Dissertação José Luiz

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA – GCBEv

O efeito da hipóxia sobre os parâmetros bioquímicos e a expressão dos genes hif-1α e phd2 do ciclídeo amazônico Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831)

JOSÉ LUIZ DE VASCONCELOS LIMA

Manaus – AM Agosto de 2018

JOSÉ LUIZ DE VASCONCELOS LIMA

O efeito da hipóxia sobre os parâmetros bioquímicos e a expressão dos genes hif-1α e phd2 do ciclídeo amazônico Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831)

Orientador: Vera Maria Fonseca de Almeida e Val

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (PPG GCBEv) do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus – AM Agosto de 2018 iii

L732 Lima, José Luiz de Vasconcelos

O efeito da hipóxia sobre os parâmetros bioquímicos e a expressão dos genes hif-1α e phd2 do ciclídeo amazônico Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) / José Luiz de Vasconcelos Lima. - Manaus: [sem editor], 2018. xi, 33 f.: il. color.

Dissertação (Mestrado) - INPA, Manaus, 2018.

Orientadora: Vera Maria Fonseca de Almeida e Val.

Programa: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

1. Reoxigenação. 2. Glicogênio. 3. Expressão gênica. I. Título

CDD 597.74

Sinopse: Estudou-se o efeito da hipóxia e da reoxigenação sob os aspectos bioquímicos e moleculares do peixe amazônico Astronotus ocellatus. Aspectos relacionados à transcrição dos genes phd2 e hif-1α, bem como aspectos bioquímicos como o glicogênio, glicose e lactato foram avaliados. Palavras-chave: Reoxigenação - Glicogênio – Glicose – Lactato – Expressão gênica.

À minha família, obrigado por tudo. v

AGRADECIMENTOS

À minha família por me fortalecer em qualquer situação. À Vanessa por ter me ajudado a realizar meu sonho e ter me ensinado coisas que irei levar para o resto da vida. À minha orientadora, Vera Val, que me acolheu, cuidou, protegeu e me incentivou quando eu mais precisei. Ao professor Adalberto Val, por também ter me acolhido e ter dado lições para a vida de cientista. À Naza, por ter me ajudado em etapas que foram fundamentais para a conclusão deste trabalho. À Dona Rai, Raquel, Dona Val, Dona Zizi e aos técnicos do laboratório, por me ajudarem durante o mestrado. À Carol, Samara e ao Carlos, por me ajudarem nas etapas de sequenciamento e desenho de primers. Ao Dinho e ao Derek, por me auxiliarem durante o mestrado e na revisão deste trabalho. Ao Ricardo, Danilo e a Priscylla, por terem me ajudado nas coletas. Aos meus amigos do LEEM, pelas dicas e apoio durante todo o mestrado. Aos meus amigos da turma do GCBEv 2016. Ao INPA, por toda a infraestutura e à equipe da secretaria e coordenação do curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, pelo zelo com os alunos e com o curso. À CAPES, CNPq e à FAPEAM pelo financiamento do projeto ADAPTA II que custeou esse projeto. Ao CNPq pela concessão da bolsa que me auxiliou durante o mestrado. A todos que contribuíram de alguma maneira para a conclusão deste trabalho.

Não importa quanto a vida possa ser ruim, sempre existe algo que você pode fazer e triunfar. Enquanto há vida, há esperança.

Stephen Hawking vii

The influence of hypoxia on biochemical aspects and expression of oxygen-homeostasis related genes of the Amazonian cichlid Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831)

ABSTRACT

Variations on dissolved oxygen levels in Amazonian lakes are determinant to the survival of aquatic organisms, which require a variety of adaptive responses to survive such environments, particularly fish. Tolerance to hypoxia is a common feature amoug species of Amazonian fishes, such as Astronotus ocellatus, which presents a series of physiological and biochemical adjustments, aiming to reduce oxygen demand and increase anaerobic metabolism. In this research, we aim to contribute with information about the physiological and molecular responses of Astronotus ocellatus submitted to low oxygen levels. This study is pioneer in evaluating Astronotus ocellatus phd2 mRNA transcripts submitted to hypoxia. Some well- known hypoxia indicators, such as plasma glucose, plasma lactate, hepatic glycogen and transcription of hif-1α and phd2 were investigated after 1, 3 and 5 hours of hypoxia followed by 3 hours of recovery in normoxia. Fishes under hypoxia presented a reduction in liver glycogen levels after 1 hour of hypoxia and an increase in plasma glucose and lactate during hypoxia. The responses of the species Astronotus ocellatus to exposure to different periods of hypoxia, followed by recovery in normoxia, showed that the fish entered hypoxia and the pattern of transcription of phd2 in liver and gills showed that these organs have different molecular responses to cope with hypoxia, although the hif-1α gene kept similar transcription levels in both tissues. The gene phd2 increased its transcripts in gills and decreased, as expected, in liver. These antagonistic responses were explained by a previously published positive feedback mechanism in which the HIF protein controls levels of the phd2 gene.

viii

A influência da hipóxia nos aspectos bioquímicos e na expressão dos genes relacionados à homeostase do oxigênio do ciclídeo amazônico Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831)

RESUMO Variações nos níveis de oxigênio dissolvido em lagos amazônicos são determinantes para a sobrevivência de organismos aquáticos, pois exigem uma variedade de respostas adaptativas para sobreviver nesses ambientes, particularmente em peixes. A tolerância à hipóxia é uma característica comum da maioria das espécies de peixes amazônicos, como Astronotus ocellatus, que apresenta uma série de ajustes comportamentais, fisiológicos e bioquímicos, com o objetivo de reduzir a demanda de oxigênio e aumentar o metabolismo anaeróbico. Nesta pesquisa, objetivamos contribuir com informações acerca das respostas fisiológicas e moleculares de Astronotus ocellatus submetidos à baixos níveis de oxigênio. Este estudo é pioneiro em avaliar os transcritos de mRNA da phd2 de Astronotus ocellatus submetidos à hipóxia. Alguns indicadores bem conhecidos de hipóxia, como glicose plasmática, lactato plasmático, glicogênio hepático e transcrição de hif-1α e phd2, foram investigados após 1, 3 e 5 horas de hipóxia, seguidos de 3 horas de recuperação em normóxia. Os resultados mostraram redução nos níveis de glicogênio após 1 hora de hipóxia e aumento de glicose e lactato durante a hipóxia. As respostas da espécie Astronotus ocellatus à exposição a diferentes períodos de hipóxia, seguido de recuperação em normóxia mostraram que os peixes entraram em hipóxia e o padrão de transcrição da phd2 no fígado e nas brânquias evidenciaram que esses órgãos possuem diferentes respostas moleculares para enfrentar a hipóxia, ainda que o gene hif-1α em ambos os tecidos não tenha demonstrado diferenças nos níveis de transcritos. O gene phd2 aumentou seu nível de transcritos nas brânquias e diminuiu, como esperado, tais níveis no fígado. Estas respostas antagônicas foram explicadas por um mecanismo de feedback positivo previamente publicado na qual a proteína HIF controla os níveis do gene phd2.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... x LISTA DE TABELAS ...... xi 1. INTRODUÇÃO ...... 1 1.1. A hipóxia em ambientes aquáticos da Amazônia ...... 1 1.2. Respostas adaptativas da ictiofauna à hipóxia ...... 2 1.3. Genes hif-1α e phd2 e suas relações com a hipóxia ...... 3 1.4. Astronotus ocellatus ...... 6 2. OBJETIVOS ...... 9 2.1. Objetivo Geral ...... 9 2.2. Objetivos específicos ...... 9 CAPÍTULO 1 ...... 10 INTRODUCTION ...... 11 MATERIALS AND METHODS...... 13 Animals ...... 13 Exposure to Hypoxia and Recovery in Normoxia ...... 13 Blood and Tissue Sampling ...... 14 Biochemical Assays...... 14 Total RNA extraction and first-strand (cDNA) synthesis ...... 15 Sequencing and obtaining primer ...... 15 Real-time quantitative PCR ...... 15 Statistical analysis ...... 17 RESULTS...... 17 Biochemical aspects ...... 17 Gene Expression ...... 19 DISCUSSION ...... 20 REFERENCES ...... 24 3. CONCLUSÃO ...... 29 4. REFERÊNCIAS ...... 30

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1. Ação da PHD2 durante a normóxia...... 5 Figura 2. Ação da PHD2 durante a hipóxia...... 5 Figura 3. Astronotus ocellatus...... 7

CAPÍTULO 1

Figure 1. Liver glycogen (A), plasma glucose (B), and plasma lactate (C) levels in Astronotus ocellatus exposed to normoxia (6 mg O2/L ± 0.5) and hypoxia (0.7 mg O2/L ± 0.05) for 1, 3 and 5 hours and recovery (6 mg O2/L ± 0.5) for 3 hours (mean±s.e.m., n=6). Statistical significance was analyzed using a two-way ANOVA. Bars with different letters indicate difference between time, normoxia, hypoxia and recovery (p< 0.05)...... 17 Figure 2. Relative expression of phd2 in liver (A) and gills (B) of Astronotus ocellatus exposed to normoxia (6 mg O2/L ± 0.5) and hypoxia (0.7 mg O2/L ± 0.05) for 1, 3 and 5 hours and recovery (6 mg O2/L ± 0.5) for 3 hours (mean±s.e.m., n=6). Statistical significance was analyzed using a two-way ANOVA. Bars with different letters indicate difference between time, normoxia, hypoxia and recovery (p< 0.05)...... ………………………………………………………………………………………..……. 19 Figure 3. Relative expression of hif-1α in liver (A) and gills (B) of Astronotus ocellatus exposed to normoxia (6 mg O2/L ± 0.5) and hypoxia (0.7 mg O2/L ± 0.05) for 1, 3 and 5 hours and recovery (6 mg O2/L ± 0.5) for 3 hours (mean±s.e.m., n=5)...... 20

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Table 1. Oxygen, temperature, ammonia and pH of water for each experimental condition...... 14 Table 2. Primers sequences...... 16 Table 3. PCR amplification efficiency of housekeeping genes, phd2 and hif-1α...... 16

1. INTRODUÇÃO

1.1. A hipóxia em ambientes aquáticos da Amazônia

A bacia hidrográfica do rio Amazonas é conhecida por sua disponibilidade hídrica, sendo responsável por 20% de toda água doce que desagua nos oceanos. A bacia amazônica abrange sete países da América do Sul e sua área total é de cerca de 6.900.000 km², dos quais aproximadamente 3.800.000 km2 encontram-se em território nacional brasileiro (IBGE 2007; Val et al., 2017). As áreas de várzea (planície de inundação de água branca) e igapó (área de floresta inundada por água preta) da Amazônia são anualmente inundadas por seus principais rios de água branca, um tipo de água rica em suspensão inorgânica, pH neutro e de alta produtividade; e água preta, um tipo de água rica em substâncias húmicas, de pH ácido e baixa concentração de minerais dissolvidos (Junk, 1983a). Os níveis dos rios variam periodicamente devido ao regime de chuvas da região amazônica e ao degelo dos Andes. O ciclo hidrológico da bacia amazônica pode ser dividido em quatro períodos - seca, enchente, cheia e vazante (Junk, 1983; Bittencourt e Amadio, 2007) - sendo que a cota máxima e mínima já registrada pelo Porto de Manaus para o rio Negro foi de, respectivamente, 29,97m durante a enchente em maio de 2014 e 13,63m durante a vazante em outubro de 2010 (www.portodemanaus.com.br). Essa variação periódica nos níveis dos rios foi conceituada por Junk e colaboradores (1989) como pulso de inundação, sendo esse processo a principal força seletiva sobre as populações naturais. Os lagos da região amazônica durante o período de cheia dos rios, se interconectam. Nesse período, há a troca de água, nutrientes, energia e material biológico, sendo esse processo essencial para a fertilidade das áreas de inundação (Junk, 1983b). A alta taxa de decomposição da matéria orgânica e as altas temperaturas dos lagos de várzea fazem com que esses ambientes possuam, naturalmente, baixas concentrações de oxigênio dissolvido (Furch e Junk, 1997). Condições de hipóxia e anóxia nos ambientes aquáticos são comuns desde o período Cambriano devido às baixas concentrações de oxigênio atmosférico nesse período, onde os níveis de oxigênio dissolvidos nos oceanos eram de aproximadamente 3% a 10% (Almeida-Val et al., 2005; Fox, 2016). A redução na tensão de oxigênio abaixo daquela normalmente encontrada pelo organismo ou célula pode ser definida como hipóxia. No ambiente aquático, esse valor é por volta de 70% de saturação de oxigênio dissolvido no nível do mar (Nikinmaa, 2013). 2

As variações nos níveis de oxigênio dissolvido nos lagos amazônicos podem ser (1) sazonais, com os níveis variando durante a vazante dos rios (setembro a novembro) e durante a enchente (março a maio) (Chippari-Gomes, 2002); (2) diárias, com níveis mais altos de oxigênio durante o dia, chegando a hiperóxia devido às altas taxas fotossintéticas e condições de hipóxia, e até mesmo anóxia durante a noite; e (3) espacial, onde a maior parte do oxigênio dissolvido se concentra nos primeiros centímetros da coluna d’água (Junk et al., 1983b; Val et al., 2005). As camadas mais profundas dos lagos de várzea – hipolímnio – têm a tendência de ser hipóxicas ou anóxicas devido à intrínseca baixa solubilidade do oxigênio em altas temperaturas e à grande demanda de oxigênio pelos processos químicos e biológicos, resultando em uma estratificação na disponibilidade de oxigênio dissolvido nesses ambientes (Junk et al., 1983b; Furch e Junk, 1997; Val et al., 2005). Essas mudanças nos níveis de oxigênio dissolvido são determinantes na distribuição dos organismos aquáticos, especialmente os peixes, sendo a tolerância à hipóxia uma característica comum da maioria das espécies de peixes amazônicos (Junk et al., 1983b; Saint-Paul e Soares, 1987; Almeida-Val et al., 2005).

1.2. Respostas adaptativas da ictiofauna à hipóxia

Muitas espécies de peixes descritas na bacia Amazônica possuem diferentes ajustes adaptativos relacionados aos seus habitats, sendo essas adaptações em nível fisiológico, comportamental e molecular. Essas adaptações servem tanto para diminuir a demanda energética quanto para aumentar a eficiência na captação do oxigênio dissolvido, ou até para evitar ambientes hipóxicos, ou como em alguns casos, utiliza-los como refúgio (Val, 1995; Muusze et al., 1998; Almeida-Val et al., 1999a; Sloman et al., 2006). As pressões seletivas que originaram tais adaptações podem ser justificadas devido às várias restrições enfrentadas por esses organismos no ambiente em que viveram ao longo do processo evolutivo, como mudanças de curto e longo prazo no pH da água, na disponibilidade de íons, na temperatura e nos níveis de oxigênio dissolvido (Almeida-Val et al., 1999a). Ainda que a hipóxia não seja completamente letal para algumas espécies de peixes, existem muitos efeitos subletais durante a exposição à hipóxia e esses efeitos podem influenciar funções biológicas de um organismo e, consequentemente, sua sobrevivência (Cheung et al., 2014). Em nível comportamental, algumas espécies de Characiformes apresentam a respiração de superfície aquática (RSA) na qual, em condições de hipóxia, o peixe nada até a camada mais superficial da coluna d´água, expande o lábio inferior e aumenta a 3 tomada de oxigênio, que se encontra mais concentrado na região superior da coluna d’água (Saint-Paul, 1984). Ciclídeos jovens também apresentam esse comportamento (Sloman et al., 2006). Em nível fisiológico, uma das respostas às baixas concentrações de oxigênio é a depressão do metabolismo aeróbico, ou seja, a diminuição do consumo de oxigênio conforme diminuem os níveis de oxigênio dissolvido na água, sendo os organismos que apresentam tal estratégia conhecidos como oxi-conformadores (Val, 1996). Por outro lado, há aqueles em que, conforme os níveis de oxigênio dissolvido diminuem, conseguem manter constante a tomada de oxigênio, sendo conhecidos como oxi- reguladores. Entretanto, há um limite, conhecido como pressão de oxigênio crítica (Pcrit), em que esses organismos oxi-reguladores passam a ser dependentes dos níveis de

O2 para a realização de suas funções vitais, alterando seu metabolismo de oxi-regulador para oxi-conformador (Val et al., 1998). Juntamente com a depressão do metabolismo aeróbico sob condição de hipóxia, há produção de energia por meio da glicólise anaeróbica, evidenciada pelo acúmulo de lactato plasmático, resultado da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH), e pelo acúmulo de glicose no sangue, agindo como transporte energético para a manutenção da glicólise anaeróbica, consequência da glicogenólise (quebra do glicogênio para mobilizar glicose) hepática. Maiores quantidades de glicogênio, importante fonte de energia no fígado e no músculo branco, são encontradas nas espécies amazônicas tolerantes à hipóxia (Chippari-Gomes et al., 2005). Com a diminuição dos níveis de oxigênio, muitos dos processos cruciais para a célula, como a produção de ATP, divisão celular e progressão do ciclo celular, são intenrrompidos; isso se dá por serem processos que requerem uma alta demanda energética (Ortmann et al., 2014). Em nível molecular, ajustes na expressão gênica ocorrem de acordo com as mudanças no ambiente, sendo responsáveis pela plasticidade fenotípica dos organismos (Val et al., 1998). Estudos sobre os genes envolvidos na homeostase do organismo em situações de baixas concentrações de oxigênio vêm ganhando destaque devido à influência do oxigênio na regulação de genes envolvidos no desenvolvimento, fisiologia e patologia dos organismos (Nikinmaa e Rees, 2005).

1.3. Genes hif-1α e phd2 e suas relações com a hipóxia

Um organismo em condições de hipóxia possui inúmeras alterações fisiológicas. Esses ajustes são frutos da expressão de diversos genes regulados pela diminuição nos 4 níveis de oxigênio e são de fundamental importância para a permanência da homeostase dos organismos (Nikinmma e Rees, 2005). O fator de transcrição induzido por hipóxia, HIF (do inglês, Hypoxia Inducible Factor) é expresso em resposta às reduções nos níveis de oxigênio (Maxwell et al.,1993). O HIF-1 é uma proteína heterodímera constituída por duas subunidades, HIF-1α e HIF-1β, expressas pelos genes hif-1α e hif-1β respectivamente, que se ligam em regiões específicas do DNA para regular a transcrição de genes regulados pelo oxigênio. As duas subunidades contêm tanto um domínio básico hélix-loop-hélix (bHLH) quanto um domínio PAS (Per, ARNT, Sim), ambos necessários para heterodimerização, ligação ao DNA e transativação. Cada subunidade do HIF possui três isoformas, tendo o HIF-α as isoformas HIF-1α, HIF-2α e HIF-3α e o HIF-β as isoformas HIF-1β, HIF-2β e HIF-3β (Kewley et al., 2004; Nikinmaa e Rees, 2005). O fator de transcrição induzido por hipóxia é evolutivamente conservado nos vertebrados que atua como principal regulador da expressão gênica em células expostas à hipóxia (Kodama et al., 2012). Estudos com vertebrados indicam que a proteína HIF-1α é ininterruptamente sintetizada; entretanto, ela é rapidamente degradada em condições normais de oxigênio. Sua degradação é mediada por uma região específica denominada domínio de degradação dependente de oxigênio (ODD). Esse domínio possui dois resíduos conservados de prolina que, em condições normais de oxigênio, são covalentemente modificados pela ação das enzimas prolil-hidroxilases (PHD). Existem três isoformas funcionais da enzima PHD: PHD1, PHD2 e PHD3. Cada isoforma de PHD difere na abundância relativa de seu mRNA, mas todas as três formas mostram o mesmo padrão de expressão ubíquo em células humanas (Cioffi et al., 2003). Entre as três isoformas da PHD em células humanas, a PHD2 mostrou ter afinidade mais elevada com os HIF-1α (Berra et al., 2003; Appelhoff et al., 2004). As PHDs (Figura 1) necessitam de O2 como substrato e dos cofatores Fe(II), ascorbato e 2-oxoglutarato para inserir o grupo hidroxila nos resíduos de prolina da subunidade HIF-1α. Quando os resíduos de prolina são hidroxilados, HIF-1α é reconhecido pela proteína von-Hippel-Lindau (pVHL), ubiquitinada e por fim é degradada pela via proteossômica no proteossomo 26S (Epstein et al., 2001; Nikinmaa e Rees 2005; Kaelin e Ratcliffe, 2008; Rytkönen et al., 2011).

Figura 1. Ação da PHD durante a normóxia.

Em situações onde a célula se encontra com baixos níveis de oxigênio, a atividade das enzimas PHDs são inibidas devido à diminuição de oxigênio (Figura 2) e assim, a proteína HIF-1α é estabilizada, acumulada e transferida do citoplasma para o núcleo, onde formará um heterodímero com a subunidade HIF-1β, formando o fator de transcrição HIF-1, o qual irá se associar ao fator geral de transcrição CBP/p300 e se ligar aos elementos de resposta à hipóxia (HRE, Hypoxia Responsive Elements), que são sequências conservadas localizadas nas regiões promotoras dos genes que são induzidos por hipóxia relacionados aos processos de angiogênese, eritropoiese, glicólise, transporte de ferro, apoptose e controle do ciclo celular (Nikinmaa e Rees, 2005; Kaelin e Ratcliffe, 2008; Rytkönen et al., 2011).

Figura 2. Ação da PHD durante a hipóxia. 6

A maioria dos estudos com os genes hif-1α e phd2 e suas respectivas proteínas está associada a pesquisas com câncer em células humanas; porém, estudos da expressão desses genes em outros organismos em condições de hipóxia, como em peixes por exemplo, vêm ganhando atenção visto que tal grupo possui uma história de vida intimamente relacionada a ambientes hipóxicos (Rytkönen et al., 2011; Chen et al., 2012; Kodama et al., 2012; Baptista et al., 2016).

1.4. Astronotus ocellatus

Astronotus ocellatus (Figura 3) é uma espécie de peixe conhecida popularmente como acará-grande, acará-açu, apaiari ou oscar, pertence à família Cichlidae, que é um grupo bastante diversificado na ictiofauna mundial. Os ciclídeos possuem cerca de 110 gêneros e agrupam pelo menos 1300 espécies catalogadas, com estimativas aproximando- se de 1900 espécies (Kullander, 1998; Chakrabarty 2004). A distribuição geográfica dos ciclídeos é bastante variada, podendo ser encontrados em ambientes aquáticos de água doce e salobra, estando presentes na África, Oriente Médio, Ásia, América do Norte, América Central e América do Sul. No continente Africano, encontram-se 900 espécies catalogadas e 1300 estimadas, sendo assim, o maior número de ciclídeos por região, seguido da América do Sul, com 291 espécies catalogadas (Kullander, 2003). Astronotus ocellatus é considerado uma espécie de porte médio, alcançando até 35 cm e 1,5 kg. É um peixe onívoro, sedentário, de hábito territorialista e que compete pelas fêmeas na formação dos casais. A primeira maturação gonadal ocorre entre 15 e 24 meses de idade com o peixe geralmente medindo 25 cm (Santos et al., 2006). Normalmente possui comportamento monogâmico e ambos os sexos apresentam cuidado parental desde a fertilização até a independência dos filhotes. Ambos os sexos constroem ninho na época de reprodução, que geralmente ocorre em diferentes períodos durante o ano. Deste modo, esta espécie pode desovar mais de uma vez ao longo do ano, chegando a desovar cerca de 1500 a 2000 ovos que se aderem facilmente ao substrato (Paiva e Nepomuceno, 1989; Santos et al., 2006). 7

Figura 3. Astronotus ocellatus. Fonte: oscarfish.com.

Esses peixes conseguem modificar sua coloração e essa alteração é associada a fatores comportamentais, como territorialismo e reprodução. Astronotus ocellatus geralmente possui coloração escura, que vai de verde-oliva ao marrom. Nas laterais do corpo dos machos é possível encontrar cores mais escuras com manchas amarelas, laranjas ou vermelhas (Beeching, 1995). A espécie A. ocellatus é um ciclídeo de alto interesse econômico, pois é um dos peixes ornamentais mais populares em todo o mundo. Essa fama facilitou a introdução dessa espécie em vários outros países (Mousavi et al., 2013). Ocorre naturalmente em países como Brasil, Colômbia, Guiana Francesa e Peru (Kullander, 2003). Habitam ambientes lênticos como lagos, locais com águas rasas e com pouca corrente nas margens dos rios, vivendo entre galhos submersos. É um peixe extremamente tolerante a ambientes hipóxicos (Muusze et al., 1998). Indivíduos adultos dessa espécie podem tolerar níveis de 5-20% de saturação de oxigênio por um período de 20 a 50 horas; em anóxia, o período de tolerância é de até 6 horas a 28° C (Muusze et al., 1998; Almeida-Val et al., 2000). Esses animais apresentam habilidades notáveis em comparação a outras espécies de teleósteos menos tolerantes a hipóxia. Essas habilidades são produtos de uma série de ajustes metabólicos visando à redução na demanda de oxigênio. A notável tolerância à hipóxia do Astronotus ocellatus se baseia na supressão do metabolismo aeróbio quando sujeitos à hipóxia, tendo diferentes respostas em diferentes tecidos, ativando o metabolismo anaeróbico para a obtenção de ATP por meio da glicólise (Muusze et al., 1998; Almeida-Val et al., 1999b; Scott et al., 2008). Chippari-Gomes e colaboradores (2005) explicam os possíveis motivos para a alta tolerância à hipóxia. Nesse estudo com a espécie congênere Astronotus crassipinnis, os 8 autores notaram que, ao expor esses animais gradualmente a baixas concentrações de oxigênio (<0,34 mg O2/L), ocorria um aumento nos movimentos operculares para compensar a tomada de oxigênio. Também observaram que Astronotus crassipinnis possui grandes concentrações de glicogênio no fígado como resultado da glicogênese ou gliconeogênese. Também observaram um acúmulo de lactato no plasma sanguíneo, fruto da glicólise anaeróbica no músculo. Baptista et al. (2016) realizaram estudos sobre a alta resistência à hipóxia do Astronotus ocellatus e observaram que, ao submeter os peixes a três horas de hipóxia (0,5 mg O2/L), os níveis de transcritos do hif-1α aumentaram no fígado desses animais. Os pesquisadores também observaram que após três horas de recuperação em hipóxia, houve um retorno aos níveis normais de transcritos do hif-1α. Essa pesquisa foi pioneira ao investigar a transcrição desse gene durante a hipóxia com posterior recuperação (normóxia) em uma espécie de peixe amazônico. Heinrichs-Caldas (2016) realizou um estudo com Astronotus crassipinnis, onde os animais foram expostos a diferentes períodos de hipóxia; o autor observou que este animal possui duas estratégias metabólicas frente à hipóxia: (i) redução da tomada do oxigênio e (ii) aumento do metabolismo anaeróbico, com resposta controlada pela expressão do gene hif-1α, que é específica em cada tecido. O fígado apresentou variações nos níveis de transcritos e o músculo branco não apresentou variação na síntese de transcritos, resultados altamente relacionados à atividade da enzima LDH, fundamental para a manutenção do metabolismo anaeróbico com vistas à sobrevivência à hipóxia e ao trabalho muscular anaeróbico. Estudos sobre os diferentes padrões de expressão do hif-1α e de genes ligados à homeostase do oxigênio em diferentes tecidos nos permitem entender como ocorrem os ajustes fisiológicos relacionados às proteínas desses genes, uma vez que elas podem regular a diminuição metabólica e ativar o metabolismo anaeróbico de animais altamente tolerantes à hipóxia. Desde a década de 90, o Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular vem estudando as espécies do gênero Astronotus como modelos biológicos de estudos sobre hipóxia por sua maior capacidade de tolerar hipóxia comparado a outros gêneros e espécies. As previsões do Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas (IPCC, 2014) apontam um aumento da temperatura média da superfície terrestre até o ano de 2100, espera-se que ocorram mudanças na dinâmica dos pulsos anuais de inundação e que, como consequência, os rios da bacia amazônica passem por períodos mais longos e 9

intensos de hipóxia. Portanto, é de grande relevância compreender os mecanismos que esses animais irão utilizar para suportar essas novas condições (Almeida-Val et al., 2005). Diante do exposto, este estudo objetiva contribuir com o conhecimento acerca dos mecanismos adaptativos em nível molecular e bioquímico, verificando a expressão dos genes hif-1α e phd2 por meio de seus transcritos e relacionando suas respostas aos ajustes metabólico, após a exposição a baixas concentrações de oxigênio nesta espécie de peixe amazônico tolerante à hipóxia.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

 Compreender as respostas bioquímicas e a dos genes relacionados à baixos níveis de oxigênio em diferentes tecidos de Astronotus ocellatus submetidos à hipóxia.

2.2. Objetivos específicos

 Verificar se há influência de diferentes tempos de exposição à hipóxia, seguida de recuperação em normóxia, sobre os parâmetros bioquímicos dos juvenis de A. ocellatus;  Avaliar o efeito da hipóxia, seguida de recuperação em normóxia, nos transcritos dos genes hif-1α e phd2 em diferentes tecidos de juvenis de A. ocellatus.

CAPÍTULO 1

INFLUENCE OF HYPOXIA ON BIOCHEMICAL ASPECTS AND ON EXPRESSION OF GENES RELATED TO OXYGEN-HOMEOSTASIS OF THE AMAZONIAN CICHLID ASTRONOTUS OCELLATUS (AGASSIZ, 1831)

Vasconcelos-Lima, J. L1*; Oikawa-Cardoso, V. L.1; Almeida-Val, V. M. F1. 1LEEM – Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – Manaus, Amazonas. *Corresponding author Phone: +55 92 98196-9508 E-mail address: [email protected] (Vasconcelos-Lima, J. L.)

ABSTRACT Variations on dissolved oxygen levels in Amazonian lakes are determinant to the survival of aquatic organisms, which require a variety of adaptive responses to survive such environments. Hypoxia tolerance is a common feature among species of Amazonian fishes, such as Astronotus ocellatus, which presents a series of physiological and biochemical adjustments, as depression of its oxygen demand and activation of anaerobic metabolism. In this research, we aimed to contribute about the biochemical and molecular responses of Astronotus ocellatus submitted to low oxygen levels. This study is pioneer in evaluating phd2 transcripts in an Amazonian fish species. Some well-known hypoxia indicators, such as plasma glucose, plasma lactate, hepatic glycogen and transcription levels of hif-1α and phd2 were investigated after 1, 3 and 5 hours of hypoxia exposure, followed by 3 hours of recovery in normoxia. Fishes under hypoxia presented a reduction in liver glycogen levels after 1 hour and an increase on plasma glucose and lactate. In hypoxia, phd2 had an increase on its transcripts levels in gills, but a decrease, as expected, in liver. On the other hand, hypoxia did not affect gills and liver hif-1a transcription. These results showed that, based on the transcription pattern of phd2, liver and gills have different molecular strategies to cope with hypoxia. Keywords: Amazon – Hypoxia – Reoxygenation - Cichlid – Glycogen – Glucose – Lactate - hif-1α - phd2. 11

INTRODUCTION

The annual and regular variation of the water level of the Amazon basin rivers, described by Junk et al. (1989) as the “flood pulse”, is the main environmental condition responsible for the productivity, existence and interaction between the biota and the river- floodplain system. The Amazonian fishes present biochemical, physiological and behavioral adaptations to deal with hypoxic environments and these adaptive responses can be related to decrease energy demand, to improve oxygen uptake and to avoid hypoxic environments or even use them as a physiological refuge (Val, 1995; Muusze et al., 1998; Almeida-Val et al., 1999; Sloman et al., 2006). Selective pressures for such adaptations can be explained by various environmental challenges faced by these organisms during their lifespan, like short- and long-term changes in water pH, ion availability, temperature and availability of dissolved oxygen (Almeida-Val et al., 1999). Although hypoxia is not completely lethal for some fish species, there are many sublethal effects during hypoxia exposure and these effects may influence the biological functions of an organism and, consequently, its survival (Cheung et al., 2014). Compared to the others Amazonian fishes, Astronotus ocellatus is a high hypoxia tolerant specie (Muusze et al., 1998; Sloman et al., 2006). Adult individuals can tolerate 5-20% of oxygen saturation for a period of 20 to 50 hours; in anoxia, their tolerance period is up to 6 hours at 28°C (Muusze et al., 1998). This high hypoxia tolerance is the product of a series of physiological adjustments aimed to reduce the oxygen demand. The remarkable tolerance of A. ocellatus to hypoxia is based on depression of the aerobic metabolism when exposed to hypoxia, and activation of the anaerobic metabolism to obtain ATP through anaerobic glycolysis, and these responses are tissue-specific (Muusze et al., 1998; Scott et al., 2008). An organism under hypoxia shows numerous physiological and molecular adjustments and these responses are the outcome of the expression of several genes regulated by hypoxia, that are of fundamental importance for the homeostasis of the organism (Nikinmaa and Rees, 2005). The hypoxia-inducible transcription factor (HIF) is expressed in response to reductions of oxygen levels (Maxwell et al., 1999). HIF-1 is a heterodimer protein composed by two subunits, HIF1-α and HIF1-β, expressed by the hif- 1α and hif-1β genes, respectively, and it binds to specific regions of the DNA to regulate the transcription of oxygen-regulated genes. Both subunits contain a basic helix-loop- helix (bHLH) and a PAS domain (Per, ARNT, Sim), both required for heterodimerization, 12

DNA binding and transactivation (Kewley et al., 2004; Nikinmaa and Rees, 2005). This hypoxia-inducible transcription factor is evolutionarily conserved in vertebrates and acts as the main regulator of gene expression in cells exposed to hypoxia (Kodama et al., 2012). Studies with vertebrates indicate that HIF-1α protein is uninterruptedly synthesized, however, it is rapidly degraded under normal oxygen conditions (Semenza, 2004). Its degradation is mediated by a specific region called oxygen-dependent degradation domain (ODD). This domain has two conserved proline residues which, under normal oxygen conditions, are covalently modified by the action of the prolyl-hydroxylase (PHD) (Nikinmaa and Rees, 2005). There are three functional isoforms of the PHD enzyme: PHD1, PHD2 and PHD3, expressed by phd1, phd2 and phd3 genes, respectively. Each isoform differs in the relative abundance of its mRNA, but all three forms show the same pattern of ubiquitous expression in human cells (Cioffi et al., 2003). Among the three PHD isoforms in human cells, PHD2 has the higher affinity for HIF-1α (Berra et al., 2003; Appelhoff et al., 2004). PHDs detect and utilize oxygen as substrate to insert the hydroxyl group into the proline residues of the HIF-1α subunit. The hydroxylation reaction of PHDs requires 2-oxoglutarate and iron as cofactors. When proline residues are hydroxylated, HIF-1α is recognized by the von-Hippel-Lindau (pVHL) protein, ubiquitinated and degraded by the proteasome pathway in the 26S proteasome (Epstein et al., 2001; Nikinmaa and Rees, 2005; Kaelin Jr and Ratcliffe, 2008; Rytkönen et al., 2011). In hypoxic situation, PHD enzyme activity is inhibited due to the low oxygen level and, this way, HIF-1α protein is stabilized, accumulated and transferred from the cytoplasm to the nucleus, where it binds to HIF-1β subunit, forming HIF-1 transcription factor. HIF-1 will associate with the general transcription factors (CBP/p300) and bind to Hypoxia Responsive Elements (HRE), which are conserved sequences located in the promoter regions of the genes that are induced by hypoxia. HIF-1 target genes are related to the processes of angiogenesis, erythropoiesis, glycolysis, iron transport, apoptosis and cell cycle control (Nikinmaa and Rees, 2005; Kaelin Jr and Ratcliffe, 2008; Rytkönen et al., 2011). In this sense, this study aimed to contribute about the adaptive responses, at molecular and biochemical level, of the high hypoxia tolerant Astronotus ocellatus under different hypoxia exposure times followed by recovery in normoxia, by verifying hif-1α and phd2 gene expression and biochemical parameters. 13

MATERIALS AND METHODS

Animals

Juveniles (approximately 5 g) of Astronotus ocellatus were purchased from a commercial supplier (Fish Farm Santo Antonio, AM 010, Km 113, Ramal do Procopio, Km 1, Rio Preto da Eva, AM, Brazil) and transferred to the Laboratory of Ecophysiology and Molecular Evolution at INPA (National Institute of Amazonian Researches), Manaus, AM, Brazil, for acclimation. The animals were held outdoors in 500 L tanks with aerated water (approximately 7 mg O2/L) at 27ºC ± 2, pH between 5 and 6, under constant water changes and natural light exposure. The animals were reared in this condition during approximately three months until they reached the experimental weight. Fishes were fed once a day until satiation with commercial pelleted food (36% protein). Feeding was suspended 24 hours prior the experiments.

Exposure to Hypoxia and Recovery in Normoxia

To verify how hypoxia affects the molecular and biochemical aspects, a time-series experiment was performed and a total of forty-eight animals, weighing 49 g ± 6, were used. Twenty-four animals were placed in the tank for normoxia treatment (control) and twenty-four animals were placed in the tank designated for hypoxia treatment. Inside the tanks, the animals were kept separated by grids so that they did not have contact with each other. The animals were transferred to the tank 24 hours prior to the experiment for acclimation. The hypoxia treatment tank was covered with bubble wrap to avoid that the oxygen from the air diffused into the water. For normoxia treatment ([O2]: 6 mg/L ± 0.5), water aeration was constant during the whole experiment. For hypoxia treatment, aeration was interrupted and N2 gas was pumped into the water until de oxygen level reached 0.7 mg/L. The animals were kept in hypoxia during 1 hour, 3 hours and 5 hours, followed by 3 hours of recovery in normoxia, when the aeration was turned back on until the oxygen level achieved normoxia condition (6 mg/L ± 0.5). Six animals were collected from the tank per exposure period from both treatments. The concentration of oxygen for hypoxia treatment was approximately half of the critical oxygen level (PO2crit) value found by De Boeck et al. (2013) for Astronotus ocellatus and was the same concentration used by Baptista et al. (2016). Three hours of recovery in normoxia was chosen because it was found that this recovery period was enough for protein synthesis to return to normal levels in gills and liver of Astronotus ocellatus (Lewis et al., 2007). The dissolved oxygen 14 level was monitored using WITROX 4 and DAQ-M equipment (Loligo System, Viborg, Denmark), combined with the commercial software AutoResp (Loligo System, Viborg, Denmark). Water physico-chemical parameters showed no significant variations during the experiment (Table 1). The whole experiment was carried out in accordance to the Brazilian Guidelines for Use and Care of Animals (CONCEA), with the authorization of INPA (CEUA protocol nº 022/2017). Table 1: Water physico-chemical parameters for each experimental condition. Treatment Oxygen (mg/l) Temperature (ºC) Ammonia (µg/l) pH Normoxia 6.0 a ± 0.50 28.0 a ± 0.5 3.7 a ± 0,004 5.64 a ± 0.08 Hypoxia 0.7 b ± 0.05 28.0 a ± 0.5 3.4 a ± 0,004 5.80 a ± 0.07 One-way ANOVA was performed. Same letter indicates no difference between normoxia and hypoxia treatments (p>0.05). Mean ± SEM.

Blood and Tissue Sampling

At the end of the experiment, blood samples were collected from the caudal vein with heparinized syringes. After the blood collection, spinal cord was cut, gills and liver were excised, promptly frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C for further analysis.

Biochemical Assays

Plasma glucose determination was performed with the colorimetric enzymatic glucose kit (InVitro, MG, Brazil), according to manufacturer’s instructions. For plasma lactate quantification, total plasma was acidified with 8% perchloric acid and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed and neutralized with 6M potassium hydroxide and centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes. The supernatant was pipetted into a microplate with glycine buffer (G5418, Sigma-Aldrich, CA, USA), β-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (N6522, Sigma-Aldrich, CA, USA) and L-lactic dehydrogenase (L2500, Sigma-Aldrich, CA, USA). The microplate was incubated at 37°C for approximately 10 minutes. The reading was performed using a microplate reader (SpectraMax M, Molecular Devices, CA, USA) at the wavelength of 340 nm. For liver glycogen quantification, liver sample (≈ 0.03 g) was placed in a microtube containing 6N potassium hydroxide. The microtube was placed in a dry bath at 98°C until liver total dissolution. Subsequently, 96% ethanol and 10% potassium sulfate were added to it. The solution was centrifuged and the supernatant discarded. Pure water was added to the white sediment (Bidinotto et al., 1997). An aliquot was withdrawn and 3% of 15 phenol and sulfuric acid were added to it. The solution was mixed and incubated for 10 minutes at 25°C (Dubois et al., 1956). The reading was performed using a microplate reader (SpectraMax M, Molecular Devices, CA, USA) at the wavelength of 340 nm.

Total RNA extraction and first-strand (cDNA) synthesis

Total RNA was isolated from gills and liver using Trizol Reagent (Invitrogen, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. Total RNA was quantifield with NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, MA, USA). The integrity of the RNA was verified by 1% agarose gel electrophoresis, showing intact 28S and 18S rRNAs bands. Total RNA was diluted to a final concentration of 500 ng/µl with nuclease-free water and was treated with DNase I Amplification Grade (Invitrogen, CA, USA). cDNA synthesis was obtained using total RNA and High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, USA), according to manufacturer's protocol.

Sequencing and obtaining primer

A BlastN search was performed (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) on the complete, non- redundant Genbank nucleotide database for orthologues of phd2 in other fish species. A multiple sequence nucleotide alignment was then carried out on coding sequences to design the primers. The specific sequences were obtained through the Sanger protocol at ABI 3130 (Applied Biosystems, CA, USA) following the ABI PRISM® Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, CA, USA) protocol. The obtained sequences were analyzed through ABI 3130 Sequence Analyzer software (Applied Biosystems, CA, USA) for the electropherograms quality parameters. The contigs were generated using the BlastN validated tool for the detection of nucleotide homology on NCBI (www.ncbi.nlm.nih). Primers were designed using Oligo Explorer 1.5 software. The annealing temperature was optimized by gradient PCR. Quantitative real-time PCR (RT-qPCR) primers sequence was: phd2 - Forward primer: 5´-AAGTTGTCGGTTAGTAGGGC-3´ phd2 - Reverse primer: 5´-TCGNTCTGCGGCTTCTCCA-3´

Real-time quantitative PCR 16

In triplicate, cDNA was used for real time-qPCR analysis, which was performed using Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA) on ViiA 7 PCR-System (Applied Biosystem, CA, USA). For RT-qPCR, besides phd2, the primer sequences for hif-1α and housekeeping genes 18S and Actin Beta, described by (Baptista et al., 2016), were analyzed (Table 2).

Table 2: Primer sequences. Gene Forward primer Reverse primer 18s 5´-GGGAGGTTCGAGACGATCAG-3´ 5´-TCGCTAGTTGGCATCGTTTATG-3´ βactin 5´-CCTTGATGTCACGCACGATT-3´ 5´-CAGAGCGTGGCTATTCCTTCA-3´ Hif-1α 5´-GGAGAGCACCAACGGACAA-3´ 5´-GGGTCACAGATCAAAACCAGGTA-3´

The amplification of housekeeping genes was constant during the experiment, qualifying them as strong housekeeping genes for hypoxia. The efficiencies of these four genes were approximately 100%, which ensures that the ΔCp equation was used correctly. RT-qPCR mix contained 5 μl Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA), 2 μl nuclease-free water, 1 μl cDNA, 1 μl forward primer (2.5 pmol) and 1 μl reverse primer (2.5 pmol). The RT-qPCR was performed under the following conditions: denaturation during 20 s at 95°C, then 40 cycles: 1 s at 95°C,20 s at 60°C,15 s at 95°C, with data collection after each cycle. Next, the melting/dissociation curve analysis was performed:15 s at 95°C,60 s at 60°C and 15 s at 95°C. To calculate the target gene relative quantification, RT-qPCR efficiency corrected calculation model was used (Pfaffl, 2004).

(E target) ∆Ct target R = (E ref ) ∆Ct ref

Table 3: PCR amplification efficiency of reference genes, phd2 and hif-1α. Genes PCR amplification efficiency E = 10(-1/S)

Gills R2 Liver R2 18s 2.0 0.99 2.01 0.99 β-actin 2.0 0.98 2.0 0.99 phd2 1.98 0.96 2.01 0.99 hif-1α 2.01 0.91 1.98 0.98

Statistical analysis

Relative gene expression and biochemical aspects were examined for exposure time between normoxia, hypoxia and recovery. For this, bidirectional analysis of variance (two-way ANOVA) followed by Holm-Sidak post hoc test was used. Analyses with p<0.05 were considered significant different. Data were expressed as mean ± SEM. Statistical analysis were done in SigmaStat (v. 3.5) and graphics were done in SigmaPlot software (v. 11.0).

RESULTS

Biochemical aspects

Exposure to 3 and 5 hours of hypoxia decreased liver glycogen when compared to 1 hour of hypoxia. (p< 0.004; F = 5.12) (Figure 1A). In hypoxia, plasma glucose (p< 0.001; F = 59.57) (Figure 1B) and plasma lactate (p< 0.001; F = 94.12) (Figure 1C) increased, when compared to normoxia. After 3 hours of recovery in normoxia, the glucose level remained elevated, but lactate returned to the levels found in normoxia.

Gene Expression

Liver and gills had inverse expression patterns for mRNA of phd2. In liver (Figure 2A), hypoxia caused a reduction in phd2 levels (p< 0.001; F = 33.79) compared to normoxia. In the gills (Figure 2B), hypoxia increased phd2 transcripts (p< 0.001; F = 96.28) when compared to normoxia. In both cases, the recovery returned the phd2 transcripts to normoxia levels. In liver (Figure 3A), hif-1α showed no difference in expression between normoxia and hypoxia (p=0.683; F = 0.170), the same occurred in gills (p=0.101; F = 2.91 (Figure 3B).

Figure 2. Relative expression of phd2 in liver (A) and gills (B) of Astronotus ocellatus exposed to normoxia (6 mg O2/L ± 0.5) and hypoxia (0.7 mg O2/L ± 0.05) for 1, 3 and 5 hours and recovery (6 mg O2/L ± 0.5) for 3 hours (mean±s.e.m., n=6). Statistical significance was analyzed using a two-way ANOVA. Bars with different letters indicate difference between time, normoxia, hypoxia and recovery (p< 0.05). 20

Figure 3. Relative expression of hif-1α in liver (A) and gills (B) of Astronotus ocellatus exposed to normoxia (6 mg O2/L ± 0.5) and hypoxia (0.7 mg O2/L ± 0.05) for 1, 3 and 5 hours and recovery (6 mg O2/L ± 0.5) for 3 hours (mean±s.e.m., n=5).

DISCUSSION

This is one of the few studies to show the effects of acute hypoxia on phd2 mRNA levels in the gills and liver, two organs essential for homeostasis of oxygen. Besides, this is the first study regarding phd2 in an Amazonian fish. 21

After the first hour of hypoxia, the hepatic glycogen content decreased (Figure 1A) and this hypoxia response has also been observed in a previous study with the congeneric Astronotus crassipinnis, by Chippari-Gomes et al. (2005). The reduction of hepatic glycogen during hypoxia is a well-known fish response to improve its tolerance to low oxygen availability (Heath and Pritchard, 1962; Chen et al., 2007; Padmavathy and Ramanathan, 2010; Chen et al., 2017). The hepatic glycogenolysis, caused by hypoxia, generated an increase in plasma glucose concentrations (Figure 1B), supplying energy to the body in anaerobic conditions through anaerobic glycolysis (Scarabello et al., 1992; Schulte et al., 1992; Chippari-Gomes et al., 2005). An increase on plasma glucose and plasma lactate levels were also observed in this specie under hypoxia by Muusze et al. (1998), Richards et al. (2007), Wood et al. (2007), Baptista et al. (2016) and by Heinrichs- Caldas et al. (2019) in the congeneric Astronotus crassipinis. Plasma lactate response is in agreement with Padmavathy and Ramanathan (2010), which showed that plasma lactate concentration, under hypoxia stress, increased to a maximum level, followed by a decrease to values close to the control during the recovery phase. This occurs due to the oxidation of the lactate, when the lactate accumulates and oxygen is abundant in the cells. The high plasma lactate level in fish submitted to hypoxia (Figure 1C) might be metabolized in the liver and, as a consequence, might increase liver lactate, as observed in Astronotus ocellatus by Richards et al. (2007). In fishes exposed to hypoxia, phd2 liver transcripts decreased, but increased during the recovery phase, returning to similar levels found in normoxia (Figure 2A). This result contrasts with the literature, which reported an increase in liver phd2 transcripts of other fish species submitted to hypoxia (Wang et al., 2015; Zhang et al., 2017). We suggest that the lower level of liver phd2 transcripts in hypoxia reflects on a lower level of its protein, PHD2, allowing HIF-1 protein to bind to its target genes. HIF-1 may have induced the expression of a wide variety of genes required for organism to survive in situations where there is a lack of oxygen, as described by Wenger et al. (2005). The gene of the lactate dehydrogenase-A (ldh-a) is one of the target genes of HIF-1 protein (Semenza, 1998, 2002; Cui et al., 2017). Thus, the reduction of phd2 transcripts resulted in an increase in ldh-a transcription, as reported by Suhara et al. (2015) in mouse liver cells. Heinrichs-Caldas et al. (2019) measured the LDH activity in the liver of A. crassipinnis submitted to hypoxia, and recovery in normoxia, and observed an increase in LDH activity in animals submitted to 5 hours of hypoxia and a decrease in the enzyme activity after recovery in normoxia. All these data suggest that LDH responded to hypoxia 22 accumulating lactate and uptaking it for conversion to glycogen (Hochachka and Somero, 1984) to avoid the toxicity caused by lactate accumulation in the organs, such as the heart and liver (Almeida-Val and Val, 1993). Gills phd2 transcripts level increased in hypoxia exposure but returned to normoxia level during the recovery phase (Figure 2B). The increase of phd2 transcripts in the gills during hypoxia contrasts with the data obtained by Wang et al. (2015), which verified a decrease of phd2 expression in the gills of Megalobrama amblycephala submitted to hypoxia during four hours. Hypoxia allows HIF-1 protein to stabilize and acts as a transcription factor that binds to the HRE region of its target genes, such as phd2, that has a HRE region (D’Angelo et al., 2003; Aprelikova et al., 2004; Metzen et al., 2005; Stiehl et al., 2006; Rytkonen et al., 2012). Consequently, we suspect that high levels of phd2 transcripts in the gills exposed to hypoxia were induced by HIF-1, since this positive feedback mechanism involving phd2 and HIF-1 protein was observed in human cells (Marxsen et al., 2004; Pescador et al., 2005) and fish liver cells (Zhang et al., 2017). The positive feedback of phd2 would result in an interruption of hypoxic responses through the degradation of HIF-1α protein during reoxygenation (D’Angelo et al., 2003; Marxsen et al., 2004). We believe that this positive feedback mechanism may be related to protein synthesis, since PHD2, in normoxia, also hydroxylates proteins related to protein synthesis, as the eukaryotic elongation factor 2 kinase (eEF2K). In hypoxia, due to decreased efficiency of PHD2, eEF2K will be not hydroxylated and will become capable of phosphorylating eukaryotic elongation factor 2 (eEF2), causing a reduction of protein synthesis, for ATP and amino acids preservation (Romero-Ruiz et al., 2012; Moore et al., 2015). A reduction of 50-55% in protein synthesis rates was observed in the gills of Astronotus ocellatus exposed to hypoxia by Cassidy et al. (2018). Thus, we believe that high levels of gills phd2 transcripts during hypoxia may be important for the resumption of protein synthesis during initiation of the reoxygenation. No differences of hif-1α transcripts in gills subjected to hypoxia was observed (Figure 3B). This result resembles data obtained for gills by Mu et al. (2015) and Li et al. (2017) and for other tissues of other fish species (Soitamo et al., 2001; Shen et al., 2010). However, Rissanen et al. (2006) combining hypoxia with exposure to different temperatures, observed an increase in hif-1α transcripts in the gills of Carassius carassius and also observed that there were no differences in the levels of hif-1α transcripts in the liver of animals exposed to long periods of hypoxia at different temperatures (18ºC e 23

26ºC). Mu et al. (2015) and Li et al. (2017) also did not find differences in liver hif-1α transcripts of other fish species exposed to hypoxia. In our study, no changes in liver hif- 1α was observed (Figure 3A), although Baptista et al. (2016), in a study with wild A. ocellatus with similar weight, noticed an increase in liver hif-1a transcripts after 3 hours of hypoxia exposure. Rytkonen et al. (2012) suggests that fishes that were previous exposed to hypoxia amplifies their transcriptional responses when compared to animals that experienced a single hypoxic crisis. The hypoxia responses of hif-1α transcripts in our study may not reflect its protein levels, as seen by Robertson et al. (2014), which observed an increase of HIF-1α proteins even without a change in the amount of hif-1α transcripts. In conclusion, hypoxia caused a decrease in liver glycogen, which was mobilized as plasma glucose to supply the demand of the anaerobic metabolism, evidenced by the high levels of plasma lactate. The different transcription pattern of phd2 found in liver and gills indicates that these organs have different molecular strategies to cope with hypoxia. Although hif-1α in liver and gills did not show any differences in transcript levels when exposed to hypoxia, we believe that both tissues have different amounts of the HIF-1α protein, evidenced by the transcription pattern of phd2.

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3. CONCLUSÃO As respostas da espécie Astronotus ocellatus a exposição a diferentes períodos de hipóxia, seguido de recuperação em normóxia, evidenciaram que os peixes entraram em hipóxia e ativaram o metabolismo anaeróbico, como comprovado pela glicogenólise no fígado e pelo aumento da glicose e do lactato no plasma dos indivíduos. Tanto quanto reconhecemos que na literatura, este é o primeiro trabalho que demonstra o mecanismo de feedback positivo atuando nas brânquias de um peixe amazônico, no qual presumimos a indução de transcritos de phd2 pela proteína HIF-1 como um modo de autorregulação durante a hipóxia. O padrão de transcritos da phd2 respondeu ao esperado no fígado, diminuindo durante a hipóxia e aumentando na recuperação, quando o oxigênio foi disponibilizado no meio aquático. Assim, o padrão de transcrição da phd2 no fígado e nas brânquias evidenciou que esses órgãos possuem diferentes respostas moleculares parar enfrentar a hipóxia, ainda que o gene hif-1α em ambos os tecidos não tenha demonstrado diferenças nos níveis de transcritos. Sugerimos que as brânquias e o fígado possuem diferentes quantidades da proteína HIF-1 dado o padrão de transcrição da phd2. Mais estudos são necessários com as proteínas PHD2 e HIF-1 para que possamos confirmar a nossa hipótese.

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