I

II

III

Dedico esta tese a minha mãe, Maria do Carmo Orlandi, meu porto seguro.

IV

“We will have to repent in this generation not merely for the hateful words and actions of the bad people,” wrote Martin Luther King , “but for the appalling silence of the good people.”

"Tell me, and I will forget.

Teach me, and I will remember.

Involve me, and I will learn"

Benjamin Franklin

“Gather a shell from the strown beach

And listen at its lips: they sigh

The same desire and mystery,

The echo of the whole sea´s speech.”

Dante Gabriel Rosseti

V

AGRADECIMENTOS

A professora doutora Shirlei Maria Recco-Pimentel por me orientar desde o mestrado, sempre proporcionado todas as condições para que a pesquisa fosse realizada com excelência. Incentivando, discutindo resultados e me estimulando a prosseguir sempre. Por ser um exemplo de seriedade, compromisso e dedicação ao trabalho.

A FAPESP pela concessão da bolsa de doutorado (Proc. n o. 04/13887-4).

A CAPES, entidade do Governo Brasileiro voltada para a formação de recursos humanos, pelo apoio para a realização desse trabalho.

A UNITAS MALACOLOGICA, Malacological Society of London e Sociedade

Brasileira de Malacologia pelos auxílios financeiros para participação em

Congressos Nacionais e Internacionais.

Aos professores Dr. Osmar Domaneschi in memoriam , Dr. Flávio Dias

Passos e a Dra. Eliane Pintor de Arruda por tão gentilmente me auxiliarem a identificar exemplares de diversas espécies de bivalves, contribuindo de forma efetiva para o êxito de nossas análises.

A Dra. Cláudia Alves de Magalhães por ter me introduzido ao universo das coletas de moluscos, por me incentivar sempre e por ser uma amiga muito especial.

As pesquisadoras, do Instituto Butantan, Dra. Toshie Kawano (Laboratório de Parasitologia), Dra. Sylvia Mendes Carneiro, Dra. Marta Maria Antoniazzi VI

(Laboratório de Biologia Celular) por disponibilizarem a utilização do Microscópio

Eletrônico de Transmissão e aos técnicos Alexsander Seixas de Souza e Simone

Jared.

A todos os alunos das professoras Dra. Luciana Bolsoni Lourenço e Dra.

Shirlei Maria Recco-Pimentel: Stenio, Juliana Nascimento, Cíntia, Paula, Eduardo,

Maria Madalena, Andréa e tantos outros por compartilharem conhecimentos e uma parte de suas vidas durante as horas em que passamos juntos durante a pós- graduação.

Aos professores doutores Ana, Odair e Luciana pelos ensinamentos e pelo exemplo de comprometimento com a pesquisa.

As alunas do programa de pós-graduação com as quais tive a oportunidade de estreitar laços de amizade Carolina Carvalho, Juliana Godoy, Aline Brandão,

Samantha Celi e Yeda Quinderé.

A Alessandra Ferreira da Costa por participar de nosso grupo de trabalho, trazendo novas abordagens ao modo como vivenciamos o dia-a-dia no laboratório; sendo sempre gentil e solícita.

A Dra. Márcia Regina Denadai e ao Dr. Alexander Turra por coletarem e me ensinarem a coletar exemplares de bivalves marinhos no norte do estado de São

Paulo.

Ao corpo técnico-administrativo do laboratório de Microscopia Eletrônica do

Instituto de Biologia da UNICAMP: Antonia Maria Ferreira Lima, Adriane Cristina VII

Sarti Sprogis, Maria Aurora Souza da Silva e Maria Aparecida Santos por sempre me auxiliarem prontamente a utilizar os equipamentos e a recorrer aos recursos disponibilizados pelo laboratório.

A Dra. Mary Anne Heidi Dolder e aos seus orientados por permitirem acesso a alguns dos equipamentos sob sua responsabilidade assim como viabilizar o empréstimo de alguns materiais de consumo.

Aos Professores Doutores Paulo Joazeiro e Áureo Tatsumi Yamada por permitirem a utilização do ultra-micrótomo e ao Juvani Lago Saturno pelo auxílio técnico.

Ao Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Estrutural por todas as oportunidades e respaldo para o desenvolvimento do doutorado e á secretária

Líliam Alves Senne Panagio por todo o suporte necessário as oficializações e documentações durante a minha trajetória acadêmica.

Ao Doutor Eugênio Rosa, da Faculdade de Engenharia Mecânica da

UNICAMP, por discutir sobre a interação entre corpos microscópicos e fluidos, permitindo o entendimento da relação entre a morfologia do espermatozóide e alguns conceitos de Física.

Ao Doutor Sérgio Siqueira Júnior, pela amizade durante os anos em que estivemos na pós-graduação e pela elaboração de ilustrações de espermatozóides.

VIII

Ao Rogério Lupo pelas ilustrações das conchas de bivalves marinhos. Ao meu irmão Walter Introíni pelas ilustrações de células gaméticas.

Durante o estágio em Portugal:

A Elsa Oliveira e a Angela, técnicas do Laboratório de Biologia Celular,

Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, por terem me recebido com tanta hospitalidade durante minha permanência nas terras portuguesas. E aos professores doutores Alexandre Lobo da Cunha e Mário

Manuel da Silva Leite Sousa por terem me orientado nesse período. Aos alunos de pós-graduação Maria Inês Pinho dos Santos Graça, Ana Raquel Andrade

Castro Azevedo e João Garcia, por serem pessoas lindas e doces que sempre estiveram ao meu lado durante três meses.

Aos meus amigos Karla, Meika, Marcelo, Ava, Hérika, Alessandro, Will,

Maria, Veve, Marília e Thiago, por proporcionarem momentos inesquecíveis e agradáveis, cheios de alegria e cumplicidade.

Referindo-me a minha formação durante os Ensinos Fundamental, Médio e

Graduação:

A todos os docentes do Externato Ofélia Fonseca, na cidade de São Paulo, assim como do curso de graduação em Ciências Biológicas da Universidade

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Rio Claro, por contribuírem para a minha formação como cidadã e bióloga, permitindo que eu me interessasse cada vez mais pela vida acadêmica.

IX

Em minhas horas particulares:

Ao Gabriel Baptista Alves Aleixo, por ser uma das pessoas mais doces, carinhosas e responsáveis que conheci. Por conseguirmos mesmo com vidas atribuladas e repletas de atividades, preenchermos as frestas das horas com amor, respeito e admiração.

Aos amigos Leandro Schlittler, Leandro Diniz e Mahayana Godoy por toda amizade, força e carinho nesses anos de convivência na cidade de Campinas.

A Maria José de Resende por ser uma pessoa incrível que transborda compaixão e generosidade. Tenho orgulho em tê-la como minha amiga.

A Maria Inês por toda a ajuda e amizade nos momentos difíceis e por comemorar as conquistas diárias.

Ao Ângelo Primo e ao José Augusto Lopes Júnior por sempre acreditarem em mim.

Ao meu pai e a minha tia Laís, in memoriam .

A Simone, minha irmã, por sua cumplicidade e tolerância durante anos em que eu pedi silêncio em casa para que eu pudesse me concentrar nos estudos.

Por sua irreverência e personalidade forte. Por sua amizade e incentivo.

A minha querida mãe por sermos unidas sempre, compartilhando vitórias e tropeços. Por seu amor incondicional. Por ser uma pessoa altruísta e generosa.

Por sempre se preocupar com a minha formação acadêmica e com a construção X de minha personalidade. Ao seu lado, inevitavelmente, encontro acalento e incentivo, força e retidão.

XI

1. RESUMO ______2 2. ABSTRACT ______4 3. INTRODUÇÃO ______6 3.1. Aspectos gerais da taxonomia dos Mollusca ______6 3.2. Ultra-estrutura de espermatozóides de bivalves marinhos ______8 3.2.1. Núcleo do Espermatozóide, tamanho do ovo e tipo de desenvolvimento ______12 3.2.2. Algumas Considerações sobre a terminologia empregada no estudo de espermatozóides ______14 3.3. As famílias, as espécies estudadas e a problemática envolvida ______15 3.3.1. Família Veneridae ______15 3.3.2. Família Donacidae ______19 3.3.3. Famíla Tellinidae ______21 3.3.4. Família Mytilidae ______25 3.3.5. Família Isognomonidae ______28 3.3.6. Família Ostreidae ______31 3.4. REFERÊNCIAS ______40 4. OBJETIVOS GERAIS ______53 5. ARTIGOS ______54 Comparison of the Spermatozoan Morphology of Isognomon bicolor and Isognomon alatus (Mollusca, Bivalvia, Isognomonidae) ______55 Spermatozoan ultrastructure and detection of nuclear acid phosphatase activity in spermatids of Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides (Mollusca, Bivalvia, Veneridae) ______64 Comparative study of sperm ultrastructure of five bivalve species of the families Tellinidae and Donacidae ______93 Sperm ultrastructure in Crassostrea oysters from Cananéia in the Southeast of Brazil ______127 Ultrastructure of spermatozoa in Mytella (Bivalvia, Mytilidae) populations from distinct habitats in the southeast coast of Brazil ______153 6. CONCLUSÕES GERAIS ______168

1

1. RESUMO

Aplicações de Microscopias Eletrônicas de Transmissão (TEM) e Varredura

(SEM) têm contribuído para a sistemática de moluscos bivalves e classificações de táxons mais abrangentes. Em muitos casos, os resultados dessas ferramentas metodológicas têm notavelmente complementado os estudos comparativos da anatomia interna e dos caracteres conquiliológicos, contribuindo para uma ampla compreensão das relações filogenéticas entre os representantes da classe

Bivalvia. A morfologia dos espermatozóides de inúmeros táxons importantes das subclasses Pteriomorphia e Heterodonta permanece pouco ou nada estudada. A análise de espécies dessas subclasses pode corroborar estudos que abordam taxonomia e filogenia. No presente trabalho, foi realizado o estudo da ultra- estrutura dos espermatozóides de espécies de bivalves das famílias Veneridae,

Donacidae, Tellinidae (Ordem Veneroida, Subclasse Heterodonta,), Mytilidae

(Mytiloida), Isognomonidae (Pterioida) e Ostreidae (Ostreoida) (pertencentes à

Subclasse Pteriomorphia). Os espermatozóides de todas as espécies de bivalves analisadas, com exceção da espécie Tellina lineata , apresentaram uma morfologia típica de animais marinhos que liberam seus gametas fertilizando seus ovos na

água do mar. A microscopia eletrônica de transmissão forneceu importantes caracteres que auxiliaram na diferenciação entre os espermatozóides das espécies Isognomon bicolor e I. alatus (única coletada em território estrangeiro);

Donax hanleyanus e D. gemmula ; Macoma biota e M. constricta . A célula gamética masculina de Tellina lineata foi considerada modificada , portadora de acrossomo cônico e curto, núcleo longo e helicoidal, mitocôndrias alongadas que

2 se estendiam sobre a periferia da base nuclear, estruturas longas que se dispunham ortogonalmente (mas que não apresentavam o padrão convencional dos centríolos) e um flagelo simples. Na literatura acerca dos Bivalvia, considera- se a cabeça alongada mais eficiente na penetração de óvulos que possuem ampla camada gelatinosa. O espermatozóide de Tivela mactroides (em comparação com aquele produzido por Anomalocardia brasiliana ) possibilitou a descrição de determinadas características que podem contribuir para vantagens adaptativas nos ambientes nos quais os bivalves ocorrem. Uma característica interessante da cabeça alongada dos espermatozóides dos membros da família Veneridae é a presença de curvatura. Populações de Mytella podem ocorrer tanto em costões rochosos quanto em bancos de sedimento areno-lamoso. Não houve diferença entre essas populações e foi sugerido que ambas se tratam de M. charruana. A presença de perforatorium no espermatozóide de Mytella charruana permite sua alocação na subfamília Mytilinae. As descrições disponíveis na literatura sobre a morfologia do gameta masculino de ostras mostram uma significativa semelhança entre as espécies investigadas, corroborando o status monofilético da família

Ostreidae. Segundo os resultados apresentados é possível afirmar que a espécie

Crassostrea brasiliana ocorre na região de Cananéia. Conclui-se que os dados da tese mostraram-se especialmente importantes por revelarem os detalhes internos mais sutis dos espermatozóides, ampliando o crescente entendimento da estrutura, biologia e desenvolvimento dos espermatozóides de bivalves das famílias Isognomonidae, Veneridae, Donacidae, Tellinidae, Mytilidae e Ostreidae.

3

2. ABSTRACT

The ultrastructure of bivalve spermatozoa can be species-specific and often provide valuable taxonomic traits for systematic reviews and phylogenetic reconstructions. Transmission and scanning electron microscopy was an efficient tool to differentiate the spermatozoan structure of species sharing many conchological characters, which could lead to equivocal identification. We analyzed sperm ultrastructural features that were useful for taxonomic issues with regard to

Isognomon bicolor and Isognomon alatus (Isognomonidae); Macoma constricta ,

Macoma biota and Tellina lineata (Tellinidae); Donax hanleyanus and Donax gemmula (Donacidae). The data revealed that the bivalve species studied here, except T. lineata , produce primitive-type spermatozoa, typical of marine invertebrates in which eggs are fertilized in the surrounding water. We, also, compared the ultrastructure of spermatozoa from the bivalves Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides (Veneridae). The spermatozoa of both species contain a curved nucleus with a short cone-shaped acrosome. There were six mitochondria and glycogen clusters in the middle piece of the T. mactroides sperm cell. Possibly, the glycogen clusters and the higher mitochondria number correspond to an adaptive advantage in turbulent waters. Increasing the sperm life expectance also increases the odds of finding the eggs and accomplishing fertilization. Oysters of the genus Crassostrea and mussels of the genus Mytella , commercially important in Brazil, were also investigated in this thesis. The sperm ultrastructure of the specimens described herein and molecular studies, confirm the presence of Crassostrea brasiliana (Ostreidae) in Cananéia. Spermatozoa of

4 mussel specimens of the genus Mytella , from two populations living in distinct habitats (muddy-sand sediment and rocky shores), were examined by transmission electron microscopy. The spermatozoa of all specimens shared the same ultrastructural pattern suggesting that the analyzed specimens, which live in distinct habitats, indeed belong to a same species, which was identified as M. charruana (Mytilidae) based on conchological analysis. The presence of an axial rod in sperm cells upholds the inclusion of M. charruana in the subfamily Mytilinae.

In conclusion the electron microscopy was an efficient method to solve some particular taxonomic issues. The present spermatozoan ultrastructural studies have provided new and welcome data about the families Isognomonidae, Veneridae,

Tellinidae, Donacidae, Ostreidae and Mytilidae. The results showed in this thesis could be valuable in future phylogenetic analyses.

5

3. INTRODUÇÃO

3.1. Aspectos gerais da taxonomia dos Mollusca

Costões rochosos, praias, fundos submersos consolidados e não consolidados correspondem aos ecossistemas marinhos nos quais uma infinidade de espécies é encontrada. Dos 35 filos de invertebrados descritos, 15 (42,9%) são exclusivamente marinhos e muitos outros apresentam alguns ou significativa parte de seus representantes integrando esse ambiente. Essa heterogênea fauna composta desde formas microscópicas até animais com enormes dimensões tem sido relativamente pouco investigada pela comunidade científica (AMARAL et al .,

2005). O número de espécies de invertebrados registrado para a costa brasileira oscila entre 1 e 2% do total das espécies mundialmente conhecidas, sendo freqüente na literatura a menção à escassez de conhecimentos sobre a fauna marinha do Atlântico Sul ocidental (AMARAL et al ., 2005).

O filo Mollusca está subdividido em sete classes: Gastropoda (lesmas, caramujos e caracóis), Bivalvia (mexilhões, ostras e mariscos), Cephalopoda (lulas e polvos), Monoplacophora, Polyplacophora (quítons), Scaphopoda (dentes-de- elefante) e a vermiforme Aplacophora. A maioria dos moluscos vive no ambiente marinho, exibindo os mais diversos modos de vida (AMARAL et al ., 2005). Os bivalves têm sido importantes membros das comunidades marinhas desde o início do Paleozóico, em termos de sua abundância numérica e diversidade (HARPER et al. , 2000).

6

Os membros da classe Bivalvia são portadores de um corpo lateralmente comprimido apresentando uma concha externa composta por duas valvas conectadas dorsalmente. As valvas são unidas por um ligamento elástico parcialmente calcificado e mantidas juntas por um ou dois músculos adutores. Não há aparelho bucal ou radular e os lobos do manto são unidos ou livres ventralmente. A ampla cavidade do manto estende-se em cada lado da massa visceral e apresenta um par de ctenídios (brânquias) suspensos. As brânquias podem ser desenvolvidas, lameladas ou plicadas. A boca e o ânus são localizados em regiões opostas do corpo e o intestino é tipicamente convoluto. Um par de palpos labiais ciliados conecta as brânquias à boca, sendo responsável pela condução de partículas alimentares para esta (GIRIBET e WHEELER, 2002).

Há alguns obstáculos para o estabelecimento de um quadro filogenético para a classe Bivalvia. Os problemas são gerados pelas dificuldades em definir homologias de certas estruturas significativas para a taxonomia de bivalves que não são presentes nas outras classes de moluscos (GIRIBET e WHEELER, 2002).

A análise morfológica de Bivalvia tem mostrado que muitos caracteres descritos para esse grupo são de difícil interpretação filogenética. Considerando as influências ambientais, caracteres morfológicos externos, especialmente conquiliológicos, não devem ser utilizados como único recurso para a separação de bivalves, pois tais caracteres apresentam elevada variação como resultado de significativa plasticidade da concha (SEED, 1968). Em espécies com desenvolvimento planctônico, a incerteza dos locais de recrutamento favorece uma ampla expressão fenotípica. As subclasses Pteriomorphia e Heterodonta compreendem a imensa maioria dos grupos cosmopolitas de bivalves, com 7 algumas espécies importantes em termos econômicos e ecológicos correspondendo ao objeto de estudo do presente trabalho.

3.2. Ultra-estrutura de espermatozóides de bivalves marinhos

Aplicações de Microscopias Eletrônicas de Transmissão (TEM) e Varredura

(SEM, incluindo f reeze-fracture ) têm contribuído para a sistemática de moluscos bivalves e classificações de táxons mais abrangentes. Em muitos casos, os resultados dessas ferramentas metodológicas têm notavelmente complementado os estudos comparativos da anatomia interna e dos caracteres conquiliológicos, contribuindo para uma ampla compreensão das relações filogenéticas entre os representantes da classe Bivalvia (BERNARD e HODGSON, 1985; GUERRA et al., 1994; SOUSA e OLIVEIRA, 1994; HEALY, 1995a; GARRIDO e GALLARDO,

1996; KOMARU e KONISHI, 1996; HEALY et al., 2001; ERKAN e SOUSA, 2002;

GWO et al., 2002; INTROÍNI et al., 2004; INTROÍNI et al., 2009). Esses estudos têm se mostrado especialmente importantes por revelarem também os detalhes internos mais sutis dos espermatozóides, ampliando a crescente compreensão da estrutura, biologia e desenvolvimento dos espermatozóides dos moluscos bivalves

(HODGSON et al. , 1990; HEALY, 1996; KAFANOV e DROZDOV, 1998; HEALY et al. , 2000; HEALY et al. , 2008).

Os espermatozóides de moluscos estão inseridos na categoria dos mais distintos morfologicamente dentre os Metazoa. Atualmente acredita-se que a morfologia dos gametas masculinos seja relacionada ao modo de fertilização

(KAFANOV e DROZDOV, 1998), à estrutura da membrana do ovo e ao desenvolvimento direto ou indireto (FRANZÉN, 1983; KOMARU e KONISHI, 8

1996). De acordo com HEALY (1996) e HEALY et al. (2000) em uma releitura de

FRANZÉN (1977) e JAMIESON (1987), animais aquáticos que liberam seus gametas na água que os envolve apresentam espermatozóides considerados primitivos, também denominados aquasperm . Em oposição, animais com fertilização “interna” produzem espermatozóides ditos modificados (KOMARU e

KONISHI, 1996). São reconhecidas duas categorias de aquasperm : (1) ect- aquasperm : para espermatozóides que, pelo menos potencialmente, fertilizam os

óvulos na água circundante; (2) ent-aquasperm : para espermatozóides liberados na água circundante, mas que subseqüentemente são capturados por uma corrente para o interior da cavidade do manto (no caso dos moluscos) ou do tubo

(no caso de poliquetas) onde, então fertilizam os ovos (ROUSE e JAMIESON,

1987).

A maioria das espécies da subclasse Pteriomorphia parece liberar seus gametas na água circundante permitindo a ocorrência de fertilização externa

(FRANZÉN, 1977; GUERRA et al. , 1994, HEALY et al. , 2000; INTROÍNI et al. ,

2004), mas algumas famílias, como Ostreidae, possuem certas espécies que exibem cuidado parental, ocorrendo a fecundação do óvulo no interior da cavidade do manto (ÓFOIGHIL e TAYLOR, 2000).

A priori , a morfologia da vesícula acrossomal e a forma do núcleo são enfatizadas nos estudos de espermatozóides, considerando que essas estruturas celulares apresentam relevância taxonômica e filogenética.

A morfologia dos espermatozóides de inúmeros táxons importantes das subclasses Pteriomorphia e Heterodonta permanece pouco ou nada estudada. A

9 análise de espécies dessas subclasses pode contribuir para a taxonomia e futuros estudos filogenéticos.

Outra característica interessante é o fenômeno de estocagem de glicogênio que apresenta um importante significado fisiológico no metabolismo do espermatozóide de vertebrados e invertebrados (ANDERSON & PERSONNE,

1970; 1976). A detecção ultra-estrutural de reservas de glicogênio em espermatozóides de bivalves é importante para entendermos as relações entre características celulares e eventuais vantagens adaptativas, como aumento da longevidade celular e/ou capacidade de sobrevivência do espermatozóide em condições adversas (ANDERSON e PERSONNE, 1970; 1976).

Há inúmeras descrições de espermatozóides de bivalves que revelam caracteres morfológicos diferentes daqueles apresentados pelo tipo primitivo

(ECKELBARGER et al. , 1990; KOMARU e KONISHI, 1996). A espécie Corbicula fluminae produz espermatozóides biflagelados. A morfologia do espermatozóide de Corbicula leana é altamente modificada. As modificações incluem: a presença de dois flagelos, a elongação da cabeça, a não distinção da peça intermediária, e a existência de uma estrutura membranosa envolvendo o flagelo ( wing-like structure ) (KOMARU e KONISHI, 1996).

A presença de núcleo alongado e a perda da peça intermediária são características dos espermatozóides de Codakia orbicularis , Scrobicularia plana ,

Tellina rostrata e Corbicula sandai (KOMARU e KONISHI, 1996). Nestas espécies, os oócitos são maiores que aqueles produzidos pelas espécies com espermatozóides primitivos. Por exemplo, em Corbicula leana e Corbicula sandai , os diâmetros dos oócitos são 167 µm e 130 µm respectivamente, ao passo que em 10

Mactra chinensis , Mytilus edulis e Crassostrea gigas , o diâmetro do gameta feminino encontra-se entre 50 e 70 µm. Uma provável razão para a presença de uma cabeça alongada nestes bivalves é o fato de que essa morfologia é mais eficiente do que a exibida pelo tipo primitivo para penetração na ampla camada gelatinosa que envolve o óvulo (KOMARU e KONISHI, 1996).

Espermatozóides de Cardita muricata (Carditidae), Eucrassatella cumingii ,

E. kingicola e Talabrica aurora (Crassatelidae) diferem do tipo clássico de espermatozóide que fertiliza os óvulos na água ( aquasperm ) devido ao fato de apresentarem uma longa vesícula acrossomal e um núcleo alongado.

Adicionalmente, a região da peça intermediária destas espécies apresenta um arranjo de 8 (raramente 7 ou 9) mitocôndrias agrupadas em volta de um bastão elétron-denso ( dense rod ), o qual é contínuo com o centríolo distal. O centríolo proximal é ausente no espermatozóide de crassatelídeos e carditídeos. Esta situação contrasta com a presença de um centríolo proximal não modificado em todos os outros bivalves cuja ultra-estrutura dos espermatozóides foi investigada

(HEALY, 1995a). Os gametas masculinos dos bivalves comensais Divariscintilla yoyo , Divariscintilla troglodytes e Scintilla sp . (Galeommatoidea) apresentam assimetria rotacional e depósitos de glicogênio perimitocondriais. Estes caracteres podem refletir especializações de fertilização e cuidado das larvas, os quais são freqüentes entre os Galeommatoidea (ECKELBARGER et al ., 1990). Muitos trabalhos defendem a idéia de que a morfologia alterada de espermatozóides de bivalves é vinculada a modos especializados de reprodução, como hermafroditismo com possível auto-fecundação e proteção dos estágios larvais

11

(ECKELBARGER et al. , 1990; REUNOV e HODGSON, 1994; KOMARU e

KONISHI, 1996; KAFANOV e DROZDOV, 1998).

3.2.1. Núcleo do espermatozóide, tamanho do ovo e tipo de desenvolvimento

Segundo FRANZÉN (1983) os espermatozóides produzidos por moluscos da classe Bivalvia são do tipo primitivo em praticamente todas as espécies estudadas. Considerando sua organização estrutural em termos gerais os espermatozóides produzidos por bivalves modificaram-se apenas sutilmente durante a evolução e são bastante semelhantes aos espermatozóides de outros grupos de invertebrados, como Cnidária, Polychaeta e Echinodermata. Acredita-se que não há dois espermatozóides idênticos produzidos por espécies distintas pertencentes à classe Bivalvia.

Considerando os bivalves, três tipos de desenvolvimento (em termos morfológicos e ecológicos) são reconhecidos (FRANZÉN, 1983). O tipo mais comum é o desenvolvimento larval planctotrófico, sendo natural categorizá-lo como o mais primitivo filogeneticamente. Nesse tipo, uma grande quantidade de pequenos ovos é liberada na água circundante onde a fertilização ocorre. Os espermatozóides também são liberados no ambiente externo. O diâmetro dos ovos oscila geralmente entre 40 e 85µm (SASTRY, 1979).

Em outros bivalves, o desenvolvimento lecitotrófico é conhecido. Nessas espécies as larvas apresentam uma curta vida pelágica durante a qual o alimento planctônico é importante. Geralmente, nutrientes suficientes parecem ser obtidos a partir das reservas do ovo. Desenvolvimento lecitotrófico é relatado para algumas 12 espécies do gênero Nucula como N. sulcata , cujo diâmetro do ovo apresenta cerca de 160µm (LEBOUR, 1938).

O terceiro tipo de desenvolvimento, o qual acontece diretamente, ou seja, sem estágio larval, geralmente envolve o cuidado parental de etapas juvenis. O desenvolvimento direto é observado na maioria das espécies de bivalves de água doce, mas também em muitas espécies marinhas de diferentes famílias. Em determinadas espécies marinhas com desenvolvimento direto, a abundância de reservas nutritivas no ovo faz com que este exiba um diâmetro notável por volta de

190-300µm.

Na espécie Turtonia minuta o núcleo longo do espermatozóide é espiralmente torcido (em hélice). Essa espécie é interessante também por seu atípico padrão de desenvolvimento, o qual é direto. Os ovos apresentam significativos diâmetros e são ricos em reservas nutritivas. OCKELMANN (1964) afirma que modificações da morfologia dos espermatozóides de bivalves ocorrem quando o modo de fertilização ou o tipo de cobertura do ovo difere das condições típicas encontradas na classe Bivalvia.

A ocorrência de ovos com amplas camadas gelatinosas que ultrapassem

90µm de diâmetro pode ser interpretada como um passo evolutivo em direção a modificação da biologia reprodutiva. Tanto no espermatozóide primitivo quanto no modificado , a peça intermediária desempenha um papel importante relacionado à biologia da reprodução.

Devido ao fato de que a estrutura da peça intermediária permanece inalterada na maioria das espécies de bivalves, os espermatozóides, mesmo portadores de cabeças alongadas, são classificados como primitivos . Entretanto, é 13 interessante analisar se a forma alongada do núcleo pode ser relacionada a qualquer alteração na biologia da reprodução do mesmo modo como em poliquetos.

Em muitos metazoários há um proeminente aparato de fibras que mantém o centríolo distal ancorado á membrana plasmática. Talvez a presença de mitocôndrias alongadas envolvendo como um capuz a base nuclear do espermatozóide de algumas espécies auxilie no processo de ancoragem da peça intermediária a qual se encontra firmemente associada ao flagelo.

3.2.2. Algumas considerações sobre a terminologia empregada no estudo de espermatozóides

ROUSE & JAMIESON (1987) propuseram novos termos (discutidos anteriormente de modo superficial) para a classificação de espermatozóides baseando-se em aspectos funcionais:

Ect-aquasperm – é usado para suplementar o termo primitivo empregado por RETZIUS (1904). O espermatozóide primitivo produzido por muitos metazoários recebeu o nome de aquático ou aquasperm .

Ent-aquasperm – Muitos metazoários aquáticos, particularmente aqueles com reduzidas dimensões, não apresentam ampla liberação de gametas no ambiente externo e fertilização na água circundante. Freqüentemente com existências sésseis, copulação e fertilização interna não são factíveis. Alguns poliquetos submetidos a essas limitações adotaram outras estratégias reprodutivas. Para descrever esses espermatozóides que são liberados na água 14 circundante, mas que subseqüentemente são capturados por uma corrente inalante para o interior da cavidade do manto ou do tubo foi introduzido o termo ent-aquasperm.

Em bivalves, as diferenças morfológicas entre espermatozóides que fertilizam óvulos na água circundante ( ect-aquasperm ) e aqueles que o fazem no interior da cavidade do manto ( ent-aquasperm ) podem ser mínimas ou inexistentes.

Introsperm – Refere-se aos espermatozóides que nunca têm nenhum contato com a água, mesmo sendo produzidos eventualmente por animais aquáticos. É o tipo universal de espermatozóide produzido por metazoários terrestres.

3.3. As famílias, as espécies estudadas e a problemática envolvida

3.3.1. Família Veneridae

Os bivalves da família Veneridae, em sua maioria, vivem em águas rasas, sendo infaunais, filtradores, habitando preferencialmente águas marinhas ou estuarinas, onde, devido à forma inflada de suas conchas, se enterram superficialmente (MIKKELSEN et al., 2006). Esta é a mais diversa família de bivalves recentes, compreendendo mais de 800 espécies, em aproximadamente

170 gêneros. Na costa brasileira são registradas 17 espécies (AMARAL et al. ,

2005). DALL (1902) referiu-se aos venerídeos como o “ápice da evolução dos pelecypoda”, em termos de sua morfologia e distribuições batimétrica e geográfica.

15

Os nomes populares, marisco e berbigão, são utilizados na identificação de grande parte das espécies de venerídeos, cujas numerosas populações são comumente exploradas comercialmente - para alimentação (AMARAL et al. ,

2005).

A compilação dos estudos sobre a ultra-estrutura dos espermatozóides de espécies da família Veneridae não corresponde a uma excessiva quantidade de informações. Entretanto, estes estudos são suficientes para delinear uma análise comparativa com relevância taxonômica. A morfologia dos espermatozóides de

Venerupis aurea, V. corrugata, Tapes rhomboides e T. decussatus foi investigada por POCHON-MASSON e GHARAGOZLOU (1970) e GHARAGOZLOU e

POCHON-MASSON (1971). NICOTRA e ZAPPATA (1991) analisaram as características do espermatozóide de Callista chione .

REUNOV e HODGSON (1994) descreveram as características do espermatozóide de Tivela polita (exemplares coletados na África do Sul).

GUERRA et al. (1994) investigaram a morfologia dos espermatozóides das espécies Protothaca thaca e Venus antiqua . Utilizando microscopias eletrônicas de transmissão e varredura, os espermatozóides de Gafrarium tumidum e Circe scripta (Circinae), Pitar sulfureum (Pitarinae) e Gomphina aequilatera (Tapetinae) foram descritos pela primeira vez por GWO et al. (2002). Um estudo comparativo da ultra-estrutura dos espermatozóides de Pitar rudis e Chamelea gallina

(Veneridae) coletados na Turquia foi desenvolvido por ERKAN e SOUSA (2002).

Um estudo ultra-estrutural do gameta masculino de Eurhomalea rufa foi realizado por GUERRA et al. (2003).

16

TYURIN e DROZDOV (2005) estudaram a morfologia do gameta masculino de Mercenaria stimpsoni proveniente da costa do Japão. A ultra-estrutura da espermatogênese e dos espermatozóides do bivalve Mercenaria mercenaria foi estudada por YING et al. (2008).

Considerando os dados acima expostos, é possível afirmar que os espermatozóides, até hoje estudados, das espécies da família Veneridae são do tipo primitivo .

Uma característica interessante da cabeça alongada dos espermatozóides dos membros desta família é a presença de curvatura. Essa forma nuclear é, possivelmente, um atributo característico dos espermatozóides dos venerídeos.

Entretanto, a curvatura do núcleo não é restrita aos exemplares desta família, sendo essa característica também observada em espécies da família

Galeommatidae (ECKELBARGER et al., 1990).

Anomalocardia brasiliana e Tivela mactroides

Anomalocardia brasiliana é popularmente conhecida como berbigão ou vôngole . Uma das características que facilita a identificação da espécie é a presença da carena. Os indivíduos desta espécie costumam se enterrar superficialmente no sedimento. Freqüentemente, há o estabelecimento de populações numerosas em áreas protegidas e portadoras de sedimentos lamosos.

Sua ocorrência é também registrada em praias arenosas. Anomalocardia brasiliana é uma das espécies mais abundantes e estudadas da costa brasileira

(AMARAL et al. , 2005). Inclusive há trabalhos que mencionam que nos tecidos deste bivalve há um glicosaminoglicano com atividade anticoagulante e 17 extensivamente degradado por uma heparinase específica. Acredita-se que a heparina de A. brasiliana não pode ser distinguida daquela encontrada em tecidos de mamíferos (DIETRICH et al ., 1985; PEJLER et al ., 1987). A espécie é explorada como alimento e pode produzir a pérola negra. Ocorre em praias lamosas dentro de baías ou estuários, principalmente na região entremarés.

Encontra-se no Oceano Atlântico (Mar do Caribe, Suriname, Brasil e Uruguai)

(AMARAL et al. , 2005).

Tivela mactroides é popularmente conhecida como berbigão ou marisco-de- areia. A charneira desta espécie é incomum, pois apresenta uma ninfa trífida cujo um dos ramos se assemelha a um dente cardinal. Os indivíduos desta espécie costumam se enterrar superficialmente no sedimento (AMARAL et al. , 2005). Em locais nos quais há elevada densidade populacional, observou-se distribuição diferenciada por tamanho em relação à batimetria, sendo que os jovens ocorrem no infralitoral raso e os adultos na região entremarés de praias arenosas. Tivela mactroides é explorada comercialmente como alimento e do mesmo modo como em A. brasiliana , houve a detecção em seus tecidos de glicosaminoglicanos basicamente com as mesmas estruturas das heparinas de mamíferos (PEJLER et al ., 1987). Esta espécie ocorre em praias arenosas semi-expostas, desde a região entremarés até cerca de cinco metros de profundidade, em sedimentos marcadamente heterogêneos que variam de areia grossa a lama. Populações de

Tivela mactroides são encontradas no Oceano Atlântico - Ilhas Ascensão, Mar do

Caribe, Venezuela, Suriname e Brasil (AMARAL et al. , 2005).

As mencionadas espécies de venerídeos apresentam diferenças conquiliológicas e quanto a anatomia interna marcantes, contudo, o estudo ultra- 18 estrutural dos espermatozóides é importante para o gênero Anomalocardia (nunca antes realizado), além de permitir uma investigação quanto a existência ou ausência de peculiaridades do espermatozóide relacionadas aos distintos ambientes nos quais as espécies prevalecem.

3.3.2. Família Donacidae

A família Donacidae é composta por quatro gêneros com aproximadamente

50 espécies. No Brasil, são conhecidos unicamente os gêneros Donax e Iphigenia .

Esses bivalves são suspensívoros, característicos de praias expostas e semi- expostas à ação das ondas, com sedimento fino, no qual estes animais vivem enterrados a poucos centímetros de profundidade. Os donacídeos são freqüentemente encontrados em águas tropicais e temperadas mornas, não havendo registros de sua ocorrência nas regiões ártica e antártica (AMARAL et al. ,

2005).

Há alguns trabalhos que descrevem a ultra-estrutura do espermatozóide de espécies do gênero Donax . Foram estudadas espécies provenientes da África do

Sul, D. madagascariensis , D. serra e D. sordidus (HODGSON et al. , 1990), Donax trunculus , espécie coletada na costa do Algarve, Portugal (SOUSA e OLIVEIRA,

1994), D. striatus , oriunda do litoral norte do Brasil (MATOS et al. , 1995), D. lubrica , coletada em Digha, na Índia (PAL, 1996) e D. deltoides da Austrália

(HEALY et al. , 2008). Há semelhanças peculiares compartilhadas pelos espermatozóides (que são do tipo primitivo ) de algumas espécies de Donax descritas até o momento, com relação à compactação da cromatina que apresenta lacunas e/ou invaginações e à estrutura da vesícula acrossomal. A ultra-estrutura

19 do espermatozóide dos gêneros Egeria e Capsella nunca foi estudada, sendo muito importante descrevê-la para entender se as peculiaridades citadas acima se restringem ao gênero Donax ou podem ser características da família Donacidae.

Iphigenia brasiliana é a única espécie do gênero registrada para o Brasil, sendo a ultra-estrutura de seu espermatozóide estudada por MATOS et al. (1996).

Donax gemmula e D. hanleyanus

Donax gemmula é uma das menores espécies do gênero. A concha atinge no máximo nove milímetros de comprimento. A vida larval planctônica é estimada em um mês, com pico de recrutamento no verão (Janeiro/Fevereiro).

Diferentemente de outras espécies de Donax , D. gemmula não migra através do transporte pelas ondas durante a subida e descida das marés (PASSOS, 2004). A espécie é encontrada na região entremarés e na faixa superior do infralitoral, em areia fina e muito fina. Donax gemmula é encontrada no Oceano Atlântico - no

Brasil e no Uruguai (AMARAL et al. , 2005).

O jovem de Donax hanleyanus pode ser confundido com indivíduos de

Donax gemmula . Os principais caracteres diagnósticos da espécie são: a carena radial posterior proeminente, a ninfa côncava e os dentículos ventrais à ninfa. A espécie é suspensívora e bem adaptada a praias expostas a ondas. A forma em cunha da concha e o pé bem desenvolvido proporcionam elevada mobilidade e agilidade ao se enterrar. Donax hanleyanus é utilizada como alimento pelas populações costeiras. É uma espécie filtradora que habita a zona intermareal rasa e é adaptada a praias de pequena declividade com sedimento constituído por

20 areia fina e quartzosa (GIL e THOMÉ, 2004). Há populações desta espécie no

Oceano Atlântico - Brasil a Argentina (AMARAL et al. , 2005).

O estudo da ultra-estrutura dos espermatozóides de Donax hanleyanus e D. gemmula contribui com caracteres úteis para a taxonomia do gênero e para diferenciar as espécies consideradas semelhantes em termos conquiliológicos, sobretudo quando jovens.

3.3.3. Famíla Tellinidae

A família Tellinidae inclui as duas recentes subfamílias Tellininae e

Macominae, as quais se distinguem pela presença ou ausência de dentes laterais

(KEEN, 1969; ABBOTT, 1974; BOSS, 1982; COAN et al ., 2000). A família apresenta distribuição por todo o globo, sendo conspícua a presença dos membros de Tellininae tanto em águas tropicais como subtropicais, já os representantes de Macominae são mais freqüentemente encontrados em águas temperadas, boreais e árticas (BOSS, 1969). Macominae inclui nove gêneros recentes (COAN et al. , 2000), sendo que três deles apresentam ao longo da costa brasileira componentes dos seguintes gêneros: Macoma , Temnoconcha e

Cymatoica . Estes bivalves são ativos cavadores infaunais em sedimentos arenosos e lamosos. A maioria das espécies alimenta-se de depósitos e apresenta longos sifões para capturar partículas depositadas na superfície do substrato

(AMARAL et al. , 2005).

Tem sido relatada a presença de aproximadamente 16 espécies de

Macoma na área oeste do oceano Atlântico. Destas, nove ocorrem no Brasil: M.

21 tenta , M. cleryana , M. pseudomera , M. constricta , M. brevifrons , M. uruguayensis ,

M. tageliformis , M. pulleyi e M. mitchelli (ARRUDA e DOMANESCHI, 2005).

A única espécie da família Tellinidae cuja ultra-estrutura do espermatozóide foi descrita é Tellina rostrata apresentando mitocôndrias alongadas que se estendem ao redor das margens nucleares formando um capuz (HEALY, 1995b).

Estudos em microscopia de luz indicam que espermatozóides portadores de núcleos helicoidais são produzidos por diversas espécies da família Cardiidae e pelo menos uma única espécie da família Tellinidae, segundo KARPEVICH (1961) apud HEALY (1995b). OCKELMANN (1964) descreveu o espermatozóide de

Turtonia minuta (família Turtoniidae) exibindo também um núcleo com arranjo helicoidal.

Macoma constricta, M. biota e Tellina (Eurytellina ) lineata

Macoma constricta apresenta uma concha muito semelhante à de Tellina

(Eurytellina ) lineata , mas se diferencia pela ausência de dentes laterais. Seu perióstraco exibe a coloração entre verde oliva e cinza, sendo relativamente fino e decíduo. Sua concha é inflada. Esta espécie alimenta-se de material depositado e para capturar os grãos de areia utiliza o sifão inalante estendido em posição horizontal sobre o substrato. Ao retrair o sifão, o animal deixa marcas sulcadas no sedimento, sendo possível observar um orifício (saída do sifão inalante) com algumas marcas de sulco ao redor. O indivíduo enterra-se até 30 cm de profundidade e permanece em posição horizontal apoiado sobre a valva esquerda

(ARRUDA et al . 2003). Macoma constricta é encontrada no Oceano Atlântico -

Estados Unidos, Golfo do México, Mar do Caribe, Suriname e Brasil (AMARAL et al. , 2005). 22

Recentemente, durante as atividades de campo do Programa BIOTA, financiado pela FAPESP, houve o relato da ocorrência de mais uma espécie do gênero Macoma em território brasileiro. Uma breve descrição de suas características anatômicas permitiu uma comparação parcial com a anatomia de

M. constricta , a espécie mais semelhante à recém descrita M. biota (ARRUDA e

DOMANESCHI, 2005). A localidade tipo de M. biota corresponde a uma área protegida próxima a região urbana, na zona entremarés da Praia da Cidade, no município de Caraguatatuba, no Estado de São Paulo. A praia na qual os exemplares foram coletados se caracteriza por apresentar sedimento arenoso fino e muito fino, retendo significativas quantidades de silte-argila, material orgânico e carbonato de cálcio. Os indivíduos de M. biota encontram-se enterrados em um local próximo a um banco de areia no qual existe uma grande concentração do bivalve Mytella charruana (Mytilidae). É possível a detecção de sua ocorrência devido à observação no substrato de um orifício (saída do sifão inalante) com algumas marcas de sulco ao redor. A espécie M. biota apresenta uma concha exteriormente lisa, branca para opaca, com sutis linhas de crescimento e estrias radiais microscópicas na porção anterior de ambas as valvas. O perióstraco é fino, marrom claro, decíduo e melhor preservado nas recém formadas margens da concha. As cicatrizes dos músculos na concha são conspícuas. Uma cicatriz de músculo adutor acessório é presente no final da linha palial em sua porção posterior. É difícil a distinção entre M. biota e M. constricta , baseando-se unicamente em caracteres conquiliológicos. Um exame minucioso do seio palial é necessário para a apropriada identificação das espécies. Mesmo compartilhando características em comum, como um seio palial profundo, amplo e simétrico em 23 ambas as valvas da concha, é possível a detecção de algumas diferenças. Para distinguir as espécies mencionadas recorre-se a uma combinação de caracteres

(da concha e da anatomia interna). A presença em Macoma biota de um único e curto músculo adutor acessório que conecta ambas as valvas ventralmente e a ausência deste músculo em Macoma constricta faz parte de uma série de características morfológicas na cavidade do manto que sem dúvida diferenciam as espécies em foco (ARRUDA e DOMANESCHI, 2005).

Para corroborar o estudo desenvolvido por ARRUDA e DOMANESCHI

(2005), o objetivo do trabalho é a análise da morfologia do espermatozóide de

Macoma constricta e M. biota , buscando outros caracteres com valor taxonômico que poderão, somados as características anatômicas, contribuir para a distinção das espécies mencionadas.

Há escassez de informações sobre a morfologia do espermatozóide de bivalves da família Tellinidae, impedindo uma discussão baseada em análise comparativa. Há o estudo do espermatozóide de uma espécie denominada

Scrobicularia plana (SOUSA et al., 2000), pertencente à família Semelidae

(superfamília Tellinoidea). Desse modo, o estudo da morfologia ultra-estrutural de gametas masculinos de espécies da família Tellinidae poderá fornecer padrões e diferenças dentro do grupo que poderão ser úteis taxonomicamente.

Tellina (Eurytellina) lineata apresenta grandes variações na cor, na forma da concha, que varia de oval-alongada a subtriangular, e na forma do seio palial.

Algo característico nesta espécie é a presença de uma concha muito inflada com forte curvatura posterior para a direita. Para alimentar-se de depósito, estende o sifão inalante acima da superfície do sedimento, dobra-o de modo que a abertura 24 permaneça próxima à superfície e captura os grãos de areia através do sifão, o qual é capaz de realizar movimentos de até 360º em torno do próprio eixo

(ARRUDA et al. 2003). Após enterrar-se, o bivalve permanece em posição horizontal, apoiado sobre a valva esquerda. Indivíduos desta espécie são freqüentemente encontrados na região entremarés de praias areno-lamosas e em ambiente estuarino. Há registros de Tellina lineata no Oceano Pacífico (América

Central) e no Oceano Atlântico - Golfo do México, Mar do Caribe, Venezuela e

Brasil (AMARAL et al. , 2005).

3.3.4. Família Mytilidae

A família Mytilidae compreende os bivalves popularmente conhecidos como mexilhões. É a única família da ordem Mytiloida. Os mexilhões são cosmopolitas, entretanto, mais abundantes em águas frias. Características particulares dos bivalves dessa família são a concha assimétrica portadora de um perióstraco relativamente espesso e a presença de cordões protéicos que formam o aparato bissal, utilizado para ancoragem, sobretudo em substratos sólidos (RUPPERT e

BARNES, 1991). Há muitas espécies, por exemplo, dos gêneros Mytilus, Perna,

Mytella e Brachidontes, comercializadas para alimentação sendo muitas vezes coletadas por atividades extrativistas ou de cultivo.

Segundo KAFANOV e DROZDOV (1998), os gêneros da superfamília

Mytiloidea ( Adula , Arcuatula , Aulacomya , Brachidontes , Bathymodiolus ,

Choromytilus , Crenomytilus , Modiolus , Musculista , Musculus , Mytilus , Perna ,

Perumytilus , Semimytilus , Septifer e Trichomya ) podem ser classificados em inúmeros grupos de acordo com as dimensões da vesícula acrossomal, o modelo

25 de compactação cromatínica, o número de elementos mitocondriais e a presença ou ausência de um bastão axial que se estende desde a área subacrossomal até o acrossomo (REUNOV e HODGSON; 1994; GARRIDO e GALLARDO, 1996;

HEALY et al. , 2000). Os dados disponíveis sobre a ultra-estrutura do espermatozóide juntamente com caracteres conquiliológicos são adequados para sugerir modificações na classificação das espécies da superfamília Mytiloidea.

Como resultado dessa análise uma única família permanece convencionalmente dentre os Mytiloidea recentes: a família Mytilidae, sendo subdividida em duas subfamílias de acordo com a presença ou ausência de um bastão acrossomal. As espécies destituídas de bastão acrossomal foram agrupadas na subfamília

Modiolinae, já aquelas portadoras desta estrutura foram consideradas membros da subfamília Mytilinae. Há fortes evidências de que todos os tipos de espermatozóides das espécies de Mytilidae tenham derivado do tipo produzido pelo gênero Modiolus (KAFANOV e DROZDOV, 1998) . Os autores ressaltam a importância da disponibilidade de dados de ultra-estrutura de espermatozóides de gêneros de bivalves para que essas características possam contribuir para estudos taxonômicos e sistemáticos futuramente. Na família Mytilidae, foram estudadas algumas espécies do gênero Brachidontes (Modiolinae): B. semistriatus

(REUNOV e HODGSON; 1994), B. darwinianus , B. solisianus (INTROÍNI et al. ,

2004) e B. virgilae (BERNARD et al. , 1988). Essas espécies são portadoras de um espermatozóide típico de animais com fertilização externa. Entretanto, as três primeiras espécies mencionadas apresentam um acrossomo cônico com uma conspícua projeção anterior. Já o espermatozóide de B. virgilae apresenta um acrossomo curto destituído de um prolongamento anterior. Essa diferença na 26 morfologia do espermatozóide de Brachidontes virgilae intensificou a incerteza quanto à alocação dessa espécie no gênero Brachidontes .

Mytella charruana e M. guyanensis

As espécies Mytella charruana e M. guyanensis (VILLARROEL e

STUARDO, 1995), únicas representantes do gênero encontradas na costa brasileira, são muito semelhantes em termos conquiliológicos, sofrendo sistematicamente equívocos de identificação.

As conchas das espécies pertencentes ao gênero Mytella são alongadas, mitiliformes a modioliformes portadoras de umbos subterminais. A charneira pode ser edentada ou apresentar 3 a 4 dentes. Há duas cicatrizes de músculos retratores anteriores (lisos ou concentricamente estriados). A parte posterior do manto exibe tentáculos ramificados (RIOS, 1994).

Ao longo dos anos, exemplares de Mytella charruana (Orbigny, 1842) receberam uma série de nomes como Mytella falcata (Orbigny, 1846), Modiola falcata (Von Ihering, 1897), Mytilus strigatus (Von Ihering, 1900) e Modiolus falcatus (Morretes, 1949). Alguns sinônimos de Mytella charruana são M. falcata

(Orbigny, 1842), M. arciformis (Dall, 1909) e M. mundahuensis (Duarte, 1926).

Mytella charruana encontra-se distribuída desde a costa oeste do México até as

Guianas, Equador, ilhas Galápagos, Venezuela, Suriname, Brasil, Uruguai e

Argentina. É utilizada como alimento na região nordeste do Brasil e seu nome popular é Sururu (RIOS, 1994). Indivíduos dessa espécie apresentam dimensões entre 22 e 50 mm, muito variáveis, com margem anterior curta a arredondada.

Freqüentemente com um proeminente ângulo dorsal. A coloração oscila entre 27 amarelo/marrom (antero-ventralmente) a verde (dorsalmente). O interior da concha é de uma tonalidade roxa escura. Milhares de indivíduos são encontrados nas regiões entremarés, vivendo em bancos de sedimento areno-lamoso e em

águas rasas estuarinas, com elevadas densidades populacionais. Populações atribuídas ao gênero Mytella foram encontradas também em ambiente distinto, ocupando costões rochosos formando agrupamentos, geralmente, com poucos indivíduos no litoral norte do estado de São Paulo (Fosca P. Pereira Leite – informação pessoal). Mytella guyanensis distribui-se desde o oeste do México até o Peru, e da Venezuela ao Brasil (Santa Catarina). Suas conchas apresentam de

33 a 70 mm, com lado ventral de modo geral profundamente impresso (RIOS,

1994). M. guyanensis ocorre na zona entremarés de mangues e em regiões estuarinas. Freqüentemente, ocorrem equívocos de identificação, pois exemplares que ocorrem em costões rochosos são atribuídos arbitrariamente à espécie

Mytella guyanensis , quando, na realidade, podem corresponder a espécimes de

M. charruana que eventualmente recrutam em costões rochosos.

3.3.5. Família Isognomonidae

Os bivalves dessa família exibem conchas morfologicamente variáveis, inequivalves, inequilaterais, delgadas e comprimidas. A valva esquerda é geralmente mais convexa que a valva direita, sendo a superfície interna da concha nacarada (RIOS, 1994). A plasticidade das conchas é significativa, fenômeno que pode dificultar a identificação das espécies dessa família. O emprego de outras metodologias (como a análise ultra-estrutural do espermatozóide) para o estudo

28 desses bivalves poderá contribuir para o entendimento da taxonomia do grupo.

Embora os moluscos da família Isognomonidae apresentem uma distribuição cosmopolita, trabalhos sobre aspectos reprodutivos, sobretudo, sobre a morfologia do espermatozóide são escassos.

Baseando-se em dados preliminares obtidos pela análise ultra-estrutural de espermatozóides de Pinctada margaritifera , Pinctada sp ., Isognomon isognomon e

Vulsella vulsella (HEALY et al ., 2000; THIELLEY et al ., 1993), os espermatozóides da superfamília Pterioidea compreendem: vesícula acrossomal cônica, a qual é profundamente invaginada em sua porção basal exibindo materiais com diferentes elétron densidades; núcleo relativamente pequeno, geralmente, mostrando ampla depressão anterior e uma fossa basal; usualmente, 5 elementos mitocondriais esféricos; dois centríolos ortogonalmente arranjados e o sistema padrão de arranjo microtubular 9+2.

Isognomon bicolor e I. alatus

O gênero Isognomon reúne espécies bissadas que se fixam a substratos firmes, incluindo vegetação de manguezais (DOMANESCHI e MARTINS, 2002). A espécie Isognomon bicolor é encontrada no litoral brasileiro com distribuição do

Rio Grande do Norte até Santa Catarina. O extremo norte da distribuição da espécie é Bermudas, com ocorrência pelo litoral da Flórida, Golfo do México e

Caribe (DOMANESCHI e MARTINS, 2002). A espécie I. alatus é encontrada desde os Estados Unidos até países da América Central. Acredita-se que I. bicolor tenha sido sistematicamente, e de longa data, confundido com I. alatus . A grande similaridade nas características externas da concha de I. alatus e I. bicolor , a 29 variabilidade intra-específica na forma de ambas espécies, mais o fato de terem hábitos e habitats semelhantes, podem conduzir a equívocos de identificação

(DOMANESCHI e MARTINS, 2002).

Os espécimes de I. bicolor ocorrem desde o supralitoral, onde vivem no interior de poças de maré, até sete metros de profundidade no infralitoral.

Entretanto, na zona entremarés, uma maior concentração de indivíduos é observada. Em costões amplos, de grande declividade, banhados por ondas de baixo impacto e correndo paralelas à superfície da rocha, são encontradas as maiores densidades de indivíduos, formando uma faixa distinta e disputando espaços na faixa de Brachidontes e ostras (DOMANESCHI e MARTINS, 2002).

A literatura aponta para I. bicolor alturas entre 28 mm e 38 mm enquanto que para I. alatus as alturas são muito superiores, atingindo valores entre 76 mm e

90 mm. A concavidade das valvas dos exemplares de I. bicolor é acentuada, já as valvas de I. alatus são rasas, com concavidade não significativa. Isognomon bicolor apresenta revestimento nacarado restrito a área côncava, enquanto a área marginal é constituída exclusivamente por camada prismática. Nos indivíduos pertencentes à espécie I. alatus , a superfície nacarada ultrapassa a área côncava podendo se estender sobre a área marginal até próxima à margem livre das valvas, restringindo a camada exclusivamente prismática a uma faixa periférica bastante estreita (DOMANESCHI e MARTINS, 2002).

É essencial o estudo da morfologia do espermatozóide de espécies da família Isognomonidae, em virtude da escassez de conhecimentos nessa área.

Adicionalmente, a ultra-estrutura das células gaméticas masculinas de I. bicolor e

30

I. alatus contribui com peculiaridades que auxiliam na diferenciação entre as mencionadas espécies.

3.3.6. Família Ostreidae

As ostras são utilizadas como alimento pelas comunidades humanas desde os tempos primitivos. Em diversas localidades o cultivo de ostras gera uma significativa movimentação de capital. Na Flórida (EUA), por exemplo, há ostras de pequenas dimensões, muito apreciadas, em virtude de seu sabor, sendo encontradas em aglomerados com diversos indivíduos. O comércio de ostras nessa área é muito importante (VILLAS e VILLAS, 1952).

Os moluscos dessa família apresentam conchas irregulares e inequivalves.

A valva esquerda e geralmente maior permanece fixa sobre o substrato durante toda a vida do indivíduo adulto. Outras características relevantes são: a presença de umbo inconspícuo e a superfície interna não nacarada da concha lisa (VILLAS e VILLAS, 1952).

Em oposição a sua relevante importância econômica, as ostras correspondem ao grupo, de moluscos bivalves, mais difícil de ser entendido em termos taxonômicos, particularmente quando se trata do nível específico (HEALY e LESTER, 1991). A plasticidade da morfologia das conchas e o número cromossômico constante têm promovido a busca por outras ferramentas metodológicas como análise genética por eletroforese, investigações minuciosas da estrutura da concha e anatomia comparada.

31

O estudo comparativo da ultra-estrutura de espermatozóides de ostras poderia ser útil taxonomicamente, pois determinadas diferenças da célula gamética masculina poderiam ser encontradas entre os táxons investigados.

HEALY e LESTER (1991) analisaram a ultra-estrutura do espermatozóide de Saccostrea commercialis . O espermatozóide de C. angulata foi descrito por

SOUSA e OLIVEIRA (1994) . GWO et al. (1996) analisaram a morfologia do espermatozóide de Crassostrea gigas . ECKELBARGER e DAVIS (1996) investigaram as gônadas masculinas e femininas assim como o processo de diferenciação celular até a formação dos gametas da espécie Crassostrea virginica . MATOS et al. , (1999) analisaram a estrutura do espermatozóide de

Crassostrea rhizophorae . Os espermatozóides estudados até o presente momento das espécies de ostras apresentam um acrossomo superficialmente semelhante, sendo uma peculiaridade dessas células a presença de uma conspícua fossa nuclear anterior.

Espécies do gênero Crassostrea

As ostras são muito importantes comercialmente no Brasil, entretanto há uma significativa disputa quanto ao número de espécies desses bivalves que ocorrem na costa de nosso país. A morfologia de suas conchas pode ser fortemente influenciada pelas condições ambientais, tornando mais difíceis as identificações baseadas em características conquiliológicas, como cor, forma, estrutura e cicatrizes de músculos. Essa acentuada variação fenotípica tem dificultado a classificação das ostras e apenas na década de 50 a ordenação das espécies em grupos, com características em comum, tornou-se possível 32

(GUNTER, 1951). Essa classificação alicerçada em uma combinação de diversos dados, como as informações sobre aspectos reprodutivos, presença ou ausência de uma câmara promial e a morfologia da charneira da dissoconcha, agrupa as principais espécies de interesse econômico, distribuídas ao longo da costa oeste do oceano Atlântico, nos gêneros Ostrea e Crassostrea . Analisando o gênero

Crassostrea , existe ainda muito debate quanto ao número atual de espécies nativas que ocorrem na costa leste da América do Sul (MORRETES, 1949;

SANTOS, 1978; ABSHER, 1989). Alguns autores (WAKAMATSU, 1973; ABSHER,

1989; NASCIMENTO, 1991) têm utilizado o nome C. brasiliana quando se referem

à forma infralitoral que vive ancorada a costões rochosos e que geralmente é distinta dos indivíduos encontrados nas áreas entre-marés principalmente pelo fato de ser maior. Entretanto, a utilização do tamanho, para fins taxonômicos, é considerada inadequada por alguns autores (MCLEAN, 1941; ABBOTT, 1974;

RIOS, 1994) desde que esta característica pode ser influenciada por fatores ambientais.

RIOS (1994) descreveu C. brasiliana como sinônimo de C. rhizophorae , sendo esta última uma espécie muito comum no Caribe e que pode também ser encontrada no Brasil. Os ecossistemas de mangue são amplamente distribuídos pelo globo, cobrindo entre 100.000 e 200.000 Km 2 das zonas estuarinas das áreas tropicais (LAPÈGUE et al. , 2002). As árvores de mangue caracterizam esses ecossistemas e constituem um habitat natural para determinadas ostras. As raízes aéreas das árvores correspondem a um lugar propício para que ocorra a fixação das larvas nas áreas entre-marés. Devido ao fato de certas ostras viverem nas raízes das árvores de mangue, conhecidas como rhizophores , o último termo foi 33 utilizado para denominar uma das espécies encontradas na América do Sul, C. rhizophorae (LAPÈGUE et al. , 2002).

Diferenças significativas nas taxas de crescimento e morfologias das larvas têm sido descritas entre as espécies C. brasiliana e C. rhizophorae (ABSHER,

1989), indicando que elas podem ser consideradas de fato espécies biologicamente distintas.

Dada a importância econômica das espécies do gênero Crassostrea existentes no Brasil, é importante verificar determinadas características para saber se as espécies são capazes de produzir híbridos. Devido à imprecisão gerada pela utilização de caracteres anatômicos, análises moleculares têm sido eficazes para o estabelecimento do status de espécie. Essas formas de análise têm sido ferramentas importantes para, por exemplo, considerar como espécie as formas de C. gigas do Japão (BUROKER et al., 1979), para rejeitar a possibilidade de que

C. virginica e C. rhizophorae (HEDGECOCK e OKAZAKI, 1984), assim como C. gigas e C. angulata sejam consideradas sinonímias (BOUDRY et al., 1998), para discriminar espécies de Crassostrea do Pacífico intimamente relacionadas

(BANKS et al., 1993) e para demonstrar que a espécie C. angulata encontrada em

Portugal tem origem asiática (O’FOIGHIL et al., 1998). IGNACIO et al. (2000) estudaram, por meio de eletroforese de aloenzimas, populações simpátricas e alopátricas de C. brasiliana e C. rhizophorae , estimando seus níveis de variação genética e estrutura populacional, para saber se essas ostras são isoladas reprodutivamente, tendo certeza de que podem ser consideradas espécies biologicamente distintas. De acordo com este estudo, foi encontrada uma elevada homogeneidade populacional para C. rhizophorae ao longo de 1300 Km da costa 34 brasileira, resultado não surpreendente considerando que as espécies de

Crassostrea apresentam larvas planctotróficas que exibem significativa longevidade e ampla capacidade de dispersão. A revalidação de C. brasiliana como uma espécie biologicamente distinta traz importantes conseqüências não unicamente para a sistemática do gênero, mas também para estudos da biologia e ecologia das ostras na América do Sul. Segundo IGNACIO et al. (2000), embora as diferenças morfológicas entre as duas espécies sejam sutis, suas preferências ecológicas contribuem para a indicação de suas identidades: os indivíduos menores geralmente encontrados no mangue ou em áreas entremarés de costões rochosos correspondem a exemplares de C. rhizophorae . Contrariamente, as ostras maiores das regiões subtidais pertencem, invariavelmente, a espécie C. brasiliana . NASCIMENTO (1991) afirmou que a cicatriz do músculo adutor em C. brasiliana é de modo geral levemente azul ou marrom, ao passo que a mesma cicatriz em C. rhizophorae é freqüentemente não pigmentada.

Em oposição aos resultados descritos por IGNACIO et al . (2000),

LAPÈGUE et al . (2002), ao realizarem análises moleculares, relataram a ocorrência de três espécies do gênero Crassostrea distribuídas ao longo da costa da América do Sul e da África. A existência de C. gasar adicionou uma terceira espécie à lista de representantes do gênero Crassostrea em território sul americano. Segundo esses autores, populações de C. gasar foram encontradas em três localidades: uma na Guiana Francesa e as outras em duas regiões do

Brasil, distantes 70 Km entre si. Tornou-se necessário, portanto, verificar se C. brasiliana e C. gasar correspondem a mesma espécie. A divergência, relativamente recente, das populações americanas e africanas de C. gasar 35 suporta a hipótese de que o homem foi o agente de dispersão. Navios provenientes da costa oeste da África com destino a América do Sul podem ter transferido estas ostras de um continente a outro. Adicionalmente, a dispersão natural também pode ter contribuído para a atual distribuição geográfica de C. gasar , pois o estágio larval de espécies de Crassostrea pode durar até 3 semanas.

O padrão predominante de circulação das águas oceânicas também favorece a hipótese de que C. gasar seja oriunda da África e tenha ocupado áreas na

América. A distância genética entre C. gasar e C. rhizophorae é suficientemente acentuada para tornar improvável a produção de híbridos. Recentemente, constatou-se que a seqüência de RNA ribossômico mitocondrial 16S de C. brasiliana depositada no GenBank (DQ839413) por PIE et al. (2006) é idêntica aquela de C. gasar (AJ312937) estudada por LAPÈGUE et al. (2002), sugerindo que ambas pertencem a mesma espécie.

O Brasil apresenta o mais amplo ecossistema contínuo de mangues, correspondendo a 1,38 milhões de hectares ao longo dos 6800 km da costa brasileira. As ostras brasileiras são distribuídas ao longo de toda a costa, sendo as espécies nativas referidas, geralmente, como C. rhizophorae. No norte e nordeste do Brasil, particularmente, essas ostras são cultivadas ou coletadas a partir de populações naturais e a correta identificação dessas espécies e suas respectivas distribuições geográficas são necessárias para o efetivo manejo dessas atividades

(NASCIMENTO, 1991).

VARELA et al. (2007) relataram a ocorrência de três espécies do gênero

Crassostrea na costa brasileira (duas nativas e uma exótica). A topologia das

árvores obtidas por esses autores, a partir de dados moleculares, mostra que C. 36 rhizophorae, C. virginica (AF092285) e C. gasar são intimamente relacionadas.

IGNACIO et al. (2000), como mencionado anteriormente, utilizando dados baseados no estudo de aloenzimas, identificaram duas diferentes espécies de

Crassostrea - C. brasiliana (sinônimo de C. gasar ) e C. rhizophorae - na costa sul do Brasil. Entretanto o trabalho de VARELA et al. (2007) não menciona a ocorrência de C. gasar entre os estados do Ceará e a região sul do Brasil, o que pode ser resultado da escassez de exemplares coletados provenientes das áreas entre Vitória (20º 18’ S, 40º 18’ W) e Florianópolis (27º 33’ S, 48º 33’ W).

LAPÈGUE et al. (2002), utilizando dados moleculares, identificaram C. rhizophorae na Ilha Martinica (Caribe) e em duas localidades do Brasil: Salvador

(12º 52’ S, 38º 37’ W) e Baía de Paranaguá (25º 30’ S, 48º 30’ W). Os mesmos autores encontraram C. gasar na Guiana Francesa e em duas localidades brasileiras: Baía de Paranaguá e Baía de Cananéia (25º 07’ S, 47º 52’ W).

SANDISON (1966) indicou que adultos de C. gasar sobrevivem melhor em salinidades mais baixas do que em mais elevadas. No Brasil, ambas as espécies,

C. gasar e C. rhizophorae , crescem e se desenvolvem mais rapidamente em salinidades mais baixas, contudo C. gasar tende a tolerar uma ampla variação na salinidade quando comparada a C. rhizophorae . A significativa interferência de

água doce proveniente dos volumosos rios na região norte do Brasil desencadeia mudanças nas águas costeiras, decrescendo os níveis de salinidade e elevando a quantidade de partículas em suspensão, fato que contribui para o aumento da turbidez das águas. Diferenças quanto à tolerância das ostras aos níveis de salinidade poderiam explicar a presença de C. gasar no Norte e a predominância de C. rhizophorae no leste (VARELA et al., 2007). 37

Considerando os dados acima expostos, especificamente aqueles que se contradizem quanto à ocorrência ou ausência de C. gasar (sinonímia de C. brasiliana ) nas regiões Sudeste e Sul do Brasil (LAPÈGUE et al., 2002; VARELA et al. , 2007), emergem questionamentos sobre o real número de espécies de

Crassostrea que ocorre particularmente nessas regiões, sendo necessário recorrer a outras metodologias (como a ultra-estrutura de espermatozóides) buscando dissolver esta dúvida.

Muitos táxons marinhos não exibem nenhum cuidado parental e se reproduzem através da liberação de uma significativa quantidade de gametas na coluna de água (LEVITAN e PETERSEN, 1995). Em contraste, uma menor quantidade de invertebrados marinhos bentônicos apresenta cuidado parental realizado pelas fêmeas que retêm em seus organismos os estágios jovens de sua progênie até que estes atinjam etapas intermediárias ou mesmo avançadas de desenvolvimento (STRATHMANN e STRATHMANN, 1982; OLIVE, 1985). Dentre as ostras, existem aquelas espécies que liberam seus gametas na água que as circunda, aquelas que liberam as formas jovens em seus estágios larvais planctotróficos e aquelas que liberam sua progênie em um estágio avançado capaz de sofrer o processo de metamorfose imediatamente.

Estudos filogenéticos dos clados reprodutivamente heterogêneos podem conduzir a compreensão da evolução do cuidado parental. A liberação dos gametas na coluna de água é considerada uma característica ancestral na maioria dos clados de invertebrados marinhos, sendo esta interpretação suportada pela análise filogenética de alguns taxa (Ó’FOIGHIL e TAYLOR, 2000). As aproximadamente 30 espécies de Ostreidae são hermafroditas, liberando seus 38 gametas no ambiente que as envolve (Crassostreinae) ou exibindo cuidado parental (Lophinae, Ostreinae). O estudo realizado por Ó’FOIGHIL e TAYLOR

(2000) indica de forma consistente que a combinação dos caracteres: ovulação trans-ctenidial, liberação dos gametas na água que circunda os indivíduos adultos e desenvolvimento de larvas planctotróficas corresponde a condição plesiomórfica na família Ostreidae.

Segundo dados disponibilizados no site do Fundo Brasileiro para a

Biodiversidade, a exploração da ostra nativa do mangue é realizada com finalidade comercial há décadas no município de Cananéia, estado de São Paulo, sendo um dos mais importantes recursos naturais explorados pelas comunidades tradicionais da região ( http://www.funbio.org.br ).

As espécies cultivadas e coletadas pela Cooperostra para comercialização pertencem invariavelmente ao gênero Crassostrea , entretanto, há incertezas quanto ao real número de espécies que são cultivadas. A priori , acredita-se que há populações de espécies diferentes que vivem em simpatria em Cananéia. Diante dessas incertezas, o emprego de investigações dos espermatozóides, produzidos por exemplares coletados na região, busca levantar dados que respondam a esses questionamentos.

Recorrendo a microscopia eletrônica, o presente trabalho teve como objetivo descrever a ultra-estrutura do espermatozóide produzido por indivíduos do gênero Crassostrea coletados na região sul do estado de São Paulo, particularmente no município de Cananéia.

39

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Observação: Informações sobre a COOPEROSTRA (Cooperativa dos Produtores de Ostras de Cananéia) foram obtidas a partir de comunicação oral com o pesquisador Dean Medeiros e do site do FUNDO BRASILEIRO PARA A

BIODIVERSIDADE. Disponível no Acessado em 10 de março de 2008.

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4. OBJETIVOS GERAIS

Os objetivos da presente tese envolveram:

- A análise da ultra-estrutura dos espermatozóides de espécies de bivalves, das famílias Isognomonidae, Mytilidae, Ostreidae (subclasse Pteriomorphia)

Donacidae, Tellinidae e Veneridae (subclasse Heterodonta), com o intuito de encontrar diferenças morfológicas úteis taxonomicamente que contribuam para distinguir as espécies em estudo.

- A comparação dos dados obtidos com as informações descritas na literatura, com a meta de determinar se o gênero das espécies consideradas está inserido de forma adequada ou equivocada na classificação atualmente aceita.

- Adicionalmente, o estudo das relações entre os caracteres morfológicos dos espermatozóides e as características ambientais dos locais nos quais estes gametas são liberados.

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5. ARTIGOS

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Comparison of the Spermatozoan Morphology of Isognomon bicolor and Isognomon alatus (Mollusca, Bivalvia, Isognomonidae)

G. O. Introíni a, C. A. Magalhães b, H. Fortunato c,* and S. M. Recco-Pimentel a, **

aDepartamento de Biologia Celular, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), CP 6109, 13083-863, Campinas, SP, Brazil. bSecretaria de Mudanças Climáticas e Qualidade Ambiental, Ministério do Meio

Ambiente, Esplanada dos Ministérios - Bloco B, Brasília, DF, Brazil. cSmithsonian Tropical Research Institute, Box 0843-03092, Balboa, Republic of

Panama.

*Present address: Institut für Geowissenschaften, Universität Kiel, Ludwig-Meyn-

Straße 10, D-24118, Kiel, Germany.

**Send correspondence to: [email protected]; Fax: +55-19-3521-6111.

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Spermatozoan ultrastructure and detection of nuclear acid phosphatase activity in spermatids of Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides

(Mollusca, Bivalvia, Veneridae)

Gisele Orlandi Introíni 1, Alexandre Lobo da Cunha 2, Mário Manuel da Silva Leite

Sousa 2,3 and Shirlei M. Recco-Pimentel 1

1. Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia, Instituto de Biologia,

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6109, 13083-863,

Campinas, SP, Brazil.

2. Universidade do Porto, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar,

Laboratório de Biologia Celular, Largo Professor Abel Salazar, 2, 4099-003 Porto,

Portugal.

3. Centro de Genética da Reprodução Professor Alberto Barros, Avenida do Bessa

591, 1º Direito Frente, 4100-009 Porto, Portugal.

Running title: Spermatozoan ultrastructure of marine bivalves.

Key words: bivalve, glycogen, marine, spermatozoon, ultrastructure.

Send correspondence to: Shirlei M. Recco-Pimentel; [email protected]; Fax:

+55-19-3521-6111.

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ABSTRACT

In this work, we compared the ultrastructure of spermatozoa from the bivalves Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides (Veneridae). The spermatozoa of both species were of the ect-aquasperm type in which the head contains a curved nucleus with a short cone-shaped acrosome. An invagination penetrated almost the entire length of the acrosome. The midpiece contained a pair of orthogonally arranged centrioles surrounded by spherical mitochondria and the flagellum had the typical 9+2 structure. The spermatozoa of A. brasiliana had a slightly curved nucleus while those of T. mactroides had a long, prominently curved nucleus. The mitochondria were equally distributed around the centrioles in the midpiece of A. brasiliana spermatozoa, but asymmetrically in the midpiece of T. mactroides spermatozoa. There were six mitochondria and glycogen clusters in the middle piece of the T. mactroides spermatozoon. The presence of glycogen clusters and the higher number of mitochondria, in comparison with Anomalocardia brasiliana , could extend the longevity of the Tivela mactroides spermatozoa.

Increasing the sperm life expectance also increases the odds of finding the eggs and accomplishing fertilization. Possibly, the glycogen clusters and the higher mitochondria number correspond to an adaptive advantage in turbulent waters.

INTRODUCTION

Comparative studies of the Bivalvia have confirmed the usefulness of spermatozoan morphology for taxonomic and phylogenetic analyses (Bernard and

Hodgson, 1985; Guerra et al. , 1994; Sousa and Oliveira, 1994; Healy, 1995a, b;

Garrido and Gallardo, 1996; Komaru and Konishi, 1996; Healy et al. , 2001; Erkan 65 and Sousa, 2002; Gwo et al. , 2002; Introíni et al. , 2004; Healy et al ., 2006). In addition, these studies showed that closely related species can be distinguished based on the ultrastructure of their spermatozoa (Hodgson et al. , 1990; Gwo et al. ,

2002; Introíni et al. , 2004).

Various features of spermatozoan ultrastructure have been associated to reproductive biology aspects. Franzén (1955, 1956, 1977, and 1983) proposed that invertebrates have two types of sperm, namely, primitive sperm, produced by species with external fertilization, and modified sperm, produced by species with internal fertilization. Primitive sperm consists of a short, round or conical head, a midpiece containing 4-5 spherical mitochondria and a flagellum with a 9+2 microtubular structure. Spermatozoa that are released directly into the surrounding water are named aquasperm or aquatic sperm . Rouse and Jamieson (1987) introduced a new terminology and described two aquasperm categories: (1) ect- aquasperm referring to sperm that fertilizes eggs in the ambient water; (2) ent- aquasperm referring to sperm that fertilizes eggs into the mantle cavity of molluscs or into the tube of sedentary polychaetes.

Sperm morphology has also been correlated with egg size and larval development (Franzén, 1983; Komaru and Konishi, 1996). These relationships between spermatozoan morphology and distinct reproductive patterns have strengthened the relevance of studies that investigate the association of evolution, ecology and the morphological diversity of spermatozoa.

The Veneroida is considered one of the most important orders of bivalves because it comprises several marine families of economic, ecological importance and widespread geographic distribution, as the Veneridae (Gwo et al ., 2002). Data 66 describing spermatozoan ultrastructure of Veneridae species have supported the identification of traits shared by the majority of the members belonging to this family (Pochon-Masson and Gharagozlou, 1970; Gharagozlou and Pochon-

Masson, 1971; Nicotra and Zappata, 1991; Reunov and Hodgson, 1994; Guerra et al. , 1994; Matos et al. , 1997; Gwo et al. , 2002; Erkan and Sousa, 2002; Park et al. ,

2002; Guerra et al. , 2003; Ying et al ., 2008).

Numerous reports have emphasized that venerid bivalves are important components of the marine benthos, including non-consolidated bottom communities (Narchi, 1972; Etchevers, 1976; Schaeffer-Novelli, 1980; Prieto,

1980; Soares et al ., 1982; Prieto, 1983; Mclachlan et al. , 1996; Arruda and Amaral,

2003; Arruda et al ., 2003). Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791) is distributed throughout the Caribbean islands and also in Suriname, Brazil and Uruguay

(Amaral et al ., 2005). This species lives buried a few centimeters below the surface of compact sand in the intertidal zone of calm waters. Adults of A. brasiliana rapidly bury themselves when placed on wet mud or muddy sand. Tivela mactroides

(Born, 1778) occurs around the Ascension Island, along the Caribbean seaboard, and in Venezuela, Suriname and Brazil (Amaral et al ., 2005). In contrast to A. brasiliana , the species T. mactroides lives in turbulent waters in the intertidal zone.

Although, the spermatozoa ultrastructure of bivalves has been largely investigated and used to solve many taxonomic and phylogenetic issues, immune and cytochemical studies of sperm and precursory cells are indeed scant.

Biochemical features of reproductive cell lineages could contribute to taxonomical descriptions and to distinguish some of the bivalve species.

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In this work, scanning and transmission electron microscopy were used to study the spermatozoan morphology of the venerid bivalves A. brasiliana and T. mactroides , which were compared with other bivalve species, aiming at better understand their taxonomic and phylogenetic characteristics.

MATERIAL AND METHODS

Specimens of Anomalocardia brasiliana were sampled in the intertidal zone of São Sebastião county (S 23° 48’ 57.2” - W 45° 24 ’ 29.8”) and T. mactroides specimens were sampled in Caraguatatuba county (S 23° 38’ 51.7” W 45° 25’

31.4”), both at the southeastern coastal region of São Paulo State, Brazil.

The voucher specimens were deposited in the Museu de Zoologia

“Professor Adão José Cardoso” (ZUEC) at the State University of Campinas

(UNICAMP), São Paulo, Brazil, under the accession numbers 1419 ( Tivela mactroides ) and 1420 ( Anomalocardia brasiliana ).

Scanning Electron Microscopy

Sperm suspensions on coverslips were fixed in 2.5% glutaraldehyde and

2.0% paraformaldehyde in 0.2 M sodium cacodylate, pH 7.2, for 1 h at room temperature. Subsequently, they were rinsed several times in the same buffer and post-fixed in 2% osmium tetroxide in the dark for 1 h. Samples were dehydrated in a graded series of ethanol solutions and critical-point dried in CO 2. The dried coverslips were mounted on stubs, coated with gold and examined with a JSM

5800 LV microscope.

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Transmission Electron Microscopy

Small fragments of testis were fixed with 2.5% glutaraldehyde and 2.0% paraformaldehyde in 0.2 M sodium cacodylate, pH 7.2, for 5 h at 4°C and then rinsed in the same buffer. Samples were post-fixed in 2% osmium tetroxide in the same buffer, for 1 h at 4°C, and then dehydrated in a graded acetone series followed by gradual infiltration with EPON resin before embedding. Ultrathin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate, and examined with a

Zeiss Leo 906 transmission electron microscope.

Phosphotungstic acid staining

Small samples of testis were fixed as described above, but without post- fixation, and subsequently dehydrated in a graded ethanol series. Samples were stained with a 2% phosphotungstic acid-ethanol (E-PTA) solution at low pH, in order to detect glycoproteins and enable cytochemical analysis of spermatozoa.

After 2 h in the E-PTA solution, samples were rinsed with ethanol, transferred to acetone, and infiltrated with EPON resin before embedding. Ultrathin sections were examined with a Zeiss Leo 906 transmission electron microscope.

Nuclear ACPase Detection during spermiogenesis

Small fragments of testis were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.2 M sodium cacodylate, pH 7.4, for 2 h at 4°C, and rins ed in the same buffer. They were then washed with 50mM Na-acetate-HCl buffer, pH 5, at 4 ºC. Subsequently, the testis fragments were incubated in 50mM Na-acetate-HCl buffer, pH 5, with 5% sucrose, 13.9 mM sodium β-glycerophosphate ( β-GP) and 3.6 mM lead nitrate, for

30 min at 37ºC, under dark conditions with constant and gentle mixing. Samples were washed twice in 50mM Na-acetate-HCl buffer, pH 5, with 5% sucrose, for 5 69 min at 4ºC, and twice in 0.1 M Na-cacodylate buffer, pH 7.2, with 5% sucrose, for 5 min at 4ºC. The specimens were post-fixed in 2% osmium tetroxide in the same buffer, for 2 h at 4°C, and then dehydrated in a gr aded ethanol series and propylene oxide. A gradual infiltration with EPON resin was done before embedding. Ultrathin sections were examined with a JEOL 100 CX II-TEM, without staining.

The experimental controls consisted of: (1) Omission of β-glycerophosphate;

(2) Addition of inhibitor 10mM NaF; (3) Other substrates: 6.4 mM Thiamine pyrophosphate chloride; 2.5 mM Na-inosine- 5-diphosphate; 0.6 mM Na- trimetaphosphate.

RESULTS

Spermatozoa

The spermatozoa of both species were either of the ect-aquasperm type

(Figs. 3, 4 and 12). The short acrosomal complex was cone-shaped and located anterior to the nucleus. Two components of the acrosomal vesicle were distinguished based on their diverse electron densities (Figs. 20 and 22). The conical acrosome was deeply invaginated, the subacrosomal region was filled with a diffuse material and there was no axial rod (Figs. 1, 2, 10, 11 and 13).

PTA staining at low pH revealed no glycoproteins in the acrosomal vesicles of A. brasiliana and T. mactroides spermatozoa (Figs. 5, 6 and 14). The nucleus was relatively long, curved, cylinder and the midpiece consisted of spherical mitochondria grouped around a pair of short cylindrical centrioles (Figs. 7, 8, 15, 16 and 17). Extensive electron-dense granules or granule clusters, considered to be 70 glycogen deposits, were observed around the centrioles and mitochondria of T. mactroides spermatozoa (Figs. 15 and 16). In the region immediately posterior to the midpiece, the triplet substructure of the centrioles was replaced by a standard

9+2 microtubular pattern axoneme that terminated in a long flagellum (Figs. 9 and

18). Overall, the spermatozoa of A. brasiliana and T. mactroides shared high morphological similarities, even though the nucleus was slightly curved in the A. brasiliana spermatozoa compared to the markedly curved and long nucleus of T. mactroides (Table 1, Figs. 19 and 24). The mitochondria were equally distributed around the centrioles in the midpiece of A. brasiliana spermatozoa (Fig. 21). In

Tivela mactroides spermatozoa, the mitochondrial assembly did not form a ring structure but showed a biased distribution of the organelles around the orthogonally arranged pair of centrioles, such that they were always more numerous in one side of the sperm cell (Fig. 23). Hence, the midpiece of T. mactroides spermatozoa was rotationally asymmetrical and contained clusters of glycogen, which were not seen in the midpiece of A. brasiliana .

Precursory cells

The nomenclature used to refer to precursory cells was based on the work written by Nicotra and Zapata (1991), which is not in accordance with the definitions proposed by Ying et al . (2008).

The early spermatids were rounded but irregular in outline and had a spherical nucleus with patches of condensed chromatin in the middle and in the cell periphery (Figs. 25 and 29). The nucleus was still rounded in the mid- spermatid stage, but the chromatin condensation was intensified (Figs. 26 and 30). 71

The late spermatid was characterized by the elongation of the nucleus. Chromatin condensation has completed and only a few nuclear vacuoles remained. While the residual cytoplasm was progressively eliminated, spherical mitochondria assembled in the base of the nucleus around the two centrioles (Figs. 27 and 31).

In Anomalocardia brasiliana gonads, a nuclear acid phosphatase (ACPase) was detected in all spermatid stages using the improved Gomori-chloride technique. In comparison, in Tivela mactroides gonads, the presence of ACPase was detected in mid and (inconspicuously) late spermatids using the same methodology. In the sperm cell of both species, nuclear ACPase was not detected (Figs. 28 and 32).

The experimental controls did not show staining.

DISCUSSION

The morphological structure of the venerid spermatozoa described herein agreed with the ect-aquasperm type proposed by Rouse and Jamieson (1987) exhibiting morphological characteristics described for free-spawning bivalves. In a previous study of bivalve sperm ultrastructure, Healy et al., (1995b) proposed five categories within the Veneroida order. The spermatozoan description presented here is in agreement with the data reported by Healy et al ., (1995b) regarding members belonging to Group A, in which the following traits are shared: a randomly organized subacrosomal material, an electron-lucent area at the acrosomal apex, a relatively long and slender rod nucleus that slightly decreases in thickness toward the gamete apex, and absence of an anterior nuclear fossa.

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Some previous studies have described detailed ultrastructural patterns of venerid spermatozoa, being the reported data sufficient for a taxonomic analysis of this bivalve group.

The species Venerupis aurea produces a spermatozoon with a very slightly curved nucleus and electron dense regions at the base of the acrosomal vesicle

(Gharagozlou and Pochon-Masson, 1971). Nicotra and Zappata (1991) investigated the sperm cells of Callista chione , which also exhibit nuclear curvature and the same pattern of acrosomal electron density. Reunov and Hodgson (1994) described the spermatozoan morphology of the venerid clam T. polita from South

Africa. The head of T. polita spermatozoa is about 3.2 µm long and has a cylindrical, slightly curved nucleus capped by a small conical acrosome. In the venerid clams Protothaca thaca and Venus antiqua , the reported length of the sperm head is about 7.5 µm and 5.3 µm, respectively, and the acrosome is a small vesicle in the anterior region of the cell (Guerra et al ., 1994). Sperm ultrastructure studies of Protothaca pectorina from the northern coast of Brazil showed that the male gamete exhibits a curved nucleus (Matos et al ., 1997). The species

Gafrarium tumidum and Circe scripta (Circinae), Pitar sulfureum (Pitarinae) and

Gomphina aequilatera (Tapetinae) share highly similar spermatozoa morphology and ultrastructure, as reported by Gwo et al . (2002). Sperm cells of these bivalve species consisted of a curved head, a short midpiece with tightly packed mitochondria and a long tail. The spermatozoa of the bivalve mollusks Pitar rudis and Chamelea gallina (Veneridae) from Turkey were characterized by a conical and slightly curved nucleus about 2.6 µm and 3.5 µm long, respectively, and

73 acrosomal vesicles about 0.6 µm long (Erkan and Sousa, 2002). The sperm cell of

Gomphina veneriformis exhibited a conspicuous curvature and the head (8.5µm) is considered very long (Park et al. , 2002). Sperm cells of the clam Mercenaria mercenaria , from China, were investigated by Ying et al . (2008), sharing common features with other venerid species, such as the presence of a curved nucleus and a short acrosomal vesicle which shows electron dense regions in its base.

The elongated head of venerid spermatozoa usually contains a curved nucleus, which characterizes these bivalves (Reunov and Hodgson, 1994).

However, the nucleus curvature is not unique to venerids since it has also been reported in galeommatoidean bivalves (Eckelbarger et al ., 1990). Nicotra and

Zappata (1991) stated that it should be interesting to analyze movement and fertilization patterns in this curved sperm, in order to evaluate the functional significance of this characteristic. However, considering the microscopic dimensions of the sperm cells, the nucleus shape should be irrelevant to the movement because these bodies have low Reynolds numbers, not being possible to derive any appreciable thrust from inertia.

The apical half of the spermatozoon acrosomal vesicle is stained with PTA in the species Venerupis decussatus , Eurhomalea rufa , Protothaca thaca and

Venus antiqua (family Veneridae), as reported by Sousa et al. (1998) . Hence, these data are divergent of the negative PTA staining pattern of the Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides spermatozoa.

Sperm morphological studies described non-curved nucleus in the venerid species Eurhomalea rufa (Sousa et al ., 1998, Guerra et al ., 2003). The nucleus of

74 sperm cells were curved in all other studied venerid species. The ultrastructural characteristics of the species Ruditapes decussatus and Tapes decussatus

(Pochon-Masson and Gharagozlou, 1970; Gharagozlou and Pochon-Masson,

1971) were different in comparison to other venerid species, especially in relation to acrosomal features. It is important to emphasize that the sperm cell of

Eurhomalea rufa shows significant morphological differences in comparison with other species of the family Veneridae. These sperm cells differences have not yet been explained, representing an invitation to a taxonomic review of these species.

Besides their similarities, A. brasiliana and T. mactroides spermatozoa showed prominent ultrastructural differences. The sperm nucleus was slightly curved in A. brasiliana and prominently curved and long in T. mactroides . In the A. brasiliana sperm cell midpiece, there were four mitochondria uniformly distributed around the centrioles. As for T. mactroides , there were six asymmetrically distributed mitochondria. Finally, the midpiece of T. mactroides contained glycogen deposits whereas that of A. brasiliana did not. These morphological patterns suggest that the T. mactroides spermatozoa could be adapted to turbulent environments.

Narchi (1972) compared structural and functional morphologies as well as adaptations of A. brasiliana and T. mactroides , which are species living close to the surface in soft substrata with suspension-feeding habits. Their most prominent anatomical features were related to burrowing behavior and suspension-feeding. A. brasiliana , which lives in calm waters of muddy beaches, does not have tentacles along the mantle edge whereas the inhalant siphon and mantle edge of T. mactroides have several ramified tentacles. The siphonal tentacles prevent the 75 penetration of large particles into the mantle cavity while the ramified tentacles along the mantle edge prevent large particles from entering the pallial cavity.

These adaptations allow T. mactroides to live on open sandy shores where large quantities of material are kept in suspension by constant wave movements. T. mactroides also has the most efficient form of particle transportation among demibranchs, which partly reflects adaptation to a specific habitat. In agreement with this characteristic, the stomach of T. mactroides is more complex than that of

A. brasiliana , which is related to the large number of particles present in this organ.

Our observations on the spermatozoan morphology of A. brasiliana and T. mactroides mostly agree with Narchi (1972), who concluded that anatomical variations in these species reflect adaptations to diverse environments. According to Anderson and Personne (1970; 1976) and Introíni et al . (2009), glycogen storage in the middle piece of bivalve sperm cells has an important meaning in the spermatozoon physiological metabolism. The presence of glycogen clusters in the mid-piece could extend the longevity of the sperm cells. Increasing the life expectance of sperm cells also increases the odds of finding the eggs in the fertilization process. It could correspond to an adaptive advantage in turbulent waters.

Spermiogenesis in Veneroida species has been described with great accuracy emphasizing architectural details of cells (Nicotra and Zapata, 1991;

Johnson et al. , 1996, Ying et al ., 2008). In the present work, the relatively low fixation status of the electron micrographs of precursory cells was carried out intentionally, in order to avoid masking detection of Nuclear ACPase activity.

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Considerable ultrastructural modifications take place during spermiogenesis.

The chromatin filaments aggregate into lamellar structures and finally into a homogeneous and compact DNA arrangement. In Anomalocardia brasiliana and

Tivela mactroides gonads, a nuclear acid phosphatase (ACPase) was detected in spermatids using the improved Gomori-chloride technique. In the present analysis, the nuclear acid phosphatase activity in both bivalve species follows a specific time and spatial-course pattern during spermatid chromatin condensation. A controlled and comparative study suggests that this pattern of nuclear acid phosphatase activity is specific and related to chromatin compaction.

In conclusion, our results suggested that detailed analyses of bivalve spermatozoan ultrastructure are useful tools for investigating interspecific taxonomic relatedness and adaptation to a given environment. Further studies on male gametes of venerid mollusks are needed to verify the hypothesis of taxonomic usefulness of sperm morphological and ultrastructural characteristics.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors thank Dr. Alexander Turra and Dr. Márcia Denadai for helping with Anomalocardia brasiliana and Tivela mactroides samplings. This work was supported by FAPESP (Grant no. 04/13887-4). M.S. was supported by POCI/SAU-

MMO/60709/60555/59994/04; UMIB.

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83

Table 1. Morphometric and numerical data of analyzed sperm structures in A.

brasiliana and T. mactroides .

Acrosomal Nuclear Head length Number of N = number

Species length ( µm) width ( µm) (µm) mitochondria of

individuals

A. brasiliana 0.4 0.9 3 4 5

T. mactroides 0.4 0.5 4.5 5-6 5

84

FIGURE CAPTIONS

Figs. 1-9. Spermatozoon of Anomalocardia brasiliana . 1. Acrosome, nucleus and midpiece; 2. Acrosomal complex and nuclear apex; 3-4. SEM showing head and flagellum; 5-6. Phosphotungstic acid staining; 7. Longitudinal section of the midpiece; 8. Transversal section of the midpiece showing four spherical mitochondria grouped as a ring around the proximal centriole; 9. Longitudinal section of the flagellum. Bars = 0.5 µm (except Figs. 3 and 4); 10 µm (Fig. 3); 1 µm

(Fig. 4).

Figs. 10-18. Spermatozoon of Tivela mactroides . 10. Acrosome, nucleus and midpiece; 11. Acrosomal complex and nuclear apex; 12. SEM showing head and flagellum; 13. Acrosomal complex and nuclear apex; 14. Lack of phosphotungstic acid staining in the acrosomal vesicle; 15. Longitudinal section of the midpiece, showing six spherical mitochondria grouped around the proximal centriole; 16.

Longitudinal section of the midpiece; 17. Spherical mitochondria grouped around the distal centriole; 18. Longitudinal section of the flagellum. Bars = 0.5 µm (except

Fig. 12); 1 µm (Fig. 12).

Fig. 19. Diagrammatic representation of A. brasiliana and T. mactroides spermatozoa.

Fig. 20-24. Illustrations of spermatozoan features of Anomalocardia brasiliana and

Tivela mactroides based on SEM and TEM. These figures were a result of a 85 professional 3D animation rendering and modeling software. 20. Apex of the head of the spermatozoon of A. brasiliana . 21. Middle piece of the spermatozoon of A. brasiliana . 22. Apex of the head of the spermatozoon of T. mactroides . 23. Middle piece of the spermatozoon of T. mactroides. 24. General visualization of the spermatozoan features of both spermatozoa.

Fig. 25-28. Precursory cells of Anonalocardia brasiliana . 25. The early spermatids had a spherical nucleus with patches of condensed chromatin in the middle and in the cell periphery. Note the staining indicating the presence of nuclear ACPase. 26.

The nucleus was still rounded in the mid-spermatid stage, but the chromatin condensation was intensified (presence of nuclear ACPase). 27. The late spermatid was characterized by the elongation of the nucleus (presence of nuclear

ACPase). 28. In the sperm cell nuclear ACPase was not detected.

Fig. 29-32. Precursory cells of Tivela mactroides: 29. The early spermatids had a spherical nucleus with patches of condensed chromatin in the middle and in the cell periphery. 30. The nucleus was still rounded in the mid-spermatid stage, but the chromatin condensation was intensified (presence of nuclear ACPase). 31. The late spermatid was characterized by the elongation of the nucleus. 32. In the sperm cell nuclear ACPase was not detected.

a. acrosome; f. flagellum; gly. Glycogen clusters, h. head; m. mitochondria; n. nucleus.

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Comparative study of sperm ultrastructure of five bivalve species of the families Tellinidae and Donacidae

Gisele Orlandi Introíni 1, Flávio Dias Passos 2 and Shirlei M. Recco-Pimentel 1

Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia, Instituto de Biologia,

Universidade Estadual de Campinas, CP 6109, 13083-863 Campinas, SP, Brazil.

Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de

Campinas, CP 6109, 13083-863 Campinas, SP, Brazil.

Keywords: Tellinidae, Donacidae, spermatozoa, ultrastructure, bivalve.

93

ABSTRACT

The ultrastructure of bivalve spermatozoa can be species-specific and often provide valuable taxonomic traits for systematic reviews and phylogenetic reconstructions. Despite the ecological and economic importance of the superfamily Tellinoidea, sperm ultrastructural studies of their bivalves are still scant. These studies could be useful, for instance, in studies of the Tellinidae species Tellina lineata , Macoma constricta and Macoma biota that share many conchological traits, which can lead to equivocal identification. Macoma biota cannot be easily distinguished from M. constricta based only on shell characters and outline. Examination of the pallial sinus shape is helpful for identification of these two species. Additionally, young individuals of the Donacidae species Donax hanleyanus are often identified as samples of Donax gemmula . Hence, the spermatozoa ultrastructure of five species of the Tellinidae and Donacidae families was studied in the present work, aiming to identify characters that could be useful for further taxonomic and phylogenetic analyses. The data revealed that the bivalve species studied here, except T. lineata , produce primitive -type spermatozoa, typical of marine invertebrates in which eggs are fertilized in the surrounding water. The sperm ultrastructure was distinct between Macoma constricta and M. biota , mostly regarding the shape of the nucleus and acrosome.

The Tellina lineata spermatozoon, in the modified category, showed short and conical acrosome, long and helical nuclei, elongated mitochondria encircling two orthogonal structures that did not exhibit a conventional centriole pattern, and a simple flagellum. Donax hanleyanus and D. gemmula spermatozoa are different especially in relation to acrosomal characteristics and chromatin condensation. In 94 conclusion, our results suggest that analyses of sperm ultrastructure of the bivalves in the superfamily Tellinoidea can be helpful to discriminate species and to investigate their taxonomic relatedness.

INTRODUCTION

For many invertebrates, sperm ultrastructure traits has been proved helpful in systematic reviews and phylogenetic analyses (BERNARD & HODGSON, 1985;

GUERRA et al., 1994; SOUSA & OLIVEIRA, 1994; HEALY, 1995; GARRIDO &

GALLARDO, 1996; KOMARU & KONISHI, 1996; HEALY et al., 2001; ERKAN &

SOUSA, 2002; GWO et al., 2002; INTROÍNI et al., 2004; INTROÍNI et al., 2009).

Several characteristics of spermatozoan ultrastructure have been related to different aspects of reproductive biology. FRANZÉN (1977) proposed that invertebrates have two types of sperm, namely, primitive sperm, produced by species with external fertilization, and modified sperm, usually, produced by species with internal fertilization. Primitive sperm consists of a short, round or conical head, a midpiece containing 4-5 spherical mitochondria, and a flagellum with a 9+2 microtubular structure. Sperm morphology has also been correlated with egg size and larval development (KOMARU & KONISHI, 1996).

In species of the bivalve superfamily Tellinoidea, sperm ultrastructural studies are still limited, in spite of their ecological and economic importance to many human communities. Several species of Tellinoidea are well known and their shells are often found in sandy beaches, estuarine regions and mangrove areas.

Other species are also abundant in diverse habitats where they are considered key

95 elements in the trophic chain. There are seventy one species of Tellinoidea along the Brazilian coast (RIOS, 1994).

The family Tellinidae is composed of several species with almost cosmopolitan distribution. In the Brazilian littoral zone, this family is subdivided into two subfamilies, the Tellininae represented by the genera Tellina and Strigilla , and

Macominae represented by the genera Macoma , Cymatoica and Temnoconcha

(AMARAL et al., 2005). Their shells are compressed, have the anterior end rounded and the posterior end reasonably pointed and folded. The umbones are small and quite close together. The ligament is strong and external (VILAS &

VILAS, 1952). These bivalves exhibit long siphons and bury themselves in sand or muddy sediments.

The family Donacidae is constituted by four genera with approximately fifty species. The Donax and Iphigenia genera are found along the Brazilian coast.

Shells of Donacidae are equivalve, elongated and subtrigonal. The siphons are short and separated and the foot is large and compressed (AMARAL et al., 2005).

Mollusks of the family Donacidae live on the surface layer of washed sandy beaches along the coast of many countries, where they are relatively abundant in the proper season (VILAS & VILAS, 1952).

Comparative studies using Transmission Electron Microscopy (TEM) have complemented comparative anatomy and shell morphology data, leading to improved elucidation of bivalve taxonomic relationships (HEALY, et al ., 2000).

Frequently, authors mention the absence of TEM studies in a number of families and genera of the superfamily Tellinoidea. These studies could provide novel and welcome information relevant to the understanding of taxonomic and phylogenetic 96 relationships within this superfamily (HEALY 1995; HEALY et al. 2008). Further

TEM sperm studies of Tellinoidea species could also be helpful in exploring possible connections with Arcticoidea, Galeommatoidea and freshwater

Dreissenoidea (HEALY, 1995).

KARPEVICH apud HEALY (1995) using light microscopy described helical sperm nuclei in at least one species of Tellinidae. HEALY (1995) studied the sperm morphology of Tellina rostrata . Those are the available data on Tellinidae species.

As for the Donacidae, according to HEALY et al. ( 2008) spermatozoa ultrastructural studies of this family seem desirable, if only to reach a better evaluation of the range of sperm features and probably to assess the monophyletic status of the family.

The species Tellina lineata (Tellininae), Macoma constricta and Macoma biota (Macominae) share many conchological features, which can be misleading to identification. According to ARRUDA & DOMANESCHI (2005), M. biota cannot be easily distinguished from M. constricta based only on their shell characters and outline (Figure 1). Examination of the pallial sinus shape is needed for proper identification of these two species. Additionally, young individuals of the species

Donax hanleyanus are often identified as D. gemmula (AMARAL, et al. , 2005)

(Figure 1). Hence, additional taxonomic traits, as sperm ultrastructure, could be useful for improving the systematics of these bivalves.

In the present work, bivalve marine specimens of the Tellinidae species

Tellina lineata, Macoma constricta and Macoma biota and of the Donacidae species Donax hanleyanus and D. gemmula , which live buried in soft sediments,

97 were examined with the objective of identifying sperm ultrastructural traits useful for taxonomic studies and future phylogenetic analyses.

MATERIAL AND METHODS

Specimens of Tellina lineata and Macoma biota from populations living in intertidal zones buried in muddy-sand sediment were sampled on the Cidade beach, in Caraguatatuba County (23°37’27.9” S; 45°2 3’55.0” W). Specimens of

Macoma constricta were collected on Araça beach (23° 48’ 57.2” S; 45 ° 24’ 29.8”

W), in São Sebastião County. Additionally, Donax hanleyanus and Donax gemmula were sampled in São Sebastião County, respectively on the Baleia beach and Barequeçaba beach. Caraguatatuba and São Sebastião are located in the northern coast of São Paulo State, Southeast of Brazil. The specimens were immediately immersed in seawater and brought to a laboratory at the State

University of Campinas, Campinas, SP, Brazil, where they were processed for analyses. The voucher specimens will be deposited in the Museu de Zoologia

“Prof. Dr. Adão José Cardoso” (ZUEC) at the State University of Campinas

(UNICAMP), São Paulo, Brazil.

Light Microscopy

A suspension of spermatozoa was prepared in 0.1M cacodylate buffer, pH

7.2, then dropped on glass slide, and fixed in this buffer containing paraformaldehyde-glutaraldehyde 2%, 5mM CaCl2, and 3% sucrose. Some slides were stained with 0.2 µg of 4.6 diamino-2-phenylindole (DAPI)/ml for 15 min, rinsed in water, and placed in 0.1M McIlvane buffer for 5 min and other slides were 98 stained with Giemsa 10%. The material was examined with an Olympus BX 60 microscope.

Scanning Electron Microscopy (SEM)

Sperm suspensions on coverslips were fixed in 2.5% glutaraldehyde and

2.0% paraformaldehyde in 0.2 M sodium cacodylate, pH 7.2, for 1 h at room temperature. Subsequently, they were rinsed several times in the same buffer and post-fixed in 2% osmium tetroxide in the dark for 1 h. Samples were dehydrated in a graded series of ethanol solutions and critical-point dried in CO 2. The dried coverslips were mounted on stubs, coated with gold and examined with a JSM

5800 LV microscope.

Transmission Electron Microscopy (TEM)

Small sections (0.1 to 0.3 mm 3) of male gonads were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, for 24h at 4ºC. After fixation, they were washed with 0.1M cacodylate buffer, for 3 h at 4ºC, and postfixed with 1% osmium tetroxide (OsO 4), in the same buffer, for 1h at 4ºC.

Subsequently, samples were dehydrated in a graded acetone series and embedded in EPON resin. Ultrathin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and then examined with a Zeiss Leo 906 transmission electron microscope.

99

RESULTS

Tellina lineata

The precursory reproductive cells exhibited a chromatin condensation that follows the coiled shape of the nucleus (Figures 2-3 and 35A’). The spermatozoa of the Tellina lineata species were recognized as being of the modified type (Figures

4-8 and 35A). The short acrosomal complex was cone-shaped and located in the region anterior to the nucleus (Figures 8-10). Two components of the acrosomal vesicle were distinguished based on their diverse electron densities (Figures 8 and

9). The subacrosomal region was filled with a diffuse material and there was no axial rod (Figure 9).

The nucleus was extraordinarily long and helical (Figures 4-9 and 35A). The midpiece was consisted of elongated mitochondria, grouped around a pair of cylindrical structures, which overlapped the marginal nuclear base (Figures 11-15).

The flagellum was simple with a 9+2 microtubular configuration.

Macoma biota

The Macoma biota spermatozoa were of the primitive type (Figures 16-17 and 35C). The acrosomal complex was relatively short, dome-shaped and positioned anteriorly to the nucleus (Figures 16 and 17). There were two spherical compartments, in symmetrical position, situated at the base of the acrosome

(Figures 16 and 17). These compartments exhibited two components of diverse electron densities. The subacrosomal region was filled with a diffuse material and no axial rod was observed (Figures 16 and 17).

100

The nucleus was spheroid (Figures 16 and 17). The midpiece consisted of spherical mitochondria clustered around a pair of short cylindrical centrioles

(Figures 18 and 19). The flagellum was simple (9+2) (Figure 20).

Macoma constricta

The precursory reproductive cells exhibited the typical chromatin condensation described to other bivalves (Figures 21-23 and 35B). The spermatozoa of the Macoma constricta species were of the primitive type. The head showed a bottle shape (Figures 24-26). The acrosomal complex was relatively long, cone-shaped and located anteriorly to the nucleus. There were two spherical compartments arranged in symmetrical position at the base of the acrosome (Figures 24 and 27-29). These compartments exhibited two components that could be visualized because of their different electron densities. The subacrosomal region was filled with a diffuse material and the axial rod was absent

(Figures 27-29).

The nucleus was relatively long (Figures 24-25 and 35B). The midpiece consisted of spherical mitochondria grouped around a pair of short cylindrical centrioles (Figures 30-33). The flagellum was simple with a 9+2 configuration

(Figure 34).

Donax hanleyanus

The transmission electron microscopy showed that Donax hanleyanus spermatozoa were of the primitive or ect-aquasperm type (Figures 36-37 and 50A).

The round nucleus showed an anterior fossa and was capped by a very long 101 acrosomal vesicle. The acrosome showed two regions of different electron densities and many striate structures (Figures 36-39). The dense component of the acrosomal vesicle laid at the base. There was a conspicuous subacrosomal area between the vesicular base and the apical region of the nucleus, which was filled with an amorphous material. The chromatin was not strongly electron-dense, exhibiting a rope-like aspect (Figures 36-37 and 40). The midpiece contained a pair of orthogonally arranged centrioles surrounded by four or five similar-sized, spherical mitochondria (Figures 40 and 41). The axoneme followed the distal centriole and the flagellum showed the typical 9+2 microtubule structure with nine double outer tubules plus two single central tubules (Figure 42).

Donax gemmula

The Donax gemmula sperm characteristics were of the primitive or ect- aquasperm type (Figures 43-44 and 50B). The nucleus was barrel shaped and showed a conspicuous anterior fossa in which the acrosomal vesicle was inserted

(Figures 43-46). There was a tenuous axial rod in the subacrosomal area. The chromatin was electron-dense and relatively compact. The midpiece consisted of a pair of orthogonally arranged centrioles surrounded by usually four similar-sized, spherical mitochondria (Figures 47 and 48). The axoneme followed the distal centriole and the flagellum showed the typical 9+2 microtubule structure (Figure

49).

All spermatozoon structures of the studied species were measured and the data are shown in Table 1.

102

DISCUSSION

The sperm ultrastructure of the species Macoma constricta, Macoma biota,

Donax hanleyanus and D. gemmula agreed with the primitive type proposed by

FRANZÉN (1977) and with the morphological characteristics described for free- spawning bivalves . As for Tellina lineata , the spermatozoa were recognized as being the modified type.

The biological classification of sperm types proposed by some authors

(FRANZEN, 1977; JAMIESON, 1987; HEALY, 1996; HEALY et al. 2000) is not based on all invertebrate groups, so we should consider the existence of exceptions, being a universal criterion questionable. The spermatozoan ultrastructural traits of the family Tellinidae have been poorly investigated. The spermatozoon produced by Tellina lineata is modified , however it is improbable the occurrence of internal fertilization in this species.

The middle-piece overlaps the slender nucleus in the Tellina rostrata spermatozoon (HEALY, 1995). These features were similar to the traits described here for the T. lineata species. It is important to emphasize that HEALY (1995) showed a relatively shallow description of the Tellina rostrata spermatozoon. A previous study using light microscopy had described helical sperm nuclei in several species of Cardiidae and in at least one species of Tellinidae (KARPEVICH apud

HEALY, 1995).

The Tellina lineata spermatozoa were described here as of the modified type. They contained short and conical acrosome, long and helical nuclei, elongated mitochondria encircling two orthogonal structures that do not exhibit the conventional centriole pattern and a simple flagellum. It has been proposed that 103 alterations in acrosome and sperm head morphology indicate differences in the egg envelope or correlations between long nuclei and the thickness of large yolky eggs (FRANZÉN, 1983; ECKELBARGER & DAVIS, 1996).

The Macoma constricta and M. biota spermatozoa were similar, however divergent regarding the shape of the acrosome and nucleus. Hence, these sperm ultrastructural characteristics were suitable for discriminating these two Tellinidae species. Further studies will certainly be helpful to verify whether primitive sperm cells are predominant in the subfamily Macominae whereas modified sperm cells occur in high frequencies in the Tellininae. Ultrastructural analyses of the ovule might also reveal a possible relation between the size of the sperm cell head and the diameter of the egg cell.

As for the family Donacidae, besides the herein reported D. hanleyanus and

D. gemmula , the following species of Donax have been investigated for sperm ultrastructure: Donax madagascariensis , D. serra and D. sordidus from South

Africa (HODGSON et al. , 1990), Donax trunculus from the Algarve coast, Portugal

(SOUSA & OLIVEIRA, 1994), D. striatus from the Brazilian coast (MATOS et al. ,

1995), D. lubrica collected in Digha, India (PAL, 1996) and D. deltoides from

Australia (HEALY et al. , 2008). In addition, the sperm ultrastructural features of

Iphigenia brasiliana were studied by MATOS et al. (1996).

HEALY et al. (2008) considered that two traits are consistently observed in sperm cells of all Donax species, (1) the acrosomal vesicle leans against a marked depression of the nuclear apex; and (2) the subacrosomal material is organized into a well-formed axial rod, often showing longitudinal-fibrous structure. However,

104 the present work did not confirm the presence of an axial rod in the subacrosomal area in all Donax species.

There is not a clear delimitated morphological sperm pattern shared by the representatives of this taxon. Considering the available data, the spermatozoa produced by the majority of studied species of this family show: (1) an anterior nuclear depression; (2) a rounded or barrel shaped nucleus (except for Donax trunculus ); (3) an acrosomal vesicle (conical with anterior projection or inserted in an anterior nuclear fossa) exhibiting an electron-dense base in comparison with its apical region. The degree of chromatin condensation was variable among the studied species (Table 2).

The sperm ultrastructure of Donax hanleyanus resembled that of Iphigenia brasiliana , because both have conical acrosome and similar chromatin aspect, while the sperm features of Donax gemmula were close to those of Donax striatus , because both show a marked anterior nuclear fossa where the acrosomal vesicle is inserted.

In conclusion, our results reported ultrastructural characteristics of bivalve spermatozoa that are suitable to discriminate species of the families Tellinidae and

Donacidae and, therefore, can be useful in taxonomic studies.

ACKNOWLEDGMENTS

We are grateful to Instituto Butantan for permission to use the transmission electron microscope.The authors thank Pedro Ribeiro Piffer, Gabriel Baptista Alves

Aleixo and Juliana Preto de Godoy for helping with bivalve samplings. This work was supported by Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo 105

(FAPESP grant no. 04/13887-4) and Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior (CAPES/PROEX).

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FIGURE CAPTIONS

Figure 1. Shell drawings by Rogério Lupo. A. Donax gemmula . B. Donax hanleyanus . C. Macoma biota . D. Macoma constricta . E. Tellina lineata .

Figures 2-3. Spermatids of Tellina lineata . Observe the pattern of chromatin condensation, which follows the helical nuclear shape.

Figures 4-7. Light Microscopy and Scanning Electron Microscopy of Tellina lineata spermatozoon. Using these techniques, it was possible to visualize the topography of the reproductive cell. 4. DAPI staining. 5. GIEMSA staining.

6. SEM showing the entire spermatozoon. 7. SEM showing nucleus and acrosome.

Figures 8-12. Spermatozoon of Tellina lineata . 8. Acrosome, nucleus and midpiece. 9. Acrosomal complex and nuclear apex. 10. Transversal section of the 109 acrosomal complex. 11. Longitudinal section of the midpiece overlapping the nuclear base. 12. Transverse section of the midpiece showing four lengthening mitochondria grouped around the nucleus and other section showing mitochondria around the proximal dense structure.

Figures 13-15. Spermatozoon of Tellina lineata . 13. Longitudinal section of the nucleus. 14. Transverse sections of the nucleus and middle-piece. 15. Longitudinal section of the midpiece showing the orthogonal arrangement of dense cylindrical structures.

Figures 16-20. Spermatozoon of Macoma biota . 16. Acrosome, nucleus and midpiece. 17. Acrosomal complex and nuclear apex. 17’. SEM. 18. Longitudinal section of the midpiece, showing spherical mitochondria grouped around the proximal centriole. 19. Spherical mitochondria grouped around the distal centriole.

20. Longitudinal section of the flagellum.

Figures 21-23. Spermatids of Macoma constricta . Observe the different pattern of chromatin condensation in relation to that exhibited by the same cells produced by Tellina lineata .

Figures 24-30. Spermatozoon of Macoma constricta . 24. Acrosome, nucleus and midpiece. 25-26. SEM . 27. Acrosomal complex and nuclear apex. 28-29.

Details of the acrosomal vesicle. 30. Longitudinal section of the midpiece, showing spherical mitochondria grouped around the centrioles. 110

Figures 31-34. Spermatozoon of Macoma constricta . 31. Tangential section showing mitochondria around the proximal centriole. 32. Longitudinal section of the midpiece, showing spherical mitochondria grouped around the proximal centriole.

33. Spherical mitochondria grouped around the distal centriole. 34. Longitudinal section of the flagellum.

Figure 35. Sperm and precursory cells drawings by Walter Costa Introíni. A.

Tellina lineata spermatozoon. A’. Tellina lineata precursory reproductive cell.

Observe de pattern of chromatin condensation. B. Macoma constricta spermatozoon . C. Macoma biota spermatozoon.

Figures 36-42. Spermatozoon of Donax hanleyanus. 36-37. Acrosome, nucleus and midpiece. Observe the rope-like aspect of the chromatin. 38. Transversal section of the top of the acrosomal complex. 39. Transversal section of the base of the acrosomal complex. Observe the striate structures compounding the marginal area. 40. Longitudinal section of the midpiece, showing spherical mitochondria grouped around the centrioles. 41. Transversal section of the midpiece, with spherical mitochondria grouped around the distal centriole. 42. Longitudinal section of the flagellum.

Figures 43-49. Spermatozoon of Donax gemmula. 43-44. Acrosome, nucleus and midpiece. Observe the acrosomal complex inserted in a marked anterior nuclear depression. 45. Transversal section of the nucleus of late spermatid. 46.

Transversal section of the nucleus of sperm cell. 47. Longitudinal section of late 111 spermatid. 48. Transverse section of the midpiece, with spherical mitochondria grouped around the distal centriole. 49. Longitudinal section of the flagellum.

50. Sperm cells drawings by Walter Costa Introíni. A. Donax hanleyanus . B.

Donax gemmula .

a = acrosome, dc = distal centriole, dds = distal dense structure, f = flagellum, m = mitochondria, n = nucleus, pc = proximal centriole, pds = proximal dense structure.

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Table 1. Morphometric and numerical data of sperm cell structures of Tellinidae and Donacidae species.

Species Head Head Acrosomal length + Number and shape

length width subacrosomal area of mitochondria

(µm) (µm) (µm)

Macoma biota 2.6 1.6 1.2 Four / spherical

Macoma constricta 3.8 1.3 1.8 Four / spherical

Tellina lineata 8.4 0.65 0.7 Four / elongated

Donax hanleyanus 3.0 1.5 2.0 Four / spherical

Donax gemmula 2.25 1.65 1.45 Four / spherical

126

Donacidae Nuclear Acrosome Additional acrosome features Chromatin Locality References Species Shape Shape Condensation Donax sordidus Barrel Short and conical Concentric lamellae in the electron- High degree of South (HODGSON et dense base condensation Africa al. , 1990). Donax Barrel Short and conical Concentric lamellae in the electron- High degree of South (HODGSON et madagascariensis dense base condensation Africa al. , 1990). Donax serra Barrel Short and almost Concentric lamellae in the electron- High degree of South (HODGSON et spherical dense base condensation Africa al. , 1990). Donax trunculus Conical Short and conical Presence of an axial rod and the High degree of Portugal SOUSA & base of the vesicle is electron- condensation OLIVEIRA, dense 1994. Donax striatus Rounded Short inserted in a Axial rod Cordon Brazil MATOS et al. , or Barrel depression of the appearance 1995. nuclear apex Donax lubrica Rounded Short and conical Axial rod and electron-dense base High degree of India PAL, 1996. or Barrel of the vesicle condensation Iphigenia brasiliana Rounded Short and conical Electron-dense base of the vesicle Medium degree of Brazil MATOS et al. , condensation 1996. Donax deltoides Barrel Conical Concentric lamellae in the electron- Medium degree of Australia HEALY et al. , dense base condensation 2008. Donax hanleyanus Rounded Long and conical The base of the vesicle is electron- Cordon Brazil PRESENT dense and there are several striate appearance WORK. structures perpendicular to the main axis Donax gemmula Rounded Short inserted in a Axial rod Medium degree of Brazil PRESENT or Barrel depression of the condensation WORK. nuclear apex Table 2: Ultrastructural sperm features of Donacidae species.

125

Sperm ultrastructure in Crassostrea oysters from Cananéia in the Southeast of Brazil

Gisele Orlandi Introíni 1, Dean Medeiros 2, Stenio Eder Vittorazzi 1, Luciana Bolsoni

Lourenço 1, Shirlei M. Recco-Pimentel 1

1. Departamento de Biologia Celular, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6109, 13083-863 Campinas, SP, Brazil

2. Climate Change Connection, 3rd Floor, 303 Portage Avenue, R3B 2B4,

Winnipeg, Manitoba, Canada

Keywords: Bivalvia, spermatozoa, ultrastructure, Crassostrea .

127

ABSTRACT

Oysters are commercially important in Brazil. There is, however, a significant discussion on the number of species of these bivalves along the

Brazilian coast. The morphology of their shells can be strongly influenced by environmental conditions and, consequently, their identification based on conchological characteristics is more difficult and not unequivocal. Studies are controversial regarding the presence of the Crassostrea gasar species, synonymy of Crassostrea brasiliana , of the family Ostreidae, in the South and Southeast regions of Brazil. Consequently, it is questionable in regard to the actual number of the Crassostrea species in these areas. In the present work, the sperm ultrastructure of Crassostrea specimens , identified as C. brasiliana and sampled in the region of Cananéia, was described with the objective of contributing with new traits for the taxonomy of this genus. The male gametes of C. brasiliana contained a short acrosome with four whorls arranged in its apical area, a conspicuous anterior nuclear fossa, an axial rod settled in the center of the sub-acrosomal area, spherical nucleus, a midpiece with spherical similar-sized mitochondria grouped as a ring right below the head, and a flagellum with simple morphology. The sperm ultrastructural traits of the specimens described herein and molecular studies, confirm the presence of Crassostrea brasiliana in Cananéia, and correspond to the literature data on other species belonging to the family Ostreidae.

128

INTRODUCTION

Oysters are commercially important in Brazil and their number of species along the Brazilian coast is still questionable. The morphology of oyster shells may be strongly influenced by environmental conditions. Consequently, their identification based on conchological characteristics, such as color, shape and muscle scars, happens to be more difficult and not always unequivocal. The high phenotypic variation has impaired the taxonomy of oysters and only in the 50’s did the ordering of the species into groups according to morphology become possible

(GUNTER, 1951). A combination of data, as reproductive aspects, presence or absence of a promial chamber and the post-larval shell joint morphology, has been the basis of oyster systematics. The main species of economical interest, distributed along the West coast of the Atlantic Ocean, are grouped in the genus

Ostrea and Crassostrea , of the family Ostreidae. Analyzing the Crassostrea genus, there is still much controversy over the current number of species native to the

East coast of South America (MORRETES, 1949; SANTOS, 1978; ABSHER,

1989).

According to IGNACIO et al. (2000), although the morphological differences between C. brasiliana (Lamarck, 1819) and C. rhizophorae (Guilding, 1828) are subtle, their ecological preferences contribute to their identities. The authors have considered that smaller individuals, usually found in mangroves or in intertidal areas of rocky substrates, correspond to specimens of C. rhizophorae . Conversely, according to these authors, the bigger oysters of subtidal regions belong, invariably, to the species C. brasiliana . NASCIMENTO (1991) argued that the scar in the adductor muscle in C. brasiliana is, in general, slightly blue or brown, 129 whereas the same scar in C. rhizophorae is frequently non-pigmented. Significant differences in the growth rate and morphology of the larvae have been described for C. brasiliana and C. rhizophorae (ABSHER, 1989), indicating that they could be considered biologically different species.

Given the economical importance of Crassostrea species in Brazil, it is essential to analyze taxonomic traits and verify if these species are capable of interbreeding and producing hybrids. Due to the imprecision generated by the use of anatomic traits, molecular analysis have been efficient to establish the status of oyster species (BUROKER et al., 1979; HEDGECOCK & OKAZAKI, 1984; BANKS et al., 1993; BOUDRY et al., 1998; O’ FOIGHIL et al., 1998).

LAPÈGUE et al. (2002), using molecular data, identified C. rhizophorae on the Martinica Island, Caribbean, Salvador (12º 52’ S, 38º 37’ W) and Paranaguá

Bay (25º 30’ S, 48º 30’ W), Brazil. The same authors found C. gasar (Adanson,

1757) in the French Guiana, Paranaguá and Cananéia Bays (25º 07’ S, 47º 52’ W).

Recently, it has been proved that the 16S ribosomal RNA sequence of C. brasiliana (GenBank - DQ839413) described by PIE et al. , (2006) is identical to that of C. gasar (GenBank-AJ312937) studied by LAPÈGUE et al. (2002), suggesting that both might belong to the same species.

VARELA et al. (2007) reported the occurrence of three different Crassostrea species on the Brazilian coast, being two native and one exotic. The topology of the trees obtained by these authors, based on molecular data, shows that C. rhizophorae, C. virginica (GenBank - AF092285) and C. gasar are closely related species. The previous allozyme analysis identified two species of Crassostrea - C. brasiliana (synonymy of C. gasar ) and C. rhizophorae – on the South coast of 130

Brazil (IGNACIO et al., 2000). However, the work of VARELA et al. (2007) does not mention the occurrence of C. gasar between the state of Ceará and the South region of Brazil, which can be a result of the scarceness of samples collected from the areas between Vitória (20º 18’ S, 40º 18’ W) and Florianópolis (27º 33’ S, 48º

33’ W).

Considering the current data on the presence or absence of C. gasar

(synonymy of C. brasiliana ) in the South and Southeast regions of Brazil

(LAPÈGUE et al., 2002; VARELA et al. , 2007), questions are raised on the actual number of Crassostrea species existing in these regions. Additional methodologies are necessary to clarify this issue. The use of sperm ultrastructure in phylogeny and taxonomy is currently well accepted and has been associated with diverse aspects of reproductive biology (BERNARD & HODGSON, 1985; HEALY, 1989;

ECKELBARGER et al. , 1990; GUERRA et al., 1994; REUNOV & HODGSON,

1994; SOUSA & OLIVEIRA, 1994; HEALY, 1995; KAFANOV & DROZDOV, 1998;

GWO e t al. , 2002).

According to the website of the Brazilian Fund for Biodiversity

(www.funbio.org.br), the exploitation of the mangrove native oyster has been conducted with commercial purposes for decades in the city of Cananéia, state of

São Paulo, Brazil, being one of the most important natural resources used by the traditional communities of the region.

The species cultivated and harvested by the Cooperation Unit of the Oyster

Producers of Cananéia (Cooperativa dos Produtores de Ostras de Cananéia –

COOPEROSTRA), for commercial purpose, invariably belong to the genus

Crassostrea. However, there are uncertainties regarding the actual number of 131

Crassostrea species that are cultivated. In principle, it is believed that there are populations of different species living in sympatry in Cananéia.

In this study, the sperm ultrastructure and 16S rDNA sequences of oyster specimens sampled in Cananéia, in the southeastern region of Brazil, were analyzed aiming at contributing to further elucidate the Crassostrea taxonomy and to help the identification of the actual number of oyster species cultivated by the

Cooperostra.

MATERIAL AND METHODS

Oyster specimens from intertidal and subtidal zones were sampled in the region of Cananéia county, state of São Paulo (SP), Brazil (S 25º00'53" W

47º55'36"). The live specimens were transferred to the State University of

Campinas (Unicamp) and analyzed for the adductor muscle scar, as proposed by

NASCIMENTO (1991). The individuals with blue, brown or lilac scars were, previously, identified as C. brasiliana (Figures 1 and 2). And the specimens with non-pigmented adductor muscle scar were identified as C. rhizophorae (Figures 1 and 2). The voucher specimens will be deposited in the Museu de Zoologia “Prof.

Dr. Adão José Cardoso” (ZUEC) at the State University of Campinas (UNICAMP),

São Paulo, Brazil.

Transmission Electron Microscopy

Small male gonad fragments (0.1 to 0.3 mm 3) were fixed for 24 h at 4ºC with

2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, supplemented with

3% sucrose and 5 mM calcium chloride. Samples were then washed with 0.1M 132 sodium cacodylate buffer for 3 h and post-fixed with 1% osmium tetroxide, in the same buffer, for 1 h at 4ºC. After dehydration in a graded acetone series, the samples were embedded in EPON 812 resin. Ultrathin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and examined with a Zeiss Leo 906 transmission electron microscope (TEM) operating at 60 and 80 kV.

The phosphotungstic acid-ethanol (E-PTA) method was used for detection of basic proteins. Male gonad samples were fixed with 2.5% glutaraldehyde in

0.1M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, supplemented with 3% sucrose and 5 mM calcium chloride. Samples were rinsed with 0.1M sodium cacodylate buffer and dehydrated in ethanol. In the last dehydration step, 1% phosphotungstic acid was added to the ethanol (SOUSA et al ., 1998). Subsequently, the samples were embedded in EPON resin 812. Ultrathin sections were examined with a Zeiss Leo

906 TEM operating at 60 and 80 kV.

Molecular Analyses

1. Analyzed specimens

The Crassostrea specimens 17, 21, 22 and 23, sampled in Cananéia, SP

Brazil, were analyzed in this work. The adductor muscle scar was pigmented in the specimens 17 and 21 and non-pigmented in the 22 and 23. These specimens will be deposited in the Zoology Museum “Prof. Dr. Adão José Cardoso”, State

University of Campinas, Brazil.

133

2. DNA extraction

Genomic DNA samples were extracted from frozen (-80°C) tissues of the adductor muscle scar. Tissues were macerated in TNES buffer (250 mM Tris-HCl, pH7.5; 2 M NaCl; 100 mM EDTA; and 2.5% SDS), supplemented with proteinase K

(20 mg/ml) and kept at 56 oC for 5 h. Proteins were precipitated by adding 5 M NaCl to a final concentration of 1.25 M. After centrifugation, the DNA was precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol and resuspended in TE buffer, pH 8.

DNA samples were quantified by comparison with known concentrations of lambda

DNA on 0.8% agarose gel electrophoresis.

3. DNA amplification by Polymerase Chain Reaction (PCR)

A partial sequence of the mitochondrial gene 16S rDNA was PCR amplified using the primers 16SL1987 (5´ GCC TCG CCT GTT TAC CAA AAA C 3´)

(VARELA et al., 2007) and 16SBR (5´ CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T 3´)

(PALUMBI et al., 1989). Immediately after a DNA denaturation step of 94°C for 3 min, PCR amplifications were performed in 30 cycles of 94°C for 1 min, 50°C for 1 min and 72°C for 1 min, followed by an extension ti me of 5 min at 72°C. Samples of

PCR products were then submitted to electrophoresis on 1% agarose gel and analyzed for amplification products.

4. Sequencing

The PCR amplified DNA fragments were sequenced in an automated sequencer ABI-3100 (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). The BigDye Terminator kit

(Applied Biosystems) was used for sequencing and the resulting reaction products 134 were purified by ethanol precipitation and centrifugation. The DNA was resuspended in loading dye (Blue-Dextran -EDTA/Formamide 1:5), denatured during

3 min at 94°C and sequenced. The data were submitte d to quality check, assembly and alignment (CLUSTALW) on the Bioedit software

(http://www.jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html ). Sequences of the 16S rDNA of C. brasiliana , C. gigas and C. rhizophorae , obtained in the GenBank

(DQ839413, DQ839414, DQ839415) were included in the alignment.

RESULTS

TEM

The TEM analysis of spermatozoa from the Crassostrea specimens revealed a relatively small head, short midpiece and a long flagellum (Figures 3-7 and 11). The acrosome is short and posteriorly invaginated, resting as a dome on the membranes of a spherical nucleus (Figures 3 and 4). In the acrosome apex, there are four whorls rich in basic proteins, as observed using the E-PTA method

(Figures 3-4 and 8-10). The acrosome invagination forms a wide subacrosomal space that contains a material with longitudinally linear organization, corresponding to an axial rod that did not have its chemical composition identified (Figures 3 and

4).

The sperm nucleus is markedly invaginated in its apical region and the electron-dense chromatin exhibits a slightly granular appearance (Figures 3 and 4).

There is a conspicuous posterior nuclear fossa, where the proximal centriole is attached to the nucleus. The midpiece contains similar-sized spherical mitochondria grouped as a ring-shaped cluster right below the head (Figures 5 and 135

6). The proximal and distal centrioles are orthogonally arranged (Figure 5). The flagellum of the analyzed oyster spermatozoa is morphologically simple, consisting of a 9 + 2 microtubular configuration axoneme sheathed by the plasma membrane

(Figure 7).

Molecular Analysis

A DNA fragment of 490 base pairs of the mitochondrial gene 16S rDNA was

PCR amplified and sequenced for the Crassostrea specimens 17, 21, 22 and 23.

The 16S rDNA fragments showed 100% similarity in the CLUSTALW alignment

(Figure 12), indicating that these specimens belong to a same species. The alignment of these sequences with C. brasiliana , C. gigas and C. rhizophorae sequences, obtained from the GenBank, revealed 100% similarity with C. brasiliana

(Table 1 and Figure 12).

136

Table 1. Identity matrix (%) of 16S rDNA sequences of four analyzed

Crassostrea specimens (17, 21, 22 and 23) compared with C. brasiliana , C. gigas and C. rhizophorae DNA sequences available in the GenBank

(Accession Numbers DQ839413, DQ839414, DQ839415). Adductor muscle scar was pigmented or without pigmentation.

C. C. 17 21 22 23 C. gigas brasiliana rhizophorae

17 ------pigmented

21 100 ------pigmented

22 non - 100 100 - - - - - pigmented

23 non - 100 100 100 - - - - pigmented

C. brasiliana 100 100 100 100 - - -

C. gigas 80.6 80.6 80.6 80.6 80.6 - -

C. 87.1 87.1 87.1 87.1 87.1 83.5 - rhizophorae

137

Figure 12. Multialignment on CLUSTALW of nucleotide sequences from the mitochondrial gene 16S rDNA of Crassostrea . Specimens a = 17; b = 21; c =

22 and d = 23 were sampled in Cananéia, SP. e = C. brasiliana; g = C. rhizophorae; and f = C. gigas are sequences from the GenBank (Accession

Numbers DQ839413, DQ839414, DQ839415).

138

DISCUSSION

A large number of oyster species have been described as belonging to the

Crassostrea genus. However, their taxonomic identification is, many times, difficult and uncertain, which makes the knowledge on the geographical distribution of these bivalves imprecise.

One particularity of the species of the genus Crassostrea is the extreme variability of its conchological characteristics and internal structures. Consequently, other methods such karyotypic analyses, molecular and sperm ultrastructure analysis have been used to differentiate these bivalves (AHMED & SPARKS, 1967;

THIRIOT-QUIÉVREUX & AYRAUD, 1982; SOUSA & OLIVEIRA, 1994; LEITÃO et al ., 1999; IGNACIO et al. , 2000; LAPÈGUE et al. , 2002; THIRIOT-QUIÉVREUX,

2002).

According to FRANZÉN (1977), sperm cells considered primitive contain a circular or conical head, an intermediate piece composed of 4 or 5 mitochondria and a relatively long flagellum. In the anterior region to the nucleus there is a short acrosome. The sperm of Crassostrea , similarly to those produced by many bivalve species, present a typical morphology of sea animals, which release their gametes fertilizing their eggs in sea water. The sperm described in the present work is, therefore, considered primitive .

The species of the Ostreidae family with known sperm ultrastructure are

Saccostrea commercialis (HEALY & LESTER, 1991), Ostrea edulis (SOUSA &

OLIVEIRA, 1994), Crassostrea angulata (SOUSA & OLIVEIRA, 1994), C. gigas

(GWO et al. , 1996), C. virginica (ECKELBARGER & DAVIS, 1996), and C. rhizophorae (MATOS et al., 1999). The spermatozoon produced by these species 139 is considered of primitive type, with a short acrosome invaginated in the posterior region, similar to a dome propped on the spherical nucleus. The acrosome invagination produces a large sub-acrosomal space containing material of linear organization, similar to a rod, denominated perforatorium by some authors

(SOUSA & OLIVEIRA, 1994; GWO et al. , 1996; MATOS et al. 1999). The gametes present one nucleus, conspicuously invaginated in its anterior region, presenting slightly granular chromatin and a posterior fossa, in which the proximal centriole attaches to the nucleus. The spermatozoon midpiece presents spherical and similarly dimensioned mitochondria, grouped as a ring right below the head, and two centrioles, one proximal and one distal arranged orthogonally. The spermatozoon flagellum of the species investigated presents simple morphology and the pattern of microtubular arrangement 9+2, sheathed by the plasma membrane. The consistent similarity shared by all the examined spermatozoa produced by species of the Ostreidae family, as significant width of the nucleus, hood-shaped acrosome, large sub-acrosomal area, spherical nucleus, axial rod and four or five pericentriolar mitochondria, indicate that this bivalve family corresponds to one coherent unit.

The phylogenetic analysis conducted by O’FOIGHIL & TAYLOR (2000) indicated that: (i) the Ostreidae family is monophyletic, (ii) the release of the gametes in the water with subsequent production of planktotrophic larvae corresponds to a plesiomorphic condition and (iii) the care of the progeny, which appeared only once in an ancestor common to Lophinae and Ostreinae, remained in all the descending lineages. This present work is in agreement with the studies of O’FOIGHIL & TAYLOR (2000), describing spermatozoon typical of animals that 140 release their gametes in the water surrounding them, an ancestral condition present in the members of the Crassostreinae sub-family.

According to NASCIMENTO (1991), the scar of the adductor muscle is frequently non-pigmented in C. rhizophorae and, in general, slightly blue or brown in C. brasiliana . The sperm ultrastructure was equal in all the specimens (from intertidal and subtidal zones) analyzed in this work and that was independent of the pigmentation and color of the scar in the adductor muscle. Mitochondrial DNA sequences have been successfully used in genetic and taxonomic analyses of numerous animal species, including Crassostrea . Considering that these two putative species were not distinguished by sperm ultrastructural traits, their mitochondrial gene 16S rDNA was partially sequenced and compared by BLAST analysis with sequences available in the GenBank.

The data on nucleotide sequences of the mitochondrial gene 16S rDNA associated with data on sperm ultrastructure indicated that the four Crassostrea analyzed specimens, which differ for the trait adductor muscle scar pigmentation, indeed belong to the C. brasiliana species. Therefore, the adductor muscle scar pigmentation is likely to be inappropriate as a taxonomic trait for distinguishing C. rhizophorae from C. brasiliana. The pigmentation diversity could be a phenotypic plasticity effect. Several authors have considered that many cryptic species existing in sympatry have diverged recently, became reproductively isolated and are distinguished only by molecular analysis (BICKFORD et al. , 2006). Thus far, molecular analysis has been considered the only efficient tool suitable to distinguish specimens of C. rhizophorae and C. brasiliana (LAPÈGUE et al. 2002;

PIE et al. , 2006). Hence, apparently they are cryptic species. The 16S rDNA 141 sequences confirmed the existence of Crassostrea brasiliana in the region of

Cananéia and corroborate the sperm ultrastructure data described herein.

The present work is in agreement with the studies of LAPÈGUE et al.

(2002), by claiming that there are populations of C. brasiliana in the region of

Cananéia. However, it disagrees with the work of VARELA et al. (2007), which reports the absence of C. brasiliana between the states of Ceará and the South region of Brazil.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are grateful to Maria Valéria Ribeiro dos Santos (Fundação

Florestal/SMA) and Mário Pontes (Cooperostra) for helping with specimen sampling in the county of Cananéia and Instituto Butantan for permission to use the electron microscope. This work was supported by Fundação de Apoio à

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP grant no. 04/13887-4) and

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES/PROEX).

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147

FIGURE CAPTIONS

Figures 1-2. 1: Shell drawings of Crassostrea samples. Note the different outlines of the adductor muscle scars. 2: Shell pictures of Crassostrea samples. Note the different degrees of pigmentation of the adductor muscle scars.

Figures 3-7. Spermatozoa of C. brasiliana . 3-4: Longitudinal sections of a sperm cell head showing spherical nucleus, subacrosomal region, perforatorium and the short acrosome with four whorls. 5: Longitudinal section of the intermediate portion.

6: Transverse section of the intermediate portion. 7: Flagellum.

Figures 8-10. Spermatozoa of C. brasiliana specimens treated with E-PTA, at low pH, for detection of basic proteins. The acrosomal portion lays on the nucleus as a cap and the four whorls of the acrosomal vesicle react positively to the E-PTA technique, indicating presence of basic proteins.

Figure 11. Schematic illustration of C. brasiliana. a= acrosome; A+= E-PTA positive reaction, which reveals basic proteins; ar = axial rod; dc= distal centriole; pc= proximal centriole; f= flagellum; m= mitochondria; n= nucleus, nf= nuclear fossa; w= whorls.

148

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152

Ultrastructure of spermatozoa in Mytella (Bivalvia, Mytilidae) populations from distinct habitats in the southeast coast of Brazil

Gisele Orlandi Introíni 1, Fernanda Martins Maester 1, Fosca Pedini Pereira Leite 2

and Shirlei Maria Recco-Pimentel 1

1. Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia, Instituto de Biologia,

Universidade Estadual de Campinas, CP 6109, 13083-863 Campinas, SP, Brazil

2. Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, CP 6109, 13083-863 Campinas, SP, Brazil

Keywords: Bivalvia, spermatozoa, sperm ultrastructure, mussel.

153

ABSTRACT

Ultrastructural analyses of bivalve spermatozoa are relevant in studies aiming at identifying taxonomic traits suitable for discriminating species and for phylogenetic studies. In the present work, spermatozoa of mussel specimens of the genus Mytella , from two populations living in distinct habitats, were examined by transmission electron microscopy. The objective was to identify sperm ultrastructural taxonomic traits that could differentiate Mytella species and populations. The specimens were sampled from populations that live in intertidal zones either buried in muddy-sand sediment or anchored to rocky substrates, in

Caraguatatuba county, on the northern coast of São Paulo State, Brazil. The spermatozoa of all specimens shared the same ultrastructural pattern. The acrosomal vesicle was conical and relatively long, the axial rod ( perforatorium ) extended from the nucleus to the base of the acrosome, the nucleus was spherical with an extremely condensed and homogeneous chromatin, the intermediate portion contained spherical mitochondria encircling a pair of short centrioles arranged in orthogonal distribution, and there was a single flagellum comprising microtubules in a basic 9+2 pattern distribution. The sperm is of primitive type, which is typical of bivalves that release their gametes in the water. The spermatozoon ultrastructure did not distinguish the specimens buried in muddy- sand sediment or anchored to rocky substrates. The observed morphological and ultrastructural traits are in accordance with sperm characteristics of diverse species of the family Mytilidae. The data suggested that the specimens analyzed, which live in distinct habitats, indeed belong to a same species, which was identified as

154

M. charruana based on conchological analysis. The presence of an axial rod in sperm cells upholds the inclusion of M. charruana in the subfamily Mytilinae.

INTRODUCTION

The genus Mytella is represented by the species M. strigata , M. speciosa ,

M. tumbezensis (the two latter ones synonymized by BERNARD, 1983 apud

VILLARROEL and STUARDO, 1995), M. charruana (= M. falcata ) and M. guyanensis (VILLARROEL and STUARDO, 1995). Shells of the Mytella species are long shaped, mytiliform to modioliform and with a subterminal umbo. The frontal edge is smooth or with 3 to 4 dents and there are two smooth or concentrically striated scars of frontal retractor muscles. The posterior part of the mantle contains ramified tentacles (RIOS, 1994). M. charruana and M. guyanensis occur in the coastline of Brazil. In the northeastern region, M. charruana is appreciated as an edible mussel and popularly known as Sururu (RIOS, 1994).

Mytella charruana is distributed from the Pacific coast of Mexico to Ecuador plus Galapagos Islands and from the coast of Venezuela to Argentina. Moreover, it has been reported in Florida, U.S.A., as a species that was recently introduced, probably by boat’s ballast water. In Florida, M. charruana is popularly known as

‘charrua mussel’ and has been considered to represent a potential menace to local species, including commercially important native oysters (BOUDREAUX and

WALTERS, 2006).

Several names have been assigned to specimens of Mytella charruana

Orbigny, 1842, as for instance Mytella falcata Orbigny, 1846, Modiola falcata Von

Ihering, 1897, Mytilus strigatus Von Ihering, 1900 and Modiolus falcatus Morretes, 155

1949. M. charruana specimens measure between 22 and 50 mm and are highly variable in their morphology. The shell front edge is short and rounded, the dorsal angle is frequently prominent, the color varies from yellow/brown on the anterior- ventral region to green on the dorsal region, and the inner face of the shell is dark purple. Thousands of M. charruana individuals are found in intertidal zones, living in muddy-sand sediment banks and in shallow estuarine waters, in high population densities. Currently, there are several Mytella charruana synonymies, among them,

M. falcata Orbigny, 1842, M. arciformis Dall, 1909 and M. mundahuensis Duarte,

1926.

The species Mytella guyanensis is found in intertidal zones of mangrove and estuarine regions. M. guyanensis is distributed from the western Mexico to Peru, and from Venezuela to Brazil (Santa Catarina). In this species, the shell size varies from 33 to 70 mm (RIOS, 1994). Because Mytella guyanensis and Mytella charruana share substantial conchological similarities, equivocal identification is frequent between these two species.

In the present work, Mytella specimens living buried in muddy-sand sediment or anchored to rocky substrates were analyzed for ultrastructure of spermatozoa with the objective of comparing these two populations and identifying sperm ultrastructural traits useful for Mytella taxonomic studies.

MATERIALS AND METHODS

Specimens of Mytella from populations living in intertidal zones buried in muddy-sand sediment were sampled in the Camaroeiro beach, Caraguatatuba

County (23°37’38.5” S; 45°23’51.1” W) and specimens that live anchored to rocky 156 substrates were sampled in the Enseada beach, São Sebastião County. Both sampling places are located in the northern coast of São Paulo State, Brazil. The sampled specimens were immediately immersed in seawater and brought to a laboratory at the State University of Campinas, SP, Brazil, where they were processed for analyses. The voucher specimens will be deposited in the Museu de

Zoologia “Prof. Dr. Adão José Cardoso” (ZUEC) at the State University of

Campinas (UNICAMP), São Paulo, Brazil.

Transmission Electron Microscopy (TEM)

Small sections (0.1 to 0.3 mm 3) of male gonads were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, for 24 h at 4ºC. After fixation, they were washed with 0.1M cacodylate buffer, for 3 h at 4ºC, and postfixed with 1% osmium tetroxide (OsO 4), in the same buffer, for 1h at 4ºC.

Subsequently, samples were dehydrated in a graded acetone series and embedded in EPON resin. Sections were stained with Uranyl acetate and Lead citrate and then examined with a Zeiss Leo 906 TEM.

Ultrastructural cytochemistry: detection of basic proteins

Phosphotungstic acid was used for detection of basic proteins. Small sections of male gonads were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.2. Samples were washed with the same buffer and dehydrated in alcohol, adding 1% phosphotungstic acid to the alcohol in the last washing step (SOUSA et al ., 1998). Subsequently, they were embedded in EPON resin. Ultrathin sections were examined with a Zeiss Leo 906 TEM. 157

RESULTS

The TEM analysis of Mytella spermatozoa revealed equal ultrastructural patterns in specimens from populations that live buried in muddy-sand sediment or anchored to rocky substrates. The sperm contained a conical and relatively long acrosome, and the nucleus was spherical containing extremely condensed and homogeneous chromatin (Figures 1, 2 and 12A). A perforatorium extends from the nucleus to the acrosomal vesicle (Figures 1, 2, 6, 8 and 9). The spermatozoon intermediate portion contained four to five spherical mitochondria encircling the distal and proximal centrioles (Figure 3 and 4). The flagellum is single and the microtubules were distributed in the basic 9+2 distribution pattern (Figure 5). In a few cells, the acrosome showed an inclined position (Figure 2, 6 and 9). The base of the acrosome was stained with the E-PTA technique (Figures 6-11 and 12A’).

DISCUSSION

Sperm ultrastructure characteristics have been used as tools in studies of

Metazoa taxonomic and phylogenetic relationships, including the family Mytilidae.

To date, spermatozoa of Mytilidae have been described as of primitive type, which is typical of invertebrates with external fertilization. In these species, the sperm acrosome is conical and long or short shaped, the nucleus is relatively small, the ultrastructural organization of the intermediate piece is similar to the one described herein in which spherical mitochondria are grouped as a ring encircling the distal and proximal centrioles, and the sperm has a single flagellum in the posterior region (KAFANOV and DROZDOV, 1998; REUNOV et al., 1999; INTROÍNI et al .,

2004). 158

According to KAFANOV and DROZDOV (1998), the genera within the superfamily Mytiloidea ( Adula , Arcuatula , Aulacomya , Brachidontes ,

Bathymodiolus , Choromytilus , Crenomytilus , Modiolus , Musculista , Musculus ,

Mytilus , Perna , Perumytilus , Semimytilus , Septifer and Trichomya ) can be classified in numerous groups according to the size of the acrosomal vesicle, chromatin condensation pattern, number of mitochondria and presence of an axial rod extending from the subacrosomal region to the acrosome (REUNOV and

HODGSON; 1994; GARRIDO and GALLARDO, 1996; HEALY et al. , 2000). The available data on sperm ultrastructure and conchology of Mytiloidea species constitute a set of traits that have suggested taxonomic changes in these taxa.

Consequently, Mytilidae is the only family formally remaining in the recent bivalve superfamily Mytiloidea. Currently, the family Mytilidae is subdivided in two subfamilies according to the presence or absence of an acrosomal rod. Species without the axial rod are grouped within the family Modiolinae and the ones that contain the axial rod are considered members of the subfamily Mytilinae. There is strong evidence that all the sperm types of Mytilidae species are derived from the genus Modiolus (KAFANOV and DROZDOV, 1998) .

The spermatozoon morphology of the Mytella specimens studied in the present work is in agreement with the known sperm characteristics of the family

Mytilidae. The presence of the long axial rod, extending from the sperm nucleus to the acrosomal vesicle, includes the genera Perna and Mytilus in the subfamily

Mytilinae, together with the two Mytella populations studied in this work. However, various other genera, as Modiolus and Brachidontes , do not have axial rod and are considered members of the subfamily Modiolinae. 159

Sperm morphology and cytochemical aspects were equal between the populations from the muddy-sand sediment or rocky habitats. Hence, the data suggested that these populations belong to a same species, even though they live in diverse habitats. All of the specimens studied were further examined for conchological characteristics and identified as Mytella charruana (Dr. Osmar

Domaneschi and Dr. Eliane Arruda, personal communication). These results disagree with the hypothesis of OLIVEIRA et al. (2005), based on alloenzyme markers, that mussel specimens living in large aggregates at high population densities in muddy-sand sediments belong to the species Mytella charruana , whereas those living at low population densities anchored to rocky substrates belong to the species Mytella guyanensis .

In some spermatozoa of Mytella charruana from the muddy-sand habitat, the acrosome showed an inclined position . A few authors defend the hypothesis that the inclined acrosome position could be caused by exposure of individuals to toxins present in their environment. REUNOV et al. (1999) described inclined acrosome in sperm cells of the mussel Perna viridis and hypothesized that it could be caused by the pollution in the Hong Kong waters where they were sampled.

However, the number of specimens analyzed was low and the experiment did not include a control from non-contaminated waters. Thus, the cause of this modified cytodifferentiation was inconclusive. It should be mentioned that, in the present work, several specimens were sampled in a moderately polluted environment with a substantial flux of boats.

According to OLIVEIRA et al. (2005), the fact that M. charruana populations form huge aggregates, living at high population densities, could partially explain the 160 high genetic variability in this species. For instance, in the Lepanto beach, Costa

Rica, M. charruana individuals were recorded at the density of 5,400 individuals per m 2, in an impressive number of 61 million individuals in just one population

(SIBAJA, 1985 apud OLIVEIRA et al., 2005). M. charruana lives preferentially in muddy-sand banks compared to rocky substrates. According to GORBUSHIN

(1996), competition is an interaction among individuals that is triggered by similar demands on limited supplies, resulting in lower survival and decreasing growth rate and reproduction of the competitors. M. charruana populations frequently reach high densities in muddy-sand banks, leading to a significant intraspecific competition. Most likely, occasional recruiting of M. charruana individuals should take place in this habitat with consequent establishment of new populations on neighboring rocky substrates. Ecological studies have investigated the colonization of distinct environments by molluscs, as land snails of the genus Mandarina

(CHIBA and DAVISON, 2007).

The spermatozoon ultrastructural traits described in this work are in accordance with sperm characteristics of diverse species in the family Mytilidae.

The presence of sperm axial rod upholds the classification of M. charruana in the subfamily Mytilinae. Moreover, the data reinforce the conchological Mytella charruana identification of all the examined specimens from the two distinct habitats. Strong intraspecific competition could be associated with needs of M. charruana populations for additional space and available supplies, expanding their colonization to diverse habitats.

161

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de

São Paulo (FAPESP grant no. 04/13887-4) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/PROEX).

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FIGURE CAPTIONS

Figures 1-5. Spermatozoa of Mytella charruana . 1-2: Longitudinal sections of a sperm cell head showing spherical nucleus, subacrosomal region, perforatorium and the acrosome that occasionally shows an inclined position. 3: Longitudinal section of the intermediate portion. 4: Transversal section of the intermediate portion. 5: Flagellum. Bars = 0.5 µm.

Figures 6-11. Spermatozoa of Mytella charruana specimens treated with E-

PTA, at low pH, for detection of basic proteins. The acrosomal portion lays on the nucleus as a cap and the base of the acrosomal vesicle reacts positively to the

E-PTA technique, indicating relatively high amounts of basic proteins. Note an inversion in electron density patterns of the acrosomal vesicle, comparing images obtained from conventional transmission electron microscopy and from samples treated with E-PTA; in this case, the clear areas become electron dense and vice- versa. Bars = 0.5µm.

Figures 12A-12A’. Schematic illustrations of Mytella charruana sperm cells.

A: Sperm cell fixed with Osmium. A’: Sperm cell treated with E-PTA. Bars = 1µm.

a= acrosome; A+= E-PTA positive reaction, which reveals basic proteins; ar = axial rod; dc= distal centriole; pc= proximal centriole; f= flagellum; m= mitochondria; n= nucleus.

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6. CONCLUSÕES GERAIS

Os resultados apresentados nesse trabalho complementam estudos comparativos da anatomia interna e dos caracteres conquiliológicos, podendo ser empregados em futuras investigações cujo objetivo será a melhor compreensão das relações filogenéticas entre os representantes da classe Bivalvia. O presente estudo mostrou-se especialmente importante por revelar também os detalhes internos mais sutis dos espermatozóides, ampliando o crescente entendimento da estrutura, biologia e desenvolvimento dos espermatozóides de espécies de bivalves das famílias Isognomonidae, Veneridae, Donacidae, Tellinidae, Mytilidae e Ostreidae. Na tabela 1 e figura 1 estão resumidas e esquematizadas as principais características dos espermatozóides das espécies analisadas nesse trabalho. Já no Cladograma e Quadro Resumo estão dispostas algumas inferências em virtude da compilação dos dados contidos na tese e daqueles disponíveis na literatura. Em função das características observadas, as principais conclusões foram:

1. Família Isognomonidae: As espécies Isognomon bicolor e I. alatus , as quais foram sistematicamente, e de longa data, confundidas devido a grande similaridade nas características externas da concha e ao fato de terem hábitos e habitats semelhantes, puderam ser inequivocamente separadas por diferenças morfológicas relevantes na forma da vesícula acrossomal. Adicionalmente, observou-se que o espermatozóide da espécie Isognomon bicolor apresenta grânulos elétron-densos em sua peça intermediária que podem contribuir para o aumento da longevidade da célula reprodutiva no ambiente marinho, conferindo

168 certa vantagem adaptativa, e que apenas I. alatus apresenta proteínas de caráter básico na área subacrossomal.

2. A compilação dos estudos sobre a ultra-estrutura dos espermatozóides de espécies de Veneridae , a mais diversa família de bivalves recentes, mostrou uma característica interessante da cabeça alongada dos espermatozóides: a presença de curvatura, possivelmente, um atributo característico dos espermatozóides da maioria dos venerídeos.

3. As espécies de venerídeos , Anomalocardia brasiliana (que vive predominantemente em águas calmas enterrada em sedimento lamoso) e Tivela mactroides (que vive em águas turbulentas enterrada em sedimento arenoso) apresentaram diferenças marcantes quanto ao número e disposição dos elementos mitocondriais, presença/ausência de grânulos de glicogênio na peça intermediária, comprimento e curvatura do núcleo. A presença de maior número de mitocôndrias e grânulos de glicogênio é responsável por maior produção de energia, podendo contribuir para o aumento da longevidade do espermatozóide produzido por Tivela mactroides , correspondendo a uma vantagem adaptativa em ambiente turbulento, já que o aumento da longevidade de gametas eleva as possibilidades de fertilização.

4. Família Donacidae : A presença de núcleo relativamente esférico com cromatina exibindo aspecto cordonal, acrossomo cônico, atipicamente longo com estrias perpendiculares ao eixo axial por toda sua extensão no espermatozóide produzido pela espécie D. hanleyanus difere dos resulta dos encontrados para outras espécies da mesma família. Em D. gemmula , o núcleo tem forma de barril, relativamente arredondado, com cromatina razoavelmente compactada, e o 169 acrossomo é curto e se encontra inserido na ampla depressão nuclear anterior, sem estrias perpendiculares, mas exibindo tênue agrupamento de feixes longitudinais na área subacrossomal. As características do espermatozóide produzido por D. hanleyanus assemelham-se mais àquelas exibidas pelo espermatozóide de Iphigenia brasiliana . Já os resultados de ultra-estrutura do espermatozóide aproximam as espécies D. gemmula e D. striatus.

5. A análise comparativa da morfologia dos espermatozóides das três espécies da família Tellinidae, Macoma constricta , M. biota e Tellina lineata , semelhantes em termos conquiliológicos, mostrou diferenças marcantes em relação à forma do núcleo e do acrossomo, sendo o espermatozóide produzido por M. constricta portador de cabeça em forma de “garrafa” (núcleo alongado e vesícula acrossomal cônica e longa), a célula gamética masculina de M. biota possui núcleo arredondado e acrossomo em forma de “cúpula”, já a de Tellina lineata é considerada modificada , portadora de acrossomo cônico e curto, núcleo longo e helicoidal, mitocôndrias alongadas que se estendem sobre a periferia da base nuclear, estruturas longas que se dispõem ortogonalmente (mas que não apresentam o padrão convencional dos centríolos) e um flagelo simples. Na literatura acerca dos Bivalvia, considera-se a cabeça alongada mais eficiente na penetração de óvulos que possuem ampla camada gelatinosa. Adicionalmente, os resultados da tese representam um convite a investigação ultra-estrutural de espermatozóides da família Tellinidae , verificando se há predominância de espermatozóides primitivos entre os Macominae e modificados entre os Tellininae.

6. A ultra-estrutura do espermatozóide de exemplares de Mytella , provenientes de populações que ocorrem em costões rochosos e enterrados em 170 bancos de areia, sugere que os indivíduos que vivem nesses habitats distintos, de fato pertencem a mesma espécie, identificada como M. charruana de acordo com caracteres conquiliológicos. A presença de um bastão axial na área subacrossomal suporta a inclusão de Mytella charruana na subfamília Mytillinae.

7. A consistente semelhança compartilhada por todos os espermatozóides de espécies da família Ostreidae estudados até o presente momento (largura significativa do núcleo, acrossomo em forma de capuz, ampla área subacrossomal, núcleo esferiforme, bastão axial e quatro ou cinco mitocôndrias pericentriolares) indica que essa família de bivalves corresponde a uma unidade coesa.

8. As ostras do gênero Crassostrea coletadas na região de Cananéia, portadoras de cicatriz pigmentada do músculo adutor e também aquelas que apresentavam cicatrizes desprovidas de pigmentação apresentaram as mesmas características ultra-estruturais do espermatozóide, não sendo possível distingui- las. Adicionalmente foi feito o seqüenciamento do gene mitocondrial 16S dos exemplares cuja ultra-estrutura dos espermatozóides foi investigada. Os resultados comparados àqueles disponíveis no GenBank demonstram fortemente que os indivíduos analisados pertencem a C. brasiliana. Desse modo, é possível afirmar que a cor da cicatriz do músculo adutor não pode ser utilizada como critério para diferenciar a espécie C. brasiliana de C. rhizophorae. Além disso, nossos dados corroboram estudos que afirmam que na região de Cananéia há populações de C. brasiliana e discordam do trabalho que relata a não ocorrência de C. brasiliana entre os estados do Ceará e a região Sul do Brasil.

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9. Portanto, o emprego das Microscopias Eletrônicas de Transmissão e

Varredura para o estudo de espermatozóides das espécies de bivalves apresentadas nessa tese foi valioso para o esclarecimento de problemas taxonômicos.

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Comprimento Largura da Comprimento do Ilustração Esquemática da cabeça cabeça acrossomo + área Elementos Fossa nuclear Fossa nuclear dos espermatozóides Espécie Cromatina (medidas em (medidas subacrossomal mitocondriais anterior posterior (sem escala) µm) em µm) (medidas em µm)

PRESENTE Isognomon Quatro elementos MUITO 1,2 1,2 0,45 (relativamente PRESENTE bicolor esféricos Compactada significativa)

Quatro ou cinco Isognomon MUITO PRESENTE 1,15 1,35 0,5 elementos PRESENTE alatus Compactada (significativa) esféricos

Compactada Crassostrea Quatro elementos PRESENTE PRESENTE (de 1,15 1,35 0,8 com aspecto brasiliana esféricos (significativa) forma conspícua) granular

Mytella Quatro elementos MUITO PRESENTE 3,5 2,2 1,7 AUSENTE charruana esféricos Compactada (minimamente)

Anomalocardia Quatro elementos MUITO 3,0 0,9 0,4 AUSENTE AUSENTE brasiliana esféricos Compactada

Tivela Seis elementos MUITO 4,5 0,5 0,4 AUSENTE AUSENTE mactroides esféricos Compactada

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Enovelada Donax Quatro elementos PRESENTE (mas 3,0 1,5 2,0 (aspecto AUSENTE hanleyanus esféricos pequena) cordonal)

Quatro elementos PRESENTE Donax gemmula 2,25 1,65 1,45 Compactada AUSENTE esféricos (significativa)

Quatro elementos Macoma biota 2,6 1,6 1,2 Compactada AUSENTE AUSENTE esféricos

Macoma Quatro elementos MUITO 3,8 1,3 1,8 AUSENTE AUSENTE constricta esféricos Compactada

Quatro elementos MUITO Tellina lineata 8,4 0,65 0,7 AUSENTE AUSENTE alongados Compactada

Tabela 1. Dados morfométricos referentes às estruturas dos espermatozóides produzidos pelas espécies estudadas.

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