ار اا ااط ا REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE وزارة ا ا و ا ا Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique ار$ ا م ا"! ااش - اا Ecole Nationale Supérieure Agronomique d’El-Harrach Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de magister en Sciences Agronomiques Département : Botanique Option : Phytopathologie Thème Mise au point d’une technique moléculaire de détection de Xanthomonas campestris et validation d’une procédure de détection dans les semences basée sur la PCR Présenté par : LAALA Samia Soutenu devant le Jury composé de : Président : Pr Z. Bouznad INA-EL Harrach (Alger) Promoteur : Dr C. Manceau INRA Angers (France) Co-promoteur : Mme S. Yahiaoui INA-EL Harrach (Alger) Examinateurs : Dr M. Louanchi INA-EL Harrach (Alger) Dr A. Guezlane INA-EL Harrach (Alger) Invité: Dr M. Kheddam CNCC - Harrach (Alger) Année universitaire : 2008-2009 Remerciements En premier lieu, je tiens à remercier mon promoteur, Mr Charles Manceau de m’avoir accueillie dans son laboratoire et permis de réaliser un travail de recherche intéressant. Je lui exprime toute ma reconnaissance pour son aide, sa compréhension et l’amitié qu’il m’a accordé. Je remerci sincerement ma copromotrice M me Saléha Yahiaoui pour son aide, son amitié, ses précieux conseilles et ses orientations. J’exprime mes remerciements à Monsieur. Z. Bouznad qui m’a fait l’honneur d’accepter de présider le jury de ma thèse. Je remercie vivement Mme M. Louanchi et Mr A. Guezlane qui ont bien voulu être les examinateurs de cette thèse et d’avoir d’accepter de faire partie de mon jury. J’adresse mes remerciements à M. r Mohamed Kheddam pour l’aide qu’il m’a apporté et d’avoir accepté mon invitation et faire partie de mon jury. J’exprime mon amitiè à tout le personnel du laboratoire de pathologie végétale de l’INRA d’Angers en particulier, Martine Devaux, Elisabeth De Lomenie, Jacky Guillaumes, Bruno Le Cam, Sophie Gérande, Bérénice Briand ; Perrine Potier, Marie-Agnès Jacques; Boureau Tristan, Jean-Pierre Paulin, Martial Briand et Jacqueline Gaudin, merci à vous pour votre soutien et vos enccouragements. J’exprime mes remerciments à mes collegues du C.N.C.C. pour leur aide et leur soutien en particulier Houria Belhadj, Rachida Telmat, Fatima Soufli, Branki Fatiha, Mokrani Chabana, Houcine Boulemnakhar, Samia Guendez et Rosa Boughris Merci à tous mes amis qui ont beaucoup compté durant cette thése : Nicol, Sofie, Mohamed, Wahiba, Adil, Jaques, Marie Noél, Kenza, Houda et Said. Je n’oublie pas de remercier la défunte Nardjes pour son amité et ses encouragements. Merci à toute ma famille, mes parents, ma sœur, mes frères, mes neveux, mes nièces merci pour votre soutien et vos encouragements. LISTE DES ABREVIATIONS Divers A : Adénine ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire ADNg : Acide désoxyribonucléique génomique ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager ATCC : American Type Culture Collection BSA : Bovine serum albumin C : Cytosine CFBP : Collection Française de Bactéries Phythopathogènes cfu : Colonies formant unité cv. : Cultivar ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay DEPC : Diéthylpyrocarbonate DNase : Désoxyribonucléase dNTP : Deoxynucléotide triphosphate EDTA : Ethylene diaminotetraacetic acid hrp : Hypersensitive reaction and pathogénicity G : Guanine M-MLV : Moloney-murine leukemia virus OEPP : Organisation Européenne et méditéranéenne pour la protection des végétaux. PCR : Polymerase chain reaction PM : Poids moléculaire PVP : Polyvinylpyrolidone RNase : Ribonucléase RT-PCR : Reverse transcriptase-PCR T : Thymine Taq : ADN polymérase TBE : Tris-Borate-EDTA TE : Tris-EDTA ATN : Acides Nucleiques Totaux UV : Ultra Violet YPGACvc Extrait de lévure, Peptone, Glucose, Agare, cycloheximide, Vancomycine Céphaléxine var. : Variété : Unités de mesures µl : Microlitre °C : Degré Celsius bp : paires de bases g : Gramme h : Heure l : Litre M : Molaire min : Minute ml : Millilitre mM : Millimolaire sec. : seconde rpm : Tour par minute µM : Micromolaire U : Unité enzymatique V : Volt Vol. : Volume - 1 - - 2 - Glossaire Acide désoxyribonucléique (ADN) Polymère de désoxyribonucléiques Acide nucléique Polymère de nucléotides Acide Ribonucléique (ARN) Polymère de Ribonucléiques ADN complémentaire (ADNc) ADN simple brin, qui est une copie d’un ARN obtenu par transcription inverse ADN polymérase Enzyme catalysant la polymérisation (5’ vers 3’) des mononucléotides triphosphates qui constituent l’ADN Aérobie Bactérie qui nécessite de l’oxygène pour survivre Amplification en chaîne par polymérase (PCR) Procédé d’amplification exponentielle in vitro d’une séquence définie d’ADN, faisant intervenir des cycles successifs d’appariements d’oligonucléotides spécifiques et d’élongation à l’aide d’une polymérase Amorce Oligonucléotide qui, hybridé avec une matrice d’acide nucléique, permet à une polymérase d’initier la synthèse du brin complémentaire Anticorps (Ac) Molécule d’immunoglobuline définie par sa propriété d’interaction spécifique avec un antigène Antigénique (Ag) Molécule définie par sa propriété d’interaction spécifique avec un anticorps Antiserum Sérum issu d’un organisme immunisé, contenant des Ac contre l’Ag utilisé pour l’immunisation. ARN mesager (mRNA) ARN pouvant être traduit en protéine - 3 - Glossaire ARNr ARN ribosomique présent dans le ribosome Bacille Bacillium, bactérie en forme de bâtonnet Bactéricide Substance ou préparation ayant la propriété de tuer des bactéries Biotype Entité génétique d’un microorganisme pathogène, définie par rapport à son pouvoir pathogène sur différents cultivars (synonyme race) Cadre de lecture Ensemble de codons en phase correspondante à la synthèse d’une protéine Cystéine Acide aminé qui joue un rôle dans les phénomènes d’oxydoréduction Dégât Altération touchant la fonction de la plante, le produit de la culture ou le potentiel de production Diagnostic Démarche adoptée pour identifier la (ou les) cause (s) des symptômes observés DNAse Désoxyribonucléase Épiphyte Qui vit à la surface d’un végétal sans provoquer de symptôme visible de maladie Epuration Elimination des déchets de culture dans une parcelle par incinération Extrémité 5’ ou 3’ terminale Début ou fin d’une chaine de polynucléotides (ARN ou ADN) Famille Rang taxonomique situé entre Ordre et Genre Gène Fragment d’un chromosome qui détermine ou conditionne un ou plusieurs caractères héréditaires. C’est la plus petite partie fonctionnelle du matériel génétique. Génome Ensemble du matériel nucléique héréditaire chez une cellule - 4 - Glossaire Genre Rang taxonomique situé entre Famille et Espèce Infection Etablissement d’une relation parasitaire entre un agent pathogène et une plante-hôte sensible Inoculum Pathogène, ou partie de celui-ci, pouvant provoquer une contamination. Latence (periode de) Période qui sépare l’infection de l’apparition des tissus infectieux Lésion Zone d’altération de tissus végétaux Lipopolysaccharides (LPS) Molécules complexes contenant à la fois des lipides et des glucides contenues dans la paroi des bactéries Gram- Maladie Anomalie du phénotype observée par rapport au phénotype attendu Marqueurs moléculaires Séquence d’ADN associée à un caractère donné du phénotype Matériel initial Matériel pour le quel l’absence de pathogène est contrôlée par des tests réalisés individuellement à l’aide des procédures les plus rigoureuses; il doit être constamment maintenu dans les conditions strictes garantissant l’absence de contamination. Matériel de propagation Matériel issu de la multiplication du matériel initial et maintenu dans les conditions garantissant l’absence de contamination. Matériel certifié Matériel produit à partir de matériel de propagation, dans des conditions adéquates et qui a fait l’objet d’un contrôle par un organisme certificateur. Il est destiné aux parcelles de production. Nucléotide Molécule résultant de l’union d’un ribose ou désoxyribose, et d’une base purique ou pyrimidique, et trois groupements phosphate Oligonucléotide Courte séquence d’acide nucléique (généralement inférieure à 100 bases) ORF Cadre ouvert de lecture dans un ARN messager, qui code pour un polypeptide - 5 - Glossaire Pathovar ( pv. ) Entité taxonomique chez les procaryotes qui montre une spécificité parasitaire vis-à- vis d’une espèce hôte particulière Phénétique Qualifie les classifications basées sur le degré de similitude des organismes Phénotype Aspect observable d’un organisme déterminé par son génotype et l’environnement Phylogénétique Qualifie les classifications basées sur les relations évolutives entre organismes Phytopathogène Qui cause une maladie chez les plantes Procaryote Organisme unicellulaire dépourvu de noyau individualisé Prophylaxie Ensemble de mesures prises pour prévenir l’apparition ou le développement d’une maladie Saprophyte Organisme qui se nourit de matière organique morte Souche Descendant d’un isolat de microorganisme isolé (in vitro ou sur la plante) Symptôme Altération du phénotype par rapport au phénotype attendu Virulence Capacité d’un biotype (pathovar ou race) à surmonter la résistance d’une espèce, d’un groupe d’espèce ou d’une variét - 6 - Table des matières Table des matières page Liste des figures Liste des tableaux INTRODUCTION .................................................................................................................. 17 PARTIE BIBILIOGRAPHIQUE ......................................................................................... 19 1. L’HOTE ET SON PATHOGENE : LES BRASSICACEES ET X. CAMPESTRIS ..... 21 1. 1 LES