Desarrollo larval del manjuarí Atractosteus tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) (Pisces: Lepisosteidae) en condiciones de cultivo: Aspectos morfo-fisiológicos.
Item Type Theses and Dissertations
Authors Comabella Soto, Y.
Download date 29/09/2021 14:43:02
Item License http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/
Link to Item http://hdl.handle.net/1834/5384 UNIVERSIDAD DE LA HABANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MARINAS
Desarrollo larval del manjuarí Atractosteus tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) (Pisces: Lepisosteidae) en condiciones de cultivo: Aspectos morfo-fisiológicos.
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas.
Yamilé Comabella Soto
La Habana 2011
UNIVERSIDAD DE LA HABANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MARINAS
Desarrollo larval del manjuarí Atractosteus tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) (Pisces: Lepisosteidae) en condiciones de cultivo: Aspectos morfo-fisiológicos.
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas.
Autor: M.C. Yamilé Comabella Soto
Tutora: Dra. Tsai García Galano Asesora: Dra. Olimpia Carrillo Farnés
La Habana 2011
AGRADECIMIENTOS
Todo el que de una forma u otra ha estado cerca de mí en estos últimos seis años, puede entender que escribir los agradecimientos de esta tesis no es tarea fácil, pues han sido muchos los que me han brindado su ayuda incondicional para la elaboración y felizmente la culminación de este trabajo.
Quisiera comenzar agradeciendo a mi tutora Tsai García y a mi asesora Olimpia Carrillo, por toda la ayuda, los conocimientos y el ánimo brindado para continuar a pesar de los obstáculos. A ambas muchas gracias.
Al gran grupo del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata, y en especial a Andrés Hurtado, por abrirme las puertas para la realización de las experimentaciones, por acogernos como familia y por ayudarnos de la forma en que lo hicieron.
A Gabriel Márquez, de la UJAT, por su gran ayuda y por haberme iniciado en el tema de los lepisosteidos.
A Arlette Hernández, también de la UJAT, por su inmensa colaboración en el procesamiento de las muestras de histología y sus conocimientos, sin su participación no hubiese sido posible incluir tan importante información en esta investigación.
A los Doctores Roberto Mendoza y Carlos Aguilera, de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México, por permitirme procesar las muestras para el análisis de las enzimas digestivas y por la asistencia brindada por todos los del Grupo de Ecofisiología de dicha universidad.
A la Dra. Allyse Ferrara, de la Universidad Nicholls State, EEUU, por sus sugerencias y comentarios a los artículos relacionados con esta tesis que fueron de gran valía.
Al Dr. Yamaoka, de la Escuela de graduados de la Universidad de Kochi, Japón, por el apoyo logístico para la realización de esta investigación, así como también por sus sugerencias y comentarios.
A la Dra. María Elena Ibarra por haberme abierto las puertas cuando pensé que ya nada era posible, por su ejemplo y por su empeño de llevar a cabo esta utopía.
Al Consejo Científico del CIM y a los oponentes, por todas las sugerencias y señalamientos realizados, lo cual fue de mucha ayuda.
A los trabajadores del CIM y en especial al grupo de Acuicultura Marina que de una forma u otra se vincularon a esta investigación; a Jorge Angulo por facilitarme tanto las cosas cuando estaba en la recta final; a Raúl Cruz, Lalana y Manolo por brindarme su ayuda cada vez que lo necesité; al personal de administración del centro.
A Patricia y Julia por la exhaustiva revisión del documento final, sus señalamientos, y sugerencias. Por la gran ayuda brindada por ambas desde el inicio de este proyecto, miles de gracias.
A Yuriem por soportarme constantemente, por sus esfuerzos en la búsqueda de bibliografía al igual que Hanaina y por su amistad.
A todos los involucrados en la impresión de este trabajo (Aimée, Vilma, Melvis, Eduardo y Felipe).
Para el final he dejado a lo más preciado que tengo, mi familia.
A mis padres, a los que les dedico esta tesis, porque además del mérito en sí que tienen, han formado parte activa en este trabajo, a tal punto de convertirse en ocasiones imprescindibles, pues sin su intervención esto no hubiese llegado al final.
A mis hermanas Jeannett, Laritza, Yildian y Patricia, por saber que las tengo para las buenas y para las malas, por el apoyo y el ánimo brindado para seguir adelante.
A Javier, porque sin su ayuda en las experimentaciones me hubiese sido imposible llevar a cabo tan intenso trabajo, por darme fuerzas para continuar, por existir y por hacerme feliz.
A mis hijas, ambas engendradas durante la realización de este trabajo e involucrada una, Cynthia, en el arduo trabajo experimental y la otra, Maya, en el intenso proceso intelectual que conlleva la escritura de la tesis. A ambas por ser mi inspiración.
En fin, a todos los que han aportado su poquito, aunque no aparezcan explícitamente aquí,
Muchas Gracias
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A mis padres, por su ejemplo
______Síntesis
SÍNTESIS
El estudio de la etapa larval de Atractosteus tristoechus fue realizado a través del análisis morfo-fisiológico bajo condiciones de cultivo a 28oC, desde la eclosión hasta los 18 días después de eclosionadas (DDE) las larvas. Se identificaron y describieron tres etapas de desarrollo: adherida 0-3 DDE, de transición 4-10 DDE y libre nadadora 11-18 DDE. Las tasas de crecimiento fueron de 1,30 mm/d y 10,2 %/d, encontrándose una desaceleración en la segunda etapa que coincide con las mayores alometrías, lo que indica fuertes cambios morfogénicos. En esta etapa crítica es donde ocurre el agotamiento del vitelo y la transición de la alimentación endógena a exógena. A los 4 DDE el tracto digestivo está diferenciado en región bucofaríngea, esófago, estómago con sus tres zonas e intestino anterior y posterior; detectándose tempranamente la actividad de las proteasas ácidas antes que la de las alcalinas. La tercera etapa se caracteriza por un pronunciado incremento del peso debido a la absorción eficiente de los nutrientes externos como consecuencia de la maduración del tracto digestivo. En este momento se inicia la transición hacia juvenil y se evidencia en el crecimiento los efectos de la inanición y de diferentes dietas. Se evaluaron cinco dietas inertes de iniciación, encontrándose los mejores resultados en incremento en peso y supervivencia con la moina congelada. La integración de los resultados morfo-fisiológicos mostró que la ontogenia larval del manjuarí ocurre a través de cambios puntuales y rápidos de la mayoría de los elementos analizados, más que por una gradación continua, identificándose dos puntos críticos en el desarrollo larval de esta especie.
______Tabla de Contenidos
TABLA DE CONTENIDOS
Capítulo Pág. 1. INTRODUCCIÓN ------1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ------8 2.1 Sistemática de los lepisosteidos vivientes …………………………………... 9 2.2 Generalidades de los lepisosteidos …………………………………………. 10 2.2.1 Hábitat …………………………………………………………………. 11 2.2.2 Alimentación …………………………………………………………... 11 2.2.3 Reproducción …………………………………………………………... 12 2.2.4 Relación con el hombre e importancia ………………………………… 13 2.2.5 Situación actual de las poblaciones de lepisosteidos …………………... 13 2.3 Especificidades biológicas de Atractosteus tristoechus …………………….. 14 2.4 Estudios de la etapa larval de los lepisosteidos ……………………………... 16 2.5 Ontogenia en peces ………………………………………………………….. 18 2.6 Alimentación larval …………………………………………………………. 20 3. MATERIALES Y MÉTODOS ------22 3.1 Condiciones experimentales ……………………………..………………… 23 3.2 Muestreos …………………………………………………...……………… 26 3.3 Procesamiento de las muestras, mediciones y determinaciones…………….. 26 3.3.1 Análisis histológico ………………………………………………….. 28 3.3.2 Actividad enzimática del tracto digestivo ………………….………... 28 3.4 Análisis estadísticos ………………………………………………………… 30 4. RESULTADOS ------32 4.1 Descripción morfológica larval ……………………………………………... 33 4.2 Morfometría larval …………………………………………………………. 37 4.3 Crecimiento …………………………………………..…………………….. 39 4.4 Desarrollo histológico del tracto digestivo …………………………………. 43 4.5 Ontogenia de las enzimas digestivas …...…………………………………… 48 4.6 Alimentación larval ………...………………………………………………. 50 4.6.1 Dietas de iniciación …..………………………………………………... 50 4.6.2 Efectos de la inanición en la etapa larval …………………………….. 52 4.7 Generalización ……………………………………………………………… 55 ______Tabla de Contenidos
Capítulo Pág. 5. DISCUSIÓN ------56 5.1 Etapa 1 de desarrollo larval ………………………………….….…………... 57 5.2 Etapa 2 de desarrollo larval ………………………….…..……….…………. 59 5.3 Etapa 3 de desarrollo larval ……………………………..……..……………. 70 5.4 Generalizaciones ……………………………….…………..…….…………. 76 6. CONCLUSIONES ------80 7. RECOMENDACIONES ------82 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------84 9. ANEXO
1. INTRODUCCIÓN
1 ______Introducción
Conocido popularmente como manjuarí, Atractosteus tristoechus es una especie endémica de Cuba y el único representante de la Familia Lepisosteidae (Cuvier, 1825) en Las Antillas, cuyos integrantes no han experimentado cambios evidentes respecto a los registros fósiles que datan del Cretácico. De ahí la terminología de “fósiles vivientes” utilizada para hacer referencia a los mismos. Esta especie habita en ríos, esteros, canales y lagunas de agua dulce en la región sur occidental de Cuba, principalmente en la Ciénaga de Zapata, donde se cree existan las mayores poblaciones, y en la Isla de la Juventud (Vergara, 1992; Alfonso y Gutiérrez, 1995). Conjuntamente a esta restricción espacial que presentan, existen otros factores como son la pérdida de hábitats y las drásticas alteraciones ecológicas ocurridas en los mismos, que han sometido a la especie a un gran estrés ambiental. Es por ello que se infiere que muchas poblaciones de A. tristoechus han desaparecido o disminuido drásticamente en número (Prats, 2003). Estas alteraciones ecológicas incluyen desde la destrucción y transformación de los hábitats naturales, la contaminación de las aguas como consecuencia del desarrollo socioeconómico, la pesca indiscriminada tanto de la especie como de los peces que le sirven de alimento, hasta la introducción de peces exóticos con fines comerciales (Ej. Clarias sp.) que compiten por el alimento y por el espacio. De forma general, en la actualidad existen pocos estudios sobre los lepisosteidos al compararlos con los peces teleósteos, destacándose las investigaciones relacionadas con aspectos morfológicos (Simon y Wallus, 1989), fisiológicos (Luft et al., 1994; Farmer y Jackson, 1998), evolutivos (Dores et al., 1996; Suzuki et al., 1999; Hale et al., 2002; Kumar et al., 2005) y genéticos (Dores et al., 1997; Raabi et al., 1999; Barrientos- Villalobos y Espinosa, 2008), siendo minoritarios los estudios relacionados con el manjuarí.
La primera obra donde se hace referencia al manjuarí, es la publicada por Parra (1787), en la cual se hace una breve descripción del mismo y aparece un grabado de su aspecto externo, aunque su clasificación fue realizada por Bloch y Schneider (1801) nombrándolo Esox tristoechus. Posteriormente, en estudios realizados por Poey (1854) se describe a la especie, se presentan varios dibujos sobre su anatomía externa e interna y se destaca la función de la vejiga de los gases como alternativa para su respiración. Otros autores como
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De la Torre (1889), Suttkus (1963) y Wiley (1976) también aportaron a su descripción morfológica. No es hasta la década de los 60 del siglo XX, que aparecen nuevos trabajos exclusivamente relacionados con A. tristoechus, a pesar de que los estudios con las especies norteamericanas habían tenido una gran explosión en la primera mitad de ese siglo como los de Potter (1923), Raney (1942), Gunter (1945), entre otros autores. En 1965, Gómez de la Masa publicó un informe sobre las primeras crías de manjuarí logradas en estanques, que constituyó el primer reporte sobre la obtención de larvas de un lepisosteido en cautiverio. En los años setenta aparecen una serie de investigaciones relacionadas con la fisiología (Siret et al., 1976), la genética (Sánchez et al., 1977) y el cultivo artificial del manjuarí (León et al., 1978). En este último, se reporta por primera vez la obtención de larvas mediante desove inducido, además de brindar los primeros datos sobre el desarrollo embrionario, crecimiento y alimentación de larvas de lepisosteidos en cautiverio. Posteriormente aparecen las publicaciones de Coy y Hernández (1982) y la de Gajdúšek y Rubcov (1986) quienes analizaron los endoparásitos más frecuentes y la microestructura de las membranas del huevo, respectivamente. Finalmente en el año 2003, se realizó el estudio de la morfometría externa y de la morfología de las gónadas masculinas (Prats, 2003), y esta es la última referencia, de las pocas que existen, sobre las investigaciones realizadas durante más de dos siglos en A. tristoechus. Este desconocimiento existente de la biología del manjuarí así como de la situación de sus poblaciones naturales, es la causa principal por la cual su estatus no ha sido evaluado por CITES (Convention on International Trade in Endangered Species) ni por la IUCN (International Union for Conservation of Nature) (Ibarra y Cotazo, 2003). Los primeros pasos dados para el manejo de esta especie fueron la creación del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena en la Ciénaga de Zapata en 1990, dedicado a la reproducción ex situ y a la obtención de juveniles que principalmente se comercializan como peces ornamentales; y la prohibición de su captura (Decreto Ley 164 del Ministerio de la Industria Pesquera). Además, se le otorgó el estatus de vulnerable en el taller de Conservación, Análisis y Manejo Planificado realizado en La Habana en 1999, basándose fundamentalmente en los factores de amenaza anteriormente descritos y en la escasa información que sobre el grupo se tenía (Pérez et al., 1999). Sin embargo, se hace necesario
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desarrollar planes de manejo y estrategias para proteger la existencia y supervivencia de estos animales en el archipiélago, por lo que es imprescindible ampliar el marco de las investigaciones que respondan a estos propósitos. Aunque la descripción de la etapa larval y de las tasas de crecimiento de los lepisosteidos como Lepisosteus osseus, L. platostomus, L. oculatus, Atractosteus spatula y A. tropicus aparecen publicadas (Netsch y Witt, 1962; Pearson et al., 1979; Yeager y Bryant, 1983; Simon y Wallus, 1989; Simon y Tyberghein, 1991; Long y Ballard, 2001; Aguilera et al., 2002); aún la del manjuarí no se ha realizado, cuando esta es la base para cualquier tipo de análisis futuro que se pretenda hacer. Durante la primera fase de vida de un pez, las larvas sufren procesos muy complejos de morfogénesis y diferenciación, lo que incluye cambios en las relaciones morfométricas, cambios morfo-fisiológicos en la musculatura y en los sistemas de órganos internos, así como cambios óseos y en la conducta (Webb, 1999). Dentro de estas transformaciones, las relacionadas con el sistema digestivo requieren de especial atención para el entendimiento de los procesos de ingestión, absorción y asimilación de los nutrientes, pues es el primer paso para determinar la posibilidad real del mantenimiento en cautiverio de las crías (Divakaran et al., 1999; Fountoulaki et al., 2005). Otros de los elementos que igualmente hay que tener presente por su influencia en el crecimiento, la supervivencia y la eficiencia de alimentación de las larvas de peces tanto de cultivo como del medio natural, son los factores abióticos, como la temperatura de incubación (Teletchea et al., 2009), la salinidad (Mihelakakis y Yoshimatsu, 1998), los niveles de oxígeno (Hanna et al., 2008) entre otros; así como la disponibilidad de alimento (Shoji et al., 2002; Bolasina et al., 2006; Kling et al., 2007). Todos ellos pueden afectar además el metabolismo, la actividad e incluso la estructura y calidad del desarrollo general de las larvas (Saka et al., 2005). Una vez entendida la morfo-fisiología digestiva en las larvas y sus requerimientos abióticos y nutricionales, se tienen los cimientos para el cultivo de la etapa más sensible de todo su ciclo de vida. Para perfilar dicho sistema, se hace imprescindible la formulación de dietas y de esquemas de alimentación adecuados que garanticen, en un alto porcentaje, la supervivencia y el crecimiento de las larvas. El alimento se convierte así, en el punto neurálgico de cualquier sistema de cultivo. Además de ser su composición, sus características físicas y la frecuencia y ración con la que se ofrece, los que determinan la
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calidad de las larvas, es el que establece la viabilidad económica del proceso, pues el mayor costo del mismo está representado por los grandes gastos que significa la alimentación, principalmente de las larvas. Es por ello que la búsqueda de dietas adecuadas debe considerar tanto las particularidades nutricionales de la especie en cuestión, como la rentabilidad económica y las posibilidades tecnológicas con las que se pueden contar. El establecimiento de sistemas de cultivos de peces, estén estos amenazados o no, ha constituido una vía eficaz para la reducción de la presión de pesca sobre los mismos, y en muchas ocasiones se ha convertido en una opción efectiva para la repoblación de áreas naturales (Leitão et al., 2011). Es por ello que se avizora el cultivo del manjuarí como un posible paliativo a la situación actual que presentan sus poblaciones. Tanto la metodología existente desde la década de los 90 en la Ciénaga de Zapata para el desove y cultivo de larvas y juveniles, así como los antecedentes de los cultivos a gran escala que actualmente existen con las otras dos especies del género Atractosteus; sientan las bases para el perfeccionamiento de un sistema que puede ofrecer la posibilidad tanto para la explotación comercial con fines ornamentales, como para el establecimiento de programas de repoblación en áreas naturales. Dado el valor faunístico del manjuarí, por ser endémico, por su importancia científica, económica y social, la aparente situación actual de vulnerabilidad de sus poblaciones y encontrándose una problemática cuya solución requiere de una base teórica que sirva como punto de partida en la elaboración de medidas eficaces para su conservación y manejo; se proponen la siguiente hipótesis y objetivos de trabajo.
HIPÓTESIS La caracterización morfo-fisiológica de las larvas de manjuarí (Atractosteus tristoechus) mantenidas en condiciones de cultivo, permite encontrar los puntos críticos del desarrollo de esta etapa.
Objetivo general: Evaluar morfo-fisiológicamente la etapa larval del manjuarí (Atractosteus tristoechus) en condiciones de cultivo.
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Objetivos específicos: 1. Describir los principales cambios morfológicos y morfométricos durante la etapa larval. 2. Describir histológicamente el desarrollo del tracto digestivo de las larvas. 3. Cuantificar la actividad de las enzimas digestivas durante la ontogenia larval. 4. Evaluar cinco dietas inertes de iniciación. 5. Determinar el efecto de la inanición en la supervivencia y crecimiento de las larvas.
La novedad científica de esta investigación se puede resumir de la siguiente manera: - Por primera vez para los lepisosteidos se aplica el análisis alométrico del crecimiento de las larvas. - Por primera vez se describe detalladamente la morfología y la morfometría de la etapa larval de A. tristoechus. - Por primera vez para la especie se describe el desarrollo ontogénico del tracto digestivo desde el punto de vista histológico y fisiológico a través de la actividad de las enzimas digestivas. - Por primera vez para la especie A. tristoechus se evalúa el efecto de la inanición y de diferentes dietas inertes de iniciación sobre la supervivencia y crecimiento de las larvas. - Se ofrecen resultados bioquímicos e histológicos como ejemplos novedosos a aportar a la “teoría de la ontogenia por saltos” formulada por Balon (1985), la cual se basa esencialmente en cuestiones morfológicas externas y conductuales.
La importancia teórica fundamental de la tesis consiste en que se caracteriza la etapa larval de A. tristoechus y la influencia que diferentes tipos de alimento puede ejercer sobre el crecimiento y la supervivencia de las mismas; aportándose conocimientos básicos de la anatomía y fisiología de esta especie con el fin de ganar un mayor entendimiento del desarrollo biológico durante esta etapa. Se indica la existencia de dos puntos críticos en el desarrollo larval que constituyen referencias obligadas para la comprensión y el manejo de esta fase del ciclo de vida del manjuarí.
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La importancia práctica de la tesis viene dada porque la definición de las etapas de desarrollo y los puntos críticos de la fase larval, así como los resultados obtenidos en la caracterización de los aspectos relacionados con la alimentación durante las primeras etapas y el manejo de las mismas, permitió perfeccionar la metodología del cultivo y así optimizar la cría de las larvas de esta especie en el Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional de la Ciénaga de Zapata. Constituye además, un importante aporte para la concepción y ejecución de planes de manejo y conservación que se pretendan implementar en el país, sirviendo también como referencia para estudios futuros en esta especie.
Parte de los resultados de esta tesis fueron publicados en revistas internacionales arbitradas (Fish Biology and Biochemistry (2006) y Zoological Science (2010)) y presentados en cinco ponencias orales y un cartel, en tres eventos internacionales auspiciados por la Red Internacional para la Investigación y el Manejo de los Lepisosteidos.
El documento está conformado por 83 páginas, distribuidas en Introducción, Revisión Bibliográfica, Materiales y Métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones y Recomendaciones. El documento consta además de los acápites Tabla de Contenidos, Síntesis, Referencias Bibliográficas (290) y Anexo.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
8 ______Revisión Bibliográfica
Los lepisosteidos constituyen un grupo de peces muy particular, pues la prevalencia de varias de sus características primitivas los separa del resto de los teleósteos. Suttkus (1963) señaló varios de sus rasgos distintivos que sin duda contribuyeron a su supervivencia durante millones de años, entre los que se encuentran: su rígida cubierta protectora proporcionada por escamas romboidales articuladas entre sí por sus bordes; la vejiga de los gases altamente vascularizada que los habilita con la capacidad de respirar aire atmosférico; el cono arterial del corazón con ocho hileras transversales provistas con cuatro a ocho válvulas cada una, lo cual los dota de una capacidad cardiaca particular; la presencia de vértebras completamente osificadas y opistocélicas, una conformación única entre los peces vivientes que les permite realizar movimientos rápidos y precisos indispensables en el momento de atacar a sus presas; así como la existencia de una válvula espiral en el intestino posterior que aumenta su capacidad digestiva, convirtiéndolos en depredadores eficaces. Este grupo se originó a finales del período Pérmico, hace unos 180 millones de años, e incluía varias líneas evolutivas que se desarrollaron durante el período Triásico y se expandieron notablemente hasta fines del Jurásico junto con los peces cartilaginosos (Young, 1985). Sin embargo, en el Cretácico su representatividad disminuyó marcadamente al aparecer los peces teleósteos, los que incrementaron el número de especies y variedad de formas, hasta sustituir gradualmente a los ganoideos y dejarlos reducidos a las pocas especies de la actualidad (Wiley, 1976). Se reconocen restos fósiles de nueve especies de lepisosteidos, encontrados en Norteamérica (Cretácico a Reciente), Europa (Cretácico a Oligoceno), África (Cretácico) e India (Cretácico). Los representantes actuales, restringidos a siete especies localizadas en Norteamérica, Centroamérica y Cuba, aparecieron en el período Cretácico tardío (Era Mesozoica) hace unos 130 millones de años y exhibieron su máximo éxito ecológico en el período Paleoceno temprano (Era Cenozoica) hace 75 millones de años (Wiley, 1976; Smith, 1981; Hedges, 1996).
2.1 Sistemática de los lepisosteidos vivientes La clasificación sistemática de este grupo ha sufrido numerosos cambios desde la segunda mitad del siglo XVIII hasta la actualidad, marcado por un gran número de sinonimias y de reconocimientos de géneros diferentes. El primer lepisosteido fue descrito por Linnaeus
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(1758) como Esox osseus (actual Lepisosteus osseus), convirtiéndose en el precursor en la clasificación sistemática de este grupo. Ya en 1801, Bloch y Schneider describieron al segundo lepisosteido, Esox tristoechus (actual Atractosteus tristoechus), y en 1803 Lacépède estableció el género Lepisosteus (Prats, 2003). Posteriormente Rafinesque (1818, 1820) agregó otros géneros al grupo, Litholepis, Sarchirus, Cylindrosteus y Atractosteus; y Cuvier en 1825 agrupó las especies existentes en una familia, Lepisosteidae. Durante la continuación del siglo XIX y el XX se describieron las especies actuales, destacándose los trabajos de Agassiz (1834, 1850), Girard (1858), Moore (1957), Suttkus (1963) y otros muchos citados en el estudio de Wiley (1976). Es este autor quien propuso la definición de dos géneros bien establecidos, Lepisosteus y Atractosteus, para la familia Lepisosteidae.
En el género Lepisosteus (Lepis =escama, osteus =ósea) se encuentran: L. osseus (Linnaeus, 1758) - Longnose gar L. platostomus (Rafinesque, 1820) - Shortnose gar L. oculatus (Winchell, 1864) - Spotted gar L. platyrhincus (De-Kay, 1870) - Florida gar Ubicados todos en el Este y centro de Norteamérica.
En el género Atractosteus (Atractos =ahusado, referido a la forma del cuerpo, osteus =ósea) se encuentran: A. tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) – manjuarí-Cuban gar (Cuba) A. spatula (Lacépède, 1803) – catán- alligator gar (Estados Unidos y Centroamérica) A. tropicus (Gill, 1863) – pejelagarto - tropical gar (Centroamérica)
2.2 Generalidades de los lepisosteidos Las características de la familia Lepisosteidae son las siguientes: cuerpo alargado, subcilíndrico, con escamas ganoideas oblicuamente imbricadas que forman una coraza protectora pero que al mismo tiempo permiten curvaturas corporales extremas (Gemballa y Bartsch, 2002); mandíbulas alargadas, la superior proyectándose sobre la inferior, premaxilas formando la mayor parte del margen de la mandíbula superior, maxila transversalmente dividida en varias piezas (Kammerer et al., 2004); mandíbula con una
10 ______Revisión Bibliográfica
serie exterior de dientes pequeños, seguida por una o dos series de dientes mayores aguzados, dientes presentes también en el vómer, palatinos y faringe; lengua edentada, corta, emarginada, anteriormente libre; ojos pequeños; narinas cerca del final de la mandíbula superior; espiráculos ausentes; pseudobranquias presentes; cuatro arcos branquiales, con la abertura tras el último; branquiespinas cortas; “pulmón” presente, funcional; aleta dorsal corta, alta, posterior, más o menos opuesta a la anal, que es de forma similar; cola heterocerca abreviada y redondeada, con filamento posterior en los juveniles; ventrales aproximadamente equidistantes de las pectorales y la anal; pectorales y ventrales moderadas, con pocos radios (Villa, 1982).
2.2.1 Hábitat Los lepisosteidos se encuentran en ríos, esteros, canales y lagunas de aguas dulces, gustan de la vegetación y aguas tranquilas, siendo peces de costumbres poco activas (Poly, 2001). Algunas especies se han visto en aguas salobres o marinas a lo largo de la costa del Golfo de México (Goodyear, 1966; Bussing, 1987; Robinson y Buchanan, 1988) indicando su tolerancia a determinadas salinidades.
2.2.2 Alimentación De manera general los lepisosteidos adultos se alimentan principalmente de peces, crustáceos (Potter, 1923; Toole, 1971; Reséndez y Salvadores, 1983) y artrópodos (Goodyear, 1967), aunque también se han encontrado eventualmente restos de aves en sus contenidos estomacales (Raney, 1942). Las preferencias alimentarias dependen de varios factores, entre los que se encuentran la disponibilidad del alimento, la etapa de desarrollo y la especie. Holloway (1954), Netsch (1964) y Echelle y Riggs (1972) reportaron que en la etapa juvenil de L. osseus, L. oculatus, L. platyrhincus y L. platostomus prefieren insectos como las larvas de mosquitos, microcrustáceos y peces, pero que con el desarrollo de los mismos se muestra una mayor preferencia por los peces en la dieta. Los escasos organismos bentónicos encontrados en los contenidos estomacales y la abundancia de pelágicos como Gambusia, suponen que su alimentación se realiza principalmente en la superficie (Echelle y Riggs, 1972). Se ha sugerido que este tipo de alimentación tiene cierta relación con su capacidad para respirar aire atmosférico, un proceso que ocurre frecuentemente durante el
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verano en las aguas poco profundas de las lagunas. Por otra parte, Holloway (1954) mencionó que la alimentación de L. platyrhincus se lleva a cabo principalmente a la caída del sol, durante las noches o en los días nublados. Esto coincide con lo observado por Reséndez y Salvadores (1983), quienes en función del grado de digestión de los contenidos estomacales de A. tropicus y de la hora de captura, dedujeron que estos animales eran de hábitos nocturnos. De manera similar, Goodyear (1967) mencionó que L. osseus es un depredador activo en aguas abiertas, alimentándose preferentemente en la noche. La estrategia de depredación de los lepisosteidos consiste en la ausencia de movimientos innecesarios, permaneciendo inmóviles hasta que la presa se encuentra a su alcance y en ese momento con un movimiento lateral muy rápido de la cabeza atrapa súbitamente de un mordisco a la misma (Suttkus, 1963; Netsch, 1964). A pesar de los numerosos y agudos dientes con que se encuentran dotados estos animales, en los contenidos estomacales prácticamente no se hallan individuos en pedazos o mordidos, lo que sugiere que los dientes son utilizados principalmente para evitar que las presas escapen.
2.2.3 Reproducción Los lepisosteidos presentan un comportamiento poco gregario, sin embargo, durante la temporada de reproducción, se les puede encontrar formando grupos de hasta más de 20 al mismo tiempo (Holloway, 1954, Alemán y Contreras, 1987). Suttkus (1963) mencionó que cuando las hembras van a desovar encabezan los grupos de reproductores y se aproximan a las orillas, haciéndose acompañar de uno a cuatro machos. Éstos con el hocico presionan la región abdominal de la hembra hasta que se inician los movimientos bruscos típicos de la ovoposición, sincronizado con la expulsión del esperma de los machos. Ocurre así la fecundación de los óvulos y la formación de los huevos que se adhieren a la vegetación sumergida por estar cubiertos de una sustancia pegajosa (Contreras y Alemán, 1987). Estos huevos son relativamente grandes, hasta 4 mm, de color verdoso y son tóxicos, por lo que causan graves daños sin son ingeridos por aves o mamíferos (Netsch y Witt, 1962). Los desoves ocurren habitualmente en las horas más frescas (Pérez-Sánchez, 1995) y las épocas de desove típicas son durante la primavera y principios del verano (García de León et al., 2001; Love, 2004). Es en este período donde se incrementan las lluvias, por lo que crecen los niveles de aguas en las zonas inundables, la maleza sirve como sustrato para los
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huevos y aumentan los niveles de zooplancton, lo que asegura el alimento para las futuras larvas (Pérez-Sánchez, 1995). Los embriones permanecen pocos días en incubación, nace una larva que presenta un órgano adhesivo con el que se fija a los objetos sumergidos hasta que comienza la natación y la búsqueda de alimentos (Mendoza et al., 2004b).
2.2.4 Relación con el hombre e importancia Este grupo de peces ha sido considerado en muchas regiones como un pez desagradable, depredador y destructivo, que afecta la pesca de interés comercial o deportiva por sus hábitos alimenticios (Holloway, 1954). Esto ha motivado que en muchas ocasiones y áreas se haya exhortado continuamente su erradicación de los hábitats naturales, existiendo asociaciones que reúnen a los interesados en la pesca de los lepisosteidos, sobre todo en los Estados Unidos. En el caso particular de Centroamérica y el Caribe, los lepisosteidos se consideran de importancia comestible, ocupando un lugar importante en la dieta de varias poblaciones humanas, como ocurre en la región de Tabasco, México (León et al., 1978; Contreras y Alemán, 1987). Por estas razones, es que se ha incrementado el cultivo de la especie existente en esta área geográfica (A. tropicus) con marcados volúmenes productivos (Márquez, 2004). Igualmente han tenido cierta importancia cultural, como en Norte y Centroamérica donde los indios tradicionalmente empleaban las escamas ganoideas y los huesos para confeccionar puntas de flecha, instrumentos para sus rituales y ornamentos (Agogino y Shelley, 1987).
2.2.5 Situación actual de las poblaciones de lepisosteidos Debido a la sobrepesca en algunas zonas, ya sea para fines comerciales o deportivos, y a la pérdida de las áreas pantanosas donde habitualmente se localizan los lepisosteidos, numerosas poblaciones se han visto afectadas. Durante años las zonas pantanosas han sido a menudo consideradas como indeseables, ya que contienen agua relativamente estancada y porque se consideran como un obstáculo para la navegación y la construcción de caminos (Mendoza et al., 2004a). Por estas razones, muchas de ellas fueron rellenadas para construir caminos, desarrollar zonas de cultivo y asentamientos poblacionales, lo que ha arruinado de
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manera crítica las zonas de permanencia y desove de estas especies. Desde hace poco tiempo es que estas áreas han ocupado el lugar ecológico que realmente tienen como reservorio de una riqueza incalculable de la flora y la fauna. Estas zonas, por sus características hidro-geográficas, también se han visto afectadas por la contaminación, la cual está considerada como otro factor negativo que afecta a las poblaciones de lepisosteidos (Hartley et al., 1996). Desafortunadamente, los estudios poblaciones sobre los aspectos básicos con interés en la conservación de este grupo se desconocen o apenas han sido explorados, lo cual dificulta la determinación con precisión del estatus de cada especie y del tipo de medidas específicas que se requieren para protegerlas. No obstante, se ha empleado el principio precautorio en muchas de ellas, como en los Estados Unidos, donde A. spatula, L. platostomus, L. oculatus y L. osseus han sido declaradas en el estatus de peligro en Kentucky, amenazada en Illinois y necesaria de manejo en Tennessee (Simon y Wallus, 1989). Por su parte, la especie A. spatula fue considerada potencialmente en riesgo considerable de desaparecer en gran parte del Golfo de México (Mendoza et al., 2004a) y A. tropicus fue incluida en Costa Rica dentro de la lista de especies con poblaciones reducidas (Mora et al., 1997). En el caso de A. tristoechus, éste fue considerado como primariamente amenazado por Buide et al. (1974) y como vulnerable por Pérez et al. (1999), basándose fundamentalmente en los factores de amenazas y la escasa información que se tenía sobre la especie.
2.3 Especificidades biológicas de Atractosteus tristoechus Al igual que el resto de las especies vivientes de lepisosteidos, la posición taxonómica del manjuarí ha estado sometida a diferentes sinonimias en la categoría de orden, familia, género y especie (Bloch y Schneider, 1801; Poey, 1854; Suttkus, 1963; Gómez de la Maza 1965; Alayo 1973, Wiley, 1976). La ubicación taxonómica de la especie según Nelson (2006) es: Phylum Chordata Subphylum Craniata Superclase Gnathostomata Clase Actinopterygii Subclase Neopterygii
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Orden Lepisosteiformes Familia Lepisosteidae Género Atractosteus Especie Atractosteus tristoechus (Bloch & Schneider, 1801)
La etimología indica: Atractosteus (del griego atractos = ahusado, referido a la forma del cuerpo y del latín osteus = hueso, referido a la escama) y tristoechus (del latín tri = tres y del griego steachos = hileras, filas; referido a las tres hileras de dientes presentes en las mandíbulas, dos en la superior y una en la inferior) (Prats, 2003). El nombre común de manjuarí proviene de los primeros pobladores de Cuba que lo llamaron “manchuari” debido a sus dientes abundantes (Cosculluela, 1965). En cuanto a las características morfológicas externas del adulto, son similares a las del resto de los lepisosteidos, con la excepción de que carece de manchas en la región de la cabeza, las aletas y el dorso del cuerpo (Poey, 1854; Wiley, 1976). La coloración general es de parda oscura a gris verdosa, más clara en el vientre. Presentan un cuerpo alargado, cilíndrico, cubierto por las escamas ganoideas y la línea lateral es completa y recta sin que difieran las escamas en esta zona. La cabeza es deprimida dorso-ventralmente y protegida por placas osificadas. La boca es terminal y grande, con mandíbulas armadas con tres hileras de numerosos dientes cónicos y afilados, siendo la mandíbula superior más prolongada que la inferior. Además, aparecen dientes relacionados con el vómer, palatinos y faringe (Parra, 1787; Poey, 1854; Gómez de la Maza 1965, Alayo, 1973). Difiere de los otros representantes del género por las características de los huesos craneales y el número de los rastrillos branquiales (Suttkus, 1963; Wiley, 1976). Posee fuertes hábitos carnívoros, por lo que se alimenta de animales acuáticos de todo tipo, de preferencia peces, además de pequeños reptiles, crustáceos, anfibios y aves acuáticas (Poey, 1854; Vergara, 1992). Los endoparásitos más frecuentes fueron descritos por Pérez (1936), Barus y Moravec (1967) y Coy y Hernández (1982) e incluyó a especies como: Proteocephalus manjuariphilus, P. singularis, Posthodiplostomulum sp., entre otros. En vida natural es frecuente la presencia de gran número de ectoparásitos, dentro del que se destaca el género Argulus sp., conocido como piojos acuáticos (Hurtado et al., 1994).
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2.4 Estudios de la etapa larval de los lepisosteidos La mayoría de las investigaciones realizadas en este grupo de peces se ha centrado en las poblaciones naturales de organismos adultos (Johnson y Noltie, 1996, 1997; Ferrara e Irwin, 2001; Love, 2002). Sin embargo, existen pocos estudios de la etapa larval, los cuales se han enfocado esencialmente en la descripción morfológica y morfométrica de algunas estas especies (Netsch y Witt, 1962; Pearson et al., 1979; Simon y Wallus, 1989; Long y Ballard, 2001; Aguilera et al., 2002). Estas descripciones morfológicas se han basado principalmente en las características generales de la pigmentación, de la conducta, en la aparición de determinadas estructuras y en el establecimiento de intervalos de longitud total con la relación de los diferentes caracteres morfométricos medidos dentro de cada uno de ellos. Simon y Wallus (1989) y Simon y Tyberghein (1991) por ejemplo, a través del análisis de larvas coleccionadas en museos, establecieron seis intervalos de talla a través de la medición de 81 ejemplares para Lepisosteus osseus (5,9-10,9; 11,4-15,6; 16,2-19,6; 20,1- 23,9; 24,1-26,9; 27,1-30,2 mm); seis intervalos con 31 individuos para L. oculatus (9,8- 11,2; 13,6-17,6; 20,2-23,9; 24-26,9; 27,2-35,9; 51,8); dos intervalos para L. platostomus por solo contar con dos individuos (26,5; 38,0) y cuatro intervalos para Atractosteus spatula (14,9; 20,4-24,0; 65,8; 94,6-103) basándose en este caso solamente en seis animales. Posteriormente Aguilera et al. (2002) reevalúa esta especie y mediante el empleo del análisis de discriminante, constituyen seis intervalos de talla (6,6-8,8; 9,2-13,5; 14,2- 19,2; 19,5-22,5; 23,0-32,0; 34,8-50,0) a través de la medición de 62 individuos. Este mismo tipo de análisis lo aplicaron en A. tropicus, formando igual número de intervalos de tallas (6,8-9,0; 9,6-12,1; 12,5-13,8; 14,5-21,8; 22,0-36,0; 38,3-60,3) empleando para ello 70 individuos. Con relación al establecimiento de estadios o etapas dentro de la fase larval, solamente aparecen los trabajos de Yeager y Bryant (1983) con L. osseus, quienes definieron las fases de prolarva (8,8-12,4 mm LT) y postlarva (23,5-27,7 mm LT) y los de Aguilera et al. (2002), quienes empleando los mismos intervalos de longitud total designaron el término de estadios de desarrollo del I al VI para A. spatula y A. tropicus. Como se evidencia, en ninguno de estos estudios se definieron etapas de desarrollo larval a través de la integración de caracteres morfológicos, morfométricos y conductuales, ni fue aplicado el análisis alométrico del crecimiento larval.
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La alometría se define como el crecimiento relativo diferencial (Gisbert y Doroshov, 2006), y muchos peces la exhiben durante su período larval (Mello et al., 2006). Estos patrones de crecimiento alométrico reflejan las prioridades morfo-anatómicas de acuerdo con su importancia en las funciones vitales primarias que garantizan una supervivencia adecuada en las larvas (Sala et al., 2005; Choo y Liew, 2006). En la última década, ha existido un incremento en este tipo de análisis debido a su uso en biología pesquera y la acuicultura, apareciendo estudios en espáridos (Kouttouki et al., 2006; Cobán et al., 2009), esturiones (Gisbert y Doroshov, 2006), peces gatos (Geerinckx et al., 2008; Huysentruyt et al., 2009) y loricaridos (Schmidt, 2001). Motivadas por el vacío de información que se tenía y por el desarrollo del cultivo de algunas de sus especies, como el catán y el pejelagarto, las universidades mexicanas (Universidad Juárez Autónoma de Tabasco y la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey), junto con otras universidades norteamericanas, iniciaron un grupo importante de investigaciones encaminadas a la caracterización de las diferentes fases del desarrollo embrionario y larvario, la comparación del crecimiento de las larvas de ambas especies, el diseño de dietas adecuadas, así como estudios histológicos, enzimáticos, endocrinológicos, y sobre marcadores bioquímicos (Mendoza y Aguilera, 2001; Mendoza et al., 2002 a,b; Márquez, 2004; de la Cruz, 2008). Dentro de estos aspectos, se potenciaron aquellas investigaciones relacionadas con la alimentación de las larvas y las condiciones para su cría en cautiverio, pues estos son elementos claves para el éxito de cualquier sistema de cultivo que se pretendiera establecer. Aparecen así estudios relacionados con los efectos de la temperatura y la densidad de siembra en el desarrollo de los embriones y el crecimiento de las larvas (Márquez, 1998; Méndez, 2004); la frecuencia y el horario de alimentación (Zapata, 2003); la determinación de los requerimientos nutricionales (Jesús, 2008) y del punto de no retorno en larvas (Hernández, 1999); la evaluación de diferentes tipos de dietas de iniciación como alimento vivo, artemia congelada, piensos comerciales y formulaciones semipurificadas (Escobar, 2006; Márquez et al., 2006; Mendoza et al., 2007), entre otros. Este último aspecto ha tomado especial atención, pues para establecer cualquier método de cultivo, es imprescindible encontrar aquellas dietas que satisfagan los requerimientos de la especie, pero que además haga factible tanto práctica como económicamente la producción
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de las crías. Es por ello que el empleo de alimento inerte motivó el desarrollo de numerosas investigaciones en el catán y el pejelagarto, lográndose buenos resultados con la utilización de piensos tanto comerciales como formulados, en el crecimiento y la supervivencia de las larvas desde su primera alimentación (Mendoza et al., 2002a; Márquez et al., 2006). Estos avances han permitido el perfeccionamiento en el diseño y operación de las técnicas de cultivo (González, 2006) con el consiguiente incremento substancial de la producción de crías (Rodríguez, 2008), viéndose como una posibilidad real la utilización de estas especies con fines comerciales y la implementación de programas de repoblación de las áreas naturales afectadas.
2.5 Ontogenia en peces La ontogenia es un proceso formativo que tiene lugar en todas las especies a una tasa y ritmo específico, provocando cambios anatómicos, fisiológicos, conductuales y ecológicos (Hensel, 1999). En el caso de los peces puede seguir tres modelos: la ontogenia indirecta, en la que aparece el embrión, la larva, el juvenil y el adulto; la ontogenia transitoria, en la que no aparece el estadio de larva, sino de alevín, el cual es considerado una larva vestigial; y la ontogenia directa en la que directamente el embrión pasa a juvenil (Balon, 1990). La etapa larval está considerada como la más vulnerable de todas las etapas comprendidas en el ciclo de vida de los peces. La misma está caracterizada por altas mortalidades y por la existencia de numerosas estructuras temporales específicas, que con posterioridad deben ser remodeladas a través de procesos metamórficos. La larva es por tanto, una forma vegetativa transitoria, que a menudo ocupa un nicho completamente diferente al del adulto. Es por eso que el patrón de ontogenia directa, está considerado un tipo de desarrollo más especializado y ventajoso al eliminar la etapa vulnerable, que implica además un costo energético dado por las remodelaciones necesarias para el paso a juvenil (Balon, 1990). Definir el final de la etapa larval y el inicio del período juvenil en los peces que tienen ontogenia indirecta, resulta complejo. Para eso es necesario combinar los análisis de crecimiento relativo con descripciones externas y funcionales, lo cual permite definir el momento del final de la metamorfosis y el paso a la etapa juvenil (Gozlan et al., 1999).
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Existen dos puntos de vista relacionados con el proceso de ontogenia en peces. Algunos autores consideran que éste es gradual y contínuo y otros que es por saltos (Kovac y Copp, 1996). La teoría de la ontogenia por saltos formulada por Balon (1985) ha sido ampliamente reconocida. La misma sugiere que el desarrollo se presenta como una sucesión de estados estabilizados que son más largos (denominados pasos), alternando con intervalos menos estables que son más cortos (denominados umbrales). Kovac (2002) consideró que estos saltos en la ontogenia vienen dados por procesos de sincronía y asincronía. El primero garantiza el desarrollo de estructuras necesarias para que nuevas funciones aparezcan en el momento adecuado, y el segundo, el desarrollo de individuos que alcancen el próximo estado de estabilidad de forma prematura. Fallos en esta sincronía y asincronía puede tener consecuencias fatales en el embrión en desarrollo. El sincronismo opera a nivel de grupos de estructuras, de forma tal que las mismas estén listas simultáneamente, proveyendo al organismo con nuevas funciones (habilidades) e interacciones asociadas con el próximo estado estabilizado superior (Kovac, 2002). Por ejemplo, las larvas recién eclosionadas poseen una aleta media bien desarrollada, así como pequeñas aletas pectorales inmóviles y horizontales. Sin embargo, tanto la capacidad natatoria como el incremento de la actividad, requieren de un buen desarrollo de los órganos de los sentidos y de un sistema respiratorio cada vez más eficiente. Durante esta etapa, las aletas pectorales aumentan su tamaño y tornan su base verticalmente y es que comienzan a ser móviles. Al incrementar los latidos cardiacos y perfeccionarse el sistema respiratorio, ya pueden nadar horizontalmente y cambiar de dirección cuando sea necesario. La sincronía armoniza el desarrollo del organismo completo en un corto intervalo de tiempo, pasando el embrión de un estado de estabilidad caracterizado por una conducta pasiva, al próximo estado de estabilidad caracterizado por el nado activo y controlado. Este cambio tiene que ser rápido, para que el organismo siga funcionando durante la transición, el cual representa un estado menos estable (Kovac, 2002). Otro ejemplo se evidencia cuando el agotamiento del vitelo avanza. El bajo nivel de las fuentes nutritivas y de energía no permiten mantener al embrión en el estado estable de forma segura y lo fuerza a prepararse para la transición hacia el otro estado de estabilización. Para esta transición es necesario haber adquirido un nado activo y
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controlado, acompáñado de otras nuevas funciones y habilidades que permitan al embrión explotar fuentes exógenas para sobrevivir (Hunt Von Herbing y Boutilier, 1996). Cada transición tiene que asegurar que el organismo adquiera nuevas funciones y habilidades y así incremente sus posibilidades de supervivencia (Kovac, 2002). Por lo tanto, el organismo como un sistema auto-organizado, resiste la desestabilización tanto como sea posible, para así asegurarse que el nuevo nivel de estabilización (superior), comience en el momento apropiado (Balon, 1990).
2.6 Alimentación larval Durante estos procesos ontogénicos en los peces, toma especial importancia aquellos relacionados con el tracto digestivo, pues solamente una adecuada formación del mismo es lo que garantizará el crecimiento y la supervivencia de cada individuo. En el desarrollo de este sistema deben darse procesos tanto morfológicos como fisiológicos, que permitan la asimilación de los nutrientes, vengan estos procedentes de las reservas internas o del alimento externo. Al eclosionar, el canal alimentario es un tubo recto que pasa por encima del saco vitelino y está cerrado hacia la boca y el ano en la mayoría de las especies (Civera et al., 2004). Posteriormente comienza la regionalización del mismo, siendo el desarrollo del estómago y de los ciegos pilóricos el último cambio morfológico en aparecer, indicando el inicio de la etapa juvenil. Este completamiento del sistema digestivo tarda aproximadamente tres semanas en Brama brama y Pagrus major, seis semanas en Chanos chanos, catorce semanas en Plecoglossus altivelis y un mes en Dicentrarchus labrax (Watanabe y Kiron, 1994). Sin embargo, existe un grupo reducido de peces que muestran una anticipación en el desarrollo del estómago y los ciegos pilóricos, incluso previo al inicio de la alimentación exógena, y otros que carecen de estas estructuras durante toda la vida (Dabrowski, 1984). No solamente estas transformaciones morfológicas se hacen vitales durante la ontogenia, sino que las mismas deben ir acompañada de la funcionalidad del sistema. Esto permitirá que una vez haya ingresado el alimento al tracto, éste sea digerido y absorbido adecuadamente, haciéndose trascendental la participación de las enzimas digestivas, tanto las gástricas como las intestinales (Civera et al., 2004).
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Es por ello que una de las primeras aproximaciones para determinar la capacidad digestiva de larvas con potencial para su cultivo, ha sido a través de los estudios de ontogenia y caracterización enzimática. Estos permiten comprender en que momento las larvas presentan un equipo enzimático completo y por consiguiente tienen la habilidad de digerir eficientemente el alimento (Alarcón y Martínez, 1998). La mayor relevancia de estos estudios se alcanza cuando se pretende hacer habitual el empleo de dietas artificiales en el mantenimiento en cautiverio de larvas de peces, lo cual impone nuevos retos. Hacia el empleo de dietas artificiales va encaminada la acuicultura de peces en la actualidad, por las ventajas que estás ofrecen tanto económicas (por la disminución en los costos de producción), biológicas como de manejo. No obstante, aún persisten serias dificultades para el empleo de estos alimentos en la etapa larval, dado principalmente por las particularidades de cada especie como son: la incapacidad de digerir el alimento inerte, no cubrir éste plenamente los requerimientos nutricionales, la falta de estimulación hacia su consumo, las conductas naturales de captura del alimento, entre otros elementos (Lazo, 2000).
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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3.1 Condiciones experimentales Las experimentaciones se realizaron en los meses de Abril, Mayo y Junio de los años 2005 y 2006 en el Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata, Provincia de Matanzas, Cuba (Fig. 1).
100 Km
10 Km
Figura 1. Mapa de Cuba que muestra la zona donde fueron realizados los experimentos. Señalizado el Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata, Provincia Matanzas.
Los huevos del manjuarí (Atractosteus tristoechus) empleados para los bioensayos, se obtuvieron del desove inducido de reproductores mantenidos en cautiverio en dicho centro. Se empleó siempre una proporción de una hembra y tres machos. Estos reproductores se colocaron en estanques de concreto de dimensiones 3 x 2.5 m con una altura de agua de 50 cm, fluctuando la temperatura de la misma entre los 24 y los 27oC. Los estanques se acondicionaron previamente con sustratos artificiales con el objetivo de garantizar las condiciones requeridas por los lepisosteidos para el desove (Dean, 1895; León et al., 1978; Simon y Wallus, 1989). Se aplicó una inyección inicial de la hormona luteinizante (LHRH- A; 25 µg/mL, ARGENT) a los reproductores y una segunda inyección a las 16 horas. El cortejo y el desove ocurrían entre las 8 y las 10 horas a partir de esta segunda inyección.
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Pasados 15 minutos del inicio del desove, los sustratos artificiales con los huevos fertilizados adheridos fueron removidos del estanque y transferidos a tanques circulares de fibra de vidrio de 100 L de capacidad hasta su eclosión (68-100 horas). Estos huevos fueron gradualmente adaptados durante cuatro horas a las temperaturas de mantenimiento (28 ± 1oC). Todos los experimentos se realizaron hasta que las larvas alcanzaron los 18 días después de eclosionadas (DDE) debido a observaciones in situ de la aparición del fenotipo juvenil así como por referencias de estudios realizados con las otras especies del género (Aguilera et al., 2002). En la evaluación del efecto de la inanición, una vez terminados los 18 días de experimentación, las larvas se mantuvieron hasta su muerte. Se emplearon tres réplicas en cada uno de los bioensayos, excepto en el de la ontogenia de las enzimas digestivas que contó con dos réplicas. Se mantuvieron las temperaturas del agua constantes, con regímenes de luz desde las 08:00 hasta las 20:00 horas, y con niveles de oxígeno mantenidos por encima de 6 ppm. Cada mañana se recambiaba entre el 50 y el 75% del agua de cada tanque después de la limpieza del fondo de los mismos. Las larvas se alimentaron tres veces al día (09:00, 14:00, y 19:00 h) a partir del cuarto día después de eclosionadas, excepto en el tratamiento de inanición en el experimento correspondiente. Las especificidades de la duración de cada experimento, así como de las dietas, los tanques y las densidades de siembra iniciales empleados aparecen en la Tabla 1. Los quistes de artemia empleados, provenientes de Salt Creek Select (Great Salt Lake, UTA), fueron hidratados con abundante aireación y luz durante una hora en agua dulce y después por 23 horas en agua salada (28 g/L). Los quistes fueron preparados 24 horas anteriores a cada alimentación. Las moinas provenían del área de alimento vivo del propio Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata y eran colectadas previas a cada alimentación. Justo antes de ofrecerlas como alimento, tanto los nauplios de artemias como las moinas eran lavados con agua dulce e igualmente distribuidos en los tanques.
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Tabla 1. Características de los experimentos realizados: duración de cada uno (DDE - días después de eclosionadas las larvas) y tamaños de muestras (n=larvas/réplica/día), especificándose los tanques utilizados, las densidades de siembra iniciales y las dietas empleadas en cada uno de ellos.
Duración Dieta Experimentos Tanques y densidades iniciales n Cantidad Tipo Descripción morfológica 0-18 DDE Tanques plásticos circulares 15L Moina1 viva y morfométrica N=2-3 (6.7 larvas/L) Desarrollo histológico del 0-18 DDE Tanques plásticos circulares 15L tracto digestivo N=2-3 (6.7 larvas/L) ad libitum Ontogenia de las enzimas 5-18 DDE Tanques fibra vidrio rectangulares 2 Artemia viva digestivas N=100 300L (6.7 larvas/L) 5-18 DDE Tanques fibra vidrio rectangulares Efectos de la inanición n=3 50L (4 larvas/L) Moina1 congelada Artemia2 congelada 50 % Moina1 100 % 5-18 DDE Tanques fibra vidrio rectangulares congelada + 50 % Dietas de iniciación de la 3, 4 n=7 50L (4 larvas/L) Pienso Biomasa 50 % Artemia2 congelada + 50 % Pienso3, 4 Pienso3 1 Moina sp. 2 nauplios de Artemia sp. 3 Pienso < 600 µm hasta los 8 DDE, de ahí en adelante 600-850 µm 4 100 % Pienso a partir de los 13 DDE
En el experimento sobre la evaluación de dietas inertes, las artemias y moinas empleadas fueron congeladas a -20oC y posteriormente porcionadas y pesadas para ofrecerlas según el porcentaje de la biomasa correspondiente. Para esto se hicieron ajustes diarios de la ración a ofrecer según los pesos que mostraban las larvas en los muestreos. El pienso empleado MR fue el alimento balanceado comercial para truchas El Pedregal (45% de proteína y 16% grasa), el cual fue previamente tamizado para obtener tamaños de partículas < 600 µm y entre 600-850 µm. Se determinaron la proteína total y el contenido de humedad (AOAC, 1990) de las dietas y de las larvas de 4 DDE y de 18 DDE. En el experimento donde se evaluó el efecto de la inanición, los tanques fueron tapados con mallas para impedir la entrada de ningún tipo de alimento.
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3.2 Muestreos Antes de la limpieza de los tanques y de la alimentación matutina, las larvas fueron muestreadas al azar de forma diaria, excepto en el bioensayo de la evaluación de las dietas de iniciación, donde solamente se analizaron los días 8, 12, 15 y 18 después de eclosionadas. Los tamaños de muestras empleados para cada bioensayo aparecen en la Tabla 1. Una vez colectadas las larvas, estas eran anestesiadas con MS 222, individualmente pesadas con una balanza Ohaus (±0.1 mg) y fijadas en solución de etanol 700 para el posterior análisis. En el experimento para la descripción histológica, las larvas se fijaron primero en Bouin a temperatura ambiente por 24 horas y luego deshidratadas en etanol. Las especificidades del experimento de la ontogenia de las enzimas digestivas fueron las siguientes. Las larvas removidas fueron mantenidas en dos pequeños tanques sin alimento por al menos una hora para impedir la asimilación de ningún alimento y permitir parte del vaciado intestinal. Todas las larvas se lavaron con agua destilada y el exceso de la misma fue removido empleando papel absorbente. La disección se realizó bajo la observación estereoscópica sobre una placa Petri refrigerada manteniendo una temperatura 0-20C. Entre los 5 y los 12 DDE, fue tomada toda la larva, con excepción de la cabeza y la cola. A partir del 13 DDE en adelante, se realizaba un corte desde el inicio del esófago y se extraía todo el segmento intestinal incluido el hígado y el páncreas. Estas muestras fueron almacenadas en tubos plásticos Eppendorf y mantenidos en hielo. Una vez terminado el muestreo, que no excedía los 15 minutos, las muestras se congelaban en nitrógeno líquido a -700C y posteriormente fueron liofilizadas para el análisis de la actividad enzimática. Fracciones del tracto digestivo de un adulto (estómago, ciegos pilóricos, intestino, válvula espiral) fueron tomadas e idénticamente procesadas como referencia para los análisis.
3.3 Procesamiento de las muestras, mediciones y determinaciones El establecimiento de los estadios de desarrollo de las larvas fue llevado a cabo mediante la observación (10, 20 y 40 X de amplificación) de la desaparición, la reducción o la aparición de estructuras externas y mediante la observación in situ de la pigmentación y de la conducta larval. Se empleó una cámara Kodak Z 760 montada en un microscopio binocular
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Omano y mediante semi-oscuridad o total iluminación se fotografiaron las larvas conservadas. Los caracteres morfométricos y merísticos fueron medidos o contados, empleando un micrómetro ocular y un vernier digital (±0,01 mm) según los criterios definidos por Simon y Wallus (1989) para las larvas de lepisosteidos. Los caracteres morfométricos aparecen en la Figura 2 y los caracteres merísticos fueron el número de radios de las aletas dorsal, anal y caudal.
Ads
AH LH AC HC D
LC Hsv HP
LAPc
Lsv LAPv
LPd Hpa LPa
Hpta
HPc LTc
Lc LS LT
Figura 2. Caracteres morfométricos medidos en el manjuarí (modificado de Simon y Wallus, 1989). Largo total (LT), largo estándar (LS), largo del hocico (LH), diámetro ocular (D), largo cefálico (LC), largo predorsal (LPd), largo preanal (LPa), largo del tronco (LTc), largo de la cola (Lc), largo del saco vitelino (Lsv), largos de las aletas pectorales (LAPc) y pélvicas (LAPv), altura cefálica (HC), altura pectoral (HP), altura preanal (Hpa), altura postanal (Hpta), altura del pedúnculo caudal (HPc), altura del saco vitelino (Hsv), ancho inicial del hocico, ancho medio del hocico, ancho posterior del hocico (AH), ancho cefálico (AC), ancho del disco suctorial (Ads).
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El porcentaje de mortalidad total fue determinado diariamente para el experimento del efecto de la inanición en las larvas y para el bioensayo de las dietas de iniciación al finalizar el mismo.
La tasa de crecimiento (TC; mm/d) fue calculada a través de: [LT2- LT1] / (t2-t1) donde LT2 y LT1 son los largos totales a los tiempos t2 y t1 (expresados en días) respectivamente. La tasa de crecimiento específica (TCE; %/d) fue calculada como: 100 [ln P2-ln P1] / (t2-t1) donde P2 y P1son los pesos húmedos a los tiempos t2 y t1 respectivamente (Rana, 1990 a,b).
3.3.1 Análisis histológico Las muestras de las larvas enteras después de fijadas en Bouin por 24 horas fueron conservadas en etanol 700 hasta su procesamiento. Posteriormente estas fueron deshidratadas con inmersiones periódicas en alcohol a diferentes graduaciones (70-1000) e incluidas en parafina. Secciones seriadas sagitales y transversas de 8 µm de espesor fueron cortadas, fijadas en portaobjetos y secadas. Posteriormente fueron teñidas con Hematoxilina-Eosina (HE) y con Ácido periódico-Shiff (PAS) (Drury y Wallington, 1980) para la observación y descripción general. Se utilizó microscopía óptica (Omano) con aumentos de 40X, 50X, 100X y 400X.
3.3.2 Actividad enzimática del tracto digestivo Las muestras fueron pesadas y homogenizadas a una proporción 1:10 (tejido:agua bi- destilada) durante unos minutos empleando un homogenizador de tejidos Polytron (Brinkman Instruments, Westbury, N.Y) a una temperatura de 4oC. Posteriormente el homogenizado fue centrifugado a 10 600 g por 15 min a la misma temperatura. El sobrenadante fue colectado y dividido en alícuotas de 0,1 mL, las cuales se almacenaron en nitrógeno líquido a -70oC y se emplearon posteriormente para los análisis de la actividad enzimática y del contenido proteico. La concentración de proteína soluble total en los extractos se determinó por el método de Bradford (1976) para lo cual se utilizó la albúmina de suero bovino (BSA) como referencia. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado a temperatura ambiente (25oC) empleando un espectrofotómetro de microplacas Tecan Sunrise excepto para los análisis de las actividades de la amilasa y de las proteasas totales donde se empleó un
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espectrofotómetro Spectronic (Thermo Electronic, Waltham, Mass.) con celdas de cuarzo. Todas las reacciones fueron corridas con concentraciones de sustratos saturadas y comparadas con el blanco apropiado, empleando reactivos marca SIGMA. La actividad de las proteasas ácidas del estómago en las muestras fue medida de acuerdo con Anson (1938). Se empleó 0,5 mL de hemoglobina como sustrato (0,25%) en 0,5 mL de buffer acetato de sodio-HCl (0,1 M, pH 3) e incubado con 25 µL del homogenado de la muestra en un tubo de micro-centrifuga por 30 min a 37oC. La reacción se detuvo por adición de 0,5 mL de ácido tricloroacético frío (TCA, 12%) y se mantuvo a 4oC durante 15 minutos. Las muestras fueron centrifugadas a 20 800 g a 4oC por 5 min y se leyó la absorbancia del sobrenadante a 280 nm. La actividad de las proteasas alcalinas fue medida mediante un protocolo similar al descrito anteriormente, excepto que se empleó como buffer 50 mM Tris-HCl/20 mM CaCl2 (pH 8,5) y como sustrato la caseína (0,1%) (Walter, 1984). Para la determinación de la actividad de aminopeptidasa, se mezclaron 30 µL del homogenizado con 70 µL de buffer 50 mM Tris-HCl, 20 mM CaCl2 (pH 8,5). Después se adicionaron, 200 µL del sustrato L-leucina-pNA (LNA, 2 mM) (Lauff y Hofer, 1984). Los cambios en la absorbancia fueron continuamente registrados por 10 min a 405 nm. Las actividades de las fosfatasas alcalinas y ácidas se determinaron de una forma similar, empleando como sustrato 2% p-nitrofenil fosfato y como buffers 1,0 M dietanolamina/50 mM MgCl2 (pH 9,8) y 0,1 M de acetato de sodio-HCl (pH 4,8) respectivamente (Moyano et al., 1996). La actividad β-esterasa no específica fue estimada siguiendo el método de Brogdon y Dickinson (1983), empleando como buffer fosfato de potasio (pH 7,2) y 100 µL de b-naftil acetato como sustrato. La absorbancia fue leída a 540 nm después de 10 min de incubación a temperatura ambiente. Para la α-amilasa se empleó como sustrato 0,1 M acetato de sodio-HCl/6 mM NaCl (pH 4,8) con un 1 % de solución de almidón (Bernfeld, 1951). En un tubo de cristal, se combinaron 0,5 mL de esta solución de almidón con 25 µL del homogenizado y 0,5 mL del buffer. La reacción fue incubada a 25oC por 30 min y se detuvo por la adición de 1,5 mL de ácido dinitrosalicílico (DNS), seguido de un baño de maría por 15 min. La solución
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resultante se diluyó con 2,5 mL de agua destilada y la actividad de α-amilasa se determinó espectrofotométricamente a 540 nm. Para todas estas determinaciones, una unidad de actividad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza al sustrato causando un cambio de 0,001 en la absorbancia por minuto (Walter, 1984), siendo las fórmulas: Actividad (U/mg proteína)= Δabs/min/mg prot Actividad (U/larva)= Δabs/min/larva
3.4 Análisis estadísticos Se comprobó el ajuste de los datos a la normalidad mediante la Prueba de Kolmogorov- Smirnov y la homogeneidad de varianza por la Prueba de Levene. Cuando no fueron cumplidas estas premisas, los datos de conteos se transformaron a través de X , mientras que a las proporciones se les aplicó el arcoseno X y luego se verificó nuevamente el cumplimiento de las premisas de las pruebas paramétricas. Para el establecimiento de los intervalos de LT se empleó un ANOVA de clasificación simple a priori. Los datos de mortalidades y de peso húmedo de las larvas (en el experimento de las dietas de iniciación), las actividades de las enzimas digestivas, la concentración de proteínas de los extractos larvales, los caracteres morfométricos entre intervalos de LT y entre los tratamientos con y sin alimento del bioensayo del efecto de la inanición, así como los resultados del análisis bromatológico en las larvas, fueron examinados mediante un ANOVA de clasificación simple y para las comparaciones múltiples se empleó la prueba de Tukey. Para describir el crecimiento de las larvas se emplearon análisis de regresión simple. Todos estos análisis se realizaron con nivel de significación de 0,05 en el programa STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., 2001). El crecimiento alométrico fue calculado como una función de X (X=LT o LC) empleando los datos no transformados: y=a Xb; donde y era el carácter medido, a el intercepto y b el coeficiente de crecimiento (Fuiman, 1983). Las ecuaciones fueron establecidas por la regresión de los datos log-transformados, empleando LT o LC como la variable independiente (Gisbert, 1999; Gisbert et al., 2002). Cuando el crecimiento es isométrico, el coeficiente de crecimiento es b=1 para el largo, altura y ancho y es b=3 para el peso cuando
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es comparado con X. El crecimiento alométrico es positivo cuando b es >1 o 3, y negativo cuando es <1 o 3 (Osse y Boogart, 2004). Los crecimientos bi o trifásicos pudieron ser descritos por dos o tres curvas diferentes de crecimiento respectivamente. El valor de la X donde la pendiente cambia es denominado punto de inflexión. Los puntos de inflexión fueron determinados a través de procedimientos de iteración de acuerdo con lo descrito por Snik et al. (1997), Gisbert (1999) y Gisbert et al. (2002) empleando una hoja de cálculo de EXCEL programada con las ecuaciones pertinentes (Zar, 1996). El set de datos x–y se ordenaron crecientemente por la X. Las líneas de regresión fueron calculadas desde Xmin hasta Xintermedia, y desde Xintermedia hasta
Xmax, donde X intermedia variaba iterativamente desde Xmin +2 hasta Xmax -2. Se realizaban pruebas t para chequear si el coeficiente de crecimiento para Xmin Xintermedia y Xintermedia Xmax difería significativamente. El valor de Xintermedia que resultara con el mayor valor de t era definido como el punto de inflexión. El nivel de significación aceptado era p< 0,05.
31
4. RESULTADOS
32 ______Resultados
4.1 Descripción morfológica larval El análisis cualitativo basado en la desaparición, reducción o la aparición de estructuras externas, así como la observación in situ de la pigmentación y de la conducta larval, permitió establecer tres etapas de desarrollo larval para esta especie (Tabla 2).
Etapa 1- Larva Adherida 0 DDE- 3 DDE (28oC) La larva recién eclosionada carece de una cavidad bucal (stomodeum) sin extensión del hocico y posee una papila adhesiva en forma de disco suctorial que le permite adherirse a la vegetación mientras se absorbe el saco vitelino. Durante esta etapa, el disco suctorial se reduce (en un 90 %), la boca se abre y se comunica con el sistema digestivo (Fig. 3A, B). La cabeza se proyecta por encima del saco vitelino y se hace evidente una copa óptica despigmentada que cubre a los ojos esféricos (Fig. 3B). El saco vitelino es de color amarillo pálido, alargado, de esférico a ovoide y a menudo puntiagudo en el extremo posterior. La profundidad de este saco decrece gradualmente (75 %) durante esta etapa (Fig. 3C). La primera aleta distinguible es la aleta media, la cual es transparente y se hace evidente en la parte posterior después del saco vitelino, con agregados pigmentarios que indican las futuras aletas dorsal, caudal y anal (Fig. 3C). No se observaron las aletas pélvicas y las aletas pectorales se localizaron por encima y anterior al saco vitelino. Ningún radio de las aletas fue visible en esta etapa. Un gran opérculo cubrió los lados anteriores laterales del saco vitelino hasta la base de las aletas pectorales (Fig. 3D). Los filamentos branquiales y la red de vasos sanguíneos se hicieron muy visibles. Las larvas recién eclosionadas aparecían muy escasamente pigmentadas, principalmente en la cabeza. Se presentaron algunos melanóforos esparcidos en la región medio dorsal del saco vitelino y junto a la unión de este con el cuerpo. Los melanóforos estaban densamente concentrados en la superficie superior del intestino desde el saco vitelino hasta el ano, formando una línea oscura en las zonas de las futuras aletas anal y caudal. En la región dorsal del cuerpo no se evidenció pigmentación hasta que se formó una línea parda desde el hocico hasta la futura aleta dorsal a los 2 DDE. Durante esta etapa, los melanóforos del saco vitelino se incrementaron en número (Fig. 3E).
33 ______Resultados
Tabla 2. Características principales descritas en cada una de las etapas de desarrollo de las larvas del manjuarí desde la eclosión hasta los 18 días después de eclosionadas (DDE). En negrita se señalan los caracteres esenciales para cada una de las etapas de desarrollo. En los esquemas Barra=1mm. TC (Tasa de crecimiento), TCE (Tasa de crecimiento específica).
Etapa 1 (n=33) Etapa 2 (n=61) Etapa 3 (n=29) Larva adherida Larva en transición Larva libre nadadora DDE (28oC) 0-3 4- 10 11-18 Largo total 10,5-17,7 mm 16,2-24,9 mm 22,9-35,2 mm Pesos 20-37 mg 32-52 mg 43-179 mg Disco suctorial Evidente Casi absorbido Ausente Boca Cavidad bucal y boca Hocico alongado, Longitud del hocico se se abren Dientes escasamente incrementa y dientes visibles presentes Saco vitelino Presente Reducido Ausente Aleta media Evidente Reducida Casi ausente (solo entre el ano y aleta anal) Aletas pélvicas Ausente Iniciadas Radios definidos Aleta caudal Sin radios Radios iniciados Radios definidos Adheridas, posición Separadas, posición Libre nadadora vertical horizontal Conducta Movimiento rítmico Inicio de alimentación mandíbula-opérculo exógena Pigmentación Dispersamente Zona ventral parda, Línea parda lateral pigmentada (cabeza, banda parda-amarilla conspicua entre los línea lateral oscura pálida con márgenes lados dorsal pardo- desde el saco vitelino blancos irregulares en amarillo y el ventral al ano y línea parda la región dorsal, Línea grisáceo, desde el dorsal) parda dorsal desaparece hocico hasta la aleta caudal con una banda superior despigmentada Fase Lecitotrófica Lecitoexotrófica Exotrófica TC=1,30 mm/d TCE= 10,2 %/d
34 ______Resultados
Las larvas permanecieron adheridas a la vegetación o a la superficie del agua a través del disco suctorial, manteniendo una posición vertical o semi-vertical y donde se hacían evidentes los movimientos rítmicos de la mandíbula y de los opérculos flexibles.
ds A B o
s am C sv s
apc
D op E
Fig. 3. Etapa 1 de desarrollo de Atractosteus tristoechus (larva adherida). A) cabeza en vista ventral, ds- disco suctorial, s-stomodeum. B) cabeza en vista lateral, o-ojo. C) larva en vista lateral, am- aleta media, sv- saco vitelino. D) región anterior de la larva en vista lateral, apc- aleta pectoral, op- opérculo. E) larva en vista superior, patrón de coloración. Barra = 1 mm.
Etapa 2- Larva en Transición 4 DDE- 10 DDE (28oC) La boca se formó y la mayoría del disco suctorial se absorbió, quedando solamente un pequeño remanente en la punta del hocico. El hocico comenzó a adoptar su forma alargada característica, con un alargamiento del maxilar con relación a la mandíbula y se hicieron visibles en esta última los primordios de los dientes (Fig. 4A, B). El aparato nasal se hizo evidente con las aberturas incurrentes y excurrentes (Fig. 4C). Los ojos comenzaron a verse esféricos y pigmentados. Los brotes de las aletas pélvicas se hicieron visibles en la parte posterior del saco vitelino, el cual se reduce considerablemente (Fig. 4D). Los remanentes de la aleta media fueron observados entre la aleta dorsal en desarrollo, la caudal y la aleta anal, siendo más conspicuos entre la aleta anal y los brotes de las aletas pélvicas. Esta aleta media se fue perdiendo gradualmente mientras las otras aletas se desarrollaban. Comenzaron a hacerse visibles en las aletas impares los rudimentos de los radios de las aletas, principalmente en la caudal (pterygióforos basales). Las aletas pectorales se alargaron, se desarrolló una
34 ______Resultados
pigmentación oscura en la base permaneciendo los márgenes transparentes y comenzó la formación de los radios. Se inicia una reducción relativa del opérculo que se observa como una estructura más sólida. En esta etapa, la larva comienza a separarse de la vegetación y permanece cercana a la superficie del agua, siendo capaz de moverse en posición horizontal, por medio de ondulaciones de la parte caudal del cuerpo. Se inicia la alimentación exógena, confirmada por el movimiento lateral de la cabeza seguida de mordiscos, que permitieron atrapar el alimento vivo. Se observó por transparencia el tracto digestivo lleno de alimento así como las primeras deposiciones fecales. La pigmentación consistió principalmente en áreas pardas hacia el lado ventral de cuerpo y hacia la región dorsal apareció una línea pálida, que se extiende desde la cabeza hasta la región posterior, de color pardo-amarillento con márgenes irregulares de color blanco. La línea dorsal distintiva que se evidenció en la etapa 1 desaparece. Al final de esta segunda etapa, todas las aletas tienen pigmentación oscura con los márgenes transparentes (Fig. 4D).
A B C
ds an
op D sv
apc apv am
Fig. 4. Etapa 2 de desarrollo de Atractosteus tristoechus (larva en transición). A-B) cabeza en vista lateral, ds- disco suctorial. C) hocico en vista superior, an- abertura nasal. D) larva en vista lateral, am- aleta media, apc- aleta pectoral, apv- aleta pélvica, op- opérculo, sv- saco vitelino. Barra = 1 mm.
35 ______Resultados
Etapa 3- Larva libre nadadora 11 DDE- 18 DDE (28oC) Las larvas son libres nadadoras y desarrollaron la forma alargada característica del adulto. El disco suctorial estaba totalmente ausente, el hocico se alargó y en las mandíbulas aparecieron los dientes afilados (Fig. 5A). La aleta media fue observada solamente entre el ano y la aleta anal con tendencia a su desaparición total. Los radios de las aletas comenzaron a formarse en la aleta dorsal, anal y en las pélvicas. La formación de los radios de las aletas pectorales y caudal se completó y las aletas pareadas se pigmentaron (Fig. 5B).
El cuerpo se tornó grisáceo hacia la zona ventral y ventro-lateral. Comenzó a hacerse conspicua una línea longitudinal parda oscura entre el lado dorsal pardo-amarillento y el lado ventral, iniciándose justo detrás del extremo posterior del hocico, atravesando los ojos y terminado en la aleta caudal (Fig. 5C). Numerosos melanóforos aparecieron esparcidos por todo el cuerpo excepto en la línea lateral despigmentada que va desde el hocico hasta el ano.
A B C
d rc
Fig. 5. Etapa 3 de desarrollo de Atractosteus tristoechus (larva libre nadadora). A) hocico en vista lateral, d- dientes. B) región posterior de la larva en vista lateral, rc-radios caudales. C) región medio-anterior de la larva en vista lateral, patrón de coloración. Barra = 1 mm.
36 ______Resultados
4.2 Morfometría larval El análisis de varianza a priori permitió establecer cinco intervalos de longitud total estadísticamente diferentes (F(5,118)=652,72; p<0,05) (Fig. 6). El primer intervalo (10,5-14,9 mm) agrupó a las larvas de la etapa 1 de desarrollo, que se encontraban adheridas al sustrato e incluye desde las recién eclosionadas hasta las de 2 DDE a 280C. El segundo intervalo (16- 22,1 mm) incluyó las larvas de 3 a 5 DDE que se encontraban pasando de la primera a la segunda etapa de desarrollo. El próximo intervalo (22,4- 24,9 mm) estuvo representado por larvas de 6 a 12 DDE, que poseían el crecimiento más lento de todos los intervalos tanto en talla (TC=0,4 mm/d) como en peso (TCE=2,14 %/d) y contenía larvas de las etapas 2 y 3 de desarrollo. Los últimos dos intervalos (26,2- 31 mm; 31,8- 35,2 mm) estuvieron caracterizados por el mayor incremento en peso (17,2 %/d) y en talla (1,5 mm/d).
18 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 16
14 12
10 E
D D 8
6
4 2
0
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Largo total (mm)
Fig. 6. Relación entre el largo total, la edad y los estadios de desarrollo de las larvas de manjuarí desde la eclosión hasta los 18 días después de eclosionados (DDE). Los círculos representan los intervalos de largo total obtenidos como resultado de un ANOVA a priori
(F(5,118)=652,72; p<0,05) (n=123).
37 ______Resultados
Los caracteres morfométricos y merísticos medidos (Tabla 3) fueron agrupados en estos cinco intervalos de longitud total. Los caracteres que difieren estadísticamente entre todos los intervalos fueron: largo de hocico, largo de las aletas pélvicas y ancho inicial del hocico (al nivel de los orificios nasales). El largo del hocico representa el 4,1 % del largo total (LT) en las larvas recién eclosionadas (que promediaron 10,5-14,9 mm LT) y se incrementó a 14,8 % del LT cuando la larvas alcanzaron 31,8-35,2 mm LT (18 DDE). El largo de las aletas pélvicas se incrementó de 2,1 % del LT cuando estas aparecieron por primera vez (16-22,1 mm) a 4,9 % de LT a los 18 DDE. Sin embargo, el ancho inicial del hocico disminuyó significativamente desde un 15,8 % hasta un 9,9 % del largo cefálico (LC) desde el segundo hasta el quinto intervalo de longitud total. Los caracteres del largo y ancho cefálico difirieron significativamente en todos los intervalos con la excepción de los dos últimos. En las larvas recién eclosionadas, el largo cefálico fue de un 22 % del LT y se incrementó a 31,5 % del LT hacia los días 15-18 DDE. El ancho cefálico sin embargo decreció del 63,8 % hasta el 32,2 % del LC en el período estudiado.
38 ______Resultados
Tabla 3. Caracteres morfométricos (media + DE; Mínimo-Máximo) de las larvas de manjuarí agrupados por los intervalos de largo total seleccionados. Los caracteres están expresados en porcentaje del largo total (LT) o del largo cefálico (LC). El conteo de los radios de las aletas también aparece para cada intervalo. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los intervalos de largo total para cada carácter (p<0,05).
Intervalos de Largo total (LT) (mm) 10,5 – 14,9 16- 22,1 (n=27) (n=27) Mediciones Media + DE Min-Max Media + DE Min-Max Largos, % de LT Largo del hocico 4,1 + 0,94e 2,5 – 7,5 6,9 + 1,34 d 5,2 – 9,5 Diámetro ocular 6,4 + 0,53 a 5,3 – 7,6 5,7 + 0,41 b 4,9 – 6,8 Largo cefálico (LC) 21,9 + 2,33 d 18,5 – 27,3 26,1 + 1,47 c 23,6 – 29,1 Largo predorsal 72,5 + 2,39 a 68,5 – 77,4 66,7 + 1,22 c 64,7 – 69,6 Largo preanal 69,4 + 2,02 a 65,8 – 73,6 63,1 + 1,30 c 61,1 – 65,7 Largo estándar 98,4 + 0,70 a 97,0 – 99,2 96,0 + 1,34 c 94,2 – 99,3 Largo del saco vitelino 36,9 + 2,29 a 31,5 – 41,1 31,9 + 3,04 b 27,2 – 37,5 Largos de las aletas, % de LT Pectorales 4,3 + 1,27 c 2,5 – 6,7 6,9 + 0,68 a 5,8 – 8,1 Pélvicas 2,1 + 0,59 d 1,0 – 2,8 Alturas corporales, % de LT Altura cefálica 14,9 + 1,64 a 12,4 – 18,9 10,9 + 1,34 b 8,8 – 14,1 Altura pectoral 22,6 + 2,60 a 18,8 – 28,3 12,6 + 3,01 b 1,4 – 17,5 Altura preanal 7,3 + 1,32 b 4,4 – 9,8 8,5 + 0,86 a 6,8 – 10,6 Altura postanal 5,5 + 0,80 b 3,5 – 6,9 6,2 + 0,56 a 5,2 – 7,7 Altura pedúnculo caudal 5,2 + 0,69 ab 4,5 – 6,1 5,7 + 0,46 a 4,7 – 6,7 Altura saco vitelino 16,8 + 2,98 a 12,1 – 22,6 9,8 + 1,40 b 6,9 – 12,7 Anchos corporales, % de LC Ancho inicial del hocico 15,8 + 1,53 a 14 – 19,1 Ancho medio del hocico 32,0 + 4,89 a 25,8 – 48,7 Ancho posterior del hocico 41,4 + 5,82 a 32,3 – 52,2 41,2 + 4,61 a 33,9 – 51,3 Ancho cefálico 63,8 + 7,42 a 48,6 – 83,3 50,1 + 5,31 b 41,9 – 60,0 Ancho disco suctorial 29,0 + 6,70 a 17,6 – 40,0 11,7 + 1,09 b 10,6 – 12,8 Conteo de radios de aletas Dorsal 0 0 Anal 0 4 Caudal 0 6 - 10
39 ______Resultados
Tabla 3. (continuación)
Intervalos de Largo total (LT) (mm) 22,4- 24,9 26,2- 31 31,8- 35,2 (n=46) (n=12) (n=11) Mediciones Media + DE Min-Max Media + DE Min-Max Media + DE Min-Max Largos, % de LT Largo del hocico 11,2 + 1,10 c 8,5–13,3 13,7 + 1,30 b 12–16,4 14,8 + 0,88 a 13,4–16,2 Diámetro ocular 5,5 + 0,29 bc 4,9–6,2 5,5 + 0,33 bc 4,8–6 5,3 + 0,28 c 4,7–5,6 Largo cefálico (LC) 28,6 + 1,60 b 25,5–33,6 31,2 + 2,07 a 27,9–34,5 31,5 + 1,12 a 29,4–33,0 Largo predorsal 67,4 + 1,26 c 65,0–69,7 69,7 + 2,61 b 66,0–74,9 69,5 + 1,20 b 67,9–71,8 Largo preanal 63,7 + 1,68 c 59,2–67,2 66,5 + 2,53 b 63,2–71,5 66,0 + 1,34 b 64,0–69,1 Largo estándar 95,4 + 1,04 c 93,2–97,7 97,3 + 1,34 b 94,6–98,9 96,9 + 1,08 b 94,9–98,7 Largo del saco vitelino Largos de las aletas, % de LT Pectorales 6,0 + 0,54 b 4,4–7,1 5,5 + 0,59 b 4,5–6,3 5,7 + 0,36 b 5,2–6,5 Pélvicas 3,2 + 0,42 c 2,4–3,9 4,2 + 0,71 b 3,4–5,8 4,9 + 0,42 a 4,3–5,5 Alturas corporales, % de LT Altura cefálica 8,8 + 0,51 c 7,6–10,1 8,9 + 0,88 c 6,9–10,5 8,5 + 0,38 c 7,9–9,4 Altura pectoral 9,5 + 0,47 c 8,6–10,7 9,7 + 0,67 c 8,3–10,4 9,6 + 0,31 c 9,1–10,1 Altura preanal 7,0 + 0,50 b 5,7–7,7 7,7 + 0,71 b 6,2–8,5 7,7 + 0,25 b 7,3–8,1 Altura postanal 5,2 + 0,42 b 3,8–5,9 5,2 + 0,36 b 4,6–5,7 5,2 + 0,28 b 4,8–5,8 Altura pedúnculo caudal 4,9 + 0,43 b 3,8–5,8 4,9 + 0,33 b 4,4–5,3 5,0 + 0,29 b 4,6–5,4 Altura saco vitelino Anchos corporales, % de LC Ancho inicial del hocico 13,5 + 1,13 b 10,8–15,9 11,0 + 1,01 c 9,1–12,8 9,9 + 0,44 d 9,3–10,9 Ancho medio del hocico 23,7 + 1,71 b 20,3–27,1 21,6 + 1,91 b 19,2–24,4 20,2 + 1,33b 18,7–22,3 Ancho posterior del hocico 31,4 + 2,70 b 23,2–36,8 29,2 + 2,04 b 25,9–32,9 27,0 + 1,32 b 24,8–29,1 Ancho cefálico 38,5 + 2,37 c 33,3–42,4 33,9 + 1,70 d 30,3–36,7 32,2 + 1,02 d 30,6–33,7 Ancho disco suctorial Conteo de radios de aletas Dorsal 4 – 6 6 – 8 6 – 8 Anal 4 – 7 5 – 7 6 – 8 Caudal 9 – 12 11 – 13 12 – 14
40 ______Resultados
4.3 Crecimiento Las larvas desde la eclosión hasta el día 18 después de la eclosión, incrementaron 3,1 veces su largo total y 6,3 veces su peso (Fig. 7). El incremento en el largo total fue definido por la siguiente ecuación: LT= 12,88 + 1,217 X DDE, y el incremento en el peso total fue descrito por la ecuación PT = 23,89 X exp (0,091 X DDE). La tasa de crecimiento fue de 1,30 mm/d y la tasa de crecimiento específica promedió 10,2 %/d. Durante estos primeros 18 días de nacidas, fueron identificados tres períodos de crecimiento larval: 0-6 DDE, 7-11 DDE y 12- 18 DDE. Se observó un rápido crecimiento durante los períodos 0-6 DDE y 12-18 DDE, y el menor crecimiento ocurrió entre los 7-11 DDE (0,02 mm/d y 2,8 %/d).
180 40 Peso 160 35 LT 1,62 mm/d 140 30 0,02 mm/d )
120 m ) 2,01 mm/d 25 m ( g
l
m 100 a ( t
20 o o t
s 80 e o g P 15 14,3 %/d r 60 a L 10 40 11,6 %/d 2,8 %/d 5 20 0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 DDE
Fig. 7. Crecimiento en peso (escala izquierda) y en longitud total (escala derecha) del manjuarí desde la eclosión hasta los 18 días después de eclosionados (DDE). Cada punto representa la media de 9 individuos + ee. Las líneas verticales discontinuas definen los tres períodos de crecimiento (0-6 DDE, 7-11 DDE, 12-18 DDE). Se representan para cada período la Tasa de crecimiento (TC, mm/d) y la Tasa de crecimiento específica (TCE, %/d).
39 ______Resultados
Al aplicar el análisis alométrico, se encontró que el crecimiento para el peso húmedo fue negativamente alométrico (a= -0,09; b= 1,29; R2= 0,79) y se detectaron dos fases distintivas del crecimiento: un crecimiento lento alométrico negativo desde la eclosión hasta el 14 DDE y un rápido crecimiento alométrico negativo desde el 14 hasta el 18 DDE (Fig. 8).
200 180 160 140 120 100 80 )
g 2,09 m
( 60 y = -2,47x ;
o 0,91 2 2
d y = 0,97x ; R = 0,86; n=105 R = 0,50; n=19 e
m 40 ú h
o
s e P 20
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 3032343638
Largo total (mm)
Fig. 8. Ecuaciones del crecimiento alométrico y relaciones entre el peso húmedo y el largo total de A. tristoechus durante el desarrollo temprano (desde la eclosión hasta los 18 días). La línea discontinua representa el punto de inflexión en el crecimiento. Note los ejes logarítmicos.
De los 23 caracteres morfométricos analizados, solamente seis mostraron crecimiento isométrico como una función del largo total durante las primeras etapas del desarrollo (Tabla 4).
40 ______Resultados
Tabla 4. Caracteres morfométricos con crecimiento isométrico como función del largo total en larvas de manjuarí desde la eclosión hasta los 18 días después de eclosionadas (n=123, a-intercepto, b-coeficiente de crecimiento). Caracteres a b R2 morfométricos Largo predorsal -0,20 0,94 0,98 Largo preanal -0,22 0,93 0,98 Largo estándar 0,04 0,98 0,99 Largo de la cola -1,4 1,08 0,97 Altura preanal -2,61 1,00 0,86 Altura postanal -2,71 0,93 0,87
Sin embargo, las otras proporciones corporales y los coeficientes de crecimiento cambiaron considerablemente durante este período larval. El largo cefálico, la altura y su ancho, exhibieron patrones de crecimiento bifásicos (Fig. 9 A,B,C) con puntos de inflexión en los 22,48mm LT (6 DDE), 19,18 mm LT (4 DDE) y 5,8 mm LC (6 DDE) respectivamente. El crecimiento del largo cefálico fue positivamente alométrico (a= -2,46; b= 1,38; R2= 0,98) durante el desarrollo larval; sin embargo, el crecimiento de la altura cefálica (a= -0,38; b= 0,37; R2= 0,61) y de su ancho (a= 0,06; b= 0,48; R2= 0,90) fueron negativamente alométricos. El diámetro ocular incrementó con alometría negativa (a= -2,28; b= 0,81; R2= 0,95) durante todo el período de desarrollo, pero su crecimiento pudo ser divido en tres etapas diferentes (Fig. 9D). Desde la eclosión hasta 3-4 DDE (primer punto de inflexión a los 17,25 mm LT) el crecimiento fue negativamente alométrico (b= 0,80); un segundo punto de inflexión apareció a los 24,42 mm LT (7 DDE), pero el ojo creció cercano a la isometría en estas dos últimas etapas. El crecimiento del largo del hocico mostró una fuerte alometría positiva en relación con el largo total en larvas tempranas (a= -6,59; b= 2,36; R2= 0,96), con un punto de inflexión a los 6 DDE y coeficientes de crecimiento similares en ambas fases (Fig. 10A). El ancho posterior del hocico también mostró este patrón bifásico pero su crecimiento fue negativamente alométrico (a= -0,52; b= 0,67; R2= 0,88) en relación con el largo cefálico (Fig. 10B).
41 ______Resultados
13 3,1 12 3,0 11 2,9 10 2,8 0,35 9 2,7 y = -0,29x ; 8 2,6 2 1,38 2 R = 0,33; n=43 7 y = -2,47x ; R = 0,95; n=56
) 2,5 ) 1,27
m 2,4 m 6 y = -2,11x ;
m 2,3 m
2 ( ( 5 R = 0,90; n=68 2,2 a o c c i
i 2,1 l
l 4 á á f 2,0 f e e c c 1,9 3 0,80 a o y = -1,77x ; r
g 1,8 u r 2 t R = 0,74; n=81 a l 1,7 L 2 A 1,6 1,5 A 1,4 B 1 1,3 10 12 14 16 18 20 22 24 26 283032343638 10 12 14 16 18 20 22 24 26283032343638 Largo total (mm) Largo total (mm) 4,0 2,0 3,8 1,9 3,6 1,8 3,4 1,7 3,2 1,6 3,0 0,62 2 1,5
y = -0,08x ; R = 0,85; n=51 )
) 2,8 1,4 m m 2,6 1,3 m 0,90 ( m
y = -2,61x ; ( 2,4 1,2
y = -0,09x 0,55; r o
a 2
l R = 0,83; n=34 c 2,2 1,1 i 2 u l R = 0,84; n=73 0,80 c
á y = -2,26x ;
f 2,0 o 1,0 e 2 c o R = 0,75; n=37
1,8 r 0,9 t o 0,97
e y = -2,82x ; h c 1,6 m 0,8 2 n á R = 0,77; n=54 i A 1,4 D 0,7
1,2 0,6 C D 1,0 0,5 2 4 6 8 10 12 14 8 10 12 14 16 18 20 22 24262830323436 Largo cefálico (mm) Largo total (mm)
Fig. 9. Ecuaciones del crecimiento alométrico y relaciones entre diferentes regiones y órganos cefálicos seleccionadas con el largo total o largo cefálico de A. tristoechus durante el desarrollo temprano. A) Largo cefálico [6 DDE], B) Altura cefálica [4 DDE], C) Ancho cefálico [6 DDE], D) Diámetro ocular [3-4; 7 DDE]. Las líneas discontinuas representan los puntos de inflexión en el crecimiento y en corchetes se especifican las edades en los que estos aparecen. Note los ejes logarítmicos.
42 ______Resultados
7 6 5 4 3 ) m m (
2 1,96 2 o y = -5,57x ; R = 0,83; n=47 2,00 c i y = -5,38x ; c o 2
h R = 0,87; n=77
l
e
d 1
o g
r a L
A
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 3032343638 Largo total (mm) 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8
) 2,6
m 2,4 m (
2,2 o
c
i 2,0
c 0,87 o 1,8 y = -0,74x ; 0,67 h y = -0,53x ;
l 2 e 1,6 R = 0,87; n=59 2
d R = 0,73; n=65
r
o 1,4 i r e
t
s 1,2 o p
o 1,0 h c
n A 0,8 B 0,6 2 4 6 8 10 12 14 Largo cefálico (mm) Fig. 10. Ecuaciones del crecimiento alométrico y relaciones entre las regiones del hocico con el largo total o largo cefálico de A. tristoechus durante el desarrollo temprano. A) Largo del hocico [6 DDE], B) Ancho posterior del hocico [6 DDE]. Las líneas discontinuas representan los puntos de inflexión en el crecimiento y en corchetes se especifican las edades en los que estos aparecen. Note los ejes logarítmicos.
43 ______Resultados
Durante los primeros 18 DDE, el crecimiento del largo del tronco fue negativamente alométrico (a= 0,08; b= 0,65; R2= 0,91) y bifásico, con un punto de inflexión a los 14,9 mm LT (2 DDE) (Fig. 11A). El crecimiento de la altura pectoral fue negativamente alométrico (b= 0,04) y se puede dividir en dos partes también (Fig. 11B), mostrando la primera parte (desde la eclosión hasta los 4 DDE) una disminución en la altura pectoral (b= -0,19), siendo este el único decrecimiento encontrado en todos estos análisis realizados. Desde este punto de inflexión (18,76 mm LT), la altura pectoral se incrementó y se evidenció un crecimiento alométrico negativo (b= 0,68). Las otras alturas corporales (preanal y postanal) mostraron sin embargo un crecimiento isométrico (Tabla 4). Las aletas pectorales y pélvicas incrementaron en largo desde la eclosión hasta los 18 DDE con un crecimiento alométrico positivo y bifásico (a= -3,65; b= 1,26; R2= 0,77 // a= -8,89; b= 2,69; R2= 0,85; respectivamente). Las aletas pectorales presentaron un crecimiento alométrico positivo desde la eclosión hasta el 8 DDE y de aquí en lo adelante mostraron un crecimiento isométrico (Fig. 11C). Para las aletas pélvicas, se encontró una alometría rápida y positiva (b= 4,04) hasta el punto de inflexión (24.88 mm LT a los 8 DDE), pero a diferencia de las aletas pectorales, de este punto en lo adelante, el coeficiente de crecimiento siguió mostrando alometría positiva (Fig. 11D). Finalmente, el crecimiento de la cola mostró la misma tendencia isométrica que exhibieron los otros caracteres presentes en la Tabla 4. Sin embargo, la altura del pedúnculo reveló alometría negativa (a= -2,39; b= 0,82; R2= 0,79) a través de los 18 días del experimento. Desde la eclosión hasta los 8 DDE (22,87 mm LT), la altura del pedúnculo caudal del manjuarí mostró una alometría positiva y desde ese punto de inflexión hasta los 18 DDE, el crecimiento fue isométrico (Fig. 12). Durante la etapa larval, todos los puntos de inflexión permanecen en un estrecho intervalo de largos corporales y edades [LT 13,7- 23,7 mm, edades 2-8 DDE] pero se concentran principalmente entre los 4 y 8 DDE (Fig. 13).
42 ______Resultados
14 3,6 13 3,4 -0,19 12 y =1,47x ; R2 = 0,21; n=41 11 3,2 )
10 ) m 3,0 m m (
9 m ( o 2,8 c y =-0,57x 0,47; l a n 8 r o 2
o 0,68 r R = 0,55; n=27 2,6 t t y = -1,30x ;
c l
e 2 e 7 R = 0,60; n=83 p d
2,4 a o 0,87 2 r g y = -0,61x ; R = 0,92; n=97 u r 6 t l a 2,2 A L
5 2,0 A B 4 10 12 14 16 18 20 22 24 26 283032343638 1,8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 283032343638 Largo total (mm) Largo total (mm)
2,6 2,0 2,4 2,2 1,8 ) 2,0 1,6 ) m 1,8 1,45 2 1,4 m
m y = -4,18x ; R = 0,76; n=89
( 1,6
m 1,2 s (
e 1,4 s l 2,01 a a 1,2 1,0 y = -6,6x ; r c i
o 0,98 2 v t y = -2,80x ; l R = 0,78; n=66 c 1,0 0,8 é e 2 4,04 R = 0,62; n=26 p p y = -13,1x ;
0,8 s s
a 2
a 0,6 t R = 0,83; n=63 t e e l l
0,6 a a
s s a l a
l 0,4
e e d
0,4 d
o o g g r r a a L L C 0,2 D 0,2 10 12 14 16 18 20 22 24 26283032343638 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Largo total (mm) Largo total (mm)
Fig. 11. Ecuaciones del crecimiento alométrico y relaciones entre diferentes regiones seleccionadas del tronco con el largo total de A. tristoechus desde la eclosión hasta los 18 días. A) Largo del tronco [2 DDE], B) Altura pectoral [4 DDE], C) Largo de aletas pectorales [8 DDE], D) Largo de aletas pélvicas [8 DDE]. Las líneas discontinuas representan los puntos de inflexión en el crecimiento y en corchetes se especifican las edades en los que estos aparecen. Note los ejes logarítmicos.
34 ______Resultados
2,0 1,8 )
m 1,6 m (
1,4
l 1,20 2
a y = -3,49x ; R = 0,85; n=44 d 1,2 u a
c 1,04 y = -3,14x ; o 1,0 l 2 u R = 0,76; n=64 c n
ú 0,8 d e p
l e d
0,6 a r u t l A
0,4 10 12 14 16 18 20 22 24 26283032343638 Largo total (mm)
Fig. 12. Ecuaciones del crecimiento alométrico y relación de la altura del pedúnculo caudal con el largo total de A. tristoechus durante el desarrollo temprano. La línea discontinua representa el punto de inflexión en el crecimiento [8 DDE]. Note los ejes logarítmicos.
LC AC LH LAPc LAPv AH HPc HC HP
LTc PH D D
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 DDE
Fig. 13. Puntos de inflexión de los coeficientes de crecimiento encontrados para A. tristoechus mantenidos a temperatura constante de incubación (28±1oC) según los días después de eclosionados (DDE). AC- ancho cefálico, AH- ancho del hocico, D- diámetro ocular, HC- altura cefálica, HP- altura pectoral, HPc- altura pedúnculo caudal, LAPc- largo aletas pectorales, LAPv- largo aletas pélvicas, LC- largo cefálico, LH- largo del hocico, LTc- largo tronco, PH- peso húmedo.
35 ______Resultados
4.4 Desarrollo histológico del tracto digestivo Cuando la larva del manjuarí emerge de la membrana del huevo, posee un tracto digestivo histológicamente indiferenciado a todo su largo, yaciendo dorsalmente al saco vitelino. Este canal alimenticio incipiente no tiene comunicación con el exterior porque tanto la boca como el ano permanecen cerrados. El epitelio consistió en una capa monoestratificada de células cúbicas-columnares con núcleo centro/basal, rodeada de una fina capa de tejido conectivo. El lumen de este tracto digestivo era estrecho con tendencia a agrandarse hacia el inicio del mismo (Fig. 14). El saco vitelino contenía numerosos glóbulos de vitelo rodeado por una envoltura vitelina y detrás aparecían un grupo de células redondeadas con núcleo esférico y citoplasma basófilo que se corresponden con el hígado incipiente que está penetrado por el tejido pancreático (Fig. 15 A,B). El volumen del saco vitelino decreció hasta su completa absorción para el final del día 11 DDE. Durante la fase de alimentación endógena, el tracto digestivo experimentó una diferenciación anatómica gradual. A los 2 DDE (12,5-14,9 mm LT) fue evidente la presencia del esófago, el estómago y el intestino (Fig. 15C). Un día después, la boca y el ano abrieron. Cuando la primera alimentación exógena se inició (4 DDE), el canal alimentario consistió en una estructura bien desarrollada y organizada: bucofaringe, esófago, estómago glandular y no glandular, intestino anterior y posterior; y ya poseía las cuatro capas de tejido característicos de los vertebrados adultos. A los ocho días después de eclosionados, la morfología gastro-intestinal del manjuarí mostró cambios numerosos y rápidos. Después del inicio exclusivo de la alimentación exógena (12 DDE), la organización y diferenciación del tracto digestivo no sufrió ninguna modificación notable. A continuación se detallan las diferenciaciones histológicas del sistema digestivo después de ocurrida la eclosión.
Bucofaringe Al eclosionar las larvas (10,6-12,6 mm LT), la región bucofaríngea se encuentra cerrada mediante una membrana que cubre la boca y el cartílago mandibular aún no está formado. Inicialmente está cubierta por una extensa capa de epitelio pseudoestratificado de dos o tres células, rodeado de tejido conectivo. La cavidad bucal y la faringe están separadas por el primer arco branquial, el cual está soportado por cartílago, y es evidente al primer día
43 ______Resultados
A
ds
cb
o
sv
B
n
an
td sv
Fig. 14. Larvas al momento de la Eclosión. A) sección sagital de la cabeza que muestra la cavidad bucofaríngea (cb) aún cerrada y células epiteliales que cubren la región anterior formando el disco suctorial (ds). B) tracto digestivo indiferenciado (td) y el ano (an) aún cerrado. Saco vitelino (sv), ojo (o), notocordio (n). H&E (A-100X, B-40X).
44 ______Resultados
A b
o s h p cb i ab sv
h
p
B
C
n s h i
es sv
Fig. 15. Sección sagital de una larva de 2 DDE. A) cabeza y parte media. B) detalle del hígado (h) y del tejido pancreático (p). C) parte media con tracto digestivo diferenciado en esófago (es), estómago (s) e intestino (i). Cavidad bucofaríngea (cb), cerebro (b), arcos branquiales (ab), saco vitelino (sv), ojo (o), notocordio (n). H&E (A,C-40X, B-400X).
45 ______Resultados
después de eclosionado (Fig. 16). Se observaron además a esta edad, los cuatro arcos branquiales constituidos por un núcleo de condroblastos y los primordios de los filamentos branquiales dirigidos hacia la cavidad faríngea (Fig. 16). Entre el tercero y el cuarto DDE, la boca se abre y se hicieron visibles el cartílago de Meckel y algunas papilas gustativas que se diferenciaron en el epitelio de la cavidad bucal hacia la región posterior (Fig. 17A). Estas papilas gustativas comenzaron a ser más numerosas con el avance del crecimiento larval. Las primeras células mucosas caliciformes PAS-positivas aparecieron a los 4 DDE (16,2-20,5 mm LT), dispersas dentro del epitelio, incrementándose sustancialmente en número tanto hacia la zona posterior de la región bucofaríngea como con el avance del desarrollo larval. Se hizo evidente a esta edad la presencia del cartílago glosohial que sostiene a la lengua (Fig. 17 A,B,C). Los dientes desarrollaron en el tejido conectivo inferior al epitelio bucofaríngeo (Fig. 18), irrumpiendo en el labio y en la región faríngea durante el período de transición hacia la alimentación exógena comprendido entre los días 4 y 10 después de la eclosión. Los dientes faríngeos y las papilas gustativas fueron claramente discernibles para el día 15 después de eclosionados (29,1-32,6 mm LT) (Fig. 19C).
Esófago El esófago se localiza directamente detrás del último arco branquial presente en la faringe, y posee el lumen más estrecho y corto de todo el tracto digestivo. Esta estructura se hizo evidente a los 2 DDE (Fig. 15C) y a los 4 DDE tuvo lugar la conexión entre el esófago y el estómago cardíaco. En este momento, el esófago estaba alongado y se podían diferenciar dos regiones, una de ellas asociadas con la secreción (anteriormente) y la otra con el transporte de alimentos (posteriormente), distinguibles por la abundancia de células caliciformes y de células ciliadas respectivamente (Fig. 19 A,B). Las células caliciformes y el borde del esófago mostraron una fuerte tinción mediante el uso del PAS, mostrando secreciones de mucopolisacáridos. La región anterior esofágica está formada por un epitelio pseudoestratificado cilíndrico, mientras que la región posterior, que conecta el esófago con el estómago cardíaco, consistió en un epitelio simple columnar. Numerosos pliegues longitudinales se hicieron presentes en la unión entre la región posterior del esófago y el
44 ______Resultados
b
n o td ab cb
sv
Fig. 16. Sección anterior de una larva de 1 DDE. Cavidad bucofaríngea (cb) y arcos branquiales (ab) con los primordios de los filamentos branquiales. Tracto digestivo indiferenciado (td), saco vitelino (sv), ojo (o) cerebro (b), notocordio (n). H&E (40X).
A B C
* * * * cM f * f cb * * bc l cmg
Fig. 17. Larva de 4 DDE. A) sección sagital de la cabeza. Cavidad bucofaríngea (cb) y la lengua (l) con las células caliciformes (*). B) faringe posterior (f) con las papilas gustativas (flechas) y numerosas células caliciformes (*). C) detalles de la faringe posterior. Boca (bc), cartílago medio glosohial (cmg), cartílago de Meckel (cM). PAS (A, B-50X) H&E (C-400X).
45 ______Resultados
* f
cb bc * * *
Fig. 18. Sección sagital de la cabeza de una larva de 9 DDE. Presencia de dientes (*) en la cavidad bucofaríngea (cb). Faringe (f), boca (bc). H&E (40X).
A B s pl
pl
cc es C
h
sv * f cz es pl
Fig. 19. Sección longitudinal de la región esofágica del tracto digestivo de larvas de manjuarí de 4 DDE (A y B) y de 15 DDE (C). A) región anterior con abundantes células caliciformes (cc) (fuertemente teñidas) y los pliegues longitudinales (pl) en la parte posterior con células caliciformes distribuidas a todo lo largo. B) detalles de los pliegues con células ciliadas. C) presencia de dientes (*) en la faringe (f). Esófago (es), estómago (s), hígado (h), corazón (cz), saco vitelino (sv). PAS (A-50X) H&E (B-400X, C-50X).
46 ______Resultados
estómago. Estos pliegues esofágicos incrementaron su complejidad y tamaño a medida que ocurría el desarrollo larval (Fig. 19).
Estómago A los dos días después de eclosionados, se hizo evidente el estómago rudimentario en forma de saco, compuesto por epitelio simple columnar (Fig. 15 A,C). Sin embargo, a los 4 DDE el estómago se diferenció morfológicamente en tres regiones histológicas: cardiaca, fúndica y pilórica (Fig. 20 A-D). La región cardiaca o región anterior no glandular, la cual se continúa al final del esófago, estaba formada por un epitelio pseudoestratificado columnar ciliado con un núcleo central y presentaba numerosos pliegues mucosos y células caliciformes. El epitelio de la región fúndica o región glandular fue similar al cardiaco aunque el lumen de esta parte es más amplio y la mucosa contiene un gran número de glándulas gástricas tanto en las paredes dorsales como ventrales, rodeadas por el tejido conectivo de la lámina propia. Estas glándulas gástricas estaban bien establecidas en el epitelio de esta región a esta edad, pero estaban ausentes en la región pilórica. Esta región posterior no glandular del estómago estaba caracterizada por un epitelio columnar con núcleo basal, algunas vacuolas apicales PAS-positivas y cilios (Fig. 20 E,F). También aparecieron numerosos pliegues mucosos que se incrementaron en tamaño y número con la edad de las larvas. El estómago está separado del intestino por un pliegue epitelial que se incrementa en tamaño y se convierte en el esfínter pilórico a los 12 DDE (Fig. 21A).
Intestino Sobre el 2 DDE, la larva posee un intestino incipiente (Fig. 14B), el cual está formado por un epitelio simple columnar. Las células intestinales o enterocitos, estaban dispuestos en una capa simple conteniendo núcleos de localización de medio a basal y presentando evidentes vacuolas apicales (Fig. 22A). A esta edad el ano aún estaba cerrado (Fig. 22B) pero a los 4 DDE, la abertura se hizo visible y la sección terminal del tracto digestivo se diferenció en un corto conducto rectal (Fig. 23A). Los ciegos pilóricos se encontraban en la parte anterior del intestino, justo detrás del esfínter pilórico y la válvula espiral comenzó a diferenciarse (Fig. 23B). Los enterocitos mostraron un borde estriado distintivo (Fig. 23C).
45 ______Resultados
A
es fu cd pi h
vb cbi sv cp
B m C D m
pm gg cn
ms cn
E F
cn
Fig. 20. Sección longitudinal de las regiones del estómago de larvas de manjuarí de 4 DDE (A). B) región cardiaca (cd) con numerosos pliegues mucosos (pm) y células caliciformes (fuertemente teñidas). C) región fúndica (fu) con gran número de glándulas gástricas (gg). D) región pilórica (pi) con numerosos pliegues mucosos. E-F) detalles de la región pilórica a 8 DDE caracterizado por células columnares con núcleo basal, algunas vacuolas apicales PAS- positiva y vellosidades. Esófago (es), saco vitelino (sv), hígado (h), vesícula biliar (vb), conducto biliar (cbi), conducto pancreático (cp), mucosa (m), tejido conectivo (cn), capa muscular (ms). H&E (A- 50X, C,D,F-400X) PAS (B,E-400X).
46 ______Resultados
A
fu m pi cn epi pex pe msc
msl cp B
Fig. 21. Larva de 12 DDE. A) región fúndica (fu) y región pilórica (pi) con alimentos. B) detalles de la pared intestinal: mucosa (m) consistente en células epiteliales columnares (enterocitos) con un borde en cepillo; tejido conectivo (cn), una capa interna de musculatura circular (msc) y una capa externa de musculatura longitudinal (msl). Esfínter pilórico (epi), páncreas exocrino (pex), páncreas endocrino (pe), ciegos pilóricos (cp). H&E (A-50X, B-400X).
s
s
i
A
B Fig. 22. Larva de 2 DDE. Región del intestino (i) y estómago (s). Ano (an), i sv saco vitelino (sv). H&E (A-400X, B- an 40X).
47 ______Resultados
B
ve
sv i
C r sv en cu an A
Fig. 23. Larva de 4 DDE. A) sección longitudinal del intestino (I) posterior con el recto (r) y el ano (an) abierto. B) detalles de la válvula espiral (ve). C) pared intestinal con enterocitos (en). Saco vitelino (sv), conducto urinario (cu). H&E (A,B- 50X, C-400X).
48 ______Resultados
Entre los 8 (22,8-24,9 mm LT) y los 12 DDE (24,1-27,0 mm LT), los pliegues mucosos comenzaron a desarrollarse a lo largo del tracto digestivo (Fig. 24). La unión del estómago y el intestino anterior comienza a curvarse, al igual que entre el intestino anterior y posterior, zona donde se localiza el bazo. El esfínter pilórico estaba bien desarrollado y aparecía en la primera curvatura del tracto digestivo. La mucosa intestinal inmediatamente posterior a este esfínter mostró un pronunciado plegamiento, indicando el desarrollo de los ciegos pilóricos (Fig. 21A). A los 12 DDE la pared intestinal presentó una capa mucosa, consistente en células epiteliales columnares (enterocitos) con un borde en cepillo; tejido conectivo, el cual se extiende hacia los pliegues de la mucosa por debajo del epitelio; y las capas musculares consistentes en una interna circular y una externa longitudinal de musculatura lisa (Fig. 21B). En general, la morfología del intestino permanece idéntica desde estos días hasta el final del estudio excepto por la elongación del intestino y el incremento de la superficie de absorción.
Glándulas anexas Al eclosionar la larva, el hígado estaba ausente. Este comenzó a diferenciarse entre el primer y el segundo día después de eclosionadas las larvas como un racimo de células esféricas con núcleo basófilo y un citoplasma eosinófilo ligero (Fig. 15 A,B). Morfológicamente, el hígado es un órgano grande que apareció ventral al intestino y formó una masa central anterior justo detrás del septo transverso que separa las cavidades pericárdicas y abdominales (Fig. 19A). Histológicamente, aparece como un tejido compacto de hepatocitos poliédricos basófilos que poseen un núcleo grande, esférico y central, un prominente nucleolo y grandes vacuolas en el citoplasma debido al almacenamiento de los productos metabólicos. A medida que la larva crece, el hígado continúa su diferenciación y los hepatocitos se disponen alrededor de sinusoides hepáticos llenos con células sanguíneas (Fig. 25 A,B,C). Sobre el día 4 DDE, la vesícula biliar y el conducto biliar comenzaron a ser visibles en las secciones histológicas (Fig. 20A). Estas estructuras aparecieron formadas por un epitelio columnar, rodeada de una capa de tejido conectivo y fibras musculares lisas hacia la parte exterior de la pared. El páncreas comenzó a diferenciarse tempranamente y se hizo evidente como un órgano compacto hacia la región posterior del hígado a los 2 DDE (Fig. 15A). El páncreas exocrino
46 ______Resultados
B en
lp
cm
Fig. 24. Larva de 8 DDE. A) sección longitudinal de la región abdominal. B) detalles de los pliegues mucosos (pm) con enterocitos (en) y células mucosas (cm). Intestino (i), saco vitelino (sv), musculatura estriada (mst), riñón (r), válvula espiral (ve), bazo (b), estómago (s), vejiga de los gases (vg), lamina propria (lp). H&E (A- 40X, B-400X).
B A Fig. 25. Diferenciación del he he h ígado y el páncreas a er diferentes edades. Hígado (h) v A ) 4 DDE, B) 8 DDE, C) 12 DD E. D) Páncreas 12 DDE. C h D Hepatocitos (he), eritrocitos s i er (er), vena (v), sinusoides (si), v er pex páncreas exocrino (pex). H&E- 400X. he
47 ______Resultados
consistió en un grupo de células piramidales (citoplasma basófilo y un prominente núcleo y nucleolo) dispuestos alrededor de un lumen central formando acinos intermezclados con vasos sanguíneos (Fig. 25D). A los 4 DDE, el conducto pancreático fue claramente distinguible, cercano al conducto biliar y a los 12 DDE se apreciaron las diferencias histológicas entre el páncreas exocrino y endocrino (Fig. 21A). Tanto el páncreas como el hígado incrementaron sus tamaños y complejidades con el desarrollo larval. En la Tabla 5 aparecen resumidos los principales cambios histológicos del tracto digestivo del manjuarí durante su desarrollo larval.
47
_ _ _ _
Tabla 5. Resumen de cambios histológicos en el sistema digestivo de las larvas de manjuarí desde la eclosión hasta los 18 _ _ _ _ días después de eclosionadas (DDE). LT (largo total). _ _ _ _
_ _
DDE _ _
Bucofaringe Esófago Estómago Intestino Glándulas anexas _
LT (mm) _ _ _
Eclosión _ _
10,6-12,6 Tracto digestivo indiferenciado que yace dorsalmente al saco vitelino sin comunicación con el exterior _ _ _
Lecitotrófica _ _
Cuatro arcos Aparece Estómago Intestino incipiente, Iniciado la _ _ _
branquiales con los rudimentario Epitelio simple diferenciación del _ _
2 primordios de los como saco columnar (enterocitos) hígado (hepatocitos _ _ _
12,5-14,9 filamentos Ano cerrado poliédricos) y _ _
Lecitotrófica páncreas exocrino _ _ _
(células piramidales _ _
formando acinos) _ _ _
Boca abierta, Se Conexión con el Diferenciación de Ano abierto, Se aprecian la _ _ _
evidencian el estómago. tres regiones: Evidencia de ciegos vesícula biliar, el _ _
cartílago de Diferenciación de las cardiaca, fúndica pilóricos, válvula espiral conducto biliar y el _ 4 _ _
Meckel y el regiones secretoras (con y pilórica y recto conducto _
16,2-20,5 _ glosohial, las células caliciformes) y pancreático _ Lecitoexotrófica _ _
papilas gustativas y transportadora (con _ _
las células pliegues longitudinales _ _ _
caliciformes ciliados) _ _
Dientes Desarrollo de pliegues Hepatocitos (con _ _
8 _
mandibulares y de la mucosa y del grandes vacuolas) _ 22,8-24,9 _ faríngeos esfínter pilórico dispuestas en _ _
Lecitoexotrófica _
sinusoides _ _ _
Numerosas papilas Los pliegues Separación del Pared intestinal formada Incremento en _
12-18 _ gustativas y células longitudinales estómago y del por mucosa, tejido tamaño de ambos _ 24,1-27 _ _
caliciformes comienzan a intestino por el conectivo, capas interna órganos _
34,4-35,2 _ incrementar su esfínter pilórico circular y externa R Exotrófica e s
complejidad y longitud longitudinal de u l
t musculatura lisa a d o s
34 ______Resultados
4.5 Ontogenia de las enzimas digestivas La concentración de proteínas totales gradualmente se incrementa con la edad de las larvas desde 3,5 mg/mL a los 5 DDE hasta 16,6 mg/mL a los 18 DDE (Fig. 26). Las diferencias significativas fueron evidentes a partir del noveno día después de eclosionadas independientemente del procedimiento seguido para la obtención de las muestras.
30 larva completa tracto gastrointestinal 25 20 L m / 15 g m 10 5
0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 DDE
Fig. 26. Concentración total de proteína de los extractos crudos de larvas de manjuarí. Cada punto representa la media de 6 mediciones + ee, se han señalado con diferentes marcas (triángulos y líneas) las diferencias significativas entre los días después de eclosionadas (DDE) (p < 0,05).
Las variaciones en las actividades de las diferentes enzimas digestivas analizadas durante el período de experimentación, se muestran en la figura 27 A-F expresadas en unidades por miligramo de proteína soluble (1) y unidades por larva (2). En la figura también fueron incluidos los valores más altos (estómago y ciegos pilóricos) de las actividades enzimáticas encontradas en el adulto como referencia. Los resultados expresados en unidades por larvas, revelaron una tendencia al incremento de la actividad con la edad, con excepción de la amilasa (Fig. 27C2). Al analizar las enzimas proteasas (Fig. 27A) se pudo apreciar que las proteasas ácidas presentaron una actividad consistentemente mayor que la de las alcalinas. La actividad de esta última enzima es escasamente detectable entre los 5-7 DDE, la cual comenzó a incrementarse discretamente a partir del 8 DDE, encontrándose una actividad en los ciegos pilóricos del adulto similar a
48 ______Resultados
la registrada para la larva entre los 8 y los 12 DDE. Sin embargo, la actividad de las proteasas ácidas se cuantifica desde el inicio de la experimentación y la muestra del estómago del adulto fue 20 U superior que el mayor valor encontrado en la larva (14 DDE).
El desarrollo de las actividades de las dos enzimas pancreáticas está resumido en la figura 27 B y C. La actividad esterasa mostró desde los 5 hasta los 12 DDE un comportamiento estable, presentando valores similares a los registrados en los ciegos pilóricos del adulto. Sin embargo, entre los 12-14 DDE ocurre un incremento significativo en su actividad con la consiguiente estabilización (Fig. 27B1). Por otra parte, la actividad de la amilasa en las larvas fue baja (Fig. 27C1), con un decrecimiento progresivo irregular desde el mayor valor encontrado a los 5 DDE (4,3 U/mg proteína) hasta un valor más o menos constante alcanzado a partir del día 9 DDE en lo adelante (alrededor 1,5 U/mg proteína); siendo este similar a la actividad observada en los ciegos pilóricos del adulto. Las actividades de las enzimas intestinales fueron variadas (Fig. 27D-F). Para la aminopeptidasa se encontró un incremento significativo para el 13 DDE y el comportamiento de su actividad durante los últimos días de experimentación fue similar a los valores encontrados para el adulto (Fig. 27D1). Las actividades de las fosfatasas ácidas y alcalinas (Fig. 27 E1 y F1, respectivamente) mostraron tendencias opuestas durante los primeros días del experimento y hasta los 12-13 DDE, seguido de un incremento ligero en ambas actividades. Las actividades de las fosfatasas alcalinas fueron consistentemente mayores que la de las fosfatasas ácidas. La actividad de las fosfatasas alcalinas en el adulto fue similar a las que mostraron las larvas durante los primeros días de experimentación. La actividad de las fosfatasas ácidas fue significativamente menor en el adulto que lo observado durante el desarrollo larval.
49 ______Resultados
50 ______Resultados
4.6 Alimentación larval 4.6.1 Dietas de iniciación Al observar el comportamiento de las larvas de manjuarí mantenidas con cinco dietas inertes (Moina congelada, Artemia congelada, Pienso, Moina congelada + Pienso, Artemia congelada + Pienso) desde el 5 DDE hasta el 18 DDE, se notó que al agregar la biomasa de artemia o moina congelada, esta se precipitaba, y después de unos segundos de haber hecho contacto con el agua y de comenzar su descompactación, las larvas se acercaban paulatinamente e iniciaban la ingesta desde el fondo, no siendo tan evidente esta conducta para el pienso comercial. La figura 28 muestra el comportamiento del peso de las larvas, haciéndose significativo el incremento del mismo a los 15 DDE para las dietas de moina congelada y de moina + pienso en comparación con las otras tres dietas. Sin embargo, a los 18 DDE ocurre una separación total del tratamiento con moina congelada, alcanzándose pesos más que duplicados con respecto al resto de los tratamientos ensayados.
160 Moina 140 Artemia M+P 120 A+P
) Pienso
g 100 m ( 80 o s e
P 60
40 20 0 8 12 15 18 DDE
Fig. 28. Peso de las larvas de manjuarí alimentadas con cinco dietas inertes (Moina congelada, Artemia congelada, Pienso, Moina congelada + Pienso, Artemia congelada + Pienso) durante 18 días después de eclosionadas (DDE). Los valores representan las medias + ee (n=21).
50 ______Resultados
Las mortalidades fueron bajas, entre 2 y 7 % para todos los tratamientos, resultando las mayores aquellas en las que aparecía el pienso como elemento de la dieta (Fig. 29).
12 a a ) 10 a
% (
a i 8 d a e m
d 6 a d i l b a 4 t r o
M 2
0 Moina Artemia M+P A+P Pienso Dietas
Fig. 29. Porcentaje de mortalidad de las larvas de manjuarí alimentadas con cinco dietas inertes (Moina congelada, Artemia congelada, Pienso, Moina congelada + Pienso, Artemia congelada + Pienso) durante 18 días después de eclosionadas. Cada barra representa la media + ee (n=137), letras diferentes indican diferencias significativas (p<0,05).
Los resultados del análisis bromatológico realizado tanto a las dietas como a las larvas del inicio de la experimentación (4 DDE) como a las del final (18 DDE) aparecen en la Tabla 6. Los porcentajes significativamente mayores de proteína total se encontraron para la dieta de moina y para las larvas de 18 DDE alimentadas con moina y con pienso.
51 ______Resultados
Tabla 6. Análisis bromatológico realizado a las dietas empleadas y a las larvas de 4 y de 18 días después de eclosionadas (DDE). (P-Pienso, M-Moina, A-Artemia). Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0,05) entre las dietas y entre las larvas de 18 DDE.
Proteína Total (%)
en base seca P 48.8 c Dietas A 63.6 b M 79.4 a L 4 DDE 80.5 A M 94.6 a R A 81.8 b 18 V M+P 79.9 b DDE A A+P 84.2 b S P 94.1 a
4.6.2 Efectos de la inanición en la etapa larval. Las larvas mantenidas en inanición comparadas con aquellas que tuvieron alimento desde el inicio de su alimentación exógena mostraron patrones de mortalidades diferentes (Fig. 30).
3 60 A Con alimento B 2,5 50 d Sin alimento Sin alimento a d 2 i 40 l a t r 1,5 30 o m
e 1 20 d
% 0,5 10 0 0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24-25 DDE
Fig. 30. Porcentaje de mortalidad diario para las larvas de manjuarí con alimento y en inanición durante los 18 días después de eclosionadas (DDE) (A), y comportamiento para las larvas en inanición hasta su muerte (B) (note cambio de escala en el eje de las y). (n=88).
52 ______Resultados
Resultaron significativamente mayores las mortalidades de las larvas en inanición solamente para los 6, 7 y 18 DDE, sin registrarse larvas muertas entre los días 9 al 13 para este tratamiento. La mortalidad de las larvas en inanición se incrementó a un 48 % en el día 23 después de eclosionadas hasta que finalmente todas murieron dos días después, sin exceder los 24,5 mm de LT y los 49,5 mg de peso húmedo. La presencia/ausencia de alimento exógeno repercutió en el crecimiento larval. Las larvas que fueron mantenidas sin alimento detuvieron su crecimiento tanto en longitud total como en peso a los 10 DDE (22,7 + 0,87 mm; 49,2 +1,29 mg) (Fig. 31 A,B). Para el resto de las variables morfométricas evaluadas se observó de manera similar este detenimiento en el crecimiento entre los días 10 y 12 después de eclosionadas (Fig. 31 C-J). La presencia externa del vitelo se hizo evidente hasta el 7 DDE para las larvas en inanición y hasta el 8 DDE para las larvas con alimento (Fig. 31 K,L). Igualmente se encontraron otras diferencias morfológicas visibles como una coloración más oscura, menor contraste entre las áreas claras y oscuras y menor brillo; cuerpo adelgazado y cabeza desproporcionalmente mayor a simple vista en aquellas larvas mantenidas en inanición (Fig. 32). No se evidenció canibalismo aunque sí una mayor inactividad en estas larvas.
Fig. 32. Comparación morfológica entre una larva de manjuarí mantenida con alimento exógeno (superior) y una larva mantenida en inanición (inferior) a los 16 DDE.
53 ______Resultados
A B 50 350 Con alimento 45 Sin alimento 300 Media+ ,95*ee 403 60
) 250
m A Con alimento B
2,535 ) m 50 ( g
d Sin alimento l Sin alimento 200 a m a ( t d 2 i o 30 40 l o
T s a
t e
o 150 r
1,5 P g 30 o
r 25 a m
L
e 1 20 100
d 20
% 0,5 10 15 * 50 0 0 * * * * * 10 *5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16* 17* 18 20 21 22 23 24-25 0 5 6 7 8 9 1011 12 13 1415 16 1718 5 6 7 8 9 101112131415161718 C D 7 14 DDE DDE DDE
6 12
) ) m 5 m m
( 10
m ( o
c o i 4 c c i l o
8 á H f
e l c e 3
d o
g o
6 r g a r 2 L a L 4 1
0 * * * * * * * * * * * 2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 6 7 8 9 1011 12 1314 15 1617 18 F E DDE DDE 4,0
3,6 3,6 3,2 ) ) m m m
( 3,2
2,8 m ( o c o i c c i l o á
H 2,4 2,8 f
e l c e d o
h o 2,0 c h * 2,4 n c n A A 1,6 2,0 1,2 * * * * * * * * 1,6 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 DDE DDE Fig. 31. Comportamiento de los caracteres morfométricos medidos en las larvas de manjuarí con alimento y en inanición durante los 18 días después de eclosionadas (DDE). A) Largo total, B) Peso, C) Largo del hocico D) Largo cefálico, E) Ancho del hocico, F) Ancho cefálico, G) Altura cefálica, H) Altura preanal, I) Largo de aletas pectorales, J) Largo de aletas pélvicas, K) Largo del saco vitelino, L) Altura del saco vitelino. Cada punto representa la media de 9 mediciones + ee. Se han señalado con asteriscos (*) los DDE en los que no existe diferencia significativa entre los tratamientos (p < 0,05).
34 ______Resultados
G H 3,4 3,6 3,2 3,2 3,0 ) 2,8 2,8 ) m m m m ( (
2,6 l a 2,4 a c i n l a á 2,4 f e r e p c 2,0
2,2 a a r r u u t t l l 2,0 A A 1,6 1,8 1,2 1,6 * * * * * * * I 1,4 0,8 J 2,6 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 2,0 DDE DDE 2,4 1,8 )
2,2 1,6 ) m m m ( m
2,0 1,4 ( s s e l a a c r
1,8 1,2 i o v t l c é
e 1,6 1,0 P
P s s a t
a 1,4 0,8 t e l e l A
A
1,2 0,6 o o g r g
r a a 1,0 0,4 L L 0,8 0,2 * * 0,6 * * * * * * * * 0,0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 DDE DDE K 6,2 2,2 L
6,0
2,0 ) ) m m m m ( (
5,8
o o 1,8 n n i i l l e e t t
5,6 i i v v
o o 1,6 c c a a 5,4 s s
l l e e d d 1,4
a o 5,2 r g u r t l a L 5,0 1,2 A * * * 4,8 * * 1,0 5 6 7 8 5 6 7 8 DDE DDE Fig. 31 (cont). Comportamiento de los caracteres morfométricos medidos en las larvas de manjuarí con alimento y en inanición durante los 18 días después de eclosionadas (DDE). A) Largo total, B) Peso, C) Largo del hocico D) Largo cefálico, E) Ancho del hocico, F) Ancho cefálico, G) Altura cefálica, H) Altura preanal, I) Largo de aletas pectorales, J) Largo de aletas pélvicas, K) Largo del saco vitelino, L) Altura del saco vitelino. Cada punto representa la media de 9 mediciones + ee. Se han señalado con asteriscos (*) los DDE en los que no existe diferencia significativa entre los tratamientos (p < 0,05).
35 ______Resultados
Se habla de esta desproporción aparente de la cabeza, pues al valorar la relación entre el largo total y el resto de las variables morfométricas analizadas, solamente se encontró desproporcionalidad para el peso. Como se aprecia en la Tabla 7, entre los 5 y los 11 DDE, para ambos tratamientos, el valor del peso (mg) duplica (2 a 2,9) al valor del largo total (mm). Sin embargo, a partir del día 12 después de eclosionadas las larvas, esta relación comienza a incrementarse exponencialmente para las larvas con alimento externo y comienza a decrecer (<1,9) para las larvas mantenidas en inanición.
Tabla 7. Relación entre el peso húmedo y el largo total de larvas de manjuarí con y sin alimento desde los 5 hasta los 18 días después de eclosionadas (DDE). Se evidencia el cambio en el cociente en los tratamientos con alimento y en inanición a partir del 12 DDE reflejados por el cambio de coloración en la tabla.
Relación Peso (mg) 1 Largo total (mm)
DDE Con alimento Sin alimento 5 2,20 2,14 6 2,23 2,30 7 2,19 2,20 8 2,21 2,29 9 2,19 2,17 10 2,48 2,17 11 2,84 2,06 12 3,46 1,96 13 3,68 1,92 14 4,26 1,85 15 4,51 1,79 16 4,82 1,82 17 5,07 1,84 18 6,58 1,75
54 ______Resultados
4.7 Generalizaciones Según lo obtenido en la presente investigación y la integración de aspectos morfo- fisiológicos, se logró definir que la fase larval de A. tristoechus transcurre durante los primeros 18 días después de eclosionados, en animales mantenidos a temperaturas constantes de 28oC. Además se pudieron identificar tres etapas dentro de esta fase del ciclo de vida, lográndose distinguir dos momentos puntuales claves de la ontogenia temprana: alrededor del día 8 y sobre el día 12 después de la eclosión. Estos dos son considerados como puntos críticos en el desarrollo larval de esta especie, asociados a modificaciones importantes, relacionado el primero con la transición de alimentación endógena a exógena y el segundo con el inicio de la transición de larva a juvenil. Estos puntos críticos vienen dados por la sincronía de cambios tanto morfológicos externos e internos (del tracto digestivo) así como fisiológicos, que permiten la supervivencia larval durante dos períodos transitorios de alta vulnerabilidad para las larvas.
55
5. DISCUSIÓN
______Discusión
Durante el desarrollo larval, muchos peces experimentan crecimientos rápidos y cambios dramáticos en su morfología, metabolismo y comportamiento en su preparación para la metamorfosis hacia juveniles (Gisbert et al., 2002; Verhaegen et al., 2007; Darias et al., 2008). Dentro de la corta fase larval del ciclo de vida del manjuarí, se encontraron cambios marcados y puntuales que permitieron identificar tres etapas del desarrollo y de nutrición de las larvas, lo cual aparece resumido en la Tabla 8. Como se aprecia, cada una de las etapas presenta sus particularidades y a continuación se profundizará en su análisis.
5.1 Etapa 1 de desarrollo larval Esta primera etapa se inicia con la eclosión y culmina con las larvas de 3 DDE, siendo esta la más corta de las tres definidas, pero que incluye importantes procesos que sientan las bases para la posterior supervivencia larval. Un ejemplo de esto lo constituye el cambio de la respiración cutánea a la respiración branquial, manifestado por el movimiento rítmico de las mandíbulas y los opérculos y el desarrollo de los filamentos branquiales, el cual es un evento trascendental y definitorio del futuro de cada individuo. En larvas recién eclosionadas, las branquias se encuentran relativamente subdesarrolladas pero tienen un crecimiento rápido (Oikawa e Itazawa, 1985), lo que permite sostener el incremento en el consumo de oxígeno requerido por los cambios en la morfología, el metabolismo, la capacidad de natación y la conducta. Similar desarrollo fue descrito, aunque más tardíamente, en larvas de Hoplias lacerdae de 5 DDE (Gomes et al., 2010), en las de Acipenser medirostris de 6 DDE (Gisbert et al., 2001; Gisbert y Doroshov, 2006) y en las de Paralichthys californicus de 18-19 DDE (Gisbert et al., 2002). Desde el punto de vista morfológico, el elemento distintivo de esta etapa es la presencia de la aleta media larval. La mayoría de los peces teleósteos la poseen durante sus primeros días de vida (Kendall et al., 1984) pues esta es una de las estructuras que define la fase larval. Esta aleta, formada en el huevo, crece después de la eclosión diferenciándose en las aletas impares (invadidas por los radios de las aletas) y finalmente sus remanentes son absorbidos (Snik et al., 1997). El tiempo en que esta aleta crece, se diferencia y/o desaparece, varía grandemente entre los diferentes grupos de peces (Balon, 1985; Fukahara, 1985) y su función es aún especulativa, aunque Snik et al. (1997), consideraron que esta
57
_
Tabla 8. Resumen de los principales resultados obtenidos del estudio realizado a la etapa larval del manjuarí A. tristoechus. ______
Etapas 1- Larva adherida 2- Larva en transición 3- Larva libre nadadora _ o _ DDE (28 C) 0-3 4- 10 11-18 _ _ _
Disco suctorial Evidente Casi absorbido Ausente _ _
Saco vitelino Presente Reducido Ausente _ _ _
Aletas pélvicas Ausentes Incipientes Radios definidos _
MORFOLOGÍA _
Aleta Caudal Sin radios Radios incipientes Radios definidos _ _
Adheridas, posición vertical Separadas, posición horizontal Libre nadadora _ _
Conducta _
Mov. rítmico mandíbula-opérculo Inicio de alimentación exógena _ _
Largo total 10,5-17,7 mm 16,2-24,9 mm 22,9-35,2 mm _ _ _
Peso 20-37 mg 32-52 mg 43-179 mg _ _
Largo del tronco Diámetro ocular, Altura cefálica, pectoral Peso húmedo _ Puntos de _ y del pedúnculo caudal. Largo cefálico, _ _
MORFOMETRÍA inflexión _
del hocico, de aletas pectorales y pélvicas _
alométricos _
Ancho cefálico, del hocico _ _
Tasas de TC= 1,30 mm/d _ _ _
crecimiento TCE= 10,2 %/d _ _
Cuatro arcos branquiales con los Boca abierta. Se evidencian: cartílago de Numerosas papilas gustativas y células _ _
primordios de los filamentos Meckel y glosohial, papilas gustativas, caliciformes _ _
H Bucofaringe _
células caliciformes, dientes mandibulares _
I _ y faríngeos _ S _ Aparece Conexión con el estómago. Diferenciación Pliegues longitudinales incrementan su _ _
T Esófago _
Regiones de las regiones secretora y transportadora complejidad y longitud _
O _ del Estómago rudimentario como Diferenciación de tres regiones: cardiaca, Separación del estómago y del intestino _ L Estómago _ Sistema saco fúndica y pilórica por el esfínter pilórico _ _
O _
Digestivo Intestino incipiente. Epitelio Ano abierto. Evidencia de ciegos Formado por mucosa, tejido conectivo, _
G Intestino _ simple columnar. Ano cerrado pilóricos, válvula espiral y recto dos capas de musculatura lisa _ Í _ _
Diferenciación del hígado y Hepatocitos (con grandes vacuolas) Incremento en tamaño de ambos _
A _
Glándulas páncreas. Presencia de vesícula dispuestos en sinusoides órganos _
_
anexas biliar, conducto biliar y _ _ pancreático _ _ _
ENZIMAS Máximo de A los 8 DDE de las proteasas ácidas, A los 13-14 DDE de todas las enzimas _ _
DIGESTIVAS actividad amilasa y aminopeptidasa analizadas _ _ Fase Lecitotrófica Lecitoexotrófica Exotrófica D i s
8+1 DDE 12+1 DDE c u s
Puntos críticos Transición de alimentación, Inicio del paso a etapa juvenil, i ó n
fuertes cambios morfogénicos marcado incremento en el peso 58
______Discusión
fuera una posible adaptación para la locomoción proveyendo un incremento superficial para la respiración cutánea larval. Durante estos primeros tres días de vida, las larvas son lecitotróficas, lo cual indica que dependen exclusivamente de fuentes endógenas de alimentación. En esta etapa, ocurre un incremento significativo en longitud corporal debido a la utilización de los elementos del saco vitelino, sin embargo el peso permanece prácticamente estable por no existir la entrada de nutrientes externos. Esto fue confirmado tanto por el estudio de concentración de proteínas en la larva, la cual se incrementa significativamente a partir del noveno DDE indicando la entrada de nuevas fuentes de proteínas a través del alimento exógeno, como por el análisis histológico del tracto digestivo. Al eclosionar, este tracto es un tubo recto indiferenciado sin comunicación con el exterior, como ha sido reportado para otros peces (Peña et al., 2003). Sin embargo, ya a solo 2 DDE están definidas tres regiones: esófago, estómago e intestino, y se hacen también evidentes el tejido hepático y pancreático. Esta diferenciación histológica indica el desarrollo rápido de este sistema a temprana edad, ocurriendo procesos importantes como son: la abertura de la cavidad bucal, la formación de la conexión entre el esófago y el estómago y la diferenciación del intestino, el hígado y el páncreas; los que hacen posible que una larva de 4 DDE pueda ingerir, digerir y asimilar el primer alimento exógeno antes de la reabsorción completa del saco vitelino. Por lo tanto, se dan los primeros pasos para que cuando las larvas entren en la segunda etapa, posean un tracto digestivo anatómicamente completo y funcional con un grado alto de organización morfológica que les permita iniciar su alimentación. Esta diferenciación temprana del canal alimentario ha sido descrita para otras especies de peces como Scophthalmus maximus (Cousin y Baudin-Laurencin, 1985), Pleuronectes ferruginea (Baglole et al., 1997), Solea solea (Boulhic y Gabaudan, 1992), Solea senegalensis (Ribeiro et al., 1999) y Pelteobagrus fulvidraco (Yang et al., 2010), aunque la edad de primera alimentación cambia según la temperatura de cultivo de las especies (Gisbert et al., 2004). De acuerdo con Dabrowski (1984), las larvas de los peces se dividen en tres grupos en relación con el desarrollo y la morfología del tracto digestivo y la secreción de enzimas en el mismo. El primer grupo, posee un estómago funcional antes del cambio de alimentación endógena a exógena; el segundo grupo incluye aquellos que no tienen un estómago
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funcional o glándulas gástricas durante la etapa larval pero que desarrollan este órgano digestivo en la metamorfosis; y el tercer grupo que incluye a aquellos peces que permanecen sin estómago durante toda su vida. El manjuarí pertenece al primer grupo, con un estómago evidente a los 2 DDE, el cual estaba morfológicamente diferenciado con tres regiones histológicamente diferentes (cardiaca, fúndica y pilórica) ya a los 4 DDE, lo cual indica el rápido desarrollo de este órgano. Esta etapa puede ser considerada riesgosa, no solo por los cambios drásticos externos e internos que en ella ocurre, sino por el peligro de depredación por su incapacidad de escape; aunque Netsch y Witt (1962) y Burns et al. (1981) consideraron, que la cardiotoxina que aparece en los huevos y en el vitelo de los lepisosteidos los ha protegido contra la depredación.
5.2 Etapa 2 de desarrollo larval La pigmentación general observada en las larvas de A. tristoechus fue similar a las descripciones realizadas para otros lepisosteidos (Suttkus, 1963; Echelle y Riggs, 1972; Moore et al., 1973; Simon y Wallus, 1989, Aguilera et al., 2002). La franja lateral despigmentada que se extiende desde la cabeza hasta la aleta caudal apareció durante esta segunda etapa (16,2-24,9 mm) de desarrollo para el manjuarí, similar a L. oculatus (22-26 mm), L. osseus (15,4 mm) y A. spatula (19,2-22,5 mm) (Simon y Wallus, 1989; Aguilera et al., 2002). En estas especies, dicha banda lateral tiene márgenes irregulares. La diferencia se presenta con el pejelagarto, el cual posee estas bandas entre las áreas oscuras de los flancos, de color amarillas, con márgenes bien definidos y que incluso surgen más tempranamente (12,5-13,8 mm) (Aguilera et al., 2002). No obstante, el impacto de la alimentación y de las condiciones de cultivo, puede resultar en patrones de coloración diferentes entre individuos de medio natural y de cautiverio, por lo que debe tomarse esto en cuenta para cualquier análisis comparativo que se realice, incluso dentro de una misma especie. El cambio morfológico y conductual más drástico observado en las larvas de A. tristoechus acontece en esta segunda etapa de desarrollo. Durante la misma, ocurre la transición de alimentación endógena a exógena, por lo que las larvas pasan a una condición lecitoexotrófica. Aunque la alimentación exógena comienza, se continúan utilizando las
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reservas vitelinas para las demandas energéticas de la captura de las presas (Moteki et al., 2001; Williams et al., 2004) y para los cambios morfogénicos intensos que tienen lugar en este período. Estos cambios morfológicos fueron corroborados por la acumulación en un estrecho intervalo de edades (4 a 8 DDE), de la mayoría de los puntos de inflexión encontrados en el estudio alométrico en el manjuarí. La supervivencia de las larvas durante esta transición depende de varios factores como: la cantidad de alimento endógeno almacenado, la tasa a la cual estas reservas son empleadas después de la eclosión (Jobling, 1995; Betti et al., 2009), la temperatura de incubación (Mendiola et al., 2007), la habilidad para capturar, ingerir y digerir el alimento (Yúfera y Darias, 2007) y la disponibilidad adecuada del mismo. Esta es una etapa decisiva en la vida larval de los peces, y está considerada como el evento crítico y vulnerable en la ontogenia inicial de los mismos, debido ya no solo a la depredación sino también a la competencia por el alimento (Coughlin, 1991; Makrakis et al., 2005) y a la posibilidad real de asimilación del mismo. Se convierten de esta forma, tanto la captura del alimento como la huida de los depredadores, acciones críticas en la supervivencia larval, que dependen del desarrollo simultáneo de órganos para la natación (Murphy et al., 2007; Huysentruyt et al., 2009) y la alimentación (Osse et al., 1997; Porter y Theilacker, 1999). Para el manjuarí, la conducta larval en esta etapa estuvo caracterizada por períodos de reposo, manteniendo su posición estática horizontal a cualquier profundidad en la columna de agua, garantizada por la funcionalidad de la vejiga de los gases, y realizando movimientos ondulatorios corporales a intervalos. Esta natación tipo anguiliforme, con una amplitud que involucra a gran parte del cuerpo, es muy común en larvas de peces (Webb y Weihs, 1986; Osse y Boogaart, 1995), la cual gradualmente evoluciona hacia el patrón de natación característico del adulto con posterioridad (Russo et al., 2007). Por estas razones, en la etapa larval de muchos peces, el desarrollo de la musculatura del tronco, más que el propio desarrollo de las aletas, ha sido definido como un factor clave en el marcado mejoramiento en la natación (Murphy et al., 2007). Sin embargo, en las larvas de manjuarí, estos movimientos ondulatorios corporales que se muestran en esta segunda etapa no conllevan un movimiento de desplazamiento en la columna del agua. Por tanto, no sorprende encontrar que a partir de los dos días después de eclosionadas, el crecimiento en longitud del tronco sea casi isométrico al igual que para la altura preanal y postanal,
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indicando un incremento constante y proporcional de esta parte del cuerpo. Patrones similares de crecimiento corporal han sido también reportados para otras larvas de peces en estadio temprano de desarrollo (Gisbert et al., 2002; Osse y Boogart, 2004; Gisbert y Doroshov, 2006). El manjuarí no se incluye dentro de los grandes nadadores, por ello, estos resultados obtenidos para el crecimiento del tronco se justifican por las prioridades establecidas en desarrollar un sistema digestivo precoz, más que el perfeccionamiento de los mecanismos de natación, que en la mayoría de los peces necesitan de la participación activa de la musculatura corporal, sobre todo en las primeras etapas de vida. La conducta alimentaria de las larvas de esta especie consistió en abandonar el estado de reposo solamente para cazar, ejecutando nados activos cortos y rápidos hacia la presa hasta colocar las mandíbulas alrededor de la pieza que intentarán atrapar. Esta natación puede basarse en las maniobras estándares y los movimientos de arrancada usualmente observados en los peces a estas edades (Barros y Higuchi, 2007). De acuerdo con Walker (2004), estas acciones están comúnmente asociadas a los ataques depredadores, los cuales involucran tanto a la aleta caudal, que genera el impulso, como a las aletas pectorales para la maniobrabilidad. El crecimiento de las aletas pectorales y pélvicas mostró alometrías positivas durante el desarrollo larval del manjuarí. Este tipo de crecimiento para las aletas pectorales ha sido también encontrado en Acipenser medirostris (Gisbert y Doroshov, 2006) y Lutjanus campechanus (Williams et al., 2004) durante los períodos lecitotróficos o exotróficos respectivamente, atribuyéndoseles una función crucial en la natación y la maniobrabilidad para la alimentación. Las aletas pectorales son las primeras en aparecer pero las últimas en obtener la totalidad de sus radios (Betti et al., 2009). En las larvas de peces teleósteos ayudan en la locomoción y en la captura de las presas a través de sus movimientos oscilatorios (Batty, 1984; Osse y Boogart, 2004). Curiosamente, las larvas de manjuarí iniciaron la alimentación sobre los 5-7 DDE, sin embargo, desde el 8 DDE en lo adelante, las aletas pectorales mostraron crecimiento isométrico. Queda de esta forma en duda la relación entre el crecimiento de las mismas y la función de maniobrabilidad que permita una natación efectiva para la alimentación, como ha sido reportado en otras especies de peces.
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Por otro lado, las aletas pélvicas tuvieron un crecimiento rápido alométrico positivo durante todos los días de experimentación, con el mayor coeficiente de crecimiento (b= 4.04) desde el agotamiento del vitelo hasta el 8 DDE. ¿Qué explicación biológica podría tener este patrón encontrado? ¿Cuál función prioritaria tendrán estas aletas pareadas en esta especie? Los peces se caracterizan por una pronunciada diversificación morfológica de estas aletas. En los lepisosteidos, la base de la aleta pectoral tiene una orientación casi horizontal con localización inferior en el cuerpo, posicionadas cerca del margen ventral del mismo. En contraste, los otros taxa derivados, comúnmente muestran aletas pectorales con bases más inclinadas verticalmente localizadas más superior en el cuerpo, aproximadamente en posición media-dorsal y cercana al centro de masa de los peces (Drucker et al., 2005). Las transformaciones en la forma, orientación y posición de las aletas pectorales están bien documentadas (Drucker y Lauder, 2002; Lauder y Drucker, 2004), pero las consecuencias hidrodinámicas de esta variación evolutiva están pobremente conocidas (Drucker et al., 2005). La otra aleta involucrada en el proceso locomotor es la caudal. Las larvas de A. tristoechus exhibieron un crecimiento isométrico en la longitud de la cola en toda la etapa larval, en contraste con la alometría positiva encontrada en Acipenser medirostris (Gisbert y Doroshov, 2006) y en Corydoras aeneus (Huysentruyt et al., 2009), y la alometría negativa en Sparus aurata (Russo et al., 2007). El punto de inflexión hallado en esas especies ha sido relacionado igualmente con el mejoramiento de la capacidad natatoria. Una posible explicación para estos patrones de crecimiento alométrico ha sido el cambio en el estilo de natación (Snik et al., 1997; Osse y Boogaart, 1999) de un modo anguiliforme a un modo de natación subcarangiforme. En este, la parte caudal del cuerpo muestra grandes amplitudes, pero el resto permanece relativamente rígido (Osse, 1990). Además, Klingenberg y Froese (1991) encontraron en 17 especies de peces marinos que la altura corporal detrás del ano exhibía una fuerte alometría positiva, indicando que la parte posterior del cuerpo comenzaba a ser relativamente más robusta con el incremento de la talla larval. Estos autores también relacionaron este patrón, con el cambio en el estilo de natación durante el crecimiento larval, asociado con el incremento en la importancia de la región caudal para la locomoción. Para el manjuarí, además del crecimiento isométrico que mostró la longitud de la cola, se encontró una alometría negativa en la altura del pedúnculo caudal con el mismo
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punto de inflexión hallado para las aletas pareadas. Queda, por lo tanto, discernir para esta especie estas particularidades con las estructuras relacionadas con la natación. Es por ello que estudios detallados en larvas de lepisosteidos, en combinación con investigaciones de la cinética de la natación, tanto en condiciones de laboratorio como de campo, podrán esclarecer este patrón de crecimiento obtenido. Pero no solamente es necesario el desarrollo de estructuras que garanticen el inicio de la natación activa, ya sea para la huída de los depredadores, como para la captura del alimento de una especie que es estrictamente carnívora, sino que simultáneamente debe existir un perfeccionamiento de aquellas estructuras o sistemas, que permitan la eficiente asimilación del alimento externo, una vez agotadas las reservas vitelinas. Ejemplo de esto son el desarrollo cefálico y del tracto digestivo ocurrido en esta segunda etapa larval del manjuarí. Los patrones de crecimiento encontrados para la cabeza y el hocico fueron positivamente alométricos para sus longitudes y negativamente alométricos para sus anchos, lo cual indica un alargamiento y un estrechamiento de la región cefálica durante el desarrollo temprano. El crecimiento alométrico positivo de la cabeza es un aspecto común en la ontogenia de los peces, como se ha presentado en loricaridos (Strauss, 1995; Schmidt, 2001), esturiones (Snik et al., 1997; Gisbert, 1999; Osse y Boogart, 2004) y peces gatos (Geerinckx et al., 2008; Huysentruyt et al., 2009). Kammerer et al. (2005) examinaron dos especies de lepisosteidos (Atractosteus spatula y Lepisosteus osseus) y encontraron una fuerte alometría positiva para la longitud de las mandíbulas relacionada con el tamaño del esqueleto durante la transición de larva a adulto, seguido por una débil alometría negativa mientras el animal continuaba su crecimiento. Gisbert y Doroshov (2006) consideraron que el crecimiento rápido de la longitud cefálica, está asociado probablemente con el desarrollo de los sistemas nervioso (cerebro), sensorial (visión y olfación), respiratorio (arcos y filamentos branquiales) y alimentario, pues un incremento cefálico asociado con mayor desarrollo del sistema nervioso, permite una mejor toma de oxígeno y de partículas alimenticias de mayor tamaño (Choo y Liew, 2006). Alometrías fuertes en los componentes tróficos del esqueleto, están generalmente asociados con cambios en la selección de las presas y en el comportamiento alimentario (Emerson y Bramble, 1993). Kolmann y Huber (2009) consideraron que una alometría positiva en el aparato alimentario, ayuda a los depredadores a superar las limitaciones funcionales
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impuestas por su presa y puede conferirle una ventaja competitiva sobre una trayectoria ontogénica isométrica, facilitando el acceso a fuentes tróficas exclusivas mucho más temprano en su ciclo de vida. Para los lepisosteidos vivientes, la conducta de alimentación está representada por movimientos generales lentos seguidos de rápidos ataques, más que de una búsqueda activa (Kammerer et al., 2005); por lo que la elongación del hocico encontrada en las larvas de manjuarí es ventajosa para la captura de presas de nado rápido como son Moina sp y Artemia sp. Los puntos de inflexión encontrados para las longitudes-anchuras de la cabeza y el hocico fueron a los 6 DDE, momento en el que está ocurriendo el agotamiento del vitelo. Por esta razón, la larva tiene que obligatoriamente cambiar hacia la alimentación exógena y por lo tanto se requiere la presencia de un aparato funcional que permita la toma de alimento. Es por esto que es consistente, que cercano al punto de agotamiento del saco vitelino, los esfuerzos morfogénicos externos estén enfocados a la elongación de la cabeza, con el objetivo de completar la formación de un aparato esencial que le posibilite la localización y la toma de presas de tamaños cada vez mayores, como una prioridad funcional para la larva que le permita su supervivencia. Debido a los resultados encontrados en el análisis alométrico realizado en las larvas de manjuarí para las aletas pareadas y caudal, así como para el crecimiento del tronco y de la región cefálica, se puede inferir, que estas aletas son las estructuras principales para el inicio del ejercicio de la natación en esta etapa, pero que el desarrollo cefálico es el que garantiza la eficiencia para el inicio de la alimentación exógena. El proceso de captura de las presas comienza a estar plenamente asegurado en A. tristoechus a los 8 DDE, por el temprano desarrollo mandibular, la presencia de los dientes maxilares y faríngeos y la proliferación de las células caliciformes y de las papilas gustativas. Estas papilas son estructuras quimiosensoriales consistentes en células epiteliales modificadas, que están implicadas en la selección del alimento y juegan un papel crucial en la degustación: exploración y reconocimiento del alimento (Sánchez-Amaya et al., 2007). Tanto los peces como otros vertebrados, utilizan sus células gustativas para monitorear el alimento potencial e incluso seleccionar o rechazar sustancias de acuerdo con su selectividad. El número de papilas gustativas se incrementa con el crecimiento de los
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peces y la diferencia en su número total y distribución aumenta la eficiencia de degustación (Fishelson et al., 2004; Kumari et al., 2005). Por otra parte, la presencia de las primeras células caliciformes funcionales secretoras de mucus fue detectada en el tracto digestivo del manjuarí en la región bucofaríngea y en el esófago a los 4 DDE. Específicamente en el esófago, aparecen tapizando el lumen de la región anterior, pues hacia la parte posterior del mismo abundan las células ciliadas, las cuales han sido descritas en larvas de peces teleósteos (Morrison, 1993) justo antes de la abertura bucal y relacionadas con el transporte a través del canal digestivo (Tytler y Blaxter, 1988). Estas secreciones mucosas juegan un papel importante en la absorción de sustancias fácilmente digeribles -como los disacáridos y los ácidos grasos de cadena corta- (Osman y Caceci, 1991); en la digestión pregástrica (Baglole et al., 1997) y en la lubricación y protección de la mucosa digestiva (Gisbert et al., 1999; Arellano et al., 2002), por lo que su presencia temprana ayuda el proceso de inicio de la alimentación. El tiempo en que tales células mucosas surgen, varía entre las especies, pero usualmente su aparición coincide con la abertura de la boca y con la primera alimentación exógena, como ocurre en Pleuronectes ferruginea (Baglole et al., 1997), Solea solea (Boulhic y Gabaudan, 1992), Dentex dentex (Santamaría et al., 2004) y el manjuarí (presente estudio); o algunos días después como en Dicentrarchus labrax (García- Hernández et al., 2001), Diplodus sargus (Ortiz-Delgado et al., 2003), Paralichthys californicus (Gisbert et al., 2004) y Pagrus auriga (Sánchez-Amaya et al., 2007). En nuestro caso, estas células tanto en la zona bucofaríngea como en el esófago aparecen simultáneamente, aunque en otros peces como Pagrus auriga (Sánchez-Amaya et al., 2007) existe un desfase, apareciendo primero a los 5 DDE en el esófago y posteriormente en la cavidad bucofaríngea (9 DDE). Además de estos cambios evidentes que ocurren en la región cefálica, tanto externos como internos, también se presentan procesos significativos en la región del tronco, no solo en la diferenciación y crecimiento de los miótomos como anteriormente se planteó, sino también en el desarrollo de los órganos del sistema digestivo (Gisbert y Doroshov, 2006). Consistente con este criterio fueron los resultados histológicos y enzimáticos obtenidos en esta investigación. Durante esta etapa de desarrollo larval del manjuarí, se observaron cambios en las actividades de varias enzimas digestivas. Estos cambios se atribuyen al crecimiento y
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desarrollo de nuevos órganos y tejidos y no al efecto que tanto la ración de alimento como el alimento en sí pueda ejercer, pues se empleó la misma dieta ofrecida ad libitum durante toda la experimentación. Además, para minimizar el posible efecto de las enzimas provenientes de las presas no digeridas en nuestras mediciones, las larvas fueron mantenidas en ayuno una hora antes de los muestreos. En esta segunda etapa, se presenta un máximo de actividad enzimática en el día ocho después de eclosionadas para las proteasas ácidas, la amilasa y las aminopeptidasas, lo cual puede estar asociado al momento crítico de la transición de alimentación endógena a exógena. Moyano et al. (1996) y Faulk et al. (2007) resumieron que en el tracto digestivo de numerosas especies de peces marinos, se ha manifestado la actividad de las proteasas alcalinas muy tempranamente (incluso antes de la abertura de la boca), mientras que la actividad de las proteasas ácidas se detecta muy tarde. En nuestro caso, el inicio de la actividad de las proteasas alcalinas ocurrió sobre el 8 DDE, mientras que la actividad de las proteasas ácidas fue cuantificable desde el 5 DDE y fue consistentemente mayor que la actividad de las proteasas alcalinas durante toda la etapa larval. Este patrón de actividad proteásica ácida alta y temprana, indica la presencia de un estómago funcional con desarrollo de glándulas gástricas. Esto fue corroborado a través del estudio histológico, en el que se hacían evidentes estas estructuras a los 4 DDE con una diferenciación en tres regiones diferentes: cardiaca, fúndica y pilórica. Ejemplos de este patrón, ha sido observado en muy pocas especies, como los salmones y los esturiones (Buddington 1985; Buddington y Dorshov 1986; Gawlicka et al., 1995; Zamani et al., 2009), Pseudoplatystoma corruscans (Lundstedt et al., 2004), y lepisosteidos como el catán (Mendoza et al., 2002a) y el pejelagarto (Iracheta, 2006); las que poseen un estómago funcional con secreción de enzimas tipo pepsina desde el inicio de la alimentación exógena y antes de la completa reabsorción del vitelo. Generalmente, las glándulas gástricas aparecen más tardíamente en los peces, entre los 13- 35 DDE como en Melanogrammus aeglefinus (Hamlin et al., 2000), Pleuronectes ferruginea (Baglole et al., 1997), Pagrus auriga (Sánchez-Amaya et al., 2007), Pagellus eryhtrinus (Micale et al., 2006) y Scophthalmus rhombus (Hachero-Cruzado et al., 2009); o incluso más tarde (60 DDE) como en Sparus aurata (Elbal et al., 2004). En las regiones cardiaca y pilórica del estómago están ausentes las glándulas gástricas, pero se aprecian
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cilios, sugiriendo que, al igual que en otras especies (Peña et al., 2003), estas partes del estómago están involucradas en la distribución y el mantenimiento de una capa de mucus, que ayuda a la musculatura digestiva en el movimiento de las partículas ingeridas (Buddington y Dorshov, 1986). De acuerdo con algunos autores, la diferenciación del estómago es un evento decisivo en la fisiología nutricional de las larvas de peces, permitiendo conductas alimentarias precoses y la digestión eficiente de proteínas (Segner et al., 1994; Martínez et al., 1999, Guan et al., 2010). Los resultados obtenidos de actividad de las proteasas en el manjuarí, indican el mayor protagonismo del estómago con respecto al intestino (particularmente los ciegos pilóricos) en la digestión proteica, no solo en la etapa larval. Las observaciones histológicas mostraron, que alrededor del cuarto día después de eclosionadas las larvas, los ciegos pilóricos aparecen como pequeñas evaginaciones del epitelio del intestino anterior y el pronunciado plegamiento en la conexión intestinal ocurre entre el día 8 y el 12. Los ciegos pilóricos están involucrados en la absorción de los nutrientes (lípidos) y en la digestión, principalmente por el incremento en el área superficial (Barrington, 1957), sin que esto conlleve a un alargamiento o engrosamiento del propio intestino. Ellos facilitan el transporte de los nutrientes que ya puedan ser absorbidos al torrente sanguíneo, antes de que el bolo de comida pase al intestino, donde continuará la ruptura del mismo y la absorción (Baglole et al., 1997). Además, neutralizan la acidez del alimento proveniente del estómago, antes de pasar al intestino y esto ha sido confirmado por la ausencia de ciegos pilóricos en los peces carentes de estómago (Gawlicka et al., 1995). El epitelio mucoso intestinal, consistente en células columnares absortivas con un distintivo borde en cepillo y con células caliciformes intercaladas productoras de mucus, comienza una intensificación en su plegamiento entre los 4 y los 8 días, con lo cual incrementa su área superficial de absorción. Este plegamiento contribuye además a la mezcla del alimento con los productos hepáticos, pancreáticos, así como con el mucus secretado por las células caliciformes (Grau et al., 1992). Las aminopeptidasas, que se localizan en el borde en cepillo de los enterocitos, completan la digestión luminal mediante la hidrólisis de péptidos (Letelier et al., 1985; Guerreiro et al., 2010) y son además, indicadoras de la maduración intestinal (Moyano et al., 2005). Como se evidencia en el patrón de actividad de esta
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enzima en el manjuarí, hasta los 8 DDE ocurre un incremento de la misma, debido principalmente a este aumento superficial de la capa mucosa del intestino. En contraste con las otras enzimas analizadas, la amilasa no mostró una tendencia clara. La detección temprana de la amilasa ha sido reportada en otras larvas de peces (Baragi y Lovell 1986; Munilla-Morán et al., 1990; Chakrabarti et al., 2006). Sin embargo, en el caso del manjuarí, la actividad no se incrementa con la edad sino que fluctúa a niveles bajos, similar a los valores detectados en los ciegos pilóricos del adulto. En numerosos peces marinos carnívoros, la expresión de la amilasa decrece durante el desarrollo larval (Cahu et al., 2004; Ribeiro et al., 2008) y se ha sugerido que esto está fuertemente relacionado con hábitos específicos de alimentación (Horn et al., 1986; Falcón-Hidalgo et al., 2011). En nuestros ensayos, durante los primeros días, la actividad de la amilasa fue baja, similar a lo reportado para A. spatula (Mendoza et al., 2002a) y para A. tropicus (Iracheta, 2006). Esto puede ser explicado dentro del contexto de los hábitos alimentarios estrictamente carnívoros de las larvas de lepisosteidos, ya que se ha observado que los peces con hábitos herbívoros y omnívoros requieren de niveles más elevados de actividad amilásica (Munilla- Morán y Saborido, 1996b; Furné et al., 2005). Estudios adicionales se necesitarían para determinar si diferentes niveles de carbohidratos en la dieta, cambian el patrón de actividad de esta enzima, pues se ha observado que este puede ser influenciado, incrementándose hasta cierto límite, al aumentar los niveles de carbohidratos en el alimento (Peres et al., 1996; Pérez-Jiménez et al., 2009). Otra observación que refuerza la idea de la baja capacidad aminolítica de esta especie es cuando la actividad se expresa en relación al individuo. Para casi todas las enzimas se observó un incremento progresivo en la actividad, lo cual se relaciona con el perfeccionamiento esperado del equipamiento enzimático a medida que el animal crece (Cahu y Zambonino, 1994; Moyano et al., 1996; Faulk y Holt, 2009; Buentello et al., 2011). La excepción fue la amilasa, donde este patrón no se encontró, posiblemente debido a que la influencia de esta enzima es escasamente significativa durante todo el desarrollo ontogénico temprano. Precisamente por iniciarse en esta etapa el proceso de alimentación, se probó el efecto que tenía el alimento en el crecimiento y supervivencia de las larvas de manjuarí. Por primera vez para esta especie se evaluaban cinco dietas inertes consistentes en pienso comercial y crustáceos congelados. Esto fue un importante avance en la metodología empleada hasta el
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momento en el cultivo del manjuarí, pues por primera vez se demostró la capacidad de estos animales de alimentarse del fondo y de alimento inerte, abriendo nuevas posibilidades para su mantenimiento en cautiverio. Durante el período que comprende esta segunda etapa larval, no se encontraron diferencias significativas entre las dietas probadas en cuanto al peso de las larvas, pues aun el proceso de asimilación de los nutrientes no está morfo- fisiológicamente respaldado para el máximo aprovechamiento de los mismos, lo cual fue confirmado por el estudio de concentración de proteínas en la larva. Otro aspecto evaluado fue el efecto de la inanición. Numerosos estudios experimentales de inducción de la hambruna en larvas de peces se realizan habitualmente, principalmente en aquellas especies de interés acuícola. Los objetivos de los mismos van enfocados hacia la búsqueda de la reducción de los costos por alimentación y a la detección de una serie de parámetros utilizables para la evaluación del grado de nutrición de las larvas, ya sea a través del empleo de métodos histológicos (Ostaszewska et al., 2005; Olsen et al., 2008), fisiológicos (Therese et al., 2008a,b), morfométricos (Uriarte y Balbontín, 1987) y de índices de condición, basados en la relación de ácidos nucleicos (Tanaka et al., 2008; Masuda et al., 2009). La inanición es un estado que experimentan naturalmente algunos peces e invertebrados durante períodos en que el alimento escasea (McCue, 2010). En el medio natural, las larvas de peces normalmente tienen una tasa alta de mortalidad debido, además de la depredación y de condiciones ambientales desfavorables, a la inanición o la limitación de las fuentes alimentarias (Sheng et al., 2007). La supervivencia generalmente se logra, por la reducción de la tasa metabólica, seguida de su restablecimiento a condiciones normales después de la alimentación, y por la preparación previa mediante la acumulación de reservas en los tejidos (Viana et al., 2007; Furné et al., 2008; Salin et al., 2010). Tanaka (1972) señaló que la falta de alimento tiene una serie de implicaciones muy importantes en el desarrollo posterior de las larvas, ya que las limita a dos posibilidades: a) tener éxito en alimentarse oportunamente y poder obtener energía suficiente para continuar la búsqueda de alimento y crecer, o b) fallar en su primera alimentación e iniciar la absorción de sus propios tejidos, haciéndose más débiles y aumentando la susceptibilidad a las enfermedades o a ser depredadas.
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En los bioensayos realizados con las larvas de manjuarí, resultó interesante encontrar una anticipación en el agotamiento externo del vitelo para las larvas en inanición. Esto coincide con lo descrito por Heming et al. (1982) en Oncorhynchus tswaytcha. Ellos concluyeron que la tasa de absorción del vitelo, que normalmente tiende a crecer conforme se intensifica el proceso de desarrollo larval (Williams et al., 2004), es afectada por la presencia de alimento en el intestino, provocando que la misma disminuya y se comiencen a utilizar los nutrientes del alimento ingerido, lo que permite conservar parte de las reservas vitelinas. Como se aprecia, todos los caracteres morfométricos medidos, muestran un comportamiento similar tanto en las larvas alimentadas como en inanición durante esta segunda etapa. Esto coincide con los resultados obtenidos con las diferentes dietas, indicando que en esta etapa son las reservas vitelinas las que garantizan los procesos morfogénicos que ocurren en las larvas. De hecho, al analizar el crecimiento en larvas alimentadas, se encontró que durante los día 7 al 11 después de eclosionadas, ni la longitud corporal ni el peso se incrementan significativamente, llegando incluso a mostrar tasas negativas discretas momentáneas. Patrones similares de reducción en el crecimiento han sido también reportados para numerosas especies de teleósteos (Blaxter, 1969; Yada y Furukawa, 1999; Gisbert et al., 2002; Geerinckx et al., 2008).
5.3 Etapa 3 de desarrollo larval Después de esta etapa crítica de transición, las larvas son exotróficas, capaces de detectar y depredar el zooplancton de la columna de agua. Durante esta tercera etapa, el alargamiento del hocico -que se hace mucho más evidente-, la presencia de los dientes afilados, así como el desarrollo de las aletas y sus radios, perfeccionan los hábitos carnívoros de esta especie. Con el patrón corporal general alargado ya parecido a un juvenil, las larvas comienzan a ser un poco más activas y perfeccionan su método de alimentación visual, aunque hacen pocos movimientos innecesarios. Su conducta alimentaria está caracterizada por la torcedura de todo el cuerpo hacia una forma sinusal una vez detectada la presa, seguido por un estallido rápido de la natación hacia la misma y el movimiento lateral de la cabeza para su captura. Por ello, es imprescindible la intervención de la aleta caudal, cuyo crecimiento y la osificación de sus radios, marca esta transición hacia el patrón de natación del adulto, que se hizo evidente en las larvas con talla mayor a 25 mm.
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Estas larvas libres nadadoras se caracterizan por un pronunciado incremento diario en el peso, debido a la efectiva asimilación de los nutrientes externos. Esta asimilación fue corroborada, tanto por el incremento significativo de los niveles proteicos de las larvas a partir del 9 DDE, como por los resultados obtenidos en el experimento del efecto de la inanición, en el cual a partir del 11 DDE comienzan a evidenciarse los cambios drásticos para casi todos los caracteres morfométricos analizados entre las larvas en inanición y las alimentadas. Igualmente, al aplicar el análisis alométrico al crecimiento del manjuarí relacionado con el peso, se encontraron dos fases: los primeros 14 días, con crecimiento alométrico negativo lento y los últimos cuatro días con un crecimiento más rápido igualmente con alometría negativa, indicando que este día marca las diferencias significativas en el coeficiente de crecimiento para esta variable. Pero además, alrededor de este punto de inflexión para el peso, el estudio de la ontogenia de las enzimas digestivas, reveló otro máximo de actividad para casi todas las enzimas analizadas, principalmente las proteasas, esterasas y las enzimas localizadas en la mucosa intestinal. La actividad esterasa fue detectada tempranamente y se mantuvo durante todo el período experimental, la cual ha sido encontrada en otras especies como Theragra chalcogramma (Oozeki y Bailey 1995), Morone saxatilis (Ozkizilcik et al., 1996), Melanogrammus aeglefinus (Perez-Casanova et al., 2004), Epinephelus coioides (Eusebio et al., 2004) y Dentex dentex (Gisbert et al., 2009). Oozeki y Bailey (1995) sugirieron la existencia de dos tipos de lipasas, una relacionada con la absorción del saco vitelino, y la otra -cuya actividad desarrolla más tardíamente- podría estar relacionada con la digestión de los lípidos exógenos. En el presente estudio, la actividad esterasa alta y su incremento continuado, reflejan la importancia de esta enzima pancreática en la utilización de los lípidos y su incremento marcado entre los 12-14 DDE, pudiera estar indicando el desarrollo del páncreas exocrino, la movilización de los lípidos acumulados y el incremento de la capacidad de la digestión de los lípidos contenidos en el alimento exógeno. A esta conclusión se arriba al verificar que la actividad esterasa del adulto, es similar a la de las larvas durante los primeros días de vida, indicando la importancia de esta enzima al inicio de la alimentación exógena. Las fosfatasas, localizadas en el interior de los enterocitos, están involucradas en la digestión intracelular de las proteínas fosforiladas (las fosfatasas ácidas), los procesos de
71 ______Discusión
absorción y el transporte intestinal (fosfatasas alcalinas) (Letelier et al., 1985; Guerreiro et al., 2010). El decrecimiento en la actividad de la fosfatasa ácida y el concomitante incremento en la actividad de la fosfatasa alcalina durante la etapa temprana del desarrollo, que se hizo evidente en este estudio, también fue encontrado por Álvarez (2003) en Paralabrax maculatofasciatus y por Aguilera (1999) en A. spatula. La actividad alta de las fosfatasas alcalinas, en relación con las actividades de las fosfatasas ácidas y las aminopeptidasas en las larvas de manjuarí, denotan el significado de la absorción intestinal. Este resultado, junto con el corto intestino que poseen (con una válvula en espiral que incrementa el área de absorción y el tiempo de permanencia del alimento) y la menor actividad proteolítica intestinal en comparación con el estómago; sugiere como papel esencial del intestino la absorción de los nutrientes. Sin embargo, en la mayoría de las larvas de peces teleósteos, como anteriormente se discutió, aunque el intestino tiene igualmente una función en la absorción, posee primariamente un peso importante en la digestión proteica, debido al desarrollo prematuro de las proteasas alcalinas que asumen el papel principal en la digestión (Munilla-Morán y Saborido, 1996a). No obstante, sería interesante realizar un estudio histológico sobre la absorción lipídica y proteica en esta región del tracto digestivo del manjuarí, como la realizada en Centropomus parallelus por Shimada et al. (2010), que permita corroborar esta afirmación. Desde el punto de vista histológico, durante esta tercera etapa larval, la morfología del tracto digestivo permanece idéntica, excepto por el aumento de la superficie de absorción dado por el incremento de los pliegues mucosos del esófago, estómago e intestino, los cuales incrementaron su complejidad y tamaño con la edad de las larvas. Como elemento distintivo de esta etapa, aparece una curvatura en el tracto digestivo, en la unión del estómago y el intestino anterior. Surge además el esfínter pilórico, e inmediatamente detrás de este esfínter ocurre un pronunciado plegamiento de la mucosa intestinal, indicando el incremento de los ciegos pilóricos. Tanto el desarrollo de esta estructura como el de las glándulas gástricas, están considerados como los mayores eventos en el desarrollo del tracto digestivo (Baglole et al., 1997). Como ha sido propuesto por varios autores, sus presencias designan el final del período larval y el inicio del período juvenil (Bisbal y Bengtson, 1995; Sarasquete et al., 1995).
72 ______Discusión
En sentido general, los patrones de actividad de las principales enzimas involucradas en el proceso digestivo en las larvas de manjuarí en esta etapa, así como el desarrollo morfológico del tracto digestivo, indican el perfeccionamiento y la funcionalidad temprana de este sistema, haciendo válido el empleo de dietas artificiales. La evaluación de las cinco dietas inertes de iniciación, mostró que a partir de los 12 DDE los tratamientos que incluía a la moina como ingrediente, conllevaban a un incremento significativo del peso. Sin embargo, solamente con la dieta de moina congelada es que se encontraron a los 18 DDE los mejores resultados tanto en incremento en peso como en la supervivencia, obteniéndose incluso valores de peso semejantes a lo logrado en otras experimentaciones con alimento vivo bajo las mismas condiciones experimentales. Para otros lepisosteidos, el empleo de dietas artificiales es un hecho (Mendoza et al., 2002a; Márquez et al., 2006), sin embargo, los resultados obtenidos con el pienso para el manjuarí, indicaron que esta fue la dieta menos apropiada en comparación con el resto. A pesar de ser el pienso el que menor porcentaje proteico presentó (48,8 %) cuando se realizaron los análisis bromatológicos, éste se encuentra dentro de los valores establecidos (sobre el 50%) para los requerimientos de las larvas de peces, pues se sabe que las mismas necesitan de altos contenidos proteicos en su dieta (Xiaobo et al., 2003), como base para el crecimiento de la musculatura y como fuente de energía principal para el sustento metabólico de los innumerables procesos fisiológicos que en ellos se dan (Rønnestad et al., 2003). En primera instancia, se ha postulado que el aprovechamiento bajo de las dietas artificiales, se debe al desarrollo incompleto del tracto digestivo y por lo tanto a su funcionamiento parcial en relación con la producción de enzimas digestivas (Kolkovski et al., 1993). Este no es el caso del manjuarí, ya que los resultados muestran que las larvas tienen, incluso antes de iniciar la alimentación exógena, un tracto digestivo morfológica y fisiológicamente más desarrollado que la mayoría de las larvas de otros peces que han podido ser acondicionadas al consumo de dietas artificiales. Debido a las observaciones realizadas in situ durante los bioensayos, en los que se evidenció que los animales bajo este tratamiento mostraron desinterés por la toma del alimento y muchas veces, una vez tomado este, era regurgitado, se considera que sea la baja tasa de ingestión de esta dieta artificial la causa más probable de los resultados obtenidos.
73 ______Discusión
Este mismo problema ha sido a menudo observado principalmente en aquellas especies con fuertes hábitos carnívoros (Lovshin y Rushing, 1989). Por otra parte, la preferencia marcada de los lepisosteidos por organismos pelágicos, encontrados en el contenido estomacal de larvas y juveniles, sugieren que su alimentación se realiza principalmente en la superficie (Echelle y Riggs, 1972; Pearson et al., 1979), por lo que pudiese pensarse que la baja flotabilidad del pienso utilizado, haya contribuido a su poca disponibilidad en la columna de agua durante el tiempo apropiado para ser consumida. Sin embargo, quedó demostrado en este mismo experimento, que las larvas se adaptaron a comer del fondo la moina y artemia congelada, por lo que el problema de la flotabilidad puede haber influido, pero no haber sido el factor determinante en los bajos pesos encontrados en las larvas alimentadas con pienso. No obstante, la utilización de dietas extruídas podría mejorar la tasa de ingestión en comparación con dietas peletizadas, como encontraron García et al. (1997) en larvas de A. tropicus y Mendoza et al. (2002a) en larvas de A. spatula, por la conducta alimentaria que tienen estos peces. Consideramos que el punto clave se centra en el empleo de dietas que sean atractivas para las larvas. Con este fin, la aceptación del pienso puede ser incrementado utilizando atrayentes alimenticios (Pawson, 1977; Kolkovski et al., 1997; Reig et al., 2003; Engrola et al., 2009) que favorezcan la detección, identificación y consumo del mismo, además de tener en cuenta las características físicas como el tamaño (Hossain et al., 2000) y la textura, para hacerlo realmente asequible por las larvas de esta especie. Otros elementos importantes radican en tener en cuenta la composición de las dietas, basada en los requerimientos nutricionales de la especie (Giacometti et al., 2009), así como en la serie de factores extrínsecos e intrínsecos -como las regulaciones neuro-hormonales (Zambonino y Cahu, 2007; Kortner et al., 2010)- que permitan la asimilación de estas dietas por el individuo. Todos estos aspectos, apoyados en las diversas técnicas que existen para la producción de alimentos artificiales, permiten que la dieta sea realmente asimilable por las especies, en dependencia de sus hábitos alimentarios y de la etapa del ciclo de vida en la que se encuentren. Queda claro, que este bioensayo fue un primer intento de acondicionar las larvas de manjuarí al consumo de dietas inertes, por lo cual es necesario realizar un número mayor de pruebas, para lograr definir progresivamente una forma adecuada de sustituir el alimento
74 ______Discusión
natural por dietas artificiales, tan necesario en el establecimiento de las metodologías de cultivo a gran escala. Por otra parte, fue interesante encontrar en el experimento del efecto de la inanición, que las mortalidades no excedieron el 2,5 % diario en cualquiera de los tratamientos desde el 5 hasta el 18 DDE, llegando incluso a ser nula en varios de los días de experimentación. No fue hasta el día 23 después de eclosionadas que aparecieron las mortalidades masivas para las larvas sin alimento, que no sobrepasaron los 25 DDE. Sin embargo, en la literatura aparecen reportes de resistencia a la ausencia total de alimento de solo seis días para Paralichthys olivaceus (Bolasina et al., 2006), de siete días para Hippocampus trimaculatus e H. kuda (Sheng et al., 2007) y de 15 días para A. tropicus y A. spatula (Aguilera, 1999). Estos patrones de mortalidad encontrados para las larvas de manjuarí son el reflejo de la capacidad de resistencia de esta especie, las cuales pueden sobrevivir a períodos prolongados de inanición de hasta 25 días, por lo que posiblemente este haya sido un factor clave en el éxito ecológico que han tenido. Esta resistencia en la etapa larval puede estar asociada al contenido energético del vitelo en el huevo, de manera similar a lo señalado por Dabrowski et al. (1985) en Acipenser baeri y como han encontrado Kristjhnsson y Vollestad (1996) en Oncorhynchus mykiss. También puede deberse a cambios fisiológicos, como han sido descritos en otras especies de peces como son: la reducción de algunos metabolitos en el plasma como la glucosa, amino ácidos y el colesterol sanguíneo (Ostaszewska et al., 2005; Pérez-Jiménez et al., 2007), la movilización de grasa en los tejidos (Regost et al., 2001) y la disminución del consumo de oxígeno (Yengkokpam et al., 2008). Sería muy interesante poder profundizar en los mecanismos que permiten esta resistencia a períodos prolongados de ausencia de alimento encontrados en la etapa larval de A. tristoechus. Los patrones de coloración hallados en las larvas en inanición coinciden con lo descrito por Aguilera (1999) para A. spatula, sin embargo, no se mostraron conductas de canibalismo como sí encontró Hernández (1999) para A. tropicus en ensayos similares de ausencia de alimento. Esta conducta para el pejelagarto ha sido asociada a la inanición y a la densidad alta de siembra, donde el canibalismo o conductas semejantes garantizan a las larvas la supervivencia, confiriéndoles un estado de salud y crecimiento superiores que al resto de los peces.
75 ______Discusión
Al analizar la relación entre las variables morfométricas y la longitud total en las larvas en inanición, no se encontró que existiera crecimiento desproporcionado, excepto para el peso. Aunque a simple observación estas larvas se presentan con una cabeza aparentemente mayor con respecto al largo total, los análisis morfométricos no indican de esto un hecho. Pudiese ser la relación entre el peso y la longitud total, junto con los patrones morfológicos y conductuales descritos para individuos bajo regímenes de alimentación ad libitum y en inanición, elementos a tener como referencia para evaluar la condición nutricional de larvas cuya edad o historia nutricional se desconozcan. Esto pudiera ser de utilidad práctica al realizar observaciones directas sobre grupos de larvas vivas, ya sea en ejemplares silvestres como de cultivo, siendo un indicador rápido de la condición de las larvas. Además de poder convertirse en una herramienta útil para la implementación futura de técnicas de cultivo masivo para la repoblación de los ambientes naturales en los que se encontraba la especie en Cuba. No obstante, sería válido profundizar en el estudio de los cambios histológicos y fisiológicos que se presentan en esta especie sometida a varios días de inanición, así como la determinación del punto de no retorno para la misma. De forma general, incorporando los cambios externos en la morfología larval del manjuarí, los criterios funcionales de las enzimas digestivas, así como los cambios internos en el tracto digestivo, se puede concluir que, alrededor de los 12 DDE (a 28oC) se inicia la transformación gradual de estado larval a juvenil.
5.4 Generalizaciones Los resultados de este trabajo están en correspondencia con el patrón de crecimiento observado para los primeros 15 DDE de A. spatula y A. tropicus (Mendoza et al., 2002a) y la tasa de crecimiento obtenida fue la segunda mayor reportada para larvas de lepisosteidos (Anexo 1). Nuestras condiciones experimentales y de temperatura (28+1oC) fueron similares a las aplicadas en los estudios realizados con las otras dos especies de Atractosteus (Aguilera et al., 2002), por lo que al comparar las tasas de crecimiento entre los tres miembros de este género, se evidencia el valor intermedio obtenido para la especie cubana. Al establecer los cinco intervalos de longitud total para las larvas de manjuarí, se encontró que los siguientes caracteres morfométricos: largo del hocico, largo de las aletas pélvicas,
76 ______Discusión
ancho inicial del hocico, largo y ancho cefálico; mostraron diferencias significativas entre estos intervalos. Como se aprecia, la mayoría de estos caracteres están relacionados con el desarrollo cefálico, haciéndose evidente el estrechamiento del hocico y el alargamiento de la cabeza durante el desarrollo larval de esta especie, similar a lo que ocurre en otros lepisosteidos, reflejando los hábitos ictiófagos de esta familia de peces. Empleando los intervalos de longitud total determinados para el manjuarí, se realizó una comparación cualitativa con otras larvas de lepisosteidos (Tabla 9), tales como: L. osseus, L. oculatus, A. spatula, A. tropicus y L. platostomus (Simon y Wallus, 1989; Simon y Tyberghein, 1991; Aguilera et al., 2002), haciendo los ajustes según los datos publicados por estos autores. Para los primeros intervalos de longitud total (10,5-22 mm), el manjuarí posee proporcionalmente el hocico más corto y la cabeza más ancha en comparación con los otros lepisosteidos mencionados anteriormente. Para los últimos intervalos (26,2-35,2 mm), la cabeza del manjuarí fue la más larga y el hocico el más estrecho de todas las especies. Basado en investigaciones de las relaciones entre los caracteres morfológicos y la alimentación de otras especies de peces (Clifton y Motta, 1998; Luboschek y McCormick, 2001), tales diferencias observadas entre el ancho y largo del hocico y la cabeza en las larvas de lepisosteidos, pueden ser debido a las variaciones en el hábitat y las fuentes de alimentación entre las especies. Desafortunadamente, no existen observaciones de las áreas de desove, ni de la dieta de las larvas de manjuarí en el medio natural, por lo que muchas interrogantes quedan aún por dilucidar. El otro carácter esencial, el largo de las aletas pélvicas, que presentó diferencias significativas entre los intervalos de longitud total en el presente estudio, fue además empleado como elemento primordial en la definición cualitativa de las etapas de desarrollo larval, lo que refleja el valor de este carácter morfológico-morfométrico en la evaluación de la fase larval de esta especie.
77 ______Discusión
Tabla 9. Caracteres morfométricos de larvas de lepisosteidos por intervalos de largo total similares a los encontrados para el manjuarí en el presente estudio (expresados en porcentaje usando la misma proporcionalidad descrita en la Tabla 3). En negritas – A. tristoechus (presente estudio), a- L. osseus (Simon y Wallus, 1989), b- L. oculatus (Simon y Tyberghein, 1991), c- A. spatula (Aguilera et al., 2002), d- A. tropicus (Aguilera et al., 2002), e- L. platostomus (Simon y Wallus, 1989).
Ancho Largo del Largo Largo Aletas Ancho Intervalos posterior del hocico cefálico pélvicas cefálico hocico I 4,1 21,9 - - 63,8 a 5,1-5,7 20,4-24,6 - --20,1 64,4-52,1 b 4-6,2 18,4-20,8 - --15,3 52,5-60,9 c 6-7,4 25,6-26 - 22,3-22,7 30,7-38,6 d 6,8-10,6 27,6-29,4 0,7-1,5 18,8-24,8 43,8-44,2 e II 6,9 26,1 2,1 15,8 50,1 a 8,9-10,5 26,9-26,2 2,8-3,2 18,5-16,3 42,7-35 b 6,2-12,2 20,8-26,6 --2,7 15,3-14,9 52,5-35,8 c 7,4-9,9 26-27,8 1,6-3,6 22,7-18,6 38,6-36,2 d 10,6-13,8 27,6-29,4 1,5-4,3 18,8-14,4 44,2-36,6 e III 11,2 28,6 3,2 13,5 38,5 a 10,5-11,5 26,2 3,2-3,3 16,3-13,9 35-32,4 b 12,2-11 26,6-25,4 2,7-3,1 14,9-15,4 35,8-35,4 c 9,9-14,2 27,8-29,5 3,6-5,1 18,6-14,8 36,2-33,4 d 13,8 29,4 4,3 14,4 36,6 e IV 13,7 31,2 4,2 11 33,9 a 11,5-12,4 26,2-26,2 3,3-3,5 13,9-12,9 32,4-33,9 b 11-14,3 25,4-27,2 3,1-3,4 15,4-12,2 35,4-27,6 c 14,2 29,5 5,1 14,8 33,4 d 13,8 29,4 4,3 14,4 36,6 e 11,9 29,2 3,8 10,2 32,6 V 14,8 31,5 4,9 9,9 32,2 a b 14,3 27,2 3,4 12,2 27,6 c 14,2-15,3 29,5-30,7 5,1-5,8 14,8-16,9 33,4-33,2 d 13,8 29,4 4,3 14,4 36,6 e
78 ______Discusión
Al integrar los aspectos morfo-fisiológicos obtenidos en la presente investigación, se puede concluir que el desarrollo larval del manjuarí muestra, para muchos elementos, cambios puntuales y rápidos, más que una gradación continua, lo cual coincide con la “teoría de la ontogenia por saltos” formulada por Balon (1985, 1990, 1999, 2001) y seguido por autores como Pavlov (1999), Kovac et al. (1999), Kovac (2002), Belanger et al. (2010), entre otros. Simultáneamente al lanzamiento de esta teoría, Govoni et al. (1986) consideraron que “el desarrollo del canal alimentario desde un simple, indiferenciado e incipiente intestino recto presente en la larva con saco vitelino, hacia un complejo y segmentado canal alimentario presente en el adulto, ocurre más por rápidos cambios periódicos que por gradación continua”. En concordancia con este criterio, se encuentran los resultados bioquímicos e histológicos aquí obtenidos, siendo estos elementos novedosos a aportar a la teoría de la ontogenia por saltos, la cual se basa esencialmente en cuestiones morfológicas externas y conductuales. Los cambios puntuales tanto morfológicos como fisiológicos encontrados en las larvas de manjuarí mantenidas a 28oC, se agrupan en dos puntos críticos (+8 DDE y +12 DDE) que se relacionan con la transición de alimentación endógena a exógena y con el inicio del paso de larva a juvenil respectivamente. En opinión de autores como Fuiman (1983) y Snik et al. (1997), los cambios en el crecimiento de las larvas reflejan las prioridades de un organismo en desarrollo, optimizando dicho crecimiento para incrementar apropiadamente su supervivencia. Las larvas presentan numerosas estructuras temporales que deben ser remodeladas hacia la forma definitiva presente en el adulto, empleándose energía para este proceso de transformación. Para mejorar las posibilidades de éxito, ellas deben emplear la energía disponible priorizando las funciones más importantes. Para el manjuarí, debido a la necesidad de alimentación a tan temprana edad, es que se observa un desarrollo rápido tanto de las porciones cefálicas empleadas en la captura del alimento como del tracto digestivo; y producto del comportamiento inactivo de esta especie, es que se explican los patrones de crecimiento obtenidos para la cola y las aletas pareadas, todo esto asociado al primer punto crítico. Una vez vencidos estos esfuerzos morfogénicos, ocurre un perfeccionamiento de los elementos asociados a la alimentación
78 ______Discusión
que permiten la adecuada asimilación de los nutrientes exógenos, reflejado en el segundo punto crítico. La información obtenida en esta investigación, proporciona enfoques sobre la conducta y el fenotipo de animales cultivados, así como de la ontogenia del tracto digestivo de las larvas de manjuarí. Los resultados igualmente pueden ser empleados como referencia en el monitoreo de su cultivo y pueden convertirse en una herramienta útil para estudios en el medio natural; aunque se debe tener en cuenta que el desarrollo morfológico, las tasas de crecimiento y la conducta pueden variar entre los animales de medio natural y las poblaciones de cultivo.
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6. CONCLUSIONES
80 ______Conclusiones
1. La fase larval de Atractosteus tristoechus transcurre en los primeros 18 días después de eclosionadas a 28oC, con tasas de crecimiento de 1,30 mm/d y 10,2 %/d, estando constituida por tres etapas: Etapa 1- Larva adherida (0–3 DDE), Etapa 2- Larva en transición (4-10 DDE) y Etapa 3- Larva libre nadadora (11-18 DDE). 2. De los 23 caracteres morfométricos analizados, 17 mostraron crecimiento alométrico, indicando que la mayoría del crecimiento corporal ocurre de forma discontinua a través de cambios abruptos. Los puntos de inflexión se concentran principalmente entre los 4 y 8 DDE, revelando los fuertes procesos morfogénicos que ocurren en este período. 3. El canal alimentario consistió en una estructura bien desarrollada y organizada a sólo 4 DDE, formada por: bucofaringe, esófago, estómago glandular y no glandular, intestino anterior y posterior. A los 8 DDE se evidenció el desarrollo de los pliegues mucosos y después del inicio exclusivo de la alimentación exógena (12 DDE), no hubo ninguna modificación notable. 4. Los patrones de actividad de las principales enzimas digestivas indican una funcionalidad temprana de este sistema, principalmente del estómago en la digestión proteica, debido a la alta y precoz actividad encontrada para las proteasas ácidas. 5. Las larvas pueden consumir dietas inertes en su primera alimentación, siendo la Moina congelada, la de mejor aprovechamiento y la que garantizó las mayores supervivencias. 6. Las larvas que fueron mantenidas sin alimento mostraron externamente un agotamiento prematuro del vitelo, cambios en la coloración y conducta y detuvieron su crecimiento entre los 10-12 DDE. La relación entre el largo total y el peso a partir de este día comienza a incrementarse exponencialmente para las larvas con alimento externo y empieza a decrecer (<1,9) para las larvas mantenidas en inanición. 7. La integración de todos los resultados obtenidos permitió identificar dos puntos críticos en el desarrollo larval de esta especie: sobre el 8 DDE, cuando ocurre la transición de alimentación endógena a exógena presentándose fuertes cambios morfogénicos, y sobre el 12 DDE, cuando se inicia el paso a etapa juvenil, marcado por el aumento en el peso de las larvas.
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7. RECOMENDACIONES
82 ______Recomendaciones
1. Determinar las áreas de desove naturales del manjuarí y establecer un programa de monitoreo in situ de las larvas que permita establecer comparaciones con los resultados obtenidos en la presente investigación. 2. Realizar estudios donde se evalúe el efecto de diferentes dietas inertes en el crecimiento, la supervivencia y la actividad de las enzimas digestivas en larvas de manjuarí. 3. Para mejorar la estrategia de cultivo de esta especie, se sugiere implementar en el manejo de sus larvas los resultados aquí obtenidos.
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8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
______Anexos
Anexo 1. Tasas de crecimiento publicadas para larvas y juveniles de lepisosteidos. (DDE- días después de eclosionadas).
Tasa de Especie crecimiento Etapa Referencia (mm/d) Pearson et al. (1979) 0,8 larva Lepisosteus osseus Netsch y Witt (1962) 2,33-4,5 juvenil Echelle y Riggs (1972) 0,83 larva Simon y Tyberghein (1991) Lepisosteus oculatus 1,3-1,7 juvenil Simon y Wallus (1989) 1,55 0-10 DDE Atractosteus spatula Aguilera et al. (2002) 5,06 10-15 DDE 0,86-1 0-15 DDE Atractosteus tropicus Aguilera et al. (2002) 2,5 15-30 DDE Atractosteus tristoechus 1,30 0-18 DDE Presente estudio