Proyecto de Tesis Doctoral que presenta el Ldo. en Ciencias

Biológicas José Ruiz Martín, para optar al título de Doctor en Ciencias

Biológicas por la Universidad de Sevilla

Se solicita la inscripción para la defensa de la Tesis Doctoral en

Biología en la Universidad de Sevilla

Directores:

Dra. Rocío Pérez-Barrales (Universidad de Portsmouth, Reino Unido) y

Dr. Juan Arroyo Marín (Universidad de Sevilla), profesores del claustro del

Programa de Doctorado en Biología Integrada de la Universidad de Sevilla.

Título: Evolución, y función de la heterostilia en Linum

(Linaceae)

Resumen:

Antecedentes:

El género Linum L., que comprende alrededor de 180 especies (The

Plant List 2013, Version 1. http://www.theplantlist.org/ último acceso el 10 de

Marzo de 2017) y con una distribución cosmopolita, ha sido históricamente importante en el estudio de la evolución de la heterostilia. En concreto, Darwin

(1877) fue el primer autor en describir la variación en la altura de estigmas y estambres, así como en el sistema de incompatibilidad en algunas especies de

Linum. Este trabajo estimuló el interés de otros autores por entender mejor la variación de la heterostilia en Linum, lo que ha favorecido la generación de información descriptiva sobre la biología reproductiva de varias especies y evaluar algunas asunciones básicas sobre el funcionamiento del polimorfismo

(Dulberger, R. (1992). Floral polymorphisms and their functional significance in the heterostylous syndrome. In Evolution and function of heterostyly (pp. 41-

84). Springer Berlin Heidelberg., entre otros). A pesar de ello, solo recientemente han aparecido algunos trabajos con un enfoque ecológico y evolutivo. Por ejemplo, el trabajo de Armbruster et al (2006) (Armbruster, W. S.,

Pérez‐Barrales, R., Arroyo, J., Edwards, M. E., & Vargas, P. (2006). Three‐ dimensional reciprocity of floral morphs in wild flax (Linum suffruticosum): a new twist on heterostyly. New Phytologist, 171(3), 581-590) puso de manifiesto que pequeñas variaciones en tres dimensiones en la posición de anteras y estigmas pueden funcionar para mejorar la transferencia de polen entre morfos. Por otro lado, el trabajo de McDill et al (2009) (McDill, J., Repplinger, M., Simpson, B.

B., & Kadereit, J. W. (2009). The phylogeny of Linum and Linaceae subfamily

Linoideae, with implications for their systematics, biogeography, and evolution of heterostyly. Systematic Botany, 34(2), 386-405, fue el primer trabajo filogenético a nivel de género, donde los autores incluyeron un muestreo amplio, y en el que realizaron una reconstrucción evolutiva del polimorfismo. A pesar que la contribución de estos estudios ha aportado información relevante sobre la evolución de la heterostilia en Linum, aún quedan grandes vacíos de conocimiento. En concreto, poco se sabe sobre la variación en la morfología floral, mas allá de clasificaciones cualitativas (e.g., homostilia vs. heterostilia), y su significado micro- y macroevolutivo. La presente Tesis Doctoral pretende aportar esta falta de conocimiento a través de los siguientes objetivos que se presentan por Capítulo de Tesis:

1. Variación de la heterostilia y polimorfismos sexuales asociados en

Linum L. (Capítulo 2): Para ahondar en esta cuestión primero debemos caracterizar el polimorfismo de las distintas especies que conforman el género, mediante mediciones de verticilos sexuales de flores de cada especie y aplicando test estadísticos para caracterizar los distintos tipos de hercogamia.

El objetivo de este capítulo consistió en describir la variación morfológica en la altura de los estilos, estambres y hercogamia en las especies de Linum, y poder asignar con precisión el tipo de polimorfismo floral correspondiente a cada especie. Como resultado principal se caracterizaron hasta 8 polimorfismos florales en el género, lo que nos coloca en un perfecto escenario para probar las hipótesis principales sobre la evolución de la heterostilia en el siguiente capítulo.

2. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Capítulo 3): Debemos tener una hipótesis sólida sobre las relaciones filogenéticas entre las especies y poblaciones. De estudios anteriores se ha deducido que la heterostilia en Linum parece ser un estado asociado a la Cuenca Mediterránea. A partir de una extensa revisión de la literatura acerca de este tema se encontró que hay algunas especies heterostilas de la Región de El Cabo en Sudáfrica, que también se desarrollan en condiciones de clima mediterráneo y que han sido muestreadas y analizadas, lo que puede arrojar luz sobre las condiciones ambientales que favorecen la heterostilia en Linum. En este capítulo, el objetivo fue generar una filogenia molecular nueva en la que se incluyeran un mayor número de especies del género, con la idea de estimar el tiempo de divergencia en relación a los eventos macroevolutivos más importantes de aparición del polimorfismo. Esta información además se usó para poder realizar una reconstrucción evolutiva del polimorfismo, así como evaluar posibles asociaciones evolutivas con rasgos relacionados con el ciclo de vida (perennialidad o anualidad).

3. Relaciones evolutivas entre distintos linajes de lino blanco (Linum tenuifolium s.l.) en la cuenca del mediterráneo (Capítulo 4). Este grupo contiene dos especies distintas: L. tenuifolium L. (especie monomórfica estilar) y L. suffruticosum L. (especie heterostila, con una hercogamia recíproca especial en tres dimensiones), aunque este último presenta una gran variabilidad fenotípica sobre todo en la Península Ibérica. Todas las poblaciones colectadas servirán para el análisis filogenético y filogeográfico y para detectar la verdadera posición taxonómica y geográfica de la diversidad del grupo. También se ha encontrado, en Linum suffruticosum, la presencia de un tipo nuevo de heterostilia, llamada “de reciprocidad tridimensional”, debido a que esta reciprocidad ocurre en altura de estambres y estigmas, en su disposición interna y externa respecto al eje vertical floral, y en la torsión hacia dentro o fuera de anteras y estigmas (Armbruster et al. 2006). Estos autores señalan que tal disposición mejora la transferencia legítima (entre morfos) de polen, en detrimento de la ilegítima (dentro de morfos, dentro de la flor). Por tanto representa un apoyo a ciertas hipótesis sobre la evolución de la heterostilia en las que esta promoción de la transferencia legítima es el factor clave (The evolution of heterostyly. In Evolution and function of heterostyly (pp. 151- 178). Springer Berlin Heidelberg. Lloyd, D. G., & Webb, C. J. (1992)), como ya propuso Darwin en “The different forms of flowers on plants of the same species” (1877). De hecho, esta heterostilia tridimensional aparece de forma terminal en una filogenia muy preliminar de algunas especies de Linum

(Armbruster et al. 2006). Sin embargo, no se sabe si hay casos intermedios en esta evolución o si una vez alcanzada ésta heterostilia, es estable.

El objetivo general de este capítulo consistió en estudiar procesos microevolutivos de la aparición de la heterostilia en tres dimensiones en el complejo de L. tenuifolium aggr., usando para ello información morfológica y del sistema de incompatibilidad. Además, se incorporaron marcadores moleculares nucleares y plastidiales para establecer las relaciones filogenéticas y procesos filogeográficos. Además se determinaran los mecanismos de reproducción de las distintas formas estilares, cuando las hay, y el tipo de hercogamia presente en este grupo de especies.

4. An unnoticed flax species (Linum flos-carmini, Linaceae) from North

Morocco revealed by morphological evidence. (Capítulo 5): Por último se presenta un resultado colateral, el reconocimiento de una nueva especie heterostila de Marruecos.

El estudio morfológico del capítulo 2 permitió identificar problemas taxonómicos en L. setaceum en el Norte de África, que están relacionados directamente con la evolución de la heterostilia en Linum. El objetivo del capítulo 4 fue esclarecer el estado taxonómico de L. setaceum var. bicolor f. robusta .

Los resultados de la tesis son:

1. Variación de la heterostilia y polimorfismos sexuales asociados en

Linum L.: En el manuscrito correspondiente al capítulo 2 se describen ocho tipos de polimorfismos que posteriormente se han usado para reconstruir la evolución de este carácter en la filogenia. Además se describe un nuevo polimorfismo en el género, trimorfismo estilar, encontrado en una especie localizada en Turquía.

En concreto se describen especies sin polimorfismo, es decir, que los verticilos sexuales que presentan sus flores no exhiben diferencia en las alturas de estambres y estigmas (especies sin hercogamia); Otras presentan una hercogamia horizontal, es decir, los verticilos sexuales se separan no en altura, sino en el eje horizontal. También existe una hercogamia reversa, es decir, todas las flores de la población presentan los estambres por encima de los estigmas, situación bastante rara en la naturaleza. Y la hercogamia de aproximación, donde los estigmas se colocan por encima de los estigmas en toda la población pero no de una forma perfecta sino que esa hercogamia puede variar.

Además, se estudia la variabilidad que presenta la distilia en el género, y se pone de manifiesto que esta distilia difiere entre especies. Para ello se usan los dos test más empleados para caracterizar y dar valores orientativos sobre la perfección de la reciprocidad presente en cada especie heterostila estudiada, ya sean distílicas o trimórficas (Richards, J. H., & Koptur, S. (1993). Floral variation and distyly in Guettarda scabra (Rubiaceae). American Journal of

Botany, 31-40.; y Sánchez, J. M., Ferrero, V., & Navarro, L. (2013). Quantifying reciprocity in distylous and tristylous plant populations. Plant Biology, 15(3),

616-620).

Tanto la hercogamia reversa como el trimorfismo, son tipos morfológicos descritos por primera vez en el género Linum.

2. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution?: No es la primera vez que se realiza un estudio filogenético de este tipo (McDill et al., 2009, 2010), pero si la primera vez que se ejecuta con la mayoría de las especies de la cuenca del Mediterráneo (74 sp.) y Sudáfrica (14 sp.) muestreadas en el campo por el autor y colaboradores.

Linum y dos de sus cinco secciones no son monofileticos. La sección

Dasylinum aparece como monofilética, pero se anida dentro de la sección

Linum. Radiola se coloca de lleno entre los principales linajes de Linum. Las secciones Cathartolinum y Syllinum se anidan dentro de la sección Linopsis, como los géneros Hesperolinon, Sclerolinon y Cliococca, lo que implica la existencia de parafilia en Linum cuando se reconocen a estos géneros como tales.

Según los resultados, el género Linum en sentido amplio (incluyendo

Cliococca, Hesperolinon, Radiola y Sclerolinon) se originó entre el final del

Eoceno y el comienzo del Oligoceno (43,31- 33,95Ma). Es un grupo monofiletico bien apoyado estadísticamente en los tres análisis por separado.

De las secciones que forman el género Linum la secc. Linum parece ser la más antigua, la cual se originó entre el mioceno medio y el oligoceno tardío (15,26-

28,67) en zonas del Asia templada. La heterostilia es muy frecuente en el género, pero parece concentrada en la cuenca mediterránea y, en menor medida, en la Región del Cabo en

Sudáfrica. La reconstrucción de caracteres ancestrales no determinó un único estado como la condición más probable para el polimorfismo estilar en el género, aunque para algunos grupos la hercogamia se resolvió como estado ancestral. Otros rasgos putativamente relacionados con la heterostilia, tales como la forma de vida (perennialidad, anualidad) y la poliploidía, no mostraron ninguna correlación filogenética significativa, mientras que algunos tipos de polinizadores (moscas de probóscide) se asocian con casos específicos de heterostilia. Las evidencias disponibles apuntan a que son los diferentes tipos de polinizadores especializados los que promueven el funcionamiento de la heterostilia en la cuenca mediterránea, y Sudáfrica. Esto explicaría la presencia múltiple de heterostilia en este linaje.

3. Relaciones evolutivas entre distintos linajes de lino blanco (Linum tenuifolium s.l.) en la cuenca del mediterráneo: En el capítulo 4 se muestran resultados sobre relaciones filogenéticas y filogeográficas, usando ADN plastidial y nuclear, de 125 poblaciones de la cuenca del mediterráneo. Una vez obtenidos los resultados filogenéticos, se infirió el periodo de formación de los clados resueltos con buen apoyo estadístico utilizando puntos de calibración internos y externos al género. De manera general podemos decir que todas las poblaciones de L. suffruticosum estudiadas (86) presentan una distilia en 3D en todo su rengo de distribución, con alguna variación dependiendo del hábitat donde se desarrollan. Mientras que L. tenuifolium s.str. (39) presenta plantas con flores monomórficas, con hercogamia en el eje horizontal entre sus verticilos sexuales, en toda su distribución, mostrando una variación floral intraespecífica casi inexistente en toda su distribución. Ambos análisis filogenéticos (nuclear y plastidial) presentaron a L. tenuifolium aggr. como un grupo monofiletico con buena resolución estadística, bajo análisis de Máxima

Parsimonia (MP), Máxima probabilidad (ML) e inferencia bayesiana. Pero los marcadores tanto nucleares como plastidiales elegidos no dieron la resolución deseada. Para separar ambas especies se realizaron varios análisis estadísticos como un Análisis de diferenciación genética (Snn) y tests de

Mantel. Posteriormente se usó la topología plastidial resultante del análisis bayesiano para determinar la edad de los clados. Según el cronograma resultante del análisis de datación, el grupo de estudio comienza a divergir aproximadamente hace unos 10 MA (media del intervalo al 95% HPD). Y la edad en la que se establecen ambas especies esta en torno a los 5,75 MA.

Periodo que corresponde aproximadamente con la formación del Mediterráneo.

A expensas de este análisis plastidial se realizó un estudio filogeográfico para ambas especies por separado seleccionando los clados más importantes resultantes de la topología. La presencia de tantos haplotipos interrelacionados en el caso del análisis biogeográfico de L. suffruticosum (18 haplotipos, frente a

8 resultantes para L. tenuifolium), nos indica que hubo un haplotipo con un gran

éxito basal que tuvo una gran capacidad colonizadora. A partir del cual aparecieron los diferentes haplotipos debido a una diferenciación reciente y a una tasa evolutiva alta.

Además se incluye un estudio de la biología reproductiva y polimorfismo estilar en L. tenuifolium aggr. en condiciones naturales. Este estudio se realizó en tres poblaciones diferentes de la Península Ibérica (Málaga, Guadalajara y los Pirineos). Este último ítem nos muestra que la especie heterostila L. suffruticosum presenta un sistema de incompatibilidad heteromorfica típico de este tipo de polimorfismo sexual, pero que las barreras interespecíficas entre estas dos especies tan afines no son tan fuertes. Mientras que L. tenuifolium se muestra como una especie autocompatible, corroborando estudios anteriores.

4. An unnoticed flax species (Linum flos-carmini, Linaceae) from North

Morocco revealed by morphological evidence. En el capítulo 5 se muestra la descripción de una nueva especie como consecuencia del estudio morfométrico y filogenético. Además esto resulta muy relevante ya que es una especie relacionada con L. setaceum, especie que es homostila, mientras que la especie nueva es heterostila.

Principales conclusiones:

Nivel Macroevolutivo: (i) Caracterización del polimorfismo sexual encontrado en cada especie. (ii) Comprobación de las relaciones filogenéticas entre las distintas especies (y algunas subespecies) y reconstrucción del estado ancestral de los caracteres en la filogenia resultante.

Nivel Microevolutivo: (iii) Se concretan las relaciones evolutivas entre los linajes de lino blanco (L. tenuifolium aggr.) en la Cuenca del Mediterráneo. (iv)

Aclaraciones sobre el funcionamiento del sistema de incompatibilidad heteromórfico dentro del grupo (v) Por último se presenta un resultado colateral, el reconocimiento de una nueva especie heterostila de Marruecos y la descripción de un nuevo polimorfismo en el género, trismorfismo estilar, encontrado en una especie localizada en Turquía.

Aval de los directores de la Tesis Doctoral:

Por la presente confirmamos que los resultados de la Tesis Doctoral que inscribe el Ldo. José Ruiz Martín para su defensa, dentro del Programa de

Doctorado en Biología Integrada, cumplen los requisitos mínimos de calidad científica para merecer su defensa. Para ello el Ldo. ha contado con una beca

FPI asociada a un proyecto (CGL2009-12565) del cual uno de nosotros (Juan

Arroyo Marín) es Investigador Principal.

Dra. Rocío Pérez-Barrales

Prof. Dr. Juan Arroyo Marín

Introducción

Antecedentes

La extraordinaria diversidad de las plantas con flores ha interesado a la comunidad científica desde finales del s. XVIII, cuando Sprengel (1793) en su Das entdeckte Geheimnifs der Natur im Bau in der Befruchtung der

Blumen (“El descubrimiento de la naturaleza oculta de la forma y la fertilización de las flores”) interpretó la función de los rasgos florales en el contexto de la polinización. Sprengel reconoció que muchas plantas hermafroditas no pueden autofertilizarse, por lo que el objetivo último de la atracción de polinizadores es asegurar la reproducción sexual. La obra de

Sprengel representó un cambio conceptual sobre la interpretación del funcionamiento de las flores, que pronto influenció el pensamiento científico.

Darwin fue uno de los primeros autores en los que se observa dicha influencia. En su trabajo se interesó por la reproducción sexual en plantas, tal y como reflejó en On the various contrivances by which British and foreign orchids are fertilised by insects (Darwin, 1862) en donde la influencia de

Sprengel es evidente cuando describió la estrecha relación entre orquídeas e insectos polinizadores. En este trabajo, Darwin escribió que “these contrivances have for their main object the fertilisation of each flower by the pollen of another flower” (estos artilugios (i.e., rasgos florales) tienen por objeto la fertilización de cada flor con el polen de otra flor). A partir de entonces, la obra botánica de Darwin provoca un gran interés por la sexualidad en las plantas y por sus estrategias reproductivas (Pannell, 2009), tal y como muestran sus estudios sobre la morfología de los órganos sexuales de las flores, la interacción entre polen y estigma, y cómo esto afecta a las tasas de autopolinización y polinización cruzada (Darwin, 1862,

1868, 1877).

Uno de los aspectos de la sexualidad de las plantas que más interesó a Darwin fue entender el funcionamiento de las especies que presentan más de una forma floral en la misma población, como es el caso de las plantas heterostilas (Darwin, 1877). La heterostilia es un polimorfismo estilar con base genética presente en al menos 28 familias de Angiospermas (Barrett y

Shore, 2008). Las especies con flores heterostilas se caracterizan por presentar dos (distilia) o tres (tristilia) formas florales con la altura de las anteras y los estigmas dispuestos de manera recíproca en morfos opuestos, de manera que los insectos polinizadores pueden colocar el polen de los morfos florales en distintas partes del cuerpo, y así promover la polinización cruzada entre morfos distintos (Barrett, 2002). Darwin incorporó experimentos de polinización manual para interpretar el funcionamiento de los morfos florales en varias especies, como fue el caso de algunas especies distilas de

Primula (e.g. P. veris, P. vulgaris) y de Linum (e.g. L. perenne, L. grandifolium) para mostrar que (i) la separación entre estambres y estigmas dentro de los morfos evita la autopolinización, y (ii) tan solo las polinizaciones entre morfos distintos resultan en la formación de semillas debido a la presencia de un sistema de incompatibilidad heteromórfico. Darwin resumió estos conceptos en la introducción de su libro “The different forms of flowers on plants of the same species” (1877), donde escribió que se “mostraría que las plantas heterostilas estaban adaptadas para la fertilización recíproca, de manera que las dos o tres formas florales, aunque todas hermafroditas, se relacionan entre ellas casi igual que los machos y las hembras de animales unisexuales” (Darwin, 1877). Estos trabajos fueron realizados paralelamente por Hildebrand (1863, 1864, 1865 a y b, 1867, 1871, 1887, 1894, 1899 y

1902), quien estuvo en contacto directo con Darwin, para alcanzar conclusiones similares. Esta interpretación del funcionamiento de la heterostilia ha prevalecido hasta la actualidad (revisada en Barrett y Shore,

2008). Sin embargo, los procesos que han determinado la evolución del polimorfismo han sido objeto de debate en la comunidad científica, y han quedado reflejadas en diversos modelos evolutivos, ampliamente debatidos, particularmente desde la segunda mitad del siglo XX (revisado en Barrett,

1992 y Barrett y Shore, 2008).

Modelos Evolutivos

Una cuestión que ha suscitado gran interés dentro de la comunidad científica ha sido entender las presiones selectivas que han favorecido el establecimiento de la heterostilia. En la actualidad, los modelos que más atención han recibido son los propuestos por Charlesworth y Charlesworth

(1979) y por Lloyd y Webb (1992). El modelo de Charleswoth y Charlesworth

(1979) propone que la situación ancestral a la heterostilia la representa una planta con flores homostilas, en donde las anteras y estigmas se sitúan a la misma altura, autocompatible y con niveles altos de depresión por endogamia. Los autores proponen que mutaciones que determinen la aparición de autoincompatibilidad heteromórfica, seguidas de mutaciones en la altura del estilo y posteriormente de las anteras, determinan la aparición de dos morfos con incompatibilidad heteromórfica y posición recíproca en la altura de verticilos sexuales. El modelo de Lloyd y Webb (1992 a y b) retoma las ideas originales de Darwin y propone que la situación ancestral es una planta con hercogamia de aproximación (estigma situado por encima de las anteras, la situación más frecuente en las angiospermas). Los autores discuten que la aparición de una mutación para la longitud del estilo se seleccionaría a través de la selección negativamente dependiente de la frecuencia y en presencia de polinizadores que sean capaces de depositar polen en el nuevo morfo (Lloyd y Webb, 1992 b). Sin embargo, este nuevo polimorfismo, denominado dimorfismo estilar (e.g., dos formas florales que tan solo se diferencian en la longitud del estilo, mientras que las anteras quedan aproximadamente a la misma altura), sería inestable debido a la falta de precisión en la posición recíproca de los órganos sexuales, que provocaría una pérdida importante de gametos masculinos. El modelo predice que la precisión en la posición de anteras y estigmas (e.g. reciprocidad entre morfos) se adquiriría a través de procesos de selección direccional sobre la posición de las anteras. La aparición del sistema de incompatibilidad heteromórfico se explica a través de su asociación al sistema de cruzamiento, es decir, al mayor éxito relativo de los cruces legítimos frente a los ilegítimos, así como la evitación de la autopolinización a través de la hercogamia. Hasta el presente, hay más casos de estudio que apoyan el modelo de Lloyd y

Webb (1992) que el modelo de Charlesworth y Charlesworth (1979), tanto a escala ecológica como evolutiva (Barrett y Shore, 2008).

Fig. 1. Modelos sobre la evolución de la heterostilia propuestos por Charlesworth y

Charlesworth (1979) y Lloyd y Webb (1992) (dibujo adaptado de Barrett, 1992). Los fenotipos claros presentan polen y estigmas autocompatibles, aquellos que aparecen oscuros presentan polen y estigmas autoincompatibles.

A pesar que el modelo de Charlesworth y Charlesworth (1979) y el de

Lloyd y Webb (1992 a y b) difieren conceptualmente en las presiones selectivas que favorecen la aparición de la heterostilia (depresión por endogamia vs. promoción de la polinización cruzada) y en la situación ancestral (homostilia vs. hercogamia de aproximación), ambos tienen en común que el dimorfismo estilar es un estado intermedio y de transición, que se caracteriza por la presencia de una baja reciprocidad, es decir, poco ajuste en la posición de las anteras con respecto el estigma del morfo contrario. De hecho, los estudios morfométricos muestran frecuentemente variaciones en la reciprocidad, lo que sugiere que la variación en la longitud del estilo y la posición de las anteras de los morfos puede estar sujeta a procesos de selección direccional y estabilizadora (Nishihiro et al., 2000; Ornelas et al.,

2004; Cesaro et al., 2004). La reciprocidad puede afectar a las tasas de cruzamiento legitima e ilegítima entre morfos, tanto en especies con dimorfismo estilar, distilas y tristilas (Baker et al., 2000; Costa et al., 2014). Es más, cuando el sistema de incompatibilidad no está ligado al morfo, las variaciones en la reciprocidad y en las tasas de cruzamiento legítimo e ilegítimo se relacionan con variaciones en las proporciones de morfos entre poblaciones (Baker et al., 2000; Thompson et al., 2003). Por tanto, a la hora de estudiar la evolución de la heterostilia, es importante generar información morfológica detallada para poder determinar correctamente el tipo de polimorfismo presente en las especies, y así interpretar adecuadamente los procesos evolutivos.

El desarrollo de los métodos filogenéticos y de análisis comparado ha permitido mostrar que, en muchos casos, la hercogamia de aproximación y el dimorfismo estilar son situaciones ancestrales a la heterostilia (Pérez et al.,

2004; Graham y Barrett, 2004; Mast y Conti, 2006; Armbruster et al., 2006;

Morris et al., 2007; McDill et al., 2009; Santos-Gally et al., 2012), lo que ha validado el modelo de Lloyd y Webb (1992), aunque Plumbaginaceae sigue quedando como un caso de cierto apoyo al modelo alternativo (Baker, 1966;

Costa, 2017) . Sin embargo, la mayoría de los estudios han adoptado una descripción cualitativa del polimorfismo presente en las especies. Esto puede llevar a errores en la caracterización de las especies. Por ejemplo, algunas especies de Narcissus, Lithodora o Pulmonaria pueden presentar variación en la proporción de morfos en la poblaciones (Baker et al., 2000, Thompson et al., 2012, Ferrero et al., 2011, Brys et al., 2008), hasta el punto de que uno de los morfos no esté presente, lo que puede determinar que las especies se clasifiquen como que presentan solo una forma floral, cuando en realidad presentan dos morfos (Graham y Barrett, 2004, Santos-Gally et al., 2015).

Igualmente, la falta de información morfológica detallada sobre la posición de los verticilos sexuales puede conducir a clasificarlas como homostilas, si no se cuantifican los niveles de hercogamia (McDill et al., 2009). El mismo tipo de error se comente al asumir que las especies que presentan dos o tres morfos son distilas y tristilas respectivamente, independientemente del nivel de ajuste entre los verticilos sexuales (véase más arriba). Esta falta de información en ocasiones ha resultado en una categorización imprecisa de los polimorfismos, lo que conlleva a una interpretación errónea de su significado ecológico y evolutivo (Barrett et al., 1997; Graham y Barrett, 2004;

McDill et al., 2009; pero véase Lloyd et al., 1990 para una interpretación de estos efectos).

Linum como sistema modelo para el estudio de la heterostilia.

El género Linum (Linaceae) fue uno de los primeros grupos en los que se estudió el funcionamiento de la heterostilia. De hecho, tanto Darwin (1862,

1877) como Hildebrand (1863) realizaron experimentos de polinización manual en L. grandiflorum y L. perenne para entender el funcionamiento del polimorfismo. Tras estos trabajos, y ya en el s. XX, otros autores han investigado la variación de la heterostilia en Linum (Laibach, 1921, 1923, 1924, 1925, 1928, 1929, 1930; Fischbach, 1933; Lewis, 1943; Rogers 1963;

Ockendon, 1968; Rogers, 1969, 1971; Dulberger, 1973, 1974; Rogers,1975,

1981, 1982, 1984; Dulberger, 1987, 1992; Armbruster et al., 2006; McDill et al., 2009, 2010, entre otros muchos). En concreto, se sabe que las especies distilas de Linum suelen tener asociado un sistema de incompatibilidad heteromórfico, mientras que las especies con un único morfo son con frecuencia autocompatibles (Lewis, 1943; Dulberger, 1974; Nicholls, 1985;

Murray, 1986). De igual forma, algunos autores han aportado información sobre la altura de estambres y estigmas para caracterizar el polimorfismo

(Darwin, 1863; Dulberger, 1973; Wolfe, 2001; Armbruster et al., 2006). En este sentido, quizás uno de los trabajos que más ha renovado el interés por el género como sistema de estudio para la evolución de la heterostilia, fue el de Armbruster et al. (2006), en donde los autores describieron un tipo de heterostilia nuevo en L. suffruticosum, con importantes implicaciones para el funcionamiento del polimorfismo. A diferencia de la distilia convencional, donde la separación de estilos y anteras ocurre en el plano vertical, en L. suffruticosum, los estambres y estigmas se separan horizontalmente en los dos morfos, observándose una torsión de hacia fuera del verticilo superior y hacia el interior del verticilo inferior (ver capítulo 2). De esta manera, el ajuste entre verticilos sexuales recíprocos ocurre en tres dimensiones, por lo que este tipo de heterostilia se denominó reciprocidad en tres dimensiones.

Armbruster et al. (2006) interpretaron que esta variación probablemente supone una mejora en la transferencia de polen entre morfos, ya que permite la total separación del polen en el cuerpo de los insectos polinizadores

(principalmente del género Usia, Bombyliidae, Diptera).

La descripción de un polimorfismo nuevo en Linum sugiere que probablemente otras especies muestren variación relevante para la interpretación de modelos evolutivos. En concreto, Armbruster et al (2006) concluyeron que la reciprocidad en tres dimensiones evolucionó en un linaje en el que la heterostilia ya había aparecido. Sin embargo, concluyeron esto basándose en un muestreo limitado, tanto al nivel de tipificación del polimorfismo estilar como al nivel de especies incluidas en el estudio filogenético. Más adelante, McDill et al. (2009) aportaron un contexto filogenético más amplio y taxonómicamente integrador (véase más abajo), pero con una clasificación limitada del tipo de polimorfismo (e.g. homostilia vs. heterostilia) y en ocasiones errónea. A pesar de estas limitaciones, este trabajo puso de manifiesto que la heterostilia en Linum parece estar restringida geográficamente a Eurasia y la Cuenca Mediterránea, así como

Sudáfrica. En este sentido, la presente Tesis Doctoral rellena estos huecos de conocimiento ya que (i) aporta información detallada y novedosa sobre la variación en los órganos sexuales al nivel de especies y poblaciones, que permite identificar y tipificar correctamente el tipo de polimorfismo presente; y

(ii) aporta información molecular para poder inferir y reconstruir procesos micro y macroevolutivos. En última instancia, todo esto permite someter a prueba los modelos de evolución de la heterostilia discutidos más arriba.

Objetivos de la Tesis Doctoral

1. Caracterizar la variación morfológica en la posición de estambres, estigmas y hercogamia en especies del género Linum para describir cuantitativamente los polimorfismos sexuales y los niveles de reciprocidad entre morfos dentro y entre especies. Esta información es necesaria para describir polimorfismos nuevos, en caso de que la variación que se encuentre no se ajuste a tipos morfológicos descritos (Capítulo 2). Para cumplir este objetivo, se realiza un esfuerzo por incluir la mayor parte de las especies descritas con algún tipo de polimorfismo y, para aquellas especies con un muestreo limitado, se consulta la información disponible en floras regionales

(véase más abajo). Este objetivo pretende aportar información detallada sobre la variación floral, más allá de clasificaciones cualitativas clásicas, en las que se adopta una perspectiva sólo tipológica, no funcional, de la variación del polimorfismo, en las que las especies se han clasificado como homostilas y heterostilas (véase Font Quer, 1979 para un ejemplo).

2. Generar una filogenia molecular que incluya el mayor número de especies del género, particularmente de las regiones biogeográficas con mayor concentración de especies polimórficas, y realizar una reconstrucción macroevolutiva del polimorfismo estilar y rasgos asociados (Capítulo 3). Esto permite someter a prueba los modelos de evolución de la heterostilia más discutidos por la comunidad científica (véase arriba). Este objetivo se nutre de los resultados obtenidos en el Capítulo 2, y representa un avance respecto al estudio de McDill et al. (2009). Aunque en dicho estudio los autores presentaron un contexto evolutivo explícito, el muestreo limitado, así como la clasificación conservadora del polimorfismo, no permitió inferir con precisión la situación ancestral al polimorfismo, ni el número de eventos evolutivos de aparición y pérdida del polimorfismo, y de otros rasgos asociados.

3. Estudiar a escala poblacional (esto es, microevolutiva) los procesos que han permitido la evolución de la reciprocidad en tres dimensiones en el complejo L. tenuifolium aggr., que incluye L. tenuifolium s.s. y el grupo de especies de L. suffruticosum (Martínez Labarga et al. 2015, ver Capítulo 4).

En concreto, este objetivo ha requerido el muestreo del complejo en toda la

Cuenca Mediterránea, para así determinar sus relaciones evolutivas y filogeográficas, y poder caracterizar con precisión el polimorfismo estilar y el sistema de incompatibilidad, particularmente en la zona de contacto de las dos especies.

4. Esclarecer el estado taxonómico de L. setaceum var. bicolor f. robusta, y elevarlo al nivel de especie como L. flos-carmini (Ruiz-Martin et al., 2015).

En concreto, este caso de estudio es un ejemplo que pone de manifiesto la necesidad de estudios taxonómicos en Linum y sus implicaciones evolutivas, lo que indica que los procesos microevolutivos son críticos para poder entender procesos de especiación asociados al funcionamiento de las estrategias reproductivas.

Estado del conocimiento de la sistemática del género Linum

Para cumplir los objetivos de la presente Tesis Doctoral, y debido a la falta de una monografía del género, ha sido necesario usar floras regionales para generar listas de especies y poder identificar las regiones geográficas con mayor número de especies. En este sentido, McDill et al. (2009) ofrecieron un marco sistemático que se usó en el presente trabajo.

El género Linum pertenece a la familia Linaceae, que incluye además otros 13 géneros, ocupando una gran diversidad de ambientes, desde especies pertenecientes a climas templados y mediterráneos, como es el caso de Linum (Ockendon, 1968; Rogers, 1981) o el género Hesperolinum en

California (Sharsmith, 1961), hasta árboles en bosques húmedos y de tierras bajas en la cuenca del Amazonas (Roucheria Planch. y Hebepetalum Benth.,

Jardim, 1999). Linaceae se divide en dos subfamilias (Dressler et al., 2014):

1) Linoideae, que incluye Linum y los otros géneros de especies anuales y perennes y distribución principalmente templada, y 2) Hugonioideae, con

árboles tropicales, arbustos y lianas. Además de su diversidad ecológica y taxonómica, la familia muestra un rango de variación en caracteres de interés biológico y evolutivo, como por ejemplo el sistema de reproducción (ambas subfamilias incluyen especies monomórficas y heterostilas).

Linum es el género más diverso de la familia Linaceae, con aproximadamente 180 especies (The Plant List, 2013: 141 especies, McDill et al., 2009: 180 especies, Mabberley, 2008: 230 especies) distribuidas por todo el mundo, de las cuales aproximadamente 70 se localizan en la cuenca mediterránea y 14 en la región del Cabo en Sudáfrica (Rogers, 1981), lugares asociados a la presencia de polimorfismos sexuales (McDill, 2009). El género ha sufrido varias revisiones taxonómicas. En concreto, el primer tratamiento mundial fue realizado por Winkler (1931), que se basó en gran parte en el trabajo de Planchon (1847, 1848). Ambos autores proporcionaron la base para las cinco "secciones" de Linum, reconocidas en la mayoría de las obras florísticas y taxonómicas regionales, como por ejemplo las revisiones de las especies americanas y sudafricanas (Rogers 1963, 1981; Mildner y Rogers,

1978), Flora Europaea (Ockendon y Walters, 1968) y Flora de Turquía y las islas del Egeo (Davis, 1967). La flora de la URSS (Yuzepchuk, 1974), que incluye un gran número de especies desde Europa oriental hasta Asia oriental, adoptó un sistema de clasificación mucho más analítico, también basado en gran parte por Planchon (1847, 1848). Todo esto sirvió de base para la clasificación más reciente realizada del género Linum (McDill et al.,

2009). Para la Península Ibérica, la revisión más reciente es la de Martínez

Labarga et al., (2015), que usa una nomenclatura de las secciones más clásica aunque muy parecida a la utilizada por McDill et al., (2009) y en ella se incluye la gran complejidad taxonómica que presenta el grupo de linos blancos heterostilos, L. suffruticosum s.l., por su extraordinaria variabilidad, lo que contrasta con la homogeneidad del próximo L. tenuifolium, monomórfico y de mayor área de distribución por el noreste de la Cuenca Mediterránea.

Para verificar las especies confinadas a la Cuenca del Mediterráneo se ha seguido la nomenclatura del inventario de plantas vasculares circunmediterráneas “Mediterranean Check List”

(ww2.bgbm.org/mcl/home.asp). Se han consultado varias floras regionales, como “Flora Iberica” (Martínez Labarga et al., 2015), el “Catalogue des plantes vasculaires rares, menacées ou endémiques du Maroc” y “Flore pratique du Maroc” (Fennane y Tattou 1998, 2007) para los linos de

Marruecos, y la “Nouvelle flore de l’Algerie: et des regions desertiques meridionales” (Quezel y Santa, 1963) para los localizados en Argelia. Otras obras que se han consultado han sido la flora de Italia (Pignatti, 1982;

Chichiricco y Tammaro, 1980), flora de la URRS (Yuzepchuk, 1974), flora de

Oregón y California (Abrams, 1951), flora de norte América (Small, 1907), flora de las montañas de Grecia (Strid, 1986), flora de Australia (Bentham y

Mueller, 1863), “Flora Orientalis” que comprende de Grecia a Egipto

(Boissier, 1867), flora de Hungría (Baksay, 1956), flora de Turquía y de las islas del mar Egeo (Davis, 1967), la “Flora Europea” (Ockendon y Walters,

1968), “Flora Zambesaica” que comprende las áreas de Botswana, Zambia,

Rhodesia y Mozambique (Robson, 1963), y “Flora of China” (Liu y Zhou,

2008). En total se han incluido 95 especies de 28 regiones (ver Tabla 1 del capítulo 3). De estos 95 taxones de Linum, 44 fueron muestreados alrededor de la Cuenca del Mediterráneo (30 sps.) y Sudáfrica (14 sps.) entre 2009 y

2013. Veintiún taxones de los 95 totales fueron obtenidos de colecciones de herbario (“SEV” del herbario de Sevilla, “MA” del Real Jardín Botánico de

Madrid y “E” perteneciente al Royal Botanic Garden de Edinburgh). Los otros

30 taxones (información de las secuencias moleculares: ITS, ndhF5-8, trnC-

F, MatK) fueron obtenidos de GenBank (ver McDill et al., 2009 y 2010).

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Variación de la heterostilia y polimorfismos sexuales relacionados en Linum L. (Linaceae)

Resumen

Los polimorfismos sexuales que implican una variación discreta en la altura y/o la posición de los estilos con respecto a las anteras, han sido reportados en al menos 28 familias de plantas angiospermas no relacionadas entre sí (Barrett et al.,

2000 a, b). Una de ellas es la familia Linaceae perteneciente al orden Malpighiales, que consta de 14 géneros. El género con la distribución más amplia y que presenta un mayor número de especies es Linum (alrededor de 180 sp., McDill et al., 2009).

Según la literatura, en el género Linum se encuentran varios tipos de formas florales con respecto a la hercogamia de sus órganos sexuales (homostilia, monomorfismo, dimorfismo estilar, heterostilia: Darwin 1877, Armbruster et al., 2006; McDill et al.,

2009), siendo el que llama más la atención la heterostilia, que es el polimorfismo estilar más común, más estudiado y que ha sido objeto de debate desde los estudios de Darwin.

Tras un extenso trabajo de campo se muestrearon y analizaron un total de 50 poblaciones de 36 taxones, tanto de la cuenca del mediterráneo como de la Región del Cabo en Sudáfrica. Tras la realización de análisis morfométricos detallados de los rasgos sexuales de las flores, se describieron hasta ocho condiciones estilares.

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la subjetividad de la anterior caracterización del polimorfismo estilar basada en la inspección visual. El trimorfismo estilar, donde en la misma población encontramos diferentes individuos de flores brevistilas, medistilas y longistilas sin variación recíproca en la posición de las anteras, no se conocía en este género excepto por una única especie L.

1 subbiflorum (Yuzepchuk, 1974), un endemismo transcaucásico descrito en la flora de la antigua URRS. En el presente trabajo se describe otra evidencia de trimorfismo en varias subespecies de L. hirsutum, natural de Turquía. Toda esta información se usará para interpretar la evolución de la heterostilia en una filogenia completa que incluya la mayoría de especies de Linum asociadas a climas mediterráneos de diferentes zonas del mundo (capítulo 3).

Palabras clave: Polimorfismos sexuales, Linum, heterostilia, trimorfismo

Introducción

La heterostilia y los polimorfismos estilares asociados evolutivamente, definidos por la presencia de dos o tres morfos estilares con disposición recíproca en la alturas de anteras y estigmas, es una condición relativamente rara al nivel de especie, género y familia en las plantas con flores. En concreto, no supera el 10% en ninguna de estas categorías (J. Arroyo, comunicación personal); sin embargo, su presencia aparece bastante dispersa en los linajes. Como ya se ha mencionado anteriormente (Capítulo 1: Introducción general), la heterostilia es un polimorfismo en ocasiones de difícil clasificación debido a la variación morfológica intra e interespecífica (Armbruster et al., 2006; Ferrero et al., 2011) y cuya separación a veces es problemática, ya que depende de cómo se mida la reciprocidad entre

órganos sexuales (Richards y Koptur, 1993; Sánchez et al., 2013; Armbruster el at.,

2017). A pesar de ser el polimorfismo estilar más estudiado, llama la atención la escasa información disponible sobre la diversidad morfológica en los grupos donde

2 hay heterostilia, más allá de la descripción de la presencia de morfos florales.

En las angiospermas, la heterostilia se ha descrito de manera independiente en 28 familias (Barrett y Shore, 2008). Una de éstas es la familia Linaceae, perteneciente al orden Malpighiales y formada por 16 géneros (The Plant List, 2013) aunque estudios recientes sugieren que estos deben ser condensados en siete

(APG, 2012). El género más diverso es Linum, que incluye unas 180 especies aproximadamente con una distribución geográfica cosmopolita, aunque la mayor diversidad de especies se concentra en la cuenca mediterránea y Asia Menor

(McDill et al., 2009). Muchas de las especies de Linum presentan aparentemente heterostilia y otros polimorfismos estilares asociados. De hecho, Darwin realizó experimentos de polinización cruzada en L. grandiflorum y L. perenne con los que describió el sistema de reproducción de las especies e interpretó su funcionamiento

(Darwin, 1863, 1877), observando ya entonces variaciones morfológicas sobre el modelo típico en L. grandiflorum, que parecía más bien dimórfico estilar con baja reciprocidad, a tenor de sus descripciones y dibujos (Darwin, 1864, 1877; Fig. 4 p.

82, pp. 252-253). Estos trabajos han estimulado el interés por entender mejor la variación natural de las especies de Linum, lo que ha generado un conocimiento relativamente aceptable de la biología reproductiva de algunas especies (East,

1940; Lewis, 1943; Nicholls, 1985; Dulberger, 1992), caracteres ancilares

(subordinados) asociados a cada morfo, tales como tamaño del polen, cantidad de polen, y diferencias en la forma de los estigmas (Dulberger, 1974, 1992; Rogers,

1971, 1979, 1985; Murray, 1986), así como el uso de la heterostilia como carácter taxonómico (Ockendon, 1968; López-González, 1979; Ruiz-Martín et al., 2015). Es más, el estudio de las especies ha permitido describir casos nuevos de heterostilia.

En concreto, la reciprocidad en tres dimensiones se caracteriza por la separación

3 horizontal de los filamentos de las anteras y los estilos, así como por la presentación de los órganos recíprocos, que ocurre de tal manera que los órganos superiores se presentan girando hacia fuera, mientras que los órganos inferiores se presentan girando hacia dentro, variación que se ha interpretado como un mecanismo para incrementar la tasa de transferencia legítima de polen (Armbruster et al., 2006). Por otro lado, Dulberger (1973) describió la existencia de una doble altura en los estambres de L. pubescens, que asoció a una posible tristilia incipiente, como hizo

Fischbach (1933) para L. hirsutum, el cual encontró una diferencia en la altura de los estambres relacionada con una sutil diferencia en el tamaño y fertilidad de los granos de polen, aunque no mencionó la existencia de tres morfos. Otra mención al trimorfismo ocurre en la especie L. subbiflorum, descrita como endémica del

Cáucaso en la flora de la URSS (Yuzepchuk, 1949). Según el autor, poblaciones de esta especie presentan los morfos florales L, B y M típicos. En otras especies de

Linaceae, como es el caso de Hugonia serrata Lam. (Thompson et al., 1996; Meeus et al., 2011) sí se ha descrito apropiadamente la tristilia típica, como ya había apuntado pero no confirmado Lloyd et al. (1990). La variación presente en Linum puede permitir someter a prueba hipótesis evolutivas sobre la aparición y mantenimiento de la heterostilia, tal y como ya se ha hecho en grupos como

Narcissus (Graham y Barrett, 2004; Pérez-Barrales et al., 2006), Lithodora (Ferrero et al., 2009) y Glandora (Ferrero et al., 2011). De hecho, ya han aparecido algunos estudios (McDill et al., 2009) en los que se evalúan las transiciones evolutivas que han conducido a la aparición de la heterostilia o a su pérdida, aunque la perspectiva sintética (heterostilia vs homostilia siguiendo literalmente la terminología de las obras sobre taxonomía del grupo) tan solo permite una interpretación limitada sobre la evolución de la heterostilia en Linum. En concreto, el trabajo de McDill et al.

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(2009) recoge tan sólo un 25% de las especies que integran el género (aunque todas las secciones taxonómicas y regiones geográficas están representadas). Sin embargo, la mayor limitación es la clasificación que los autores hacen del polimorfismo, en el que las especies se categorizan en homostilas y heterostilas, sin realizar mediciones sobre la variación en la posición de anteras y estigmas, o variaciones en la expresión del polimorfismo (pero véase Armbruster et al., 2006).

En este punto, es necesario anotar un detalle terminológico. Muchos autores, especialmente los de orientación más taxonómica, consideran el término "homostilo" como opuesto a "heterostilo", es decir, que no presenta variación polimórfica estilar en la población: todos los estilos tienen aproximadamente la misma longitud. De hecho, este es el significado que Font Quer (1979) en su “Diccionario de Botánica” atribuyó al término “homostilia”. Sin embargo, los estudiosos de la heterostilia en tiempos recientes consideran este término sólo apropiado para describir una situación en la que no hay polimorfismo discreto y tampoco hercogamia. De esta forma se evitan los problemas de confusión con otras situaciones de significado evolutivo como es la presencia de hercogamia reversa y de aproximación (Lloyd y

Webb, 1986; Lloyd et al., 1992). Por tanto, al usar textos taxonómicos o florísticos, donde el uso del término homostilo es el tradicional, es necesario tomarlo con cautela y comprobar si las flores presentan hercogamia o no, lo cual justifica la necesidad del estudio morfométrico realizado en este capítulo.

La finalidad de este capítulo de la presente Tesis Doctoral consistió en describir con detalle los tipos de polimorfismo estilar presentes en las especies de

Linum. En concreto, los objetivos a cumplir fueron:

1) Describir y clasificar con precisión los tipos de polimorfismo que las

especies presentan y la variación en la proporción de morfos,

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poniendo mayor énfasis en las regiones geográficas que acumulan

mayor diversidad de especies, como es el caso de la cuenca

mediterránea y la región de El Cabo.

2) Describir la variación en la posición de los verticilos sexuales en los

morfos, con la idea de utilizarla para estimar la reciprocidad de las

poblaciones y especies.

3) Determinar si la variación en la proporción de morfos de las

poblaciones y especies se correlaciona con la reciprocidad, con el

objetivo de evaluar si desviaciones de la proporción 1:1 ocurren con

más frecuencia en especies con baja reciprocidad.

Los resultados de este capítulo se ponen en el contexto de la información disponible sobre la variación de la heterostilia y polimorfismos sexuales relacionados descritos en otros grupos de plantas, además de la información adicional sobre aspectos más detallados de la biología de la heterostilia (e.g., sistema de incompatibilidad, caracteres ancilares, polinización) en Linum, que se han obtenido a partir de la información disponible en la literatura. Además, los resultados obtenidos en el presente capítulo se utilizarán en el capítulo 3 para someter a prueba los modelos evolutivos discutidos. Para una lista completa de los taxones estudiados, con las autoridades correspondientes, véase Tabla S1 (en material suplementario).

Material y Métodos

Entre 2009 y 2013 se realizaron diversas campañas de recolección por la cuenca mediterránea, Europa central y la región de El Cabo en Sudáfrica, con el objetivo de recolectar el mayor número posible de poblaciones de las especies del género Linum localizadas en el área donde se sabe que se concentra la heterostilia.

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Otras regiones fueron muestreadas con ayuda de colaboradores (véase

Agradecimientos). En total se recolectaron flores en 50 poblaciones de 36 taxones.

En cada población se recogió una flor por planta en un máximo de 100 plantas separadas al menos un metro para evitar recolectar el mismo individuo dos veces

(aunque la multiplicación vegetativa es rara en el género). En poblaciones con menor número de individuos, se recogieron flores de todos los individuos en flor. Las flores se conservaron en etanol al 70% para su posterior análisis biométrico en el laboratorio, donde se determinó el morfo floral de cada individuo para calcular la proporción de morfos por población, cuando los morfos se pudieron distinguir a simple vista (la mayoría de las especies). En las especies con dos o más morfos, se midieron hasta 30 flores por morfo, mientras que en las especies con un solo tipo floral, se midieron hasta 30 flores. En el caso de las poblaciones con menos de 30 plantas en flor, se recolectó una flor madura de todos los individuos presentes. La

Tabla S1 incluye la lista de especies y autores, poblaciones recolectadas, el número de flores por morfo, así como los detalles de la localización geográfica. La nomenclatura seguida para los taxones presentes en este estudio ha sido extraída de las siguientes obras: 1) “Flora Europaea” (Ockendon y Walters, 1968), para los linos europeos, 2) para los linos americanos y sudafricanos se usaron los trabajos de Rogers (1963, 1981), y Mildner y Rogers (1978) respectivamente, 3) la flora de

Turquía y las islas del Egeo (Davis, 1967) se usó para las especies turcas, 4) la flora de la URRS (Yuzepchuk, 1974), se usó para las especies desde Europa oriental hasta Asia oriental, y 5) para las especies de Marruecos se usó Valdés (2002) y

Fennane y Tattou (1998). Para verificar las especies confinadas a la cuenca del

Mediterráneo y decidir casos conflictivos en la taxonomía, se usó el inventario de plantas vasculares circunmediterráneas Mediterranean Check List (Greuter et al.,

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última actualización: Agosto 2016).

Para determinar si la proporción de morfos por población difirió significativamente de 1:1, se usó el test G y se aplicó el ajuste de Bonferroni para corregir el nivel de significación de p, dado que se realizaron comparaciones múltiples (Sokal y Rohlf, 1981). Este valor crítico de p, estimado como p ≤ α/m, es una reducción del nivel de significación, la división del nivel alfa habitual (0,05) por el número total de comparaciones equivalentes de dos en dos (m).

En el laboratorio, las flores se fotografiaron con un estereomicroscopio Zeiss

Stemi 2000C y cámara fotográfica AxioCam ERc 5s (Zeiss). Las medidas florales se realizaron sobre las fotografías digitales, usando el programa ImageJ 1.44p

(Abramoff et al., 2004). Se tomaron dos medidas por cada flor de la siguiente manera: 1) altura de anteras, medida desde la base la flor (en la zona donde se unen el pedicelo y el cáliz) hasta el punto de inserción del filamento estaminal en la antera, que se encuentra a la mitad del área de esta (no se midieron las anteras ya que se desprenden de los filamentos con facilidad una vez conservados en alcohol y varían en su tamaño según el grado de maduración) y, 2) altura del estigma, medida desde la base de la flor hasta la mitad de los estigmas (Fig. 1). La hercogamia floral se estimó como la diferencia entre estas dos medidas. Las flores de la mayoría de las especies de Linum presentan cinco filamentos y cinco estilos dispuestos radialmente y, a simple vista, los órganos de cada verticilo se encuentran aproximadamente a la misma altura, por lo que se midió tan sólo uno de los filamentos y estigmas (véase Fig. 1).

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Fig.1. a) Medidas tomadas para caracterizar la variación en la longitud de los verticilos sexuales de cada flor, para cada una de las poblaciones monomórficas o dimórficas. b) Medidas tomadas (una por cada estambre) desde la base de la flor al punto de inserción del filamento en la antera, desde la base de la flor al centro de los estigmas, para definir las poblaciones trimórficas (1= Línea de inserción floral; 2= Distancia de la base de la flor a la altura media de las anteras; 3= Distancia desde la base de la flor a la altura media de los estigmas).

Para L. hirsutum se midió la posición de los cinco estambres en cada flor ya que se observó que éstos estaban dispuestos a distintas alturas de una manera evidente (véase Fig. 1).

Clasificación de los polimorfismos y estimación de la reciprocidad

Para las especies dimórficas, se realizó un ANOVA para comparar la longitud de estambres, la altura de estigmas y hercogamia entre morfos, y se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (nuevo valor de p=0,0167).

En las especies monomórficas, se realizó un ANOVA para comparar la altura de las anteras y estigmas, y así poder determinar la hercogamia. Toda esta información se usó para hacer una clasificación de los tipos morfológicos de las especies de la siguiente manera: 9

1. Homostilia, especies en las que se observa un único morfo floral donde las

anteras y los estigmas se presentan a la misma altura.

2. Hercogamia de aproximación o reversa, especies en las que se observa un único

morfo, donde el estigma se dispone por encima o por debajo del verticilo de

anteras respectivamente.

3. Dimorfismo estilar, especies en las que se observan dos morfos (“L”: Longistilo y

“B”: Brevistilo, ver Introducción general) que difieren en la posición del estigma,

pero que presentan las anteras virtualmente a la misma altura.

4. Heterostilia, incluyendo:

4.1. Distilia convencional, similar a la presente en especies de Primula

4.2. Distilia en tres dimensiones, tal y como se describió en L. suffruticosum

4.3. Tristilia, en especies en las que se observan o tres morfos (“L”: Longistilo;

“M”: Medistilo y “B”: Brevistilo) con una posición aproximadamente recíproca

entre ellos en la posición de las anteras y estigmas (véase Figura 13).

Para estimar la reciprocidad de las especies con polimorfismo, se usaron el

índice de reciprocidad relativa de Richards y Koptur (1993) y el índice de reciprocidad de Sánchez et al. (2013). El índice de Richards y Koptur (1993) se estima de la siguiente manera:

(µ altura de las anteras – µ altura estigma recíproca)/ (µ altura de anteras + µ altura estigmática recíproca).

Lo que permite obtener un valor de reciprocidad relativa respecto al verticilo superior e inferior, independientemente del morfo. Valores cercanos a “0” indican que la especie tiene una alta reciprocidad. Con propósito comparativo, se incluyen especies con un índice de reciprocidad relativa tomado de la literatura: Anchusa officinalis (Philipp y Schou, 1981); Guettarda scabra (Richards, 1993); Hedyotis

10 nigricans (Bahadur, 1970a); Bauvardia ternifolia, Psychotria poeppigiana, Psychotria chiapensis (Faivre y McDade, 2001); Pentas lanceolata (Bahadur, 1970b);

Palicourea petiolaris, Palicourea fendleri (Sobrevila et al., 1983); Quinchamalium chilense (Riveros et al., 1987); Glandora diffusa, Glandora moroccana, Lithodora hispidula subsp. hispidula, Lithodora oleifolia (Ferrero et al., 2009, 2011);

Nymphoides montana (Haddadchi., 2013); Narcissus albimarginatus, Narcissus calcicola (Pérez-Barrales et al., 2004).

El índice de reciprocidad de Sánchez et al. (2013) varía entre 0 y 1, y los valores próximos a 1 indican altos valores de reciprocidad, mientras que valores cercanos a 0 indican una baja reciprocidad. Los detalles del desarrollo matemático del índice se encuentran en Sánchez et al. (2008), mientras que en Sánchez et al

(2013) los autores realizaron modificaciones para poder calcular la reciprocidad en especies tristilas. Una de las ventajas de este índice es que permite estimar la reciprocidad con respecto a todas las anteras, lo que facilita incluir variaciones en la reciprocidad relacionadas con la posición a veces variable de los estambres, como es el caso de las especies del género Lithodora y Glandora (Sánchez et al., 2008,

Ferrero et al., 2009).

Para comprobar si existe una correlación entre ambos métodos de estimación de la reciprocidad se calculó la distancia euclídea para cada punto, en el caso del

índice de Richards y Koptur, obtenida mediante la siguiente fórmula (distancia entre dos puntos A (xa, ya) y B (xb, yb) en un plano):

AB = √ (xb - xa)2 + (yb - ya)2

Posteriormente se midió la correlación entre ambos índices, mediante un análisis de correlación de Pearson.

En el caso de Linum, para comprobar si la posición de las cinco anteras es

11 similar, se eligió una población de L. suffruticosum de entre las que no se observó una variación fuerte en la altura de las anteras dentro de la flor (nº 34, Tabla S2) y se midieron todos los filamentos para así estimar el índice de reciprocidad con todas las medidas hechas por flor. En ambos casos se obtuvo un valor de 0,85 y se decidió medir solamente la posición de una de las 5 anteras para todos los casos de heterostilia (véase arriba).

Variación intraespecífica

Para las especies en las que se recolectó más de una población, se realizaron comparaciones interpoblacionales para determinar el nivel de variación en la expresión del polimorfismo al nivel de especie. En concreto, para las especies dimórficas L. austriacum, L. tenue y L. suffruticosum (Tabla 1) se realizó un ANOVA de dos factores para cada especie, en los que la variable dependiente fue el rasgo floral (altura de anteras, altura de estigma y hercogamia) y los factores fueron la población, el morfo y el término interacción.

En las especies monomórficas L. africanum, L. brevistylum, y L. tenuifolium se realizó un ANOVA de un factor por especie, en donde la variable dependiente fue los rasgos florales (véase arriba), y la variable independiente fue la población (véase

Tabla S2 para los detalles de las poblaciones). Para estos análisis, se aplicó la corrección de Bonferroni para múltiples comparaciones, estableciendo el nuevo valor crítico de p=0,0167.

Relación entre la variación en la proporción de morfos y la reciprocidad.

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Para evaluar si las desviaciones en la proporción de morfos de las especies y poblaciones se relacionan con la reciprocidad, se estimó el coeficiente de correlación de Pearson entre la proporción de morfos observada y el índice de reciprocidad de Sánchez et al. (2013) obtenido.

Resultados

La información correspondiente a las 50 poblaciones pertenecientes a 36 taxones estudiados se encuentra detallada en las Tablas S1 y S2, donde se incluye el tipo de polimorfismo asignado, la proporción de morfos, y las medidas en que se basan los análisis realizados. En la Tabla S3 aparecen los resultados de los

ANOVAs para la comparación de la altura de los órganos florales y la hercogamia entre morfos de las especies dimórficas, y en la Tabla S4 se incluyen los resultados de los ANOVAs para comparar la altura de las anteras y estigmas (hercogamia) en las especies monomórficas. En la tabla 2 se representan los resultados de los

ANOVAs de especies dimórficas de las que se ha muestreado más de una población para ver si hay diferencias entre las poblaciones en la expresión del dimorfismo. Igualmente, se ha comparado la altura de estambres y estigmas en especies monomórficas (Tabla 3) en las que hemos muestreado más de una población a lo largo de su distribución. Los análisis de las especies inicialmente descritas como dimórficas mostraron diferencias estadísticamente significativas entre morfos para la altura de las anteras y de los estigmas, exceptuando L. grandiflorum, especie en la que la altura de las anteras no varió entre morfos

(véanse Tabla S2 y S3).

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Tabla 1. Selección de las poblaciones de L. suffruticosum L. para cuantificar la variación floral

intraespecífica a lo largo de su distribución.

Prop. G- Media sd Nº Reciprocidad Índice de Morfos Test hercogamia hercogamia Localidad muestra relativa (L/B) reciprocidad (L/B) (p) (L/B) (L/B)

34 49/53 0,69 1,97/-1,07 0,27/0,28 -0,083/0,022 0,851 Alora (Málaga, España)

Sierra de Gádor (Almería, 35 44/36 0,37 1,74/-2,15 0,36/0,5 -0,013/0,054 0,892 España)

36 50/57 0,50 1,44/-1,46 0,61/0,39 0,013/0,028 0,831 Annot (Francia)

37 49/53 0,69 3,28/-2,57 0,57/0,41 -0,045/0,021 0,893 Targuist (Marruecos)

Albalate de Zorita 38 53/47 0,55 2,29/-1,89 0,35/0,34 -0,048/0,033 0,906 (Guadalajara, España)

Tabla 2. Resultados de los ANOVAs para la comparación de la longitud de los órganos sexuales

entre morfos de especies dimórficas de las que se han muestreado varias poblaciones. El valor de

“p” tras la corrección de Bonferroni (0,05/3) fue 0,016 (en negrita las diferencias significativas).

Poblaciones Altura de Longitud de Hercogamia

Estigma Estambre

L. austriacum F g.l. p F g.l. p F g.l. p

Población 7,084 2 0,001 36,947 2 <0,001 50,73 2 <0,001

morfo 1199,158 1 <0,001 1784,116 1 <0,001 105,299 1 <0,001

localidad * morfo 19,237 2 <0,001 6,015 2 0,003 9,814 2 <0,001

L. suffruticosum

Población 564,459 4 <0,001 559,775 4 <0,001 104,75 4 <0,001

morfo 1309,465 1 <0,001 543,282 1 <0,001 20,354 1 <0,001

localidad * morfo 21,145 4 <0,001 11,011 4 <0,001 35,969 4

L.tenue

Población 129,433 4 <0,001 71,946 4 <0,001 139,741 4 <0,001

morfo 2631,372 1 <0,001 1253,057 1 <0,001 92,717 1 <0,001

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localidad * morfo 35,578 4 <0,001 34,418 4 <0,001 6,073 4 <0,001

Tabla 3. Resultados de los ANOVAs para comparar la altura de las anteras y estigmas en las

especies monomórficas, de las que se ha muestreado más de una población. El valor de “p” tras la

corrección de Bonferroni (0,05/3) fue 0,016 (en negrita las diferencias significativas).

Estigma Antera Hercogamia

Poblaciones F g.l. p F g.l. p F g.l. p

L. africanum 63,974 1 <0,001 107,380 1 <0,001 8,100 1 0,005

L. esterhuysenae 38,173 1 <0,001 36,634 1 <0,001 4,116 1 0,048

L. tenuifolium 0,564 1 0,456 4,213 1 0,045 10,177 1 0,002

L.brevistylum 4,266 1 0,044 0,171 1 0,681 9,972 1 0,002

La comparación de la hercogamia entre morfos reveló que la mayoría de

especies muestran diferencias significativas, exceptuando L. capitatum, L.

floscarminii, L. hirsutum subsp. spathulatum, L. tenue de Argelia y L. mumbyanum

(véanse Tabla S3 y S2). En las especies monomórficas se encontraron diferencias

estadísticamente significativas en la altura de las anteras y estigmas, lo que significa

que tiene algún grado de hercogamia, excepto en L. bienne (véase Tabla S4 y S1).

Según estos resultados, a continuación se presenta asignación de los taxones al

tipo de polimorfismo en relación a la variación en la posición de los verticilos

sexuales y morfos (Véanse Figuras 2-10):

1. Monomorfismo sin hercogamia (homostilia) (Fig. 2.), donde ambos verticilos

(estigmas y anteras) están a la misma altura, sin separación entre sí; es decir, no

hay hercogamia entre los verticilos sexuales. La única especie que presenta

monomorfismo sin hercogamia en este estudio es L. bienne, especie descrita como

homostila en “Flora Europaea” (Ockendon, 1968). 15

Fig. 2. Monomorfismo sin hercogamia de Linum bienne: a) imagen de L. bienne (Thomas

Schoepke; www.plantpictures.com.; b) Gráfica mostrando la variación en la altura de los órganos masculinos y femeninos en la población 10 (Tabla S1, □ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos están ordenados en orden decreciente con respecto a la altura de los estigmas

(N=12).

2. Monomorfismo con hercogamia, que se subdivide en dos tipos.

2.1 hercogamia de aproximación (Fig. 3), es decir, todas las flores de la misma población presentan los estigmas por encima de los estambres. Las especies que presentan monomorfismo con hercogamia de aproximación dentro de este estudio son: L. africanum, L. brevistylum, L. esterhuysenae, L. gracile, L. hologynum,

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L. macraei, L. pungens, L. thunbergii, y L. villosum. Estas especies estaban descritas como homostilas (Tutin et al., 1976, Rogers, 1978, 1981), pero existe una separación clara entre los verticilos sexuales (véanse los valores de hercogamia en la Tabla S2). También se incluyen aquí L. tenuifolium, descrita como homostila en

“Flora Europaea” (Ockendon, 1968), especie en la que además se observó una evidente separación de los estambres y estigmas en el eje horizontal en flores frescas, pero que no se pudo medir al conservar las flores en alcohol 70% (Fig. 4.).

Fig. 3. Hercogamia de aproximación en Linum africanum correspondiente a la población nº 4 (ver en Tabla S1). a) Flor de L. africanum sin pétalos conservada en alcohol 70º; b) Flor de L. africanum recién colectada. Nótese la hercogamia en el eje vertical de la flor (fotos realizadas por J. Ruiz-

Martín); c) Gráfica mostrando la variación en la altura de los órganos masculinos y femeninos (□ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas (N=32). d) Distribución de la altura de los estigmas en la población.

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Fig. 4. Linum tenuifolium correspondiente a la población nº 45 (véase Tabla S1). a) Flor de L. tenuifolium sin pétalos conservada en etanol 70º. En ella no se percibe bien la hercogamia en el eje horizontal debido a la conservación; b) Flor de L. tenuifolium recién colectada. Nótese la hercogamia en el eje horizontal; c) Gráfica mostrando la variación en la altura de los órganos masculinos y femeninos (□ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas (N=30). d)

Distribución de la altura de los estigmas en la población. No se pudieron realizar medidas horizontales para caracterizar este tipo de hercogamia, presentada por esta especie, ya que los verticilos sexuales se retraen cuando son conservadas las flores en etanol 70º. Aun así la hercogamia en el eje vertical es patente en la gráfica y en la fotografías (realizadas por J. Ruiz-

Martín).

2.2. Hercogamia reversa (Fig. 5.), es decir, todas las flores de la misma población presentan los estigmas por debajo de las anteras. Esta situación es rara y se observó sólo en L. nodiflorum en una población del sur de Italia. Además, se comprobó visualmente esta característica en otras cinco poblaciones de Turquía

18

(100 individuos de cada población), corroborándose esta situación en todas las flores.

Fig. 5. Hercogamia reversa en Linum nodiflorum correspondiente a la población nº 30 (ver en Tabla

S1). a) Flor de L. nodiflorum sin pétalos conservada en alcohol 70º. Nótese la disposición de las anteras por encima de los estigmas (foto realizada por J. Ruiz-Martín); c) Gráfica mostrando la variación en la altura de los órganos masculinos y femeninos (□ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas (N=11). c) Distribución de la altura de los estigmas en la población.

3. Dimorfismo estilar: esta situación comprende plantas con flores “L” y “B” en la misma población, sin que varíe de forma significativa la altura de las anteras. Este polimorfismo se observó en L. grandiflorum (Fig. 6). En este caso, se estudió una

19 población cultivada en un jardín, como ocurrió con las plantas utilizadas por Darwin

(1877), pues no se ha podido localizar en el campo (Argelia, y tal vez en el Este de

Marruecos (pliegos del herbario), donde no se encontró a pesar de haberla buscado por la zona). Esta población aparece como isoplética, al no haber desviación significativa de la igualdad de proporción de los morfos (G (p)= 0,273) y presenta un valor de índice de reciprocidad de Sánchez et al. (2013) de 0,787. En la gráfica del

índice de reciprocidad relativa de Richards y Koptur (1993), L. grandiflorum (nº 21) aparece alejado del valor cero de reciprocidad máxima (Fig. 12).

Fig. 6. Dimorfismo estilar en Linum grandiflorum correspondiente a la población nº 21 (ver en Tabla

1). a) Flor longistila de L. grandiflorum sin pétalos conservada en alcohol 70º; b) Flor brevistila de L. grandiflorum conservada en alcohol 70º. Nótese la diferencia en la altura de los estigmas en ambas fotos (fotos realizadas por J. Ruiz-Martín); c) Gráfica mostrando la variación en la altura de los

20

órganos masculinos y femeninos (□ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas; d)

Gráfica mostrando la distribución de frecuencias de la altura de los estigmas que presenta cada población (N=41).

4. Heterostilia, que a su vez se puede clasificar en:

Distilia convencional (similar al observado en especies de Primula), en la que se observan flores L y B con diferencias en la altura de las anteras y estigmas. Para algunas especies, además se observó que los dos morfos presentaban hercogamia recíproca (es decir, sin diferencias entre morfos en la hercogamia, véase más arriba), característico de especies con alta reciprocidad (Faivre y McDade, 1995;

Barrett, 2002). Este tipo de distilia es el más común entre las especies del género en el Mediterráneo, donde se incluyen L. aroanium, L. austriacum, L. austriacum subsp. mauritanicum, L. campanulatum, L. capitatum, L. comptonii, L. corymbiferum, L. elegans, L. flos-carminii sp. nov., L. mucronatum, L. munbyanum, L. narbonense, L. subasperifolium, L. tauricum, L. tenue (Fig. 7) y L. viscosum. Todos estos taxones presentan poblaciones isopléticas (Tabla S1), y los valores del índice de reciprocidad de Sánchez et al (2013) varían entre 0,754 y 0,976, lo que indica que la reciprocidad varía entre especies. En la figura 12 del índice de reciprocidad relativa de Richard y Koptur (1932) se observa que los valores se encuentran cercanos al cero en comparación con la especie de Linum que presenta dimorfismo estilar (L. grandiflorum).

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Fig. 7. Distilia convencional en Linum tenue correspondiente a la población nº 43 (ver en Tabla S1). a) Flor sin pétalos, equivalente al morfo “L” de L. tenue conservada en alcohol 70º; b) Flor sin pétalos, equivalente al morfo “B” de L. tenue conservada en alcohol 70º. Nótese la posición recíproca de los órganos sexuales de ambas fotos (fotos realizadas por J. Ruiz-Martín); c) Gráfica mostrando la variación en la altura de los órganos masculinos y femeninos (□ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas. d) Gráfica mostrando la distribución de frecuencias de la altura de los estigmas que presenta la población (N=64).

4.2. Reciprocidad en tres dimensiones (Fig. 8), descrita por primera vez por

Armbruster et al. (2006). En este polimorfismo se mantiene la reciprocidad entre la altura de anteras y estigmas presentando valores del índice de reciprocidad para las cinco poblaciones estudiadas entre 0,831 y 0,906. Además, se observa que los

22 estigmas de las flores L y las anteras de las flores B presentan un giro hacia el exterior de la flor, mientras que las anteras de las flores L y los estigmas de las flores B lo hacen hacia el interior. La isopletía en las poblaciones estudiadas de esta especie también se mantiene (G (p)= 0,370-0,672). Este tipo de polimorfismo lo presenta sólo L. suffruticosum s.l. dentro del género (Fig. 8), en todo su rango de distribución desde el norte de África, hasta el sur de Francia y noroeste de Italia.

Fig. 8. Flores de L. suffruticosum. Nótense las posiciones recíprocas (en tres dimensiones) de las anteras y los estigmas en los dos morfos. (a) Morfo L, con Usia sp. (Bombyliidae), contactando anteras con la parte, mientras que el estigma contacta la parte dorsal del tórax, que aparece cargado de polen. (b) Morfo B (de estilo corto), con Usia sp. tomando néctar de la base de la corola. (c)

Morfos L y B sin pétalos, tomado de Armbruster et al. (2006).

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Fig. 9. Distilia 3D en Linum suffruticosum correspondiente a la población nº 35 (ver en Tabla S1). a)

Flor sin pétalos, equivalente al morfo “L” de L. suffruticosum conservada en etanol; b) Flor sin pétalos, equivalente al morfo “B” de L. suffruticosum conservada en alcohol 70º. Nótese la torsión y posición reciproca de los órganos sexuales de ambas fotos (fotos realizadas por J. Ruiz-Martín); c)

Gráfica mostrando la variación en la altura de los órganos masculinos y femeninos (□ = altura de anteras; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas; d) Gráfica mostrando la distribución de frecuencias de la altura de los estigmas que presenta la población (N=62).

4.3. Trimorfismo estilar (Fig. 10): Este polimorfismo fue encontrado en tres poblaciones de L. hirsutum s.l. colectadas en Turquía (véase Tabla S1), en las que se observó que los estigmas se presentaban por encima de los estambres (morfo L

24 o longistilo), entre los estambres (morfo M o medistilo) y por debajo de los estambres (morfo B o brevistilo). En estas poblaciones se observó que los cinco estambres se disponen aproximadamente a dos alturas pero con una variación substancial, sin poder identificar con claridad un verticilo superior e inferior de estambres, como ocurre en otras especies tristilas (Thompson et al., 1996) (véase

Figura 13). Según esto, no se puede considerar esta especie tristila, sino trimórfica estilar.

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Fig. 10. Trimorfismo estilar en L. hirsutum correspondiente a la población nº 24 (ver en Tabla S1). a, b, c) Flores sin pétalos de los tres morfos (a= flor longistila; b= flor mesostila, c= flor brevistila); d, e, f) Flores sin pétalos de los tres morfos recién colectados (d= flor longistila; e= flor mesostila, f= flor brevistila) (fotos realizadas por J. Ruiz-Martín); g) Gráfica mostrando la variación en la altura de los

órganos masculinos y femeninos (□, x, o, ▲ = altura de anteras, ; ♦ = altura de estigmas), donde los individuos de la población están ordenados decrecientemente con respecto a la altura de los estigmas. h) Gráfica mostrando la distribución de frecuencias de la altura de los estigmas que presenta esta población (N=74) en condiciones naturales.

Para esta especie se obtuvieron valores de reciprocidad de Sánchez et al (2013)

26 que variaron entre 0,755 y 0,900 (véase Tabla S2 con los valores de reciprocidad, y

Figura 12). En todas las poblaciones, el morfo L fue muy escaso y los morfos M y B aparecieron aproximadamente en la misma proporción, por lo que las poblaciones se desviaron de la isoplétia. Además, se recolectó una población de L. hirsutum subsp. spathulatum en Grecia, con diferencias morfológicas respecto las poblaciones encontradas en Turquía, en la que se encontraron sólo los morfos L y B

(Fig. 13) en igual proporción (G (p)= 0,1477) y con un índice de reciprocidad de

Sánchez et al. (2013) relativamente alto (0,801) (Fig. 12).

Fig. 11. Esquema con los distintos tipos morfológicos florales encontrados en el género Linum: a) monomorfismo sin hercogamia (homostilia); b) monomorfismo con hercogamia en eje horizontal de la

27 flor; c) monomorfismo con hercogamia en eje vertical de la flor y presencia de hercogamia de aproximación; d) monomorfismo con hercogamia en eje vertical de la flor y con hercogamia reversa; situaciones de polimorfismo estilar: e) Dimorfismo estilar; f) Distilia convencional; g) Distilia tridimensional y h) Trimorfismo estilar.

La figura 12 representa, para todas las especies y poblaciones, el índice de reciprocidad de Richard y Koptur (1993), en donde se representa la reciprocidad del morfo B en el eje vertical (“y”), mientras que la reciprocidad del morfo L se representa en el eje horizontal (“x”). Así, se puede comprobar que las poblaciones con mayor reciprocidad aparecen próximas al origen de coordenadas. Los valores que se observan en Linum son similares a los de otras especies. Las especies con dimorfismo estilar tomadas de la literatura, Nymphoides montana (TL), Anchusa officinalis (AO) y Quinchamalium chilense (QC), presentan un índice de reciprocidad relativa muy parecido a L. grandiflorum, única especie de Linum con este tipo de polimorfismo.

Por otro lado las especies de Linum que presentan una mayor reciprocidad son: L. austriacum subsp. mauritanicum (8), L. flos-carminii (19), L. mumbyanum (28), y L. tenue (40).

28

Fig. 12. Índice de reciprocidad relativa del morfo “L” frente al del morfo “B” de las especies heterostilas (según Richards y Koptur, 1993). Cada número pertenece a una población distinta (nº muestra en la Tabla S1). Cada símbolo corresponde a un tipo de polimorfismo de la siguiente manera: rombos grises = Poblaciones distilas; círculos grises = Poblaciones con distilia tridimensional; cuadrados grises= dimorfismo estilar. Las poblaciones trimórficas no están representadas en este grafico ya que su reciprocidad relativa fue calculada con otro índice de reciprocidad más adecuado para este caso. Con propósito comparativo, se incluyen especies con

índice de reciprocidad relativa tomada de la literatura: Anchusa officinalis (AO)(Philipp y Schou,

1981); Guettarda scabra (GS)(Richards H., 1993); Hedyotis nigricans (HN)(Bahadur B., 1970a);

Bouvardia ternifolia (BT), Psychotria poeppigiana (PP), Psychotria chiapensis (PC)(Faivre A.E. y

McDade L.A., 2001); Pentas lanceolata (PL)(Bahadur B., 1970b); Palicourea petiolaris (PPe),

Palicourea fendleri (PF)(Sobrevila et al., 1983); Quinchamalium chilense (QC)(Riveros et al. 1987);

29

Glandora diffusa (GD), Glandora moroccana (GM), Lithodora hispidula subsp. hispidula (LH),

Lithodora oleifolia (LO)(Ferrero et al., 2009, 2011); Nymphoides montana (DD, TL)(Haddadchi A.,

2013); Narcissus albimarginatus (NA), Narcissus calcicola (NC)(Pérez-Barrales et al., 2004).

Correlación entre los índices de reciprocidad y la proporción de morfos

El índice de Sánchez (2010) y el índice de Richards y Koptur (1993), modificado

como distancia euclidea-1, resultaron estar correlacionados positivamente con un r=

0,665 El coeficiente de correlación entre la proporción de morfos y el índice de

reciprocidad de Sánchez fue de r = - 0,028 (p=0,13), por lo que no existe una

relación entre estas dos variables.

Variación floral intraespecífica

Para todas las especies dimórficas en las que se compararon las poblaciones, se

detectaron diferencias significativas en todos los rasgos florales entre poblaciones, y

entre morfos, siendo el término interacción significativo, es decir, las diferencias

entre morfos dependen de la población (véase Tabla S2 y Tabla 5).

Tabla 5. Poblaciones de Linum hirsutum L. elegidas para cuantificar la variación floral

intraespecífica en esta especie.

Nº Especie Prop. G-Test Media L/M/B sd hercogamia Reciprocidad Localidad muestra Morfos (p) (L/M/B) relativa

(L/M/B) (L/M/B)

22 L.hirsutum 5L/20M/20S 0,002 0,43/0,12/-2,71 0,40/0,62/0,79 0,837 Aksehir

(Turquia)

30

23 L.hirsutum 3L/26M/34S <0,001 0,42/0,38/-2,65 0,63/0,84/0,79 0,755 Aksaray

(Turquia)

24 L.hirsutum 7L/34M/33S <0,001 0,31/0,49/-2,40 0,26/0,76/0,86 0,900 Kuzörendagli

(Turquia)

A diferencia de las especies dimórficas, en las especies monomórficas se

encontraron distintos patrones. Para L. africanum se encontraron diferencias

estadísticamente significativas entre las dos poblaciones estudiadas en todos los

rasgos, mientras que para las dos poblaciones de L. esterhuysenae estudiadas se

encontraron diferencias en la altura de las anteras y estigmas, pero no en la

hercogamia, es decir, ambos órganos sexuales variaron concomitantemente (véase

Tabla S2 y 6). Tanto en L. brevistylum como en L. tenuifolium se encontraron

diferencias estadísticamente significativas entre poblaciones tan sólo en la

hercogamia (Tabla S2). En L. tenuifolium, se observó en campo y en las dos

poblaciones incluidas en este estudio (de Italia y Turquía), la separación horizontal

entre anteras y estigmas, era muy evidente, pero no existen diferencias

significativas entre ellas.

En la única especie trimórfica L. hirsutum (Tabla 5) las tres poblaciones

estudiadas (de Turquía) no presentaron diferencias significativas entre ellas, pero si

las comparamos con la subespecie L. hirsutum subsp. spathulatum (Grecia), la

diferencia es evidente, ya que esta última no presenta el morfo M en ninguno de los

individuos muestreados (Fig. 13).

Además se muestra la variación intraespecífica encontrada en las especies L.

suffruticosum (5 poblaciones) y L. hirsutum (3 poblaciones) a lo largo de su

distribución, ambas presentan los polimorfismos más interesantes desde puntos de

vista evolutivo y adaptativo, distilia con reciprocidad en 3D y trimorfismo estilar 31 incipiente, respectivamente (Fig. 11).

Fig. 13. Altura de estigmas y estambres en L. hirsutum de Turquía (22: L.hirsutum subsp.pseudoanatolicum; 23: L.hirsutum subsp.byzantinum; 24: L.hirsutum subsp.anatolicum var. anatolicum) y L. hirsutum sbsp. spathulatum de Grecia. Nótese la diferencia de la población griega

(dos longitudes de estilo) en comparación con las de Turquía (tres longitudes de estilo).

Discusión

La determinación del tipo de polimorfismo estilar y su variación en cada especie o linaje es trascendental para entender su significado adaptativo o poder responder preguntas de carácter micro y macroevolutivo. Por ello, en los últimos años se han descrito las características morfológicas, fisiológicas y funcionales de muchos

32 grupos taxonómicos donde la heterostilia es frecuente [p. ej., en las familias

Amaryllidaceae (Pérez et al., 2004; Graham y Barrett, 2004; Pérez-Barrales et al.,

2006; Santos-Gally et al., 2013; Boraginaceae (Ferrero, 2009; Ferrero et al., 2011a),

Iridaceae (Sánchez et al., 2010), Malvaceae (Faife-Cabrera et al., 2014),

Gentianaceae (Kissling y Barrett, 2013), Plumbaginaceae (Ferrero et al., 2009b),

Pontederiaceae (Kohn et al., 1996), y Oxalidaceae (Turketti et al., 2012). Sin embargo, en ninguno de estos casos se ha descrito una variación de los polimorfismos florales tan grande como la que se observa en el género Linum. El polimorfismo estilar en Linum presenta una gran variabilidad a todos los niveles, entre especies y categorías inferiores, e incluso entre poblaciones. Así, incluye dimorfismo estilar, distilia convencional, distilia en tres dimensiones y trimorfismo.

Este último tipo debe ser analizado en mayor profundidad, pues es posible una mayor representación, teniendo en cuenta indicaciones de autores anteriores muy solventes en el estudio de la heterostilia (Dulberger, 1973). Si se confirmara la presencia de tristilia, el género contaría con toda la diversidad de polimorfismos ya descrita para la familia, más algún tipo particular como la distilia en tres dimensiones

(Armbruster et al., 2006) y la distilia con dos alturas de estambres presente en L. hirsutum subsp. spathulatum, que en este trabajo solo se distingue en la única población de esta especie que se ha podido muestrear. Este hecho es de crucial importancia dado que Linum presenta todos los grandes estadios morfológicos reconocidos en los principales modelos evolutivos de la heterostilia (Charlesworth y

Charlesworth, 1997; Lloyd y Webb, 1992a, b): monomorfismo con y sin hercogamia

(tanto de aproximación como reversa), dimorfismo estilar, distilia convencional (y variaciones sobre ésta) y trimorfismo (incluyendo tal vez tristilia). La tristilia ya ha sido reportada en la familia, en un género, Hugonia (Thompson et al., 1996; Meeus

33 et al., 2011) en el que también aparece distilia (Lloyd et al., 1990), por lo que puede representar una situación paralela a la de Linum, confirmando el interés de la familia en el estudio de la macroevolución de la heterostilia.

En particular, Linum y la familia Linaceae pueden ser clave para resolver uno de los puntos aún oscuros en los estudios de evolución de la heterostilia: la transición hacia el trimorfismo y la tristilia. Éste es muy escaso en las angiospermas

(Barrett et al., 2000) y su resolución se hace recalcitrante por no aparecer condiciones intermedias (la distilia y el trimorfismo incipiente en especies/poblaciones relacionadas). Por ejemplo, en Narcissus hay distilia y tristilia

(con una especie de cada uno de estos tipos), pero su aparición es completamente independiente (Pérez et al., 2004; Graham y Barrett, 2004; Pérez-Barrales et al.,

2006). Es posible que la tristilia dominante en algunos grupos taxonómicos (e.g.

Oxalis, Baena-Diaz et al., 2012) sea una condición de alta ventaja adaptativa que elimine rápidamente cualquier estadio intermedio. De hecho cuando éste se ha observado, ha resultado ser realmente una condición derivada (Oxalis alpina; Pérez-

Alquicira et al., 2010). Es notable que en L. hirsutum subsp. spathulatum la pérdida de la longitud media (M) de estilo con respecto a otras subespecies se asemeje un tanto al caso de Oxalis alpina (Rose) Rose ex R. Knuth. Se desconoce, de momento, si ésta es una transición de la distilia a la tristilia (o trimorfismo) o una pérdida del morfo intermedio. Por tanto, en Linum hirsutum s.l. (Turquía) y en L. hirsutum subsp. spathulatum (Grecia), especialmente en el primero por la gran variabilidad morfológica, es deseable un mayor esfuerzo de muestreo de poblaciones y de plantas por población, para asegurar qué tipo de condición trimórfica existe y cuál es su relación exacta con la distilia (véase Fig.11).

En conjunto, en este trabajo se muestran mediciones cuantitativas de los órganos

34 sexuales de 34 especies y 2 subespecies de Linum. Esto, unido a la separación de distintos tipos de polimorfismo, ha llevado a expandir el número de taxones polimórficos de McDill (2009) de 14 a 31 (incluyendo especies y subespecies).

Donde no parece haber una gran variación en Linum es en el sistema de incompatibilidad. Aunque su estudio exhaustivo y extensivo no ha sido objeto de esta Tesis Doctoral (excepto algunos experimentos en L. tenuifolium y L. suffruticosum; véase Capítulo 4) parece que la mayoría de las especies dimórficas analizadas por otros autores muestran un típico sistema de incompatibilidad heteromórfico, en el que sólo se producen semillas viables a partir de cruces legítimos (es decir, entre distintos morfos estilares, Darwin 1863, 1877; Dulberger

1974, 1981, 1987; Ghosh y Shivanna, 1984; Murray, 1986; Lewis y Jones, 1992). La

única variación conocida sobre este patrón es que algunas de las especies monomórficas son autocompatibles (Ockendon, 1968). Una cuestión a resolver es si estas especies son homostilas autocompatibles derivadas (como ocurre en Primula,

Piper et al., 1986) o si algunas son hercógamas (Tammes, 1928; Khanna y Singh,

1956). Por ejemplo, dentro del grupo de L. perenne, parece que L. leonii, el único autocompatible y homostilo, es de origen híbrido (Heitz, 1972). Sin embargo, parece que la autoincompatibilidad heteromórfica no es suficiente para evitar el cruzamiento entre plantas del mismo morfo. En concreto, L. suffruticossum, al igual que todas las especies distilas estudiadas, presenta autoincompatibilidad heteromórfica y, sin embargo, ha complicado su morfología (heterostilia 3-D) para hacerla aún más eficaz en la transferencia legítima de polen, procurando el menor descuento posible del mismo (Armbruster et al. 2006). También es significativo que la gran novedad que supuso la descripción de este tipo de polimorfismo ha resultado no ser exclusiva, ya que recientemente se describió el mismo tipo en varias especies de

35

Oxalis tristilas de Sudáfrica (Turketti et al. 2012). El análisis comparado del Capítulo

3 pretende arrojar luz sobre algunas de estas cuestiones.

También es notable la existencia persistente de hercogamia reversa en L. nodiflorum. No hay ningún modelo que prediga que ésta puede ser una condición ancestral en la evolución del polimorfismo. Ockendon (1968) y posteriormente

Dulberger (1974) achacan esta situación a la pérdida de uno de los morfos, a partir de una situación de distilia, y asocian la pérdida del polimorfismo a una reducción del tamaño efectivo en las poblaciones. En cualquier caso esto requeriría que las plantas sean autocompatibles, o al menos compatibles dentro del mismo morfo, lo que no se sabe. Si esto fue así en el pasado, no se corresponde con nuestra experiencia de campo, ya que hemos encontrado poblaciones (al menos 10) muy grandes y densas de esta especie en Turquía y en todas ellas las flores de cada población (100 flores muestreadas, una por planta) presentaban esta situación (J.

Ruiz Martín, datos inéditos). Puede que ese posible cuello de botella ocurriera en el pasado y la situación monomórfica se haya estabilizado. Un problema adicional con esta explicación es que si el morfo B es heterocigoto, como tradicionalmente se ha propuesto (Lewis y Jones, 1992), en la recombinación tras la reproducción sexual deberían segregarse las dos longitudes de estilo. Se desconoce si esta condición genética ocurre en esta especie.

Variación intraespecífica

En ocasiones es difícil definir el tipo de polimorfismo estilar debido a las variaciones inter- e intra-poblacionales (Ferrero et al., 2011a). Además, el uso de distintos métodos para la caracterización del polimorfismo puede resultar en clasificaciones diferentes de este (Faivre y McDade, 2001). Por ejemplo, en los géneros Lithodora y

36

Glandora (Boraginaceae) se ha descrito cómo el polimorfismo puede variar entre poblaciones de la misma especie, algo que no es fácilmente diferenciable de forma visual (Ferrero et al., 2011a). La variación inter-poblacional se ha observado en otros grupos (Narcissus (Amaryllidaceae), Arroyo et al., 2002, Simón-Porcar et al.,

2014, Baker et al., 2000; Melochia (Malvaceae), Faife-Cabrera et al. 2014;

Jasminum (Oleaceae), Thompson y Dommée 2000; Oxalis (Oxalidaceae), Weller et al., 2007; Baena-Díaz et al., 2012; Primula (Primulaceae), Nishihiro et al., 2000;

Bouvardia y Psychotria (Rubiaceae), Faivre y McDade, 2001; Sampson y Krebs,

2012). El estudio detallado del polimorfismo de las especies puede llevar a re- caracterizaciones morfológicas mal descritas con anterioridad, como es el caso de especies de Nivenia (Sánchez et al., 2010). En ocasiones ha servido para determinar si una especie anteriormente considerada monomórfica es en realidad polimórfica (e.g., Narcissus broussonetii Santos-Gally et al., 2015). Finalmente, conocer la posible variabilidad en la reciprocidad es condición necesaria para iniciar investigaciones sobre su valor adaptativo. En este sentido, una aproximación de estudio de selección fenotípica permitiría evaluar hasta qué punto la variación en la posición de anteras y estigmas de un morfo se aproxima a su óptimo fenotípico

(Armbruster et al., 2009 a,b; Keller et al., 2012, 2014).

Buena parte de la variabilidad interpoblacional en otros grupos sin polimorfismo recíprocos (es decir, con variación continua) se debe a que las especies que la poseen tienen un sistema de incompatibilidad homomórfico o no tienen sistema de incompatibilidad y cada morfo tiene un éxito dependiendo de su fitness maternal y paternal. Las variaciones interpoblacionales observadas en Linum parecen estar relacionadas con procesos incipientes de diferenciación ligados a un promoción eficaz de la fecundación cruzada eficiente en el uso de los gametos,

37 como ocurre en el grupo de L. tenuifolium s.l. (referidos como “Linos blancos”, véase

Capítulo 5), donde ocurre tanto monomorfismo como polimorfismo (Armbruster et al., 2006), o en las variaciones dentro de L. hirsutum. De la misma forma, el muestreo de Linum en Sudáfrica ha estado dirigido a recolectar las especies reconocidas (Rogers, 1981), pero casualmente se ha visto que algunas especies muestran variaciones interpoblacionales que merecen estudio más detallado, dificultado por la escasa abundancia de la mayoría de las especies en esa región.

Relación entre reciprocidad y proporción de morfos

Las transiciones evolutivas desde la heterostilia no sólo se reflejan en la morfología floral y el sistema de incompatibilidad, sino también en las frecuencias de los distintos morfos florales dentro de una población (Barrett y Richards, 1990; Barrett,

1992; Barrett, et al., 2000). Se espera que los morfos florales L y B deben estar presentes en una proporción de 1: 1 (isoplétia) en las poblaciones heterostilas, y las proporciones sesgadas (anisoplétia) suelen indicar una falta o debilidad del sistema de incompatibilidad heteromórfico (Charlesworth y Charlesworth, 1979a) y un flujo de polen asimétrico debido a distintos tipos de polinizadores o a reciprocidades también asimétricas (Brys et al., 2008; Simón-Porcar et al., 2015). En el caso de la distilia convencional, presente en 15 taxones de los 50 analizados en este estudio, los valores del índice de reciprocidad varían entre 0,754, de L. elegans (Grecia) con una proporción de morfos prácticamente isoplética (43L: 40B), y 0,976 de L. tenue

(Argelia) donde la población es anisoplética y presenta una mayor abundancia de plantas B (7L: 22B). Esto demuestra la baja correlación en Linum entre estos dos parámetros, a diferencia con los resultados obtenidos en Narcissus assoanus

(Thompson et al., 2012) donde sí se encontró una relación directa entre ambas

38 variables. Sin embargo, debe recalcarse que esta última especie no presenta incompatibilidad heteromórfica, sino homomórfica (Baker et al., 2000). Dado que en

Linum la incompatibilidad heteromórfica parece general en las especies polimórficas, es esperable el resultado observado de escasa variación en la proporción de morfos. Cuando ésta ocurre la explicación más probable reside en variaciones demográficas aleatorias, fluctuantes y no estables.

En conclusión, a pesar de que Linum es uno de los primeros géneros en los que se reportó la heterostilia, sigue siendo un caso de estudio idóneo para profundizar en aspectos aún poco desarrollados, como son las pruebas empíricas de modelos existentes, dada la gran variabilidad de formas florales y estrategias encontradas, incluyendo casos intermedios realmente intrigantes (evolución hacia y desde la tristilia, sistemas recíprocos muy especializados, aparentemente relacionados con polinizadores muy específicos, Capítulo 3). Este grupo seguirá dando muchas satisfacciones a los interesados en profundizar en el funcionamiento y la evolución de este polimorfismo sexual, que tanto ha ayudado a comprender los vericuetos de la fecundación cruzada desde los tiempos de Darwin.

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Material suplementario.

53

Tabla S1. Especies recolectadas para estudiar la variabilidad en el polimorfismo estilar del género Linum. Se incluyen 50 taxones (36 de la cuenca mediterránea y Europa, 13 de Sudáfrica y 1 de Sudamérica), indicando la especie, localidad y las coordenadas, latitud y longitud (Datum: WGS80), el tipo de polimorfismo (monomorfismo (M) o de polimorfismo (P)).

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Nº Tipo de muestra Taxón Localidad Latitud Longitud Polimorfismo polimorfismo Tipología según literatura 1 L. acuticarpum C.M.Rogers Kobelgerg valley (Sudáfrica) 34°19'23.52"S 18°58'26.59"E M Aproximación Homostilia /Rogers 1981 2 L. adustum E.Mey. ex Planch. Gaansbay (Sudáfrica) 34°33'02.10''S 19°25'37.80''E M Aproximación Homostilia /Rogers 1981 De Hoop Nat. Reserve 3 L. aethiopicum Thunb. (Sudáfrica) 34°25'48.80''S 20°39'50.50''E M Aproximación Homostilia /Rogers 1981 4 L. africanum L. Simon´s Town (Sudáfrica) 34°10'58.96''S 18°25'21.17''E M Aproximación Homostilia /Rogers 1981 5 L. africanum L. Cape Peninsula (Sudáfrica) 34°09'03.91"S 18°25'46.21"E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 Zarouchla, Peloponeso 6 L. aroanium Boiss. & Orph. (Grecia) 38°00'37.90''N 22°16'06.50''E P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 7 L. austriacum L. Arganda del Rey (Madrid) 40°17'29.80''N 03°27'42.50''O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 L. austriacum subsp. mauritanicum (Pomel) Greuter & 8 Burdet Azrou (Marruecos) 33°03'33.23"N 05°02'14.35"O P Distilia Heterostilia/Fennane 2007 9 L. austriacum L. Balikesir (Turquia) 39°28'12.40''N 28°02'56.40''E P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 10 L. bienne Mill. Kesan (Turquia) 40°45'01.80"N 26°42'54.58"E M Homostilia Homostilia/Ockendon 1968 Pringle bay, Overberg 11 L. brevistylum C.M.Rogers (Sudáfrica) 34°21'09.96"S 18°50'16.10"E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 12 L. brevistylum C.M.Rogers Ratelrivier (Sudáfrica) 34°44'26.10"S 19°40'44.89"E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 Albalate de Zorita 13 L. campanulatum L. (Guadalajara) 40°16'52.03"N 02°50'56.44"O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 14 L. capitatum Kit. ex Schult. Mte. Olympo (Grecia) 40°05'15.60''N 22°24'32.70''E P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 15 L. comptonii C.M.Rogers Kleinmond (Sudáfrica) 34°20'02.12"S 19°03'12.45"E P Distilia Homostilia/Rogers 1981 16 L. corymbiferum Desf. Saket (Argelia) 36°52'04.80"N 04°50'16.40"E P Distilia Heterostilia/Quezel 1962 Dervéni, Peloponeso 17 L. elegans Spruner ex Boiss. (Grecia) 37°51'03.70''N 22°14'47.50''E P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 Robinsson Pass, Mossel 18 L. esterhuysenae C.M.Rogers Bay (Sudáfrica) 33°52'16.90''S 22°01'56.60''E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 19 L. floscarminii sp. nov. Ouazzane (Marruecos) 34°54'33.14"N 05°32'11.60"O P Distilia Ruiz-Martín et al., 2015 20 L. gracile Planch. Bloukrans Pass (Sudáfrica) 33°58'08.30''S 23°43'57.60''E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 Cultivar “rubrum” P.Mª Luisa Dimorfismo Dimorfismo estilar/ Darwin 21 L. grandiflorum Desf. (Sevilla) 37°22'29.67"N 05°59'10.48"O P Estilar 1877

L. hirsutum

22 subsp.pseudoanatolicum Davis Aksehir (Turquia) 38°11'26.60''N 31°13'33.30''E P Trimorfismo Heterostilia/Ockendon 1968

L. hirsutum subsp.byzantinum

23 Azn. Aksaray (Turquia) 38°24'22.30''N 34°02'15.80''E P Trimorfismo Heterostilia/Ockendon 1968

55

L. hirsutum subsp.anatolicum 24 var. anatolicum (Boiss) Hayek. Kuzörendagli (Turquia) 40°44'53.30''N 31°52'55.00''E P Trimorfismo Heterostilia/Ockendon 1968 25 L. hologynum Rchb. Metsovo (Grecia) 39°50'46.70''N 21°12'31.00''E M Aproximación Homostilia/Ockendon 1968 Hualpén, Concepción 26 L. macraei Benth. (Chile) 36°47'S 73°10'O M Aproximación Rogers, 1978 27 L. mucronatum Bertol. Aksaray (Turquia) 38°24'22.30''N 34°02'15.80''E P Distilia Heterostilia/Davis 1967 28 L. mumbyanum Boiss. & Reut. Sebdou (Argelia) 34°50'59.14"N 01°21'24.37"O P Distilia Heterostilia/Valdés 2002 Teresa de Cofrentes 29 L. narbonense L. (Valencia) 39°06'16.42"N 01°01'56.20"O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 30 L. nodiflorum L. Formia (Italia) 41°23'08.80''N 13°31'35.20''E M Reversa En flora de USSR Cederberg, Algeria 31 L. pungens Planch. (Sudáfrica) 32°22'26.10''S 19°03'48.30''E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 32 L. strictum L. Cartagena (Murcia) 37°36'05.44"N 01°01'49.68"O M Homostilia Homostilia/Ockendon 1968 L. subasperifolium Humbert & 33 Maire Taza (Marruecos) 34°46'28.24"N 03°47'42.84"O P Distilia Heterostilia/Valdés 2002 Distilia 3D/Armbruster et al. 34 L. suffruticosum L. Alora (Málaga) 36°50'51.80''N 04°48'13.40''O P Distilia 3D 2006 Distilia 3D/Armbruster et al. 35 L. suffruticosum L. Sierra de Gádor (Almería) 36°56'10.90''N 02°36'22.80''O P Distilia 3D 2006 Distilia 3D/Armbruster et al. 36 L. suffruticosum L. Annot (Francia) 43°57'00.74"N 06°30'41.44"E P Distilia 3D 2006 Distilia 3D/Armbruster et al. 37 L. suffruticosum L. Targuist (Marruecos) 34°58'46.30''N 04°13'37.70''O P Distilia 3D 2006 Albalate de Zorita Distilia 3D/Armbruster et al. 38 L. suffruticosum L. (Guadalajara) 40°16'51.95"N 02°50'56.42"O P Distilia 3D 2006 39 L. tauricum Willd. Malkara (Turquia) 40°52'02.96"N 26°46'12.48"E P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 40 L. tenue Desf. * Saida (Argelia) 34°47'16.44"N 00°15'27.79"O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 41 L. tenue Desf. El Ourit (Argelia) 34°52'39.14"N 01°14'38.72"O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 42 L. tenue Desf. Taza (Marruecos) 34°08'51.63"N 04°00'53.16"O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 43 L. tenue Desf. Talambote (Marruecos) 35°15'24.75"N 05°13'07.85"O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 44 L. tenue Desf. Ronda (Málaga) 36°47'39.00''N 04°59'24.40''O P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 45 L. tenuifolium L. P.N. de Maiella (Italia) 42°12'18.40''N 14°04'30.70''E M Horizontal Homostilia/Ockendon 1968 46 L. tenuifolium L. Agva (Turquia) 41°03'06.90''N 29°56'37.80''E M Horizontal Homostilia/Ockendon 1968 47 L. thunbergii Eckl. & Zeyh. Witsieshook (Sudáfrica) 28°41'09.92"S 28°53'57.05"E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 48 L. villosum C.M.Rogers Outeniqua Pass (Sudáfrica) 33°51'57.20''S 22°48'04.40''E M Aproximación Homostilia/Rogers 1981 49 L. viscosum L. Sopeira (Huesca) 42°21'26.42"N 00°44'37.62"E P Distilia Heterostilia/Ockendon 1968 L. hirsutum subsp.spathulatum Distilia con 2 50 (Halácsy & Bald.) Hayek Elatos (Grecia) 40°04'55.62"N 21°18'21.33"E P alturas de Heterostilia/Ockendon 1968

56

estambres

Tabla S2. Datos estadísticos: La proporción de morfos “Prop. Morfos (L/B)” indica el número de plantas longistilas (L) y brevistilas encontradas en el campo (de 100 plantas, cuando fue posible). “G-Test (p)”, probabilidad de que la proporción de morfos sea isoplética, los valores por debajo de 0,005

(p<0,05) rechazan la hipótesis nula (G Test: L>B, L

“Media hercogamia (L/B) ± dt hercogamia (L/B) (mm)”, y nos indica la media de la hercogamia entre verticilos de toda la población ± la desviación típica. La

“Reciprocidad relativa (L/B)”, calculada según el índice de Richards y Koptur (1993), se expresa en dos valores, uno para cada morfo (L y B), es por ello que se ha calculado la distancia de cada punto resultante (Fig. 12) hasta el 0, calculada mediante la distancia euclídea, para poder comparar ambos índices utilizados “Distancia euclidea-1” (para poder expresarnos en valores positivos, y no lleve a confusión). La siguiente columna nos muestra el “Índice de reciprocidad” calculado según el índice de Sánchez et al. (2010). Por último vemos una columna que indica el número de individuos por morfo encontrado y analizado en cada población “N por morfo (L/M/B)”.

En algunas especies (L. africanum, L. brevistylum, L. suffruticosum, L. austriacum, L. tenue, L. hirsutum y L. tenuifolium) se han analizado varias poblaciones para comprobar si el polimorfismo cambia a lo largo de su rango de distribución. Las especies se han clasificado según el tipo de polimorfismo estilar que presentan: monomorfismo (M), polimorfismo (P) y el tipo correspondiente, de los nueve caracterizados para el género. Se indica el resultado del test estadístico (G) usado para evaluar la hipótesis nula de isoplétia (proporción de morfos 1:1). Se indica la media y desviación estándar de la hercogamia que presenta cada población, medida como la diferencia de longitud entre los verticilos sexuales (en mm), mostrando los valores para cada morfo (Longistilo,

Medistilo y Brevistilo, representados como L, M y B respectivamente). La reciprocidad relativa proporciona un valor por cada morfo (índice de Richards y

Koptur, 1993), mientras que el índice de reciprocidad de Sánchez et al (2013) varía entre 0 y 1 (e.g., cuanto más próximos sean los valores a 1, mayor reciprocidad habrá entre los verticilos sexuales).

57

Media hercogamia(L/B) Índice de Nº Prop. Morfos G-Test (p) ± dt hercogamia(L/B) Reciprocidad relativa Distancia reciprocidad N por morfo muestra Taxón (L/B) (1) (mm) (2) (L/B) (3) euclidea-1 (4) (L/M/B) (5) 1 L.acuticarpum C.M.Rogers NA NA 2,79 ± 0,57 NA NA NA 32 2 L.adustum E.Mey. ex Planch. NA NA 2,7 ± 0,36 NA NA NA 32 3 L.aethiopicum Thunb. NA NA 1,12 ± 0,21 NA NA NA 32 4 L.africanum L. NA NA 1,28 ± 0,46 NA NA NA 32 5 L.africanum L. NA NA 1,63 ± 0,52 NA NA NA 32 6 L.aroanium Boiss. & Orph. 45/46 0,916 2,82/-3,92 ± 0,54/0,78 0,002/0,069 0,930 0,874 30/30 7 L.austriacum L. 45/55 0,317 2,60/-1,92 ± 0,47/0,33 -0,005/0,0543 0,945 0,909 32/30 L.austriacum subsp. mauritanicum 8 (Pomel) Greuter & Burdet 63/55 0,461 3,15/-2,85 ± 0,43/0,39 -0,009/-0,013 0,983 0,933 30/30 9 L.austriacum L. 30/27 0,691 2,90/-1,89 ± 0,44/0,50 -0,024/-0,063 0,932 0,909 27/31 10 L.bienne Mill. NA NA 0,11 ± 0,31 NA NA NA 12 11 L.brevistylum C.M.Rogers NA NA 0,83 ± 0,28 NA NA NA 18 12 L.brevistylum C.M.Rogers NA NA 0,55 ± 0,32 NA NA NA 32 13 L.campanulatum L. 50/50 1 2,5/-3,38 ± 0,70/0,65 -0,007/0,073 0,925 0,878 30/30 14 L.capitatum Kit. ex Schult. 25/17 0,216 4,14/-4,28 ± 0,67/0,95 -0,014/0,030 0,966 0,9 25/17 15 L.comptonii C.M.Rogers 45/33 0,173 2,75/-2,15 ± 0,47/0,55 -0,042/0,006 0,957 0,891 33/32 16 L.corymbiferum Desf. 33/16 * 2,71/-1,04 ± 0,24/0,21 -0,035/-0,085 0,907 0,932 33/16 17 L.elegans Spruner ex Boiss. 43/40 0,74190729 2,62/-3,39 ± 0,79/0,78 -0,004/0,076 0,923 0,754 30/30 18 L.esterhuysenae C.M.Rogers NA NA 3,21 ± 0,82 NA NA NA 33 19 L.floscarminii sp. nov. 55/45 0,317 1,26/-1,03 ± 0,38/0,35 0,002/-0,019 0,981 0,963 30/30 20 L.gracile Planch. NA NA 1,89 ± 0,42 NA NA NA 32

58

21 L.grandiflorum Desf. 24/17 0,273 -0,34/-3,65 ± 0,98/0,58 -0,015/0,223 0,776 0,787 24/17

L.hirsutum 0,43/0,12/-2,71 ± 22 subsp.pseudoanatolicum Davis 5L/20M/20S * 0,40/0,62/0,79 NA NA 0,837 5/21/19 0,42/0,38/-2,65 ± 23 L.hirsutum subsp.byzantinum Azn. 3L/26M/34S *** 0,63/0,84/0,79 NA NA 0,755 3/26/34

L.hirsutum subsp.anatolicum var. 0,31/0,49/-2,40 ± 24 anatolicum (Boiss) Hayek. 7L/34M/33S *** 0,26/0,76/0,86 NA NA 0,901 7/34/33 25 L.hologynum Rchb. NA NA 1,73 ± 0,5 NA NA NA 32 26 L.macraei Benth. NA NA 2,23 ± 0,67 NA NA NA 32 27 L.mucronatum Bertol. 15/20 0,397 2,20/-3,64 ± 0,64/0,81 -0,045/0,123 0,868 0,812 15/20 28 L.mumbyanum Boiss. & Reut. 7/20 * 1,68/-1,34 ± 0,33/0,34 -0,025/0,007 0,974 0,887 7/20 29 L.narbonense L. 35/65 ** 2,8/-3,55 ± 0,7/0,69 -0,004/0,075 0,925 0,838 34/34 30 L.nodiflorum L. NA NA -0,82 ± 0,19 NA NA NA 11 31 L.pungens Planch. NA NA 2,65 ± 0,75 NA NA NA 35 32 L.strictum L. NA NA -0,2 ± 0,17 NA NA NA 30 L.subasperifolium Humbert & 33 Maire 57/50 0,498 2,01/-3,08 ± 0,34/0,48 0,014/0,097 0,901 0,869 30/30 34 L.suffruticosum L. 49/53 0,692 1,97/-1,07 ± 0,27/0,28 -0,083/0,022 0,914 0,851 30/30 35 L.suffruticosum L. 44/36 0,371 1,74/-2,15 ± 0,36/0,5 -0,013/0,054 0,945 0,892 32/30 36 L.suffruticosum L. 50/57 0,498 1,44/-1,46 ± 0,61/0,39 0,012/0,028 0,969 0,831 32/32 37 L.suffruticosum L. 49/53 0,692 3,28/-2,57 ± 0,57/0,41 -0,045/0,021 0,950 0,893 36/35 38 L.suffruticosum L. 53/47 0,548 2,29/-1,89 ± 0,35/0,34 -0,048/0,033 0,941 0,906 31/31 39 L.tauricum Willd. 40/44 0,662 3,28/-3,68 ± 0,54/0,63 -0,022/0,064 0,932 0,887 30/30 40 L.tenue Desf. * 7/22 ** 1,05/-1,03 ± 0,46/0,27 -0,011/0,012 0,983 0,976 7/22 41 L.tenue Desf. 26/23 0,668 2,69/-3,41 ± 0,31/0,64 -0,004/0,082 0,917 0,857 26/23 42 L.tenue Desf. 45/55 0,317 3,09/-3,53 ± 0,37/0,45 0,013/0,025 0,971 0,93 32/32 43 L.tenue Desf. 47/53 0,548 2,13/-3,0 ± 0,26/0,32 -0,022/0,073 0,923 0,91 32/32

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44 L.tenue Desf. 47/53 0,548 2,3/-2,87 ± 0,30/0,44 -0,030/0,119 0,877 0,788 32/32 45 L.tenuifolium L. NA NA 1,84 ± 0,54 NA NA NA 40 46 L.tenuifolium L. NA NA 1,38 ± 0,64 NA NA NA 45 47 L.thunbergii Eckl. & Zeyh. NA NA 0,57 ± 0,19 NA NA NA 16 48 L.villosum C.M.Rogers NA NA 2,08 ± 0,73 NA NA NA 27 49 L.viscosum L. 40/60 * 2,87/-3,19 ± 0,55/0,58 -0,024/0,059 0,936 0,897 30/31 L.hirsutum subsp.spathulatum 50 (Halácsy & Bald.) Hayek 16/24 0,148 3,25/-3,37 ± 1,05/0,86 0,088/-0,037 0,904 0,801 15/24

Tabla S3. ANOVA para comparar la longitud de estambres, la altura de estigmas y hercogamia entre morfos de las especies dimórficas, se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (nuevo valor de p=0,0167). Los resultados de p<0,005 se representan como “*“(en negrita las diferencias significativas).

Estigma Estambre Hercogamia Taxón F g.l. p F g.l. p F g.l. p L.aroanium Boiss. & Orph. 432,152 1 * 216,578 1 * 42,195 1 * L.austriacum L. 226,846 1 * 642,100 1 * 41,529 1 * L.austriacum L. 494,593 1 * 575,334 1 * 65,055 1 * L.austriacum subsp. mauritanicum (Pomel) Greuter & Burdet 584,126 1 * 586,701 1 * 8,248 1 0,005 L.campanulatum L. 456,356 1 * 194,558 1 * 25,164 1 * L.capitatum Kit. ex Schult. 363,712 1 * 180,341 1 * 0,337 1 0,565 L.comptonii C.M.Rogers 540,034 1 * 256,310 1 * 22,178 1 * L.corymbiferum Desf. 893,393 1 * 1233,284 1 * 568,579 1 * L.elegans Spruner ex Boiss. 287,283 1 * 114,351 1 * 14,609 1 *

60

L.floscarminii sp. nov. 90,202 1 * 327,904 1 * 6,179 1 0,016 L.grandiflorum Desf. 200,815 1 * 6,103 1 0,018 201,678 1 * L.mucronatum Bertol. 431,242 1 * 45,913 1 * 30,726 1 * L.mumbyanum Boiss. & Reut. 42,869 1 * 26,911 1 * 5,197 1 0,031 L.narbonense L. 319,297 1 * 147,492 1 * 35,770 1 * L.spathulatumHalácsy 434,254 1 * 164,651 1 * 6,441 1 0,015 L.subasperifolium Humbert & Maire 635,888 1 * 485,752 1 * 98,113 1 * L.suffruticosum L. 498,168 1 * 73,260 1 * 158,840 1 * L.suffruticosum L. 481,025 1 * 162,667 1 * 20,942 1 * L.suffruticosum L. 346,664 1 * 136,850 1 * 14,088 1 * L.suffruticosum L. 318,429 1 * 148,044 1 * 32,764 1 * L.suffruticosum L. 83,817 1 * 79,474 1 * 15,657 1 * L.tauricum Willd. 587,109 1 * 364,663 1 * 7,163 1 0,009 L.tenue Desf. 871,432 1 * 234,970 1 * 37,455 1 * L.tenue Desf. 1219,865 1 * 806,140 1 * 17,858 1 * L.tenue Desf. 1375,546 1 * 916,644 1 * 146,703 1 * L.tenue Desf. 631,155 1 * 240,476 1 * 25,884 1 * L.tenue Desf. 79,452 1 * 73,683 1 * 0,023 1 0,881

Tabla S4. ANOVA para comparar la hercogamia (diferencia entre altura de estambres y de estigma) de las especies monomórficas, se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples (nuevo valor de p=0,0167). Los resultados de p<0,005 se representan como “*“(en negrita las diferencias significativas).

61

Taxón Hercogamia g.l. p L.acuticarpum C.M.Rogers 522,148 1 * L.adustum E.Mey. ex Planch. 398,672 1 * L.aethiopicum Thunb. 115,795 1 * L.africanum L. 87,781 1 * L.africanum L. 130,469 1 * L.bienne Mill. 1,237 1 0,278 L.brevistylum C.M.Rogers 67,793 1 * L.brevistylum C.M.Rogers 25,526 1 * L.esterhuysenae C.M.Rogers 92,409 1 * L.esterhuysenae C.M.Rogers 207,716 1 * L.gracile Planch. 94,792 1 * L.hologynum Rchb. 124,865 1 * L.macraei Benth. 94,213 1 * L.nodiflorum L. 10,789 1 * L.pungens Planch. 266,902 1 * L.strictum L. 9,908 1 * L.tenuifolium L. 139,488 1 * L.tenuifolium L. 58,083 1 * L.tunbergii Eckl. & Zeyh. 34,997 1 * L.villosum C.M.Rogers 120,573 1 *

62

Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of

Mediterranean convergent evolution?

Ruiz-Martín, J.1; Santos-Gally, R.1,2; Escudero, M1., Midgley, J.J.3; Pérez-

Barrales, R1, 4.; Arroyo, J.1

Addresses

1. Departamento de Biología Vegetal y Ecología, Universidad de Sevilla,

Spain; 2. current address: CONACYT-Departamento de Ecología Evolutiva, Instituto de Ecología, UNAM, México; 3. Department of Biological Sciences, University of

Cape Town, South Africa; 4. current address: School of Biological Sciences,

University of Portsmouth, UK.

Running title: convergence of heterostyly in Linum

Author for correspondence:

J. Arroyo

[email protected]

tel +34 954 557 058 fax +34 954 557 059

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in

Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Keywords: Cape Floristic Region, divergence time, heterostyly, life-form, phylogeny, pollination, polyploidy.

Abstract

 Heterostyly is a sex polymorphism, which has challenged evolutionary

biologists ever since Darwin. One of the lineages where heterostyly is more

frequent is the family Linaceae and its most diverse and cosmopolitan genus,

Linum. This allows for testing the hypothesis that the evolution of heterostyly is

due to specialized pollinators, which promote cross-pollination between

morphs and increase the efficiency of pollen delivery and receipt. Additionally,

some variable traits that are putatively correlated with breeding systems and

heterostyly can also be examined.

 We resolved a phylogeny of Linum based on extensive sampling and plastid

and nuclear DNA sequences and used it to trace evolution of character states

of style polymorphism and its correlation with traits related to pollination and

breeding systems, obtained from our samples and from literature.

 Results support former phylogenetic hypotheses: the paraphyly of Linum and

the non-monophyly of current taxonomic sections. Heterostyly is very frequent

in the genus but appears concentrated in the Mediterranean Basin and, to a

lesser extent, in the South African Cape. Ancestral character state

reconstruction failed to determine a unique state as the most probable

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condition for style polymorphism in the genus, although for some groups

approach herkogamy was resolved as ancestral state. Other traits putatively

related with heterostyly, such as life-form and polyploidy, did not show any

significant phylogenetic correlation, whilst some pollinator types (bee-flies) are

associated with specific cases of heterostyly.

 We conclude that available evidence points out to specialized pollinator types

promote the functioning of heterostyly in the Mediterranean Basin, and

hypothesize that similar pollinator types would act similarly in South African

Linum. This would explain the multiple presence of heterostyly in this

widespread lineage.

Introduction

The great variation of flowers across lineages has inspired plant classification since Linneaus (1735), as well as the formulation of hypotheses about the causes of angiosperm diversification (Grant & Grant, 1965; Stebbins, 1970, 1974). Flowers are also variable within species and populations. This variation can be of continuous and discontinuous nature and it is often associated to geographical variation, which has been important to bring insights on the biotic and abiotic causes of such variation

(Herrera et al., 2006; Strauss & Whittall, 2006; Gómez et al., 2009). When continuous variation occurs within populations, phenotypes have small differences in

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their adaptive value or they have larger differences but the population is not at equilibrium. Lastly, sometimes there is discontinuous variation within populations; that is, there are modal phenotypes in the population, which might be symptom of population divergence through disruptive selection. However, some of the discontinuous variation in floral phenotypes cannot be explained by disruption.

Instead, they are the result of negative frequency dependent selection on each of these phenotypes, as the fitness of one phenotype strongly depends on the abundance of the other phenotypes. At equilibrium, it is expected that all phenotypes are maintained in the population. Discrete variation is better understood when studying gender. Usually, the success of the uncommon gender is larger than the common gender, as the availability of mates for the latter is reduced (McCauley &

Taylor, 1997; Dufay et al., 2009). A similar situation can be achieved without gender differentiation (Pannell et al., 2005). Such is the case of reciprocal style polymorphisms, shown by some hermaphroditic plants, where morphs have styles and stamens in a reciprocal position (Fig. 1), in such a way that pollination and mating tend to occur between morphs rather than within morphs, maintaining the frequency of morphs (Barrett 2002).

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Fig. 1. Floral variation and pollinators in Mediterranean Linum species: a) L. viscosum visited by an Halictidae bee, b) L. narbonense with Usia pubera bee-fly collecting nectar, c) and d) L. tenuifolium visited by Ceratina cucurbitina and Lasioglossum malachurum bees respectively (courtesy of Blanca Arroyo), e) three dimensional reciprocity in L. suffruticosum, f) Usia sp. collecting nectar in L. suffruticosum, g) conventional distyly in L. tenue. h) L. tenue with nectar collecting U. pusilla, i) L. comptonii visited by pollen collecting Amegilla in South Africa (courtesy of Ross Turner), and j) L. pubescens with Usia bicolor in Israel (courtesy of Yuval Sapir).

The most common style polymorphism is heterostyly (Barrett & Shore,

2008), for which flowers in a population present two (distyly) or three reciprocal morphs (tristyly). This polymorphism has been known since the 16th century (Ornduff,

1992) and called the attention of evolutionists ever since Darwin (1877), and early geneticists, who soon discovered its simple genetic basis (Bateson & Gregory, 1905).

Yet, in those early times, it was recognized that most heterostylous species showed the so-called heteromorphic incompatibility system, for which only crosses between different morphs are compatible, whereas self-fertilization and within-morph cross- fertilization was impeded (Darwin, 1877; Dulberger, 1992). During most of 20th century, heterostyly has been a model system to study evolution of inbreeding avoidance. Furthermore, most of the studies to explain the evolutionary pathways towards the construction of heterostyly were based on proposals by Mather & de

Winton (1941), with important modifications by Baker (1966), which ultimately lead to

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the quantitative model of Charlesworth & Charlesworth (1979). In short, these models predict that reciprocal style polymorphism, and the associated ancillary traits in pollen grains and stigmatic papillae, evolved after the appearance of the incompatibility system, and that the ancestor would have non-herkogamous (homostylous) flowers with high selfing rates and inbreeding depression. During the 90´s, these models were challenged by that of Lloyd & Webb (1992 a, b), who suggested that the main driving force was the promotion of compatible cross pollination to avoid pollen discount (enhanced male fitness, as Darwin himself proposed in 1877). The latter model presumed (i) an independent evolution between reciprocal positioning of anthers and stigmas and the heteromorphic incompatibility systems and (ii) an ancestral condition of an outcrosser with approach herkogamous flowers (i.e., the stigma protruding the anthers). This model strongly emphasized the ecological context of pollination, that specialized pollinators select for and maintain the style morphs if plant morphs are able to place pollen grains on different parts of the body and legitimately deliver them on the opposite stigmas.

The model of Lloyd & Webb (1992 a, b) has progressively gained more support from both microevolutionary and macroevolutionary studies.

Microevolutionary analyses have mostly approached the study of the physiology of the incompatibility reaction (e.g. Sage et al., 1999), and the relative rates of pollination and mating between and within morphs (Lau & Bosque, 2003), and following specific predictions made by Lloyd & Webb's (1992b) model. In contrast, macroevolutionary models to study how the heterostylous floral syndrome evolved

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have been relatively scarce compared to population level studies. However, some plant groups, such as Narcissus, Lithodora and related genera, Pontederiaceae,

Exochaenium, Amsinckia, or Primula (Kohn et al., 1996; Schoen et al., 1997;

Guggisberg et al., 2006; Pérez-Barrales et al., 2006; Ferrero et al., 2009; Kissling &

Barrett, 2013; Santos-Gally et al., 2013) have been very valuable to support Lloyd &

Webb’s (1992 a, b) ideas. Given the ample occurrence of heterostyly both among lineages of Angiosperms (28 families across many orders in both monocots and dicots; Barrett & Shore, 2008) and biomes, these studies offer good opportunities to explore the ecological and biogeographical correlates of heterostyly, which may allow for inferences in the conditions promoting this polymorphism to arise and maintain.

For example, heterostyly should be common in plants where pollination by specialized animals is more frequent, or should be disadvantageous where outcrossing (a salient feature of this reproductive system) is at risk, as expected when pollinators are scarce, or in highly disturbed places (Piper et al., 1986).

Additionally, it would be unlikely to find heterostyly associated with hybridization and polyploidy (both associated to self-fertilization as a by-product, Ramsey & Schemske,

1998), or associated with short-lived plants, particularly in annuals, as these typically present large selfing rates (Barrett, 2002).

Heterostyly has been known to occur in Linaceae since Darwin (1864,

1877) and Hildebrand (1864) seminal works. In particular, Darwin’s experimental and observational work on Linum grandiflorum and L. perenne was very influential in determining the function of the polymorphism. Later, it was suggested that other

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genera in the family could be also style polymorphic, including both distyly and tristyly

(Lloyd et al., 1990; Thompson et al., 1996). After Darwin´s work in Linum, geneticists used species in this genus to study the inheritance of heterostyly and demonstrated that style polymorphism and heteromorphic incompatibility are linked (Lewis, 1943,

1992; Dulberger, 1992; Ushijima et al., 2012). This linkage is expected to be frequent in the genus and its nature quite stable, as most of populations show isoplethic

(equal) morph ratios (Ruiz-Martín, unpublished data). The stability of heterostyly as a trait has been valuable for taxonomists, who used it as binary character (e.g.,

"heterostylous" vs "homostylous") to define some species and groups, and it is frequently used in identification keys (e.g., Ockendon & Walters, 1968; Ockendon,

1971; Martínez-Labarga & Muñoz-Garmendia, 2015; Ruiz-Martín et al., 2015). Thus, taxonomic descriptions have been valuable to characterize species to conduct evolutionary reconstructions of the trait (McDill et al., 2009). However, Linum is a highly diverse genus with a wide geographic distribution, in which the diversity of stylar conditions is greater than previously reported (Ruiz-Martín, unpublished data;

Darwin, 1877; Heitz, 1980; Armbruster et al., 2006). Most of the taxonomic diversity is centred in the Mediterranean and, surprisingly, the morphological variation on the types of polymorphism and other associated traits remain to be explored. Thus,

Linum, the most diverse and widespread genus in Linaceae (The Plant List 2013:

141 species; McDill et al., 2009: 180 species; Mabberley, 2008: 230 species) represents an excellent study system for understanding the correlates and causes of heterostyly.

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The specific aims of our study where: (1) to generate an updated phylogeny of the genus and represent adequately lineages and infrageneric taxa recognized in former studies, (2) to estimate divergence times in such a way that events of evolutionary significance can be dated, (3) to reconstruct ancestral states for stylar condition and other related traits, (4) to estimate significance of correlated evolution between style polymorphism and other traits across the phylogeny, and (5) to put all these results in a geographical and ecological context , which may help in explaining under what conditions heterostyly evolved and validate current evolutionary models.

Material and methods

Floral measurements and categorization

Previous work reported that style polymorphism occurred mostly in the

Mediterranean Basin and South Africa (McDill et al., 2009), thus we concentrated our field sampling efforts in these regions, although others were also explored, and completed information with literature reports. As long as the population size allowed, we collected at least 100 flowers from 50 populations from 50 taxa of Linum distributed mostly along the Mediterranean Basin and South Africa during 2009—

2013 (Table S1). We preserved flowers in 70% ethanol until their measurement in the laboratory. Linum flowers have typically five styles and five stamens, reaching each

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of five similar heights. Previous analysis measuring five styles and five stamens show as same results that measuring only one style and one stamen, in L. suffruticosum and L. tenuifolium populations. Measuring were taken in this way: each style measured include the stigma, all the way down to the top of the ovary; and each filaments were taken in account from the top of the filament to the base where is fused to the base of the ovary. The anthers of Linum specimens are very delicate and they fall easily during manipulation and preservation. We measured one style and one stamen length of each flower from the joining point of the ovary and the stamen filaments. Petals were removed before. All measurements were taken from digital images taken with a stereomicroscope (Zeiss Stemi-2000) and a digital camera attached (Zeiss Axiocam) of the lateral view of flowers using ImageJ

(Rasband, 2008). Data for the remaining species of the genus and outgroup species were collected from the literature (see Table S1 Suppl. Material and Appendix 1).

Overall, we collected information of taxa from almost all regions in the world where

Linum is present: Europe, northern and southern Africa, western and central Asia, the Americas and Australia.

For style polymorphic species, that is, those with discrete morphs for style length, we classified flowers as L-morph when the stigmas were above

(sometimes at the same height but separated horizontally) the anther whorl and, S- morph when the stigmas were below the anther whorl. Style polymorphism may include two morphs (distyly, stigma height dimorphism) or three morphs (tristyly and trimorphism). Species with populations composed only by one-morph flowers are

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called monomorphic and were classified as homostylous (when there is no separation between sexual organs), approach herkogamous (when the stigmas are above the anther whorl), reverse herkogamous (the stigmas are below the anthers) and horizontal herkogamous (when anther-stigma separation is along the horizontal plane of the flower). The distinction is based on extensive flower measurements and frequency distribution of sex organ heights (Ruiz-Martín, unpublished data). It should be recognized that style polymorphism in most taxonomic references is mentioned only as heterostylous (sometimes discriminating distyly from tristyly) or homostylous; the latter is referred to any style monomorphic condition, irrespective of sex organ heights. We discriminate the types above based on data provided on taxonomic descriptions and considered approach and reverse herkogamy when no overlap was reported between stamen and style length, otherwise we considered homostylous condition. This distinction is made because is critical for testing models of evolution of heterostyly in what refers to ancestral stylar condition (true non-herkogamous homostyly in Charlesworth & Charlesworth, 1979 vs approach herkogamy in Lloyd &

Webb, 1992a). Although the most frequent polymorphic condition in Linum is distyly, throughout the text we mostly refer to style polymorphism in general except when otherwise specifically stated.

We considered other biological traits of species putatively related with style polymorphism. Thus, we gathered information from literature references, including floras and monographs, and also original research papers on life-form, chromosome number, breeding system, pollinators, ancillary traits and genetic

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control of polymorphism. This information was completed with systematic and non- systematic observations made during field sampling whenever it was possible, which involved life-form and pollinators (see Table 1 Suppl. Material, for references).

Given that there is not a recent single monograph on Linum, for nomenclature we followed the most recent and comprehensive treatment for regions of high species diversity in the genus: Yusepchuk (1949), Davis (1967), Ockendon & Walters

(1968), Rogers (1981), Greuter et al. (1984), Yilmaz & Kaynak (2008) and McDill et al. (2009).

Phylogeny and Divergence times

Sampling. 111 samples from 108 taxa were included as ingroup. First, a total of 103 samples from 95 taxa (93 species and two subspecies) from species of genus

Linum, representing the five sections, were included. Two samples from different localities were included for eight taxa with taxonomical doubts to test for monophyly.

Second, eight samples from eight species representing closely related genera

(Anisadenia, Cliococca, Hugonia, Hesperolinon, Radiola, Reinwardtia, Sclerolinon and Tirpitzia, McDill et al., 2009) were also included. Three species from closely related families (Hypericum perforatum from Hypericaceae, Viola pubescens from

Violaceae, and Humiria balsamifera from Humiriaceae) were included as outgroup

(Table S1).

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Samples from 51 taxa of Linum were collected in field trips in the

Mediterranean Basin and South Africa (Vouchers are stored at SEV herbarium; Table

S1). Samples from 19 taxa were obtained from herbaria (SEV, MA and E, Table S1).

The DNA sequences from the remaining 32 taxa of Linum, eight other Linaceae and three from other families were directly downloaded from GenBank data base and previously published by McDill et al. (2009, 2011).

DNA extraction, PCR and sequencing. Total genomic DNA was extracted using DNEasy Plant Minikit (QIAGEN Inc., BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA,

USA). One nuclear DNA region, ITS (internal transcribed spacer), and three plastid

DNA regions, NADH dehydrogenase subunit F (ndhF) gene, maturase K (matK) gene and trnL-F spacer were amplified, purified and sequenced. PCR amplificatioin were performed following McDill et al. (2009), with minor modifications. Products were purified using ExoSAP-IT (USB, Cleveland, Ohio, USA). Sequencing reactions were performed using the ABI BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

(Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, U.S.A.) in Macrogene Europe

Laboratory (Amsterdam, The Netherlands).

Phylogenetic analyses. Sequences from the four DNA regions were aligned separately using MaffT 6.0 FFT-NS-I (Katoh & Toh, 2008) as implemented in

Geneious Pro™ 5.3 (Kearse et al., 2012). The resulting alignments were manually revised. Putative homoplasic regions were detected and removed from the alignments using GBlock v0.91b (Castresana, 2000). Incongruence between DNA

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regions was discarded and the four DNA regions were combined in a single matrix

(2,900 pb).

Bayesian inference analysis was performed using Markov chain Monte

Carlo (MCMC) as implemented in MrBayes3.0b4 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001).

The simplest model of DNA evolution for each DNA region was selected from the analysis in ModelTest 3.06 (Posada & Crandall, 1998). GTR +G +I was selected for ndhF and matK regions and GTR +G for trnL-F and ITS regions. To avoid overparameterization, we combined the three plastid regions and analysed it together using GTR +G +I model. Two independent analyses of four Metropolis-coupled

Markov chains were run for 10 million generations. After a burn-in of 25%, the remaining trees (15,000) were used to construct a majority-rule consensus tree using posterior probability values as a measure of clade support. Phylogenetic analyses were performed using CIPRES Science Gateway V. 3.3 portal (Miller et al. 2010).

Analyses of divergence times. The four DNA regions were combined in a single partition (using GTR+G+I as DNA model of evolution). Analyses were conducted using two independent MCMC runs of 50 million generations each, assuming the Yule model for tree prior, as implemented in BEAST v1.4.8 (Drummond

& Rambaut, 2007). Trees were estimated using an uncorrelated lognormal relaxed clock model. Run convergence and burn-in were assessed in Tracer 1.6 (Rambaut &

Drummond, 2007) with a 10% of burn-in. Trees from the two independent runs were combined using LogCombiner 1.4.8 (10% of burn-in). Maximum clade credibility trees

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were calculated with TreeAnnotator 2.3.2 using a posterior probability limit of 0.95, maximum clade credibility tree and the mean heights options.

Two calibration points were used: 1) a normal distribution prior with a mean of 93.5 Ma (95% CI 88-97 Ma), a secondary calibration base on the age of the stem node of Linaceae which is the Malpighiales crown node (Bell et al. 2010) and;

2) a log-normal distribution with mean = 0, standard deviation = 1.0 and zero offset =

33.9 for the crown node of genus Linum (which includes genera Cliococca,

Hesperolinon, Radiola and Sclerolinon). This last calibration point accounts for the oldest Linum fossil. This is a pollen grain from Ebro River Basin (33.9-37.2 Ma, Late

Eocene, Cavagnetto & Anadón, 1996). Analyses of times of divergence were performed using CIPRES Science Gateway V. 3.3 portal (Miller et al., 2010).

Ancestral state reconstruction. We used maximum likelihood approaches to reconstruct the ancestral states of the stylar polymorphism in Linum, implemented in

R (R Core Team, 2015). We performed the analyses on the BEAST Bayesian phylogenetic tree obtained from ITS and chloroplast DNA regions. This tree was pruned to remove tips when the information of character state was unavailable.

Because we included more than one sample for eight species, we also pruned the additional samples for the same species in case of monophyly. Outgroup species and Hugonia busseana (Linaceae) were also pruned. Character ancestral state was estimated for each internal node of the tree using the re-rooting method of Yang et al

(1995) provided as function in the package “phytools” (Revell, 2013), where conditional probabilities are calculated for the root node (which is the same as the

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marginal state reconstruction for that node) and consecutively moves the root to each node in the tree. First, just to compare results with former studies based in a simple binary codification (McDill et al., 2009), we reconstructed ancestral states to understand the evolution of monomorphic vs. polymorphic states. The former included any of the states without within-population differentiation in morphs, with or without herkogamy; the latter include any of the style polymorphism found. Second, we considered for the analysis of ancestral state reconstruction only relevant states to the two competing hypothesis of the evolution of heterostyly (Charlesworth y

Charlesworth, 1979; Lloyd y Webb, 1992a). Thus, we formed five state groups: 1) monomorphic homostyly (ancestral state proposed by Charlesworth & Cahrlerworth,

1979); 2) monomorphic approach herkogamy (ancestral state proposed by Lloyd &

Webb, 1992a); 3) monomorphic reverse herkogamy –which is the alternative state to monomorphic approach herkogamy-; 4) style polymorphism -including conventional distyly, three-dimensional distyly, style dimorphism and trimorphism; and 5) monomorphic horizontal herkogamy. The latter is not included in any of the models, but it was found in some species and we were interested in determining its evolutionary pathway. Finally, because the most common ancestor of Linum (genus

Tirpitzia) presents two monomorphic and one heterostylous species (Suksathan &

Larsen, 2006), we reconstructed ancestral states for Linum codifying the genus

Tirpitzia first as monomorphic and second as heterostylous.

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Phylogenetic correlations. To test the evolutionary correlations between stylar polymorphism and life history, and stylar polymorphism and polyploidy in

Linum, we performed Pagel’s (1994) binary character correlation test implemented in the package “phytools” (Revell, 2015) in R (R Core Team, 2015). We performed the analyses on the same tree used for ancestral reconstruction analysis. Tree was pruned to include species for which information on stylar morph (monomorphic vs. polymorphic), life history (perennial vs. annual), and polyploidy (diploid vs. polyploid) was available.

The method applies a continuous-time Markov model of trait evolution that calculates the likelihood of discrete trait data under two models of evolution, one in which the traits are allowed to evolve independently of one another on the phylogenetic tree and one in which they evolve in a correlated fashion (dependent model). The independent and dependent models can be compared by means of a likelihood ratio test, calculated as 2(log [likelihood (dependent model)] – log

[likelihood (independent model)]). Significance of the difference in log likelihoods is based on a χ2 distribution with 4 degrees of freedom (4 parameters are estimated in the independent model and 8 are estimated in the dependent model). The parameters of the model of trait evolution are the values of the transition rates between the four possible character state combinations in a model of correlated evolution.

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Results

Style polymorphism and other traits. We were able to collect information, in the field or from bibliographic sources, from 93 Linum species (and two subspecies of

L. austriacum), and 11 species from outgroups (8 genera within Linaceae, and 3 in other families). Our sample represents 66% of species number (141) of Linum recorded at The Plant List (2013). Quantitative data of flower measurements are still unpublished and here we resume main results (see Table S1). Within Linum, 46

(49.4%) species have a kind of style polymorphism, 40 (43.0%) are monomorphic, and 8 (8.6%) lack enough data as to ascertain their stylar condition. Style polymorphism was mostly distyly (two morphs), but we could find some deviations.

Thus, L. suffruticosum presented a kind of distyly of particularly high reciprocity, in three dimensions: on the vertical axis of the flower (flowers are either long- or short styled), on the radial axes of this actinomorphic flower (flowers have either outer stamens and inner styles or vice-versa) and on the longitudinal axis of each sex organ (anthers and stigmas are twisted to inner or outer side of the flower)

(Armbruster et al., 2006). Linum grandiflorum shows stigma-height dimorphism, that is styles are either long or short, but stamens do not have a perfectly reciprocal position to stigmas; Heitz (1980) mentioned some populations of L. perenne as having a similar stigma-height dimorphism. Finally, L. hirsutum represents a

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controversial case that resembles trimorphism. There are apparently two anther levels and three style lengths in the three populations sampled, but our sample size is limited as to completely ascertain it (Ruiz-Martín, unpublished data). Given the paucity of these unconventional cases of polymorphism, all of them are pooled as style polymorphism for the analysis of ancestral state reconstruction and of correlated evolution, and only their particular position along the tree is discussed below.

Monomorphism is also variable: non-herkogamous homostyly is present in 24 species, approach herkogamy in 18 species, reverse herkogamy in 3 species and horizontal herkogamy in 3 species (number of species is not congruent with number of species that presents monomorphism because some of them are sampled from different localities to check possible geographical changes: L. suffruticosum, L. tenuifolium, L.tenue, L. aroanium, L. empetrifolium, L. densiflorum, L. decumbens, L. punctatum, L. mucronatum). We were able to find data of breeding system in only 19 species. Twelve species were self-incompatible and seven species are self- compatible; the former were all style polymorphic whereas the later were all monomorphic. All self-incompatible species are of heteromorphic nature, that is, only crosses between morphs render seed. We were able to find data on ancillary traits

(any heteromorphism on pollen size or colour, exine sculpturing, stigma width, stigmatic papillae) for eight taxa, all of them being distylous.

About 27% Linum species in our sample are annual and 73% are perennial, usually herbs, hemicriptophytes and only sometimes subshrubs or small

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chamaephytes, and only one shrub up to 1 m height (eastern Mediterranean L. arboreum) (Table S1).

We found reports on chromosome numbers for 50 taxa; 23 are polymorphic and and 27 monomorphic. Ten out the former and 3 out the latter showed some level of polyploidy (different counts of the whole chromosome set)

(Table S1). A particularly noteworthy case is that of L. suffruticosum, endemic to the western Mediterranean, showing a very particular kind of distyly of extremely precise reciprocity (see above and Armbruster et al., 2006) in all populations examined and showing a polyploid series from diploid to decaploid (Nicholls, 1986; Ana Afonso, personal communication).

The current information on the pollination biology of Linum species is scarce. The information available for Mediterranean species indicates that bombylid flies from the genus Usia are important pollinators of at least distylous species.

Distylous L. pubescens is almost exclusively pollinated by Usia bicolor beeflies

(Bombyliidae) in eastern Mediterranean (Johnson & Dafni, 1998; Gibbs, 2014).

Linum suffruticosum, distylous and endemic from western Mediterranean, is also almost exclusively pollinated by several Usia beeflies. Although also visited by other flies and bees, they do no effectively pollinate flowers and some of them are pollen thieves (Armbruster et al., 2006). We made systematic observations on pollinators on three distylous species, which showed the exclusive abundant presence of Usia beeflies in L. suffruticosum and the wider variety of pollinators in the other species

(Table 1). Our non-systematic observations, mostly on the related pair Linum

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tenuifolium and L. suffruticosum, rendered similar results. Monomorphic L. tenuifolium was visited by a wide array of pollinators, including mostly bees and in lesser extent flies of different sizes, whereas distylous L. suffruticosum was almost exclusively visited by Usia flies of different sizes (as previously reported), which were searching for both nectar and pollen, and frequently used flowers as mating and resting sites overnight (see Fig. 1). Also, the information for other Western

Mediterranean species indicate that Usia species are the main visitors of distylous L. tenue, L. narbonense and L. viscosum (R. Pérez-Barrales,, unpublished), although the latter two species are also visited by solitary bees. Monomorphic L. bienne is reported to be visited by Bombylius spp. bee-flies (Boesi et al., 2009), whereas its closely relative and also monomorphic, the cultivated flax (Linum usitatissimum) is visited mostly by bees (Ssymank et al., 2009). The only information reported for the non-Mediterranean species is that of North American monomorphic L. lewisii (Kearns

& Inouye 1994): the species is visited by 25 species of 9 families of flies and 19 species of 4 families of different orders, with very different body size, efficiency, visit rate, and frequency across populations.

Phylogenetic reconstruction based on Bayesian inference. The analyses of the three plastid (rbcL, matK and trnL-F) and nuclear (ITS) regions recovered congruent topologies under Bayesian criteria (data not shown), thus consensus tree is shown (Fig. S1). Inferred trees were partially congruent with taxonomical subgeneric classification of Linum (sections) as already shown by McDill et al.

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(2009). While the genus Linum was paraphyletic, as core Linum included the genera

Cliococca, Hesperolinon, Screrolinom and Radiola, the family Linaceae was monophyletic. The topology recovered by MrBayes (Fig. S1) showed two main clades, similar to what was found by McDill et al. (2009). The first clade, Clade A, was mainly formed by sects. Linum and Dasylinum, mainly from Eurasia. Specifically, a species from sect. Linum, L. stelleroides from China, is sister to two main clades,

Clade A1, the one formed by most of the species from sect. Dasylinum and the second clade, Clade A2, formed by most of the species from sect. Linum (including also some species from sect. Dasylinum). The second main clade, clade B, formed by the other genera included in core Linum and the remaining sections (Linopsis,

Syllinum and Cathartolinum). Specifically genus Radiola is sister to two main clades,

Clade B1, the one formed by genera Cliococca, Hesperolinon and Scleronlinon and sect. Linopsis from North and South America and South Africa, and the second clade, Clade B2, formed by sects. Linopsis (excluding the species from America and

South Africa), Syllinum and Cathartolinum, and with a distribution mainly in Europe,

Mediterranean Basin and western Asia.

Times of diversification. The topology of the maximum credibility tree inferred from BEAST (Fig. 2) analyses was highly congruent with the majority rule consensus tree inferred from MrBayes. The divergence time for crown node of

Linaceae was 61.35 (MYA) (95% CI: 44.48 - 84.62) (Fig. 1).

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Fig. 2. Phylogenetic tree of Linaceae based on BEAST analysis of combined nuclear (ITS) and plastid (trnL-F, matK and ndhF) DNA regions. Numbers above each branch indicates posterior probability support. Bars in each node indicate 95% CI of the age of each node. Time scale is in millions of years.

The crown node of core Linum was dated back to 35.37 MYA (95% CI: 33.95 -

43.31). The crown node of Clade A was dated back to 30.38 (95% CI: 23.65 - 38.59).

The crown node of clade A1 was about 10.62 MYA (95% CI: 5.62 – 17.42) and the crown node of clade A2 was about 21.89 MYA (95% CI: 15.26 – 28.67). The crown node for clade B was dated back to 19.7 MYA (95% CI: 11.48 - 29.49). Finally, the crown node of clade B1 was about 9.02 MYA (95% CI: 5.58 - 29.49) and the crown node of clade B2 was about 14.67 MYA (95% CI: 8.95 - 22.06).

Evolutionary pathways of style polymorphism and phylogenetic correlations.

Binary reconstruction (monomorphism vs. polymorphism). There were no significant differences when Tirpitzia was coded as polymorphic or monomorphic.

Equivocal ancestral state reconstruction of the most common ancestral of Linum and core Linum (Clade A, Clade A1, Clade A2, Clade B and Clade B2, Fig. 3) precludes inference whether the evolution of heterostyly derived from monomorphic or

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polymorphic taxa.

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Fig. 3. Maximum likelihood ancestral state reconstruction of stylar polymorphism in Linum.

We considered two ancestral states (blue = monomorphic, red = polymorphic) as the simplest way to understand the evolution of heterostyly (see Material and methods for details). Letter above branches are referenced in main text.

Within Clade A1, there is a transition from polymorphism to monomorphism, although this is not significant (see L. seljukorum). Within Clade A2, three clear and significant transitions from polymorphism to monomorphism were inferred (see L. leonii, L. pallescens and L. lewisii). The transitions from monomophic to polymorphic state are also inferred in this clade (see L. grandiflorum and L. narbonense) but they were not significant. The most recent common ancestor of Clade B1 is clearly inferred as monomorphic with two significant transitions to polymorphism (see South

African L. comptonii and L. heterostylum). Within Clade B2, transitions from polymorphism to monomorphism and from monomorphic to polymorphic states were not clear.

Five states reconstruction. There were no significant differences when

Tirpitzia was coded as polymorphic or monomorphic. Equivocal ancestral state reconstruction of the most common ancestral of Linum precludes inference whether the evolution of polymorphism derived from monomorphic or polymorphic taxa (Fig.

4).

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Fig. 4. Maximum likelihood ancestral state reconstruction of stylar polymorphism in Linum.

We considered five relevant states to the two competing hypothesis of the evolution of heterostyly

(Charlesworth y Charlesworth 1979, Lloyd & Webb, 1992a; see Material and Methods for details).

Colours represent the different stylar conditions: blue = homostyly, red = style polymorphism, green = approach herkogamy, yellow = horizontal herkogamy, and orange = reverse herkogamy. Letters above branches are referenced in main text.

The most recent common ancestor of core Linum, Clade A, Clade A1, Clade

A2, Clade B and Clade B2 is equally likely to have presented homostyly or polymorphic state. Within Clade A, clear and significant transitions from polymorphism to homostyly (see L. leonii and L. pallescens; also see L. seljukorum although it was not significant) and from polymorphism to approach herkogamy (see

L. lewisii) were inferred. Also within Clade A, transitions from homostyly to polymorphic state (see L. grandiflorum and L. narbonense) and, to approach herkogamy (see L. hologynum) were inferred, although they were not significant. The most recent common ancestor of Clade B1 is approach herkogamy with four possible transitions inferred: to horizontal herkogamy (see He. micrantum and L. tenuifolium), to polymorphism (see L. comptonii and L. heterostylum), to reverse herkogamy (see

L. littorale and L. prostratum) and to homostyly (see S. digynum). Reconstruction of shallower nodes of Clade B2 inferred clear and significant transitions from polymorphic state to reverse herkogamy (see L. nodiflorum), to horizontal herkogamy

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(see L. tenuifolium) and to homostyly (see L. corymbulosum- L. trigynum clade; only marginally significant). Also within Clade B2 a transition from homostyly or from polymorphic state to approach herkogamy was inferred (see L. volkensii).

Trait correlation. There was marginal support for the correlation between presence of stylar polymorphism and perennially. Our results indicated that a dependent model of evolution between life history and stylar polymorphism did not provide a better fit to the data than an independent model (difference between likelihood–ratio = 9.136, p=0.057), where evolutionary transitions in character state of one trait are unrelated to the state of the second trait (Pagel and Meade, 2006). For the set of 50 species where we were able to get chromosome number data, there was no significant correlation between presence of stylar polymorphism and polyploidy (difference between likelihood-ratio= 3.646, p= 0.456). Correlation between style polymorphism and other traits could not be estimated due to lack of data.

Discussion

Linaceae is one of the families with the largest morphological diversity of style polymorphisms, including homostyly and different types of herkogamy, style dimorphism, distyly, tristily and some kind of trimorphism. Linum also displays most

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of this diversity. This allows testing models of evolution of heterostyly for those traits where specific transitions are predicted, as proposed by Charlesworth &

Charlesworth (1979) and Lloyd & Webb (1992a). Lloyd et al. (1990) called attention on some particular species that failed to support former canonical models

(Charlesworth & Charlesworth, 1979). This stimulated the formulation of a new model, with a strong Darwinian influence, challenging the generally accepted views on the evolution of heterostyly mostly based on genetic evidence (Lloyd & Webb,

1992b). Hugonia within Linaceae was one of the study cases that inspired this model, which was later confirmed as tristylous (Thompson et al., 1996; Meeus et al., 2011).

It is possible that a form of trimorphism is also present in Linum. Surprisingly, the great variation in polymorphism within Linum has been rarely interpreted in the context of the evolution of heterostyly (but see Darwin, 1877; Armbruster et al., 2006 and McDill et al., 2009). Here we gathered variation on traits essential to conduct evolutionary analyses, and used the variation in traits for which variation across species was incomplete to add significance to the evolutionary patterns detected on the phylogeny of the genus.

Phylogeny and divergence times. We confirmed taxonomic aspects that deserve further taxonomic work (e.g., the paraphyly of the genus Linum due to the inclusion of four genera traditionally considered separately and the non-monophyly of some sections, see McDill et al., 2009, 2011). Despite our sampling effort almost duplicated the sampling of previous systematic work (McDill et al., 2009), and that

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some of the DNA regions used were different (we included matK instead of 3’trnK intron and rbcL), the results we retrieved were similar, which gives an extra support to the findings by those authors.

Unlike species groups from other geographic regions, the 14 species in South

Africa, which belong to the sect. Linopsis, formed a well-supported monophyletic clade. This clade was closely related to the American clades, rather than the

Euroasiatic clades of this section. These results reinforce the findings by McDill et al.

(2009) and have important implications for our interpretation of evolution of stylar polymorphisms, given the noteworthy absence of them in the Americas. In our analyses, we were interested to estimate the chronology of divergence leading to clades present in the Mediterranean Basin and the only clade present in South

Africa, which is the only region with style polymorphic Linum species outside the

Mediterranean Basin. Thus, it is remarkable that the South African clade separated from its monomorphic sister American clade in the late Miocene, about 9 MYA. In contrast, its closest Mediterranean clade, which also includes members of section

Linopsis (mostly present in W Mediterranean) as well as mostly eastern

Mediterranean species from section Syllinum, diverged longer ago (in middle

Miocene, more than 14 MYA). Unlike the American clade, these Mediterranean clades include many style polymorphic species. By the time the clades split, continents were already quite separated, particularly Africa and the Americas. Thus, episodes of long distance dispersal should be invoked or, alternatively, massive extinctions of connecting clades in Africa, which would not have left a living trace.

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These episodes are coincident with last Antarctic glaciation and a sharp decrease in temperature in southern Africa (Linder, 2005). Whatever the process was, for some reason the American clades did not contain any style polymorphic lineage. A proper biogeographical analysis considering explicit paleogeographic setting would be needed to ascertain the process.

Evolution of style polymorphism in Linum (models test). When evolution of heterostyly is approached in the context of taxonomic work, it is rarely framed under explicit evolutionary models which help in determining the transitional states.

The previous work in Linum (McDill et al., 2009) provided a plausible reconstruction of pathways of heterostyly and “homostyly” (this term including any monomorphic condition). Although our evolutionary reconstruction included more than twice as the samples included in McDill et al. (2009) and was inferred using different DNA regions, our results were similar (Fig. 3), albeit more complex due to the higher number of taxa sampled.

We were unable to determine the ancestral condition, which could be either style polymorphic and monomorphic (our terms). This can be a consequence of the combination of the inferred high rates of transitions among character states and long- branches arising from the root of the phylogeny. Despite this limitation, we found that the polymorphism has independently evolved several times along the evolutionary history of Linum. Although some clades are integrated by mostly monomorphic or

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polymorphic species, any of these conditions is secondarily lost, even in pairs of sister species. For example, our results showed loss of polymorphism in L. seljukorum-L. pubescens, L. leoni-L. punctatum, L. lewisii-L pallescens, L. tenuifolum-L. suffruticosum, L. corymbulosum-L. trigynum. In addition, polymorphic species evolved in most of monomorphic clades, as shown by the species pairs L. grandiflorum-L. decumbens, L. comptoni-L. pungens; L. heterostylum-L. esterhuysenae. A particular evolutionarily dynamic clade was B2 (Fig. 3), especially the mostly W Mediterranean subclade including from L. virgatum to L. setaceum.

This is the case of L. suffruticosum s.l. (López-González, 1979; Martínez-Labarga &

Muñoz-Garmendia, 2015), or that of Linum tenue, which at present cannot be considered monophyletic, and have wide phenotypic variability in NW Africa (J.

Arroyo and J. Ruiz-Martín, pers. observ). A recent detailed study of some of these taxa revealed the existence of a new species, L. flos-carmini (Ruiz-Martín et al.,

2015), separated from L. setaceum because its heterostylous condition, among other traits. Clearly, further work is needed in these taxa and geographic range.

The most salient result of this analysis is, notwithstanding, the independent evolution of heterostyly in two South African species in a clade. It was already suggested that heterostyly appeared in South Africa independently from its occurrence in the Mediterranean Basin and nearby regions (Rogers, 1979), and later supported by phylogenetic analyses (McDill et al., 2009). For these reasons, we put special effort in South African Linum according to the information provided by Rogers

(1979) and were able to collect all the 14 species in the region. Although limited, our

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population sampling allowed us to confirm style polymorphism (distyly) in two species

(L. comptonii and L. heterostylum). Because South African Linum clade is monophyletic and more related to the monomorphic clade of American Linum species, the independent evolution of the polymorphim is thus fully supported. Unlike

American species, all South African Linum species, except L. thurnbergi, are restricted to Mediterranean type climate of the Cape Floristic Region (Rogers, 1979).

Thus it became apparent that some direct or indirect biogeographic effect of climate type is probably occurring to explain this apparent case of convergence.

When we characterised monomorphism and identify homostyly and different herkogamy types (Fig. 4) the reconstruction of pathways became more complex but allowed us explicitly testing competing hypotheses of ancestral stylar state. At the genus level, the ancestral state was unresolved being both homostyly and heterostyly equally likely. Approach herkogamy is the ancestral state proposed in the model of Lloyd & Webb (1992a) but this is not supported at the genus level. The variability of stylar conditions in Linaceae and in Linum (Ganders, 1979; Lloyd et al.,

1990; Thompson et al., 1996; Suksathan & Larsen, 2006; McDill et al., 2011) in combination with long branches may explain this lack of resolution. Perhaps a detailed analysis at the whole family would throw more light. Interestingly, the only clade within Linum where heterostyly is present and the ancestral state was well resolved is the South African clade. Here, the Lloyd & Webb (1992a) model is supported, as the ancestral state is reconstructed as approach herkogamy.

Interestingly this is the only clade where approach herkogamy is widespread. In other

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groups, although present, approach herkogamy is very rare (Linum lewisii, L. volkensii and L. hologynum) whereas homostyly is more frequent. This homostyly is secondary, derived from a polymorphic condition, and perhaps related with a shift towards selfing for reproductive assurance (see for instance L. corymbulosum and L. trigynum, or L. leonii) although we do not have information on the breeding system of these species. Such shifts have been reported in other style polymorphic groups

(Schoen et al., 1997; Guggisberg et al., 2006; Mast et al., 2006; Pérez-Barrales et al., 2006; Kissling & Barrett, 2013; Santos-Gally et al., 2013).

Other stylar conditions are scarcer. Reverse herkogamy, a necessary phenotype in an intermediate step for the establishment of style polymorphism is present in three species: one Mediterranean species (L. nodiflorum) and two South

American sister species (L. littorale and L. prostratum). In all cases, this is a derived situation. A similar transition has been reported for Exochaenium in the

Gentianaceae (Kissling & Barrett, 2013). Horizontal monomorphic herkogamy is present in two Linum species (L. kingii and L. tenuifolium) and two closely related genera (Radiola and Hesperolinum), which are placed within Linum (as McDill et al.,

2009 already reported). It might have been selected for avoiding self-pollination, as in the self-compatible L. tenuifolium (Nicholls, 1986) (see Fig. 1). Finally, we did not consider reconstruction of the stigma height dimorphism of L. grandiflorum. This condition has been reported as an intermediate unstable condition towards heterostyly (Lloyd & Webb, 1992b, but see Barrett & Harder, 2005), which is consistent with its unclear ancestral/derived condition. This evolutionary lability has

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Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

been reported for stigma-height dimorphism in some Boraginaceae (Ferrero et al.,

2009).

Correlated evolution and trait associations. There are few phylogenetic studies of style polymorphism and traits putatively associated to its evolution (e.g. corolla size and form: Santos-Gally et al., 2013; Kissling & Barrett, 2015). Here, we were able to estimate correlation between style polymorphism and life form (annual vs perennial), and found only a marginal significance for style polymorphism being more frequent among perennial species. This association is expected (Dulberger,

1992) because pollination of style polymorphic plants is expected to be specialized

(Darwin, 1877; Lloyd & Webb, 1992a; Lau & Bosque, 2003) and short-lived plants, especially annuals, are more sensitive to loss of these pollinators. Reproductive assurance would play a role against maintaining style polymorphism. Similar effects could be expected about disturbed habitats or remote places (Barrett et al., 1989), but it remains to be examined. Data on breeding systems of the species would be particularly valuable here.

One of the traits directly related to breeding system and thus with style polymorphism is polyploidy. In our data set of 50 species of Linum, we failed to detect a significant correlation between these traits. Several studies have showed that there is a variable association between heterostyly and polyploidy, from no correlation to heterostyly being more frequent among diploids (Naiki, 2012). Across

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families, phylogenetic account of these studies suggests that this may stand only for

Rubiaceae and Primulaceae (Naiki, 2012). At least for Primula, it has been demonstrated that heterostyly is not present among allopolyploid taxa (Guggisberg et al., 2006), which has been also suggested for Turnera (Shore et al., 2006). This is in agreement with the mechanism of breakdown of heterostylous supergene by recombination linked to hybridization (Lewis & Jones, 1992). It is possible that among the Linum species in our data set, most of polyploid series are autopolyploids.

Although hybridization occurs among some species of Linum, this occurs mostly between those with similar chromosome numbers (Seetharam, 1972; Muravenko et al., 2003; Yurkevich et al., 2013).

A pair of closely related species may be particularly illustrative in this respect. Linum tenuifolium is monomorphic and diploid across its wide range in

Europe and western Asia, whereas Linum suffruticosum, with three-dimensional reciprocity (Fig. 1, Armbruster et al., 2006), displays a polyploid series from diploidy to decaploidy (Nicholls, 1986; Ana Afonso, unpublished data) across its western

Mediterranean range. Both species produce abundant viable seeds in dozens of populations examined, have no mean of vegetative reproduction, and for L. suffruticosum, population morph-ratios are isoplethic, a typical result of its heteromorphic incompatibility system (José Ruiz-Martín, unpublished data; Nicholls

1986; Armbruster et al., 2006). Interestingly, all the few Linum species so far analysed with self-incompatibility, it is of heteromorphic type, whereas all the species that showed self-compatibility were monomorphic, with no intermediate cases being

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Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

reported. Thus, the independent evolution of presence and type of self-incompatibility and style polymorphism proposed by Lloyd & Webb (1992a) is not supported, although many more species should be screened (cf. Lithodora and Glandora in the

Boraginaceae, Ferrero et al., 2012). Incidentally, all the eight style polymorphic species, which have been checked for the presence of typical ancillary traits linked to heterostyly showed them, reinforcing the cohesiveness of the heterostylous syndrome in Linum.

Are pollinators involved in convergence of style polymorphism in

Linum? One of the most insightful predictions made by Lloyd & Webb (1992a) stated that pollinators are critical for the selection of the polymorphism. Pollinators need to fit tightly with flowers and contact anthers and stigmas in specific body parts to legitimately transfer pollen between morphs. This involves the shape of flowers and the behaviour of pollinators. Flower morphology in Linum has relatively little variability in shape (funnel-like corolla of limited variation in tube width), thus pollinator behaviour becomes crucial. Actual pollinator data is rare for comparative analyses in large phylogenies (but see Santos-Gally et al., 2013). Our own observations and information from literature sources correspond to only five northern Hemisphere species, which offers limited insight for a whole genus picture. However, two unrelated species studied in detail (Johnson & Dafni, 1998; Armbruster et al., 2006) allow for some interesting inferences: Linum pubescens (eastern Mediterranean range, sect. Dasylinum, pink flowers, distylous, clade A1 in Fig. 4) and L.

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suffruticosum (western Mediterranean, sect. Linopsis, white flowers, three- dimensional distylous; B2 in Fig. 4). Both of them are almost exclusively pollinated by

Usia bee-flies (Bombyliidae): U. bicolor in L. pubescens and two species of different size in L. suffruticosum. The behaviour is similar in both Linum species and typical of these bee-flies (Orueta, 2002). They land on flowers, where they spend time searching for both pollen and nectar, mating, basking and even resting overnight.

Armbruster et al. (2006) describe in detail how efficient they are in transferring pollen in legitimate pollinations between style-morphs by precisely entering the flower through the gap between stamens and pistils, and petals, something that other flower visitors cannot do (Fig. 1). Although the behaviour of U. bicolor on L. pubescens flowers is described only with regard visual stimuli, we can suppose its behaviour is similar given the similar flower shape and rewards (Fig. 1). Usia species are common in other Mediterranean distylous Linum species (Du Merle & Mazet, 1978; and personal observations). Interestingly, Usia is a truly Mediterranean genus with its highest species diversity in the Iberian Peninsula, northern Africa, and Anatolia and the Levant (Gibbs, 2011, 2014; Fig. 5).

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Fig. 5. Map of the Mediterranean Basin with the range of the bee-fly tribe Usiini (Diptera,

Bombyliidae), which includes Usia species, whose highest species diversity is marked by ovals. Based on Gibbs (2011, 2014).

If heterostyly in Linum is restricted in the Northern Hemisphere to the

Mediterranean Basin due to its tight association to Usia flies is a challenging hypothesis that deserves further insight. The only monomorphic species with detailed data on pollinators is L. lewisii in North America, were other flies (mostly muscoids) are visiting flowers in addition to bees (Kearns & Inouye 1994). Our non-systematic observations in the European monomorphic Linum tenuifolium, has also a variety of pollinators whose behaviour is not precise in accessing specific parts of the flowers

(see Fig. 1).

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Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

The tight association between Linum and Usia seem to be more specific for the plants than for the insects, as these also visit other plant species with similar purposes (Orueta, 2002). However, this level of specialization is uncommon in the

Mediterranean flora. Instead, generalist and variable pollination is the norm, in communities (Petanidou et al., 2008) and populations (Herrera, 2005). This specialized pollination provides strong support for the Darwinian model of Lloyd &

Webb (1992a), particularly in the case of L. suffruticosum. These species possess a heteromorphic incompatibility system, which prevents all illegitimate crosses in all style polymorphic Linum species so far studied. Then, why then has the sophisticated three-dimensional reciprocal distyly evolved apart from increasing efficiency of between-morph pollination and thus avoiding pollen discounting? Torsion of sex organs responsible for this particular reciprocity was previously observed by Darwin in L. grandiflorum, (Darwin, 1877) and has been further reported in the monomorphic

L. usitatissimum (Schewe et al., 2011), albeit incompletely studied.

The information on pollination of South African Linum species is virtually absent, which prevents us to make strong inferences about the causes of the appearance of heterostyly there. However, there is some insight, which can be obtained from the particular pollination biology of South African plants under

Mediterranean-type climate (the Cape Floristic Region, CFR). Heterostyly is frequent there (Ornduff, 1974) and even a new related type has been discovered in response to specific pollinators, which are present only in this region (Pauw, 2005). In the CFR pollinators are much more diverse and specialized than in the Mediterranean Basin

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(Johnson & Steiner, 2003). Although comparative studies on the effects of these contrasting scenarios are still scarce, there is some evidence that this is in part responsible for the higher diversity in CFR plant clades in comparison with

Mediterranean ones (Valente et al., 2012; Valente & Vargas, 2013). The opposite pattern of diversity is shown by Linum. It is not probable that this is the result of a limited fly pollination there, as this pollination type has one of the highest representations across the world (Johnson, 2010). Although Usia is not present in the

CFR, other Bombyliidae may act similarly, as for instance the bee-fly Megapalpus nitidus as the almost exclusive pollinator of Gorteria diffusa (Asteraceae), in which flower heads these insects search for resting places associated to dark spots

(Johnson & Midgley, 1997), as it occurs in many other CFR plants and also in

Mediterranean Linum species (Johnson & Dafni, 1998).

Finally indirect evidence comes from the recent discovery of three- dimensional heterostyly in a group of CFR Oxalis species (Oxalidaceae) (Turketti et al., 2012). The arrangement of stamens and styles is very similar to that of L. suffruticosum, except that all Oxalis species are tristylous. This is the second report of this unique floral syndrome. Despite being from a different family, flower architecture is similar in these species, that is, funnel-like corollas. We do not know the pollinators of those Oxalis species but we can hypothesize that are insects behaving similarly to Usia flies in the Mediterranean Basin. As Armbruster et al.

(2006) guessed, perhaps this kind of style polymorphism is not so rare and only needs closer examinations of flowers. This might throw light of how this specialized

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system arose, and would give an additional support to the Darwin’s views on heterostyly.

Conclusions

Linum has proved to be a good model system for studying the evolution of heterostyly, both at macro and microevolutionary levels. The genus contains one of the largest ranges of morphological diversity related with heterostyly, and is present in many ranges across the world. In contrast, genetic systems linked to heterostyly seems to be rather invariant, for which it could assumed, as working hypothesis, that pollinators have moulded floral morphological variation on sex organs. Phylogenetic relationships have been reasonably well resolved and hence good evolutionary hypotheses about convergence can be tested. If species with similar trait assemblages in different clades and in different areas of the Mediterranean and

South Africa are found then this indicates ecological convergence rather than phylogenetic conservatism. If true this would be a strong support for the Darwinian pollinator hypothesis for the evolution of heterostyly.

Acknowledgements

This study forms part of a PhD project of JRM, who received a fellowship from

MINECO (FPI: BES-2008-003946). This study was funded by MINECO grants

(CGL2013-45037-P, CGL2010-11379-E, CGL2009-12565, CGL2006-13847-CO2-

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01). RSG was recipient of a postdoctoral contract from the Andalusian regional government (excellence grant P09-RNM-5280) and from the University of Seville.

RPB had a postdoctoral contract of the “Juan de la Cierva” program, and ME had a postdoctoral contract of MINECO. Many people helped in collecting or locating populations, particularly: M. Benavent, Y. Bouchenak-Khelladi, A. de Castro, S.

Gómez-González, J.J. Aldasoro, J. A. Mejías, P. Peñalver, S. Moreno, A. Pérez and

Ross Turner. Blanca Arroyo, Yuval Sapir and Ross Turner provided some photographs for Fig. 1 and Jordi Bosch identifies bees on Linum tenuifolium flowers.

Ana Afonso, Silvia Castro and Joao Loureiro provided valuable information on Linum chromosome numbers.

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Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Supplementary material

Table 1. Floral visitors observed and number of visits observed in three style polymorphic

Linum species (L. narbonense, L. tenue and L. suffruticosum) in the Sierra de las Nieves (SW Spain) on the 5-9 June 2014 during 15 h of observations. Observations were made between 11:30 and 17:00.

Identification was made to the lowest possible taxonomic level. All observations were conducted by the same person.

L. L. L.

narbonense suffruticosum tenue

Bee-flies 7 121 33

Usia cf. pusilla

Bombylius sp. 17

Bees

Lassioglosum 1 15

Rhodanthidium 19 sticticum

Apis mellifera 7

Unknown bee 4

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in

Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Lepidoptera 17 10

(including Gonepteryx cleopatra and Pieris brassicae)

Total 48 121 82

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Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

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Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in

Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Fig. S1. Phylogenetic tree of Linaceae based on BEAST analysis of combined nuclear (ITS) and plastid (trnL-F, matK and ndhF) DNA regions. Numbers above each branch indicates posterior probability support. Bars in each node indicate 95% CI of the age of each node. Time scale is in millions of years. Tip labels include species name, section and distribution.

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in

Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

1 Table S1. Source of plant material and traits considered in the study. References for literature sources are given in Appendix S1.

S G

GenBank G G S tylar

Sa enBank Accesion enBank enBank tylar condition Chr b

Tax S D mpled Coordenate Accesion no. Accesion Accesion condition (five L R omosome Refe reeding R on ection istribution population s no. ITS ndhF5-8 no. trnL-F no. matK (binary) states) ife-form eferences Number rences system eferences

Oc F FJ H L. C N Mc F M H A kendon& n=8/ Harris, - - J160796 160880 M544103 catharticum athartolinum Med. Dill, 2009 NA J169533 onomorphism omostyly nnual Walters, 1968 2n=16 1968 - -

Az

L. D A erbayan F F For F P P S Da - - densiflorum A asylinum zerbaijan (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescent vis, 1967 -- - -

L. D T Tu 40º06'57.8''N/3 F F For F P P S Da - - densiflorum B asylinum urkey rkey 2º36'17.8''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescent vis, 1967 -- - -

P

F FJ H erennial n=8; Ray, S

L. D T Mc F J160788 160872 M544106 P P often Da 2n=16/n=16; 1944; Rogers, 1972; elf- M hirsutum asylinum urkey Dill, 2009 NA J169520 olymorphism olymorphism lignified vis, 1967 2n=32 Pogan et al, 1987 incompatible urray, 1986

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

L. D T Mc F F FJ H P P p Yu - - hypericifolium asylinum urkey Dill, 2009 NA J169519 J160789 160873 M544107 olymorphism olymorphism erennial zepchuk, 1974 -- - -

Tu Mo

L. D T rkey F F For F S untain flora of - - olympicum asylinum urkey, Greece (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? uffruticose Greece -- - -

Chenn

F FJ aveeraiah & Joshi, S

L. D S Mc F J160790 160874 M P P A W 2n= 1983; Mohamed, M. elf- D pubescens asylinum yria Dill, 2009 NA J169518 issing Data olymorphism olymorphism nnual olfe,2001 18 ; 2n=16 K. 1997 incompatible ulberger, 1967

Tu

L. D T rkey F F For F M H A Da n=8; - - seljukorum asylinum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly nnual vis, 1967 2n=16 - -

Mo

L. D G Gr 40º04.9'N/22º2 F F For F P P S untain flora of 2n= Petrov - - spathulatum asylinum reece eece 2.7'E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescent Greece 16/2n=36 a, 1972; Rogers, 1972 - -

Tu

L. D T rkey F F For F P Da - - unguiculatum asylinum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? erennial vis, 1967 -- - -

NA F FJ L. D S Sp F M P P P Oc n=8; Ray, - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

viscosum asylinum pain ain J169517 J160791 160875 issing Data olymorphism olymorphism erennial kendon, 1968 2n=16 1944 - -

A Rui

L. L A Alg 34°47'16.44"N/ F F For F P P nnual or z-Martín, - - virgatum inopsis lgeria eria 0°15'27.79"W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism biennial unpublished -- - -

A

L. L S So 33º59'55.60"S/2 F F For F M pproach P Ro n=1 Rogers - - acuticarpum inopsis outh Africa uth Africa 0º26'33.70"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 5 , 1983 - -

A

L. L S So 34º33'02.10"S/1 F F For F M pproach P Ro - - adustum inopsis outh Africa uth Africa 9º25'37.80"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

A

L. L S So 34º25'48.80"S/2 F F For F M pproach P Ro - - aethiopicum inopsis outh Africa uth Africa 0º39'50.50"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

A Chenn S

L. L S So 34º09'39.40"S/1 F F For F M pproach P Ro n=1 aveeraiah & Joshi, elf- D africanum inopsis outh Africa uth Africa 8º52'16.00"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 6/2n=30; 2n=29 1983; Rogers, 1983 compatible ulberger, 1974

A

L. L S So 34°44'26.10"S/1 F F For F M pproach P Ro - - brevistylum inopsis outh Africa uth Africa 9°40'44.89"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

L. L S So 32º37'51.20"S/1 F F For F P P P Ro n=1 Rogers - - comptonii inopsis outh Africa uth Africa 9º09'05.80"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial gers, 1981 5 , 1983 - -

P Fe

L. L A Alg 36°52'4.80"N/ F F For F P P erennial/ nanne et al., n=1 Ray, - - corymbiferum inopsis lgeria eria 4°50'16.40"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism Bienniall 2007 5; 2n=18/2n=30 1944; Rogers, 1972 - -

Chenn

L. L G Gr 38º00'28.9''N/2 F F For F M H A Yu n=9; aveeraiah & Joshi, - - corymbulosum inopsis reece eece 2º16'30.4''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly nnual zepchuk, 1974 2n=18 1983 - -

A

L. L S So 33º55'05.10"S/2 F F For F M pproach P Ro - - esterhuysenae inopsis outh Africa uth Africa 2º01'32.20"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981. -- - -

L. L G Gr 37º59'32.3''N/2 F F For F M H A Flo n=1 Ray, - - gallicum inopsis reece eece 2º27'47.0''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly nnual ra of Greece 0; 2n=20 1944 - -

A

L. L S So 33º57'24.50"S/2 F F For F M pproach P Ro n=1 Rogers - - gracile inopsis outh Africa uth Africa 3º31'02.00"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 5 , C. M., 1983 - -

L. L S So 33º58'09.40"S/2 F F For F P P P Ro n=1 Rogers - - heterostylum inopsis outh Africa uth Africa 1º13'06.00"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial gers, 1981 5 , C. M., 1983 - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

H P F FJ L. L C US F M M orizontal erennial/ Ro n=1 Rogers - - J160780 160864 kingii inopsis , S USA A NA J169555 issing Data onomorphism herkogamy Biennial gers, C. M. 1968 3; 2n=26 , 1972 - -

L. L G Gr 38º04'06.6''N/2 F F For F M H A Flo - - liburnicum inopsis reece eece 2º23'00.3''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly nnual ra of Greece -- - -

R Mil n=1 F FJ L. L S Mc F M M everse P dner & Rogers, 8; 2n=36/n=36; Rogers - - J160781 160865 littorale inopsis America Dill, 2009 NA J169543 issing Data onomorphism herkogamy erennial 1978 2n=72 , 1972 - -

A Mil F FJ L. L S Mc F M M pproach P dner & Rogers, n=3 Rogers - - J160782 160866 macraei inopsis America Dill, 2009 NA J169544 issing Data onomorphism herkogamy erennial 1978 6; 2n=72 , 1972 - -

H S F FJ L. L S Mc F M P P erbaceous Oc n=1 Rogers elf- D J160811 160895 maritimum inopsis pain, Italy Dill, 2009 NA J169535 issing Data olymorphism olymorphism perennial kendon, 1968 0; 2n=20 , 1972 incompatible ulberger, 1974

B Fe

L. L M Alg 34°50'59.14"N/ F F For F P P iennial or nanne et al., n=1 Rogers - - mumbyanum inopsis orocco, Algeria eria 1°21'24.37"W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism perennial 2007 0; 2n=20 , 1972 - -

L. L M M 35º11'52.8''N/0 F F For F P P P - - Fe numidicum inopsis orocco, Algeria orocco 3º58'50.2''W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial -- - - nanne et al.,

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

2007

L. L S Mc F F FJ H P Ro n=1 Rogers - - oligophyllum inopsis America Dill, 2009 NA J169546 J160783 160867 M544111 ? ? erennial gers, 1978 8; 2n=36 , 1972 - -

R P F FJ L. L S Mc F M M everse erennial or Ro n=1 Rogers - - J160784 160868 prostratum inopsis America Dill, 2009 NA J169545 issing Data onomorphism herkogamy annual gers, 1978 8; 2n=36 , 1972 - -

A

L. L S So 32º22'26.10"S/1 F F For F M pproach P Ro - - pungens inopsis outh Africa uth Africa 9º03'48.30"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

A

L. L S So 33º57'06.70"S/1 F F For F M pproach P Ro - - quadrifolium inopsis outh Africa uth Africa 8º27'05.70"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

A Flo F FJ H L. L C US F M pproach P ra n=1 Harris, - - J160785 160869 M544113 rupestre inopsis , S USA A NA J169553 onomorphism herkogamy erennial mesoamericana 8 1968 - -

S Ray,

L. L pain, Portugal, Sp 36º47'39''N/4º5 F F For F M H A Oc n=9; 1944; Rogers, C. M. - - setaceum inopsis Morocco ain 9'24.4''W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly nnual kendon, 1968 2n=18 1980 - -

-- L. L M M 34º54.555'N/5º F F For F P P A Rui - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

flos-carmini inopsis orocco orocco 32.193'W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism nnual z-Martín et al., - -

2015

A F FJ L. L U Mc F M M pproach P Sm n=1 Harris, - - J160786 160870 striatum inopsis SA, Canada Dill, 2009 NA J169554 issing Data onomorphism herkogamy erennial all, 1907 8 1968 - -

Ray,

F FJ 1944;

L. L C Mc F J160806 160890 M M H A Oc n=9; Chennaveeraiah & - - strictum inopsis osmopolitan Dill, 2009 NA J169530 issing Data onomorphism omostyly nnual kendon, 1968 2n=18/ 2n=32 Joshi, 1983 - -

Fe

L. L M M 34.77457ºN/3.7 F F For F P P A nanne et al., - - subasperifolium inopsis orocco orocco 9526ºW orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism nnual 2007 -- - -

S R

L. L S Sp 36º47'39''N/4º5 F F For F P P S Oc n=1 Rogers elf- ogers, 1979; suffruticosum A inopsis pain ain 9'24.4''W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescens kendon, 1968 8; n=36/2n=72 , 1972;Rossello, 1987 incompatible Nicholls, 1984

S R

L. L It Ital 44.20828ºN/8.3 F F For F P P S Oc n=1 Rogers elf- ogers, 1979; suffruticosum B inopsis aly y 9239ºE orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescens kendon, 1968 8; n=36 , 1972 incompatible Nicholls, 1984

L. L M M 32º00'58.25''N/ F F For F P P A Oc n=1 M Rogers S tenue A inopsis orocco orocco 06º43'12.28''W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism nnual kendon, 1968 0; 2n=20/2n=30 urray, 1986 , 1972; A. Seetharam, elf-

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

1972. incompatible

Rogers S

L. L M M 30º40'43''N/09º F F For F P P A Oc n=1 , 1972; A. Seetharam, elf- M tenue B inopsis orocco orocco 29'15''W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism nnual kendon, 1968 0; 2n=20/2n=31 1972. incompatible urray, 1986

Rogers S

L. L A Alg 34°52'39.14"N/ F F For F P P A Oc n=1 , 1972; A. Seetharam, elf- M tenue C inopsis lgeria eria 1°14'38.72"W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism nnual kendon, 1968 0; 2n=20/2n=32 1972. incompatible urray, 1986

H H S N

L. L S Sp 42º20'27.77''N/ F F For F M orizontal erbaceous Oc n=9; Ray, elf- icholls, tenuifolium A inopsis pain ain 1º43'08.50''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy perennial kendon, 1968 2n=18/ 2n=16 1944; Baksay, 1956 compatible 1985a,b

H H S N

L. L T Tu 40º38'01.0''N/3 F F For F M orizontal erbaceous Oc n=9; Ray, elf- icholls, tenuifolium B inopsis urkey rkey 3º36'32.1''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy perennial kendon, 1968 2n=18/ 2n=17 1944; Baksay, 1956 compatible 1985a,b

A

L. L S So 33°57'06.70"S/1 F F For F M pproach P Ro - - thesioides inopsis outh Africa uth Africa 8°27'05.70"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

A

L. L S So 28°41'09.92"S/2 F F For F M pproach P Ro - - thunbergii inopsis outh Africa uth Africa 8°53'57.05"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

L. L C Mc F F FJ M M H A Da n=1 Rogers - - trigynum inopsis osmopolitan Dill, 2009 NA J169536 J160810 160894 issing Data onomorphism omostyly nnual vis, 1967 0; 2n=20 , 1972 - -

A F FJ L. L U Mc F M M pproach A Ro n=1 Harris, - - J160812 160896 vernale inopsis SA Dill, 2009 NA J169552 issing Data onomorphism herkogamy nnual gers, 1978 5 1968 - -

A

L. L S So 33º51'57.20"S/2 F F For F M pproach P Ro - - villosum inopsis outh Africa uth Africa 2º48'04.40"E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy erennial gers, 1981 -- - -

A P F FJ H L. L T Mc F M pproach erennial or Ro n=2 Lewis, - - J160813 160897 M544116 volkensii inopsis anzania Dill, 2009 NA J169531 onomorphism herkogamy annual bson, 1963 7 1964 en Rogers, 1982 - -

Ira

L. L Ir n F F For F P - - bungei inum an (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? erennial -- - -

P F FJ L. L A Mc F M M H erennial or Be 2n= Jhala, - - J160804 160888 marginale inum ustralia Dill, 2009 NA J169528 issing Data onomorphism omostyly annual ntham, 1863 80 2008 - -

L. L T Taj 38º38'06''N/70º F F For F P P P Yu - - lanuginosum inum ajikistan ikistan 42'36''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial zepchuk, 1974 -- - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

W

L. L Mediterranean, Ital 42º29'17.4''N/1 F F For F P P P Pig n=9; Ray, - - alpinum inum C Europe y 3º00'28.9''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial natti, 1982 2n=18/ 2n=36 1944; Van Loon, 1980 - -

L. L T Gr 38º00'37.9''N/2 F F For F P P S Da 2n= Mount - - aroanium A inum urkey, Greece eece 2º16'06.5''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescens vis, 1967 36 ain flora of Greece - -

L. L T Tu 40º06'57.8''N/3 F F For F P P S Da 2n= Mount - - aroanium B inum urkey, Greece rkey 2º36'17.8''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescens vis, 1967 36 ain flora of Greece - -

H Ray, S F FJ L. L M Mc F M P P erbaceous Fe n=9; 1944; A. Seetharam, elf- O J160799 160883 austriacum inum ed. Basin Dill, 2009 NA J169522 issing Data olymorphism olymorphism perennial nanne et al 2007 2n=18/2n=36 1972 incompatible ckendon, 1968

L. H austriacum L M M 35º08'N/05º08' F F For F P P erbaceous Fe - - gomaricum inum orocco orocco W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism perennial nanne et al 2007 -- - -

L. austriacum L M M 33° F F For F P P S Fe Devesa - - mauritanicum inum orocco orocco 3'33.23"N/5° 2'14.35"W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffruticose nanne et al 2007 n=9 , 1984 - -

Fu, F FJ H L. L C Mc F M H Fe n=1 D A 2010;Ockendon, S J160797 160881 M544102 bienne inum osmopolitan Dill, 2009 NA J169527 onomorphism omostyly nanne et al 2007 5, 18/2n=30, 32 ulberger, 1974 nnual, 1968; Mugnier, C. elf-

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

biennial 1981 compatible

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Roselló & F. N.

Andrés. 1988.

Números

cromosómicos para

la flora Española.

504–515. Lagascalia

15: 112–119.

Fu,

2010; Chichiricco &

A Tammaro, 1980;

L. L It Ital 37º41'10.3"N/1 F F For F M H nnual, Oc n=1 Mohamed, M. K. - - decumbens A inum aly y 3°36'39.4"W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly biennial kendon, 1968 5,18; 2n=32 1997 - -

Fu,

2010; Chichiricco, G.

A & F. Tammaro. 1980;

L. L It Ital 37º50'42.0''N/1 F F For F M H nnual, Oc n=1 Mohamed, M. K. - - decumbens B inum aly y 3º25'58.9''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly biennial kendon, 1968 5, 18; 2n=32 1997 - -

L. L T Tu 38º24'09.5''N/3 F F For F P P Da - - C empetrifolium A inum urkey rkey 4º01'41.4''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism vis, 1967 -- - - aespitose

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

perennial

C

L. L T Tu 40º02'19.1''N/4 F F For F P P aespitose Da - - empetrifolium B inum urkey rkey 0º29'08.2''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism perennial vis, 1967 -- - -

Ray, S L F FJ L. L A Mc F M P P A Qu n=8; 1944; Muravenko, elf- ewis D., 1943; J160798 160882 grandiflorum inum lgeria Dill, 2009 NA J169525 issing Data olymorphism olymorphism nnual ezel, 1963 2n=16 2004 incompatible Darwin, 1877

A P

L. L G Gr 39º50'46.7''N/2 F F For F M pproach erennial, Oc n=9; Ray, - - hologynum inum reece eece 1º12'31.0''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism herkogamy woody base kendon, 1968 2n=18/2n=42 1944; Petrova, 1972. - -

P Ocken

L. L G Ge 51º29'32''N/09º F F For F M H erennial Oc n=9; don, 1968; Gregor, T. - - leonii inum ermany, France rmany 18'13''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly caespitose kendon, 1968 2n=18; 2n=20 & R. Hand., 2006 - -

A S K F FJ L. L Mc F M M pproach P Oc n=9; Harris, elf- earns et al. J160800 160884 lewisii inum W of N America Dill, 2009 NA J169523 issing Data onomorphism herkogamy erennial kendon., 1968 2n=18 1968/ Ray, 1944 compatible 1994

Tu

L. L T rkey F F For F S - - meletonis inum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? uffruticose -- - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Ray,

1944; Ruíz de Clavijo

n= E., 1993;

S 7, n=9, n=14/ Chennaveeraiah & S

L. L pain, Italy, Sp 39°06'16.81"N/ F F For F P P S Oc 2n=28, 2n=20, Joshi, 1983; A. elf- M narbonense inum France ain 1°01'56.28"W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffruticose kendon, 1968 2n=18 Seetharam, 1972 incompatible urray, 1986

H Gill,

L. L T Tu 38º52'20.1''N/4 F F For F P P erbaceous Da 2n= 1987; Magulaev, A. - - nervosum inum urkey rkey 2º31'24.9''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism perennial vis, 1967 30, 2n=18 V., 1984. - -

Tu

L. L T rkey F F For F P P S Da - - obtusatum inum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffruticose vis, 1967 -- - -

B F FJ L. L R Mc F M M H iennial or Yu 2n= Ocken - - J160801 160885 pallescens inum usia, China Dill, 2009 NA J169521 issing Data onomorphism omostyly perennial zepchuk, 1974 18 don, 1968 - -

Ray, D

F FJ 1944; S arwin, 1877;

L. L M Mc F J160802 160886 M P P P Oc n=9/ Chennaveeraiah, & elf- Ockendon, perenne inum ed. Basin Dill, 2009 NA J169524 issing Data olymorphism olymorphism erennial kendon, 1968 2n=18; 2n=36 Joshi, 1983. incompatible 1968

L. L It Ital 37º51'N/14º01' F F For F P P P Gia n=1 Ray, - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

punctatum A inum aly y E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial rdinia et al., 2007 8 1944 - -

L. L It Ital 37º51'40.6''N/1 F F For F P P P Gia n=1 Ray, - - punctatum B inum aly y 4º00'45.5''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial rdinia et al., 2007 8 1944 - -

Tu Mo

L. L T rkey F F For F P P P untain flora of 2n= Mount - - pycnophyllum inum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial Greece 18 ain flora of Greece - -

Fu,

F FJ A 2010; Sokolovskaya,

L. L C Mc F J160805 160889 M M H nnual or Yu n=1 A. P. & N. S. - - stelleroides inum hina and Japan Dill, 2009 NA J169516 issing Data onomorphism omostyly biennial zepchuk, 1974 0/ 2n=20 ,2n=18 Probatova, 1985 - -

A

L. L T Tu 40º30'45.2''N/3 F F For F P P nnual or Da - - tmoleum inum urkey rkey 8º21'05.0''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism biennial vis, 1967 -- - -

L. L It Ital 42º22'23.2''N/1 F F For F P P F Pig n=9; Ray, - - tommasinii inum aly y 3º23'25.9''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism ruticose natti, 1982 2n=18 1944 - -

S F FJ H L. L C Mc F M H A Oc n=1 Ray, elf- D J160803 160887 M544115 usitatissimum inum osmopolitan Dill, 2009 NA J169526 onomorphism omostyly nnual kendon, 1968 5; 2n=30 1944 compatible ulberger, 1974

-- L. L M M 35º52'30.6''N/0 F F For F M H P Val - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

villarianum inum orocco orocco 5º24'14.4''W orthcoming orthcoming thcoming orthcoming onomorphism omostyly erennial des, 2002 - -

Tu

L. L T rkey F F For F P P A Oc - - virgultorum inum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism nnual kendon, 1968 -- - -

Mo F FJ L. S I Mc F M P P P hagheghzadeh A., 2n= Gill, - - J160792 160876 album yllinum ndia, Iran Dill, 2009 NA J169547 issing Data olymorphism olymorphism erennial 2006 30; 2n=28 1987; Ghaffari, 1987 - -

L. S T Mc F F FJ H P P S Da 2n= Ray, - - arboreum yllinum urkey, Greece Dill, 2009 NA J169537 J160793 160877 M544100 olymorphism olymorphism hrub vis, 1967 28 1944 - -

Tu Gü

L. S T rkey F F For F P P P vensen et al., - - aretioides yllinum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial 2013 -- - -

S

L. S pain, France, Sp 40.28112ºN/2.8 F F For F P P P S. n=1 Ray, - - campanulatum yllinum Italy ain 4901ºW orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism erennial Pignatti, 1982 4; 2n=28 1944 - -

Ray,

n=1 1944;

L. S It Ital 42º09'N/14º06' F F For F P P S Oc 2, n= 28/ 2n=28, Chennaveeraiah & - - capitatum yllinum aly y E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffruticose kendon, 1968 2n= 34 Joshi, , 1983. - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Tu C

L. S T rkey F F For F aespitose Da - - cariense yllinum urkey (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? perennial vis, 1967 -- - -

Franze

n, R. & L. A.

L. S G Gr 37º51'03.7''N/2 F F For F P P S Da 2n= Gustavsson. 1983; - - elegans yllinum reece eece 2º14'47.5''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescent vis, 1967 28, 2n=30 Papanicolaou, 1984 - -

Ray,

F FJ H P n=1 1944;Fu, S

L. S N Mc F J160794 160878 M544105 P P erennial Yu 5; 2010;Chennaveeraiah elf- M flavum yllinum E Med. Basin Dill, 2009 NA J169538 olymorphism olymorphism herbaceous zepchuk, 1974 2n=30/n=14/2n=28 & Joshi, 1983 incompatible urray, 1986

S No

L. S G Gr F F For F P P uffruticose or rdic J. Bot. 15(2): n=3 Phitos - - gyaricum yllinum reece eece NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism fruticose 145 (1995) 0+1B D., 1988 - -

H S

L. S T Tu 38º04'34.6''N/3 F F For F P P erbaceous or Da n=1 Ghaffa elf- D mucronatum A yllinum urkey rkey 6º44'05.1''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism suffruticose vis, 1967 4 ri S. M., 1987 incompatible ulberger, 1973

H

L. S T Tu 38º11'20.8''N/3 F F For F P P erbaceous or Da n=1 Ghaffa - - mucronatum B yllinum urkey rkey 6º49'43.9''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism suffruticose vis, 1967 4 ri S. M., 1988 - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Fu,

2010; F FJ R Chennaveeraiah & S J160795 160879 L. S T Mc F M M everse A Da n=1 Joshi, 1983; Mugnier, elf- D nodiflorum yllinum urkey, Italy Dill, 2009 NA J169539 issing Data onomorphism herkogamy nnual vis, 1967 3/ 2n=26, 2n=24 C. 1981 incompatible ulberger, 1974

Syr

L. S S ia F F For F P Flo - - syriacum yllinum yria (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? erennial ra of Syria -- - -

L. S T Tu 40.86763ºN/26. F F For F P P S Da 2n= Mugni - - tauricum yllinum urkey rkey 77020ºE orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescens vis, 1967 28 er, C. 1981. - -

L. S T Tu 38º34'59.8''N/4 F F For F P P S Da - - triflorum yllinum urkey rkey 2º16'10.7''E orthcoming orthcoming thcoming orthcoming olymorphism olymorphism uffrutescens vis, 1967 -- - -

Lo

L. S Ir Ira F F For F P n.J.Bot. - - velutinum yllinum aq q (R.H.Edinburgh) NA orthcoming orthcoming thcoming orthcoming ? ? erennial 7_517_1848 -- - -

O H F FJ Radi utgroup C Mc F M M orizontal A Oc 2n= Dressle - - J160815 160899 ola linoides (Linaceae) osmopolitan Dill, 2009 NA J169534 issing Data onomorphism herkogamy nnual kendon, 1968 18 r, 2013 - -

O NA F FJ -- Anis utgroup C Mc F M M H S Flo - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

adenia pubescens (Linaceae) hina Dill, 2009 J169513 J160772 160856 issing Data onomorphism omostyly uffruticose ra of China - -

O Ro F FJ Clioc utgroup S Mc F M M H P gers, C. M. & n=1 Dressle - - J160774 160858 occa selaginoides (Linaceae) America Dill, 2009 NA J169540 issing Data onomorphism omostyly erennial Mildner, R. 1971 8; 2n=36 r, 2013 - -

Hesp O H F FJ erolinon utgroup W Mc F M M orizontal A Ab n=1 Rogers - - J160775 160859 micranthum (Linaceae) USA Dill, 2009 NA J169542 issing Data onomorphism herkogamy nnual rams et al. 1951 8; 2n=36 , 1972 - -

O S F FJ Hugo utgroup M Mc F M M H hurb, small Flo - - J160773 160857 nia busseana (Linaceae) alawi Dill, 2009 NA J169512 issing Data onomorphism omostyly tree ra Zambesiaca -- - -

O A F FJ Rein utgroup fganistan, Mc F M P P P Sm 2n= Dressle - - J160814 160898 wardtia indica (Linaceae) Pakistan Dill, 2009 NA J169514 issing Data olymorphism olymorphism erennial all, 1907 20,22 r, 2013 - -

O F FJ Scler utgroup U Mc F M M H A Ro n=6; Rogers - - J160787 160871 olinon digynum (Linaceae) SA Dill, 2009 NA J169541 issing Data onomorphism omostyly nnual gers, 1968 2n=12 , 1972 - -

O F FJ Tirpit utgroup C Mc F M P P S H. - - J160816 160900 zia sinensis (Linaceae) hina Dill, 2009 NA J169515 issing Data olymorphism olymorphism hrub or tree Hallier, 1921. -- - -

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

H

Hype O M E M KC A N H erbaceous Lin - - ricum perforatum utgroup ed. Basin NA U796888 issing Data 709009 B698447 A omostyly perennial neo, 1753. -- - -

H

Viola O U D F JF7 J N H erbaceous Cul - - pubescens utgroup SA and Canada NA Q006044 J670135 67162 X661966 A omostyly perennial ley et al. 2001 -- - -

Humi O B M E AF A N H T He - - ria balsamifera utgroup rasil NA issing Data U002231 350941 Y935932 A omostyly ree ft, 1877 -- - -

2

Ruiz-Martín, J.; Santos-Gally, R.; Escudero, M.; Midgley, J.J.; Pérez-Barrales, R.; Arroyo, J. Style polymorphism in Linum (Linaceae): a case of Mediterranean convergent

evolution? (Manuscrip under revision on Plant Biology)

Evolución de linajes heterostilos y monomórficos del grupo de Linum tenuifolium en la cuenca mediterránea.

Resumen:

El complejo taxonómico de Linum tenuifolium (Linaceae) está formado por un grupo de especies distribuidas por la cuenca del Mediterráneo y zonas limítrofes que muestran una gran variación de rasgos florales y vegetativos solapantes, situación que se refleja en tratamientos taxonómicos muy diferentes. Esta variación probablemente se debe a la complejidad de los procesos ecológicos y evolutivos que han afectado a la diversificación y ponen de relieve la necesidad de desentrañar las relaciones de parentesco de este complejo de especies. Investigaciones anteriores han mostrado una cierta diversidad de sistemas reproductivos dentro del grupo, incluyendo la auto- compatibilidad e incompatibilidad estilar-estaminal (heteromorfismo, heterostilia y monomorfismo). Por tanto, es un sistema ideal para explorar los procesos evolutivos vinculados a los cambios en los sistemas reproductivos en plantas mediterráneas. En el presente trabajo se muestran resultados sobre relaciones filogenéticas, filogeográficas y estimación del tiempo de divergencia con base en análisis de secuencias de ADN plastidial y nuclear y 125 poblaciones. Para ello se obtuvieron datos morfológicos florales y se realizaron experimentos preliminares sobre el sistema de reproducción en los dos principales taxones del grupo (L. tenuifolium s.str. y L. suffruticosum). Linum tenuifolium s.str. es una especie monomórfica, con hercogamia de anteras y estigmas en un plano horizontal, y autocompatible. Por el contrario, Linum suffruticosum s.l. es una especie distila, con reciprocidad tridimensional, autoincompatible y Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

heteromórfica. Ambas especies no están aisladas genéticamente, por lo que pueden formar híbridos de forma espontánea. Aunque el grupo es claramente monofilético y su diferenciación comenzó a finales del Mioceno y comienzos del

Plioceno, las relaciones filogenéticas y filogeográficas no están bien esclarecidas dentro del grupo, probablemente debido a procesos naturales, como la hibridación mencionada, o la segregación incompleta de linajes

(“incomplete lineage sorting”). Sin embargo, estas especies muestran signos inequívocos de diferenciación genética y de aislamiento por distancia, especialmente en L. suffruticosum s.l. Se discuten estos resultados y su posible influencia en la diferenciación biogeográfica y reproductiva.

Palabras clave: Heterostilia, Linum, cuenca del Mediterráneo, monomorfismo, filogenia, filogeografía, incompatibilidad.

Introducción

La cuenca del Mediterráneo se caracteriza por presentar una alta heterogeneidad geomorfológica y ambientes muy diversos. En consecuencia es uno de los lugares con mayor riqueza vegetal y endemismo del mundo, pues contiene aproximadamente el 10% de todas las especies conocidas y de ellas cerca del 60% son endémicas (Thompson, 2005). La actividad tectónica y la variación edáfica han propiciado la evolución vegetal, la cual ha sido

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

posteriormente modulada por el clima estacional típico del mediterráneo, los cambios climáticos recurrentes del Pleistoceno (periodos glaciales e interglaciales) y, más recientemente, por la actividad humana (Thompson,

2005). Se ha propuesto que han habido dos contingentes evolutivos, ecológicos y biogeográficos principales en la flora mediterránea (Herrera,

1992): uno pre-mediterráneo (origen y diversificación anterior al establecimiento del clima mediterráneo) y otro propiamente mediterráneo (diversificación ligada al establecimiento del clima mediterráneo, aunque su origen sea anterior).

Mientras que el primer grupo está compuesto por taxones de mayor (especies típicas del matorral mediterráneo esclerófilo como Pistacia lentiscus; Herrera,

1995) o menor (relictos Terciarios, Hampe y Arroyo, 2002) éxito ecológico, su

éxito evolutivo en términos de especiación es muy bajo (Herrera, 1992; Verdú y

Pausas, 2013; Cowling et al., 1996). Sin embargo sabemos muy poco de los mecanismos subyacentes en el éxito ecológico (expansión de estos elementos florísticos por toda la cuenca) y evolutivo (incremento de diversidad) de los taxones herbáceos o, en general, de corta vida.

Disponemos de un número de estudios sobre taxones antiguos, premediterráneos, que han persistido o incluso han ampliado su distribución en condiciones mediterráneas (Palamarev, 1989; Ojeda et al., 2000; Mansion et al., 2008; Rodríguez‐Sánchez et al., 2009; Albaladejo et al., 2009; Besnard et al., 2009; Blondel, 2010) desde mediados del Terciario y en particular desde finales del Mioceno (crisis del Messiniense; Krijgsman et al., 1999; Suc, 1984) y

Plioceno (establecimiento definitivo del clima mediterráneo en la cuenca; Suc,

1984). Sin embargo, sólo recientemente se ha comenzado a incorporar

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

conocimiento empírico sobre varios linajes estrictamente mediterráneos de diversas edades y distribuciones, con resultados muy dispares en Cistus

(Fernandez-Mazuecos et al., 2010), Dianthus (Balao et al., 2010), Linaria

(Blanco-Pastor et al., 2012), o Narcissus (Santos-Gally et al., 2012), entre otros. Esto indica la naturaleza fuertemente idiosincrática de los patrones observados, estando aún lejos de una posible síntesis. Este objetivo es especialmente deseable pues este contingente florístico es el mayor y el que más endemismo aporta en la actual flora mediterránea (e.g., Molina-Venegas et al., 2016).

Los cambios biogeográficos y evolutivos en los linajes suelen ir asociados a cambios en rasgos biológicos (“life-history” o ciclos biológicos, tolerancia al estrés y sistemas reproductivos). El Mediterráneo no es una excepción, sino más bien un sitio idóneo donde estudiar esta asociación, dada la gran variabilidad de rasgos observada. Pocos estudios han analizado los mecanismos biológicos asociados a los procesos de diferenciación y diversificación en el Mediterráneo, aunque hay muchas hipótesis sobre ello

(adaptación a condiciones climáticas cambiantes, refugio en zonas relictas, tolerancia a estrés edáfico, ajuste de la longevidad al clima estacional, cambios en el sistema de reproducción incluyendo polinización, dispersión, multiplicación vegetativa, hibridación homoploide y poliploide; Comes, 2004;

Thompson, 2005; Blondel, 2010; Feliner, 2014; Arroyo y Thompson, 2017 (en revisión)).

Los sistemas de reproducción han sido particularmente olvidados en los estudios de flora mediterránea con metodología explícita de análisis evolutivo, Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

a pesar de la cantidad de datos sobre hibridación, poliploidía y sistemas genéticos de incompatibilidad. Otros aspectos de la reproducción, como la biología floral, han sido aún menos estudiados en este contexto (pero véanse los trabajos en Linaria (Newman y Thompson, 2005), Dianthus (Balao et al.,

2011; Collin y Shykoff, 2003), Narcissus (Worley et al., 2000; Baker et al., 2000;

Pérez-Barrales et al., 2007). Uno de los mecanismos reproductores que combina sistemas genéticos de reproducción (SI) y biología floral (polinización) es la heterostilia, presente en una amplia diversidad de familias botánicas y regiones en el mundo. No se sabe cuán frecuente es en el Mediterráneo, pero parece ser al menos tan frecuente como en otras áreas. La heterostilia es un polimorfismo floral intrapoblacional descrito hace varios siglos, que desde

Darwin (1877) ha fascinado a los biólogos evolutivos por ser un mecanismo que favorece la fecundación cruzada, disminuye el despilfarro de polen y opera mediante procesos de selección negativa dependiente de la frecuencia. Lo que es peculiar de la cuenca Mediterránea es que se han descubierto varios casos de grupos de plantas con heterostilia que se desvía del patrón canónico. Por ejemplo, falta de SI ligado al polimorfismo estilar en Lithodora y Glandora

(Ferrero et al, 2011); Narcissus (Santos-Gally et al. 2013), Anchusa (Philipp y

Schou, 1981), escasa reciprocidad de órganos sexuales en Primula (Keller et al., 2012), y alteraciones morfológicas importantes en Jasminum (Thompson y

Dommee, 2000). Las especies heterostilas generalmente presentan poblaciones en equilibrio, mostrando igualdad en el número de morfos.

Desviaciones de lo esperado (1:1) son indicativas de que el polimorfismo no funciona según lo teóricamente esperado (promoción de cruces entre morfos) y

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

las causas pueden ser diversas (eficiencia diferencial de los polinizadores en los morfos, pérdida del sistema de incompatibilidad, incompatibilidad asimétrica, diferencias sutiles de género (Shore y Barrett, 1985; Barrett, 1992;

Meeus et al., 2011; Simón-Porcar et al., 2014).

El complejo taxonómico de Linum tenuifolium (Nicholls, 1985) pertenece a la sección Linopsis del género Linum (Linaceae). Está constituido por un grupo de taxones perennes, muy variable, que se encuentran normalmente en suelos calcáreos rocosos. Se han reconocido históricamente dos taxones que muestran cierta diversidad morfológica y de polimorfismo estilar: L. tenuifolium

L. s.str. y L. suffruticosum L. s.l. (Nicholls, 1985), típicas de matorrales mediterráneos degradados. Linum tenuifolium s. str. presenta poblaciones monomórficas (estigmas y anteras dispuestas a la misma altura, con separación de los verticilos sexuales solo en el eje horizontal) y un sistema genético descrito como autocompatible para la especie (Nicholls, 1986). Su distribución ocupa desde el noreste de España (Pirineos orientales) hasta el este de la cuenca mediterránea (Turquía, Siria), pasando por buena parte de

Europa central. Linum suffruticosum s.l. presenta poblaciones con una heterostilia (distilia) particular llamada de reciprocidad tridimensional entre sus

órganos sexuales (Armbruster et al., 2006), debido a la torsión que presentan los verticilos sexuales dentro de la cada flor, además de la altura diferencial típica de las especies heterostilas (Fig. 1). Es una especie que presenta autoincompatibilidad física (heteromórfica), es decir, solo produce progenie viable por cruzamiento entre distintos morfos de una misma población (Nicholls,

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1986). Esta especie se distribuye en el Oeste de la cuenca mediterránea (Norte de África, Península Ibérica C y Sur de Francia y Noroeste de Italia).

Fig. 1. 1) Flores de Linum suffruticosum. Nótense las posiciones recíprocas (en tres dimensiones) de las anteras y los estigmas en los dos morfos. (a) Morfo “L” (de estilo largo), con Usia sp. (Bombyliidae) en su camino hacia el interior de la flor para obtener el néctar, contactando anteras con su superficie ventral y el punto de contacto con el estigma con el lado dorsal del tórax, con una carga de polen. (b) Morfo “B” (de estilo corto), con pétalos. (c) Morfos

“L” y “B” sin pétalos. (Imagen tomada de Armbruster et al., 2006). 2) a) Flor de L. tenuifolium s.str. conservada en etanol 70º sin pétalos. En ella no se aprecia bien la hercogamia en el eje horizontal debido a la conservación; b) Flor de L. tenuifolium s.str. recién colectada. Nótese la hercogamia en el eje horizontal.

Es en la Península Ibérica donde presenta un mayor grado de variabilidad morfológica (Martínez-Labarga y Muñoz-Garmendia, 2015). Ambas especies conviven en una zona de contacto entre Pirineos y norte de Italia que ha sido objeto de muestreo en este estudio. Este grupo ha sido objeto de estudio durante el último siglo (Rivas Goday y Rivas Martínez, 1968;

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Ockendon, 1968; López, 1979, 1984; Bolos y Vigo, 1984; Nicholls, 1985, 1986;

Martínez-Labarga y Muñoz-Garmendia, 2015), con tratamientos muy diferentes, desde muy sintéticos a muy analíticos, pero sin utilización de técnicas filogenéticas, y por tanto lejos de una taxonomía integradora que registre la historia evolutiva del grupo. A falta de una resolución de las relaciones filogenéticas entre los linajes del grupo, se ha preferido una aproximación de partida sintética (Nicholls 1985; Greuter et al., 1989) poniendo el énfasis en el muestro poblacional, para a partir de ahí construir grupos evolutivos en función de los resultados de los análisis filogenéticos y filogeográficos. En la tabla S3

(del material suplementario) se presentan los tratamientos de Flora Europaea

(Ockendon, 1968), López González (1979) y Flora Iberica (Martínez-Labarga y

Muñoz-Garmendia, 2015).

El grupo taxonómico de L. tenuifolium representa una oportunidad única para estudiar si su expansión en el Mediterráneo está ligada a una transición en el tipo de polimorfismo: elaboración de un tipo floral más especializado en la promoción de la fecundación cruzada (reciprocidad 3-D) en ambientes estrictamente mediterráneos, o evolución hacia la simplificación (pérdida de polimorfismo y autocompatibilidad que favorezca invasión de nuevos hábitats templados en los periodos interglaciales –regla de Baker- (Baker, 1955)). Al mismo tiempo y dado que las especies solapan en su distribución geográfica, es una buena oportunidad para comprobar si la coexistencia de los dos sistemas reproductores (monomórfico y polimórfico 3-D altamente especializado) garantizan un aislamiento reproductor y si es así, si los linajes están allí claramente diferenciados por mecanismos genéticos y/o ecológicos.

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Los objetivos de este estudio son: (1) Muestrear poblaciones de las especies del grupo de L. tenuifolium a través de su área de distribución

(Mediterráneo y parte de Europa templada) para (2) determinar su condición de polimorfismo floral en toda la distribución de ambas especies aceptadas en el grupo y (3) en zonas de contacto entre linajes dentro del grupo, realizar experimentos de cruzamiento manual para comprobar si son autocompatibles o autoincompatibles (y en este caso determinar el tipo existente) y si hay barreras al cruzamiento entre especies; finalmente (4) reconstruir las relaciones filogenéticas y filogeográficas entre las linajes y poblaciones del grupo en función de secuencias de DNA nuclear y plastidial y proporcionar una cronología de los principales eventos evolutivos. Como se ha indicado, se ha preferido una delimitación taxonómica sintética dentro el grupo (Nicholls, 1985;

Greuter et al., 1989), aunque en el la Tabla S3 se incluye la identificación con otras clasificaciones según distintos autores y zonas geográficas.

Materiales y Métodos

Muestreo de poblaciones

Se recolectaron 125 poblaciones morfológicamente circunscritas al grupo de L. tenuifolium (39 de L. tenuifolium s. str. y 86 de L. suffruticosum s.l.) en el área de distribución del complejo en la cuenca mediterránea entre 2009 y

2012 (Fig. 2). Se colectó una flor por individuo en un máximo de 100 individuos por población y se anotó si la población presentaba polimorfismo estilar tras el examen visual del conjunto de la muestra.

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Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Fig. 2. Mapa de la cuenca mediterránea con la localización de las 39 poblaciones muestreadas de Linum tenuifolium s.str. (círculos) y las 86 de L. suffruticosum s.l. (triángulos).

La recolección se realizó de forma aleatoria, permitiendo una distancia de al menos un metro entre individuos para evitar la repetición de genotipos. En las poblaciones pequeñas se recolectaron flores de todos los individuos presentes en floración. Las flores se preservaron en etanol 70% para su posterior medición en el laboratorio. En cada población se recolectaron ejemplares de referencia (incluyendo los dos morfos en las poblaciones dimórficas) y se depositaron en el herbario de la Universidad de Sevilla (SEV, Tabla S1). Para el estudio molecular, se recolectaron hojas jóvenes en 5-10 individuos por población y se preservaron en gel de sílice.

Proporción de morfos y descripción del sistema de incompabilidad

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En el laboratorio se comprobó la proporción de morfos en cada población (flores longistilas -L- y flores brevistilas -B-) en todas las poblaciones polimórficas (Tabla S1) y se estudió si ésta se desvió de la isoplétia (i.e., razón

1:1) usando para ello el test G (Sokal y Rohlf, 1981).

El sistema de incompatibilidad se estudió en el campo mediante experimentos de polinizaciones manuales en tres poblaciones dimórficas de L. suffruticosum s.l. distribuidas a lo largo de la Península Ibérica, y una monomórfica de L. tenuifolium s. str. en el Pirineo catalán (Tabla S5). En las poblaciones dimórficas, se realizaron los tratamientos 1) autopolinización en flores L y B, 2) polinización legítima, en la que el morfo donador de polen fue opuesto al morfo receptor de polen (L x B y B x L), y 3) polinización ilegítima, donde la flor donadora de polen y la receptora fueron del mismo morfo (L x L y B x B). En la población monomórfica se aplicaron los tratamientos 1) y 3), en este caso sin distinguir morfos estilares. Las polinizaciones se realizaron en flores recién abiertas que se emascularon antes de realizar los tratamientos y se examinó la formación de frutos una semana tras la realización de las polinizaciones. En total, se usaron 7-15 plantas por morfo y por población y 3-15 flores por planta en L. suffruticosum s.l. para realizar los distintos tratamientos, mientras que en

L. tenuifolium s.str. se seleccionaron 9 plantas y 2-6 flores por planta. Tras varios experimentos preliminares, se encontró que la tasa de pérdida de flores por embolsamiento fue elevada. Se decidió dejar las flores sin embolsar tras las polinizaciones manuales y eliminar los pétalos para disminuir la probabilidad de que fueran visitas por insectos. Por ello, se incluyeron dos controles en el experimento. El primer control consistió en marcar y emascular flores recién

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abiertas (control polinización abierta), a las que no se les eliminaron los pétalos, que se dejaron expuestas a polinización natural. El segundo control fue similar al primero, pero en este caso se eliminaron los pétalos (control sin pétalos) de las flores para evaluar si las flores sin pétalos recibían visitas que resultaban en polinización exitosa (i.e., formación de frutos). Finalmente, se realizó un estudio preliminar para evaluar la probabilidad de hibridación entre L. tenuifolium s. str. y L. suffruticosum s.l. Esto se realizó en la población monomórfica de L. tenuiflium s. str., cerca de la cual se encontró una población dimórfica de L. suffruticosum s.l. (Población 4 Montellá (Lérida) Tabla S5). En este estudio L. tenuifolium s.str. actuó como receptor de polen, mientras que las flores L y B de L. suffruticosum s.l. actuaron como donadoras de polen. No se pudo realizar el experimento de cruces recíprocos entre especies por falta de flores disponibles.

Los análisis de los experimentos de polinización se realizaron con modelos lineares generalizados mixtos, en los que la variable independiente fue el tratamiento y la variable dependiente fue la formación del fruto, modelada con una función binomial, y usando la función de vínculo “logit”. Para L. suffruticosum s.l., se incluyó el factor aleatorio población dentro del cual se encajó el factor planta, mientras que para L. tenuifolium s. str. sólo se incluyó el factor aleatorio planta. En ambos casos, se realizó un análisis “post-hoc” utilizando para ello el método de los mínimos cuadrados (“least square means”) para identificar las diferencias entre los tratamientos. Los análisis se realizaron usando R 3-3-1 (R Development Core Team) y los paquetes nmle (Pinheiro et al., 2016) y multcomp (Hothorn et al., 2008).

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Extracción, amplificación y secuenciación de ADN

Se usaron 15-20 mg de hojas secas para realizar las extracciones de

ADN de las 125 poblaciones, para lo que se usó el kit de extracción DNEasy

Plant Minikit (QIAGEN Inc.) de acuerdo al protocolo de uso del fabricante.

La selección de marcadores moleculares se realizó mediante un estudio piloto para evaluar cuáles presentaron mayor número de cambios nucleotídicos en las secuencias. Para ello, se usaron nueve poblaciones de L. tenuifolium aggr. representativas morfológica y geográficamente (220PV04, 38JML04, 05JML05,

40JML04, 75JML04, 02JML05, 11JML05, 51JML04, 74JML04) y se examinaron un total de 17 regiones del ADN plastidial (ndhF-rpL32R, rpl14-36, ATPHF-

ATIR, TrnS-G, TrnD-T, nadH1x-2x, TrnK-RPS16, Psbd-TrnT, NDHJ-TabE, psaI-accD, TrnCF-DR, TrnE-F, Rbcl1460R-1F, PetL-psbE, TrnQ-RPS16,

Rpl32F-TrnL y TrnV-ndhC, Weisburg et al., 1991; Taberlet et al., 1991; Graham y Olmstead, 2000; Shaw et al., 2005, 2007). Las regiones que presentaron un mayor número de cambios fueron ndhF-rpL32R y nadH1x-2x (20-30 cambios en 400-600 pares de bases), y fueron los que se usaron en el estudio filogenético. Además, se usó la región plastidial ndhf5-8 para poder estimar el tiempo de divergencia entre las especies del grupo dentro del género Linum

(Jansen, 1992), así como la región de ADN nuclear ITS. McDill et al. (2009) usaron estos marcadores en un estudió filogenético amplio del género Linum, lo que nos permitió incluir grupos externos para realizar el análisis de datación de una manera más precisa. Las regiones de ADN usadas en este estudio, así como las secuencias están incluidas en la Tabla 1.

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Tabla 1. Regiones genómicas y primers utilizados para los análisis filogenéticos.

Región Nombre Secuencia (5′-3′) Referencia

Primer

Nuclear

ITS P1A GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G White et al. 1990

P4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White et al. 1990

Plastidial ndhF-rpl32 ndhF GAA AGG TAT KAT CCA YGM ATA TT Shaw, 2007

rpL32-R CCA ATA TCC CTT YYT TTT CCA A Shaw, 2007 ndhA intron ndhA x1 GCY CAA TCW ATT AGT TAT GAA ATA CC Shaw, 2007

ndhA x2 ATTTGAACTGGTGACACGAG Shaw, 2007 ndhF (Dating) ndhF5 CAA TGG TAG CAG CGG GAA TTT TTC Jansen 1992

ndhF8 ATA GAT CCG ACA CAT ATA AAA TGC GGT T Jansen 1992

La amplificación de ITS y de las tres regiones plastidiales (ndhF-rpL32, ndhA 1x-2x y ndhF5-8) se realizó mediante PCR usando la polimerasa Ecogen, cuyo nombre comercial es EcoTaq 500 U., de concentración 5 U/μl. La mezcla para la reacción de PCR consistió en 2,5 µl 10 x BioTherm reaction buffer, 200

µM dNTPs (2,5 mM), 10 μM para cada marcador (ida y vuelta), 2 mM MgCl₂,

0,025U/µl de polimerasa y 2 µl de DNA extraído. El volumen final de PCR fue de 25 μl. El ADN amplificado fue purificado usando la encima Exo SAP-IT® for

PCR Product Clean-Up de los laboratorios USB. Cada ciclo de PCR comprende

5 min a 93º, 32 ciclos a 93º durante 1 min, 51–52º (ITS: 51º/ndhF-rpL32R: 52º/ nadH 1x-2x: 52º) durante 1–2min, y 72º durante 2 min. Los productos de la amplificación fueron comprobados en geles de agarosa al 1,5% en TAE (Tris–

Acetate buffer) y marcados con SYBR Green. Los productos de las PCR fueron enviados a Macrogen Inc. (http://www.macrogen.co.kr) para su secuenciación.

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El proceso extracción de ADN y amplificación de las regiones se realizó en el

Laboratorio de Sistemática Molecular del Jardín Botánico de Madrid, mientras que la secuenciación la realizó Macrogen Inc. (Seoul, South Korea).

Análisis filogenéticos

Los análisis filogenéticos son necesarios para inferir las relaciones de parentesco entre las especies y para definir grupos monofiléticos sobre los que se deben realizar análisis filogeográficos. Una vez se obtuvieron las secuencias para cada muestra, se construyó una matriz para cada región (ITS con 550 pb, ndhF-rpL32R con 421 pb y nadH 1x-2x con 500 pb). La matriz de ITS fue completada con 43 grupos externos (Tabla S2, McDill et al (2009)), mientras que para las secuencias plastidiales se usaron tres grupos externos (L. strictum

L., L. maritimum L. de la sección Linopsis y L. viscosum Desf. de la sección

Dasylinum). Cada matriz fue alineada usando MaffT 6.0 FFT-NS-I (Katoh y

Toh, 2008) implementado en Geneious Pro™ 5.5.9. (Drummond et al., 2011).

Se evitaron posibles fallos en los alineamientos usando GBlock v0.91b

(Castresana, 2000). Tras éste, se combinaron las dos matrices correspondientes de los marcadores ndhF-rpL32R y nadH 1x-2x en una única matriz plastidial (921 pb). Además, se combinaron las matrices de los marcadores plastidiales y nuclear para realizar un análisis concatenado con toda la información disponible.

Los análisis de máxima parsimonia (MP) fueron realizados con el programa

TNT (Goloboff et. al, 2008) con los siguientes parámetros heurísticos: 1000-

5000 réplicas al azar tomando 100 árboles por réplica, “tree-bisection-

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reconnection” (TBR) para el intercambio de ramas y las opciones “Multrees” y

“Steepest Descent in effect”. La cantidad máxima de árboles a evaluar fue de

20.000 para las tres matrices, pero difirieron en el número de réplicas tomadas por análisis: 2.000 para ITS, 5.000 para el análisis plastidial (matriz combinada de ndhF-rpL32 y ndhA 1x-2x), y 1.000 para el concatenado (ITS, ndhF-rpL32 y ndhA 1x-2x).

Los análisis de inferencia bayesiana fueron realizadas con MrBayes3.0b4

(Huelsenbeck y Ronquist, 2001), que permite estimaciones independientes de los parámetros para cada partición (nuclear y plastidial). El modelo de sustitución adecuado para cada partición se eligió usando ModelTest 3.06

(Posada y Crandall, 1998) para cada región. El modelo más adecuado a la información genética de las muestras obtenidas fue el GTR +G +I (Yang, 1994) para las tres regiones. Se permitió la variación entre particiones en las tasas de sustitución para sitios específicos (ratepr=variable). Se utilizó el algoritmo de cadenas de Markov Monte Carlo (MCMC) para 10.000.000 de generaciones tomando un árbol por cada 1.000 generaciones. Se realizaron dos análisis independientes para comprobar si alcanzaba la convergencia hacia la misma distribución posterior, descartándose los primeros 2.500 árboles como “burn- in”.

Por último, los análisis usando máxima verosimilitud (ML) fueron realizados con el programa PhyML (Guindon et al. 2005) implementado en ATV herramientas filogenéticas online (Zmasek, 2001). Los valores de “bootstrap” se obtuvieron a partir de 1.000 réplicas.

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Diferenciación genética y aislamiento por distancia

Debido a que no se encontró una separación filogenética clara entre ambas especies (véanse Resultados), se realizó un análisis de diferenciación genética. El estadístico “nearest-neighbour statistic” (Snn) es una medida que indica la frecuencia de similitud genética en las secuencias para poblaciones de especies que tienen una distribución geográfica similar (Hudson, 2000). Valores altos del estadístico, que oscila entre 0 y 1, pueden ayudar a separar las dos especies usando la distancia genética encontrada en el rango de distribución de ambas. Para ello, se realizaron dos análisis. En el primer análisis se incluyeron todas las muestras recolectadas de L. tenuifolium s. str. y L. suffrutisosum s.l, para comprobar si efectivamente se podían separar las dos especies teniendo en cuenta toda la variabilidad genética presente a lo largo de su distribución. El segundo análisis se realizó usando las muestras recolectadas en la zona de contacto de las dos especies, desde Pirineos hasta el Norte de Italia, ya que los resultados de la filogenia con los marcadores plastidiales mostró la introgresión de dos muestras, concordantes morfológicamente con L. suffruticosum s.l. (F_su_68 y F_su_72), en un clado de L. tenuifolium s. str. (clado 1) de la zona de contacto en Francia (véanse los

Resultados). El estadístico Snn fue calculado usando DnaSP v5 (Librado y

Rozas, 2009). El test de permutación se realizó con 1000 réplicas para evaluar la significación estadística de los valores obtenidos (Sokal y Rohlf, 1995).

Además, se estudió la relación entre las matrices de distancia genética (Nei et al., 1972) y distancia geográfica entre pares de poblaciones en L. tenuifolium s. str. y L. suffruticosum s.l. por separado. Para ello, se realizó un test de Mantel,

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implementado en GenAlex 6 (Peakall y Smouse, 2006); la significación del estadístico se obtuvo mediante 10.000 permutaciones de la matriz (resultados en fig. S1).

Estimación del tiempo de divergencia

Se estimó el tiempo de divergencia usando la región plastidial ndhF5-8 por su grado de variación nucleotídica y el número de muestras disponibles de otras Lináceas y familias filogenéticamente próximas. Para ello, se seleccionaron 16 poblaciones L. tenuifolium s. str. y L. suffruticosum, usando como criterio maximizar la distancia geográfica entre poblaciones (véase Fig.

4), y se generó una matriz en la que se incluyeron las secuencias disponibles para ndhF5-8 de especies pertenecientes a las Lináceas y familias filogenéticamente próximas (Linaceae: Tirpitzia sinensis, Reinwardtia indica,

Anisadenia pubescens y Hugonia busseana; Humiriaceae: Humiria balsamífera

(Davis et al., 2001), y Violaceae: Viola pubescens (Yockteng et al., 2003), y especies del género Linum (McDill et al., 2009). Se repitieron las condiciones del análisis bayesiano (véanse los detalles arriba) para generar un árbol consenso que se usó como base para realizar el análisis de datación. La datación molecular se realizó usando un reloj relajado, con tasas de sustitución no correlacionadas y muestreada sobre una distribución lognormal, como está implementado en BEAST v1.4.8 (Drummond y Rambaut, 2007). Este software estima simultáneamente la topología del árbol y la edad de los nodos y la incertidumbre está incorporada en ambos aspectos del análisis. El modelo de sustitución para esta región de ADN, estimado también por MODELTEST 3.06, fue el mismo que para las regiones plastidiales usadas para los análisis Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

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filogenéticos, GTR+I+G con cuatro categorías gamma estimadas. El análisis fue realizado contando con dos puntos de calibración secundaria. El primero de ellos fue tomado de Bell et al. (2010), y se refiere al tiempo estimado de la divergencia de la familia Linaceae (88-97 Ma). El segundo, más reciente, está basado en la datación de un fósil de granos de polen de Linum encontrado en la cuenca del río Ebro al nordeste de España, datado aproximadamente entre

33,9-37,2 Ma, i. e. Eoceno tardío (Cavagnetto y Anadón, 1996). Estos granos de polen son tricolpados y parecen pertenecer a las especies L. catharticum o

L. austriacum, según la descripción de Punt y Den Breejen (1981). Este polen parece proporcionar evidencias de la edad mínima del ancestro común a

Linum, en torno a 33,9 Ma. Estos puntos de calibración fueron implementados en el programa BEAST ajustando el parámetro “tmrca” (“time to most recent common ancestry”) como el ancestro común al género (incluyendo Cliococca,

Hesperolinon, Radiola y Sclerolinon, ya que aparecen dentro del género Linum en la filogenia (McDill et al., 2009), mediante una distribución log-normal

(mean= 0, standard deviation= 1, zero offset= 33,9) que permite estimar el tiempo de divergencia, no posterior a 33,9 Ma, pero sí anterior a esa fecha. La cadena MCMC fue recorrida durante 80 millones de generaciones con las características de auto-optimización activadas (descartando un 10% inicial del periodo de burn-in para todos cálculos y estimas). El muestreo de la topología del árbol, los parámetros del modelo y el tiempo de divergencia se calculó cada

1000 generaciones. Al final de cada análisis con BEAST, los parámetros “logs” y los resultados, fueron analizados con Tracer v1.4.4. (Rambaut y Drummond,

2007) para verificar que las cadenas MCMC se estabilizaron, y para evaluar el

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tamaño efectivo de muestreo (ESSs) alcanzado por las estimas del tiempo de divergencia y los parámetros del modelo. El análisis de BEAST fue repetido dos veces, para verificar la convergencia de análisis independientes realizados con las mismas estimas de tiempo de divergencia, y para obtener ESSs adecuados para todas las estimas y parámetros (ESSs > 200, como se recomienda en el manual de BEAST).

Red de haplotipos

Para generar la red de haplotipos, se usó la matriz consenso de dos tipos de secuencias plastidiales (ndhF-rpL32R y nadH, 922 bp) debido a su supuesta herencia materna. Para ello, se eligieron los grupos monofiléticos que en el análisis filogenético bayesiano presentaron un apoyo estadístico de probabilidad posterior alto (véanse Resultados) y que contenían un número alto de poblaciones. En concreto, se eligieron el Clado 2, correspondiente a L. suffruticosum s.l., con una probabilidad posterior de 1, y el Clado 1, correspondiente a L. tenuifolium s. str., cuyo apoyo estadístico fue de 0,97 p.p.

Estos clados incluyeron 24 y 43 poblaciones respectivamente (véase Fig. 3 b).

Las relaciones genealógicas entre haplotipos se infirieron usando parsimonia estadística (Templeton et al., 1992) y “reduced median network” (Posada y

Crandall, 2001) como algoritmos de coalescencia diferentes. El algoritmo estadístico de parsimonia, implementado en TCS 1.21 (Clement et al., 2000) se usó para inferir relaciones basadas en sustituciones nucleotídicas. El número máximo de diferencias resultantes de sustituciones individuales entre haplotipos se calculó con un 95% de intervalo de confianza, tratando los “gaps” como “missing data”. Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

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RESULTADOS

Variación en el polimorfismo y el sistema de incompatibilidad

Durante el muestreo se observó que todas las poblaciones de L. suffruticosum s.l. presentaron heterostilia (distilia) con reciprocidad 3D (véase

Fig. 1), y ninguna población de las medidas se desvió estadísticamente de la proporción 1:1 (véase la Tabla S4). Por el contrario, todas las poblaciones recolectadas de L. tenuifolium s.str. fueron monomórficas, y en todas se observó que las anteras y estigmas se separaban en el plano horizontal (véase

Fig. 1). El capítulo 2 incluye un análisis detallado de la morfología floral y reciprocidad de L. suffruticosum s.l. y L. tenuifolium s. str. en relación con la de otras especies de Linum.

El estudio del sistema de incompatibilidad mostró distintos patrones en las dos especies (Fig. S3). En L. suffruticosum s.l., el modelo mixto mostró que hubo diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (2 = 52,176, g.l. =3, p<0,0001). En las comparaciones pareadas, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la probabilidad de producir frutos entre los tratamientos autopolinización y polinización ilegítima (z=1,356, g.l. =1, p =0,63), autopolinización y control sin pétalos (z=1,478, g.l. =1, p =0,55), y entre polinización ilegitima y control sin pétalos (z=0,101, g.l. =1, p =0,99).

Todas las comparaciones restantes mostraron diferencias estadísticamente significativas (para todas las comparaciones, z4,233, g.l. =1, p <0,0001). El tratamiento control polinización abierta fue el que tuvo una mayor probabilidad Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

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de producir frutos (promedio, tamaño de muestra (95% intervalo de confianza);

0,93, 100 (0,711; 0,987)), seguido por el tratamiento de polinización legítima

(0,399, 77 (0,119; 0,765)). La probabilidad de producción de frutos fue muy baja en los tratamientos autopolinización (0,039, 75 (0,006, 0,204)), polinización ilegítima (0,014, 69 (0,002, 0,103)) y control sin pétalos (0,012, 66

(0,001, 0,096)). La baja probabilidad de producir frutos en el último (e.g., flores emasculadas y sin pétalos) indica que las flores sin pétalos apenas reciben visitas efectivas. En L. tenuifolium s. str. se encontró que el 100% de las flores marcadas (ocho flores) para polinización abierta produjeron frutos, mientras que ninguna de las flores marcadas para el tratamiento control sin pétalos lo hizo (siete flores). Por tanto, estos dos tratamientos se excluyeron del modelo mixto, que se realizó comparando los tratamientos de autopolinización y polinización cruzada. Para este análisis, se encontró que aunque la producción de frutos del tratamiento autopolinización (0,46, 8 (0,065, 0,913) fue menor que en el de polinización cruzada (0,95, 7 (0,113, 0,999), las diferencias no fueron estadísticamente significativas (2 = 1,174, g.l. =1, p =0,279) (véase Fig. S3).

En resumen, los resultados indican que el sistema de incompatibilidad genética de L. suffruticosum s.l. es heteromórfico y típico de plantas heterostilas, mientras que L. tenuifolium s. str. es una especie autocompatible.

Debido al bajo tamaño de muestra, no fue posible realizar un análisis estadístico para evaluar la probabilidad de formación de frutos tras las polinizaciones manuales entre especies. En concreto, se realizaron un total de cinco y seis polinizaciones manuales con el morfo L y S de L. suffruticosum s.l. respectivamente como donador de polen, y L. tenuifolium s.str. como receptor.

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Se encontró que el 100% de las polinizaciones con el morfo L como donador de polen resultaron en formación de frutos, mientras que el cuándo el morfo S funciono como donador de polen, se observó un 60% de formación de frutos

(Fig. S3).

Relaciones filogenéticas en L. tenuifolium aggr.

Las Figuras 3 a y 3 b, representan los resultados obtenidos para la región ITS y la matriz combinada de las secuencias plastidiales (ndhF-rpL32R y nadH = CPL) respectivamente.

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Fig. 3. A) Filogenia nuclear (a la izquierda). La matriz de ITS fue completada con 43 secuencias como grupo externo (Tabla S2, McDill et al (2009)), ya que existían secuencias en

GenBank para varias especies de Linum. B) Filogenia plastidial (a la derecha) (ndhF-rpL32R y nadH1x-2x). Para las secuencias plastidiales se usaron tres secuencias como grupo externo (L. strictum, L. maritimum de la sección Linopsis y L. viscosum de la sección Dasylinum).

Los resultados obtenidos con ITS mostraron a L. tenuifolium aggr. como un grupo monofilético, aunque el apoyo estadístico fue débil, con valores de p.p de 0,56 para el análisis bayesiano, y de 71% de bootstrap para ML. Además, la filogenia basada en secuencias ITS no mostró una separación filogenética clara entre las dos especies del complejo taxonómico debido a una baja resolución

(Fig. 3a). El estudio de las secuencias plastidiales distingue dos grandes clados dentro de L. tenuifolium agg. El clado 1, formado por 24 poblaciones con una p.p. de 0,97 y, compuesto por poblaciones de L. tenuifolium s. str. de España,

Francia, Italia, Suiza, Grecia y Turquía, excepto dos poblaciones con caracteres morfológicos de L. suffruticosum s.l. colectadas en Francia. El clado

2 está formado por individuos de 43 localidades provenientes principalmente del NE de la Península Ibérica, con una p.p. de 1 (Fig. 3b). El análisis de la matriz concatenada, donde se combinaron la matriz ITS y la matriz plastidial dio mayor apoyo a estos resultados (Fig. S2). En concreto, L. tenuifolium aggr. apareció como un grupo monofilético estadístico, con valores de MP y ML de

100% y 99% respectivamente y probabilidad posterior de 1. Este análisis tampoco permitió resolver las relaciones filogenéticas internas del complejo

(resultados no mostrados).

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Diferenciación genética y aislamiento por distancia

Los valores del estadístico Snn para el análisis de diferenciación genética mostraron una fuerte diferenciación entre las dos especies reconocidas dentro del grupo, tanto para el muestreo extensivo (Snn=0,9), como para la el análisis usando las muestras correspondientes a la zona de contacto (Snn=0,84). Estos resultados sugieren que L. tenuifolium s. str. y L. suffruticosum s.l. son especies genéticamente distintas, tanto a lo largo de su distribución como en la zona de contacto.

El test de Mantel para evaluar la relación entre distancia genética y la distancia geográfica entre poblaciones mostró patrones similares para las dos especies

(Fig. S1). En concreto, se detectó una correlación positiva entre las dos variables, que se ajusta a un modelo de aislamiento por distancia (L. tenuifolium s. str.: R² =0,0307, p < 0,05); L. suffruticosum: R² =0,109, p <

0,001). Aunque el porcentaje de varianza explicada por esta correlación es muy bajo, es tres veces mayor en L. suffruticosum s. str. que en L. tenuifolium s.l., a pesar de la distribución más restringida del primero.

Estimación del tiempo de divergencia

Para estimar el tiempo de divergencia fue utilizada una matriz reducida, incluyendo solo 16 poblaciones de L. tenuifolium aggr., ampliamente distribuidos por el rango geográfico del grupo. Los valores del reloj relajado lognormal no correlacionado (1,168), y del coeficiente de correlación (1,291) para los datos de ndhF5-8 para la tasa de heterogeneidad, indican que un reloj molecular relajado es el óptimo para los análisis realizados. El número de

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iteraciones MCMC fue suficiente, ya que todos los parámetros resultaron estar en equilibrio después de desechar un número predeterminado de árboles

(“burn-in”). El árbol de máxima credibilidad, con 95% de intervalos mayores de densidad posterior (HPD) para la estima de la divergencia de los nodos relevantes, se presenta en la Figura 4 y los valores en millones de años (MA) se muestran en la Tabla 2.

Fig. 4. Árbol de máxima credibilidad producido por análisis de reloj molecular relajado basado en secuencias ndhF5-8. Se seleccionaron 16 muestras de L. tenuifolium s. str. y L. suffruticosum, usando como criterio maximizar la distancia geográfica entre poblaciones

(02JRM09, 07JRM09, 21JRM09, 26JRM09, 47JRM09, 38JML04, 05JML05, 75JML04,

11JML05, 74JML04, 23JML07, 55JML04, 01JML09, 107JRM10, 143JRM10, 208JRM11, véase

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Tabla S1), y se generó una matriz en la que se incluyeron las secuencias disponibles para ndhF5-8 de especies pertenecientes a familias que comparten el último ancestro común con

Linum (Linaceae: Tirpitzia sinensis, Reinwardtia indica, Anisadenia pubescens y Hugonia busseana; Humiriaceae: Humiria balsamífera (Davis et al., 2001), y Violaceae: Viola pubescens

(Yockteng et al., 2003), y especies del género Linum (McDill et al., 2009) (Tabla S2).

Según el cronograma resultante, el grupo de estudio divergió aproximadamente hace unos 10 Ma (nodo “C”) al tomar la media del intervalo al 95% HPD (Fig.

4). La edad en la que divergen ambas especies está en torno a los 5,75 Ma

(media del intervalo al 95% HPD), tal y como muestran los nodos “D” y “E”

(véase Tabla 2).

Tabla 2. Edad estimada de los nodos e intervalos de 95% “highest posterior density” (HPD) para los puntos de calibración usados (A y B) y nodos relevantes no constreñidos (C-E), basados en el análisis del reloj molecular relajado de Linaceae para las secuencias de ndhF5-8 realizado mediante el programa BEAST. Nodos representados en Fig. 4.

Nodo Edad Nodo 95%HPD Media del 95%HPD

(MA) intervalo intervalo

A 91,48 86,77-96,59 91,68

B 34,11 26,96-40,85 33,90

C 9,12 2,43-18,11 10,27

D 4,91 1,04-10,36 5,70

E 4,90 0,67-11,00 5,83

Red de haplotipos

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Se eligieron los clados 1 y 2 para estudiar la red de haplotipos en L. tenuifolium s. str. y L. suffruticosum respectivamente. Se eligieron estos clados por ser monofiléticos, con buen apoyo estadístico, y representar mayormente a las dos especies por separado. El clado 1 incluyó 24 muestras de L. tenuifolium s. str. que representan todo el rango de distribución de la especie, desde el norte de la Península Ibérica hasta Turquía, mientras que el clado 2 incluyó 43 muestras de L. suffruticosum s.l. distribuidas por la Península Ibérica y

Marruecos, casi coincidente con la distribución general de la especie (Fig. 3b).

Se utilizaron grupos externos a ambos clados (de clados hermanos) para ambos análisis.

En concreto, el análisis del clado 1 incluyó 22 secuencias de L. tenuifolium s.str y dos secuencias de L. suffruticosum s.l. colectadas en Francia (F_su_68;

F_su_72). Se detectaron 8 haplotipos, y se identificó un haplotipo ancestral

(Haplotipo 7) distribuido en seis poblaciones de Turquía e Italia. Los restantes haplotipos se conectaron a este. No se observaron ni desconexión de haplotipos por excesivo número de cambios nucleotídicos en las secuencias ni loops que indiquen que la molécula elegida (ndhF5-8) haya sufrido homoplasia

(Fig. 5).

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Fig. 5. Red de haplotipos de las poblaciones de Linum tenuifolium s.str. de Francia a Turquía, basada en información del plasto (Clado 1 en Fig. 3b (fliogenia plastidial). Para una interpretación de los códigos de las poblaciones se indica la inicial del país, Linum tenuifolium: te, Linum suffruticosum: su. Véanse códigos completos en Tabla S1.

El análisis de parsimonia de la matriz plastidial correspondiente al clado 2 permitió identificar 18 haplotipos de L. suffruticosum (Fig. 6). Apareció un haplotipo ancestral (Haplotipo 1) ampliamente distribuido desde el norte de la Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

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PI hasta las montañas del Atlas marroquí en un total de 15 poblaciones. Los haplotipos restantes (Haplotipos 2-18) comprendieron como máximo 3 poblaciones cada uno y se conectaron entre sí componiendo el resto de relaciones de la red. Las reconexiones entre haplotipos, como se observaron entre el haplotipo 1 y haplotipo 10 y 12, y entre haplotipo 12 y 15, se consideran eventos de homoplasia.

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Fig. 6. Red de haplotipos para L. suffruticosum: Poblaciones correspondientes a cada uno de los 18 haplotipos resultantes del análisis biogeográfico con TCS. Todas ellas pertenecientes a

L. suffruticosum, Clado 2, del árbol resultante del análisis filogenético de la información plastidial. Ver códigos correspondientes en Tabla S1.

Discusión

Linum tenuifolium aggr. es un grupo monofilético bien apoyado estadísticamente, pero con una escasa estructura filogenética interna, en especial en el caso de la información nuclear (ITS). Los dos taxones se entremezclan en las topologías resultantes, lo cual tiene que ver con posibles eventos de hibridación entre ambos, sobre todo en la zona de contacto (véase

Clado 1 en Fig. 3b). Además, se observa una exitosa y rápida expansión por el

Mediterráneo que puede haber provocado una ordenación o segregación incompleta de los linajes (“incomplete lineage sorting”). Estos resultados dificultan la reconstrucción de rutas migratorias y de transiciones evolutivas en rasgos de interés, como por ejemplo el polimorfismo estilar. Sin embargo, en la medida que estos resultados obedecen a situaciones reales (e.g., hibridación, diferenciación incipiente, etc.) son explicables en el contexto de la biología conocida del grupo y ayudan a diseñar estudios futuros que traten de dilucidar inequívocamente estas cuestiones.

Polimorfismo floral y sistemas de cruzamiento

Después del análisis morfométrico de las poblaciones correspondientes a las dos especies, de zonas cercanas a los límites del área de distribución de

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ambas (5 poblaciones de L. suffruticosum s.l. (02JRM09, 17JRM09, 24JRM09,

51JRM09 y 86JRM10) y 2 de L. tenuifolium s. str. (128JRM10 y 135JRM10)), y del análisis visual en campo y en el laboratorio, se puede decir que la heterostilia de reciprocidad tridimensional está presente en todas las poblaciones de L. suffruticosum con alguna variación en el nivel de hercogamia y el grado de torsión de los verticilos sexuales, cuya medición cuantitativa traspasa los objetivos de este estudio. Por el contrario, L. tenuifolium s.l. es constantemente monomórfico, con hercogamia solo horizontal, es decir, la separación entre anteras y estigmas ocurre en el plano horizontal, no vertical, de la flor. La presencia del polimorfismo floral en L. suffruticosum s.str. a lo largo de toda su distribución, incluso en la zona de contacto con L. tenuifolium s. str. (con la que puede hibridar, véase más abajo), sugiere una gran estabilidad evolutiva y funcional de este carácter.

Es muy interesante resaltar que, como había supuesto Nicholls (1985) a partir de algunos cruzamientos, las dos especies producen híbridos, aunque nuestros datos son aún preliminares como para conocer si hay alguna dirección predominante en estos cruzamientos compatibles y si los híbridos son fértiles.

Esto explicaría la frecuencia en ciertas zonas del sur de Francia de poblaciones en las que se observan individuos de caracteres intermedios y otros más afines a una u otra especie progenitora (poblaciones mixtas) (J. Arroyo y E. Olmedo, com. pers.).

La hercogamia solo horizontal parece además ser una condición estilar mucho más eficiente en la transferencia de polen entre morfos compatibles que en el caso de una heterostilia linear sin torsión de los verticilos sexuales (Armbruster Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

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et al., 2006). Los dos morfos se diferencian en el ángulo de divergencia de estilos y estambres con respecto al eje central de la flor y en el grado de rotación de los estilos y filamentos. Esta diferencia debe provocar como resultado el emplazamiento de polen en la zona dorsal del polinizador, por parte del morfo corto, y en la zona ventral por parte del morfo largo. Por otro lado, los estigmas del morfo corto contactarían con la zona ventral del polinizador y los estigmas del morfo de estilos largos contactarían con la zona dorsal (Armbruster et al., 2006). Por tanto, la presencia de este polimorfismo es una de las evidencias más fuertes a favor de la hipótesis darwiniana de Lloyd y

Webb (1992) de evolución de la heterostilia, incluso representando un estado no previsto por el modelo propuesto por estos autores. Esta hipótesis ecológica

(basada en la acción de los polinizadores) plantea que la principal fuerza selectiva promotora de la heterostilia y de la reciprocidad que ésta representa es la promoción de la fecundación cruzada a través de un uso eficaz del polen, que debe ser transportado por los insectos en partes diferenciadas y específicas de sus cuerpos. Las evidencias encontradas apoyan mucho menos la hipótesis genética alternativa que ha predominado durante la mayor parte del siglo XX, en la que la fuerza selectiva promotora de la heterostilia sería la evitación de la depresión endogámica (hipótesis canónica; Charlesworth y

Charlesworth, 1979). ¿Por qué una especie como Linum suffruticosum s.l., que ya tiene incompatibilidad heteromórfica y por tanto no debe tener niveles altos de depresión endogámica, presenta este sofisticado sistema de reciprocidad tridimensional? Sólo un incremento de la probabilidad de transferencia legítima de polen puede ofrecer una explicación plausible. Téngase en cuenta que el

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polen ilegítimo que llegue ni tan siquiera germinará, dado el tipo de incompatibilidad heteromórfica, probablemente esporofítica, que presenta esta especie. Recientemente se ha descrito un sistema aparentemente similar en varias especies sudafricanas de Oxalis (Turketti et al., 2012), aunque faltan datos sobre los polinizadores y el éxito en la transferencia de polen. La ontología de la torsión en los órganos sexuales ya había sido descrita en otras especies de Linum, polimórficas o no, y otras especies heterostilas (véase

Schewe et al., 2011). Por tanto, la maquinaria para desarrollar este sistema ya está disponible para que la selección actúe sobre ella. Es posible que futuros estudios detallados en otros grupos revelen más casos. En el caso que nos ocupa, Linum suffruticosum, Armbruster et al. (2006) propusieron que la actividad de polinizadores específicos, moscas del género Usia (Bombyliidae), propias de la cuenca mediterránea, son los actores que ejercen estas presiones selectivas. Nuestro estudio no ha incluido observaciones sistematizadas de polinizadores. Sin embargo, observaciones casuales en diversas áreas de la Península Ibérica, donde ocurren la mayoría de las poblaciones de L. suffruticosum, revelan que estos son los polinizadores más frecuentes, incluso en comparación con la especie monomórfica emparentada

L. tenuifolium. Son necesarios muchos más estudios (en curso, Erika Olmedo, com. pers.) que corroboren estos patrones y sobre todo que cuantifiquen el papel de estos insectos y otros posibles en la transferencia legítima de polen.

Linum tenuifolium s. str. presenta monomorfismo floral con hercogamia en el plano horizontal de la flor en todas las poblaciones recolectadas alrededor en su rango de distribución, sin variación alguna apreciable en ningún carácter

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floral. Esta separación en el plano horizontal de los verticilos sexuales incrementa la hercogamia de esta especie y debe ayudar a evitar la autopolinización. Aunque esta resulte en fecundación viable, es posible que haya cierto nivel de depresión endogámica que favorezca la separación espacial de anteras y estigmas. Aparentemente esta especie es polinizada por un espectro más amplio de insectos, incluyendo abejas de diverso tamaño (J.

Arroyo y E. Olmedo, obs. pers.).

En definitiva, la consecución de un sistema sofisticado de polinización cruzada en L. suffruticosum no ha conllevado un aislamiento genético potencial paralelo. Sin embargo, en la práctica, debe haber un cierto aislamiento dado que el análisis estadístico Snn nos asegura que ambas especies están de hecho genéticamente aisladas y son lo suficientemente diferentes como para considerarlas diferenciadas. En el análisis de las poblaciones de la zona de contacto para ambas especies, el valor del estadístico baja algo, lo que nos estaría indicando que podría ocurrir algún intercambio genético entre ambas especies. Esta disminución en el valor del estadístico se debe a un menor número de cambios en las secuencias, pero sigue siendo lo suficientemente significativo como para separar ambas especies.

Relaciones filogenéticas, tiempo de divergencia y filogeografía

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Mientras que las relaciones filogenéticas del grupo con el resto del género son claras y apoyan la monofilia de Linum tenuifolium s.l., la resolución de las relaciones internas dentro de este es muy pobre, pues ambas especies consideradas (L. tenuifolium s.str. y L. suffruticosum s.l.) aparecen entremezcladas en los clados bien resueltos, o bien otras muestras no se resuelven formando politomías. Todo esto ocurre a pesar de cierta diferenciación genética (test Snn) y de cierto aislamiento por distancia (test de

Mantel). Esta falta de resolución puede ser debida a varios factores no excluyentes: (1) efecto de la hibridación relativamente reciente, que puede haber sido más extensiva de lo que aparentemente es en la actualidad (zona de contacto, actualmente bajo escrutinio; Erika Olmedo, com. pers.), esto estaría de acuerdo con una aún menor resolución de la filogenia con el marcador nuclear (ITS) que con los plastidiales; (2) escasa diferenciación de los linajes (“incomplete lineage sorting”) relacionada con procesos recientes y dinámicos de diferenciación en una zona compleja (la cuenca mediterránea y en particular la Península Ibérica) (Blanco-pastor et al., 2012); (3) convergencia

(paralelismo) de ciertos rasgos que añadirían confusión a la hora de circunscribir poblaciones en taxones concretos.

Mientras que la diferenciación del grupo dentro del género es antigua, de finales del Mioceno, la diversificación dentro de Linum tenuifolium s.l. es mucho más reciente. Desde finales del Mioceno y durante el Plioceno, la disrupción de territorios que este período supuso tras la amplia conexión que provocó la crisis de salinidad del Mesiniense a finales del Mioceno, probablemente favoreció la diferenciación dentro del grupo de L. tenuifolium, posiblemente exacerbada por

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las oscilaciones climáticas pleistocénicas. Este grupo debió sufrir continuas migraciones, contactos y aislamientos entre linajes, con oportunidades secundarias para el cruzamiento (Stebbins, 1985). De hecho es conocida la gran variación en los niveles de ploidía del grupo, que puede estar relacionada con este dinamismo pleistocénico, como en otros casos (Trewick et al., 2002;

Eidesen et al., 2007; Popp et al., 2011).

Linum tenuifolium s. str. es diploide (2n=18 Ray, 1944) mientras que L. suffruticosum s.l. presenta poliploidía (2n=18, 36 (72), López, 1979; Nicholls,

1986; recientemente se han encontrado incluso algunas poblaciones decaploides: Ana Afonso, com. pers.). Es decir, a partir de un ancestro 2n=18, por un lado aparecería un linaje que sigue siendo diploide en todo su amplio

ámbito geográfico (L. tenuifolium s.str.) y otro que cambia según condiciones ecológicas y geográficas (L. suffruticosum s.l.; Ana Afonso, datos inéditos).

Dado que no conocemos los citótipos de las poblaciones estudiadas para la filogeografía, no es posible de momento saber si la poliploidía (y las posibilidades de mayor cruzamiento entre especies dentro del mismo nivel) ha influido en la escasa estructura filogeográfica.

Implicaciones para la evolución del polimorfismo estilar en Linum tenuifolium aggr.

La baja resolución de la filogenia en lo que se refiere a la separación de las dos especies del grupo impide resolver adecuadamente el estado ancestral de la condición estilar. Además, aunque la resolución filogenética del género

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(véase capítulo 3) es razonablemente buena, la gran variabilidad de condiciones estilares dentro y fuera del grupo hace que ninguna condición destaque con una probabilidad alta de ser ancestral en el clado al que pertenece este grupo (Fig. 4 del capítulo 3), al igual que en el género completo.

Por el contrario, la distribución actual de ambas especies permite inferir un proceso de divergencia adaptado a las estrategias reproductivas extraordinariamente diferentes de estas.

Linum tenuifolium s.str. se distribuye ampliamente por el N de la cuenca mediterránea y Europa templada. Dado su tiempo de divergencia es probable que haya recolonizado áreas libres de hielos tras las glaciaciones, aprovechando para ello su autocompatibilidad y monomorfismo, que la hace relativamente independiente en el proceso de la polinización (Baker, 1955;

Pannell y Barrett, 1998). Este proceso de invasión ha debido ser rápido y homogéneo, no ha generado variaciones citológicas (ploidía) ni taxones diferenciados de ninguna categoría, como reconocen todos los autores que han tratado la taxonomía del grupo. Por el contrario, L. suffruticosum s.l. ha invadido zonas más meridionales, montañas mediterráneas del Mediterráneo occidental. En este proceso un nivel alto de diversidad genética promovido por el sistema de incompatibilidad heteromórfico y la reciprocidad tridimensional ha debido ser valioso para la colonización de sitios ya ocupados durante el

Pleistoceno, por lo que la especie debió de ser más competitiva. La generación de nuevos citotipos poliploides no ha afectado a la expresión del polimorfismo, por lo que debe tratarse hipotéticamente de autopoliploidía (Naiki, 2012). Este proceso debe haber sido muy reciente en ambas especies, lo que podría

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explicar que ninguna de las dos haya colonizado las grandes islas del

Mediterráneo (solo se conoce la presencia, muy escasa, escasa de L. tenuifolium en Córcega, Cerdeña y Sicilia, destacando la ausencia en Baleares, en Creta, Chipre y las islas del Egeo; Greuter et al., 1989), a pesar de que la ecología de ambas especies es pionera típica, propia de tomillares, romerales y otros matorrales de degradación, sobre todo en suelos calizos o derivados, incluso con invasión de sitios muy estresantes (peridotitas del sur de la

Península Ibérica). Todo esto nos hace pensar que se trata de un grupo recién llegado y diversificado (como Linaria (Blanco-Pastor et al., 2012) o Dianthus

(Valente et al., 2010; Balao et al., 2010)).

Futuros análisis de un mayor número de marcadores nucleotídicos obtenidos por secuenciación masiva podrán ayudar a determinar más fiablemente las relaciones entre los linajes del grupo y así establecer qué condiciones de sistema de reproducción, ploidía, distribución ecológica, etc., son ancestrales y derivados. Así mismo, estudios microevolutivos sobre la cantidad de flujo génico entre los dos linajes en zonas de contacto determinarán la expresión real en la actualidad.

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Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Material Suplementario

Fig. S1. Resultados del test de Mantel para la correlación entre la distancia genética y la distancia geográfica con 10.000 permutaciones para establecer el nivel de significación. A) Test de Mantel para las poblaciones de L. suffruticosum R²=0,109 (p<0,001). B) Test de Mantel para

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Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

las poblaciones de L. tenuifolium. R²=0,0307 (p<0,05). GD= Distancia genética de Nei; GDD=

Distancia geográfica (Km).

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Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Fig. S2. Filogenia concatenada (ITS + ndhF-rpL32R y nadH) con muestras de McDill et al.,

2009.

Fig. S3. Resultados de los cruzamientos realizados en las tres poblaciones de L. suffruticosum s. str.: Ronda (36º47'39''N/04º59'24''O; Málaga), Campisábalo

(41º15'48''N/03º12'38''O; Guadalajara) y Estana (42º21'32''N/01º43'28''E; Lérida); y una población de L. tenuifolium s. str.: Montellá (42º20'29''N/01º43'25''E; Lérida). Se indica la probabilidad de formación de frutos según los distintos tratamientos. En las poblaciones dimórficas (L. suffruticosum), se realizaron los siguientes tratamientos: autopolinización en flores longistilas (L) y brevistilas (B); polinización legítima, en la que el morfo donador de polen fue opuesto al morfo receptor de polen (L x B y B x L), y polinización ilegítima, donde la flor donadora de polen y la receptora fueron del mismo morfo (L x L y B x B). En la población monomórfica (L. tenuifolium) se aplicaron los tratamientos autopolinización y polinización ilegitima, en este caso sin distinguir morfos estilares, obviamente.

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of

Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Tabla S1. Lista de las 125 poblaciones de L. tenuifolium aggr. incluidas en el estudio con información concerniente al código correspondiente a cada población, taxón, latitud y longitud, altitud sobre el nivel del mar, condición estilar (dimorfismo o monomorfismo), nº de flores del morfo longistilo (L), nº de flores del morfo brevistilo (B), número de flores analizadas (Flores totales), localidad y códigos usados para las gráficas (Códigos resultados).

Código de Condición "Estilo "Estilo Flores Código TAXON LATITUD LONGITUD ALTITUD LOCALIDAD campo estilar Largo" Corto" totales Resultados

171JRM11 L. suffruticosum 32º36'02.10''N 04º48'55.20''W 1854m Dimorfismo 49 51 100 Marruecos, Midelt, Circo de Jaffar A_su_171

172JRM11 L. suffruticosum 33º52'18.90''N 04º01'46.20''W 1500m Dimorfismo 60 42 102 Marruecos, Taza, Merhaoua A_su_172

602YBK L. suffruticosum 34°42'40.36"N 01°31'45.12"W 648m Dimorfismo 11 31 42 Algeria, Beni Bahdel A_su_602

87JRM10 L. suffruticosum 34°59'47.34"N 04°12'21.07"W 1100m Dimorfismo NA NA NA Marruecos, Beni Hadifa A_su_77

33JRM09 L. suffruticosum 34°56'59.14"N 04°20'03.41"W 1100m Dimorfismo NA NA NA Marruecos, Ketama A_su_78

97JRM10 L. suffruticosum 32°41'50.81"N 04°49'26.02"W 1782m Dimorfismo NA NA NA Marruecos, Midelt, Circo de Jaffar A_su_79

92JRM10 L. suffruticosum 34°49'02.80"N 02°25'12.00"W 510m Dimorfismo 51 49 100 Marruecos, Taforalt, Tagma A_su_80

86JRM10 L. suffruticosum 34°58'46.30"N 04°13'37.70"W 1100m Dimorfismo 49 53 102 Marruecos, Targuist A_su_81

España, Alicante, Benifallim, Sierra del

51JML04 L. suffruticosum 38°38'56.68"N 00°24'52.36"W 970m Dimorfismo NA NA NA Rentonar E_su_A24

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

16RP08 L. suffruticosum 37°47'44.82"N 02°17'02.03"W 1079m Dimorfismo 55 49 104 España, Almería, Cañada de Cañepla E_su_Al25

24JRM09 L. suffruticosum 36°56'10.90"N 02°36'22.80"W 800m Dimorfismo 44 36 80 España, Almería, S.de Gádor E_su_Al26

25JRM09 L. suffruticosum 37°18'44.56"N 03°24'27.77"W 1188m Dimorfismo 51 46 97 España, Almería, S.de Huétor E_su_Al27

18JML05 L. suffruticosum 37°42'04.19"N 02°08'57.15"W 930m Dimorfismo NA NA NA España, Almería, María-Vélez Blanco E_su_Al6

España, Barcelona, Sant Julià de Vilatorta,

5JML05 L. suffruticosum 41°52'58.60"N 02°19'30.19"E 715m Dimorfismo NA NA NA Vilalleons E_su_B12

42JRM09 L. suffruticosum 42°15'14.62"N 01°52'17.65"E 847m Dimorfismo 47 49 96 España, Barcelona, Bagá E_su_B28

40JRM09 L. suffruticosum 42°07'41.12"N 01°51'48.37"E 771m Dimorfismo 45 51 96 España, Barcelona, Berga E_su_B29

86JML04 L. suffruticosum 42°41'09.08"N 02°37'17.74"W 630m Dimorfismo NA NA NA España, Burgos, Condado de Treviño E_su_Bu17

España, Burgos, Partido de la Sierra en

91JML04 L. suffruticosum 42°42'47.35"N 03°16'51.16"W 780m Dimorfismo NA NA NA Tobalina E_su_Bu19

96JML04 L. suffruticosum 42°18'28.52"N 03°16'00.96"W 1050m Dimorfismo NA NA NA España, Burgos, Valmala E_su_Bu20

21JRM09 L. suffruticosum 36°30'58.57"N 06°08'17.85"W 33m Dimorfismo 52 39 91 España, Cádiz, Puerto Real E_su_Ca30

18JRM09 L. suffruticosum 38°53'13.42"N 03°03'11.05"W 833m Dimorfismo 47 50 97 España, Ciudad Real. Alhambra E_su_CR31

España, Ciudad Real, Puertollano, Puerto de

25JML04 L. suffruticosum 38°37'05.59"N 04°06'51.19"W 932m Dimorfismo NA NA NA Mestanza E_su_CR7

57JML04 L. suffruticosum 39°52'57.92"N 00°22'15.20"W 630m Dimorfismo NA NA NA España, Castellón, Almedíjar E_su_Cs32

75JML04 L. suffruticosum 40°36'09.95"N 02°09'38.90"W 1280m Dimorfismo NA NA NA España, Cuenca, Carrascosa E_su_Cu1

01RP09 L. suffruticosum 39°51'48.40"N 02°08'07.10"W 1090m Dimorfismo 54 44 98 España, Cuenca,Tortola-Valeria E_su_Cu33

29JML04 L. suffruticosum 39°30'56.09"N 02°53'01.20"W 725m Dimorfismo NA NA NA España, Cuenca, Mota del Cuervo E_su_Cu34

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

211JRM11 L. suffruticosum 42°19'45.84"N 02°27'42.42"E 686m Dimorfismo NA NA NA España, Gerona, Rocabruna-Beget E_su_Ge211

23JRM09 L. suffruticosum 37°26'24.54"N 02°52'58.76"W 1188m Dimorfismo 25 26 51 España, Granada, Baza E_su_Gr35

01RP07 L. suffruticosum 37°16'36.90"N 02°58'38.70"W 1272m Dimorfismo 32 30 62 España, Granada, Charches E_su_Gr36

02RP07 L. suffruticosum 37°23'27.50"N 02°59'56.80"W 1205m Dimorfismo 42 40 82 España, Granada, Gor E_su_Gr37

32JML04 L. suffruticosum 36°50'44.65"N 03°43'04.23"W 1073m Dimorfismo NA NA NA España, Granada, Otívar, Puerto de la Cabra E_su_Gr5

101JML04 L. suffruticosum 41°15'15.17"N 03°12'53.48"W 1350m Dimorfismo NA NA NA España, Guadalajara, Cantalojas, Villacadima E_su_Gu21

17JRM09 L. suffruticosum 40°16'52.03"N 02°50'56.44"W 818m Dimorfismo 23 21 44 España, Guadalajara, Albalate de ZorIta E_su_Gu22

74JML04 L. suffruticosum 40°37'54.38"N 02°30'12.09"W 1043m Dimorfismo NA NA NA España, Guadalajara, Peralveche E_su_Gu23

España,Guadalajara, Sierra de Pela,

04RPB10 L. suffruticosum 41°17'24.50"N 03°07'27.60"W 1470m Dimorfismo 47 72 119 Campisabalo E_su_Gu38

02RPB10 L. suffruticosum 41°14'07.60"N 03°02'30.60"W 1238m Dimorfismo 74 53 127 España,Guadalajara, Atienza E_su_Gu39

España, Guadalajara, Salmeron-

30RP08 L. suffruticosum 40°31'34.50"N 02°31'37.60"W 809m Dimorfismo 51 56 107 Salmeroncillo E_su_Gu40

España, Huesca, Fonz, San Jorge

1JML09 L. suffruticosum 41°59'16.38"N 00°17'01.72"E 430m Dimorfismo NA NA NA E_su_Hu3

11RP09 L. suffruticosum 42°20'48.90"N 00°23'05.90"E 622m Dimorfismo 24 25 49 España, Huesca, Benasque E_su_Hu41

09RP09 L. suffruticosum 42°39'54.90"N 00°35'53.40"W 1083m Dimorfismo 55 40 95 España, Huesca, Borau E_su_Hu42

08RP09 L. suffruticosum 42°31'57.80"N 00°32'58.40"W 1097m Dimorfismo 53 48 101 España, Huesca, Jaca, Oroel E_su_Hu43

04RP09 L. suffruticosum 42°29'39.40"N 00°48'25.90"W 799m Dimorfismo 55 41 96 España, Huesca, Jaca, Pto. Sta. Barbara E_su_Hu44

05RP09 L. suffruticosum 42°30'16.70"N 00°38'19.70"W 1116m Dimorfismo 48 43 91 España, Huesca, Jaca, San Juan de la Peña E_su_Hu45

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

12RP09 L. suffruticosum 42°29'44.80"N 00°24'17.90"E 895m Dimorfismo 38 40 78 España, Huesca, Seira E_su_Hu46

03RP09 L. suffruticosum 42°23'23.35"N 00°42'54.98"W 575m Dimorfismo NA NA NA España, Huesca, Triste E_su_Hu47

España, Jaén, Santiago-Pontones, Barranco

19JML04 L. suffruticosum 38°00'38.16"N 02°51'47.89"W 680m Dimorfismo NA NA NA del Borosa E_su_J10

31JML04 L. suffruticosum 37°40'31.74"N 03°38'06.15"W 866m Dimorfismo NA NA NA España, Jaén, Pegalajar E_su_J8

España, Jaén, Santa Elena, Paso de

43JML04 L. suffruticosum 38°21'07.12"N 03°31'35.25"W 713m Dimorfismo NA NA NA Despeñaperros E_su_J9

7JML05 L. suffruticosum 41°49'57.63"N 00°35'26.90"E 330m Dimorfismo NA NA NA España, Lérida, Ivars de Noguera E_su_L4

06RPB10 L. suffruticosum 42°22'59.40"N 00°47'25.40"E 1063m Dimorfismo 29 34 63 España, Lérida, Adons E_su_L48

56JRM09 L. suffruticosum 42°28'00.26"N 00°46'26.58"E 1043m Dimorfismo 36 37 73 España, Lérida, Barruera E_su_L49

13RP09 L. suffruticosum 42°20'27.00"N 01°40'38.30"E 1148m Dimorfismo 64 47 111 España, Lérida, Montellá E_su_L50

8JML05 L. suffruticosum 41°49'57.53"N 00°35'29.17"E 330m Dimorfismo NA NA NA España, Lérida, Ivars de Noguera E_su_L51

60JRM09 L. suffruticosum 42°08'51.90"N 00°48'29.16"E 835m Dimorfismo 58 35 93 España, Lérida, Tremp E_su_L52

España, Madrid, Orusco de Tajuña, El

5JML04 L. suffruticosum 40°16'52.57"N 03°13'24.63"W 680m Dimorfismo NA NA NA Colmenar E_su_M13

España, Madrid, Arganda del Rey, Morata de

11JRM09 L. suffruticosum 40°17'10.64"N 03°27'02.44"W 610m Dimorfismo 47 50 97 Tajuña E_su_M53

15JRM09 L. suffruticosum 40°24'30.31"N 03°16'59.49"W 741m Dimorfismo 49 47 96 España, Madrid, Valverde de Alcalá E_su_M54

40JML04 L. suffruticosum 36°50'34.91"N 04°49'00.83"W 470m Dimorfismo NA NA NA España, Málaga, Carratraca, Sierra de Aguas E_su_Ma2

02JRM09 L. suffruticosum 36º50'51.80''N 04º48'13.40''W 523m Dimorfismo 49 53 102 España, Málaga, Alora, Carratraca E_su_Ma55

26JRM09 L. suffruticosum 36°47'39.00"N 04°59'24.40"W 1010m Dimorfismo 45 55 100 España, Málaga, Ronda E_su_Ma56

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

38JML04 L. suffruticosum 36°50'05.92"N 03°57'52.05"W 873m Dimorfismo NA NA NA España, Málaga, Cómpeta E_su_Ma82

23JML07 L. suffruticosum 38°01'55.46"N 01°44'00.38"W 486m Dimorfismo NA NA NA España, Almería, Bédar E_su_Al11

01JA06 L. suffruticosum 41°17'02.87"N 00°31'16.98"E 190m Dimorfismo NA NA NA España, Tarragona, Flix E_su_T57

34RP08 L. suffruticosum 40°50'50.77"N 01°27'41.11"W 1104m Dimorfismo 49 62 111 España, Teruel, Blancas E_su_Te58

39JRM09 L. suffruticosum 40°49'47.50"N 00°47'53.48"W 856m Dimorfismo 40 25 65 España, Teruel, Montalbán E_su_Te59

38JRM09 L. suffruticosum 40°50'34.66"N 01°01'45.77"W 1285m Dimorfismo 41 47 88 España, Teruel, Montalbán, Pto. Minguez E_su_Te60

08JRM09 L. suffruticosum 39°35'07.12"N 01°09'22.32"W 856m Dimorfismo 50 50 100 España, Valencia, Estenas E_su_V61

55JML04 L. suffruticosum 39°42'53.26"N 00°32'18.45"W 348m Dimorfismo NA NA NA España, Valencia, Marines E_su_V62

07JRM09 L. suffruticosum 39°06'16.81"N 01°01'56.28"W 520m Dimorfismo 41 55 96 España, Valencia, Teresa de Cofrentes E_su_V63

84JML04 L. suffruticosum 42°38'57.33"N 02°28'31.52"W 738m Dimorfismo NA NA NA España, Vitoria, Bernedo E_su_Vi18

2JML05 L. suffruticosum 41°19'24.06"N 02°09'05.86"W 750m Dimorfismo NA NA NA España, Zaragoza, Pozuel de Ariza E_su_Z14

11JML05 L. suffruticosum 41°52'02.69"N 01°36'08.08"W 720m Dimorfismo NA NA NA España, Zaragoza, Borja E_su_Z64

37JRM09 L. suffruticosum 41°10'52.18"N 01°27'26.71"W 851m Dimorfismo 65 41 106 España, Zaragoza, Daroca E_su_Z65

40JML09 L. suffruticosum 43°46'53.64"N 07°15'08.22"E 550m Dimorfismo NA NA NA Francia, Alpes Maritimes, Aspremont F_su_16

50JRM09 L. suffruticosum 43°58'08.90"N 06°46'43.39"E 526m Dimorfismo 36 59 95 Francia, Annot F_su_66

51JRM09 L. suffruticosum 43°57'00.83"N 06°30'41.44"E 890m Dimorfismo 50 57 107 Francia, Annot2 F_su_67

24RPB10 L. suffruticosum 43°49'05.50"N 07°09'30.70"E 523m Dimorfismo 31 32 63 Francia, Carros-Le Broc F_su_68

44RPB10 L. suffruticosum 44°41'30.80"N 05°40'21.40"E 1179m Dimorfismo 62 57 119 Francia, Grimone F_su_69

53JRM09 L. suffruticosum 44°15'49.25"N 03°13'33.74"E 423m Dimorfismo NA NA NA Francia, Languedoc-Rosellón, Les Vignes F_su_70

22RPB10 L. suffruticosum 43°20'17.10"N 05°46'36.40"E 703m Dimorfismo 44 32 76 Francia, Massif de Sante Baume F_su_71

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

19RPB10 L. suffruticosum 43°51'10.62"N 03°24'26.96"E 721m Dimorfismo 42 28 70 Francia, St. Mitchell (H'erault), Soulagets F_su_72

17RPB10 L. suffruticosum 43°51'20.90"N 03°24'13.30"E 721m Dimorfismo 37 39 76 Francia, St. Pierre de la Fage F_su_73

34JML09 L. suffruticosum 45°09'07.32"N 07°03'22.86"E 1023m Dimorfismo NA NA Italia, Piemonte, Valle de Susa I_su_15

47JRM09 L. suffruticosum 44°12'29.81"N 08°23'32.60"E 312m Dimorfismo 8 8 16 Italia, Cabo Noli I_su_74

45JRM09 L. suffruticosum 44°30'58.57"N 08°47'48.52"E 870m Dimorfismo 53 43 96 Italia, Genova, Caranessi I_su_75

30RPB10 L. suffruticosum 44°33'03.73"N 08°46'24.65"E 728m Dimorfismo 27 30 57 Italia, P.N. Capanne di Marcorolo I_su_76

208JRM11 L. tenuifolium 42º20'27.77''N 01º43'08.50''E 1311m Monomorfismo NA NA NA España, Lérida, Sierra del Cadí E_te_208

25RPB10 L. tenuifolium 43°59'03.70"N 07°21'09.70"E 911m Monomorfismo NA NA NA Francia, Bollene-Col de Turin F_te_83

29RPB10 L. tenuifolium 43°53'51.00"N 07°28'22.19"E 619m Monomorfismo NA NA NA Francia, Breil F_te_84

08RPB10 L. tenuifolium 44°26'27.80"N 01°28'01.52"E 265m Monomorfismo NA NA NA Francia, Cahors F_te_85

10RPB10 L. tenuifolium 43°06'10.00"N 02°21'50.50"E 210m Monomorfismo NA NA NA Francia, Carcassone, Ladern-Sur Lauquet F_te_86

42RPB10 L. tenuifolium 44°45'34.60"N 05°40'04.50"E 836m Monomorfismo NA NA NA Francia, Grenoble F_te_87

45RPB10 L. tenuifolium 44°41'29.25"N 05°40'24.93"E 1179m Monomorfismo NA NA NA Francia, Grimone F_te_88

52JRM09 L. tenuifolium 44°21'10.08"N 03°31'03.90"E 516m Monomorfismo NA NA NA Francia, Languedoc-Rosellón, Florac F_te_89

12RPB10 L. tenuifolium 42°50'10.29"N 02°10'00.24"E 837m Monomorfismo NA NA NA Francia, Pasando Quirbajou F_te_90

Francia, Gorges de St. Martin de Lys 41JML09 L. tenuifolium 42°49'40.10"N 02°12'17.12"E 740m Monomorfismo NA NA NA F_te_91

11RPB10 L. tenuifolium 42°48'57.40"N 02°13'36.80"E 367m Monomorfismo NA NA NA Francia, Quirbajou F_te_92

13RPB10 L. tenuifolium 42°52'50.37"N 02°08'09.92"E 606m Monomorfismo NA NA NA Francia, Ginoles F_te_93

16RPB10 L. tenuifolium 43°46'27.32"N 03°24'45.80"E 448m Monomorfismo NA NA NA Francia, St. Etienne de Gourgas, Parlatges F_te_94

18RPB10 L. tenuifolium 43°50'52.95"N 03°25'47.41"E 721m Monomorfismo NA NA NA Francia, St. Mitchell (H'erault), Soulagets F_te_95

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

41RPB10 L. tenuifolium 45°23'47.90"N 05°57'35.00"E 456m Monomorfismo NA NA NA Francia, Sta. Marie du Mont F_te_96

121JRM10 L. tenuifolium 40°05'15.20"N 22°24'30.30"E 1034m Monomorfismo NA NA NA Grecia, Mte. Olympo G_te_100

220PV04 L. tenuifolium 40°04'49.48"N 22°23'59.25"E 1240m Monomorfismo NA NA NA Grecia, Mte. Olympo2 G_te_101

123JRM10 L. tenuifolium 39°57'55.00"N 21°22'09.60"E 652m Monomorfismo NA NA NA Grecia, Kraniá G_te_97

124JRM10 L. tenuifolium 39°53'59.11"N 21°15'52.62"E 923m Monomorfismo NA NA NA Grecia, Metsovo G_te_98

127JRM10 L. tenuifolium 39°45'19.70"N 21°08'12.30"E 903m Monomorfismo NA NA NA Grecia, Metsovo2 G_te_99

107JRM10 L. tenuifolium 40°37'15.87"N 14°33'38.42"E 335m Monomorfismo NA NA NA Italia, Amalfi I_te_102

110JRM10 L. tenuifolium 39°52'51.20"N 16°00'04.30"E 856m Monomorfismo NA NA NA Italia, Castrovillari I_te_103

32RPB10 L. tenuifolium 45°26'18.50"N 10°30'41.20"E 146m Monomorfismo NA NA NA Italia, Lago di Garda, Desenzano del Garda I_te_104

34RPB10 L. tenuifolium 45°33'32.90"N 10°34'09.00"E 170m Monomorfismo NA NA NA Italia, Lago di Garda, Rocca de Minerva I_te_105

129JRM10 L. tenuifolium 42°22'23.20"N 13°23'25.90"E 787m Monomorfismo NA NA NA Italia, L'Aquila, Pettino I_te_106

112JRM10 L. tenuifolium 39°50'02.40"N 16°10'50.00"E 509m Monomorfismo NA NA NA Italia, Morano I_te_107

128JRM10 L. tenuifolium 42°12'18.40"N 14°04'30.70"E 1025m Monomorfismo NA NA NA Italia, P.N. Maiella I_te_108

132JRM10 L. tenuifolium 42°33'53.39"N 12°54'42.63"E 1125m Monomorfismo NA NA NA Italia, Rieti, Terminillo I_te_109

44JRM09 L. tenuifolium 44°02'42.79"N 10°23'15.97"E 322m Monomorfismo NA NA NA Italia, Gallicano, Grotta del vento I_te_110

108JRM10 L. tenuifolium 40°36'34.40"N 15°32'14.50"E 510m Monomorfismo NA NA NA Italia, Vietri di Potenza I_te_111

37RPB10 L. tenuifolium 46°10'20.70"N 07°24'56.30"E 977m Monomorfismo NA NA NA Suiza, Arolla-Evolene S_te_112

39RPB10 L. tenuifolium 47°35'14.20"N 08°31'02.00"E 405m Monomorfismo NA NA NA Suiza, Zurich, Eglisau 1 S_te_113

40RPB10 L. tenuifolium 47°34'51.47"N 08°30'47.41"E 405m Monomorfismo NA NA NA Suiza, Zurich, Eglisau 2 S_te_114

135JRM10 L. tenuifolium 41°03'06.90"N 29°56'37.80"E 219m Monomorfismo NA NA NA Turquía, Agva T_te_115

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

143JRM10 L. tenuifolium 40°38'01.00"N 33°36'32.10"E 796m Monomorfismo NA NA NA Turquía, Çankiri T_te_116

146JRM10 L. tenuifolium 41°10'46.80"N 32°35'04.70"E 1056m Monomorfismo NA NA NA Turquía, Karabük T_te_117

147JRM10 L. tenuifolium 40°44'53.30"N 31°52'55.00"E 1005m Monomorfismo NA NA NA Turquía, Kuzörendagli T_te_118

204JRM11 L. tenuifolium 40º53'56.80''N 35º27'11.80''E 865m Monomorfismo NA NA NA Turquía, Merzifon, P.N. Tavsan Da. T_te_204

207JRM11 L. tenuifolium 40º06'57.80''N 32º36'17.80''E 915m Monomorfismo NA NA NA Turquía, Karabuk, Keltepe T_te_207

Tabla S2. Grupos externos usados en la filogenia de ITS y para el análisis de la estimación del tiempo de divergencia con sus correspondientes números de acceso de GenBank.

Acceso GenBank Acceso GenBank Taxón ITS ndhF5-8

Anisadenia pubescens FJ169513 FJ160772

Cliococca selaginoides FJ169540 FJ160774

Hesperolinon micranthum FJ169542 FJ160775

Hugonia busseana FJ169512 FJ160773

Linum album FJ169547 FJ160792

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Linum arboreum FJ169537 FJ160793

Linum africanum FJ169551 FJ160777

Linum austriacum FJ169522 FJ160799

Linum bienne FJ169527 FJ160797

Linum catharticum FJ169533 FJ160796

Linum comptonii FJ169550 FJ160778

Linum esterhuysenae FJ160779 FJ160822

Linum flavum FJ169538 FJ160794

Linum gracile FJ169556 FJ160776

Linum grandiflorum FJ169525 FJ160798

Linum hirsutum FJ169520 FJ160788

Linum hypericifolium FJ169519 FJ160789

Linum kingii FJ169555 FJ160780

Linum lewisii FJ169523 FJ160800

Linum littorale FJ169543 FJ160781

Linum macraei FJ169544 FJ160782

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Linum marginale FJ169528 FJ160804

Linum maritimum FJ169535 FJ160811

Linum nodiflorum FJ169539 FJ160795

Linum oligophyllum FJ169546 FJ160783

Linum pallescens FJ169521 FJ160801

Linum perenne FJ169524 FJ160802

Linum prostratum FJ169545 FJ160784

Linum pubescens FJ169518 FJ160790

Linum rupestre FJ169553 FJ160785

Linum stelleroides FJ169516 FJ160805

Linum striatum FJ169554 FJ160786

Linum strictum FJ169530 FJ160806

Linum trigynum FJ169536 FJ160810

Linum tenue FJ169548 FJ160808

Linum usitatissimum FJ169526 FJ160803

Linum vernale FJ169552 FJ160812

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Linum viscosum FJ169517 FJ160791

Linum volkensii FJ169531 FJ160813

Radiola linoides FJ169534 FJ160815

Reinwardtia indica FJ169514 FJ160814

Sclerolinon digynum FJ169541 FJ160787

Tirpitzia sinensis FJ169515 FJ160816

Humiria balsamífera - EU002231

Viola pubescens - FJ670135

Tabla S3. Identificación de las poblaciones estudiadas según las claves realizadas por tres autores: Flora Europaea (Ockendon, 1968); López González

G., (1979) y Flora Iberica (Martínez-Labarga y Muñoz-Garmendia, 2015).

Código de campo Flora Europaea López González (1979) Flora Ibérica Localidad

171JRM11 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Midelt, Circo de Jaffar

172JRM11 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Taza, Merhaoua

602YBK NA NA L. suffruticosum Algeria, Beni Bahdel

87JRM10 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Beni Hadifa

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

33JRM09 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Ketama

97JRM10 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Midelt, Circo de Jaffar

92JRM10 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Taforalt, Tagma

86JRM10 NA NA L. suffruticosum Marruecos, Targuist

51JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. suffruticosum subsp. crespoi España, Alicante, Benifallim, Sierra del Rentonar

16RP08 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. jimenezii España, Almería, Cañada de Cañepla

24JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. jimenezii España, Almería, S.de Gádor

25JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. jimenezii España, Almería, S.de Huétor

18JML05 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. tejedense L. jimenezii subsp. willkommii España, Almería, María-Vélez Blanco

5JML05 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Barcelona, Sant Julià de Vilatorta, Vilalleons

42JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Barcelona, Bagá

40JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Barcelona, Berga

86JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appressum L. appressum subsp. permixtum España, Burgos, Condado de Treviño

91JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appresum L. appressum subsp. commutatum España, Burgos, Partido de la Sierra en Tobalina

96JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appresum L. appressum subsp. commutatum España, Burgos, Valmala

21JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. gaditanum España, Cádiz, Puerto Real

18JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Ciudad Real. Alhambra

España, Ciudad Real, Puertollano, Puerto de

25JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. marianorum Mestanza

57JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. suffruticosum España, Castellón, Almedíjar

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

75JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appressum L. appressum subsp. appresum España, Cuenca, Carrascosa

01RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. marianorum España, Cuenca,Tortola-Valeria

29JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Cuenca, Mota del Cuervo

211JRM11 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Gerona, Rocabruna-Beget

23JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. jimenezii España, Granada, Baza

01RP07 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii España, Granada, Charches

02RP07 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii España, Granada, Gor

32JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. willkommii España, Granada, Otívar, Puerto de la Cabra

101JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appresum L. appressum subsp. commutatum España, Guadalajara, Cantalojas, Villacadima

17JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. salsoloides L. salsoloides España, Guadalajara, Albalate de ZorIta

74JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. salsoloides L. salsoloides España, Guadalajara, Peralveche

04RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appresum L. appressum España,Guadalajara, Sierra de Pela, Campisabalo

02RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appresum L. appressum España,Guadalajara, Atienza

30RP08 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. differens España, Guadalajara, Salmeron-Salmeroncillo

1JML09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum NA L. castroviejoi España, Huesca, Fonz, San Jorge

11RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Benasque

09RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Borau

08RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Jaca, Oroel

04RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Jaca, Pto. Sta. Barbara

05RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Jaca, San Juan de la Peña

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

12RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Seira

03RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Huesca, Triste

España, Jaén, Santiago-Pontones, Barranco del

19JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. marianorum subsp. marianorum Borosa

31JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. jimenezii España, Jaén, Pegalajar

43JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. marianorum subsp. marianorum España, Jaén, Santa Elena, Paso de Despeñaperros

7JML05 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. castroviejoi España, Lérida, Ivars de Noguera

06RPB10 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Lérida, Adons

56JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Lérida, Barruera

13RP09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Lérida, Montellá

8JML05 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. suffruticosum subsp. differens España, Lérida, Ivars de Noguera

60JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. milletii L. milletii España, Lérida, Tremp

5JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Madrid, Orusco de Tajuña, El Colmenar

11JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Madrid, Arganda del Rey, Morata de Tajuña

15JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Madrid, Valverde de Alcalá

40JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. carratracensis L. carratracense España, Málaga, Carratraca, Sierra de Aguas

02JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. carratracensis L. carratracense España, Málaga, Alora, Carratraca

26JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. marianorum subsp. arundanum España, Málaga, Ronda

38JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. tejedense L. tejedense España, Málaga, Cómpeta

23JML07 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. angustifolium L. jimenezii subsp. jimenezii España, Almería, Bédar

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

01JA06 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. suffruticosum España, Tarragona, Flix

34RP08 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appressum L. appressum España, Teruel, Blancas

39JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. differens España, Teruel, Montalbán

38JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appressum L. appressum subsp. appresum España, Teruel, Montalbán, Pto. Minguez

08JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Valencia, Estenas

55JML04 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. suffruticosum España, Valencia, Marines

07JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Valencia, Teresa de Cofrentes

84JML04 L. suffruticosum subsp. salsoloides L. appressum L. appressum subsp. permixtum España, Vitoria, Bernedo

2JML05 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Zaragoza, Pozuel de Ariza

11JML05 L. suffruticosum subsp. suffruticosum NA L. suffruticosum subsp. montserratii España, Zaragoza, Borja

37JRM09 L. suffruticosum subsp. suffruticosum L. suffruticosum var. suffruticosum L. suffruticosum subsp. loeflingii España, Zaragoza, Daroca

40JML09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Alpes Maritimes, Aspremont

50JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Annot

51JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Annot2

24RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Carros-Le Broc

44RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Grimone

53JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Languedoc-Rosellón, Les Vignes

22RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, Massif de Sante Baume

19RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, St. Mitchell (H'erault), Soulagets

17RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Francia, St. Pierre de la Fage

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

34JML09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Italia, Piemonte, Valle de Susa

47JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Italia, Cabo Noli

45JRM09 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Italia, Genova, Caranessi

30RPB10 L. suffruticosum subsp. salsoloides NA L. suffruticosum Italia, P.N. Capanne di Marcorolo

208JRM11 L. tenuifolium NA L. tenuifolium España, Lérida, Sierra del Cadí

25RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Bollene-Col de Turin

29RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Breil

08RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Cahors

10RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Carcassone, Ladern-Sur Lauquet

42RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Grenoble

45RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Grimone

52JRM09 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Languedoc-Rosellón, Florac

12RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Pasando Quirbajou

41JML09 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Gorges de St. Martin de Lys

11RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Quirbajou

13RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Ginoles

16RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, St. Etienne de Gourgas, Parlatges

18RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, St. Mitchell (H'erault), Soulagets

41RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Francia, Sta. Marie du Mont

121JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Grecia, Mte. Olympo

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

220PV04 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Grecia, Mte. Olympo2

123JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Grecia, Kraniá

124JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Grecia, Metsovo

127JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Grecia, Metsovo2

107JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Amalfi

110JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Castrovillari

32RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Lago di Garda, Desenzano del Garda

34RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Lago di Garda, Rocca de Minerva

129JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, L'Aquila, Pettino

112JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Morano

128JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, P.N. Maiella

132JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Rieti, Terminillo

44JRM09 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Gallicano, Grotta del vento

108JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Italia, Vietri di Potenza

37RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Suiza, Arolla-Evolene

39RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Suiza, Zurich, Eglisau 1

40RPB10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Suiza, Zurich, Eglisau 2

135JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Turquía, Agva

143JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Turquía, Çankiri

146JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Turquía, Karabük

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

147JRM10 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Turquía, Kuzörendagli

204JRM11 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Turquía, Merzifon, P.N. Tavsan Da.

207JRM11 L. tenuifolium NA L. tenuifolium Turquía, Karabuk, Keltepe

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Tabla S4. Poblaciones escogidas para analizar el polimorfismo en ambas especies a lo largo de sus distribuciones. En la tabla se presentan los resultados

de los análisis de la proporción de morfos, media de la hercogamia, desviación estándar, e índice de reciprocidad relativa de 5 poblaciones de L.

suffruticosum s.l. y 2 de L. tenuifolium s.str. El tipo de polimorfismo se presenta como Het. 3D= Heterostilia en tres dimensiones (L. suffruticosum s.l.); y Mon.

= Monomorfismo (L. tenuifolium s.str.) (estos datos se analizan en el capítulo 2 de esta tesis).

Prop. sd nº Media Reciprocidad Nº fotos por Especie Tipo Morfos G-Test (p) hercogamia Localidad Campo hercogamia(L/S) relativa (L/S) morfo (L/S) (L/S) (L/S)

02JRM09 L. suffruticosum Het. 3D 49/53 0,692 1,97/-1,07 0,27/0,28 -0,083/0,022 Alora (Málaga) 30/30

Sierra de Gádor 24JRM09 L. suffruticosum Het. 3D 44/36 0,371 1,74/-2,15 0,36/0,5 -0,013/0,054 32/30 (Almería)

51JRM09 L. suffruticosum Het. 3D 50/57 0,498 1,44/-1,46 0,61/0,39 0,012/0,028 Annot (Francia) 32/32

Targuist 86JRM10 L. suffruticosum Het. 3D 49/53 0,692 3,28/-2,57 0,57/0,41 -0,045/0,021 36/35 (Marruecos)

Albalate de 17JRM09 L. suffruticosum Het. 3D 53/47 0,548 2,29/-1,89 0,35/0,34 -0,048/0,033 31/31 Zorita

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

(Guadalajara)

P.N. de Maiella 128JRM10 L. tenuifolium Mon. 1,84 0,54 40 (Italia)

135JRM10 L. tenuifolium Mon. 1,38 0,64 Agva (Turquia) 45

Tabla S5. Resultados de los experimentos de cruzamiento controlado realizado en las tres poblaciones de L. suffruticosum: Campisábalo

(41º15'48''N/03º12'38''O; Guadalajara), Estana (42º21'32''N/01º43'28''E; Lérida) y Ronda (36º47'39''N/04º59'24''O; Málaga). Se refleja la probabilidad de

formación de frutos según los distintos tratamientos, el número total de flores tratadas (N) y el intervalo de confianza al 95%. En las poblaciones dimórficas

(L. suffruticosum), se realizaron los tratamientos: Control emasculadas sin pétalos, autopolinización en flores L y B; polinización legítima, en la que el morfo

donador de polen fue opuesto al morfo receptor de polen (L x B y B x L), y polinización ilegítima, donde la flor donadora de polen y la receptora fueron del

mismo morfo (L x L y B x B) y control emasculadas con pétalos.

Campisábalo Estana Ronda

Probabilidad Probabilidad Probabilidad

de producir de producir de producir

Tratamiento fruto N (95 % IC) fruto N (95 % IC) fruto N (95 % IC)

Autopolinización 0,004 34 (0,001 0,108) 0,004 24 (0,001 0,108) 0,098 17 (0,020 0,364)

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

Control emasculación -

pétalos ~ 0 30 (0,00E+00 0) ~ 0 26 (0,00E+00 0) ~ 0 10 (0,00E+00 0,00E+00)

Polinización ilegítima ~ 0 31 (0,00E+00 0) ~ 0 21 (0,00E+00 0) ~ 0 17 (0,00E+00 0,00E+00)

Polinización legítima 0,068 28 (0,012 0,304) 0,068 28 (0,012 0,304) 0,359 21 (0,166 0,612)

Control emasculación +

pétalos 0,879 49 (0,656 0,965) 0,879 26 (0,656 0,965) 0,816 25 (0,584 0,934)

Ruiz-Martín, J., Pérez-Barrales R., Vargas P. & Arroyo J. Evolution of heterostylous and monomorphic lineages of Linum tenuifolium group in tye Mediterranean Basin. (Unpublished manuscript)

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Linum flos-carmini (Linaceae), a New Species from Northern Morocco

Article in Annales Botanici Fennici · October 2015 DOI: 10.5735/085.052.0521

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Pedro Jiménez-Mejías Juan M Martínez Labarga Smithsonian Institution Universidad Politécnica de Madrid

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View publication stats Discusión General

La presente Tesis Doctoral pretende aumentar el conocimiento empírico sobre el polimorfismo estilar y condiciones relacionadas en el género Linum

(Linaceae), así como probar algunos presupuestos de los modelos evolutivos existentes sobre la evolución de la heterostila. Para ello se realiza una reconstrucción del polimorfismo en una filogenia lo más completa posible del género, realizada a partir de muestras de poblaciones naturales recolectadas y analizadas por el autor y colaboradores, otras tomadas regladamente de herbarios, y algunas otras obtenidas de repositorios públicos de secuencias de

ADN. Este análisis se realiza por tanto al nivel macroevolutivo (especies y niveles superiores). Sin embargo, para algunos casos de estudio se realizan aproximaciones microevolutivas, es decir, intraespecíficas y poblacionales, para comprobar otros supuestos de las mencionadas hipótesis. Estas hipótesis se pueden resumir en dos contrapuestas, alternativas, en los presupuestos y en los estados transitorios (Charlesworth y Charlesworth, 1979; Lloyd y Webb

1992a, b). De forma resumida, los primeros autores asumen autocompatibilidad y homostilia (falta de hercogamia) como estados ancestrales, seguidos de incompatibilidad heteromórfica y dimorfismo estilar, para acabar en distilia; la fuerza selectiva propuesta es la evitación de la endogamia y los costes asociados. Los segundos parten de la independencia entre incompatibilidad, del tipo que sea, y estado estilar, que se asume es de hercogamia de aproximación como condición ancestral, dimorfismo estilar no ligado a incompatibilidad heteromórfica, tras el que sigue la distilia con la misma falta de ligamiento con incompatibilidad, para acabar en distilia convencional (con incompatibilidad heteromorfica); proponen que la fuerza motriz es la promoción

1 de la polinización eficaz (incremento de las funciones masculina y femenina, mediante la acción de polinizadores efectivos en ellos; Barrett, 2002, retomando ideas explícitas de Darwin, 1877). En esta tesis se realizan pruebas sobre las condiciones morfológicas mencionadas y, en menor medida, se infieren procesos sobre incompatibilidad y sobre sistemas de polinización, que pueden ayudar a apoyar una hipótesis u otra.

Nivel macroevolutivo

Caracterización y evolución de los polimorfismos estilares.

Cualquier análisis macroevolutivo que trate de reconstruir las transiciones entre estados de condición estilar necesita primero de una definición de los polimorfismos en el grupo en cuestión. La variación de las condiciones posibles es amplia (como se ha encontrado en Kohn et al., 1996;

Li, 2001; Barrett, 2002; Graham y Barrett, 2004; Pérez-Barrales et al., 2006;

Brys et al., 2008; Ferrero et al., 2009, 2011; Haddadchi, 2013). En Linum se conocía una pequeña parte de esta variación (Darwin, 1877; Thompson, 2005), pero nunca se había abordado de forma exhaustiva (aunque véase Dulberger,

1992). Casi todos los estudios que han abordado procesos evolutivos sobre la heterostilia en Linum han seguido las descripciones taxonómicas que incluyen sólo heterostilia (distilia, más concretamente) y homostilia (entendida como falta de heterostilia). Los estudiosos de la heterostilia consideran que el término homostilia debe ser restringido al monomorfismo estilar sin hercogamia

(Barrett, 1992), una condición asociada a la autofecundación, sea ancestral o derivada (Lloyd y Webb, 1986). Un análisis exploratorio previo mostró que

2 había muchas más condiciones aparentes en este género. Es la primera vez que se hace una caracterización de la variación floral precisa en el género

Linum a la luz de los recientes estudios evolutivos en los que se proponen las condiciones fenotípicas transicionales (Armbruster et al., 2006; McDill et al.

2009). Normalmente este carácter se ha determinado sólo en base a examen de ejemplares de herbario y usando las descripciones taxonómicas (McDill et al, 2009). Esto conlleva dos problemas básicos para determinar el tipo de variación floral: (1) la variación morfológica fina está muy distorsionada por el prensado del material y (2) por definición no hay muestreo dentro de las poblaciones, algo que se sabe que varía mucho en los polimorfismos estilares

(Baker et al., 2000, Hodgins y Barrett, 2008, Ferrero et al., 2011). En este estudio se ha procurado caracterizar el polimorfismo estilar de cada especie en base a mediciones florales realizadas en material abundante recolectado en poblaciones naturales, cuando fue posible.

Como resultado notable, hay que puntualizar que todas las poblaciones de la misma especie/subespecie mantienen el mismo tipo de polimorfismo estilar, es decir, no se han encontrado variaciones morfológicas florales importantes en poblaciones de la misma especie, al menos en aquéllas en las que ha sido posible un muestreo de varias poblaciones. Asimismo, se ha encontrado una escasa variación en la proporción de morfos en la mayoría de los casos, que apenas se desvía de la isoplétia. Aunque no se disponen de muchos datos de sistema de reproducción en Linum (pero véase capítulo 3,

Dulberger, 1992, y Lewis y Jones, 1992), todo apunta a que las especies polimórficas tienen un sistema heteromórfico de incompatibilidad y sólo los cruces entre morfos (órganos sexuales a la misma altura) son fértiles. Esto y

3 una base genética típica del polimorfismo estilar (hasta donde se sabe, el morfo longistilo es homocigótico recesivo, y el morfo brevistilo es heterocigótico, para un locus con dos alelos en situación de dominancia) garantizaría directamente una proporción isoplética de morfos (Dulgerber, 1992). En general, un sistema heteromórfico de incompatibilidad suele ser evolutivamente muy estable (Lewis y Jones, 1992) con muy pocas reversiones reales a estados ancestrales (pero véase Ferrero et al. (2011) en Lithodora-Glandora (Boraginaceae)). El cambio evolutivo más frecuente tras la heterostilia con incompatibilidad heteromórfica es hacia la pérdida de la autocompatibilidad y ganancia de homostilia

(monomorfismo sin hercogamia) frecuentemente ligado a hibridación (Barrett et al., 2009) y/o a una estrategia de garantía reproductiva cuando la disponibilidad de plantas conspecíficas o polinizadores es escasa (Carlson et al., 2008).

Aparte de las variaciones discretas que determinan los tipos de polimorfismos estilares, estos muestran variaciones continuas que influyen directamente en un aspecto funcional del polimorfismo: la reciprocidad de los

órganos sexuales de los tipos de flores. El polimorfismo debe funcionar tanto más apropiadamente cuanto mayor sea la reciprocidad de estos órganos, facilitando la transferencia de polen (por los polinizadores) entre los morfos, garantizando así un uso eficiente de los gametos masculinos y femeninos

(Darwin, 1877; Lloyd & Webb, 1992b; Lloyd et al., 1996). Por ello, se han desarrollado diversos índices que tratan de medir la reciprocidad en poblaciones de especies polimórficas estilares. La reciprocidad debe variar profundamente entre tipos de polimorfismo, pero también dentro de cada uno de ellos, entre especies y poblaciones (revisado en Armbruster et al., 2017). En nuestro estudio se ha comprobado que la variación en la reciprocidad es

4 relativamente pequeña, entre especies polimórficas y dentro de ellas, entre poblaciones. Dado que no se han realizado estudios sobre los niveles de transferencia legítima/ilegítima de polen, no podemos conocer si estas variaciones tienen consecuencias funcionales. Estudios en curso en el grupo de Linum tenuifolium s.l. determinarán tal posibilidad.

El exhaustivo estudio morfológico de los órganos sexuales de las poblaciones y especies de Linum ha arrojado resultados interesantes, que incrementan el interés que este género ya había producido en los estudiosos de la heterostilia. Así, se ha podido constatar la amplia variedad de condiciones estilares en este género, especialmente en la región Mediterránea, donde además ocurre la mayor diversidad taxonómica y filogenética (véase más abajo). Además de la distilia convencional, reportada ya por Darwin (1877) y ampliada por otros a lo largo del s. XX (Dulberger, 1973, 1974, 1987; Nicholls,

1985, 1986; Rogers, 1979, 1980; Wolfe, 2001), se confirma también la existencia de dimorfismo estilar en L. grandiflorum (ya descrita por Darwin en

1877) y tal vez existente también en L. perenne (Heitz, 1973). Recientemente se ha descrito un nuevo tipo de polimorfismo en L. suffruticosum (Armbruster et al., 2006), que aquí se estudia y confirma, con muy pequeñas variaciones, en toda su extensión geográfica y se confirma su exclusividad en el género. La relación entre L. suffruticusum y la especie hermana L. tenuifolium es objeto de un análisis microevolutivo más abajo. Finalmente, se reportan condiciones estilares que suponen novedades de interés para la reconstrucción de las transiciones entre estados, como son la hercogamia reversa en situación de monomorfismo en L. nodiflorum, el dimorfismo estilar con dos alturas estaminales en L. hirsutum subsp. spathulatum en Grecia, o el aparente

5 trimorfismo en L. hirsutum s.l. en Turquía (ya sugerido por Fishback (1933)), y de L. subbiflorum perteneciente a la serie trimorfa de la flora de la URRS

(Yuzepchuk, 1974). Estos casos necesitan un mayor esfuerzo de muestreo al nivel de poblaciones, pues aunque parecen claros, implican estados nuevos no considerados en los modelos o pertenecientes a otros modelos (evolución de la tristilia (Charlesworth, 1979)), por lo que las consecuencias pueden ser trascendentes. Así por ejemplo, no es de extrañar la presencia de trimorfismo en una familia en la que ya se ha reportado tristilia (Hugonia serrata, Thompson et al., 1996, Meeus et al. 2011). Más sorprende la aparición de hercogamia reversa, cuyo significado adaptativo es difícil de interpretar. Hipotéticamente el escenario más plausible es el de una pérdida del dimorfismo asociada a una pérdida de incompatibilidad como seguro reproductor, pero este punto está por comprobar. Aunque la casuística queda así aumentada, lamentablemente no es posible reconstruir la historia evolutiva de todas las transiciones supuestas, dada (1) la gran variedad unida a (2) una gran escasez de casos para algunos de los tipos encontrados. Por ello, el análisis necesariamente ha sido simplificado para obtener potencia estadística. Aun así, se hace imposible resolver el estado ancestral, dada la gran variabilidad dentro del grupo y fuera de él. No obstante, en algunos grupos monofiléticos dentro del género, sí que se ha podido constatar que el monomorfismo con hercogamia de aproximación es la condición ancestral a la distilia, como prevé el modelo de Lloyd & Webb

(1992a). Otras condiciones monomórficas diferentes, con homostilia o con hercogamia (reversa, horizontal), aparecen como condiciones derivadas, probablemente relacionadas con un incremento de la autofecundación, como consecuencia de un proceso de aseguramiento reproductor. Más intrigante es

6 una transición terminal hacia el trimorfismo, dado que aún no tenemos un modelo de evolución claro para la tristilia (sólo para su pérdida; Charlesworth,

1979), por lo que este caso debe ser explorado con mayor detalle.

Correlatos evolutivos. En cuanto a los correlatos de esta reconstrucción, una cierta relación con los polinizadores no ha podido ser lamentablemente determinada. No obstante, la presencia abundante o casi exclusiva de polinizadores del género Usia (Bombyiilidae, Diptera), que ocurre preferentemente en especies distilas de la cuenca mediterránea hace sospechar de una cierta especialización en la construcción de la heterostilia en esta zona geográfica. La escasez de datos sobre polinizadores ha impedido analizar esta posible asociación positiva apropiadamente, como la hipótesis de

Lloyd & Webb (1992a) predice explícitamente. Mientras que la obtención de datos fiables de polinizadores en un número suficientemente alto de especies es muy tediosa y consume mucho tiempo, sí es posible examinar el papel de estos insectos, en comparación con otros, en la transferencia legítima de polen, como ya se está haciendo en la actualidad (Erika Olmedo, comunicación personal). Otras asociaciones secundarias sí han podido someterse a prueba.

Así, hay una cierta relación entre la presencia de heterostilia y el carácter perenne de las especies. Posiblemente esto sea una relación a través de una mayor probabilidad de autopolinización y autogamia en especies de vida corta, lo cual debe estar asociado negativamente con la heterostilia (Ganders, 1979).

Se ha encontrado además que la poliploidía no está asociada a la heterostilia, probablemente porque se trate de autopoliploidía, pues ya se ha visto que no tiene por qué implicar disolución del supergen que codifica el fenotipo típico de la heterostilia, al no haber hibridación (Naiki, 2012). Se desconoce el papel de

7 la hibridación en este sentido en Linum, aunque L. leonii es una especie híbrida

(Ockendon, 1968) que es homostila en un grupo que por lo demás es completamente heterostilo (L. perenne).

Implicaciones sistemáticas y biogeográficas

Aunque ya se habían realizado estudios filogenéticos de la familia

Linaceae y de Linum (McDill et al., 2009, 2010), el diferente objetivo (relaciones sistemáticas) y el foco secundario en la heterostilia (vs. homostilia, véase el uso diferente de este término en sistemática de plantas en el Capítulo 2), limitó el número de taxones incluido en esos estudios. En esta Tesis Doctoral se ha incluido la mayoría de las especies de la cuenca del Mediterráneo (74 spp.) y

Sudáfrica (14 spp.), aunque todavía hay zonas infrarrepresentas como por ejemplo Asia occidental y central, así como el continente americano (aunque en general presenta pocas especies). De esta forma se ha recogido una mayor variabilidad de condiciones estilares en zonas donde se presumía esta sería mayor, al tiempo que se ha podido comprobar si las relaciones filogenéticas son razonablemente congruentes con la sistemática disponible del género.

Nuestros análisis filogenéticos indican que Linum y dos de sus cinco secciones no son monofiléticas, sino parafiléticas (Fig. 1). La sección

Dasylinum aparece como monofilética, pero está encajada dentro de la sección

Linum, que por tanto es parafilética. Radiola se coloca entre los principales linajes de Linum, haciendo que el género sea parafilético tal y como hoy está reconocido. Las secciones Cathartolinum y Syllinum quedan encajadas dentro de la sección Linopsis, como los géneros Hesperolinon, Sclerolinon y Cliococca

(Sharsmith 1961; Rogers 1966, 1975), remarcando la parafilia de Linum. Es

8 necesaria por tanto una revisión exhaustiva de estos géneros para esclarecer las relaciones sistemáticas resultantes, lo que probablemente llevará a una redefinición de las categorías infragenéricas y de los géneros mencionados.

9

10 Fig. 1. Posición de las cinco secciones (según McDill et al., 2009) en la filogenia resultante del capítulo 3.

Sección Linum. La sección Linum comprende alrededor de 50 especies de las cuales 30, que en su conjunto cubren todo el rango geográfico de la sección (norte América, Eurasia y Australia), se incluyeron en este estudio. La sección Linum aparece como parafilética en relación con la sect. Dasylinum debido a la posición de L. stelleroides (sect. Linum), de Asia Central, que comparte un ancestro común a la sección Linum (CPL=información plastidial) y con la sección Dasylinum más los restantes miembros de la sección Linum (ITS e ITS+CPL). Las especies de la sección Linum se caracterizan porque tienen hojas lanceoladas sin glándulas estipulares y la mayoría de las especies tienen pétalos azules brillantes y las hojas no decurrentes. Dentro de la sección Linum

(excluyendo L. stelleroides), encontramos tres grupos bien apoyados estadísticamente en los tres análisis filogenéticos realizados: 1) el primer clado contiene el mayor número de especies. En CPL e ITS+CPL comparte un ancestro común con L. meletonis (Turquía), mientras que en ITS aparece L. pallescens (Rusia, China) con este papel. 2) Aparece un segundo clado formado por L. aroanium, L. bungei, L. tmoleum, L. nervosum y L. virgultorum.

Todas estas especies están en Anatolia. 3) El tercer grupo está formado por L. bienne, L. usitatissimum, L. villarianum, L. hologynum, L. marginale, L. narbonense, L. decumbens y L. grandiflorum. Los tres grupos son morfológicamente muy similares, pero pueden ser distinguidos unos de otros por la base de sus sépalos y estigmas. Los miembros del grupo de L. perenne tienen estigmas capitados y sépalos enteros con un margen liso. En el segundo clado la mayoría de sus miembros presentan estigmas clavados-filiformes y los

11 sépalos tienen glándulas en el margen. En el tercer clado los estigmas son lineales y los sépalos tienen márgenes ciliados.

Sección Dasylinum. Los análisis filogenéticos muestran que la sección

Dasylinum es un grupo monofilético bien apoyado, como ocurre en estudios anteriores (McDill et al., 2009). Este resultado tiene un buen soporte tanto morfológico (Davis, 1957, 1967) como estadístico (PP=1). Esta sección es uno de los grupos más fácilmente reconocibles dentro del género Linum, pues se distingue de otros por la presencia de indumento por toda la planta, con tricomas unicelulares. La mayoría de las especies de la sección son perennes y con tallos más o menos cilíndricos. Las hojas son espatuladas o lineales y normalmente presentan glándulas marginales. No presentan glándulas estipulares. Los sépalos generalmente presentan glándulas marginales y los estigmas son de lineares a clavados. La sección se distribuye por Europa meridional y oriental y suroeste de Asia.

Sección Linopsis. Esta sección aparece como polifilética en relación con la sección Syllinum y la monotípica sección Cathartolinum, y los géneros agregados del Nuevo Mundo (Hesperolinon, Sclerolinon y Cliococca). Dentro de la sección Linopsis, hay varios grupos bien apoyados en los análisis filogenéticos. Por un lado encontramos el grupo de L. maritimum, L. tenue (A y

B, de Marruecos), L. trigynum, L. corymbulosum, L. mumbyanum, L. numidicum y L. subasperifolium forman un clado bien apoyado en ITS, CPL e ITS+CPL.

Este grupo se caracteriza por presentar estigmas más o menos lineares. Este aparece como grupo hermano de la sección Syllinum, y comparten un ancestro común con L. catharticum (en ITS e ITS+CPL, en el caso de CPL no aparece resuelto). Observamos que L. tenue C (Argelia) aparece dentro de otro clado 12 de la misma sección, con lo que es posible que se trate de otro taxón. Se necesitan más estudios para asegurar tal posibilidad.

De hecho, como consecuencia de los muestreos de campo y de los análisis morfológicos y filogenéticos realizados en esta Tesis, se ha descrito una nueva especie, L. flos-carmini (Ruiz-Martín et al. 2015) en la sect. Linopsis, muy cercana a L. setaceum, pero que se diferencia por una diferencia biológica fundamental (el primero es heterostilo y el segundo homostilo, sin hercogamia).

Todo parece indicar que la región del clima mediterráneo del NW de África necesita de una mejor exploración, pues son más los casos que precisan ser estudiados con mayor detalle ya que aparentemente son pertinentes para evaluar cuestiones sobre la evolución del polimorfismo estilar, tal y como se aborda en la presente Tesis Doctoral. Un caso extraordinariamente interesante es el de L. grandiflorum. En concreto, se desconoce si es estable la condición de dimorfismo estilar de la especie, o la clase de incompatibilidad que muestra, pues todos los análisis publicados, incluyendo el de Darwin en 1877, se basan en material de jardinería. De igual manera, estudios futuros deberían evaluar la relación de L. grandiflorum con la especie monomórfica L. decumbens. A escala poblacional investigaciones futuras deberían abordar la exploración de

L. tenuifolium en Argelia, y si la especie aparece, hasta qué punto esta región representa una segunda zona de contacto con L. suffruticosum (véase Capítulo

4).

Entre los miembros del Viejo Mundo de la sect. Linopsis, surgen dos grupos hermanos de especies bien apoyados por los tres análisis, que comprenden por un lado a L. setaceum, L. flos-carminii, L. suffruticosum, L. tenuifolium, y por otro lado a L. volkensii, L. virgatum, L. corymbiferum, L.

13 strictum, L. gallicum, L. liburnicum y L. tenue C. Estas especies comparten estigmas capitados y células epidérmicas en forma de gancho en las hojas.

Por último, un cuarto grupo más numeroso también aparece separado del resto de los miembros de la sección. Este está formado por las especies de

Sudáfrica y del Nuevo Mundo y por los miembros de otros géneros de Linaceae del Nuevo Mundo. Este gran clado esta subdividido a su vez en dos grupos.

Por un lado, las catorce especies de Sudáfrica junto a Hesperolinon micranthum y Sclerolinon digynum, como grupo hermano aunque en este aspecto no hay un buen apoyo estadístico en ninguno de los análisis. Por otro lado, Cliococca selaginoides comparte un ancestro común con L. littorale, L. macraei, L. prostratum y L. oligophyllum todos presentes a Sudamérica; junto a otro pequeño grupo hermano formado por: L. kingii, L. rupestre, L. vernale y L. striatum, especies propias del centro y norte de América. Este último resultado aparece bien apoyado estadísticamente en el caso de ITS e ITS+CPL (en el caso de CPL no hay apoyo suficiente).

Sección Syllinum. Esta sección está confinada casi exclusivamente a la cuenca del Mediterráneo (Diedrichsen y Richards, 2003), contiene aproximadamente 22 taxones (Yilmaz, 2010) de los cuales 16 están incluidos en nuestros análisis. Forman un grupo monofilético bien apoyado, que además está apoyado por los datos morfológicos. La mayoría de las especies de esta sección presentan roseta basal, son perennes, glabras, con hojas mucho más grandes de las que encontramos en las especies restantes de los linos de flores amarillas (la mayoría de la sect. Syllinum). Presentan glándulas estipulares, aunque no en todos los casos. Las hojas son generalmente decurrentes, con los márgenes de las hojas y venación central formando alas

14 prominentes a lo largo de los tallos. El margen de los sépalos es ciliado y a veces cubierto de glándulas. Los pétalos, predominantemente amarillos, se fusionan después de la iniciación. Los estigmas son lineares y se estrechan hacia el estilo.

Sección Cathartolinum. La sección Cathartolinum es la única sección monotípica del género Linum. Linum catharticum se distingue de las otras secciones por su combinación de filotaxis decusada, pequeños pétalos blancos y ciclo de vida anual. En una circunscripción más amplia, fue reconocida por

Small (1907) como el género Cathartolinum Rchb., que incluía L. catharticum

(como Cathartolinum catharticum Small), L. digynum A. Gray (como C. digynum, para ser considerada más tarde como Sclerolinon), y todos los linos de flores amarillas de Norte América. Este género ampliado, Cathartolinum, fue aceptado en el rango de sección por autores posteriores, como Winkler (1931) y Diederichsen y Richards (2003), mientras que otros (en particular Rogers

(1982), en sus extensos trabajos en el género) consideran que la mayoría de las especies de Cathartolinum de Small, son miembros de Linum sección

Linopsis (= sect. Linastrum (Winkler, 1931)). La posición de L. catharticum no aparece resuelta en ninguno de los análisis, aunque en el caso del análisis combinado ITS+CPL, aparece con una PP= 0,78, compartiendo un ancestro común con la sección Syllinum y el clado de la sección Linopsis representado por L. maritimum. Sin embargo, no hay sinapomorfías morfológicas obvias que sean compartidas por L. catharticum y los miembros de las secciones Linopsis o Syllinum (McDill, 2009). Linum catharticum es una especie común y generalizada en Europa y Asia, e introducida en el este de Canadá y el noreste de EE.UU.

15 Géneros emparentados de Linaceae

Sclerolinon y Hesperolinon: En ambos géneros, el número de carpelos se reduce a tres (en la mayoría de especies pertenecientes a Hesperolinon) o dos (en dos especies de Hesperolinon y en Sclerolinon). Sclerolinon digynum tiene algunas características únicas, incluyendo un fruto bicarpelado que se divide en cuatro núculas con una semilla cada una (Rogers, 1966), lo que sirvió como base para su separación de Linum. Los dos géneros son miembros de un clado que incluye las especies americanas y sudafricanas de la sección

Linopsis. Estos géneros parecen estar más asociados con las especies de

Linum de Sudáfrica, lo que difiere de resultados de trabajos anteriores (McDill et al., 2009), pero las relaciones dentro de este clado no están bien apoyadas estadísticamente en nuestros análisis, y solo en el caso del análisis combinado

(ITS+CPL) se puede apoyar algo esta observación (PP=0.63). Por otro lado, las hojas opuestas o verticiladas también están presentes en varias especies de

Linum que se encuentran en el suroeste de los Estados Unidos, México y en una especie sudafricana (Rogers, 1984, 1981). Un estudio de los pigmentos florales también reveló algunas similitudes entre Hesperolinon y linos del

Suroeste de Estados Unidos (Rogers, 1975), incluyendo la presencia de solo un compuesto (apigenina- c glucósido) que no aparece en Linum. La presencia de pétalos con apéndices en garra, similares a los de Hesperolinon, también se encuentran en L. kingii y otras especies de Linum de América del Norte

(Sharsmith, 1961). Es evidente que la escasa concordancia entre la morfología que ha llevado a la separación de estos géneros necesita de una nueva aproximación que la haga más congruente con los resultados filogenéticos

16 obtenidos en esta Tesis Doctoral y en trabajos anteriores (McDill et al. 2009,

2010).

Cliococca: Este tercer género del Nuevo Mundo, como Sclerolinon, es un género monotípico descrito por su morfología única (Babington, 1842;

Rogers y Mildner, 1971). La separación se ha justificado por características tales como presentar cápsulas indehiscentes y sépalos que se extienden más allá de los pétalos. Desde los resultados filogenéticos encontramos que

Cliococca aparece, con un buen apoyo estadístico (PP=0.98), como hermana del clado que contiene las especies sudamericanas de Linum sección Linopsis

(L. littorale, L. macraei, L. prostratum, y L. oligophyllum), lo que difiere de trabajos anteriores, aunque solamente en el mayor apoyo estadístico.

Radiola: El género Radiola es monotípico, cuyo único representante es

R. linoides. Fue descrita originalmente como una especie perteneciente al género Linum por Linneo, pero se ha mantenido como un género separado, debido a varios caracteres distintivos que los aleja de la mayoría de linos del

Viejo Mundo: es una especie de plantas diminutas, anual y con las flores tetrámeras. Sin embargo, muchas especies de este linaje son también anuales, y existe por lo menos otra especie, L. keniense del Este de África (secc.

Linopsis), que también presenta flores tetrámeras, con lo que Radiola no parece demasiado apartado del rango de variación que se observa en sus parientes. Una revisión taxonómica conservadora podría devolver la especie separada a Linum, aunque haría falta un mayor esfuerzo en el muestreo, así como un mejor estudio de la morfología de todas las posibles especies implicadas.

17 Biogeografía

Aunque en esta Tesis no se ha realizado un análisis biogeográfico explícito, se han detectado algunos patrones que merecen ser explorados en el futuro, particularmente en lo que se refiere a la distribución del polimorfismo. La mayor diversidad de especies ocurre en la cuenca mediterránea, con un total de aproximadamente 74 especies de las aproximadamente 180 que tiene el género. Dentro de la cuenca, la mayor riqueza de especies ocurre en la península de Anatolia, mientras que la mayor diversidad de secciones y de clados coincide en toda la cuenca del Mediterráneo. No obstante, es conveniente explorar con mayor detalle las zonas limítrofes al este de la cuenca, en Asia occidental y central, donde aún se encuentra una alta diversidad (por ej., en el Cáucaso hay 44 especies (Yuzepchuk, 1974), o en

China, donde se han reportado 9 especies, algunas de ellas heterostilas (L. perenne y L. heterosepalum) (Liu y Zhou, 2008)). Fuera de la cuenca mediterránea hay menos especies, menos secciones (normalmente una) y menos clados monofiléticos (McDill et al., 2009). Aunque es probable que un estudio detallado revele más taxones en determinadas áreas de la cuenca

(como en el NW de África, véase más arriba) es poco probable que los patrones de diversidad cambien mucho.

Sin duda, el aspecto biogeográfico más notable en lo que se refiere a evolución del polimorfismo estilar concierne a su aparición independiente en la cuenca mediterránea y en Sudáfrica, especialmente en la región de clima mediterráneo y submediterráneo de El Cabo. Incluso sin un análisis biogeográfico explícito queda patente que el grupo monofilético hoy presente en el extremo sur del continente africano está más relacionado con los grupos

18 hoy presentes en América, en donde hasta el presente no se ha descrito ninguna especie heterostila. Es más, sólo dos de las 14 especies sudafricanas han sido reportadas, y aquí confirmadas, como heterostilas (Rogers, 1981), por lo que incluso allí, al igual que parece ocurrir con las especies heterostilas de la cuenca mediterránea, la aparición de este polimorfismo ha ocurrido más de una vez. El reciente desciframiento de los mecanismos genéticos y de transcripción de la heterostilia en Primula (Li et al., 2016; Huu et al., 2016) tal vez ofrezca una vía explicativa de por qué este polimorfismo es tan dinámico evolutivamente en lo que se refiere a su aparición, pero no en su pérdida, que normalmente ocurre casi invariablemente hacia la disolución del supergen responsable, provocando homostilia y autocompatibilidad (Lewis y Jones,

1992). En cuanto a los agentes ecológicos responsables de la selección del polimorfismo (polinizadores), queda mucho trabajo por realizar en estas dos regiones para comprobar si son suficientemente similares en su acción como para provocar presiones selectivas similares sobre maquinarias génicas equivalentes o no, condición necesaria para determinar si es un caso de convergencia evolutiva. En cualquier caso, lo que sí es abordable a corto plazo es la realización de un análisis biogeográfico explícito, basado en predicciones concretas de migración y vicarianza sobre un escenario paleogeográfico ajustado a los tiempos de divergencia estimados (cf. Santos-Gally y Arroyo,

2012).

Nivel microevolutivo

En esta Tesis Doctoral se ha elegido el grupo de Linum tenuifolium s.l. como caso de estudio para una aproximación microevolutiva al origen y

19 mantenimiento de la heterostilia. Ello fue debido a estudios previos (Rogers,

1979; Nicholls, 1985, 1986), que habían puesto de manifiesto la variabilidad en polimorfismo estilar y caracteres relacionados, aunque estos estudios no habían usado una aproximación evolutiva explícita (filogenética y filogeográfica) y sus limitados resultados (en parte debidos al muestreo limitado) aun han generado controversia sobre cómo categorizar las especies (e.g., McDill et al.

2009). Más aún, recientemente, Armbruster et al. (2006) habían descubierto un caso especial de distilia, en tres dimensiones diferentes (3-D), único entre los hasta entonces reportados, en poblaciones meridionales de una de las especies del grupo (L. suffruticosum). Todo ello llevó a realizar un muestreo exhaustivo del grupo completo en toda su área de distribución para reconstruir las relaciones filogenéticas y filogeográficas entre los linajes y poblaciones considerados en este grupo, así como para determinar con precisión el tipo de polimorfismo presente. Se pudo comprobar que L. tenuifolium s. str. es siempre monomórfico, pero no exactamente homostilo, pues presenta una clara hercogamia de un tipo raro pero no exclusivo de la especie: en el plano horizontal de forma que los estigmas están en una posición mucho más externa que los estambres en la flor. Por el contrario, L. suffruticosum s.l, (incluyendo todos los taxones intraespecificos considerados en él) presenta siempre distilia

3-D, con variaciones pequeñas entre poblaciones, que se refieren solo al nivel de reciprocidad, especialmente difícil de medir en esta especie (Fig. 2).

20

Fig. 2. A) Flores de Linum suffruticosum. Nótese la posición reciproca de anteras y estigmas en los dos morfos presentes en cada población en una proporción 1:1. (En tres dimensiones: arriba y abajo, centro y periferia, y anteras y estigmas en posición reciproca; reciprocidad 3-D: Armbruster et al. 2006). Los morfos “L” y “B” aparecen sin los pétalos. B)

Vista horizontal sin pétalos de Linum tenuifolium s.str. El monomorfismo con hercogamia horizontal con respecto a la posición de los verticilos sexuales, está presente a lo largo de toda su distribución.

Ni la filogenia ni la filogeografía han podido hasta ahora resolver la cuestión sobre qué condición estilar es ancestral en este grupo, pues la resolución ha sido pobre. Esto se debe probablemente en gran medida a lo reciente del proceso de diferenciación (pleistocénico, véase Capítulo 4, téngase en cuenta la escasez o nula presencia de estas plantas en las islas mediterráneas, a pesar de su carácter pionero y la abundancia de suelos derivados de calizas donde prosperan, por lo que puede pensarse en falta de tiempo para su colonización), a la probable hibridación entre ambas especies en el pasado reciente y en la actualidad (Nicholls, 1985, Capítulo 4), y al hecho de que L. suffruticosum presenta niveles de ploidía desde diploide hasta

21 decaploide (Nicholls, 1986; Ana Afonso, comunicación personal). En la zona supuestamente híbrida, desde los Pirineos Orientales hasta los Alpes

Marítimos, se observan con cierta frecuencia poblaciones mixtas, con ambas especies, y presencia variable de individuos de aparente constitución híbrida por su morfología. Estudios en curso (Erika Olmedo y Ana Afonso, comunicación personal) determinarán qué nivel de hibridación y aislamiento entre citotipos y especies existe realmente, que favorezca o impida el flujo génico y por tanto el mantenimiento del polimorfismo, pero todo parece indicar al menos una esperable falta de resolución filogenética/filogeográfica. No obstante, se plantea que el polimorfismo 3-D debe ser muy estable y eficaz en la transferencia de polen entre morfos, pues no parece perderse evolutivamente una vez adquirido. Más aún, su aparición es probablemente una de las mejores pruebas a favor de la hipótesis de Lloyd y Webb (1992b), en este caso sobre la mejora del funcionamiento del polimorfismo, pues si la especie es incompatible heteromórfica (como la mayoría de los linos heterostilos; Nicholls, 1985, Capítulo 4). En concreto, la separación de órganos sexuales en tres dimensiones permite que, a diferencia de las especies con distilia convencional, el polen de los dos morfos florales se puede colocar en partes distintas del cuerpo de los polinizadores (Armbruster et al., 2006), siendo esto una de las premisas del modelo de Lloyd y Webb (1992 a) para el funcionamiento de la heterostilia, que escasamente se reporta (pero véase

Masinga et al., 2005). Consecuentemente, esta variación sutil permite no solo mejorar la transferencia legitima de polen (el sistema de incompatibilidad heteromórfico en L. suffruticosum no permite la formación de semilla tras la transferencia ilegitima de polen) sino que evitar la autointerferencia.

22 A pesar que la morfología en tres dimensiones probablemente mejora la transferencia de polen legitima, queda aún por resolver cual el agente selectivo asociado a la heterostilia en 3-D. Armbruster et al. (2006) sugirieron que debían ser moscas del género Usia (Bombyilidae, Diptera). Nuestras observaciones y estudios en curso parecen corroborar la asociación entre estos insectos y distintas especies de Linum heterostilos (véase también Johnson y Dafni, 1998, para L. pubescens, distilo convencional; Capítulo 2). Ya se mencionó la estrecha correspondencia entre la diversidad de especies de Usia (género típicamente Mediterráneo) y de Linum (Capítulo 3), pero se necesitan más estudios experimentales sobre la eficacia de estos insectos. Si tal asociación es fuerte e implica no solamente el mantenimiento (y tal vez la aparición) de la heterostilia en Linum, sino la mejora de su funcionamiento, representaría un caso de coadaptación, raramente reportados en la polinización de la flora mediterránea (como entre Chamaerops y el gorgojo Derelomus chamaeropsis, o entre Ophrys y varios géneros de abejas solitarias; Schiestl y Cozzolino,

2008; Jácome‐Flores et al., 2016).

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31 Conclusiones Generales

1. En este estudio se reportan un total de nueve tipos morfológicos florales según la disposición de los verticilos sexuales, dentro del género

Linum, con o sin polimorfismo estilar, que se mantienen en las poblaciones y a nivel de especie en toda su distribución. Tres de ellos son nuevos para el género (hercogamia reversa, trimorfismo y dimorfismo con dos alturas de estambres).

Es la primera vez que se hace una caracterización de la variación

floral precisa en el género Linum a la luz de los recientes estudios

evolutivos en los que se proponen las situaciones fenotípicas

transitorias. Por lo tanto, el género Linum es un magnifico grupo para

testar predicciones implicadas en la evolución de los polimorfismos

estilares.

2. Las relaciones filogenéticas han sido razonablemente bien resueltas y, por lo tanto, pueden usarse para probar las hipótesis evolutivas sobre las transiciones en las condiciones estilares en Linum. Existe una buena concordancia con resultados anteriores (McDill et al., 2009:

Systematic Botany, 34(2), 386-405, y 2010: Botanical Journal of the Linnean

Society, 165(1), 64-83). Nuestros análisis filogenéticos indican que Linum y dos de sus cinco secciones son parafiléticas. La sección Dasylinum aparece como monofilética, pero está encajada dentro de la sección Linum, que por tanto es parafilética. Radiola se coloca entre los principales linajes de

Linum, haciendo que el género sea parafilético tal y como hoy está reconocido. Las secciones Cathartolinum y Syllinum quedan encajadas dentro de la sección Linopsis, como los géneros Hesperolinon, Sclerolinon y

Cliococca, remarcando la parafilia de Linum. Por tanto, es necesaria una revisión de estos géneros para esclarecer las relaciones filogenéticas sistemáticas resultantes, lo que probablemente llevará a una redefinición de las categorías infragenéricas y de los géneros mencionados.

3. Los polimorfismos estilares en Linum parecen estar ligados a zonas de clima mediterráneo del Viejo Mundo (cuenca mediterránea, región de El Cabo) y probablemente a los polinizadores que ahí viven.

4. La heterostilia tiene un origen polifilético en Linum, es un polimorfismo sexual muy lábil, que se gana o se pierde con facilidad y en periodos de tiempo relativamente cortos. La pérdida del polimorfismo no es una vuelta a las condiciones ancestrales, sino a una condición homostila y aparentemente autocompatible, probablemente ligada al seguro reproductivo.

5. Existe una correlación evolutiva positiva entre el polimorfismo estilar y el ciclo de vida perenne en Linum, pero no existe tal correlación con la poliploidía.

6. La evolución de la heterostilia en Linum respalda en algunos grupos infragenéricos la hipótesis de Lloyd y Webb (1992a), en la que el estadio inicial es la hercogamia de aproximación. Otros supuestos de esta hipótesis no han podido ser probados, así como tampoco si la condición ancestral en el género es la hercogamia de aproximación.

7. La heterostilia tridimensional está presente en todas las poblaciones de L. suffruticosum con alguna variación en la hercogamia y grado de torsión de los verticilos sexuales. La presencia del polimorfismo floral en esta especie a lo largo de toda su distribución, incluso en la zona de contacto con L. tenuifolium s. str., sugiere una gran estabilidad evolutiva para este carácter en esta especie.

8. Linum tenuifolium aggr. es un grupo monofiletico bien apoyado estadísticamente, pero con una escasa estructura filogenética y filogeográfica interna, en especial cuando se infiere a partir de las secuencias nucleares (ITS). Los dos taxones (L. tenuifolium s.l. y L. suffruticosum s. str.) del grupo se entremezclan en las topologías resultantes, lo cual tiene que ver con posibles eventos de hibridación entre ambos, sobre todo en la zona de contacto, y con una expansión rápida y reciente en el Mediterráneo que haya provocado una segregación incompleta de los linajes moleculares.

9. Después de varias extensas campañas de campo a través del norte de África, podemos concluir que esta región todavía está escasamente explorada y alberga especies que todavía no están caracterizadas. Se recomienda una revisión del género, con énfasis en la sección Linopsis (linos de flor amarilla), que en esta región incluye una gran variación fenotípica.

10. La exploración realizada en el N. de África ha permitido describir una nueva especie (L. flos-carmini, separado de L. setaceum), basada en diferencias cualitativas y cuantitativas en el margen de los sépalos, el color de los pétalos y, lo que es más importante, la posición de las anteras y estigmas en situación de hetersotilia (a diferencia de los parientes homostilos), además de las diferencias en la distribución.

Agradecimientos

En primer lugar dar las gracias a Juan Arroyo por darme la oportunidad de realizar esta tesis doctoral. Le agradezco la formación que me ha brindado, su ayuda en la organización de los trabajos de campo, colección de algunos ejemplares, y su paciencia con las correcciones de mis trabajos escritos, al igual que a Rocío Pérez-Barrales.

Quiero dar las gracias encarecidamente a todas las personas y amigos que me han ayudado en los extensos trabajos de campo, pero sobre todo a

Manuel Benavent Burger, nunca se me olvidará como encontramos la especie nueva en Marruecos, y a Patricio Peñalvert Duque por los trabajos alrededor de

Turquía, Grecia, Italia, Francia y España, toda una aventura donde nos ha pasado de todo… ambos desarrollaron la increíble capacidad de ver los linos por las cunetas desde el coche alquilado. A Rocío Pérez-Barrales, David

Windich y Pablo Pinedo, por su inestimable ayuda en los tres trabajos de campo por la Región del cabo en Sudáfrica; pasar las navidades en verano recogiendo linos por lugares desconocidos en aquellas latitudes, con David, fue una experiencia increíble. Recuerdo que pasamos el fin de año en el parque

Kruger bebiendo cerveza con un keniano, un inglés, un australiano, David

(austriaco) y yo, de Sevilla, como un chiste…

A Alejandro Pérez-Bueno y Samuel Moreno por su ayuda alrededor de los Alpes, campaña bastante infructuosa por causas de la nieve acumulada en junio en ese año en la zona. Nunca se me olvidará cruzar el “paso de

Karatrass” sin cadenas patinando con el coche… A Celia M. Rodriguez-Dominguez por los trabajos de campo por los

Alpes marítimos franceses y los pirineos junto a Manuel Benavent; me encantaban esas cenas a base de queso y vino por aquellos maravillosos pueblos pedregosos. A Rafael Molina por su ayuda en el segundo trabajo de campo por Marruecos, en el que calló enfermo con una amigdalitis tremenda y con el que por poco nos salimos de la carretera porque se quedó dormido de la fiebre que tenía mientras él conducía; recuerdo que nos metimos por carreteras infames con un “205” hasta lugares en los que se vivía casi como en la edad media, y donde nos perdimos sin saber si llegaríamos a algún lugar antes de que nos pillara la noche.

A Virginia Tellado por su inestimable ayuda realizando los cruzamientos en las tres poblaciones naturales de L. suffruticosum por la Península Ibérica.

Un auténtico” trabajo de chinos” debido a la gran habilidad que hay que tener para emascular anteras, polinizar estigmas, embolsar flores, y recoger insectos en el campo.

Todas estas aventuras, y más que no puedo describir por la ilegalidad de los hechos, y porque esto se extendería más de la cuenta, es lo que más voy a echar de menos de esta larga travesía.

A Ross Turner, Juanjo Aldasoro, Juan Manuel Martinez-Labarga, José

Antonio Mejías y Yanis Bouchenak-Khelladi por su ayuda en la recolección de algunos taxones en el campo, y sobre todo a este último por los consejos con los análisis filogenéticos. A Ana M. Gómez Zanoletty por su inestimable ayuda con las mediciones florales en el laboratorio. A los herbarios de Sevilla, Madrid, Montpellier, Florencia, Edimburgo,

Ciudad del Cabo (Kirstenbosch y Bolus Herbarium), Estambul y Atenas entre otros, y a sus conservadores, los cuales siempre me han ayudado en todo lo necesario.

A los miembros del departamento de botánica de la Universidad de Cape

Town por su amabilidad y por hacerme sentir como en casa en un lugar tan remoto para mí en aquellos tiempos. Me encantaba ver como todo el departamento sin excepción, se reunía para tomar el té de las 11 mientras planeaban donde sería la siguiente reunión lúdica, y en casa de quien. Se respiraba un ambiente de cooperación fantástico que nunca he sentido en ningún otro lugar. Y a Francesca Stomeo, mi gran amiga, que me acogió en el primer viaje a Ciudad del Cabo, en su casa de “OBZ”, siempre te estaré agradecido y jamás te volveré a esconder tu moka por la mañana…

A mis compañeras de departamento Violeta Simón Porcar, Rafael Molina

Benegas, Rocío Santos Gally y a las nuevas “chicas lino”, Erika Olmedo y Ana

Afonso a las que les deseo muchísima suerte y ánimo para seguir en esta línea de investigación tan interesante. A Vania Jiménez y a Estefanía Martínez les deseo mucha suerte para que sus futuros inmediatos sean lo más extraordinario y fructíferos posible. Y como no a Alejandra de Castro, por su ayuda con papeleos de todo tipo, y con los cruzamientos realizados en la escuela de jardinería Romero- Murube ubicada en Sevilla.

A Salvador Talavera por creer en mi especie nueva tanto como yo, y convencerme de que no la describiésemos como subespecie (como me decían todos), gracias por tus animos. Con respecto a los análisis agradecer la paciencia conmigo de los

“chicos de Pablo Vargas” en mis estancias en el Real Jardín Botanico de

Madrid. Sobre todo a Mario Fernández Mazuecos y José Luis Blanco Pastor por enseñarme a usar esos “programas infernales” que utilizamos para inferir relaciones filogenéticas y biogeográficas entre las especies, y también con respecto a la estadística profunda, tema engorroso y a veces difícil de entender para un “biólogo de botas” como yo. Y a Emilo Cano, gran técnico de laboratorio, que me ha visto en modo desesperación total cuando no salían las extracciones o las PCR´s, y que gracias a él, el laboratorio ha sido mucho más ameno y divertido dentro de lo que cabe.

Con respecto a los análisis, también quiero agradecer a Yanis

Bouchenak, Francisco Balao, Rafael Albaladejo, Marcial Escudero y Rocío

Santos-Gally su ayuda con la reconstrucción de caracteres ancestrales, modelos mixtos y filogenéticos, y análisis biogeográficos.

A mi tío Mariano Martín Cacao y a la escuela de jardinería Joaquín

Romero Murube ubicada en el parque de María Luisa en Sevilla, por intentar sacar adelante todos los linos que les llevaba, tanto en forma de semilla como de cepellón arrancado del campo, y por darme permiso para realizar los cruzamientos controlados en una población grande de L. grandiflorum ornamental sembrada por él. Y por haberme metido el gusanillo del amor por la naturaleza desde muy pequeño. Mariano es un gran naturalista y un gran divulgador del que he aprendido muchas cosas. Dar por supuesto también las gracias a la música que ha hecho que no pierda la cordura. Por ello agradecer a mis grupos y amigos del mundo de la música por estar siempre ahí.

Y como no a mis amigos más cercanos, muchos de los cuales tuve la suerte de que me acompañaran en el campo como Virginia, Manu, Patricio,

Dani, Samu y Ale, antes mencionados, y que de una forma totalmente altruista han querido ser partícipes de mis investigaciones. A mi amigo Santiago

Castroviejo Fisher por invitarme a algún que otro trabajo de campo por el trópico colectando anfibios y reptiles, muy importante para despejarme y volver con fuerzas renovadas, gracias por haberme dado la oportunidad de conocer gente maravillosa y ver lugares increíbles.

Por último agradecer a mi hermano, a mi padre (que descansa en paz), y a mi madre, a la que le dedico la especie nueva por haberme dado la oportunidad de haber estudiado una carrera cuando yo era un auténtico desastre y estaba todavía más perdido que ahora. A mi tía Mariascen (que descansa en paz), a la que no le dio tiempo de verme como doctor pero que estoy seguro le hubiera hecho mucha ilusión, gracias por creer en mí. Y a mi pareja por aguantarme en los momentos más duros y darme los ánimos que encarecidamente necesita un doctorando.

Seguro que se me olvidan muchas personas por agradecer, pero que le vamos a hacer... esto ha sido todo. Gracias y salud!