DINÂMICA EVOLUTIVA DO Dnar EM CROMOSSOMOS DE PEIXES DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA ORDEM GOBIIFORMES(OSTEICHTHYES, TELEOSTEI)

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DINÂMICA EVOLUTIVA DO DNAr EM CROMOSSOMOS DE PEIXES DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA ORDEM GOBIIFORMES(OSTEICHTHYES, TELEOSTEI)

SIMIÃO ALEFE SOARES DA SILVA ______Dissertação de Mestrado Natal/RN, Fevereiro de 2019

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO

DINÂMICA EVOLUTIVA DO DNAr EM CROMOSSOMOS DE PEIXES DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA ORDEM GOBIIFORMES (OSTEICHTHYES, TELEOSTEI)

Simião Alefe Soares da Silva

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.

Orientador: Dr. Wagner Franco Molina Co-Orientador: Dr. Paulo Augusto de Lima Filho

Natal/RN 2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Silva, Simião Alefe Soares da.

Dinâmica evolutiva do DNAr em cromossomos de peixes da família Eleotridae e revisão citogenética da ordem gobiiformes (Osteichthyes, Teleostei) / Simião Alefe Soares da Silva. - 2019.

69 f.: il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em

1. Evolução cromossômica - Dissertação. 2. Diversificação cariotípica - Dissertação. 3. Rearranjos cromossômicos - Dissertação. 4. DNAr - Dissertação. 5. Microssatélites - Dissertação. I. Lima Filho, Paulo Augusto de. II. Molina, Wagner Franco. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 575:597.2/.5

SIMIÃO ALEFE SOARES DA SILVA

DINÂMICA EVOLUTIVA DO DNAr EM CROMOSSOMOS DE PEIXES DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA ORDEM GOBIIFORMES (OSTEICHTHYES, TELEOSTEI)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisitos para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução com ênfase em Padrões e Processos Evolutivos.

Aprovado em 27 de Fevereiro de 2019.

Comissão examinadora:

Dr. Gideão Wagner Werneck Félix Costa – UFRN Dr. Clóvis Coutinho da Mota Neto – CPRM Dr. Paulo Augusto de Lima Filho - IFRN Dr. Wagner Franco Molina - UFRN

“Dedico a Deus por tudo que faz por mim, aos meus pais, a minha querida Tia Hagar (in memorian) e a todos que contribuíram na minha formação”

“Por isso, me alegro, por amor de cristo, com as fraquezas, com as ofensas, com as adversidades, com as perseguições, com as angústias. Porque quando sou fraco, então é que sou forte” (Apóstolo Paulo)

“Não são nossas habilidades que mostram quem realmente somos, são nossas escolhas” (J. K. Rowling)

v AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por tudo que tem feito na minha vida, pelas portas que ele abriu durante toda minha vida e no percurso desta pesquisa e por tudo que é para mim. Agradeço do fundo do meu coração aos meus pais Valdenir Dalvino da Silva e Antônia Eveline Soares da Silva, por todo apoio, paciência, carinho e auxilio que me proporcionou em toda minha vida. Agradeço a minha Vó Maria de Lourdes Mendonça Soares, pelas inúmeras orações e carinho, que foram de muita importância para eu chegar até aqui. Ao meu irmão por ter me ajudado várias vezes quando precisei e pelo apoio que tem me fornecido. Ao meu tio Saquel Pascoal de Mendonça Soares, por toda ajuda que me proporcionou e por sempre estar ao meu lado. Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Wagner Franco Molina, por ter acreditado nesse projeto e confiado na minha pessoa para realizar essa pesquisa, e por todo aprendizado que tive o prazer de ter recebido. Agradecimento especial ao meu co-orientador Prof. Dr. Paulo Augusto de Lima Filho, por ser uma pessoa excepcional, por ter acreditado e confiado em mim, por ter me proporcionado a oportunidade de desenvolver essa pesquisa, assim como, ter grade participação na minha formação. Agradeço ao meu tio ‘China’ e ao meu amigo ‘Pretinho’, por ter me ajudado em algumas coletas. Agradeço também a minha noiva Monike Paulino da Silva de Mendonça, por todo carinho prestado, apoio nos momentos de dificuldade, pelas coletas que fomos juntos que com a presença dela se tornaram especiais. Agradeço a Enildo e a Francisco pelas incontáveis ajudas que deram ao longo desses dois anos vindo de Guamaré para Natal. Agradeço ao meu amigo e parceiro de pesquisa Anderson, pelo apoio e dedicação no desenvolvimento do trabalho, como também, na coleta do material biológico. Agradeço ao meu amigo dos fungos Renan Oliveira, um amigo que ganhei nesse percurso sempre me ajudando nas disciplinas e na construção da dissertação. Agradeço também a todos os componentes do Laboratório de Genética de Recursos Marinho, Gideão, Karlla, Inaílson, Divana, Aparecida, Glaicon, Vanessa, Josy, Juliany, Erika, Alisson e os demais, por toda ajuda que me proporcionaram que foram essenciais para desenvolvimento deste trabalho, sem essa ajuda, nada disso seria possível. Agradeço ao pessoal que trabalha no CTA de Extremoz, pela grande ajuda que me proporcionaram. Agradeço também, a todos os professores desde o maternal até aqui, pois todos contribuíram para minha formação tanto pessoal como acadêmica. A professora Lidiane Guilhermino, pela grande ajuda que me deu, me substituindo em algumas aulas quando precisada ir para Natal. Agradeço aos componentes da “Melhor Turma” do IFRN campus Macau, pelo companheirismo, amizade e ajuda que ultrapassou os limites da graduação e tornou- se para vida.

Resumo

A ordem Gobiiformes, com mais de 2.200 espécies é um dos grupos mais diversificados dentre os teleósteos. Essa alta diversidade é acompanhada por significativa diversificação cariotípica, cujas causas biológicas não são completamente estabelecidas. Dentre seus grupos encontra-se a família Eleotridae, com 23 gêneros e 171 espécies, das quais seis habitam rios próximos à costa e regiões estuarinas em vastas áreas do litoral brasileiro. Com vistas a ampliar os dados citogenéticos para Eleotridae e revisar os padrões de diversificação cariotípica em Gobiiformes, aqui foram analisadas as espécies Dormitator maculatus, Eleotris pisonis, Erotelis smaragdus e Guavina guavina com ocorrência no Atlântico Sul e realizada uma ampla revisão citogenética e associação com os aspectos biológicos e ecológicos da Ordem Gobiiformes. As análises citogenéticas empregaram metodologias convencionais (coloração com Giemsa, impregnação por nitrato de prata, bandamento-C), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e mapeamento por hibridação in situ fluorescente com sondas DNAr 18S, 5S e de sequências microssatélites (CA)15. As espécies E. smaragdus e E. pisonis apresentaram 2n=46 cromossomos (NF=46), D. maculatus exibiu um cariótipo estruturalmente diversificado, com 36sm+4st+6a (NF=86), enquanto G. guavina um cariótipo numericamente divergente com 2n=52 (NF=52). As regiões organizadoras nucleolares nas quatro espécies, estão localizadas em diferentes posições de um único par cromossômico, revelando-se em um efetivo marcador citotaxonômico entre as espécies. O mapeamento in situ do DNAr indicou uma significativa variação de arranjos estruturais dos genes 18S e 5S, confirmando a elevada dinâmica evolutiva dos cariótipos dessas espécies. O conjunto de dados citogenéticos confirma 2n=46 cromossomos acrocêntricos, como uma condição simplesiomórfica para Gobiiformes. O variado conjunto de sequências repetitivas nos cromossomos das espécies de Eleotridae, e em Gobiiformes em geral, pode atuar como fator promotor de diversificação cariotípica, associado a características biológicas, como hábitos bentônicos e ovos adesivos bentônicos. Os resultados encontrados contribuem para um melhor conhecimento da evolução cariotípica da família Eleotridae, indicando a participação de variados rearranjos (inversões, fusões e fissões) e amplia as informações citogenéticas para Gobiiformes. Os padrões estruturais heterogêneos dos cromossomos desta Ordem de peixes, aliado aos seus aspectos biológicos que favorecem estruturações populacionais elevando a dinâmica evolutiva dos cromossomos, tornando este grupo um dos modelos mais ilustrativos de megaevolução cariotípica em ambientes marinhos.

Palavras-chave: Evolução cromossômica, diversificação cariotípica, rearranjos cromossômicos, DNAr, microssatélites.

Abstract

The Order Gobiiformes, with more than 2200 species is one of the most diversified groups among teleosts. This high diversity of species is accompanied by significant karyotypic diversification, whose the biological causes are not completely established. Among its groups there is the family Eleotridae, with 23 genera and 171 species, of which six inhabits rivers near the coast and estuarine regions in vast areas of the Brazilian coast. In order to extend the cytogenetic data for Eletridae and to review the patterns of karyotype diversification in Gobiiformes, the species Dormitator maculatus, Eleotris pisonis, Erotelis smaragdus and Guavina guavina with occurrence in the South Atlantic were analyzed and a broad review of cytogenetic, biological and ecological aspects of the Order Gobiiformes were performed. The cytogenetic analyses employed conventional techniques (Giemsa staining, silver nitrate impregnation, C-banding), base-specific fluorochromes (MM/DAPI) staining, and fluorescence in situ hybridization with probes of 18S rDNA, 5S rDNA and repeats (CA)15. The species E. smaragdus and E. pisonis presented 2n=46 chromosomes (NF=46). D. maculatus exhibited a structurally diverse karyotype with 36sm+4st+6a (NF=86), while G. guavina had a numerically divergent karyotype with 2n=52, NF=52). The nucleoli organizing regions in the four species are located in different positions of a chromosome, showing its potential to be an efficient cytotaxonomic marker among the species. In situ rDNA mapping indicated a greater variation in the structural arrangements of the 18S and 5S genes, confirming the high evolutionary dynamics of the karyotypes of these species. The cytogenetic data set for the Order Gobiiformes confirms 2n=46 acrocentric chromosomes, as a symplesiomorphic condition for the Order. The varied set of repetitive sequences in the Eleotrid chromosomes, and in Gobiiformes in general, associated to biological biology, such as benthic habits, benthic adhesive eggs can act as trigger for karyotype diversification. The results contributed to a better knowledge on the karyotype evolution in Eleotridae, indicating a variety of rearrangements (inversions, fusions and fissions) and extending the cytogenetic data for Gobiiformes. The heterogeneous structural patterns of the chromosomes of this Order, together with their biological aspects that favor population structure promoting an elevate evolutionary dynamics in their chromosomes, making this group one of the most illustrative models of karyotype megaevolution in marine environments.

Keywords: Chromosome evolution, karyotype diversification, chromosomal rearrangements, rDNA, microsatellites

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

INTRODUÇÃO

Figura 1. Mapa dos pontos de coleta das espécies de Eleotridae no Estado do Rio Grande do Norte, nordeste do Brasil.

Figura 2. Espécies da família Eleotridae utilizados nas análises citogenéticas. a. Dormitator maculatus; b. Eleotris pisonis; c. Erotelis smaragdus; d. Guavina guavina. Fotos: SASS. Imagem de Erotelis smaragdus obtida em: https://biogeodb.stri.si.edu/caribbean/en/gallery/specie/4099. Barra = 1cm.

CAPÍTULO 1

Figura 1. Cariótipos de Erotelis smaragdus, Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina, sob coloração com Giemsa e bandamento C. Em destaque nas caixas os pares organizadores nucleolares exibindo os sítios Ag-RONs e regiões MM+/DAPI-. Barra = 5µm.

Figura 2. Hibridização in situ com sondas DNAr 18S (vermelho) e DNAr 5S (verde) nas espécies E. smaragdus, E. pisonis, D. maculatus e G. guavina. Os padrões dos arranjos DNAr 18S e DNAr 5S são apresentados para D. maculatus. Barra = 5µm.

Hibridização in situ de sequências dinucleotídicas (CA)15 em Eleotris Figura 3. pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina. Em destaque no box os pares heterogaméticos da espécie Dormitator maculatus. Barra = 5µm.

Tabela 1. Informações citogenéticas disponíveis para espécies da família Eleotridae.

CAPÍTULO 2

Figura 1. Padrões filogenéticos na Ordem Gobiiformes com informações citogenéticas (2n e NF) por espécie ou gênero. Linhas vermelhas destacam grupos com 2n=46 cromossomos.

Tabela 1. Frequência de valores diploides (2n) e de números de braços cromossômicos (NF) conhecidos para os gêneros e subfamílias da ordem Gobiiformes.

Tabela 2. Frequência de números diploides e Número Fundamental quanto aos hábitos bentônico (B), pelágico (P) e bento-pelágico (B/P), para a Ordem Gobiiformes e suas famílias.

Tabela 3. Dados citogenéticos de 2n e NF e sua frequência no quesito características reprodutivas, ovos bentônicos (OB) e ovos pelágicos (OP) organizados por ordem.

Tabela 4. Frequência do número diploide e Número Fundamental em relação ao tipo de ambiente. M= Marinho, D= Dulcícola, E= Estuarino. Espécies que habitam em mais de um ambiente são identificadas pela sigla referente ao hábitat correspondente, separado por ‘/’. O número total de espécie analisadas por tipo de habitat, estão organizadas no espaço destinado a Total.

ANEXO

Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para Ordem Gobiiformes.

Sumário INTRODUÇÃO ...... 13 1.1 Aspectos biológicos da Ordem Gobiiformes...... 13 1.2 Diversidade cariotípica na Ordem Gobiiformes ...... 14 1.3 Aspectos biológicos e citogenéticos da família Eleotridae...... 15 OBJETIVOS ...... 17 2.1 Objetivo Geral ...... 17 2.2 Objetivos Específicos ...... 17 MATERIAL E MÉTODOS ...... 18 3.1 Material ...... 18 3.2 Métodos ...... 21 3.2.1 Estimulação mitótica ...... 21 3.2.2 Técnica de preparação de cromossomos mitóticos ...... 21 3.2.3 Preparação das lâminas ...... 22 3.2.4 Análises cromossômicas ...... 22 3.2.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) ...... 22 3.2.6 Detecção de heterocromatina constitutiva ...... 23 3.2.7 Coloração com fluorocromos base-específicos ...... 23 3.2.8 Hibridação in situ fluorescente (FISH) ...... 23 REFERÊNCIAS ...... 26 CAPÍTULOS ...... 31 5.1 Capítulo I ...... 31 Intensa divergência cariotípica e dinâmica das sequências DNAr 18S e DNAr 5S em quatro espécies da família Eleotridae (Teleostei, Gobiiformes) ...... 31 5.2 Capítulo II ...... 50 Aspectos carioevolutivos da Ordem Gobiiformes (Teleostei): condição cariotípica basal do grupo ...... 50 CONCLUSÕES ...... 65 ANEXO...... 66

13 Introdução

INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos biológicos da Ordem Gobiiformes

Gobiiformes possui 9 famílias, 268 gêneros e 2.210 espécies, constituindo um dos grupos com a maior diversidade entre os vertebrados (Thacker, 2003; Nelson et al., 2016; Eschmeyer & Fong, 2019). O pequeno porte e aspectos morfológicos pouco distintivos, contribuem para uma morfologia críptica, que em muitos casos ocasionam imprecisão taxonômica na identificação das espécies da Ordem Gobiiformes (Tornabene et al., 2010), o que enseja identificações taxonômicas também embasadas em análises genéticas e citogenéticas (Lima-Filho et al., 2012). Algumas características morfológicas são diagnósticas para os representantes da Ordem, como linha lateral ausente ou pouco desenvolvida, membranas branquiais geralmente unidas ao istmo, primeira nadadeira dorsal com 4 a 10 espinhos flexíveis, segunda nadadeira dorsal e anal com variação na quantidade de raios, em geral moles, exceto o primeiro raio da segunda nadadeira dorsal que é geralmente duro, presença de nadadeiras pélvicas com 4 a 5 raios moles ligados, formando um disco utilizado na estabilização e movimentação (Nelson et al., 2016). Gobiiformes possuem uma ampla distribuição geográfica, incluindo áreas da Oceania, Ásia, Europa, América do Norte e América Latina, onde habitam ambientes marinhos, águas salobras e dulcícolas. Algumas espécies podem habitar águas hipersalinas ou mesmo grandes profundidades oceânicas (Muus & Nielsen, 1999; Suzuki et al., 2015; Oto et al., 2017). Contudo, em geral, ocorrem em estuários, costas marinhas rochosas, ou associadas a recifes de corais, onde são predominantemente bentônicas, ocupando tocas em substratos lamacentos ou rochosos, bem como enterradas no substrato, permanecendo apenas com os olhos acima da superfície (Eskinazi, 1972; Kottelat & Freyhof, 1972; Baensch & Riehl, 1991; Patzner et al., 2012). Suas características comportamentais e reprodutivas são fatores importantes na distribuição e adaptações a novos nichos (Fanta, 1997). Apresentam mecanismos reprodutivos muito variáveis, muitas espécies produzem ovos adesivos perdendo-os ao substrato, enquanto que outras lançam ovos flutuantes, que sob

14 Introdução

ação de correntes marinhas, aumentam o potencial de dispersão (Manacop, 1953; Skora et al., 1999; Donaldson & Myers, 2002; Patzner et al., 2012). Algumas espécies apresentam cuidado parental dos ovos e larvas, podem exibir fecundação interna ou externa ou, sob certas circunstâncias ambientais, os machos podem mudar de sexo (Nakashima et al., 1996; Skora, et al., 1999). Características comportamentais, como movimentação restrita associadas a hábitos bentônicos, tornam as espécies da Ordem Gobiiformes propícias a fragmentações populacionais. Isso pode resultar em modificações cariotípicas, que vão desde diferenças no número cromossômico, a variações intrínsecas nos cromossomos das espécies (Lima-Filho et al., 2012). Nesse sentido a redução do fluxo gênico, propicia diferenciações morfológicas e genéticas das populações, que podem culminar com processos de especiação alopátrica, ecológica e alguns casos de especiação simpátrica (Dawson et al., 2002; Lima-Filho et al., 2012; Zastavniouk et al., 2017), resultando na surpreendente diversidade de espécies desta Ordem.

1.2 Diversidade cariotípica na Ordem Gobiiformes

Rearranjos cromossômicos podem estar diretamente associados ao processo de especiação (Rieseberg, 2001). Assim, dados citogenéticos recentes permitem compreender o processo evolutivo e a importância do dinamismo evolutivo em alguns grupos de peixes (Molina et al., 2014). Os aspectos citogenéticos em Gobiiformes são ainda pouco conhecidos. Apenas 139 espécies possuem algumas informações citogenéticas, em geral, derivadas de técnicas citogenéticas clássicas. Esse total corresponde a menos de 10% das espécies, que abrange cinco das nove famílias da Ordem, das quais Gobiidae e Oxudercidae apresentam o maior número de espécies analisadas (Arai, 2011). Diferentemente de outras Ordens marinhas, como Perciformes e Siluriformes, que são detentoras de um alto grau de conservadorismo cromossômico, a Ordem Gobiiformes apresenta uma elevada divergência de número cromossômico entre suas espécies (Galetti et al., 2000; Amorim et al., 2017). A causa da elevada diversidade carioevolutiva no grupo, tem sido associada ao rico repertório comportamental, diversidade de hábitats e limitada capacidade dispersiva das

15 Introdução

espécies (Fanta, 1997; Ruber et al., 2003; Lima-Filho et al., 2012; Rocha et al., 2015). Em meio a variação numérica dos cromossomos, tem sido sugerido que 2n=46 cromossomos acrocêntricos constitua o padrão basal para a Ordem, como foi para a família Gobiidae (Vasil’ev & Gregorian, 1994). De fato, dentre as 51 espécies da família Gobiidae analisadas, 41% (21 spp.) exibem 2n=46 cromossomos, das quais 21% (11 spp.) apresentam apenas cromossomos acrocêntricos (Arai, 2011), enquanto as demais, como Gobiopsis macrostoma (10m+4sm+32a) (Khuda-Bukhsh et al., 1995), exibem fórmulas cariotípicas diversificadas. Algumas famílias, como Oxudercidae e Odontobutidae, apresentam 2n=44, como condição mais frequente (Dong, 1984). No primeiro grupo, essa é a condição modal, presente em 37% das espécies. Em Eleotridae e Butiidae, por outro lado, 2n=46 cromossomos é a condição prevalente, ocorrendo em 66% das espécies, com 30% delas com cariótipos inteiramente formados por cromossomos acrocêntricos (Donsakul & Magtoon, 1997; Molina 2005). Os mecanismos de diversificação cariotípica das espécies de Gobiiformes, tais como rearranjos cromossômicos, têm se mostrado extremamente variados (Amores et al., 1989; Caputo et al., 1997; Prazdnikov et al., 2013). Diante da dimensão evolutiva deste grupo de peixes, análises citogenéticas resolutivas, sob bases filogenéticas mais extensas, incluindo alguns grupos com poucas informações como Eleotridae, permitirão estabelecer a amplitude da diversificação cromossômica bem como possíveis efeitos de fatores biológicos e geográficos na sua evolução cariotípica.

1.3 Aspectos biológicos e citogenéticos da família Eleotridae

Eleotridae, conhecidos popularmente como “dorminhocos” ou “peixes- macaco” (nome dado devido ao seu modo de vida, escondendo-se em tocas no substrato e pouca mobilidade), abrange 23 gêneros e 171 espécies (Thacker, 2009; Betancur-R et al., 2013; Eschmeyer & Fong, 2019). Em toda costa brasileira ocorrem apenas seis espécies, que são Erotelis smaragdus (Valenciennes, 1837), Dormitator maculatus (Bloch, 1792), Eleotris pisonis (Gmerlin, 1789), Eleotris perniger (Cope, 1871), Eleotris amblyopsis (Cope, 1871) e Guavina guavina (Valenciennes, 1837) (Pezold & Cage, 2002; Silva et al., 2014; Guimarães-Costa et al., 2016). Algumas

16 Introdução

espécies do oceano Atlântico Ocidental estendem sua distribuição do litoral brasileiro até o litoral do Caribe (Guimarães-Costa et al., 2017; Ottoni, 2017). Quando é analisado a morfologia dos peixes da família Eleotridae é possível constatar uma condição críptica para a família, dificultando uma identificação precisa em algumas espécies. Pigmentação, escamas laterais e distribuição geográfica, são usadas como critérios taxonômicos mais frequentes (Pezold & Cage, 2001). A maioria das espécies da família possui ovos pelágicos, fase larval pelágica longa e movimentação restrita na fase adulta, contudo poucas espécies possuem hábito pelágico (Riede, 2004; Bussing & Lopez, 2005), fatores que favorecem estruturações populacionais (Ceccarelli et al., 2001). Dados citogenéticos para Eleotridae são escassos (Arai, 2011). Os poucos dados existentes revelam uma notável variação nas fórmulas cariotípicas (Arai et al., 1974; Uribe-Alcocer et al., 1983, 1989; Maldonado-Monroy et al., 1985; Molina, 2005). Apesar de 2n=46 cromossomos ser a condição mais frequente na família, algumas espécies exibem 2n=52 cromossomos, resultado de fissões cromossômicas (Uribe-Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996). Elevados números de braços cromossômicos (NF) sem redução diploide, apontam que inversões pericêntricas tiveram um papel ativo na modelagem dos cromossomos das espécies (Molina, 2005). As contribuições das informações citogenéticas para o conhecimento da diversidade de espécies de peixes na região Neotropical têm sido notáveis (Nirchio et al., 2014; Borges et al., 2019). O conhecimento citogenético em várias famílias de Gobiiformes, entre elas Eleotridae ainda é incipiente, mas tem revelado nos cariótipos de suas espécies desde divergências dentro de sua área de distribuição (Molina, 2005), polimorfismos cromossômicos (Uribe-Alcocer et al., 1989), como também a ocorrência de cromossomos sexuais (Oliveira & Toledo, 2006; Lima-Filho et al., 2014). A ampliação das informações citogenéticas nesta Ordem, através de análises citogenéticas resolutivas, baseadas no mapeamento de sequências repetitivas se mostra apropriada para identificação de possível fauna críptica, nesse grupo. Além disso, as análises podem auxiliar a compreensão da diversificação cariotípica na família Eleotridae e no grande grupo filético representado pela Ordem Gobiiformes.

17 Objetivos

OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O presente trabalho visa ampliar os dados citogenéticos para a família Eleotridae por meio de técnicas citogenéticas resolutivas, contribuindo para um melhor entendimento dos padrões de evolução cariotípica na família e na Ordem Gobiiformes. Adicionalmente, se propõe a realizar uma ampla revisão dos aspectos cariotípicos dos Gobiiformes, identificando seus processos de diversificação cromossômica e possíveis associações com aspectos biológicos desse grande grupo de peixes.

2.2 Objetivos Específicos

• Realizar análises citogenéticas nas espécies Erotelis smaragdus, Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina (Eleotridae), através de técnicas citogenéticas convencionais (coloração com Giemsa, Ag-RONs, bandamento C), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e hibridização fluorescente in situ (FISH) das sequências repetitivas DNAr 18S,

DNAr 5S e sequências microssatélites (CA)15. • Compilar os dados citogenéticos disponíveis para a Ordem Gobiiformes e analisar mecanismos de diversificação, relacionando-os com fatores biológicos dos grupos e realizando inferências/inferindo sobre o possível cariótipo basal para Ordem.

18 Material e Métodos

MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

Quatro espécies da família Eleotridae foram utilizadas nas análises citogenéticas. As espécies Dormitator maculatus (n=10; 8 ♂ e 2 ♀) e Eleotris pisonis (n=25; 15 ♂ e 10 ♀) foram coletadas no Rio Pium, em Parnamirim (5°56’51.2”S, 35°14’09.2”O), Erotelis smaragdus (n=15; 10 ♂ e 5 ♀), próxima à foz do estuário no Rio Curimataú, município de Canguaretama (6°19'15.50"S, 35°2'29.31"O) e Guavina guavina (n=4; 1 ♂ e 3 ♀) coletada no estuário do Rio Potengi (5°41’07.2”S, 35°14’28.1”O), no Estado do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil. Todos os procedimentos desenvolvidos em campo ou laboratório contaram com a aprovação do Comitê de Ética no uso de Animais (Proc. 044/2015) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Figura 1. Mapa indicando os pontos de coleta no estado do Rio Grande do Norte. RPO= Rio Potengi, no município de Natal; RP= Rio Pium, no município de Parnamirim; RC= Rio Curimataú, no município de Canguaretama.

19 Material e Métodos

Após as coletas, os espécimes foram transportados vivos ao Laboratório de Genética de Recursos Marinhos (LGRM) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde foram mantidos em aquários aerados até a realização das preparações cromossômicas.

20 Material e Métodos

Figura 2. Espécies da família Eleotridae utilizados nas análises citogenéticas. a. Dormitator maculatus; b. Eleotris pisonis; c. Erotelis smaragdus; d. Guavina guavina.

21 Material e Métodos

Fotos: SASS. Imagem de Erotelis smaragdus obtida em: Biogeodb.stri.si.edu. Barra = 1cm.

3.2 Métodos

3.2.1 Estimulação mitótica

Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica com o uso de complexos de antígenos bacterianos e fúngicos, de acordo com Molina (2001) e Molina et al. (2010). Um total de 7mg de antígenos foi diluído em 10ml de água destilada e injetado intramuscularmente na proporção 1ml/50g do peso corporal dos exemplares. Após um período de 24-48 horas os indivíduos foram eutanasiados com superdosagem de Eugenol, anestésico a base de óleo de cravo (Syzygium aromaticus), até cessação dos movimentos branquiais, quando foram removidos fragmentos da porção anterior dos rins.

3.2.2 Técnica de preparação de cromossomos mitóticos

A técnica de preparação e obtenção de cromossomos mitóticos, fez uso da preparação in vitro, descrito por Gold et al. (1990). O tecido renal foi removido com o auxílio de uma pinça e adicionado a uma cuba de vidro contendo 10ml de meio de cultura RPMI 1640. Os fragmentos foram dissociados por sucção com seringa de vidro de 10ml desprovida de agulha, até se obter uma mistura de células homogênea. Em seguida foi adicionado 125µl de colchicina a 0,025%, deixando-a agir por 28 minutos em temperatura ambiente. Terminado a colchicinização, o material foi centrifugado por 10 minutos à 1000 rpm, retirando-se o sobrenadante com ajuda de pipeta Pasteur. Em seguida o material foi ressuspendido em 10ml de solução hipotônica de KCl à 0,075M, onde permaneceu por 30 minutos à temperatura ambiente. Ao término desse período o material foi pré-fixado com o acréscimo de um volume de 0,5ml de fixador de Carnoy (Metanol/Ácido Acético, 3:1), sendo refrigerado, e posteriormente centrifugado por 10 minutos à 1000 rpm. Após três ciclos de fixação, com ressuspensão em 6ml de fixador, e centrifugação à 1000rmp, o material foi estocado em 1,5ml de fixador em tubos Eppendorf e mantido em freezer à -20°C.

22 Material e Métodos

3.2.3 Preparação das lâminas

Para análises da morfologia cromossômica e valor diploide das espécies, 75µl a 100µl da suspensão celular (3 gotas) foi gotejado em uma lâmina recoberta com um filme de água destilada aquecida à 60°C e secas ao ar em temperatura ambiente. Posteriormente, o material foi corado com Giemsa 5%, diluído em solução tampão fosfato pH 6,8, durante 8 minutos, sendo posteriormente lavado com água destilada e seco ao ar.

3.2.4 Análises cromossômicas

As preparações cromossômicas foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência OlympusTM BX50, em um aumento de 1000X, com sistema de captura de digital DP73 (Olympus), com o uso do software cellSens. O valor diploide modal e o cariótipo das espécies foram estabelecidos pela análise de cerca de 30 metáfases para cada exemplar. Os cromossomos foram classificados de acordo com a razão entre braços, em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) ( Levan et al., 1964).

3.2.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs)

A detecção das regiões organizadoras de nucléolos foi realizada de acordo com Howell e Black (1980). Previamente foi preparada uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina incolor em 50ml de água destilada e 0,5ml de ácido fórmico. Posteriormente foi depositada sobre uma lâmina com preparações mitóticas 150µl de solução de gelatina (1g de gelatina, dissolvida em 50 ml água e 0,5ml ácido fórmico), 75µl de água destilada e 175µl de solução aquosa de AgNO3 à 50%, misturando bem e recobrindo com uma lamínula. A lâmina foi incubada em estufa à 60°C, por um período de aproximadamente 3 minutos, até que assumisse uma tonalidade âmbar, sendo em seguida lavada em água deionizada e seca ao ar. A preparações foram analisadas em microscópio sob magnificação de 1000X, e as melhores metáfases fotografadas.

23 Material e Métodos

3.2.6 Detecção de heterocromatina constitutiva

As regiões heterocromáticas foram identificadas de acordo com Summer (1972). Lâminas com preparações cromossômicas foram mantidas em estufa de 37°C por 3 dias. Posteriormente foram imersas em HCl 0,2N à temperatura ambiente durante 15 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida foram mergulhadas em solução saturada de hidróxido de bário Ba(OH)28H2O à 5% à 42°C, por aproximadamente 1 minuto e 20 segundos, mergulhada rapidamente em solução de HCl 0,2N, lavadas em água destilada e secas ao ar. Foram então incubadas em solução salina 2XSSC à 60°C, durante 45 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Por fim, foram coradas em solução de Giemsa diluída em tampão fosfato à 2% (pH=6,8), durante 15 minutos.

3.2.7 Coloração com fluorocromos base-específicos

Adicionalmente foi realizada coloração com os fluorocromo MM (C52H76O24) e DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), de acordo com Schweizer (1976). As lâminas foram envelhecidas por três dias em estufa à 37°C, coradas com 30µl de MM (0,5mg/ml) por 30 min, lavadas com água destilada e coradas com DAPI (2µl/ml) por 15 minutos. Feito isso, as lâminas foram montadas em tampão glicerol Mcllvaine pH 7,0 (1:1), seladas com esmalte incolor e mantida em câmara escura por pelo menos três dias até as análises em fotomicroscópio de epifluorescência (OlympusTM BX50), sob filtros apropriados.

3.2.8 Hibridação in situ fluorescente (FISH)

A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. Sondas para as sequências DNAr 18S e DNAr 5S, foram obtidas da amplificação do DNAr da espécie Rachycentron canadum (Rachycentridae sensu Betancur-R et al., 2013), utilizando primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CG ATC-3’ e B 5’-CGA GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994). para as sondas DNAr 18S foram utilizadas seguimentos de 1400 pares de base (bp) do gene RNAr 18S (White et al., 1990) e a de DNAr 5S corresponderam a seguimentos de 200bp do gene RNAr 5S (Pendás et al., 1994) obtida via PCR do DNA nuclear (Costa, 2015).

24 Material e Métodos

Ambas as sondas foram marcadas por nick translation (BioNick Labeling System – Invitrogen) com digoxigenina-11-dUTP para sonda 18S e 5S com biotina- 14-dATP, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo Pinkel et al. (1986). A solução de hibridação consistiu de 240μl de formamida 50%, 96μl de sulfato dextrano 50%, 48μl de 20XSSC, 32μl de água q.s.p., 30 perfazendo um volume total de 480μl, sendo adicionado 1,5 μg de sonda (DNA marcado com biotina). Em seguida, a solução de hibridação foi transferida para um recipiente a 100°C, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. As lâminas contendo as preparações cromossômicas foram lavadas com tampão PBS 1X por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e, posteriormente, desidratadas em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foram submetidas à digestão com RNAse (100μg/ml) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida à 37°C, e lavadas em soluções salinas. O material foi desidratado em uma série alcoólica, 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2XSSC à 70°C, por 5 minutos, para que os mixes da formamida promovessem a diminuição da temperatura de melting do DNA sem comprometer a estrigência, além de prolongar o tempo de hibridação. Uma nova desidratação em série alcoólica foi realizada. Após tal procedimento, foi aplicado, sobre a lâmina, 60μl da solução de hibridação contendo a sonda desnaturada, permanecendo em câmara úmida overnight, à 37oC. Transcorrido esse tempo, as lâminas foram lavadas em solução de formamida 50%/2XSSC à 42oC por 10 minutos, três vezes em 0,1XSSC à 60°C, 5 minutos em cada lavagem e em solução Tween20 (0,05%/2XSSC), sob agitação, por 5 minutos. Em seguida, foi realizado um tratamento com 90μl de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4XSSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. Os sinais de hibridação foram detectados através da deposição de 100μl de Mix NFDM + Strepteavidina – FITC + anti-digoxigenina rodamina conjugada por 1 hora, com três lavagens adicionais de 5 minutos com Tween20. Finalizado, a lâmina foi desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos em cada banho. Os cromossomos foram contracorados com vectashild com DAPI (0,2 μg/ml). Sequências de oligonucleótidos

(CA)15 foram marcadas diretamente com Alexa Fluor 555 durante a síntese. A sonda

25 Material e Métodos

desnaturada foi aplicada à lâmina, coberta com uma lamínula, permanecendo por 18 horas à 37°C. As lâminas foram então lavadas à temperatura ambiente, duas vezes durante 5 minutos cada, em 2XSSC e uma vez durante 1 minuto em 1XPBS (Kubet et al., 2008).

As sequências (CA)15 foram marcadas diretamente com Cianina durante a síntese. A sonda desnaturada foi aplicada a lâmina, coberta com uma lamínula, permanecendo por 18 horas à 37°C. As lâminas foram lavadas em temperatura ambiente, duas vezes durante 5 minutos cada, em 2XSSC e uma vez durante 1 minuto em 1XPBS.

26 Referências

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31 Capítulo I – Divergência de sequências repetitivas do DNA de peixes da família Eleotridae

CAPÍTULOS

5.1 Capítulo I

Intensa divergência cariotípica e dinâmica das sequências DNAr 18S e DNAr 5S em quatro espécies da família Eleotridae (Teleostei, Gobiiformes)

Resumo

A família Eleotridae é uma das 9 famílias que compõem a Ordem Gobiiformes. Com aproximadamente 23 gêneros e 171 espécies, são popularmente conhecidos como “dorminhocos” ou “peixes-macaco”. Suas espécies apresentam ampla distribuição na costa do Atlântico, onde habitam águas doces e estuarinas rasas. Dados citogenéticos neste grupo são incipientes e baseados em técnicas convencionais. Com vistas a contribuir para definição dos padrões de divergência cariotípica e da dinâmica das sequências DNAr nesta família, foram analisadas as espécies Dormitator maculatus, Eleotris pisonis, Erotelis smaragdus e Guavina guavina. As análises incluíram técnicas cromossômicas convencionais (coloração com Giemsa, Ag-RONs e bandamento C), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e hibridação in situ com sondas fluorescentes DNAr 18S, DNAr 5S e de sequências microssatélites dinucleotídicas (CA)15. As espécies D. maculatus (2n=46, 36sm+4st+6a, NF=86), Eleotris pisonis (2n=46a, NF=46), Erotelis smaragdus (2n=46a, NF=46), e Guavina guavina (2n=52a, NF=52), apresentaram em geral uma conspícua variação cariotípica. Os sítios Ag-RONs ocorrem em um único par, mas em diferentes posições, entre as espécies. O mapeamento dos sítios DNAr 18S e DNAr 5S mostraram diferenças relacionadas ao número de sítios DNAr 5S (E. smaragdus), e quanto ao padrão de organização dessas sequências entre as espécies, variando entre arranjos sintênicos (E. pisonis, e cariomorfo de D. maculatus) e não sintênicos. As sequências microssatélites (CA)15 se localizaram em regiões teloméricas e centroméricas, com grandes variações de posicionamento entre as espécies. Apesar do conservadorismo do número diploide em três das espécies (2n=46), as variações estruturais dos cromossomos (D. maculatus), do número e arranjo das sequências ribossomais (D. maculatus, E. pisonis e E. smaragdus), e sequências (CA)15, apontam uma vigorosa reorganização evolutiva dos cromossomos das espécies da família.

Palavras-chave: Evolução cariotípica, FISH, DNAr, sequências repetitivas, peixes- macaco.

INTRODUÇÃO

A família Eleotridae (Gobiiformes) possui 171 espécies válidas que estão divididas nas subfamílias Eleotrinae, Butinae e Milyeringinae (Thacker, 2009; Betancur et al., 2013, Eschemeyer & Fong, 2019). As espécies desta família frequentemente apresentam padrões morfológicos crípticos, dificultando a identificação taxonômica. Algumas características merecem

32 Capítulo I – Divergência de sequências repetitivas do DNA de peixes da família Eleotridae

destaque na taxonomia das espécies, como pigmentação, escamas da linha lateral e distribuição geográfica (Pezold & Cage, 2002). Fatores biológicos intrínsecos como período pelágico larval, comportamento reprodutivo, pouca mobilidade entre os representante do grupo, podem influenciar a estruturação genética das populações, entre os exemplos podemos citar ovos pelágicos, período pelágico larval longo e movimentação restrita na fase adulta (Riede, 2004; Bussing & Lopez, 2005). Dentre suas subfamílias, Eleotrinae, formada pelos gêneros Dormitator, Eleotris, Erotelis, Guavina, e outros gêneros é a mais diversa, com distribuição no Atlântico Ocidental e Pacífico Oriental, Indo-Pacífico e Atlântico Oriental (Guimarães- Costa et al., 2016; Guimarães et al., 2018). Na costa brasileira ocorrem seis espécies, Dormitator maculatus (Bloch, 1792), Eleotris pisonis (Gmerlin, 1789), Eleotris perniger (Cope, 1871), Eleotris amblyopsis (Cope, 1871), Erotelis smaragdus (Valenciennes, 1837), e Guavina guavina (Valenciennes, 1837) (Marceniuk et al., 2013, Guimarães-Costa et al., 2016), com ampla distribuição nas bacias hidrográficas, onde ocupam rios costeiros e regiões estuarinas (Silva et al., 2014, Nelson et al., 2016). Descrições recentes indicam ainda, duas possíveis novas espécies do gênero Eleotris e uma espécie invasora Butis koilomatodon (Bleeker, 1984), proveniente do Indo-Pacífico, em áreas do extremo norte da costa brasileira (Guimarães-Costa et al., 2016; Guimarães et al., 2018). Os dados citogenéticos para a família são incipientes, revelando em geral cariótipos com 2n=46 (Arai, 2011), contudo algumas espécies apresentem números diploides mais elevados, como Eleotris picta, com 2n=52 cromossomos (Uribe- Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996). Além da variação diploide, os cariótipos podem exibir estruturas variadas, sendo formados apenas por cromossomos acrocêntricos, ou por diferentes tipos cromossômicos, como identificado em espécies dos gêneros Dormitator, Gobiomorus e Morgunda (Arai & Sawada, 1974; Uribe-Alcocer et al., 1983; Maldonado-Monroy et al., 1985; Uribe-Alcocer et al., 1989; Molina, 2005). A frequência e distribuição de sequências de DNAr 18S e 5S que têm sido informativas sobre a evolução do cariótipo de muitos grupos de peixes (Gornung, 2013) são desconhecidos em Eleotridae. Neste trabalho são apresentados dados citogenéticos de quatro espécies com ocorrência na costa brasileira e investigados

33 Capítulo I – Divergência de sequências repetitivas do DNA de peixes da família Eleotridae

os aspectos de diversificação cariotípica e da distribuição de três classes de DNA repetitivo (DNAr 18S, DNAr 5S, sequências (CA)15 e (CAA)10). MATERIAL E MÉTODOS

Análises citogenéticas foram realizadas nas espécies Dormitator maculatus (n=11; 6♂ e 5♀), Eleotris pisonis (n=25; 15♂ e 10♀), Erotelis smaragdus (n=15; 10♂ e 5♀) e Guavina guavina (n=4; 4♀). Os espécimes de D. maculatus e E. pisonis foram coletados no rio Pium (5°56’51.2”S, 35°14’09.2”O), município de Parnamirim, os de E. smaragdus no estuário do rio Cunhaú (6°19'15.50"S, 35°2'29.31"O), no município de Canguaretama e os de Guavina guavina coletados no estuário do rio Potengi (5°41’07.2”S, 35°14’28.1”O), no município de Natal, Estado do Rio Grande do Norte, região Nordeste do Brasil. Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica in vivo com inoculação intramuscular de complexos de antígenos bacterianos e fúngicos (Molina et al., 2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de suspensões celulares de fragmentos do rim anterior (Gold et al., 1990). As preparações foram coradas com Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato (pH 6,8). Cerca de 30 metáfases foram analisadas para cada exemplar. As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) e as regiões heterocromáticas foram identificadas de acordo com Howell & Black (1980) e Sumner (1972) respectivamente. Adicionalmente, os cromossomos foram corados com fluorocromos base-específicos DAPI e MM (Schweizer, 1976). As hibridações fluorescentes in situ (FISH) foram realizadas de acordo com Pinkel et al. (1986). As sondas foram amplificadas por PCR a partir do DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Rachycentridae sensu Betancur-R et al., 2013), utilizando primers para DNAr 18S (White et al., 1990) e DNAr 5S (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 18S foi marcada por nick translation com digoxigenina-11- dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha), enquanto que a sonda 5S rDNA, com biotina- 14-dATP (Invitrogen, San Diego, EUA), de acordo com as especificações do fabricante. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando avidina-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina-rhodamina (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml).

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As sondas da sequência (CA)15 e (CAA)10 foram marcadas diretamente com durante a síntese. A hibridização das sondas ocorreu em câmara úmida por 18 horas à 37°C. As lâminas foram lavadas em temperatura ambiente, duas vezes durante 5 minutos cada, em 2XSSC e uma vez durante 1 minuto em 1XPBS. As preparações com FISH e fluorocromos base-específicos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX51, equipado com sistema digital de captura de imagens Olympus DP73, utilizando o software cellSens (Olympus Optical Co. Ltda.) Os cromossomos foram classificados de acordo com razão entre os braços em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964).

RESULTADOS

Erotelis smaragdus, E. pisonis e D. maculatus têm 2n=46 cromossomos, enquanto G. guavina possui 2n=52 cromossomos. Erotelis smaragdus (NF=46), E. pisonis (NF=46) e G. guavina (NF=52) compartilham cariótipos formados apenas por cromossomos acrocêntricos. Por outro lado, D. maculatus apresentou um cariótipo 2n=46, com variados tipos cromossômicos 36sm+4st+6a (NF=86) (Figura 1). Os sítios Ag-RONs ocorrem em um único par de cromossomos e são as únicas regiões no cariótipo que apresentam coloração MM+/DAPI-. Em E. smaragdus se localizam em posição terminal no braço longo do par 9, em E. pisonis em posição intersticial do braço longo do par 21, em D. maculatus na porção terminal do braço curto do par 4 e em G. guavina na região intersticial no braço longo do par 19 (Figura 1).

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Figura 1. Cariótipos de Erotelis smaragdus, Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina, com coloração com Giemsa e bandamento C. Em destaque nas caixas os sítios Ag-RONs e regiões MM+/DAPI-. Barra = 5µm.

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As regiões heterocromáticas ocorrem principalmente nas regiões centroméricas dos cromossomos de E. smaragdus e E. pisonis, enquanto em D. maculatus e G. guavina, além das regiões centroméricas, localizam-se também em posição terminal e intersticial de alguns pares (figura 1). Em todas as espécies os sítios DNAr 18S são simples e congruentes com as marcações Ag-RONs. Por outro lado, os sítios DNAr 5S demonstraram considerável variação nas espécies, apresentando divergências interespecíficas quanto ao número de sítios, posição e arranjo com os sítios DNAr 18S (figura 2). Os sítios DNAr 5S em E. smaragdus são múltiplos situados nos pares 7 e 14. Em G. guavina ocorrem na porção pericentromérica do par 4. Em E. pisonis exibiram um arranjo sintênico e co-localizado com sítios DNAr 18S na porção intersticial do par 21. Em D. maculatus apresentam um notável polimorfismo estrutural, com dois citótipos quanto à organização e posicionamento destas regiões (Figura 2). Assim, enquanto alguns indivíduos apresentaram sítios DNAr 18S (par 4) e sítios DNAr 5S (par 5), outros exibiram um segundo tipo de organização, com o par 4 portando sítios DNAr 18S, com um dos homólogos exibindo um arranjo DNAr 18S/DNAr 5S co-localizado e um homólogo do par 5 portando um sítio DNAr 5S (Figura 2).

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O mapeamento da sequência microssatélites (CA)15 a partir da hibridação in situ fluorescente mostrou padrões diferenciados de distribuição entre as espécies E. pisonis, D. maculatus e G. guavina (Figura 3). Em E. pisonis, estas sequências ocorrem principalmente na região terminal dos braços longos, e em ambos os braços dos pares 15 e 21. Em G. guavina as regiões marcadas pela sonda (CA)15, se mostraram muito variáveis, ocorrendo exclusivamente em posição terminal dos braços curtos ou longos, ou nessa posição em ambos os braços, e ainda em regiões intersticiais de alguns poucos pares de cromossomos. Na espécie D. maculatus, ocorreram variação na distribuição destas sequências nos cromossomos, contudo

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predominou uma distribuição nas posições terminal de ambos os braços. No par 5, pode ocorrer uma condição heterozigota, com presença e ausência do sinal destas sequências entre os braços curtos dos homólogos (Figura 3). Foram observados sinais dispersos em todas as espécies para sequências microssatélites (CAA)10, entretanto um padrão de localização semelhante foi encontrado nas espécies G. guavina e E. pisonis nas regiões terminais dos braços cromossômicos, em D. maculatus, foram encontrados em regiões terminais dos braços longos e curtos vários cromossomos (Figura 3).

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Figura 3. Hibridização in situ de sequências dinucleotídicas (CA)15 e trinucleotídicas (CAA)10 em Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina. Em destaque no box os pares heterogaméticos da espécie Dormitator maculatus. Barra = 5µm.

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DISCUSSÃO

As espécies analisadas dos quatro gêneros da família Eleotridae indicaram notáveis discrepâncias quanto ao número fundamental, morfologia cromossômica e organização ou localização física de sequências nos cromossomos. Enquanto a maioria tem 2n=46, G. guavina apresenta 2n=52, o maior valor diploide descrito para a família. Adicionalmente, as fórmulas cariotípicas demonstram uma diversificação evolutiva, onde E. pisonis, E. smaragdus e G. guavina apresentam exclusivamente cromossomos acrocêntricos, e D. maculatus um padrão cariotípico diversificado com a ocorrência de diversos elementos bibraquiados, formando diferentes tipos cromossômicos. As espécies E. pisonis, E. smaragdus e D. maculatus ampliam a frequência de cariótipos com 2n=46 para a família Eleotridae, condição considerada basal para Gobiiformes (Vasil’ev & Grigoryam, 1993) (discussão detalhada no Capítulo 2). Entretanto, valores diploides discrepantes (Tabela 1), progressivamente maiores decorrentes de fissões têm sido identificados em algumas espécies, como Gobiomorus dormitor (2n=48; Maldonado-Monroy et al., 1985), G. guavina (2n=52; presente trabalho) e Eleotris picta (2n=52; Uribe-Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996). A diversificação de valores diploides (2n=46-52) e estrutura cariotípica (NF=46-90) em Eleotridae se mostra elevada mesmo entre espécies co-genéricas (Tabela 1), demonstrando uma marcante dinâmica cariotípica decorrente sobretudo da ação de inversões pericêntricas e fissões cromossômicas (Uribe-Alcocer & Diaz- Jaimes, 1996; Molina, 2005). As espécies mostraram uma marcante heterogeneidade intra e interespecífica dos padrões de heterocromatina, seja quanto ao conteúdo ou localização dos blocos nos cromossomos. Essa diversidade de padrões heterocromáticos é bem conhecida em espécies de Gobiiformes, onde algumas espécies, como G. guavina, apresentam heterocromatinas reduzidas e centroméricas (Molina, 2007; Lima-Filho et al., 2012; 2014), ou padrões intersticiais e terminais nos cromossomos, como em D. maculatus. Estas variações sugerem intensas reorganizações internas derivadas de elevada dinâmica evolutiva neste grupo.

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Tabela 1. Informações citogenéticas disponíveis para espécies da família Eleotridae.

Espécie 2n Cariótipo NF Região Referências Uribe-Alcocer et al., Dormitator latifrons 46 12m+22sm+10st+2a 90 Pacífico Oriental 1983; Uribe-Alcocer et al., 1989 Dormitator maculatus 46 36sm+4st+6a 86 Atlântico Ocidental Presente estudo Eleotris acanthopoma 46 46a 46 Indo-Pacífico Arai & Sawada, 1974 Gui et al., 1984; Yu et Eleotris oxycephala 46 46a 46 Indo-Pacífico al., 1989 Uribe-Alcocer & Diaz- Eleotris picta 52 52a 52 Atlântico Ocidental Jaimes, 1996 Molina, 2005 Eleotris pisonis 46 46a 46 Atlântico Ocidental Presente estudo Erotelis smaragdus 46 46a 46 Atlântico Ocidental Presente estudo Maldonado-Monroy et Gobiomorus dormitor 48 2m+4sm+42a 54 Atlântico Ocidental al., 1985 Guavina guavina 52 52a 52 Atlântico Ocidental Presente estudo Hypseleotris 48 48a 48 Indo-Pacífico cyprinoides Suzuki, 1996 Mogurnda mogurnda 46 6sm+40st/a 52 Pacífico Ocidental Arai et al., 1974

O mapeamento de genes ribossomais é particularmente elucidativo na análise da dinâmica evolutiva dos cromossomos de peixes (Gornung, 2013). Variações cromossômicas estruturais interespecíficas podem ser identificadas pela análise de sítios Ag-RONs nos cromossomos (Peres et al., 2008). Em Eleotridae, os sítios Ag-RONs preferencialmente ocorrem em um único par portador, condição mais frequente em Teleostei, sendo considerada uma condição basal para diversos grupos de peixes (Galetti et al., 2000). Análises destes sítios em espécies marinhas tanto de Gobiiformes, como outros grupos, têm permitido evidenciar variações populacionais ao longo do litoral brasileiro e ilhas oceânicas do Atlântico (Lima-Filho et al., 2012; Amorim et al., 2017). O mapeamento de sequências DNAr permite uma maior acuidade na identificação de variações estruturais em cariótipos muito diversificados como os dos Gobiiformes (Ocalewicz & Sapota, 2011; Lima-Filho et al., 2014). Apesar da presença de um par portador dos sítios DNAr 18S em todas as espécies desse estudo sugerir condições de conservadorismo evolutivo destes sítios, identifica-se uma conspícua diversificação na sua organização com os sítios DNAr 5S e sua localização nos cromossomos das espécies. Arranjos independentes de DNAr 18S e 5S em cromossomos distintos, como em G. guavina, representa uma condição considerada ancestral e conservada em alguns grupos de peixes (Motta-Neto et al., 2011). Por outro lado, sítios múltiplos de DNAr 18S e 5S bem como arranjos sintênicos são considerados apomórficos

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(Gornung, 2013), cuja diversificação pode estar atrelada à ação de elementos móveis (Hett et al., 2011; Lima-Filho et al., 2014). De fato, as regiões ribossomais de DNAr 5S são sítios genômicos passíveis de atuação de elementos transponíveis promovendo dispersão em larga escala nos cromossomos (Cioffi et al., 2010). Em gobídeos do gênero Ctenogobius, sequências DNAr 5S podem ocorrer em um único par cromossômico ou, em consequência da ação de elementos transponíveis, largamente dispersas no cariótipo (Lima-Filho et al., 2014). Arranjos co-localizados das sequências ribossomais 18S e 5S em E. pisonis sugere uma condição derivada. A co-localização dessas sequências em Gobiiformes se mostra pouco comum, no entanto têm sido reportada em espécies continentais da região Neotropical e em outros grupos de peixes marinhos do Atlântico Ocidental (Vicari et al., 2006; Nirchio et al., 2014). Em D. maculatus os sítios DNAr 5S se mostram polimórficos. Alguns indivíduos os sítios DNAr 18S ocorrem no par 4 e sítios DNAr 5S no par 5. Outros indivíduos apresentam uma arranjo alternativo com 18S/5S co-localizado e um sítio simples DNAr 18S, respectivamente, em cada um dos homólogos do par 4, e um sítio DNAr 5S sobre um único homólogo do par 5. Devido ao número amostral analisado não foi possível descartar uma associação deste polimorfismo a ocorrência de cromossomos sexuais. De fato, os arranjos encontrados poderiam indicar para a espécie um sistema de cromossomos sexuais múltiplos X1X2Y onde os cromossomos portadores de sítios 18S, 5S e 18S/5S representassem respectivamente os cromossomos X1, X2 e Y, capaz de manter o balanço gênico destes genes entre sexos (Cioffi et al., 2011). Esta condição merece esforços futuros de investigação, tendo em vista que sequências DNAr 5S já foram identificadas nos cromossomos Y de outros Gobiiformes (Lima-Filho et al., 2014), ou em localização diversas entre os cromossomos X e Y (Chen et al., 2008). A diversificação cariotípica em Eleotridae, reflete uma evolução permeada por fragmentações populacionais com efeitos evolutivos diretos sobre a diversificação genômica e à fixação de rearranjos cromossômicos no cariótipo (Molina, 2005). Essa condição se mostra presente em D. maculatus, na qual os padrões cariotípicos dos indivíduos da costa nordeste do Brasil, se mostraram divergentes daqueles da costa sudeste brasileira, onde regiões heterocromáticas foram associadas a presença de um sistema de cromossomos sexuais do tipo XY (Oliveira & Toledo, 2006) e do

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México (Uribe-Alcócer, 1989). Desta forma, nesta espécie além de se destacar o extremo dinamismo cromossômico, os resultados sugerem a existência de espécies crípticas. Sequências microssatélites podem apresentar padrões variáveis de acúmulo nos cromossomos dos peixes (Cioffi et al., 2012; Lima-Filho et al., 2014). Nas espécies de Eleotridae o mapeamento de sequências (CA)15 e (CAA)10 indicou uma distribuição em clusters bem definidos localizados nas regiões terminais, centroméricas e, em menor grau, ocupando regiões intersticiais dos cromossomos.

Em Eleotris pisonis, sequências (CA)15 ocorreram em maior quantidade nas regiões terminais dos braços longos dos cromossomos. Guavina guavina apresentou uma distribuição intermediária de cromossomos com sequências (CA)15 em uma ou ambas as regiões terminais dos braços cromossômicos, enquanto D. maculatus exibiu a maioria dos cromossomos com sequências (CA)15 distribuídas nas regiões terminais de ambos os braços cromossômicos. As sequências (CAA)10 revelaram uma distribuição espécie-específica, com ausência de sinais em alguns pares de cromossomos. O mapeamento das sequências microssatélites revelam uma sobreposição incompleta com os padrões de bandamento C nas espécies, apontando a ocorrência de heterocromatinas heterogêneas nas espécies desta família. As sequências de microssatélites estão sujeitas a altas taxas de recombinação no genoma e sua distribuição entre as espécies, mostram caminhos evolutivos distintos, que podem ser resultados de rearranjos diferentes entre as espécies (Xu et al., 2017). A distinção morfológica críptica em algumas de suas espécies, o grande potencial de fragmentação populacional e a notável diversidade cariotípica interespecífica e intragenérica, tornam a análise citogenômica uma ferramenta resolutiva na prospecção de dados carioevolutivos e relação com o processo de diversificação da família. Os dados apresentados contribuíram para demonstrar um padrão citogenético com elevada taxa de diferenciação, indicando distintos caminhos evolutivos dos cromossomos seguidos por quatro gêneros da família Eleotridae.

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49 Capítulo I – Divergência de sequências repetitivas do DNA de peixes da família Eleotridae

Perciformes): evidence of interspecific chromosomal diversification. Molecular Cytogenetics, 1-8.

50 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

5.2 Capítulo II

Aspectos carioevolutivos da Ordem Gobiiformes (Teleostei): condição cariotípica basal do grupo

Resumo

A ordem Gobiiformes apresenta 9 famílias, 268 gêneros e 2.121 espécies, constituindo um dos maiores grupos de vertebrados. Suas espécies com vasta distribuição geográfica habitam águas marinhas, salobras e dulcícolas de regiões da Oceania, Ásia, Europa e Américas. Dados citogenéticos disponíveis para esse grupo são muito reduzidos, os quais revelam notáveis variações de valores diploides (2n=30-56) e no número de braços cromossômicos (NF=40-98). Com vistas a auxiliar no estabelecimento do cariótipo basal para a ordem e correlacionar seus padrões de diversificação cariotípica com fatores biológicos e ambientais, foram realizados um extenso levantamento das informações citogenéticas para a ordem, através de revisão da literatura, e de diferentes bases de dados eletrônicos. Foram obtidas uma extensa quantidade de informações citogenéticas para 139 espécies, cerca de 6% do total de espécies, distribuídas em 5 famílias e 54 gêneros. Parâmetros cromossômicos como números diploides (2n), fórmulas cariotípicas e números de braços cromossômicos (NF), foram analisados sob perspectiva filogenética e correlacionados com alguns aspectos biológicos como capacidade de dispersão em diferentes fases ontogenéticas, associação ao substrato tolerância metabólica osmótica, todos com possível influência na diversificação das espécies. A ocorrência em diferentes ramos evolutivos em maior frequência sugere que 2n=46a seja o cariótipo basal para Gobiiformes. A diversidade cariotípica presente em Gobiiformes parece associada aos fatores biológicos e ecológicos, como fragmentação ambiental e baixa vagilidade. O conjunto de dados citogenéticos das espécies de Gobiiformes, associado aos parâmetros biológicos contribui para uma melhor compreensão dos processos carioevolutivos ocorridos neste grupo.

Palavras-chave: Diversificação cariotípica, cariótipo basal, evolução cromossômica, Revisão bibliográfica.

INTRODUÇÃO

A ordem Gobiiformes contém 2.121 espécies catalogadas, divididas entre 9 famílias e 268 gêneros (Nelson et al., 2016). Seus aspectos sistemáticos tem merecido muita atenção há bastante tempo, sendo considerado um grupo monofilético a partir de dados moleculares e morfológicas (Thacker, 2003). Informações mais recentes, elevaram a subordem Gobioidei, anteriormente inserida em Perciformes, como uma nova ordem, Gobiiformes, com a inclusão de novas famílias e reorganizações dentro das famílias (Betancur et al., 2013),

51 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

apresentando como grupos irmãos as famílias Kurtidae e Apogonidae (Betancur et al., 2017). Análises filogenéticas e biogeográficas em Gobiiformes do Indo-Pacífico, indicam que o surgimento do grupo ocorreu a aproximadamente 65 M.a no Paleoceno, onde a família Eleotridae, surgida a cerca de 45 M.a, representa o ramo mais basal vivente. Já a subfamília Benthonphillinae (Gobiidae), originado a cerca de 10 M.a, com ramificações de até 2 M.a, apresentando-se como um dos grupos mais recentes (Neilson & Stepien, 2009). Os representantes da Ordem Gobiiformes ocupam vastas áreas geográficas de regiões tropicais e subtropicais, incluindo a Oceania, Ásia, Europa e Américas. Nestas regiões habitam os ambientes marinhos, estuários e águas continentais (Fanta, 1997; Ruber et al., 2003; Rocha et al., 2005). Apresentam em geral capacidade dispersiva bastante restrita, devido a dispersão passiva de ovos ou ativa de adultos, promovendo condições para a fragmentação das populações (Moreira- Filho & Bertollo, 1991), tornando um excelente modelo carioevolutivo em peixes (Lima-Filho et al., 2012). Uma variedade de rearranjos cromossômicos está relacionada na diversificação cariotípica dos Gobiiformes, onde se destacam as inversões pericêntrica e fusões Robertsonianas, mas também ocorrem processos de fusão in tandem e fissões cromossômicas (Caputo et al., 1997; Amores et al., 1989; Prazdnikov et al., 2013). Adicionalmente, são encontradas espécies com polimorfismo cromossômico numérico e estrutural, além de padrões cariotípicos marcadamente diferenciados (Nishikawa et al., 1974; Webb, 1986; Ene, 2003). Em meio a essa variação, existem controvérsias sobre o valor basal para a ordem, sendo 2n=46 cromossomos acrocêntricos considerado basal dada a sua maior frequência neste grupo (Vasil’ev & Gregorian, 1993). Contudo, análises complementares utilizando bases filogenéticas são necessárias para referendar esta condição. Adicionalmente, a correlação de mudanças cromossômicas deste grupo com padrões ambientais são perspectivas a serem analisadas para uma melhor compreensão da diversificação cariotípica.

52 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

MATERIAL E MÉTODOS

Dados citogenéticos relativos ao número diploide (2n), fórmula cariotípica, número fundamental (NF), bem como aspectos biológicos como comportamento bentônico ou pelágico, distribuição em ambientes marinhos, estuarinos e continentais, ovos adesivos ou pelágicos, foram obtidas para 139 espécies distribuídas em 54 gêneros de 5 famílias da Ordem Gobiiformes. Os parâmetros analisados, foram obtidos a partir de busca sistemática, não delimitando idioma ou período de publicação, em bases eletrônicas de dados ResearchGate, PubMed, SciELO, Fish Base, IUCN RedList, WoRMS, California Academy of Sciences e GBIF, utilizando os descritores: “karyotype” combinado com “Eleotridae”, com “Gobiidae” e demais famílias; “Cytogenetics” – “Gobioidei”; nomes de espécies e da checklist apresentada no livro Fish Karyotypes (Arai, 2011). Para o desenvolvimento das análises as espécies foram organizadas de acordo com a classificação de Nelson et al. (2016). Os dados foram tabelados e sobrepostos a partir de relações filogenéticas baseadas em dados moleculares com abrangência para o maior número de espécies com informações citogenéticas. Por esse critério foi escolhida a proposta filogenética para a Ordem apresentada em Thacker et al. (2009), excluindo-se ramos relativos às espécies sem informações citogenéticas. Foram tabuladas as frequências de valores diploides (2n<46; 2n=46, 2n>46) e números de braços cromossômicos (NF<46; NF=46, NF>46), associando- os aos parâmetros biológicos e ecológicos como tipo de hábitat; hábito bentônico, pelágico ou bentônico-pelágico; ovos adesivos ou ovos pelágicos.

RESULTADOS

A análise amostral dos dados citogenéticos representa 6% do total de espécies da Ordem Gobiiformes. A variação do número de cromossomos alternou- se de 2n=30 a 56 cromossomos, com um valor diploide modal de 2n=46. A família Gobiidae representou 36% do total das espécies cariotipadas da Ordem, 42% das espécies tinha 2n=46, 24% com 2n=44, 14% mostrou-se com 2n=48, 8% com 2n=38, 4% das espécies possuem 2n=32 e 8% apresentavam valores menos representativos (2n=30, 36, 40 e 50 cromossomos). A variação do

53 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

número de braços cromossômicos se mostrou extensa, variando de NF=38 a 98 (Tabela 1).

Tabela 1. Frequência de valores diploides (2n) e de números de braços cromossômicos (NF) conhecidos para os gêneros e subfamílias da ordem Gobiiformes. Dados inexistentes foram identificados por traço (-).

Gêneros 2n 2n médio 2n modal NF NF médio NF modal

Acentrogobius 50 50 50 98 98 98

Amblygobius 44 44 44 46 46 46

Aphia 44 44 44 44 44 44

Bathygobius 48 48 48 48 - 76 58 -

Benthophilus 44 44 44 48 - 46 44 -

Caspiosoma 48 48 48 82 82 -

Favonigobius 48 48 48 96 96 -

Tigrigobius 38 38 38 38 38 38

Gobiopsis 46 46 46 60 60 60

Glossogobius 44 - 46 45 - 84 - 46 65 -

Gobiodon 44 44 44 44 - 46 44 44

Gobius 38 - 50 44 46 46 - 74 51 46

Ponticola 46 40 46 46 46 46

Pomatoschistus 32 - 46 41 46 46 - 86 74 -

Valenciennea 44 - 46 45 - 46 46 46

Dormitator 46 46 46 90 90 90

Eleotris 46 - 52 48 46 46 - 52 48 46

Erotelis 46 46 46 46 46 46

Gobiomorus 48 48 48 54 54 54

Hypseleotris 48 48 48 48 48 48

Morgunda 46 46 46 52 52 52

Micropercops 44 44 44 44 44 44

Odontobutis 44 44 44 44 44 44

Percottus 44 44 44 44 44 44

Bostrychus 48 48 48 52 52 52

Ophiocara 48 48 48 48 48 48

Oxyeleotris 46 46 46 48 – 52 52 -

Subfamilia

Apocryptei 38 - 48 44 46 66 – 80 52 -

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Boleophthalmi 46 - 56 46 46 46 – 92 55 46

Sicydiinae 44 44 44 64 64 64

Gobioneliinae 40 - 56 88 44 40 – 92 52 44

Amblyopinae 46 46 46 74 74 74

Para Eleotridae os dados citogenéticos correspondem a 11 espécies. Desse valor, 64% (7 ssp.) apresentaram 2n=46, representando a condição mais frequente. 18% (2 ssp.) das espécies com 2n=48 e 18% (2 ssp.) das espécies apresentou um cariótipo com maior número de cromossomo (2n= 52) para a família. Com relação ao NF, houve uma variação entre 46 a 90, sendo NF=46 o mais frequente entre as espécies. Odontobutidae possui o menor número de espécies com dados cariotípicos conhecidos (Arai, 2011). Suas 4 espécies apresentam 2n=44 cromossomos acrocêntricos. A família Butiidae apresenta dados citogenéticos para 5 espécies, que exibem 2n=46 e 2n=48, com NF variando entre 48 e 58 (Donsakul et al., 2005; Chen et al., 2006). Os dados cromossômicos para a família Oxudercidae foram obtidos de 69 espécies, sendo discriminados em cinco subfamílias. A maior frequência foi de cariótipos com 2n=44 cromossomos, em sua maioria formada por cromossomos acrocêntricos. Do total, 37% (25 ssp.) das espécies tinha 2n=44, sendo este o valor modal para a família; 31% (21 ssp.) apresentaram 2n=46, 10% (7 ssp.) com 2n=48, 9% (6 ssp.) das espécies com 2n=42, 6% (4 ssp.) com 2n=56, 3% (2 ssp.) com 2n=40, duas espécies (3%) com 2n= 38, e 1% (1 ssp.) com 2n=50. O NF mostra uma grande diversidade entre os taxa desse grupo variando de 40 a 92, apesar de muitas espécies exibirem cariótipos com todos os cromossomos acrocêntricos (Arai & Sawada, 1974; Lima-Filho et al., 2014). As análises de variação cromossômica em relação a fatores biológicos como hábitos bentônico, pelágico e bentônico/ pelágico (Tabela 2), indicaram que espécies bentônicas apresentam maior divergência de 2n e NF. Indivíduos com hábitos pelágicos e bento-pelágicos, por outro lado, apresentam maior frequência de cariótipos conservados.

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Tabela 2. Frequência de números diploides (2n) e Número Fundamental (NF) quanto aos hábitos bentônico (B), pelágico (P) e bento-pelágico (B/P), para a Ordem Gobiiformes e suas famílias. O número de espécies está apresentado entre parênteses.

Gobiiformes 2n B (%) P (%) B/P(%) NF B (%) P(%) B/P(%) <46 41,7 (43) 50 (2) 52,4 (11) <46 13 (13) 0 (0) 23,5 (4) 46 34,0 (35) 50 (2) 47,3 (10) 46 22 (22) 33,3 (1) 47,0 (8) >46 24,3 (25) 0 (0) 0 (0) >46 65 (65) 66,7 (2) 29,5 (5) Total 103 4 21 Total 100 3 17 Gobiidae <46 52,4 (22) 33,3 (1) 50 (4) <46 10,8 (4) 25 (1) 7,1 (1) 46 28,6 (12) 66,7 (2) 50 (4) 46 35,2 (13) 25 (1) 42,9 (6) >46 19,0 (8) 0 (0) 0 (0) >46 54,0 (20) 50 (2) 50,0 (7) Total 42 3 8 Total 37 4 14 Oxudercidae <46 50,0 (22) 100 (1) 54 (6) <46 14,0 (6) 0 (0) 28,6 (2) 46 32,6 (16) 0 (0) 46 (5) 46 11,6 (5) 0 (0) 14,2 (1) >46 22,4 (11) 0 (0) 0 (0) >46 74,4 (32) 100 (1) 57,2 (4) Total 49 1 11 Total 43 1 7 Butiidae <46 0 (0) 0 (0) 0 (0) <46 0 (0) 0 (0) 0 (0) 46 60 (3) 0 (0) 0 (0) 46 0 (0) 0 (0) 0 (0) >46 40 (2) 0 (0) 0 (0) >46 100 (5) 0 (0) 0 (0) Total 5 0 0 Total 5 0 0 Eleotridae <46 0 (0) 0 (0) 0 (0) <46 0 (0) 0 (0) 0 (0) 46 60 (6) 0 (0) 100 (1) 46 30 (3) 0 (0) 100 (1) >46 40 (4) 0 (0) 0 (0) >46 70 (7) 0 (0) 0 (0) Total 10 1 Total 10 1 Odontobutidae <46 100 (3) 0 (0) 100 (1) <46 100 (3) 0 (0) 100 (1) 46 0 (0) 0 (0) 0 (0) 46 0 (0) 0 (0) 0 (0) >46 0 (0) 0 (0) 0 (0) >46 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 3 1 Total 3 1

A associação dos valores 2n e NF em relação ao tipo de ovos (Tabela 3) indicou que espécies com ovos adesivos e bentônicos apresentam maior variação

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em relação ao padrão basal proposto para a Ordem Gobiiformes. Espécies pelágicas ou bento-pelágicas tem em geral uma elevada proporção de espécies com padrões conservados. Tabela 3. Dados citogenéticos de 2n e NF e sua frequência no quesito características reprodutivas, Ovos bentônicos (OB) e Ovos pelágicos (OP) organizados por ordem. O número de espécies está apresentado entre parênteses.

Ordem Gobiiformes 2n OB (%) OP (%) NF OB (%) OP (%) <46 45,2 (19) 0 (0) <46 23,8 (10) 0 (0) 46 33,3 (14) 50 (1) 46 23,8 (10) 50 (1) >46 21,5 (9) 50 (1) >46 52,4 (22) 50 (1) Total 42 2 42 2

Variações citogenéticas em relação ao tipo de ambiente foram analisadas para 124 espécies organizadas em seis categorias (Tabela 4). Os resultados demonstraram que a variação cromossômica não se mostra à princípio conspicuamente relacionada aos arranjos ambientais estabelecidos.

Tabela 4. Frequência do número diploide e Número Fundamental em relação ao tipo de ambiente. M= Marinho, D= Dulcícola, E= Estuarino. Espécies que habitam mais de um ambiente são identificadas.

Gobiiformes 2n M - M/E (%) D - D/E (%) E - M/D/E (%) NF M - M/E (%) D - D/E (%) E-M/D/E (%) <46 54,1 (20) 37 (17) 36,7 (15) <46 16,6 (6) 21 (9) 7,3 (3) 46 18,9 (7) 45,7 (21) 46,3 (19) 46 19,4 (7) 34,8 (15) 22,0 (9) >46 27,0 (10) 17,3 (8) 17 (7) >46 64 (23) 44,2 (19) 70,7 (29) Total 37 46 41 36 43 41 Gobiidae <46 45,4 (10) 23,5 (4) 66,7 (6) <46 17,3 (4) 6,2 (1) 9 (1) 46 27,3 (6) 58,8 (10) 33,3 (3) 46 30,4 (7) 62,5 (10) 45,5 (5) >46 27,3 (6) 17,7 (3) 0 >46 52,3 (12) 31,3 (5) 45,5 (5) Total 22 17 9 22 16 11 Oxudercidae <46 78,6 (11) 34 (5) 40,6 (13) <46 15,3 (2) 33,3 (4) 7,7 (2) 46 7,1 (1) 46 (7) 40,6 (13) 46 8,7 (1) 16,7 (2) 7,7 (2) >46 14,3 (2) 20 (3) 18,8 (6) >46 76 (10) 50,0 (6) 84,6 (22) Total 14 15 32 13 12 26 Butiidae <46 0 0 0 <46 0 0 0 46 - - - 46 - - -

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>46 100 (1) 100 (1) 0 >46 100 (1) 100 (1) Total 1 1 0 1 1 0 Eleotridae <46 0 0 0 <46 0 0 0 46 0 66 (4) 60 (3) 46 0 20 (1) 40 (2) >46 0 34 (2) 40 (2) >46 0 80 (4) 60 (3) Total 0 6 5 0 5 5 Odontobutidae <46 0 100 (4) 0 <46 0 100 (4) 0 46 0 0 0 46 0 0 0 >46 0 0 0 >46 0 0 0 Total 0 4 0 0 4 0 *Espécies com mais de um hábitat estão somadas nas categorias M, D e E. com os hábitats separadas por ‘/’. Os traços (-) representam a ausência de dados.

A distribuição dos valores diploides em relação aos padrões de divergência dentro da Ordem Gobiiformes (Figura 1) demonstra que 2n=46 é a condição mais difundida em todos os clados, desde basais aos mais modernos. O valor diploide de 44 cromossomos também é frequente e difundido, mas com frequência mais alta prevalência em grupos específicos.

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Figura 1. Distribuição dos valores 2n e NF por espécie ou gênero em famílias da ordem Gobiiformes, sob perspectiva filogenética (adaptado de Thacker, 2009). Linhas vermelhas destacam espécies ou gêneros com 2n=46. Entre parênteses é apresentada a quantidade de espécie por gênero com dados citogenéticos disponíveis.

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DISCUSSÃO

O valor diploide mais frequente entre as espécies de Gobiiformes foi 2n=46 cromossomos, sobretudo de cariótipos compostos apenas por cromossomos acrocêntricos. Essa condição vem sendo considerada como plesiomórfica para a família Gobiidae devido a frequência de ocorrência (Grigoryan & Vasil’ev, 1993). Em Eleotridae e Butiidae 2n=46 cromossomos acrocêntricos é uma condição frequente, enquanto outras demonstram uma maior representatividade de cariótipos com 2n=44 cromossomos. Essa condição constitui o segundo valor diploide mais frequente na Ordem, sendo frequente em Oxudercidae e Odontobutidae. Exceto em Odontobutidae, cujas espécies apresentaram exclusivamente 2n=44, todas as demais famílias, desde as mais basais às mais derivadas, apresentaram cariótipos com 2n=46 cromossomos. As complexas relações evolutivas das espécies da Ordem Gobiiformes têm requerido análises filogenéticas baseadas em dados moleculares e morfológicos, com suporte de informações citogenéticas (Thacker, 2003, 2009; Galvão et al., 2011; Lima-Filho et al., 2017). Diante das filogenias utilizadas para as espécies da Ordem Gobiiformes (Thacker et al., 2009; Betancur et al., 2013), identificou-se que tanto grupos mais basais, quanto grupos mais recentes exibem maior frequência de cariótipos com 2n=46. Apesar de Odontobutidae, uma ramificação basal para a Ordem apresentar 2n=44, algumas evidências apontam que a família Eleotridae, com prevalência de cariótipos com 2n=46, teve um surgimento mais antigo (65 M.a), do que Odontobutidae, que teria divergido posteriormente (50 M.a) (Neilson & Stepien, 2009). Esta ordem de divergência apoia uma condição apomórfica para 2n=44 presente em Odontobutidae. Além disso, essa família tem informações restritas a um pequeno número de espécies, necessitando de maior cobertura taxonômica para aferir a extensão desse valor diploide no grupo. Em Oxudercidae, a subfamília Gobioneliinae apresenta uma frequência maior de cariótipos com 2n=44, enquanto em Apocryptei e Boleophthalmi 2n=46 cromossomos é a condição mais frequente, sugerindo que 44 cromossomos possa representar uma característica homoplásica entre alguns grupos de Gobiiformes.

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Ambos os valores 2n mais frequentes (2n=46 e 2n=44) estão presentes em dois grupos irmãos de Gobiiformes. Apogonidae, filogeneticamente próximo à Gobiiformes (sensu Betancur et al., 2017), possui uma frequência maior de conjuntos diploides com 46 cromossomos (Arai, 2011), enquanto, outro grupo próximo (família Kurtidae) apresenta 2n=44 (Ezaz et al., 2006). Os dados mostram uma grande diversificação do número cromossômico nas espécies de Gobiiformes. Entre esses, 2n=46 constitui o valor modal presente em 36% das espécies. Contudo, aproximadamente 63% das espécies apresentam cariótipos diversificados, com variações quanto ao número de cromossomos, fórmulas cariotípicas e número de braços cromossômicos (Arai, 2011; Lima-Filho et al., 2014). Esse padrão difere significantemente de outras Ordens, como Perciformes, que apresenta um marcante conservadorismo cromossômico (Molina, 2007). A dinâmica evolutiva das sequências DNAr 18S e 5S nas espécies de Gobiiformes reforça a massiva reorganização interna de seus cromossomos, assim como ocorre em famílias próximas (Amorim et al., 2016). Os sítios DNAr 18S apesar de em geral ocorrerem em um par cromossômico, sua localização e posição são notavelmente divergentes entre as espécies (Ocalewicz & Sapota, 2011; Lima-Filho et al., 2012; Lima-Filho et al., 2014). Sítios DNAr 5S, com alto grau de diversificação evolutiva em peixes, também se mostram evolutivamente dinâmicos, com variações na frequência, localização e posicionamento nos cromossomos (Cioffi et al., 2011). Em alguns casos, apresentam arranjos sintênicos com o DNAr 18S (e.g. E. smaragdus), ou arranjos polimórficos (e. g. D. maculatus), podendo ainda ser encontrados em cromossomos sexuais (Lima-Filho et al., 2014). A diversidade cromossômica nas espécies da Ordem Gobiiformes, é reflexo da ocorrência de vários mecanismos de variação cromossômica. Existem exemplos de variação cromossômica intraespecífica, como na espécie Aphia minuta, com números diploides variando de 41 a 44 cromossomos (Caputo et al., 1999). No gênero Gobius, ocorrem marcantes variações com relação ao 2n e NF, como em Gobius cobitis, com 2n=46, G. fallax, com 2n=40 e G. niger, com 2n=50 (Thode et al., 1988; Grigoryan & Vasiliev, 1993; Caputo et al., 1997). Foram descritas também

61 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

variações interpopulacionais na espécie Bathygobius soporator envolvendo variações com relação aos sítios DNAr 5S (Lima-Filho et al., 2012). Diante da diversidade de espécies, a família Gobiidae é o grupo com maior quantidade de dados citogenéticos (Arai, 2011). Sua diversificação filética tem sido acompanhada em grande parte pela fixação de diferentes tipos de rearranjos cromossômicos (Caputo et al., 1997; Amores et al., 1989; Prazdnikov et al., 2013). Toda essa diversidade cariotípica presente na Ordem Gobiiformes parece estar associada a alguns fatores biológicos específicos deste grupo. Os dados aqui analisados sugerem sobretudo uma correspondência com o tipo de hábitat, e aspectos reprodutivos, ambos com interferência sobre os padrões dispersivos das espécies, proporcionando a ocorrência de estratificações populacionais ou mesmo espécies crípticas (Uribe-Alcócer et al., 1989; Molina, 2005). Os dados obtidos trazem novas perspectivas de entendimento da evolução cromossômica no grupo e consolidam esse como um dos grupos modelo quanto a congruência da diversificação filética e cariotípica.

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63 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

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64 Capítulo II – Carioevolução da ordem Gobiiformes: condição do cariótipo basal

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65 Conclusões

CONCLUSÕES

• A Ordem Gobiiformes apresenta uma enorme diversificação citogenética. Essa diversidade cariotípica ocorre em diferentes níveis, que vão do valor diploide, e macroestrutura cariotípica, até os arranjos das sequências DNAr. A família Eleotridae reflete esse padrão evolutivo, exibindo uma elevada reorganização interna dos cromossomos, resultado de diferentes caminhos evolutivos.

• A diversificação cromossômica em Gobiiformes, revela profunda relação com suas características biológicas. A análise conjunta dos padrões cariotípicos e aspectos biológicos permite compreender essa íntima associação. O conjunto de dados analisados sob perspectiva filogenética destaca que 2n=46 representa uma condição plesiomórfica para a Ordem. Meta-análises são ainda raras em grupos de peixes, mas se mostram efetivas em entender como fatores biológicos (intrínsecos) e ambientais (extrínsecos) contribuem como gatilhos para a elevada taxa de diferenciação cariotípica neste notável grupo de peixes.

• A família Eleotridae pode apresenta interessantes estruturações populacionais, perculiarmente observadas nos sítios DNAr 5S que podem revelar considerável dinâmica de localização física e arranjos dos sítios, podendo estar possivelmente associadas ao sexo.

66 Anexo

ANEXO

Tabela 1. Dados citogenéticos da ordem Gobiiformes.

Família/Espécie 2n Fórmula Cariotípica NF Referências Localização Gobiidae Gobiinae Acentrogobius pflaumii 50 48m/sm+2st/a 98 Nogusa (1960) Pacífico Ocidental Amblygobius albimaculatus 44 2m+42st/a 46 Nishikawa et al. (1974) Indo-Pacífico Amblygobius phalaena 44 2m+24st/a 46 Arai et al. (1974) Indo-Pacífico Aphia minuta 44 44a 44 Caputo et al. (1999) Atlântico Oriental Bathygobius fuscus 48 48a 48 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Bathygobius soporator 48 2m+6st+40a 56 Lima-Filho et al. (2012) Atlântico Ocidental Bathygobius geminatus 48 2m+4st+42a 54 Lima-Filho et al. (2015) Atlântico Ocidental Bathygobius sp. 48 28st+20a 76 Lima-Filho et al. (2012) Atlântico Ocidental Benthophilus leobergius 44 2sm+2st+40a 48 Grigoryan & Vasil‘ev (1993) Indo-Pacífico Benthophilus stellatus 44 2st+42a 46 Grigoryan & Vasil‘ev (1993) Indo-Pacífico Caspiosoma caspium 48 4sm+30st+14a 82 Grigoryan & Vasil‘ev (1993) Indo-Pacífico Favonigobius gymnauchen 48 48m/sm 96 Lee et al. (1987) Indo-Pacífico Coryphopterus glaucofraenum 40 2sm+38a 42 Atlântico Ocidental Tigrigobius macrodon 38 38a 38 Musammil (1974) Atlântico Ocidental Tigrigobius zebrellus 38 38a 38 Musammil (1974) Atlântico Ocidental Gobiopsis macrostoma 46 10m+4sm+32a 60 Khuda-Bukhsh et al. (1995) Indo-Pacífico Glossogobius olivaceus 44 10m+28sm+2st+4a 84 Fei & Tao (1987) Indo-Pacífico Glossogobius giuris 46 46a 46 Rishi & Singh (1982) Indo-Pacífico Gobiodon citrinus 44 2m+42st/a 46 Arai & Sawada (1974) Indo-Pacífico Gobiodon quinquestrigatus 44 44a 44 Arai & Fujiki (1979) Indo-Pacífico Gobiodon rivulatus 44 44a 44 Arai & Fujiki (1979) Indo-Pacífico Gobius bucchichi 44 2sm+42a 46 Thode & Alvarez (1983) Atlântico Oriental Gobius cobitis 46 46a 46 Caputo et al. (1997) Atlântico Oriental Gobius couchi 46 2sm+44a 48 Miller & El-Tawil (1974) Atlântico Oriental Gobius cruentatus 46 2st+44a 48 Thode & Alvarez (1983) Atlântico Oriental Gobius fallax 38 8m/sm+30a 46 Thode et al. (1988) Atlântico Oriental Gobius niger 49 5m+4sm+16st+24a 74 Caputo et al. (1997) Zosterisessor ophiocephalus 46 46a 46 Vasil‘ev (1985) Atlântico Oriental Gobius paganellus 48 2sm+46a 50 Caputo et al. (1997) Atlântico Oriental Rhinogobius similis 44 -- -- Nogusa (1960) Pacífico Ocidental Gobiusculus flavescens 46 6m/sm+40a 52 Klinkhardt (1992) Atlântico Oriental Mesogobius batrachocephalus 30 16m+14a 46 Ivanov (1975) Atlântico Oriental Neogobius melanostomus 46 46a 46 Vasil‘ev (1985) Atlântico Oriental Ponticola cyrius 38 8m/sm+30a 46 Vasil‘ev & Vasil‘eva (1994) Atlântico Oriental Ponticola constructor 42 4m/sm+38a 46 Vasil‘ev & Vasil‘eva (1994) Atlântico Oriental Neogobius fluviatilis 46 46a 46 Vasil‘ev (1985) Atlântico Oriental

67 Anexo

Ponticula eurycephalus 32 12m+2sm+18a 46 Ene (2003) Atlântico Oriental Vasil‘ev & Grogoryan Babka gymnotrachelus 46 46a 46 (1992) Atlântico Oriental Ponticola gorlap 46 46a 46 Vasil‘ev (1985) Atlântico Oriental Ponticola rhodioni 46 46a 46 Vasil‘ev & Vasil‘eva (1994) Atlântico Oriental Padogobius bonelli 46 1m+3sm+2st+40a 52 Cataudella et al. (1973) Atlântico Oriental Pomatoschistus lozanoi 37 3m+12sm+10st+12a 62 Webb (1986) Atlântico Oriental Pomatoschistus microps 46 4m+16sm+20st+6a 86 Klinkhardt (1989) Atlântico Oriental Pomatoschistus minutus 46 18sm+18st+10a 82 Klinkhardt (1992) Atlântico Oriental Pomatoschistus norvegicus 32 10m+10sm+8st+4a 60 Webb (1986) Atlântico Oriental Pomatoschistus adriaticus 46 22m/sm+12st+12a 80 Klinkhardt (1992) Atlântico Oriental Proterorhinus marmoratus 46 46a 46 Rab (1985) Atlântico Oriental Zosterisessor ophiocephalus 46 2m/sm+44a 48 Caputo et al. (1996) Indo-Pacífico Khuda-Bukhsh & Nayak Valenciennea muralis 46 46a 46 (1990) Indo-Pacífico Valenciennea strigata 44 2m+42st/a 46 Arai & Sawada (1974) Eleotridae Uribe-Alcocer et al., 1983; Dormitator latifrons 46 12m+22sm+10st+2a 90 Uribe-Alcocer et al., 1989 Pacífico Oriental Dormitator maculatus 46 12m+22sm+10st+2a 90 Molina, 2005 Atlântico Ocidental Eleotris acanthopoma 46 46a 46 Arai e Sawada, 1974 Indo-Pacífico Gui et al., 1984; Yu et al., Eleotris oxycephala 46 46a 46 1989 Indo-Pacífico Uribe-Alcocer e Diaz- Eleotris picta 52 52a 52 Jaimes, 1996 Atlântico Ocidental Eleotris pisons 46 46a 46 Molina, 2005 Atlântico Ocidental Erotelis smaragdus 46 46a 46 Presente estudo Atlântico Ocidental Maldonado-Monroy et al, Gobiomorus dormitor 48 2m+4sm+42a 54 1985 Atlântico Ocidental Guavina guavina 52 52a 52 Presente estudo Atlântico Ocidental Hypseleotris cyprinoides 48 48a 48 Suzuki, 1996 Indo-Pacífico Mogumda moguma 46 6sm+40st/a 52 Arai et al., 1974 Pacífico Ocidental Odontobutidae Micropercops swinhonis 44 44a 44 Dong, Y.K. (1984) Indo-Pacífico Arai, R. et al (1974) ; Ojima, Y. and Yamamoto, Odontobutis obscura 44 44st/a 44 K. (1990) Indo-Pacífico Odontobutis platycephalos 44 44st/a 44 Indo-Pacífico Percottus glehni 44 44st/a 44 Indo-Pacífico Butidae Bostrychus sinensis 48 4m+44st/a 52 Fei e Tao, 1987 Indo-Pacífico Ophiocara porocephala 48 48st/a 48 Arai e Fujiki, 1979 Indo-Pacífico Oxyeleotris lineolatus 46 2sm+8st+36a 48 Chen et al., 2006 Pacífico Ocidental Oxyeleotris marmorata 46 2m+2sm+42a 50 Zhu et al., 2003 Indo-Pacífico Oxyeleotris urophthalmoides 46 6m+6sm+8st+26a 58 Donsakul et al., 2005 Indo-Pacífico Oxudercidae

68 Anexo

Apocryptei Nayak & Khuda-Bukhsh Apocryptes bato 46 24m+10sm+12a 80 (1987) Indo-Pacífico Nayak & Khuda-Bukhsh Apocryptes lanceolatus 38 14m+22sm+2st 76 (1987) Indo-Pacífico Apocryptodon madurensis 48 Verma (1968) Indo-Pacífico Apocryptodon punctatus 42 24m/sm+18st/a 66 Matsuo (1998) Parapocryptes serperaster 46 8m+16sm+4st+18a 70 Pseudapocryptes bomeensis 48 Pseudapocryptes lanceolatus 38 14m+22sm+2st 74 Boleophthalmi Boleophthalmus boddarti 46 46m/sm 92 Subrahmanyan (1969) Indo-Pacífico Boleophthalmus Khuda-Bukush & Barat dussumieri 46 14m+18sm+14a 78 (1987) Indo-Pacífico Scartelaos cantoris 46 12m+20sm+2st+12a 80 Manna & Prasad (1974) Indo-Pacífico Boleophthalmus pectinirostris 46 46st/a 46 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Periophthalmus borneensis 48 Indo-Pacífico Periophthalmus cantonensis (Periophthalmus novaeguineaensis) 46 18m+12sm+16st/a 76 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Periophthalmus chrysospilos 56 Indo-Pacífico Periophthalmus modestus 46 16m/sm+30a 62 Lee (1986a) Indo-Pacífico Periophthalmus scholosseri 46 46a 46 Matsuo (1998) Indo-Pacífico Periophthalmus Khuda-Bukhsh & Nayak serperaster 46 8m+16sm+4st+18a 74 (1990) Indo-Pacífico Scartelaos histophorus 48 8m/sm+40st/a 56 Matsuo (1998) Indo-Pacífico Sicydiinae Sicyopterus japonicus 44 10m+10sm+24a 64 Arai & Fujiki (1979) Indo-Pacífico Gobioneliinae Acanthogobius lactipes 40 40a 40 Arai & Sawada (1974) Indo-Pacífico Acanthogobius elongate 42 8m/sm+34st/a 50 Lee et al. (1987) Indo-Pacífico Acanthogobius flavimanus 44 10m/sm/st+34a 54 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Acanthogobius hasta 44 6m/sm+38st/a 50 Lee et al. (1987) Indo-Pacífico Acanthogobius lactipes 40 40a 40 Lee et al. (1987) Indo-Pacífico Atlântico Awaous flavus 46 Oliveira et al. (2007) Ocidental Khuda-Bukhsh & Barat Awaous grammepomus 46 46st/a 46 (1987) Indo-Pacífico Awaous strigatus 46 (F) X1X1X2X2 -- Souza et al. (1998) Atlântico Ocidental Stange & Passamani Awaous tajasica 46 46a 46 (1986) Atlântico Ocidental Brachygobius nunus 48 Post (1965) Indo-Pacífico Chaenogobius annularis 44 18sm+26st/a 62 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Gymnogobius castaneus 44 36m/sm/st+8a 80 Nishikawa et al. (1974) Indo-Pacífico

69 Anexo

Gymnogobius urotaenia 44 -- -- Nogusa (1960) Indo-Pacífico Chaenogobius annularis 44 44st/a 44 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Chasmichthys gulosus 44 44st/a 44 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Ctenogobius boleosoma 44 2sm+42a 46 Lima-Filho et al. (2014) Atlântico Ocidental Ctenogobius smaragdus 48 2sm+46a 50 Lima-Filho et al. (2014) Atlântico Ocidental Ctenogobius criniger 50 34m/sm+6st+10a 90 Arai & Sawada (1974) Indo-Pacífico Evorthodus lyricus 46 24m+22sm 92 Atlântico Ocidental Gillichthys mirabilis 44 12sm+32a 56 Chen & Ebeling (1971) Indo-Pacífico Gillichthys seta 44 6sm+14st+24a 64 Chen & Ebeling (1971) Atlântico Ocidental Ctenogobius shufeldti 48 48a (F) 48 Pezold (1984) Atlântico Ocidental Gobionellus oceanicus 56 (M) 12m+5st+39a 73 Lima-Filho et al. (2015) Atlântico Ocidental Gobionellus stomatus 56 (M) 20m+15st+21a 91 Lima-Filho et al. (2015) Atlântico Ocidental Uribe-Alcocer, Diaz-Jaimes Gobionellus microdon 56 4m+6sm+46a 66 (1996) Pacífico Ocidental Gymnogobius breuniguu 44 36m/sm/st+8a 80 Nishikawa et al. (1974) Indo-Pacífico Gymnogobius heptacanthus 44 44st/a 44 Lee (1986) Indo-Pacífico Gymnogobius isaza 44 12sm+32st 88 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Gymnogobius castaneus 42 14m/sm+28st 84 Arai et al. (1974) Indo-Pacífico Gymnogobius mororanus 42 12m/sm+30st/a 54 Lee et al. (1987) Indo-Pacífico Luciogobius grandis 44 -- -- Arai (1981) Indo-Pacífico Luciogobius guttatus 44 12st+32a 56 Murofushi (1980) Indo-Pacífico Mugilogobius abei 46 46st/a 46 Lee et al. (1987) Indo-Pacífico Pterogobius elapoides 44 14sm+30st 88 Arai & Kobayashi (1973) Indo-Pacífico Pterogobius zonoleucus 44 14sm+30st 88 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Quietula guaymasiae 42 6m+4sm+32a 52 Cook (1978) Indo-Pacífico Quietula y-cauda 42 42a 42 Cook (1978) Indo-Pacífico Rhinogobius brunneus 44 44a 44 Nishikawa et al. (1974) Pacífico Ocidental Rhinogobius flumineus 44 44a 44 Arai & Kobayashi (1973) Indo-Pacífico Rhinogobius giurinus 44 44a 44 Nishikawa et al. (1974) Indo-Pacífico Rhinogobius shennongensis 44 44a 44 Dong (1984) Indo-Pacífico Stigmatogobius Hinegardner & Rosen sadanundio 46 2sm+44a 48 (1972) Indo-Pacífico Tridentiger brevispinis 44 10m/sm+34st 88 Arai & Kobayasi (1973) Indo-Pacífico Tridentiger nudicervicus 44 62 Lee (1986) Indo-Pacífico Tridentiger obscurus 44 10m/sm+34a 54 Arai et al. (1974) Indo-Pacífico Tridentiger trigonocephalus 46 16sm+6st+24a 68 Fei & Tao (1987) Tukugobius flumineus 46 4m+16sm+26st/a 66 Amblyopinae Odontamblyopus rubicundus 46 12m+6sm+10st+18a 74 Arai & Sawada (1975) Indo-Pacífico Trypauchen vagina 46 12m+6sm+10st+18a 74 Khuda-Bukhsh (1978) Indo-Pacífico