Synthesis of New Xanthene Derivatives Dissertation Zur Erlangung des Grades “Doktor der Naturwissenschaften” im Promotionsfach Pharmazie am Fachbereich Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz Michaela Kotásková geboren in Skalica, Slowakei Mainz, 2012 II Vom Fachbereich Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Johannes Gutenberg- Universität Mainz als Dissertation angenommen. D77 (Dissertation Johannes Gutenberg- Universität Mainz) III IV Hiermit erkläre ich eidesstattlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe, sowie wörtliche oder inhaltliche Zitate als solche gekennzeichnet habe. Ich habe keinen anderen Promotionsversuch unternommen. Mainz, Mai 2012 Michaela Kotásková V VI VII VIII Michaela Kotásková, Magister (Corresponding to M. Sc.) Summary Title: Synthesis of New Xanthene Derivatives Xanthene dyes, including fluorescein, are a well-known class of fluorescent dyes, which have widespread applications in natural sciences. The synthesis of xanthene derivatives via acid catalyzed condensation of substituted phenols with phthalic anhydride, to afford the asymmetric derivatives, is well established. The high temperature, harsh reaction conditions and often low yields make this method less convenient. The synthesis of xanthene dyes by direct modification of the fluorophore moiety is a great option to circumvent the above mentioned drawbacks. Our new synthetic strategy for the preparation of novel asymmetric xanthene dyes via direct conversion of hydroxyl groups on 3'- and 6'-positions into leaving groups by mesylation is reported. It was discovered that 3',6'-di-mesylated fluorescein underwent a nucleophilic aromatic substitution with sulfur nucleophiles and afforded new asymmetric xanthene sulfides. The impact of substituents possessing an electron-withdrawing character such as chlorines and bromines was investigated with the aim to improve the aromatic substitution on the electron-rich fluorescein structure. It was observed that the incorporation of these groups did not considerably affect the substitution reaction and the yields were comparable with the unsubstituted fluorescein. This strategy provided novel fluorescent probes with the linker suitable to further modifications. The modifications of the linker delivered fluorescein derivatives that could be used as fluorescent labels in peptides, oligonucleotides and for cell imaging. The hydroxyl group on the linker was modified to achieve potent bioconjugate functionality such as azide. The new fluorescent azides were obtained in a 4-step synthesis, namely 2-(6-(2- azidoethylthio)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid with an overall yield of 13%, its 2',7'- dichloro derivative with an overall yield of 10% and its 2',4',5'-tribromo derivative with an overall yield of 1%, respectively. An asymmetric xanthene sulfide with an amino functionality placed on the aliphatic linker, namely 2-(6-((2-aminoethyl)thio)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid, was obtained in a 3- step synthesis with an overall yield of 33%. The impact of the substitution with sulfur nucleophiles on the 6'-position of the xanthene moiety on its fluorescent characteristics was investigated. In comparison with fluorescein new asymmetric xanthene sulfides afforded lower extinction coefficients and fluorescent quantum yields. On the other hand, the substitution with a sulfur nucleophile significantly improved the photostability of xanthene dyes. It was shown that after 10 hours of continuous excitation, the asymmetric sulfur-containing xanthene fluorophores exhibited 58-94% of their initial fluorescent intensities. This observation suggested that the novel dyes were 1-2 orders of magnitude more stable than fluorescein. The azido-modified xanthenes were “clicked” via Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition with an oligonucleotide, which contained the terminal alkyne residue. IX X Michaela Kotásková, Magister (Corresponding to M. Sc.) Zusammenfassung Titel: Synthesis of New Xanthene Derivatives Xanthen Farbstoffe, insbesondere Fluoreszein, sind sehr bekannt als Fluoreszenzfarbstoffe und haben eine Vielzahl von Anwendungen. Die Synthese von Xanthen Derivaten findet via eine säurekatalysierte Kondensation substituierter Phenole mit Phthalsäureanhydrid statt. Die hohen Temperaturen und extremen Bedingungen, unter denen diese Reaktion abläuft, führen oft zu schlechten Ausbeuten. Daher bietet eine direkte Modifikation der Fluorophore eine hervorragende Alternative. In dieser Doktorarbeit konnten neue Synthesewege zur Herstellung neuer asymmetrischer Xanthen Farbstoffe mittels direkter Überführung der Hydroxyl Gruppen an 3'- und 6'- Position in Abgangsgruppen durch Mesylierung eingeführt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass 3',6'-di-mesyliertes Fluoreszein eine nukleophile aromatischen Substitution mit Schwefel Nukleophilen eingeht, wobei neue asymmetrische Xanthen Sulfide erhalten wurden. Inwieweit elektronenziehende Substituenten, wie zum Beispiel Chlorid oder Bromid, die aromatische Substitution beeinflussen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eingehend untersucht. Dabei wurde beobachtet, dass die Einführung dieser Gruppen keine signifikante Auswirkung auf die Substitutionsreaktion hat und die Ausbeuten vergleichbar waren mit der Reaktion an unsubstituiertem Fluoreszein. Um weitere Modifikationen einzuführen, wurden die Schwefel Nukleophile mit einem aliphatischen Linker verknüpft. Über diesen Linker wurden so Hydroxylgruppen eingeführt, die wiederum mit gängigen Biokonjugaten wie z.B. Aziden modifiziert wurden. Die Synthese eines neuen fluoreszenten Azids, 2-(6-(2-Azidoethylthio)-3-oxo-3H-xanthen-9- yl) Benzoesäure, konnte in nur 4 Stufen mit einer Gesamtausbeute von 13% realisiert werden. Auf dem gleichen Weg konnten das 2',7'-Dichloro- und 2',4',5'-Tribromo-Derivat in Ausbeuten von 10% und 1% gewonnen werden. In lediglich drei Stufen wurde ein asymmetrisches Xanthen Sulfid, welches als funktionelle Gruppe ein Amin am aliphatischen Linker trug, mit einer Gesamtausbeute von 33% synthetisiert: 2-(6-((2-Aminoethyl)thio)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl) Benzoesäure. Der Einfluss der Substitution mit Schwefelnukleophilen in der 6'-Position von Xanthen auf das Fluoreszenzverhalten wurde eingehend untersucht und es konnte gezeigt werden, dass asymmetrische Xanthene, die Sulfide als funktionelle Gruppen tragen, einen niedrigeren Extinktionskoeffizent und eine niedrigere Quantenausbeute aufweisen als Fluoreszein selbst. Allerdings wiesen diese neuen modifizierten Xanthene eine erheblich bessere Photostabilität als herkömmliches Fluoreszein auf. Selbst nach kontinuierlicher Anregung über 10 Stunden waren noch 58-94% der ursprünglichen Floureszenz vorhanden. Diese Beobachtung führt zu der Fesstellung, dass die Stabilität dieser neuen Farbstoffe 1-2 Größenordnungen höher liegt als die des Fluoreszeins. Weiterhin konnten die mit einem Azid modifizierten Xanthene in einer „Click“ Reaktion durch eine Kupfer(I) katalysierte Azid-Alkin Cycloaddition mit einem Oligonukleotid umgesetzt werden, welches einen terminalen Alkinrest enthielt. XI XII ____________________________________________________________ Table of Contents Table of Contents 1 Introduction ........................................................................................................................ 1 1.1 Phenomena of Fluorescence ....................................................................................... 1 1.2 Classes of fluorescent Dyes ......................................................................................... 4 1.3 Xanthene Dyes ............................................................................................................. 6 1.3.1 Fluorescein .............................................................................................................. 7 1.3.2 Tokyo Green Dyes and their Derivatives ............................................................. 12 1.3.3 Rhodols and Rhodamines ..................................................................................... 13 1.4 Leuco Dyes ................................................................................................................. 17 1.5 Caged fluorescent Dyes ............................................................................................. 21 2 Objectives and Scope ....................................................................................................... 26 3 Results and Discussions ................................................................................................... 27 3.1 Overview .................................................................................................................... 27 3.2 Synthesis of Sulfonate Esters of Fluoresceins ......................................................... 27 3.2.1 Di-sulfonylation of Fluorescein ............................................................................ 27 3.2.2 Mono-sulfonylation of Fluorescein ...................................................................... 29 3.2.3 Sulfonylation of Derivatives of Fluorescein ......................................................... 30 3.3 Sulfonation of Fluorescein ........................................................................................ 32 3.3.1 Di-sulfonation of Fluorescein on 4',5'-Positions ................................................... 32 3.3.2 Mono-sulfonation of Fluorescein on 4'- or 5'-Position ........................................