Isabela Maciel Monteiro Carneiro Biologia, História Natural E Efeitos De Tamanho De Grupo No Desenvolvimento De Halysidota Pear

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE BIOMAS TROPICAIS

Isabela Maciel Monteiro Carneiro

Biologia, história natural e efeitos de tamanho de grupo no desenvolvimento de Halysidota pearsoni (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae)

Ouro preto 2020

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE BIOMAS TROPICAIS

Isabela Maciel Monteiro Carneiro

Biologia, história natural e efeitos de tamanho de grupo sobre o desenvolvimento de Halysidota pearsoni (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais da Universidade Federal de Ouro

Preto, como requisito para obtenção do título de Mestre

Orientadora: Dra. Marina do Vale Beirão Co-orientadora: Dra. Laura Braga

Ouro preto 2020 2

SISBIN - SISTEMA DE BIBLIOTECAS E INFORMAÇÃO

C289b Carneiro, Isabela Maciel Monteiro . CarBiologia, história natural e efeitos de tamanho de grupo no desenvolvimento de H. pearsoni (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae). [manuscrito] / Isabela Maciel Monteiro Carneiro. - 2019. Car59 f.: il.: color., gráf., tab..

CarOrientadora: Profa. Dra. Marina do Vale Beirão. CarCoorientadora: Dra. Laura Braga. CarDissertação (Mestrado Acadêmico). Universidade Federal de Ouro Preto. Departamento de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente. Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais. CarÁrea de Concentração: Evolução e Funcionamento de Ecossistemas.

Car1. Lepidóptero . 2. Insetos - Populações. 3. História natural. I. Beirão, Marina do Vale. II. Braga, Laura. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.

CDU 591.5

Bibliotecário(a) Responsável: Celina Brasil Luiz - CRB6 - 1589

Sumário Agradecimentos ...... 5

Introdução geral ...... 7

Referências ...... 10

Capítulo 1 ...... 14

Introduction ...... 15

Materials and methods ...... 16

Results ...... 17

Stages ...... 17

Natural enemies ...... 24

Discussion and conclusion ...... 25

Acknowledgments ...... 28

References ...... 28

Capítulo 2 ...... 35

Introdução ...... 35

Material e Métodos ...... 36

Espécie estudada ...... 36

Experimento e levantamento de dados ...... 37

Análises estatísticas ...... 38

Resultados ...... 39

Cápsulas cefálicas ...... 40

Tempo de instar entre gerações e tratamentos ...... 43

Tempos dos estágios ...... 45

Pupas ...... 47

Adultos ...... 48

Mortalidade e número ideal ...... 48

Discussão ...... 52

Agradecimentos ...... 55

Referências ...... 56

Agradecimentos Primeiramente dedico este trabalho à minha filha Catarina Monteiro Carneiro Ruiz, que sempre foi e sempre será meu motivo de vida. Dedico a ela a força de vontade, a perseverança, o esforço e os méritos de realizar um sonho e que sirva de exemplo para ela continuar seguindo seus caminhos e não esmorecer nunca!

Agradeço primeiramente aos meus pais e meu irmão, que me ajudaram como puderam nessa trajetória acadêmica e agora podem colher os frutos do meu trabalho, que com tanta dedicação foi realizado. Agradeço também os momentos de distração e risadas proporcionadas com tanto carinho e que serviram para tirar um pouco da tensão resultante da vida de pesquisador. Agradeço ao apoio e por acreditarem em mim, embora a questão “porque mesmo você está fazendo isso? ” estivesse sempre presente nos papos... Mas pra mim sempre foi e ainda é gratificante explicar para vocês as descobertas que meu trabalho me proporcionou. Rodolfo, além do meu trabalho, vai me ouvir explicar tudo sobre biologia.

Agradeço também a Professora Doutora Yasmini Antonini por me apoiar, incentivar (quando digo incentivar, é fazer a gente sofrer para aprender... brincadeira!), além de conselhos fundamentais para meu desenvolvimento enquanto profissional, e principalmente, por ceder o Laboratório de Biodiversidade para a realização deste trabalho tão trabalhoso! Agradeço também a Universidade Federal de Ouro Preto pelo incentivo e apoio financeiro que foi fundamental para o desenvolvimento dessa dissertação.

Agradeço aos amigos do “Credo, que delícia!”, Cecília, Vanessa’s, Paula, Natasha, Eloá, Hernani que foram colegas de trabalho e de lazer. Momentos prazerosos que faziam nos esquecer das qualificações e as vezes dos nossos trabalhos! Um imenso prazer trabalhar com cada um de vocês!

Esse parágrafo é dedicado aos amigos Francielle e Richard (se esse parágrafo faltasse, eu certamente não estaria aqui terminando minha dissertação..). Agradeço pela amizade sincera e literalmente para todos os momentos. Desde momentos acadêmicos a momentos pessoais, vocês nunca

deixaram (e ainda não deixam) a gente esmorecer. Posso falar que é “tri- recíproco” porque se vocês vierem com drama, já sabem... Já estou esperando a dissertação de vocês e se não tiver um parágrafo pra mim, não vou falar nada com vocês, nada!

Agradeço a Professora Maíra Morais, que foi minha orientadora de TCC e que acompanhou literalmente desde o início minhas observações ecológicas e me ouviu quando essa ideia surgiu lá no quinto período da graduação. Embora não tenha sido possível terminar o trabalho na faculdade, fico extremamente satisfeita e realizada de desenvolver uma ideia puramente minha e que deu certo! Obrigada por tudo que me ensinou. Sem você, meus conhecimentos em ecologia e estatística seriam mínimos quando eu entrei para o mestrado.

A minha orientadora Marina Beirão, eu nem tenho palavras para descrever como foi ser sua orientanda. A liberdade de poder escolher o que fazer ou não no meu trabalho, os conselhos do que seria melhor, além de todo o conhecimento de R que eu aprendi. Foi para mim uma fase maravilhosa poder contar com você, e além da academia também foi parceira. Sou imensamente grata por ter te conhecido! A minha co-orientadora Laura Braga, eu jamais imaginaria que naquele primeiro curso de introdução a lepidóptera que eu te conheci, você se tornaria minha co. E pensar que pedi para autografar meu livro “Lagartas do Cerrado”! Foi um prazer te conhecer e aprender sobre “nossas meninas”. E vi também que gostei mais de trabalhar com elas do que com os adultos! Obrigada por tudo que me ensinou!

Aos professores do Uni BH, em especial Bruno Kraemer, que sempre acreditou em mim e em meu potencial, que me ajudou quando fui fazer o curso de verão de entomologia na USP, e que sempre me ensinou as melhores coisas da biologia. Aos colegas de trabalho, Filipe Gudin e Thalles Platiny, pela parceria nos trabalhos e identificação dos parasitoides. Quem diria que eu teria duas surpresas em laboratório?! Cenas dos próximos capítulos.... Agradeço a Capes pelo financiamento dessa pesquisa. Sem isso, nós pesquisadores jamais conseguiríamos realizar pesquisas nas mais diversas áreas de conhecimento. Pesquisas essas de tamanha importância para o desenvolvimento ambiental, econômico e sociocultural do país. Sem pesquisas, o Brasil não avança!

Introdução geral O nome Lepidoptera deriva do grego lepis que significa escamas, e pteron que significa asa, ou seja, asas cobertas por escamas. A ordem Lepidoptera possui uma diversidade muito acima do que está descrito. Estima-se em torno de 500 mil espécies em todo o mundo, e essa discrepância demonstra como pouco conhecidas são as borboletas e mariposas (Rafael et al., 2012). Algumas espécies de borboletas são tidas como espécies bandeiras, por serem coloridas, grandes e em sua maioria, de fácil visualização, o que as torna um grupo interessante para estudos de conservação e monitoramento ambiental (Freitas et al., 2006).

Mesmo com sua grande importância nestes estudos, as borboletas são mais difíceis de coletar, além de serem pouco representadas em determinados tipos florestais (Kitching et al, 2000). Em contrapartida, as mariposas são muito mais numerosas e fáceis de amostrar, sendo muito mais conhecidas taxonomicamente, facilitando estudos sobre impactos, diversidade, e até mesmo sobre a qualidade da vegetação em qualquer localidade (Kitching et al., 2000).

Tanto borboletas quanto mariposas também possuem características essenciais como bioindicadores, entre estas podemos citar a associação entre as espécies e sua planta hospedeira, os fatores físicos específicos (Brown e Freitas, 2000), além de rápidas respostas a alterações ambientais, redução ou perda de habitat, fragmentação e outros tipos de distúrbios (Freitas, 2010).

Em geral, os lepidópteros apresentam ciclos curtos e complexos e por isso são amplamente utilizados para diagnósticos rápidos, estudos de comparação e em relatórios ambientais (Freitas, 2010). Espécies que são consideradas pragas em áreas de cultivo costumam ser mais estudadas devido a prejuízos econômicos tais como como Spodoptera frugiperda Smith, 1797, conhecida popularmente como lagarta-do-cartucho é considerada uma das principais pragas de cultura de milho nas Américas e possui sua biologia bem estudada por diversos pesquisadores (Cruz e Turpin, 1982).

Lagartas são em sua maioria herbívoras, e desempenham papel importante na manutenção das interações e na coevolução entre insetos e

plantas. Além disso, compreendem um dos grupos mais importantes de herbívoros das regiões tropicais, apesar de ainda serem pouco estudadas nestas regiões. (Benson et al., 1975; Bendicho-Lopez et al., 2006; Freitas e Marini-Filho, 2011).

Algumas espécies de Lepidoptera são consideradas pragas em áreas de cultivo durante sua fase larval, e outras possuem importância médica, porém muito pouco se sabe sobre a história natural e suas relações ecológicas das espécies que não são de interesse econômico e suas interações com as plantas hospedeiras em seus ambientes naturais (Cardoso e Haddad, 2005; Nava e Parra, 2005; Siewert e Silva, 2012). Além disso, estudos com estágios imaturos, em sua maioria são realizados em espécies de maior tamanho, como Saturniidae e Sphingiidae, e sua interação com a planta hospedeira (Morais et al., 2005), espécies que possuem interações com formigas (mirmecofilia) (Kaminski et al., 2009) e estudos sobre morfologia e/ou quetotaxia de imaturos (Freitas e Oliveira, 1992; Garcia-Barros, 2000; Paim et al., 2004; Diniz et al., 2007).

Espécies de Lepidoptera apresentam variados tipos de estratégias em sua fase larval (Silva-Brandão et al., 2005), seja para defesa, procura de recursos, entre outros, como, por defesa, o aposematismo observado em Chlamydastis smodicopa (Morais et al., 2005) e o gregarismo em Ascia monuste (Figueiredo e Zucoloto, 2016). O gregarismo é um hábito evolutivo que beneficiou a sobrevivência de inúmeras espécies de Lepidoptera. Em lagartas impalatáveis, o gregarismo resulta em um grande grupo, inibindo assim possíveis predadores (Stamp e Bowers, 1988). Além disso, outros benefícios do gregarismo foram retratados como termorregulação, localização simultânea de recurso e comportamentos sincronizados contra predadores (Allen, 2010).

A definição de gregarismo para Lepidoptera nos estágios imaturos abrange aquelas espécies que se mantém gregárias desde o ovo até a emergência dos adultos, e também espécies que são solitárias apenas nos instares finais, como Malacosoma spp., e exclui aquelas espécies que tem ovos gregários, mas que se dispersam logo após o nascimento para alimentação, por exemplo Lymantria dispar (Hunter, 2000). Nas fases adultas, por exemplo as espécies Actinote surima e Epityches eupompe, possuem o hábito de formar 8

“poleiros gregários” para repouso, seja durante a noite ou durante as horas mais frias do dia no inverno (Paluch et al., 2005; Shirai, at al., 2017).

Em outros grupos taxonômicos, o gregarismo também é estudado, como no caso do trabalho realizado com carrapatos Haemaphysalis leporispalustris. Os autores observaram que o ritmo de ecdise dos carrapatos foi maior quando se aumentou a agregação, sugerindo que grupos com maior número de indivíduos favorecem a alimentação e diminuem a resposta imunológica do hospedeiro, demonstrando uma relação positiva entre o tamanho de grupo e o desenvolvimento (Cançado et al., 2007). Tanto em baratas da espécie Blatella germanica quanto em formigas do gênero Oecophylla, foi demonstrado que o hábito gregário beneficia o mecanismo de comunicação através de feromônios, fazendo, assim, com que as decisões sejam tomadas em grupo, quer seja para se agruparem ou para se separarem, na procura de alimento, presença de predadores ou para se recolherem para descanso (Deneubourg et al., 2002).

Definindo o conceito de estudos de biologia e história natural, podemos inferir que tais estudos demonstram aspectos biológicos da espécie, promovendo o entendimento das funções e relações ecológicas da espécie com o ambiente e outros organismos (Ferraro, 2010). Tais estudos são de extrema importância nos estágios iniciais de desenvolvimento pois contribuem com informações para taxonomia completa das espécies holometábolas e para a sistemática (Braby e Nishida, 2010; Braga et al, 2014; Moraes et al., 2010).

Além disso, poucos são os estudos que demonstram as vantagens e desvantagens do gregarismo em relação ao desenvolvimento dos organismos em diferentes tamanhos de grupos (Krebs, 1996). Dessa forma, torna-se relevante o conhecimento sobre os estágios imaturos das espécies de Lepidoptera, uma vez que parte dos estudos com lagartas não descrevem seu desenvolvimento, focando apenas em suas interações com suas plantas hospedeiras, sendo insuficientes as informações sobre seus estágios imaturos.

Este trabalho conta com dois capítulos, sendo o primeiro sobre a biologia e história natural de Halysidota pearsoni Watson, 1980 (Lepidoptera: Arctiinae) e o segundo sobre os efeitos dos tamanhos de grupo sobre o desenvolvimento 9

dessa espécie em duas gerações. O primeiro capítulo teve o objetivo de conhecer e descrever todos os estágios da espécie, assim como seu tempo de desenvolvimento, repetido em duas gerações em períodos sazonais distintos (verão e inverno). O segundo capítulo priorizou a análise do desenvolvimento da espécie em função do tamanho do grupo, tendo como variáveis respostas parâmetros morfológicos e temporais. Neste capítulo, lagartas de H. pearsoni foram separadas em 5 tamanhos diferentes de grupos. O primeiro capítulo foi realizado com os dados dos grupos considerados “controle” (posturas com quantidade inalterada de ovos que a fêmea colocou) entre todos os tratamentos realizados no experimento total.

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Capítulo 1 Esse capítulo foi submetido a revista “Journal Of Natural History”

A necessary "pause": differences between Halysidota pearsoni (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae) generations Carneiro, Isabela¹; Braga, Laura¹; Beirão, Marina do Vale¹

¹Laboratório de Biodiversidade – Universidade Federal de Ouro Preto.

Departamento de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente da Universidade Federal de Ouro Preto, ICEB III, Campus Morro do Cruzeiro, Bauxita, Ouro Preto - MG, 35400-000. [email protected]

Abstract. The species Halysidota pearsoni Hubner, belongs to the family Erebidae and its caterpillars are medium to small sized, with black bristles and tufts of white bristles on the pronotal region. This study aimed to describe the lifecycle of the species from two generations reared in the laboratory, one generation (F1) during the warmest time of the year (summer) and the second (F2) in the coldest (autumn/winter). Morphometric and temporal parameters were analyzed to compare the generations. The first generation completed its lifecycle in an average of 76.52 ± 3.39 days, about 29 days less than the second generation with 105.8 ± 14.22 days (F = 16,03; p < 0.01). The pupae time for F1 generation was lower than for F2 (29.25 ± 2.06 and 59.35 ± 15.55, respectively; F = 54.97; P < 0.001). The adults of the second generation presented slightly larger wings than adults of the first generation with a mean of 2.12 ± 0.05 and 1.95 ± 0.17 cm, respectively (F = 19.2; p < 0.01). The presence of a seventh instar was verified in the second generation and species occurred twice a year. Due to the long pupal phase of the second generation, this species may present diapause during the coldest time of the year. New records of H. pearsoni interactions with parasitoids of the Order Diptera (Tachinidae: Leschenaultia bicolor Macquart, and Phoridae: Megaselia scalaris Loew) and predators of the Order Hemiptera (Pentatomidae: Supputius cincticeps Stal) were recorded.

Keywords: Arctiinae, Photoperiod, Natural History, Parasitoids, Morus sp.

Introduction

The Erebidae family is considered the second largest in Noctuioidea, comprising species that formerly belonged to taxonomic groups such as Lymantriidae and Arctiidae. ( Lafontaine and Schmidt, 2010). The moths of the Arctiinae subfamily are known as tiger moths due to their wing coloration, and comprise approximately 6% of the variety of Lepidoptera species in the world. Studies about Arctiinae encompass aspects of temporal and spatial distribution of species, their evolutionary and phylogenetic relationships, as well as chemical ecology, physiology, pheromones, predators and parasitoids, and mimicry (Conner, 2008; Ferro et al., 2012; Goldsmith and Marec, 2010; Green et al., 2011; Moreno et al., 2015; Scherrer et al., 2013; Teston and Corseuil, 2004; Teston et al., 2009; Zaspel et al., 2014; Soukarov, 2015; Weller et al., 1999;). Although Arctiinae possesses high species richness and are well studied, little is known about its biology and natural history in Brazil (Scherrer et al., 2013).

The genus Halysidota Hubner is found throughout the American continent and comprises 39 species, and has recently been described (Vincent and Laguerre, 2017). It is known to possess leaf-eating caterpillars that generally consume Moraceae and Myrtaceae plant families (Tavares et al., 2014). Adults can vary in size between three to six centimeters and present a great diversity of shapes and colors, with larvae that are generally densely covered by bristles. Some species of Halysidota as H. ruscheweyhi Dyar, H. caryae Harris and H. orientallis Waldstein & Kitaibe have had their biology (Lawrence, 1990; Sanchez- Soto et al., 2004; Scatoni and Bentacourt, 2004) and relationships with parasitoids described (Pereira et al., 2008; Tavares et al., 2014).

The H. pearsoni lifecycle was described by Pereira et al. (2007), where caterpillars were fed Morus sp. leaves and their lifecycles lasted an average 65 days, including the egg, larva, pupae and adult phases (7, 28, 20 and 10 days, respectively). Egg clusters of H. pearsoni were found on cotton leaves and collected for breeding/rearing in the laboratory, but the species failed to complete its cycle, only reaching the fifth instar stage (Guerra et al,

2009). H. pearsoni was also found on eucalyptus trees in Minas Gerais state (Tavares et al., 2014). The caterpillars in the present study were fed blackberry leaves (Morus sp.: Moraceae).

Thus, this study aimed to describe the complete cycle (egg, larva, pupae and adult) of two generations of Halysidota pearsoni, reared in laboratory conditions during a hot period (summer) and cold period (autumn/winter), describing each instar of its larval phase, the development time of each stage and the annual variation in species development between two generations.

Materials and methods

Moth rearing was performed at the Biodiversity Laboratory of the Federal University of Ouro Preto, Ouro Preto, MG. The reared caterpillars were collected from matrices in the municipality of São Sebastião das Águas Claras, MG, latitude 20°02'57.99"S and longitude 43°54'57.69"W, on 26 November 2017. They were created in plastic boxes inside the laboratory, with daily maintenance and replacement of leaves until the pupal stage. The adults were released in a shaded structure located in the university's garden, where several specimens of Morus sp. were placed for egg laying. Once egg clusters were observed on the leaves, they were removed and taken to the laboratory where they were kept separately in 1 liter plastic pots until eggs hatched. Four entire egg clusters were used as replicates (A, B, C and D). The caterpillars were kept in 50 L plastic boxes and were fed blackberry leaves ad libitum every day.

Morphometric data was recorded: cephalic capsules widths, size of caterpillars, size and weight of pupae, size of wing and adult body were measured at each instar stage, and daily counts of each stage (egg, larva and pupae), the total time of the cycle and the time of each instar, as well as mortality, were made. The measurements were performed in the ImageJ program version 1.51 K using photos taken at a millimeter scale by a digital camera. Shortly after the pre-pupae phase, the pupae were weighed on a precision scale. The growth ratio was calculated by the current measurement minus the previous measurement, divided by the previous measurement, to verify whether the 16

species had growth as seen in the Dyar rule (Daly, 1985). To test whether there was a difference between generations, generalized linear models (GLM), and then analysis of variance (Anova) of each morphologic and temporal parameter between generations were performed. The rearings were carried out from January 17, 2018 to June 12, 2018 (Summer) (1st generation: F1) and from 29 March 2018 to 07 January 2019 (Winter) (2nd generation: F2). The end date of each generation corresponds to the last adult emergence record.

Results In total, 1268 larvae of Halysidota pearsoni were reared, the first generation had 616 caterpillars (A = 91, B = 159, C = 279 and D = 87) and the second had 652 caterpillars (A = 237, B = 154, C = 125 and D = 136). The first generation presented six instars, while the second presented seven (Table 1). The cephalic capsules of the last instars of both generations were unmeasurable, as they split in the pre-pupae period.

Stages Egg. There were many eggs laid under the abaxial surface of the Morus sp. leaves, with a mean of 203.5 ± 90.9 eggs per female. The eggs are round and pearl colored (figure 1A), tending to turn gray on the surface when ready to hatch.

1st instar. Caterpillars had yellowish coloration with black wrinkles where bristles were inserted (Figure 1b). The average size of the cephalic capsules was similar between generations, with a mean of 0.574 ± 0.123 mm (F = 2.10; p > 0.05). The average time in the first instar of F1 was higher (13.33 ± 3.21 days) than that of F2 (6 ± 0.81 days; F = 2.33; P < 0.01).

2nd instar. Caterpillars resembled those of the first instar, with yellowish coloration and the presence of a black dorsal spot on the pronotum region is noted (Figure 1c). The average size of F1 cephalic capsules was higher compared to F2 (1.362 ± 0.131 mm and 0.987 ± 0.031 mm respectively; F = 30.98; P < 0.01). The instar time was similar between generations with a mean of 4.5 ± 1.99 days (F = 3.42; p > 0.05).

3rd instar. Caterpillars showed changes in coloration compared to second instars, with the emergence of gray bristles along the body. In the third segment of the thorax, there was a black transverse stripe covered with darkened bristles and in the region of the first and second segments of the thorax there were eight tufts of elongated white bristles, four per segment (Figure 1D). F1 cephalic capsules had a greater average size than those of F2 (2.236 ± 0.133 mm and 1.534 ± 0.055 mm, respectively; F = 11.2; P < 0.05). For instar time, the average of the two generations was similar with 6 ± 1.28 days (F = 0.27; p > 0.05).

4th instar. Caterpillars presented the terminal portion of the body covered with black bristles and a pair of elongated lateral white bristle tufts. The tegument of the thorax region was more marked by black staining and by the presence of eight tufts of white bristles. At the base of each of these tufts of bristles, an orange longitudinal line linking the bristles from one segment to another was noticed. The middle region of the body presented grayish staining due to the presence of ash bristles (Figure 1E). F1 cephalic capsules were higher than F2 (3.128 ± 0.336 mm and 2.496 ± 0.169 mm, respectively; F = 11.2; p < 0.05). The instar time between the generations was similar with an average of 4 ± 1.59 days (F = 0.04; p > 0.05).

5th instar. Caterpillars presented black bristles throughout the entire body and in the terminal portion the pair of white bristle tufts was larger and more evident. The eight tufts of white bristles on the thorax presented an orange tint near the base. The orange line at the base of the bristle tufts was more evident with white dots between the segments. On the lower part of the body, the caterpillars had whitish bristles that protruded laterally (Figure 1F, 2A and 2B). F1 cephalic capsules were larger than those of F2 (3.991 ± 0.162 mm and 3.504 ± 0.367 mm, respectively; F=5.89, p > 0.05). The instar time was also similar between generations with a mean of 5.5 ± 1.83 days (F = 0.55; p > 0.05).

6th instar. Caterpillars had the same morphological characteristics as the fifth instar, except sixth instar caterpillars were larger than the previous instar (Figure 2a). F1 went into the pupae phase in the sixth instar. The larvae of F2 had cephalic capsules with a mean size of 4.707 ± 0.233 mm. For instar time, the

two generations had similar times with an average of 7 ± 1.77 days (F = 0.6; p > 0.05).

7th instar. Only the second generation caterpillars presented the seventh instar. The caterpillars had the same morphological characteristics as the sixth instar. Instar time was 8.25 ± 1.5 days.

Table 1. Size of the cephalic capsules and respective standard errors, growth ratio of each instar and mean instar time (independent of significance) of Halysidota pearsoni caterpillars reared in the laboratory. Instar time Generation Instar Width of cephalic capsule (mm) (x ± ep) Growth ratio (days ± ep) F1 I 0.474 ± 0.160 13.33 ± 3.21 F1 II 1.362 ± 0.131 1.87 3.5 ± 1 F1 III 2.236 ± 0.133 0.641 5.5 ± 1.73 F1 IV 3.128 ± 0.336 0.398 4.5 ± 1.73 F1 V 3.991 ± 0.162 0.275 5.25 ± 1.70 F1 VI 6 ± 2.44 F2 I 0.592 ± 0.024 6 ± 0.81 F2 II 0.987 ± 0.031 0.665 5.75 ± 2.21 F2 III 1.534 ± 0.055 0.554 6 ± 0.81 F2 IV 2.496 ± 0.169 0.626 4.25 ± 1.70 F2 V 3.504 ± 0.367 0.403 6.25 ± 2.06 F2 VI 4.707 ± 0.233 0.343 7 ± 0.81 F2 VII 8.25 ± 1.5

The total duration of the lifecycle (egg until adult emergence) was higher in F2 than in F1 (F = 16.03; p < 0.01). Mortality was 68% (n = 442) in F1 and 31% (n = 156) in F2 (Table 2).

Table 2. Total time of development in days and their respective standard errors

and mortality percentage for each generation.

Generation Total time (average ± ep) Mortality (%) (average ± ep)

F1 76.52 ± 3.39 0.68 ± 0.10

F2 105.8 ± 14.22 0.31 ± 0.14

The F2 generation presented longer pupae time than the first (F = 14.72; p < 0.001). Despite the fact that one more instar occurred, the duration of the

larvae phase of F2 was similar to that of F1 (F = 0.01; p > 0.05). For the egg and pre-pupae phases, there were also no differences between F2 and F1 (F=0.87; p>0.05 and F=0.03; p>0.05, respectively) (Table 3).

Table 3. Duration in days and their respective standard errors of each developmental stage of Halysidota pearsoni caterpillars reared in the laboratory.

Stages F1 (days) (x ± SE) F2 (days) (x ± SE) P

Egg 6.5 ± 1.29 7.25 ± 0.95 0.38

Caterpillar 40.5 ± 3.1 40.25 ± 2.75 0.90

Pre-Pupae 2.05 ± 0.1 2.02 ± 0.25 0.85

Pupae 29.25 ± 2.06 59.35 ± 15.55 0.00 8 Cocoon and pupae. In the pre-pupae phase, the caterpillars wove a cocoon with their bristles, joining them with silk, sometimes using leaves or bristles from cocoons of neighboring caterpillars (Figure 2c). The pupae had brown coloration, with a smooth appearance and the abdominal segments of the adult were well defined (Figure 2D). The pupae of the first generation were lighter than the second generation (F = 205,8; p < 0.001). Regarding the pupae size, there were no differences (F = 0.68; p >0.05) (table 4).

Table 4. Sizes and weights of pupae from both generations and their respective standard errors.

Pupae F1 (x ± SE) F2 (x ± SE) P

Weight (g) 0.297 ± 0.009 0.42 ± 0.01 0.001

Size (cm) 1.695 ± 0.025 1.713 ± 0.035 0.43

Adults. Both males and females showed orange coloration, with the lower abdomen tending to be a straw color. The dorsal portion of the thorax is composed of orange bristles and 3 green toned stripes parallel to the body length.

The wings present beige coloration throughout, with brown and black colored cells presenting the typical "tiger moth" pattern. The legs present the same coloration pattern as the wings (Figure 3). They have pectinate antennae and sexual dimorphism is absent, with differences only in the terminal portion of the abdomen (Figure 3), where a pair of valves was observed in males (figure 3B and 4A). Adult body size was similar in the two generations with an average of 1.60 ± 0.13 cm (F = 1.2; p > 0,05). Wings were smaller in F1 compared to adults of F2 (F = 19.2; p < 0.01) (Table 5).

Table 5. Size of wings (measured from the base junction of the right anterior wing to its insertion in the thorax) and bodies (measured from the anterior-posterior axis) and their respective standard errors.

Adults F1 (cm) (x ± SE) F2 (cm) (x ± SE) P Wing 1.95 ± 0.06 2.12 ± 0.05 0.004

Body 1.55 ± 0.05 1.65 ± 0.17 0.31

Figure 1. A. Egg cluster; B. First instar caterpillars; C. Second instar caterpillars; D. Third instar caterpillars; E. Fourth instar caterpillars; F. Fifth instar caterpillars.

Figure 2. A. Sixth instar caterpillars; B. Seventh instar caterpillar; C. Cocoon; D. Pupa.

Figure 3. A. Dorsal view (female). B. Dorsal view (male). C. Ventral view (female). D. Ventral view (male).

Figure 4. A. Male genitalia . B. Female genitalia.

Natural enemies

In the laboratory rearings, both generations were parasitized by flies. The F1 caterpillars were parasitized by a fly from the Phoridae family: Megaselia scalaris Loew, 1866 (Figure 5b) and larvae of F2 were parasitized by the Tachinidae family: Leschenaultia bicolor Macquart, 1846, (Figure 5A). The larvae of these flies leave the host to pupate after the caterpillars enter the pre-pupae phase. In this case, the fly larva pupated inside the cocoon made by the caterpillar, next to the pre-pupae (Figure 5C).

The adults who remained in the shaded breeding structure were predated on by a bug of the order Hemiptera: Pentatomidae: Supputius cincticeps Stal, 1860. This species was brought to the lab to confirm predation. The bedbug slowly approaches the adult moth, so it is unperceived and inserts its sucking mouthpiece into the prey (personal communications)

(Figure 5D).

Figure 5. A. Registered parasitoid fly (Diptera: Tachinidae: Leschenaultia bicolor). B. Registered parasitoid fly (Diptera: Phoridae: Megaselia scalaris). C. Open cocoon with parasitoid pupae observed in A. D. Record of adult moth predation (Hemiptera: Pentatomidae: Supputius cincticeps).

Discussion and conclusion This study demonstrated that the species Halysidota pearsoni may be bivoltine, presenting two generations in the study year, one from the end of spring until autumn and another from autumn to summer of the following year. The lifecycle time of the first generation (hotter months) was shorter than the second generation (colder months). Other Arctiini species were also recorded with bivoltinism/multivoltinism as Virbia aurantiaca Hubner (Zaspel et al., 2008) or univoltinism as Halysidota ruscheweyhi (Scatoni, 2004) and Idalus lineosus Walker (Braga et al., 2014). Another similar record was found for the species Automeris io (Saturniidae) which possibly presents bivoltinism, with two types of development, one faster in the warmer months and another slower in the colder months, without necessarily going through diapause, since adults of this species were recorded throughout the year (Manley, 1993).

Due to rearing in the laboratory, where conditions are relatively more stable than in natural environments, the two generations were viable, but an increase in total lifecycle time was observed, especially in the pupae phase. The second generation occurred in months with lower average temperatures due to the change from autumn to winter seasons, which could justify the long period in the pupae phase and suggest diapause for the species. Multivoltine species increase their development time during the unfavorable season so that a second generation is possible, which then abruptly decreases development time due to the favorable season, causing a "sawtooth" effect for generation lengths (Esperk et al., 2007).

Diapause is an important process in the lifecycle of insects, and is considered a developmental delay in response to changes or periods that are not favorable for a species, whether they are climate or food related (Mousseau and Dingle, 1991; Chapman, 1994), with development resuming as soon as conditions become favorable (Gullan and Cranston, 2012). Diapause beyond the pupal phase can also be seen in other stages of the Lepidoptera cycle, and may be embryonic as in Bombyx mori L., which can take up to ten months to hatch (Duarte et al., 2012), larval, where it is regulated by hormones controlled by the photoperiod causing the larva to increase its pre-pupae phase

(Chippendale, 1977) as seen in Tiracola grandirena Herrich-Shaffer, (Specht et al., 2014) or in adults in their reproductive phase.

The photoperiod or the length of day is a preponderant factor for diapause. Longer days with more light hours, as in the summer, tend to accelerate the larval development process, contrary to what occurs in winter, when the days are shorter and consequently have less light hours, thus initiating dormancy as the photoperiod decreases (Gullan and Cranston, 2012).

The pupae of the winter generation were heavier than the pupae of the summer generation. This shows that caterpillars needed a further instar to acquire enough energetic reserves to face diapause. The pupate process depends on the accumulated biomass gained during the larval phase. The metabolism decreases as temperature decreases, and it is necessary for caterpillars to gain much more weight to prepare for diapause, increasing their lipid reserves by up to two times (Mathews and Mathews, 2009). In Malacosoma americanum F., lower temperatures decrease assimilation efficiency and consequently decrease development (Levesque et al., 2002). In this study, the adults of the winter generation were relatively larger than the adults of the summer generation, with different wing sizes recorded. Caterpillars that are in the last instar and still do not have enough biomass for the pupae process require longer feeding times to ensure success at adult size (Barros-bellanda and Zucoloto, 2002; Esperk and Tammaru , 2007). As seen in Table 4, the pupae of the generation with seven instars were larger and heavier in relation to the generation with six instars. Arctiini caterpillars can have varying numbers of instars, as seen in Grammia incorrupta Henry, where the larval phase is commonly recorded with seven instars, while some individuals pupate in the sixth or eighth instar (Conner, 2008).

Temperature also greatly influences the development of insects. When food is unlimited, heat controls the development and growth of insects (Gullan and Cranston, 2012). Low temperatures combined with shorter days can reduce development and consequently increase the number of instars in bivoltine species. The inclusion of additional instars may be a condition that induces diapause or a part of diapause (Esperk and Tammaru, 2007). 26

Arctiines have numerous parasitoids and predators belonging to diverse orders, among them Coleoptera, including Parena perforata that feeds on both the larva and the adults of Thanatarctia imparilis Butler. They also present records of parasitoids for the orders Hymenoptera and Diptera (Green et al., 2011). Herein, two Diptera parasitoids and a possible Hemiptera predator were recorded.

The parasitoids of Diptera belong to two different families: Tachinidae and Phoridae. The family Tachinidae is well studied and is one of the most numerous orders with approximately 10,000 species described worldwide (Stankovic et al., 2018). A striking feature of this family is that all of the species that have had their biology described are parasitoids of other insects or arthropods. Tachinids are predominately parasitoids of Lepidoptera, making them good at regulating populations of species considered pests and structuring ecological communities (Stireman et al., 2006).

In this work, the tachinid parasitoid Leschenaultia bicolor was recorded in the second generation, which is a new record of parasitism for the genus. For the genus Halysidota, there are not many records about its parasitoids and their relationships. Some records of the tachinid Belvosia sp. in Halysidota caterpillars were recorded in the city of Viçosa, Minas Gerais, Brazil (Tavares et al., 2014).

First generation caterpillars were parasitized by the phorid fly Megaselia scalaris and also presented a new record of parasitism for Halysidota (unpublished results). Currently, the Phoridae family has few records of parasitoidism of Lepidoptera. The genus Megaselia is a large group of flies and their larvae possess differentiated dietary habits (Brown and Oliver, 2007) encompassing anurans (Downie et al., 1995) to ants (Disney et al., 2008). Some ancient records of the phorid Megaselia parasitica Loew were found in larvae of Heliothis sp., Spodoptera mauritia Boisduval, and Chlumetia transversa Walker (Noctuidae) (Disney et al., 1992). Other more current records of the genus were found in caterpillars of the Limacodidae family (Stoepler and Disney, 2013).

Some adult moths of this study were predated by the pentatomid 27

bug Supputius cincticeps. This bug is well known for being a generalist predator feeding preferably of Lepidoptera (Zanuncio et al., 2003). Therefore, it is used to biologically control several leaf eating pests in agricultural areas, such as Spodoptera frugiperda Smith, and Thyrinteina arnobia Stol, (Holtz et al., 2006; Zanuncio et al., 1998).

The results of this contribute to knowledge about the species H. pearsoni, as well as to a better understanding of the species’ development throughout the year. It was possible to verify how the species occurs in different seasons of the year and the differences it presents between generations. In addition, an additional instar was observed in the autumn/winter generation and a diapause process was suggested for the species. New records of parasitoids and predators of H. pearsoni (unpublished results) were also found. Thus, this work enriches the literature on H. pearsoni describing its complete biology, from egg to adult, its respective stages and its temporal variation.

Acknowledgments We thank CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) for financing this work. Professor Yasmine Antonini for providing the laboratory and necessary materials to create caterpillars and adults. The Federal University of Ouro Preto for the support and opportunity to accomplish this work. To colleagues Thalles Pereira and Filipe Gudin for the identification of parasitoids.

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Capítulo 2 Efeitos de tamanho de grupo sobre o desenvolvimento em Halysidota pearsoni (Lepidoptera: Arctiinae)

Introdução

O comportamento gregário é resultado de pressões seletivas (Allen, 2010), servindo para defesa contra inimigos naturais diminuindo a proporção de parasitismo tanto na fase de lagarta quanto na fase de ovo, além de benefícios na alimentação, termorregulação ou, até mesmo, na liberação de feromônios para procura de recursos ou para manter o grupo coeso (Denno e Benrey, 1997; Despland e Huu, 2007; Inouye e Johnson, 2005). Porém o hábito gregário também pode ter desvantagens, como competição por alimento, transmissão de patógenos e maior visibilidade para o predador (Clark e Faeth, 1997; Hunter, 2000; Ronnas, et al., 2010).

Além disso, outros fatores podem interferir no desenvolvimento e crescimento na fase larval de algumas espécies, tais como temperatura, alimentação e, até mesmo, a presença de outros indivíduos da mesma espécie podem afetar o número de instares, tamanho do adulto, entre outras características (Woodhead e Paulson, 1983).

Em Lepidoptera, o tamanho de grupo na fase larval foi estudado em alguns trabalhos realizados com lagartas de Automeris illustris, Hylesia nigricans e Tolype ventriosa, cujas espécies possuem hábito gregário. As mesmas foram individualizadas para observação de comportamento e biologia, e concluiu-se que o comportamento gregário é essencial à sobrevivência dos indivíduos destas espécies (Pereira et al., 2009; Specht et al., 2004, 2006a e 2006b). Nesses estudos, nenhum dos espécimes que foi individualizado atingiu a fase adulta.

Em vários estudos feitos para avaliar os benefícios do gregarismo, foi demonstrado que a variação da temperatura corporal das lagartas em agregação foi menor que nas lagartas individualizadas, o que proporciona um melhor metabolismo favorecendo o crescimento (Klok e Chown, 1999). Desta forma, o tamanho de grupo em lagartas gregárias afeta diretamente a sobrevivência dos indivíduos, principalmente quando estes são individualizados (Pereira et al., 35

2009; Specht et al., 2004, 2006a e 2006b) e as taxas de crescimento, devido a termoregulação (Lawrence, 1990; Klok e Chown, 1999).

Nesse contexto, este trabalho teve o objetivo de verificar os efeitos de diferentes tamanhos de grupos e de lagartas isoladas no desenvolvimento de Halysidota pearsoni Watson, 1980 (Lepidoptera: Erebidae: Arctiinae) em duas gerações, sendo analisadas as seguintes questões: i. grupos com 1 e 3 indivíduos não completarão o ciclo, visto que lagartas de espécies gregárias morreram ao serem individualizadas (Spetch et al., 2004, 2006a); grupos maiores (com 20, 50 ou o total de indivíduos da oviposição) terão seu desenvolvimento afetado diferentemente, por exemplo: diferenças no tamanho das cápsulas cefálicas, no tempo de desenvolvimento, no tamanho dos adultos e peso das pupas de acordo com o tamanho do grupo, já que tanto em lepidóptera quando para outros grupos taxonômicos, foi verificada a diferença no desenvolvimento em função do tamanho do grupo (Cançado et al., 2007; Reader e Hochuli, 2003; Fordyce e Nice, 2004); ii. existe um número ideal de indivíduos em que o desenvolvimento pode ser considerado ótimo, com menor tempo de duração de cada estádio e maior tamanho das lagartas e dos adultos; iii. as gerações apresentarão o mesmo padrão de desenvolvimento em relação aos tratamentos.

Material e Métodos

Espécie estudada A subfamília Arctiinae possui grande riqueza e com cerca de 10 mil espécies registradas, sendo aproximadamente seis mil pertencentes a região Neotropical (Moreno et al, 2015). Os estudos realizados sobre ecologia e biologia com a fauna de Arctiinae são em sua maioria feitos em ecossistemas temperados e muito pouco nos trópicos (Green et al., 2011).

Para a realização deste trabalho, foram utilizadas lagartas da espécie Halysidota pearsoni Watson, 1980 (Lepidoptera: Arctiinae). As lagartas se alimentam de folhas de amora (Morus sp.: Moraceae). A duração do ciclo completo (ovo a adulto) da espécie tem em média 91,16 ± 18,34 dias, sendo a fase de ovo, larva (7 instares) e pupa de aproximadamente 6,87 ± 1,12, 40,33 ±

2,72, 44,3 ± 19,08 dias, respectivamente (Carneiro et al., resultados não publicados).

Experimento e levantamento de dados

As lagartas utilizadas nesse estudo foram provenientes de uma população coletada em campo no município de São Sebastião das Águas Claras, MG, com localização de latitude 20° 2'57.99"S e longitude 43°54'57.69"O, na data 26 de novembro de 2017, no instar 3 e criadas em laboratório com folhas de Morus sp. ad libitum. A primeira prole dessa população foi utilizada como primeira geração (F1). Para a segunda geração (F2) foram utilizadas lagartas da prole de F1.

O experimento foi realizado no Laboratório de Biodiversidade da Universidade Federal de Ouro Preto, na cidade Ouro Preto, MG. Para obter maior relevância para o estudo, foram realizados experimentos com duas gerações (F1 e F2), sendo F1 no período entre janeiro a junho de 2018 e F2 no período março de 2018 a janeiro de 2019.

Para testar a primeira hipótese, o experimento compreendeu cinco tratamentos distintos: T1 (somente um indivíduo), T3 (3 indivíduos), T20 (20 indivíduos), T50 (50 indivíduos) e TMAX (número de ovos da postura original). Foram realizadas cinco réplicas (A, B, C, D e E) de cada tratamento. As lagartas dos grupos T1, T3 foram criadas em potes plásticos de 1L, T20 e T50 foram criadas em potes plásticos de 5L e as lagartas do TMAX em caixas plásticas de 40L, totalizando 25 recipientes por geração (adaptação de Specht et al, 2004; Specht et al, 2010). Todos os recipientes tinham as tampas furadas para circulação de ar e eram limpos diariamente. Para cada tratamento de agregação, as lagartas foram separadas manualmente com auxílio de pinça entomológica logo após a eclosão e colocadas em um dos cinco tratamentos.

O experimento contou com duas gerações (F1 e F2) sendo F1 com uma quantidade inicial de 1202 indivíduos, distribuídos da seguinte forma: cinco tratamentos com um indivíduo (T1) (n=5); cinco tratamentos de três indivíduos (T3) (n=15); cinco tratamentos de 20 a 22 indivíduos (n=103); cinco tratamentos de 50 a 54 indivíduos (n=254) e cinco tratamentos máximos de 87, 91, 159, 209 e 279 (n=825).

A segunda geração (F2) iniciou com uma quantidade inicial de 1182 indivíduos distribuídos em: cinco tratamentos com um indivíduo (T1) (n=5); cinco tratamentos com três indivíduos (T3) (n=15); cinco tratamentos de 20 indivíduos (T20) (n=100); cinco tratamentos de 50 indivíduos (T50) (n=250) e cinco tratamentos máximos (TMAX) de 125, 136, 154, 160 e 237 (n=652).

Em cada tratamento foram avaliados os seguintes aspectos: largura da cápsula cefálica de cada instar, tempo entre instares, tempo de desenvolvimento larval e pupal, peso e comprimento das pupas, tamanho dos adultos (asa e corpo), tempo total de desenvolvimento (data da postura até a emergência dos adultos) e mortalidade.

As cápsulas cefálicas das lagartas foram coletadas e fotografadas para medição a cada troca de instar. Quando as lagartas eram observadas em fase de pré-pupa, as mesmas eram separadas em potes identificados para cada tratamento para medição do tempo de pupa. Após 15 dias no estágio de pupa, estas foram retiradas dos casulos, quando houve formação deste, e pesadas em balança de precisão. Em seguida, as pupas eram fotografadas para realização da medição.

Após estes procedimentos, as pupas foram realocadas nos potes devidamente identificados até a emergência dos adultos. Todos os registros foram feitos utilizando fotos tiradas por máquina digital e as medidas realizadas no programa ImageJ versão 1.51k, sempre com uma régua para escala milimétrica. Para as medidas de asa, foi utilizado o comprimento da junção do tórax com a asa anterior direita até sua extremidade e para medida do corpo foi realizada a medição do eixo ântero-posterior (modificado de Lorini e Corseuil, 2001). Todas as lagartas deste estudo foram mantidas a condições naturais do ambiente (sem controle de temperatura, umidade e fotoperíodo).

Análises estatísticas Para as comparações entre tratamentos e gerações, foram realizados modelos lineares generalizados (GLM) para cada variável resposta, sendo elas: tempo entre instar (do primeiro ao sétimo) (Carneiro et al, resultados não publicados), largura das cápsulas cefálicas (do primeiro ao sexto instar), tempo

larval, pupal e total, peso e comprimento das pupas, comprimento da asa e do corpo, quantidade final de indivíduos (foi utilizado o número de lagartas que fizeram pupa), mortalidade (para calcular a mortalidade, foi utilizado o número de lagartas inicial subtraído do número de pupas para cada tratamento), totalizando 22 variáveis respostas. Além disso, foi avaliado após os resultados finais, se existiu um número ideal de indivíduos. Para esta variável, foi utilizada a soma das quantidades finais de indivíduos dividido pelo número de tratamentos restantes/viáveis/disponíveis.

As variáveis explicativas foram os tratamentos (T1, T3, T20, T50 e TMAX), as gerações (F1 e F2) e a interação entre tratamentos e gerações. A interação entre tratamentos e gerações é importante para demonstrar se os tratamentos se comportam da mesma forma nas diferentes gerações. Em seguida, após testar a distribuição dos dados, foram realizadas análises de variância para cada variável (ANOVA) para testar a significância dos modelos. Para aqueles em que o resultado do tratamento foi significativo, foram realizadas análises de contraste para saber entre quais tratamentos existia a diferença. Para fins de facilitar a visualização apresentaremos somente os resultados significativos.

Todas as análises foram realizadas no programa R Studio, versão 1.1.447 (R Core Team, 2018).

Resultados Em F1, das 25 réplicas, 17 conseguiram atingir a fase de pupa, tendo sido registrada perdas dos seguintes tratamentos: quatro réplicas T1; duas réplicas T3 e uma réplica TMAX (n=209). A quantidade final de indivíduos foi dada pelo número de lagartas que atingiram a fase de pupa, sendo um total de 425 (35,35%) indivíduos. Em F2, das 25 réplicas, foram registradas três perdas: duas réplicas T1 e uma réplica TMAX (n=160). A quantidade final de indivíduos foi registrada com 641 (54,23%) lagartas que atingiram a fase de pupa. Cada variável foi testada e os resultados podem ser observados na Tabela 1 e foram detalhados a seguir.

Cápsulas cefálicas 1° instar. Para os tratamentos, houve dois grupos distintos: T1T20T50TMAX e T3 (0,519 ± 0,135 e 0,627 ± 0,070 mm, respectivamente; F= 3,05; p<0,05; Figura 1A). O comprimento cefálico neste instar foi maior em F2 em relação a F1 (0,624 ± 0,038 e 0,434 ±0,133 mm, respectivamente, F= 42,59; p<0,001; (Figura 1B). A interação entre tratamentos e gerações para o tamanho das cápsulas cefálicas não foi significativa (F=2,44; p>0,05).

Figura 1. Tamanho das cápsulas cefálicas de primeiro instar de lagartas de H. pearsoni (A) entre tratamentos e (B) entre gerações.

2° instar. Entre os tratamentos, também houve dois grupos distintos: T1T3T20T50 e TMAX (1,017 ± 0,155 e 1,175 ± 0,219 mm, respectivamente; F=2,68; p<0,05; Figura 2A). Para este instar, a geração F1 obteve o maior comprimento cefálico em relação a F2 (1,163 ±0,188 e 0,962 ± 0,111 mm, respectivamente; F=19,28; p<0,001; Figura 2B). A interação entre tratamentos e gerações para a cápsula cefálica do segundo instar não foi significativa (F=1,98; p>0,05).

Figura 2. Tamanho das cápsulas cefálicas de segundo instar de lagartas de H. pearsoni. (A) entre tratamentos e (B) gerações

3° instar. Entre os tratamentos, assim como no primeiro e no segundo instar, também houve dois grupos distintos: T1T3T50TMAX e T20 (1,766 ± 0,346 e 1,919 ± 0,389 mm, respectivamente; F=4,53; p<0,01; Figura 3A). Entre gerações, F1 apresentou maior comprimento cefálico em relação a F2 (2,151 ± 0,214 e 1,516 ± 0,103 mm, respectivamente; F=169,19; p<0,001; Figura 3B). A interação para os tamanhos das cápsulas cefálicas do terceiro instar não foi significativa (F=1,36; p>0,05).

Figura 3. Comprimentos cefálicos do terceiro instar de H. pearsoni (A) entre tratamentos e (B) gerações.

4° instar. Para este instar, o comprimento cefálico em F1 foi maior em relação a F2 (3,234 ± 0,397 e 2,468 ± 0,210 mm, respectivamente; F=94,88; p<0,001). Entre os tratamentos, houve dois grupos: T1T3 e T20T50TMAX (2,515 ± 0,278 e 2,915 ± 0,510 mm, respectivamente; F=6,24; p<0,001). A interação entre tratamentos e gerações foi significativa (F=3,16; p<0,05; Figura 4). Os tratamentos T20 e T50 ficaram com os maiores tamanhos em F1, enquanto em F2 os mesmos foram menores.

Figura 4. Interação significativa dos tamanhos das cápsulas cefálicas do quarto instar de H. pearsoni.

5° instar. Para esta variável, não houve diferenças significativas entre tratamentos (p=0,35) e entre gerações (p=0,08) e nem houve interação entre tratamentos e gerações (p=0,51).

6° instar. Apenas em F2 ocorreu a sexta cápsula cefálica, no entanto não houve diferenças significativas entre os tratamentos (F=1,95; p>0,15).

Tempo de instar entre gerações e tratamentos 1° instar. O tempo entre os tratamentos não diferiu significativamente (F=2; p>0,05). Para as gerações, o tempo no primeiro instar na F1 foi maior que na F2 (11,23 ± 2,04 e ,95 ± 0,48 dias, respectivamente; F= 137,47; p< 0,001; Figura 5A). A interação entre geração e tratamentos não foi significativa (F=1,73; p>0,05; Tabela 1).

2° instar. Como no tempo do 1˚ instar, os tratamentos não diferiram significativamente entre si (F=1,47; p>0,05). A geração F1 apresentou o menor tempo em comparação a F2 (3,94 ± 1,16 e 5,72 ± 1,77 dias, respectivamente; F= 13,38; p<0,001; Figura 5B). A interação entre tratamentos e gerações não foi significativa (F=0,32; p>0,05).

Figura 5. Tempo de duração (em dias) do primeiro (A) segundo (B) instar do desenvolvimento de H. pearsoni por geração.

Para os 3o, 4o e 5o instares, o tempo não diferiu entre tratamentos e entre gerações, assim como as interações entre as variáveis explicativas não foram significativas (ver tabela 1).

6˚ instar. A interação entre tratamentos e geração foi significativa (F= 11,16; p<0,001), sendo T1 com 13,3 ± 3,24 dias, T3 com 7,25 ± 2,08 dias e T20, T50 e TMAX com média de 6,16 ± 1,65 dias (F=15,74; p<0,001) (Figura 6). O tratamento T3 em F1 teve o tempo maior, enquanto em F2 o maior tempo foi T1.

Figura 6. Tempo em dias no 6˚ instar em relação às gerações e tratamentos de H. pearsoni

Apenas a geração F2 apresentou o sétimo instar e não houve diferenças significativas no tempo de instar entre tratamentos (F=0,64, p>0,05).

Tempos dos estágios Larva. Para os tratamentos houve dois grupos: T20T50 e T1T3TMAX (37,4 ± 3,80 e 40,86 ± 2,49 dias, respectivamente; F=8,48; p<0,01). O tempo larval foi menor em F1 do que em F2 (36,3 ± 3,62 e 41,14 ± 2,13 dias, respectivamente; F=54,24; p<0,001). A interação entre tratamentos e gerações foi significativa (F=121,02; p<0,001; Figura 7A). As variações do tempo larval entre os tratamentos são menos evidentes na F2 que na F1 (ver Figura 7A).

Pupa. Entre tratamentos houve dois grupos: T1T3TMAX e T20T50 (39,7 ± 23,37 e 75,57 ± 50,89; F=8,26; p<0,001). Para o tempo de pupa, F2 apresentou o maior tempo em relação a F1 (88,83 ± 44,01 e 29,88 ± 2,82 dias, respectivamente; F=89,15; p<0,001). A interação entre tratamentos e gerações foi significativa (F=7,24; p<0,01; Figura 7B). As variações do tempo de pupa entre tratamentos são menos evidentes na F1 que na F2. Na segunda geração, o tempo de pupa dos tratamentos T20 e T50 foi muito superior em comparação aos outros.

Figura 7. Relação entre tempo de pupa (A) e de larva (B) e tratamentos entre as gerações de H. pearsoni.

Tempo total (data da postura até a emergência do adulto). Entre os tratamentos, houve dois grupos: T1T3TMAX e T20T50 (87,04 ± 18,65 e 119,5 ± 53,18 dias, respectivamente; F=6,72; p<0,001). A geração F2 apresentou o maior tempo total em relação a F1 (140,31 ± 42,86 e 72,27 ± 4,02 dias, respectivamente; F=104,1; p<0,001). A interação entre tratamentos e gerações foi significativa (F=6,71; p<0,001; Figura 8). As variações do tempo total entre tratamentos foram menos evidentes na F1, enquanto na F2 os tratamentos T20 e T50 tiveram os maiores tempos.

Figura 8. Interação significativa do tempo total de desenvolvimento de H. pearsoni entre tratamentos e gerações

Pupas Peso de pupa. Para os tratamentos, houve dois grupos: T50TMAX e T1 T3T20 (0,374 ± 0,060 e 0,485 ± 0,098 g, respectivamente; F=5,82; p<0,05; Figura 9A). Já para a geração F2 obteve os maiores pesos em relação a F1 (0,467 ± 0,105 e 0,390 ± 0,072 g, respectivamente; F=5,56; p<0,05; Figura 9B). Não houve significância na interação entre tratamentos e gerações (F=0,49; p>0,05).

Figura 9. Pesos da pupa de H. pearsoni nos tratamentos (A) e nas gerações (B). 47

Tamanho da pupa. Para essa variável, nenhum resultado foi significativo (Tabela 1).

Adultos

Asa. Entre os tratamentos, houve três grupos distintos: T50TMAX, T20 e T1T3 (2,08 ± 0,10; 2,19 ± 0,08 e 2,46 ± 0,21 cm, respectivamente; F=12,26; p<0,001; Figura 10A). Já entre as gerações não houve diferenças para o tamanho de asa (F=2,3; p>0,05). Não houve significância na interação entre os tratamentos e gerações (F=0,98; p>0,05).

Corpo. Entre os tratamentos, houve dois grupos: T1T3 e T20 T50TMAX (1,91 ± 0,14 e 1,63 ± 0,09 cm, respectivamente; F=11,76; p<0,001; Figura 10B). Entre gerações não houve diferenças para o tamanho do corpo (F=0,52; p>0,05). Não houve significância na interação entre tratamentos e gerações (F=1,78; p>0,05).

Figura 10. Tamanhos de asa (A) e corpo (B) dos adultos de H. pearsoni.

Mortalidade e número ideal Mortalidade. Entre os tratamentos, houve dois grupos: T3T20T50 e TMAX (0,37 ± 0,19 (37%) e 0,49 ± 0,22 (49%), respectivamente; F=7,31; p<0,01). Entre gerações não houve diferenças significativas (F=1,06; p>0,05). A interação entre tratamentos e gerações foi significativa (F=4,66; p<0,01; Figura 11). A

mortalidade de TMAX observada em F1 não se repetiu na F2, para os outros tratamentos o padrão se manteve.

Figura 11. Mortalidade observada no ciclo de H. pearsoni entre tratamentos e gerações.

O tamanho dos adultos variou em função do tempo de pupa, podendo observar que nos tratamentos T20 e T50 e TMAX, o tamanho das asas foi maior à medida que o tempo de pupa aumentou (Figura 14).

Figura 14. Relação dos tamanhos de asa com a quantidade de dias na fase de pupa.

Tabela 1 – Modelos lineares generalizados completos e mínimos dos resultados.

Variáveis resposta Variáveis explicativas Gl F P Tempo 1 instar ᴬ Tratamento 4 2 0.17 Geração 1 147.99 <0.001 tratamento:geração 4 1.73 0.17 Tempo 1 instar ᴮ Geração 1 137.47 <0.001 Tempo 2 instar ᴬ Tratamento 4 1.47 0.23 Geração 1 10.6 <0.01 tratamento:geração 4 0.32 0.86 Tempo 2 instar ᴮ Geração 1 13.38 <0.01 Tempo 3 instar ᴬ Tratamento 4 1.21 0.32 Geração 1 3.14 0.08 tratamento:geração 4 0.75 0.56 Tempo 4 instar ᴬ Tratamento 4 2.3 0.08 Geração 1 0.1 0.91 tratamento:geração 4 0.55 0.69 Tempo 5 instar ᴬ Tratamento 4 2.38 0.07 Geração 1 0.49 0.48 tratamento:geração 3 1 0.4 Tempo 6 instar ᴬᴮ Tratamento 4 15.74 <0.001 Geração 1 0.001 0.96 tratamento:geração 3 11.16 <0.001 Tempo 7 instar ᴬ Tratamento 3 0.64 0.59 *F1 não ocorreu

Cápsula cefálica 1 ᴬ Tratamento 4 3.57 <0.05 Geração 1 49.85 <0.001 tratamento:geração 2.44 0.06 Cápsula cefálica 1ᴮ Tratamento 4 3.05 <0.05 Geração 1 42.59 <0.001 Cápsula cefálica 2 ᴬ Tratamento 4 2.99 <0.05 Geração 1 21.51 <0.001 tratamento:geração 4 1.98 0.12 Cápsula cefálica 2 ᴮ Tratamento 4 2.68 <0.05 Geração 1 19.28 <0.001 Cápsula cefálica 3 ᴬ Tratamento 4 4.73 <0.01 Geração 1 176.86 <0.001 tratamento:geração 4 1.36 0.27 Cápsula cefálica 3 ᴮ Tratamento 4 4.53 <0.01 Geração 169.19 <0.001 Cápsula cefálica 4 ᴬᴮ Tratamento 4 6.24 <0.001 50

Geração 1 94.88 <0.001 tratamento:geração 4 3.16 <0.05 Cápsula cefálica 5 ᴬ Tratamento 4 1.16 0.35 Geração 1 5.49 <0.05 tratamento:geração 3 0.78 0.51 Cápsula cefálica 5 ᴮ Geração 1 3.14 0.08 Cápsula cefálica 6 ᴬ Tratamento 4 1.95 0.15 *F1 não ocorreu

Tamanho de asa ᴬ Tratamento 4 12.77 <0.001 Geração 1 2.3 0.14 tratamento:geração 3 0.98 0.43 Tamanho de asa ᴮ Tratamento 4 12.26 <0.001 Tamanho de corpo ᴬ Tratamento 4 13.14 <0.001 Geração 1 0.52 0.47 tratamento:geração 4 1.78 0.16 Tamanho de corpo ᴮ Tratamento 4 11.99 <0.001 Tempo de pupa ᴬᴮ Tratamento 4 8.26 <0.001 Geração 1 89.15 <0.001 tratamento:geração 4 7.24 <0.001 Tempo larval ᴬᴮ Tratamento 4 8.48 <0.001 Geração 1 54.24 <0.001 tratamento:geração 4 4.05 <0.001 Tempo de ovo ᴬ Tratamento 4 4.35 <0.01 Geração 1 5.33 <0.05 tratamento:geração 4 2.53 0.06 Tempo de ovo ᴮ Tratamento 4 3.68 <0.05 Geração 1 4.51 <0.05 Peso da pupa ᴬ Tratamento 4 5.47 <0.01 Geração 1 5.23 <0.05 tratamento:geração 4 0.49 0.73 Peso da pupa ᴮ Tratamento 4 5.82 <0.01 Geração 1 5.56 <0.05 Tamanho da pupa ᴬ Tratamento 4 2.34 0.07 Geração 1 2.05 0.38 tratamento:geração 4 1.08 0.38 Mortalidade ᴬᴮ Tratamento 4 7.31 <0.01 Geração 1 1.06 0.3 tratamento:geração 4 4.66 <0.01 Tempo total ᴬᴮ Tratamento 4 6.72 <0.001 Geração 1 104.1 <0.001 tratamento:geração 4 6.71 <0.001 Quantidade ideal ᴬ Tratamento 2 24.94 <0.001 Geração 1 4.05 0.05 tratamento:geração 2 10.63 <0.001

ᴬ – Modelo completo; ᴮ – Modelo mínimo

Discussão

De acordo com todos os resultados obtidos neste trabalho, podemos sugerir que exista um número ideal de indivíduos por grupo, com melhor tempo de desenvolvimento. Em H. pearsoni, o tratamento de 20 lagartas mostrou-se mais vantajoso em relação aos demais, devido a baixa mortalidade nas duas gerações, menor tempo de desenvolvimento larval, maiores pesos de pupa e maior tempo de diapausa, favorecendo o período de emergência dos adultos, porém não afetando negativamente o tamanho dos adultos.

A interação entres os tratamentos e as gerações foi altamente significativa, mostrando que o tempo variou em cada tratamento em função das gerações. O efeito do tamanho do grupo pode ser visto somente em F1 em que os tratamentos T20 e T50 levaram menos tempo na fase larval. Dessa forma, pode-se sugerir que o efeito do inverno em F2 foi mais evidente sobre o tempo larval do que o efeito de tamanho de grupo.

Embora os resultados tenham mostrado diferenças no crescimento das lagartas (tamanhos das cápsulas cefálicas) em função dos tratamentos (exceto o 5º instar), o padrão difere entre os instares, ou seja, cada tratamento se comportou de forma diferente em cada instar. Dessa forma, mesmo que grupo menores tenham apresentado maiores tamanhos de cápsulas cefálicas em alguns instares, o tamanho da cápsula cefálica não se demonstrou eficaz para avaliar o efeito do tamanho de grupo. Com lagartas do mesmo gênero, H. caryae, foi constatado que lagartas no grupo com 10 indivíduos apresentaram menores taxas de crescimento (Lawrence, 1990)

Da mesma forma em que a agregação afetou o crescimento das larvas em H. pearsoni, em Coleoptera, um estudo utilizou larvas do besouro Dendroctonus micans, e o resultado indicou que as larvas cresceram mais em grupos com 10 indivíduos (grupo considerado médio) comparados aos demais (Storer et. al. 1997).

O tamanho do grupo concomitantemente com as gerações afetou o tempo apenas do sexto instar. Para este instar os tratamentos que apresentaram maiores tempo de instar foram os menores grupos (T3 em F1 e T1 em F2). Outros resultados de efeito de tamanho de grupo sobre o tempo de instar foram encontrados em lagartas de Chlosyne lacinia, em que as larvas apresentaram menor tempo no terceiro instar em grupos maiores (50 e 100 lagartas) em relação a grupos com 10 lagartas (Clark e Faeth, 1997; Inouye e Johnson, 2005). Também em lagartas de Dione juno juno, o efeito de tamanho do grupo sobre o tempo de desenvolvimento larval também foi observado, sendo menor em grupos maiores e maior em lagartas solitárias e em grupos pequenos (Boiça et. al., 1999; Bianchi e Moreira, 2005).

Mesmo que exista uma tendência de dispersão das lagartas com o decorrer dos instares em outras famílias, como em Chlosyne lacinia (Inouye e Johnson, 2005), em H. pearsoni esse padrão não pôde ser observado, pois as lagartas foram mantidas em confinamento e em condições de laboratório, sendo necessário realizar o mesmo experimento em campo e com mais réplicas anuais para verificar se existe alguma tendência para a espécie.

Para o tempo de pupa e tempo total do ciclo, os tratamentos e gerações tiveram influência sobre essas variáveis. Para os tratamentos, os grupos com 20 e 50 indivíduos em F2, tiveram um tempo maior em relação aos outros, elevando o tempo total da geração pela ocorrência de diapausa. Tais resultados foram mais evidentes nos grupos com 50 indivíduos. Dessa forma, pode-se sugerir que o maior tempo de pupa nestes tratamentos, traz algum tipo de benefício para os adultos, já que a diapausa é um processo programado em determinada fase do ciclo de desenvolvimento em que a atividade metabólica do inseto é diminuída drasticamente, aumentando o tempo de desenvolvimento em condições ambientais adversas para a espécie (Denlinger, et al., 2012; Kostal, 2006; Begon, et al., 2006).

O tamanho do grupo influenciou tanto o peso da pupa quanto o tamanho dos adultos de H. pearsoni. Os tratamentos com maior número de lagartas tiveram não só as pupas mais leves quanto as menores medidas de asa. Desta forma, para grupos mais numerosos, aparentemente, a agregação não foi

vantajosa para esses grupos. Para o notondontídeo Trichoplusia ni e para o afídio Acyrthosiphon pisum, os adultos de criações com maiores tamanhos de grupos tiveram a tendência de apresentar menores tamanhos (Henneberry e Kishaba, 1966; Parra, 2000). O efeito de tamanho de grupo afeta os benefícios da alimentação em grupo, determinando assim tanto o crescimento larval quanto o fitness dos adultos (Allen, 2010), apresentando uma relação positiva entre o crescimento larval e o tamanho das asas dos adultos de Lepidoptera (Nilsson e Forsman, 2003).

Sabe-se que o gregarismo é vantajoso para proteção contra predadores, facilitação alimentar, busca de recursos, entre outros (Clark e Faeth, 1997; Hunter, 2000; Klock e Chown, 1999; Reader e Hochuli, 2003). Porém, também pode não ser vantajoso para a espécie, uma vez que o tamanho do grupo pode causar competição por recurso e espaço, diminuindo a quantidade de alimento ingerido, podendo até mesmo ocorrer canibalismo (Joyner e Gould, 1985; Kakimoto, et. al., 2003). Em lagartas de Trichoplusia ni, foi verificado que a redução do peso da pupa foi inversamente proporcional a quantidade de lagartas, ou seja, quanto maior o grupo, mais leves eram as pupas (Henneberry e Kishaba, 1966). Em outras ordens, como observado em Musca domestica (Diptera), em posturas com maior quantidade de ovos, mais leves são as pupas (Spiller, 1966).

Em relação a mortalidade, os grupos numerosos (TMAX) da geração de inverno tiveram as menores taxas, demonstrando que a sobrevivência nesse período pode ter sido compensada pelo tamanho do grupo. Provavelmente as lagartas se beneficiaram do tamanho do grupo para manter a temperatura e assim diminuir a mortalidade do grupo. A termorregulação é um fator importante que afeta o desenvolvimento e mortalidade em lagartas, ajudando a manter a temperatura elevada e mais constante em períodos de condições desfavoráveis (Klok e Chown, 1999). Na geração de verão, onde as temperaturas são mais altas, pode ter havido um aumento da umidade e um superaquecimento nestes grupos, aumentando assim a mortalidade.

Dessa forma, podemos inferir que devido ao espaço limitado (potes plásticos e caixas plásticas) em que as lagartas foram criadas e a variação da mortalidade entre gerações, a termorregulação pode ter sido fundamental para a mortalidade nos tratamentos TMAX tanto no verão quanto no inverno. Lagartas de Dione juno juno também tiveram a mortalidade afetada em função da densidade larval, tanto nos tratamentos com poucas lagartas quanto nos instares iniciais, mostrando que a agregação pode ser importante para manutenção da temperatura nessas fases quanto para quebrar a barreira foliar da planta hospedeira (Bianchi e Moreira, 2005). Em larvas de Pryeria sinica, a mortalidade foi afetada pela densidade larval, mostrando que em grupos maiores a mortalidade foi menor (Tsubaki, 1981).

Neste estudo, conclui-se que as seguintes hipóteses foram corroboradas: i. O desenvolvimento foi afetado pelo tamanho do grupo, sobretudo os aspectos como mortalidade e tamanho dos adultos. Lagartas de H. pearsoni se mostraram eficazes para estudos relacionados a densidade larval e desenvolvimento. Considerando que estes resultados foram observados no período de um ano e por duas gerações, torna-se necessária a replicação e complementação dos experimentos inclusive para estudar os efeitos de tamanho de grupo desta e outras espécies. Desde os primeiros estudos relacionando o gregarismo com período larval, poucos estudos foram realizados com Lepidoptera, sendo mais comum com outras ordens de insetos (Allen, 2010). Tais estudos contribuem com informações sobre a biologia, ecologia e história natural dessas espécies, assim como suas interações com plantas hospedeiras, predadores e parasitoides, tornando possível a criação, conservação e/ou manejo de espécies.

Agradecimentos Agradecemos primeiramente a Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo fomento a esta pesquisa. Agradecemos também a Prof. Doutora Yasmini Antonini pelo laboratório onde foi realizada a pesquisa. A Universidade Federal de Ouro Preto pelo apoio e incentivo.

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