UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
“ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS Y SEMILLAS DE Manilkara bindetata subesp. surimanensis (Miq), T.D.Penn “
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICA Y FARMACÉUTICA
AUTORES:
Diana Maricela Castro Jara
Johana Guadalupe Coronel Nivelo
TUTORA: PhD. Migdalia Miranda Martínez
COTUTORA: MsC. Katherine Bustamante Pesantes
GUAYAQUIL- ECUADOR 2016 i ii iii iv
AGRADECIMIENTO
Mi agradecimiento infinito para Dios todopoderoso, sin él mis anhelos no estarían plasmados en realidad en este momento, mi familia el pilar principal de esta sociedad y en especial a mi madre el ser más bondadoso y fiel del amor, mis hermanas por su apoyo constante y sacrificio sin esperar nada a cambio; por enseñarme que las cosas con constancia y perseverancia se logran culminar, y que nada es fácil en esta vida, y no importa el sacrificio que representa alcanzar un objetivo, gracias por estar siempre a mi lado y creer en mí. A mi tutora Dra. Migdalia Miranda, por su apoyo incondicional haciendo notar siempre mis errores y fortaleciéndome mis aptitudes, rescatando con su aliento mi desenvolvimiento como profesional capaz de resolver situaciones que se presente en el camino.
Diana Maricela Castro Jara
Agradezco primeramente a Dios nuestro padre, ya que sin él nada sería posible, quien con su infinito amor me ha bendecido con sabiduría y entendimiento para conseguir el objetivo. A mis padres Henry y Lourdes, que han sido instrumentos de fortaleza, amor que gracias a sus consejos, apoyo que me han brindado sin esperar nada a cambio, tan solo con el objetivo de convertirme en profesional de éxito. A mi esposo Victor por comprenderme y por su apoyo brindado. A mi tutora Lic. Migdalia Miranda, por sus valiosos aportes, apoyo y orientación para la culminación de nuestro trabajo.
Johana Guadalupe Coronel Nivelo v
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN...... 1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...... 2
PROBLEMA ...... 2
HIPÓTESIS ...... 2
OBJETIVO GENERAL ...... 2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 2
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...... 3
I.1 FAMILIA SAPOTÁCEA. GENERALIDADES ...... 3
I.1.1 Clasificación...... 3
I.1.2 Géneros importantes...... 4
I.1.3 Relaciones filogenéticas ...... 4
I.1.4 Sinónimos...... 4
I.1.5 Distribución geográfica...... 4
I.1.6 Hábitat ...... 4
I.1.7 Usos más importantes ...... 5
I.2 ESPECIE Manilkara bindetata subesp. surimanensis (Miq), T.D.Penn...... 5
I.2.1 Aspecto generales...... 5
I.2.2 Taxonomía...... 7
1.2.3 Usos tradicionales...... 9
1.2.4 Composición química...... 10
1.2.5 Actividad Farmacológica...... 12
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 15
II.1 RECOLECCIÓN, SELECCIÓN Y SECADO DEL MATERIAL...... 15
II.2 CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE ...... 15
II.2.1 Evaluación macromorfológica de hojas y semillas ...... 15
II.2.2 Evaluación micromorfológica de hojas...... 16
II.3 ALMACENAMIENTO...... 17 vi
II.4 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS ...... 17
II.4.1 Humedad residual...... 17
II.4.2 Cenizas totales ...... 18
II.4.3 Sustancias solubles ...... 19
II.5 IDENTIFICACIÓN DE LOS METABOLITOS POR TAMIZAJE QUÍMICO...... 19
II.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA ...... 20
II.7 EXTRACCIÓN, SAPONIFICACIÓN Y ANÁLISIS DEL ACEITE DE LAS SEMILLAS...... 20
II.7.1 Extracción...... 20
II.7.2 Saponificación ...... 21
II.7.3 Reacción de metilación...... 21
II.7.4 Análisis por el sistema acoplado Cromatografía gaseosa-Espectrometría de masas (CG-EM)...... 21
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 23
III.1 EVALUACIÓN MACROMORFOLÓGICA DE HOJAS Y SEMILLAS...... 23
III.2 EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA DE HOJAS ...... 28
III. 3 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS ...... 29
III.4 EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DEL ACEITE DE LA SEMILLAS...... 32
IV. CONCLUSIONES...... 38
V. RECOMENDACIONES ...... 39
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 40
ANEXOS ...... 49 vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
FIGURA 1. Madera y látex de M. bidentata...... 6 FIGURA 2. Órganos de la especie Manilkara bidentata. A) Hojas, B) Flores, C)...... 6 FIGURA 3. Fruto y semilla de M. bidentata...... 7 FIGURA 4. Estudio macromorgológico de las hojas...... 23 FIGURA 5. Histograma del ancho de las hojas ...... 24 FIGURA 6 . Estudio macromorfológico de frutos y semillas: A) fruto maduro, B) Fruto verde, C) Semillas frutos maduros con tegumento, D) Semillas frutos verdes con tegumento, E) Endospermos semillas madura, F) Endospermos semillas verdes...... 26 FIGURA 7. Detalles micromorfológicos del nervio central de Manilkara bidentata ssp. surimanensis. EAD: Epidermis adaxial; PL: Parénquima lagunar; HC: Haces conductores; EAB; Epidermis abaxial; CU: Cutícula...... 28 FIGURA 8. Secciones ampliadas de los detalles micromorfológicos de Manilkara bidentata ssp. surimanensis. A: Parénquima lagunar; B: Cristales de oxalato de calcio; c: Haces conductores. CU: Cutícula; EAD: Epidermis adaxial; PL: Parénquima lagunar; COX: Cristales de oxalato de calcio; HC: Haces conductores ...... 29 FIGURA 9. Cromatografía en capa delgada de los extractos del tamizaje fitoquímico...... 31 FIGURA 10. Cromatogramas gaseosos analíticos de la fracción de ácidos grasos del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. Surimanensis ...... 33 FIGURA 11. Cromatogramas gaseosos analíticos de la fracción de compuestos insaponificables del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis...... 35 viii
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
TABLA I. Taxonomía...... 8 TABLA II. Dimensiones de las hojas...... 23 TABLA III. Análisis estadístico de los parámetros macromorfológicos de las semillas del fruto de M. bidentata. ssp surimanensis ...... 27 TABLA IV. Parámetros físico-químicos de las hojas de Manilkara bidentata ssp. surimanensis...... 30 TABLA V. Tamizaje fitoquímico de las hojas de Manilkara bidentata ssp. surimanensis...... 30 TABLA VI. Rendimiento en aceite fijo del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis...... 32 TABLA VII. Componentes identificados en la fracción de ácidos grasos del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis...... 34 TABLA VIII. Componentes identificados en la fracción de compuestos insaponificables del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis...... 37 ix
ABSTRACT
The balatá, ácana, ausubo (Manilkara bidentata), is a botanical species of the genus Manilkara pertaining to the Sapotaceaes, native of a great area of the north of South America, Central America and the Caribbean. Two varieties are reported from this species: Manilkara bidentata subsp. bidentata and Manilkara surinamensis (Miq.) T.D.Penn, which is the objective of this work in which the pharmacognostic and phytochemical study of leaves and seeds was carried out. The results of this work allowed to report for the first time some macromorphological characteristics of the seeds and the micromorphological characteristics of the leaves. The physicochemical parameters of the leaves of the species were determined, which correspond to those established for plant drugs. For the qualitative chemical composition through phytochemical screening were found fatty compounds, phenolic compounds and terpenoids as the fundamental components, these groups of compounds have been identified for other species of the genus. The saponifiable and unsaponifiable fractions of the oil of the endosperm of the seeds were characterized, with differences in the chemical composition attributable to the maturation process, which were also reflected in the macromorphological characteristics. As a fundamental component of the fatty acid fraction, 10-octadecenoic acid and the fraction of compounds unsaponifiable to methyl eugenol and α and β-amirines were found. x
RESUMEN
La balatá, ácana, ausubo (Manilkara bidentata), es una especie botánica del género Manilkara perteneciente a las Sapotaceaes, nativa de una gran área del norte de Sudamérica, América Central y el Caribe. De esta especie se informan dos variedades: Manilkara bidentata subsp. Bidentata y Manilkara surinamensis (Miq.) T.D.Penn, la cual es el objetivo de este trabajo en el cual se realizó el estudio farmacognóstico y fitoquímico de las hojas y las semillas. Los resultados de este trabajo permitieron informar por primera vez algunos caracteres macromorfológicos de las semillas y las características micromorfológicas de las hojas. Se determinaron los parámetros físico-químicos de las hojas de la especie, los cuales responden a los establecidos para las drogas vegetales. Para la composición química cualitativa a través de Tamizaje Fitoquímico se encontraron los compuestos grasos, los compuestos fenólicos y los terpenoides como los componentes fundamentales, estos grupos de compuestos se han identificado para otras especies del género. Se caracterizaron las fracciones saponificables e insaponificables del aceite del endospermo de las semillas, encontrándose diferencias en la composición química atribuibles al proceso de maduración, las cuales se reflejaron también en las características macromorfológicas. Como componente fundamental de la fracción de ácidos grasos se encontró al Ácido 10-octadecenoico y de la fracción de compuestos insaponificables al metil-eugenol y a la α y β-amirinas. INTRODUCCIÓN
Las virtudes curativas del reino vegetal han sido, desde los tiempos más remotos, altamente celebradas y ventajosamente aprovechadas en beneficio del bienestar de la doliente humanidad, siendo muchos hombres los que han dedicado y todavía dedican sus esfuerzos, al descubrimiento y estudio de las propiedades de las plantas en general y de las curativas en particular (Lifchitz, 2006).
A lo largo de la historia el hombre se ha beneficiado de las plantas medicinales, siendo este el único recurso del que disponían los médicos en la antigüedad. Con el desarrollo de la química y el descubrimiento de complicados procesos de síntesis orgánica, surgieron nuevos fármacos capaces de luchar contra enfermedades incurables hasta entonces; no obstante siguieron obteniéndose de las plantas valiosas sustancias, que eran irremplazables y de esta forma la fitoterapia mantenía viva su tradición (Cañigueral, 2002).
La OMS impulsa a los países a identificar y aprovechar las plantas que proporcionan remedios o prácticas inocuas y eficaces para el uso en la atención primaria de salud. En algunos países, la medicina tradicional forma parte integrante del sistema sanitario oficial, en pie de igualdad con la medicina moderna. La base de la medicina tradicional se encuentra en el empleo de las plantas medicinales (WHO, 2000, 2014).
Manilkara es un género que se cultiva en zonas tropicales y subtropicales que pertenece a la familia de Sapotácea. Las especies más conocidas de este género son: M zapota o M. chicle (ácana, chicle) y la Manilkara bindetata (balatá), estas especies son ampliamente utilizadas por su gran producción de látex que se empleaba en las industrias de alimentos en las gomas de mascar, el fruto tiene gran aporte nutricional (Rivera Martín y col., 2013).
1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
M. bidentata subsp. surimanensis (Miq), T.D. Penn, es una especie que carece de estudios Farmacognósticos y Fitoquímico y, en consecuencia no se han establecido los parámetros de calidad como droga vegetal, ni existen antecedentes sobre su composición química.
PROBLEMA ¿La especie Manilkara bidentata subsp surimanensis presentará composición y propiedades de importancia farmacognóstica como otras especies del género?
HIPOTESIS La evaluación farmacognóstica y fitoquímica de las hojas y semilla de Manilkara bidentata subsp. surimanensis (Miq), T.D.Penn, permitirán establecer los parámetros de calidad de la planta.
OBJETIVO GENERAL Establecer las características farmacognósticas y fitoquímicas de las hojas y las semillas de Manilkara bidentata subsp. surimanensis (Miq), T.D.Penn.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Caracterizar macromorfológicamente las hojas y semillas y micromorfologicamente las hojas de M. bidentata ssp surimanensis. Determinar los parámetros físico-químicos de las hojas de la especie, que permitan establecer sus parámetros de calidad como droga vegetal. Informar la composición química cualitativa de las hojas a través de Tamizaje Fitoquímico Estudiar el aceite de las semillas empleando el método de Soxhlet con hexano como disolvente para su extracción y la CG-EM para su caracterización.
2 CAPíTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.1 FAMILIA SAPOTÁCEA. GENERALIDADES
La familia Sapotáceae son plantas arbóreas de hojas enteras, con o sin estipulas, de disposición alterna. Flores pequeñas, no vistosas, de simetría radial, hermafroditas, cíclicas, diclamídeas. Sépalos en número de 4 a 8 y en dos verticilos, soldados en la base. Corola con 4 a 8 pétalos soldados. Androceo formado por 8 o 10 estambres en dos verticilos, todos fértiles o un verticilo estaminodial. Ovario súpero con 4 a 12 carpelos y otros tantos lóculos, y en cada lóculo sólo un óvulo. Fruto carnoso, a veces con cáscara coriácea (AFPD, 2008).
Morfológicamente es característico de esta familia y la presencia de conductos galactóforos, responsable de la conducción de látex. La especie no suele tener estípulas (Correa y col., 2004).
I.1.1 Clasificación
Su clasificación sigue siendo confusa. Inicialmente, el árbol filogenético, Sapotaceae aparecía relacionada a la familia Ebenaceae. Sin embargo, con los años y después de muchas pruebas, incluyendo secuencias de ADN, Sapotaceae se insertó en el árbol filogenético en otro lugar, esta vez en relación con Lecythidaceae (Liogier, 2000).
También resulta incierta la cantidad de géneros y especies descritas. Las cantidades varían de acuerdo con lo que diversos autores describen. El más utilizado (o más aceptada) es actualmente el nombre de Pennington, que distribuye a esta familia en 53 géneros y 1.100 especie (Liogier, 2000).
3 I.1.2 Géneros importantes.
Pouteria (325), Palaquium (110), Madhuca (100), Manilkara (80), Sidero xylon (75), Chrysophyllum (70), y Mimusops (50) (Liogier, 2000; Funk y col., 2007).
I.1.3 Relaciones filogenéticas
Sapotaceae pertenece al orden Ericales, algunas de las sinapomorfías del orden son: nudos 1:1; hojas en espiral, dientes con una vena simple y una tapa opaca decidua. Sapotaceae es hermana de las familias Ebenaceae y Primulaceae, una de las sinapomorfías compartidas es: óvulos apótropos (Liogier, 2000).
I.1.4 Sinónimos
Achradaceae, Boerlagellaceae, Bumeliaceae, Sarcospermataceae (Liogier, 2000).
I.1.5 Distribución geográfica
Pantropical, con especies distribuidas más o menos equitativamente entre América, África y Asia. La mayor riqueza de especies se da en una amplia franja desde Guayana a través del Brasil amazónico, el Perú amazónico, Ecuador y Colombia (Hokche y col., 2008)
I.1.6 Hábitat
Son típicamente especies de selvas tropicales de tierras bajas, por debajo de los 1000 metros (Rivera Martín y col., 2013).
4 I.1.7 Usos más importantes
Muchas de sus spp., producen fruta comestible, y/o de otros usos económicos. Las spp. más conocidas por su fruta comestible son: Manilkara zapota (sapodilla, sapota), Manilkara chicle (chicle), Chrysophyllum cainito (manzana estelar), Pouteria caimito (caimito), Pouteria campechiana, Pouteria sapota, Vitellaria paradoxa y Sideroxylon australe (Rivera Martín y col., 2013).
Los árboles del género Palaquium (Gutapercha) produce un importante látex con muchos usos (Rivera Martín y col., 2013).
Las semillas del árbol Argania spinosa (L.) Skeels produce un aceite comestible aceite de Argán, tradicionalmente cosechado en Marruecos (Rivera Martín y col., 2013).
En el género Manilkara se da atención especial a la producción de maderas duras (Rivera Martín y col., 2013).
I.2 ESPECIE Manilkara bindetata subesp. surimanensis (Miq), T.D.Penn.
I.2.1 Aspectos generales.
La balatá, ácana , ausubo (Manilkara bidentata), es una especie botánica del género Manilkara perteneciente a las Sapotaceaes. Es nativa de una gran área del norte de Sudamérica, América Central y el Caribe (Funk y col., 2007).
5 Produce látex en su savia. Los habitantes de Guyana, llaman a su madera corazón púrpura (fig. 1).
Figura 1. Madera y látex de M. bidentata (Funk y col., 2007)
Es un árbol grande, que alcanza 30-45 m de altura. Las hojas son alternas, elípticas, enteras, de 1-2 dm de longitud. Las flores son blancas, y se encuentran al comenzar la estación de las lluvias (fig. 2).
Figura 2. Órganos de la especie Manilkara bidentata. a) Hojas, b) flores, c) tronco (Rivera Martín y col., 2013)
6 El fruto es una drupa amarilla, de 3-5 cm de diámetro, comestible; que contiene una u, ocasionalmente dos semillas (fig. 3).
Figura 3. Fruto y semilla de M. bidentata (Funk y col., 2007; AFPD, 2008; Hokche y col., 2008)
I.2.2 Taxonomía
Manilkara bidentata fue descrita por (A.DC.) A. Chev y publicado en 1932 en el Revue de Botanique Appliquée et d'Agriculture Tropicale. Se encuentra también como un espécimen de herbario en el Royal Botanic Garden, identificada bajo los nombres de Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. subsp. surinamensis (Miq.) T.D.Penn. (Familia Sapotácea) y de Mimusops surinamensis Miq. [Familia Sapotácea) (AFPD. 2008)
Variedades aceptadas
Manilkara bidentata subsp. bidentata
Manilkara bidentata subsp. surinamensis (Miq.) T.D.Penn.
Sinonimia
Mimusops bidentata A.DC. basónimo
Mimusops surinamensis Miq.
7 Tabla I. Taxonomía
Manilkara bidentata surinamensis
Reino: Plantae
Subreino: Euphyllophytina
División: Radiatopses
Subclase: Magnoliidae
Suborden: Asteranae
Orden: Ericales
Familia: Sapotaceae
Tribu: Mimusopeae
Subtribu: Manilkarinae
Género: Manilkara
Especie: M. bidentata
Subespecie: surinamensis
Nombre binomial
Manilkara bidentata surinamensis (Miq.) T.D. Penn.
GBI, (2011)
8 1.2.3 Usos tradicionales
Para Manilkara bidentata subsp. surinamensis (Miq.) T.D. Penn o su basónimo Mimusops surinamensis Miq., no se informan en la literatura usos medicinales.
Su látex se extrae de la misma forma como se hace con la savia de otros árboles, por incisión del tronco. Luego, el látex extraído se seca, formando una goma inelástica. Se lo usa para producir la cobertura de pelotas de golf (Rivera Martín y col., 2013).
Tiene madera dura, roja, para mueblería, y material de la construcción. Es tan densa que no flota en el agua. Para clavar es necesario perforar antes un orificio, por donde va a pasar el clavo (Rivera Martín y col., 2013).
El fruto, parecido al de su pariente sapodilla (Manilkara zapota), es comestible, con excelente sabor (Rivera Martín y col., 2013).
Sin embargo, para otras especies del género se informan diversos usos medicinales para diferentes órganos, entre los que se citan:
La corteza se utiliza para el resfriado, como tónico cardiovascular, estomacal, antihelmíntico, para trastornos biliares y enfermedades de las encías y los dientes. Las flores se consideran astringentes, en uso interno se utilizan para la cura de enfermedades de la sangre, bilis e hígado, el humo de las flores en incienso se le considera bueno para el asma. La fruta es astringente para el intestino aunque causa flatulencia. Las semillas sueltas se utilizan para curar problemas en la cabeza. La raíz se emplea como afrodisíaco, diurético y astringente (Kadam y col., 2012).
9 1.2.4 Composición química
De la especie objeto de estudio, no se ha encontrado información acerca de su composición química, sólo se refiere la presencia de látex, en la cual los politerpenoides son los compuestos abundantes. Esto sugiere que ha sido poco estudiada, ya que para otras especies de la familia Sapotacea y del género se han encontrado diferentes estudios (Moustafa y col., 2016).
Para Manilkara zapota: se han identificado en sus hojas compuestos fenólicos tales como: miricetin-3-O-α-Lrhaminopiranosido, apigenina-7-O-α-L- rhamnopiranosido y ácido cafeico, además de los ácidos grasos oleico, linoleico, linolénico y los triterpenoides acetato de lupeol y ácido oleanólico (Fayek y col., 2012; Parle Milind y Preeti, 2015).
En los frutos se ha informado los compuestos fenólicos quercetrina, (+)- catequina, (-) -epicatequina, (+)-gallocatequina, ácido gálico, dihidromiricetina, metilclorogenato, metil-4-O-galoil clorogenato y ácido 4-O-galoilclorogenico, (Ma y col., 2003); Leucodelfinidina, Leucocianidina y Leucoperalgonidina (Miland y Pretti, 2015); mientras que el D-quercitol fue informado en semillas y hojas (Rao y col., 2014). También para los frutos (Fayek y col 2013) han informado la presencia de β-amirina, 3-(3´-dimetil)-butirato, lupeol 3-acetato y ácido cafeil- quínico.
(Fernández y col., 2013), han informado para la especie Manilkara subceracea, ácido hexadecanoico, ácido hexadecanoico etiléster, 9- octadecenoico etiléster y octadecanoico etiléster, β-amirina caproato y caprilato y α-amirina acetato.
10 (Rhourri-Frih y col., 2013), han identificado de la resina de M. bidentata al 3β—O-acetil-α-amirina, el 3β-O-trans cinamil α-amirina y al 3β-O-trans –cinamil- lupeol.
Para el género Mimusops y en particular para la especie M. elengi, se han informado diferentes compuestos. (Jahann y col., 2001), aislaron de la corteza del tallo: Taraxerona, taraxerol, ácido betulínico y espinasterol, sal de sodio de ácido betulínico y ácido ursólico, ésteres de ácidos grasos de alfa-espinasterol. También aislaron un nuevo triterpeno, el 3β-hidroxi-LUP-20 (29)-en-23, ácido 28- dioico, amirina beta, lupeol. (Akhtar y col., 2009), aislaron un nuevo farnanetipo de triterpeno pentacíclico, Farnan-2-ona-3 betaol (Mimusopfarnanol), junto con los triterpenoides conocidos, Farnan-3-ona, y olean-18-en-2-ona-3-ol y lup-20 (29) -en-3 beta-ol. Estos autores informaron también la presencia de nuevos ésteres del ácido gálico, caracterizados como galato de propilo fenilo (Akhtar et al., 2010). La destilación de vapor de la corteza arrojó 0,18 % de materia orgánica volátil; los principales constituyentes fueron α-cadinol, taumuurolol, ácido hexadecanoico, diisobutil ftalato y ácido octadecadienoico (Ruikar y col., 2009).
Los frutos y semillas de bakula (Mimusops elengi), mostraron después de la saponificación, presencia de quercitol, ácido ursólico, dihidro quercetina, quercetina, βd - glicósidos de sitosterol y α-espinasterol. Se aislaron dos nuevos ácidos triterpénicos pentacíclicos los ácido mimusops y mimusopsic, los cuales poseen un nuevo esqueleto oleanano.y mimusopano, mimugenona y los triterpenos pentacíclicos 3β, 6β, 19α, 23- tetrahidroxi-urs-12-eno y 1 β-hidroxi-3β- hexanoillup-20 (29) -eno-23-ácido 28-dioico. También se han aislados dos nuevas saponinas de las semillas junto con dos saponinas triterpenoides conocidas, además de taxofolina y otros glicósidos triterpénicos. (Kadam y col., 2012)
11 También se ha informado que la fruta contiene una humedad de 79,27%, proteínas (1,29%), grasa (2,76 kcal), azúcar reductor (8,9%), azúcar no reductor (6,3%), Azúcar total (15,2%), fibra (1,13%), Vitamina C (3,27 mg / 100 g), contenido en minerales (0,32%), hierro (0,59 mg / 100 g) , Sodio (5,16 mg / 100 g) , potasio (98,54 mg / 100 g) (Nazarudeen, 2010)
De las hojas, las raíces y el duramen se aislaron hentriacontano, caroteno y lupeol una nueva saponina esteroide 5-α-stigmast 9 (11) en-3-O-β- D- glucopiranosil (1-5) –O-β-D-xylofuranosido fue aislada de las raíces (Kadam y col., 2012).
Como se aprecia, los compuestos más abundantes en el género son los compuestos fenólicos, los terpénicos y los ácidos grasos.
1.2.5 Actividad Farmacológica
A algunas especies del género Manilkara se les han realizado estudios farmacológicos donde se demuestran algunas de los usos tradicionales que le atribuye la población.
Para M. subcericea, (Fernández y col., 2013 a), encontraron que los extractos de los frutos presentaban actividad antimicrobiana frente a S. aureus, además de presentar baja toxicidad frente a células vero. En otro trabajo de la misma especie, estos autores informan potente acción inhibidora del crecimiento de plagas de cultivo (Fernández y col., 2013 b).
(Rhourri-Frih y col., 2013), han reportado actividad antiinflamatoria para la resina de M. bidentata.
12 Para M. zapota se han realizado diversos estudios farmacológicos. (Osman y col., 2011) y (Sakala y col., 2013), informaron que las raíces, hojas y corteza, presentaban un amplio espectro en la actividad antimicrobiana. (Fayek y col., 2012 y 2013) y (Saradha y col., 2014), informaron actividad hipoglucemiante, hipolipemiante y antioxidante para los extractos de las hojas y de los frutos.
(Awasare y col., 2012), encontraron actividad citotóxica in vitro para una nueva saponina aislada de la corteza, mientras (Rashid y col., 2014), encontraron actividad antitumoral sobre el carcinoma de Erlich en ratones también para extractos de corteza de M. zapota.
La actividad antiinflamatoria, antipirética y analgésica fue informada para diferentes extractos de las hojas de M. zapota (Jain y col, 2011; Hossain y col, 2012; Ganguly y col, 2013; Manirujjaman y col, 2014). Otras actividades farmacológicas demostradas han sido: hepatoprotectora de hojas y corteza (Islam y col, 2010 y 2012) y antidiarreica de extractos metanólicos de las hojas (Manirujjaman y col, 2013)
Para la especie Mimusops elengi, se han informado diferentes actividades farmacológicas que están en dependencia de la parte de la planta estudiada; entre ellas se citan: Actividad antihelmíntica (hojas) (Jana y col., 2011); actividad analgésica, antiinflamatoria y antipirética (hojas y corteza), (Purnima y col., 2010; Karmakar y col., 2011; Rajkumara y col., 2012); actividad hipolipemiante (corteza) (Ghaisas y col., 2008); actividad ansiolítica (corteza), (Ganu y col., 2011); actividad antioxidante (hojas, corteza y fruto) (Saha y col., 2008; Boonyuen y col., 2009; Ganu y col., 2010; Rao y col., 2011; Shaik y col., 2011); actividad antiurolítica (corteza), (Ashok y col., 2010); actividad antiulcerosa (corteza) (Shah y col., 2003; Prakash y col., 2011); actividad antiateroesclerosis
13 (hojas) (Satishchandra, 2011) y actividad antimicrobiana sobre microorganismos de la cavidad bucal (corteza) (Jebashree y col., 2011), donde se observa que el mayor número de actividades farmacológicas se ha encontrado en la corteza del tronco.
Para la especie Mimusops balata, (Schlickmann y col., 2015), han informado actividad gastroprotectora de los frutos.
14 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1 RECOLECCIÓN, SELECCIÓN Y SECADO DEL MATERIAL
La especie vegetal utilizada fue hojas y frutos de Manilkara surimanensis, la cual fue recolectada, en una zona de vegetación natural “Jardín Botánico” de la Ciudad de Guayaquil, Ecuador, el 24 de febrero de 2016, en horas de la mañana. La especie vegetal se encontraba en estado de floración. La identificación botánica fue realizada por el Herbario Guay, Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil, Ecuador.
Los órganos recolectados hojas y frutos, fueron previamente lavados con agua corriente y secados a temperatura ambiente durante 15 días. Las hojas fueron trituradas con la ayuda de una batidora doméstica marca Oster, de los frutos fueron extraídas las semillas, las cuales se clasificaron en semillas de frutos verdes y maduras, según las características de los frutos. A éstas se les retiró la cáscara, o corteza externa con ayuda de un mortero, obteniendo el endospermo de cada uno de forma separada.
II.2 CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE
II.2.1 Evaluación macromorfológica de hojas y semillas
La descripción macromorfológica de hojas y semillas de la especie se realizó a simple vista. (Miranda y Cuellar 2000)
Se estudiaron 50 hojas del lote recolectado, de las cuales se analizó color, superficie (haz y envés), forma del limbo, borde, ápice, base, venación y consistencia. Se determinó las dimensiones (largo y ancho), lo cual se realizó con la ayuda de un pie de rey; se calculó la media, desviación estándar y coeficiente de variación.
15 Se evaluaron 50 semillas se determinaron sus caracteres morfológicos (forma, dimensión y peso).
II.2.2 Evaluación micromorfológica de hojas
Para el estudio micromorfológico, se llevó a cabo la inclusión en parafina, para lo cual se empleó la metodología descrita por Miranda y Cuellar (2000).
Se realizaron cortes pequeños de las hojas, por el nervio medio de las mismas. Los pequeños cortes se sometieron a deshidratación con etanol al 45%, 60%, 75%, 98% por 48 horas en cada uno a temperatura ambiente, finalmente se depositó durante 48 horas en el reactivo intermediario (hexano). Una vez realizada la deshidratación, las muestras se depositaron en parafina en la estufa Memmert, a 60° C durante 2 horas, posteriormente se prepararon las láminas de Leuchart, se agregó la parafina en los moldes y se colocó la muestra, esperando su solidificación.
Para el análisis histológico se realizaron cortes trasversales. Los cortes se efectuaron en un micrótomo, se desparafinaron y después fueron hidratados y aclarados con hipoclorito de sodio. Los mismos se colorearon con safranina al 1 %, se fijaron con gelatina glicerinada, según los procedimientos descritos por (Gattuso y Gattuso 1999) y (Khandelwal 2004)
Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal se empleó un microscopio Nikon Alphaphot-2 con cámara de video a color TK- C1380 JVC modelo TK-C1380U.
16 II.3 ALMACENAMIENTO
Una vez secadas y trituradas las hojas, el material vegetal se almacenó en fundas de polietileno a temperatura ambiente, para su posterior análisis.
Las semillas desprovistas de corteza se guardaron en refrigeración hasta su posterior análisis
II.4 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
Los ensayos se realizaron siguiendo la metodología descrita por Miranda y Cuellar (2000).
Humedad residual Sustancias solubles Cenizas totales Tamizaje fitoquímico
II.4.1 Humedad residual
Se empleó el método gravimétrico, las determinaciones se hicieron por triplicado a partir de 2 g de muestra, se utilizó una estufa a 105o C marca Memmert y para las pesadas una balanza analítica marca Kern Modelo: ABS- 220-4
Expresión de los resultados.
M2 − M1 Hg: x 100 M2 − M
17 Dónde:
Hg: Pérdida en peso por desecación
M2: masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)
M1: masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g)
M: masa de la cápsula vacía
100: factor matemático para cálculo
II.4.2 Cenizas totales
Para el análisis se empleó una mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E por 2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4. Cada determinación fue realizada por triplicado a partir de 2 g de muestra, se utilizó ácido nítrico hasta obtener cenizas blancas.
Expresión de los resultados.
M2 − M C: x 100 Dónde: M1 − M
C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
100: factor matemático para cálculo
18 II.4.3 Sustancias solubles
Este ensayo se determinó por triplicado, a partir de 5g de la droga. Los disolventes utilizados fueron agua y alcohol al 98 %.
Expresión de los resultados.
R. 500 x 100 Ss: Dónde: M(100 − H)
Ss: sustancias solubles (%)
H: humedad de la muestra (%)
500 y 100: factores matemáticos para los cálculos
R: residuo de la muestra (g)
M: masa de la muestra (g)
II.5 IDENTIFICACIÓN DE LOS METABOLITOS POR TAMIZAJE QUÍMICO
El tamizaje fitoquímico se realizó a las hojas secas, según procedimiento descrito por Miranda y Cuellar (2000).
Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad creciente, a partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo sucesivamente con éter di etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los extractos etéreo, alcohólico y acuoso, los cuales se sometieron a diferentes ensayos (anexos 1 y 2).
19 II.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
Se realizó a los extractos etéreo, alcohólico y acuoso obtenidos de la extracción sucesiva de las hojas. Se empleó una placa de 10x50 cm de sílica gel G, sobre soporte de aluminio.
El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente y se utilizó como fase móvil la mezcla de: Hexano-Cloroformo-Acetato de etilo-Metanol (10:5:5:2,5)
Como revelador se empleó luz ultravioleta con una longitud de onda de 254nm
II.7 EXTRACCIÓN, SAPONIFICACIÓN Y ANÁLISIS DEL ACEITE DE LAS SEMILLAS
II.7.1 Extracción
Se empleó el método de Soxhlet, se realizaron tres extracciones a partir de 30 g de muestra triturada, de semillas verdes y maduras de forma independiente. Éstas se agregaron en un cartucho de papel filtro y como disolvente se empleó éter de petróleo; el tiempo de extracción fue de 2 horas.
Una vez culminada la extracción, los extractos se destilaron en rotoevaporador, hasta eliminación total del disolvente. Los residuos se pesaron para calcular el rendimiento.
20 II.7.2 Saponificación
Los residuos sólidos se le añade de forma independiente, tres veces el peso en volumen de NaOH 1 N en etanol y se refluja durante 2 horas. Se deja enfriar, se añade igual volumen de agua destilada y se extrae tres veces con 25 mL de éter dietílico. Las fracciones etéreas reunidas se lavan con agua destilada hasta pH 7. El extracto etéreo se seca con sulfato de sodio anhidro y se rotula como fracción insaponificable de frutos maduros (FIFM) y de frutos verdes (FIFV).
Los extractos acuosos se ajustan hasta pH 3 con ácido clorhídrico concentrado y se extrae tres veces con 25 mL de éter dietílico. Las fracciones etéreas reunidas se lavan con agua destilada hasta pH 7, se seca con sulfato de sodio anhidro y se rotula como fracción de compuestos saponificables de frutos maduros (FSFM) y de frutos verdes (FSFV).
II.7.3 Reacción de metilación
Las fracciones saponificables (FSFV y FSFV), se sometieron a un proceso de metilación, como paso previo a la caracterización por CG-EM. Se utilizaron 50 µL de yoduro de metilo, 100 µL de acetona y 50 mg de carbonato de potasio, incubándose a 60° C por tres horas.
II.7.4 Análisis por el sistema acoplado Cromatografía gaseosa- Espectrometría de masas (CG-EM)
Las fracciones de los compuestos saponificables metilados y las insaponificables, se analizaron en un cromatógrafo de gases Agilent 6890 acoplado a espectrómetro de masas 5973N, las condiciones de trabajo fueron: columna Ultra 2 de 12 m x 0,20 mm x 0,33 µm, temperatura inicial: 60° C por 3
21 minutos incrementando 10° C/ min hasta 300° C por 5 min. Tiempo de corrida: 32 min. Espectrómetro de masas operado a 70 eV en modo full scan desde 50 hasta 600 unidades de masa. Temperatura de la fuente 230° C, temperatura del cuadrupolo 150° C. Temperatura del inyector: 280° C, volumen de inyección 2 µL con gas portador helio a 1 mL/min.
22 CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1 EVALUACIÓN MACROMORFOLÓGICA DE HOJAS Y SEMILLAS.
Las hojas presentaron forma obovada, de color verde oscuro por la haz y verde claro por el envés, con el borde entero, ápice obtuso, base aguda, peciolada y con la superficie lisa. Nerviación penninervia. No exhibía aroma (fig. 4). Las características observadas para la especie se corresponden con lo informado por Marcelo Peña, (2017).
Figura 4. Estudio macromorgológico de las hojas
Con respecto a las dimensiones de las hojas, los resultados se muestran en la tabla II. Se pudo observar que el valor promedio para el largo de las hojas era de 14,95 cm y el ancho de 7,67 cm.
Tabla II. Dimensiones de las hojas.
PARÁMETRO VALOR MEDIO DESVIACIÓN VARIANZA ESTÁNDAR LARGO cm 14,95 2,78 7,77 ANCHO cm 7,67 1,18 1,41
23 Para el largo y ancho de las hojas se realizaron los histogramas de frecuencia y los resultados representan en la (fig. 5).
Figura 5. Histograma del ancho de las hojas
24 Como se observa, la mayor frecuencia de valores se encontraron entre 14,6 -18,6 cm para el largo y 6,3 – 8,3 cm para el ancho, existiendo una gran dispersión para el tamaño de las hojas.
En el estudio macromorfológico se tuvieron en cuenta el peso, largo y ancho, de las semillas de los frutos verdes y maduros con tegumento y el largo y ancho del endospermo de las mismas (fig.6). Se realizó el análisis estadístico comparativo de estos parámetros y los resultados se exponen en la tabla III.
25 Figura 6 . Estudio macromorfológico de frutos y semillas: A) fruto maduro, B) fruto verde, C) semillas frutos maduros con tegumento, D) semillas frutos verdes con tegumento, E) endospermos semillas madura, F) endospermos semillas verdes.
26 Tabla III. Análisis estadístico de los parámetros macromorfológicos de las semillas del fruto de M. bidentata. ssp surimanensis
PARÁMETROS SEMILLAS CON TEGUMENTO PARÁMETROS SEMILLAS SIN TEGUMENTO ESTADÍSTICOS PESO DIÁMETRO ANCHO DIÁMETRO ANCHO SV SM SV SM SV SM SV SM SV SM MEDIA 1,18 a 1,09 b 1,88 c 1,83 d 1,22 e 1,17 f 1,17 g 1,35 h 0,87 i 0,77 j
DESV. 0,25 0,18 0,08 0,10 0,11 0,07 0,09 0,07 0,09 0,09 ESTÁNDAR VARIANZA 0,18 0,36 0,00 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Leyenda: Letras diferentes indican diferencias significativas de cada parámetro para p<0,0
Como se observa, se encontraron diferencias significativas entre las semillas verdes y maduras, para todos los parámetros evaluados.
27 III.2 EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA DE HOJAS
En el corte transversal de la hoja (fig. 7), se pudo observar una forma muy peculiar del nervio central donde la superficie adaxial de dicho nervio es profundamente ondulada y la abaxial con una gran protuberancia en el centro y hacia los laterales adopta una forma profundamente covexa. Se pudo apreciar una tenue cutícula (Cu), seguida de la epidermis adaxial (EAd) que está constituida por un estrato de células. Continua el parénquima lagunar (PL) formando como una especie de red, con gran cantidad de espacios intercelulares y le siguen dos hileras de haces conductores (Hc) relacionados con el xilema y floema en forma de paquetes. Hacia abajo se visualiza otra porción de parénquima lagunar, la epidermis abaxial (EAb) y la cutícula.
Figura 7. Detalles micromorfológicos del nervio central de Manilkara bidentata ssp. surimanensis. EAd: epidermis adaxial; PL: parénquima lagunar; Hc: haces conductores; EAb; epidermis abaxial; Cu: cutícula
Otras secciones ampliadas de los detalles micromorfológicos de la especie permitió apreciar (fig. 8 A) una mejor definición de las células epidérmicas (EAd)
28 formada por segmentos rectangulares y que las cubre una ligera cutícula (Cu). Lo notorio fue el hecho de encontrar un parénquima lagunar con gran cantidad de espacios de aire, separados por láminas de una sola célula, y formando segmentos sinusoides (Khandelwal, 2004). En la figura 8 B se visualizan gran cantidad de cristales, al parecer de oxalato de calcio, los cuales adoptan una forma de conglomerado variable. En la figura 8 C se muestra una ampliación de los haces conductores (Hc), formados por células redondeadas de diferentes tamaños.
A B C
Figura 8. Secciones ampliadas de los detalles micromorfológicos de Manilkara bidentata ssp. surimanensis. A: parénquima lagunar; B: cristales de oxalato de calcio; C: haces conductores. Cu: cutícula; EAd: epidermis adaxial; PL: parénquima lagunar; COx: cristales de oxalato de calcio; Hc: haces conductores
III. 3 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
A las hojas de la especie se le determinaron los parámetros físico-químicos de calidad. Estos fueron: humedad residual, cenizas totales y sustancias solubles en etanol al 90% y agua. Los resultados se muestran en la tabla IV.
Se observó valores de cenizas totales algo elevado, que sugieren un estudio más detallado para descartar la presencia de metales pesados. El
29 porcentaje de humedad residual estuvo en el rango aceptado (hasta 14 %) que responde a las características de las hojas. Los valores obtenidos para las sustancias solubles indican que el mayor porcentaje de metabolitos presentes en las hojas son de naturaleza medianamente polar lo que se demuestra en el porcentaje de sustancias solubles en alcohol, muy superior a las solubles en agua.
Tabla IV. Parámetros físico-químicos de las hojas de Manilkara bidentata ssp. surimanensis.
PARÁMETRO PORCENTAJE
HUMEDAD RESIDUAL (%) 12,82 CENIZAS TOTALES (%) 6,67
SUSTANCIAS SOLUBLES EN ETANOL 90% (%) 37,76 SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA (%) 3,3
El estudio de los parámetros de calidad se continuó con el tamizaje fitoquímico y los resultados se presentan en la tabla V.
Tabla V. Tamizaje fitoquímico de las hojas de Manilkara bidentata ssp. surimanensis.
Extracto Etéreo
Ensayo Metabolito Resultado Sudán Aceites y grasas + Lieberman Triterpenos-esteroides + Extracto Alcohólico Resinas Resinas +
Fe Cl3 Fenoles y Taninos + Shinoda Flavonoides + Catequinas Catequinas + Lieberman Triterpenos-esteroides +
30 Antocianidina Antocianidina + Espuma Saponina + Extracto Acuoso
Fe Cl3 Fenoles y taninos + Espuma Saponina + Shinoda Flavonoides +
A los extractos del tamizaje fitoquímico se les realizó la cromatografía en capa delgada y los resultados se presentan en la (fig. 9).
Figura 9. Cromatografía en capa delgada de los extractos del Tamizaje Fitoquímico.
En el extracto etéreo se observaron dos manchas intensas con valores Rf cercanos al frente del disolvente, que florecen a la luz UV. En los extractos alcohólicos y acuosos, no se observaron buenas resoluciones de las manchas.
31 Los resultados obtenidos son indicativos de la presencia de compuestos grasos, compuestos terpénicos y compuestos fenólicos, lo cual está en concordancia con lo informado para otras especies del género por Akhtar y col, (2009); Akhtar y col., (2010); Fayek y col., (2012) y Parle Milind y Preeti, (2015). Para la especie objeto de estudio, no existen antecedentes sobre estudios químicos, por lo que estos resultados se informan por primera vez.
III.4 EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DEL ACEITE DE LA SEMILLAS. A partir de los endospermos de las semillas del fruto verde y maduro, se obtuvieron los aceites fijos por el método de Soxhlet, empleando hexano como disolvente. Los rendimientos de los mismos se exponen en la tabla VI.
Tabla VI. Rendimiento en aceite fijo del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis.
FRUTOS VERDES 0,86 RENDIMIENTO DE ACEITE (%) FRUTOS MADUROS 1,25
Se pudo observar un mayor rendimiento en aceite fijo para los frutos maduros, aunque desde el punto de vista organoléptico no se apreciaron diferencias.
Los aceites obtenidos fueron sometidos a saponificación para separar la fracción de compuestos saponificables (ácidos grasos) de los compuestos insaponificables. Los ácidos grasos fueron metilados y analizados por el sistema acoplado cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (CG-EM). Los cromatogramas de esta fracción se presentan en la fig. 10.
32 Se pudo apreciar que existían algunas diferencias entre los perfiles cromatográficos de las fracciones de ácidos grasos de los frutos verdes y maduros, destacándose la ausencia de algunos picos cromatográficos en las zonas de tiempo de retención 16 a 18 minutos y de 25 a 26 min para los frutos maduros.
La asignación estructural de los compuestos presentes en la fracción se llevó a cabo por comparación de los espectros de masas obtenidos con los de la biblioteca del equipo, seleccionando aquellos que presentaron un factor de similitud mayor al 95%. Los resultados se presentan en la tabla VII.
FRUTOS VERDES
FRUTOS MADUROS
Figura 10. Cromatogramas gaseosos analíticos de la fracción de ácidos grasos del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. Surimanensis
33 Tabla VII. Componentes identificados en la fracción de ácidos grasos del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis
FRACCIÓN SAPONIFICABLE FRUTOS FRACCIÓN SAPONIFICABLE FRUTOS VERDES MADUROS % % Tr Tr No COMPUESTO ABUNDANCIA COMPUESTO ABUNDANCIA (min) (min) RELATIVA RELATIVA 1 16.75 Ácido nonanoico 0,84 Ácido 2 18.34 0,55 nonanodioico Ácido Ácido 3 22.59 22,33 22,56 27,00 hexadecanoico hexadecanoico Ácido 10- Ácido 10- 4 24.29 47,34 24,24 54,55 octadecenoico octadecenoico Ácido Ácido 5 24.48 7,03 24,46 10,84 octadecanoico octadecanoico 6 24.84 Etil-oleato 1,12 24.84 Etil-oleato 1,30 7 25.57 NI 1,95 8 25.78 NI 2,74 Ácido oxirano 9 25.82 octanoico-3-octil 1,61 cis Ácido oxirano 10 25.94 octanoico-3-octil 1,12 trans 11 26.02 NI 6,49 Ácido Ácido 12 26.21 0,83 26,20 1,24 eicosanoico eicosanoico 13 26.45 NI 1,51 Ácido 9- Ácido 9- octadecenoico-2- octadecenoico-2- 14 27.4 hidroxi-1 4,47 27,03 hidroxi-1 4,03 (hidroximetil)-etil- (hidroximetil)-etil- éster éster
Se observó que para ambas fracciones el componente mayoritario fue el Ácido 10-octadecenoico con un porcentaje de abundancia relativa de 54,55 para los frutos maduros y un 47,34 para los frutos verdes. Le siguió en abundancia el ácido hexadecanoico el cual presentó un porcentaje de 27,00 para los frutos maduros y un 22,33 para los frutos verdes. Nótese que en ambos casos hubo un incremento en la concentración con la maduración del fruto. Es de señalar que en la fracción de ácidos grasos de los frutos verdes pudieron asignársele estructura a 10 compuestos, de ellos cuatro no se
34 encontraron presentes en los frutos maduros, por lo que se pudo inferir que con la maduración existen pérdidas de algunos de los componentes de la fracción de los ácidos grasos.
Similar análisis se realizó para la fracción de compuestos insaponificables. Los cromatogramas gaseosos analíticos de estas fracciones se presentan en la fig. 11.
FRUTOS VERDES
FRUTOS MADUROS
Figura 11. Cromatogramas gaseosos analíticos de la fracción de compuestos insaponificables del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. Surimanensis.
35 En esta fracción se observan mayores diferencias que en la fracción de los ácidos grasos. El pico cromatográfico de tiempo de retención 16,3 minutos, mayoritario en la fracción insaponificable de los frutos verdes, aparece a muy baja intensidad en los frutos maduros, mientras que los picos cromatográficos de tiempo de retención 33,61 min y 33,96 min, mayoritarios en la fracción de los frutos maduros, son minoritarios en la de los frutos verdes. La asignación estructural de estas fracciones se presenta en la tabla VIII.
En los frutos verdes los compuestos metileugenol (39,63 %), α-amirina (9,91 %), estragol (7,84 %) y β-amirina (5,75 %), eran los mayoritarios. Para los frutos maduros, sin embargo fueron la α-amirina (27,11%), la β-amirina (16,31 %) y el 9,19-ciclolaniost-3-ol, 24-metileno (3β) (12,56 %). Estos compuestos, aunque presentes en la fracción de los frutos verdes, se encontraban en mucha menor proporción.
En los frutos maduros no fueron identificados el β-mirceno, estragol, octadecano, eicosano y el 13-hexiloxaciclo-tridec-10-en-2-ona. En los frutos verdes sin embargo no pudieron detectarse el pentadecano, benzoato de bencilo, ácido hexadecanoico, ácido 9-octadecenoico y el taraxerol. Esto demuestra una vez más que durante el proceso de maduración de los frutos ocurren cambios en la composición química que se reflejan también en las características macromorfológicas.
Un aspecto a señalar es la presencia de abundantes hidrocarburos como componentes de la fracción de compuestos insaponificables tanto de los frutos verdes como maduros.
Un análisis de la composición química encontrada en el aceite obtenido de las semillas, permite señalar que el taraxerol fue informado para M. elengi por Jahann y col, (2001); mientras que la α y β-amirinas han sido informadas por Fernandes y col, (2013) y Rhourri-Frih y col, (2013), en M. suberosa y M. bidentata, respectivamente. También Fernandes y col, (2013), han informado la
36 presencia de los ácidos hexadecanoico y octadecanoico en M. suberosa, lo que confirma la similitud entre las diferentes especies del género.
Tabla VIII. Componentes identificados en la fracción de compuestos insaponificables del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Manilkara bidentata ssp. surimanensis
FRACCIÓN INSAPONIFICABLE FRUTOS FRACCIÓN INSAPONIFICABLE FRUTOS VERDES MADURO % % Tr Tr No COMPUESTO ABUNDANCIA No COMPUESTO ABUNDANCIA (min) (min) RELATIVA RELATIVA 1 5.44 β-mirceno 2,19 2 11.79 Estragol 7,84 3 16.37 Metil-eugenol 39,63 1 16.31 Metil-eugenol 1,08 2 17.69 Pentadecano 0,38 4 18.98 Hexadecano 0,80 3 18.98 Hexadecano 0,95 Benzoato de 4 20.96 2,31 bencilo 5 21.26 octadecano 0,54 Ácido 5 23.02 2,71 hexadecanoico 6 23.28 eicosano 0,49 13-hexiloxaciclo 7 23.95 0,57 tridec-10-en-2-ona ácido 9- 6 24.69 4,17 octadecenoico 8 25.11 Docosano 0,78 9 25.97 Tricosano 0,99 7 25.97 Tricosano 1,09 10 26.79 Tetracosano 1,76 8 26.80 Tetracosano 1,62 11 27.59 Pentacosano 2,12 9 27.59 Pentacosano 2,11 12 28.36 Hexacosano 2,25 10 28.36 Hexacosano 2,18 13 29.09 Heptacosano 2,17 11 29.09 Heptacosano 2,22 14 29.81 Octacosano 1,99 12 29.81 Octacosano 2,19 15 30.05 Escualeno 1,86 13 30.04 Escualeno 0,82 16 30.49 Nonacosano 1,48 14 30.49 Nonacosano 1,92 17 31.15 Triacontano 1,05 15 31.15 Triacontano 1,44 18 31.80 NI 0,91 16 31.80 NI 1,07 19 33.32 Chondrillasterol 2,13 17 33.32 Chondrillasterol 2,14 18 33.47 Taraxerol 2,87 20 33.59 β-amirina 5,75 19 33.61 β-amirina 16,31 9,19-ciclolanost - 9,19-ciclolanost-24- 21 33.87 20 33.89 5,76 24-en-ol (3β) 2,49 en-ol (3β) 22 33.94 α-amirina 9,91 21 33.96 α-amirina 27,11 9,19-ciclolaniost-3- 9,19-ciclolaniost-3- 23 34.31 3,50 22 34.34 12,56 ol, 24-metileno (3β) ol, 24-metileno (3β) 9,19-ciclolaniost-3- 9,19-ciclolaniost-3- 24 34.37 ol, 24-metileno (3β) 1,66 23 34,39 ol, 24-metileno (3β) 4,98 isom isom 25 35.57 NI 5,10
37 IV. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos permitieron arribar a las siguientes conclusiones:
Se informaron por primera vez algunos caracteres macromorfológicos de las semillas y las características micromorfológicas de las hojas de Manilkara bidentata ssp. surimanensis
Se determinaron los parámetros físico-químicos de las hojas de la especie, los cuales responden a los establecidos para las drogas vegetales.
Para la composición química cualitativa a través de Tamizaje Fitoquímico se encontraron los compuestos grasos, los compuestos fenólicos y los terpenoides como los componentes fundamentales.
Se caracterizaron las fracciones saponificables e insaponificables del aceite del endospermo de las semillas, encontrándose diferencias en la composición química atribuibles al proceso de maduración, las cuales se reflejaron también en las características macromorfológicas.
38 V. RECOMENDACIONES
Profundizar en la caracterización macromorfológica de los frutos y semillas.
Profundizar en el estudio de la variación de la composición química de las semillas en diferentes estados de maduración de los frutos.
Realizar la caracterización genética de la especie para confirmar si se trata del género Mimosup o Manilkara.
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48 ANEXOS
Anexo 1. Tamizaje fitoquímico. Extracción Sucesiva con Disolvente
49 Anexo 2. Reacciones cualitativas a realizar en los extractos
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