(Dendrobium Crumenatum Swartz) Paveena Ka
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
i Inhibition of Browning Agents in Bisected Protocorm-Derived Callus of Pigeon Orchid (Dendrobium crumenatum Swartz) Paveena Kaewubon A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Biology Prince of Songkla University 2015 Copyright of Prince of Songkla University ii Thesis Title Inhibition of Browning Agents in Bisected Protocorm-Derived Callus of Pigeon Orchid (Dendrobium crumenatum Swartz) Author Miss Paveena Kaewubon Major Program Biology Major Advisor Examining Committee : ………………………………………... ...………………………….........Chairperson (Assist. Prof. Dr. Upatham Meesawat) (Prof. Dr. Sompong Te-chato) Co-Advisor ………………………………………… ..………………………………....Committee (Assoc. Prof. Dr. Nongporn Towatana) (Assist. Prof. Dr. Upatham Meesawat) ..………………………………....Committee (Assoc. Prof. Dr. Nongporn Towatana) ..………………………………....Committee (Assoc. Prof. Dr. Kanchit Thammasiri) The Graduate School, Prince of Songkla University, has approved this thesis as fulfillment of the requirements for the Doctor of Philosophy Degree in Biology ........……………………………................... (Assoc. Prof. Dr. Teerapol Srichana) Dean of Graduate School iii This is to certify that the work here submitted is the result of the candidate’s own investigations. Due acknowledgement has been made of any assistance received. ...................................................... Signature (Assist. Prof. Dr. Upatham Meesawat) Major Advisor ...................................................... Signature (Paveena Kaewubon) Candidate iv I hereby certify that this work has not already been accepted in substance for any degree, and is not being concurrently submitted in candidature for any degree. ...................................................... Signature (Paveena Kaewubon) Candidate v ชื่อวิทยานิพนธ์ การยบั ย้งั การเกิดสารสีน้า ตาลในแคลลสั ที่ไดจ้ ากการชกั นา ชิ้นส่วน ตัดตามขวางของโพรโทคอร์มกล้วยไม้หวายตะมอย (Dendrobium crumenatum Swartz) ผู้เขียน นางสาวปวีณา แกว้ อุบล สาขาวิชา ชีววิทยา ปีการศึกษา 2557 บทคัดย่อ การชักนาแคลลัส จา เป็นส าหรับการชกั นา ให้เกิดตน้ โดยผา่ นแคลลสั นา ชิ้นส่วน โพรโทคอร์มตัดตามขวางของกล้วยไม้หวายตะมอย (Dendrobium crumenatum Swartz) อายุ 3 เดือน เพาะเล้ียงบนอาหารแข็งสูตรดัดแปลง Vacin and Went (1949) (VW) ที่เติมน้า ตาลซูโครส 20 กรัมต่อลิตร, ไฟตาเจล 2 กรัมต่อลิตร ร่วมกบั 1-naphthaleneacetic acid (NAA) ที่ความเข้มข้น 0, 0.1, 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร และ 6-benzyladenine (BA) ที่ความเข้มข้น 0, 1, 2 มิลลิกรัมต่อลิตร พบวา่ อาหารแข็งสูตรดัดแปลง VW ที่เติม NAA 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกบั BA 1 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนาให้ เกิดแคลลสั ได้ดีที่สุด โดยแคลลัสเจริญมาจากเซลล์ใต้ช้นั อิพิเดอร์มิสของชิ้นส่วน และเจริญต่อไปเป็นกอ้ นแคลลสั ที่สมบูรณ์ ภายหลงั การเพาะเล้ียงนาน 8 สัปดาห์ พบเซลล์ของ แคลลัสมีขนาดเล็ก ไซโทพลาสซึมเข้มข้น นิวเคลียสขนาดใหญแ่ ละมีนิวคลิโอลัส ข้นั ตอนการชกั นา แคลลสั มีขอ้ จา กดั เนื่องจากเซลล์แคลลัสเกิดการเปลี่ยนแปลง เป็นสีน้า ตาล ส่งผลให้ความสามารถในการเจริญเติบโตลดลง จนแคลลสั ตาย การทดลองคร้ังน้ี มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของระยะเวลาการเพาะเล้ียงโดยไม่มีการยา้ ยเล้ียงที่มีผลต่อการเกิด การเปลี่ยนแปลงเป็นสีน้า ตาลของแคลลัส ท้งั ในระดับเซลล์ ระดับออร์แกเนลล์ และระดับชีวเคมี ของเซลล์ โดยทาการตรวจสอบ ทุกๆ 1 เดือน เป็นเวลา 3 เดือน พบวา่ หลงั การเพาะเล้ียงนาน 3 เดือน เซลล์ของแคลลัสมีการจดั เรียงตวั อย่างไม่เป็นระเบียบ และมีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของออร์- แกเนลล์ส าคญั เช่น นิวเคลียส ไมโทคอนเดรีย คลอโรพลาสต์ และพบการสะสมของแทนนิน ภายในแวคิวโอล ซ่ึงแตกต่างจากแคลลสั อายุ 1 เดือน ที่มีสีเขียวและเป็นชุดควบคุม นอกจากน้ี การเปลี่ยนแปลงระดับออร์แกเนลล์สามารถบ่งบอกถึงการเกิดการเปลี่ยนแปลงเป็นสีน้า ตาลของ แคลลัส โดยเป็นผลมาจากเอนไซมท์ ี่เกี่ยวขอ้ งกบั สภาวะเครียดของพืช จากการศึกษาพบวา่ แคลลสั อายุ 3 เดือนที่มีสีน้า ตาล มีกิจกรรมของเอนไซม์พอลิฟีนอลออกซิเดสและเอนไซม์ฟี นิลอลานีน- แอมโมเนียไลเอสค่อนขา้ งสูง รวมท้งั มีปริมาณลิปิ ดเปอร์ออกซิเดชันในรูปของปริมาณมาลอน- vi ไดอัลดีไฮด์ และปริมาณสารประกอบฟี นอลิกสูงกว่าแคลลัสชุดควบคุม ในขณะที่ปริมาณ คลอโรฟิลล์และแคโรทีนอยด์ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกบั แคลลสั ชุดควบคุม การเปลี่ยนแปลงของ ปัจจยั เหล่าน้ี สามารถใช้เป็นตวั ช้ีวดั ความสมบูรณ์ของแคลลสั ที่เหมาะส าหรับใช้ในการศึกษาการ เจริญตอ่ ไป การทดลองคร้ังน้ีจึงจา เป็นต้องศึกษาผลของสารต้านการเกิดสารสีน้า ตาล ไดแ้ ก่ กรดแอสคอบิก ที่ความเข้มข้น 0, 0.001 และ 0.01 กรัมต่อลิตร, แอล-ซีสเตอีน ที่ความเข้มข้น 0, 0.01 และ 0.05 กรัมตอ่ ลิตร, พอลิไวนิลไพโรลิโดน ที่ความเข้มข้น 0, 0.5 และ 5 กรัมต่อลิตร รวมท้งั ผงถ่านกมั มนั ต ์ ที่ความเขม้ ขน้ 0, 1 และ 2 กรัมตอ่ ลิตร เพื่อยบั ย้งั การเกิดปัญหาการเปลี่ยนแปลงเป็น สีน้า ตาลของเซลล์แคลลสั พบวา่ อาหารแข็งสูตรดดั แปลง VW ที่เติม NAA 0.5 มิลลิกรัมต่อลิตร และ BA 1 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกบั กรดแอสคอบิก 0.01 กรัมต่อลิตร สามารถลดการเกิดการ เปลี่ยนแปลงเป็นสีน้า ตาลของแคลลสั ไดด้ ีที่สุด โดยยบั ย้งั กิจกรรมของเอนไซม์พอลิฟีนอลออก- ซิเดสและเอนไซม์ฟี นิลอลานีนแอมโมเนียไลเอส และลดปริมาณการสะสมของผลผลิตของ ปฏิกิริยาลิปิดเปอร์ออกซิเดชันและปริมาณสารประกอบฟีนอลิก นอกจากน้ียงั พบว่าคลอโรฟิลล์ และแคโรทีนอยด์มีปริมาณเพ่ิมมากข้ึน ซ่ึงผลการทดลองแตกต่างอยา่ งมีนยั ส าคัญเมื่อเปรียบเทียบ กบั ชุดการทดลองที่เติม ผงถ่านกมั มนั ต์ 1 กรัมต่อลิตรและชุดควบคุม และผลการศึกษาปัจจัยทาง ชีวเคมีดงั กล่าวสอดคลอ้ งกบั ผลการศึกษาทางเน้ือเยอื่ วทิ ยา โดยพบวา่ แคลลสั ที่ไดจ้ ากการเพาะเล้ียง บนอาหารแข็งสูตรดัดแปลง VW ที่เติม กรดแอสคอบิก 0.01 กรัมต่อลิตร มีลกั ษณะเป็นแคลลสั ที่ หลุดแยกออกจากกนั ไดง้ ่าย ภายในเซลล์มีออร์แกเนลล์ที่สมบูรณ์ ไดแ้ ก่ ไมโทคอนเดรีย คลอโร- พลาสต์ที่สะสมเม็ดแป้ง และพอลิโซม ซ่ึงตรงกนั ขา้ มกบั แคลลสั ที่เพาะเล้ียงบนอาหารแข็งสูตร ดัดแปลง VW ที่เติมผงถ่านกมั มนั ต ์ 1 กรัมต่อลิตร ซ่ึงพบวา่ เซลล์ของแคลลสั เหล่าน้ีมีการจดั เรียง ไมส่ มบูรณ์และภายในเซลลม์ ีการเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างของเซลล์และออร์แกเนลล์หลายชนิด ไดแ้ ก่ ไมโทคอนเดรีย คลอโรพลาสต์ ผนังเซลล์ เยื่อหุ้มเซลล์ และการสะสมของแทนนินภายใน แวคิวโอล การศึกษาคร้ังน้ีสามารถยืนยนั ได้ว่า กรดแอสคอบิกเป็ นสารต้านการเกิดสาร สีน้า ตาลที่มีประสิทธิภาพ โดยสามารถยบั ย้งั การเกิดการเปลี่ยนแปลงเป็นสีน้า ตาลของเซลล์แคลลสั และรักษาสภาพการแบ่งแยกส่วนระหวา่ งเอนไซมแ์ ละซบั สเตรทในแคลลสั ที่เพาะเล้ียงบนอาหาร ชุดเดิมเป็นระยะเวลานานไว้ได้ vii Thesis Title Inhibition of Browning Agents in Bisected Protocorm-Derived Callus of Pigeon Orchid (Dendrobium crumenatum Swartz) Author Miss Paveena Kaewubon Major Program Biology Academic Year 2014 ABSTRACT Callogenesis is a prerequisite step for the initiation of callus-mediated plant regeneration. Three-month-old protocorms of Dendrobium crumenatum Swartz (Pigeon orchid) were bisected transversely and cultured on modified Vacin and Went (1949) (VW) solidified medium containing 20 g L-1 sucrose, 2 g L-1 Phytagel and various concentrations of 1-naphthaleneacetic acid (NAA) (0, 0.1, 0.5 mg L-1) and 6- benzyladenine (BA) (0, 1, 2 mg L-1). The highest percentage of callus induction was obtained from the explant cultured on a modified VW medium supplemented with 0.5 mg L-1 NAA and 1 mg L-1 BA. The callus was originated from the subepidermal layer of the bisected protocorm and subsequently formed nodular structure after a culture for 8 weeks. The callus mass contained small isodiametric cells, dense cytoplasm, prominent nuclei and nucleoli. The browning phenomenon can be a major limitation for callus culture, causing a loss of regenerative capacity and subsequent cell death. This research was conducted to determine the effect of in vitro culture period on the appearance of tissue browning. Biological alterations at the cellular and subcellular levels, as well as biochemical aspects, were examined. Cultured callus on a modified VW solid medium supplemented with 0.5 mg L-1 NAA and 1 mg L-1 BA was not subcultured and collected at one-month intervals for 3 months and examined for structural and biochemical alterations associated with browning. Three-month-old unsubcultured callus cells were loosely arranged and major organelles were deformed, exhibiting nuclear envelope breakage, dysfunctional mitochondria, swollen chloroplasts and tannin-filled vesicles, relative to one-month-old green callus, which served as the control. Ultrastructural disorganization involving the nucleus, mitochondria and chloroplasts typified enzymatic oxidative browning. Three-month-old brown callus viii had significantly higher polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity, lipid peroxidation in terms of malondialdehyde (MDA) content and total phenolic content than those of control callus. Meanwhile, the contents of chlorophyll and carotenoid of three-month-old callus were significantly reduced as compared with control. The level of these factors may serve as useful biochemical markers when selecting suitable callus for subsequent regeneration trials. Accordingly, the effectiveness of anti-browning agents including L- ascorbic acid (AA; 0, 0.001 and 0.01 g L-1), L-cysteine (Cys; 0, 0.01 and 0.05 g L-1), polyvinylpyrrolidone (PVP; 0, 0.5 and 5 g L-1) and activated charcoal (AC; 0, 1 and 2 g L-1) for prevention of callus browning was then determined. After 3 months of callus culture on the medium added with different concentrations of individual anti- browning agent, the calli were randomly collected and examined for their biological features in structural, ultrastructural and biochemical aspects. The results indicated that 0.01 g L-1 AA significantly inhibited the activities of PPO and PAL enzymes, reduced MDA content, decreased total phenolic content, but increased the contents of chlorophyll and carotenoid as compared with 1 g L-1 AC and control. Microscopy observation showed that 0.01 g L-1 AA-treated friable callus displayed a highly organized system of organelles such as electron-dense mitochondria, chloroplasts containing starch grain and numerous polysomes within