carron C.A., Vouillamoz J.F. and Baroffio C.A., "The New Thymus vulgaris L. Hybrid Cultivar 'Varico 3' Compared to Five Established Cultivars from Germany, France and Switzerland", Agroscope Changins- Wadenswil Research Station ACW, 2009 Cabo J., Cabo M.M., Crespo M.E., Jimenez J. and Zarzuelo A., 1986, "Thymus granatensis. Pharmacodynamic study of its essential oil". Fitoterapia, 57, 173- 178 Cha M.-N., "Chemical composition and antioxidant activity of Korean cactus (Opuntia humifusa) fruit", 2013, Food Science and Biotechnology 22 (2), pp. 523-529 Charoenkiatkul S., "Nutrients and bioactive compounds in popular and indigenous durian (Durio zibethinus murr.)", 2016, Food Chemistry 193, pp. 181-186 Chatzopoulou A., "Depsides and other polar constituents from origanum dictamnus L. and their in vitro antimicrobial activity in clinical strains", 2010, Journal of Agricultural and Food Chemistry 58 (10), pp. 6064-6068 Cheng H.B., "Chemical constituents of ethyl acetate extract from Polygonum perfoliatum"., 2012, Journal of Chinese medicinal materials 35 (7), pp. 1088- 1090 Cheng W., "Flavonoids from root of Machilus wangchiana", 2014, China journal of Chinese materia medica 39 (19), pp. 3794-3797 Chizzola R. and Chlodwig F., "Antioxidative Properties of Thymus vulgaris Leaves: Comparison of Different Extracts and Essential Oil Chemotypes", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008 Chkhikvishvili Irakli, "Rosmarinic Acid-Rich Extracts of Summer Savory (Satureja hortensis L.) Protect Jurkat T Cells against Oxidative Stress", Hindawi Publishing Corporation Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2013 Cho N., "Neuroprotective and anti-inflammatory effects of flavonoids isolated from Rhus verniciflua in neuronal HT22 and microglial BV2 cell lines", 2012, Food and Chemical Toxicology 50 (6), pp. 1940-1945

144

Choi C.-I., "Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of constituents from Euonymus alatus twigs", 2015, Industrial Crops and Products 76, pp. 1055-1060 Ciemniewska-Zytkiewicz H., "Determination of lipid and phenolic fraction in two hazelnut (Corylus avellana L.) cultivars grown in Poland", 2015 Food Chemistry 168, pp. 615-622 Cieniak, C., "Phytochemical comparison of the water and ethanol leaf extracts of the cree medicinal plant, Sarracenia purpurea L. (Sarraceniaceae)", 2015, Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 18 (4), pp. 484-493 Corradini Eleonora, "Flavonoids: chemical properties and analytical methodologies of identification and quantitation in foods and plants", 2011, Natural Product Research, 25:5, 469-495 Corticchiato M., "Free flavonoid aglycones from Thymus herba barona and its monoterpenoid chemotypes", 1995, Phytochemistry 40 (1), pp. 115-120 Crespo M.E., Jimenez J., Gomis E. and Navarro C., 1990, "Antibacterial activity of the essential oil of Thymus serpylloides subspecies gadorensis", Microbios, 61, 181-184 Cretu E., "In vitro antioxidant activity and phenolic content of Cedrus brevifolia bark", 2014, Natural Product Communications 9 (4), pp. 481-482 Cui C.W., "Preliminary study on chemical constituents seperated from Cayratia japonica", 2012, China journal of Chinese materia medica 37 (19), pp. 2906- 2909 Cuyckens F. and Claeys M., "Mass spectrometry in the Structural Analysis of Flavonoids", Journal of Mass Spectrometry, 2004, 39:1-15 Dias M.I., "Phenolic profile and antioxidant properties of commercial and wild Fragaria vesca L. roots: A comparison between hydromethanolic and aqueous extracts", 2014, Source of the Document Industrial Crops and Products Didry N., Dubreuil L. and Pinkas M., 1993, "Antibacterial activity of thymol, carvacrol and cinnamaldehyde alone or in combination", Pharmazze, 48, 301- 304 Dodonaeus R., 1616, Stirpiurn Historiae Pemptadis secundae liber tertius, Antwerp. Doménech-Carbó A., "Electrochemical tomato (Solanum lycopersicum L.) characterisation using contact probe in situ voltammetry", 2015, Food Chemistry 172, pp. 318-325 Ebel J. and Hahlbrock K., 1982, " Biosynthesis. In J.B. Harborne and T.J. Mabry (eds), The Flavonoids: Advances in Research" , Chapman and Hall, London, pp. 64 1-679 Errera H., 1978, "Conzo curarse con las plantas", Argos Bergara, Barcelona, pp. 196-197 Esra M., "Secondary metabolites and antioxidant activity of Vitex agnus castus", 2012, Research Journal of Biotechnology 7 (3), pp. 70-74

145

Fabre Ν. and Rustan Ι., "Determination of Flavone, Flavonol, and Flavanone Aglycones by Negative Ion Liquid Chromatography Electrospray Ion Trap Mass Spectrometry", J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12, 707–715 Farrell K.T., 1985, "Spices, Condiments and Seasonings" , The AVI Publ. Co. Inc., Westport, Connecticut Fecka I., Turek S., "Determination of Polyphenolic Compoundsin Commercial Herbal Drugs and Spices from Lamiaceae: Thyme, Wid Thyme and Sweet Marjoram by Chromatographic Techniques", Food Chemistry 108 (2008) 1039- 1053 Fernandez M. and Nieto A., 1982, " Plantas Medicinales", Eunsa, Pamplona, pp. 168-170 Ferreres F., Lilorach R. and Gil-Izquierdo A., "Characterization of the Interglycosidic Linkage in di-, tri, tetra- and pentaglycosylaed Flavonoids and Differentation of Positional Isomers by Liquid Chromatography/Electrospray Ionizaton Tandem Mass Spectrometry", Journal of Mass Spectrometry, 2004, 39: 312-321 Ferreres F., "Free flavone aglycones from thymus membranaceus Boiss. subsp. membranaceus", 1985, Plantes Medicinales et Phytotherapie 19 (2), pp. 89-97 Feryal Benayache, "Flavonoids from Thymus numidicus Poiret" , Der Pharmacia Lettre, 2014, 6 (2):50-54 Forster H.B., Niklas H. and Lutz S., 1980, "Antispasmodic effects of some medicinal plants", Planta Med., 40, 309-319 Funari C.S., "Interconverting flavanone glucosides and other phenolic compounds in Lippia salviaefolia Cham. ethanol extracts", 2011, Phytochemistry 72 (16), pp. 2052-2061 Furlenmeier M., 1984, " Plantas curativas y suspropiedades medicinales", Schwittez, Zug, Switzerland, pp. 168 Ge Y.-B., "Chemical constituents of Fortunella margarita fruits", 2014, Journal of Chinese medicinal materials 37 (3), pp. 435-438 Gecan J. S., Bandler R., Glaze L. E. and Atkinson J. C., 1986, "Microanalytical quality of ground and unground marjoram, sage and thyme, ground allspice, black pepper and paprika", J. Food Prot., 49, 216-221. Gerhardt U. , 1994, "Gewiirze in der Lebensmittelindustrie: Eigenschafen, Technologien, Verwendung", B. Behr's Verlag, 2. Auflage, Hamburg Ghribia L., "Antioxidant and anti-acetylcholinesterase activities of extracts and secondary metabolites from Acacia cyanophylla", 2014, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 4, pp. S417-S423 Gogna N., "Metabolomic profiling of the phytomedicinal constituents of Carica papaya L. leaves and seeds by 1H NMR spectroscopy and multivariate statistical analysis", 2015, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 115, pp. 74-85 Gonzalez A. and Mufioz F., 1980, "Secretos y virtudes de plantas medicinales", Selecciones del Reader's Digest, Madrid, p. 277

146

Grisebach H. , 1985, " Topics in flavonoid biosynthesis", In C.F. Van Summere and P.J. Lea (eds), Annual Proceedings athe Phytochemical Society of Europe. Vol. 25. The Biochemistry of Plant Phenolics, Clarendon Press, Oxford, pp. 183- 198 Guillen M. D. & Manzanos M.J., "Study of the Composition of the Different Parts of Spanish Thymus vulgaris L. Plant", Food Chemistry Vol 63(3),pp 373- 383, 1998 Gupta R., "A review on plant Cordia obliqua Willd. (Clammy cherry)", 2015, Pharmacognosy Reviews 9 (18), pp. 127-131 Hahlbrock K. and Grisebach H., 1975, " Biosynthesis of flavonoids", In J.B. Harborne, T.J. Mabry and H. Mabry (eds), The Flavonoids, Chapman and Hall, London, pp. 866-915 Hanáková Z., "C-Geranylated Flavanones from Paulownia tomentosa Fruits as Potential Anti-inflammatory Compounds Acting via Inhibition of TNF-α Production", 2015, Journal of Natural Products 78 (4), pp. 850-863 Harborne J.B. , 1967, " Comparative Biochemistry of the Flavonoids", Academic Press, London Harborne J.B. and Mabry T.J., 1982, " The Flavonoids: Advances in Research", Chapman and Hall,London Harborne J.B., 1975, " The biochemical systematics of flavonoids" , In J.B. Harborne, T.J. Mabry and H. Mabry (eds), The Flavonoids, Chapman and Hall, London, pp. 1056-1095 Harborne J.B., 1985, "Phenolics and plant defence", In C.F. Van Sumere and P.J. Lea (eds), Annual Proceedings of the Phytochemical Society of Europe. Vol. 25. The Biochemistry of Plant Phenolics, Clarendon Press, Oxford, pp. 393-408 Harborne J.B., 1986, "The natural distribution in angiosperms of anthocyanins acylated with aliphatic dicarboxylic acids", Phytochemistry, 25, 1887-1894 Hassan R.A., "Investigation of some chemical constituents and antioxidant activity of asparagus sperngeri", 2014, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 6 (11), pp. 46-51 He L., "Rapid identification and quantitative analysis of the chemical constituents in Scutellaria indica L. by UHPLC-QTOF-MS and UHPLC-MS/MS", 2016, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 117, 10234, pp. 125- 139 Heath H.B. and Reineccius G., 1986, "Flavor Chemistry and Technology", Macmillan Publishers Ltd. Heath H.B., 1981, "Source Book of Flavors", The AVI Publishing Company, Inc. Westport, Connecticut, USA Hegnauer R., 1966," Chemotaxonomie der Pflanzen. IV", Birkhauser Verlag, Basel Hegnauer R., 1989, " Chemotaxonomie der Pflanzen. VIII", Birkhauser Verlag, Basel Heindl A. and Muller J., 1997, "Trocknung von Arznei- und Gewiirzpflanzen", Z. Ar. Gew.pfl., 2, 90-98

147

Hiroyuki Takeuchi, Zhan-Guo Lu and Tomoyuki Fujita, "New monoterpene Glucoside from the Aerial Parts of Thyme (Thymus vulgaris L.)", Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(5),1131-1134,2004 Hoffmannsegg, J.C. and Link, H.F. (1809) Flore portugaise, Vol. 1, Berlin, 123- 138. Hossain Mohammad Amzad, Khulood Ahmed Salim AL-Raqmi, Zawan Hamood AL-Mijizy, Afaf Mohammed Weli and Qasim AL-Riyami, "Study of Total Phenol, Flavonoids Contents and Phytochemical Screening of Various Leaves Crude Extracts of Locally Grown Thymus vulgaris", Asian Pac J Trop Biomed 2013, 3(9), 705-710 Huerta, G. (1629) Historia Natural de Cayo Plinio Segundo 11, Madrid. Hyug Chun, Dong Hoon Shin, Bum Shik Hong, Hong Yon Cho and Han Chul Yang, "Purification and Biological Activity of Acidic Polysaccharide from Leaves of Thymus vulgaris", Biol.Pharm.Bull. 24(8) 941-946, 2001 Iravani S., "Phytochemical analysis of Pinus eldarica bark", 2014, Research in Pharmaceutical Sciences 9 (4), pp. 243-250 Ismaili H., "Topical anti-inflammatory activity of extracts and compounds from Thymus broussonettii", 2002, Journal of Pharmacy and Pharmacology 54 (8), pp. 1137-1140 Ismaili H., "Topical anti-inflammatory activity of Thymus willdenowii", 2001, Journal of Pharmacy and Pharmacology 53 (12), pp. 1645-1652 Jabri-Karoui I., Bettaieb I., Msaada K., Hammami M. and Marzouk B., "Research on the Phenolic Compounds and Antioxidant Activities of Tunisian Thymus capitatus", Journal of Functional Foods 4(2012) 661-669 Jalas J. ,1971, Notes on Thymus L. (Labiatae) in Europe. I. Supraspecific classification and nomenclature. Bot. J. Linn. Soc., 64, 199-2 15. Jalas J. ,1972, Thymus L. In T. Tutin, V.H. Heywood, N.A. Burges, D.M. Moore and D.H. Valentine (eds), Flora Europaea, Vol. 3, University Press, Cambridge, pp. 172-182. Jalas J. ,1982, Thymus. In K.H. Rechinger (ed.), Flora Iranica Graz, pp. 532-551. Jalas J , 1982, Thymus. In P.H. Davis (ed.), Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Vol. 7,Edinburgh, pp. 349-382. Javed H., Erum S., Tabassum S. and Ameen F., "An Overview on Medicinal Importance of Thymus vulgaris", Journal of Asian Scientific Research, 2013, 3(10), 974-982 Jeong S.-J., "Extract of Rhus verniciflua stokes protects the diet-induced hyperlipidemia in mice", 2015, Archives of Pharmacal Research, 38 (11), pp. 2049-2058 Jin M.J., "Pharmacokinetic Profile of Eight Phenolic Compounds and Their Conjugated Metabolites after Oral Administration of Rhus verniciflua Extracts in Rats", 2015, Journal of Agricultural and Food Chemistry 63 (22), pp. 5410- 5416

148

Johnson J., "The flavonoid Eriodictyol Induces Long-term Protection inARPE-19 Cells Through its Effects on Nrf2 Activation and Phase 2 Gene Expression", Retina Cell Biology, Volume 50, Issue 5 Jung-Min, "Inhibitory Effect of Eriodictyol on IgE/Ag Induced Type I Hypersensitivity", Biosc. Biotech. and Biochem., Vol. 76, Issue 7, pp 1285-1290 Junichi Kitajima, Toru Ishikawa and Atushi Urabe, "A New Hydroxyjasmone Glucoside and Its Related Compounds from the Leaf of Thyme", Chem. Pharm. Bull. 52(8) 1013-1014, 2004 Junichi Kitajima, Toru Ishikawa, Atushi Urabe, Mitsuru Satoh, "Monoterpenoids and their Glycosides from the Leaf of Thyme", Phytochemistry 65 (2004) 3279-3287 Kadhim A., Hussein Ali Khayoon and Azal Hamoody Juma, "Antibacterial Efficiency for Alcoholic Extracted of Thymus vulgaris and Negilla sativa", Medicinal Journal of Babylon, Vol. 8, No 3, 2011 Kauniene V. and Kaunas E., 1991, " Medicinal Plants", Varpas, Kaunas, Lithuania (Lithuania) Keser S., "Some bioactive compounds and antioxidant activities of the bitter almond kernel (Prunus dulcis var. amara)", 2015, Journal of the Chemical Society of Pakistan 36 (5), pp. 922-930 Kim J.E., "Antioxidative chemical constituents from the stems of Cleyera japonica thunberg", 2012, International Journal of Pharmacology 8 (5), pp. 410-415 Kulevanova S., "Isolation and identification of flavonoids from Thymus longidens var. lanicaulis and T. longidens var. dassareticus (Lamiaceae)", 1997, Acta Pharmaceutica 47 (4), pp. 281-285 Kulisic Τea , "The effects of essential oils and aqueous tea infusions of oregano (Origanum vulgare L. spp.hirtum), thyme(Thymus vulgaris L.) and wild thyme (Thymus serpyllum L.) on the copper-induced oxidation of human low-density lipoproteins", International Journal of Food Sciences and Nutrition, March 2007; 58(2): 87-93 Kumar A., "Functional characterization of flavanone 3-hydroxylase gene from Phyllanthus emblica (L.)", 2015, Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 24 (4), pp. 453-460 Kummell H.J., 1959, Doctoral thesis, Braunschweig. Quoted from G. Stoess (1972) "Phytochemische und physiologicrhe Unterszlchungen uber Polyphenole in Thymus vulgaris L. und Thymus pulegioides L.", Doctoral thesis, Munster Kuroda M., "Chemical constituents of the aerial parts of Scutellaria lateriflora and their α-glucosidase inhibitory activities", 2012, Natural Product Communications 7 (4), pp. 471-474 LaBell F. , 1991, "Frozen fresh chopped herbs", Food Processing, USA, 52, 106- 108

149

Laguna A. ,1555, "Pedacio Dioscurides Anazarbeo. Acerca de la materia medicinal y de los venenos mortiferos", Salamanca. Ledesma-Escobar C.A., "Characterization of lemon (Citrus limon) polar extract by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in high resolution mode", 2015, Journal of Mass Spectrometry 50 (11), pp. 1196-1205 Lee J. K., "Anti-inflammatory Effects of Eriodictyol in Lipopolysaccharide- stimulated Raw 264,7 Murine Macrophages", Arch, Pharm. Res. 2011 Lee E. R., "The anti-apoptotic and anti-oxidant Effect of Eriodictyol on UV- induced Apoptosis in Keratocytes", Biol. Pharm. Bull. 2007, 30(1) 32-37 Leng J., "Two new triterpenoid saponins from roots and rhizomes of Glycyrrhiza uralensis", 2015, Chinese Traditional and Herbal Drugs 46 (11), pp. 1576-1582 Li D.-M., "Study on chemical constituents from green husk of Juglans sigillata", 2015, Chinese Traditional and Herbal Drugs 46 (7), pp. 962-965 Linné C. ,1738, "Hortus ClifJartianus", Amstelaedami Linné C. ,1748, "Hortυs Upsaliensis "I, Stockholm Linné C., 1753, "Species Plantarum", (Εd. l), Holmiae Linné C. , 1754, "Genera Plantarum", Holmiae Linné C., 1762-1763, "Species Plantarum", (Εd. 2), Stockholm Linné C., 1767, "Systema Naturae", (Εd. 12), reformata, Holmiae Litvinenko V.I. and Zoz I.G., 1969, "Chemotaxonomic study of Thymus species in the Ukraine", Rast. Resur., pp. 481-495 Loers G., "Neural cell activation by phenolic compounds from the Siberian larch (Larix sibirica)", 2014, Journal of Natural Products 77 (7), pp. 1554-1561 Luyen N.T., "Inhibitors of a-glucosidase, a-amylase and lipase from Chrysanthemum morifolium", 2013, Phytochemistry Letters 6 (3), pp. 322-325 Mabry Т.J., Markham K.R. and Тomas M.B., "Тhe systematic identification of flavonoids", Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New Υork, 1970 Magro M., "Magnetic purification of curcumin from Curcuma longa rhizome by novel naked maghemite nanoparticles", 2015, Journal of Agricultural and Food Chemistry 63 (3), pp. 912-920 Malejko J., "Determination of the total polyphenolic content in Cirsium palustre (L.) leaves extracts with manganese(IV) chemiluminescence detection", 2014, Food Chemistry 152, pp. 155-161 Malmir M., "A new bioactive monoterpene-flavonoid from Satureja khuzistanica", 2015, Fitoterapia 105, pp. 107-112 March R. E., Lewars E. G., Stadey C. J., "A comparison of Flavonoid Glycosides by Electrospray Тandem Mass Spectrometry", International Journal of Mass Spectrometry 248(2006), 61-85 Martinez M., 1936, "Sobre algunas plantas valencianas citadas en 10s "icones" de Barrelier". 801. Soc. Esp. Hist. Nat., 36, 199-204. Martins N., Barros L., Santos-Buelga C., Silva S., Henriques M. and Ferreira I., "Decotion, Infusion and Hydroalcoholic Extract of Cultivated Thyme:

150

Antioxidant and Antibacterial activities, and Phenolic Characterisation", Food Chemistry 167 (2015), 131-137 Martins N., "Decoction, infusion and hydroalcoholic extract of Origanum vulgare L.: Different performances regarding bioactivity and phenolic compounds", 2014, Food Chemistry 158, pp. 73-80 Mashanov V.I. and Pokrovskij A.A., 1991, " Spicy and Aromatic Plants", Αgropromizdat, Moscow (Russian) McClure J.W. , 1975," Physiology and functions of flavonoids", In J.B. Harborne, T.J. Mabry and H. Mabry (eds), The Flavonoids, Chapman and Hall, London, pp. 970-1055 Merghem R., "Five 8-C-benzylated flavonoids from Thymus hirtus (Labiateae)", 1995, Phytochemistry flavonoids from Thymus hirtus (Labiatae)", Phytochemistry, 38, 637-640 Μiguel López-Lázaro, "Distribution and Biological Activities of the Flavonoid Luteolin ", 2009 Miura K. and Nakatani N., "Antioxidative Activity of Flavonoids from Thyme (Thymus vulgaris L.)", Agric. Biol. Chem., 53 (11), 3043-3045, 1989 Miura K., Inagaki Τ. and Nakatani N.,"Structure and Activity of New Deodorant Biphenyl Compounds from Thyme (Thymus vulgaris L.)", Chem . Pharm. Bull. 37(7), 1816-1819, 1989 Mohamed M.A., 1997, "Effect of plant density and date of cutting on Thymus vulgaris L. plants", Egypt. J. Hort., 24, 1-6 (Arabic) Monforte M.T., "Feijoa sellowiana berg fruit juice: Anti-inflammatory effect and activity on superoxide anion generation", 2014, Journal of Medicinal Food 17 (4), pp. 455-461 Monforte M.T., "Protective effect of Calamintha officinalis moench leaves against alcohol-induced gastric mucosa injury in rats. Macroscopic, histologic and phytochemical analysis", 2012, Phytotherapy Research 26 (6), pp. 839-844 Montes R. and Carvajal M., 1998, "Control of Aspergillus in maize with plant essential oils and their components", J. Food Prot., 61, 616-619 Morales R., 1986, "Taxonomia de los generos Thymus (excluida la seccion Serpyllum) y Thymbra en la Peninsula Ibérica" Ruizia, 3, 1-324. Morales R., 1989, "El género Thymus L. en la region mediterranea occidental (Lamiaceae)", Biocosme Mesogéen, 6, 205-2 1 1. Morales R., 1995, "Hibridos de Thymus L. (Labiatae) en la Peninsula Ibérica", Anales Jaipd. Bot. Madrid, 5 3, 199-2 1 1. Morales R., Macia M.J., Dorda, E., and Garcia-Villaraco, A., 1996, "Nombres vulgares 11". Archivos de Flora Iberica 7. Real Jardin Botanico. Madrid. Morales R., 1997, "Synopsis of the genus Thymus L. in the Mediterranean area", Lugascalia. 19, 249-262. Murugan P.S., "Identification and quantification of phytocompounds in Acalypha indica leaves", 2015, International Journal of Pharma and Bio Sciences 6 (2), pp. P11-P21

151

Nazaruk J., "The influence of selected flavonoids from the leaves of Cirsium palustre (L.) Scop. on collagen expression in human skin fibroblasts", 2014, Phytotherapy Research 28 (9), pp. 1399-1405 Niebergall H., Humeid A. and Blochl W. , 1978, "Die Aromadurchlassigkeit von Verpackungsfolien und ihre Bestimmung mittels einer neu entwickelten MeBapparatur", Lebensm. Wiss. Technol., 11, 1-4. Nobuji Nakatani, Kayoko Miura and Takashi Inagaki, "Structure of New Deodorant Biphenyl Compounds from Thyme (Thymus vulgaris L.) and Their Activity Against Methyl Mercaptan", Agric. Biol. Chem., 53(5), 1375-1381, 1989 Olechnowicz-Stepien W. and Lamer-Zarawska E., 1975," Study of the flavonoid fraction of some plants of the Labiatae family (Herba serpylli L., Herba thymi L., Herba marjovanae L., Herbaorzgani L.)", Herba Pol., 2 1, 347-356 Otuki M.F., "Garcinia gardneriana (Planchon & Triana) Zappi. (Clusiaceae) as a topical anti-inflammatory alternative for cutaneous inflammation", 2011, Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology 109 (1), pp. 56-62 Pahlow M., 1979, "Das grosse Buch der Heilpflanzen - gesund durch Heilkrasse der Natur", Grafe und Unzer, Miinchen, pp. 333-334 Pan Y.-G., "Isolation, purification and identification of etiolation substrate from fresh-cut Chinese water-chestnut (Eleocharis tuberosa)", 2015, Food Chemistry 186, pp. 119-122 Pavela R., 2015, "Essential oils for the development of eco-friendly mosquito larvicides: A review", Industrial Corps and Products Peng B., "Chemical constituents from Ilex hainanensis", 2012, Journal of Chinese medicinal materials 35 (8), pp. 1251-1254 Pereira O. R., "Simultaneous characterization and quantification of phenolic compounds in Thymus x citriodorus using a validated HPLC-UV and ESI-MS combined method", 2013, Food Research International 54 (2), pp. 1773-1780 Perrot E. and Paris R., 1971, "Les plantes medicinales", Presses Universitaires de France, Paris, p. 233 Poletti A., 1979, "Plantas y Flores Medicinales", Instituto Parramon, Barcelona, pp. 103-104 Poludennij L.V. and Zhuravlev Ju.P., 1989, " Medicinal Plants in the Home Garden", Moskovskij Rabotchij, Moscow (Russian) Ragab E.A., "A new monoterpene glucoside and complete assignments of dihydroflavonols of Pulicaria jaubertii: potential cytotoxic and blood pressure lowering activity", 2015, Natural Product Research Raghavan B., Abraham K.O. and Koller W.D., 1995, "Flavour quality of fresh and dried Indian thyme (Thymus vulgaris L.)", Pafai Journal, 17, 9-14. Rainis G. and Ternes W., "Identification and Characterization of Dimeric Oxidation Products of p-Cymene-2,3-diol Isolated from Thymus vulgaris L.", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62, 235-243

152

Ramchoun M., "Investigation of antioxidant and antihemolytic properties of Thymus satureioides collected from Tafilalet Region, south-east of Morocco", 2015, Source of the Document Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine Ramos P.A.B., "Phenolic composition and antioxidant activity of different morphological parts of Cynara cardunculus L. var. altilis (DC)", 2014, Industrial Crops and Products 61, pp. 460-471 Rattanapant 0 . and Phongpipatpong M., 1990, "Drying of spices by using a dehumidifying dryer" Food, 20, 253-263. Reineccius G.,1994, "Source book of flavours", Chapman and Hall, New York Ren B., "Simultaneous determination of seven caffeoylquinic acids and three flavonoids in Pyrrosia petiolosa (Christ) Ching by RPUFLCDAD", 2014, Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 23 (9), pp. 642-648 Rey C., Carron C.-A., Cottagnoud A., Schweizer N., Bruttin B. & Carlen C., 2004. Νouveaux hybrides de thym vulgaire. Revue suisse Vitic., Arboric., Hortic. 36(5), 297–301 Richard H. , 1992, "Epices et Aronzates", Tec. Doc.-Lavoisier, A.P.R.I.A., Paris Rijke Eva, "Analytical separation and detection methods for flavonoids", , 2006, Journal of Chromatography A, 1112 (2006) 31–63 Rossato Mateus Fortes, "Eriodictyol: a Flavonoid Antagonist of the TRPV1 Receptor with Antioxidant Activity", Biochem. Pharmacology, Vol 81, Issue 4, pp. 544-551 Rudrapaul P., "New flavonoids from the fruits of Cornus mas, Cornaceae", 2015, Phytochemistry Letters 11, pp. 292-295 Saejueng K., "Radical scavenging activities of flavonoids from roots of Akschindlium godefroyanum", 2015, Natural Product Research 29 (12), pp. 1177-1179 Samuelsson Gunnar, "Φαρμακευτικά Προϊόντα Φυσικής Προέλευσης", Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης 2η Έκδοση,2004 Santos S.A.O., "Supercritical fluid extraction of phenolic compounds from Eucalyptus globulus Labill bark", 2012, Journal of Supercritical Fluids 71, pp. 71-79 Santos L.A. , "Evaluation of Chemical Constituents and Antioxidant Activity of Coconut Water (Cocus nucifera L.) and Caffeic Acid in Cell Culture", An. Acad. Bras. Ciênc. vol.85 no.4 Rio de Janeiro 2013 Epub Sep 27, 2013 Schafer D. and Schafer W., 1981, " Pharmacological studies with an ointment containing menthol, camphene and essential oils from broncholytical and secretolytical effects", Arzneim. - Forsch.,31,82-86 Schauenberg P. and Paris F., 1977," Guia de las plantas medicinales", Omega, Barcelona, pp. 316-317 Schlickmann F., "Gastroprotective bio-guiding study of fruits from Mimusops balata", 2015, Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology, 388 (11), pp. 1187-1200

153

Semrau R., 1958, "Edrie Flavone in der Familie der Labiaten", Doctoral thesis, Munchen Seung-Joo Lee, Katumi Umani, Takayuki Shibamoto and Kwang-Geun Lee, "Identification of Volatile Components in Basil (Ocinum basilicum L.) and Thyme Leaves (Thymus vulgaris L.) and their Antioxidant Properties", Food Chemistry, 2004 Simonyan A.V. and Litvinenko V.I., 1971, " Flavone aglycones of some Thymus species from the Caucasus", Rust. Resur., pp. 580-582 Song P., "HPLC-based activity profiling of anti-hepatocellular carcinoma constituents from the Tibetan medicine, Caragana tibetica", 2015, Source of the Document Journal of Huazhong University of Science and Technology - Medical Science 35 (3), pp. 450-455 Stahl-Biskup Ε. and Saez F., "Thyme: The genus Thymus", 2002 Taylor & Francis Stark T.D., "Antioxidative compounds from Garcinia buchananii stem bark", 2015, Journal of Natural Products 78 (2), pp. 234-240 Stoess G., 1972, "Phytochemische und Physiologische Untersuchungen uber Polyphenole in Thymus vulgaris L, und Thymus pulegioides L.", Doctoral thesis, Munchen Sun T., "Flavanoids from the leaves of Engelhardtia roxburghiana", 2012, Chinese Pharmaceutical Journal 47 (20), pp. 1617-1620 Tainter D.R. and Grenis, A.T., 1993," Spices and Seasonings. A Food Technology Handbook", VCH Publ. Inc., New York. Tanagornmeatar K., "Cytotoxic and anti-metastatic activities of phenolic compounds from Dendrobium ellipsophyllum", 2014, Anticancer Research 34 (11), pp. 6573-6579 Tang K.S.C., "Identification and quantification of phenolics in Australian native mint (Mentha australis R. Br.)", 2016, Food Chemistry 192, 17827, pp. 698-705 Thitilertdecha P., "Characterisation of polyphenolic compounds in Clerodendrum petasites S. Moore and their potential for topical delivery through the skin", 2014, Journal of Ethnopharmacology 154 (2), pp. 400-407 Thompson J.D., Manicacci D. and Tarayre M., 1998, "Thirty five years of thyme: a tale of two polymorphisms", BioScience, 48, 805-815 Thompson J.D. and Tarayre M., 2000, "Exploring the genetic basis and causes of variation in female fertility advantage in gynodioecious Thymus vulgaris", Evolution, 54, 1510-1520 Thompson J.D., Rolland A.-G and Pugnolle F., 2002, "Genetic variation for sexual dimorphism in flower size within and between populations of gynodioecious Thymus vulgaris", J. Evol. Biol., in press. Tian L.-W., "Phenolic compounds from the branches of eucalyptus maideni", 2012, Chemistry and Biodiversity 9 (1), pp. 123-130

154

Tlili N., "Phytochemicals and antioxidant activities of Rhus tripartitum (Ucria) fruits depending on locality and different stages of maturity", 2014, Food Chemistry 160, pp. 98-103 Tomas-Barberan F.A. and Wollenweber E. ,1990, " Flavonoid aglycones from the leaf surfaces of some Labiatae species", PI. Syst. Evol., 173, 109-118 Tomas-Barberan F.A., Husain S.Z. and Gil M.I. 1988, "The distribution of methylated flavones in the Lamiaceae", Biochem. Syst. Ecol., 16, 43-46 Toru Ishikawa, Yukiko Sega and Junichi Kitajima, "Water-soluble Constituents of Ajowan", Chem. Pharm. Bull. 49(7) 840-844, 2001 Trimech I., "Evaluation of anti-oxidant and acetylcholinesterase activity and identification of polyphenolics of the invasive weed dittrichia viscosa", 2014, Phytochemical Analysis 25 (5), pp. 421-428 Τsimogiannis D., Samiotaki M., Panayotou G. and Oreopoulou V., "Characterization of Flavonoid Subgroups and Hydroxy Substitution by HPLC- MS", Molecules 2007, 12, 593-606 Тung Υ.-Т., "Antioxidative phytochemicals from Rhododendron oldhamii Maxim. leaf extracts reduce serum uric acid levels in potassium oxonate- induced hyperuricemic mice", 2015, BMC Complementary and Alternative Medicine Ufuk Özgen, "Relationship Between Chemical Structure and Antioxidant Activity of Luteolin and Its Glycosides Isolated from Thymus sipyleus subsp. sipyleus var. sipyleus ”, Rec. Nat. Prod. 5:1 (2011)12-21 Uguzlar H., "Screening of Phytochemicals and Antioxidant Activity of Arum Dioscoridis Seeds", 2012, Journal of Food Biochemistry 36 (3), pp. 285-291 Underriner E.W. and Hume I.R. , 1994, "Handbook of Industrial Seasonings", Blackie Academic & Professional, London Valdeyron G., Dommke B. and Vernet P., 1977, "Self-fertilisation in male-fertile plants of a gynodioecious species: Thymus vulgaris L.", Heredity, 39, 243-249. Vallverdu-Queralt A., Regueiro J., Martinez-Huelamo M., "A comprehensive Study on the Phenolic Profile of Widely Used Culinary Herbs and Spices: Rosemary, Thyme, Cinnamon, Cumin and Bay", Food Chemistry 154(2014) 299-307 Van den Broucke Chris O., Roger A. Dommisse, Eddy L. Esmans and Jozef A. Lemli, "Three Methylated Flavones from Thymus vulgaris", Phytochemistry, Vol 21, No 10, pp 2581-2583, 1982 Van den Broucke C.O. and Lemli J.A., 1981, " Pharmacological and chemical investigation of thyme liquid extract", Planta Med., 41, 129-135 Venskutonis P.R., Poll L. and Larsen, M., 1996, " Influence of drying and irradiation on the composition of the volatile compounds of thyme (Thymus vulgaris L.)", Flavour Fragr. J., 11, 123-128 Vila R., Adzet T. and Ibsfiez C,. 1987, "Analysis por GC-MS del aceite esencial de Thymus moroderi,Thymus membranaceus y su hibrido", Actas III Congreso Internat. Ciencias Famceuticas, Barcelona

155

Volak J. and Stodola J., 1989," El gran libro de las plantas medicinales", Susaeta, Espania, pp. 288-289 Vouillamoz J., Schaller Μ., Rossineli Μ., "‘Varico 3’, nouvel hybride de thym (Thymus vulgaris L.) pour la production en Suisse", Revue suisse Viticulture, Arboriculture, Horticulture | V 370 ol. 43 (6): 370–376, 2011 Wang M., "New isoprenylated phenolic compounds from Morus laevigata", 2015, Chemistry and Biodiversity 12 (6), pp. 937-945 Wang S., "Study on the effects of sulfur fumigation on chemical constituents and antioxidant activity of Chrysanthemum morifolium cv. Hang-ju", 2014, Phytomedicine 21 (5), pp. 773-779 Wang X.-F.,"Polyphenols from leaves of Olea europaea", 2011, Chinese Traditional and Herbal Drugs 42 (5), pp. 848-851 Wang Q., "Chemical constituents in flavonoids from root of Glycyrrhiza uralensis", 2014, Chinese Traditional and Herbal Drugs 45 (1), pp. 31-36 Wang L., "Chemical constituents of Euphorbia dracunculoides", 2014, China journal of Chinese materia medica 39 (20), pp. 3969-3973 Watanabe J., Shinmoto H. and Tsushida T., "Coumarin and Flavone Derivatives from Estragon and Thyme as Inhibitors of Chemical Mediator Release from RBL-2H3 Cells", Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(1), 1-6, 2005 Win T., "Lavandulyl flavanones from the stems of Hypericum calycinum L", 2012, Chemistry and Biodiversity 9 (6), pp. 1198-1204 Wijesekera R.O.B., 1993, "Processing of medicinal plant derived preparations in developing countries - prospects & perspectives", Acta Hortic., 332, 63-71 Wollenweber E. and Dietz V.H., 1981, " Occurrence and distribution of free aglycones in plants", Phytochemistry, 20, 869-932 Wollenweber E., Favre-Bonvin J. and Jay M. , 1978, "A novel type of flavonoids: flavonol esters from fern exudates", Z. Naturforsch., 35c, 831-835 Wollenweber E., 1985," On the occurrence of acetylated flavonoid aglycones", Phytochemistry, 24, 1493-1494 Wu W., "Chemical constituents of antitumor active fraction of Lysimachia clethroides", 2011, Chinese Traditional and Herbal Drugs 42 (1), pp. 38-41 Xiong J., "Phenolic constituents from the leaves of Cratoxylum formosum ssp. pruniflorum", 2014, Fitoterapia 94, pp. 114-119 Yahagi T., "Inhibitory effect of chemical constituents from Artemisia scoparia Waldst. et Kit. on triglyceride accumulation in 3T3-L1 cells and nitric oxide production in RAW 264.7 cells", 2014, Journal of Natural Medicines 68 (2), pp. 414-420 Yang B., "Analysis of hydrolysable tannins and other phenolic compounds in emblic leafflower (Phyllanthus emblica L.) fruits by high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry", 2012, Journal of Agricultural and Food Chemistry 60 (35), pp. 8672-8683 Ye Q., "Antiosteoporotic activity and constituents of Podocarpium podocarpum", 2015, Phytomedicine 22 (1), pp. 94-102

156

Yin W., "Chemical constituents of Osmanthus fragrans", 2015, China journal of Chinese materia medica 40 (4), pp. 679-685 Zar C.T., "Use Piper sarmentosum as an effective antidiabetic supplement in South East Asia: A review", 2012, Clinica Terapeutica 163 (6), pp. 505-510 Zeghad N. and Merghem R., "Antioxidant and Antibacterial Activities of Thymus vulgaris L.", Medicinal and Aromatic Plant Research Journal Vol1(1), pp 5-11, 2013 Zekry S.H., "Effect of metabolites isolated from Cuscuta pedicellata on high fat diet-fed rats", 2015, Medicinal Chemistry Research 24 (5), 1269, pp. 1964- 1973 Zhang W.-K., "Flavonoids from Humulus lupulus", 2014, Zhongguo Zhongyao Zazhi 38 (10), pp. 1539-1542 Zhao M.-H., "Flavonoids in Juglans regia L. leaves and evaluation of in vitro antioxidant activity via intracellular and chemical methods", 2014, Scientific World Journal 2014 Zhou J., "Chemical constituents of Dendrobium officinale", 2015, Chinese Traditional and Herbal Drugs 46 (9), pp. 1292-1295 Zhou X.-D., "Chemical constituents from Tetracera asiatica", 2015, Chinese Traditional and Herbal Drugs 46 (2), pp. 185-188 Zhu H., "Anti-inflammatory constituents from Inula japonica", 2014, Zhongguo Zhongyao Zazhi 39 (1), pp. 83-88 Zinchenko T.V. and Bandyukova V.A., 1969, "Flavonoids of the Labiatae family", Farm. Zh. (Kiev), 25,49-55 Δαβίας Ορέστης, Το άρωμα του μύθου, του θύμου οι αλήθειες, http://www.iama.gr/ethno/thymus.html Παπαδογιάννης Ι., Σαμανίδου Β., "Ενόργανη Χημική Ανάλυση", Θεσσαλονίκη (2000) Σουλελές Χ., "Φαρμακογνωσία", Εκδόσεις Πήγασος, 2000 Στράτης Ι.Α, Βουλγαρόπουλος Α.Ν, Ζαχαριάδης Ι.Α.,"Ποσοτική Χημική Ανάλυση", Θεσσαλονικη 1999

157