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Année Universitaire MEMOIRE 2015-2016 Présenté pour l'obtention de l'UE de stage de MASTER 1 en sciences et technologies des aliments

option: Microbiologie et Biologie Moléculaire

Par:

N'DEPO Kevin Patrick-Roch

Nuniérod'ordre 02

Soutenu publiquement Prof. TETCID Fabrice Président 03/10/2016 Dr ADOU Marc Membre

Dr DJE Kouakou Martin Membre

Dr. AKA Solange GBEZO Encadreur N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

1J'E1JIC.'A.C'E

Je dédie ce modeste travail qui s'est achevé grâce à I'aide de 'Dieu, {e TOV.T PWSS.'A:NT:

.'A. mon yère N'D'E'PO :N4 de .'A. ma mère .'A.LL'EM'E .'Akouassi Justine

Mes spéciales dédicaces: .'A. mon oncle .'A.LL'EM'E Jean 'Denis et .'A. ma tante .'A.LL'EM'E Pauline ..'Ainsi qu'aux autres membres de {a f'a miiie

Sans oublier toute {a yromotion 2015-2016 de Master I MicrobioCogie et 6ioCogie molécuiaire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculair-e/- 20-15-20-16------

..'Avant tout je remercie 'DI'E1L, {e T01LT P1LISS.'A.J'.!T qui m'a donné {e courage, {a volonté, {a force et surtout {a santé your accomplir ce modeste travail Merci de m'avoir éciairé {e chemin. de {a réussite.

Mes pius vifs remerciements s'adressent yarticuûèrement: ..'Aux yrofesseurs 'I.'. ' A:NO Yao et CCYLJ.U'B.:ALY Eacina, respectivement Président et "vice-Président de î1Lniversité :Nangui ..'A.Grogoua . ..'Au yrofesseur Louis (guicfiara 'BOJf01L..'A, 'Doyen de î1L:f'R des Sciences et Technologies des ..'A.ûments. ..'Au 'Docteur ..'AX'A Soianqe (i'B'EZO, Maître-assistant, encadreur au yrésent mémoire, your sa disponibilité, ses conseils, ses encouragements et surtout son aynamisme tians {e domaine de {a recfiercfie.

.'A.u yrofesseur 'DJ'E Xoffi :MarceŒn, 'Directeur au Laboratoire de Biotechnologie et Micro6iofogie des aliments. Mes vifs remerciements sont aussi adressés à Tous {es professeurs titulaires, maitres de conférences ainsi qu'aux 'Docteurs, Maîtres• assistants de {a [ilière microbioioqie your Ieur disponibilité durant ces trois ans.

Mes remerciements reviennent à tous ceux qui étaient {à your Ieurs encouragements et ieur compréhension.

:fi naiement, je remercie tous ceux ou celles qui ont contribué de yrès ou de loin. à {'a ccomplissemerü de ce mémoire.

Il N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

RESUME

Les bactéries lactiques (BL) sont des microorganismes de catégorie alimentaire qui jouent un rôle important dans la fermentation des matières premières animales et végétales. Elles sont impliquées dans un grand nombre de fermentations spontanées de produits alimentaires. Elles sont principalement utilisées en tant que starter dans les produits alimentaires fermentés où elles permettent de développer certaines caractéristiques organoleptiques et d'augmenter la durée de conservation. et Lactobacillus sont rencontrés dans les aliments fermentés principalement des produits laitiers et des boissons fermentées. Ils contribuent à améliorer et à conserver certains produits alimentaires. Cependant, le pH du milieu ou de l'aliment influence la croissance de ces bactéries. Ces bactéries résistent au milieu défavorable par la production d'acides organiques et de nombreux composés antimicrobiens telles les bactériocines qui jouent un rôle majeur dans la conservation des produits laitiers fermentés et contribuent à l'inhibition des germes pathogènes et des germes d'altération alimentaire.

Mots clés: Bactéries lactiques, Lactobacillus, Enterococcus, bactériocines, pH.

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SOMMAIRE

'D'E'Dic.J'tC'E 1

'R:E:M.'E'RCI'E:Jvt.'E:Jv1l'S 11 RESUME 111 SOMlVlAIRE IV LISTE DE FIGURES ET DE TABLEAUX V

LISTE DES ABRÉVIATIONS VI INTROD.UCTION 1 1) GENERALITES SUR LES BACTERIES LACTIQUES 3 l Présentation générale 3 2 Habitat des bactéries lactiques 6 3 Origines des bactéries lactiques 6 4 Taxonomie des bactéries lactiques 7 S Utilisation des bactéries lactiques 8 O)LACTOBACILLUS 11 1 Définition 11 2 Caractéristiques 11 3 Habitat et utilisation 12 4 Caractères biochimiques 13 Ill) ENTEROCOCCUS 13 1 Définition 13 2 Phylogenèse 13 3 Caractéristiques 14 4 Habitat 15 5.Applications biotechnologiques des entérocoques 16 IV) INFLUENCE DU PH 20 1 pH 20 2 Acides organiques 21 CONCLUSION 22 REFERENCES BIBLJOGRAPlllQUES 23

IV _____N _'D_EPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

LISTE DE FIGURES ET DE TABLEAUX

Figure 1 : Différentes formes microscopiques de bactéries lactiques obtenues au laboratoire de microbiologie appliquée de l'université d'Oran 3

Figure 2 : Représentation schématique des principales voies de fermentation des hexoses chez les bactéries lactiques 5

Figure 3 : Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres associés, obtenu par analyse des ARNr l 6S 7

Figure 4 : Dendrogramme ARNr 16S de la position phylogénétique de l'espèce Enterococcus 14

Tableau 1 : Principales sources d' Enterococcus spp dans les aliments 16

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LISTE DES ABRÉVIATIONS

AB Ami.ne biogène

ADN Acide désoxyribonucléique

ADP Adenosine diphosphate

ARNr Acide ribonucléique ribosomique

ATP Adénosine triphosphate

BL Bactéries lactiques

C Cytosine

oc Température en degré Celsius

C02 Dioxyde de carbone

E Enterococcus

EMP Embden-Meyerhoff-Parnas

G Guanine

g/l Gramme/litre

GRAS Généralement reconnue comme sure

Kg Kilogramme

Lb Lactobacillus

NAD/NADH,H Couple oxydant/réducteur du nicotinamide adénine dinucléotide

02 Dioxygène

pH Potentiel d'Hydrogène

Pi Phosphate inorganique

UFC Unité Formant Colonies

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INTRODUCTION

Les bactéries lactiques (BL) sont des microorganismes de catégorie alimentaire qui jouent un rôle essentiel dans la fenuentation des matières premières animales et végétales. Elles sont impliquées dans un grand nombre de fermentations spontanées de produits alimentaires (Stiles et al, 1997), ce qui a conduit à la reconnaissance de leur statut GRAS (Generally Recognized As Safe) c'est-à-dire généralement reconnues comme sure (Klaenhammer et al., 2005). Actuellement, les bactéries lactiques regroupent treize genres bactériens différents, grâce aux techniques de biologies moléculaires: Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Oenococcus, Weissella, Aerococcus, Tetragenococcus et Vagococcus (Carine et al., 2009).

En outre, les BL telles que Enterococcus et Lactobacillus font partie des aliments fermentés principalement des produits laitiers et des boissons fermentées. Ils contribuent à améliorer les propriétés organoleptiques et à conserver certains produits alimentaires. les BL sont principalement utilisées en tant que starter dans les produits alimentaires fermentés où ils permettent de développer certaines caractéristiques organoleptiques et d'augmenter la durée de conservation (Abee, 1995; Hugenholtz et al., 1999). Les bactéries lactiques ont longtemps été utilisées pour la conservation et la fabrication des aliments (Soomro et Kiran, 2002). Le concept d'amélioration des bilans nutritionnels et sanitaires par addition de bactéries bénéfiques (probiotiques) à l'aliment a fait l'objet de recherches approfondies. Le rôle propice des probiotiques en tant que facteur d'équilibre sur la microflore intestinale et en particulier leur action vis-à-vis d'une population microbienne indésirable a été démontré (Ouwehand, 1998; San ni et al., 1999; Soomro et Kiran, 2002). Les BL contribuent, par leur métabolisme et leurs activités enzymatiques variées, à la production de composés volatils qui participent au développement de l'arôme, de la saveur et de la texture des produits fermentés (Cheri-Ho, 1997; Oyewole, 1997).

Cependant, le pH du milieu exerce parfois une influence sur la croissance de ces BL. Cela peut résulter en une résistance de ces BL par l'acidification du milieu, la production d'acides organiques (Desmazeaud, 1996; Cheri-Ho, 1997; Oyewole, 1997; Daly et Davis, 1998; Ouwehand, 1998). Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d'une compétition pour les substrats même si les conditions de développement sont favorables (CaUewaert et De Vuyst, 2000). de

1 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016 l'élaboration de bactériocines (Piard et Desmazeaud, 1992) comme la rusine (Song et Richard, 1997).

Dans notre synthèse bibliographique, nous parlerons de l'influence du pH des milieux de culture ou de l'environnement de croissance des bactéries lactiques. Ce travail comporte quatre parties: La première partie comporte les généralités sur les bactéries lactiques, la deuxième partie décrit le genre Lactobacillus, la troisième partie présente le genre Enterococcus et la quatrième partie insiste sur l'influence du pH sur leur croissance.

2 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-20-16- -"'"'-----

1) GENERALITES SUR LES BACTERIES LACTIQUES

1 Présentation générale Les bactéries lactiques (BL) sont des cocci ou des bâtonnets qui sont en générale aérotolérantes. Cependant, certaines espèces habitant par exemple le tube digestif des animaux sont anaérobies strictes, même en présence d'02, elles sont incapables de réaliser la phosphorylation oxydative. Elles sont Gram positif; généralement immobiles et asporulées. Elles ne possèdent ni catalase ni nitrate réductase. ru cytochrome oxydase. En plus de cela, elles ne liquéfient pas la gélatine, ne produisent pas d'indole ni d'hydrogène sulfureux. Les BL regroupent un ensemble d'espèces hétérogènes (Labioui et al., 2005; Pilet et al., 2005), chimio-orgaootrophe, Gram positivf, cocci ou des bâtonnets (Bourgeois et Larpent, 1996). Ce sont des cel1ules vivantes, autonomes et procaryotes (Doleyres et al., 2002), dont le trait commun est leur aptitude à produire de l'acide lactique suite à la fermentation des glucides. Elles sont devenues les principaux candidats probiotiques et bénéficient d'un statut GRAS (Generally Regarded As Safe), c'est-à• dire généralement reconnues comme sure {Ait-Belgnaoui et al, 2005). Les BL sont des micro• organismes ubiquitaires et ont été définies pour la première fois par Orla-Jensen en 1919. Elles ont des besoins complexes en factures de croissance: vitamine B, acides aminées, peptides, bases puriques et pyrimidiques {Letort et al., 2001).

1.1 Caractères morphologiques et structuraux La forme des cellules microbiennes représentant souvent un caractère distinctif de l'espèce et du genre bactérien (coques ou bâtonnets) se trouve à la figure 1.

' '

a Diplocoques b Diplocoques c Streptocoques d Diplocoques (Leuconostoc sp.) (Lactobacillus sp.) (Lactococcus lactis sp.) (Lactococcus lactis sp.)

Figure 1: Différentes formes microscopiques de bactéries lactiques obtenues au laboratoire de microbiologie appliquée de l'université d'Oran par Saidi, (2007) (Grossissement x 1000).

3 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch -Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire 1_2_0_1.• s .-2•. 0 ;..1...6, _

1.2 Principales voies fermentaires des bactéries lactiques Toute croissance nécessite la production d'énergie et les bactéries lactiques ne font pas exception à la règle. Hétérotrophes, elles tirent leur énergie de la fermentation de substrats carbonés. Les bactéries lactiques utilisent principalement 1 'une des deux voies majeures du métabolisme des sucres (Figure 2). Il s'agit des voies bomofermentaires (Embden-Meyerhoff• Pamas, EMP) et hétérofennentaire (voie des pentoses-phosphate). Ainsi, les bactéries lactiques sont divisées en deux groupes principaux d'espèces homo ou bétérofermentaires selon la nature et la concentration des produits terminaux issus de la fermentation du glucose. homofermentation: regroupe la voie de la glycolyse, aussi connue sous le nom de voie d'Embden-Meyerhoff- Pamas, (EMP) (Figure 2a). suivie de: La conversion de 2 molécules de pyruvate en 2 molécules de lactate. Au cours de cette voie EM, ces bactéries dégradent le glucose, le fructose, le mannose, le galactose, le saccharose ou le lactose.

Hétérofermentation: (Figure 2b), aussi appelée voie des pentoses phosphate (transcétolases) suivi de: Dégradation des hexoses avec formation quasi stœcbiométrique d'une molécule d'acide lactique, d'une molécule de C02 et d'une molécule d'éthanol. Les sucres à cinq atomes de carbone ou pentoses, comme le fructose, peuvent parfois être fermentés et donnent alors une molécule d'éthanol et une molécule d'acide lactique.

4 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. Glucose ATP

AOP

Glucose-6-P NAD NAoH+ H' '--f Fructose-6-P Gluconate-6-P ATP

ADP NADH+ H.._

Fructose-1.6-P Ribulose-5-P 1 P/ Xylulose-5-P ___À _ ) ' Glycéraldéhyde-3-P - Dihydroxyactone-P Glycéraldéhyde-3-P Acétyl-P

2NAD+ 2PI Pl NAD+ CoA )1; le: le 2H1 +NADH NAOH+ H+ Pi

2(1.3-Diphosphoglycérate) 1.3-Diphosphoglycérate Acétyl-CoA

AOP ADP NADH+ tt•

)1 le: CoA le ATP ATP

2(3-Phosphoglycérate) 3-Phosphoglycérate Acétaldéhyde

NADH+ H1 l 1 te 2(2-Phosphoglycérate) 2-Phosphoglycérate Ethanol 1 l 2H20 H20 1 2Phosphoénolpyruvate Phosphoénolpyruvate

2AC>P. AOP ::>I le: 2ATP ATP 2Pyruvate Pyruvate

2H' + NADH NADH+ H+ le 2NAD+ )1 NAO• 2Lactate Lactate

HOMOFERMENTATION HETROFERMENTATION

a. b.

Figure 2: Représentation schématique des principales voies de fermentation des hexoses chez les bactéries lactiques (Elbelle et Satara, 2014).

5 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et BiologJe Moléculaire/ 2015-2016

ATP: Adenosine triphosphate

ADP: Adenosine diphospbate

NAD/NADH, H: couple oxydant/réducteur du nicotinamide adénine dinucléotide

Pi: Phosphate inorganique

2 Habitat des bactéries lactiques Les bactéries lactiques sont présentes à l'état libre dans l'environnement ou vivent en association avec un hôte, tel que l'homme ou l'animal, dans un écosystème bactérien comme le tractus gastro-intestinal ou génital des mammifères (Klein et al., 1998).

Les bactéries lactiques sont ubiquistes et on les trouve dans différentes niches écologique comme le lait et les produits laitiers, les végétaux, la viande, le poisson, les muqueuses humaines et animales et dans le tractus digestif (Douault et Corthier, 2000) et ont été également retrouvées dans le sol, les engrais, et les eaux d'égout (Holzapfel et al., 1998).

3 Origines des bactéries lactiques Les bactéries lactiques ont été retrouvées dans des sédiments datant de 2,75 milliards d'années bien avant l'apparition d'oxygène dans l'atmosphère, ce qui pourrait expliquer leur caractère anaérobie. De plus, des études sur la phylogénie bactérienne mentionnent leur apparition avant celle des cyanobactéries. D'autres études montrent que certaines bactéries lactiques. comme Lb. lactis, sont en voie d'acquérir une chaîne respiratoire. Les bactéries lactiques ont été isolées dans de nombreux milieux naturels, végétaux, animaux et humains; certaines espèces semblent adapter à un environnement spécifique et ne semblent guère se retrouver ailleurs que dans leur habitat naturel. Grâce à leur souplesse d'adaptation physiologique, les bactéries lactiques peuvent coloniser des milieux très différents de point de vu physico-chimique et biologique (De Roissard et Luquet, 1994). Selon Desmazeaud et De Roissard (1992), les espèces du genre Streptococcus,· Lactococcus et Leuconostoc et se rencontrent plutôt chez les hommes ainsi que chez les animaux. Dans le domaine laitier. elles existent en quantité considérable. Les espèces du genre Lactobacillus sont encore plus répandues dans la nature; par exemple: elles sont retrouvées dans les végétaux où elles assurent l'acidification de l'ensilage; elles sont retrouvées aussi dans l'intestin des animaux et de l'homme. Elles sont également isolées des cavités naturelles d'organismes (cavités buccales et cavités vaginales) (De Roissard et Luquet, 1985).

6 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moljculair_e_ _l_ 2_0,_J_s-_2_0_1_6 _

4 Taxonomie des bactéries lactiques La composition en G+C de 1 'ADN, la composition eo acides gras, la mobilité électrophorétique de la lactate déshydrogénase sont des critères qui peuvent être étudiés pour l'identification des espèces lactiques (Vandamme et al., 1996; Stiles et Holzopfel, 1997; Ho et al, 2007). La morphologie est considérée comme la caractéristique clé pour décrire et classifier les genres des bactéries lactiques. De ce fait, les bactéries lactiques peuvent être divisées arbitrairement en bacilles (Lactobacillus et Carnobacterium) et coques (tous les autres genres). Le genre Weissella, récemment décrit. est le seul genre qui comporte à la fois des bacilles et des coque (Collins et al., 1993; Ho et al., 2007). A ce groupe de bactéries lactiques, appartiennent plusieurs genre comme Aerococcus, Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacilles, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissel/a. (Stiles et Holzapfel, 1997; Pot, 2008).

Oenococcus Streptococcus Lactococcus Enterococcus. Melissococcus Eeucorcostoc Tetragenococcus Vagococcus Weissella Carn obaateriusn Lactosphaera ,<::: -..._._~------Lactobacillus Aerococcu Allolococcus Dotosigranrüum

Propionibacterium

Bifidobacterium

Figure 3: Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres associés. obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et Holzapfel, 1997).

Un arbre phylogénétique est un arbre schématique qui montre les relations de parentés entre des groupes d'êtres vivants. Chacun des nœuds de l'arbre représente l'ancêtre commun de ses

7 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biolog}e Moléculaire/ 2015-2016 descendants; le nom qu'il porte est celui du clade formé des groupes frères qui lui appartiennent non celui de l'ancêtre qui reste impossible à déterminer (Ciccarelli et al., 2006).

5 Utilisation des bactéries lactiques

5.1 Principales utilisations des bactéries lactiques en alimentation humaine De très nombreux produits alimentaires subissent une fermentation lactique avant leur consommation. Celle-ci leur assure des caractéristiques bien particulières d'arôme et de texture, mais aussi une bonne sécurité alimentaire par rapport aux bactéries indésirables grâce aux acides Organiques produits. Les bactéries qui en sont responsables sont toutes regroupées sous la même appellation de «bactéries lactiques» bien que ce terme concerne des germes très différents (Novel, 1993; Caplice et Fitzgerald, 1999; Soomro et Kiran, 2002).

Dans un certain nombre de cas, la fermentation lactique est spontanée et la qualité des produits finaux obtenus est très variable. Aussi. au fur et à mesure de l'industrialisation de certaines fabrications, les technologues ont bien connu ces bactéries et les utilisent dans des conditions définies. Après sélection de souches spécialement adaptées aux fabrications, les technologues cherchent actuellement à leur appliquer les techniques récentes du génie génétique afin de mieux les exploiter (Gasson, 1993).

Ainsi, tous les types de produits alimentaires sont concernés. Au niveau des produits animaux, le lait est transformé en fromages, crèmes et beurre, yaourts et autres laits fermentés. La viande est transformée en des saucisses fermentées ou en des produits saumurés secs, le poisson est utilisé dans différentes préparations. Dans de nombreux pays, les produits végétaux subissent aussi une fermentation lactique pour la production de boissons (vins, bières, cidres), des pains dans la transformation du soja, du chou en choucroute ou de différents végétaux ou fruits (Daly et Davis, 1998; Soomro et Kiran, 2002).

L'utilisation prolongée des bactéries lactiques dans les techniques traditionnelles et leur Consommation à forte dose dans certains produits connus de tous les temps, sans qu'aucune toxicité n'ait été démontrée, militent naturellement pour leur innocuité. Cependant, certaines espèces sont pathogènes (germes causant des mammites) et sont donc rejetées des fabrication alimentaires. Des cas particuliers d'infections cliniques par des souches de genres normalement non pathogènes ont été rapportés (Gasser, 1994). De nouveaux produits sont développés notamment dans le secteur laitier compte tenu du fait que certaines souches de bactéries lactiques peuvent jouer un rôle bénéfique pour la santé humaine (Gasser, 1994; Heyman,

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2000; Meydani et Ha, 2000; Drouault et Carthier, 2001; Marteau et al., 2001; Solis et al., 2002).

5.2 Bactériocines

5.2.1 Production des bactériocines Les bactériocines sont généralement produites à la fin de la phase exponentielle et au début de la phase stationnaire de croissance. Elles peuvent ensuite être dégradées par les protéases produites par la bactérie lactique productrice (Savijoki et al., 2006) ou être adsorbées à sa surface ce qui mène à la baisse de la concentration de bactériocines dans la culture. Les facteurs influençant la production de bactériocines sont principalement la souche productrice, la température, le pH, la composition du milieu et la technologie de fermentation employée.

Comme l'ont montré Moretro et al. (2000) pour la production de sakacin P par Lb. sakei, une même bactériocine peut être produite par des souches ou espèces différentes dont la capacité de production peut être variable. Lors d'une optimisation de production, si différentes souches sont disponibles, le choix de celle-ci pourra être déterminant. Les conditions de culture influencent fortement la production de bactériocines. En effet, l'optimalisation de la croissance ne résulte pas nécessairement en l 'optimaJisation de la production de bactériocines (Parente et Ricciard, 1999). TI a même été suggéré que des conditions de croissance défavorables permettent de stimuler leur production (Verluyten et al, 2004).

Les températures et pH optimaux de production sont souvent inférieurs à ceux optimaux pour la croissance. C'est par exemple le cas pour la production de bactériocine par Lb. curvatus LTHl 174 (Messens et al., 2003), Leuconostoc mesenteroides L124, Lb. curvatus IA42 (Mataragas et al., 2003), de sakacin P par Lb. sakei CCUG42687 (Moretro et al., 2000), d'amylovorin L471 par Lb. AmylovorusDCE471 (De Vuyst et al, 1996) et de pediocin PA-1 par Pediococcus damnosus (Nel et al., 2001).

La composition du milieu, tout particulièrement les sources et concentrations de carbone et azote, affectent fortement la production de bactériocines. Les bactéries lactiques productrices requièrent de nombreux nutriments pour leur croissance et des milieux riches, contenant de l'extrait de viande, de levure et des hydrolysats de protéines, sont nécessaires. Il a déjà été montré que l'augmentation des concentrations en extrait de levure, extrait de viande ou peptone peut permettre une augmentation de la production de bactériocines (Aasen et al., 2000; Nel et al, 2001; Mat.aragas et al., 2004; Todorov et al., 2004; Verluyten et al., 2004).

9 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiolog_ie et Biologie Moléculaire/ 2015-20-16 ------D'autre part, quelques études ont montré que la source de carbone utilisée et sa concentration est un facteur important dans l'optimisation de Ja production de bactériocines (Leal-Sanchez et al., 2002; Leroy et al.,2006; Chen et al.,2007; Anastasiadou et a/.,2008). L'ajout de ces nutriments lors d'une culture fed-batch permet souvent d'augmenter la production comparativement à une cuJture en batch (Callewaert et al., 2000; Guerra et al., 2005; Lv et al, 2005).

L'utilisation de la technique des cellules immobilisées peut permettre d'augmenter la durée et la stabilité de la production de bactériocines. Les cellules peuvent être immobilisées dans des biofilms ou des billes d'alginates de calcium. Cette technique a déjà été utilisée avec succès pour la lacticine 3147 et la nisine (Scannell et al., 2000; Pongtharangkul et al., 2006b).

5.2.2 Applications des bactériocines dans l'industrie alimentaire Les bactériocines sont habituellement reconnues comme sûres, sont sensibles aux protéases digestives et ne sont pas toxiques pour les cellules eucaryotes (Wijaya et al., 2006). Elles ont une grande tolérance aux variations de pH et aux traitements thermiques. Leur spectre antirnicrobien peut être large ou étroit, elles peuvent donc cibler sélectivement des bactéries pathogènes ou détériorantes sans inhiber les bactéries indispensables et ont un mode d'action bactéricide (Galvez et al., 2007). Les bactériocines doivent cependant être considérées comme un moyen de préservation complémentaire à ceux déjà existant (Deegan et al., 2006). Les bactériocines peuvent être appliquées sous un forme purifiée, semi-purifiée ou sous la forme d'un concentré obtenu après fermentation d'un substrat alimentaire. Les bactéries productrices peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires, la bactériocine sera alors produite in situ. (Luchansky et al., 2004; Deegan et al., 2006; Ghalfi et al., 2006a; Galvez et al, 2007).

5.2.2.1 Application de la bactérie productrice de bactêriocines L'utilisation des bactéries productrices de bactériocines peut être intéressante tant au niveau législatif qu'économique. Les bactéries productrices de bactériocines peuvent être ajoutées comme starter dans des produits fermentés ou comme culture protectrice. Les bactéries productrices de bactériocines peuvent être également ajoutées en combinaison avec un autre starter qui produira les propriétés organoleptiques désirables. Dans ce cas. la bactérie productrice de bactériocines ne doit pas détériorer les qualités organoleptiques de l'aliment fermenté et la bactériocine produite ne doit pas avoir d'activité contre le starter (Deegan et al., 2006; Galvez et al, 2007). Si la bactérie est appliquée en tant que culture protectrice, e1Je doit

10 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

être capable de produire sa bactériocine sans modifier les propriétés organoleptiques (Rodgers, 2001).

5.2.2.2 Facteurs influençant l'activité des bactériocines dans les produits alimentaires Lors d'une application alimentaire, la composition du produit est un des premiers facteurs pouvant réduire ou totaJement dissiper l'activité des bactériocines de par son adsorption sur des composantes du produit, la limitation de sa solubilité et de sa diffusion dans Je produit, sa dégradation par les protéases, l'interaction avec des additifs alimentaires ou des ingrédients et/ou un pH inapproprié. Les traitements appliqués aux produits constituent un deuxième facteur pouvant limiter l'activité inhibitrice des bactériocines dans un produit alimentaire. En effet, des traitements thermiques trop élevés peuvent dégrader les bactériocines présentes. La température de stockage pourra également réduire l'activité des bactériocines, qui varie en fonction de la température (Galvez et al., 2007). En outre, dans les produits solides, les bactéries forment des microcolonies ou des biofilms dont la résistance aux bactériocines peut être plus élevée (Bouttefroy et Millière, 2000; Schôbitz et al, 2003).

Il) LACTOBACILLUS

1 Définition Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant dans de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s'agit de bacilles longs et fins (parfois incurvés) souvent groupés en chaînes, immobiles, asporulés, catalase négative, se développent à un optimum de température situé entre 30 et 40 °C. Les lactobacilles ont des exigences nutritionnel1es très complexes en acides aminés, en vitamines, en acides gras, en nucléotides en glucides et en minéraux (Khalid et Marth, 1990; Leclerc et al., 1994). Ce genre comme le streptocoques fécaux qui représentent une hémolyse de type À. et ~ appartiennent au groupe D. Ce sont des commensaux de l'intestin. Les espèces rencontrées dans l'alimentation sont essentiellement E. faecalis et les espèces proches. Les entérocoques sont des coques qui sont immobiles et sans capsule, homofermentaires, généralement différenciés par la fermentation de l'arabinose et le sorbitol. ils croissent entre 10 °Cet 45 °C (Tamime, 2002; Ho et al., 2007).

2 Caractéristiques Lactobaci/lus est un genre de bactéries à gram positif, immobiles comprend près de 80 espèces. Ce sont généralement des bâtonnets non sporulants et parfois des coccobacilles dépourvus de

11 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch -Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-20_16_ , =;;;;;aa _ catalase et de cytochrome. Ils sont facultatifs ou micro-aérophiles, donnent de l'acide lactique comme produit de fermentation unique ou majeur et ont des besoins nutritionnels complexes en acides aminés, en vitamines, en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux (Khalid et Marth, 1990; Leclerc et al., 1994). Ces bactéries se développent au mieux dans des conditions légèrement acides, quand le pH de 4,5 à 6,4 (acidotolérants) et à un optimum de température situé entre 30 et 40 °C. L'hétérogénéité des espèces est illustrée par le contenu en G+C qui peut varier de 32 à 53 %. Le genre Lactobacillus a été subdivisé par Orla-Jensen en trois groupes et cette classification est encore utilisée en milieu industriel (Tamime, 2002; Guiraud et Rosec, 2004):

-Groupe 1: forme de lactobacilles homofermentaires stricts qui ne fermentent que les hexoses par la voie d'Embden-Meyerhof en produisant presque exclusivement du lactate. Ce groupe comprend notamment Lb. acidophilus, Lb. farciminis, Lb.johnsonii, Lb. amylovorus, Lb. paralimentarius (Cai et al., 1999), Lb. delbrueckiisubsp. delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus (Torriani et al., 1999), Lb. Nantensis (VaJcheva et al, 2006).

-Groupe li: renferme les lactobacilles homo-hétérofermentaires facultatifs qui fermentent les hexoses mais aussi les pentoses en lactate et acétate par la voie d'Embden-Meyerhof. TI s'agit en particulier de Lb. alimentarius, Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. graminis, Lb. paracasei, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. Sakei (Stiles et al., 1997). Ces espèces bactériennes sont présentes dans les végétaux fermentés comme l'ensilage et dans les produits carnés et laitiers fermentés.

-Groupe ID: forme de lactobacilles hétéroferrnentaires stricts qui fermentent les hexoses en lactate. acétate (ou éthanol) et C02. Les pentoses aussi sont fermentés en lactate et en acétate. Ces Lactobacillus ont un faible pouvoir acidifiant et produisent des substances aromatiques. Il s'agit notamment de Lb. brevis, Lb.buchneri, Lb. fermentum, Lb.hilgardii, Lbfructivorans, Lb.pani (Wiese et al., 1996), Lb.pontis, Lb. reuteri, Lb.hammesii (Valcheva et al., 2005), Lb. sanfranciscensis, Lb. spicheri, Lb. Kimchii et Lb. Frumenti (Müller et al., 2000). Ces espèces se retrouvent dans les levains de panification et les produits laitiers fermentés (Obeix, 2003).

3 Habitat et utilisation Les lactobacilles représentent le groupe des bactéries lactiques le plus ubiquitaire (la surface des plantes, dans les produits laitiers, la viande, l'eau, la bière, les fruits et bien d'autres

12 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevit, Patrick-Roch - Master I / Microbiologie et Biolog_ie Moléculaire/ 2015---2.-016------produits) (Prescott et al., 2007), qui colonisent tous les habitats contenant des glucides fermentescibles, des produits d'hydrolyse des protéines, des vitamines, des facteurs de croissance et une basse tension d'oxygène (Luquet et Corrieu, 2005). lis sont naturellement présents dans le tractus gastro-intestinal et le tractus urinaire de l'Homme et des animaux, où ils jouent un rôle dans la maintenance et l'amélioration de la santé (Prescott et al., 2007). Lactobacillus est indispensable aux industries alimentaires et laitière telleque la production d'aliment fermentés (choucroute, pickles, ensilage), boissons (bière, vin, jus) et pain au levain fromage suisse et d'autres fromages dures, de yaourt et de saucisses. Les Lactobacilles posent aussi des problèmes, ils sont parfois responsables de l'altération de la bière, du lait, de la viande parce que les produits terminaux de leur métabolisme donnent des gouts et des odeurs indésirables (Prescott et aL, 2007).

4 Caractères biochimiques Les Jactobacilles sont catalase négative, certains ont une pseudocatalase. Ils sont dépourvus de cytochrome. Généralement, nitrate réductase négative, gélatinase négative et ils sont microaérophiles ou anaérobies. Leur métabolisme est essentiellement fermentaire et libère de l'acide lactique pour les homofennentaires (thermobactrium et streptobactrium), de l'acide lactique, de l'acide acétique, de l'éthanol et du C02pour les hétérofennentaires (bctabactérium) (Larpent, 1991). La production de C02 est importante pour distinguer les groupes (Guiraud, 1998).

Ill) ENTEROCOCCUS

1 Définition Les Enterococcus sont des bactéries lactiques, ubiquitaires, trouvées fréquemment dans la flore microbienne du tractus gastro-intestinal des animaux à sang chaud, ainsi que dans une variété de produits alimentaires. Tls sont utilisés dans les aliments soit comme agents antimicrobiens, soit pour leurs propriétés organoleptiques et parfois comme probiotiques. Le genre Enterococcus rassemble la plupart des espèces du groupe sérologique D. Ce sont également des coques homofermentaires, elles sont des indicateurs de contamination fécale dans les aliments (Streptocoques fécaux) comme Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium (Tamime, 2002; Ho et al, 2007).

2 Phylogenèse Dans les années 1930 et sur la base du système Lancefield Serological Typing, les Enterococcus étaient classés dans le genre Streptococcus (groupe D), comme d'autres bactéries lactiques du

13 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire.

N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-201 ~ genreLactococcus et Vagococcus. Avec l'avènement de Ja biologie moléculaire et de nouvelles techniques telles que la détermination du pourcentage G+C, le séquençage de l'ARNr 16S et l'hybridation DNA-DNA, Carine et al. (2009) ont reclassé les bactéries Streptococcus faecium et Streptococcus faecalis comme Enterococcus faecium et Enterococcus faecalis, respectivement. Le genre Enterococcus est placé dans le domaine des , le phylum des , classe des , ordre des Lactobacillales, famille des , branche des Clostridium. Le genre Enterococcus peut être subdivisé en groupes d'espèces.

Leuconostoc

Weissella

Carnobacterium

Aerococcus

Staphylococcus Lactococcus

Bacillus subtilis group Streptococcus

Figure 4: Dendrogramrne ARNr 16S de la position phylogénétique de l'espèce Enterococcus (Klein, 2003).

3 Caractéristiques Les Enterococcus sont des coccoïdes Gram+ oxydase positifs, généralement catalase négatifs. Certaines espèces présentent une activité pseudo-catalase. lis sont généralement des anaérobie facultatifs et non mobiles. Les cellules sont ovoïdes et se présentent sous forme de cellules isolées. par paire ou encore sous forme de chainette. Généralement, les entérocoques produisent des colonies de couleur blanche. Toutefois, quelques-unes sont de couleur jaune comme E. mundtii, E. casseliflavus et E. sulfureus (Higashide, 2005). De plus, la majorité des

14 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch -MasterlJ Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016 entérocoques sont positifs au test de Voges-Proskauer qui relie la production d'acétone à la fermentation du ribose. Ce test est largement utilisé dans la discrimination entre Enterococcus et Streptococcus. Les Enterococcus sont des micro-organismes mésophiles qui se développent daas une gamme de températures allant de 10 à 45 °C, avec une température optimale de 35 °C. Certaines espèces peuvent survivre à 60 °C pendant 30 min. Ils poussent dans des condition hostiles de 6,5 % de Na Cl, de lait renfermant 0, 1 % de bleu de méthylène, de concentration en sels biliaires de 40 % et dans une gamme de pH comprise entre 4,4 et 9,6.

Les Enterococcus sont homofermentaires, lis produisent essentiellement de l'acide lactique et en quantité moindre, de l'acétate, du formiate et de l'étbanoJ. Les produits finaux du métabolisme peuvent changer en fonction de la présence ou non d'oxygène ou d'autres accepteurs d'électrons. Ainsi en anaérobiose, le lactate est le principal produit du métabolisme du glucose, tandis qu'en condition d'aérobiose, les produits du métabolisme sont l'acétate et le C02. Ils sont capables de métaboliser divers types de sucres comme le N-acétyl glucosamine, l'amygdaline, l'arbutine, le cellobiose, le D-fructose, le galactose, le p-gentiobiose, le glucose, le lactose, le maltose, le D-mannose, le P-D-méthyle glucopyranoside, le ribose, la salicine et le trébaJose (LeBlanc, 2006).

4 Habitat Les entérocoques sont de nature ubiquiste, leur capacité d'adaptation à des environnements inhospitaLiers permet de les retrouver dans différentes eaux (usées, douces et de mer). dans le sol, sur les végétaux et dans le tractus gastro-intestinal des animaux à sang chaud (y compris celui de l'homme) (Manero et al., 1999). Leur adaptabilité à différents écosystèmes a permis de retrouver trois clones d'E.faecalis et d'E. casseliflavus dans du lait, dans du fromage ou dans des matières fécales humaines (Gelsomino, 2002). La plupart des espèces du genre Enterococcus font partie intégrante de la flore intestinale de nombreux animaux, leur concentration dans les matières fécales peut varier de 105 à 107 UFC·g·1 (Kayser, 2003). Les entérocoques les plus fréquemment isolés dans les fèces de l'homme sontE.faecalis, Eifaecium et E. durans (Murray, 1990). Dans la plupart des contenus intestinaux d'animaux (la volaille, les bovins, les porcs, les chiens, les chevaux, les moutons), E. faecalis, E. faecium et E. hirae sont représentés; par contre, chez les chèvres et les lapins, on ne retrouve que E. faecalis et E. hirae. Dans des échantillons provenant de sources environnementales (composts, eaux usées, sédiments et eaux de piscine), il a été démontré que les espèces prédominantes sont E.faecalis (ca. 40 %) etE.faeciwn (ca. 30 %), suivies de E. durans/E. hirae, E. casseliflavus/E. gallinaru et E. raffinosus, avec une prévalence différente de l'espèce selon la source (Pinto et al., 1999).

15 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

D'autre part, E. mundtii, E. casseliflavus et E. sulfureus sont des bactéries qui ont été isolées d'échantillons végétaux d'ensilage d'herbe. De plus, E. mundtii a été trouvé dans de la chicorée fraiche (Bennik, 1998) et des graines de soja (Todorov, 2005; Zendo, 2005).

5.Applications biotechoologiques des entérocoques L'incorporation de micro-organismes à des aliments peut avoir quatre objectifs différents:

- améliorer la sécurité alimentaire (inhiber des pathogènes),

- améliorer la stabilité (prolongation de la vie du stockage)

- offrir une diversité de produits (modification de la matière première)

- apporter des bénéfices pour la santé (effets positifs sur la flore intestinale).

Tableau 1 : Principales sources d'Enterococcus spp dans les aliments,

Groupe Produits Produits Laitiers Lait cru de vache, chèvre et brebis Fromages traditionnels et mi-dure Viandes et poissons Saucisses Produits carnés traditionnels fermentés Poissons fermentés Carcasses de porc Poulets Muscles de poisson Fruits de mer

Produits végétaux Olives vertes Ensilage d'herbe Légumes fermentés : sorgho, soja Chicorée fraiche Graines de soja

Source: Aguilar-Galvaz et al. (2011)

5.1. Les entérocoques dans l'alimentation

5.1.1 Produits laitiers Les entérocoques les plus couramment présents dans les fromages sont E. faecium, E. faecalis et E. durans (Giraffa, 2003), aussi bien les fromages à base de lait cru que de lait pasteurisé, provenant de chèvre, de brebis ou de vache; on retrouve moins souvent E .casseliflavus (Burdychova et Komprda, 2007). Les entérocoques ont un rôle important dans la maturation

16 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 11 Microbiologj_e et Biologie Moléculaire/ 2015-2016_ .,,_ _ de plusieurs variétés de fromages, probablement en raison de leur activité protéolytique, lipolytique, de leur capacité de production du diacétyle et d'autres composants volatils contribuant à l'aromatisation, la flaveur et au gout caractéristique. La concentration d'entérocoques dans Les fromages frais se situe entre 104 à 106 UFC·g-1, alors que celle des fromages fermentés est de l'ordre de 105 à 107 UFC-g-1 (Giraffa, 2003).

5.1.2 Viandes et poissons Comme indiqué précédemment, Les entérocoques appartiennent à la microflore commensale du tractus gastro-intestinal des animaux. De ce fait, il existe de fortes probabilités qu'ils contaminent la viande au cours de l'abattage. E. faecium et E. faecalis sont les espèces prédominantes dans Les produits carnés, tandis que E. hirae et E. durans (Franz et Holzapfel, 2004) s'y retrouvent en moindre proportion. E. faecium et E. mundtii ont été mis en évidence dans du muscle de turbot par Campos, (2006). E. faecium a été aussi retrouvé par Sanchez, (2010) dans des poissons et des fruits de mer. E.faecium NKR-5-3 a été isolé dans des poissons fermentés (Wilaipun et al., 2002).

5.1.3 Légumes fermentés L'origine de la présence d'entérocoques dans le règne végétal n'est pas clairement définie. Elle peut être endogène comme elle peut résulter d'une contamination environnementale. Dans les olives vertes fraiches, E. faecium et E. faecaliss ont des espèces prédominantes, elles sont retrouvées également dans les olives fermentées. Ben-Omar, (2004) a signalé que les

3 1 entérocoques trouvés dans les olives (2,2 x 10 UFC · g- ) sont bien adaptés aux valeurs de pH initial (9,0) et à la concentration en sel de la saumure employée lors de la transformation. Dans les alimentations asiatique et africaine, E. faecium et E. faecalis sont généralement liés à la fermentation du sorgho (Yousif, 2005) et du soja (Y oon et al, 2008).

5.2 Les entérocines (bactériocines des entérocoques) Le genre Enterococcus produit une grande variété de bactériocines, dénommées entérocines. Ces bactériocines sont des peptides de faibles poids moléculaires constitués de 20 à 60 acides aminés cationiques et amphiphiles. Cependant, le spectre d'activité, le mode d'action, la structure, la thermostabilité et le pH d'activité varient d'un type de bactériocine à l'autre (Dortu et Thonart, 2009). Généralement, les bactériocines sont constituées de deux domaines structuraux: un domaine hydrophile et cationique en position N-tenninale (appelé leader double-glycine) dont la longueur minimale est de 14 résidus et qui peut atteindre 30 résidus; la

17 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. ---==--N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

seconde région, en position C-terminale, est hydrophobe et/ou amphiphile (Johnsen et al., 2005).

5.3 Utilisation des entérocoques comme probiotiques Les probiotiques sont définis comme des préparations de micro-organismes viables en quantités suffisantes qui peuvent moduler la flore de l'organisme hôte, exerçant ainsi des effets bénéfiques pour La santé (FAO/WHO, 2006). La plupart des souches utilisées comme probiotiques sont des bactéries lactiques provenant du tractus gastro-intestinal humain (Champagne et Mellgaard, 2008). L'emploi des entérocoques comme probiotiques est potentiellement possible puisqu'ils appartiennent aux bactéries lactiques et font partie intégrante de la flore commensale de l'homme et des animaux. En Suisse, l'efficacité clinique d'E.faecium SF68 a été démontrée dans la prévention de diarrhées associées aux antibiotiques cbcz l'aduJte et dans le traitement de diarrhées chez l'enfant. Cette souche a été également testée pour traiter des diarrhées aigües, et lors d'essais cliniques en Belgique, un raccourcissement de ces diarrhées de 1 à 3 jours a été observé (Buydens et Debeuckelaere, 1996).

5.4 Risque des entérocoques Les problèmes entre les entérocoques et les humains sont leur origine gastro-intestinale, leur entrée dans la chaine alimentaire, leur résistance aux antibiotiques et leur possible rôle dans des maladies d'origine alimentaire. On peut citer également leur capacité à échanger du matériel génétique ou encore, pour quelques souches, à produire de grandes quantités d'amines biogéniques associées à la fermentation. Les entérocoques ne sont pas des bactéries très virulentes par rapport aux Staphylococcus ou aux Pneumococcus. Pour devenir pathogènes, les entérocoques ont besoin d'exprimer des caractéristiques de virulence associées à l'adhésion, la translocation et la disparition de la réponse immunitaire (Ben-Omar, 2004).

5.4.1 Résistance à des antibiotiques. Cette propriété est due à la présence intrinsèque de gènes de résistance principalement acquis par l'intermédiaire d'éléments génétiques mobiles (plasmides ou transposons). La plasticité du génome des entérocoques leur permet de s'adapter constamment à leur environnement et de résister à une large variété d'antibiotiques (Inoue et al., 2006) appartenant à différentes classes comme les bêta-lactames, les aminoglycosides, les lincosamides ou les glycopeptides. En 1986, certains E. faecium ont montré des résistances à des antibiotiques de type glycopeptides (la vancornycine et le teicoplanine) (LeBlanc, 2006). De plus, il est souvent utilisé comme une alternative à l'ampicilline, la pénicilline et aux aminoglycosides chez les personnes allergique

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(Franz et Bolzapfel, 2004). Par ailleurs, les entérocoques vancomycine-résistants sont habituellement multi-résistants et posent dès lors un réel problème de santé publique (lnoue et al. . 2006).

5.4.2 Facteurs de virulence Les facteurs de virulence permettent la colonisation et l'invasion des tissus ainsi que la perrnéabilisation des cellules épithéliales contournant ainsi les défenses immunitaires de l'hôte (Franz et Holzapfel, 2004). Les facteurs de virulence les plus couramment étudiés chez les entérocoques sont Ja production de substances d'agrégation, la production de cytolysine (bactériocine) et les activités enzymatiques. L'adhérence des bactéries aux tissus de l'hôte étant une étape cruciale dans le processus d'infection, la présence de SA dans les souches peut conduire à l'accroissement de la capacité de colonisation (Eaton et Gasson, 2001). Une étude suggère que la combinaison d'hémolysine et de la substance d'agrégation entraine une mortalité accrue dans l'endocardite due à E.faecalis. Les autres facteurs sont les enzymes hydrolytiques produites telles que l'hyaluronidase, la gélatinase et la sérine protéase (Fisher et Phillips, 2009). En outre, la gélatinase contribue au processus de formation de biofilm, ce qui peut accroitre la capacité des entérocoques à coloniser les tissus et à persister dans les sites d'infection (Del-Papa et al., 2007).

5.4.3 Production d'amines biogènes par les entérocoques Les amines biogènes (AB), aussi appelées amines naturelles, sont des bases azotées de faible poids moléculaire, constituant de nombreux aliments (Burdycbova et Komprda, 2007). Les AB peuvent affecter le système vasculaire, ce qui entraine une constriction des vaisseaux sanguins, ensuite une augmentation de la pression artérielle. Les intoxications par l'histamine peuvent provoquer des symptômes de type allergique tels que les éternuements, maux de tête/migraines ou essoufflement (Holzapfel et al., 2008). A des concentrations supérieures à 100 mg· kg", l'histamine et la tyramine peuvent causer une intoxication alimentaire et une crise hypertensive (Hammes et al., 2008). La production d'AB par entérocoques est favorisée lors de la fermentation. en raison de l'acidification et de la protéolyse. A partir de deux fromages à pâte mi-dure, Burdychova et Komprda (2007) ont isolé 14 souches capables de produire de AB: E. durans (7 souches), Ei faecalis (3 soucbes),E. casseliflavu (3 souches) etE.faecium (1 souche).

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5.4.4 Evaluation de l'incidence des entérocoques opportunistes et pathogènes en alimentation Avant d'employer E. faecalis ou Efaecium, leur présomption d'innocuité doit être avérée, en identifiant correctement les facteurs qui peuvent favoriser l'émergence du caractère pathogène opportuniste, ainsi que Ja capacité de ces espèces à acquérir des gènes d'espèces génétiquement proche. Notons que E. faecium SF68, employée pendant 20 ans comme un probiotique, ne contient ni facteurs de virulence, ni plasmide phéromone-sensible codant pour la SA (Kayser, 2003).

IV) INFLUENCE DU PH

lpH La majorité des bactéries lactiques se multiplient préférentiellement à des pH voisins de la neutralité (6,5 à 7,5), mais elles sont capables de croître dans une large gamme de pH. La croissance bactérienne est inhibée lorsque le pH du milieu devient acide (Torrino et al., 2001). Le pH influence sur la croissance des bactéries lactiques mais il peut aussi agir sur la voie de fermentation des sucres (homo ou hétérofermentaire), le rendement de la fermentation, et l'isomérie de l'acide lactique formé. Ainsi, Lb. bulgaricus qui est homofennentaire en milieu acide et hétérofermentaire en milieu alcalin (Rhee et Pack, 1980) peut être cité. L. oenosqui produit plus de lactate en condition acide qu'en condition alcaline (Champagne et al., 1989). Lb. Manihotivorans qui produit davantage de lactate lors de la fermentation, lorsque le pH est maintenu à 6,0 (Guyot et al., 2000).

L'utilisation des substrats carbonés peut dévier quand la valeur du pH est voisine de 6 pour la production d'exopolysaccharides. Les produits principaux du métabolisme des bactéries lactiques sont les acides organiques. Les acides organiques sont produits soit par la voie homofermentaire, soit par la voie hétérofermentaire. Le métabolisme du pyruvate conduit à Ja formation uniquement d'acide lactique chez les homofermentaires tandis qu'il conduit à la formation d'acide lactique, acétique et formique, d'éthanol et de dioxyde de carbone chez les hétérofermentaires. Grâce à cette production d'acides organiques, les bactéries lactiques diminuent le pH du milieu dans lequel elles se multiplient en inhibant une partie de la flore qui s'y développe. Leur compétitivité est améliorée étant donné leur grande tolérance aux pH bas extra et intra cellulaires. Outre la diminution du pH du milieu, l'effet antagoniste des acides organiques résulte de l'action de leur forme non dissociée. En effet, la forme non dissociée de l'acide peut traverser passivement la membrane et acidifier le cytoplasme par libération du

20 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Molécula..,i.re.1_2_0_1...s,.-2..• 0 _1_6 _ proton, ce qui affecte le métabolisme celluJaire en inhibant certaines fonctions (Klaenbammer, 1993; Brui et al., 1999; Caplice et al., 1999; Hsiao et al., 1999; Cotter et al., 2003; Janssen et al., 2007).

2 Acides organiques Les acides organiques sont des agents classiques de préservation des aliments (Brui et al., 1999) et sont reconnus comme des additifs alimentaires. Les acides couramment utilisés sont les acides benzoïque, sorbique, acétique, fumarique, propionique et lactique. lis sont utilisés pour prévenir ou retarder la croissance des bactéries dégradant la nourriture (Hsiao et al., 1999). Le principal problème consécutif à leur utilisation est la haute concentration nécessaire pour inhiber Les bactéries pathogènes ou indésirables et qui est parfois inacceptable pour Le consommateur (Kobilinsky et al., 2007).

La concentration inhibitrice minimale, qui est la plus petite quantité d'acide qui peut empêcher La croissance d'un microorganisme, de chacun de ces acides doit être déterminée dans des conditions précises de pH mais aussi d'activité d'eau, de température ... Elle varie avec chaque microorganisme à inhiber. Hsiao et al. (1999) ont montré qu'une concentration en acide acétique de 0, l 05 g/1 inhibe la croissance de Bacillus subtilis à un pH de 5,3 alors qu'il faut une concentration de 27.5 g/1 pour inhiber Lactobacillus plantarum et une concentration de 1,6 g/1 pour inhiber Escherichia coli dans les mêmes conditions. Listeria monocytogenes est inhibé par de l'acide lactique à 9,0 g/ 1 et un pH de 3,7 tandis qu'il l'est à un pH de 3,4 par l'acide chlorhydrique à la même concentration (Gravesen et al., 2004).

Les bactéries pathogènes peuvent développer certains mécanismes de résistance appelés «acid tolerance response» vis à vis de l'exposition à des pH bas. Ceux-ci leur sont également utiles pour survivre au transit intestinal. L. monocytogenes par exemple peut survivre à une exposition de 60 minutes à un pH de 3 (Brui et Coote, 1999; Gahan et Hill, 1999; Cotter et RiJI, 2003).

21 N'DEPO Kevin Patrick-Roch - Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016. Mémoire. ______N ,....'.;D;;.;'E; PO Kevin Patrick-Roch -Master 1 / Microbiologie et Biologie Moléculaire/ 2015-2016

CONCLUSION

Les Enterococcus et les Lactobacillus font partie des aliments fermentés, principalement des produits laitiers et des produits de boissons fermentées. Ils contribuent à améliorer les propriétés organoleptiques et de conservation de certains produits alimentaires. Leur nature ubiquiste rend possible leur capacité d'adaptation à divers environnements et aux procédés technologiques de transformation des aliments. Ils sont aussi utilisés comme probiotiques.

Ces bactéries lactiques ont une capacité à résister au pH du miLieu défavorable par la production d'acides lactique, d'acide organiques et composés antimicrobiens en tant telles que la bacteriocine,la nisine etc, qui pourrait être utiliser dans conservation et dans la formulation des aliments en industrie agroalimentaire ,et en inhibant la croissance des bactéries d'altération des aliments. des champignons et des levures.et de certaines bacteries pathogènes telles que Listeria spp.

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