Aus dem Institut für Parasitologie
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Studien zur Charakterisierung und metaphylaktischen Kontrolle der Eimeria zuernii – Kokzidiose des Kalbes
Inaugural-Dissertation
Zur Erlangung des Grades eines
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
durch die Veterinärmedizinische Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von
Berit Bangoura
aus Anklam
Leipzig, 2008
Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Dekan: Prof. Dr. Karsten Fehlhaber
Betreuer: Prof. Dr. Arwid Daugschies
Gutachter: Prof. Dr. Arwid Daugschies, Institut für Parasitologie, Leipzig
Prof. Dr. Axel Sobiraj, Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik, Leipzig
Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna, Institut für Parasitologie, Hannover
Tag der Verteidigung: 19. Februar 2008
Meiner Familie.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ...... 1
2 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten ...... 4
2.1 Ziele...... 4
2.1.1 Parasitologische und klinische Parameter im Infektionsverlauf (Publikation 1) ...... 5
2.1.2 Pathophysiologische Untersuchung der E. zuernii - Infektion (Publikationen 1-3) ...... 6
2.1.3 Pathologische Untersuchungen (Publikation 4) ...... 7
2.1.4 Prüfung des metaphylaktischen Behandlungsansatzes mit Toltrazuril im E. zuernii – Infektionsmodell (Publikation 4)...... 8
2.1.5 Prüfung der Effektivität der metaphylaktischen Toltrazurilbehandlung bei Vorliegen von natürlichen Mischinfektionen mit E. zuernii und E. bovis (Publikation 5)...... 8
2.2 Publikationen...... 10
2.2.1 Bangoura B, Daugschies A. Parasitological and clinical parameters of experimental Eimeria zuernii infection in calves and influence on weight gain and haemogram. Parasitol Res. 2007;100:1331-40...... 10
2.2.2 Bangoura B, Daugschies A, Fuerll M. Influence of experimental Eimeria zuernii infection on clinical blood chemistry in calves. Vet Parasitol. In Press...... 20
2.2.3 Bangoura B, Daugschies A. Influence of experimental Eimeria zuernii infection in calves on electrolyte concentrations, acid-base balance and blood gases. Parasitol Res. In Press...... 32
2.2.4 Mundt HC, Bangoura B, Rinke M, Rosenbruch M, Daugschies A. Pathology and treatment of Eimeria zuernii coccidiosis in calves: Investigations in an infection model. Parasitol Int 2005;54:223-30...... 44
2.2.5 Mundt HC, Bangoura B, Mengel H, Keidel J, Daugschies A. Control of clinical coccidiosis of calves due to Eimeria zuernii with toltrazuril under field conditions. Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42...... 52
3 Übergreifende Diskussion...... 61
3.1 Parasitologische und klinische Parameter im Infektionsverlauf (Publikation 1) ...... 61
3.2 Pathologische Untersuchungen (Publikation 4) ...... 63
3.3 Pathophysiologische Untersuchung der E. zuernii - Infektion (Publikationen 1-3) .... 64
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3.4 Prüfung des metaphylaktischen Behandlungsansatzes mit Toltrazuril im E. zuernii – Infektionsmodell sowie gegen natürliche Mischinfektionen mit E. zuernii und E. bovis (Publikationen 4 und 5)...... 67
3.5 Übergreifende Interpretation und Bewertung der Studien ...... 68
3.6 Schlussfolgerungen und Ausblick...... 72
4 Zusammenfassung...... 75
5 Summary...... 77
6 Literaturverzeichnis...... 79
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Verzeichnis verwendeter Abkürzungen
a. Im Rahmentext verwendete Abkürzungen
GCP Gute Klinische Praxis (Good Clinical Practice) E. Eimeria EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzymgekoppelter Immunoadsorptionstest (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) n Stichprobenanzahl OpG Oozystenzahl pro Gramm Kot PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) p.i. post infectionem spp. Spezies (Plural)
b. In den Publikationen verwendete Abkürzungen
AnGap anion gap ANOVA analysis of variance CK creatine kinase dpi days post infection E. Eimeria FFA free fatty acids fig. figure GCP Good Clinical Practice HDW haemoglobin distribution width LS means least square mean values MCH mean cellular haemoglobin MCHC mean cellular haemoglobin concentration MCV mean cellular volume n number of samples no. number opg oocysts per gram of faeces P1 interval of assumed prepatency P2 interval of assumed patency p statistical probability value PC personal computer RDW red cell distribution width susp. suspension VICH International Cooperation on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Veterinary Products
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1 Einleitung
Die Kokzidiose des Rindes ist eine häufige Jungtiererkrankung (FITZGERALD 1980, TAYLOR u. CATCHPOLE 1994) und tritt bei Kälbern ab einem Alter von drei Wochen auf (BEJŠOVIC u. DONÁT 1982). Beim Rind sind z. Zt. mehr als 20 Kokzidienarten beschrieben, welche sämtlich dem Genus Eimeria angehören (DAUGSCHIES u. NAJDROWSKI 2005). Die klinische Erkrankung wird vor allem durch Eimeria bovis (FITZGERALD u. MANSFIELD 1972, DAUGSCHIES et al. 1986, MUNDT et al. 2003a), Eimeria zuernii (STOCKDALE u. NIILO 1976, PARKER et al. 1986, STASCHEN 2004) und Eimeria alabamensis (GRAUBMANN et al. 1994, SVENSSON et al. 1994, VON SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. 2006) ausgelöst, wobei besonders in Stallhaltungen E. bovis und E. zuernii als Pathogene dominieren (DAUGSCHIES u. NAJDROWSKI 2005).
Die Kälberkokzidiose ist eine schwerwiegende Erkrankung, welche meist als Bestandsproblem in Erscheinung tritt (FITZGERALD 1980, CORNELISSEN et al. 1995, OVINGTON et al. 1995). Als Erreger sowohl der klinischen als auch der subklinischen Kokzidiose ist E. zuernii von erheblicher Bedeutung (LEVINE u. IVENS 1970, BEJŠOVIC u. DONÁT 1982, BÜRGER 1983, EMANUEL et al. 1988, HASBULLAH 1990). Allgemein wird E. zuernii als ubiquitärer Erreger mit weltweiter Verbreitung betrachtet (MCKENNA 1972, WEIßENBURG u. BETTERMANN 1978, PARKER et al. 1984, ERNST et al. 1987, MAGE et al. 1990, CHIBUNDA et al. 1997, PILARCZYK 2001, MATJILA u. PENZHORN 2002, STASCHEN 2004). Es werden bei Kälbern Bestandsprävalenzen von bis zu 100% in endemischen Betrieben erreicht (MATJILA u. PENZHORN 2002).
Der Lebenszyklus von E. zuernii ist monoxen mit endogenen (intestinalen) Stadien und exogenen Stadien in der Umwelt (ERNST u. BENZ 1981). Die Parasiten sind streng wirtsspezifisch und entwickeln sich endogen aus Sporozoiten durch zwei asexuelle Schizogonien und eine sexuelle Gamogonie zu Oozysten (STOCKDALE 1976, ERNST u. BENZ 1986), welche unsporuliert ausgeschieden werden und sich im exogenen Teil des Zyklus durch Sporulation zu den infektiösen Stadien entwickeln, welche die Sporozoiten enthalten (ERNST u. BENZ 1986).
1
Die Präpatenz von E. zuernii beträgt etwa 16 bis 17 Tage, während welcher der endogene Zyklus abläuft. Danach schließt sich die mehrtägige Patenz mit der Ausscheidung der unsporulierten Oozysten an (STOCKDALE u. NIILO 1976, ERNST u. BENZ 1986).
Die Oozyste als nachweisbares exogenes Stadium ist rundlich bis schwach ellipsoidal (s. Abb. 1). Sie besitzt eine Länge von 16 bis 20 µm und eine Breite von 15 bis 18 µm. Die Oozystenhülle ist 1 bis 2 µm dick und besitzt eine undeutliche Mikropyle. Die sporulierte Oozyste enthält vier Sporozysten mit kleinen Stiedai-Körperchen und je zwei länglichen Sporozoiten (NYBERG u. HAMMOND 1965). E. zuernii – Oozysten sind koproskopisch von den Oozysten anderer Eimeria-Arten anhand ihrer Morphologie, insbesondere Größe und Form, bereits unsporuliert gut unterscheidbar (NYBERG u. HAMMOND 1965, TENTER 2006).
Abb. 1: Eimeria zuernii – Oozysten (unsporuliert)
Verluste durch klinische und subklinische Kokzidiosen, die in einigen Betrieben regulär auftreten (CICEK et al. 2007), stellen ein wirtschaftliches Problem dar. Die jährlichen ökonomischen Verluste durch die Kälberkokzidiose schätzte FITZGERALD (1980) auf etwa 120 Millionen US-Dollar. In Nordamerika bereitet vor allem die meist durch E. zuernii ausgelöste, z. T. auch subklinische, Winterkokzidiose Probleme (MARQUARDT 1962, NIILO 1970).
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Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war die Etablierung und Charakterisierung eines reproduzierbaren Infektionsmodelles mit E. zuernii unter standardisierten Bedingungen für Untersuchungen zur Pathologie, Pathophysiologie und Bekämpfung der E. zuernii – Kokzidiose.
Zum einen wurde der Verlauf der Erkrankung durch Messung verschiedener hämatologischer und klinisch-chemischer Messgrößen sowie von Parametern des Säure-Basen-Haushaltes verfolgt, zum anderen wurden Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion zur Darstellung der Schadwirkung im Darm pathologisch untersucht. Als Behandlungsansatz wurde der Wirkstoff Toltrazuril auf seine metaphylaktische Effektivität im Hinblick auf die Unterdrückung sowohl der parasitären Entwicklung als auch der klinischen Symptomatik getestet.
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2 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten
2.1 Ziele
Die vorliegenden Untersuchungen bearbeiten verschiedene Aspekte der E. zuernii – Kokzidiose mit den folgenden Zielen:
1. Die Etablierung eines standardisierten und reproduzierbaren E. zuernii – Infektionsmodells und dessen klinische und parasitologische Charakterisierung.
2. Die Vertiefung des Verständnisses der Pathophysiologie der E. zuernii – Kokzidiose anhand hämatologischer und klinisch-chemischer Parameter sowie Parameter des Säure- Basen-Haushaltes.
3. Die pathologische Darstellung der befallenen Darmabschnitte nach experimenteller E. zuernii – Infektion mit besonderem Augenmerk auf pathohistologische und elektronenmikroskoskopische Befunde.
4. Die Entwicklung eines Behandlungsansatzes gegen E. zuernii zur Vermeidung der Erregerausscheidung und zur Minderung der klinischen Erscheinungen durch metaphylaktischen Einsatz von Toltrazuril im Infektionsmodell.
5. Bestätigung der Effektivität der metaphylaktischen Toltrazurilbehandlung bei Vorliegen von Mischinfektionen mit E. zuernii und E. bovis unter Feldbedingungen in natürlich infizierten Beständen.
Für alle Versuche im Infektionsmodell wurde ein E. zuernii – Feldisolat verwendet, welches vor Verwendung einmal im Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig oder im Tierzentrum Monheim der Bayer HealthCare AG, Leverkusen, passagiert wurde.
Die in fünf Publikationen dargestellten Ergebnisse sollen einen Beitrag zum besseren Verständnis von Verlauf und Schadwirkung der E. zuernii – Kokzidiose leisten. In experimentellen Studien wurden der Infektionsverlauf und die resultierende Erkrankung eingehend dargestellt (parasitologische und klinische Untersuchungen, Publikation 1) und die Frage der primären Pathogenität bearbeitet, wobei neben der lokalen Schädigung des
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parasitierten Darmes (pathologische Untersuchungen, Publikation 4) auch die durch E. zuernii – Infektionen ausgelösten metabolischen Störungen berücksichtigt wurden (pathophysiologische Untersuchungen, Publikationen 1 bis 3). Mit Hilfe des geprüften metaphylaktischen Behandlungsansatzes mit Toltrazuril (Publikationen 4 und 5), welches bereits in der Präpatenz verabreicht wird, ergäbe sich für Betriebe mit vorberichtlicher Kokzidioseproblematik die Chance, Kälber in endemischen Ställen vor einer E. zuernii – Kokzidiose zu schützen.
Die hier dargestellten fünf Schwerpunkte werden nachfolgend ausgeführt. In die Versuche wurden unter experimentellen Bedingungen insgesamt 70 Studienkälber einbezogen, welche alle unter vergleichbaren Bedingungen (Fütterung, Haltung, Pflege) gehalten wurden. Alle Tiere waren zu Beginn der Studien zwischen 10 Tagen und vier Wochen alt und waren männliche Holstein Friesian-Mix-Kälber. Den nationalen und EU-Vorschriften zur Versuchstierhaltung wurde entsprochen. Zusätzlich wurden für die Prüfung der antiparasitären Effektivität der Toltrazurilbehandlung 208 Kälber untersucht, welche einer natürlichen Feldinfektion ausgesetzt waren.
Es ist das Ziel der vorgelegten Studien, die Auswirkungen der Erkrankung besser zu verstehen und die Notwendigkeit sowie Möglichkeiten einer gezielten Therapie zu ermitteln.
2.1.1 Parasitologische und klinische Parameter im Infektionsverlauf (Publikation 1)
Der klinische Verlauf der E. zuernii – Infektion wurde in Kombination mit der quantitativen Erfassung der Oozystenausscheidung untersucht. Das Hauptaugenmerk der klinischen Untersuchung war aufgrund der Natur der zu erwartenden Erkrankung auf den Allgemeinzustand, das Herz-Kreislauf-System und die Kotkonsistenz gerichtet.
Es wurden zwei Gruppen infizierter Studientiere gebildet, von welchen einer Gruppe eine moderate Dosis (150.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten pro Kalb, n=11; Gruppe 2) und der anderen Gruppe eine hohe Dosis (250.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten pro Kalb, n=16; Gruppe 3) der Parasiten oral verabreicht wurde. Eine weitere Gruppe von Studientieren wurde als uninfizierte Kontrollgruppe mitgeführt. Dieser Studienaufbau sollte der Darstellung einer Dosisabhängigkeit des Infektionsverlaufes dienen. Es wurde untersucht, ob und
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gegebenenfalls inwieweit klinische Beobachtungen oder pathophysiologische Veränderungen (s. 2.1.2) in Art und Umfang abhängig von der Infektionsdosis sind. Zum Vergleich wurde eine Kontrollgruppe von uninfizierten Kälbern (n=14; Gruppe 1) unter identischen Haltungsbedingungen mitgeführt. Die verschiedenen Gruppengrößen trotz ursprünglich gleicher Tierzahl (n=16) resultieren aus Begleiterkrankungen von Kälbern wie z. B. entzündlichen respiratorischen Erkrankungen oder eitrigen Arthritiden, die zum Ausschluss der betroffenen Tiere aus der Studie führten. Die endgültige Zahl der Kälber (n=11 bis 16) umfasst die Tiere, welche während der Studiendauer keine schweren oder langwierigen Begleiterkrankungen durchlebten.
Die Kotkonsistenz wurde nach einem Punktesystem von 1 bis 4 beurteilt: Der Wert 1 entsprach normalem bis pastösem Kot, der Wert 2 entsprach Kotproben von halbflüssiger bis flüssiger Konsistenz, mit dem Wert 3 wurden wässrige Kotproben erfasst. Der Wert 4 wurde Kotproben mit Blut- und / oder Gewebsbeimengungen zugeordnet. Die Bestimmung der Oozystenausscheidung erfolgte quantitativ mittels eines modifizierten McMaster-Verfahrens (Nachweisgrenze: 50 Oozysten pro Gramm Kot; 50 OpG).
Der vorhandene Zusammenhang zwischen klinischen Erscheinungen und koproskopischem Parasitennachweis wurde durch zeitlich parallele Erfassung von Daten zu Parasitenausscheidung und Klinik, hierbei insbesondere zur Kotbeschaffenheit, herausgearbeitet. Die verwendeten Infektionsdosen wurden gewählt, um die ideale Dosis für die Etablierung eines standardisierten E. zuernii – Infektionsmodell zu ermitteln, welche einerseits zuverlässig klinische Erkrankungen hervorruft, andererseits aber auch keine übermäßige Belastung für die Kälber darstellt.
2.1.2 Pathophysiologische Studien (Publikationen 1 bis 3)
Innerhalb einer Versuchsreihe wurde ein Spektrum von Blutparametern bestimmt, um den Einfluss der E. zuernii – Infektion auf diverse Stoffwechselvorgänge und Organsysteme aufzuzeigen. Hierzu zählen das rote Differentialblutbild, die klinische Chemie und der Säure- Basen- sowie der Blutgas-Status infizierter Kälber im Vergleich zu nichtinfizierten Kontrolltieren. Die Untersuchungen wurden an denselben 41 Tieren in drei Studiengruppen
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durchgeführt, die auch für die Beobachtung des parasitologischen und klinischen Infektionsverlaufes genutzt wurden (s. 2.1.1).
Die Blutproben wurden zeitlich analog zu den Kotproben entnommen. Es wurden für die Serumgewinnung Vacuette®-Röhrchen mit Trenngel benutzt, womit der methodische Fehler im Vergleich zu Plasmawerten weitgehend vermindert wurde (KRAFT u. DÜRR 1999).
Die Untersuchung der hämatologischen Parameter (Publikation 1) erfolgte am Technicon H1 (Bayer HealthCare LLC, Diagnostics Division, Tarrytown, NY, USA) aus Vollblut, welches in Ethylendiamintetraessigsäre (EDTA) – Röhrchen entnommen wurde.
Aus Serumproben wurden am Hitachi 912 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) im Labor der Medizinischen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät Leipzig die Parameter der klinischen Chemie bestimmt (Publikation 2).
Die Messung von Elektrolytkonzentrationen, Säure-Basen-Parametern und Blutgasen wurde aus heparinisiertem Vollblut am AVL Opti CCA (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) durchgeführt (Publikation 3).
2.1.3 Pathologische Studien (Publikation 4)
Es wurden sechs Kälber mit einer moderaten E. zuernii – Dosis (150.000 sporulierte E. zuernii - Oozysten pro Kalb) infiziert. An drei verschiedenen Zeitpunkten im Infektionsverlauf wurden je zwei Tiere getötet. Die Därme aller sechs Tiere wurden pathologisch-anatomisch, pathohistologisch und rasterelektronenmikroskopisch untersucht. Hierbei wurde nach Entwicklungsstadien von E. zuernii sowie Gewebeschädigungen durch die Parasiten gesucht. Der Verlauf der Infektion wurde durch regelmäßige Kotuntersuchungen verfolgt.
Für die pathohistologische Untersuchung wurden Gewebeproben vom mittleren Jejunum bis zum Spiralkolon sowie aus den Darmlymphknoten ausgewählt, da diese Abschnitte als Zielregionen für die E. zuernii – Kokzidiose bekannt sind (STOCKDALE 1977a u. 1977b). Die Proben wurden mittels der Hämatoxilin-Eosin (HE)-Färbung aufbereitet. Die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung erfolgte an einem ESEM, Quanta 400, FEI Company, Hillsboro, USA. Hierfür wurden Proben aus dem terminalen Ileum, dem Zäkum 7
und dem Kolon verwendet, da hier als Lokalisationen der zweiten Schizogonie und der Gamogonie die deutlichsten Veränderungen zu erwarten sind (STOCKDALE 1977a).
2.1.4 Entwicklung des metaphylaktischen Behandlungsansatzes mit Toltrazuril im E. zuernii – Infektionsmodell (Publikation 4)
Für die Wirksamkeitsprüfung von Toltrazuril (Baycox®, Bayer HealthCare AG, Leverkusen) wurden 23 Kälber mit je 150.000 sporulierten E. zuernii – Oozysten infiziert. Diese wurden dann 14 Tage p.i. randomisiert zwei Behandlungsgruppen zugeordnet, wovon einer Gruppe (n=12) Toltrazuril verabreicht wurde, während die zweite Gruppe (n=11) als Negativkontrolle eine Scheinbehandlung erhielt. Hauptkriterien für eine Wirksamkeit der Behandlung waren Unterschiede in der Kotkonsistenz, der Oozystenaussscheidung und der Gewichtszunahme der toltrazurilbehandelten Tiere im Vergleich zur Negativkontrolle. Der Versuch wurde als kontrollierte Blindstudie nach den Regeln der Guten Klinischen Praxis (GCP) durchgeführt.
2.1.5 Prüfung der Effektivität der metaphylaktischen Toltrazurilbehandlung bei Vorliegen von natürlichen Mischinfektionen mit E. zuernii und E. bovis (Publikation 5)
Die Kenntnisse zur Effektivität einer metaphylaktischen Behandlung mit Toltrazuril gegen E. zuernii – Infektionen, welche im Infektionsmodell gewonnen wurden, wurden unter Feldbedingungen angewandt. Dies diente dem Überprüfen der Praxisnähe des Behandlungsansatzes. Da im Feld eine reine E. zuernii – Infektion selten zu erwarten ist (DAUGSCHIES u. NAJDROWSKI 2005), wurde Toltrazuril in fünf Kälberaufzuchtbetrieben unter verschiedenen Stallhaltungs- und Infektionsbedingungen eingesetzt. Alle Bestände wiesen vorberichtlich eine Kokzidioseproblematik auf. In drei Betrieben wurden zwei Studiendurchgänge durchgeführt, um die Tierzahl zu erhöhen. Insgesamt wurden 208 Kälber in die Studie einbezogen. Dieser Versuch wurde ebenfalls unter GCP-Konditionen als kontrollierte, randomisierte Blindstudie durchgeführt.
Der Einfluss der metaphylaktischen Toltrazurilbehandlung wurde aufbauend auf den Erfahrungen im Infektionsmodell, dass eine Behandlung 14 Tage p.i. hoch effizient ist,
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getestet. Da als frühester Expositionstermin der Tag der Einstallung der Kälber in einen bekanntermaßen kontaminierten Bereich anzunehmen war, wurde die medikamentelle Prophylaxe mit Toltrazuril (Baycox®, Bayer HealthCare AG, Leverkusen) 14 Tage nach der Einstallung vorgenommen. Von den Studientieren wurden 104 Kälber behandelt, während eine gleiche Anzahl als Negativkontrolle scheinbehandelt wurde.
Die Effektivität der Behandlung wurde wie im Infektionsmodell anhand der Kotkonsistenz (nach einem Punktesystem von 0 bis 3) und der Oozystenausscheidung (quantitativ als OpG) bewertet.
9 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
10 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
11 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
12 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
13 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
14 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
15 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
16 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
17 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
18 2.2.1 Publikation 1 Parasitol Res. 2007;100:1331-40.
19 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
Influence of experimental Eimeria zuernii infection on clinical blood chemistry in calves
Bangoura B1*, Daugschies A1, Fuerll M2
1 Institute of Parasitology, University of Leipzig, Faculty of Veterinary Medicine, An den Tierkliniken 35, 04103 Leipzig, Germany 2 Large Animal Clinic for Internal Medicine, University of Leipzig, Faculty of Veterinary Medicine, An den Tierkliniken 11, 04103 Leipzig, Germany *corresponding author: tel. +49 (0) 341 97 38 085, fax. +49 (0) 341 97 38 095, email: [email protected] correspondence address: Berit Bangoura, Institute of Parasitology, University of Leipzig, Faculty of Veterinary Medicine, An den Tierkliniken 35, 04103 Leipzig, Germany, email: [email protected]
Abstract
Coccidiosis, often caused by E. zuernii – infection, is an important diarrhoeal disease in calves (Fitzgerald, 1980). Infection trials were performed to investigate the effects of experimental Eimeria zuernii coccidiosis on clinical blood chemistry in calves. Three groups of calves were formed: group 1 (n=14) served as uninfected control group, group 2 (n=11) was infected with 150,000 sporulated E. zuernii oocysts per calf, and group 3 (n=16) was infected with 250,000 sporulated E. zuernii oocysts per calf. Measurements throughout the prepatent and the patent period revealed a marked influence of E. zuernii-infection on the following parameters: total protein, albumin, urea, bilirubin, creatine kinase, free fatty acid concentration, and cholesterol. Aberrances in these were most pronounced in group 3. No significant and/or distinct changes after infection could be detected in blood glucose concentration. E. zuernii – infection impairs intestinal function and induces catabolic metabolism in affected calves. Bilirubin, urea and cholesterol concentration and creatine kinase activity were particularly affected indicating catabolism of protein and lipids.
Keywords: cattle, Eimeria zuernii, experimental infection, coccidiosis, blood chemistry, pathophysiology
1. Introduction and Niilo, 1976, Ernst and Benz, 1986). During late prepatency and the following Eimeria zuernii occurs worldwide and is patent period, clinical symptoms and one of the two most pathogenic coccidia metabolic alterations may occur (Stockdale species in calves (Ernst and Benz, 1986, et al., 1981, Mundt et al., 2005). The Marshall et al., 1998), inducing clinical purpose of the present investigation was coccidiosis with massive diarrhoea, the characterisation of experimental E. reduced weight gain, weakness, apathy and zuernii infection with respect to the secondary bacterial infections resulting in influence on clinical blood chemistry economic losses (Ernst and Benz, 1986). E. during prepatency and patency. zuernii is characterised by a prepatent period of about 16 to 17 days (Stockdale 20 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
2. Materials and methods animals of group 3 to investigate dose related effects. A total of 41 healthy Holstein-mix calves After infection all calves were observed for were included into the study. The a period of four weeks until day 28 post investigations were performed in the same infection (28 dpi). calves as previously described (Bangoura Faecal samples were examined for and Daugschies, 2007). All animals were consistency and oocyst excretion three 10 days to 4 weeks old at the start of the times weekly for the first 14 dpi and trial and were kept under the same afterwards daily as previously described experimental conditions (air-conditioned (Bangoura and Daugschies, 2007). All rooms of the same experimental stable, two calves were under continuous clinical calves per pen, feeding with milk replacer surveillance. and roughage). Animals were supplied by a Faecal consistency and oocyst excretion commercial dairy herd without coccidiosis- were determined as previously described related problems. Due to this and the youth (Bangoura and Daugschies, 2007). of the animals it appeared very unlikely Blood samples were collected three times that these animals had already acquired weekly during the first 14 days of the study coccidial infection due to E. zuernii in the and afterwards daily up to 28 dpi, always farm of origin. In fact, shedding of oocysts on the same days on which faecal before the end of the prepatent period after examinations were performed. Blood experimental infection was not observed. chemistry was examined in serum samples The animals were assigned to three groups. using Hitachi 912 technology (Roche Group 1 (n=14) remained uninfected as Diagnostics, Basel, Switzerland). negative control for determination of The samples were analysed for the reference values; the calves of groups 2 following parameters: free fatty acids (n=11) and 3 (n=16) were infected orally (FFA, µmol/l), total protein (g/l), albumin with 150,000 sporulated E. zuernii – (g/l), bilirubin (µmol/l), urea (mmol/l), oocysts (group 2) or 250,000 sporulated E. glucose (mmol/l), cholesterol (mmol/l), zuernii – oocysts (group 3) per calf, and creatine kinase (CK, U/l). respectively. Oocysts were gained from a field isolate Statistical methods: originating from a commercial farm in Data were analysed using ANOVA and North-East Germany. The isolate was Bonferroni test for parameters that passaged once 2 to 6 months before use followed normal distribution. Mann- (approximately one month after isolation) Whitney-U-test was applied in case that and contained a contamination with less normal distribution could not be confirmed than 3% of E. ellipsoidalis – oocysts as previously described (Bangoura and (confirmed by counting of the oocyst stock Daugschies, 2007). Normal distribution solution using a modified McMaster was assessed by Kolmogorov-Smirnov- technique as previously described by test. Bangoura and Daugschies, 2007; The parameters were analysed separately differentiation of the oocysts was for prepatent period (assumed as 0 to 17 performed by morphological dpi, interval P1) and patent period characteristics at 400fold magnification). (assumed as 18 to 28 dpi, interval P2) The infective dose of 150,000 sporulated according to the recorded duration of the oocysts was expected to provoke clinical prepatent period of E. zuernii (Stockdale coccidiosis according to a preliminary and Niilo, 1976, Ernst and Benz, 1986). study (unpublished data). The higher dose To normalise the data of the investigated rate of 250,000 sporulated E. zuernii – parameters control mean values of group 1 oocysts per calf was administered to were defined as 100% and values of the infected calves of groups 2 and 3 were 21 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53. expressed in % of the control values, altered consistency. In both infected respectively (see fig. 1). groups watery and haemorrhagic diarrhoea were observed. Seven animals (63.6%) of 3. Results group 2 and eight calves (50 %) of group 3 suffered from haemorrhagic diarrhoea. All animals of both infected groups (group Their faeces partly contained strands of 2 and 3) developed clinical signs of intestinal tissue and/or fibrin. Faecal coccidiosis (e. g. diarrhoea) and excreted consistency significantly differed in both Eimeria zuernii oocysts after the prepatent infected groups from that observed in the period as previously described (Bangoura uninfected control group 1 (p<0.001). and Daugschies, 2007). Diarrhoea was most severe in the high- In short, oocyst shedding started between dose infected group 3 (p<0.001). 16 dpi (one animal) and 20 dpi in group 2 Exsiccosis and depressed animal behaviour and between 15 dpi (one animal) and 22 as signs of severe clinical disease showed dpi in group 3. The highest mean oocyst in five animals of group 2 (39%) and in excretion of 13,563 opg was observed on eight animals of group 3 (50%). One group 21 dpi in group 2 and on 23 dpi in group 3 3 calf entered a moribund state (apathy, with 101,550 opg. Thereafter oocyst emaciation and fatal exsiccosis) due to excretion declined gradually until the end coccidiosis. Mean body weight gain was of the investigation period (28 dpi) when reduced in both infected groups throughout only 2 calves of group 2 and 8 calves of patency. It was lowest in the high-dose group 3 still excreted low numbers of infected group 3 with 9.0% from 14 to 28 oocysts. dpi (correlating to late prepatency and patency) compared to 12.0% in the All infected animals displayed diarrhoea moderately infected group 2 and 18.3% in for 1 to 7 days (group 2) and 4 to 11 days the control group 1, respectively. (group 3), respectively, starting around 18 dpi in most calves. During P2 (18 to 28 Except for CK all blood chemical dpi), 53.7% (group 2) or 66.2% (group 3), parameters were normally distributed. respectively, of all faecal samples had
Fig. 1: Relative mean values 200 (CK: median) of groups 2 and 3 (%) in comparison to group 1 180 (group 1 means = 100%; CK: group 1 median = 100%) over 160 P2 (18 to 28 dpi) after normalisation of data (for 140 statistical significances of the group 2 differences between the groups: group 3 see table 1; for further 120 information: see fig. 2) 100
% of group1 meanvalues (CK: median) 80
60 FFA TP alb bili urea gluc chol CK
Parameter
22 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
3.1 Free fatty acids group 2 and also in group 3 in which it Significant differences could be observed declined from 22 dpi onwards. between groups 2 and 3 (p=0.044) during prepatency (P1) and between groups 1 and 3.4 Bilirubin 2 (p=0.036) and groups 1 and 3 (p=0.002) During prepatency, significant differences during patency (P2). Group 3 showed were observed only between groups 1 and highest levels throughout the observation 2 (p=0.001). During patency, significant period, while group 2 had lower values differences (p<0.001) showed between than group 1 during prepatency but higher groups 1 and 2 and groups 1 and 3. Highest FFA concentrations during patency (see mean values were seen in group 2 followed table 1, fig. 1). A clear trend over time by group 3, lowest values were recorded in could not be detected for any of the groups. group 1 throughout the study (see table 1, Nevertheless, on average P2 mean values figs. 1 and 2). Group 2 values were fairly were 23.6% higher in group 2 and 30.1% constant and declined slowly from day 22 higher in group 3 than in group 1. onwards while in group 3 minimum bilirubin concentration showed on 18 dpi 3.2 Total protein and increased afterwards. Significant differences were recorded between groups 1 and 2 (p<0.001) and 3.5 Urea groups 2 and 3 (p<0.001) during During the prepatent period (P1), no prepatency (P1) and between groups 1 and significant group differences were 2 (p<0.001), groups 1 and 3 (p=0.046), and recorded. During patency (P2), marked groups 2 and 3 (p<0.001) during patency differences were seen which were (P2). Group 3 showed highest levels significant (p<0.001) for comparison of throughout, while group 2 had lowest groups 1 and 3 and groups 2 and 3. Group average values over the whole study period 3 urea levels were highest throughout the (see table 1, fig. 1). In group 2 total protein observation period, followed by group 2 decreased distinctly on 23 dpi levels (see table 1, figs. 1 and 3). Though and remained low thereafter. In group 3 group 2 values were not significantly total protein concentration appeared higher than group 1 values throughout P2, elevated from 15 to 21 dpi and a marked peak was seen on 22 dpi declined afterwards to he level of group 1. accompanied by increased urea concentrations from 20 to 24 dpi resulting 3.3 Albumin in a 22.9% higher mean urea concentration Albumin concentration differed compared to group 1 over P2. A similar but significantly between all groups during the more distinct trend occurred in group 3 prepatent period (group 1 vs. group 2 and with a peak mean value on 21 dpi and group 2 vs. group 3: p<0.001; group 1 vs. elevated concentrations between 19 and 28 group 3: p=0.021). During patency, dpi. Group 3 means were nearly twice as significant differences (p<0.001) were high as group 1 means over P2. observed between groups 1 and 2 and groups 2 and 3. During prepatency, highest 3.6 Glucose albumin concentration occurred in group 3, No significant differences were observed followed by group 1. In patency, group 1 during the prepatent period. During levels were slightly higher than group 3 patency, differences were significant levels, but this difference was not (p<0.001) between groups 1 and 2 and statistically significant (p=1.000). Group 2 between groups 2 and 3. Throughout the had lowest levels throughout (see table 1, whole study, highest values were observed fig. 1). Albumin concentration paralleled in group 1 and lowest in group 2 (see table the curve progression of total protein in 1, fig. 1). Group 2 levels were relatively constant throughout both study intervals 23 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53. while group 3 showed an increase from 18 220 dpi to 22 dpi followed by a decline until 25 200 dpi and a second peak thereafter. 180
160 3.7 Cholesterol 140 During prepatency, no statistically significant differences between the study 120 100 group 1 bilirubin concentration (µmol/l) groups were revealed. In patency, marked group 2 differences occurred between all groups 80 group 3 (group 1 vs. group 2: p<0.001, group 1 vs. 60 5 5 7 3 5 7 e 1 1 19 21 2 2 2 ple 3 pl m m group 3: p<0.001, group 2 vs. group 3: sample 1 sa sa p=0.002). Group 1 mean values were day of the study (dpi) highest during prepatency and patency, while group 3 showed lowest levels during Fig. 2: Mean bilirubin serum levels over prepatency and group 2 during patency study period (P1=assumed prepatency from (see table 1, figs. 1 and 4). While group 1 0 to 17 dpi, P2=assumed patency from 18 to levels steadily increased, levels of group 2 28 dpi) by groups (group 1: uninfected and 3 declined from 17 dpi (group 2) or 22 control, group 2: 150,000 oocysts per calf, dpi (group 3) onwards, respectively. group 3: 250,000 oocysts per calf). Samples 1 to 5 were taken during the first 14 days of 3.8 Creatine kinase the study. Differences were significant CK values differed significantly (p<0.001) during P2 for: groups 1 and 2 (p<0.001); in prepatency between groups 1 and 3 and groups 1 and 3 (p<0.001). groups 2 and 3, and in patency between all groups. Over both time intervals, group 3 6.0 had highest mean rank values for CK 5.5 (Mann-Whitney-U-test) while group 1 had 5.0 P1 P2 4.5 group 1 4.0 lowest (see table 2, figs. 1 and 5). In group group 2 2, CK activity showed an indistinct peak 3.5 group 3 about 12 dpi and another one on 18 dpi. 3.0 2.5
However, in the patent period CK activity concentrationurea (mmol/l) 2.0 remained on a relatively constant level. In 1.5 group 3, the first peak was seen on 16 dpi, 1.0 1 5 5 7 3 5 e e 1 1 19 21 2 2 27 pl pl m afterwards CK activity increased steadily sa sample 3 sam until 21 dpi and remained high from 21 to day of the study (dpi) 23 dpi. Mean activities in infected groups Fig. 3: Mean urea serum levels over study were elevated by 32.9% (group 2) or period (0 to 28 dpi) by groups (for further 70.7% (group 3), respectively, in information see fig. 2). Differences were comparison to the uninfected group 1. significant during P2 for: groups 1 and 3 (p<0.001); groups 2 and 3 (p<0.001).
24 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
Table 1: Results of Bonferroni test applied on normally distributed data of the blood chemistry with significant differences by ANOVA (P2)
Significant differences Arithmetic Parameter Group (n) Minimum Maximum between the mean ± SD groups: A:B (p) 94,53 1 (121) 24,0 473,0 (± 62,371) FFA 116,79 1:2 (0.036) 2 (110) 46,0 520,0 (µmol/l) (± 65,025) 1:3 (0.002) 123,25 3 (132) 23,0 383,0 (± 72,497) 53,30 1 (106) 45,1 61,5 (± 3,800) 1:2 (<0.001) total protein 50,20 2 (99) 41,7 63,4 1:3 (0.046) (g/l) (± 4,492) 2:3 (<0.001) 54,81 3 (74) 39,6 69,6 (± 6,060) 32,39 1 (106) 29,1 37,0 (± 1,916) albumin 30,22 1:2 (<0.001) 2 (99) 25,0 33,8 (g/l) (± 1,876) 2:3 (<0.001) 32,33 3 (74) 22,3 39,4 (± 3,199) 5,84 1 (106) 2,8 11,8 (± 1,296) bilirubin 6,91 1:2 (<0.001) 2 (99) 4,5 10,1 (µmol/l) (± 1,236) 1:3 (<0.001) 6,68 3 (74) 3,2 11,7 (± 1,732) 1,558 1 (106) 0,10 3,06 (± 0,4482) urea 1,914 1:3 (<0.001) 2 (99) 1,07 12,72 (mmol/l) (± 1,3073) 2:3 (<0.001) 2,995 3 (74) 0,13 27,48 (± 3,1774) 6,43 1 (106) 3,3 9,8 (± 1,527) glucose 4,95 1:2 (<0.001) 2 (99) 2,0 8,3 (mmol/l) (± 1,207) 2:3 (<0.001) 6,37 3 (74) 2,8 16,7 (± 5,962) 2,481 1 (106) 1,82 3,19 (± 0,3646) 1:2 (<0.001) cholesterol 2,023 2 (99) 0,92 3,33 1:3 (<0.001) (mmol/l) (± 0,4966) 2:3 (0.002) 2,226 3 (74) 0,79 3,41 (± 0,4954)
25 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
3.00
2.75 P1 P2
2.50
2.25
2.00
group 1 1.7 5 group 2 group 3 1.5 0
1 5 5 e e 1 17 19 21 23 25 27 pl ampl s sample 3sam
day of t he study (dpi)
Fig. 4: Mean cholesterol serum levels over study period (0 to 28 dpi) by groups (for further information see fig. 2). Differences were significant during P2 for: groups 1 and 2 (p<0.001); groups 1 and 3 (p<0.001); groups 2 and 3 (p=0.002).
225
200 P1 P2 175
150
125
100 group 1
creatine kinase activity (U/l) group 2 75 group 3
50
1 9 1 e e 3 e 5 15 17 1 2 23 25 27 mpl mpl sampl sa sa day of the study (dpi)
Fig. 5: Mean creatine kinase activity over study period (0 to 28 dpi) by groups (for further information see fig. 2). Differences were significant during P2 for: groups 1 and 2 (p=0.001); groups 1 and 3 (p<0.001); groups 2 and 3 (p<0.001).
4. Discussion In general, serum levels of most E. zuernii coccidiosis is an important and investigated parameters differed more or highly prevalent disease in calves less distinctly from previously described (Fitzgerald,1980, Ernst and Benz, 1986). values in healthy calves (Martin and The present investigations where Lumsden, 1987, Doornenbal et al., 1988, conducted to enhance the knowledge of the Adams, 1992, Steinhardt et al., 1993, pathophysiology of E. zuernii infection and Knowles et al., 2000) probably due to to allow a better understanding of the differences in age, race, feeding and resulting disease. Unspecific alterations are housing. Therefore, serum levels of the often similar in diarrhoea irrespective of uninfected control animals (group 1) the causing agent, however, specific effects served as reference values for blood of the pathogen may also appear. chemistry in the present trial.
26 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
Table 2: Statistical key parameters of CK (Mann-Whitney U-test; n = number of pooled values over P2 = over 18 to 28 dpi; group 1: uninfected control, group 2: 150,000 oocysts per calf, group 3: 250,000 oocysts per calf)
Parameter Period Group (n) Median 1st / 3rd quartile Significant differences between the groups: A:B (p) Group 1 (121) 90,3 74,55 / 160,0 1:2 (0.001) CK P2 Group 2 (110) 120,0 100,7 / 140,45 1:3 (<0.001) Group 3 (132) 154,1 120,1 / 191,0 2:3 (<0.001)
Significant differences between the three Distinct differences in FFA were seen study groups were found for several during patency when both infected groups parameters. Mann-Whitney-U-test showed showed higher values than the control significantly elevated values for CK in the group. Particularly elevated values in infected groups throughout the prepatent as group 3 (high dose infection) indicate a well as the patent period (see table 2). relation of FFA concentration and the Using oneway ANOVA, the values of degree of intestinal lesions. FFA FFA, total protein, albumin and bilirubin concentration increases generally in differed significantly different between the periods of lipolysis (Teichmann et al., study groups during the prepatent period. 2002, pp. 17-18) because of malabsorption During patency the values of urea, glucose, or loss of nutrients via the inflamed and cholesterol showed statistically intestine as previously demonstrated in significant differences between the three bovine coccidiosis due to E. bovis groups. (Daugschies et al., 1998). Interestingly, For total protein, albumin, and glucose variation appeared very high in all groups similar differences were observed between and thus FFA concentration seems not to groups from the beginning to the end of the be suitable as indicator of coccidiosis, experiment and were thus considered not especially if concentration is determined related to coccidiosis. only once.
Both infected groups displayed altered Differences in total protein and albumin blood chemical values during patency that values were consistent between the groups. were attributed to coccidiosis. FFA, Highest total protein values occurred in the bilirubin, and urea concentration and CK severely infected animals (group 3) and activity were higher in the infected groups can be explained by increase of albumin (see tables 1 and 2), whereas cholesterol concentration. Increase of serum antibody levels were reduced. levels was not determined during this study The discussion of observed differences but was reported before to occur in calf between the groups is mainly focussed on coccidiosis (Hughes et al., 1989, Holst and patency. Comparison between prepatent Svensson, 1994, Faber et al., 2002). This and patent period within each group was may have contributed to elevated total not emphasized because blood chemistry is protein levels, however only to a low variable over the first weeks of age and a extent. distinction between effects related to age or growth or infection appeared not In general, diarrhoea is assumed to cause possible. intestinal protein loss and consequently a reduced total protein serum concentration. This was expected particularly in the high-
27 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53. dose infected animals. However, the serum availability of nutrients in the present study protein levels in group 3 were surprisingly as well. Alterations in bilirubin plasma high. In combination with elevated concentration could not be found haematocrit levels (Bangoura and throughout E. bovis – coccidiosis albeit Daugschies, 2007) this probably reflects variation in this parameter was high haemoconcentration rather than increased (Willuhn, 1999, pp. 75-77). availability of serum protein. In contrast to these observations in calves infected with a Urea levels were markedly lower high dose of oocysts slightly reduced total throughout the whole study period and in protein and albumin were observed all groups than claimed by other authors previously in coccidiosis caused by E. for healthy calves (Martin and Lumsden, zuernii (Stockdale et al., 1981) and more 1987, Doornenbal et al., 1988, Steinhardt distinctly also during E. bovis – infection et al., 1993, Knowles et al., 2000). (Fitzgerald and Mansfield, 1972). This is Concentration of urea was significantly consistent with the findings in the calves of increased in high-dose infected calves group 2 that were infected with a (group 3) compared to the other two considerable but lower dose of oocysts groups during patency. Also after a than group 3. This most likely reflects moderate infection there was a distinct increased intestinal protein loss and temporary increase from 20 to 24 dpi. It is malabsorption after moderate E. zuernii - known that azotaemia appears during infection while in severe E. zuernii - endogenous protein catabolism (Steiger infection massive water loss induces Burgos et al., 2001), probably due to tissue hemoconcentration which obscures serum damage and intestinal haemorrhage, and in protein loss. states of dehydration and electrolyte imbalance (Sahal et al., 1993). Urea Bilirubin concentration was higher in all concentrations are altered similarly and groups than found previously in healthy dose-dependant in the infected groups so calves (Martin and Lumsden, 1987, this parameter seems to be very concise in Doornenbal et al., 1988) and is slightly but judging the extent of metabolic alteration definitely higher in both infected groups in a possibly clinically inconspicuous calf. than in the control group during patency. However, a clear relationship between Significantly lower blood glucose levels bilirubin level and severity of infection were observed in group 2. However, could not be found. Variations were glucose values were very similar in all highest in highly infected animals which three groups and the mean glucose may be indicative for a more severe concentrations were in the range of normal disease with stronger pathophysiological values assessed in healthy calves of about alterations than in moderately infected two to eight weeks of age (Doornenbal et calves. Increase in bilirubin levels was al., 1988, Knowles et al., 2000). Therefore, previously observed as concomitant serum glucose appears not to be very phenomenon of E. alabamensis – representative for clinical coccidiosis. This coccidiosis (Holst and Svensson, 1994) corresponds with previous investigations and as symptom of disease in general into E. zuernii-infection (Stockdale et al., (McSherry et al., 1984), but because of the 1981). small differences the impact of E. zuernii infection on bilirubin concentration has to Low cholesterol blood concentration was be considered as marginal. In E. seen before, e.g. in Theileria-infected alabamensis – coccidiosis (Holst and calves (Singh et al., 2001) and is attributed Svensson, 1994) increase of bilirubin was to fat mobilisation. Presumably, this is discussed to be most likely due to reduced caused by impaired intestinal absorption of food intake and is attributed to a poor fatty acids which may lead to reduced 28 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53. esterification in the liver and thus lower conditions. However, controlled blood concentrations of low density experimental conditions are mandatory to lipoproteins including cholesterol. This is examine certain mechanismns of disease corroborated by the markedly reduced and standardization and a good weight gain in both infected groups understanding of the infection model is a compared to the controls (Bangoura and prerequisite for its application in basic and Daugschies, 2007). A relation between clinical research. Altogether, E. zuernii infectious dose and extent of cholesterol coccidiosis appears not only to alter the alteration could not be seen. To our intestine but also has metabolic effects. knowledge, deviations in cholesterol have Particularly hemoconcentration and not been described previously in bovine catabolism of protein and lipids were coccidiosis. observed and the respective blood parameters may help to estimate the CK levels were within the normal range for severity of metabolic alteration and the calves (Knowles et al., 2000) but were prognosis for the affected calf. higher in the infected groups than in the control animals, particularly in the high dose infected calves (group 3). An early 5. Conclusion peak in CK activity on 16 dpi, interestingly coinciding with increased bilirubin values, E. zuernii – coccidiosis causes enteritis could be observed in the high dose infected which is clinically reflected in diarrhoea group. Increase in CK concentration in (Bangoura and Daugschies, 2007) and cattle is generally related to muscular leads to systemic impairment of the damage (Hapke et al., 1994), and may organism and various metabolic functions. indicate muscular dystrophy due to This includes disorder of water balance, increased mobilisation of protein following protein catabolism and lipolysis. Most malnutrition and/or malabsorption. distinct changes were observed in However, only one calf of the moderately bilirubin, urea and cholesterol serum infected group 2 displayed weight concentrations, as well as in CK activity. depression whereas six calves of the high These parameters might be helpful to dose infected group 3 lost weight from 14 estimate the degree of metabolic to 21 dpi. One high dose infected calf did dysfunction in infected calves. In general, not regain weight loss until the end of the it can be stated that E. zuernii - coccidiosis study. Protein catabolism seems to causes blood chemical alterations which establish rapidly in young calves. are related to the course and severity of infection as was stated before (Daugschies The present experiment was designed to and Najdrowski, 2005). investigate the principle pathological mechanisms of E. zuernii coccidiosis under Acknowledgements strictly defined conditions. Under field conditions, the immune status is undefined Thanks are given to the Bayer HealthCare and the infection pressure may be very AG, Division Animal Health, Monheim, variable. Also the infectivity and Germany for providing the study animals pathogenicity of different E. zuernii field and stable facilities, and to the laboratory strains are variable (Davis and Bowman, of the Large Animal Clinic for Internal 1957, Marquardt, 1962). Therefore, mild Medicine, University of Leipzig for infections may occur as well as severe support in analysis of clinical chemistry infections or subclinical infections and the parameters. The authors also thank in extent of clinical disease and of particular Mr. A. Richter for statistical pathophysiological effects is thus much support and Dr. H.-C. Mundt for more variable than under experimental coordinational support. 29 2.2.2 Publikation 2 Vet Parasitol. 2007;150:46-53.
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31 2.2.3 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
Influence of experimental Eimeria zuernii infection in calves on electrolyte concentrations, acid-base balance and blood gases
Bangoura B*, Daugschies A Institute of Parasitology, University of Leipzig, Faculty of Veterinary Medicine, An den Tierkliniken 35, 04103 Leipzig, Germany
*corresponding author: tel. +49 (0) 341 97 38 085, fax. +49 (0) 341 97 38 095, email: [email protected] correspondence address: Berit Bangoura, Institute of Parasitology, University of Leipzig, Faculty of Veterinary Medicine, An den Tierkliniken 35, 04103 Leipzig, Germany, email: [email protected]
Abstract
Coccidiosis, often caused by Eimeria zuernii, is an important disease in calf rearing and is clinically mainly associated with diarrhoea (Fitzgerald, 1980). Calves were experimentally infected with E. zuernii - oocysts to investigate the effects of artificial E. zuernii coccidiosis on electrolyte concentrations, acid-base balance and blood gases. Therefore, animals were assigned to three groups: group 1 (n=14) served as uninfected control group, group 2 (n=11) was infected with 150,000 sporulated E. zuernii oocysts per calf, and group 3 (n=16) was infected with 250,000 sporulated E. zuernii oocysts per calf. Aberrances which were attributed to coccidiosis were observed in the following parameters: sodium and chloride concentrations, pH (only high-dose infected group 3), base excess, standard bicarbonate, total carbon dioxide, and partial pressure of carbon dioxide. Alterations were most pronounced in the high-dose infected group 3. Anion gap and oxygen saturation did not show significant differences between the groups. Due to diarrhoea and malabsorption in coccidiosis-affected calves there is a distinct loss not only of fluid and blood but also of electrolytes and alkaline buffer substances which provokes the development of an acidosis. This is counteracted by metabolism and respiration but can not be compensated in severely affected and moribund calves.
Keywords: cattle, Eimeria zuernii, experimental infection, coccidiosis, blood gases, electrolytes, acid- base balance
1. Introduction symptoms and metabolic aberrances are to be expected (Stockdale et al. 1981). They Eimeria zuernii and Eimeria bovis are the are caused by affection mainly of the large two most pathogenic coccidia species in intestine, namely cecum and colon (Ernst calves worldwide (Ernst and Benz, 1986, and Benz, 1986, Mundt et al., 2005a). Marshall et al., 1998). Infections with E. Bovine coccidiosis is known to be zuernii may result in clinical coccidiosis, a associated with electrolyte imbalances due severe diarrhoeal disease (Ernst and Benz, to intestinal lesions and the following loss 1986). After a prepatent period of about 16 of blood and fluid (Stockdale et al., 1981, to 17 days (Ernst and Benz, 1986, Fitzgerald, 1967, Daugschies and Stockdale and Niilo, 1976) clinical Najdrowski, 2005, Daugschies et al., 32 2.2.3 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
1997). The purpose of the present oxygen was not applicable because venous investigations was the overall blood was used. characterisation of experimental E. zuernii The blood electrolytes, acid-base infection with respect to the influence on parameters and blood gases were electrolyte concentrations, acid-base determined using AVL Opti CCA balance and blood gases during patency. technology (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland).
2. Materials and methods Statistical methods: Data were tested for normal distribution Investigations were performed in 41 calves using Kolmogorov-Smirnov-Test. as previously described (Bangoura and Afterwards, data were analysed using Daugschies, 2007, Bangoura et al., analysis of variance and Bonferroni as submitted). Three groups were formed: previously described (Bangoura and group 1 (n=14) served as uninfected Daugschies 2007). In compliance with the negative control for determination of commonly known duration of the prepatent reference values; group 2 (n=11) and 3 period of E. zuernii (Ernst and Benz, 1986, (n=16) were infected orally with 150,000 Stockdale and Niilo, 1976), parameters sporulated E. zuernii – oocysts (group 2) or were analysed separately for prepatent 250,000 sporulated E. zuernii – oocysts period (assumed as 0 to 17 dpi, P1 interval) (group 3) per calf, respectively. Following and patent period (assumed as 18 to 28 dpi, infection, animals underwent an P2 interval). At first, differences between observation period of four weeks, the the uninfected control group 1 and both experiment ended on day 28 post infection infected groups 2 and 3 were analysed for (28 dpi). infection-related alterations. Only in case Clinical observations were done daily in all of differences attributed to coccidiosis, calves, faecal consistency (according to a eventual differences between both infected scoring system) and faecal oocyst groups were regarded (infection dose- excretion (oocysts per gram of faeces, opg) related differences). If there were no were determined thrice weekly during the significant differences between uninfected first 14 dpi and daily afterwards as control and infected groups, differences previously described (Bangoura and between both infected groups were Daugschies, 2007, Bangoura et al., disregarded and not attributed to effects of submitted). coccidiosis. Blood samples were collected in parallel to each faecal sampling. One heparin tube of blood was taken per calf and per sampling 3. Results day. Blood samples of group 1 calves were Diarrhoea and shedding of E. zuernii - analysed only until 26 dpi, and of group 2 oocysts occurred in groups 2 and 3 animals only until 25 dpi. (infected groups) after or beginning with The blood samples (heparinized whole the end of the assumed prepatency (P1 blood) were analysed for the following interval), as described previously parameters: sodium concentration (Bangoura and Daugschies, 2007). Oocyst (mmol/l), chloride concentration (mmol/l), shedding in the moderately infected group potassium concentration (mmol/l), pH, 2 started earliest on 16 dpi (one animal) base excess (mmol/l), standard bicarbonate and latest on 20 dpi. In the high-dose (mmol/l), total carbon dioxide (mmol/l), infected group 3, oocyst excretion could be partial pressure of carbon dioxide (kPa), detected starting between 15 dpi (one anion gap (mmol/l), and oxygen saturation animal) and 22 dpi. Termination of oocyst (%). Measurement of partial pressure of excretion was observed individually until 33 2.2.3 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
28 dpi when there were still two group 2 period. Group 2 minimum of sodium animals and eight group 3 animals concentration of 140 mmol/l occurred on shedding oocysts. The highest mean oocyst 22 dpi and thus coincided with the onset of excretion occurred with 13,563 opg on 21 clinical disease (most severe diarrheoa). In dpi for group 2. In group 3, oocyst the highly infected group 3 decreased excretion peaked on 23 dpi with a mean mean values were observed from 18 to 27 opg of 101,550. dpi, i.e. over the whole period with marked Infected animals showed diarrhoea for 1 to diarrhoea (increased mean faecal score). In 7 days (group 2) and 4 to 11 days (group group 3 the bottom concentration was 3), respectively, starting around 18 dpi in observed on 21 dpi with 128 mmol/l most calves. Most severe diarrhoea (most (minimum value reached by a single calves showed watery to haemorrhagic moribund animal: 104 mmol/l). On 28 dpi, diarrhoea, partly with loss of intestinal group 3 values were again similar to group tissue) was observed on 20 to 22 dpi for 1 values (see table 1, see fig. 1). Regarding group 2 and on 20 to 24 dpi for group 3. P2, group 1 showed highest sodium One calf of group 3 reached a moribund concentration, followed by group 2, lowest state and had to be euthanized due to concentrations were seen in group 3. animal welfare reasons after the During P1, sodium concentrations were not termination of the study. altered due to coccidial infection. In contrast, during P2 significant differences All parameters investigated during the could be observed between all groups present experiment were normally (comparison of groups 1 and 2: p=0.047; distributed. comparison of groups 1 and 3 or 2 and 3, During P1 the parameters sodium, respectively: p<0.001). chloride, potassium, pH, base excess, partial pressure of carbon dioxide, and 150 oxygen saturation showed significant group 1 145 group 2 differences between the groups by means group 3 of oneway analysis of variance. 140 Over P2, additionally the parameters 135
sodium (mmol/l) P1 standard bicarbonate and total carbon 130 P2 dioxide were statistically significantly 125 1 3 7 different between the three groups, e 5 15 17 19 21 23 25 2 sample sample sampl however, differences in oxygen saturation day of the study (dpi) were not significant in P2. In general, significant differences observed throughout Fig. 1: Mean sodium blood levels over study P1 were clearly of minor extent compared period (P1=assumed prepatency from 0 to to differences during P2 (see figs. 1 to 7). 17 dpi, P2=assumed patency from 18 to 28 Anion gap did not show significantly dpi) by groups (group 1: uninfected control, different values over both study intervals. group 2: 150,000 oocysts per calf, group 3: 250,000 oocysts per calf). Samples 1 to 5 3.1 Sodium were collected during the first 2 weeks of the Sodium levels of the uninfected control study. (group 1) remained fairly constant throughout the study (range: approx. 137.5 3.2 Chloride to 141.0 mmol/l). A decrease in sodium Control group (group 1) mean levels concentration was seen in both infected showed little variation within a range of groups during patency (P2). The 100.5 to 103.5 mmol/l during the study. In moderately infected group 2 showed a contrast, patency (P2) levels in the infected decline in sodium values from 20 dpi groups 2 and 3 showed a decline to a lower onwards until the end of the observational plateau. In the low-dose infected group 34 2.2.3 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
(group 2) the mean chloride concentration 3.5 Base excess fell down during the interval of most Control mean values (group 1) varied severe diarrhoea (19 to 22 dpi) to a moderately between 6.1 and 9.9 mmol/l minimum value of 99 mmol/l. In the high- over the whole study period. During dose infected group (group 3) lowest prepatent period (P1), both infected groups values showed from 18 to 27 dpi, on 21 dpi showed slightly higher mean Base excess a minimum value of 96 mmol/l was than group 1. In contrast, during patency reached (see table 1, see fig. 2). The lowest (P2) both infected groups showed lower chloride concentration observed during the base excess levels than group 1 throughout study showed in the later moribund calf the period of clinical disease (diarrhoea). (group 3) on 21 dpi with 75 mmol/l. In the moderately infected group 2, base Significant differences were shown excess mean values were 13.9% lower than between groups 1 and 3 (p<0.001) and 2 in group 1, decreased values were observed and 3 (p<0.001) during P2, group 1 levels from 21 dpi until the end of the being highest. observation period (minimum mean value: 4.21 mmol/l on 22 dpi, minimum single 3.3 Potassium value in one group 2 calf: -7.9 mmol/l). In Potassium mean levels of the uninfected the high-dose infected group 3 base excess control (group 1) remained relatively levels were reduced by 24.6% compared to constant throughout the study (range: the controls; the decline of base excess in approx. 4.4 to 4.8 mmol/l). In the group 3 lasted from 18 to 25 dpi and moderately infected group 2, mean levels reached a minimum mean of 1.6 mmol/l on also were fairly constant between 4.3 and 21 dpi (minimum single value in the 4.8 mmol/l and slightly higher than in moribund group 3 calf: -7.5 mmol/l; see group 1. High-dose infected group 3 table 1, see fig. 4). During P1, differences showed a generally lower level with were significant between groups 1 and 2 minimum mean values of 4.0 mmol/l and a (p=0.033). Over P2, significant decrease small peak of 4.9 mmol/l on 21 dpi (see owed to coccidiosis was seen only in the table 1). During prepatency (P1) and high-dose infected group 3 (p<0.001). patency (P2), significant differences were seen between groups 1 and 2 (for P1: 3.6 Standard bicarbonate p=0.012; for P2: p=0.004) and groups 2 Standard bicarbonate mean concentrations and 3 (for P1 and P2: p<0.001). in the uninfected control (group 1) ranged between 31.5 and 36.4 mmol/l with one 3.4 pH small peak around 8 dpi. Standard Variations in pH in the uninfected control bicarbonate values of the infected groups 2 (group 1; daily mean levels: 7.38 to 7.40) and 3 were very similar to group 1 values as well as in the low-dose infected group throughout prepatency (P1). During (group 2; daily mean levels: 7.39 to 7.43) patency (P2), in both infected groups a were very low throughout the study. In the decrease in parallel to clinical disease was high-dose infected group 3, a decline in pH observed. In the moderately infected group with a minimum mean value of 7.35 (21 2, a slight decline appeared from 21 dpi dpi, minimum single value: 7.26 in the onwards (minimum mean concentration: moribund calf) was observed from 18 to 23 29.3 mmol/l on 22 dpi, one day after dpi (see table 1, see fig. 3). During observation of highest faecal score). A prepatency (P1), pH values were more distinct decline was seen in group 3 significantly higher in groups 2 and 3 than from 20 to 24 dpi (coinciding with watery in group 1 (p<0.001 and p=0.013, to haemorrhagic diarrhoea in most respectively). In contrast, group 3 values were lower than group 1 values during P2.
35 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
Table 1: Results of ANOVA and Bonferroni test applied on data of electrolytes, acid base balance and blood gas analysis (days 18 to 28 after infection = P2 interval)
Significant Arithmetic differences* Minimum Maximum Parameter Group (n) mean value between the value value (± SD) groups: A:B (p) Group 1 138.76 136.0 144.0 (96) (± 1.31) 1:2 (0.047) Sodium Group 2 137.02 116.0 147.0 1:3 (<0.001) (mmol/l) (87) (± 4.20) 2:3 (<0.001) Group 3 133.33 104.0 143.0 (112) (± 6.81) Group 1 102.06 98.0 106.0 (96) (± 1.660) Chloride Group 2 101.09 1:3 (<0.001) 89.0 107.0 (mmol/l) (87) (± 2.880) 2:3 (<0.001) Group 3 97.82 75.0 106.0 (112) (± 5.501) Group 1 4.581 3.9 5.4 (96) (± 0.282) Potassium Group 2 4.648 1:3 (0.004) 3.8 5.3 (mmol/l) (87) (± 0.284) 2:3 (<0.001) Group 3 4.423 2.8 5.4 (112) (± 0.445) Group 1 7.393 7.33 7.43 (96) (± 0.021) Group 2 7.403 - pH 7.28 7.44 (87) (± 0.025) (none) Group 3 7.383 7.26 7.44 (112) (± 0.428) Group 1 6.876 2.7 10.6 (95) (± 1.795) Base excess Group 2 5.922 -7.9 10.2 1:3 (<0.001) (mmol/l) (87) (± 3.035) Group 3 5.184 -7.5 11.3 (112) (± 3.817) Group 1 32.259 28.3 36.0 (96) (± 1.783) Standard Group 2 30.906 1:2 (0.006) bicarbonate 17.6 35.5 (87) (± 3.007) 1:3 (<0.001) (mmol/l) Group 3 30.561 18.6 36.8 (112) (± 3.615) Group 1 33.805 29.7 37.6 (96) (± 1.843) Total carbon Group 2 32.302 1:2 (0.003) dioxide 18.7 37.1 (83) (± 3.146) 1:3 (<0.001) (mmol/l) Group 3 32.065 19.8 38.5 (112) (± 3.686)
36 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
Table 1(continued): Results of ANOVA and Bonferroni test applied on data of electrolytes, acid base balance and blood gas analysis (days 18 to 28 after infection = P2 interval)
Group 1 7.302 6.4 8.3 Partial pressure (96) (± 0.378) 1:2 (<0.001) of carbon Group 2 6.852 5.2 7.9 1:3 (0.001) dioxide (87) (± 0.483) 2:3 (0.008) (kPa) Group 3 7.054 5.7 10.2 (112) (± 0.530) Group 1 9.055 3.3 15.4 (96) (± 1.575) Anion gap Group 2 9.624 - 3.6 18.4 (mmol/l) (87) (± 1.802) (none) Group 3 9.375 4.6 17.3 (112) (± 2.251) Group 1 78.20 59.0 98.0 (96) (± 11.473) Oxygen Group 2 76.26 - saturation 59.0 96.0 (87) (± 8.568) (none) (%) Group 3 75.41 59.0 98.0 (112) (± 9.931) *: Parameters were tested for coccidiosis-related significant differences at the first; if there were no differences between the control group A and the infected groups B and C, no further significances were considered
calves), the minimum mean was 27.2 group 1 110 mmol/l on 21 dpi, the minimum single group 2 group 3 value in the moribund calf was 18.6 105
(mmol/l) 100 mmol/l (see table 1, see fig. 5). Altogether, coccidiosis of either infection level did not chloride 95 P1 P2 alter standard bicarbonate values during prepatency (P1). During patency (P2), 90 1 3 9 1 3 le e 15 17 1 2 2 25 27 pl ple 5 mp m m differences were significant between sa sa sa groups 1 and 2 (p=0.006) and between day of the study (dpi) groups 1 and 3 (p<0.001). Fig. 2: Mean chloride blood levels over study period (0 to 28 dpi) by groups (for 3.7 Total carbon dioxide further information see fig. 1). The curve progression for all three study groups was analogous to standard
7.50 bicarbonate (see table 1, see fig. 6) with a group 1 nearly constant total carbon dioxide level group 2 7.45 in the control group (group 1). During group 3 prepatency (P1), no infection-related 7.40 pH alterations were observed in both infected groups. Over patency (P2), marked 7.35 P1 P2 differences between group 1 and group 2 7.30
7 9 7 (p=0.003) and group 1 and group 3 1 15 1 1 21 23 25 2 e le 5 pl m a (p<0.001) were recorded. s sample 3samp day of the study (dpi)
Fig. 3: Mean blood pH levels over study period (0 to 28 dpi) by groups (for further information see fig. 1). 37 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
range of 7.2 to 7.5 kPa except a small peak of 7.7 kPa on day 25. In the low-dose
14 infected group (group 2), a slow and steady group 1 12 group 2 decline took place from 18 to 25 dpi, 10 group 3 reaching a minimum daily mean of 6.6 kPa 8
6 on 25 dpi. In the high-dose infected group
4 3 the curve was relatively constant for
base excess (mmol/l) P1 P2 2 carbon dioxide partial pressure (minimum 0 value: 6.8 kPa on 22 dpi) with a small peak 1 3 9 1 e e 15 17 1 2 23 25 27 pl m a s sampl sample 5 of 7.6 kPa on 25 dpi (see table 1, see fig. day of the study 7). Significant differences showed in prepatency (P1) between groups 1 and 2 Fig. 4: Mean blood base excess over study (p=0.005) and groups 1 and 3 (p=0.015), period (0 to 28 dpi) by groups (for further information see fig. 1). respectively. In patency (P2), between all of the groups significant differences were observed (comparison of groups 1 and 2: 40 group 1 p<0.001; comparison of groups 1 and 3: group 2 p=0.001; comparison of groups 2 and 3: group 3 35 p=0.008), group 2 levels being lowest during P2. 30 Standard bicarbonate P1 P2 3.9 Anion gap 25 Anion gap control values of group 1 started
1 3 5 5 7 3 5 7 e e 1 1 19 21 2 2 2 pl pl with a mean of 8.1 mmol/l on day 0 of the mple a s sam sam day of the study (dpi) study, fell down to 7.0 mmol/l around day 7 and showed a prolonged increase until Fig. 5: Mean blood standard bicarbonate the end of the second week. Thereafter, (SBIC) levels over study period (0 to 28 dpi) group 1 values varied moderately between by groups (for further information see fig. 8.3 and 10.0 mmol/l. Over the whole study 1). period, values of both infected groups 2 and 3 were very similar to control group
45 group 1 values. In Anion gap values, no marked group 2 40 aberrances were seen in both infected group 3 groups compared to the uninfected control 35 neither during prepatency (P1) nor during 30 patency (P2). 25 P1 P2
total carbon dioxide (mmol/l)
20 9.0 1 3 9 1 7 group 1 e e 15 17 1 2 23 25 2 pl m 8.5 a group 2 s sampl sample 5 day of the study (dpi) group 3 dioxide (kPa) 8.0
7.5 carbon carbon
Fig. 6: Mean blood total carbon dioxide 7.0 (tCO ) levels over study period (0 to 28 dpi) P1 P2 2 6.5 by groups (for further information see fig. 6.0 partial of pressure
1). 1 3 9 1 7 e e 15 17 1 2 23 25 2 pl m a s sampl sample 5 3.8 Partial pressure of carbon dioxide day of the study (dpi) Control animal (group 2) values declined Fig. 7: Mean blood carbon dioxide partial during the first 14 days of the study (start pressure (pCO2) over study period (0 to 28 mean values: approx. 8 kPa) and remained dpi) by groups (for further information see relatively constant afterwards within a fig. 1). 38 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
not described previously for E. zuernii - 3.10 Oxygen saturation coccidiosis in the present extent. Oxygen saturation values of the uninfected Unfortunately, physiological blood levels control group (group 1) varied moderately of most investigated parameters are not within a range of 71.3 to 84.0% except for well documented in literature for healthy a peak with a maximum mean of 97.6% calves. Reference values given refer to from 0 to 12 dpi. The curve progressions other age groups or certain breeds (Martin for both infected groups 2 and 3 were and Lumsden, 1987, Sahal et al., 1993, fairly similar to group 1 throughout the Steinhardt et al., 1993). Therefore, serum study. However, the initial peak of group 1 levels of the uninfected control animals was not seen in both infected groups. (group 1) were consistently regarded as Significant differences (p<0.001) between reference values for blood chemistry for the study groups could be detected for the present trial. groups 1 and 2 (owing to the initial peak in Significant differences between the three group 1) and groups 2 and 3, respectively, study groups were found in sodium, for prepatency (P1). No coccidiosis-related chloride, pH, base excess, standard alterations were observed during patency bicarbonate, total carbon dioxide, and (P2). partial pressure of carbon dioxide. Blood levels of these parameters decreased due to coccidiosis during patency (P2), whereas 4. Discussion differences in prepatency (P1) were markedly less pronounced and thus not E. zuernii - coccidiosis is highly prevalent attributed to coccidiosis and are not further in calves and of economic importance discussed. (Fitzgerald, 1980, Ernst and Benz, 1986). Electrolyte (sodium, chloride) Studies on the pathophysiology of bovine concentrations declined shortly after the eimeriosis have been conducted before beginning of patency. In both infected (Fitzgerald, 1967, Fitzgerald and groups decreased mean values were found Mansfield, 1972, Stockdale et al., 1981, and lasted for 6 days in the moderately Willuhn, 1991, Daugschies et al., 1997) infected group 2, and even longer in the but mainly refer to E. bovis except high-dose infected group 3. Similar investigations by Stockdale et al. (1981) observations for sodium and chloride were who infected calves experimentally with previously made during investigations in sporocysts of E. zuernii. Stockdale et al. Eimeria zuernii – coccidiosis (Stockdale et (1981) described E. zuernii – coccidiosis in al., 1981). The reduction of electrolyte terms of some selected parameters of concentrations is attributed to an elevated haematology, clinical chemistry and faecal loss of electrolytes which electrolyte parameters (including carbon corresponds to an increased intestinal loss dioxide). Investigations on a broad range of water (reflected in haemoconcentration) of acid-base balance, clinical chemistry and nutrients (reflected in endogenous and blood gas parameters were not protein catabolism and lipolysis) observed published before. The aim of our in the same calves (Bangoura and previously described investigations Daugschies, 2007, Bangoura et al., (Bangoura and Daugschies, 2007, submitted). In the present investigation Bangoura et al., submitted) and of the azotaemia developed in both infected study experiment presented in this publication groups (Bangoura et al, submitted) which was to enlighten whether the also indicates a state of dehydration and pathophysiology resulting from E. zuernii electrolyte imbalances (Sahal et al., 1993). – coccidiosis differs from other diarrhoeal diseases. This included an overall Concentrations of both sodium and screening of blood components which was chloride showed a coinciding minimum on 39 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
21 dpi (high-dose infected group) or 22 dpi dependent and can be respiratorily (moderate-dose infected group). This is compensated (Kasari and Naylor, 1986) presumed to be a sign of dysregulation of unless the calf is moribund as stated before electrolyte balance. Afterwards for bovine coccidiosis (Daugschies and compensatory mechanisms like increased Najdrowski, 2005). glucocorticoid secretion and activation of the renin angiotensin aldosteron system are Regarding blood gas analysis, total carbon engaged and probably counteract sodium dioxide and partial pressure of carbon loss as assumed for E. bovis – coccidiosis dioxide showed a decline in both infected (Daugschies et al., 1997). Thus advanced study groups. As a marker of metabolic electrolyte imbalances are impeded. aberrances in acid-base balance (Kraft, Interestingly, in accordance with previous 1999), partial pressure auf carbon dioxide findings in patent E. zuernii - infection is lowest in the high-dose infected group (Stockdale et al., 1981) and other than (group 3) on days 20 to 23 contemporarily described in E. bovis – coccidiosis with decrease in electrolytes and standard (Fitzgerald, 1967), no marked alterations in bicarbonate. Thus it seems that the potassium levels were observed. An reduction in partial pressure of carbon increase in potassium levels after E. bovis dioxide is also owed to acidosis and its – infection was dedicated to immense cell respiratory compensation. The levels of death followed by release of intracellular total carbon dioxide observed were lower potassium ions into the blood and therefore in both infected groups than in the considered to occur only in moribund uninfected group. Although effect of calves (Fitzgerald, 1967). infection on total carbon dioxide was not very distinct this observation obviously Alterations of acid-base homoiostasis reflects metabolic acidosis (Grove-White occur in diarrhoeal diseases and and Michell, 2001). However, according to indigestions in general (Roussel et al., previous findings in healthy calves (Grove- 1998). They are based on the intestinal loss White and Michell, 2001) all total carbon of buffer ions, thus a relative excess of dioxide mean values observed were in the acids emerges (Kraft, 1999). Standard reference range even on day 21 which bicarbonate was significantly and dose- marked the bottom in the high-dose dependently reduced in both infected infected group. The minimum values of groups compared to the controls (group 1) single animals fell down to 18.7 during patency. Decline in standard (moderately infected group 2) or 19.8 bicarbonate is typical for acidotic calves mmol/l (highly infected group 3), (Kasari and Naylor, 1986). However, respectively, which indicates a marked during the present trials decrease was only acidosis with partial respiratory of moderate extent compared to severe and compensation in the respective calves uncompensated cases of acidosis (Omole et (Groutides and Michell, 1990). al., 2001). In the high-dose infected group 3 a marked decrease in pH occurred during One calf of the high-dose infected group 18 and 23 dpi, concomitantly with most entered a moribund state due to E. zuernii severe diarrhoea (Bangoura and – coccidiosis and had to be euthanized Daugschies, 2007). Additionally, base directly after the end of the study excess was markedly and dose- (Bangoura et al., submitted). This calf dependently reduced in both infected showed the lowest values in respect of groups during patency. Anion gap was not sodium, chloride, pH, base excess, altered in the infected groups. Altogether, standard bicarbonate, partial pressure of from these facts it is concluded that a carbon dioxide, and total carbon dioxide of moderate metabolic acidosis is caused by all high-dose infected animals (see table 1, E. zuernii – coccidiosis which is dose- minimum values listed under group 3). All 40 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45. specified minimum values for this calf conspicuous calves at least a fluid and were reached on 21 dpi. The calf showed electrolyte therapy should be considered as haemorrhagic diarrhoea with tissue early as possible. Besides the potentially admixture, lost weight until the end of the life threatening character, E. zuernii – study and did not recover (Bangoura and coccidiosis induces a weight loss or Daugschies, 2007). Due to animal welfare markedly reduced weight gain (Bangoura reasons, the animal was treated with oral and Daugschies, 2007). electrolyte solution (Dialyt®, Dr. E. The pathogenesis and character of the Graeub AG, Bern, Switzerland) at the end disease appears to be similar to E. bovis – of the study. This could not prevent lethal coccidiosis (Fitzgerald, 1967, Fitzgerald decompensation. and Mansfield, 1972, Willuhn, 1991, Daugschies and Najdrowski, 2005) and It is concluded from the present study that many other diarrhoeal diseases in calves. sublethal E. zuernii - coccidiosis induces a Because specific diagnosis is not possible moderate acidosis which is normally in the early phase of the disease, a compensated by respiration. The clinical supportive treatment in terms of unspecific signs of the disease are often limited to rehydration with electrolyte solutions diarrhoea and reduced weight gain as long should be administered in the early phase as the calf is able to compensate for life of metabolic decompensation in severely threatening metabolic disorders affected animals. In general, there is no (Fitzgerald, 1967, Daugschies and specific therapeutic treatment against Najdrowski, 2005). Nevertheless, various patent E. zuernii - coccidiosis due to the metabolic alterations occur consistently pathogenesis of disease, i.e. setting of during patent infection in terms of intestinal lesions before the start of oocyst haemoconcentration, inflammatory excretion (Mundt et al., 2005a, Daugschies response, lipolysis, protein catabolism and Najdrowski, 2005). Therefore, a (Bangoura et al., submitted) and acidosis specific metaphylaxis should be applied in which correlate with the severity of calf rearing farms with a known history of infection. Metabolic impairment manifests coccidiosis. Modern anticoccidial in many haematological, blood chemical, compounds such as triazines (e. g. blood gas and acid-base balance toltrazuril (Mundt et al., 2005a, Mundt et parameters (Bangoura and Daugschies, al., 2005b) or diclazuril (Keidel, 2005)) 2007, Bangoura et al., submitted). In may prevent massive lesions and severe general, the extent of disease is related to affection of infected calves as an untreated the severity of infection-induced diarrhoea E. zuernii – coccidiosis may lead to a life (Bangoura and Daugschies, 2007). threatening disease.
Although E. zuernii – coccidiosis affects mainly the large intestine (Mundt et al., Acknowledgements 2005a), systemic metabolic alterations result from loss of electrolytes and water as The authors wish to thank the Bayer well as from catabolism. Calves will HealthCare AG, Division Animal Health, survive as long as they are able to Monheim, Germany for providing the compensate for these effects, this study animals and stable facilities. In implicates regulatory mechanisms particular, thanks are given to Mr. A. involving other tissues. Compensation Richter for statistical support and Dr. H.-C. success will depend on general constitution Mundt for coordinational support. The of the calf and supportive treatment. The experiment was conducted in compliance loss of water, nutrients, electrolytes and the with current German laws and European development of metabolic acidosis should guidelines. not be underestimated and in clinically 41 Publikation 3 Parasitol Res. 2007;101:1637-45.
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43 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
44 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
45 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
46 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
47 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
48 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
49 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
50 2.2.4 Publikation 4 Parasitol Int. 2005;54:223-30.
51 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
52 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
53 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
54 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
55 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
56 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
57 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
58 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
59 2.2.5 Publikation 5 Parasitol Res. 2005;97 Suppl 1:S134-42.
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3 Übergreifende Diskussion
Die Kokzidiose wurde in den vorliegenden Untersuchungen im Infektionsmodell E. zuernii in klinischer, parasitologischer, pathologischer und pathophysiologischer Hinsicht analysiert. Die diesbezüglich bisher veröffentlichten Untersuchungen zur Kälberkokzidiose beziehen sich vornehmlich auf E. bovis, während E. zuernii weitaus weniger gut untersucht ist. Die zu E. zuernii bisher zugängliche Literatur ließ Fragen zum Verlauf und den systemischen Auswirkungen einer standardisierten Infektion offen, welche mit Hilfe der vorgestellten Experimente geklärt werden konnten. In den Untersuchungen wurden zwei verschiedene Infektionsdosen eingesetzt, wobei Unterschiede im Schweregrad des Infektionsverlaufes zwischen moderat (150.000 Oozysten / Tier in Gruppe 2) und schwer infizierten Tieren (250.000 Oozysten / Tier in Gruppe 3) deutlich wurden.
Neben der umfassenden Beschreibung der aufeinander aufbauenden Pathologie und Pathophysiologie sollte ein Behandlungsansatz entwickelt und geprüft werden, welcher für betroffene Kälberhaltungen von großer praktischer Bedeutung sein kann.
3.1 Parasitologische und klinische Parameter im Infektionsverlauf (Publikation 1)
Es konnte gezeigt werden, dass die Oozystenausscheidung und das Durchfallgeschehen in der mit der höheren Dosis infizierten Gruppe 3 (250.000 Oozysten/ Tier) deutlicher ausgeprägt waren als in der moderat infizierten Gruppe 2 (150.000 Oozysten/ Tier). Sowohl die durchschnittliche Höhe und Dauer der E. zuernii – Oozystenausscheidung als auch die maximale Ausscheidung von Oozysten pro Gramm Kot (OpG) war in der hochdosiert infizierten Gruppe 3 deutlich höher als in der moderat infizierten Gruppe 2.
In der Dauer der Präpatenz, die im Allgemeinen mit 16 bis 17 Tagen beschrieben wird (STOCKDALE u. NIILO 1976, ERNST u. BENZ 1986), wurde mit 16 bis 20 Tagen in der moderat infizierten und 15 bis 22 Tagen in der hochdosiert infizierten Gruppe eine unvermutet hohe Variabilität festgestellt.
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Die Infektion mit der höheren Oozystendosis (Gruppe 3) bewirkte eine erhöhte Oozystenausscheidung sowie eine stärkere Ausprägung des klinischen Bildes. Generell erkranken Tiere, welche eine höhere Erregerdosis aufgenommen haben, schwerer als Tiere nach einer geringeren Exposition. Es wurde auch eindeutig gezeigt, dass der in den beiden infizierten Gruppen 2 und 3 beobachtete Durchfall der E. zuernii – Infektion zuzuschreiben ist. Differentialdiagnostisch konnten mittels Schnelltest-Streifen (FASTest BCV-Strip ad us. vet., FASTest E. coli K99-Strip ad us. vet. und FASTest ROTA-Strip ad us. vet., MegaCor Diagnostik GmbH, Hörbranz, Österreich) keine anderen Pathogene (E. coli K99, Bovines Corona- und Rotavirus) nachgewiesen werden.
Die beobachtete Schwankungsbreite im Grad der klinischen Erkrankung nach E. zuernii – Infektionen stimmt mit früheren Erfahrungen bei natürlichen Infektionen überein (CORNELISSEN 1995, CICEK et al. 2007). In den eigenen Studien zeigten die Kälber dennoch eine regelmäßigere Oozystenausscheidung und einen einheitlicheren Erkrankungsverlauf, als es von vorherigen experimentellen Erfahrungen ohne medikamentelle Immunsupprimierung beschrieben wurde (DAVIS u. BOWMAN 1957, MARQUARDT 1962, NIILO 1969). Insgesamt wurde bestätigt, dass es sich bei E. zuernii entgegen der Einschätzung von RODERICK (1928) und MARSH (1938) um ein primäres Enteropathogen handelt, d. h. die E. zuernii – Kokzidiose kann nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie als Primärerkrankung auftreten. Nichtsdestotrotz ist die E. zuernii – Kokzidiose unter Feldbedingungen oft als multifaktorielles Geschehen zu betrachten. So begünstigen Stressfaktoren wie kalte Temperaturen (MARQUARDT 1962), eine unspezifische Immunsupprimierung (STOCKDALE 1976) oder ungenügende Stallhygiene (STASCHEN 2004) die Erkrankung. Besonders bei älteren Kälbern spielen Stressfaktoren wie Futterumstellungen, Überbelegung, Transport und Wetterextreme eine große Rolle für die Erkrankungsschwere bei Infektionen mit pathogenen Kokzidien (ERNST u. BENZ 1981, ERNST u. BENZ 1986). Bei keinem der infizierten Versuchstiere konnte die nervöse Form der enteralen Kokzidiose, die bei Feldinfektionen mit E. zuernii vor allem in Nordamerika relativ häufig und in Europa gelegentlich auftritt (RAILLIET 1919, FITZGERALD 1975, RADOSTITS u. STOCKDALE 1980, ENESS u. OWEN 1984), beobachtet werden. Dies könnte in der verhältnismäßig geringen Versuchstierzahl begründet sein. Wahrscheinlicher ist es jedoch, dass die nervöse Kokzidiose mit einer Unterversorgung mit Spurenelementen oder Vitaminen einhergeht, wie von ISLER et al. (1987) vermutet, und es sich damit um eine Faktorenerkrankung handelt. Durch die optimierte Fütterung und Haltung in den vorgelegten Studien wurde die nervöse Kokzidiose möglicherweise unterdrückt. 62
3.2 Pathologische Studien (Publikation 4)
In der ersten Kälbergruppe, welche 16 Tage p.i. in der Präpatenz pathologisch untersucht wurde, wurden lichtmikroskopisch vom kaudalen Jejunum bis zum mittleren Kolon geringgradige entzündliche zelluläre Infiltrationen der Mukosa und vermehrt Zelldebris mit eingeschlossenen Mero- und Trophozoiten nachgewiesen. Entgegen der Erfahrung von STOCKDALE (1977a) wurden im Ileum zu diesem Zeitpunkt weder entzündliche Veränderungen noch erste Schizonten festgestellt. Das Jejunum eines der beiden Tiere enthielt außerdem Schizonten der zweiten Generation. Das widerspricht früheren Erkenntnissen, wonach die zweite Schizogonie nur in Kolon und Zäkum beobachtet wurde (STOCKDALE 1977a). Rasterelektronenmikroskopisch waren beide Tiere während der späten Präpatenz, mit Ausnahme gering- bis mittelgradiger epithelialer Verletzungen im Kolon, weitgehend unauffällig. Dies deutet darauf hin, dass die frühen parasitären Stadien der ungeschlechtlichen Teilung, welche bis dahin durchlaufen wurde (STOCKDALE 1977a), kaum Läsionen im Darm verursachen und steht im Einklang mit vorherigen Beschreibungen (STOCKDALE 1977b).
Die Kälber, welche am Tag 21 p.i. während einer Phase mit hoher Oozystenausscheidung getötet wurden, wiesen deutliche Veränderungen in der Darmmukosa auf. Lichtmikroskopisch konnten Parasitenstadien vom mittleren Jejunum bis zum mittleren Zäkum nachgewiesen werden, wobei besonders das proximale Kolon und das Zäkum als Orte der Gamogonie in Erscheinung traten, analog zu vorherigen Beschreibungen (STOCKDALE 1977a). Die Gamogonie löste bei beiden Kälbern akute, z. T. nekrotisierende Entzündungen der betroffenen Darmabschnitte aus, wovon bei einem Tier auch die Submukosa betroffen war. Demzufolge entstehen durch die Gamogoniestadien im Gegensatz zu den Schizogoniestadien deutliche Läsionen. Die entzündlichen Veränderungen sind in Art und Lokalisation den durch E. bovis hervorgerufenen sehr ähnlich (HAMMOND et al. 1944, MUNDT et al. 2003a), auch der zeitliche Verlauf der Entwicklung ist vergleichbar.
Die Kälber der Gruppe 3 wiesen am Ende der Patenz (Tag 26 p.i.) nur noch eine Oozystenausscheidung an der Nachweisgrenze auf. Beide Tiere zeigten neben Resten entzündlicher Infiltration regenerative und zum Teil hyperplastische Prozesse im Kryptenepithel in Kolon und Zäkum, bei einem Tier auch im terminalen Ileum. Unerwartet konnten elektronenmikroskopisch bei einem der Tiere Verletzungen des apikalen
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Zottenepithels des terminalen Ileums dargestellt werden, was entgegen bisherigen Annahmen (STOCKDALE 1977a) auf eine Beteiligung des Dünndarmes zu diesem späten Zeitpunkt nach der Infektion schließen lässt.
3.3 Pathophysiologische Studien (Publikationen 1 bis 3)
Die festgestellten metabolischen Abweichungen sind ursächlich auf das Durchfallgeschehen und die parasitär bedingte Enteritis zurückzuführen.
Die moderat infizierten Tiere (150.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten/ Kalb) wiesen ebenso wie die hochinfizierten Tiere (250.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten/ Kalb) auf der Grundlage der Laborbefunde (Publikationen 1 bis 3) während der Patenz vier pathophysiologische Hauptkomplexe auf, nämlich eine Dehydrierung, einen erhöhten Katabolismus, Elektrolytverluste und azidotische Störungen des Säure-Basen-Haushaltes. Die meisten beobachteten Aberrationen traten dosiskorreliert auf, d. h. die Tiere der hochdosiert infizierten Gruppe waren neben der stärkeren Klinik auch stärker von metabolischen Störungen betroffen.
Zum einen tritt eine Hämokonzentration als Zeichen der Dehydrierung auf (Publikationen 1 und 2). Dies spiegelt sich in erhöhten Hämatokritwerten, Hämoglobin-, Totalprotein- und Harnstoffkonzentrationen wider. Neben den zugrundeliegenden enteralen Wasserverlusten kommt es mit den hämorrhagischen Durchfällen (Publikation 1) zu Blutverlusten, welche sich hämatologisch bei beiden infizierten Gruppen 2 und 3, verglichen mit der Negativkontrolle, im erhöhten mittleren Erythrozyteneinzelvolumen (MCV) und in der hochdosiert infizierten Gruppe 3 zusätzlich in der verringerten Mittleren Zellulären Hämoglobinkonzentration (MCHC) niederschlägt. Es ist anzunehmen, dass das erhöhte MCV durch eine vermehrte Ausschüttung von unreifen Retikulozyten aus dem Knochenmark in das Blut bedingt ist (KOCIBA 1989), um die über den hämorrhagischen Durchfall auftretenden Blutverluste auszugleichen. Diese Beobachtung wird durch die in Publikation 4 beschriebenen Untersuchungen gestützt, welche eine Schädigung der Darmschleimhaut durch die Entwicklung der parasitären Stadien selbst noch gegen Ende der Patenz ergaben. Ähnliche Darmläsionen durch eine patente E. zuernii - Infektion, zum Teil noch in massiverer Ausprägung, wurden bereits von STOCKDALE (1977b) beschrieben. Die Beobachtung von
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erniedrigten MCHC-Werten in Gruppe 3, insbesondere ab dem 17. Tag p.i., erhärtet die These, dass infolge des Durchfallgeschehens eine Retikulozytose vorliegt (BOVY et al. 2005), zumal mit zunehmender Dauer der Infektion die MCHC-Werte statistisch signifikant absinken (Publikation 1).
Eine Hämokonzentration wurde zuvor bereits von FITZGERALD u. MANSFIELD (1972) für die E. bovis – Kokzidiose beobachtet. Im Gegensatz hierzu beobachtete STOCKDALE (1981) für die patente E. zuernii – Kokzidiose eine initiale Hämokonzentration, welche allerdings in der 4. Woche p.i. von einer Hämodilution abgelöst wurde. Es ist von einem engen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Durchfall und der Hämokonzentration auszugehen, da beide zeitlich parallel auftraten (Publikation 1). Die erhöhten Hämoglobin- und Hämatokritwerte sind als Zeichen einer durchfallbedingten Exsikkose zu bewerten. Eine Hämokonzentration ist bei tagelangen Durchfällen, wie sie im vorliegenden Versuch in beiden infizierten Gruppen 2 und 3 aufgetreten sind, die Folge, wenn der Flüssigkeitsverlust den Blutverlust überwiegt (FITZGERALD u. MANSFIELD 1972).
Desweiteren ergab die Untersuchung der diversen klinisch-chemischen Parameter ein deutliches Bild eines katabolen Stoffwechsels, wie er nach verminderter Nährstoffzufuhr auftreten kann (REID et al. 1979, ROBERTS et al. 1979). Dies äußert sich in Form einer Lipolyse, sichtbar an den erhöhten Konzentrationen der Freien Fettsäuren (TEICHMANN et al. 2002) und den erniedrigten Cholesterolblutspiegeln (SINGH et al. 2001) sowie in einem verstärkten endogenen Proteinkatabolismus (Publikation 2). Dieser zeigt sich in der Steigerung von Harnstoffkonzentration (STEIGER BURGOS et al. 2001) und Kreatinkinaseaktivität (HAPKE et al. 1994).
Durch das Ablösen der Darmmukosa, vor allem im Bereich von Zäkum und Kolon, entstehen zum einen direkte Verluste von Blut und Nährstoffen über den Darm (STOCKDALE 1977b, Publikation 4), andererseits kommt es zu einer erhöhten Permeabilität der Darmschleimhaut und damit zu Verlusten von Plasma in den Darm. Diese durchfallbedingten Nährstoffverluste sind mit einer verminderten Resorption durch die entzündete und teilweise stark geschädigte Darmschleimhaut im Jejunum und Ileum gekoppelt (Publikation 4), wie auch durch STOCKDALE (1977b) und STOCKDALE et al. (1978) zuvor gezeigt wurde. Zusätzlich kommt es aufgrund der Erkrankung, welche mit allgemeinen Krankheitssymptomen und zum Teil erheblich gestörtem Allgemeinbefinden einherging (Publikation 1), zu einem erhöhten Energiebedarf der Tiere, was sicher nicht unerheblich zu der katabolen Stoffwechsellage
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beiträgt. Zwar wiesen einige Tiere im Zuge der Allgemeinerkrankung einen verminderten Appetit auf (Publikation 1), wodurch die verfügbare Nährstoffmenge schon stark begrenzt war, dieser Faktor spielte allerdings bei den meisten infizierten Tieren keine oder nur eine vernachlässigbare Rolle.
Die Elektrolytkonzentrationen von Natrium und Chlorid waren im Zuge der patenten E. zuernii – Infektion im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich vermindert (Publikation 3). Dies betraf sowohl die moderat als auch die hochdosiert infizierte Gruppe. Der relative Mangel an Plasmaelektrolyten ist vermutlich auf den Verlust von Elektrolyten über den Durchfallkot, sowie die mit der Darmschädigung einhergehende verminderte Resorption zurückzuführen. Die intestinalen Elektrolytverluste erfolgen einerseits osmotisch und andererseits auch über Blutungen in das Darmlumen.
Die Kaliumkonzentrationen (Publikation 3) zeigten im Verlauf der Infektion keine klaren Veränderungen. Aus früheren Studien mit E. bovis (FITZGERALD 1967) ist bekannt, dass im Verlauf der Kokzidiose die Kalium-Blutspiegel merklich angestiegen sind, was der Zellzerstörung und dem damit verbundenen Freisetzen der Kaliumionen zugeschrieben wurde. Bei E. zuernii – Infektionen ist eine Erhöhung des Kalium-Blutspiegels vermutlich erst bei moribunden Tieren zu beobachten, da hier die Gewebszerstörung im Darm das größte Ausmaß erreicht.
Im Hinblick auf das Säure-Basen-Gleichgewicht wurde eine Störung im Sinne einer azidotischen Stoffwechsellage beobachtet (Publikation 3), welche sich in erniedrigten Basenüberschusswerten niederschlägt (KASARI u. NAYLOR 1986, KRAFT 1999). Die gemessenen pH-Werte lagen vornehmlich innerhalb des Referenzbereiches, so dass unter Berücksichtigung der verringerten Standardbikarbonat- (KASARI u. NAYLOR 1986) und Gesamtkohlendioxidkonzentrationen (GROVE-WHITE u. MICHELL 2001) von einer respiratorischen Kompensation einer metabolisch verursachten Azidose ausgegangen werden muss.
Ein Tier gelangte zum Ende der Studie in einen moribunden Zustand. Dieses Kalb zeigte eine deutliche Azidose, bei welcher die respiratorische Kompensation nicht mehr möglich war. Trotz eines niedrigen Bikarbonat- und Kohlendioxidgehaltes des Blutes wurde ein azidotischer pH-Wert erreicht. Diese Dekompensation konnte bei den subletalen Infektionsverläufen, welche in dieser Studie bei allen anderen Tieren der Gruppen 2 und 3 auftraten, nicht beobachtet werden. 66
Sowohl die Störungen des Elektrolythaushaltes als auch die Tendenz zur Azidose sind generell eng mit Durchfallgeschehen verbunden (ROUSSEL et al. 1998) und daher als unspezifischer Effekt der klinischen Kokzidiose anzusehen.
3.4 Metaphylaktische Kontrolle der E. zuernii – Kokzidiose mit Toltrazuril (Publikationen 4 und 5)
Durch den metaphylaktischen Einsatz von Toltrazuril (Baycox® 5% Suspension) Präpatenz konnte sowohl nach der experimentellen E. zuernii – Infektion (Publikation 4) als auch nach natürlichen Mischinfektionen (Publikation 5) eine hochgradige Reduktion der Oozystenausscheidung und eine deutliche Milderung des Durchfallgeschehens im Hinblick auf Inzidenz und Schwere erreicht werden.
Im Feld konnte in jedem der fünf untersuchten Studienbetriebe eine natürliche Mischinfektion des Bestandes mit E. zuernii und E. bovis nachgewiesen werden. In vier Betrieben überwog E. zuernii im Hinblick auf die ausgeschiedene Oozystenmenge (OpG) und die Ausscheidungsdauer. Aus den eigenen Ergebnissen lässt sich auch im Feld eine hohe Effektivität der Toltrazurilbehandlung gegen E. zuernii – Infektionen ableiten (Publikation 5). Trotz des nicht genau definierten Infektionszeitpunktes im Feldversuch hat Toltrazuril in allen Betrieben eine deutliche Wirkung gezeigt. Dies entspricht früheren Untersuchungen, welche eine Wirksamkeit des symmetrischen Triazintrions gegen sämtliche intrazellulären Entwicklungsstadien von Kokzidien postulieren (MEHLHORN et al. 1984, HABERKORN u. MUNDT 1988, HACKSTEIN et al. 1995). Die Wirkung von Toltrazuril wird als kokzidiozid beschrieben und unter anderem mit der Hemmung der Kernteilung (HABERKORN u. STOLTEFUß 1987) oder mit der Wirkung auf membranöse Organellen in parasitisch lebenden Apicomplexa allgemein (HACKSTEIN et al. 1995) begründet. Eine Wirksamkeit auf sporulierte oder unsporulierte Eimeria - Oozysten besteht hingegen nicht (HABERKORN u. STOLTEFUß 1987). Die Wirksamkeit auch gegen frühe intestinale Stadien ermöglicht die Unterbrechung der E. zuernii – Entwicklung bereits zum Zeitpunkt der Trophozoiten- oder initialen Schizontenbildung, so dass schwere Schleimhautläsionen durch spätere Schizonten und Gamonten (STOCKDALE 1977b, Publikation 4) und damit die Pathologie und Symptomatik einer Kokzidiose (Publikationen 1 bis 4) verhindert werden können. Eine metaphylaktische Behandlung ist aufgrund der dargelegten Pathogenese der Läsionen
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(Publikation 4) grundsätzlich als erfolgversprechender anzusehen als eine therapeutische Behandlung, da die Zerstörung der Mukosa mit Einsetzen der Oozystenausscheidung und dem möglichen Nachweis der Kokzidiose am betroffenen Einzeltier zum größten Teil schon stattgefunden hat (Publikationen 1 und 4).
Zusätzlich konnten nach der experimentellen E. zuernii – Infektion in der mit Toltrazuril behandelten Gruppe signifikant höhere Gewichtszunahmen im Vergleich zu den infizierten, unbehandelten Kontrolltieren festgestellt werden (Publikation 4). Im Gegensatz dazu wurden im Feld keine signifikanten Unterschiede zwischen den unbehandelten und mit Toltrazuril behandelten Tieren nachgewiesen (Publikation 5), was auf den multizentrischen Studienansatz zurückzuführen ist. In den verschiedenen Studienbetrieben waren die Kälber zum Zeitpunkt der Einstallung verschieden alt, gehörten unterschiedlichen Rassen an und wurden unter diversen Haltungsbedingungen aufgezogen, wobei auch die Begleiterkrankungen zwischen den Beständen stark variierten. All diese Faktoren bedingten in der Summe starke statistische Zentrumseffekte, womit der Einfluss der Kokzidiose auf das Gewicht nicht auswertbar war. Nichtsdestotrotz ist auch im Feld von einem verbesserten Allgemeinzustand der Tiere auszugehen, da die kokzidiosebedingten Durchfälle von Kälbern durch die Toltrazurilbehandlung deutlich gesenkt werden (MUNDT et al. 2007, Publikation 5). Der positive Gewichtseffekt beim metaphylaktischen Einsatz von Toltrazuril gegen Feldkokzidiosen konnte beispielsweise schon für Schwein und Huhn nachgewiesen werden (MATHIS et al. 2003, THOMSON 2007).
3.5 Übergreifende Interpretation und Bewertung der Studien
Insgesamt ergeben die unter experimentellen Bedingungen gewonnenen Erkenntnisse zum parasitologischen, klinischen und pathophysiologischen Verlauf im Zusammenhang mit den pathologischen Befunden ein Gesamtbild der E. zuernii – Kokzidiose als im Infektionsmodell reproduzierbare Enteritis mit systemischen Krankheitsfolgen.
E. zuernii entwickelt sich mit einer erstaunlich variablen Präpatenz im Wirtsorganismus (Publikation 1), wobei die Schizogonien zum größten Teil im Jejunum und Ileum und die Gamogonie im Kolon und Zäkum stattfinden (Publikation 4). Offenbar gibt es hier aber auch durchaus Überlappungen in den Zielabschnitten der verschiedenen Vermehrungsstadien. Die
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Variabilität in der Dauer der Präpatenz scheint mit zunehmender Infektionsdosis zu steigen (Publikation 1). Damit ergibt sich für die Metaphylaxe die Empfehlung, relativ zeitnah zum erwarteten Infektionszeitpunkt zu behandeln, da sich die Wirksamkeit von Toltrazuril auf alle Schizogoniestadien und auch die intrazellulären Gamogoniestadien erstreckt (HABERKORN u. STOLTEFUß 1987). Dies ermöglicht eine Unterdrückung der parasitären Enteritis durch Vermeidung der Entwicklung darmschädigender Gamogoniestadien (Publikation 4) und verhindert, dass hochdosiert infizierte Tiere bereits vor dem oder zum Behandlungszeitpunkt die Präpatenz durchlaufen haben.
Neben der Präpatenz schwankt auch die Stärke der Oozystenausscheidung (gemessen als Oozysten pro Gramm Kot) bei gleicher Infektionsdosis und gleichen Haltungsbedingungen erheblich zwischen den einzelnen Tieren einer Gruppe, ebenso die Ausscheidungsdauer. Dies deutet auf einen starken Einfluss der individuellen Immunantwort hin. Für E. bovis konnte eine Erhöhung der peripheren Blutlymphozyten im Zuge einer Immunreaktion auf die Infektion bereits zum Zeitpunkt der Schizogonie nachgewiesen werden (HERMOSILLA et al. 1999), wenngleich eine belastbare Immunität erst mit oder nach der Patenz zu erwarten ist (DAUGSCHIES u. NAJDROWSKI 2005). Generell konnte gezeigt werden, dass trotz der unterschiedlichen Menge der ausgeschiedenen Oozysten zuverlässig kokzidiosebedingte Durchfälle induziert wurden und alle infizierten Tiere mehr oder weniger starke klinische Erscheinungen aufweisen. Dies lässt sich verallgemeinern und bestätigt die Einschätzung, dass es sich bei E. zuernii um eine primär pathogene bovine Eimeria-Art handelt (PARKER et al. 1984, CORNELISSEN et al. 1995, LENTZE et al. 1999). Eine vergleichbar komplexe Darstellung der E. zuernii – Kokzidiose unter Einbeziehung von Pathologie, Histologie, Analyse metabolischer Vorgänge und Dokumentation klinisch-parasitologischer Befunde war bislang in der Literatur nicht verfügbar.
Die Durchfallerscheinungen waren in Auftreten und Stärke mit der Oozystenausscheidung korreliert (Publikation 1). Dies weist auf eine Darmschädigung insbesondere durch die späten intestinalen Gamogoniestadien hin, welche in unmittelbarer zeitlicher Nähe zur Oozystenausscheidung auftreten. Diese parasitologisch-klinische Beobachtung (Publikation 1) konnte durch lichtmikroskopisch-histologische Untersuchungen verifiziert werden (Publikation 4).
Trotz des Auftretens hämorrhagischer Durchfälle konnten selten deutliche klinische Anzeichen einer Exsikkose oder erhebliche Störungen des Allgemeinbefindens beobachtet
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werden. Mit Ausnahme eines Tieres aus der hochdosiert infizierten Gruppe, welches aufgrund einer kokzidiosebedingten Exsikkose einen Zustand mit infauster Prognose erreichte, gesundeten alle Kälber gegen Ende der Studie, so dass bei der E. zuernii – Kokzidiose von einer selbstlimitierenden Erkrankung ausgegangen werden kann. Diese Aussage kann sich aber nur auf die gewählten Infektionsdosen beziehen, im Feld wäre eine Infektion mit höheren Dosen und damit das Auftreten einer schwereren Klinik denkbar. Natürliche Infektionen verlaufen im Allgemeinen auch als allmähliche Infektionen mit wiederholter Aufnahme von Oozysten über mehrere Tage hinweg, so dass eine verstärkte oder protrahierte klinische Erkrankung vorkommen kann. RADOSTITS u. STOCKDALE (1980) kamen ebenfalls zu dem Schluss, dass bei der E. zuernii – Infektion im Allgemeinen entweder eine spontane Genesung oder aber Todesfälle auftreten. Allerdings sind auch bei spontan gesundenden Tieren immer eine vorübergehende Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens und eine anhaltende verminderte Produktivität (FITZGERALD 1980) möglich. Die Gewichtszunahmen der E. zuernii – infizierten Kälber waren über den Studienzeitraum von bis zu 28 Tagen nach der Infektion gegenüber den Kontrolltieren signifikant vermindert. Eine weitere verringerte Gewichtszunahme über den Zeitraum des Infektionsgeschehens hinweg wurde hier nicht ermittelt, generell ist ein Kümmererwachstum aber in Abhängigkeit von der Konstitution und Erkrankungsschwere als durchaus möglich anzusehen (FITZGERALD 1980, BÜRGER 1983, FOX 1985).
Die Untersuchung der verschiedenen Blutparameter ergab das Bild einer klassischen Durchfallerkrankung. Es traten aufgrund der verminderten Resorption und erhöhten Permeabilität an der Darmschleimhaut eine verringerte Nährstoffresorption bei gesteigertem intestinalen Nährstoffverlust auf (DAUGSCHIES u. NAJDROWSKI 2005). Zusätzlich ist aufgrund der Allgemeinerkrankung der infizierten Tiere (Publikationen 1 bis 3) von einem erhöhten Nährstoffbedarf auszugehen. Die Folge des resultierenden Mangels waren lipolytische Prozesse, gepaart mit erhöhtem Abbau körpereigener Eiweiße mit dem Resultat eines katabolen Stoffwechsels (Publikation 2). Zusätzlich kam es aufgrund der starken enteralen Wasser- und Blutverluste zu einer Hämokonzentration, welche offenbar mit Retikulozytosen im Zuge einer regenerativen Anämie einherging. Es konnte im Rahmen der lokalen Enteritis auch der typische Reaktionsverlauf entsprechend der Biologischen Entzündungskurve nach Schilling (KRAFT et al. 1999) mit initialer Leukopenie ab Beginn der Patenz und anschließender Leukozytose, durchschnittlich ab 23 Tagen p.i., verfolgt werden (Publikation 1).
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Im Bezug auf den Säure-Basen-Haushalt zeigte sich das aus der Katabolie resultierende Bild einer azidotischen Stoffwechsellage, wobei diese im Allgemeinen respiratorisch kompensiert war, die Ausnahme bildete hier das oben erwähnte moribunde Kalb aus der hochdosiert infizierten Gruppe (s. 3.3). Analog zum enteralen Basenverlust kam es zum Elektrolytverlust mit dem Durchfall, so dass die Konzentrationen von Natrium und Chlorid im Blut deutlich verringert waren.
Eine therapeutische Behandlung der klinischen Kokzidiose ist vor allem symptomatisch möglich, da die der Erkrankung zu Grunde liegenden Läsionen zum Beginn der Patenz bereits gesetzt sind (STOCKDALE 1977b, BÜRGER 1983, FOX 1985, Publikation 4). Zur Prävention bietet sich ein metaphylaktischer Ansatz, der neben E. zuernii auch E. bovis spezifisch erfasst, an. In der experimentellen E. zuernii – Infektion konnte eine gute Wirksamkeit des Toltrazurils nachgewiesen werden, welche sich sowohl auf die Minderung des Durchfallgeschehens und die Verbesserung der Gewichtszunahmen als auch auf die nahezu vollständige Unterbindung der Oozystenausscheidung erstreckte. Damit ist zum Einen die Erhaltung der klinischen Gesundheit des Einzeltieres möglich, was im Sinne des Tierschutzes, aber auch aus ökonomischen Gründen (FITZGERALD 1980, GRÄFNER et al. 1985) angezeigt ist. Andererseits kommt es durch eine wesentlich geringere Kontamination des Stalles mit ausgeschiedenen Oozysten zur Verringerung des Infektionsdruckes für nachfolgende Kälbergenerationen.
Der verwendete Wirkstoff Toltrazuril wurde zum Zeitpunkt der Untersuchungen bereits bei verschiedenen Tierarten mit Erfolg als Kokzidiozid eingesetzt (MEHLHORN et al. 1984, GJERDE u. HELLE 1986, HABERKORN u. MUNDT 1988, MUNDT et al. 2003b). Die vorgestellten Behandlungsstudien (Publikationen 4 und 5) waren Teil der Unterlagen, die zur inzwischen erfolgten Zulassung von Toltrazuril gegen die Rinderkokzidiose in der Europäischen Union einzureichen waren (Baycox® Bovis, Bayer Vital GmbH, Leverkusen).
Aufgrund der hohen Prävalenz von E. zuernii in Kälberhaltungen (ERNST u. BENZ 1986, PARKER et al. 1986, MAGE et al. 1990, MATJILA u. PENZHORN 2002, STASCHEN 2004) ist eine geeignete Bekämpfungsstrategie von immenser Bedeutung. Deshalb wurde der Einsatz von Toltrazuril nach erfolgreicher Prüfung in der experimentellen Infektion (Publikation 4) im Feld erprobt (Publikation 5). In den ausgewählten Studienbetrieben mit unterschiedlichen Stall-, Hygiene- und Fütterungsbedingungen lagen Mischinfektionen mit den beiden Erregern der Stallkokzidiose, E. zuernii und E. bovis (ERNST u. BENZ 1981),
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vor, was als repräsentativ für die Situation in mitteleuropäischen Kälberhaltungen zu betrachten ist (WEIßENBURG u. BETTERMANN 1978, BEJŠOVIC u. DONÁT 1982, EMANUEL et al. 1988, MAGE et al. 1990, PILARCZYK et al. 2000). Unter den Bedingungen einer natürlichen Mischinfektion konnte ebenfalls eine gute Wirksamkeit des Toltrazurils gegen die Oozystenausscheidung und die damit verbundenen Durchfallerscheinungen demonstriert werden. Aufgrund des multizentrischen Ansatzes, in dem die Wirksamkeit in jedem der untersuchten Betriebe gezeigt werden konnte, ist davon auszugehen, dass der effiziente Einsatz von Toltrazuril unabhängig von der Form der Kälberhaltung möglich ist.
Der Behandlungszeitpunkt (ca. 14 Tage nach Ein- bzw. Umstallung, d. h. nach dem erwarteten Beginn der Exposition) hat sich als günstig erwiesen, was auf eine kokzidiostatische Wirksamkeit des Toltrazurils auf die späten Schizogoniestadien von E. zuernii schließen lässt (STOCKDALE 1977a, Publikation 4). Dies steht in Einklang mit früheren Erfahrungen mit diesem Wirkstoff bei Einsatz gegen Eimeriosen, welche die Wirksamkeit ab dem Trophozoitenstadium bis zur Gamogonie feststellen (MEHLHORN et al. 1984; HABERKORN u. STOLTEFUß 1987, MUNDT et al. 2003a).
3.6 Schlussfolgerungen und Ausblick
Mit den vorgestellten Untersuchungen ist die E. zuernii – Kokzidiose im Infektionsmodell für weitere wissenschaftliche Studien oder die Prüfung von Antikokzidia eingehend charakterisiert. In der Feldstudie konnte belegt werden, dass durch E. zuernii eine teils subklinische, teils massive klinische Kokzidiose ausgelöst wird. Es ist gezeigt worden, dass eine metaphylaktische Behandlung für Kälberbestände mit klinischer Kokzidioseproblematik sinnvoll ist und die Anwendung von Toltrazuril zwei Wochen nach der Einstallung in den kontaminierten Bereich einen effektiven Behandlungsansatz darstellt. Bezüglich der Erkrankungsschwere wurde eine Variabilität beobachtet, welche im Feld aufgrund der unterschiedlichen aufgenommenen Infektionsdosen und des uneinheitlichen Gesundheitsstatus der Kälber besonders hoch ist. Die Ausprägung der klinischen Erscheinungen, die in von E. zuernii – Infektionen betroffenen Betrieben erfahrungsgemäß auftreten, sind für die Entscheidung, ob es sich im jeweiligen Bestand um einen behandlungswürdige Kokzidiose handelt, von grundlegender Bedeutung. 72
Aufbauend auf den durchgeführten Experimenten kann im etablierten E. zuernii – Infektionsmodell eine weiterführende Bearbeitung der Pathophysiologie erfolgen. Die gewonnenen Erkenntnisse zum Krankheitsverlauf sollten weiter vertieft werden, z. B. hinsichtlich eventueller spezifischer durch die E. zuernii – Infektion ausgelöster Veränderungen im Wirtsorganismus, die als eindeutige Indikatoren für eine Kokzidiose dienen können. Es ist zu klären, ob Enzymaktivitäten, neben der untersuchten Kreatinkinase, oder Akutphasenproteine, wie z. B. Haptoglobin, eine Früherkennung des Kokzidiosegeschehens ermöglichen können.
Eine immunologische Untersuchung kann eine Infektion sehr spezifisch anzeigen. Allerdings sind zum Einen bis dato keine serologischen Nachweismethoden für E. zuernii entwickelt und zum Anderen ist die Serokonversion wie bei E. bovis (FABER et al. 2002) erst nach der Oozystenausscheidung zu erwarten. Für eine Früherkennung in der Präpatenz bietet die Serologie daher keine Optionen und ist allenfalls für epidemiologische Fragestellungen von Wert.
Als frühdiagnostisches Mittel wäre ein Nachweis von mit dem Kot ausgeschiedenen Merozoitenstadien in der frühen Präpatenz geeignet, welcher beispielsweise als Enzymgekoppelter Immunoadsorptionstest (Koproantigen-ELISA) oder als DNA-Nachweis mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) denkbar wäre. Beide Verfahren sind bislang nicht entwickelt, so dass das Problem der Erkennung der Infektion vor Ausbruch der Erkrankung nicht gelöst ist.
Die in den eigenen Untersuchungen aufgezeigten klinischen Erscheinungen und metabolischen Abweichungen sind vorrangig dem Leitsymptom Durchfall zuzuordnen und damit relativ unspezifisch. Aufgrund der metabolischen Parameter ist es nicht möglich, eine gezielte Metaphylaxe von Kälbern zu empfehlen, da sie erst im Verlauf der Patenz und bei klinischer Erkrankung Veränderungen aufweisen. Generell sollte die Behandlung immer die gesamte eingestallte Kälbergruppe umfassen, um den Infektionsdruck für nachfolgende Jungtiergenerationen nachhaltig zu verringern, da auch geringe ausgeschiedene Oozystenmengen die Grundlage für spätere Infektionen bilden. Damit ist für die Wahl des optimalen Behandlungszeitpunktes die Anamnese der Herde bezüglich des üblichen Erkrankungszeitpunktes entscheidend. Obwohl eine Einzeltierbehandlung damit in den Hintergrund rückt, kann eine Erhebung von diversen Blutparametern sinnvoll sein, um eine Aussage zur Prognose erkrankter Tiere treffen zu können.
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Da es sich bei der E. zuernii – Infektion in vielen Beständen um ein dauerhaft auftretendes Problem handelt und eine vollständige Bestandssanierung bei Kälberkokzidiosen praktisch unmöglich ist (FOX 1985), wird diese Erkrankung sicher auch in Zukunft nicht an Aktualität und Wichtigkeit verlieren. Es ist also von allgemeinem veterinärmedizinischem Interesse, weiterhin auf diesem Gebiet zu forschen. Dies betrifft weiterführende experimentelle Studien, für welche das beschriebene Infektionsmodell eine wichtige Grundlage bildet, aber auch breit angelegte epidemiologische Studien, welche der Verbesserung von Bekämpfungsstrategien dienen werden. Die Entwicklung von frühdiagnostischen Nachweisverfahren ist ebenfalls als wünschenswert anzusehen, um die untersuchte Metaphylaxemaßnahme optimieren und unnötige Anwendungen von Antikokzidia und das damit verbundene Risiko einer Resistenzentwicklung vermeiden zu können.
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4 Zusammenfassung
Berit Bangoura „Studien zur Charakterisierung und metaphylaktischen Kontrolle der Eimeria zuernii – Kokzidiose des Kalbes“ Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im September 2007
Bibliographische Angaben: Anzahl der Seiten: 78 Anzahl der Abbildungen: 24 Anzahl der Tabellen: 15 Literaturangaben (ohne eigene Publikationen 1-5): 80 Schlüsselwörter: Eimeria zuernii, Kokzidiose, Kalb, Infektionsmodell, Pathologie, Pathophysiologie, Toltrazuril
In den vorliegenden Studien wurde die Eimeria zuernii – Kokzidiose im Hinblick auf den klinischen Verlauf, die Pathophysiologie, die Pathologie und einen metaphylaktischen Behandlungsansatz charakterisiert. Hierfür wurden experimentelle Infektionen an Kälbern durchgeführt, zusätzlich wurden natürlich infizierte Tiere in die Prüfung der Wirksamkeit der Behandlung einbezogen. Die parasitologischen und pathophysiologischen Untersuchungen wurden im Infektionsmodell an insgesamt 41 Kälbern durchgeführt, die in drei Gruppen eingeteilt wurden: eine uninfizierte Kontrollgruppe 1 (n=14), die moderat infizierte Gruppe 2 (150.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten pro Kalb, n=11) und die hochdosiert infizierte Gruppe 3 (250.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten pro Kalb, n=16). Die Tiere wurden regelmäßig klinisch und ihre Kotproben auf Konsistenz und Parasitenaussscheidung untersucht. Es wurden regelmäßig Blutproben zur Bestimmung hämatologischer und klinisch-chemischer Parameter sowie des Säure-Basen-Status entnommen, und die Tiere wurden wöchentlich gewogen. Die Infektion mit E. zuernii löste bei allen Tieren der Gruppen 2 und 3 nach einer variablen Präpatenzdauer eine Ausscheidung von E. zuernii-Oozysten aus. Im Gegensatz zur uninfizierten Kontrollgruppe entwickelten alle infizierten Tiere Durchfall mit teils hämorrhagischem Charakter, wobei eine deutliche Korrelation zwischen der Oozystenausscheidung und dem Auftreten von Diarrhoe nachgewiesen werden konnte. Klinische Erkrankungen traten häufiger in der hochdosiert infizierten als in der moderat infizierten Gruppe auf. Hierbei standen Exsikkosen und ein vermindertes Allgemeinbefinden im Vordergrund. Ein Tier der hochinfizierten Gruppe erkrankte aufgrund der Kokzidiose infaust. Die Gewichtszunahmen waren in beiden infizierten Gruppen, bezogen auf die Kontrollgruppe 1, signifikant erniedrigt, in der hochdosiert infizierten Gruppe 3 stärker als in der moderat infizierten Gruppe 2.
Die Veränderungen bei den untersuchten Blutparametern traten im Allgemeinen dosisabhängig auf. In Gruppe 3 wurden stärkere Abweichungen von den Blutwerten der Kontrollkälber beobachtet als in 75
Gruppe 2. Initial kam es während der Patenz zu einer Leukopenie, welche anschließend in eine Leukozytose überging. Im Zuge der enteralen Blut- und Wasserverluste bildeten sich eine Hämokonzentration sowie eine Retikulozytose heraus, was als Hinweis auf eine regenerative Anämie gewertet wird. Während der Patenz fand eine Umstellung des Organismus auf einen katabolen Stoffwechsel statt, was sich in einer Lipolyse und einem gesteigerten Proteinabbau niederschlug. Außerdem kam es zu einer Störung der Homoiostase. Es lagen Elektrolytverluste über den geschädigten Darm vor, und es entwickelte sich eine respiratorisch kompensierte metabolische Azidose.
Die pathologischen Untersuchungen wurden an sechs weiteren moderat infizierten Kälbern (150.000 sporulierte E. zuernii – Oozysten pro Kalb) durchgeführt. In der späten Präpatenz (16 Tage p.i.) zeigten sich nur geringe Läsionen durch die Schizogoniestadien vom kaudalen Jejunum bis zum mittleren Kolon. Zum Höhepunkt der Patenz hin (21 Tage p.i.) wiesen die beiden untersuchten Tiere akute, teils nekrotisierende Enteritiden auf, vor allem im proximalen Kolon sowie im Zäkum. Offenbar verursacht die Gamogonie, welche zu diesem Zeitpunkt vorherrscht, die stärksten Schleimhautschäden und ist damit als Auslöser der Durchfallerscheinungen zu betrachten. Gegen Ende der Patenz, am 26. Tag p.i., lagen noch entzündliche Infiltrationen der Schleimhautabschnitte vom terminalen Ileum bis zum Kolon vor, parallel fanden regenerative und hyperplastische Prozesse statt.
Im Infektionsmodell und anschließend unter Feldbedingungen wurde die Effektivität einer einmaligen oralen metaphylaktischen Toltrazurilbehandlung (15 mg pro kg Körpergewicht, Baycox® 5% Suspension) etwa 14 Tage nach der Infektion getestet. Für die Prüfung unter experimentellen Bedingungen wurden 23 Kälber mit einer Dosis von 150.000 sporulierten E. zuernii – Oozysten infiziert. Die Anwendung des Toltrazurils im Feld wurde im Rahmen einer multizentrischen Studie mit fünf Studienbetrieben und insgesamt 208 Kälbern getestet. Es lagen in allen Betrieben Mischinfektionen mit den Pathogenen E. zuernii und E. bovis vor. In jedem der beiden GCP-Versuche wurde etwa die Hälfte der Tiere behandelt, während die andere Hälfte als Negativkontrolle unbehandelt blieb. Durch den Einsatz des Antikokzidiums konnten im Experiment sowie unter Feldbedingungen die Durchfalldauer und –schwere ebenso wie die Dauer und Höhe der Oozystenausscheidung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant gesenkt werden. Die Gewichtszunahme war in der toltrazurilbehandelten Gruppe unter experimentellen Bedingungen signifikant höher als in der Kontrollgruppe, im Feld ließ sich dieser Effekt nicht zeigen.
Damit konnte die E. zuernii – Infektion im zeitlichen Verlauf und im Einfluss auf das Zielorgan Darm und den Gesamtorganismus unter den standardisierten Bedingungen einer experimentellen Infektion dargestellt werden. Es konnte eine Behandlungsmöglichkeit als hochwirksam eingestuft werden, welche durch die frühe, metaphylaktische Anwendung eines Kokzidiostatikums die zu erwartenden Darmläsionen während der späten Schizogonie und der Gamogonie unterbindet.
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5 Summary
Berit Bangoura „Studies on the characterization and metaphylactic control of Eimeria zuernii – coccidiosis in calves“ Institute of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in September 2007
Bibliographical Details: No. of pages: 78 No. of figures: 24 No. of tables: 15 References (without own publications 1-5): 80 Keywords: Eimeria zuernii, coccidiosis, cattle, infection model, pathology, pathophysiology, toltrazuril
The studies presented were designed to characterize Eimeria zuernii – coccidiosis regarding the clinical course, pathophysiology, pathology and a metaphylactic approach in treatment. Thererfore experimental infections in calves were performed. In addition, naturally infected animals were included into the assessment of efficacy of the applied treatment. The parasitological and pathophysiological investigations were conducted in the infection model and included a total of 41 calves which were divided into three groups: an uninfected control group 1 (n=14), a moderate-dose infected group 2 (150,000 sporulated E. zuernii – oocysts per calf, n=11), and a high-dose infected group 3 (250,000 sporulated E. zuernii – oocysts per calf, n=16). Clinical examinations of all animals were consistently performed, parasite excretion was regularly investigated in faecal samples. Blood samples were taken regularly for determination of haematologic parameters, clinical chemistry and acid-base-balance. Animals were weighed weekly. Infection with E. zuernii caused E. zuernii oocyst excretion in all calves of groups 2 and 3 after a variable prepatent period. In contrast to the uninfected control, diarrhoea of partially haemorrhagic quality developed in all infected animals. A marked correlation between oocyst excretion and occurrence of diarrhoea could be observed. Clinical disease showed more frequently in the high-dose infected than in the moderate-dose infected group. Exsiccosis and reduced general behaviour were the main symptoms. One animal of the high-dose infected group entered a moribund state due to coccidiosis. Body weight gain was significantly decreased in both infected groups compared to the control group 1, reduction was more pronounced in the high-dose infected group 3 than in the moderately infected group 2.
In general, changes in the blood parameters investigated showed a dose dependency. Aberrations were more severe in group 3 than in group 2 compared to the values observed in the control calves. During patency an initial leukopenia was observed which was followed by a leukocytosis. Due to intestinal loss of blood and water haemoconcentration and reticulocytosis developed which are regarded as 77
indicative for a regenerative anaemia. In the course of patency a conversion to a catabolic metabolism took place which was reflected in lipolysis and an intensified protein catabolism. Furthermore, a disturbance of homoiostasis occurred. There was an electrolyte loss via the damaged intestine. A metabolic acidosis emerged which was compensated by respiration.
Pathological examinations were conducted in six additional calves which were infected with a moderate dose rate (150,000 sporulated E. zuernii – oocysts per calf ). In late prepatency (16 days after infection) only slight intestinal lesions caused by schizonts were seen in the sections from caudal jejunum to the middle colon. Towards the peak of patency (21 days after infection) both examined animals showed acute and partially necrotizing enteritis, mainly in the proximal colon and caecum. Apparently gamogony which prevails at this point in time causes most severe mucosal lesions. Thus it is to be regarded as the trigger of the occurrence of diarrhoea. At the end of patency (26 days after infection) there were still inflammational infiltrations of the mucosa present from terminal ileum to colon. In parallel, regenerative and hyperplastic processes took place.
Under experimental conditions of the infection model and afterwards under field conditions efficacy of a single, oral and metaphylactic treatment with toltrazuril (15 mg per kg body weight, Baycox® 5% suspension), applied about 14 days after infection, was assessed. For the evaluation under experimental conditions, 23 calves were infected with a dose rate of 150,000 sporulated E. zuernii – oocysts each. Usage of Toltrazuril in the field was tested in a multicentric study with a total 208 calves on five different farms. On all farms multiple infections with E. zuernii and E. bovis occurred. In both GCP trials about the half of the animals were treated while the remaining animals served as untreated negative control. Due to the application of the anticoccidial compound there was a significant reduction of severity and duration of diarrhoea as well as of duration and quantity of oocyst excretion compared to the untreated control. This applied to both trials under experimental and field conditions. Body weight gain was significantly higher in the Toltrazuril-treated than in the untreated group under experimental conditions. This could not be confirmed during the field study.
Thus, E. zuernii – infection could be described in course over time and in terms of its influence on the target organ intestine and its systemic impact using an infection model with standardized conditions and experimental infection. An option for treatment could be classified as highly effective because the early metaphylactic use of an anticoccidial compound prevents expected intestinal lesions during late schizogony and gamogony.
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Danksagung
Hiermit möchte ich all denen danken, die mir bei der Erstellung dieser Arbeit zur Seite gestanden haben.
Allen voran danke ich Prof. Dr. A. Daugschies, der bei der Festlegung des Themas, während der Durchführung der Experimente und bei der Auswertung der Ergebnisse und Erstellung des Manuskripts stets verfügbar war und hilfreiche Anregungen lieferte.
Weiterhin bedanke ich mich bei der Bayer HealthCare AG für die Zurverfügungstellung der Tiere und deren Pflege, die Überlassung von Räumlichkeiten und Gerätschaften für die Durchführung der experimentellen Versuche sowie für die Organisation und statistische Auswertung der Feldstudie. Insbesondere möchte ich hierbei Dr. H.-C. Mundt danken.
Auch all meinen Leipziger Kollegen gilt mein Dank für die Aufarbeitung einer Vielzahl von Kotproben im Rahmen der Feldstudie. Friederike Uebe möchte ich für die gute Einarbeitung und Zusammenarbeit danken.
Desweiteren danke ich Herrn A. Richter für die Hilfe bei der statistischen Auswertung der experimentellen Studien.
Nicht zuletzt möchte ich meiner gesamten Familie von Herzen für die seelische Unterstützung während der vergangenen Jahre danken.
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