Conservació D'espècies Vegetals En Perill Crític a L

Màster de Biodiversitat

CONSERVACIÓ D’ESPÈCIES VEGETALS EN PERILL CRÍTIC A L’ARXIPÈLAG DE LES SALVATGES

Manuel Pomar Cloquell

Directora: Tutor:

Roser Vilatersana Lluch José Manuel Blanco Moreno

Institut Botànic de Barcelona - CSIC Facultat de Biologia - UB

Setembre 2014

ÍNDEX

ABSTRACT- RESUM 1. INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS 2. MATERIAL I MÈTODES 2.1. Mostreig 2.2. Métodes moleculars 2.3. Anàlisi de les dades 3. RESULTATS 3.1. Demografia 3.2. Dades morfològiques 3.3. Dades genètiques 4. DISCUSSIÓ 5. CONCLUSIONS 6. AGRAÏMENTS 7. BIBLIOGRAFIA ANNEXOS

ABSTRACT – RESUM

The Selvagem Pequena is one of the two main islands in the Macaronesian archipelago of the Savage Islands ( Ilhas Selvagens ). The absence of introduced species, an exception amongst the rest of Macaronesian islands, has preserved a unique system where we can find the narrow endemic Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. Its demographic structure has been studied and we have used AFLP markers in order to shed light on the genetic relationships between individuals and to infer possible conservation strategies. This study revealed that the individuals sampled form a single population of different age classes structured in four lineages or genetic clusters with a high degree of gene flow and proven reproductive capacity. It has also been found that the number of individuals is higher than previously expected (97 reproductively individuals). Its current IUCN classification is hereby discussded according to the results of this study. KEYWORDS: AFLP, Asparagus nesiotes subsp. nesiotes , conservation, endemism, Macaronesian archipelago, Selvagem Pequena

La Salvatge Petita és una de les dues illes principals de l’arxipèlag macaronèsic de les Salvatges ( Ilhas Selvagens ). L’absència d’espècies introduïdes, una excepció entre la resta d’illes de la Macaronèsia, ha preservat un sistema únic on hi podem trobar l’endemisme com Asparagus nesiotes subsp. nesiotes . D’aquest tàxon s’ha estudiat la demografia i s’ha explorat la seva variabilitat genètica mitjançant marcadors AFLP, amb l’intenció de determinar les relacions genètiques entre individus i per a inferir possibles estratègies de conservació. Aquest estudi ha revelat que els individus mostrejats conformen una única població amb diferents classes d’edat estructurada en quatre llinatges principals que presenten un alt grau de flux genètic entre ells i bona capacitat reproductiva. També s’ha trobat que el nombre total d’individus (97 individus reproductors) és major de l’esperat. Amb els estudis realitzats també s’avalua la seva categoria UICN. PARAULES CLAU: AFLP, Asparagus nesiotes subsp. nesiotes , conservació, endemisme, Macaronèsia, Salvatge Petita,

1. INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS

La Macaronèsia és una regió biogeogràfica fo rmada per cinc arxipèlags de l'o ceà Atlàntic: les Açores , Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d 'origen volcànic (Fernández-Palacios et al., 2011) . Alguns autors hi inclouen també un enclavament continental situat al sud -oest del Marroc ( Médail & Quézel, 1999; Kim et al., 2008 ) (Fig. 1).

Fig. 1. La Macaronèsia d’acord amb Médail & Quézel (1999) .

La Macaronèsia representa un sistema insular que destaca p er la presència de flora relicta d’Europa i el nord d’Àfrica, supervivent de les extincions que es donaren al continent a finals del Neogen (Vargas, 2007). La composició d e la flora dels arxipèlags de la Macaronèsia, essent illes oceàniques, prové de la colonització i establ iment d'espècies provinents del continent en diferents temps geològics i de l'evolució d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes es veu accentuada pel diferent grau d'aïllament i l'edat de formació de cada illa (Cronk, 1997). Cal destacar la importànc ia d’aquestes illes no només com a punts de conservació de biodiversitat en quant a presència de paleoendemismes sinó també com a punts on se'n genera in situ de nova, essent sistemes d'altíssima densitat d'endemismes ( Cowie & Holland, 2006 ).

L’origen d'aquesta regió biogeogràfica el trobem en els diferents esdeveniments de caràcter volcànic que s'han donat al llarg dels darrers 70 milions d’anys (Ma). Aquests han donat lloc a diversos grups d'illes, moltes d'aquestes sota l'actual nivell del mar, destí que sol ser el típic en les dinàmiques geològiques de les illes volcàniques (Fernández-Palacios et al., 2011). D'aquests arxipèlags macaronèsics, el de les illes Salvatges ( Ilhas Selvagens ) és el d’origen més antic, aproximadament 27 Ma (Geldmacher et al., 2001) i es troba en les darreres fases de l'ontogènia de les illes volcàniques, caracteritzada per una topografia d'altiplà i finalment una fase terminal de desaparició per l'efecte de l'erosió i els canvis en el nivell del mar (Fernández-Palacios et al., 2011). Aquest petit arxipèlag pertany administrativament a la regió autònoma de Madeira (Portugal), tot i que geològicament forma part de la província volcànica de les Canàries. L'arxipèlag de les Salvatges està constituït de dues illes principals, la Salvatge Gran ( Selvagem Grande ) i la Salvatge Petita ( Selvagem Pequena ) així com nombrosos illots i farallons, destacant l' Ilheu de Fora , veí de la Salvatge Petita (Fig. 2).

Fig. 2. Arxipèlag de les Salvatges. Les dues illes principals es troben a una distància d’uns 20 km.

Les illes es troben situades a mig camí entre Madeira i les Canàries, estant a 280 Km de la primera i a 165 km de les segones i ja apareixen als mapes portolans del segle XIV com l'Atles Català de Cresques però no varen ser visitades fins el segle XV i, tot i així, despertaren poc interès per ésser considerades inhabitables. Més endavant, la Salvatge Gran sí que fou explotada i habitada de manera puntual per mariners i pescadors dels arxipèlags veïns, essent conegudes sobretot per les colònies de virot de les Açores ( Calonectris diomedea subsp . borealis ), que foren caçats regularment fins l'any 1967 per a la producció d'oli, però també per la presència de líquens que es recol·lectaven per a la fabricació de tints (Ritsema, 2010). Aquesta intermitent presència humana propicià la introducció d'espècies invasores tant vegetals com animals, moltes d’elles com a aliment pels visitants ocasionals, que afectaren profundament a la composició d'espècies original. Ja al segle XV hi foren introduïdes cabres i conills així com indirectament també ratolins que reduïren molt la flora nativa, provocant extincions o sovint només permetent-ne la supervivència als racons més inaccessibles. Les cabres s'extingiren al segle XIX mentre que els conills mantingueren la seva presència fins el 2003, any des del qual no se n’han registrat observacions (Serviço do Parque Natural da Madeira , 2004). En quant a plantes introduïdes, el cas més notable és el de Nicotiana glauca , cultivada i després naturalitzada al segle XIX i de la qual se'n fan programes d’eradicació actualment (Serviço do Parque Natural da Madeira , 2004). Contràriament, la Salvatge Petita, molt més petita i hostil per a l'establiment humà va romandre inalterada. Això ha permès que arribi fins als nostres dies un ecosistema intacte i de composició única. Actualment aquest arxipèlag té l'estatus de Reserva Natural Integral des del 1971 i es troba classificat dins el pla d'ordenament del territori de l'ens autonòmic com Área de Uso Proibido i estant administrativament dins el municipi de Funchal hi apareixen al Pla Director Municipal com no edificables. La seva protecció recau sobre la Secretaria Regional do Ambiente e dos Recursos Naturais per mitjà del Serviço do Parque Natural da Madeira . Les visites estan estrictament regulades, requereixen un permís especial i no és permès pernoctar-hi. La Marinha de Guerra Portuguesa hi té presència com a encarregada de vetllar del manteniment la Zona Econòmica Exclusiva (ZEE) portuguesa i porta a terme les connexions entre illes. L’àrea de treball d'aquest estudi es centra exclusivament en la Salvatge Petita (Fig. 3). Amb una superfície d'unes 20 hectàrees, aquesta illa i el seu subarxipèlag són una formació volcànica en la fase final de la seva ontogènia.

L'illa està formada per aglomerats piroclàstics de lapil·li ( Geldmacher et al., 2001 ) i presenta una topologia de plana coberta de sorres calcàries amb la única elevació rocosa del Pico do Veado (49 m). Al contrari que la seva veïna major, la Salvatge Petita només manté presència humana d'abril a novembre per guardes del parc que hi fan torns de tres setmanes. Tota l’illa es troba sotmesa a una forta erosió i a una pujada del nivell del mar, els efectes de la qual es veuen cada cop més accentuats (Moreira, 1991). En aquesta illa hi trobem nou dels onze endemismes propis de les illes Salvatges, dos dels quals només presents a la Salvatge Petita (Hansen & Sunding, 1993) i un exclusiu de la illa de Fora (subarxipèlag de la Salvatge Petita).

Fig. 3. Ortofoto de la Salvatge Petita (GeoPortal do LNEG - Laboratório Nacional de Energia e Geologia).

Aquest treball es troba integrat dins el projecte “Conservation of the critically endangered endemic flora of the Selvagens Islands, Atlantic Ocean ”, finançat pel Mohammed Bin Zayed Species Conservation Fund i que es centra en l'estudi dels tres endemismes exclusius de la Salvatge Petita: Argyranthemum thalassophilum Humphries, Asparagus nesiotes Svent. subsp. nesiotes i Euphorbia anachoreta Svent., i amb un nombre d'efectius menor de 250 individus per al primer i de menys de 50 per als dos darrers (Martín et al., 2008). Aquest estudi es centra en Asparagus nesiotes subsp. nesiotes.

A la Macaronèsia hi podem trobar 14 representants del gènere Asparagus L. (Asparagaceae; APG II, 2003) dels quals 12 són endemismes d’aquesta regió biogeogràfica (Hansen & Sunding, 1993). Trobem en aquest gènere tant espècies hermafrodites com dioiques ( Lee et al., 1997) però totes són perennes, presentant un rizoma subterrani proveït de tubercles radicals que produeixen tiges aèries, herbàcies o llenyoses. Així doncs, una de les característiques d’aquest gènere, així com de moltes monocotiledònies, és la capacitat per a generar clons. D’aquesta manera, diferenciem entre genets i ramets , essent els primers definits com aquells individus provinents d’un zigot i els segons aquells provinents de la fragmentació de parts vegetatives d’un genet original o planta mare. No obstant, no cal descartar la presència de mutacions somàtiques dins les espècies clonals (Scrosati, 2001). El pes de la reproducció asexual en el conjunt de les poblacions pot variar bastant entre les diferents espècies. La pol·linització d’aquest gènere és totalment entomòfila (Delaplane et al., 2000) i en illes oceàniques s’ha observat que la dispersió de les llavors la porten a terme tant sargantanes com ocells, a més d’aus rapinyaires com a dispersadors secundaris (Nogales et al., 2007). Asparagus nesiotes subsp . nesiotes és endèmica del subarxipèlag de la Salvatge Petita ( Marrero & Ramos, 1989). Forma mates densament ramificades de tiges volubles, és hermafrodita i presenta nombre cromosòmic 2 n = 6 x = 60 (Bramwell et al., 1976) (Fig. 4). La subespècie A. nesiotes subsp. purpurensis Marrero Rodr. & A. Ramos la trobem en canvi amb una distribució fragmentada a les illes de Fuerteventura, Lanzarote i la Graciosa i està inclosa al Libro Rojo de la Flora vascular de España amb la categoria UICN En Perill (EN) (Santos Guerra et al., 2013).

La tècnica dels marcadors moleculars AFLP ( Amplified Fragment Lenght Polymorphisms ) està àmpliament usada per a avaluar la diversitat genètica d’espècies clonals (Escaravage et al., 1998; Albert et al., 2003) i en projectes de conservació en poblacions d’illes (Kim et al., 2004). Aquesta tècnica es basa en l'amplificació de marcadors per PCR i va ser descrita per primera vegada per Vos et al. (1995). El seu protocol d’execució inclou 5 passos principals: a) restricció del DNA i lligació dels adaptadors als fragments de restricció, b) amplificació preselectiva amb PCR d’una submostra dels fragments, c) amplificació selectiva , d) separació per electroforesi dels fragments de DNA amplificats, i e) anàlisi i interpretació de les dades (Paun & Schönswetter, 2012). Respecte a altres tècniques, els marcadors AFLP ofereixen diversos avantatges, principalment el fet de ser un mètode relativament econòmic, senzill, ràpid i fiable per a generar un gran nombre de marcadors genètics informatius. El fet de detectar molta

6 variabilitat el fa molt adequat per a estudis a nivell subespecífic i l’ús d’enzims de restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc requereix cap coneixement previ de l’estructura i organit zació del genoma. A més d’això, són especialment útil s en estudis d’espècies poliploides ja que els avantatges dels marcadors codominants desapareixen, degut a que en aquests casos , els marcadors codominants tan sols poden discernir entre presència/absència . Al no verificar-se l’homologia d els marcadors , fa que aquesta tècnica sigui menys adequada per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).

Fig. 4. Detalls d’ Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. (A). Flors. (B). Fruits. (C). Individu juvenil . (D). Presa de mesures morfològiques .

Els objectius d’aquest treball són: • Determinar l’estat demogràfic de la població d’ Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. • Avaluar la diversitat genètica d’aquest tàxon. • Determinar el pes que té la clonalitat en el tàxon. • Estudiar l’existència de subpoblacions genèticament diferenciades. • Avaluar la categoria d’amenaça segons els criteris de la UICN. • Establir criteris per a la seva conservació.

2. MATERIAL I MÈTODES

2.1. Mostreig

Es va estudiar l’única població existent de A. nesiotes subsp. nesiotes de la Salvatge Petita. Es comptaren el nombre d’individus de la població, considerant com a individu (genet ) cadascuna de les mates individualitzades. Cada individu es va georreferenciar amb GPS (Garmin, Legend Cx) i es van prendre algunes mesures morfològiques: alçada de la mata, dimensió horitzontal màxima i nombre de branques (considerades cadascuna com a ramets ). De cada individu es prengueren mostres de fulles i es conservaren en sobres amb gel de sílice amb un codi d’identificació.

2.2. Mètodes moleculars

Extracció d’ADN : L’extracció d’ADN es va realitzar als laboratoris de l’Institut Botànic de Barcelona utilitzant el protocol de CTAB (Doyle & Doyle, 1987) amb la modificacions de Tel-Zur et al. (1999). El material es triturà amb esferes de plom dins eppendorfs de 2 ml durant 3 minuts amb un triturador Retsch®. Les mostres passaren per tres cicles de rentats de sorbitol a 4ºC, cada una d’elles incloïa un vòrtex i una centrifugació de 3 minuts a 13000 rpm i decantat del sobrenedant. S’afegeiren 700 l del buffer d’extracció CTAB i es deixà incubar a 65ºC durant 30 minuts. Després d’això es varen afegir 500 l de cloroform-isoamilalcohol (24:1) i es centrifugà. Es va retirar la fase superior (transparent) i es passà a un altre eppendorf amb tancament de seguretat. S’hi varen afegir 350 l d’isopropanol i es deixaren les mostres 5 minuts a l’ultracongelador (-70ºC). Una vegada descongelat es centrifugà durant 3 minuts a

13000 rpm i es decantà el sobrenedant amb pipetes Pasteur de plàstic (una per mostra). S’hi afegí 1ml d’etanol (70%) i es tornà a centrifugar. Es tornà a decantar amb molta cura el sobrenedant, tenint en compte la fragilitat del pellet en la mostra purificada. L’excés d’etanol es deixà eixugar dins una bomba de buit. Completat això, es va resuspendre amb 50 l de TE-buffer i 2,5 l de RNAsa (1mg/ml) i es deixà incubar a 37ºC almenys durant 30 minuts. El contingut en ADN de les extraccions es va determinat per espectrofotometria amb NanoDrop 1000 v.3.7.1 (Thermo Fisher Scientific) . La concentració mínima requerida per extracció era de 30 ng/ l. Segons els resultats obtinguts, s’ajustà la concentració les mostres per a obtenir una quantitat mínima de de 250 ng, l’establerta per a aplicar la tècnica d’AFLP.

Marcadors AFLP : La fase de Restricció es va portar a terme amb un volum total de 10 l per mostra (5 l ADN i 5 l còctel de reactius). Per a cada mostra, els volums de reactius varen ser de 3,6 l d’H 20, 1,0 l d’EcoRl buffer , 0,1 l de sèrum d’albúmina bovina (BSA, New England BioLabs) a 1mg/ml. Els fragments d’ADN es varen digerir amb els enzims de restricció 2,8 U Msel (New England BioLabs) i 10 U de EcoRl (Roche) i s’incubaren 3 hores a 37ºC. Per a la lligació el volum de reacció per mostra va ser de 12,5 l (7,5 l d’ADN procedent de la restricció i 5 l del còctel de reactius). El còctel de reactius va incloure

1,3 l d’H 20, 1,1 l de X10 T4 buffer , 0,5 l de BSA a 1mg/ml, 1 U Ligasa T4 (Roche) i els adaptadors de Msel (10 M) i EcoRl (50 M). Es va incubar durant 16 hores a 16ºC. Després d’aquesta fase es realitzà una comprovació de l’acció dels enzims mitjançant una electroforesi amb un gel d’agarosa a l’1% usant SYBR safe DNA gel stain (Molecular Probes Inc.). Una vegada comprovat es diluïren les mostres a 1/10. Per a la fase preselectiva el volum total per mostra va ser 12,5 l (2,5 l de la lligació diluïda i 10 l de còctel de reactius). Els reactius del còctel varen ser 6,82 l d’H 20, 1,25

l de Taq buffer (Applied Biosystems), 0,75 l de MgCl 2, 0,63 l de dNTP (10 mM), 0,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems) i 0,25 l de cada un dels primers preselectius EcoRI-A i MseI-C (10 M els dos). Es va fer un segon gel de verificació i després d’aquesta fase es diluïren les mostres a 1/10. Per a la fase selectiva el volum total per mostra va ser de 13 l (2 l de mostra del preselectiu diluït i 11 l del còctel de reactius). Es varen fer servir eppendorfs semiopacs per a evitar la degradació dels primers EcoRI fotosensibles, marcats amb el fluorocrom VIC® (Applied Biosystems). El contingut del còctel de reactius va ser 6,45

l d’ H20, 1,25 l de buffer TaqGold (Applied Biosystems), 0,75 µl de MgCl 2, 1 l dNTP

(10mM), 1 l BSA (1mg/ml), 1 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) i els primers 0,1 l de EcoRI-AXX(10 M) i 0,25 l MseI-CXX (10 M). Els productes d’amplificació selectiva junt amb 0,5 µl de l’estàndard de mida GeneScan 500 LIZ van se analitzats per la Unitat de Genòmica del Parque Científico de Madrid usant un seqüènciador automàtic ABI 3730 (Applied Biosystems). Després de provar 30 parells de primers selectius amb 8 mostres, es varen escollir dos parells (EcoRI-AGA/MseI-CTC i EcoRI-AGA/MseI-CTA) per realitzar l’estudi donat que eren els més reproductibles i fàcils d’analitzar. Controls negatius es varen realitzar en totes les diferents fases del procés d’AFLP per detectar contaminacions exògenes.

2.3. Anàlisi de les dades

Mapatge : Utilitzant el software ESRI ArcMap v.10.0® (ESRI, 2011) es va representar la distribució de l’espècie sobre el mapa de corbes de nivell proporcionat pel Serviço do Parque Natural da Madeira i per la Direção Regional de Florestas e Conservação da Natureza da Madeira utilitzant les dades recollides al camp amb GPS . Els mapes obtinguts es van editar posteriorment amb Adobe Illustrator 10®. Amb el visualitzador de mapes online del GeoPortal del Laboratorio Nacional de Energia e Geologia s’han descarregat les ortoimatges utilitzades. Els mapes descriptius de la regió macaronèsica s’han editat a partir de les imatges obtingudes des d’aquest portal.

Anàlisis morfològiques : S’han realitzat models de regressió lineals entre els parells de caràcters morfològics estudiats usant el programa R v.2.15.0 (R Development Core Team, 2012) i el paquet DEDUCER v.1.7.9 (Fellows, 2012). Usant les tres mesures morfològiques s’ha construït una Anàlisi de Components Principals (PCA) amb el programa R, l’entorn R-Commander v.1.9-5 (Fox, 2005) i el paquet FactoMineR v.1.24 ( Lê et al., 2008).

Anàlisis moleculars : L’anàlisi de les dades es portà a terme utilitzant el software GeneMarker® v.1.85 (SoftGenetics) utilitzant els fragments entre 64 i 500 pb. Aquest programa permet estandarditzar un patró en les mostres a partir del qual guiar-se en les anàlisis dels AFLP i determinar els polimorfismes observats. El criteri de valoració pot establir-se depenent del soroll de fons de les mostres. El resultat final és una matriu de presència/absència que es pot exportar. S’han seguit les recomanacions de Bonin et al. (2007) i s’han realitzat repeticions de mostres i les bandes ambigües i no reproduïbles s’han extret de la matriu binària.

Aquesta matriu binària obtinguda s’ha analitzat de diferents maneres i amb programes diversos. Per a adaptar el format de la matriu als programes que ho requerien s’ha utilitzat el paquet AFLPdat (Ehrich, 2006) usant el programa R . Per a explorar les relacions dins el dataset s’ha realitzat una anàlisi de coordenades principals (PCoA) usant la distància euclídia binària mitjançant el mòdul d’anàlisi multivariant Ginkgo (Bouxin, 2005) del paquet B-VegAna (De Cáceres et al., 2003). També s’ha explorat amb UPGMA ( Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean ) usant el coeficient de similitud de Dice (Dice, 1945) usant el programa NTSYSpc v.2.02j (Rohlf, 1997). Per a representar l’agrupament de les dades i distancies relatives entre parell d’individus simultàniament s’ha utilitzat l’algoritme Neighbor-Net (Bryant & Moulton, 2004), implementat al programa SPLITSTREE4 v4.10 (Huson & Bryant, 2006) utilitzant la distància no corregida (p) entre tots els parells de dades. S’ha realitzat un test de Mantel (Mantel, 1967) per avaluar l’existència de correlació entre la matriu de distàncies genètiques Dice i la matriu de distàncies geogràfiques usant el programa NTSYSpc. La matriu de distàncies geogràfiques s’ha calculat amb el programa Geographic Distance Matrix Generator v.1.2.3 (Ersts, 2011). Paral·lelament s’ha analitzat l’estructura genètica de la població amb BAPS v.6.0 (Bayesian Analysis of Population Structure; Corander et al., 2008) escollint les opcions de population mixture i clustering of individuals . S’han corregut 10 rèpliques per cadascuna de les sis simulacions provades, de K=2 a K=8. La millor K es va escollir amb la que presenta el major valor de log marginal likelihood [log (ml)]. Per tal de mesurar la diferenciació genètica entre les subpoblacions (geogràfiques o resultants de BAPS), s’han realitzat les anàlisis de variància molecular (AMOVA; Excoffier et al., 1992) usant el programa ARLEQUIN v.3.5.1.2. (Excoffier et al., 2005) basant-se en les distàncies euclidianes entre mostres i 1000 permutacions. Per avaluar la contribució de la clonalitat en la diversitat genètica d’ A. nesiotes subsp. nesiotes s’han usat els programes GENOTYPE v.1.2 i GENODIVE v.1.1 (Meirmans & Van Tienderen, 2004). Amb el primer s’ha obtingut el nombre de genotips ( genets ) i el histograma amb la distribució de la freqüència de les distàncies entre parells assumint el model d’infinits al·lels (IAM) per a la matriu originada amb els marcadors AFLP. Aquesta mesura de distància determina quin és el nombre de mutacions necessàries per a transformar el genotip d’un individu en el genotip d’un altre sumant tots els loci. El programa GENODIVE calcula els índex de clonalitat i proporciona una mesura d’uniformitat genotípica (E). Aquesta mesura és un indicador de com els genotips estan distribuïts a la població,quan E=1 tots els genotips tenen la mateixa freqüència. La variabilitat genètica s’ha mesurat amb l’aproximació Bayesiana utilitzant el

11 programa HICKORY v.1.1 (Holsinger & Lewis, 2003) que te l’avantatge de no assumir l’equilibri de Hardy-Weinberg.

El desequilibri de lligament es va inferit utilitzant l’índex d’associació modificat () independent del nombre de loci estudiats a través del programa MULTILOCUS v.1.2 (Agapow & Burt, 2001). Aquest índex té un valor esperat de 0 quan els loci no presenten associació, com s’esperaria en panmixi. La significació de () s’ha testat 1000 vegades a l’atzar comparant el valor observat amb la hipòtesi nul·la d’aparellament a l’atzar.

3. RESULTATS

3.1. Demografia

La població d’ Asparagus nesiotes subsp. nesiotes de la Salvatge Petita consta de 97 individus repartits en tres àrees principals. Les dues més importants es troben als vessants est (45 individus) i oest (50 individus) del Pico do Veado mentre que una tercera es situa a l’extrem sud-oest de l’illa i consta de només 2 individus (Fig. 5). Els individus es troben en bon estat i amb capacitat reproductora. Es comptabilitzen individus de totes les classes d’edat i s’observa que les mates es distribueixen exclusivament sobre sòls rocosos.

3.2. Dades morfològiques

Les dades recollides mostren una gran varietat de mides (Fig. 6): el nombre de ramets oscil·la entre 1 i 378 amb una mitjana de 31,2 ; llargada màxima de branques entre 10 i 870 cm amb una mitjana de 272,6 cm i la alçada de la mata oscil·la entre 8 i 420 cm amb una mitjana de 59,2 cm. Les mesures morfològiques estan lleugerament correlacionades (llargada/alçada; r = 0,2605 , p < 0,001; llargada/nº ramets : r = 0,1583, p < 0,001; alçada/nº ramets : r = 0.2425, p < 0,001). La PCA de les tres dades morfològiques estudiades es troba representada en la Fig. 7, diferenciant-se els individus distribuïts al vessants est i oest del Pico do Veado , observant-se que els individus al costat est tenen una lleugera tendencia a presentar un nombre menor de ramets .

Fig. 5. Distribució de dels individus d’ A. nesiotes subsp. nesiotes sobre el mapa de corbes de nivell de la Salvatge Petita.

Fig. 6. Histogrames per a les mesures morfològiques. (A). Nombre de ramets . (B). Llargada màxima de branques. (C). Alçada de la mata.

Fig. 7. Representació gràfica del PCA de les mesures morfològiques realitzades en els individus de la població de A. nesiotes subsp. nesiotes diferenciats segons la vessant. (A). Representació gràfica dels

individus segons les dues vessants. (B). Representació gràfica de les variables .

3.3. Dades genètiques

Amb els 93 individus analitzats genèticament s’ha obtingut una matriu binària de 99 loci dels quals el 78% són polimòrfics. Els nombre de loci trobats per individu varia de 47 (individu A017) a 91 (individu A105). La relació entre els individus de la població es troba representada gràficament en la Fig. 8 (Neighbor-Net) i Annexos 1 i 2 (PCoA i UPGMA respectivament). No s’ha trobat correlació entre les distancies genètiques i geogràfiques ( r = 0,049, p = 0,778). L’anàlisi BAPS mostra que l’agrupació dels individus òptima es la de quatre clústers (log (ml) = -2860,2303; P = 1) (Figs. 8 i 9). Els clústers 1, 2, 3 i 4 es composen de 30, 14, 39 i 10 individus respectivament. En la representació gràfica dels quatre clústers sobre el mapa de corbes de nivell de l’illa trobem aquests dispersos en les tres subpoblacions (Fig. 9). Aquesta agrupació dels individus per clústers ha estat contrastada amb el resultat de l’Neighbor-Net (Fig. 8). Les anàlisis d’AMOVA realitzades han donat com a resultat que la variabilitat genètica entre les subpoblacions segons criteris geogràfics és molt baixa (< 2%), mentre que entre els clúster de BAPS es del 29% (Taula 1).

Fig. 8. Diagrama Neighbor-Net aplicat a la matriu binària d’AFLP. S’ha representat a la mateixa figura els diferents clústers obtinguts amb BAPS

Font de Suma de Components Percentatge de d.f. Valor p F variació quadrats variància variació ST

BAPS

Entre clústers 3 242,62 3,41 29,01 0,000 0,29

Dins clústers 89 742,85 8,35 70,99

Est-Oest

Entre 1 18,15 0,16 1,50 0,042 0,01 subpoblacions Dins 91 967,31 10,63 98,50 subpoblacions

Est-Oest-Sud

Entre 2 27,90 0,14 1,27 0,083 ns 0,01 subpoblacions

Dins 90 957,56 10,64 98,73 subpoblacions

Taula 1. Resultats de l’AMOVA basant-nos en les agrupacions d’individus segons el resultat de BAPS i distribucions geogràfiques. El valor p s’ha estimat després de 1023 permutacions. ns: no significatiu.

Els estudis de la clonalitat, mostren l’absència de clons dins de la població d’ A. nesiotes subsp. nesiotes segons el mostreig realitzat ja que s’ha troben 93 genets i en l’histograma de la distribució de la freqüència de les distàncies entre parells amb el model IAM, s’observa l’absència de comparacions amb zero o pocs canvis, reflectint l’absència de clonalitat en les mostres (Fig. 10). Els coeficients de clonalitat mostren un nombre de genotips igual al nombre d’individus i un grau d’uniformitat clonal (eveness ) molt alt ( E = 1) ja que tots els genotips estan presents amb la freqüència d’1. Segons les agrupacions geogràfiques, les mesures de variabilitat genètica bayesiana de la població com de les subpoblacions es de 0,29; mentre que amb l’agrupació dels individus seguint els clústers de BAPS la diversitat genètica varia de 0,22 a 0,28 (Taula 2). S’ha detectat una petita part de desequilibri de lligament a la població d’ A . nesiotes

subsp. nesiotes ( = 0,028; p < 0,001). Amb les subpoblacions Est i Oest els resultats han estat significatius tot i que també molt baixos (Taula 3).

Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus segons els clústers obtinguts per BAPS.

Fig. 10. Histograma representant el nombre de canvis per parell de comparacions entre individus.

Població/Grup Mitjana 2,5% 97,5%

Est/Oest * * * hs [Est] 0,290 (0,011) 0,272 0,312

Hs[Oest] 0,293 (0,013) 0,270 0,317

Hs 0,292 (0,011) 0,272 0,314

Ht 0,294 (0,011) 0,273 0,315

Est/Oest/Sud * * * hs [Est] 0,290 (0,010) 0,271 0,311 hs [Oest] 0,294 (0,012) 0,272 0,317 hs [Sud] 0,289 (0,012) 0,267 0,313

Hs 0,291 (0,011) 0,271 0,313

Ht 0,293 (0,011) 0,274 0,315

BAPS * * * hs [1] 0,230 (0,008) 0,213 0,244 hs [2] 0,252 (0,010) 0,233 0,272 hs [3] 0,280 (0,008) 0,263 0,295 hs [4] 0,216 (0,010) 0,195 0,237

Hs 0,244 (0,005) 0,233 0,244

Ht 0,301(0,005) 0,291 0,301

Taula 2. Diversitat genètica Bayesiana basada en la variació d’AFLP d’ Asparagus nesiotes subsp. nesiotes . Entre parèntesi es mostra la desviació estàndard. El 2,5% i 97,5% mostren l’interval de confiança. hs indica la diversitat genètica en termes d’heterozigositat mitjana en panmixi per a cada població o grup. Hs és la mitjana de les hs i Ht és l’heterozigositat panmíctica basada en la mitjana de freqüències al·lèliques

Subpoblació Est 0,029 <0,001

Subpoblació Oest 0,026 <0,001

Població sencera 0,028 <0,001

Taula 3. Desequilibri de lligament trobat en la població i les subpoblacions geogràfiques d’ Asparagus nesiotes subsp. nesiotes .

4. DISCUSSIÓ

El resultat del recompte d’individus de l’única població d’ A. nesiotes subsp. nesiotes a la Salvatge Petita (97 individus) resultà ser el doble del que s’havia determinat prèviament (menys de 50 individus; veure Annex 3; Jardim et al., 2008). A més d’això, hi trobem representants de totes les classes d’edat, des de plàntules, individus juvenils, individus reproductors amb abundants flors i/o fruits, i individus senescents però molt vigorosos (Fig. 4a-d). Si relacionem les característiques morfològiques estudiades amb l’edat, es a dir, si considerem que al incrementar l’edat del individu s’incrementa el nombre de ramets i de mida de la mata o de les branques, ens trobem amb una població madura però amb molta regeneració ja que hi ha molts individus en les primeres classes dels histogrames morfològics (Fig. 6). Els individus més senescents, el més gran format per una mata de més de dos metres d’alçada i amb més de 300 ramets (exclòs de la representació gràfica del PCA, Fig. 7) es troben al vessant oest del Pico do Veado, degut possiblement a la orografia (Fig. 5) i, també, per trobar-se més al resguard dels vents (Pérez de Paz & Acebes Ginovés, 1978). La divisió genètica de la població en tres subpoblacions seguint criteris geogràfics (est, oest, sud) no es veu reforçada per les anàlisi AMOVA realitzades (Taula 1) ja que aquestes divisions expressen menys del 2% de la variabilitat trobada en tota la població. No obstant, l’anàlisi BAPS divideix la població en 4 grups genètics o clústers (Fig. 8). Aquests grups es troben distribuïts en tota l’àrea de distribució del tàxon (Fig. 9), fet que es veu recolzat per l’absència d’aïllament per distància entre els individus mostrada pel test de Mantel. Per tant, es tracta d’una població no fragmentada que presenta flux genètic entre les subpoblacions geogràfiques i, que tant, el rang d’acció dels pol·linitzadors com dels agents dispersants de llavors no es veuen afectats per la presencia del Pico do Veado. Tot i tractar-se d’un tàxon amb capacitat per a generar clons i que la reproducció asexual té un pes important en aquest gènere, els resultats del treball ens mostren que tots els individus analitzats (93 en total) corresponen a genets. És a dir, cada mata estudiada correspon a un individu genèticament diferent al altre. Tant les mutacions somàtiques com errors en les anàlisis d’AFLP podrien afavorir la manca de detecció de clons, no obstant, això es poc probable ja que les comparacions entre genotips indica un mínim de sis canvis (Fig. 10). El tipus de sòl sobre el que creix A. nesiotes subsp. nesiotes és un factor important que afavoreix els resultats trobats, ja els substrat rocós no és el més adequat per a la reproducció i proliferació clonal a llarga distància.

L’alta variabilitat genètica observada en aquesta població (Taula 3) contrasta amb el que succeeix en casos similars d’endemismes insulars on la diversitat és molt baixa i sovint acompanyada de molt poc flux gènic (Crawford et al., 2001; Houliston et al., 2012) ja que les poblacions amb baix nombre d’individus són més susceptibles a la pèrdua i reorganització de la variabilitat per deriva genètica (Ellstrand & Ellam, 1993). I a més, una població amb un nombre molt baix d’individus pot sofrir també pèrdua de variació per fluctuacions degudes a factors externs atzarosos (Ellstrand et al., 1993). Hi ha pocs estudis de variabilitat genètica en el gènere Asparagus (Sica et al., 2005; Vijay et al., 2009) i en molts casos són difícilment comparables ja que utilitzen diferents marcadors genètics i/o diferents paràmetres per a calcular aquesta variabilitat. De totes maneres, comparant els nostres resultats amb l’estudi del tetraploide A. acutifolius L. en diferents zones d’Itàlia, realitzat per Sica et al. (2005), veiem que, tot i ser del mateix gènere, la variabilitat trobada en aquesta espècies és bastant més baixa (Hs = 0,162) que la trobada en A. nesiotes subsp. nesiotes (Hs = 0,291). No obstant, a l’hora d’explorar aquests resultats obtinguts de variabilitat genètica en aquest tàxon, cal tenir en compte el fet de que A. nesiotes subsp . nesiotes és un hexaploide i que en les espècies que presenten aquest alt grau de ploïdia s’hi tendeix a observar una variabilitat genètica més elevada (Soltis & Soltis, 2000). Aquesta alta variabilitat trobada en una població petita, com es l’estudiada, podria explicar-se també per una major retenció de la variació observada en aquest tipus de poblacions i que ocasionalment pateixen nivells d’estrès moderat quan se les compara amb altres poblacions d’igual mida en ambients més benignes (Lesica & Allendorf, 1992). Els valors de diversitat genètica (Hs) trobada en A. nesiotes subsp. nesiotes són similars als mostrats en la metaanàlisi de Nybom (2004), també amb marcadors dominants, per a un seguit de trets vitals com són la forma de vida perenne i de llarga durada (Hs = 0,25), l’endemicitat (Hs = 0,20) i la dispersió de llavors per ingesta (Hs = 0,24). El grau de desequilibri per lligament es àmpliament usat per avaluar especies clonals (Agapow & Burt, 2001) i també per estimar diferents escenaris evolutius com pot ser, la presència de colls d’ampolla (Frankham et al., 2003). En les nostres anàlisis trobem un lleuger desequilibri per lligament que no sembla ser causats ni per la presència de reproducció asexual ni per la presència de recents colls d’ampolla, sinó que probablement és degut al baix nombre d’individus de la població (Frankham et al., 2003). Donat l’alt nivell de variabilitat genètica i la baixa quantitat de desequilibri per lligament trobat en A. nesiotes subsp. nesiotes , es pot dir que el tàxon no està genèticament depauperat.

Pel que fa a les amenaces a les quals s’enfronten les poblacions aïllades de característiques similars al tàxon estudiat, hi trobem la deriva genètica, l’envelliment i pèrdua de vigor, l’activitat humana i factors ambientals estocàstics (Lesica & Allendorf, 1992). Segons els resultats trobats en el present treball les dues primeres amenaces enumerades no semblen afectar directament a la població d’ A. nesiotes subsp. nesiotes ja que encara que la presència d’individus senescents és bastant abundant (Fig. 6), no representen una majoria i en tot cas queda clara la seva capacitat reproductiva i robustesa. En quant a les activitats humanes que es puguin dur a terme a la Selvagem Pequena, la potencialment més perjudicial pel tàxon són les derivades de les visites incontrolades a l’àrea protegida de les Salvatges Petita. Cal remarcar que la Salvatge Petita només està habitada pels guardes del parc durant sis mesos a l’any, coincidint amb la temporada alta (Serviço do Parque Natural da Madeira , 2004) i que correspon amb el període en el qual l’estat de la mar permet la connexió amb Madeira i amb la resta de l’arxipèlag. La resta de l’any, tot i que l’onatge sol fer impossible el desembarcament a l’illa, s’hi han registrat visites furtives. Però tot i que en termes biològics l’espècie pugui semblar viable, les poblacions petites tenen més probabilitat de veure’s abocades a l’extinció degut a fluctuacions ambientals estocàstiques (Goodman,1987). El seu aïllament, l’escàs nombre d’individus i les característiques geològiques de l’illa la posen en una situació especialment fràgil a factors ambientals estocàstics com poden ser esllavissades, incendis provocats per llamps i, fins i tot, s’ha d’incloure el risc de tsunamis dins la llista d’amenaces (Løvholt et al., 2008). De totes maneres, el factor ambiental que suposa el risc principal a la Salvatge Petita i també a la població d’ A. nesiotes subsp nesiotes és la pujada del nivell del mar i, amb aquesta, l’increment de l’erosió que pateix i que gradualment redueix la superfície emergida de l’illa (Moreira, 1991; Courchamp et al., 2014). Dins aquest sistema insular, A. nesiotes subsp. nesiotes hi juga un paper important començant pel fet que és una font d’aliment per als rèptils de l’illa que, alhora, són els principals dispersadors de llavors (Nogales et al., 2007). A banda d’això les espesses mates creixen sobre elles mateixes formant concavitats que serveixen de refugi i de lloc de cria per a Calonectris diomedea subsp . borealis , que forma una important colònia a l’arxipèlag (López-Pujol et al., 2013). Actualment la IUCN Red List of Threatened Species inclou Asparagus nesiotes a nivell específic com espècie EN PERILL [ EN B2ab(ii,v)] (Santos Guerra et al., 2013). En aquesta fitxa s’inclouen tant les poblacions de Fuerteventura, Lanzarote, la Graciosa

(corresponents a A. nesiotes subsp . purpurensis ) com les de la Salvatge Petita (corresponent a A. nesiotes subsp . nesiotes ). Al mateix temps, la subspècie endèmica de les Canàries està també catalogada com EN PERILL [ EN B2ab(ii,iii,iv)] (Santana et al., 2004). La singularitat d’ A. nesiotes subsp .nesiotes i el fet que actualment hi ha una absència total de flux gènic entre els dos tàxons fa recomanable la catalogació apart de l’estat actual d’ A. nesiotes subsp. nesiotes . Els criteris de la UICN per a establir les diferents categories d’amenaça dels taxons son referents a tendència demogràfica, reducció de l’àrea de distribució o nombre total d’individus (UICN, 2012). En la bibliografia consultada es parla sempre d’ A. nesiotes subsp. nesiotes com a tàxon raríssim (Sventenius, 1968), amb nombre reduït d’exemplars (Pérez de Paz & Acebes Ginovés, 1978) o de menys de 50 individus i formant una població estable (Jardim et al., 2008). Per tant, no es disposen de dades per inferir que hi hagi una tendència demogràfica a la baixa, ni en nombre d’individus ni en l’àrea que ocupa. Per tot això, amb les dades que disposem després de realitzar aquest estudi, i seguint els criteris de la UICN, es pot establir que aquest tàxon no entra dins classificació de PERILL CRITIC (CR) ja que només compleix un dels subapartats del criteri B, referent a la distribució geogràfica: àrea d’ocupació menor a 10 km² i coneguda a una sola localitat (criteri Ba) (UICN, 2012). Amb les dades de les quals disposem, la classificació UICN per a Asparagus nesiotes subsp .nesiotes és de EN PERILL (EN) segons el criteri D: mida de la població estimada en menys de 250 individus madurs [EN D]. Per una altra banda, si tenim en compte que la subpoblació sud és clarament sensible a factors d’estocasticitat ambiental donat el seu baix nombre d’individus veiem que el tàxon es troba al llindar de la classificació CR d’acord amb el criteri de reducció d’àrea, es requereix un seguiment de la població a mig o llarg termini per avaluar possibles canvis en la classificació IUCN. Amb els resultats demogràfics i genètics obtinguts amb aquest treball, juntament amb les observacions realitzades al camp, ens permeten suggerir una sèrie de mesures per la de la conservació del tàxon: (a) conservació de llavor ex situ en un banc de germoplasma del major nombre d’individus possibles donada l’alta variabilitat genètica observada, assegurant--se de incloure en el mostreig llavors dels 4 clúster genètics, seria apropiat realitzar la conservació d’un segon estoc de llavors en un segon banc de germoplasma com a mesura de seguretat; (b) realitzar un seguiment de l’evolució demogràfica de la població, i (c) reforçar el control de la presència humana a l’illa.

5. CONCLUSIONS

• El cens d’ Asparagus nesiotes subsp . nesiotes és de 97 individus reproductors a la Salvatge Petita que conformen una única població. • Els individus es distribueixen geogràficament en tres grups principals, als vessants est i oest del Pico do Veado (45 i 50 individus respectivament) i un grup de dos individus al sud de l’illa. • Hi ha una alta variabilitat genètica, tots els individus estudiats són genets diferents i no s’observa clonalitat. • Els resultats de BAPS indiquen que la població es troba estructurada en quatre clústers genètics sense segregació geogràfica. • Les amenaces per a aquest tàxon són fonamentalment degudes a l’estocasticitat ambiental i les activitats humanes. • La classificació UICN per a A. nesiotes subsp . nesiotes segons els resultats obtinguts és de EN PERILL segons el criteri D [EN D]. • Les mesures recomanades de conservació inclouen la preservació ex situ del germoplasma en banc de llavors, seguiment demogràfic i control de visites a l’illa

6. AGRAÏMENTS

En primer lloc vull donar les gràcies a la meva directora, Roser Vilatersana, per tot el que he après amb ella, per la seva santa paciència i per no desesperar massa amb mi. Sense ella aquest treball no hagués estat possible. També vull agrair el suport rebut per part del jefe Jordi López i del Sergi Massó en la realització d’aquest treball així com a les companyes de despatx i penúries, la Sònia i la Deborah. Agrair també a l’Alfonso i la Núria i a la resta del personal de l’IBB que m’han ajudat quan ho necessitava i pel bon tracte rebut. Dono també les gràcies al meu tutor, José Blanco per la seva ajuda i la fe dipositada , al Jordi Carreras per l’ajuda amb ArcMap i a Sara Isabel Correia Freitas (Serviço do Parque Natural da Madeira) i Nuno da Conceicao Gouveis Serralha (Direção Regional de Florestas e Conservação da Natureza – Madeira) per elaborar el mapa de corbes de nivel de les illes Salvatges. Agraïment especial a la meva família pel seu suport constant i als amics que m’han fet costat quan

23 ho necessitava. No vull acabar sense agrair l’ajuda espiritual del Padre Pio i de San Benito Menni així com del les relíquies paganes que hagin pogut intervenir en que aquest treball arribés a bon port.

7. BIBLIOGRAFIA

Agapow, P. & Burt, A. (2001). Indices of multilocus linkage disequilibrium. Molecular Ecology Notes 1: 101–102.

Albert, T.; Raspé, O. & Jacquemart, A. L. (2003). Clonal structure in Vaccinium myrtillus L. revealed by RAPD and AFLP markers. International Journal of Plant Sciences 164: 649–655.

APG II (2003). An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean Society 141: 399–436.

Bonin, A.; Ehrich, D. & Manel, S. (2007). Statistical analysis of amplified fragment length polymorphism data: a toolbox for molecular ecologists and evolutionists. Molecular Ecology 16: 3737–3758.

Bouxin, G. (2005). Ginkgo, a multivariate analysis package. Journal of Vegetation Science 16: 355–359.

Bramwell, D.; Pérez de Paz, J. & Ortega, J. (1976). Studies in the flora of Macaronesia: some chromosome numbers of flowering plants. Botánica Macaronésica 1: 9–16.

Bryant, D. & Moulton, V. (2004). Neighbor-net: an agglomerative method for the construction of phylogenetic networks. Molecular Biology and Evolution 21: 255–265.

Corander, J.; Marttinen, P.; Sirén, J. & Tang, J. (2008). Enhanced Bayesian modelling in BAPS software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics 9: 539.

Courchamp, F.; Hoffmann, B. D.; Russell, J. C.; Leclerc, C. & Bellard, C. (2014). Climate change, sea-level rise, and conservation: keeping island biodiversity afloat. Trends in Ecology and Evolution 29: 127–130.

Cowie, R. H. & Holland B. S. (2006). Dispersal is fundamental to biogeography and the evolution of biodiversity on oceanic islands. Journal of Biogeography 33: 193–198.

Crawford, D. J.; Ruiz, E.; Stuessy, T. F.; Tepe, E.; Aqeveque, P.; Gonzalez, F.; Jensen; R. J.; Anderson, G. J.; Bernardello, G.; Baeza, C. M.; Swenson, U. & Silva, M. (2001). Allozyme diversity in endemic flowering plant species of the Juan Fernandez Archipelago, Chile: ecological and historical factors with implications for conservation. American Journal of Botany 88: 2195 –2203.

Cronk, Q. C. B. (1997). Islands: stability, diversity, conservation. Biodiversity and Conservation 6: 477–493.

De Cáceres, M.; Font, X.; García, R. & Oliva, F. (2003). VegAna, un paquete de programas para la gestión y análisis de datos ecológicos. In: VII Congreso Nacional de la Asociación Española de Ecología Terrestre, pp. 1484–1497. Barcelona.

Delaplane, K. S.; Mayer, D. R. & Mayer, D. F. (2000). Crop pollination by bees. Cabi Publishing. Wallingford.

Dice, L. R. (1945). Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology 26: 297–302.

Doyle, J. J. & Doyle, J. L. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13–15

Ehrich, D. (2006). AFLPdat: a collection of R functions for convenient handling of AFLP data. Molecular Ecology Notes 6: 603–604.

Ellstrand, N. C. & Elam, D. R. (1993). Population genetic consequences of small population size: implications for plant conservation. Annual Review of Ecology and Systematics 24: 217–242.

Ersts, P. J. (2011) Geographic Distance Matrix Generator (version 1.2.3). American Museum of Natural History, Center for Biodiversity and Conservation. New York.

Escaravage, N.; Questiau, S.; Pornon, A.; Doche, B. & Taberlet, P. (1998). Clonal diversity in a Rhododendron ferrugineum L.(Ericaceae) population inferred from AFLP markers. Molecular Ecology 7: 975–982.

ESRI (2011). ESRI ArcGIS Desktop: Release 10. Environmental Systems Research Institute. Redlands.

Excoffier, L.; Laval, G. & Schneider, S. (2005). Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: 47.

Excoffier, L.; Smouse, P. E. & Quattro, J. M. (1992). Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479–491.

Fellows, I. (2012). Deducer: A data analysis GUI for R. Journal of Statistical Software 49: 1–15.

Fernández–Palacios, J. M.; de Nascimento, L.; Otto, R.; Delgado, J. D.; García-del- Rey, E.; Arévalo, J. R. & Whittaker, R. J. (2011). A reconstruction of Palaeo- Macaronesia, with particular reference to the long-term biogeography of the Atlantic island laurel forests. Journal of Biogeography 38: 226–246.

Fox, J. (2005). The R commander: A basic–statistics graphical user interface to R. Journal of Statistical Software 14: 1–42.

Frankham, R.; Ballou; J. D.; Briscoe, D. A. (2003). Introduction to conservation genetics. Cambridge University Press. Cambridge.

Geldmacher, J.; Hoernle, K.; van den Bogaard, P.; Zankl, G. & Garbe-Schönberg, D. (2001). Earlier history of the ≥ 70-Ma-old Canary hotspot based on the temporal and geochemical evolution of the Selvagen Archipelago and neighboring seamounts in the eastern North Atlantic. Journal of Volcanology and Geothermal Research 111: 55–87.

Goodman, D. (1987). Consideration of stochastic demography in the design and management of biological reserves. Natural Resource Modelling 1: 205–223

Hansen, A. & Sunding, P. (1993). Flora of Macaronesia. Checklist of vascular plants. 4. Revised edition. Sommerfeltia 17: 1–297.

Holsinger, K. E. & Lewis, P. O. (2003). HICKORY: A package for analysis of population genetic data v1. 0. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Connecticut. Storrs.

Houliston, G. J.; Dawson, M. I.; De Lange, P. J. & Heenan, P. B. (2012). Using AFLP markers to inform population management of the endemic Chatham Island toetoe, Austroderia turbaria (Poaceae). Pacific Conservation Biology 18: 33—40

Huson, D. H., & Bryant, D. (2006). Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular Biology and Evolution 23: 254–267.

Jardim, F.; Fernandes, F. & Carvalho, J. A. (2008). Asparagus nesiotes Svent. subsp. nesiotes . In: Martín, J. L., Arechavaleta, M., Borges, P. A. V. & Faria, B. (eds.). Top 100. Las 100 especies amenazadas prioritarias de gestión en la región europea biogeográfica de la Macaronesia, pp. 216–217. Consejería de Medio Ambiente y Ordenación Territorial, Gobierno de Canarias. Las Palmas de Gran Canaria.

Kim, S. C.; Lee, C. & Santos-Guerra, A. (2005). Genetic analysis and conservation of the endangered Canary Island woody sow-thistle, Sonchus gandogeri (Asteraceae). Journal of Plant Research 118: 147–153.

Kim, S. C.; McGowen, M. R.; Lubinsky, P.; Barber, J. C.; Mort, M. E. & Santos-Guerra, A. (2008). Timing and tempo of early and successive adaptive radiations in Macaronesia. PLoS One 3: e2139.

Lê, S.; Josse, J. & Husson, F. (2008). FactoMineR: an R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software 25: 1–18.

Lee, Y.; Kanno, Y. & Kameya, T. (1997). Phylogenetic relationships in the genus Asparagus based on the restriction enzyme analysis of the chloroplast DNA. Breeding Science 47: 375–378.

Lesica, P. & Allendorf, F. W. (1992). Are small populations of plants worth preserving? Conservation Biology 6: 135–139.

López-Pujol, J.; Vilatersana, R. & Carvalho, J. A. (2013). E-Opinió núm. 29: Crònica (il lustrada) d’un viatge al paradís: expedició a les Illes Salvatges. Portal de biologia de la conservació de plantes. Laboratori de Botànica, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona. Barcelona. Consultat juliol 2014, a http://hdl.handle.net/2445/46386

Løvholt, F.; Pedersen, G. & Gisler, G. (2008). Oceanic propagation of a potential tsunami from the La Palma Island. Journal of Geophysical Research: Oceans 113: C09026.

Mantel, N. (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research 27: 209–220.

Marrero, A. & Ramos, A. (1989). Chorologic-taxonomic comment of Asparagus nesiotes Svent. ( Liliaceae ). Botánica Macaronésica 18: 5–26.

Martín, J. L.; Arechavaleta, M.; Borges, P. A. V. & Faria, B. (2008). Top 100. Las 100 especies amenazadas prioritarias de gestión en la región europea biogeográfica de la Macaronesia. Consejería de Medio Ambiente y Ordenación Territorial, Gobierno de Canarias. Las Palmas de Gran Canaria.

Médail, F. & Quézel, P. (1999). The phytogeographical significance of SW Morocco compared to the Canary Islands. Plant Ecology 140: 221–244.

Meirmans, P. G. & Van Tienderen, P. H. (2004). GENOTYPE and GENODIVE: two programs for the analysis of genetic diversity of asexual organisms. Molecular Ecology Notes 4: 792–794.

Moreira, M. E. (1991). A elevação do nível do ocenao no litoral das Ilhas Selvagens. Finisterra: Revista Portuguesa de Geografia 26: 140–149.

Mueller, U. G. & Wolfenbarge, L. L. (1999). AFLP genotyping and fingerprinting. Trends in Ecology & Evolution 14: 389–394.

Nogales, M.; Padilla, D. P.; Nieves, C.; Illera, J. C., & Traveset, A. (2007). Secondary seed dispersal systems, frugivorous lizards and predatory birds in insular volcanic badlands. Journal of Ecology, 95: 1394–1403.

Nybom, H. (2004). Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants. Molecular Ecology, 13: 1143–1155.

Paun, O. & Schönswetter, P. (2012). Amplified fragment length polymorphism: an invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies. In: Sucher, N. J., Hennell, J. R. & Carles, M. C. (eds.). Plant DNA Fingerprinting and Barcoding – Methods and Protocols, pp. 75–87. Humana Press. New York.

Pérez de Paz, P. L. & Acebes Ginovés, J. R. (1978). Las Islas Salvajes: Contribución al conocimiento de su flora y vegetación. In: Contribución al estudio de la historia natural de las Islas Salvajes. Mueso de Ciencias Naturales del Excmo. Cabildo Insular de Sta. Cruz de Tenerife. Santa Cruz de Tenerife.

R Development Core Team (2012). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna.

Ritsema, A. (2010). The Selvagens, forgotten Atlantic Islands. Lulu.com. Deventler.

Rohlf, F. J. (1997) NTSYS–Pc. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, v. 1.80. Exeter Software. New York.

Santana, I.; Scholz, S. & Naranjo, J. (2004). Asparagus nesiotes subsp. purpurensis Marrero Rodr. et Ramos. In: Bañares, A.; Blanca, G.; Güemes, J., Moreno, J. C. & Ortíz, S. (eds.) Atlas y libro rojo de la flora vascular amenazada de España, pp. 612– 613. Dirección General para la Biodiversidad, Publicaciones del O. A. P. N. Madrid.

Santos Guerra, A.; Draper, D.; Magos, J.; Duarte, M. C.; Tavares, M. & Carvalho, M. (2013). Asparagus nesiotes . In: The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.2. Consultat el 2 de setembre 2014, a http://www.iucnredlist.org/details/176453/0.

Scrosati, R. (2002). An updated definition of genet applicable to clonal seaweeds, bryophytes, and vascular plants. Basic and Applied Ecology 3: 97–99.

Serviço do Parque Natural da Madeira (2004). As Ilhas Selvagens. Serviço do Parque Natural da Madeira, Funchal.

Sica, M.; Gamba, G.; Montieri, S.; Gaudio, L. & Aceto, S. (2005). ISSR markers show differentiation among Italian populations of Asparagus acutifolius L. BMC Genetics 6: 17.

Soltis, P. S. & Soltis, D. E. (2000). The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 7051–7057.

Sventenius, E. R. (1968). Plantae Macaronesienses novae vel minus cognitae. I. In: Separatum Indices Seminum Horti Acclimatationis Plantarum Arautapensis, pp. 43-60. Santa Cruz de Tenerife.

Tel-Zur, N.; Abbo, S.; Myslabodski, D. & Mizrahi, Y. (1999). Modified CTAB procedure for DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus and Selenicereus (Cactaceae). Plant Molecular Biology Reporter 17: 249–254.

UICN (2012). Categorías y Criterios de la Lista Roja de la UICN. Versión 3.1. Segona edició. Comisión de la Supervivencia de Especies de la UICN, Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza. Gland & Cambridge.

Vargas, P. (2007). Are Macaronesian islands refugia of relict plant lineages?: a molecular survey. In: Weiss, S. & Ferrand, N. (eds). Phylogeography of Southern European refugia, pp. 297–314. Springer. Dordrecht.

Vijay, N.; Sairkar, P.; Silawat, N.; Garg, R. K. & Mehrotra, N. N. (2009). Genetic variability in Asparagus racemosus (Willd.) from Madhya Pradesh, India by random amplified polymorphic DNA. African Journal of Biotechnology 8: 3135–3140.

Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Van de Lee, T.; Hornes, M. & Zabeau, M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407–4414.

ANNEXOS:

1. Representacions del PCoA obtingut amb Ginkgo (De Cáceres et al., 2003)

2. Cladograma obtingut amb UPGMA mitjançant NTSYSpc v.2.02j (Rohlf, 1997)

3. Fitxa per a Asparagus nesiotes subsp . nesiotes a Martin et al. (2008)

Annex 1:

Representació del PCoA per a les variables 1 i 2

Representació del PCoA per a les variables 1 i 3

A001 A123 A097 A002 A007 A031 A074 A141 A048 A112 A006 A083n A009 A126 A096 A051 A063 A107 A138 A116 A004 A079n A093 A139 A131 A095n A115 A078n A003 A086 A022 A005 A053 A057 A010 A035 A140 A060 A021 A094 A065 A067 A011 A089 A134 A013 A082 A104 A129 A105 A106 A108 A125 A120 A136 A071 A109 A072 A121 A130 A084 A085 A119 A058 A044 A073 A049 A111 A062 A066 A132 A114 A113 A008 A033 A027 A101 A028 A064 A088 A061n A137 A017 A025 A124 A030 A032 A024 A117 A036 A081n A092 A075n 0.80 0.84 0.88 0.92 0.96 Coefficient A n e x 2 216 Asparagus nesiotes Autor Factores y riesgos naturales que pueden agravar su situación Hábitat Factores limitantes de la especie para la recuperación Factores limitantes para a recuperação da espécie Factores que podem e agravar riscos naturais a sua situação Distribución Tendencia poblacional Tamaño poblacional(individuos) genéticaSingularidad Tendência populacional Evolução populacional Tamanho (indivíduos) populacional Singularidade genética Distribuição mundial mundialDistribución Evolución poblacional taxa crescimento de red habitat de populacional. Superfície gené empobrecimento ou endogamia de Processos duos. subpopu de Isolamentopopulacional. densidade Baixa crecimiento de tasa hábitat de reduc poblacional. Super cie Baja genético. empobrecimiento o endogamia de Procesos duos. Matos termo-mediterrânicos pré-desérticos. Matorrales termomediterráneos pre-desérticos. endémicaSubespécie Selvagem da Pequena. Salvaje Pequeña. de endémica Subespecie Baja densidad poblacional. Aislamiento de subpoblaci de Aislamiento poblacional. densidad Baja Secas. Tempestades vendavais. e Sequías. Tempestades yvendavales. R.Jardim, F. Fernandes &J.A.Carvalho Habitat lHer aPlaL oeaTnrf rnCnraFuerteventur Gran Canaria Tenerife La Gomera La Palma El Hierro Distribuição División Clase Svent. subsp. Divisão Classe Liliopsida Spermatophyta nesiotes lações/indiví- ones/indivi- Área distrib.: Área distrib.: Tamaño: Endemismo insular Endemismo insular Endemismo daMadeira Endemismo de Madeira Tamaño: tico. Baixa tico. uzida. < 50 ida. Estable Estable Estable Estable Estatus de protección Estudios einvestigaciones Estudos e investigação Acções de propostas conservação Acciones de conservación propuestasAcciones de conservación Tamanho: Tamanho: Convenção - de Berna: Convenio - deBerna: Directiva - Habitats: Directiva Hábitat: - Ecologia. e Biologia Genética. Dinâmica populações. de poblaciones. de ecología. y Biología Dinámica Genética. habitat.do (Re)introdução novas de (sub)populações. Manutençãoconsciencializaçãosocial. de Campanhas del hábitat. (Re)introducción denuevas (sub)poblaciones. Campañas deconcienciación social. Mantenimiento yconservación 50-250 Área distrib.:Área Área distrib.:Área Estável Estável Estável Estável Familia Orden Estatuto deEstatuto protecção 250 -1.000 Família Ordem Lanzarote a Liliaceae Liliales > 1.000 e conservação e

CANARIAS