Universidad De Guayaquil Facultad De Ciencias Naturales Anexo 13 Carrera De Biología Unidad De Titulación

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

CARRERA DE BIOLOGÍA

Trabajo de titulación previo a obtener el grado académico de Bióloga

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce y Croton ferrugineus Kunth

AUTOR: VIVIANA CAROLINA VALDEZ MURILLO

TUTOR: PhD. EVER MORALES AVENDAÑO

GUAYAQUIL-ECUADOR

2019

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ANEXO 13 CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce y Croton ferrugineus Kunth

Autora: Viviana Valdez Murillo Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño

RESUMEN En el presente estudio, se realizó el tamizaje fitoquímico, cuantificación de flavonoides y fenoles totales, la evaluación de la actividad antibacteriana contra tres bacterias Gram Positivas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes) y tres Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) y la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos etanólicos obtenidos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus. Para el análisis de las muestras se realizó el tamizaje fitoquímico por el método de Domínguez, la cuantificación de flavonoides por el método colorimétrico cloruro de aluminio, la cuantificación de fenoles totales por el método Folin-Ciocalteu, actividad antibacteriana por ensayos de difusión por disco y actividad antioxidante mediante la técnica 2,2- Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). En el tamizaje fitoquímico los flavonoides y taninos presentaron mayores contenidos, mientras que los alcaloides, quinonas, antraquinonas, esteroides y saponinas estuvieron presentes en menor proporción. El contenido de flavonoides varió de 100,95 ± 1,73 a 995,42 ± 3,16 mg CE / g extracto en H. escobariae y L. huasango y el contenido de fenoles varió de 10,17 ± 0,22 a 314,72 ± 1,91 mg GAE/ g extracto en Croton ferrugineus y L. huasango el cual también obtuvo la mejor actividad antibacteriana frente a las cepas evaluadas con CMI que varían de 2.5 a 5 mg/mL y la mejor actividad antioxidante con IC50 de 0,1 mg/mL y de 0,7 mg/mL para C. ferrugineus con una diferencia significativa p<0.05. Estos resultados son los primeros reportados los que servirán como línea base para estudios posteriores. Palabras claves: antibacteriano, antioxidante, Croton ferrugineus, fenoles, flavonoides, Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango, tamizaje fitoquímico.

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ANEXO 14 CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN

ANTIBACTERIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ETHANOLIC EXTRACTS OF Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce and Croton ferrugineus Kunth

Author: Viviana Valdez Murillo Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño

ABSTRACT

This study has done phytochemical screening, quantification of flavonoids and total phenols, evaluation of antibacterial activity against three Gram positive bacterias (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes), three Gram negatives (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) and the evaluation antioxidant activity of ethanolic extracts of Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango and Croton ferrugineus. The sample analysis employed phytochemical screening by Dominguez’s method, quantification of flavonoids by the aluminum chloride colorimetric method, quantification of total phenols by the Folin-Ciocalteu method, antibacterial activity by disk diffusion assay and antioxidant activity by DPPH method. In the phytochemical screening, the flavonoids and tannins were higher proportion, while alkaloids, quinones, anthraquinones, steroids and saponins were present in lower proportion. The flavonoid content varied in a range of 100.95 ± 1.73 and 995.42 ± 3.16 mg CE / g extract, in H. escobariae and L. huasango and the total phenol content varied in a range of 10.17 ± 0.22 a 314.72 ± 1.91 mg GAE/ g extract in C. ferrugineus and L. huasango, which also obtained the best antibacterial activity against all the strains evaluated with MIC that varied of 2.5 - 5 mg/mL and also obtained the best antioxidant activity with a IC50 of 0.1 mg/mL and 0.7 mg/mL for Croton ferrugineus with a significant difference p<0.05. These results are the first reported and will serve as a baseline for further studies.

Key words: antibacterial, antioxidant, Croton ferrugineus, flavonoids, Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango, phenols, phytochemical screening.

Viviana Carolina Valdez Murillo

2019

DEDICATORIA

A Dios por haberme permito llegar hasta este momento tan especial e importante en mi vida profesional. A mis padres, hermanos, tíos y abuelos por haberme brindado todo su cariño y apoyo incondicional. A mi papá German que a pesar de la distancia física, sé que está muy orgulloso de mí en estos momentos porque logré lo que el tanto anhelaba.

AGRADECIMIENTOS

A Dios porque sin él nada habría sido posible. A mi familia porque siempre han estado conmigo en todo momento importante en mi vida. A los biólogos Shirley, Leonardo, Xavier, Jaime, a mi tutor Ever y a mi amigo Jhon por haberme enseñado con mucha paciencia y permitido elaborar mi trabajo de titulación.

ÍNDICE DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ...... 1

CAPÍTULO I ...... 4

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 4

1.2 OBJETIVOS ...... 6

1.2.1 Objetivo General ...... 6

1.2.2 Objetivos Específicos ...... 6

1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA ...... 7

1.4 HIPÓTESIS ...... 9

CAPÍTULO II ...... 10

2.1 ANTECEDENTES ...... 10

2.2 MARCO TEÓRICO ...... 14

2.2.1 Hibiscus escobariae ...... 14

Taxonomía...... 14

Ecología ...... 14

Descripción botánica ...... 15

2.2.2 Loxopterygium huasango ...... 15

Taxonomía...... 15

Ecología ...... 15

Descripción botánica ...... 16

2.3.3 Croton ferrugineus ...... 16

Taxonomía...... 16

Ecología ...... 17

Descripción botánica ...... 17

2.2.4 Metabolitos secundarios ...... 17

2.2.5 Tamizaje fitoquímico ...... 19

Alcaloides ...... 19

iii

Flavonoides ...... 20

Taninos ...... 21

Quinonas ...... 23

Triterpenoides y esteroides ...... 25

Saponinas ...... 26

2.2.6 Cuantificación de flavonoides ...... 27

2.2.7 Cuantificación de fenoles ...... 27

2.2.8 Actividad antioxidante ...... 28

Metabolitos secundarios como agentes antioxidantes ...... 28

2.2.9 Actividad antibacteriana ...... 29

Metabolitos secundarios como agentes antibacterianos ...... 30

CAPÍTULO III ...... 31

3.1 METODOLOGÍA ...... 31

3.1.1 Material biológico ...... 31

3.1.2 Obtención del extracto ...... 31

3.1.3 Tamizaje fitoquímico ...... 32

3.1.3.1 Determinación de alcaloides...... 32

3.1.3.2 Determinación de flavonoides ...... 32

3.1.3.3 Determinación de taninos...... 32

3.1.3.4 Determinación de quinonas y antraquinonas...... 33

3.1.3.5 Determinación de esteroides y triterpenos...... 33

3.1.3.6 Determinación de saponinas...... 33

3.1.4 Cuantificación de flavonoides y ácidos fenólicos totales ...... 34

3.1.4.1 Cuantificación de flavonoides totales...... 34

3.1.4.2 Cuantificación de ácidos fenólicos totales...... 35

3.1.5 Actividad antioxidante ...... 35

3.1.5.1 Preparación de soluciones ...... 35

3.1.5.2 Procedimiento ...... 36

3.1.5.3 Procedimiento para diluciones ...... 36

3.1.6 Actividad antibacteriana ...... 37

3.1.6.1 Cultivo de microorganismos ...... 37

3.1.6.2 Preparación y suspensión del inóculo ...... 37

3.1.6.3 Siembra de la muestra ...... 37

3.1.6.4 Medición de la zona del halo de inhibición ...... 38

3.1.7 Análisis estadístico ...... 38

CAPÍTULO IV ...... 39

4.1 RESULTADOS ...... 39

4.1.1 Tamizaje fitoquímico ...... 39

4.1.1.1 Hibiscus escobariae...... 39

4.1.1.2 Loxopterygium huasango ...... 40

4.1.1.3 Croton ferrugineus ...... 41

4.1.2 Cuantificación de flavonoides ...... 42

4.1.3 Cuantificación de fenoles ...... 43

4.1.4 Actividad antioxidante ...... 44

4.1.5 Actividad antibacteriana ...... 46

4.1.6 Análisis estadístico ...... 48

DISCUSIÓN ...... 49

CONCLUSIONES ...... 53

RECOMENDACIONES ...... 54

REFERENCIAS ...... 55

ANEXOS ...... 67

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas de Hibiscus escobariae ...... 39 Tabla 2: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas Loxopterygium huasango ...... 40 Tabla 3: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas de Croton ferrugineus ...... 41 Tabla 4: Contenido total de flavonoides ...... 42 Tabla 5: Contenido total de fenoles ...... 43 Tabla 6: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae en bacterias Gram positivas ...... 46 Tabla 7: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae en bacterias Gram negativas ...... 46 Tabla 8: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium huasango en bacterias Gram positivas ...... 47 Tabla 9: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium huasango en bacterias Gram negativas ...... 47 Tabla 10: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus en bacterias Gram positivas ...... 48 Tabla 11: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus en bacterias Gram negativas ...... 48 Tabla 12: Actividad antioxidante de los extractos etanólicos de hojas de tres especies de plantas del Ecuador ...... 44

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Hibiscus escobariae ...... 14 Figura 2: Loxopterygium huasango ...... 15 Figura 3: Croton ferrugineus...... 16 Figura 4: Elementos del metabolismo del carbono en relación con las rutas de síntesis de metabolitos secundarios ...... 18 Figura 5: Alcaloides representativos ...... 20 Figura 6: Tipos de flavonoides ...... 21 Figura 7: Estructura química de compuestos polifenólicos no flavonoides ..... 22 Figura 8: Estructura química de compuestos polifenólicos de tipo flavonoide 23 Figura 9: Tipos de quinonas ...... 24 Figura 10: Molécula de escualeno y sus derivados triterpenos cíclicos estigmasterol y sitosterol ...... 26 Figura 11: Estructura química de las saponinas ...... 26

vii

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Curva de calibración usando quercetina como estándar ...... 42 Gráfico 2: Curva de calibración usando ácido gálico como estándar ...... 43 Gráfico 3: Actividad antioxidante de Loxopterygium huasango ...... 44 Gráfico 4: Actividad antioxidante de Croton ferrugineus ...... 45 Gráfico 5: Comparación del porcentaje de inhibición de radical DPPH de las especies evaluadas frente al ácido ascórbico ...... 45

viii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1: Pruebas de alcaloides ...... 67 Anexo 2: Prueba Shinoda para flavonoides ...... 67 Anexo 3: Prueba de Hidróxido de sodio para flavonoides ...... 67 Anexo 4: Prueba del cloruro férrico para taninos ...... 68 Anexo 5: Prueba Salkowski para esteroles y triterpenos ...... 68 Anexo 6: Prueba Liebermann-Bouchardat para esteroles y triterpenos ...... 68 Anexo 7: Prueba Borntrager para quinonas y antraquinonas ...... 69 Anexo 8: Prueba del ácido sulfúrico para quinonas y antraquinonas ...... 69 Anexo 9: Prueba de espuma para saponinas...... 69 Anexo 10: Curva de cuantificación de flavonoides ...... 70 Anexo 11: Prueba para la cuantificación de flavonoides ...... 70 Anexo 12: Prueba de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de fenoles ...... 70 Anexo 13: Ensayo del radical DPPH para actividad antioxidante ...... 71 Anexo 14: Actividad antibacteriana de Hibiscus escobariae ...... 71 Anexo 15: Actividad antibacteriana de Loxopterygium huasango ...... 72 Anexo 16: Actividad antibacteriana de Croton ferrugineus en Escherichia coli 72

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce Y Croton ferrugineus Kunth

Autor: Viviana Valdez Murillo Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño

RESUMEN

En el presente estudio, se realizó el tamizaje fitoquímico, cuantificación de flavonoides y fenoles totales, la evaluación de la actividad antibacteriana contra tres bacterias Gram Positivas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes) y tres Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) y la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos etanólicos obtenidos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus. Para el análisis de las muestras se realizó el tamizaje fitoquímico por el método de Domínguez, la cuantificación de flavonoides por el método colorimétrico cloruro de aluminio, la cuantificación de fenoles totales por el método Folin- Ciocalteu, actividad antibacteriana por ensayos de difusión por disco y actividad antioxidante mediante la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). En el tamizaje fitoquímico los flavonoides y taninos presentaron mayores contenidos, mientras que los alcaloides, quinonas, antraquinonas, esteroides y saponinas estuvieron presentes en menor proporción. El contenido de flavonoides varió de 100,95 ± 1,73 a 995,42 ± 3,16 mg CE / g extracto en H. escobariae y L. huasango y el contenido de fenoles varió de 10,17 ± 0,22 a 314,72 ± 1,91 mg GAE/ g extracto en Croton ferrugineus y L. huasango el cual también obtuvo la mejor actividad antibacteriana frente a las cepas evaluadas con CMI que varían de 2.5 a 5 mg/mL y la mejor actividad antioxidante con IC50 de 0,1 mg/mL y de 0,7 mg/mL para C. ferrugineus con una diferencia significativa p<0.05. Estos resultados son los primeros reportados los que servirán como línea base para estudios posteriores.

Palabras claves: antibacteriano, antioxidante, Croton ferrugineus, fenoles, flavonoides, Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango, tamizaje fitoquímico.

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN

ANTIBACTERIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ETHANOLIC EXTRACTS OF Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce AND Croton ferrugineus Kunth

Author: Viviana Valdez Murillo Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño

ABSTRACT

Key words: antibacterial, antioxidant, Croton ferrugineus, flavonoids, Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango, phenols, phytochemical screening.

INTRODUCCIÓN

Ecuador se ha convertido en uno de los países con un gran potencial respecto a la medicina tradicional debido a su alta diversidad biológica y cultural (Zambrano et al., 2014). Se estima que aproximadamente el 80% de la población de nuestro país depende de la medicina tradicional, principalmente las personas que viven en zonas rurales; las cuales, todavía necesitan directa o indirectamente de las plantas para cubrir sus necesidades. En las ciudades, el uso de plantas con propiedades terapéuticas es menor y generalmente es más usado por las personas que viven en zonas marginales; no obstante, el comercio de plantas medicinales aún se mantiene en los mercados de nuestro país (Buitrón, 2013).

Las plantas están compuestas por metabolitos primarios como carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos que están ampliamente distribuidos y participan en la actividad celular. También, están formadas por metabolitos secundarios; los cuales no son indispensables para las plantas; sin embargo, forman parte de los llamados principios activos, compuestos químicos de estructura relativamente compleja. Entre ellos se encuentran los alcaloides, ácidos fenólicos, terpenos, quinonas, antraquinonas, saponinas que poseen propiedades medicinales. Conociendo los metabolitos secundarios presentes en la planta se pueden diseñar reacciones para producir derivados con utilidad terapéutica (Kuklinski, 2000 y Lock, 1998).

Un antioxidante es una molécula que posee la capacidad de prevenir o retardar la oxidación de otras moléculas, que pueden conducir al organismo a un estrés oxidativo; lo que provoca una amplia diversidad de enfermedades como la hipertensión arterial, psoriasis, diabetes mellitus, entre otras, debido a que la defensa antioxidante es insuficiente (Lee et al., 2004; Pham-Huy, 2008). La ingesta de una dieta rica en antioxidantes de origen natural, presentes en frutas y vegetales disminuye el riesgo de padecer enfermedades provocadas por estrés oxidativo (Paredes, 2010). Para saber la capacidad antioxidante de los principios activos de las plantas y alimentos se han descrito diversas técnicas. Entre estas,

las más utilizada es la técnica que utiliza el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo conocido por las siglas DPPH; el cual es susceptible de reaccionar con compuestos antioxidantes (Villaño et al., 2007; Goupy et al., 2003).

Los productos obtenidos de las plantas como los extractos y sus compuestos puros, otorgan una gran cantidad de oportunidades para poder crear nuevos medicamentos que beneficien al control microbiano. Uno de los problemas actuales es la resistencia que presentan una serie de bacterias a los antibióticos, debido a mutaciones en sus genes o por la adquisición de genes de resistencia presentes en otros microorganismos. Además, de evitar la propagación y la aparición de la resistencia a los antibióticos el objetivo es el descubrimiento de nuevos fármacos (Fernández et al., 2003).

En Ecuador según los datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) las enfermedades causadas por infecciones bacterianas fueron las más comunes, ubicándose en el puesto número uno las infecciones respiratorias, la diarrea aguda en segundo lugar. En relación a esto, se puede lograr el desarrollo de farmacéuticos con actividad antimicrobiana, siendo indispensable el estudio de plantas utilizadas en el país, comenzando con la identificación de los principios activos presentes en las plantas para después obtener información sobre la capacidad antimicrobiana del compuesto de interés (OMS, 2018; Ncube, et al., 2008).

En la medicina, actualmente existen un 30% de fármacos provenientes del reino vegetal, esta cifra tiende a elevarse en los últimos años debido al descubrimiento de los principios activos presentes en las plantas. Los metabolitos secundarios presentes en ellas poseen un gran interés biomédico, por las diversas actividades biológicas que poseen como antioxidantes, antimicrobianos, antiinflamatorios, expectorantes, analgésicos, desintoxicantes, entre otros (Villareal, et al., 2014).

El género Hibiscus pertenece a la familia Malvaceae y se caracteriza por presentar gran cantidad de flavonoides, taninos, triterpenos. Además, se han demostrado sus propiedades antimicrobianas frente a Escherichia coli,

Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, y con actividad antioxidante, atribuida a los fenoles presentes en este género, de los que destacan las antocianinas y los ácidos fenólicos (Medina et al., 2013; Reyes et al., 2015; Sulaiman et al., 2014; Da Costa et al., 2014). A pesar de las propiedades que poseen algunas especies del género Hibiscus, no se han reportado estudios de la composición química y actividad biológica de Hibiscus escobariae.

La especie Loxopterygium huasango de la familia Anacardiaceae se encuentra en bosques secos tropicales, y presenta entre los metabolitos secundarios: flavonoides, fenoles, saponinas, quinonas. Sin embargo, a pesar de que esta especie ha sido empleada como antiviral, diaforético, anestésico, repelente, catártico (Bussman, et al., 2009; Aguirre, 2012), hasta el presente no se han registrado estudios sobre su actividad biológica; de acuerdo a revisiones bibliográficas realizadas.

Croton ferrugineus es un arbusto que pertenece a la familia Euphorbiaceae y diversas especies que pertenecen a este género son conocidas comúnmente como “sangre de drago”, “palo sangre”, “palo de grado”, entre otros dependiendo la zona. En cuanto a su uso, se han descrito experiencias como antiséptico, cicatrizante, antiinflamatorio y antidiarréicos (Ordoñez, 2016). El género Croton contiene metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas, esteroles y catequinas; sin embargo, no se han realizado estudios de la composición química y la actividad biológica a Croton ferrugineus.

Dado a los antecedentes antes nombrados, estas especies fueron escogidas por estar descritas en otros trabajos científicos por su contenido de principios activos de importancia en la biomedicina como antioxidantes, antiinflamatorios, antimicrobianos, entre otros. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue identificar los metabolitos secundarios y evaluar la actividad antibacteriana y antioxidante de los extractos etanólicos.

CAPÍTULO I

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El Ecuador presenta una gran diversidad de flora, la cual se ha estudiado desde hace muchos años, pero no fue sino hace 19 años que gracias a la publicación Catálogo de las Plantas Vasculares del Ecuador (Jørgensen y León- Yánez 1999), se documentó la presencia de más de 16000 especies de plantas. Este número se ha ido incrementando durante los últimos años en un 6%; por lo que actualmente sobrepasa las 17000 especies de plantas vasculares (Neill y Ulloa 2011, Jørgensen et al., 2006).

Valencia et al. (2000) documentó la existencia de 4011 especies de plantas endémicas en el Libro Rojo de Plantas Vasculares del Ecuador. La flora de este país siempre ha sido distinguida debido a la riqueza de plantas empleadas en la medicina tradicional y actualmente un 60% de estas especies endémicas tienen uso medicinal (Naranjo y Escaleras, 1995); las mismas que son de gran importancia por las comunidades indígenas. El estudio de estas plantas medicinales ha sido desarrollado mayormente en la región Sierra y Amazónica; sin embargo, en la región Costa son muy pocos los estudios dedicados a plantas medicinales (Zambrano, et al., 2014).

Entre las especies de interés fitoquímico se encuentra, Hibiscus escobariae, incluida en la familia Malvaceae; la cual, es un arbusto endémico de los bosques secos de la costa del Ecuador de 0-500 msnm. De esta, solo se conocen 18 poblaciones; encontradas en el Parque Nacional Machalilla ubicado en la Provincia de Manabí y en la Isla de La Plata. Hibiscus escobariae, está documentada en el Libro Rojo de Plantas Endémicas del Ecuador y catalogado por la UICN como especie casi amenazada (Montúfar, R. y Pitman, 2004).

Actualmente no se han registrado estudios fitoquímicos de Hibiscus escobariae, pero se conoce que diversas especies del género Hibiscus son utilizadas en la industria farmacéutica para tratar afecciones como la

hipertensión arterial, procesos inflamatorios, afecciones hepáticas, entre otras (Carretera y Ortega, 2017).

Loxopterygium huasango pertenece a la familia Anacardiaceae, conocida comúnmente como: “Huasango” o “Hualtaco” en la provincia del Guayas y Santa Elena. Se encuentra distribuida en la costa ecuatoriana y en la región tumbesina peruana, desarrollándose en Bosques Muy Seco y Bosque Seco Premontano (Jørgensen y León-Yánez 1999); además se caracteriza por estar presente creciendo en suelos de textura moderadamente fina o fina con presencia de gravas superficiales y es frecuente encontrarlo cerca de las quebradas (Conde, 2015).

La resina de L. huasango es empleada en la medicina como repelente, ungüentos contra el reumatismo y anestésico para extraer los dientes en mal estado. Otras de sus aplicaciones es la utilización de la madera para la construcción de casas como postes, vigas, astillas para paredes que logran resistir varias décadas, también como leña (Aguirre, 2012).

Croton ferrugineus pertenece a la familia Euphorbiaceae, conocida comúnmente como: “Mosquera”, “Mosqueta” en el Ecuador, es un arbusto que se distribuye desde Colombia, Brasil y en Ecuador desde el Río Chota en el norte hasta Loja en el sur, está documentado en el Libro Rojo de Plantas Vasculares del Ecuador y catalogado por la UICN como especie vulnerable (Webster et al., 1999, Jørgensen y León-Yánez 1999).

Las hojas de Croton son utilizadas en la medicina tradicional por sus propiedades cicatrizantes, antiinflamatorios, antisépticas, hemostáticas y antidiarréicas. Algunas poblaciones indígenas las usan para tratar la fiebre causada por infecciones digestivas, para baños vaginales antes del parto y para hemorragias postparto (Tamariz, et al., 2003).

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo General

• Identificar los metabolitos secundarios y evaluar la actividad antibacteriana y antioxidante de los extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.

1.2.2 Objetivos Específicos

• Realizar el tamizaje fitoquímico de los extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.

• Cuantificar flavonoides y fenoles totales de los extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus y su actividad antioxidante.

• Determinar la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.

1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA

La fitoquímica está encargada del estudio de metabolitos secundarios y primarios elaborados, acumulados por las plantas. Esta disciplina se encarga de analizar, la estructura de estos compuestos, su biosíntesis, metabolismo, su distribución natural, su función biológica y su evaluación. Una de las aplicaciones más importantes de la fitoquímica se encuentra en la industria de alimentos y farmacéuticas de compuestos vegetales. De igual manera, contribuye a generar información a la bioquímica vegetal, fisiología vegetal, fitopatología, paleobotánica, toxicología, agronomía, genética vegetal, sistemática vegetal y biotecnología vegetal (Viña, 2017).

El uso de plantas medicinales para tratar distintas enfermedades está ligado a las tradiciones culturales, que han pasado de generación en generación desde épocas ancestrales, beneficiando a las personas y comunidades que mantienen y conservan el uso de plantas con propiedades terapéuticas (Osorio, 2014). En Ecuador, por poseer una gran diversidad de flora, existe una amplia variedad de plantas con propiedades terapéuticas que podrían ser usadas como materia prima para la producción de medicamentos (Sharapin, 2000).

Los estudios fitoquímicos realizados por Carretera y Ortega (2017) en especies del género Hibiscus de la familia Malvaceae, indican que existe presencia de flavonoides, taninos y triterpenos. En Hibiscus sabdariffa se ha detectado actividad antimicrobiana y antioxidante, la cual ha sido comprobada en ratas de laboratorio; además de que la misma es capaz de atenuar la progresión de la enfermedad renal crónica.

En Loxopterygium huasango, de la familia Anarcadiaceae, existe la presencia de flavonoides, taninos, quinonas, saponinas, y alcaloides; los cuales tienen su importancia en la producción de fármacos como antibióticos, antifúngicos, inhibidores enzimáticos y antitumorales (Bussman et al., 2009).

En Croton ferrugineus se han realizado estudios fitoquímicos que indican la presencia de flavonoides, fenoles, triterpenos y esteroles; los cuales están

relacionados a su interés terapéutico como tratamiento de úlceras gastrointestinales, cólicos uterinos, retención de orina y como anticancerígeno (Tamariz, et al. 2003).

En la actualidad son diversas enfermedades por las que tiene que padecer el ser humano, y muchas de ellas son causadas por microorganismos patógenos que han adquirido gran resistencia a los antibióticos, además del daño que causa los radicales libres. He aquí la importancia de la presente investigación que permitirá dar a conocer acerca de la composición fitoquímica presente en los extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus y evaluar su actividad antibacteriana y antioxidante; además de prevenir la destrucción de especies de plantas, que por desconocimiento no son consideradas económicamente rentables.

1.4 HIPÓTESIS

Hipótesis alternativa (Hi):

Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus presentan actividad antibacteriana y antioxidante.

Hipótesis nula (Ho):

Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus no presentan actividad antibacteriana y antioxidante.

CAPÍTULO II

2.1 ANTECEDENTES

En el estudio “Actividad biológica de los compuestos del género Hibiscus”, Vasudeva et al. (2008), mencionan que diversas especies del género presentan flavonoides, antocianinas, terpenoides, esteroides, polisacáridos, alcaloides, aminoácidos, lípidos, sesquiterpenos, quinonas y grupos de naftaleno. Algunos de estos metabolitos secundarios mencionados han mostrado actividad antibacteriana, antioxidante, antiinflamatoria, antihipertensiva, antifertilidad y antifúngica (Kholkute et al., 1977; Parmar y Ghosh, 1978; Gangrade et al., 1979; Jain et al., 1997; Faraji y Tarkhani, 1999).

Prasad (2014), realizó un análisis fitoquímico en varias especies de Hibiscus donde los extractos etanólicos de las hojas mostraron la presencia de alcaloides y taninos, mientras que los flavonoides, triterpenos, glucósidos cardiotónicos y quinonas estuvieron presentes en pocos extractos, mientras que las saponinas estuvieron ausentes.

En el estudio “Propiedades terapéuticas del Hibisco”, realizado en Hibiscus sabdariffa, encontraron la presencia de ácidos orgánicos, cítrico, málico, entre otros. También contiene aminoácidos, flavonoides, ácidos fenólicos, polisacáridos y fitoesteroles. Se han elaborado diferentes ensayos in vitro e in vivo destacando los efectos que tiene para tratar enfermedades como la hipertensión arterial, procesos inflamatorios, afecciones hepáticas. Además de comprobar sus propiedades antimicrobiana, antioxidante, antiespasmódica, antipirética, diurética, cardioprotectora, protectora renal, hipoglucemiante, antiobesidad y quimioprotectora, disminuye los niveles de colesterol y logra la inhibición de la oxidación del LDL-colesterol en animales como ratas y conejos y en el ser humano (Serban et al., 2015; Buckholz et al., 2016; Carretera y Ortega, 2017).

Hibiscus sabdariffa presenta fenoles, tales como antocianinas y ácidos fenólicos a los cuales se atribuye su actividad antioxidante. Se ha logrado

detectar la presencia de flavonoides como el kaempferol-3-glucósido, un derivado de quercetina, y antocianinas, así como varios ácidos fenólicos. (Medina et al., 2013; Reyes et al., 2015; Salinas-Moreno et al., 2012, Da Costa et al., 2014; Frank et al., 2012). Se han reportado diversos estudios del contenido total de fenoles en Hibiscus sabdariffa, presentando un contenido total de 14,18 mg GAE/ g de extracto y de 10.71±0.29 mg GAE g-1 (Vivas et al., 2014; Reyes et al. 2015).

La evaluación de la actividad antioxidante que se realizó en Hibiscus sabdariffa mediante la técnica del radical DPPH presentó un IC50=0,1 mg / mL. También se le ha evaluado la actividad antioxidante en Hibiscus rosa-sinensis mostrando su mayor capacidad en el extracto etanólico (Prassad, 2014; Reyes et al., 2015; Da Costa, 2010).

En cuanto a estudios de actividad antibacteriana en las especies del género Hibiscus contra las bacterias Gram positivas, se ha demostrado que son susceptibles a los extractos; contrario a lo que sucede con las bacterias Gram negativas que por lo general son menos susceptibles porque poseen su membrana externa de lipopolisacárido y lipoproteína que es resistente a sustancias antibacterianas (Chung et al., 2004; Alzoreky et al., 2003).

Sulaiman et al. (2014), realizó pruebas de actividad antimicrobiana del Hibiscus sabdariffa para compararlas con Allium sativum (ajo) y Zingiber officinale (jengibre), frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, observándose inhibición del crecimiento bacteriano en concentraciones de 25 a 200 mg/mL. Alshami y Alharbi (2014), determinaron el efecto antimicrobiano bacteriostático de Hibiscus sabdariffa, frente a cepas de Escherichia coli en concentraciones mínimas que podían variar entre 0.5 a 4 mg/mL.

Bussman et al. (2009), evaluó el extracto de hojas de Loxopterygium huasango encontrando en el tamizaje fitoquímico metabolitos secundarios tales como alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas, antraquinonas, saponinas y esteroles. De la Torre et al. (2008) y Aguirre (2012), afirman que Loxopterygium

huasango es empleada como antiviral, diaforética, anestésica, repelente y para eliminar verrugas; además la resina de la corteza del huasango es utilizada para tratar dolores musculares y fracturas.

Actualmente no se han reportado estudios sobre la actividad biológica de Loxopterygium huasango. Sin embargo, si se han realizado estudios a la familia Anacardiaceae que se caracteriza por presentar metabolitos secundarios tales como flavonoides, taninos, terpenos, estroles, saponinas y quinonas. Debido a la diversidad química que posee esta familia se le atribuyen diversas actividades biológicas como: citotóxica, antibacteriana, antioxidante, antiinflamatoria, antimalárica, antiviral, catártico, entre otras (Silva et al., 2015; Atto et al. 2016; Pérez et al., 2012; Suzimone et al., 2006; Sanchez, 2000; Garrido et al., 2004).

En el estudio “Importancia medicinal del género Croton (Euphorbiaceae)”, menciona que existe la presencia de metabolitos secundarios tales como fenoles, esteroles, diterpenos de tipo labdano y flavonoides de tipo flavanoles y derivados del Kaempferol, los cuales, son de gran importancia por las actividades biológicas que poseen, debido a la variedad química que presenta, el cual ofrece diversos compuestos con potencial farmacológico (Barrera et al., 2016). Wen et al. (2018), realizaron diversos estudios desde 2006-2018, de los componentes químicos y biológicos que presentan especies del género Croton encontrándose diterpenoides, sesquiterpenoides, glucósidos, alcaloides. El metabolito secundario predominante lo conforman los diterpenoides, los cuales han sido los aislados más estudiados del género y se ha demostrado que poseen actividades biológicas muy variadas.

Salatino et al. (2007), indicó que la presencia de alcaloides en la familia Euphorbeaceae no son comunes, pero existen en algunas especies del género Croton, que si lo poseen. El alcaloide glutarimida es una nueva clase de sesquiterpeno de tipo alcaloide que fue obtenido por especies de Croton. También confirmó la presencia de taninos como proantocianidinas uno de los principios activos más importantes en las especies que pertenecen al grupo de “sangre de drago”, además de flavonoides de tipo flavonoles y flavonas que se han aislado de hojas.

El tamizaje fitoquímico que se realizó en Croton elegans reporta la presencia de metabolitos secundarios tales como: quinonas, alcaloides, flavonoides, catequinas y triterpenos que han sido reportados por poseer actividad antimicrobiana, antiinflamatoria, cardiotónica y espasmolítica (Ordoñez, 2016; Romero, 2015; Kongkathip et al., 2002; Queiroga et al., 2000; Tamokou et al., 2009; Kuete et al., 2007; Tchakam et al., 2012).

En Croton mauritianus se ha encontrado actividad antioxidante mediante la técnica de eliminación del radical DPPH, con un IC50 de 0,03 ± 0,7 mg/mL, en

Croton thurife un IC50, con un valor de 0,02 mg/mL, y en Croton collinus un IC50 de 0,06 mg/mL. Mientras que, en Croton elegans no hubo actividad (Novello et al., 2016; Quintero, 2017; Romero, 2015; Altamirano, 2015).

Algunas especies del género Croton poseen actividad antibacteriana, se ha comprobado que la especie C. laui presenta una fuerte actividad antibacteriana con una concentración mínima inhibitoria (CIM) de 43.4 µM, contra cepas de bacterias Gram positivas como Staphylococcus sp., Micrococcus luteus y Bacillus subtilis, mientras que en Croton thurifer presenta una CMI de 1 mg/mL frente a Bacillus subtilis. También se evaluó la actividad antibacteriana en Croton elegans, frente a diversas cepas del género Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Trichophytum, presentando actividad solo en Streptococcus (Liu et al., 2014; Quintero, 2017; Ordoñez, 2016; Romero, 2015).

2.2 MARCO TEÓRICO

2.2.1 Hibiscus escobariae

Figura 1: Hibiscus escobariae Taxonomía

Phylum: Tracheophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Malvales

Familia: Malvaceae

Género: Hibiscus

Especie: Hibiscus escobariae

Ecología

Es una planta endémica de los bosques secos tropicales y subtropicales del Ecuador de 0-500 m.s.n.m, conociéndose únicamente 18 poblaciones en el Parque Nacional Machalilla y en la Isla de la Plata, aunque pueden estar en hábitats similares de la Reserva Ecológica Manglares-Churute (Montúfar y Pitman, 2004).

Descripción botánica

Poseen tallos híspidos, tomentosos o con tricomas escuamiformes, hojas indivisas, lobadas o digitales, pedúnculo generalmente articulado, flores solitarias con sus pétalos más largos que el cáliz, con colores vivos; cinco estilos libres en la parte superior, estigmas terminales (Montúfar y Pitman, 2004).

2.2.2 Loxopterygium huasango

Figura 2: Loxopterygium huasango Taxonomía

Phylum: Tracheophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Sapindales

Familia: Anacardiaceae

Género: Loxopterygium

Especie: Loxopterygium huasango

Ecología

Se encuentra distribuido en Bosques Secos y Bosque Seco Premontano, desde la región tumbesina de las costas de Perú, hasta la Península de Santa Elena en Ecuador entre los 0 a 800 m.s.n.m (Chavesta, 2005).

Descripción botánica

Árbol caducifolio que mide 25 m de alto, de fuste cilíndrico y algunas veces irregular, con hojas imparipinadas, alternas, dispuestas en espiral, con base oscura y ápice agudo. Su fruto es una sámara y su inflorescencia es en panículas axilares pinosas de 5 cm de longitud, siendo terminales o distales, sus flores son pequeñas, actinomorfas, pentámeras, de 2-4 mm de longitud, el pedicelo de 1-2 mm de longitud (Centro de Ideas, 2006 y Chavesta, 2005).

2.3.3 Croton ferrugineus

Figura 3: Croton ferrugineus Taxonomía

Phylum: Tracheophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Malpighiales

Familia: Euphorbiaceae

Género: Croton

Especie: Croton ferrugineus

Ecología

Se encuentra distribuido en Perú, Colombia, Brasil y Ecuador (provincia de Loja); habita desde Bosques Húmedos hasta zonas xerofíticas (Govaerts, 2018).

Descripción botánica

Arbusto con savia lechosa, sus hojas son alternas, simples, con presencia de tricomas en la superficie, presentan glándulas en la base de la lámina, inflorescencia condensada, las flores son unisexuales actinomorfas, poseen pétalos reducidos o ausentes, ovario es tricarpelar con un lóbulo por lóculo o cámara (Barrera et al., 2016).

2.2.4 Metabolitos secundarios Son compuestos orgánicos de bajo peso molecular que presentan una distribución restringida en cada género, familia o especie del reino vegetal, incluso en partes específicas de cada planta, encontrándose en pequeñas cantidades. No poseen función directa en los procesos de: crecimiento, fotosíntesis, respiración, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos.

A pesar de no ser indispensable en el funcionamiento celular de las plantas, tiene importantes funciones ecológicas otorgándoles olor, sabor y color a las flores y frutos; lo que las hace atrayente de insectos polinizadores y dispersores de semillas y frutos, o repelente de animales predadores debido a que le proporciona sabores amargos que algunas veces pueden ser venenosos (Ávalos y Pérez, 2009; Lincoln y Zeiger, 2006). Algunos de estos metabolitos secundarios como: alcaloides, flavonoides, taninos, terpenos, saponinas, quinonas, entre otros. Son de alto valor medicinal debido a sus propiedades terapéuticas, además de poseer valor económico para la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica.

Las principales rutas de biosíntesis de metabolitos secundarios se derivan del metabolismo primario del carbono. Para el caso de los alcaloides que se sintetizan a mediante la ruta de síntesis del ácido shikímico y a partir de aminoácidos. Mientras que, los compuestos fenólicos (lignanos, cumarinas, taninos y flavonoides) son derivados de los fenilpropanoides mediante la vía del ácido shikímico o la vía malonato/acetato. En cambio, los terpenoides se sintetizan por la vía del ácido mevalónico (Figura 4).

Figura 4: Elementos del metabolismo del carbono en relación con las rutas de síntesis de metabolitos secundarios (Ávalos y Pérez, 2009)

2.2.5 Tamizaje fitoquímico Una de las primeras etapas del estudio fitoquímico es el tamizaje o screening fitoquímico, un método cualitativo que va a poder determinar los principales grupos químicos presentes en las plantas y a partir de allí va a ser de gran ayuda para poder guiar a la extracción y aislamiento de los grupos de interés.

El screening fitoquímico se fundamenta en la aplicación de solventes y de reacciones de precipitación y color para la extracción de metabolitos en las plantas, permitiendo una evaluación rápida, reproducible, sensible y de bajo costo. Los resultados solo sirven de guía y se debe interpretar junto a los resultados del screening farmacológico. Es decir, si una planta tiene acción sobre el sistema nervioso central en el tamizaje farmacológico y a su vez presenta alcaloides en el tamizaje fitoquímico, es muy probable que se deba a la presencia de estos; lo mismo sucede cuando hay actividad antiinflamatoria que puede ser por la presencia de flavonoides, efectos catárticos relacionado con las antraquinonas (Palacios, 2009).

Alcaloides

Son compuestos que contienen uno o más átomos de nitrógeno, formando parte de un anillo heterocíclico que posee átomos de nitrógeno y carbono (Figura 5). Es uno de los grupos más grandes debido a que posee aproximadamente 15 mil metabolitos secundarios, encontrándose en un 20% de las plantas vasculares (Lincoln y Zeiger, 2006). Los alcaloides son biosintetizados a partir de aminoácidos precursores como triptófano, tirosina, fenilalanina, lisina, arginina y ornitina, solos o combinados con terpenoides (Sepúlveda et al., 2003).

Hasta el presente, se han aislado aproximadamente 7 mil estructuras de alcaloides, debido a sus propiedades toxicológicas y medicinales como anestésicos y analgésicos. Se los puede encontrar en abundancia en hojas, raíces y semillas, pero sus concentraciones van a ser variables por factores como la madurez, suelo, variaciones estacionales, entre otros (Sepúlveda et al., 2003).

Para poder detectar la presencia de alcaloides en general, existen diversos reactivos como Wagner, Mayer, Bouchardat y Dragendorff, que están basados en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados (López 2007, Arango, 2008).

Figura 5: Alcaloides representativos (Arango, 2008)

Flavonoides

Son compuestos fenólicos que contienen un variable número de grupos hidroxilos, ubicados generalmente en los carbonos 4, 5 y 7; comparten un esqueleto carbonado básico (difenilpiranos) que posee 15 átomos de carbono (Figura 6), se diferencian de las distintas clases de flavonoides, dependiendo del lugar en anillo C. Los azúcares son muy comunes en la mayoría de flavonoides, apareciendo naturalmente como glicósidos (Lincoln y Zeiger, 2006).

Figura 6: Tipos de flavonoides (López, 2010)

Se han identificado aproximadamente 5 mil flavonoides de distintos tipos, encontrándose en vegetales, semillas y frutos, también se han descrito diversas propiedades terapéuticas atribuidas a los flavonoides tales como: antioxidantes, antimicrobianas, antiinflamatoria, antihemorrágicas, antivirales, antialérgicas, hepatoprotectora, fotoprotectora, entre otras. En la prueba de shinoda para determinar la presencia de flavonoides, el ácido clorhídrico al ser un medio ácido fuerte y en presencia de magnesio se genera un hidrógeno produciendo la reducción del ión flavilio de color rojo escarlata (Guacuja, 1995).

Taninos

Son compuestos polifenólicos solubles en agua y en solventes orgánicos polares, presentan varios grupos hidroxilo que están unidos a estructuras fenólicas, lo que les otorga la característica de poder formar complejos con proteínas, minerales y otras macromoléculas. Existen dos grupos de taninos: hidrolizables y condensados.

Los taninos hidrolizables son componentes fenólicos no flavonoides (Figura 7), se caracterizan por presentar estructura de glicósidos, ésteres de glucosa y de ácidos fenólicos como el ácido gálico. Son aquellos que por medio de hidrólisis en medio ácido y a ebullición forman productos solubles en agua y en presencia de sales de hierro dan coloraciones negro-azulada. Estos taninos se los encuentran comúnmente en hojas, fruto, vainas y espinas de plantas dicotiledóneas (Vásquez et al., 2012; Goycochea, 2010).

Figura 7: Estructura química de compuestos polifenólicos no flavonoides (Vásquez, 2014)

Los taninos condensados de tipos flavonoides (Figura 8), son menos solubles en agua que los taninos hidrolizables y se oxidan en un medio ácido a ebullición formando flobafenos que son polímeros de color rojo. Sus moléculas parecen ser intermediarios en la biosíntesis de catequina y los flavan-,34-dioles, por esta razón están relacionados con los flavonoides, además de poderse hidrolizar a antocianinas con la presencia de ácidos, denominándose proantocianidinas (Ávalos y Pérez, 2009).

Figura 8: Estructura química de compuestos polifenólicos de tipo flavonoide (Vásquez, 2014)

Se han descrito diversas aplicaciones de los taninos que son originadas por sus propiedades astringentes, actuando como antidiarreico y antiséptico debido a que pueden impermeabilizar las capas más externas de la piel y las mucosas, pueden bloquear la formación de endotelina-1 que es una molécula que provoca la vasoconstricción, poseen efectos antimicrobianos, antifúngicos, antioxidante, además de servir como antitóxico por ser hemostáticos y precipitar en presencia de alcaloides. Todas las propiedades terapéuticas que poseen es a causa de su toxicidad al unirse a proteínas de forma inespecíficas, formando puentes de hidrógeno entre los grupos hidróxilo y los sitios electronegativos de las proteínas (Reed, 2010).

Quinonas

Las quinonas son compuestos aromáticos que poseen un grupo dicarbonilo, y se pueden encontrar en plantas, hongos y bacterias. Existen tres tipos: benzoquinonas, naftoquinonas o antraquinonas (Figura 9), dependiendo del grado de complejidad de su estructura química; de tal manera que pueden ser monocíclicas, bicíclicas o tricíclicas (Domínguez, 1985).

Figura 9: Tipos de quinonas (Martínez, 2012)

Las benzoquinonas (monocíclicas) son estructuras derivadas del benceno que conforman el grupo al que le han dado menor interés en relación a la fitoterapia, además de ser un potente alergizante debido a que algunas pueden comportarse como haptenos por la combinación de los grupos amino o tiol induciendo una dermatitis por sensibilización.

Las naftoquinonas (bicíclicas) son estructuras derivadas del naftaleno, que se encuentran generalmente en plantas superiores, en forma heterosídica cuando la planta está fresca y durante el proceso de desecación libera genina. Presenta importantes propiedades terapéuticas como antibacteriana y fungicida. También es muy usada en la industria cosmética como colorante natural (Stoldùlková et al., 2010).

Las antraquinonas (tricíclicas) son estructuras derivadas del antraceno, presentan dos grupos de cetona insaturadas que por reducción se transforman en fenoles y generalmente están en forma de heterósidos. Se han descrito diversas propiedades terapéuticas como antimicrobianas, anticancerígenas, antioxidantes y antifúngicas (Stoldùlková et al., 2010; Bustamante et al., 2010).

Para poder detectar la presencia de antraquinonas existen pruebas cualitativas como la reacción de Bornträger, en la que solo se da cuando existen antraquinonas oxidadas libres, que son solubles en disolventes orgánicos y al añadirles hidróxido de potasio se forma una capa de coloración roja debido a las sales que posee (Sánchez y Santa, 2009).

Triterpenoides y esteroides

Los terpenoides son compuestos que poseen hidrógeno, oxígeno y cadenas de carbono que están formadas por la unión de dos o más moléculas de isoprenos, conforman uno de los grupos más numerosos de metabolitos secundarios existiendo más de 40 mil moléculas diferentes. Se clasifican según el número de unidades de isopreno en: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) y poliisoprenoides ((C5) n) (López, 2007; Ávalos y Pérez, 2009; Lizcano et al., 2008). Además, son solubles en solventes orgánicos y por lo general insolubles en agua, aunque en el contenido celular se encuentran solubles debido a que forman parte de los glicósidos. Diversos terpenoides son de gran importancia en la industria de alimentación, cosmética, agrícola como insecticida y farmacéutica por sus propiedades antioxidantes, anticancerígenas, antimalariales y antimicrobianas (Cuadrado, 2004; Ringuelet et al., 2013).

Uno de los grupos más estudiados de los terpenoides son los triterpenoides que están formados por una estructura policíclica, generalmente tetra o pentacíclica. En el reino vegetal se los puede encontrar como glicósidos, ésteres o libres, en las hojas, frutos y algunas resinas de árboles.

Entre los triterpenoides se encuentran los esteroides, alcoholes sólidos formados con C27 a C29 átomos, con una estructura fundamental de ciclopentano perhidro fenantreno y una cadena lateral al que pueden insertarse radicales libres de metilo o etilo, son de origen animal, aunque también han sido encontrados en vegetales en forma libre, como ésteres (Figura 10), o como glicósidos. Pueden clasificarse como esteroles, saponinas esteroidales (o sus agliconas sapogeninas), glicósidos cardíacos, esteroalcaloides y las llamadas hormonas esteroidales (Look, 1994; Domínguez, 1979).

Figura 10: Molécula de escualeno y sus derivados triterpenos cíclicos estigmasterol y sitosterol

(Ávalos y Pérez, 2009)

Saponinas

Son un grupo de glicósidos formados por una estructura heterosídica que contienen uno o varios azúcares con propiedades surfactantes, es decir que al diluirse en el agua forman espuma abundante y relativamente estable, similares al jabón, también se pueden presentar como agliconas es decir sin molécula de azúcar denominándose sapogeninas, originadas por hidrólisis ácida o enzimática (Figura 11). Además, muchas de ellas también tienen propiedades hemolíticas debido a que pueden alterar la permeabilidad de las membranas biológicas, lo que resulta tóxico para los animales que poseen sangre fría (Domínguez, 1979).

Figura 11: Estructura química de las saponinas (Ahumada, et al., 2016)

A las saponinas se le atribuyen diversas propiedades terapéuticas como antiinflamatorias, antimicrobianas, analgésicas, antiespectorantes, antiviral, espermicida, antihemorroidales, venotónicos, además pueden producir hemólisis de los glóbulos rojos y proteger contra el cáncer de estómago e intestino (Cuadrado, 2004).

2.2.6 Cuantificación de Flavonoides

Existen diversos métodos para realizar la cuantificación de flavonoides, como métodos cromatográficos entre los cuales se puede encontrar cromatografía de capa fina, cromatografía de gases, cromatografía líquida y cromatografía de gases acoplado a masas GC/MS. Estos métodos poseen la ventaja de ser altamente eficientes, debido a su aportación de información definitiva para la caracterización de las muestras, teniendo como desventaja el elevado costo. Sin embargo, se puede cuantificar los flavonoides por métodos espectrofotométricos que son más económicos y confiables entre ellos se encuentra el método colorimétrico de cloruro de aluminio que forma complejos estables de ácidos con el grupo cetona en C-4 o bien el grupo hidroxilo en C-3 o C-5 de flavonas y flavonoles. Además, también forma complejos lábiles ácidos con los grupos dihidroxilo en el anillo A o B de los flavonoides (Meza, 2011; Zhishen et al., 1999).

2.2.7 Cuantificación de fenoles

El método más usado para la cuantificación de fenoles totales es Folin- Ciocalteu propuesto por Singleton et al. (1999), basado en la capacidad de los fenoles para reaccionar frente a agentes antioxidantes. Folin-Ciocalteu es un reactivo con una mezcla de molibdato y tungstato sódico que puede reaccionar en presencia de fenoles, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico. En el momento en que se da la transferencia de electrones a un pH básico va a reducir los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, produciendo un color azul intenso, de tungsteno y molibdeno, de tal manera que este color es

proporcional al número de grupos hidroxilo de las moléculas de los fenoles (Henderson et al., 2000).

2.2.8 Actividad antioxidante

Un antioxidante es aquella sustancia que puede prevenir o retardar las reacciones de oxidación; es decir pueden evitar el daño que causan los radicales libres. Estos son átomos que poseen un electrón desapareado o impar, que recorren el organismo para robar un electrón a moléculas estables y lograr su estabilidad electroquímica; ocasionando la inestabilidad de las moléculas que cedieron su electrón, lo que a su vez se convierte en un radical libre, iniciándose reacciones en cadena.

Se han descrito diversos métodos para evaluar la actividad antioxidante, pero al que más se le ha mostrado su atención es a la técnica 2,2-difenil-1- picrilhidrazilo conocido comúnmente como DPPH, debido a que es una técnica barata, rápida, sensible y reproducible. Este método se basa en que el radical libre DPPH, reacciona en presencia de un agente antioxidante, el cual le cedió un átomo de hidrógeno, decolorándose de color azul-violeta a amarillo pálido, que se lee a una absorbancia de 517nm, para poder determinar el porcentaje de inhibición del DPPH y finalmente obtener el valor IC50, es decir la concentración de la muestra problema que produce una inhibición del 50% del DPPH (Nenadis et al., 2007; Chaouche et al., 2013).

Metabolitos secundarios como agentes antioxidantes

Los compuestos fenólicos como los flavonoides poseen un variable número de grupos hidroxilos en su estructura química, la excelente actividad antioxidante se le atribuye a la quelación de hierro y otros metales de transición. Por ello la industria farmacéutica y alimenticia ha mantenido un gran interés como protección a los fenómenos que causan un daño oxidativo ocasionando un elevado número de enfermedades (Havsteen, 1993, Perez, 1994).

La acción antioxidante de los flavonoides de debe a que son capaces de retirar el oxígeno reactivo generalmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidróxidos, peróxidos, lipídicos o hidroperóxidos. Así bloquea la acción destructora de dichas sustancias sobre las células (Pace et al., 1995).

El grupo de flavonoides que se presenta en las plantas como glucósidos, quercetina y mircetina poseen una elevada actividad antioxidante, debido a son excelentes captadores de radicales libres, rompiendo la cadena en reacciones de oxidación de lípidos. La capacidad antioxidante de los flavonoides va a depender de: la presencia en el anillo B de la estructura catecol u O-dihidroxi, la presencia de un doble enlace en posición 2,3 y la presencia de grupos hidroxilo en posición 3 y 5 que ejercen el máximo potencial antioxidante (Bors et al., 1990).

El flavonoide que mejor cumple estos requisitos es la quercetina, así que es la más efectiva en cuanto a su función antioxidante y muestra efectos correlacionados con el ácido ascórbico (Vitamina C). De manera que el ácido ascórbico reduce la oxidación de la quercetina, que al combinarse con ella, permite que mantenga sus funciones durante un tiempo más prolongado (Merck, 2000).

2.2.9 Actividad antibacteriana

Consiste en evaluar si la muestra es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, para esto el ensayo más empleado es el antibiograma disco-placa propuesto por Bauer-Kirby, recomendado por el Comité Nacional para Estándares de Laboratorios Clínicos (NCCLS). El fundamento de este ensayo es depositar en la superficie del agar previamente inoculado con el microorganismo, discos de papel secante que contiene los diferentes antibióticos y muestras a evaluar. En el momento en que existe el contacto entre el disco que contiene antibiótico y la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe el agua y el antibiótico se difunde en el agar de manera radial, formándose un gradiente de concentración, lográndose observar una zona de inhibición a partir de 18-24 horas de haber realizado el ensayo (Picaso, 2000; Bauer et al. 1966).

El ensayo disco-placa finaliza en la lectura del valor de la concentración mínima inhibitoria (CMI), que se obtiene por métodos de dilución, la concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la CMI.

Metabolitos secundarios como agentes antibacterianos

El anillo B de los flavonoides juegan un papel importante en la actividad antibacteriana, porque se intercalan con las bases de los ácidos nucleicos, lo que origina la inhibición de la síntesis de ADN y ARN. Los flavonoides robinetina, miricetina y epigallocatequina inhiben la síntesis de ARN en S. aureus y los flavonoides como quercetina, apigenina y 3,6,7,3’, 4’-pentahidroxiflavona, que poseen una hidroxilación en el anillo B inhiben la síntesis de la enzima ADN girasa, variando la estructura de E.coli (Cushnie et al., 2005).

Una de las isoflavonas con mejor actividad antibacteriana son las fitoalexinas, que son un tipo de flavonoides indetectable antes de la infección, se producen como un mecanismo de resistencia frente a microorganismos patógenos, limitando la invasión de los mismos, transcribiendo y traduciendo los ARNm adecuados, activando nuevas rutas biosintéticas (Lincoln y Zeiger, 2006).

Otros de los compuestos fenólicos como: proantocianidinas, antocianidinas, ácido cinámico, ácido 3-cumárico, ácido cafeico, ácido ferulico, ácido clorogénico, pelargonidina, delfinidina y cianidina y cianidin-3-glucósido también poseen actividad antibacteriana pero solo contra bacterias gram- negativas (Puupponen et al., 2001).

Las quinonas identificadas como 2-acetoxi-2,3-dihidro-nafto-[2,3-b]-furan- 4,9-diona; 2-hidroxi-1,4- naftoquinona; 1,4-naftoquinona y 2-acetoxi-2,3- dihidronafto-[1,2-b]-furan-4,5-diona poseen actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus inhibiendo la síntesis de ADN y ARN (Rodríguez et al., 2007).

CAPÍTULO III

3.1 METODOLOGÍA

3.1.1 Material biológico

Las hojas de Hibiscus escobariae fueron recolectadas en mayo del 2018, en el campus de la Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias Naturales ubicada en 79°55.14' Oeste 2°8.50.4' Sur. La identificación botánica fue realizada por el especialista MSc. Xavier Cornejo, basada en la colección Cornejo 5916 que reposa en el herbario GUAY de la Facultad de Ciencias naturales, Universidad de Guayaquil, Ecuador.

Las hojas de Loxopterygium huasango fueron recolectadas en mayo del 2018, en el campus de la Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias Naturales 79°55.14' Oeste 2°8.50.4' Sur. La identificación botánica fue realizada por el especialista MSc. Xavier Cornejo, basada en la colección Cornejo 5686 que reposa en el herbario GUAY de la Facultad de Ciencias naturales, Universidad de Guayaquil, Ecuador.

Las hojas de Croton ferrugineus, fueron recolectadas en abril del 2018 en la provincia de Loja-Ecuador, en la localidad de Catamayo ubicada en 79°34.52' Oeste 3°98.13' Sur. La identificación botánica fue realizada por el especialista MSc. Xavier Cornejo, basada en la colección Cornejo 9244 que fue depositado en el herbario GUAY de la Facultad de Ciencias naturales, Universidad de Guayaquil, Ecuador.

3.1.2 Obtención del extracto

Las muestras vegetales se secaron durante dos días a temperatura de 40°C, en una estufa con circulación de aire; luego de este período se procedió a la maceración de hojas con etanol al 99%, el cual estuvo en reposo durante 4 días en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente. Luego se filtraron los extractos y se concentraron a presión reducida en un Rotavapor (R-3 BUCHI).

3.1.3 Tamizaje fitoquímico

Los metabolitos secundarios tales como: alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas y antraquinonas, saponinas, esteroides y triterpenos se determinaron mediante la metodología propuesta por Domínguez (1979).

3.1.3.1 Determinación de alcaloides.

A cada 10 mg de extracto se le añadieron 2 mL de ácido clorhídrico al 5%.

Posteriormente se agregaron de 2-5 gotas de los reactivos Wagner, Mayer, Bouchardat y Dragendorff. Se consideró como positiva las pruebas en las que se observó un precipitado color rojo marrón (Wagner), blanco (Mayer), pardo (Bouchardat) y naranja-rojizo para el reactivo Dragendorff (Anexo 1).

3.1.3.2 Determinación de Flavonoides

Prueba de Shinoda: A 1 mL de extracto diluido se le añadieron 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado. La formación del color rojo indicó la presencia de auronas y chalconas. En los casos en que no se observaron cambios de color, se añadieron piezas de magnesio metálico. La formación de coloraciones naranja, roja o magenta indicó la presencia de flavonas y flavonoides, respectivamente (Anexo 2).

Prueba de hidróxido de sodio (10%): A 1 mL de extracto diluido en etanol absoluto se le añadieron 3 gotas de hidróxido de sodio al 10%. La Formación de coloración rojo-amarillo, café-naranja, púrpura-rojo o azul indicó la presencia de xantonas y/o flavonas, flavonoides, chalconas y antocianinas, respectivamente (Anexo 3).

3.1.3.3 Determinación de Taninos.

Reacción cloruro férrico: A 1 mL del extracto etanólico se le añadieron gotas de la solución de cloruro férrico al 10%. La formación de una coloración

azul indicó la presencia de taninos hidrolizables y el color verde, indicó la presencia de taninos condensados (Anexo 4).

3.1.3.4 Determinación de quinonas y antraquinonas.

Prueba de Borntrager: Se llevó a sequedad 5mL de extracto y se añadieron 4 mL de la solución de hidróxido de potasio al 5%, se llevó el tubo a ebullición por 3 minutos a baño María, se dejó enfriar, se añadieron 2 mL de cloroformo, se agitó para la extracción y la fase acuosa se descartó, mientras que a la fase orgánica se le adicionaron 2 mL de una solución de hidróxido de potasio al 5%. La formación del color rojo indicó la presencia de antraquinonas (Anexo 5).

Prueba de ácido sulfúrico: A 10 mg de extracto etanólico se le añadió 1 gota de ácido sulfúrico concentrado. La formación de color rojo indicó la presencia de quinonas (Anexo 6).

3.1.3.5 Determinación de esteroides y triterpenos.

Prueba de Salkowski: A 3 mL de extracto etanólico se le añadieron 2 mL de cloroformo y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado hasta que se formó una doble fase. La formación de color pardo en la capa media indicó un anillo esteroideo (Anexo 7).

Prueba Lieberman Bouchard: A 2 mL de extracto etanólico se le añadió 1 mL de anhídrido acético y 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Se dejó en reposo por de 5 minutos. La formación de una capa intermedia de color azul- verde indicó esteroles, y el color rosado, rojo, magenta o violeta reveló la presencia de terpenoides (Anexo 8).

3.1.3.6 Determinación de saponinas.

Prueba de la espuma: A 20 mg del extracto etanólico se le añadió 1 mL de agua destilada caliente, se agitó vigorosamente para formar espuma, se dejó reposar durante 10 minutos. El contenido de saponina se midió de la siguiente

manera: sin espuma (ausencia); espuma menos de 3 mm de alto (pobre); espuma de 6 mm de altura (moderada) y espuma de más de 8 mm de altura (abundante) (Anexo 9).

3.1.4 Cuantificación de flavonoides y ácidos fenólicos totales

Se cuantificó los flavonoides totales mediante el método colorimétrico cloruro de aluminio propuesto por Zhishen et al. (1999) y la cuantificación de fenoles totales se la realizó mediante el método Folin Ciocalteu propuesto por Singleton et al. (1999).

3.1.4.1 Cuantificación de Flavonoides Totales.

Para la cuantificación de flavonoides totales se realizó una curva de calibración utilizando la quercetina como patrón de referencia a una concentración de 0.1 mg/mL. Para realizar el tratamiento de la curva de calibración se añadió una alícuota (0.25 mL) de solución estándar de quercetina (20, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ,750 µg/ mL) a un tubo de ensayo de 15 mL. Se agregó un 1 mL de H2O destilada. Se añadió al tubo de ensayo 0.075 mL de NaNO2 al 5%. Después de 6 minutos, se agregó 0,075 mL de AlCl3 al 10%. Después de 5 minutos, 0.5 mL de NaOH 1 M y completar el volumen total hasta 2.5 mL con H2O. Se mezcló bien la solución y se colocó 200 µL en los micros placas. La absorbancia se midió frente a blanco de reactivo preparado a 510 nm en un espectrofotómetro Multiskan GO Thermo Scientific. El contenido total de flavonoides se expresó como mg equivalentes de Quercetina (CE) / g de masa fresca (Anexo 10).

Para el análisis de las muestras por triplicado, se utilizó una concentración de 0.5 mg/mL de etanol absoluto. Posteriormente se sometió al mismo tratamiento que la curva de calibración (Anexo 11).

3.1.4.2 Cuantificación de Ácido Fenólicos Totales.

Para la cuantificación de ácidos fenólicos totales se realizó una curva de calibración utilizando el ácido gálico como patrón de referencia a una concentración de 0.5 mg/mL. Para realizar el tratamiento de la curva de calibración se añadió una alícuota (150 L) solución estándar de Ácido gálico (30, 50, 80, 100, 120, 150, 180, 210 µg/ mL) a un tubo de ensayo de 15 mL. Se agregó 75 µL de Folin-Ciocalteu. Inmediatamente se agitó en vortex. Se Esperó 10 minutos, en absoluta oscuridad. Se añadió 375 µL de la solución de Carbonato de sodio. Se agitó y guardó en absoluta oscuridad por 30 minutos. Se colocó 200 µL en los micros placas. La absorbancia se midió frente a blanco de reactivo preparado a 760 nm en un espectrofotómetro Multiskan GO Thermo Scientific. El contenido total de fenoles se expresó como mg equivalentes de Ácido Gálico (GAE) / g de extracto seco.

Para el análisis de las muestras por triplicado, se utilizó una concentración de 0.5 mg/mL de etanol absoluto. Posteriormente se sometió el mismo tratamiento que la curva de calibración (Anexo 12).

3.1.5 Actividad antioxidante

Las pruebas de actividad antioxidante se la realizaron por la técnica DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) propuesta por Williams et al. (1995) utilizando el ácido ascórbico como blanco positivo.

3.1.5.1 Preparación de soluciones

Solución stock DPPH (A): 6 x 10 -5 M (metanol)

Solución de trabajo (B): Se tomaron 5 mL de solución stock de DPPH y se aforó a 50 mL con metanol. Solución de ácido ascórbico (C): Se preparó una solución de ácido ascórbico 1 mM: 17.6 mg en 100 mL de metanol.

Solución stock de muestra (D): Se pesaron en tubo eppendorff 4 mg de extracto y se aforaron a 1 mL.

3.1.5.2 Procedimiento En tubo de ensayo se colocaron 50 µL de solución C y 700 µL de solución B y se agitó. Se tomaron 50 µL de la solución stock de muestra de extracto y se agregaron 700 µL de la solución B y se agitó. Posteriormente se dejaron los tubos en oscuridad y cubiertos durante 30 minutos. Se leyó la absorbancia a 517 nm del blanco (metanol), de la solución DPPH, del ácido ascórbico y de las muestras. La absorbancia del DPPH estuvo en un rango de 0.600 a 0.700 nm. Las muestras se analizaron por triplicado (Anexo 13).

Los cálculos del porcentaje de inhibición se lo realizaron con la siguiente fórmula:

absorbancia del DPPH − Absorbancia muestra %I = x 100 absorbancia del DPPH

Cuando el porcentaje de inhibición de la muestra fue mayor al 50 %, se aplicaron diluciones de la solución stock de extracto para lograr encontrar la concentración mínima inhibitoria.

3.1.5.3 Procedimiento para diluciones

Se tomaron 500 µL, 250 µL, 150 µL, 100 µL 50 µL, 25 µl, 20 µl de la solución stock de extracto y se aforaron a 1 mL en un tubo eppendorff, luego en tubos de ensayo por triplicado se agregaron 50 µL de cada una de las diluciones, se agregaron 700 µL de la solución B. Posteriormente se dejaron los tubos en oscuridad y cubiertos durante 30 minutos. Se leyó la absorbancia a 517 nm y se calculó el porcentaje de inhibición.

3.1.6 Actividad antibacteriana

Las pruebas de actividad antibacteriana se la realizaron mediante la metodología de ensayos de difusión por disco propuesta por Bauer-Kirby (1966), contra tres bacterias Gram Positivas (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria monocytogenes ATCC 19115 y tres Gram negativas (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802).

3.1.6.1 Cultivo de microorganismos

La siembra se realizó en el medio Müeller-Hinton Agar a 37 °C durante 18 h.

3.1.6.2 Preparación y suspensión del inóculo

Se seleccionaron de 3-5 colonias de cada microorganismo de un cultivo puro de no más de 24 horas de su inoculación, se transfirieron las colonias a un tubo que contenía de 3-5 mL de solución salina, se ajustó el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 1,0 de McFarland.

3.1.6.3 Siembra de la muestra

Se agregaron 200 µL de la suspensión del microorganismo y se lo distribuyó en toda la placa de Müeller-Hinton Agar de manera homogénea con ayuda de un asa de inoculación, se esperó 15 minutos manteniendo la caja Petri cerrada para que la superficie del medio sembrado se seque. Se evaluaron cuatro concentraciones del extracto: 20, 50, 100 y 200 mg/mL, para encontrar la concentración mínima inhibitoria (CMI), para lo cual se colocaron 20 µL sobre discos en blanco de la marca Oxoid™ de 6 mm de diámetro. En cada placa también se colocaron como blanco positivo un disco de antibióticos de referencia y como blanco negativo un disco en blanco con 20 µL de etanol. Se incubaron las placas sembradas a 35°C por 16-18 horas.

En el caso de L. huasango también se evaluaron las concentraciones de 2.5, 5, 10, 15 mg/mL debido a que la CMI se encontró por debajo de la mínima evaluada anteriormente (20 mg/mL).

Los antibióticos que se usaron de referencia fueron:

Ceftriaxone® Oxoid™ (30 µg) para Staphylococcus aureus

Sulfamethoxazole® Oxoid™ (25 µg) para Bacillus subtilis

Penicillin® G Oxoid™ (10 µg) para Listeria monocytogenes

Gentamicin® Oxoid™ (10 µg) para Escherichia coli

Tobramicina® Oxoid™ (10 µg) para Pseudomonas aureginosa Tetracycline® Oxoid™ (30 µg) para Vibrio parahaemolyticus

3.1.6.4 Medición de la zona del halo de inhibición

Se midió la zona de inhibición redondeando al perímetro más cercano al disco con un calibrador vernier digital, manteniendo la placa a unos pocos centímetros sobre una superficie de color negro que no refleje la luz (Anexo 14- 16).

3.1.7 Análisis estadístico

Se comparó el porcentaje de inhibición del DPPH de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus, frente al ácido ascórbico, realizando un test de Anova simple, mediante el paquete estadístico Statgraphics Plus.

CAPÍTULO IV

4.1 RESULTADOS

4.1.1 Tamizaje fitoquímico

4.1.1.1 Hibiscus escobariae

La Tabla 1 resume los resultados de los metabolitos secundarios presentes en Hibiscus escobariae. Los alcaloides se presentaron en bajas proporciones. Los flavonoides se presentaron de manera abundante en los dos ensayos realizados. Los taninos al igual que los flavonoides fueron abundantes. Esteroles y triterpenos se presentaron en cantidades moderadas. Quinonas, antraquinonas y saponinas estuvieron ausentes.

Tabla 1: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de Hibiscus escobariae

Metabolitos Ensayo Hibiscus escobariae Alcaloides Reactivo Mayer + Reactivo Bouchardat - Reactivo Wagner - Reactivo Dragendorff +

Flavonoides Reactivo Shinoda +++ NaOH 10% +++

Taninos FeCl3 +++ Esteroles y triterpenos Reactivo Salkwosky + Reactivo Liebermann-Burchard ++

Quinonas y Reactivo Borntrager -

antraquinonas H2SO4 -

Saponinas Espuma - Clave: Nivel de precipitación en Alcaloides e intensidad de color en flavonoides, taninos, esteroles y triterpenos, quinonas y antraquinonas: Ausente (-), Bajo (+), Moderado (++), Abundante (+++). Saponinas: Espuma: Ausente (-), Pobre (< 3mm), Moderado (>6mm), Abundante (>8mm).

4.1.1.2 Loxopterygium huasango

En la Tabla 2 resume los resultados del tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas Loxopterygium huasango. Los alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas y antraquinonas se presentaron en proporciones abundantes; mientras que los esteroles, triterpenos y saponinas se presentaron en bajas proporciones.

Tabla 2: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas Loxopterygium huasango

Metabolitos Ensayo Loxopterygium huasango

Alcaloides Reactivo Mayer +++ Reactivo Bouchardat ++ Reactivo Wagner + Reactivo Dragendorff ++ Flavonoides Reactivo Shinoda +++ NaOH 10% +++

Taninos FeCl3 +++

Esteroles y triterpenos Reactivo Salkwosky + Reactivo Liebermann-Burchard -

Quinonas y Reactivo Borntrager +++

antraquinonas H2SO4 -

Saponinas Espuma 3mm

Clave: Nivel de precipitación en Alcaloides e intensidad de color en flavonoides, taninos, esteroles y triterpenos, quinonas y antraquinonas: Ausente (-), Bajo (+), Moderado (++), Abundante (+++). Saponinas: Espuma: Ausente (-), Pobre (< 3mm), Moderado (>6mm), Abundante (>8mm).

4.1.1.3 Croton ferrugineus

Los flavonoides y taninos fueron abundantes en todos los ensayos realizados. Los alcaloides, esteroles, triterpenos, quinonas, antraquinonas y saponinas se presentaron en bajas proporciones (Tabla 3).

Tabla 3: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas de Croton ferrugineus

Metabolitos Ensayo Croton ferrugineus

Alcaloides Reactivo Mayer - Reactivo Bouchardat - Reactivo Wagner - Reactivo Dragendorff +

Flavonoides Reactivo Shinoda +++ NaOH 10% +++

Taninos FeCl3 +++

Esteroles y triterpenos Reactivo Salkwosky + Reactivo Liebermann-Burchard +

Quinonas y Reactivo Borntrager +

antraquinonas H2SO4 -

Saponinas Espuma 3 mm

4.1.2 Cuantificación de flavonoides

La curva de calibración obtenida para la cuantificación de flavonoides totales mediante el uso de quercetina como estándar se muestra en la Gráfico 1.

y = 0,00045x + 0,067 0,450 R² = 0,997 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200

0,150 Absorbancia 0,100 0,050 0,000 0 200 400 600 800 Concentración g CE/mL

Gráfico 1: Curva de calibración usando quercetina como estándar

Los resultados de la Tabla 4 muestran el contenido total de flavonoides de las tres plantas evaluadas:

Hibiscus escobariae, presentó un contenido total de flavonoides de 100,95 ± 1,73 mg CE/g extracto.

Loxopterygium huasango presentó un contenido total de flavonoides de 995,42 ± 3,16 mg CE / g extracto.

Croton ferrugineus presentó un contenido total de flavonoides de 190,50 ± 0,83 mg CE / g extracto.

Tabla 4: Contenido total de Flavonoides

Especie Flavonoides totales (mg CE / g extracto) Hibiscus escobariae 100,95 ± 1,73 Loxopterygium huasango 995,42 ± 3,16 Croton ferrugineus 190,50 ± 0,83

4.1.3 Cuantificación de fenoles

La curva de calibración obtenida para la cuantificación de fenoles totales mediante el uso de ácido gálico como estándar se muestra en la Gráfico 2.

y = 0,0071x + 0,0226 1,8 R² = 0,9961 1,6 1,4 1,2 1 0,8

Absorbancia 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 250 Concentración g GAE/ mL

Gráfico 2: Curva de calibración usando ácido gálico como estándar

Los resultados mostrados en la Tabla 5 indican el contenido total de fenoles de las tres plantas evaluadas:

Hibiscus escobariae obtuvo un contenido total de fenoles de 12,24 ± 0,22 mg GAE/ g extracto.

Loxopterygium huasango presentó un contenido total de fenoles de 314,72 ± 1,91 mg GAE/ g extracto.

Croton ferrugineus presentó un contenido total de fenoles de 10,17 ± 0,22 mg GAE/ g extracto.

Tabla 5: Contenido total de fenoles

Especie Fenoles (mg GAE/ g extracto) Hibiscus escobariae 12,24 ± 0,22 Loxopterygium huasango 314,72 ± 1,91 Croton ferrugineus 10,17 ± 0,22

4.1.4 Actividad antioxidante

En la Tabla 12 se muestran los resultados de Hibiscus escobariae, que obtuvo un porcentaje de inhibición del radical DPPH de 47,33 ± 1,26, menor al requerido para calcular la concentración de inhibición del 50% (IC50).

Loxopterygium huasango presentó un porcentaje de inhibición del 92,97 ± 0.81, con una concentración de inhibición del 50% de 0,1 mg/mL (Tabla 12).

La concentración de inhibición del 50% (IC50) se calculó con la ecuación de la recta (y= 286,36x+20,756) R² = 0,989, obtenido de la curva de referencia del patrón analizado (Gráfico 3).

Croton ferrugineus presentó un porcentaje de inhibición de 82,95 ± 0,35, con un IC50 de 0,7 mg/mL (Tabla 2). La concentración de inhibición del 50% (IC50) se calculó con la ecuación de la recta (y=50,926x+15,046) R² = 0,985, obtenido de la curva de referencia del patrón analizado (Gráfico 4).

Tabla 6: Actividad antioxidante de los extractos etanólicos de hojas de tres especies de plantas del Ecuador

Especie Porcentaje de inhibición (%) IC50 mg/mL Hibiscus escobariae 47,33 ± 1,26 - Loxopterygium huasango 92,97 ± 0.81 0,1 Croton ferrugineus 82,95 ± 0,35 0,7

Clave: IC50: Concentración de inhibición del 50%; (-) Ausente

y = 286,36x + 20,756 100 R² = 0,9892 80

40 Porcentaje 20

0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Concentración mg/mL Gráfico 3: Actividad antioxidante de Loxopterygium huasango

y = 50,926x + 15,046 60 R² = 0,9858 50 40 30

20 Porcentaje 10 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Concentración mg/mL

Gráfico 4: Actividad antioxidante de Croton ferrugineus

En el Gráfico 5, se compara el porcentaje de inhibición del radical DPPH de las tres especies evaluadas frente al ácido ascórbico. Se puede observar que la especie Hibiscus escobariae presentó un 47,33% de inhibición, mostrando una gran diferencia frente al porcentaje de inhibición del ácido ascórbico que fue de 95,32%. Loxopterygium huasango presentó un porcentaje de inhibición del 92,97%, siendo muy similar al del ácido ascórbico con un 95,32%. Croton ferrugineus presentó un porcentaje de inhibición del radical DPPH del 82,95%, estando cerca al porcentaje de inhibición de 95,32% del ácido ascórbico.

120

100 95,48 92,97 82,95 80

60 47,33

Porcentaje 40

Ácido ascórbico Hibiscus escobariae Loxopterygium huasango Croton ferrugineus

Gráfico 5: Comparación del porcentaje de inhibición de radical DPPH de las especies evaluadas frente al ácido ascórbico (control).

4.1.5 Actividad antibacteriana

La actividad antibacteriana de Hibiscus escobariae, sobre Bacillus subtilis produjo un halo de inhibición de 13,5 mm con una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 100 mg / mL y frente a Listeria monocytogenes con un halo de inhibición de 7,4 mm con una CMI de 50 mg / mL (Tabla 6). En cambio, Hibiscus escobariae, no presentó ninguna actividad antibacteriana frente a las bacterias Gram negativas (Tabla 7).

Tabla 7: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae en bacterias Gram positivas Zona del halo de inhibición (mm) Antibióticos de referencia Bacterias Gram 20 50 100 200 CRO SXT P positivas mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Staphylococcus aureus NI NI NI NI 13,5 ATCC 25923 Bacillus subtilis ATCC NI NI 13,5 19 30 6633 Listeria monocytogenes NI 7,4 7,75 8,4 18 ATCC 19115 NI: No presentó inhibición. CRO: Ceftriaxone (30 µg); STX: Sulfamethoxazole (25 µg); P: Penicillin G (10 µg)

Tabla 8: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae en bacterias Gram negativas

Zona del halo de inhibición (mm)

Antibióticos de referencia Bacterias Gram negativas 20 50 100 200 CN TOB TE mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Escherichia coli ATCC NI NI NI NI 22 25922 Pseudomonas aeruginosa NI NI NI NI 22 ATCC 15442 Vibrio parahaemolyticus NI NI NI NI 27 ATCC 17802 NI: No presentó inhibición. CN: Gentamicin (10 µg); TOB: Tobramicina (10 µg); TE: Tetracycline (30 µg)

Loxopterygium huasango mostró inhibición frente a las bacterias Gram positivas evaluadas, mostrando una zona del halo de inhibición de 9 mm frente a Staphylococcus aureus, 10,5 mm frente Bacillus subtilis, ambas con una CMI de 5 mg/mL, mientras que Listeria monocytogenes obtuvo un halo de inhibición de 8mm con una CMI de 2,5 mg/mL (Tabla 8).

Loxopterygium huasango presentó actividad antibacteriana frente a las bacterias Gram negativas evaluadas, obteniendo un halo de inhibición de 7,75 mm para Escherichia coli, 10,25 mm en Pseudomonas aeruginosa y 9,5 mm en Vibrio parahaemolyticus, todas presentaron una CMI de 2,5 mg/mL (Tabla 9).

Tabla 9: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium huasango en bacterias Gram positivas

Zona del halo de inhibición (mm) Antibióticos de referencia Bacterias Gram 2,5 5 10 15 20 CRO SXT P positivas mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Staphylococcus NI 9 10 12,5 14,5 13,5 aureus ATCC 25923 Bacillus subtilis NI 10,5 12,2 13,5 15,5 30 ATCC 6633 Listeria 8 9 10 12,2 13,5 18 monocytogenes ATCC 19115 NI: No presentó inhibición. CRO: Ceftriaxone (30 µg); STX: Sulfamethoxazole (25 µg); P: Penicillin G (10 µg)

Tabla 10: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium huasango en bacterias Gram negativas

Zona del halo de inhibición (mm) Antibióticos de referencia Bacterias Gram 2,5 5 10 15 20 CN TOB TE negativas mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Escherichia coli 7,75 9,25 11,5 13,25 14,5 22 ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10,25 11,75 13 15 17,75 22 15442 Vibrio parahaemolyticus 9,5 12,5 15 17,5 20,5 27 ATCC 17802 NI: No presentó inhibición. CN: Gentamicin (10 µg); TOB: Tobramicina (10 µg); TE: Tetracycline (30 µg)

Croton ferrugineus no presentó inhibición antibacteriana frente a las bacterias Gram positivas (Tabla 10) y en presencia de Escherichia coli, mostró un halo de inhibición de 8 mm con un CMI de 200 mg/mL (Tabla 11).

Tabla 11: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus en bacterias Gram positivas

Zona del halo de inhibición (mm) Antibióticos de referencia Bacterias Gram positivas 20 50 100 200 CRO SXT P mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Staphylococcus aureus NI NI NI NI 13,5 ATCC 25923 Bacillus subtilis ATCC NI NI NI NI 30 6633 Listeria monocytogenes NI NI NI NI 18 ATCC 19115 NI: No presentó inhibición. CRO: Ceftriaxone (30 µg); STX: Sulfamethoxazole (25 µg); P: Penicillin G (10 µg)

Tabla 12: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus en bacterias Gram negativas

Zona del halo de inhibición (mm) Antibióticos de referencia Bacterias Gram negativas 20 50 100 200 CN TOB TE mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL Escherichia coli ATCC 25922 NI NI NI 8 22 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 NI NI NI NI 22 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 NI NI NI NI 27 NI: No presentó inhibición. CN: Gentamicin (10 µg); TOB: Tobramicina (10 µg); TE: Tetracycline (30 µg)

4.1.6 Análisis estadístico

Puesto que el p-valor del test de Anova simple fue inferior a 0,05, hubo diferencia significativa estadísticamente entre las medias de la actividad antioxidante de una especie a otra con el ácido ascórbico, para un nivel de confianza del 95%.

DISCUSIÓN

Hibiscus escobariae

Hibiscus escobariae (Malvaceae), presentó poco contendido de alcaloides, esteroles y triterpenos; los flavonoides y taninos fueron abundantes, mientras que las quinonas, antraquinonas y saponinas estuvieron ausentes. La presencia de estos metabolitos y ausencia de saponinas coincide con los resultados reportados por Prasad (2014), para las especies del género Hibiscus (Serban et al., 2015). La presencia de estos metabolitos le otorgaría a H. escobariae, las propiedades antimicrobiana, antioxidante, antiespasmódica, antipirética, diurética, cardioprotectora, entre otras, que presentan las especies de su mismo género (Vasudeva et al., 2008).

Las hojas de Hibiscus escobariae presentaron elevados contenidos de flavonoides con un total de 100,95 mg CE/g de extracto y de fenoles con un total de 12,24 mg GAE/g de extracto. Estos valores son muy cercanos al contenido de fenoles totales de la especie Hibiscus sabdariffa con 14,18 mg GAE/ g de extracto (Vivas et al., 2014). H. escobariae no presentó actividad antioxidante a pesar de tener elevados contenidos de flavonoides y fenoles; lo cual difiere de los estudios realizados a otras especies de su mismo género. Medina et al. (2013) y Reyes et al. (2015), afirman que la estructura química y concentraciones de antocianinas y otros polifenoles presentes en las flores y cáliz son los responsables de la actividad antioxidante en Hibiscus sabdariffa. Probablemente esta sea la razón por la cual H. escobariae no expresó inhibición mayor al 50% del DPPH, debido a que en el presente trabajo se utilizó el extracto de hojas; mientras que en los otros trabajos realizados a distintas especies de Hibiscus se emplearon otras partes aéreas de la planta excepto sus hojas (Gomes et al., 2010).

Diversos estudios confirman que los flavonoides y taninos son los responsables de la actividad antibacteriana y antioxidante (Serban et al., 2015; Buckholz et al., 2016; Carretera y Ortega, 2017). Posiblemente el alto contenido de flavonoides y taninos que presentó H. escobariae, sean los responsables de

la actividad antibacteriana frente a Bacillus subtilis (CMI 100 mg/mL) y frente a Listeria monocytogenes (CMI 50 mg/mL); lo cual coincide con los estudios realizados por Chung et al. (2004), quienes mencionan que los extractos evaluados de diferentes especies de la familia Malvaceae no presentaron inhibición frente a bacterias Gram negativas. Probablemente este resultado sea debido a la cápsula externa de lipopolisacárido y lipoproteína, que poseen las bacterias; las cuales son resistentes a compuestos antibacterianos (Alzoreky et al., 2003). Sin embargo, los resultados presentados difieren de la especie Hibiscus sabdariffa; la cual obtuvo inhibición frente a Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa observándose una CMI de 25 a 200 mg/mL (Sulaiman et al., 2014).

Loxopterygium huasango

Loxopterygium huasango (Anacardiaceae), presentó alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas y antraquinonas en proporciones abundantes; mientras que los esteroles, triterpenos y saponinas, presentaron poco contenido. Estos resultados coinciden con los metabolitos secundarios reportados por Bussman et al. (2009). La presencia de estos metabolitos es común en la familia Anacardiaceae (Suzimone et al., 2006).

Se ha reportado que los altos contenidos de flavonoides y taninos son los responsables de la actividad antibacteriana, antioxidante, citotóxica, diaforética, antiinflamatoria y antiviral, en diversas especies de la familia Anacardiaceae; mientras que los alcaloides, le otorga propiedades analgésicas y anestésicas; y las quinonas y antraquinonas son las responsables de actuar como laxantes (Silva et al., 2015; Atto et al., 2016; Pérez et al., 2012; Sepúlveda et al., 2003; Bustamante et al., 2010). La presencia de estos metabolitos secundarios en L. huasango confirmaría su uso en la medicina tradicional como antiviral, diaforético, anestésico, repelente y catártico (Bussman, et al., 2009; Aguirre, 2012).

A pesar de que hubo diferencia significativa estadísticamente entre L. husango y el ácido ascórbico, el porcentaje de inhibición del radical DPPH en L. huasango fue de 92,97%, cercano al del ácido ascórbico (Vitamina C) que obtuvo un porcentaje del 95,48%. Lo que coincide con los estudios realizados por Sanchez et al. (2000), quienes mencionan que la actividad antioxidante presentes en los compuestos fenólicos en algunos géneros de la familia Anacardiaceae, se debe a capacidad funcional de excelentes captores de radicales libres, ejerciendo efecto inhibitorio sobre la peroxidación de fosfolípidos. Además, de presentar una mejor actividad antioxidante que la vitamina C, E y β-carotenos. Estudios realizados por Garrido et al. (2004), mencionan que los flavonoides de tipo biflavonoides y otros compuestos fenólicos comunes en algunas especies de la familia Anacardiaceae, son el componente principal de una marca de productos antioxidantes 100% naturales denominada VIMANG®. Por lo tanto, L. huasango al haber presentado un porcentaje de inhibición del DPPH cercano al del ácido ascórbico, podría ser empleado para la creación de nuevos fármacos naturales con capacidad antioxidante.

El extracto de L. huasango, presentó una excelente actividad antibacteriana frente a todas las bacterias Gram positivas y Gram negativas evaluadas y a mínimas concentraciones (2,5 – 5 mg/mL). Probablemente la actividad antibacteriana determinada en L. huasango se deba al elevado contenido de flavonoides y taninos analizados, lo que confirman los estudios realizados por Suzimone et al. (2006), quienes mencionan que los compuestos fenólicos presentes en la familia Anacardiaceae son los responsables de la actividad inhibitoria frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas, debido a que en su estructura poseen una hidroxilación en el anillo B, lo cual inhibe la síntesis de ADN y ARN de las bacterias (López, 2010).

Croton ferrugineus

Croton ferrugineus (Euphorbeaceae), en el tamizaje fitoquímico presentó elevadas cantidades de flavonoides y taninos, mientras que los alcaloides,

esteroles, triterpenos, quinonas, antraquinonas y saponinas se presentaron en bajas proporciones. Los metabolitos presentes en Croton ferrugineus son comunes a los reportados en distintas especies del género Croton (Barrera et al., 2016). Se han realizado diversos trabajos de aislamiento de alcaloides, flavonoides, taninos y terpenoides a los cuales se le atribuyen actividades biológicas como: antimicrobianas, antiinflamatorias, cardiotónicas y espasmolíticas (Wen et al., 2018; Salatino et al., 2007, Ordoñez, 2016).

El alto contenido de flavonoides y taninos que presentó Croton ferrugineus, podría ser el responsable de la actividad antioxidante cercana a la del ácido ascórbico (Vitamina C). Estos resultados son similares a los obtenidos por Altamirano (2015), quién evaluó la presente actividad con cuatro especies del género Croton, donde menciona que todas presentaron una actividad antioxidante similar a la del ácido ascórbico. En diversas especies del género Croton se ha encontrado la presencia de flavonoides de tipo flavonoles y flavonas y taninos como proantocianidinas, responsables de la propiedad antioxidante debido a los grupos hidroxilos que presentan en el anillo B y la doble ligadura que se presentan en algunos flavonoides en el anillo C (Salatino et al., 2007; Bors et al., 1990).

A pesar de que Croton ferrugineus obtuvo elevados contenidos de flavonoides y fenoles totales, solo presentó actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, lo que difiere de la especie C. laui, que presentó inhibición frente a bacterias Gram positivas como: Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, al igual que Croton thurifer que también obtuvo actividad frente Bacillus subtilis (Liu et al., 2014; Quintero 2017). Sin embargo estudios realizados por Romero (2015), de actividad antibacteriana en la especie Croton elegans frente a Staphylococcus aureus y Pseudomonas aureginosa evidenciaron que no hubo actividad frente a las cepas mencionadas. Por lo tanto, las actividades antibacterianas de las especies del género Croton van a variar de una especie a otra debido a la diversidad química que presenta (Barrera et al., 2016).

CONCLUSIONES

• En el presente estudio la mayoría de compuestos activos estuvo presentes en las tres especies evaluadas; sin embargo, los metabolitos que se presentaron en cantidades abundantes fueron los flavonoides y taninos. Loxopterygium huasango fue la que más presentó compuestos activos, obteniendo aparte de abundantes contenidos de flavonoides y fenoles, la presencia de alcaloides, quinonas y antraquinonas en abundancia, mientras que las saponinas solo estuvieron presentes en Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.

• Los mayores contenidos de flavonoides totales se observaron en Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus, con 995,42 ± 3,16 y 190,50 ± 0,83 mg CE/g de extracto; y el mayor contenido de fenoles totales lo obtuvieron Loxopterygium huasango e Hibiscus escobariae, con 314,72 ± 1,91 y 12,24 ± 0,22 mg GAE/g de extracto. De acuerdo a los resultados obtenidos, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus fueron las que obtuvieron la mejor actividad antioxidante, por lo que podría usarse en un futuro para la elaboración de nuevos fármacos con capacidades antioxidantes.

• De acuerdo a los resultados obtenidos en la evaluación de actividad antibacteriana, las especies Hibiscus escobariae y Loxopterygium huasango podrían considerarse como una nueva fuente natural para la elaboración de productos antibacterianos, sobretodo la especie Loxopterygium huasango que mostró el mejor resultado contra todas las bacterias evaluadas, presentando concentraciones mínimas inhibitorias de 2,5 a 5 mg/mL; mientras que Hibiscus escobariae solo presentó actividad frente a Bacillus subtilis y Listeria monocytogenes causantes de enfermedades infecciosas.

RECOMENDACIONES

• Hibiscus escobariae y Loxopterygium huasango al haber presentado actividad antibacteriana contra algunas de las cepas evaluadas, son especies promisorias recomendadas para realizar pruebas para la bioprospección de nuevos antibióticos.

• Los resultados de actividad antibacteriana y antioxidante de Loxopterygium huasango muestran que es una especie rica en principios activos. Por esta razón es importante evaluar en L. huasango otro tipo de actividades biológicas como: antifúngica, citotóxica, alelopática, antiinflamatoria, entre otras.

• Realizar el aislamiento de metabolitos secundarios de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus para descubrir cuál es el responsable de las actividades biológicas que poseen.

• Realizar estudios biodirigidos de los metabolitos secundarios presentes en los extractos de estas plantas, donde su aplicación esté orientada a la industria farmacéutica, de alimento, entre otras.

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ANEXOS

Anexo 1: Pruebas de alcaloides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 2: Prueba Shinoda para flavonoides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 3: Prueba de Hidróxido de sodio para flavonoides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 4: Prueba del cloruro férrico para taninos: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 5: Prueba Salkowski para esteroles y triterpenos: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 6: Prueba Liebermann-Bouchardat para esteroles y triterpenos: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 7: Prueba Borntrager para quinonas y antraquinonas: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 8: Prueba del ácido sulfúrico para quinonas y antraquinonas: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 9: Prueba de espuma para saponinas: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 10: Curva de cuantificación de flavonoides.

Anexo 11: Prueba para la cuantificación de flavonoides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 12: Prueba de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de fenoles: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 13: Ensayo del radical DPPH para actividad antioxidante: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).

Anexo 14: Actividad antibacteriana de Hibiscus escobariae: Bacillus subtilis (A), Listeria monocytogenes (B).

Anexo 15: Actividad antibacteriana de Loxopterygium huasango: Staphylococcus aureus (A), Bacillus subtilis (B), Listeria monocytogenes (C), Escherichia coli (D), Pseudomonas aeruginosa (E), Vibrio parahaemolyticus (F).

Anexo 16: Actividad antibacteriana de Croton ferrugineus en Escherichia coli.